CN108982865B - 一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒，包括缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂；制备方法包括：配制缓冲液、凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、生物防腐液、兔脑凝脂储备液；取支持剂加入缓冲液配制成支持液；按试剂盒规格要求将凝血因子Xa、凝血因子活化剂、兔脑凝脂储备液加到支持液中，混匀后加入生物防腐液、再加入缓冲溶液至规定量，混匀后分装冻干。本发明能通过血栓弹力图检测法对样本中的肝素进行定量检测，线性范围内相关性好，符合肝素检出限标准且变异系数不大于10%，样本采用全血，无需额外处理，对凝血瀑布中的蛋白完整性亦无要求，简化了检验操作流程，方便了医生和患者。

Description

一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒及其制备方法，属于医疗器械技术领域。

背景技术

肝素，因首先从肝脏中发现而得名，也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，呈强酸性，是动物体内一种天然抗凝血物质，天然存在于肥大细胞，现主要从牛肺或猪小肠黏膜中提取。

临床上最初应用的肝素称为标准肝素、普通肝素或未分级肝素(UnfractionatedHeparin)，平均分子量为15KD，临床上主要用于抗凝血和抗血栓，治疗各种原因引起的弥漫性血管内凝血和抗血栓，以及血液透析、体外循环、导管术、微血管手术等操作中的抗凝血处理等。同时，临床应用及研究显示，标准肝素还具有其他多种生物活性和临床用途，包括抗炎、抗过敏、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、抗病毒、抗癌等作用。

低分子肝素是普通肝素经过物理分离法、化学裂解法与合成法等使标准肝素解聚而成，相对分子量为3000～7000。低分子量肝素的活性/抗凝血活性的比值为1.5～4.0，而普通的肝素为1，保持了肝素的抗血栓作用而降低了出血的危险，具有半衰期长，生物利用度高等优点，主要用于防治血栓形成和栓塞，治疗各种原因的弥散性血管内凝血(DIC)以及其他体内外抗凝血，如心肌梗死及肺、脑、外周血管栓塞，体外循环等，其有效性和安全性均优于普通肝素，量效关系明确，可用固定剂量，无需实验室监测调整剂量，应用方便。

然而，肝素用量过大，可发生自发性出血，包括皮肤、口腔及鼻黏膜、关节、内脏等均可发生出血，甚至可发生脑、脊髓、肾上腺等重要器官出血，大量出血可导致休克。对肝素过敏者，可出现急性鼻炎、严重哮喘、荨麻疹、结膜炎、血管神经性水肿、发热等，偶尔还会出现过敏性休克。此外，部分病人还可出现血管痉挛性反应，表现为患肢疼痛、缺血或青紫，或有四肢感觉异常、全身血管痉挛、表皮淤血、头痛、呼吸急促等症状。肝素治疗4个月以上，可发生骨质疏松及自发性骨折，偶有脱发、肌注局部疼痛、脂肪萎缩、皮肤坏死，少数病人可有心律失常，极少数病人使用肝素后体内会形成肝素性的抗血小板抗体，由此可造成严重血小板缺乏症而发生出血。

肝素的抗凝作用一般认为主要通过两个方面发挥作用：①是对凝血酶的抑制作用；②是对凝血活性因子Xa(FXa)的抑制作用。两者都依赖于肝素的戊糖结构与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的结合。经肝素结合的抗凝血酶-Ⅲ结合凝血酶和FXa的能力增强，其中肝素抗凝血酶的作用不但要求肝素与AT-Ⅲ的结合，还同时要求肝素与凝血酶的直接结合，这就需要肝素分子有足够的长度，一般至少18个单糖的长度，分子量至少为5000D，但肝素增强抗凝血酶-Ⅲ抑制FXa的作用不需要肝素与FXa直接接触，此种作用对肝素无最低分子量上的要求。低分子肝素由于片断较短，大部分分子长度均小于18个单糖长度，因此其抗凝血酶的作用远低于其抗FXa作用。

现有技术中，肝素常用检测方法包括以下几种。

(1)APTT法：

APTT即活化部分凝血活酶时间，英文为activated partial thromboplastintime，英文缩写为APTT，测定原理为：37℃条件下，以白陶土激活内源性凝血途径的始动因子Ⅻ，以脑磷脂(部分凝血活酶)代替血小板第三因子，在Ca²⁺参与下，观察血浆凝固所需的时间，即为活化部分凝血活酶时间，是内源凝血系统较敏感和最为常用的筛选试验；

目前，APTT依然是监测普通肝素(unfraction heparin，简称UFH，中文译为普通肝素，又称非组分肝素)的选项之一，是非常简单、快速和便宜的检测项目，然而，却难以标准化；

APTT检测时，要求整个凝血瀑布中的所有蛋白都是完整的，如此才能准确测量肝素水平，有狼疮抗凝物或抗磷脂综合症的病人通常都有APTT升高现象，他们就必须使用专门的肝素试验来监测，除了不同凝血因子水平的因素，试剂和仪器也会影响其对肝素的敏感性，导致实验室之间最终结果会有多达四倍的差异；

国际血栓与止血协会和标准化委员会(英文缩写：ISTH SSC)企图建立一个标准方法，类似血浆凝血酶原时间测定(英文缩写：PT)实验中使用的，以标准品组织凝血活酶与每批组织凝血活酶校正曲线的斜率表示的国际敏感指数(英文缩写：ISI)一样，给APTT试验建立一个纠正系数。但是，由于磷脂、激活剂和仪器种类的多样化，这一工作目前只取得了一点进步。ISTH SSC建议每个APTT的检测系统都应当采用推荐的方法，通过凝血因子Xa活性来进行定标并获得相应的APTT监测范围，但到目前为止，还是难以全面推广和施行。

(2)硫酸鱼精蛋白中和试验法：

该试验是基于一个负电荷的普通肝素分子(英文简称：UFH)可被一个正电荷的硫酸鱼精蛋白中和的原理进行设计的，试验时，先将不同浓度的硫酸鱼精蛋白加入血浆之中，再加入凝血酶，测量凝固时间，将凝血酶凝固时间恢复至正常的硫酸鱼精蛋白浓度就被认为是肝素的浓度，但这个试验仅仅适用于UFH的监测，而不适用于低分子肝素的检测。

(3)抗Xa活性检测法：

凝血因子Xa是一种丝氨酸蛋白酶，位于血液凝集级联的上游，处在连接内源性和外源性激活途径共同通路的中心位置，它既能阻断内源性凝血亦能抑制外源性凝血的发生；

Xa因子是凝血酶生成的限速成分，由于在血液凝集级联反应过程中还存在生物信号的放大，估计一个Xa因子抑制剂分子具有能抑制138个凝血酶分子的生理效果，因此，Xa因子抑制剂可能比凝血酶抑制剂更为有效；

抗凝血因子Xa活性检测法即采用发色底物进行凝血因子Xa活性的检测，其原理是：标本中的肝素与抗凝血酶(英文简称：AT)形成复合物，抑制过量添加的Xa因子，剩余Xa因子的活性通过其作用于特异底物，释放出色原肽核酸(英文简称：pNA)，以其显色的程度反应抗Xa因子的作用，这一反应与肝素活性成反比。

(4)一步法检测：

一步法测量肝素使得检测更加简单，并缩短了时间；这种方法不添加外源性AT，检测是基于竞争抑制原理；检测时，加入Xa到血浆中与底物混合，立即同时有发生两个反应，即：底物被Xa水解和Xa被肝素-AT复合物抑制；一旦反应达到平衡，底物中释放出的pNA与待测血浆中肝素活性成反比；

在这个检测中，没有添加外源性的AT，完全依赖病人血浆中的AT数量，这就代表了病人真实的肝素功能反应，病人AT水平在35％～130％之间，肝素活性检测不会受到影响。

(5)血栓弹性图法(英文简称：TEG)：

德国Helmut Hartert教授在上世纪40年代研制出相应的仪器，其原理是体外模拟缓慢静脉血流，用传感器测定血栓形成的时间和强度，并由计算机绘制出血凝强度曲线；

检测时，将一导丝相连的探针置入全血标本中，装有全血样本的容器以一定的角度顺逆时针交互转动，血栓形成后，粘合于探针表面，并与之一起转动，血栓强度越大，则探针运动幅度越大，通过与探针相连的细丝将探针的运动幅度记录下来，即可判断血液凝结的速度和强度，进而判断血栓风险的大小；

TEG的优点是采用全血检测，除检测血小板功能外，还可了解血栓溶解的情况，对血栓和出血风险均可进行评价；目前市场上凝血激活检测试剂盒(凝固法)和肝素酶包被试剂杯即是通过血栓弹力图法定性检测肝素，判断肝素是否过量。

综上所述，现有技术中：采用APTT或PT检测时，只有当整个凝血瀑布中的所有蛋白都是完整的，才能准确测量肝素水平，但是试剂和仪器会影响其对肝素的敏感性，导致实验室之间最终结果会有多达四倍的差异；硫酸鱼精蛋白中和试验仅仅适用于普通肝素(UFH)的监测；凝血激活检测试剂盒(凝固法)和肝素酶包被试剂杯无法定量检测肝素；此外，APTT或PT和硫酸鱼精蛋白中和试验以及抗Xa活性检测和一步法检测仅适用于检测血浆中的肝素的量，检测时，需要将病人样本进行处理获取血浆后再进行检测，不能对直接对全血进行检测，故不适用于床边检测。

发明内容

为解决现有技术的上述缺陷，本发明提供一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒及其制备方法，以全血为样本，采用血栓弹力图法，无需对样本进行额外处理也不要求凝血瀑布中的蛋白一定要保持完整即可完成肝素的定量检测，从而简化检验流程，适应所有肝素定量检测的需要。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒，其特征在于，包括：缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂。

进一步的，所述缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述凝血因子活化剂为Russell’s蛇毒RVV-V，所述支持剂包括NaCl、甘氨酸、牛血清白蛋白、海藻糖，所述生物防腐剂为液体生物防腐剂Proclin300。

进一步的，所述血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒由包括最终浓度分别为：10～50mmol/L且pH值为7.0～8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸液，10～30mg/L的凝血因子Xa液，2～10mg/L的兔脑凝脂液，2～10mg/L的Russell’s蛇毒RVV-V液，由50～250mmol/L的NaCl液、1～6g/L的甘氨酸液、10g/L～30g/L的牛血清白蛋白液、12～40g/L的海藻糖液组成的支持液，体积百分浓度为0.03％～0.05％的Proclin300防腐液混合冻干而成。

一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括步骤：

a)分别将缓冲剂、凝血因子Xa、凝血因子活化剂、生物防腐剂配制成缓冲液、凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、生物防腐液，并将缓冲溶液pH值调节至7.0～8.0；

b)取兔脑凝脂加入少量缓冲液研磨至乳状后再加入缓冲液配制兔脑凝脂储备液；

c)取支持剂加入缓冲液配制成支持液；

d)按试剂盒规格要求分别量取凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液加入到支持液中，混匀，加入生物防腐液后再混匀，再加入缓冲溶液至规定量，混合均匀后分装冻干，即制成血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：

本发明提供的一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒及其制备方法，通过缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂的配伍组合，能够通过血栓弹力图检测法，方便准确地对样本中的肝素进行定量检测，样本采用全血，无需进行额外处理，对凝血瀑布中的蛋白完整性亦无要求，简化了检验操作流程，方便了医生和患者，因而，极具推广应用价值。

附图说明

图1为普通肝素及低分子肝素活性-ACT值校准曲线图；

图2为实际普通肝素活性与理论普通肝素活性关系图；

图3为实际低分子肝素活性与理论低分子肝素活性关系图。

具体实施方式

下面结合附图以及附图说明和实施例对本发明提供的技术方案做进一步详细说明；

需要说明的是，以下实施例所涉及的缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂及其他试剂皆市售可得。

实施例1

S11)称取0.596g的缓冲剂4-羟乙基哌嗪乙磺酸(英文简称：HEPES)放入250ml容量瓶中，用适量蒸馏水溶解后，加入浓度为0.1mol/L的NaOH溶液适量进行pH值调节，再加水至刻度线，混合均匀，配制成浓度为10mmol/L且pH值为7.9左右的HEPES缓冲液；

S12)吸取蒸馏水复溶凝血因子Xa冻干粉，制成浓度为1g/L的凝血因子Xa储备液；

S13)吸取蒸馏水复溶凝血因子活化剂RVV-V冻干粉，制成浓度为1g/L的凝血因子活化剂RVV-V储备液；

S14)称取兔脑凝脂并加入与兔脑凝脂的重量︰体积＝1︰1的HEPES缓冲液，研磨至乳状且肉眼观察无明显颗粒，制成浓度为1g/L的兔脑凝脂储备液；

S15)称取0.467g的NaCl、0.2g的甘氨酸、1.0g的牛血清白蛋白(英文简称：BSA)、1.5g的海藻糖，放入100ml容量瓶中，加入适量的HEPES缓冲液配制成支持液；

S16)吸取1.0ml凝血因子Xa储备液、0.2ml凝血因子活化剂储备液、0.2ml兔脑凝脂储备液加入装有支持液的容量瓶中；

S17)吸取30μl生物防腐剂Proclin300加入到装有凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液及支持液的容量瓶中，使其最终体积百分浓度为0.03％，再加入HEPES缓冲液至刻度线，混合均匀成试剂溶液；

S18)将上述试剂溶液进行分装，20μl/瓶，冻干，即成规格为含10mg/L凝血因子Xa的本发明所述血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒。

实施例2

S21)称取1.489g的缓冲剂4-羟乙基哌嗪乙磺酸放入250ml容量瓶中，用适量蒸馏水溶解后，加入浓度为0.1mol/L的NaOH溶液适量进行pH值调节，再加水至刻度线，混合均匀，配制成浓度为25mmol/L且pH值为7.4左右的HEPES缓冲液；

S22)、S23)、S24)分别与实施例1步骤S12)、S13)、S14)相同；

S25)称取0.877g的NaCl、0.4g的甘氨酸、2.0g的牛血清白蛋白、2.5g的海藻糖，加入100ml容量瓶中，加入适量的HEPES缓冲液配制成支持液；

S26)吸取2.0ml凝血因子Xa储备液、0.6ml凝血因子活化剂储备液、0.5ml兔脑凝脂储备液加入装有支持液的容量瓶中；

S27)吸取50μl生物防腐剂Proclin300加入到装有凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液及支持液的容量瓶中，使其最终体积百分浓度为0.05％，再加入HEPES缓冲液至刻度线，混合均匀成试剂溶液；

S28)将上述试剂溶液进行分装，20μl/瓶，冻干，即成规格为含20mg/L凝血因子Xa的本发明所述血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒。

实施例3

S31)称取2.979g的缓冲剂4-羟乙基哌嗪乙磺酸(英文简称：HEPES)放入250ml容量瓶中，加入适量蒸馏水溶解后，加入浓度为0.1mol/L的NaOH溶液适量进行pH值调节，再加水至刻度线，混合均匀，配制成浓度为50mmol/L且pH值为7.1左右的HEPES缓冲液；

S32)、S33)、S34)分别与实施例1步骤S12)、S13)、S14)相同；

S35)称取1.695g的NaCl、0.6g的甘氨酸、3.0g的牛血清白蛋白、3.8g的海藻糖，加入100ml容量瓶中，加入适量的HEPES缓冲液配制成支持液；

S36)吸取3.0ml凝血因子Xa储备液、1.0ml凝血因子活化剂储备液、1.0ml兔脑凝脂储备液加入装有支持液的容量瓶中；

S37)吸取40μl生物防腐剂Proclin300加入到装有凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液及支持液的容量瓶中，使其最终体积百分浓度为0.04％，再加入HEPES缓冲液至刻度线，混合均匀成试剂溶液；

S38)将上述试剂溶液进行分装，20μl/瓶，冻干，即成规格为含30mg/L凝血因子Xa的本发明所述血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒。

效果实施例

S41)检测试剂盒规格及组成：

本效果实施例采用规格为含20mg/L凝血因子Xa的本发明所述血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒，所述试剂盒组成包括：

缓冲液：50mmol/L HEPES，pH＝7.4；Xa因子：20mg/L；兔脑凝脂：5mg/L；RVV-V：6mg/L；NaCl：150mmol/L；甘氨酸：4g/L；BSA：20g/L；海藻糖：25g/L；Proclin300：体积百分浓度0.05％。

S42)校准品的制备：

S421)普通肝素校准品制备：首先配制包含体积百分浓度分别为0.05％的防腐剂Proclin300、质量体积百分浓度为0.5％的甘氨酸和0.5％的海藻糖组成的基础溶液，然后将普通肝素标准品添加至正常血浆中制成含普通肝素不同浓度的普通肝素血浆，再将不同浓度的普通肝素血浆分别加到基础溶液中，制成含有普通肝素活性分别为0、0.2、0.5、1、2U/ml的系列校准溶液，分别分装，1ml/瓶，冻干，即成普通肝素系列校准品。

S422)低分子肝素校准品制备：首先配制包含体积百分浓度分别为0.05％的防腐剂Proclin300、质量体积百分浓度为0.5％的甘氨酸和0.5％的海藻糖组成的基础溶液，然后将低分子肝素标准品添加至正常血浆中制成含低分子肝素不同浓度的低分子肝素血浆，再将不同浓度的低分子肝素血浆分别加到基础溶液中，制成含低分子肝素活性分别为0、0.2、0.5、1、2U/ml的系列校准溶液，分别分装，1ml/瓶，冻干，即成低分子肝素系列校准品。

S43)肝素活性定量检测方程的建立：

S431)普通肝素活性定量检测方程的建立：

1)将含20mg/L凝血因子Xa的本发明所述血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒和普通肝素系列校准品从2～8℃的贮存环境中取出，室温平衡15～30分钟，分别加水复溶；

2)在血栓弹力图仪上选择“CRT”，装载检测杯，将10μl复溶后的本发明所述血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒复溶液注入检测杯中，再加入20μl的0.2mol/L CaCl₂溶液；再从上述普通肝素系列校准品中的一个活性的普通肝素校准品复溶液中吸取340μL加至检测杯中，用移液器上下混吸3次，然后立即测试，记录其ACT数值；

依此方法对该活性的普通肝素校准品复溶液再重复检测1次并记录其ACT数值；

按上述方法依次对不同普通肝素活性的校准品复溶液进行检测，获得普通肝素活性分别为0、0.2、0.5、1、2U/ml的校准品复溶液的各两个ACT数值；

3)以不同普通肝素活性校准品复溶液各两次测得的ACT数值的均值为纵坐标，对应的普通肝素活性为横坐标，作图，得到图1普通肝素及低分子肝素活性-ACT值校准曲线图中虚线所示的“普通肝素活性-ACT值校准曲线”；

4)根据上述“普通肝素活性-ACT值校准曲线”可得“普通肝素活性-ACT值直线方程”，本实施例中，普通肝素活性-ACT值直线方程为：

y＝110.96x+88.939，相关系数r²＝0.998；

根据上述“普通肝素活性-ACT值直线方程”，可得“普通肝素活性方程”为：

x＝(y-88.939)/110.96；

其中：y为检测样本ACT值(s)，x为检测样本中普通肝素活性(U/ml)。

S432)低分子肝素活性方程的建立：

用低分子肝素系列校准品代替普通肝素系列校准品，按S431)普通肝素活性定量检测方程的建立中1)和2)的方法进行操作，可得到图1普通肝素及低分子肝素活性-ACT值校准曲线图中实线所示的“低分子肝素活性-ACT值校准曲线”；

根据此“低分子肝素活性-ACT值校准曲线”可得“低分子肝素活性-ACT值直线方程”，本实施例中，“低分子肝素活性-ACT值直线方程”为：

y'＝117.54x'+99.82，相关系数r'²＝0.998；

根据上述“低分子肝素活性-ACT值直线方程”，可得“低分子肝素活性方程”为：

x'＝(y'-99.82)/117.54；

其中：y'为检测样本ACT值(s)，x'为检测样本中普通肝素活性(U/ml)。

S44)样本肝素的定量检测：

在血栓弹力图仪上中选择“CRT”，装载检测杯，将10μl复溶后的本发明所述血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒复溶液注入检测杯中，再加入20μl的0.2mol/L CaCl₂溶液；从枸橼酸化的全血样本中吸取340μL加至检测杯中，用移液器上下混吸3次，然后立即测试，记录其ACT数值；

将上述样本的ACT值代入“普通肝素活性-ACT值校准曲线图”或“普通肝素活性方程”中，即可得出样本中普通肝素的浓度；

将上述样本的ACT值代入“低分子肝素活性-ACT值校准曲线图”或“低分子肝素活性方程”中，即可得出样本中低分子肝素的浓度。

本效果实施例中，所述血栓弹力图仪采用美国的Haemoscope TEG5000，然而，本发明提供的血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒同样适用于其它品牌、型号的血栓弹力图仪进行肝素的检测，如西芬斯CFMS血栓弹力图仪等，当然，具体参数应根据不同仪器进行适当的调整。

S45)本发明提供的血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒分析性能评估：

S451)普通肝素定量检测分析性能评估：

Ⅰ)线性范围：

将接近线性范围上限、含普通肝素活性为3.6U/ml的高普通肝素活性样本用血浆分别按2/3、1/2、1/3、1/6的比例稀释，并以血浆为空白样本，加上稀释前原样本，共得到6份不同普通肝素活性的样本；

使用实施例1所得本发明所述试剂盒，按步骤S42)、S43)、S44)进行普通肝素活性测定，将测定所得普通肝素活性的平均值与理论活性进行线性回归分析，得回归计算方程为：

UA＝1.02UT-0.002，相关系数R²＝0.994；

其中：UT为理论普通肝素稀释活性，UA为实际普通肝素检测活性。

从图2所示实际普通肝素活性与理论普通肝素活性关系图中可以看出，本发明提供的试剂盒在普通肝素活性0～3.6U/ml的线性范围内相关性较好。

Ⅱ)最低检出限：

以血浆为空白样本，使用实施例1所得本发明所述试剂盒，按S42)、S43)、S44)所述步骤重复测定20次，计算空白样本ACT均值和标准差(SD)，以空白均值加两倍标准差代入普通肝素活性方程，计算最低检测限，其结果如表1所示：

表1普通肝素检测最低检出限

表1结果显示：本发明提供的血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒的最低普通肝素检测限为0.198U/ml，能够满足普通肝素最低检出限要求。

Ⅲ)重复性：

取上述普通肝素系列校准品中的一个样本，使用实施例1所得本发明所述试剂盒，按S42)、S43)、S44)所述步骤重复测定10次，计算样本的ACT均值和SD值，得到变异系数(CV％)，结果如表2所示：

表2普通肝素重复性试验检测数据

表2结果显示：本发明提供的血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒检测普通肝素的ACT变异系数(CV)不大于10％，具有较好的重复性。

S452)低分子肝素定量检测分析性能评估：

Ⅰ')线性范围

将接近线性范围上限、低分子肝素活性为3.5U/ml的高低分子肝素活性样本用血浆分别按4/5、3/5、2/5、1/5的比例稀释，并以血浆为空白样本，加上稀释前原样本，共得到6份不同低分子肝素活的样本；

使用实施例1所得本发明所述试剂盒，按步骤S42)、S43)、S44)进行低分子肝素活性测定，将测定所得低分子肝素活性的平均值与理论浓度进行线性回归分析，可得回归计算方程为：

DUT＝1.0045DUA+0.0005，相关系数R'²＝0.991；

其中：DUA为理论低分子肝素稀释活性，DUT为实际低分子肝素检测活性。

从图3实际低分子肝素活性与理论低分子肝素活性关系图中可以看出，本发明所提供的试剂盒在低分子肝素活性0～3.5U/ml线性范围内相关性较好。

Ⅱ')最低检出限：

以血浆为空白样本，使用实施例1所得本发明所述试剂盒，按S42)、S43)、S44)所述步骤重复测定20次，计算空白样本ACT均值和标准差(SD)，以空白均值加两倍标准差代入低分子肝素活性方程，计算最低检测限，其结果如表3所示：

表3普通肝素检测最低检出限

表3结果显示：本发明提供的血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒的最低低分子肝素检测限为0.097U/ml，能够满足低分子肝素最低检出限要求。

Ⅲ')重复性

取上述低分子肝素系列校准品中的一个样本，使用实施例1所得本发明所述试剂盒，按S42)、S43)、S44)步骤重复测定10次，计算样本的ACT均值和SD值，得到变异系数(CV％)，其结果如表4所示：

表4普通肝素重复性试验检测数据

表4结果显示：本发明提供的血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒检测低分子肝素的ACT变异系数(CV)不大于10％，具有较好的重复性。

综上所述：

本发明提供的一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒及其制备方法，通过缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂的配伍组合，能够通过血栓弹力图检测法，方便准确地对样本中的肝素进行定量检测；

实验表明，本发明提供的试剂盒在普通肝素活性0～3.6U/ml的线性范围内、低分子肝素活性0～3.5U/ml线性范围内相关性较好；普通肝素最低检测限为0.198U/ml、低分子肝素最低检测限为0.097U/ml，皆能满足肝素最低检出限要求；普通肝素和低分子肝素的ACT变异系数(CV)均不大于10％，显示其在肝素的定量检测中具有较好的重复性；

此外，利用本发明提供的血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒检测时，样本采用全血，无需进行额外处理，对凝血瀑布中的蛋白完整性亦无要求，简化了检验操作流程，方便了医生和患者，因此，极具推广应用价值。

最后，有必要说明的是：上述内容仅用于帮助说明和理解本发明的技术方案，不能理解为对其的限制；本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒，其特征在于，包括：缓冲剂、凝血因子Xa、兔脑凝脂、凝血因子活化剂、支持剂、生物防腐剂；

所述缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述凝血因子活化剂为Russell’s蛇毒RVV-V，所述支持剂包括NaCl、甘氨酸、牛血清白蛋白、海藻糖，所述生物防腐剂为液体生物防腐剂Proclin300；

所述试剂盒由最终浓度分别为10～50mmol/L且pH值为7.0～8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸液，10～30mg/L的凝血因子Xa液，2～10mg/L的兔脑凝脂液，2～10mg/L的Russell’s蛇毒RVV-V液，由50～250mmol/L的NaCl液、1～6g/L的甘氨酸液、10g/L～30g/L的牛血清白蛋白液、12～40g/L的海藻糖液组成的支持液，体积百分浓度为0.03％～0.05％的Proclin300防腐液混合冻干而成。

2.一种权利要求1所述的血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括步骤：

a)分别将缓冲剂、凝血因子Xa、凝血因子活化剂、生物防腐剂配制成缓冲液、凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、生物防腐液，并将缓冲溶液pH值调节至7.0～8.0；

b)取兔脑凝脂加入少量缓冲液研磨至乳状后再加入缓冲液配制兔脑凝脂储备液；

c)取支持剂加入缓冲液配制成支持液；

d)按试剂盒规格要求分别量取凝血因子Xa储备液、凝血因子活化剂储备液、兔脑凝脂储备液加入到支持液中，混匀，加入生物防腐液后再混匀，再加入缓冲溶液至规定量，混合均匀后分装冻干，即成所述血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒。

Images