CN105424944A

CN105424944A - 用凝集测定检测和分类抗凝血剂

Info

Publication number: CN105424944A
Application number: CN201510755414.XA
Authority: CN
Inventors: 法齐·S·扎曼; 马克·道布尔迪
Original assignee: Haemonetics Corp
Current assignee: Haemonetics Corp
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2035-07-31
Also published as: EP3611507B1; JP2017523411A; JP7250744B2; EP3175245B1; JP7246559B2; EP3611507A1; EP3175245A1; WO2016019145A1; CN105424944B; JP2023017978A; US10501773B2; HK1223151A1; US20200063184A1; JP6776221B2; JP2023072032A; ES2907190T3; JP2021012207A; US10954549B2; US20160032355A1; US20210230663A1

Abstract

本发明提供了用于在患者中检测治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法。本发明还包括在蝰蛇毒试剂的存在下使用凝集测定，将抗凝血剂分类为抗-凝血因子Xa抗凝血剂或直接凝血酶抑制剂的方法。本发明还提供用于在患者中检测和分类治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法。本发明进一步包括用于在凝血因子Xa试剂的存在下鉴定和分类抗凝血剂为抗-凝血因子Xa抗凝血剂的方法。

Description

用凝集测定检测和分类抗凝血剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年7月31日提交的美国临时申请号62/031,371和2015年2月3日提交的美国临时申请号62/111,376的优先权，其中每一个在此通过引用以其整体作为参考.

背景

本发明涉及凝血和止血领域.

随着人口老龄化，涉及心脏和循环系统疾病的风险已成为日益关注的问题。抗凝血剂已被用于对抗和/或管理(如，预防)包括患者的心房颤动、肺栓塞、深静脉血栓形成、静脉血栓栓塞、充血性心脏衰竭、中风、心肌梗塞和血液凝固性过高的综合症.在过去，抗凝血剂药物华法林，其减少了所有维生素K依赖性凝血因子的功能水平，被经常使用。然而，最近改良的抗凝血剂已被开发为在凝血级联反应中特异性靶向某些因子。

例如，口服抗凝血剂的引入已经改变有静脉和动脉血栓栓塞疾病的患者的管理.不同于传统的口服维生素K拮抗剂(VKA)，最近开发的不普遍降低维生素K依赖性因子的口服抗凝血剂以固定剂量给药，并具有较低潜在的药物与食物相互作用，因此消除了常规实验室监测的要求(AnsellJ.等人，Chest133：160S-198S，2008；AgenoW.等人，Chest141：e44S-88S，2012)。与VKA药物如华法林相比，这些新制剂显示出类似的或改良的功效和安全性，并建立包括未分级肝素和低分子量肝素的非肠道药剂。

然而，这些新的口服抗凝血剂的现有管理挑战着临床医生和实验室人员，当患者出现出血倾向(如因外伤或手术期间)。缺乏现成的方法来确定抗凝作用的程度在临床治疗潜在接受抗凝血剂的出血患者中产生重大挑战.在某些情况下，没有有用的方法来检测和监控这些药剂(参见Miyares和Davis，Am.J.Health.Syst.Pharm.69：1473-1484，2012)。

有一个快速方法来检测取自患者样品中抗凝血剂的存在将是有用的.确定患者的样品中有哪种类型的抗凝血剂也将是有用的.

实施方案概要

在一些实施方案中，本发明提供了一种快速和准确的方法以检测取自患者的样品中的抗凝血剂的存在和逆转。在一些实施方案中，本发明提供了一种快速和准确的方法以鉴定在样品中是哪种类型的抗凝血剂。

因此，在第一方面，本发明提供了在怀疑有抗凝血剂的患者中检测至少治疗相关量的(即，治疗相关量或更高量)抗凝血剂的方法.该方法包括(a)使对照血液成分的对照样品，该对照样品已知不包含抗凝血剂，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得对照样品的凝血测量结果；和(b)使来自怀疑有抗凝血剂的患者的血液成分的患者样品，在凝血因子Xa试剂存在下以凝集测定得到该患者样品的凝血测量结果，其中患者样品凝血测量结果大于对照样品凝血测量结果，表明所述抗凝血剂在患者中以治疗相关量存在，且其中患者样品凝血测量结果小于或等于对照样品凝血测量结果，表明在患者中不存在治疗相关量的抗凝血剂。在一些实施方案中，抗凝血剂是口服抗凝血剂.该口服抗凝血剂可以是直接凝血酶抑制剂，或者可以是凝血因子Xa抑制剂.

在一些实施方案中，所述方法还包括：对被确定为存在于患者中的抗凝血剂分类，通过(a)使所述对照血液成分的对照样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得对照蝰蛇毒凝血测量结果；和(b)使来自患者的血液成分的患者样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者蝰蛇毒凝血测量结果，其中当患者蝰蛇毒凝血测量结果大于对照蝰蛇毒凝血测量结果时，则鉴定患者中的抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，并且其中所述患者蝰蛇毒凝血测量结果小于或等于对照蝰蛇毒凝血测量结果，鉴定患者中的抗凝血剂为抗-凝血因子Xa抗凝血剂。

在另一个方面，本发明提供用于在怀疑有抗凝血剂的患者中检测和/或分类治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法，其包括使来自患者的血液成分的第一样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者凝血因子Xa凝血测量结果，使来自患者的所述血液成分的第二样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者蝰蛇毒凝血测量结果；以及比较患者凝血因子Xa的凝血测量结果和来自已知缺乏抗凝血剂的对照血液成分的对照凝血因子Xa的凝血测量结果，以及比较患者蝰蛇毒凝血测量结果和来自对照血液成分的对照蝰蛇毒凝血测量结果；其中所述患者蝰蛇毒凝血测量结果大于对照蝰蛇毒凝血测量结果，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量或高于治疗相关量存在，并确定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，并且其中患者凝血因子Xa凝血测量结果大于对照凝血因子Xa凝血测量结果，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量或高于治疗相关量存在，并鉴定抗凝血剂为抗-凝血因子Xa抗凝血剂，并且其中患者凝血因子Xa凝血测量结果小于或等于对照凝血因子Xa凝血测量结果，则确定在患者中缺乏治疗相关量或高于治疗相关量的抗凝血剂.

在另一个方面，本发明提供了一种用于从患者的血液成分中分类治疗相关量或高于治疗相关量的抗凝血剂的方法，其包括：确定血液成分中抗凝血剂的存在，通过(i)使已知不包含抗凝血剂的对照血液成分的第一部分，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得对照凝血因子Xa凝血测量结果；和(ii)使来自患者的血液成分的第一部分，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者凝血因子Xa凝血测量结果，其中所述患者凝血因子Xa凝血测量结果大于对照凝血因子Xa凝血测量结果，表明在患者血液成分中所述抗凝血剂以治疗水平存在，和其中所述患者凝血因子Xa凝血测量结果小于或等于对照凝血因子Xa凝血测量结果，表明在患者血液成分中缺乏治疗相关量的抗凝血剂，以及分类抗凝血剂，如果存在于患者的血液成分，通过(i)使对照血液成分的第二部分，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得对照蝰蛇毒凝血测量结果；和(ii)使患者血液成分的第二部分，在所述蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者蝰蛇毒凝血测量结果，其中当患者蝰蛇毒凝血测量结果大于对照蝰蛇毒凝血测量结果时，则鉴定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，并且其中所述患者蝰蛇毒凝血测量结果小于或等于对照蝰蛇毒凝血测量结果，鉴定所述抗凝血剂为抗-凝血因子Xa抗凝血剂.

在一些实施方案中，凝集测定选自凝血酶原时间(PT)测定、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定和活化凝血时间(ACT)测定.

在一些实施方案中，对照样品的凝血测量结果的范围为来自已知缺乏抗凝血剂的至少两个对照血液成分的至少两个对照样品的至少两个凝血测量结果.

在一些实施方案中，凝集测定是粘弹性分析凝集测定.在一些实施方案中，使用含有位于容器内的样品的容器进行粘弹性分析.在一些实施方案中，使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述针相对于所述容器移动.在一些实施方案中，使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述容器相对于所述针移动。在一些实施方案中，所述容器没有底面。

在各个实施方案中，所述患者是人.在一些实施方案中，患者正经历包括手术、创伤、出血、中风或血栓栓塞事件的条件。

在另一个方面，本发明提供了用于在怀疑有抗凝血剂的患者中分类治疗相关量(或更高)的抗凝血剂的方法.该方法包括(a)确定来自所述患者的血液成分中抗凝血剂的存在，包括以下步骤：(i)使对照血液成分的对照样品，所述对照血液成分已知不包含抗凝血剂，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得对照样品的凝血因子Xa的凝血测量结果；和(ii)使来自患者的血液成分的患者样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者样品的凝血因子Xa凝血测量结果，其中患者样品的凝血因子Xa凝血测量结果大于对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果，表明在患者中所述抗凝血剂以治疗相关量存在，并且其中第二样品的凝血因子Xa凝血测量结果小于或等于对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果，表明在患者中缺乏治疗相关量的抗凝血剂；和(b)分类患者的抗凝血剂，其包括以下步骤：(i)使对照血液成分的第二对照样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得第二对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果；和(ii)使来自患者血液成分的第二患者样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果，其中第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果大于第二对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果，鉴定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，并且其中所述第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果小于或等于第二对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果，鉴定该抗凝血剂为抗-凝血因子Xa试剂.

在另一个方面，所述方法用于在怀疑有抗凝血剂的患者中检测治疗相关量或更高量的抗凝血剂的逆转.所述方法包括通过(a)使已知缺乏(即，没有)抗凝血剂的对照血液成分的样本，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得对照蝰蛇毒凝血测量结果；(b)使已知缺乏(即，没有)抗凝血剂的对照血液成分的样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得对照凝血因子Xa凝血测量结果；(c)使来自已知或怀疑含有逆转剂或解毒剂(例如，idarucizumab或andexanet)的患者的血液成分，在抗凝血剂的存在或缺乏下，在蝰蛇毒试剂的存在下，经历凝集测定以获得患者蝰蛇毒凝血测量结果，和(d)使来自已知或怀疑含有逆转剂或解毒剂(例如，idarucizumab和/或andexanet)的患者的血液成分，在抗凝血剂的存在或缺乏下，在凝血因子Xa试剂的存在下，经历凝集测定以获得患者凝血因子Xa凝血测量结果，和比较对照蝰蛇毒凝血测量结果和患者蝰蛇毒凝血测量结果，和比较对照凝血因子Xa凝血测量结果和患者凝血因子Xa凝血测量结果.当患者蝰蛇毒凝血测量结果和/或患者凝血因子Xa凝血测量结果小于或等于对照蝰蛇毒凝血测量结果和/或对照凝血因子Xa凝血测量结果时，则确定患者含有逆转剂，所述逆转剂已逆转了患者的抗凝血剂的抗凝血活性.在一些实施方案中，所述逆转是在患者的抗凝血剂的抗凝血活性的完全逆转.在一些实施方案中，所述逆转是在患者的抗凝血剂的抗凝血活性的部分逆转.在一些实施方案中，所述逆转剂是凝血酶原复合浓缩物(PCC)，或用于特异性逆转直接凝血酶抑制剂或凝血因子Xa抑制剂的活性物质如单克隆抗体，或肽，或可逆转直接凝血酶抑制剂和凝血因子Xa抑制剂的试剂.

在一些实施方案中，抗凝血剂是口服抗凝血剂。所述口服抗凝血剂可以是直接凝血酶抑制剂，或者可以是凝血因子Xa抑制剂。

在一些实施方案中，凝集测定是粘弹性分析凝集测定.在一些实施方案中，使用含有在容器内的样本的容器进行粘弹性分析。在一些实施方案中，使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述针相对于所述容器移动。在一些实施方案中，使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述容器相对于所述针移动.在一些实施方案中，所述容器没有底面.

在各个实施方案中，所述患者是人.在一些实施方案中，患者正经历包括手术、创伤、出血、中风或血栓栓塞事件的条件.

在一些实施方案中，对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果的范围为来自已知缺乏抗凝血剂的至少两个对照血液成分的至少两个对照样品的至少两个凝血因子Xa凝血测量结果。在一些实施方案中，对照血液成分的蝰蛇毒凝血测量结果的范围为已知缺乏抗凝血剂的至少两个对照血液成分的至少两个蝰蛇毒凝血测量结果.

在另一个方面，本发明提供了用于在怀疑有抗凝血剂的患者中检测治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法，该方法包括使来自患者的血液成分的患者样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者样品的凝血测量结果，其中所述患者样品的凝血测量结果大于已知缺乏抗凝血剂的对照血液成分的对照样品的凝血测量结果，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量存在.

在一些实施方案中，患者样品的凝血测量结果比对照样品的凝血测量结果大至少1.25倍，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量存在.在一些实施方案中，患者样品的凝血测量结果比对照样品的凝血测量结果大至少1.5倍，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量存在。

在一些实施方案中，凝集测定选自凝血酶原时间(PT)测定、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定和活化凝血时间(ACT)测定。

在一些实施方案中，凝集测定是粘弹性分析凝集测定.在一些实施方案中，使用含有位于容器内的样品的容器进行粘弹性分析。在一些实施方案中，使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述针相对于所述容器移动.在一些实施方案中，使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述容器相对于所述针移动.在一些实施方案中，所述容器没有底面。

在各个实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，患者正经历包括手术、创伤、出血、中风或血栓栓塞事件的条件。

在一些实施方案中，抗凝血剂是口服抗凝血剂.所述口服抗凝血剂可以是直接凝血酶抑制剂，或者可以是凝血因子Xa抑制剂.

还有在另一个方面，本发明提供了一种用于在怀疑有抗凝血剂的患者中分类治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法，该方法包括：(a)使来自患者的血液成分的第一患者样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者血液成分的凝血因子Xa的凝血测量结果，其中患者血液成分的所述凝血因子Xa凝血测量结果大于已知缺乏抗凝血剂的对照血液成分的对照血液样品的凝血因子Xa的凝血测量结果，则确定在患者中所述抗凝血剂以治疗相关量存在；和(b)使来自患者的血液成分的第二患者样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者血液成分的蝰蛇毒凝血测量结果；其中第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果大于对照血液成分的对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果，鉴定所述抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，并且其中所述第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果小于或等于对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果，鉴定所述抗凝血剂为抗-凝血因子Xa试剂.

在另一个方面，本发明提供用于在患者中检测和分类治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法。该方法包括使对照血液成分的对照样品(已知不包含抗凝血剂)，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得对照蝰蛇毒测量结果；和使来自怀疑有抗凝血剂的患者的血液成分样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者蝰蛇毒凝血测量结果，其中患者样品的凝血测量结果大于对照样品的凝血测量结果，表明在患者中抗凝血剂以治疗相关量或更高量存在，并将其分类为DTI。

本发明还提供了用于在怀疑有抗凝血剂的患者中检测和分类治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法。该方法包括：(a)使来自患者的血液成分的第一患者样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者血液成分的蝰蛇毒凝血测量结果，其中患者血液成分的蝰蛇毒凝血测量结果大于已知缺乏抗凝血剂的对照血液成分的对照血液样品的蝰蛇毒凝血测量结果，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量存在，并确定所述抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)；和(b)使来自患者血液成分的第二患者样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得第二患者样品的凝血因子Xa凝血测量结果；其中第二患者样品的凝血因子Xa凝血测量结果大于对照血液成分的对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量存在，并鉴定所述抗凝血剂为抗-凝血因子Xa，以及其中第二患者样品的凝血因子Xa凝血测量结果小于或等于对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果，则确定所述样品无抗凝血剂.

在一些实施方案中，患者样品的凝血因子Xa凝血测量结果比对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果大至少1.25倍，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量存在.在一些实施方案中，患者样品的凝血因子Xa凝血测量结果比对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果大至少1.5倍，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量存在.

在一些实施方案中，患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果比对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果大至少1.25倍，鉴定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI).在一些实施方案中，患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果比对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果大至少1.5倍，鉴定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI).

在一些实施方案中，抗凝血剂是口服抗凝血剂。所述口服抗凝血剂可以是直接凝血酶抑制剂，或者可以是凝血因子Xa抑制剂.

在一些实施方案中，凝集测定是粘弹性分析凝集测定.在一些实施方案中，使用含有位于容器内的样品的容器进行粘弹性分析.在一些实施方案中，使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述针相对于所述容器移动.在一些实施方案中，使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述容器相对于所述针移动.在一些实施方案中，所述容器没有底面。

在一些实施方案中，对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果是来自已知缺乏抗凝血剂的至少两个对照血液成分的至少两个对照样品的至少两个凝血因子Xa凝血测量结果。在一些实施方案中，对照血液成分的蝰蛇毒凝血测量结果的范围为已知缺乏抗凝血剂的至少两个对照血液成分的至少两个蝰蛇毒凝血测量结果.

在不同实施方案中，对确定为含有存在治疗相关量或更高量的抗凝血剂的患者施用治疗相关量的逆转剂。在一些实施方案中，所述逆转剂是凝血酶原复合浓缩物。在一些实施方案中，对确定为含有存在治疗相关量或更高量的DTI抗凝血剂的患者施用治疗相关量的逆转剂以逆转所述DTI抗凝血剂。在一些实施方案中，可逆转DTI抗凝血剂的逆转剂是idarucizumab.在一些实施方案中，对确定为含有存在治疗相关量或更高量的抗-凝血因子Xa抗凝血剂的患者施用治疗相关量的逆转剂以逆转抗-凝血因子Xa抗凝血剂。在一些实施例中，可逆转抗-凝血因子Xa抗凝血剂的逆转剂为andexanet.

附图简要说明

实施方案的前述特征通过参考以下详细描述将更容易理解，参考附图，其中：

图1是显示了凝血级联反应的示意图，该凝血级联反应导致最终由交联纤维蛋白构成的纤维蛋白凝块的形成.抗凝血因子Xa的试剂(或药物)和直接凝血酶抑制剂两者都会影响外源性和内源性途径。

图2A-2C是一系列流程图，显示了不同类型的凝集测定，其在本发明的实施方案中是有用的。图2A描绘了凝血酶原时间(PT)凝集测定；图2B显示了活化部分凝血活酶时间(APTT)凝集测定；图2C显示了活化凝血时间(ACT)测定。

图3A是示意图，其显示用TEG跟踪测量的取自正常人血液成分样品的整个凝块的生命期限.R(反应时间)和ACT(活化凝血时间)是纤维蛋白链聚合物形成的时间，K(凝血时间)是直到达到一定凝块强度后测量的时间，α(α角)是从R正切到曲线而绘制的线的斜率，和MA(最大振幅，以mm测量)是凝块的强度.LY30是裂解测量百分比，其是在直到确定MA30分钟后测量的.

图3B是表示覆盖TEG跟踪的血栓生成曲线(用绿色表示V-曲线)的示意图.从凝块阻力的变化的第一导数绘制V-曲线，凝块阻力的变化表示为每单位时间(达因/cm²/s)的凝块强度变化，代表凝块形成的最大速度.MRTG代表血栓生成的最大速率；和TMRTG代表血栓生成最大速率的时间.

图4是展示TEMogram跟踪的示意图.CT表示凝血时间，CFT表示凝块形成时间，α是α-角，λ-角是裂解速率，MCF是最大凝块硬度，和ML是最大裂解.

图5是显示凝血级联反应的阶段的示意图，其中各种蝰蛇毒试剂(其包括蝰蛇毒和类似酶)干扰级联反应.

图6是显示涉及本发明的非限制性方面步骤的决策树的示意图.首先使取自怀疑有抗凝血剂的患者的血液成分接受检测的步骤(以查看在测试血液成分中是否有抗凝血剂)，然后进行分类步骤以鉴定该抗凝血剂为DTI或抗-凝血因子Xa抗凝血剂.

表1显示了在健康供体中TEG高岭土试验的凝血参数的灵敏度，在存在或不存在蝰蛇毒时所述健康供体掺入了带有不同剂量的阿哌沙班、利伐沙班和达比加群的样品.在表1中，R-反应时间；MRTG-血栓生成的最大速率；TMRTG-血栓生成最大速率的时间。统计学显著：￥-高剂量和中剂量；-高剂量和低剂量；◇-中剂量和低剂量；*-对照.§-带有或不带有蝰蛇毒的配对样本。SDR-重复三次测量的三个独立实验的平均值的标准误差。1个符号P＜0.05；2个符号P＜0.01；3个符号P＜0.001。

表2显示了在健康供体中快速TEG试验的凝血参数的灵敏度，在存在或不存在蝰蛇毒时所述健康供体掺入了带有不同剂量的阿哌沙班、利伐沙班和达比加群的样品。在表2中，R-反应时间；MRTG-血栓生成的最大速率；TMRTG-血栓生成最大速率的时间.统计学显著：￥-高剂量和中剂量；-高剂量和低剂量；◇-中剂量和低剂量；*-对照.§-带有或不带有蝰蛇毒的配对样本.SDR-重复三次测量的三个独立实验的平均值的标准误差.1个符号P＜0.05；2个符号P＜0.01；3个符号P＜0.001。

图7A-7F是线形图.图7A-7C显示作为药物不同浓度的函数的TEG高岭土试验的R时间灵敏度的结果.图7A显示利伐沙班；图7B显示阿哌沙班；和图7C显示达比加群.图7D-7F显示作为药物不同浓度的函数的快速TEG试验的ACT时间灵敏度的结果.图7D显示利伐沙班；图7E显示阿哌沙班；和图7F显示达比加群。对所有剂量的达比加群、以及最高浓度的阿哌沙班和利伐沙班所测试的R时间分别显著高于不掺入的血液样品.对所有浓度的达比加群、以及中浓度和较高浓度的阿哌沙班和利伐沙班所测试的ACT时间显著高于不掺入的血液样品的ACT.带点的平行线显示R和ACT的正常范围.统计学意义：￥-高剂量和中剂量；-高剂量和低剂量；◇-中剂量和低剂量；*-对照.图7A-7F中，1个符号P＜0.05；2个符号P＜0.01；3个符号P＜0.001.误差棒代表重复三次测量的三个独立实验的标准误差。

图8A-8C显示在存在或不存在蝰蛇毒时，对于利伐沙班(图8A)、阿哌沙班(图8B)和达比加群(图8C)，作为药物浓度函数的TEG高岭土试验的R时间的结果的线形图。由于蝰蛇毒的存在，不论何种药物浓度，利伐沙班和阿哌沙班都显示R时间的等效和显著缩短.达比加群具有在R时间的浓度依赖性降低.带点的平行线显示对于正常供体的R的正常范围.统计学意义：￥-高剂量和中剂量；-高剂量和低剂量；◇-中剂量和低剂量；*-对照.§带有或不带有蝰蛇毒的配对样本之间的统计学显著性.误差棒代表重复三次测量的三个独立实验的标准误差。

图9A-9C是TEG跟踪和线形图，显示在标准高岭土试验中掺入了50ng/ml、200ng/ml、或500ng/ml的达比加群的血液的凝血测量结果.图9A显示了随着达比加群剂量的增加，R时间增加.图9B(其为图7C的放大图)显示掺入达比加群的血液的R时间增加，与对照(未掺入)血液的高岭土R时间相比.图9C(其为图8C的放大图)显示，在蝰蛇毒和高岭土存在下，当对达比加群-掺入血液进行凝集测定，R时间减少的结果。

图10是显示标准TEG跟踪的示意图，所述标准TEG跟踪用高岭土显示掺有50ng/ml的达比加群(粉红色，左边线)、200ng/ml的达比加群(绿色，中心线)、或500ng/ml的达比加群(白色，右边线)的血液中血栓生成的速率.

图11A-11C是显示在标准高岭土试验中掺有22ng/ml、89ng/ml、或500ng/ml的利伐沙班(凝血因子Xa抑制剂抗凝血剂)的血液的凝血测量结果的线形图。图11A显示在最高剂量的利伐沙班，R时间的增加.图11B显示与对照(未掺入)血液的高岭土R时间相比，利伐沙班-掺入血液的R时间的增加.图11C显示，在蝰蛇毒的存在下，对利伐沙班-掺入血液进行凝集测定，R时间的结果显著降低，这样即使是最高剂量，利伐沙班掺入血液的R时间比R时间(来自对照，未掺入的血液)的高岭土正常范围的下限要短。

图12是线形图，其显示在FXa试剂的存在下，来自掺入阿哌沙班(“AP”；菱形)的血液、掺入利伐沙班(“RV”；方形)的血液、和掺入达比加群(“DB”；三角形)的血液的R时间.水平虚线表示对照血液(即，取自已知不服用抗凝血剂和不掺入任何抗凝血剂的供体)的R范围。

图13是柱状图，其显示在蝰蛇毒的存在下，从掺入0ng/ml达比加群、50ng/ml达比加群、150ng/ml达比加群、或300ng/ml达比加群的所示供体的血液的R时间.水平虚线表示对照血液(无抗凝血剂的血液)的R范围。

图14是线形图，其显示在蝰蛇毒的存在下，来自四个供体的含有利伐沙班或阿哌沙班的血液的R时间.水平虚线表示对照血液(没有任何抗凝血剂)的R范围。

图15A-15C是一系列柱状图，其描绘在患者施用抗凝血剂之前和之后，从患者获得的血液的检测和分类步骤。图15A显示为“之前”样本，检测和分类R时间均在来自对照血液的正常R范围内。图15B显示，在“之后”样品中检测步骤(即，在FXa试剂的存在下)，R时间加长使得它不再处于对照血液的正常R范围内。图15C显示，在分类步骤(即，在蝰蛇毒试剂的存在下)，R时间是在正常范围内.这些结果确定了在“之后”样品中有抗凝血剂，并且该抗凝血剂是抗-凝血因子Xa抗凝血剂.

图16是一个条形图，其显示在直接凝血酶抑制剂(DTI，红色条)的存在下，R-时间延长，随后当在猪血浆样品中施用逆转剂(绿色条)，R时间缩短到基线。基线表示为蓝色条.

具体实施方案的详细描述

在一些实施方案中，本发明提供用于检测血液成分(例如，来自患者)中抗凝血剂的存在的方法和试剂(例如，杯).在一些实施方案中，本发明提供用于鉴定存在于血液成分中的抗凝血剂类型的方法和试剂.在一些实施方案中，本发明还提供了用逆转剂或解毒剂演示抗凝血作用的逆转的方法和试剂.

本文提及的出版物(包括专利出版物)、网站、公司名称和科学文献所确立的知识，是提供给那些本领域技术的人员，和在此通过引用整体以相同程度并入本文，如同每个特别地和逐一地指明通过引用并入.本文引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突应当以后者为准.

在第一方面，本发明提供用于在怀疑有抗凝血剂的患者中检测治疗相关量的抗凝血剂的方法，该方法包括(a)使对照血液成分的对照样品，已知该对照样品不包含抗凝血剂，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得对照样品的凝血测量结果；(b)使来自怀疑有抗凝血剂的患者的血液成分的患者样品，在凝血因子Xa试剂存在下经历凝集测定以获得患者样品的凝血测量结果，和(c)比较患者样品的凝血测量结果和对照样品的凝血测量结果，其中患者样品的凝血测量结果大于对照样品的凝血测量结果，表明在患者中存在治疗相关量的抗凝血剂，和其中所述患者样品的凝血测量结果小于或等于对照样品的凝血测量结果，表明在患者中缺乏治疗相关量的抗凝血剂.

在另一个方面，本发明提供用于在怀疑有抗凝血剂的患者中检测治疗相关量(或高于治疗相关量)的抗凝血剂的方法，该方法包括使来自患者的血液成分的患者样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者样品的凝血测量结果，其中患者样品的凝血测量结果大于已知缺乏抗凝血剂的对照血液成分的对照样品的凝血测量结果，表明在患者中存在治疗相关量的抗凝血剂.

凝血测量结果的延长程度取决于血液成分中口服抗凝血剂的浓度.浓度越高，与已知缺乏任何口服抗凝血剂的血液成分相比，凝血测量结果就越大.在一些实施方案中，测试血液成分的凝血测量结果比已知缺乏抗凝血剂的血液成分的凝血测量结果大至少1.25倍，则确定在所述血液成分中存在治疗相关量的抗凝血剂.在一些实施方案中，测试血液成分的凝血测量结果比已知缺乏抗凝血剂的血液成分的凝血测量结果大至少1.5倍，则确定在所述血液成分中抗凝血剂以治疗相关量存在。在一些实施方案中，测试血液成分的凝血测量结果比已知缺乏抗凝血剂的血液成分的凝血测量结果大至少1.75倍，则确定在所述血液成分中存在治疗相关量的抗凝血剂.在一些实施方案中，测试血液成分的凝血测量结果比已知缺乏抗凝血剂的血液成分的凝血测量结果大至少两倍，则确定在所述血液成分中存在治疗相关量的抗凝血剂.

在一些实施方案中，对照样品的凝血测量结果可以是平均值、中值、或来自已知缺乏抗凝血剂的至少两个对照血液成分的至少两个对照样品的至少两个凝血测量结果的范围.例如，范围(其可被称为参考范围)可以从来自多个对照血液成分的对照样品(例如，从已知缺乏抗凝血剂的多个供体)产生.如果使用平均值或均值，将多个对照样品的凝血测量结果平均，并且将平均数用作对照样品的凝血测量结果.

在一些实施方案中，本发明利用凝血测定评估凝血级联反应在患者血液成分中的作用。

凝血级联反应(或凝血级联)是一个血液从液体变为固体凝块的严密调节的过程。这个过程被称为凝结或凝血.图1提供了凝血级联反应的示意图.凝血可通过外在组织因子途径(例如，通过损伤或损坏血管)或通过内在接触活化途径被触发.这两种途径参加凝血因子Xa的激活然后激活凝血酶原到凝血酶.

所谓“血液成分”是指取自血液的一个或多个成分，例如，从患者，其中血液成分含有足够量的血浆以形成纤维蛋白介导的凝块.血液成分可以含有基于体积的至少约8％的血浆(即，8％v/v血浆)。血液成分可以含有至少约10％v/v的血浆，或至少约12％v/v的血浆，或至少约15％v/v的血浆，或至少约20％v/v的血浆.患者可以是人，但也可以是任何其他动物(例如，兽医动物或外来动物).血液是生物体的循环组织，携带氧气和营养物质到组织以及除去二氧化碳和排泄的各种代谢产物.血液包括浅黄色或灰黄色液体、血浆、在其中悬浮的红细胞、白细胞和血小板.血液(有时称为全血)能分成如下密度梯度离心的各种组件或部分.因此，血液成分，包括但不限于，全血(其可简称为血)，包括至少约10％体积血浆的白血细胞，包括至少约10％体积血浆的红血细胞，包括至少约10％体积血浆的血小板，血浆和血液的各种部分，所述血液的各种部分包括至少约10％体积血浆，该部分血浆包括血小板部分、红血细胞部分(例如，由多数的红血细胞、和少数一些白血细胞和血浆组成)、和血沉棕黄层部分(例如，由多数的白血细胞和血小板、和少数一些红血细胞和血浆组成)。血液成分还包括任一上面所列出的成分，所述成分还包括在获得来自患者血液成分后加入的物质(例如，柠檬酸或柠檬酸盐、或肝素)，以防止或减少血液成分的凝结。

所谓“抗凝血剂”是指一种防止或减少凝血(即，凝固)的物质(即，试剂或药物)，它存在于患者的血液成分，如果该物质取自患者或在从患者获得血液成分之前施用该物质到患者.此类施用可以通过任何途径包括口服、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、等。注意，在从患者获得血液成分后，被添加到血液成分中的物质(例如，肝素或柠檬酸盐)，不是该定义内的抗凝血剂.

在一些实施方案中，给患者口服抗凝血剂。口服施用的抗凝血剂可以被称为口服抗凝血剂.

所谓“逆转剂”是指逆转抗凝血剂效果(例如，逆转剂逆转由抗凝血剂产生的出血)的物质(例如，试剂、抗体、蛋白质或药物)，所述物质在患者的血液成分中存在，如果该物质取自患者或在从患者获得血液成分之前施用该物质到患者.此类施用可以通过任何途径包括口服、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、等。

在一些实施方案中，逆转剂给患者口服施用.

所谓“怀疑有抗凝血剂的患者”是指怀疑已接受抗凝血剂(例如，通过口服施用)的患者(例如，人类患者)，在从所述患者获得血液成分之前.例如，无意识的病人可能会被带入急诊室.在手术中，可以在患者血液成分的样品中进行本文描述的方法之一，通过检测血液成分样品中抗凝血剂的存在与否，以确定他/她是否已接受抗凝血剂。这个信息有助于照顾患者的需要，并能根据需要逆转抗凝血作用。来自怀疑有抗凝血剂的患者的血液成分可被称为“怀疑有抗凝血剂的血液成分”。来自怀疑有抗凝血剂的患者的血液成分的样品可被称为“怀疑有抗凝血剂的样品”.

在一些实施方案中，从其获得血液成分的患者是怀疑有出血性体质的患者.在一些实施方案中，出血性体质可能是因为包括先天性血友病条件、维生素K缺乏的任何原因.在一些情况下，出血性体质可能是因为患者摄入抗凝血剂，使得不知道是否患者有出血性体质以及是否患者无出血性体质，从而不知道为什么患者有出血性体质.使用本文描述的方法，可以确定抗凝血剂的鉴定和分类(如果病人已接受抗凝血剂)以及逆转(如果逆转剂已被施用于患者)。在一些实施方案中，患者正在经历(或即将经历)可能涉及出血的条件.例如，患者可能接受手术，可能正在准备手术，可能带伤或受伤，可能出血，或可能有过或当前具有或怀疑即将有血栓栓塞事件，包括但不限于，中风、静脉血栓栓塞事件(VTE)、心脏病发作、心脏衰竭、动脉血栓栓塞事件、肺栓塞。患者可以是创伤患者和/或可有内膜出血.

最近开发的不普遍抑制所有维生素K依赖性凝血因子的口服抗凝血剂一般可分为两类，这取决于特定凝血因子的抗凝血剂的目标.

在一些实施方案中，口服抗凝血剂是直接凝血酶抑制剂，并且可以被称为DTI。在血液凝固过程中，凝血酶(凝血因子IIa)是核心成员(见图1).凝血酶扮演多个角色，包括(a)将可溶性纤维蛋白原转化为纤维蛋白，(b)活化凝血因子VI、VIII、XI、和XIII，以及(c)刺激血小板。通过激活凝血因子XI和XIII，凝血酶产生更多的凝血酶和有利于形成交联纤维蛋白分子，从而加强血液凝块.

DTI是结合凝血酶以及阻止凝血酶与它的底物相互作用的抗凝血剂。DTIs可以是二价(在活性部位和外部位点之一阻断凝血酶)或单价(在活性部位阻断凝血酶).二价DTIs包括但不限于，水蛭素和比伐卢定。单价DTIs包括但不限于，阿加曲班、美拉加群、希美加群和达比加群.达比加群是由BoehringerIngelheimInterationalGmbH，Ingelheim商业销售，德国名为Pradaxa.达比加群是凝血酶(凝血因子IIa)的口服直接抑制剂，其“不是永久性的”，具有选择性和竞争性.在欧洲和美国达比加群被许可以减少整形外科手术患者的静脉血栓栓塞(VTE)的风险、以及非瓣膜性房颤患者的中风和系统性栓塞的风险.

在一些实施方案中，口服抗凝血剂是凝血因子Xa的抑制剂，且可被称为抗-凝血因子Xa试剂、凝血因子Xa抑制剂或xaban.在血液凝血级联反应中xaban直接作用于凝血Xa因子(见图1A)。凝血因子Xa的两个非限制性市售抑制剂是利伐沙班(商品名称X为Ito，由BayerPharmaAG，Leverkusen，Germany和JanssenPharmaceuticals，Inc.，Titusville，NewJersey销售，)和阿哌沙班(商品名称Eliquis，由Bristol-MyersSquibb，NewYork，NewYorkandPfizerEEIGSandwich，UnitedKingdom销售，).在欧洲和美国利伐沙班和阿哌沙班被许可以减少在整形外科手术患者中静脉血栓栓塞(VTE)的风险、以及在非瓣膜性房颤的患者中中风和系统性栓塞的风险。在欧盟利伐沙班也被批准用于急性冠脉综合征的二级预防。在发生冠脉事件后根据BayerPharma提供的产品信息，利伐沙班能与乙酰水杨酸(ASA)组合施用，或者与ASA加上氯吡格雷或噻氯匹定组合施用，以用于预防带有升高心脏生物标志物的成年患者的血栓事件.

凝血因子Xa的其他非限制性抑制剂包括贝曲西班(LY517717；PortolaPharmaceuticals)、darexaban(YM150；Astellas)、依度沙班(Lixiana；DU-176b；Daiichi)，TAK-442(Takeda)和伊利巴西班(PD0348292；Pfizer).

在各个实施方案中，本文描述的方法涉及凝血因子Xa试剂的使用.“凝血因子Xa试剂”是指凝血因子Xa(FXa)和/或包括凝血因子Xa的凝血因子的任意组合.凝血因子Xa试剂可以含有其他物质，其用于性能和/或稳定性的改善(包括盐、缓冲剂、糖等).在从患者获得血液成分后将凝血因子Xa试剂添加到血液成分.可替代地，凝血因子Xa试剂可以从血液成分样品中内源性凝血因子X来制备，其通过加入另一试剂如Russel的蝰蛇毒液以激活凝血因子X酶原(活性凝血因子Xa的前体)。

所谓“凝血测量”是血凝块形成的测量.能在血凝块形成期间的任何时间采取这一测量，包括但不限于，纤维蛋白初步形成的时间或血凝块达到一定水平强度的时间.如果用于确定凝血测量结果的凝集测定是血栓弹力图(TEG)测定(例如，在血栓弹力图凝血分析仪型号5000平台执行)，纤维蛋白的初步形成的时间是“R”的时间和血凝块达到一定水平的强度的时间是“K”时间.如果用于确定凝血测量结果的凝集测定是血栓弹性图(TEM)试验(例如，ROTEM平台上执行)，则纤维蛋白的初步形成时间是“反应时间(RT)”和血凝块达到一定水平的强度的时间是“凝块形成时间(CFT)”.应当指出的是，凝血测量结果可采取直接取自患者的血液成分、或用凝血活化剂如高岭土或凝血抑制剂如柠檬酸盐处理过的血液成分，其通过加入钙已适当地逆转.

所谓“凝集测定”是指可用于测量血液或血液成分形成血凝块的能力的任何类型的测定。凝血测定包括但不限于，粘弹性测定(包括血栓弹力图(TEG)测定或血栓弹性图(TEM)测定)，凝血酶原时间(PT)测定，活化部分凝血活酶时间(aPTT)测定，以及活化凝血时间(ACT)测定.

在一些实施方案中，凝集测定是凝血酶原时间(PT)凝集测定.图2A示意性地描绘凝血酶原时间(PT)凝集测定。通过添加促凝血酶原激酶试剂和钙到血浆(或其他血液成分，例如，其可以是柠檬酸化的)，所述促凝血酶原激酶试剂包含组织因子(其可以是重组的来源或来源自脑、肺或胎盘的提取物)，以及测量凝血时间，而执行PT测定法.凝血酶原时间(PT)随试剂和血凝计变化，但通常范围为10～14秒(参见Bates和Weitz，Circulation112：e53-e60，2005；White等人，“Approachtothebleedingpatient”，In：ColmanRW等人(编辑)HemostasisandThrombosis：BasicPrinciplesandClinicalPractice.3rded.Philadelphia，Pa：JBLippincottCo.1134-1147，1994).PT值可用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.PT可能是异常的(例如，可能延长)，当被测试血液含有抗凝血剂(例如，抗凝血剂口服给予血液被测试的人)，或者当被测试血液是来自缺乏凝血因子的患者(例如，凝血因子VII、X和V，凝血酶原，或纤维蛋白原的缺乏).在有纤维蛋白原-纤维蛋白转化反应的抑制剂的患者中，这个试验也为异常，包括高剂量肝素和纤维蛋白降解产物的存在.

在一些实施方案中，凝集测定是活化部分凝血活酶时间(aPTT)凝集测定.图2B示意性地描绘了涉及活化部分凝血活酶时间(aPTT)凝集测定的步骤.aPTT试验也被称为高岭土脑磷脂凝血时间测定(脑磷脂是血小板磷脂替代品)或带有高岭土的部分凝血活酶时间(PTTK)试验.aPTT通常通过首先加入表面活性剂(如，高岭土、硅藻土、鞣花酸或二氧化硅)和稀释的磷脂(例如脑磷脂)以柠檬酸盐血浆(图2B)而进行.在该试验中的磷脂被称为部分凝血活酶，因为缺乏组织因子。温育后，以允许接触因子(例如，凝血因子XII、凝血因子XI、前激肽释放酶和高分子量激肽原)的最佳活化和凝血因子IXa的产生，然后加入钙，以及测量凝血时间.因此，APTT时间是从添加钙到纤维蛋白血凝块形成所需的时间。虽然根据不同试剂(例如，表面活性剂的类型)和所使用的不同血凝计，凝血时间变化，但aPTT通常范围为22秒～40秒(参见Bates和Weitz，同上)。aPTT时间可以用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.当被测试血液含有抗凝血剂(例如，抗凝血剂口服给予血液被测试的人)，aPTT可能是异常的(例如，可能延长).随着接触因子；凝血因子IX、VIII、X或V；凝血酶原；或纤维蛋白原的缺陷，aPTT可能被延长.特异性因子抑制剂以及非特异性抑制剂，也可能延长aPTT。纤维蛋白降解产物和抗凝血剂(例如，肝素、直接凝血酶抑制剂或华法林)也延长aPTT.

在一些实施方案中，凝集测定是活化凝血时间(ACT)测定。图2C示意性地描绘了涉及活化凝血时间(ACT)测定的步骤.通常，全血被收集到含有凝血活化剂(例如，硅藻土、高岭土或玻璃颗粒)和磁力搅拌棒的管或盒中。一旦产生凝血酶，它同时诱导血小板聚集和纤维蛋白形成，然后测量取血到凝固的时间(也参见VanCott和Laposata，“Coagulation”.In：JacobsDS等人(编辑)，TheLaboratorytestHandbook，第五版Cleveland，Ohio：Lexi-Comp；2001：327-358，2001)。ACT的参考值范围在70～180秒之间.ACT值可以用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.当被测试血液含有抗凝剂(例如，向血液被测试的人口服给予的抗凝血剂)，ACT时间被延长.

在一些实施方案中，凝集测定是粘弹性测定.所谓“粘弹性分析”是指用于测量弹性固体(例如，纤维蛋白固体)和流体的特性的任何分析方法。换句话说，粘弹性分析允许研究粘性流体的性质，如血液、血浆或血液样品.在一些实施方案中，在模仿体内导致止血的条件下进行粘弹性分析。例如，所述条件可以包括模拟体温温度(例如，37℃的温度)。该条件还可以包括模仿那些在血管中发现的血流中的血凝块的形成和溶解.

在一些实施方案中，血液样品的粘弹性分析可以包括在止血分析仪上对所述血样进行分析.一个非限制性的粘弹性分析方法是血栓弹力图(“TEG”)测定.因此，在一些实施方案中，粘弹性分析包括使用血栓弹力图(TEG)对血液样品进行分析，这是由HelmutHartert在德国于1940年首次描述.

执行血栓弹力图测定的各种装置和其使用的方法，在以下美国专利公开号中被描述：Nos.5,223,227；6,225,126；6,537,819；7,182,913；6,613,573；6,787,363；7,179,652；7,732,213；8,008,086；7,754,489；7,939,329；8,076,144；6,797,419；6,890,299；7,524,670；7,811,792；20070092405；20070059840；8,421,458；US20120301967；和7,261,861，每一篇的全部公开内容在此通过引用明确并入本文.

血栓弹力图(TE)监视血液的弹性性质，因为它是在一个类似于缓慢静脉血流的低剪切环境下的诱导血凝块.发展中的血凝块的剪切弹性的变化模式使血凝块形成的动力学以及所形成凝块的强度和稳定性得以测定；总之，发展中的血凝块的机械性能得以测定.如上所述，所述血凝块的动力学、强度和稳定性提供了有关血凝块执行“机械作业”的能力的信息，即，抵抗循环血液的变形剪切应力。在本质上，血凝块是止血的基本核心.测量止血的止血仪能够测量血凝块在其结构发展中执行机械工作的能力.这些止血分析仪连续测量作为全血成分的净产品的患者止血的所有阶段，以非隔离或静态方式，从试验开始的时间直到初始纤维蛋白形成，通过凝血速率加强并通过血凝块溶解最终凝块强度.

在一些实施方案中，粘弹性分析和/或止血分析仪包括与血液接触的容器.

如本文所用，“容器”是指刚性表面(例如，固体表面)，在粘弹性分析期间的任何一点，容器的一部分接触放入容器的一部分血样。对接触血液样品部分的容器的所述部分也可称为容器的“内部”。注意，“进入容器”的阶段并不意味着该容器具有与血液样品部分接触的底面。相反，容器可以是环状结构，其中环的内侧是容器的内部，这意味着该环的内侧是接触血液样品部分的环状容器部分.血液样品可流入容器并保持在那里，例如，通过真空压力或表面张力.

还有其他类型的容器包括在这个定义中，是指那些以板和盒存在的容器(例如，微流体盒)，其中，所述板或盒具有在其中的多个通道、储存器、隧道和环.各个邻接的通道(包括，例如，通道、储存器以及环)是容器，如在本文中使用的该术语.因此，有可能在一个盒上有多个容器.美国专利NO.7,261,861(通过引用并入本文)描述了这种有多个通道或容器的盒。在粘弹性分析期间的任何时间，如果该表面接触到血液样品的任何部分，则在盒的任何通道或隧道的任何表面可以是容器的内部.

在美国专利NO.7261861、美国专利公开号NO.US20070092405和美国专利公开号NO.US20070059840中描述了一个非限制性止血分析仪.

使用血栓弹力图执行粘弹性分析的另一个非限制性止血分析仪是由Haemonetics公司(Braintree，MA)商业销售的TEG血栓弹力图止血分析仪系统.

因此，TEG分析可使用TEG血栓弹力止血分析仪系统进行，该系统测量不断发展的血液凝块的机械强度.运行该试验，将血液样品放入容器(例如，杯子或比色皿)，和将塑料针插入容器中心.与容器内壁(或加入容器中的凝块催化剂)接触引发血凝块形成。然后在TEG血栓弹力止血分析仪以振荡方式旋转所述容器，大约每10秒4.45度～4.75度，以模仿缓慢静脉血流和刺激凝血.随着纤维蛋白和血小板聚集形成，它们用塑料针连接容器内部，转移针上用于移动容器的能量.连接到针上的扭力丝测量血凝块随时间的强度，输出大小与血凝块强度成正比。随着血凝块的强度随时间增加，一个经典的TEG跟踪曲线形成(见图3A)。所描绘的曲线是从已知未服用任何抗凝血剂的正常人类患者形成的.

针的旋转运动由传感器转换成电信号，其可以由包括处理器和控制程序的计算机监测。在电信号上可操作的计算机创建对应于所测量的凝血过程的止血曲线.此外，计算机可以包括视觉显示器或连接到打印机，以提供止血轮廓的视觉表现。计算机的这种配置是本领域普通技术人员熟知的。如图3A所示，所得的止血轮廓(即，TEG跟踪曲线)是时间的测量，该时间取自所形成的第一纤维蛋白链、血凝块形成的动力学、血凝块的强度(以毫米(mm)测量)和转换为dyn/cm²的剪切弹性单位)和血凝块的溶解的时间.参见Donahue等人，J. VeterinaryEmergencyandCriticalCare：15(1)：9-16(2005年3月)，其通过引用并入本文.

对于几个这样的测量参数的描述，其中任何一种可以作为按照此处所描述方法的凝血测量结果，如下：

R是从血液放置到血栓弹力图分析仪到初始纤维蛋白形成的延迟的时间段.这通常需要约30秒～约10分钟；然而根据执行的特定TEG试验R范围会变化(例如，所测试血液成分的类型，血液成分是否柠檬酸化，等等).例如，下面的实施例1中，正常的R范围(即，在高岭土存在下来自柠檬酸盐血液成分)为约5分钟～约10分钟之间.患者在凝固性过低状态(即，降低血液凝固性的状态)，R数较长表明血凝块形成较慢，而在凝固性过高状态(即，增加血液凝固性的状态)，R数较短.本文所描述的方法中，R值(以分钟或秒为单位)，可用作非限制性的凝血测量结果.注意，在图3A，R值被标为“R/ACT”，因为当用高岭土-组织因子处理过的血液成分进行TEG试验时，有时R值被称为ACT值(活化凝血时间值)，根据以上描述的和图2C中描述的旧的活化凝血时间(ACT)试验.

K值(以分钟为单位)是从R结束直到血凝块达到20mm的时间，此K值表示凝块形成的速度。此K值通常为约0～约4分钟(即，R结束后).在凝固性过低状态下，K数较长，而在凝固性过高状态，所述K数较短.此K值可被用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果。

α角(或简称α)测量纤维蛋白积聚和交联(凝块强化)的速度。它是从分裂点切线到曲线形成的线和水平轴之间的角度.这个角度通常为约47至74

.在凝固性过低状态下，α角度较低，而在凝固性过高状态，α角度较高.这个α角度值可被用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.

MA或最大振幅以mm为单位，是纤维蛋白和血小板粘结的最大动态特性的直接函数，其代表纤维蛋白-血小板凝块的最终强度.通常，该数是从约54mm到约72mm，以及在粘弹性试验开始之后MA通常发生在约15～约35分钟之间。要注意的是，如果测试的血样具有减少的血小板功能，该MA代表仅基于纤维蛋白的凝块强度.减小的MA可能反映了凝固性过低状态(例如，血小板功能异常或血小板减少)，而增加的MA(例如，加上降低的R)可能提示凝固性过高状态。该MA值可被用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.

LY30是跟踪区域的测量-在MA后减少30分钟.LY30是在MA后30分钟内振幅下降的百分比.通常，该数为0％～约8％-按照本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.当没有发生纤维蛋白溶解，在MA跟踪的振幅值保持不变或可能由于血凝块回缩略有下降。然而，随着纤维蛋白溶解发生(例如，在凝固性过低状态)，TEG跟踪的曲线开始衰减.TEG试验在30分钟内随着最大振幅的潜在曲线下面积的所得损失称为LY30(见图3A)。LY30，在最大振幅点(表示为溶解凝块的百分比)之后裂解30分钟的百分比表示血凝块溶解的速率.

应当注意的是，能执行TEG试验的修改，如下面实施例部分所描述的改良的TEG试验.例如，下述实施例1中，快速TEG(rTEG)试验包含组织因子和高岭土以产生常规高岭土参数以及TEG-ACT参数，该试验以秒为单位.TEG-ACT相当于活化凝血时间(参见ChavezJJ.，Anesth.Analg.99：1290-1294，2004).延长的TEG-ACT时间(相对于来自正常血液成分的ACT时间)表明较慢的血凝块形成.

最后，应当注意的是，速度曲线可以来自高岭土TEG试验和快速TEG试验(加入高岭土和组织因子).这些速度曲线可以用TEG软件绘制。这些曲线代表血凝块形成的速度(MRTG，血栓发生的最大速率；TMRTG，血栓发生最大速率的时间)(见图3B).MRTG和/或TMRTG可以用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.

正越来越多地采用如TEG的设备提供的凝血粘弹性测量值，以评估达到继发休克的创伤患者的大出血，以及用于出血状态的手术患者的急性护理。将TEG广泛地用作对心脏手术和移植的患者的管理工具，并提供信息以引导血液制品的施用(参见HolcolmbJ.B.等人，Ann.Surg.256：476-486，2012)。随着肝素杯的使用，TEG能够既检测低分子量肝素又检测未分级肝素，并能说明这些药物的作用是否已经完全逆转.此外，TEG血小板映射试验用来量化包括氯吡格雷和阿司匹林的抗血小板疗法的响应，所述血小板疗法可与口服抗凝血剂组合使用.使用蝰蛇毒的TEG测定已被用于在心脏手术期间监测重组水蛭素以及比伐卢定(Koster，A.等人，J.Card.Surg.23：321-323，2008；Choi，T.S.等人，Am.J.Clin.Path.125：290-295，2006)。

可使用的另一种粘弹性止血试验是血栓弹性(“TEM”)试验。该TEM试验可使用ROTEM血栓形成凝血分析仪(TEMInternationalGmbH，Munich，德国)进行，其使用是公知的(参见，例如，Sorensen，B.，等人，J.Thromb.Haemost.，2003.1(3)：p.551-8.Ingerslev，J.，等人，Haemophilia，2003.9(4)：p.348-52.Fenger-Eriksen，C.，等人，BrJAnaesth，2005.94(3)：p.324-9).在ROTEM分析仪，将血液样品放入容器(也称为比色皿或杯)以及浸入一圆柱形针，在针和容器的内壁之间有由血液桥接的1mm的间隙.通过弹簧向右侧和左侧转动该针.只要血液是液体(即，非凝血的)，运动不受限制。然而，当血液开始凝固，随着血凝块硬度上升，血凝块越来越限制针的旋转.将针连接到光学检测器上.机械地检测该动力学以及由集成计算机计算典型跟踪曲线(TEMogram)和数值参数(见图4)。

在ROTEM血栓形成凝血分析仪中，针的运动可以由包括处理器和控制程序的计算机监控。在电信号上可操作的计算机创建对应于所测得的凝血过程的止血轮廓.此外，计算机可以包括视觉显示器或连接到打印机，以提供止血轮廓的视觉表示(称为TEMogram)。计算机的这种配置是本领域普通技术人员熟知的.如图5所示，所得到的止血轮廓(即，TEM跟踪曲线)是时间的测量，该时间取自所形成的第一纤维蛋白链、血凝块形成的动力学、血凝块的强度(以毫米(mm)测量)和转换为dyn/cm²的剪切弹性单位)和血凝块的溶解的时间.几个这些测量的参数的描述，其中任一种可用作按照此处所描述方法的凝血测量结果，如下：

CT(凝血时间)是从血液被放置在ROTEM分析仪的时间直到血凝块开始形成的延迟的时间段。该CT时间可用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.

CFT(血凝块形成时间)：从CT直到已达到20mm点的血凝块硬度的时间.该CFT时间可用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.

α-角：α角是在2mm振幅的切线的角度.该α角可用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果.

MCF(最大血凝块硬度)：MCF是跟踪的最大垂直振幅.MCF反映纤维蛋白和血小板凝块的绝对强度.MCF值可用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果。

A10(或A5、A15或A20值).该A10值描述10(或5或15或20)分钟后获得的血凝块硬度(或振幅)，并在早期阶段提供对预期MCF值的预测.任何这些A值(例如，A10)可用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果。

LI30(30分钟后的裂解指数).LI30值是在CT后30分钟时涉及MCF值的剩余血凝块稳定性的百分比.这个LI30值可用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果。当没有发生纤维蛋白溶解，在TEM跟踪上MCF振幅值保持不变或可能因血块回缩略有下降.然而，由于纤维蛋白溶解发生(例如，在凝固性过低状态)，TEM跟踪曲线开始衰减.LI30相当于来自TEG跟踪的LY30值.

ML(最大裂解).ML参数描述了在任何选定的时间点或当测试已停止时观察到的损失血凝块稳定性的百分比(相对于MCF，以％为单位).这个ML值可用作根据本文所描述方法的非限制性凝血测量结果。

因此，在TEG或TEM测定中感兴趣的参数，其中每一个可用作根据本文所描述方法的凝血测量结果，包括反映血凝块强度的血凝块最大强度。在TEG测定中这是MA值，以及以TEM测定中是MCF值.在TEG中的反应时间(R)(以秒或分钟为单位)和在TEM中的凝血时间(CT)是直到有血凝块的第一证据的时间；在TEG测试中血凝块动力学(K，以分钟测量)是指示血凝块硬度的完成的参数；和在TEG中的α或在TEM中的α-角是从血凝块反应时间点(反映血凝块发展的动力学)开始的TEG跟踪或TEM跟踪的曲线所绘制的切线的角度测量.(参见Trapani，L.M.Thromboelastography：CurrentApplications，FutureDirections”，OpenJournalofAnesthesiology3(1)：ArticleID：27628，5页(2013)；和Kroll，M.H.，“Thromboelastography：TheoryandPracticeinMeasuringHemostasis，”ClinicalLaboratoryNews：Thromboelastography36(12)，2010年12月；TEG仪的使用说明书(得自Haemonetics，Corp.)，和ROTEM仪的使用说明书(得自TEMInternationalGmbH)，所有这些文献通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，通过观察作为凝血发生的样品的不同激发水平而记录参数(及由此的凝血测量结果).例如，当容器是微流体盒或在盒中的特定通道，血液成分样品可以在共振频率被激发，并通过电磁源或光源而观察其作为凝血发生的行为.在其他实施方案中，在不激发样品的情况下，可以通过光源的变化观察到血液成分样品的凝血测量结果.

由于单个盒可以有多个容器(例如，在盒中的不同通道)，不同样品(例如，来自患者的血液成分的部分)很容易直接相互比较.例如，一个通道可以是未经处理的血样，一个通道可以是用凝血因子Xa试剂处理过的血样，以及一个通道可以是用蝰蛇毒试剂处理过的血样。在另一个例子中，来自不同个体的血液成分可以在不同的通道进行测量，以及从单一盒同时得到来自不同个体的结果。

所谓“治疗相关量”是指在被测试血液成分的抗凝血剂的量为抗凝血剂在治疗上有效的浓度范围内。对于每个抗凝血剂，治疗相关量会有所不同，并受到由患者摄入后的抗凝血剂的生物利用度以及抗凝血剂半衰期的影响.例如，达比加群有12～17小时的半衰期，其半衰期在肾功能障碍患者中被延长(BoehringerIngelheimInterationalG.Pradaxa(达比加群酯)产品信息)。阿哌沙班和利伐沙班比达比加群有更短的半衰期.然而，与健康志愿者相比，阿哌沙班在严重肾损伤患者中也有高达44％的增加的半衰期(参见Dager等人，Crit.CareMed.41：e42-46，2013).可以预期阿哌沙班或利伐沙班的抗凝血作用，在最后一次给药后存留至少10-30小时，即约两个半衰期。然而，通常，在血液(或血液成分)中抗凝血剂的治疗相关量为约75ng/ml至约为500ng/ml之间.例如，对于阿哌沙班，在血液或血液成分中治疗相关量是约275至约775ng/ml之间，或约300至约650ng/ml之间，或约400至约600ng/ml，或约500ng/ml。对于利伐沙班，在血液或血液成分中治疗相关量为约40至约350ng/ml之间，或约55至约250ng/ml之间，或约70至约150ng/ml之间，或约89ng/ml。对于达比加群，在血液或血液成分中治疗相关量为约100至约350ng/ml之间，或约150至约300ng/ml之间，或约175至约250ng/ml，或约200ng/ml.

在另一个方面，本发明提供了一种用于对来自患者的血液成分中治疗相关量或高于治疗相关量的抗凝血剂分类的方法，所述方法包括：(a)确定血液成分中抗凝血剂的存在，包括以下步骤：(i)使对照血液成分样品(已知不包含抗凝血剂)，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得对照凝血测量结果；和(ii)使来自同一供体的血液成分样品(不知是否存在抗凝血剂)，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得第二血液成分的凝血测量结果，其中所述第二样品的凝血测量结果大于第一样品的凝血测量结果，表明在血液成分中存在治疗水平的抗凝血剂，并且其中所述第二样品的凝血测量结果小于或等于第一样品的凝血测量结果，表明血液成分中不存在治疗相关量的抗凝血剂，和(b)血液成分中抗凝血剂的分类，包括以下步骤：(i)使血液成分的第二部分(已知含有抗凝血剂)，根据(a)所描述的步骤，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得第二部分的凝血测量结果；和(ii)使血液的第二部分(已知不包含抗凝血剂)，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得该部分的凝血测量结果，其中已知含有抗凝血剂的部分的凝血测量结果大于已知不包含抗凝血剂的部分的凝血测量结果，则确定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，以及其中已知含有抗凝血剂的部分的凝血测量结果小于或等于已知不包含抗凝血剂的部分的凝血测量结果，则确定该抗凝血剂为抗-凝血因子Xa抗凝血剂.

在另一个方面，本发明提供了一种用于对怀疑有抗凝血剂的患者的治疗相关量或高于治疗相关量的抗凝血剂分类的方法，该方法包括：(a)确定来自患者的血液成分中抗凝血剂的存在，包括以下步骤：(i)使对照血液成分的对照样品，已知该对照血液成分不包含抗凝血剂，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得对照样品的凝血因子Xa的凝血测量结果；和(ii)使来自患者的血液成分的患者样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者样品的凝血因子Xa的凝血测量结果，其中患者样品的凝血因子Xa的凝血测量结果大于对照样品的凝血因子Xa的凝血测量结果，表明在患者中存在治疗相关量的抗凝血剂，并且其中第二样品的凝血因子Xa凝血测量结果小于或等于对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果，表明在患者中不存在治疗相关量的抗凝血剂；和(b)对患者的抗凝血剂进行分类，其包括以下步骤：(i)使对照血液成分的第二对照样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得第二对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果；和(ii)使来自患者的血液成分的第二患者样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果，其中第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果比第二对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果更大，鉴定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，并且其中第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果小于或等于第二对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果，鉴定该抗凝血剂为抗-凝血因子Xa试剂.

在另一个方面，本发明提供了一种用于在怀疑有抗凝血剂的患者中分类治疗相关量或高于治疗相关量的抗凝血剂的方法，该方法包括：(a)使来自患者血液成分的第一患者样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者血液成分的凝血因子Xa凝血测量结果，其中患者血液成分的凝血因子Xa凝血测量结果大于已知缺乏抗凝血剂的对照血液成分的对照血液样品的凝血因子Xa凝血测量结果，则确定在患者中存在治疗相关量的抗凝血剂；和(b)使来自患者的血液成分的第二患者样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果；其中第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果大于对照血液成分的对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果，鉴定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，以及其中第二患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果小于或等于对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果，鉴定该抗凝血剂为抗-凝血因子Xa试剂.

在另一个方面，本发明提供了一种用于在怀疑有抗凝血剂(或已知有抗凝血剂)的患者中鉴定和分类治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法，该方法包括使来自患者血液成分的第一患者样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者血液成分的蝰蛇毒凝血测量结果，其中患者血液成分的蝰蛇毒凝血测量结果大于已知缺乏抗凝血剂的对照血液成分的对照血液样品的蝰蛇毒凝血测量结果，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量存在，并将它分类为DTI.在一些实施方案中，该方法进一步包括使来自已知含有或怀疑含有抗凝血剂的患者血液成分的第二患者样品，在FXa试剂的存在下经历凝集测定以获得第二患者样品的FXa凝血测量结果；其中第二患者样品的FXa凝血测量结果大于已知缺乏抗凝血剂的对照血液成分的对照样品的FXa凝血测量结果，则确定抗凝血剂以治疗相关量存在，并将其分类为FXa抑制剂，并且其中第二患者样品的FXa凝血测量结果小于或等于对照样品的FXa凝血测量结果，表明缺乏任何抗凝血剂.

在一些实施方案中，患者样品的凝血因子Xa凝血测量结果比对照样品的凝血因子Xa凝血测量结果大至少1.25倍，则确定在患者中凝血因子以治疗相关量存在.在一些实施方案中，患者样品的凝血因子Xa凝血测量结果比时照样品的凝血因子Xa凝血测量结果大至少1.5倍，或至少1.75倍，或至少2.0倍，或至少2.25倍，则确定在患者中凝血因子以治疗相关量存在.

在一些实施方案中，患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果比对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果大至少1.25倍，则确定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI).在一些实施方案中，患者样品的蝰蛇毒凝血测量结果比对照样品的蝰蛇毒凝血测量结果大至少1.5倍，或至少1.75倍，或至少2.0倍，或至少2.25倍，则确定该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂。

“蝰蛇毒试剂”是指激活凝血酶原(活性凝血酶的前体)和产生带有凝血酶类似酶活性的激活形式的分子。在一些实施方案中，蝰蛇毒试剂也包括类似蝰蛇毒的酶.图5显示一些非限制性蝰蛇毒试剂.在一些实施方案中，蝰蛇毒试剂激活凝血酶原(活性凝血酶的前体)，并来源于锯鳞蝰，Echiscarinatus的毒液.在一些实施方案中，蝰蛇毒试剂是textarin.

图6示意性示出涉及本发明的该非限制性方面的决策树.如图6所示，上述方法的步骤(a)可称为“检测”步骤.在凝血因子Xa试剂的存在下使用凝集测定，如果测试的血液成分的凝血测量结果(图6中的“R-时间”)在正常范围内(其中，正常范围是基于来自已知未服用抗凝血剂的供体的血液成分)，将获得的所测试血液成分的患者鉴定为没有抗凝血剂的患者(即，在获得测试血液样品之前，没有被施用抗凝血剂的患者).然而，如果所测试血液成分的凝血测量结果(图6的“R-时间”)不在正常范围内(例如，R-时间超过正常范围)，那么将获得的所测试血液成分的患者确定为有抗凝血剂的患者。上述方法的步骤(b)可被称为“分类”步骤(见图6).一旦测试血液成分被鉴定为从在抗凝血剂上的患者(即，施用了抗凝血剂的患者)获得，在凝集测定中使用蝰蛇毒试剂，可将抗凝血剂鉴定为DTI或抗-凝血因子Xa，这取决于凝血测量结果是否在蝰蛇毒正常范围内.如图6所示，如果凝集测定中使用蝰蛇毒的R时间是在正常范围内(即，来自已知无抗凝血剂的健康供体的血液成分在蝰蛇毒的存在下R时间的范围)，则在患者中的抗凝血剂被鉴定为凝血因子Xa抑制剂.但是，如果凝集测定中使用蝰蛇毒的R时间长于(即，超出)正常范围(即，来自已知无抗凝血剂的供体的血液成分在蝰蛇毒的存在下R时间的范围)，则将在患者中的抗凝血剂鉴定为DTI抑制剂。

在一些实施方案中，一旦患者已被确定为施用了抗凝血剂的患者，如果需要的话，可以用逆转剂治疗患者(例如，以治疗相关量)。例如，如果确定患者有达比加群抗凝血剂(DTI抗凝血剂)，可向患者施用以逆转达比加群的抗凝血作用的非限制性逆转剂是Idarucizumab(BoehringerIngelheim)。类似的，如果确定患者有凝血因子Xa抑制剂抗凝血剂，可向患者施用以逆转凝血因子Xa抑制剂的抗凝血作用的非限制性逆转剂是andexanetα(PortolaPharmaceuticals).可向患者施用以逆转DTI或凝血因子Xa抑制剂抗凝血剂的抗凝血作用的另一个非限制性逆转剂是凝血酶原复合浓缩物(PCC)(例如，商品名称为KCentra、Octaplex和Beriplex的PCC-4因子)。

应当注意的是，图6仅仅是所公开方法的实施例.在一些实施方案中，分类步骤和检测步骤同时发生。例如，如果凝集测定是用同时进行多个凝集测定的方法和设备而进行的测定(使用，例如，在美国专利No.7261861中公开的TEG方法和设备)，我们可以很容易地设想方案，其中如果单一盒包含四个通道，四个通道可包含(a)来自在凝血因子Xa试剂的存在下已知未服用抗凝血剂的供体的对照血液成分，(b)在凝血Xa因子试剂的存在下的测试血液成分，(c)在蝰蛇毒试剂的存在下的对照血液成分，以及(d)在蝰蛇毒试剂的存在下的测试血液成分.其中，对照血液成分的正常范围是预先确定的，四个通道可以是，例如，(a)无凝血因子Xa试剂的测试血液，(b)有凝血因子Xa试剂的测试血液，(c)无蝰蛇毒试剂的测试血液，和(d)有蝰蛇毒试剂的测试血液.当然，常规熟练技术人员可利用任何凝集测定来确定所需要确定的信息，所述信息为是否患者正在服用抗凝血剂，以及如果是这样，该抗凝血剂是否为DTI或抗-凝血因子Xa抗凝血剂.

提供以下实施例，其是为了说明而不是限制本文描述的本发明的各种实施方案.

实施例1

用TEG凝集试验来确定，是否达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的低、正常和高剂量在掺有这些化合物的血液中能被检测出。将3种口服抗凝血剂(OAC)，即达比加群、利伐沙班和阿哌沙班，掺入到获得自14名健康志愿者人类供体的血液中。对于每个测试的OAC，向来自三个供体的柠檬酸盐血液掺入三种不同浓度的活性药物(即，化合物).用使用高岭土和试剂(Haemonetics)的止血分析仪(HaemoneticsCorporation，Braintree，MA，USA)对掺入活性药物的血样和掺有稀释剂的对照样品进行测试。每个样品重复三次运行.将带有和不带有蝰蛇毒(购买自EnzymeResearchLaboratories，SouthBend，IN)的所有样品进行测试.本研究得到IRB的许可，所有捐助者超过18岁，并签署知情同意书.

样品制备

使用标准静脉穿刺技术和带有21号针头的BectonDickinson真空采血管按钮收集装置抽取血液。血液中掺入活性药物并在抽取两个小时内进行测试.

通过在0.1M的HCl中溶解和进一步以1∶1的DMSO∶H₂O稀释，从活性达比加群部分(Alsachim，法国)制备达比加群储备液.在掺有达比加群储备液的柠檬酸盐血液的0.1MHCl/DMSO/H₂O管中，用于掺入血液的最终储备液有20ng/pL的浓度，以创建终浓度为500、200和50ng/mL的柠檬酸盐全血.

在美国达比加群被批准，用于在下述选择性膝关节或髋关节置换中预防静脉血栓栓塞(VTE)(无肾功能损害的患者220mg/天，和中度肾功能损害的患者150mg/天)，以及用于在带有肾功能损害和房颤(AF)的患者中预防中风(75mg/天的降低剂量).(BoehringerIngelheimInterational，达比加群酯产品和处方信息)达比加群的150mg口服剂量有110ng/mL的最大血浆浓度(C.).(参见Stangier等人，Clin.Pharmacokinet.47；285-295，2008；Mueck，W.，等人，ThrombosisJournal11：10(2013)。

通过在1∶1的DMSO∶H₂O溶液中搅拌20mg拜瑞妥片剂(Jannsen，Titusville，NJ)制备利伐沙班储存液，其中在1∶1的DMSO∶H₂O中将利伐沙班稀释至20ng/μL的终浓度。向含柠檬酸盐血液的管掺入该利伐沙班储存液以创建终浓度为500、89和22ng/mL的柠檬酸盐全血。利伐沙班被批准在患有非瓣膜性AF的成人中用于预防中风和系统性栓塞(20mg/天；欧盟和美国)，在成年患者中对深静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)的治疗以及对复发性DVT和PE的预防(15mg，每天两次，连续3周，随后20mg/天；欧盟和美国)(参见Wong等人，J.Thromb.Haemost.6：820-829，2008；JanssenPharmaceuticals，利伐沙班的处方信息).利伐沙班的10mg口服剂量为141ng/mL的Cmax(参见Mueck，W.，等人，ThrombosisJournal11：10，2013；KubitzaD.等人，ClinPharmacolTher.78：412-421，2005)。以类似的方式从2.5mg的Eliquis片剂(Bristol-MyersSquibb，NewYork，NY)制备阿哌沙班储存液，所述储存液在全血中最终浓度为1000、500和250ng/mL.阿哌沙班被批准用于预防在选择性髋关节或膝关节置换手术中的VTE(2.5mg的BID)和在非瓣膜AF的患者中预防中风和系统性栓塞(5mg的BID)(参见Bristol-MyersSP，EEIG.阿哌沙班的产品特性概要).阿哌沙班的20mg的口服剂量为460ng/mL的Cmax(参见Mueck，W.，等人，ThrombosisJournal11：10，2013；RaghavanN等人，DrugMetabDispos.37：74-81，2009)。对于每个测试药物，制备对照样品，包括只含有柠檬酸盐血液的溶剂对照，和用于稀释药物储存液的稀释剂，以及无掺杂的柠檬酸输血导管.

血栓弹力图

在TEG-5000分析仪(HaemoneticsCorp.，Braintree，MA，USA)上用高岭土样品瓶、0.2M的CaCl₂、RapidTEG(rTEG)样品瓶、稀释用水、和制造商(Haemonetics，Braintree，MA)提供的一次性透明杯和针、以及蝰蛇毒(EnzymeResearchLaboratories，SouthBend，IN)进行测试.在每个剂量上重复三次执行所有测试，并允许继续直到达到所定义的MA(最大振幅)参数.图3A示出了TEG跟踪的各种组分。高岭土测试产生的R参数，它以分钟测量，它是从试验开始直到凝血的发生提供了足够阻力以在TEG跟踪上产生2mm振幅读数的点所经过的时间.这个参数代表有关的酶的凝血因子功能的凝血的起始阶段.R参数对高岭土有5～10min的正常范围.延长的R时间显示较慢的凝块形成.K是从分裂点到纤维蛋白交联提供足够的凝块阻力以产生20mm振幅读数的点的时间间隔的测量结果.α角是通过从R到K时间跟踪的切线的斜率和用角度表示的中心线所形成的角度。K时间和α角表示凝块增强的速率，和代表可用的纤维蛋白原变成纤维蛋白的凝血酶裂解。MA表示凝块强度达到其最大振幅的点，在TEG跟踪上以毫米测量，并反映通过GPIIb-IIIa受体的最大血小板-纤维蛋白相互作用的最终结果(参见KhuranaS等人，JLabClinMed.130：401-411，1997).

RapidTEG(rTEG)试验引入组织因子和高岭土，以产生常规高岭土参数以及TEG-ACT参数，其以秒为单位测量.TEG-ACT相当于活化凝血时间(参见ChavezJ.J.等人，Anesth.Ahalg.99：1290-1294，2004)，并有86至118秒的正常范围.延长的TEG-ACT时间显示较慢的凝块形成。此外，用TEG软件绘制来自于上述高岭土和rTEG试验的速度曲线.这些曲线代表血块传播的速度(MRTG，血栓发生的最大速率；TMRTG，血栓发生最大速率的时间)(见图3B).

对于高岭土试验，1mL柠檬酸盐血液样品与高岭土混合，以及将340微升(μL)的该血液加入含有20μL的0.2MCaCl₂的TEG杯中用于复钙.使用20μL的蝰蛇毒/CaCl₂溶液(0.16M的CaCl₂；19EU/mL的蝰蛇毒)，以类似的方式进行带有蝰蛇毒的高岭土试验。

对于RapidTEG(rTEG)试验，试剂用20μL稀释用水重构，并按照制造商说明将其静置5分钟.将10μL的此重构试剂加入到含有20μl的0.2MCaCl₂的TEG杯中用于复钙.

将340微升的柠檬酸盐血液样品加入到带有这两个试剂的杯子，以及通过向上吸取杯的内含物到移液管和重分散它到杯中而将杯的内含物混合3次.混合后测试立即开始，使之运行直到已定义的MA参数出现.和上述rTEG试验一样，使用20μL的蝰蛇毒/CaCl₂溶液(0.16MCaCl₂；19EU/mL的蝰蛇毒)，进行带有蝰蛇毒的rTEG试验.

统计学分析

用双尾学生t检验完成统计学分析.对于所有分析，P值＜0.05被视为统计学显著.

结果：

高岭土试验的结果显示于表1和图7A、7B和7C。

表1显示了在蝰蛇毒存在或缺乏下TEG高岭土测试健康供体掺杂样本的凝血参数的灵敏度，所述健康供体群本掺入了不同剂量的阿哌沙班、利伐沙班和达比加群的样品。在表1中，R-反应时间；MRTG-血栓生成的最大速率；TMRTG-血栓发生最大速率的时间.统计学意义：￥-高剂量和中剂量；-高剂量和低剂量；◇-中剂量和低剂量；*-对照.§-带有或不带有蝰蛇毒的配对样本.SDR-重复三次测量的三个独立实验的平均值的标准误差.1个符号P＜0.05；2个符号P＜0.01；3个符号P＜0.001.

在高岭土测试中R、K、α和MRTG参数只对较高浓度的利伐沙班实现统计学意义(表1，图7A)，但能够检测出阿哌沙班(P＜0.045)(表1，图7B)和达比加群(P＜0.038)(表1，图7C)的所有测试浓度的存在.此外，对于所有药物，TMRTG参数在对照组与所有测试浓度之间有统计学差异。此外，对于达比加群样品的R、α和TMRTG参数，在所有浓度之间显著不同，表明有适当的剂量反应(表1，图7C)。最后，与对照相比，通过加入所研究的NOAC，对于利伐沙班和达比加群，来自高岭土试验的MA值没有变化，说明在血小板/纤维蛋白贡献凝块强度上这些试剂缺乏效果。然而，在250ng/mL浓度上的阿哌沙班跟踪表明，MA显著不同于对照组(P＜0.001)，但仍然在正常范围内(数据未显示).

表2显示了在蝰蛇毒存在或缺乏下快速TEG测试健康供体的凝血参数的灵敏度，所述健康供体掺入了带有不同剂量的阿哌沙班、利伐沙班和达比加群的样品。在表2中，R-反应时间；MRTG-血栓生成的最大速率；TMRTG-血栓发生最大速率的时间。统计学意义：￥-高剂量和中剂量；-高剂量和低剂量；◇-中剂量和低剂量；*-对照.§-带有或不带有蝰蛇毒的配对样本.SDR-重复三次测量的三个独立实验的平均值的标准误差。1个符号P＜0.05；2个符号P＜0.01；3个符号P＜0.001.

在RapidTEG测试中，对于所有测试药物的TEGACT参数，在对照组和所有测试浓度的利伐沙班、阿哌沙班以及达比加群之间显著不同.该测试的结果显示在表2和图7D、7E和7F，22ng/mL浓度的利伐沙班(P＝0.576)除外(见表2，图7D)。

此外，TEGACT参数能够在利伐沙班的浓度(结果见表2和图7D)和达比加群(表2，图7F)的浓度之间区分，表明有良好的剂量响应曲线.对来自RapidTEG测试的阿哌沙班和利伐沙班两者的K、α和MRTG参数，没有在对照之间或所研究浓度(见表2)之间显示任何统计学差异。然而，对于达比加群组的K参数在较低测试浓度(200ng/mL，P＝0.003；50ng/mL，P＝0.003)与对照有统计学差异，但在500ng/mL的浓度没有统计学差异(P＝0.438)，以及来自达比加群组的α参数在500ng/mL(P＜0.01)和50ng/mL(P＜0.001)浓度与对照有统计学差异，但在200ng/mL浓度没有统计学差异(P＝0.383)(表2).此外，k和α这两个参数都能够区分最高达比加群浓度和其他浓度(500ng/mLvs200ng/mL，P＝0.002；500ng/mLvs50ng/mL，P＜0.001)(表2).此外，MRTG参数对达比加群的两个最低浓度(500ng/mL，P＝0.061；200ng/mL，P＝0.0015；50ng/mL，P＜0.001)敏感.来自RapidTEG试验的TMRTG参数对利伐沙班和达比加群两者的存在敏感，但对阿哌沙班的存在不敏感(表2).此外，TMRTG参数能够在达比加群的浓度之间区分(500ng/mLvs200ng/mL，P＜0.001；200ng/mLvs50ng/mL，P＜0.001)(表2)。最后，与对照相比，通过所研究药物浓度的加入，对利伐沙班和阿哌沙班的RapidTEG试验的MA值没有变化，以及只有达比加群500ng/mL浓度的MA值显著不同于对照组(P＜0.01)，但是仍然在正常范围内(数据未显示).

蝰蛇毒来源于锯鳞蝰(Echiscarinatus)的毒液.蝰蛇毒激活凝血酶原(凝血酶的前体-见图5).通过蝰蛇毒活化凝血酶原产生meizothrombin，它是具有低水平的促凝血酶活性的凝血酶原-凝血酶中间体.

如在表1以及图8A-8C中可以看出，将蝰蛇毒加入高岭土试验在对照组和处理组中均引起R、K和TMRTG值的显著减少(阿哌沙班P＜0.001；利伐沙班P＜0.003；达比加群P＜0.004)，以及在处理组和对照组中均引起α和MRTG值的显著增加(阿哌沙班P＜0.001；利伐沙班P＜0.008；达比加群P＜0.008)(见表1)。此外，在抗-凝血因子Xa药物(也简单称为抗-Xa药物)存在下，将蝰蛇毒加入高岭土试验，严重降低R值到来自对照的无统计学差异的凝固性过高范围(＜5min)，除了较高的研究剂量(阿哌沙班：1000ng/mL，P＝0.026；500ng/mL，P＝0.756；250ng/mL，P＝0.054)，利伐沙班(500ng/mL，P＝0.0017；89ng/mL，P＝0.079；22ng/mL，P＝0.898)，而在达比加群的存在下，只有与剂量相关的减小的R(表1，也见图8C).相对于没有蝰蛇毒而操作的样品，对于达比加群或利伐沙班，向高岭土试验加入蝰蛇毒并没有改变样品的MA值，但在阿哌沙班的存在下，相对于没有蝰蛇毒而操作的样品，MA值有统计学差异(1000ng/mL，P＝0.020；500ng/mL，P＝0.009；250ng/mL，P＜0.001)，但仍然在正常范围内(数据未显示).

如在表2中可以看出，将蝰蛇毒加入RapidTEG试验显著降低了对于抗-Xa和DTI药物(阿哌沙班，P＜0.001；利伐沙班，P≤0.001；达比加群，P＜0.001)的TEG-ACT时间，也显著降低了在增加凝固性过高状态的利伐沙班和达比加群(利伐沙班，P＜0.001；达比加群，P＜0.001)的存在下的TMRTG时间(见表2).另一方面，当在利伐沙班或阿哌沙班的存在下加入蝰蛇毒，对于任何所研究的浓度，RapidTEG的α角没有发生变化.然而，对于达比加群的最低浓度有下降的角度值(200ng/mL，P＝0.047；50ng/mL，P＝0.016)(表2).当加入蝰蛇毒时，对于阿哌沙班的最高和最低浓度(1000ng/mL，P＝0.017；250ng/mL，P＝0.17)以及利伐沙班的中浓度(89ng/mL，P＝0.044)，RapidTEG的K值显著下降，但在达比加群的中浓度(200ng/mL，P＝0.004)，所述K值增加了.最后，将蝰蛇毒加入RapidTEG试验仅显著降低200ng/mL浓度的达比加群的MA值(P＜0.05)，但这仍然在正常范围内(数据未显示).

实施例2

健康志愿者(没有施用任何抗凝血剂)捐献的血液.捐献后，从供体收集的血液(其中加入柠檬酸盐以防止凝血)被分成几个部分，而血液的着几个部分或没有掺入任何物质，或掺入达比加群，或掺入利伐沙班.然后所述部分用thromboegraphy试验，所述试验包括在蝰蛇毒的存在下执行的试验.

在这些研究中，从三个健康人类志愿者收集血液.对于每一剂量，运行三次血栓弹力图试验，并且所报告的数字指示平均结果.所使用的直接凝血酶抑制剂是达比加群.达比加群的储存液为1mlDMSO+750μl生理盐水(0.9％NaCl)+1mg活性达比加群部分.所用的抗-凝血因子Xa药物是利伐沙班。利伐沙班的储存液是溶解于1ml生理盐水加9mlDMSO的20mg片剂.

使用达比加群和利伐沙班的三个剂量，也就是低剂量、正常剂量和高剂量.对于达比加群，低剂量为50ng/ml，正常剂量为200ng/ml，以及高剂量为500ng/ml。对于利伐沙班，低剂量为22ng/ml，正常剂量为89ng/ml，以及高剂量为500ng/ml.

图9A显示了对掺入有50ng/ml的达比加群(红线)、200ng/ml的达比加群(绿线)和500ng/ml的达比加群(黑线)的血液成分的高岭土TEG跟踪.如在图9A中可以看出，达比加群的存在以剂量依赖性的方式增加所测试血液成分的R值.图9B是所述掺入血液成分的R值图，与对照血液成分(即，取自已知不服用抗凝血剂的志愿者以及志愿者的血液中未掺入抗凝血剂)的R值相比。注意，图9B是图7C的放大图。图9B显示，对照血液的R值的参考范围是约5分钟至约10分钟之间，其中平均R值是约7.9分钟.达比加群(50ng/ml)的最低剂量产生在正常(即，对照)参考范围之外的R值.有趣的是，当用蝰蛇毒处理血液成分，达比加群-掺入血液的R值被缩短并且接近正常参考范围(见图9C).注意，图9C是图8C的放大图.

图10显示了达比加群的存在降低了达到血栓生成的速率和时间。这些结果反映在下面的表3中，测量掺入血液的MRTG(mm/min)和TMRTG(min).(见图3B，其为了说明这些参数)。

表3

达比加群(ng/ml)	MRTG(mm/min)	TMRTG(min)
			500	7	22
200	12	18
			50	13	13

图11A显示了对掺有22ng/ml利伐沙班(红线)、89ng/ml利伐沙班(绿线)和500ng/ml利伐沙班(黑线)的血液成分的高岭土TEG跟踪.如在图11A中可以看出，高剂量的利伐沙班的存在以剂量依赖性的方式增加所测试血液成分的R值.图11B是利伐沙班-掺入血液成分的R值图，与对照血液成分(即，取自已知不服用抗凝血剂志愿者以及志愿者的血液中未掺入抗凝血剂)的R值相比.图11B显示，对照血液的R值的参考范围是约5分钟至约10分钟之间，其中对照R值是约8.2分钟。利伐沙班(500ng/ml)的最高剂量产生在正常(即，对照)参考范围之外的R值，而较低的两个剂量在对照参考范围之内.有趣的是，当用蝰蛇毒处理血液成分，利伐沙班-掺入血液的R值被显著缩短并且所有三个剂量水平下降到对照参考范围之外(见图11C)。

实施例3

运行该方法以确定TEG是否可用于鉴定血液成分中抗凝血剂的存在.

使用FXa或蝰蛇毒试剂在止血分析仪上分析血液，所述血液来自已知未服用任何口服抗凝血剂和没有其他任何显著健康问题的健康志愿者.

FXa试剂(即凝血因子Xa试剂)用于检测被测试血液成分中抗凝血剂的存在(或缺乏)。缺乏任何口服抗凝血剂，FXa试剂将加速凝血过程，并导致很短的R-时间.在直接凝血酶抑制剂和/或抗-凝血因子Xa抗凝血剂(多个)存在下，该过程减慢，并会造成R-时间的延长。R-时间的这种差异被用于检测口服抗凝血剂的存在。

如果之前和之后的血液样品是可用的，那么将R-时间的显著差异用于检测存在.然而，在一个实际患者群中，假定之前(药物)的样品不容易获得.在这样的情况下，从健康群体样品产生的参考范围将用于检测。如果来自血液样品的R-时间是在正常范围内，那么可以得出结论，没有口服抗凝血剂的存在.如果R-时间超出该范围，那么结果将指示在该人/供体中存在口服抗凝血剂。

蝰蛇毒试剂用于分类抗凝血剂的类型。来自蝰蛇毒试验的R-时间是用于在两个可用类别(直接凝血酶抑制剂和抗-Xa抑制剂)之间区分.该蝰蛇毒试剂可以与来自FXa试剂的结果组合使用以做出决定。对这个试剂的参考范围将从健康志愿者群体样本(无任何药物)产生.

根据本发明的该非限制性实施方案，如果FXa试剂指示口服抗凝血剂的存在，则将针对用于分类目的的蝰蛇毒参考范围来分析蝰蛇毒试剂的R-时间.如果R-时间在蝰蛇毒正常范围，则存在的抗凝血剂将是抗-Xa.R-时间超出(蝰蛇毒正常)范围将指示直接凝血酶抑制剂的存在.

从多个供体产生的R-时间被用来构建参考范围。血液中以不同浓度掺入直接凝血酶抑制剂或抗-Xa(s)，并使用FXa试剂或蝰蛇毒试剂进行分析.所选择的药物浓度代表这两个类别药物所公布的治疗范围.该试验在多个供体中重复以考虑可能的供体变化.

图12显示了在FXa试剂的存在下R时间的参考范围(以分钟计).图12中的虚线代表对FXa试剂的正常参考范围(即，在FXa试剂的存在下，已知缺乏抗凝血剂的血液成分的R时间).缺乏任何口服抗凝血剂的R-时间将落入该范围内(即，将低于约1.8分钟).在图12中，AP和RV分别表示阿哌沙班和利伐沙班，并且是两个非限制性抗-Xa药物的代表.在图12中，非限制性直接凝血酶抑制剂(DTI)由DB或达比加群表示。在体外，来自相同供体(其已知未施用抗凝血剂)的血液掺入抗-Xa药物之一(即，AP或RV)或掺入直接凝血酶抑制剂(即，DB)，与参考范围相比，导致R-时间的剂量依赖性延长.

在一些实施方案中，对照血液的参考范围(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在FXa的存在下为约1.0分钟至约2.0分钟之间，在一些实施方案中，对照血液的参考范围(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在FXa的存在下为约1.5min至约1.9min之间。在一些实施方案中，对照血液的参考范围(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在FXa的存在下是约1.8分钟.

如图12所示，相对于上述大约1.8分钟的参考范围，在血液成分中100ng/ml浓度的药物(其中，该量是AP、RV和DB的治疗相关量)提高R时间至少1.25倍、或至少1.5倍，或至少1.75倍，或至少2倍。

使用蝰蛇毒试剂，可以在血液成分中使用血栓弹力图检测直接凝血酶抑制剂抗凝血剂的存在.图13显示了对来自四个供体的血液成分的R时间测量，所述供体的血液(从供体被收集之后)中掺入了指定量的达比加群，并在蝰蛇毒试剂的存在下用血栓弹力图测量.R时间(以分钟计)与无口服抗凝血剂的供体血液(其已知未施用抗凝血剂)获取的R时间对比，所述血液用蝰蛇毒试剂处理并使用血栓弹力图测量.

在一些实施方案中，对照血液的参考范围(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在蝰蛇毒试剂的存在下是约1.0分钟至约3.5分钟之间。在一些实施方案中，对照血液的参考范围(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在蝰蛇毒试剂的存在下是约1.5分钟至约3.25分钟之间.在一些实施方案中，对照血液的参考范围(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在蝰蛇毒试剂的存在下是约1.9分钟至约3分钟.在一些实施方案中，对照血液的参考范围(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在蝰蛇毒试剂的存在下是约3.1分钟。

如图13所示，特定供体的参考范围可以变化.例如，供体126具有低的未处理R-时间(即，当来自供体126的血液不掺入DB)。用50ng/ml的DB掺入供体126的血液中，并在蝰蛇毒试剂的存在下使用血栓弹力图测量R时间，导致R时间的增加，即R时间比未掺入供体血液126(即，未经处理或对照血液)的未处理R时间长两倍。如图13所示，与其他供体以及与来自同一供体的未掺入血液对比，这是真的。此外，使用约3.1分钟的R时间作为集体参考范围时，来自供体117、127、和146的血液掺入50ng/ml的DB(其低于DB的110ng/ml的治疗相关量，参见Muek等人，supra)，在蝰蛇毒的存在下，大于3.1分钟的参考范围的至少1.25倍、或至少1.5倍.当看到150ng/mlDB的R时间(这是DB的治疗相关量)，来自所有四个供体的掺入血液有超过3.1分钟的集体参考范围至少1.25倍或至少1.4倍的R时间(在蝰蛇毒的存在下).

使用蝰蛇毒试剂，可以使用血栓弹力图检测在血液成分中抗-凝血因子Xa的抗凝血剂药物的存在.

图14显示了来自四个供体的血液成分的R时间测量结果，所述供体的血液(在收集之后)中掺入了指定量的利伐沙班(抗-凝血因子Xa药物)，并在蝰蛇毒试剂的存在下用血栓弹力图测量。R时间(以分钟计)与无口服抗凝血剂的供体血液(其取自已知未施用抗凝血剂的患者)获取的R时间对比，所述血液用蝰蛇毒试剂处理并使用血栓弹力图测量.

在图14所执行的测定中，对照血液的R时间(以分钟计)(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在蝰蛇毒的存在下为约1分钟至约4.5分钟之间(数据未显示)。在一些实施方案中，对照血液的参考范围(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在蝰蛇毒的存在下是约3.9分钟至约4.2分钟之间.在一些实施方案中，对照血液中的参考范围(即，取自未施用过抗凝血剂的供体)在蝰蛇毒的存在下是约4.1分钟.

如图14所示，血液成分中RV药物的浓度在50～350ng/ml变化(其中，这代表RV的治疗相关量)导致在约1至4.1分钟的参考范围内的R时间.需要注意的是，对照血液的R时间的参考范围将取决于获取血液的患者.在一些实施方案中，RV-掺入血液的R时间比对照血液的R时间的上限小或慢至少1.25倍、或至少1.5倍、或至少1.75倍，或至少2倍.

在另一种抗-凝血因子Xa药物，即阿哌沙班(数据未显示)中发现类似的结果.

在图14中的这些结果显示蝰蛇毒可用于分类作为凝血因子Xa分子的抗凝血剂。

实施例4

用凝血因子Xa试剂和蝰蛇毒检测和分类抗凝血剂。

在志愿者口服给予抗凝血剂之前和之后，以凝血因子Xa和蝰蛇毒用血栓弹力图对来自单个人类志愿者的血液进行分析.

在这些研究中，使用已知未接受任何抗凝血剂的多个供体对特定试剂的正常范围(即，凝血因子Xa或蝰蛇毒)进行测定.

已知人类志愿者未服用(即没有被施用)抗凝血剂.在本实施例中，在志愿者被施用任何抗凝血剂之前从志愿者获取血液.这是“之前”血液成分样品.向志愿者口服施用20mg的利伐沙班(抗-凝血因子Xa抗凝血剂).口服施用利伐沙班2小时30分钟后，从志愿者重新采血.这是“之后”血液成分样本.

在凝血因子Xa的存在下或在蝰蛇毒的存在下，使用血栓弹力图分析“之前”和“之后”的样品.当在凝血因子Xa的存在下确定R时间，该时间称为检测时间。当在蝰蛇毒的存在下确定R时间，该时间称为分类时间.

图15A显示“之前”分析的结果(即向供体施用抗凝血药物之前取得的R时间).图15A中，实心水平线在约1.5分钟(在检测时间)和实心水平线在约4.1分钟(在分类时间)指示对凝血因子Xa和蝰蛇毒的参考范围的上限，分别由从已知未接受抗凝血剂的多个人类供体(即，对照供体)而确定.如图15A所示，在志愿者的血液中没有任何抗凝血药物(即，在“之前”血液样本中)的情况下，对检测试剂(即，FXa)的R-时间落在检测时间的正常范围内(即低于水平线)。由于R时间是在正常范围内(即，来自已知未接受抗凝血剂的对照供体的血液的范围内)，这些发现证实了在志愿者的血液中不存在任何抗凝血剂(也见图6中的决策树)。

图15B显示在FXa试剂的存在下使用血栓弹力图对“之前”和“之后”分析的结果(即，“之后”分析是在供体已施用抗凝血剂药物后所取得的R时间).供体患者口服给予20mg利伐沙班(抗-Xa药物)2小时30分钟之后采血.如在图15A中，在FXa试剂的存在下，约1.5分钟的水平线是来自已知未接受抗凝血剂的多个供体的参考范围(即，这是检测时间的参考范围)的上限。如图15B所示，“之前”检测时间是在约1.5分钟的参考范围内(即，短于所述参考范围)。然而，“之后”检测时间(即，供体口服给予利伐沙班2.5小时后)在1.5分钟的参考范围之外.事实上，“之后”检测时间是大约4.4分钟；因此在本研究中，“之后”检测时间是1.5分钟的R时间参考范围的2.93倍。“之后”检测时间(R时间)在检测时间的参考范围之外表明抗凝血剂的存在(参考图5).

图15C显示在蝰蛇毒试剂的存在下使用血栓弹力图对“之前”和“之后”分析的结果(即，“之后”分析是在供体已施用抗凝血剂药物后所取得的R时间).供体患者口服给予20mg利伐沙班(抗-Xa药物)2小时30分钟之后采血.如在图15A中，在蝰蛇毒试剂的存在下，约4.1分钟的水平线是由来自已知未服用抗凝血剂的多个供体所确定的参考范围(即，这是对分类时间的参考范围)的上限.如图15C所示，因为志愿者的“之后”血液的R结果在对照血液的蝰蛇毒参考范围之内(即，来自已知未服用抗凝血剂的供体血液)，将志愿者血液中的抗凝血剂鉴定为抗-凝血因子Xa试剂，并鉴定为不是直接凝血酶抑制剂(也参见图6中的决策树).

因此，在图15A-15C中，使用FXa试剂和蝰蛇毒试剂与血栓弹力图凝集测定相结合，分析接受(即，施用)抗凝血剂的志愿者血液，能够确认(a)志愿者接受抗凝血剂(与对照血液相比，在凝血因子Xa的存在下，通过检测时间中增加的R时间证明)和(b)志愿者所接受的抗凝血剂是抗-凝血因子Xa试剂，并不是直接凝血酶抑制剂试剂(在蝰蛇毒的存在下，通过对照血液的参考范围内的R时间证明).

实施例5

新的口服抗凝血剂(OAC)不需要常规监测，然而可能需要在临床情况下，如创伤和紧急手术，测量药物水平.没有对达比加群建立临床或实验室的全血测定。通过改变止血参数，血栓弹力图在检测和下述的达比加群中已经显示出可喜的成果.

用新一代全自动系统，本研究评估达比加群的作用以及它的特异性逆转剂。

系统(Haemonetics公司，Braintree，MA)是基于使用共振频率和一次性多通道的微流体盒的粘弹性测量。来自健康志愿者的血液和血浆掺有在治疗范围内的达比加群(以递增的浓度)，并用基于蝰蛇毒的OAC盒测试，直接凝血酶抑制剂(DTI)通道。该通道也评估来自实验创伤模型的猪血浆(N＝6)，其中达比加群水平用稀释的TT测量。TEG6s的R-时间(反应时间)与药物水平相关.

结果：体外：R-时间与全血中的达比加群水平高度相关(R²＞0.95).在血浆中也观察到显著相关性(R²＞0.6).

创伤模型：R-时间与达比加群的血浆水平显著相关(R²＝0.7)。在基线上的R-时间为(3.4±0.6min，n＝4).达比加群给药后，观察到创伤之前和之后的R-时间显著延长(R-时间＞21±5.9min).逆转剂idarucizumab的给药使R-时间回到基线(3.6±0.6min).

表4总结了如何对来自不同通道的R时间进行分析，以检测和分类抗凝血剂。

表4

图16所示的条形图显示在五个独立的猪血浆样品中，在DTI抗凝血剂的存在下，R时间如何延长(红色条)；然而，当idarucizumab逆转剂给药时，R时间(绿色条)回到基线(蓝色条).因此，当使用本文所描述方法对样品分析时，样品中的抗凝血剂的鉴定和分类允许该抗凝血剂的选定逆转.

结论：在临床环境，具有在止血系统中有效测量全血以及血浆中的达比加群的效果的潜力.这种新颖的技术是完全自动化的，并在短短5分钟内能提供对全血的临床相关结果。

如上所述的本发明的实施方案仅是示例性的；对本领域那些技术人员而言许多变化和修改将是显而易见的。所有这些变化和修改的目的是在本发明的范围内，如任何所附加的权利要求所限定的。

Claims

1.一种在怀疑有抗凝血剂的患者中检测治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法，该方法包括

a)使已知不包含抗凝血剂的对照血液成分的样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得对照凝血因子Xa的凝血测量结果；和

b)使来自怀疑有抗凝血剂的患者的血液成分的样品，在凝血因子Xa试剂存在下经历凝集测定以获得患者的凝血因子Xa的凝血测量结果，

其中患者凝血因子Xa凝血测量结果大于对照凝血因子Xa凝血测量结果，表明在患者中所述抗凝血剂以治疗相关量存在，并且其中所述患者凝血因子Xa凝血测量结果小于或等于对照凝血因子Xa凝血测量结果，表明在患者中不存在治疗相关量或更高量的抗凝血剂。

2.权利要求1所述的方法，还包括对确定为在患者中以治疗相关量或更高量存在的抗凝血剂分类，包括：

a)使对照血液成分的样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得对照蝰蛇毒凝血测量结果；和

b)使来自患者的血液成分的样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者蝰蛇毒凝血测量结果，

其中患者蝰蛇毒凝血测量结果大于对照蝰蛇毒凝血测量结果，则确定患者中的抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，并且其中患者蝰蛇毒凝血测量结果小于或等于对照蝰蛇毒凝血测量结果，则确定患者中的抗凝血剂为抗-凝血因子Xa抗凝血剂。

3.一种用于在怀疑有抗凝血剂的患者中鉴定和分类治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法，该方法包括：

a)使已知不包含抗凝血剂的对照血液成分样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得对照的蝰蛇毒凝血测量结果；和

b)使来自怀疑有抗凝血剂的患者的血液成分样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者的蝰蛇毒凝血测量结果，其中所述患者的蝰蛇毒凝血测量结果大于所述对照的蝰蛇毒凝血测量结果，则确定在患者中存在抗凝血剂和分类所述抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)。

4.一种用于在怀疑有抗凝血剂的患者中检测和/或分类治疗相关量或更高量的抗凝血剂的方法，其包括：

a)使来自所述患者的血液成分的第一样品，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者凝血因子Xa的凝血测量结果，

b)使来自所述患者的血液成分的第二样品，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者蝰蛇毒的凝血测量结果；和

c)比较患者凝血因子Xa的凝血测量结果和来自已知缺乏抗凝血剂的对照血液成分的对照凝血因子Xa的凝血测量结果，以及比较患者蝰蛇毒的凝血测量结果和来自对照血液成分的对照蝰蛇毒的凝血测量结果；

其中所述患者蝰蛇毒的凝血测量结果大于对照蝰蛇毒的凝血测量结果，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量或高于治疗相关量存在，并确定所述抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，并且其中所述患者凝血因子Xa凝血测量结果大于对照凝血因子Xa凝血测量结果，则确定在患者中抗凝血剂以治疗相关量或高于治疗相关量存在，并确定所述抗凝血剂为抗-凝血因子Xa抗凝血剂，并且其中所述患者凝血因子Xa凝血测量结果小于或等于对照凝血因子Xa凝血测量结果，则确定在患者中没有任何以治疗相关量或高于治疗相关量存在的抗凝血剂。

5.一种用于在来自患者的血液成分中分类治疗相关量或比治疗相关量更高的抗凝血剂的方法，所述方法包括：

a)确定血液成分中抗凝血剂的存在，包括：

(i)使已知不含有抗凝血剂的对照血液成分的第一部分，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得对照凝血因子Xa的凝血测量结果；和

(ii)使来自患者的血液成分的第一部分，在凝血因子Xa试剂的存在下经历凝集测定以获得患者凝血因子Xa的凝血测量结果，其中患者凝血因子Xa凝血测量结果大于对照凝血因子Xa的凝血测量结果，表明在患者血液成分中抗凝血剂以治疗水平存在，并且其中患者凝血因子Xa的凝血测量结果小于或等于对照凝血因子Xa的凝血测量结果，表明在患者血液成分中不存在治疗相关量的抗凝血剂和

b)如果在患者的血液成分中存在所述抗凝血剂，则分类所述抗凝血剂，包括：

(i)使对照血液成分的第二部分，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得对照蝰蛇毒的凝血测量结果；和

(ii)使所述患者血液成分的第二部分，在蝰蛇毒试剂的存在下经历凝集测定以获得患者蝰蛇毒的凝血测量结果，其中所述患者蝰蛇毒的凝血测量结果大于对照蝰蛇毒的凝血测量结果，则确定所述抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂(DTI)，并且其中所述患者蝰蛇毒的凝血测量结果小于或等于对照蝰蛇毒的凝血测量结果，则确定所述抗凝血剂为抗-凝血因子Xa抗凝血剂。

6.权利要求1、2、3、4、或5的所述方法，其中所述凝集测定选自凝血酶原时间(PT)测定、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定和活化凝血时间(ACT)测定。

7.权利要求1、2、3、4、或5的所述方法，其中所述凝集测定是粘弹性分析凝血测定。

8.权利要求7的所述方法，其中使用含有在容器内部的样品的容器进行粘弹性分析。

9.权利要求8的所述方法，其中使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述针相对于所述容器移动。

10.权利要求8的所述方法，其中使用容器和针进行粘弹性分析，其中所述容器相对于所述针移动。

11.权利要求8的所述方法，其中所述容器缺少底面。

12.权利要求1、2、3、4、或5的所述方法，其中所述患者是人。

13.权利要求1、2、3、4、或5的所述方法，其中患者正经历选自手术、创伤、出血、中风和血栓栓塞事件的条件之一。

14.权利要求1、2、3、4、或5的所述方法，其中所述抗凝血剂是口服抗凝血剂。

15.权利要求14的所述方法，其中所述口服抗凝血剂是直接凝血酶抑制剂或抗-凝血因子Xa抗凝血剂。

16.权利要求1、4或5的所述方法，其中所述对照凝血因子Xa的凝血测量结果的范围为已知缺乏抗凝血剂的至少两个对照血液成分的至少两个凝血因子Xa的凝血测量结果。

17.权利要求2、3、4或5的所述方法，其中所述对照蝰蛇毒凝血测量结果的范围为已知缺乏抗凝血剂的至少两个对照血液成分的至少两个蝰蛇毒的凝血测量结果。

18.权利要求1、2、3、4或5的所述方法，其中所述患者凝血因子Xa的凝血测量结果比所述对照凝血因子Xa的凝血测量结果大至少1.25倍，则确定在患者中所述抗凝血剂以治疗相关量或更高量存在。

19.权利要求18的所述方法，其中所述患者样品的患者凝血因子Xa凝血测量结果比所述对照凝血因子Xa的凝血测量结果大至少1.5倍，则确定在患者中所述抗凝血剂以治疗相关量或更高量存在。

20.权利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述患者蝰蛇毒的凝血测量结果比所述对照蝰蛇毒的凝血测量结果大至少1.25倍，则确定在患者中所述抗凝血剂以治疗相关量或更高量存在。

21.权利更求20的所述方法，其中所述患者样品的患者蝰蛇毒凝血测量结果比所述对照蝰蛇毒的凝血测量结果大至少1.5倍，则确定在患者中所述抗凝血剂以治疗相关量或更高量存在。

22.权利要求1、2、3、4或5的所述方法，其中对确定为含有以治疗相关量或更高量存在的抗凝血剂的患者施用治疗相关量的逆转剂。

23.权利要求22的所述方法，其中所述逆转剂是凝血酶原复合浓缩物。

24.权利要求1、2、3、4或5的所述方法，其中对确定为含有以治疗相关量或更高量存在的DTI抗凝血剂的患者施用治疗相关量的idarucizumab。

25.权利要求1、2、3、4或5的所述方法，其中对确定为含有以治疗相关量或更高量存在的抗-凝血因子Xa抗凝血剂的患者施用治疗相关量的andexanet。