CN107250375A - 在血栓溶解剂存在下使用粘弹性分析鉴定新疾病状态 - Google Patents

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Abstract

在一些实施方案中，本发明提供了用于检测患者中异常纤维蛋白溶解状况的方法。该方法包括在已知量的血栓溶解剂的存在下对来自患者的血液样品进行粘弹性分析，以获得患者的凝血特征值；将患者的凝血特征值与健康个体的凝血特征值进行比较，将来自健康个体的血液样品在已知量的血栓溶解剂的存在下经过粘弹性分析得到健康个体的凝血特征值，其中与健康个体的凝血特征值相比，患者的凝血特征值的差异将该患者鉴定为具有异常纤维蛋白溶解。在一些实施方案中，本发明还提供一种适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的异常纤维蛋白溶解状况的容器，该容器包含具有包含血栓溶解剂的涂层的内部。

Description

在血栓溶解剂存在下使用粘弹性分析鉴定新疾病状态
交叉参考相关申请
本申请要求2014年11月6日美国临时申请号62/076,386(其全部内容通过引用并入本文)的优先权。
关于联邦赞助研究或发展的声明
本发明是由国家卫生研究院授予的授权号为T32-GM008315，P50-GM49222和UMHL120877的政府支持产生的，以及处于国防部合同号.W81XWH1220028。政府对发明有一定的权利。
背景
本发明涉及医学和外科以及创伤性损伤和创伤性损伤后遗症的急性和慢性危重护理的领域。
创伤性损伤后，人体对组织损伤的正常反应是产生血凝块以防止损伤的血管损失血液。合适的血凝块形成过程称为凝血，它是止血的重要组成部分：维持脉管系统的完整性和遏制血管内的血流。然而，在至多三分之一的严重受损伤的创伤患者中，发生凝血的病理学失败，称为“创伤诱导性凝血病”或“TIC”。TIC是由于生理耗尽、消耗血液凝固的成分因素以及其他不太了解的原因。TIC患者的死亡风险高于类似受损伤的正常凝血患者的至多四倍。
因此，找到用于鉴定和治疗创伤诱导的凝血病的患者的方法和试剂将是有用的。
发明内容
本发明提供用于快速且准确地检测和治疗创伤性诱导性凝血病或“TIC”患者的方法和试剂。在一些实施方案中，本发明提供用于快速且准确地检测和治疗患有新定义的障碍纤维蛋白溶解停止和潜在的纤维蛋白溶解亢进的患者的方法和试剂。
在第一方面，本发明提供了一种用于检测患者中的异常纤维蛋白溶解的方法，包括(a)在已知量的血栓溶解剂存在下使来自患者的血液样品进行粘弹性分析，以获得患者的凝血特征值；和(b)将患者的凝血特征值与健康个体的凝血特征值或一组健康个体的平均凝血特征值进行比较，所述健康个体的凝血特征值通过在已知量的血栓溶解剂的存在下使来自健康个体的血液样品进行粘弹性分析而获得，所述一组健康个体的平均凝血特征值通过使来自所述健康个体的血液样品在已知量的血栓溶解剂的存在下进行粘弹性分析而获得，其中与健康个体的凝血特征值或一组健康个体的平均凝血特征值相比，患者的凝血特征值的差异将该患者鉴定为具有异常纤维蛋白溶解。在一些实施方案中，血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。在一些实施方案中，血栓溶解剂是tPA，人单链tPA，人双链tPA，来自非人哺乳动物物种的tPA，阿替普酶，瑞替普酶，替奈普酶，阿尼普酶，血清激酶，链激酶，尿激酶，激肽释放酶和/或前述内容的一个或多个的组合。
在一些实施方案中，血栓溶解剂的已知量是血栓溶解剂的低量，并且其中异常纤维蛋白溶解状况是纤维蛋白溶解亢进(例如，潜在的纤维蛋白溶解亢进)。在一些实施方案中，低量为约1ng/ml至约100ng/ml血栓溶解剂。在一些实施方案中，低量为约10ng/ml至约90ng/ml血栓溶解剂。在一些实施方案中，血栓溶解剂是人单链tPA，低量为约75ng/ml人单链tPA。在一些实施方案中，与健康个体的凝血特征值或一组健康个体的平均凝血特征值相比，患者的凝血特征值的增加将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解亢进(例如潜在的纤维蛋白溶解亢进)。
在一些实施方案中，已知量的血栓溶解剂是高量的血栓溶解剂，其中异常纤维蛋白溶解状况是纤维蛋白溶解停止(fibrinolysis shutdown)。在一些实施方案中，高量为约110ng/ml至约1200ng/ml血栓溶解剂。在一些实施方案中，高量为约130ng/ml至约1000ng/ml血栓溶解剂。在一些实施方案中，血栓溶解剂是人单链tPA，高量为约150ng/ml人单链tPA。在一些实施方案中，与健康个体的凝血特征值或一组健康个体的平均凝血特征值相比，患者凝血特征值的降低将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。
在另一方面，本发明提供了一种用于检测患者中纤维蛋白溶解亢进(例如，潜在的纤维蛋白溶解)或纤维蛋白溶解停止的方法，所述方法包括(a)使来自患者的第一血液样品在低量血栓溶解剂的存在下进行粘弹性分析，以获得患者的低凝血特征值；(b)使来自患者的第二血液样品在高量血栓溶解剂存在下进行粘弹性分析，以获得患者的高凝血特征值；(c)将患者的低凝血特征值与健康个体的低凝血特征值或一组健康个体的平均低凝血特征值进行比较，通过使来自健康个体的样品血液在低量血栓溶解剂存在下进行粘弹性分析而获得健康个体的低凝血特征值，以及通过使来自一组健康个体的血液样品在低量的血栓溶解剂存在下进行粘弹性分析而获得一组健康个体的平均低凝血特征值，和(d)将患者的高凝血特征值与健康个体的高凝血特征值进行比较，通过使来自健康个体的血液样品在高量的血栓溶解剂存在下进行粘弹性分析而获得健康个体的高凝血特征值，其中与健康个体的低凝血特征值相比或与一组健康个体的平均低凝血特征值相比，患者的低凝血特征值的差异将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解亢进(例如，潜在的纤维蛋白溶解亢进)，并且其中与健康个体的高凝血特征值相比或与一组健康个体的平均高凝血特征值相比，患者的高凝血特征值的差异将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。在一些实施方案中，与健康个体的低凝血特征值或与一组健康个体的平均低凝血特征值相比，患者的低凝血特征值的增加将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解亢进(例如，潜在的纤维蛋白溶解亢进)。在一些实施方案中，与健康个体的高凝血特征值或与一组健康个体的平均高凝血特征值相比，患者的高凝血特征值的降低将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。
在一些实施方案中，血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。在一些实施方案中，血栓溶解剂是tPA，人双链tPA，来自非人类哺乳动物物种的tPA，阿替普酶，瑞替普酶，替奈普酶，阿尼普酶，血清激酶，链激酶，尿激酶和/或激肽释放酶。
在本发明的所有方面的各种实施方案中，凝血特征值(例如，低，高，平均，平均低或平均高)是LY30值或LI30值。
在各种实施方案中，使用在容器内部含有样品的容器进行粘弹性分析。在各种实施例中，使用容器和销(pin)进行粘弹性分析，其中销(pin)相对于容器移动。在各种实施例中，使用容器和销(pin)进行粘弹性分析，其中容器相对于销(pin)移动。在各种实施例中，容器缺少底面。
在各种实施方案中，患者是人或非人动物。在各种实施方案中，患者具有或正在经历诸如手术，疾病状况，危重疾病，创伤，出血和/或血栓栓塞事件的状况。
在各种实施方案中，被鉴定为具有纤维蛋白溶解亢进(例如潜在的纤维蛋白溶解亢进)的患者被施用治疗相关量的治疗剂，其增强血凝块或减缓血凝块的溶解。增强血凝块或减缓血凝块溶解的非限制性治疗剂包括抗纤维蛋白溶解剂(例如，氨甲环酸，氨基己酸或抑肽酶)，全血，血浆，低温沉淀物(cryoprecipitate)，因子XIII，纤维蛋白原，前述物质的一种或多种的组合和/或其它特异性凝血因子浓缩物。在一些实施方案中，基于患者的凝血特征值来确定增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂的治疗相关量。
在各种实施方案中，被鉴定为具有纤维蛋白溶解停止的患者被施用治疗相关量的治疗剂，其减弱血凝块或加速血凝块的溶解。减弱血凝块或加速血凝块的溶解的非限制性治疗剂包括阿司匹林，肝素，氯吡格雷，华法林，直接凝血酶抑制剂，因子Xa抑制剂，tPA，抗凝血剂，血栓溶解剂，抗纤维蛋白原剂，抗因子XIII试剂，糖蛋白IIb/IIIa抑制剂，抗血小板剂和/或前述物质的一种或多种的组合。在一些实施方案中，基于患者的凝血特征值来确定减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂的治疗相关量。
在另一方面，本发明提供一种适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解亢进(例如，潜在的纤维蛋白溶解亢进)的容器，其包含具有包含低量血栓溶解剂的涂层的内部。在一些实施方案中，血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。在一些实施方案中，低量为约1ng/ml至约100ng/ml血栓溶解剂或约10ng/ml至约90ng/ml血栓溶解剂。在一些实施例中，容器缺少底面。在一些实施方案中，容器还包含稳定剂(例如EDTA或表面活性剂)以稳定血栓溶解剂。
在另一方面，本发明提供适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解停止的容器，其包含具有包含高量血栓溶解剂的涂层的内部。在一些实施方案中，血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。在一些实施方案中，高量为约110ng/ml至约1200ng/ml血栓溶解剂或约150ng/ml至约1000ng/ml血栓溶解剂。在一些实施例中，容器缺少底面。在一些实施方案中，容器还包含稳定剂(例如EDTA)以稳定血栓溶解剂。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解亢进(例如，潜在的纤维蛋白溶解亢进)、包含具有包含低量血栓溶解剂的涂层的内部的第一容器，适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解停止、包含具有包含高量血栓溶解剂的涂层的内部的第二容器，以及说明书(instructions)，其用于在粘弹性分析中使用所述第一和第二容器，以鉴定血液样品中纤维蛋白溶解亢进和/或纤维蛋白溶解停止。在一些实施例中，容器缺少底面。
在另一方面，本发明提供了一种包含多个容器以用于检测血液样品中的异常纤维蛋白溶解的药筒(cartridge)，其中所述容器中的至少一个包含具有包含低量血栓溶解剂的涂层的内部和至少一个容器包含具有包含高量血栓溶解剂的涂层的内部。在一些实施方案中，血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。在一些实施方案中，高量为约110ng/ml至约1200ng/ml血栓溶解剂或约150ng/ml至约1000ng/ml血栓溶解剂。在一些实施方案中，低量为约1ng/ml至约100ng/ml血栓溶解剂或约10ng/ml至约90ng/ml血栓溶解剂。在一些实施例中，容器缺少底面。在一些实施方案中，容器还包含稳定剂(例如EDTA)以稳定血栓溶解剂。
附图简要说明
本专利或申请文件包含至少一个以颜色制作的图。本专利的彩色图副本将由专利商标局根据要求和支付必要的费用来提供。
通过参考参考附图、以下详细描述，将更容易理解实施方案的前述特征，其中：
图1A和1B是示出凝血级联的示意图，凝血级联最终导致由交联的纤维蛋白制成的纤维蛋白凝块的形成(图1A)和纤维蛋白溶解期间凝块的分解(图1B)。通过tPA活化的纤维蛋白溶酶原产生纤维蛋白溶酶，其将纤维蛋白降解成纤维蛋白降解产物。
图2是条形图，其显示创伤诱导的纤维蛋白溶解亢进患者(左侧条)、肢体缺血患者(中间条)和健康个体(右侧条)中组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)(黑色)，纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1(PAI-1)(浅灰色)和tPA和PAI-1复合物(深灰色)的浓度。
图3是条形图，其显示损伤后28天内患者的死亡率，所述患者具有纤维蛋白溶解停止(左侧条；在该图中，LY30小于0.8％)，纤维蛋白溶解的生理正常水平(中间条；在该图中，LY30在0.9％至2.9％之间)和纤维蛋白溶解亢进(右侧条；在该图中，LY30大于3％)，其由所有原因导致。
图4是显示来自具有正常止血的样品的凝血弹性描记法(thromboelastography)(“TEG”)测定迹线(tracing)的示意图；也就是说，正常量的纤维蛋白溶解以及没有纤维蛋白溶解亢进。R(反应时间)是形成纤维蛋白链聚合物的时间，K(凝块动力学，以分钟测量)，以及MA(最大振幅，以mm计)，是凝块的强度。LY30是MA后三十分钟的裂解百分比。
图5是来自健康个体的血液样品的TEG迹线(tracing)，其中血液样品尚未用增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂或减弱血凝块或加速血凝块的溶解的治疗剂进行处理。
图6A和6B是示出两个典型的TEMogram迹线(tracing)的示意图。在图6A和6B中，CT表示凝血时间(clotting time)，CFT表示凝块形成时间，α为α角，λ角为裂解率(lysisrate)，MCF为最大凝块硬度，LI130为CT后30分钟裂解指数，ML为最大裂解。
图7是条形图，其显示在75ng/ml tPA存在下通过粘弹性分析获得的创伤患者(黑条)和健康个体(灰色条)的LY30凝血特征值的比较。
图8是条形图，其显示在150ng/ml tPA存在下通过粘弹性分析获得的创伤患者(黑条)和健康个体(灰色条)的LY30凝血特征值的比较。
图9A和9B是来自两个健康个体、即患者15(图9A)和患者33(图9B)的TEG迹线(tracing)。图9A-9B中的白线是天然TEG(采用柠檬酸化的全血)，绿线是全血加75ng/mltPA，粉红线是全血加150ng/ml tPA。图9A中迹线(tracing)下所示的参数值(例如，R，K，MA，LY30等)是来自健康志愿者患者15的全血加75ng/ml tPA的样品的值。图9B中迹线(tracing)下所示的参数值(例如，R，K，MA，LY30等)是来自健康志愿患者33的全血样品加75ng/ml tPA的值。
图10A和10B是来自具有纤维蛋白溶解停止的两个个体、即患者22(图10A)和患者38(图10B)的TEG迹线(tracing)。图10A-10B中的白线是天然TEG(采用柠檬酸化全血)，绿线为全血加75ng/ml tPA，粉红线为全血加150ng/ml tPA。图10A中迹线(tracing)下所示的参数值(例如，R，K，MA，LY30等)是来自健康志愿者22的全血样品加150ng/ml tPA的值。图10B中迹线(tracing)下所示的参数值(例如，R，K，MA，LY30等)是来自健康志愿患者38全血样品加150ng/ml tPA的值。
图11A和11B是来自具有潜在的纤维蛋白溶解亢进的两个个体、即患者3(图11A)和患者24(图11B)的TEG迹线(tracing)。图11A-11B中的白线是天然TEG(采用柠檬酸全血)，绿线为全血加75ng/ml tPA，粉红线为全血加150ng/ml tPA。图11A中迹线(tracing)下所示的参数值(例如，R，K，MA，LY30等)是来自患者3的全血样品本加75ng/ml tPA的值。图11B中迹线(tracing)下所示的参数值(例如，R，K，MA，LY30等)是来自患者24的全血样品本加75ng/ml tPA的值。
图12A和12B是来自具有经典(或公开(overt))纤维蛋白溶解亢进的两个个体，即患者4(图12A)和患者36(图12B)的TEG迹线(tracing)。图12A-12B中的白线是天然TEG(柠檬酸化全血)，绿线是全血加75ng/ml tPA，并且粉红线是全血加150ng/ml tPA。图12A中迹线(tracing)下所示的参数值(例如，R，K，MA，LY30等)是来自患者4的全血样品本加75ng/mltPA的值。图12B中迹线(tracing)下所示的参数值(例如，R，K，MA，LY30等)是来自患者36的全血样品本加75ng/ml tPA的值。
图13A和13B是显示从健康志愿者获取的血液样品中LY30值的频率的条形图，其中在75ng/ml tPA(图13A)存在下或在150ng/ml tPA(图13B)的存在下分析样品。如图13A所示，在tPA的低量(例如75ng/ml)的存在下，大多数健康志愿者的血液样品的LY30值为5或10。如图13B所示，在tPA的高量(例如，150ng/ml)的存在下，大多数健康志愿者的血液样品的LY30值在50和70之间。
图14是显示全身性纤维蛋白溶解的高死亡率的条形图。
图15A-15B是显示没有TXA(图15A)或有TXA(图15B)的tPA/纤维蛋白溶酶系统的示意图。
图16-18是显示tPA和PAI-1的相互作用以及PAI-1作为tPA的同源抑制剂的作用的示意图。
图19是显示tPA和PAI-1如何相互抑制并且与无活性和由肝脏清除的共价复合物平衡存在的示意图。
图20-25是一系列示意图，其显示通过因子V和VIII的降解、活化的蛋白C(aPC)是创伤诱导的凝血病(TIC)的驱动剂。
图26是显示创伤诱导的凝血病(TIC)的三个主要成分的图表。
图27是显示凝血弹性描记法(TEG)测定的机械作用的图。
图28是经典的TEG曲线。
图29是图28的经典TEG曲线，具有显示的α角和LY30度量。
图30是显示与健康志愿者相比，纤维蛋白溶解亢进患者的LY30值的图。
图31是显示健康志愿者和纤维蛋白溶解亢进患者的总血浆PAI-1(活性的加络合的；左图)和总血浆tPA(活性的加络合的；右图)的浓度的图。
图32是显示健康志愿者和纤维蛋白溶解亢进患者的有活性的PAI-1(左图)和有活性的tPA(右图)的浓度的图。
图33是显示健康志愿者(左)与纤维蛋白溶解亢进患者(右)的PAI-1/tPA平衡变化的条形图。
图34是显示健康对照(左)和纤维蛋白溶解亢进患者(右)的低量tPA TEG测定的LY30值结果的图。可以看出，在存在低量tPA的粘弹性测定中，纤维蛋白溶解亢进患者的LY30值增加。
图35-37是显示止血中凝血和纤维蛋白溶解的相关和平衡系统的一系列示意图。
图38是显示创伤患者纤维蛋白溶解谱的条形图。请注意，图38中的数据与上述图3所示的数据相同。超过60％的严重受损创伤患者出现纤维蛋白溶解停止，少于20％表现出纤维蛋白溶解亢进。
图39是图38的图表，显示了在纤维蛋白溶解停止患者中抗纤维蛋白溶解剂(例如TXA)的可疑用途。
图40是来自图9B的健康志愿者患者33的TEG迹线(tracing)的图像，附有的标记，其显示未处理血液(图40中标记为“天然的”的线)，用低量tPA处理的血液(图40中标记为“低量tPA”的线)或用高量tPA处理的血液(图40中标记为“高剂量tPA”的线)。
图41是显示健康对照和纤维蛋白溶解停止患者的高量tPA TEG测定的LY30值结果的图。可以看出，在存在高量tPA的粘弹性测定中，纤维蛋白溶解停止患者的LY30值降低。
图42是显示健康对照和纤维蛋白溶解停止患者的有活性的PAI-1活性的图。
图43是显示健康志愿者、纤维蛋白溶解停止患者和纤维蛋白溶解亢进患者的有活性的PAI-1(蓝色)、有活性的tPA(红色)和相互失活的tPA/PAI-1复合物(紫色)的相对水平的条形图。
图44是在健康志愿者(绿色菱形)和创伤患者(紫色方块)中，将高有活性的PAI-1水平作为LY30值的函数在高量tPA下绘制的散点图。
具体实施方式的详细描述
本发明部分地源于以下发现：存在潜在的纤维蛋白溶解亢进和纤维蛋白溶解停止的，并且可以检测到这两种疾病状况。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于检测潜在的纤维蛋白溶解亢进和/或纤维蛋白溶解停止的方法和试剂(例如杯子)。这里提到的出版物(包括专利出版物)，网站，公司名称和科学文献建立了本领域技术人员可获得的知识，并且通过引用整体并入本文，其程度如同每个都是具体地和单独地表示通过引用并入。本文引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突均应以后者为准。
止血是一种紧密调节的，非常复杂的过程，其涉及许多相互作用因子，其包括凝血和纤维蛋白溶解蛋白，激活剂，抑制剂和细胞元件，例如血小板细胞骨架，血小板细胞质颗粒和血小板细胞表面，其控制个人(例如，人个人)体内出血。止血包括并包含两个过程之间的平衡：(1)凝血过程，即通过形成含纤维蛋白的血凝块的血液凝固，和(2)纤维蛋白溶解过程，即涉及以下的过程：例如，通过激活纤维蛋白溶酶使该凝块分解以溶解将凝块保持在一起的纤维蛋白网。
在身体中，循环血液在正常条件下保持流体，但是当血管系统的完整性被破坏时，会形成局部凝块。创伤，感染和炎症都激活血液的凝血系统，这取决于凝血级联中酶蛋白的相互作用(例如凝血因子如因子VII或因子IX)，活化的血小板和损伤的血管内皮。这三个要素协调一致地堵塞破裂的血管中的缺陷。
在止血期间形成血凝块(也称为血栓)(参见图1A)。血凝块需要具有足够的强度以抵抗通过循环血液或机械运动导致的移动。如果特定的凝血因子是功能障碍的或不存在的，如在血友病中，则不足量的纤维蛋白形成。最终，减少的纤维蛋白形成或血小板聚集导致抗拉强度不足的凝块。这种凝固性过低的的状态使得患者容易出血。相反，损伤，不动，炎症，感染，癌症或遗传性疾病导致高凝性，并且潜在地导致血栓形成(即血凝块)形成，例如深静脉血栓形成，肺栓塞和动脉闭塞如中风和心肌梗死。还认为小血管的微血管血栓和血管闭塞性疾病是多器官功能衰竭(MOF)的重要因素，是患有多种潜在疾病过程的危重患者。
纤维蛋白溶酶的前体，纤维蛋白溶酶原是掺入血凝块中的酶原(参见图1B)。组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶是血清激酶，其能够将血液凝块中的纤维蛋白溶酶原转化成纤维蛋白溶酶，从而激活它并允许发生纤维蛋白溶解。纤维蛋白溶解，即分解血凝块、使其不成问题的过程是正常的生物过程。通常，tPA被损伤的血管内皮非常缓慢地释放到血液中。结果，在停止出血之后，凝块被分解，因为凝块中的无活性酶原纤维蛋白溶酶原被活化以变成纤维蛋白溶酶，其用于将保持凝块在一起的纤维蛋白网分解。称为纤维蛋白降解产物(FDP)的所得片段然后被其他酶或肾脏和肝脏清除。
组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶的主要抑制剂是纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)(参见图1B)。PAI-1是由位于人染色体7(7q21.3-q22)上的PAI-1基因SERPINE1编码的血清激酶抑制剂(血清激酶抑制剂)。PAI-1主要由内皮(衬里血管细胞)产生，但也由其他组织类型(例如脂肪组织)分泌。通过抑制tPA和尿激酶，PAI-1是纤维蛋白溶解的抑制剂。PAI-1在纤维蛋白溶解中的作用如图1B所示。请注意，还有许多纤维蛋白溶解酶系统的其他抑制剂，包括PAI-2和3，TAFI，α2-抗纤维蛋白溶酶，alph-2巨球蛋白等。然而，tPA和尿激酶的主要抑制剂是PAI-1。
在正常的健康个体(例如14至44岁或20至40岁之间的男性和女性人群)中，PAI-1和tPA的血液浓度存在于平衡中，其中tPA稍微多于PAI-1。因此，“健康个体”被定义为健康的患者。例如，如果患者是人类，健康的人类是14至44岁之间，其正常(即，未受损伤的)tPA血液浓度比正常(即未受损伤的)的PAI-1血液浓度高1％，或2％或5％，或10％。
在一些实施方案中，患者是非人动物，例如哺乳动物，鸟，爬行动物或鱼。因此，患者可以是非人灵长类动物(例如，黑猩猩，狒狒)，猫，狗，牛，猪，绵羊，鸡，火鸡，骆马，大象，实验室动物(例如大鼠，小鼠，豚鼠，斑马鱼)，异国动物(如老虎，狮子，科莫多龙(巨蜥)，斑马，长颈鹿，狼)。在一些实施方案中，患者是哺乳动物。
来自健康个体的血液样品将对低量的血栓溶解剂(例如tPA)具有很少或没有纤维蛋白溶解反应，并且将对高量的血栓溶解剂具有纤维蛋白溶解反应。
相比之下，“显然健康的个体”是指以下的个体(例如，14至44岁或20至40岁之间的男性和女性人)：当未受损伤时似乎为正常的(例如，表面上健康的个体没有血友病)个体，但是当该个体受损伤、出血(例如，接受手术)或危重病时，所述个体的PAI-1和tPA浓度向PAI-1侧转移过多(即，与tPA相比太多的PAI-1)或者向tPA侧转移过多(例如，与PAI-1相比太多的tPA)，并且表面上健康的个体可以具有异常的纤维蛋白溶解(例如潜在的纤维蛋白溶解亢进或纤维蛋白溶解停止)。当然，由于在本发明的一些实施方式之前，大多数没有危重病、流血或受损伤的男性和女性人类常规地不测量他们的PAI-1和tPA的血液浓度，所以不可能区分表面上健康个体与健康个体。在一些实施方案中，本发明允许快速鉴定这些表面上健康的个体，使得医生能够以比其他方式给予健康个体更紧急的方式对这些个体进行分类。
本发明部分地源于以下发现：如果在损伤期间或之后不久(例如包括意外损伤，例如车祸，或有目的的损伤，例如选择性手术)，则表面上健康个体的tPA与PAI-1的比例开始变化，表面上健康的个体可能具有异常的纤维蛋白溶解状况，如潜在的纤维蛋白溶解亢进或纤维蛋白溶解停止。如果这个比例比正常人转移至更多的tPA，这个表面上健康的个体可能具有潜在的纤维蛋白溶解亢进。如果该比例转移至更多的PAI-1，则表面上健康的个体可能具有纤维蛋白溶解停止。
本文所用的“异常纤维蛋白溶解”是指其中止血的纤维蛋白溶解分叉(fibrinolysis prong)不正常的疾病状况。在一些实施方案中，异常纤维蛋白溶解是创伤诱导的凝血病或“TIC”。
如上所述，纤维蛋白溶解是血凝块的分解。这是通过将非活性纤维蛋白溶酶原酶原激活成活性纤维蛋白溶酶来实现的。然后，纤维蛋白溶酶将分解将血凝块保持在一起的纤维蛋白网。如图1B所示，多种药剂能够将纤维蛋白溶酶原激活成活性纤维蛋白溶酶。如图1B所示，这些试剂包括因子XIa，因子XIIa，激肽释放酶，组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)(包括人单链tPA和人双链tPA)，链激酶和尿激酶。能够将纤维蛋白溶酶原激活成活性纤维蛋白溶酶的其它试剂包括但不限于尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)。纤维蛋白溶酶原转化为纤维蛋白溶酶包括在纤维蛋白溶酶原中切割Arg-561和Val-562之间的肽键。
TIC的特别危险的方面是纤维蛋白溶解亢进。在这种状况下，纤维蛋白溶解系统(其通常负责通过在损伤已治愈后分解血凝块来维持血流量)以病理方式上调，并且破坏在损伤后形成的必要的血凝块。这种状况与超过60％的死亡率有关。虽然状况是可治疗的，但这种状况偶尔呈现出特别危险的隐匿或潜伏形式，这是现有的实验室测试无法检测到的。具有潜在的纤维蛋白溶解亢进的患者将表面上良好，但是易于意外地和显著地失代偿，大量出血并频繁死亡，部分是由于治疗医师低估了他们的敏锐度。在一些实施方案中，本发明允许潜在的纤维蛋白溶解亢进的检测和/或诊断。
在创伤患者中可能发生的另一隐匿状况基本上与纤维蛋白溶解亢进相反：纤维蛋白溶解停止。纤维蛋白溶解系统的严重损伤的这种状况存在于所有严重受损伤的创伤患者中的一半以上，以及包括肾脏疾病在内的其他医疗和外科疾病患者。纤维蛋白溶解停止也不能通过现有的临床实验室试验被检测。在一些实施方案中，本发明还提供了用于检测和/或诊断纤维蛋白溶解停止的方法。
如本文所用，“潜在的纤维蛋白溶解亢进”(有时称为“隐匿性纤维蛋白溶解亢进”)是指异常纤维蛋白溶解疾病状况的一种类型，其中具有损伤(例如，在外科手术期间或创伤性损伤后)的患者(例如，人类患者)最初出现稳定，但由于血栓过度快速的分解，内部或外部突然开始大量出血。因此，在潜在的纤维蛋白溶解亢进中，止血的第一部分即血凝块形成或凝血过程是正常的。然而，血凝块的分解(即止血的纤维蛋白溶解部分)是异常的。在潜在的纤维蛋白溶解亢进中，太多的纤维蛋白溶酶原被太多的组织纤维蛋白溶酶原激活剂分解成纤维蛋白溶酶。换句话说，tPA与PAI-1的比例在潜在的纤维蛋白溶解亢进中转移至太多的tPA。
注意，创伤诱导的纤维蛋白溶解亢进也可以扭曲该比例。例如，如图2所示，在肢体缺血或创伤引起的纤维蛋白溶解亢进患者中，tPA浓度超过PAI-1浓度，从而将比例转移至太多的tPA。这导致凝块分解过快；因此纤维蛋白溶解亢进产生。
本文中使用的“纤维蛋白溶解停止”是指一种异常纤维蛋白溶解疾病，其中患者中的血凝块(例如，在创伤性损伤后形成的)延迟分解。换句话说，纤维蛋白溶解停止是一种极度形式的纤维蛋白溶解抗性，可能发生在一些血液凝块不能被正确分解的患者中，可能导致器官衰竭和血栓形成事件。在纤维蛋白溶解停止中，尽管止血的凝血过程正常，但是纤维蛋白溶解过程异常。在纤维蛋白溶解停止中，太多的PAI-1将过少的纤维蛋白溶酶原细胞分解为纤维蛋白溶酶。换句话说，tPA与PAI-1的比例在纤维蛋白溶解停止中转移至太多的PAI-1。纤维蛋白溶解停止导致血栓形成，即血栓(即血凝块)的形成。存在血栓可以减少血液流向组织，导致低氧或缺氧，这可导致组织死亡和器官衰竭。如果血栓的一部分中断并通过身体迁移(例如通过血流)，则迁移的血栓被称为栓塞(embolus)。栓塞最终停留的场所能够堵塞血管，杀死被堵塞的血管供应的组织和器官。
由于难以检测潜在的纤维蛋白溶解亢进和纤维蛋白溶解停止，所以这两种状况的死亡率高。我们对纤维蛋白溶解障碍的大部分理解来自两个不同的手术患者群体：创伤性损伤的患者和接受肝移植的患者。自20世纪60年代以来，已经知道进行肝移植的患者在手术无肝期期间他们的纤维蛋白溶解系统有明显的上调，并且这种纤维蛋白溶解亢进状态使他们面临大量凝血病性出血的风险。类似地，一部分严重受损伤的创伤患者(约20％)将出现纤维蛋白溶解亢进，出血死亡风险显著增加，死亡率约为50％-60％或为没有纤维蛋白溶解亢进的类似受损伤患者的预期死亡率的4倍。
我们最近认识到关于纤维蛋白溶解系统的另一病理实体：纤维蛋白溶解停止。虽然直接致死性不如纤维蛋白溶解亢进，但是纤维蛋白溶解停止使患者具有血管闭塞事件(即静脉血栓栓塞)和来自微血管血栓形成的多器官衰竭的更大风险。此外，纤维蛋白溶解停止是比纤维蛋白溶解亢进更常见的现象，影响超过60％的严重受损伤患者。
因此，纤维蛋白溶解亢进和纤维蛋白溶解停止是与增加的死亡率相关的危险综合征。如图3(和图38)所示，损伤28天内纤维蛋白溶解停止患者的全因死亡率为18％，损伤28天内潜在的纤维蛋白溶解患者全因死亡率为45％。相比之下，只有约2％的在损伤28天内死于全部原因的患者具有生理正常的止血作用。在一些实施方案中，如果患者采用治疗相关量的治疗剂(其增强血凝块或减缓血凝块溶解，例如抗纤维蛋白溶解剂氨甲环酸(TXA))进行处理(例如，预防性地)，则由于潜在的纤维蛋白溶解亢进引起的死亡的数目可能降低。
因此，显而易见的是，一些患者(即具有纤维蛋白溶解亢进的患者)将受益于用增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂如抗纤维蛋白溶解剂(例如TXA)的预防性处理。然而，增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂不能均匀地给予急诊室的所有创伤患者，因为如果患者具有纤维蛋白溶解停止，TXA的“治疗”实际上并不是治疗，而是导致这些患者的结果比他们没有接受TXA的结果更差。
注意，鉴于纤维蛋白溶解过程的复杂性，在本公开内容之前，难以测量或甚至检测纤维蛋白溶解停止或潜在的纤维蛋白溶解亢进。此外，为了有益于可能需要治疗的患者(例如，在的纤维蛋白溶解亢进的患者的情况下采用治疗相关量的增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂如氨甲环酸或ε氨基己酸在患有潜或，在患有纤维蛋白溶解停止的患者的情况下采用减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂例如利伐沙班(因子Xa抑制剂)或阿加曲班(直接凝血酶抑制剂))，潜在的纤维蛋白溶解亢进或纤维蛋白溶解停止的检测优选非常快。
在一些实施方案中，本发明提供用于快速检测患者血液样品中的纤维蛋白溶解停止或潜在的纤维蛋白溶解亢进的方法和试剂。在一些实施方案中，本发明使用外源性tPA来改变血液中PAI-1、tPA和PAI-1/tPA复合物的平衡，并读出功能结果。在一些实施方案中，本发明提供了tPA抑制的间接功能测定。在本发明的一些实施方案中，可以快速鉴定患者以确定哪些患者不应该接受治疗，哪些患者具有潜在的纤维蛋白溶解亢进并且应该接受采用增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂(例如，氨甲环酸或ε氨基己酸)的治疗，以及哪些患者具有纤维蛋白溶解停止并且应该不接受治疗或接受采用减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂(例如肝素，华法林，阿司匹林，氯吡格雷，直接凝血酶抑制剂如水蛭素(hirudin)或因子Xa抑制剂如艾多沙班(edoxaban))的治疗。
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于检测患者异常纤维蛋白溶解的方法，包括在已知量的血栓溶解剂存在下使来自患者的血液样品进行粘弹性分析，以获得患者凝血特征值；将患者的凝血特征值与健康个体的凝血特征值进行比较，通过在已知量的血栓溶解剂存在下对来自健康个体的血液样品进行粘弹性分析凝血测定而获得健康个体的凝血特征值，其中与健康个体的凝血特征值相比，患者的凝血特征值的差异将该患者鉴定为具有异常纤维蛋白溶解状况。
应当注意，健康个体的凝血特征值可以是来自多个健康个体的平均值。此外，健康个体的凝血特征值可以是储存值或已知值。
如本文所用，“血液样品”是指例如从患者采集的血液样品(例如，全血，经处理的血液或血液成分)。患者可以是人，但也可以是任何其他动物(例如，兽医动物或外来动物(exotic animal))。血液是生物体的循环组织，其向组织携带氧和营养物质，并除去二氧化碳和各种代谢产物用于排泄。血液(通常称为全血)由以下组成：淡黄色或灰黄色液体，血浆，其中悬浮红细胞，白细胞和血小板。在一些实施方案中，血液样品是全血。血液可以是未经处理的，或者可以被处理(例如用柠檬酸盐)。例如，血液样品可以是柠檬酸化的血液(例如，将全血收集到含有3.2％柠檬酸盐的3.5mL容器中)。血液样品也可以是肝素化的血液，或者可以是用鱼精蛋白处理的血液样品以逆转堆肝素(heaparin)的作用。在一些实施方案中，血液样品是全血的一种或多种组分。因此，血液样品可以是从患者的血液中取出的血浆或不含血小板的血浆。在一些实施方案中，血液样品可以是具有降低的血小板功能的样品。例如，可以用血小板功能抑制剂如细胞松弛素D处理血液样品。
在一些实施方案中，血液样品取自来源。来源可以是包括供体袋或直接来自患者的任何来源。在一些实施方案中，被采取血液样品的患者对增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂(例如抗纤维蛋白溶解剂氨甲环酸)有应答。在一些实施方案中，被采取血液样品的患者对减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂(例如tPA)有应答。
在一些实施方案中，异常纤维蛋白溶解状况是潜在的纤维蛋白溶解亢进。在异常纤维蛋白溶解是潜在的纤维蛋白溶解亢进的方法中，已知量的血栓溶解剂(例如tPA)是低量的。在一些实施方案中，低量血栓溶解剂(例如tPA)为约1ng/ml至约100ng/ml。在一些实施方案中，低量血栓溶解剂(例如tPA)为约10ng/ml至约90ng/ml。在一些实施方案中，低量血栓溶解剂(例如tPA)为约20ng/ml至约80ng/ml。
在一些实施方案中，当在低量血栓溶解剂存在下进行粘弹性测定时，反映患者凝血过程的凝血特征值(例如，MA值)与反映健康个体凝血过程的凝血特征值相比的降低将患者鉴定为具有潜在的纤维蛋白溶解亢进。在一些实施方案中，反映患者凝血过程的凝血特征值比反映健康个体的凝血过程的凝血特征值小至少约7.5％，所述反映患者凝血过程的凝血特征值将患者鉴定为具有潜在的纤维蛋白溶解亢进。在一些实施方案中，反映患者凝血过程的凝血特征值比反映健康个体的凝血过程的凝血特征值小至少约10％，所述反映患者凝血过程的凝血特征值将患者鉴定为具有潜在的纤维蛋白溶解亢进。
在一些实施方案中，当在低量血栓溶解剂的存在下进行粘弹性测定时，反映患者的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值(例如，LY30值)与反映健康个体的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值相比的增加将患者鉴定为具有潜在的纤维蛋白溶解亢进。在一些实施方案中，反映患者的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值比反映健康个体的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值大至少约7.5％，所述反映患者的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值将患者鉴定为具有潜在的纤维蛋白溶解亢进。在一些实施方案中，反映患者的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值比反映健康个体的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值大至少约10％，所述反映患者的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值将患者鉴定为具有潜在的纤维蛋白溶解亢进。
被鉴定为具有潜在的纤维蛋白溶解亢进的患者可受益于用治疗相关量的增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂的治疗。
“增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂”是指任何干扰或抑制血凝块分解或溶解或减缓或抑制血凝块的溶解或分解的化学物质。在一些实施方案中，增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂与减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂不同。
在一些实施方案中，增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂包括但不限于抗纤维蛋白溶解剂(也称为抗纤维蛋白溶解剂)，特异性因子置换物质(replacement)(例如因子XIII)，凝血酶原(prothrombic)复合物浓缩物，纤维蛋白原浓缩物和活体供体人血液制品如血浆。非限制性抗纤维蛋白溶解剂包括纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1(PAI-1)，纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂2(PAI-2)，氨甲环酸，氨基己酸(例如，ε-氨基己酸)，抑肽酶。
在一些实施方案中，异常纤维蛋白溶解状况是纤维蛋白溶解停止。在异常纤维蛋白溶解是纤维蛋白溶解停止的方法中，已知量的血栓溶解剂(例如tPA)是高量的。在一些实施方案中，高量的血栓溶解剂(例如tPA)为约110ng/ml至约1200ng/ml。在一些实施方案中，高量的血栓溶解剂(例如，tPA)为约150ng/ml至约1000ng/ml。在一些实施方案中，高量的血栓溶解剂(例如，tPA)为约200ng/ml至约900ng/ml。在一些实施方案中，高量的血栓溶解剂(例如tPA)为约300ng/ml至约900ng/ml。
在一些实施方案中，在存在高量血栓溶解剂的情况下进行粘弹性测定时，与反映健康个体的凝血过程的凝血特征值相比，反映患者凝血过程的凝血特征值的增加将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。在一些实施方案中，反映患者凝血过程的凝血特征值比反映健康个体的凝血过程的凝血特征值大至少约7.5％，所述反映患者凝血过程的凝血特征值将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。在一些实施方案中，反映患者的凝血过程的凝血特征值比反映健康个体的凝血过程的凝血特征值大至少约10％，反映患者的凝血过程的凝血特征值将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。
在一些实施方案中，其中在存在高量血栓溶解剂的情况下进行粘弹性测定，与反映健康个体的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值相比，反映患者纤维蛋白溶解过程的凝血特征值降低将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。在一些实施方案中，反映患者的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值比反映健康个体的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值低至少约7.5％，所述反映患者的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。在一些实施方案中，反映患者的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值比反映健康个体的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值低至少约10％，所述反映患者的纤维蛋白溶解过程的凝血特征值将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。
被鉴定为具有纤维蛋白溶解停止的患者可受益于采用治疗相关量的治疗剂(其减弱血凝块或加速血凝块的溶解)的治疗。
“减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂”是指干扰或抑制血凝块形成或加速血凝块溶解或分解的任何化学物质。在一些实施方案中，减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂不同于增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂。因此，术语“减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂”包括但不限于抗凝血剂，血栓溶解剂，抗纤维蛋白原剂，抗因子XIII试剂和抗血小板剂。抗凝血剂包括但不限于抑制凝血级联中血小板或抑制因子的化学物质，例如直接凝血酶抑制剂(例如阿加曲班，美拉加群(melagatran)，希美加群和达比加群)，直接因子Xa抑制剂(如利伐沙班，阿哌沙班和艾多沙班)，肝素和维生素K拮抗剂(如华法林)。血栓溶解剂(也称为血栓溶解剂)包括但不限于激活血凝块分解的化学物质，例如单链或双链人体组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，来自其他物种的tPA，阿替普酶，瑞替普酶，替奈普酶，阿尼普酶，血清激酶(serokinase)，链激酶，尿激酶，激肽释放酶或纤维蛋白溶酶/纤维蛋白溶解系统的任何其它上调物(upregulator)。抗血小板剂包括但不限于阿司匹林，氯吡格雷(P2Y12受体拮抗剂)和糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂。
在一些实施方案中，本发明使得能够确定减弱血凝块或加速血凝块的溶解的治疗剂例如抗凝血剂或血栓溶解剂用于个体患者的适当剂量，用于治疗疾病状况，包括深静脉血栓形成(DVT)，肺栓塞(PE)，心肌梗死(MI)或缺血性中风，所述确定通过以下进行：限定患者对减弱血凝块或加速血凝块的溶解的治疗剂(例如，血栓溶解剂如tPA)的抗性的基线水平和患者对全身治疗的反应。
本文所用的“粘弹性分析”是指测量弹性固体(例如纤维蛋白固体)和流体的特性的任何分析方法。换句话说，粘弹性分析允许研究粘性流体(如血液或血液样品)的性质。
在一些实施方案中，粘弹性分析在模拟导致止血的体内条件的条件下进行。例如，条件可以包括模拟体温的温度(例如，37℃的温度)。该条件还可以包括凝块形成和溶解，其采用模拟在血管中发现的流速的流速。
在一个非限制性形式中，包括在本发明的一个实施方案中的非限制性测定包括一组具有0、75或150ng/ml人单链tPA的3种柠檬酸化的天然TEG加入到全血混合物中，采用两种含tPA的杯子的LY30与没有tPA的天然TEG相比，相比。该分组可以例如在血管(粘弹性)(vasoelectric)分析仪器的单个药筒(cartridge)中进行，其中所述药筒(cartridge)具有多个通道，其中一个通道保持单独的样品(例如，一个通道保持未处理的血液，另一个通道保持具有75ng/ml的血液tPA等)。低浓度(75ng/ml)样品在健康个体中产生最小的凝块裂解，但是在具有潜在的纤维蛋白溶解亢进的个体中显示潜在的纤维蛋白溶解亢进与升高的LY30。相反，高浓度(150ng/ml tPA)将在健康个体的血液中产生严重的纤维蛋白溶解(约20％)。然而，如果严重受损伤的个体在150ng/ml tPA存在下显示出对纤维蛋白溶解的抗性，那么该个体可能具有纤维蛋白溶解停止。在某些个体中和在动物模型中，根据需要可以使用其它浓度的tPA或其他血栓溶解剂。
在一些实施方案中，血液样品的粘弹性分析可以包括使血液样品在止血分析仪设备上进行分析。一种非限制性粘弹性分析方法是凝血弹性描记法(“TEG”)测定。因此，在一些实施方案中，粘弹性分析包括使用凝血弹性描记法(TEG)对血液样品进行分析，凝血弹性描记法由Helmut Hartert在德国在20世纪40年代首次描述。
执行凝血弹性描记法的各种装置及其使用方法在美国专利公开号5,223,227；6,225,126；6,537,819；7,182,913；6,613,573；6,787,363；7,179,652；7,732,213，8,008,086；7,754,489；7,939,329；8,076,144；6,797,419；6,890,299；7,524,670；7,811,792；20070092405；20070059840；8,421,458；US 20120301967；和7,261,861，其各自的全部公开内容通过引用明确地并入本文。
凝血弹性描记法(TE)监测血液的弹性性质，因为血液在类似于缓慢的静脉血流的低剪切环境下被诱导凝结。发展凝块的剪切弹性变化的模式能够确定凝块形成的动力学以及形成的凝块的强度和稳定性；简而言之，发展凝块的机械性能。如上所述，凝块的动力学，强度和稳定性提供关于凝块执行“机械加工”、即抵抗循环血液的变形剪切应力的能力的信息。实质上，凝块是止血的基本机器。测量止血的止血仪器能够测量凝块在整个结构发育过程中进行机械工作的能力。这些止血剂分析仪连续测量患者止血的所有阶段，作为从测试开始的时间到初始血纤维蛋白形成之间的非隔离或静态方式的全血成分的净产物，其通过凝固速率加强和最终凝块强度通过凝血特征。
在一些实施方案中，粘弹性分析和/或止血分析仪包括与血液接触的容器。
如本文所用，“容器”是指刚性表面(例如，固体表面)，其一部分在粘弹性分析期间的任何点处接触放置在容器中的血液样品的部分。接触血液样品部分的容器部分也可以称为容器的“内部”。注意，表达“进入容器”并不意味着容器具有与血液样品的部分接触的底面。相反，容器可以是环形结构，其中环的内部是容器的内部，这意味着环的内部是与血液样品的部分接触的环形容器的部分。血液样品可以例如通过真空压力或表面张力流入容器并保持在那里。
包括在该定义中的另外类型的容器是存在于药筒(cartridge)和盒(例如微流体药筒(cartridge))上的容器，其中所述药筒(cartridge)或盒具有多个通道，储存器，穴(tunnel)和环。作为本文中使用的术语，每个相邻通道(包括例如通道，储存器和环)是容器。因此，一个药筒上可能有多个容器。美国专利No.7,261,861(通过引用并入本文)描述了具有多个通道或容器的这种药筒。如果药筒任何通道或穴中的任何表面在粘弹性分析期间的任何时间与血液样品的任何部分接触，则该表面(cartridge)可以是容器的内部。
一种非限制性止血分析仪器被描述于美国专利号7,261,861；美国专利公开号USUS20070092405；和美国专利公开号US20070059840。
使用凝血弹性描记法进行粘弹性分析的另一种非限制性止血分析仪是由Haemonetics，Corp.(Braintree，MA)商业销售的TEG血栓弹性描记器止血分析仪系统。
因此，TEG测定可以使用测量发展的血液凝块(blood cloth)的机械强度的TEG血栓弹性描记器止血分析仪系统进行。为了运行测定，将血液样品放入容器(例如，杯子或比色皿)中，并且销(pin)进入容器的中心。与容器的内壁接触(或向容器中加入凝块激活剂)引发凝块形成。然后，TEG血栓弹性描记器止血分析仪以每10秒大约4.45度至4.75度的摆动方式旋转容器，以模拟缓慢的静脉血流并激活凝血。由于纤维蛋白和血小板聚集体形成，它们将容器的内部与销(pin)接合，传递用于将容器移动的能量到销(pin)中。连接到销(pin)的扭力线(torsion wire)测量凝块随时间的强度，其输出量与凝块的强度成正比。随着凝块的强度随着时间的推移而增加，产生了经典的TEG迹线(tracing)曲线(见图4和图5)。图4中图示的原理图描绘了发生纤维蛋白溶解时的TEG迹线(tracing)。当然，来自健康个体的未经处理的血液样品(即，未用增强血凝块或减缓血凝块的溶解的治疗剂或者减弱血凝块或加速血凝块的溶解的治疗剂进行处理的血液))的典型TEG迹线(tracing)如图5所示。
在TEG分析仪中存在销(pin)的情况下，销(pin)的旋转运动由转换器转换成电信号，电信号可由包括处理器和控制程序的计算机监视。计算机可以通过电信号操作以产生对应于所测量的凝血过程的止血曲线(profile)。另外，计算机可以包括视觉显示器或偶联到打印机以提供止血曲线的视觉表示。计算机的这种配置也在本领域普通技术人员的技能范围之内。如图4所示，所得到的止血曲线(即，TEG迹线(tracing)曲线)是以下的测量：第一个纤维蛋白链形成所需的时间，凝块形成的动力学，凝块的强度(以毫米(mm)测量和转化为dyn/cm2的剪切弹性单位)和凝块溶解。参见Donahue等人，J.Veterinary Emergency andCritical Care：15(1)：9-16(2005年3月)，其通过引用并入本文
这些测量参数中的几个的描述如下：
R是从血液置于凝血弹性描记法分析仪直到初始纤维蛋白形成的潜伏期的时间段。通常需要约30秒至10分钟；然而，R范围将基于所进行的特定TEG测定(例如，所测试的血液样品的类型(例如，血浆或全血)，血液成分是否被柠檬酸化等)而变化。对于处于低凝状态(即血液凝固性降低的状态)的患者，R数较长，而在高凝状态(即血液凝固性增加的状态)中，R数较短。在本文所述的方法中，R值(以分钟或秒为单位)可以用作非限制凝血特征值。
K值(以分钟测量)是从R的末端直到凝块达到20mm的时间，并且这代表凝块形成的速度。该K值为约0至约4分钟(即R结束后)。在低凝状态下，K数较长，而在高凝状态下，K数较短。在本文所述的方法中，K值可以用作非限制性凝血特征值。
α(α)值测量纤维蛋白积聚和交联的快速性(凝块强化)。因此，α(α)值反映了凝血过程。它是由与曲线切线的分割点形成的线与水平轴之间的角度。该角度通常约为47°至74°。在低凝状态下，α度较低，而在高凝状态下，α度较高。在本文所述的方法中，α值可以用作非限制性凝血特征值。
MA或最大振幅(以mm计)是纤维蛋白和血小板结合的最大动态特性的直接函数，代表血凝块的极限强度。MA值反映了凝血过程，通常为约54mm至约72mm。MA通常在粘弹性测定开始后约15至约35分钟之间发生。注意，如果测试的血液样品具有降低的血小板功能(例如，无血小板血浆)，则该MA表示主要基于纤维蛋白的凝块的强度。MA的减少可能反映出低凝状态(例如，伴有血小板功能障碍或血小板减少症)，而增加的MA(例如伴有降低的R)可能表示高凝状态。
在一些实施方案中，如果患者的MA凝血特征值小于健康个体的MA凝血特征值(或一组健康个体的平均MA值)(如在低量tPA或其它血栓溶解剂存在下由TEG所测定)，则潜在的纤维蛋白溶解亢进状态存在于患者体内。在一些实施方案中，如果患者的MA凝血特征值比健康个体的MA凝血特征值(或一组健康个体的平均MA值)低至少约7.5％(如在低量的tPA或其它血栓溶解剂的存在下由TEG所测定的)，则潜在的纤维蛋白溶解亢进状态存在于患者内。在一些实施方案中，来自患者的MA比健康个体的MA(或一组健康个体的平均MA值)小约6％，约5％，或约4％(如在少量的tPA或其他血栓溶解剂存在下由TEG所测定的)，所述来自患者的MA可以鉴定患有潜在的纤维蛋白溶解亢进的患者。在一些实施方案中，如果患者的MA凝血特征值大于健康个体的MA凝血特征值(或一组健康个体的平均MA值)(如通过TEG在存在大量tPA的情况下所测定的)，则患者中存在纤维蛋白溶解停止状态。在本文所述的方法中，MA值可以用作非限制性凝血特征值。
LY30是MA后30分钟的振幅减小的量度，并且表示凝块收缩或裂解。因此，LY30值是Ma后30分钟的振幅下降百分比，反映纤维蛋白溶解过程。该数字通常为0％至约8％。LY30值越大，纤维蛋白溶解越快发生。当没有发生纤维蛋白溶解时，MA迹线(tracing)的振幅值保持不变或由于凝块收缩而略微减小。然而，当发生纤维蛋白溶解(例如，在健康个体中)时，TEG迹线(tracing)的曲线开始衰减。在TEG测定中最大振幅之后的30分钟内，在曲线下面积的潜在(potential)损失称为LY30(参见图4和图5)。LY30，在最大振幅点(表示为溶解的凝块的百分比)后30分钟的裂解百分比表示凝血特征的速率。在一些实施方案中，可以使用凝块硬度(G，以达因/cm 2测量)来表达LY30。在一些实施方案中，如果患者的LY30凝血特征值大于在低量tPA或其它血栓溶解剂存在下由TEG测定的LY30凝血特征值，则患者中存在潜在的纤维蛋白溶解亢进状况。
在一些实施方案中，如果患者的LY30凝血特征值比健康个体的LY30凝血特征值(或一组健康个体的平均LY30值)大至少约3％(如在低量tPA或其它血栓溶解剂的存在下由TEG测定的)，则潜在的纤维蛋白溶解亢进状况存在于患者内。在一些实施方案中，来自患者的LY30比健康个体的LY30(或一组健康个体的平均LY30)大至少约5％，或至少约7.5％，或至少约10％，或至少约15％，如在低量的tPA或其他血栓溶解剂存在下通过TEG测定的，所述来自患者的LY30鉴定潜在的纤维蛋白溶解亢进的患者。在一些实施方案中，如果患者的LY30凝血特征值小于健康个体的LY30凝血特征值(或一组健康个体的平均LY30值)(如在高量tPA或其他凝血剂存在的情况下通过TEG所测定的)，则患者中存在纤维蛋白溶解停止状态。在一些实施方案中，如果患者的LY30凝血特征值比健康个体的LY30凝血特征值(或一组健康个体的平均LY30值)小至少约3％(如由TEG在高量tPA存在下所测定的)，则患者中存在纤维蛋白溶解停止状态。在一些实施方案中，来自患者的LY30比健康个体的LY30(或一组健康个体的平均LY30)小至少约5％，或至少约7.5％，或至少约10％，或至少约15％(如在高量的tPA或其他血栓溶解剂存在下通过TEG所测定的)，所述来自患者的LY30鉴定了纤维蛋白溶解停止的患者。在本文所述的方法中，LY30值可以用作非限制性凝血特征值。
应当注意，可以进行TEG测定的修饰。
可以使用的另一种粘弹性止血测定法是血栓弹性测量法(thromboelastometry)(“TEM”)测定。该TEM测定可以使用ROTEM血栓弹性测量法凝血分析仪(TEM InternationalGmbH，Munich，德国(Germany))进行，其使用是众所周知的(参见例如Sorensen，B.，等人，J.Thromb.Haemost.，2003.1(3)：p.551-8。Ingerslev，J.，等人，Haemophilia，2003,9(4)：p.348-52。Fenger-Eriksen，C.，等人Br J Anaesth，2005.94(3)：p.324-9)。在ROTEM分析仪中，将血液样品放入容器(也称为比色皿或杯子)中，并将圆柱形销(pin)浸入。在销(pin)与容器内壁之间有1毫米的间隙，其由血液桥接。销(pin)由弹簧向右和向左旋转。只要血液是液体的(即未凝结的)，运动是不受限制的。但是，当血液开始凝血时，凝块越来越多地限制了销(pin)的旋转，凝块硬度越来越高。销(pin)连接到光学检测器。这种动力学被机械地检测并通过一体化计算机计算出来典型迹线(tracing)曲线(TEMogram)和数值参数(见图6A和6B)。
在ROTEM凝血测定凝血分析仪中，销(pin)的移动可由包括处理器和控制程序的计算机监视。计算机可以通过电信号操作以产生对应于所测量的凝血过程的止血曲线。此外，计算机可以包括视觉显示器或偶联到打印机以提供止血曲线的视觉表示(称为TEMogram)。这种计算机的配置在本领域普通技术人员的技能范围内。如图6A和6B所示，所得到的止血曲线(即，TEM迹线(tracing)曲线)是以下的测量：第一次纤维蛋白链形成所需的时间，凝块形成的动力学，凝块的强度(以毫米(mm)计测量，并转化为dyn/cm 2的剪切弹性单位)和凝块溶解。这些经测量参数中的几个描述如下：
CT(凝血时间)是从血液置于ROTEM分析仪直到凝块开始形成的时间的潜伏时间段。该CT时间可以根据本文所述的方法用作非限制性凝血特征值。
CFT(凝块形成时间)：从CT直到已达到20mm点的凝块硬度的时间。该CFT时间可以根据本文所述的方法用作非限制性凝血特征值。
α角：α角是2mm振幅处的切线角度。根据本文所述的方法，该α角可以用作非限制凝血特征值。
MCF(最大凝块硬度)：MCF是迹线的最大垂直振幅。MCF反映了纤维蛋白和血小板凝块的绝对强度。如果测试的血液样品具有降低的血小板功能，则该MCF主要是纤维蛋白结合强度的函数。根据本文所述的方法，MCF值可以用作非限制性凝血特征值。
A10(或A5，A15或A20值)。该值描述在10(或5或15或20)分钟后获得的血凝块硬度(或振幅)，并在早期阶段提供对预期MCF值的预测。根据本文所述的方法，这些A值中的任何一个(例如，A10)可以用作非限制性凝血特征值。
LI 30(30分钟后的裂解指数)。LI30值是在CT后30分钟相对于MCF值的残留凝块稳定性的百分比。根据本文所述的方法，该LI30值可以用作非限制性凝血特征值。当不发生纤维蛋白溶解时，TEM迹线(tracing)MCF处的振幅值保持恒定或由于凝块收缩而略微降低。然而，当发生纤维蛋白溶解(例如，处于低凝状态)时，TEM迹线(tracing)的曲线开始衰减。LI30对应于来自TEG迹线(tracing)的LY30值。
ML(最大裂解)。ML参数描述了在任何选定的时间点或测试停止时看到的损失的凝块稳定性(相对于MCF，以％计)的百分比。该ML值可以根据本文所述的方法用作非限制性凝血特征值。
低LI 30值或高ML值表示纤维蛋白溶解亢进。在正常血液纤维蛋白溶解活性相当低的情况下，在临床样品中，纤维蛋白溶解亢进会导致凝块稳定性的更快速丧失，可能导致出血并发症，其可通过施用增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂、如抗纤维蛋白溶解剂来治疗。
因此，根据本文所述的方法，TEG或TEM测定中关注的参数中的每一个可用作凝血特征值，包括反映凝块强度的凝块的最大强度。这是TEG测定中的MA值，和TEM测定中的MCF值。TEG中的反应时间(R)(以秒或分钟测量)和TEM中的凝血时间(CT)是直到首次有凝块证据的时间；凝块动力学(K，以分钟测量)是TEG测试中的参数，表明凝块硬度的实现；TEG中的α或TEM中的α角是切线的角度测量，所述切线从凝块反应时间点开始绘制到TEG迹线(tracing)或TEM迹线(tracing)的曲线，所述凝块反应时间反映凝块发展的动力学。(见Trapani，L.M.Thromboelastography：Current Applications，Future Directions”，OpenJournal of Anesthesiology 3(1)：Article ID：27628,5页(2013)；和Kroll，M..H.，“Thromboelastography:Theory and Practice in Measuring Hemostasis,”Clinical Laboratory News:Thromboelastography 36(12),2010年12月(December 2010)；TEG仪器(可从Haemonetics，Corp.获得)的使用说明书和ROTEM仪器(可从TEM International GmbH获得)的使用手册，这些文献的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，通过在发生凝血的情况下观察样品的不同激发水平来记录参数(和因此凝血特征值)。例如，在容器是微流体药筒(cartridge)或者药筒(cartridge)中的特定通道的情况下，血液样品可以以共振频率被激发，并且当电凝或发生凝结时，由电磁或光源观察到血液样品的行为。在其它实施方案中，可以观察到样品的凝血特征值在不激发样品的情况下随着光源进行的变化。
由于单个药筒(cartridge)可以具有多个容器(例如，药筒(cartridge)中的不同通道)，与已知量的tPA接触的容器中的患者样品容易直接与来自与已知量相同的tPA接触的容器中的健康个体的对照样品(例如，在相同的微流体药筒(cartridge)中的相邻通道中)相当。
当没有纤维蛋白溶解发生时(例如，在没有添加tPA的纤维蛋白溶解停止情况下)，TEG迹线(tracing)处的MA处的振幅值和在TEM迹线(tracing)处的MCF处的振幅值保持恒定或可能由于凝块收缩而轻微减少。然而，当发生纤维蛋白溶解(例如，在具有低量血栓溶解剂如tPA的潜在的纤维蛋白溶解亢进情况下)时，TEG迹线(tracing)和TEM迹线(tracing)曲线开始衰减。在TEG测定中最大振幅之后的30分钟内，在潜在(potential)曲线下面积的产生的损失称为LY30(参见图4和图5)。LY30，在最大振幅点(表示为裂解的凝块的百分比)后30分钟的裂解百分比表示凝血特征的速率(比率)。TEM测定中的相应值是LI30值(参见图6A)。
如本文所用，“凝血特征”是指指示正在测试的血液样品的止血状态的参数。使用粘弹性分析测定测量的任何凝血特征值可用于本文所述的方法中以确定患者是否具有纤维蛋白溶解停止或潜在的纤维蛋白溶解亢进。例如，在TEG测定中，可以比较R(反应时间)，K(实现凝块硬度的时间)，α(凝块发展的动力学)，MA(最大振幅)和LY30中的任何一个(参见图4和5)。对于TEM测定，CT(凝血时间)，CFT(凝块形成时间)，α角，MCF(最大凝块硬度)，A10(CT后10分钟)，LI30(CT后30分钟的裂解指数)和ML(最大裂解)可以比较(参见图6A和6B)以及任何和所有这些参数的衍生物也可以用作凝血特征。
因此，在本文所述方法的一些实施方案中，粘弹性分析使用TEG凝血弹性描记法分析仪系统或ROTEM血栓弹性测量法分析仪系统进行。
实际上，在一些实施方案中，在创伤情况下，常规技术医师可以简单地对来自患者的血液样品(例如，血小板缺失的血液样品)进行实时粘弹性测定(例如，TEG测定)，患者中一位采用血栓溶解剂(例如，没有tPA)，一位采用低量血栓溶解剂，一位采用高量的血栓溶解剂，并且一旦来自对照血液样品的(例如，取自来自健康个体的捐献的血液)两个迹线(tracing)开始分歧(例如，早在测定开始后两分钟)，医师可以选择用以下治疗患者：增强血凝块或减缓血凝块的溶解的治疗剂，例如抗纤维蛋白溶解剂(例如，氨甲环酸或ε氨基己酸，或作为最后手段的抑肽酶)，或者减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂，例如抗凝血剂或血栓溶解剂(例如，肝素，阿司匹林或tPA)。或者，根据患者的凝血特征值(例如，患者的R时间)，医师可能能够鉴定患者健康的个体，从而使医生能够护理更加迫切地需要照顾的其他患者。因此，检测患者纤维蛋白溶解停止或潜在的纤维蛋白溶解亢进的速度在临床上是相关的，特别是在可以在几分钟内决定生命和死亡结果的创伤患者的情况下。
因此，本文所述的方法比较了用已知量的血栓溶解剂如tPA治疗的患者血液样品中的凝血特征值，以及来自健康个体的对照血液样品中相同的凝血特征。
本发明部分地源于尝试减少检测纤维蛋白溶解停止和潜在的纤维蛋白溶解亢进所需的时间量，从而改善患者的结果。在本发明描述的发现之前，纤维蛋白溶解停止和潜在的纤维蛋白溶解亢进都不是熟知的，并且不能检测。结果，似乎健康的患者受损伤(例如在手术期间意外的或施加的)时经常令人意外地转向恶化和死亡。用增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂(如抗纤维蛋白溶解性氨甲环酸(TXA))的治疗可以降低一些纤维蛋白溶解亢进患者的死亡率，但对于纤维蛋白溶解停止患者则是非常有害的。此外，如果患者具有潜在的纤维蛋白溶解亢进，并且因此没有接受TXA，那么结果非常差。本发明允许鉴定具有潜在的纤维蛋白溶解亢进和纤维蛋白溶解停止的患者以改善他们的结果。
在一些实施方案中，少量或高量的血栓溶解剂涂覆在容器的内部，使得一旦将血液样品放入容器中，血栓溶解剂与血液样品接触。
止血期间还涉及血小板。由骨髓中的巨核细胞产生，直径约1um的这些小细胞浆囊充满活性生物介质(biological agent)。恰恰因为凝血级联的酶需要被激活以形成纤维蛋白凝块，四种介质-二磷酸腺苷(ADP)，肾上腺素，凝血酶和胶原激活血小板。称为糖蛋白IIb-IIIa(Gp IIb-IIIa)的粘合蛋白介导血小板聚集。促凝血因子纤维蛋白原附着于该受体，将血小板彼此连接。由纤维蛋白原连接的桥接代表聚集的主要来源。手术或创伤将促凝血因子暴露于组织因子，引发凝血级联。除了将纤维蛋白原转化为纤维蛋白外，还有一种加强凝块的聚合物，凝血级联会产生大量凝血酶，即血小板的主要激活剂。
在一些实施方案中，可以除去或减少血小板对患者凝块形成和强度的贡献，从由此允许基于仅凝块的纤维蛋白含量和纤维蛋白原的贡献来测定纤维蛋白溶解亢进或纤维蛋白溶解。
因此，在一些实施方案中，血液样品是具有降低的血小板功能的血液样品。例如，血液样品可以与血小板功能抑制剂接触以降低血液样品中血小板的功能。血液样品也可以被物理操作(例如进行离心)，以通过从血液样品物理去除血小板来减少血液样品中血小板的数量。
如上所述，纤维蛋白原和血小板均有助于凝块完整性。在本文所述的一些方法中，可以在已经减少血小板功能(例如通过用血小板抑制剂如细胞松弛素D处理样品)的血液样品中检测纤维蛋白溶解。如果通过添加抗纤维蛋白溶解剂(例如氨甲环酸)来防止血小板功能降低的样品中的纤维蛋白溶解，则纤维蛋白溶解可能不是由于血小板功能而是由于血栓形成级联中的纤维蛋白和其它因素。因此，被获得样品(并且易于发展，或正在经历纤维蛋白溶解或纤维蛋白溶解亢进)的患者可能对采用抗纤维蛋白溶解剂的治疗作出反应。因此，在一些实施方案中，与正常全血相比，被测试的血液样品具有降低的血小板功能。
注意，“降低的血小板功能”不意味着血液样品根本不具有任何血小板功能。相反，与正常全血相反，具有降低的血小板功能的血液样品只是具有降低的血小板功能。例如，具有降低的血小板功能的血液样品包括具有血小板功能的血液样品，其血小板功能比全血血小板功能低至少25％，或低至少50％，或低至少75％或至少低90％。血小板功能包括但不限于对止血的贡献。因此降低的血小板功能可以通过在血液凝固期间(例如，在高岭土和钙的存在下)血小板彼此聚集减少来评估。
在一些实施方案中，物理地操作血液样品以减少血液样品中血小板的数量。例如，可以将全血离心以去除一些或大部分血小板。在一个非常简单的程序中，可以将1.5ul血液在2.0ml微量离心管中以1000rpm离心10分钟。富含血小板的血浆将漂浮在上清液中血液的顶部。可以去除上清液(例如通过抽吸)，将血小板减少的全血留在管的底部。为了进行下述的粘弹性分析，需要少于500μl的血液，这是快速减少血液中血小板数量的非常快速的方法。
在另一种方法中，血小板减少的全血可以通过使全血与连接到固体表面的血小板特异性抗体接触而获得。血小板将选择性地结合到固体表面，并且可以获得血小板减少的全血。例如，特异性结合糖蛋白IIb/IIIa受体(其在血小板上但不在红细胞上表达)的抗体可以偶联到磁珠(例如，可从Life Technologies，Carlsbad，CA，USA商购获得的Dynabeads)。可以将全血与抗体包被的磁珠接触，并且在血小板被抗体结合之后，使用磁性。磁体将吸引珠子(从而将吸引血小板)，并且具有降低的血小板含量(从而降低的血小板功能)的剩余血液将不会与磁性结合，因此可以被收集。
在一些实施方案中，通过使血液样品与血小板功能抑制剂接触来降低血小板功能。一种非限制性血小板功能抑制剂是阿昔单抗(也称为c7E3Fab)。阿昔单抗是一种糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂，并且抑制血小板聚集。另外的非限制性血小板功能抑制剂包括二磷酸腺苷(ADP)受体抑制剂(如氯吡格雷，普拉格雷，替格雷洛，噻氯匹定)，磷酸二酯酶抑制剂(如西洛他唑)糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂(如阿昔单抗，依替巴肽和替罗非班)，腺苷再摄取抑制剂(例如，双嘧达莫)和血栓烷抑制剂，包括血栓烷合成酶抑制剂和血栓烷受体拮抗剂(例如，tertroban)。这些血小板功能抑制剂(或其组合)中的任何一种可以用于本文所述的方法中。
血小板功能抑制剂(包括上面列出的那些及其组合)是公知的，并且可以以已知浓度使用以降低全血中的血小板功能。在各种实施方案中，将血小板功能抑制剂以约2.5μg/ml至约250μg/ml的浓度施用于血液样品(例如全血样品)。
在本文描述的方法的一些实施方案中，一旦从患者收集全血样品，则可以以降低样品中血小板功能的方式处理血液(例如，通过物理操作或通过与血小板功能抑制剂接触)。例如，全血可以放置在已经含有血小板功能抑制剂的单个容器中。或者，可以将血小板功能抑制剂加入含有全血的容器中。或者，全血可以是血小板减少的(例如，通过从血液中物理清除血小板)。随着血小板功能的降低，血液样品可以分离成三个弹性测定测试组，第一测试是在不存在血栓溶解剂的情况下进行的，第二测试是在低量的血栓溶解剂存在下进行的，并且第三测试是在存在高量血栓溶解剂的情况下进行。
当然，在一些实施方案中，在加入血栓溶解剂的同时减少样品的血小板功能。因此，在一些实施例中，当被测试的血液样品放置在容器(例如杯子或比色皿)中时，血小板功能抑制剂在添加血液样品之前在容器中。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂涂覆容器的内部，使得一旦将血液样品放入容器中，血小板功能抑制剂与血液样品接触。
使用凝血弹性描记法(TEG)方法的功能性纤维蛋白原测定可从Haemonetics，Corp.(Braintree，MA，USA)购得。该测定包括血小板抑制剂，因此从纤维蛋白溶解测量除去血小板的贡献。已经描述了使用这种功能性纤维蛋白原测定(参见Harr等人，Shock 39(1)：45-49，2013)。
如下所述，为了在非常早期阶段检测纤维蛋白溶解停止或潜在的纤维蛋白溶解亢进，除了标准TEG或TEM测定，可以使用功能性纤维蛋白原(FF)测定(即，去除血小板对止血过程的贡献的TEG测定)。如上所述，与正常血液相比，来自患有纤维蛋白溶解停止或潜在的纤维蛋白溶解亢进的患者的血液在低量血栓溶解剂存在下或在存在高量血栓溶解剂的情况下将显示出差异。这些迹线(tracing)(例如，来自TEG，TEM或FF测定)将允许测定反映凝血过程的凝血特征值和反映纤维蛋白溶解过程的凝血特征值。
在另一方面，本发明提供了一种用于检测患者中的潜在的纤维蛋白溶解亢进或纤维蛋白溶解停止的方法，所述方法包括在低量血栓溶解剂存在下使来自患者的第一血液样品进行粘弹性分析，以获得患者的低凝血特征值；在高量血栓溶解剂存在下使来自患者的第二血液样品进行粘弹性分析，以获得患者的高凝血特征值；将患者的低凝血特征值与健康个体的低凝血特征值进行比较，通过使来自健康个体的血液样品在低量的血栓溶解剂存在下进行粘弹性分析凝血测定而获得健康个体的低凝血特征值，将患者的高凝血特征值与健康个体的高凝血特征值进行比较，使来自健康个体的血液样品在高量血栓溶解剂存在下进行粘弹性分析凝血测定而获得健康个体的高凝血特征值，其中与健康个体的低凝血特征值相比，患者的低凝血特征值的差异将该患者鉴定为具有潜在的纤维蛋白溶解亢进，并且其中患者的低凝血特征值与健康个体的低凝血特征值相比的差异将该患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。
在另一方面，本发明提供一种适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解亢进的容器，其包含具有包含低量血栓溶解剂的涂层的内部。另一方面，本发明提供了一种适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解停止的容器，其包含具有包含高量血栓溶解剂的涂层的内部。
当然，容器还可以包含用于稳定血栓溶解剂的稳定剂(也简称为稳定剂)。非限制性稳定剂包括EDTa，聚合物(例如PEG)，氨基酸(例如甘氨酸)，防腐剂(例如苄醇)，表面活性剂(例如非离子表面活性剂如聚山梨酸酯(Polysorbate)80，聚山梨醇酯(Polysorbate)20，Triton X010，普流尼克(Pluronic)F127和十二烷基硫酸钠(SDS))，以及糖和糖醇如蔗糖和海藻糖。
在一些实施方案中，容器可以是进行粘弹性分析的容器(例如，在TEG和ROTEM装置的上下文中通常称为“杯(杯子)”)，或单独容器，其中血液样品和纤维蛋白溶解剂和其它试剂在进行测定之前混合并孵育。
另一方面，本发明提供了一种包含用于检测血液样品中的异常纤维蛋白溶解的多个容器的药筒(cartridge)，其中容器中的至少一个包含具有包含低量血栓溶解剂的内部，并且容器中的至少一个包含具有包含高量血栓溶解剂的涂层的内部。在一些实施方案中，药筒中的容器缺少底面。
应当注意，虽然血栓溶解剂可以涂覆在药筒(cartridge)内的容器或容器的内部，但是低量或高量的血栓溶解剂可以容易地处于预先包装的形式(例如，作为丸剂或片剂或滴剂)，所述形式然后可以在将血液样品添加到容器中的同时、之前、或之后加入到容器(或药筒(cartridge)中的容器)中。对于tPA攻击的(激发的)TEG或tPA攻击的(激发的)TEM，在对血液样品进行TEG或TEM之前，将血栓溶解剂简单地添加到容器中的血液样品中。
在一些实施方案中，血栓溶解剂是单链或双链人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，来自另其他物种的tPA，阿替普酶，瑞替普酶，替奈普酶，阿尼普酶，血清激酶，链激酶，尿激酶，激肽释放酶或纤维蛋白溶酶/纤维蛋白溶解系统的任何其它上调剂。在一些实施方案中，血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂或人双链组织纤维蛋白溶酶原激活剂。在一些实施方案中，低量为约1ng/ml至约100ng/ml血栓溶解剂或约10ng/ml至约90ng/ml血栓溶解剂。在一些实施方案中，高量为110ng/ml至约1200ng/ml或约150ng/ml至约1000ng/ml血栓溶解剂。
在一些实施方案中，容器用于粘弹性分析，所述粘弹性分析使用TEG凝血弹性描记法分析仪系统或在ROTEM血栓弹性测量法分析仪系统中进行。
在一些实施方案中，所述药筒(cartridge)用于粘弹性分析，所述粘弹性分析使用TEG凝血弹性描记法分析仪系统或在ROTEM血栓弹性测量法分析仪系统中进行。
提供了以下实施例，其旨在说明而不是限制本文所述的本发明。
实施例1：采用血栓溶解剂的功能性纤维蛋白原TEG测定
简言之，从创伤患者获得柠檬酸化的全血样品。在肘前静脉中用21号针进行静脉穿刺，并将血液收集在含有3.2％柠檬酸盐(例如含有3.2％柠檬酸盐的3.5mL塑料)的抽空容器中。
功能性纤维蛋白原测定购自Haemonetics Corp.(Niles，IL，USA和Braintree，MA，USA)，并根据制造商的说明书在5000装置上进行。
为了进行功能性纤维蛋白原(FF)测定，将0.5mL柠檬酸化血液加入含有组织因子(凝血激活剂)和阿昔单抗(单克隆GPIIb/IIIa受体拮抗剂；有时称为FF试剂)的混合物的指定的FF-小瓶中，并且将血液样品轻轻地混合。将340uL等分试样从FF-小瓶转移至预先装载有20μL0.2mol/L CaCl2的37℃TEG杯中。FF测定测量无血小板凝块的凝血参数。将第二次340uL等分试样从FF-小瓶转移至预先装载有20μL0.2mol/L CaCl2的37℃TEG杯中，其中第二个TEG杯涂覆有75ng/ml组织纤维蛋白溶酶原激活剂(“低量tPA”)。将第三个340uL等分试样从FF-小瓶转移至预先装载有20μL0.2mol/L CaCl2的37℃TEG杯中，其中第三个TEG杯涂覆有150ng/ml组织纤维蛋白溶酶原激活剂(“高量tPA”)。
在TEG 5000装置上同时分析血液样品的三个部分(即，无tPA的FF，FF加低量tPA，以及FF加高量tPA)。如果血液样品正常，则每个样品与健康个体的无tPA的FF、FF加低量tPA、以及FF加高量tPA样品相同。
然而，如果血液样品是从具有潜在的纤维蛋白溶解亢进的患者中获取的，那么血液样品的低量tPA处理的部分将提供显著不同于来自也用低量tPA处理的健康个体的血液样品的TEG迹线(tracing)的TEG迹线(tracing)。如果从具有纤维蛋白溶解停止的患者取血液样品，则血液样品的高量tPA处理的部分将提供与来自也用高量tPA处理的健康个体的血液样品TEG迹线(tracing)显著不同的TEG迹线(tracing)。
实施例2：采用血栓溶解剂的多通道(MultiChannel)TEG测定
对于这些研究，遵循实施例1中的方案，其中柠檬酸盐化，但不进行功能性纤维蛋白原测定。
简而言之，从为了手术引入的患者收集全血。在肘前静脉中用21号针进行静脉穿刺，并将血液收集在含有3.2％柠檬酸盐(例如含有3.2％柠檬酸盐的3.5mL塑料Vacutainers)的抽空容器中。
将所采集的血液样品分成多个部分，并如下装载到多通道(和多容器)药筒上的TEG通道中。
在第一通道中，将340uL的柠檬酸化全血加载到通道中，通道预先装载有20μL0.2mol/L的CaCl2，并作为“柠檬酸化的天然的”样品运行。请注意，药筒中的每个通道和容器都没有底面。
将用于装载第二和第三通道的血液分别加入含有37.5和75ng tPA的冻干tPA的小瓶中。然后将500μL柠檬酸化的血液(即来自含有3.2％柠檬酸盐的Vacutainers)加入到这两个小瓶中的每一个中，导致小瓶中的75ng/ml和150ng/ml的tPA最终浓度。将小瓶轻轻倒置10次，然后将340μL其内容物吸移到第2和第3通道的TEG杯中，并且这些通道也运行作为“柠檬酸化的天然的”，附加说明，第二通道含有终浓度为75ng/ml的tPA，并且第三通道含有终浓度为150ng/ml的tPA。第二和第三通道中的每一个通道预先装载有20μL0.2mol/L的CaCl2。
结果示于表1和1B以及图7中(对于为75ng/ml的低tPA)，和在表2A和2B和图8中(对于150ng/ml的高tPA)。
表1B的结果通过图描述于图7。请注意，“面元(仓)中心(Bin Center)”是指在特定仓(bin)中的样品的平均LY30数的反映。例如，在表1中，测试的21.875％的创伤患者(其中在75ng/ml tPA存在下对其样品进行分析)具有的平均LY30值为5。相反，31.915％的健康个体(其中其样品在75ng/ml tPA存在下被分析)具有的平均LY30值为5。这是创伤患者的典型反应-在75ng/ml tPA存在下分析的大多数患者的样品将具有比来自健康个体的75ng/mmlTPA处理的样品更低的LY30LY30时间。
然而，存在创伤患者的小子集，当其血液样品在75ng/ml tPA存在下被分析时，其血液样品具有比在75ng/ml tPA存在下血液被分析的健康志愿者的LY30值更高的LY30值。在图7中，当LY30为25或更高时，出现这个子群。这些创伤患者可能具有潜在的纤维蛋白溶解亢进，并且应该被预防性施用治疗相关量的治疗剂，其增强血凝块或减缓血凝块的溶解诸如抗纤维蛋白溶解剂。
表2A和2B，以及图8显示在创伤患者和健康个体中在存在高(150ng/ml)tPA的情况下TEG分析的LY30数。
表2B的结果通过图描述于图8中。如表2A和2B以及图8显示，在150ng/ml tPA存在下，创伤患者的LY30值通常高于健康个体的LY30值，所述健康个体的血液样品在采用150ng/ml tPA的TEG测定中运行。这些个体通常具有高于40，特别是高于60的LY30值。这些个体具有纤维蛋白溶解停止，并且应该用治疗相关量的减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂治疗，以预防血栓栓塞事件和其他血栓相关的损伤。
重要的是要注意，在该实施例中，根据其LY30值诊断患者。换句话说，在MA时间(最大凝块强度)后30分钟诊断出患者。由于这一点通常在粘弹性分析开始后不到20分钟就达到，所以在不到50分钟的时间里诊断出患者。虽然这可能看起来是长时间，但重要的是要注意，潜在的纤维蛋白溶解亢进和纤维蛋白溶解停止状态通常在表面上健康的个体中被看到。事实上，如果患者是一个健康的个体，他或她可能不会被立即治疗，并且可能不得不在急诊室的候诊室等待，而其他显然不是健康个体的患者(例如老年患者或儿童)被首先处理。在一些实施方案中，当患者立即进入急诊室时，本发明的方法允许收集数据，并且在粘弹性分析开始一小时内提供结果。
实施例3.健康个体和具有异常纤维蛋白溶解的表面上健康个体的TEG迹线(tracing)的比较。
为了突出本发明的各种实施方案，本实施例3提供了来自以下组中的每一个的两名患者的迹线(tracing)：健康个体(图9A和9B)，纤维蛋白溶解停止(图10A和10B)，潜在的纤维蛋白溶解亢进(图11A和11B)，并且提供与潜在的纤维蛋白溶解亢进相反的常规(非潜在的纤维蛋白溶解亢进(图12A-12B))。
所有这些研究都在TEG 5000 Thrombelastograph系统(可从Haemonetics，Inc.，Braintree，MA购得)中进行，使用预先装载有20μL0.2mol/L CaCl2的杯。
在图9A和9B所示，显示了来自健康个体患者15(图9A)和患者33(图9B)TEG迹线(tracing)。图9A-9B中的白线是天然TEG(即采用柠檬酸化的全血)，绿线是全血加75ng/mltPA，粉红线是全血加150ng/ml tPA。从图9A和9B中可以看出，在健康个体中，未经处理的全血中没有纤维蛋白溶解(或很少)。当用75ng/ml tPA(绿线)处理血液时，纤维蛋白溶解以适度的速度发生。在150ng/ml tPA(粉红线)的存在下，这种纤维蛋白溶解速度急剧增加。有关健康志愿者患者33的TEG曲线的更详细的说明，请参见下面的实施例9和图40。
在图10A和10B中，显示来自纤维蛋白溶解停止患者22(图10A)和患者38(图10B)的TEG迹线(tracing)。图10A-10B中的白线是天然TEG(即采用柠檬酸化的全血)，绿线是全血加75ng/ml tPA，粉红线是全血加150ng/ml tPA。从图10A和10B中可以看出，在纤维蛋白溶解停止的患者中，不发生纤维蛋白溶解，即使在高量的血栓溶解剂tPA存在下也不发生。如果这些患者没有立即用治疗相关量的tPA(或另一种减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂)进行治疗，那么他们处于由血栓阻断血液供应给器官和/或血栓栓塞事件(例如，如果在肺部中则为肺栓塞或如果在脑中则为中风)导致的器官衰竭的危险之中。
在图11A和11B中，显示了潜在的纤维蛋白溶解亢进患者3(图11A)和患者24(图11B)的TEG迹线(tracing)。图11A-11B中的白线是天然TEG(即采用柠檬酸化全血)，绿线是全血加75ng/ml tPA，粉红线是全血加150ng/ml tPA。从图11A和11B中可以看出，在具有潜在的纤维蛋白溶解亢进的患者中，即使采用低量血栓溶解剂(即25ng/ml tPA，绿线)也快速发生纤维蛋白溶解，并且在大量150ng/ml tPA(粉红色线)的存在下，凝块溶解得如此之快，以至于显著无效。如果这些患者不立即用治疗相关量的增强血凝块或减缓凝块溶解的治疗剂(例如氨甲环酸)治疗，则他们处于出血死亡的危险中。注意，当在tPA存在下不分析这些潜在纤维蛋白溶解亢进患者的血液样品时，他们的血凝块不溶解(参见图11A和11B中的白线)。
最后，在图12A和12B中，显示了经典(或公开)纤维蛋白溶解亢进患者，即患者4(图12A)和患者36(图12B)的TEG迹线(tracing)。图12A-12B中的白线是天然TEG(例如，采用柠檬酸化的全血)，绿线是全血加75ng/ml tPA，粉红线是全血加150ng/ml tPA。从图12A和12B中可以看出，在具有明显纤维蛋白溶解亢进的患者中，纤维蛋白溶解在不向这些患者的血液样品中添加任何tPA的情况下发生。当加入低量的血栓溶解剂(例如，25ng/ml tPA；绿线)时，纤维蛋白溶解发生得更快，并且在存在高量血栓溶解剂(例如，150ng/ml tPA；粉红色线)的情况下更快发生。
注意，对于被鉴定为具有纤维蛋白溶解停止(图10A和10B)的患者，其血液样品可以使用TEG测定在存在不同量的tPA的情况下测试，以定制促进其血凝块溶解的所需的tPA量。例如，患者22(图10A)和患者38(图10B)都具有对150ng/ml tPA无响应的凝块。使用本文所述的测定，可以增加tPA的浓度，以在TEG测定中找到在体外分解其凝块所需的tPA浓度。然后，患者可以全身施用该量的tPA以体内溶解血凝块，从而防止与血凝块相关的不良结果。受益于tPA治疗的这种调节的一些患者包括但不限于具有包括深静脉血栓形成(DVT)，肺栓塞(PE)，心肌梗死(MI)或缺血性中风的疾病状况的患者。
实施例4：鉴定受益于本文所述方法的表面上健康的个体
本实施例4提供了一个条件性例子，以示出本发明某些实施方案的实际应用。在这个条件性例子中，各种年龄的患者在涉及两辆公共汽车的公路坠毁后被带进医院急诊室，一辆公共汽车携带四十名年长公民，另一辆公共汽车携带四十名当地大学管弦乐团的学生。年长公民的平均年龄为60岁。学生的平均年龄是19岁。两种性别平等地体现在两辆公共汽车中。
鉴于他们年龄的差异，患者被分类，使得年长公民得到更高的紧急护理优先权。然而，在低量的血栓溶解剂(例如75ng/ml tPA)存在下和在高量血栓溶解剂(例如，150ng/mltPA)存在下的TEG迹线(tracing)针对所有二十位学生获得。随着事故的消息传播到大学，学生的同学和朋友到达急诊室。在75ng/ml TPA和在150ng/ml tPA存在下，从未受损伤的学生获得TEG迹线(tracing)。未受损伤的学生的平均年龄为19岁。
大多数受损伤管弦乐队学生在75ng/ml TPA存在下和在150ng/ml tPA存在下具有的TEG迹线(tracing)基本上与未受损伤的学生在75ng/ml TPA存在下和在150ng/ml tPA存在下的TEG迹线(tracing)的大部分相同。大多数这些未受损伤的学生因此是健康个体，作为这里使用的术语。
然而，两名受损伤管弦乐团学生被发现在75ng/ml tPA的存在下的TEG迹线(tracing)不同于未受损伤的学生在75ng/ml tPA的存在下的TEG迹线(tracing)。这两名学生的LY30数高于未受损伤的学生的LY30数。这两名学生中的一名立即用氨甲环酸治疗。她完全康复。这两名学生中第二名的异常TEG迹线(tracing)不幸被忽视。因此，他没有服用氨甲环酸。他在紧急候诊室中似乎很好，但是突然在他的表面伤口出血增加，并且他显示内出血的标志(例如轻度头痛，腹痛，头痛)。当急诊室的工作人员警觉到他突然恶化时，他死亡。
另外，两个受损伤管弦乐队成员被发现在150ng/ml tPA的存在下具有的TEG迹线(tracing)与未受损伤的学生在150ng/ml tPA的存在下的TEG迹线(tracing)不同。这两名学生的LY30数低于未受损伤的学生的LY30数。其中一名学生立即用减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂(如抗凝血剂(例如达比加群))治疗，并完全康复。两名学生中的另一名被忽视。当她的异常TEG迹线(tracing)被注意到时，她的身体中的大块血凝块已经减少了血液供应给她的一个肾脏。她幸存下来，但是结果是肾脏永久性受损伤。
这个条件性例子表明，使用本文描述的一些方法，四名受损伤的管弦乐学生是表面上健康个体，然而不是健康个体。然而，由于他们的年轻，他们在急诊室被忽视。他们的异常TEG迹线(tracing)被发现，他们在存在75ng/ml tPA或150ng/ml tPA的情况下的TEG迹线(tracing)与健康个体在存在75ng/ml tPA或150ng/ml tPA的情况下的TEG迹线(tracing)相比，所述异常TEG迹线(tracing)将这四名患者鉴定为具有异常纤维蛋白溶解的表面上健康的个体。如本文所述，如果立即用增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂诸如抗纤维蛋白溶解剂(例如氨甲环酸)治疗具有潜在的纤维蛋白溶解亢进的患者，则该患者可以完全恢复，但是如果不治疗，则患者可能死亡。类似地，如果立即用减弱血凝块或加速血凝块的溶解的治疗剂如抗凝血剂(例如达比加群)治疗患有纤维蛋白溶解停止的患者，那么患者可能会完全恢复，但是如果没有治疗，则患者可能遭受永久性损伤或可能死亡。
实施例5：鉴定可能受益于移植物的终末期肾脏疾病的个体
简介：终末期肾病(ESRD)患者显示凝血的各种紊乱。在这些患者中可以发现低凝性和高凝性的混合模式，伴随凝块形成的酶相的矛盾延长，随后快速凝块生长和升高的最终凝块强度。本实施例旨在阐明ESRD凝血病的可高凝的组分的详细特征，以发展旨在预防透析接近移植物(dialysis access graft)血栓形成的预防性治疗的靶标。
方法：在透析接近建立时从16名连续的ESRD人类患者收集血液，并与使用多通道凝血弹性描记法(TEG)的53名健康个体(志愿者)进行比较。使用快速TEG和功能纤维蛋白原(血小板抑制的)TEG来评估凝块强度和血小板和纤维蛋白原的相对贡献。使用tPA攻击的(激发的)TEG来评估纤维蛋白溶解敏感性，使用TEG的30分钟凝血特征(LY30)参数，当样品用外源性tPA攻击时(例如，采用两个剂量，一个在75ng/ml人单链tPA，和一个在150ng/ml人单链tPA。通过聚集测量法和TEG血小板作图评估血小板功能。
结果：通过快速TEG最大振幅(MA)测量的总体凝块强度在ESRD患者中升高在71±6mm，与之相比的是健康对照组的66±4(p＝0.0005，双尾Mann-Whitney检验)。功能性纤维蛋白原水平(通过血小板抑制性TEG MA)在ESRD患者中甚至更显著升高在32(IQR 29-37)mm，而对照组为20(IQR 17-22)mm(p<0.0001)。ESRD患者还显示出对纤维蛋白溶解增加的抗性，在高剂量tPA(即150ng/ml tPA)的情况下，tPA攻击的(激发的)TEG LY30为29％(IQR为15-39％)，与之相比的是健康对照组为56％(IQR 40-65％)(p＝0.0004)。ESRD患者的血小板功能测试均在正常限度内。ESRD患者对低量和高量tPA均有抗性，表明他们处于纤维蛋白溶解停止状态。
结论：血纤维蛋白原过多症(Hyperfibrinogenemia)(即潜在的纤维蛋白溶解亢进)和纤维蛋白溶解受损(即纤维蛋白溶解停止)是ESRD中观察到的高凝性的原因，可能导致移植物/瘘血栓形成。由于ESRD中酶促凝血已经延长，血小板功能通常是正常的，传统药剂如肝素或阿司匹林在预防移植物/瘘血栓形成方面的预防性益处有限。影响纤维蛋白凝块强度和促进纤维蛋白溶解的抗纤维蛋白溶解治疗剂(例如，因子XIIIa抑制剂，氨甲环酸(TXA)，PAI-1拮抗剂或低剂量血栓溶解剂如组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA))因此可更广泛用于保持透析接近。
该实施例5的结果显示，在高量血栓溶解剂(例如，150ng/ml tPA)存在下的TEG分析中，来自ESRD患者的血液样品的LY30值低于来自健康个人的血液样品。在本发明的一些实施方案中，这些ESRD患者被鉴定为可能具有(或已经具有)纤维蛋白溶解停止。这些ESRD患者可受益于预防性施用治疗相关量的减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂(例如，PAI-1拮抗剂，因子XIIIa，tPA，肝素，华法林，直接凝血酶抑制剂(如达比加群)和因子Xa抑制剂(如阿哌沙班)。
实施例6：低剂量和高剂量tPA的测定
健康个体的平均值
进行这些研究以确定健康个体的平均LY30值，健康个体血液样品用75ng/ml tPA或150ng/ml tPA处理
对于75ng/ml tPA，测试了150名健康志愿者的血液样品。最小LY30为0.7。25％百分位数LY30值为5.875。中位数LY30值为8.6。75％百分位数LY30值为12.3。最大LY30为52.9。对于在75ng/ml tPA存在下测试血液样品的健康个体，平均LY30值为10.987，标准偏差为7.565，平均值的标准误差为0.6177。平均值下(较低的)95％CI为8.97813，平均值的上(较高的)95％CI为11.4192。
图13A显示在75ng/ml tPA存在下健康志愿者血液样品的LY30数量的频率。如上所述，仓是特定仓中样品的平均LY30值的反映。例如，LY30值最接近5的所有样品将被放入仓5中。如在图13A中可以看出的，仓5和10(即，5和10的LY30数)具有最高的频率。
对于159ng/ml tPA，测试115名健康志愿者的血液样品。最小LY30为5.8。25％百分位数LY30值为40.1。中位数LY30值为53.5。75％百分位数LY30值为62.4。最大LY30为73.9。对于在150ng/ml tPA存在下测试血液的这些健康个体，平均LY30值为49.7，标准偏差为16.8592，平均值标准误差为1.572。平均值下(较低的)95％CI为46.5865，平均值的上(较高的)95％CI为52.8152。
图13B显示在150ng/ml tPA存在下健康志愿者血液样品的LY30数量的频率。从图13B中可以看出，仓55和60(即55和60的LY30数量)具有最高的频率)，尽管来自健康个体的大多数血液样品在存在150ng/ml tPA的情况下具有50至70之间的LY30值。
实施例7：生产含有低量tPA和高量tPA的容器和药筒(cartridge)
人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)获自Molecular Innovations(Novi，Michigan)。这用于制造单个500ul小瓶，其中每个小瓶含有37.5ng tPA或75ng tPA。加入500ul之后。在专有混合物(专利药混合物)中冻干。
含有37.5ng tPA的500ul小瓶和含有75ng tPA的500μl制备如下：
将人单链tPA与以下混合：25μl的30mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.4具有1％BSA。将tPA冻干并置于小瓶中，使37.5ng或75ng置于每个500μl小瓶中。在一些实施方案中，冻干的tPA被涂覆在小瓶的内壁上。
在加入500μl(即0.5ml)血液样品(例如全血或血浆)后，含有37.5ng tPA的小瓶中的tPA浓度为75ng/ml tPA，tPA浓度在含有75ng tPA的小瓶中为150ng/ml tPA。
当然，使用含有不同量的tPA的小瓶或其他容器或药筒(cartridge)可以容易地实现其它浓度的tPA。
一旦将血液样品加入到小瓶中，则通过倒置小瓶将tPA混合到血液样品中。例如，小瓶可以是TEG杯。在另一个实施方案中，可将小瓶的混合内容物(即与血液样品混合的tPA)转移至TEG容器或TEG药筒(cartridge)。
例如，可将340μl小瓶的混合内容物转移至预先装载有20μL0.2mol/L CaCl2的37℃TEG杯中。然后可以对加载到TEG杯中的样品进行TEG分析。
实施例8：纤维蛋白溶解亢进
全身性纤维蛋白溶解亢进是创伤性诱导的凝血病(TIC)的关键组分，并且是高度致死的-与超过60％的死亡率相关(图14)。如图15所示，这种病理学的详细分子机制仍有待阐明，但已知外伤中的纤维蛋白溶解亢进主要由tPA/纤维蛋白溶酶系统驱动，如通过其与氨甲环酸(TXA)的可逆性所证明的。
如通过图在图16中所示，组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)催化酶原纤维蛋白溶酶原转化为其有活性的纤维蛋白溶解型纤维蛋白溶酶。纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)是tPA的同源抑制剂，与其形成相互抑制的共价复合物(图17)。这会关闭纤维蛋白溶酶系统(图18)。tPA和PAI-1是相互抑制的，与由肝脏无活性和清除的共价复合物平衡存在(参见图19)。在TEG中具有可证明的纤维蛋白溶解亢进的创伤患者子集中，初步工作显示出不可检测的低水平的PAI-1活性。然而，尽管缺血性状况如心肌梗死(MI)、中风和血管疾病中，总PAI-1增加，但这主要是与PAI-1无活性共价复合物的形式。此外，微血管内皮能够释放tPA以应对缺血性应激以及在出血性休克中显著升高的儿茶酚胺和血管加压素。
如图20-25中所示，已经表明活化的蛋白C(aPC)通过因子V和VIII的降解是TIC的驱动剂(驱动器)(图20-23)。此外已经表明，aPC介导的PAI-1降解是创伤中全身性纤维蛋白溶解亢进的主要原因(图24-25)。
然而，主成分分析已经证明，TIC的纤维蛋白溶解亢进成分(被认为是构成图26中的主要成分3的血栓弹性图的LY30参数)与TIC的凝血酶产生成分是不同的，并且与其互相独立。因此，这两个现象必须在机械上是截然不同的，并且不能都由aPC介导。
因此，损伤后纤维蛋白溶解亢进可能是由于tPA的过量产生而不是PAI-1的破坏。
为了测试这一点，针对纤维蛋白溶解亢进筛选了86名连续严重受损伤的创伤患者(中位数损伤严重程度评分(ISS)为25，中值基础(基线)过量：-7.5)，并与健康对照(例如健康志愿者)进行比较。使用活性ELISA和免疫测定法，定量了这些患者血浆(和健康对照组血浆)中的有活性的PAI-1，有活性的tPA和非活性共价tPA/PAI-1复合物的相对水平。
粘弹性止血测定凝血弹性描记术或“TEG”测量发展的血凝块的机械强度以测量纤维蛋白溶解(参见图27)
随着凝块的强度随着时间的推移而增加，经典的TEG曲线随时间在X轴上发生，并且在Y轴上产生凝块强度。(参见图4和图28)。在MA后30分钟内的凝块裂解量或LY30定量纤维蛋白溶解作为TEG曲线下潜在面积的损失(参见图29)。
如预期的那样，纤维蛋白溶解亢进患者不仅在其TEG上显示出严重的凝块裂解(参见图30)，而且一般也较为严重，中位ISS为33，基础缺陷为9，死亡率为52％。
测量总PAI-1水平(有活性的PAI-1及其与tPA的复合物的总和)。纤维蛋白溶解亢进患者和健康对照组的水平相同(见图31，左图)，而总血浆tPA显著上升近2个数量级(见图31，右图)。这反映了在纤维蛋白溶解亢进患者中显著转移为PAI-1与tPA的复合形式。与所述转移并行的是，活跃的tPA从健康对照中的最低水平上升了近10倍，反映出随着PAI-1的储备被压倒，tPA的溢出。(参见图32，右图)。
为了将其正确地(符合透视法地)安置，图33是所讨论的三种物种之间的整体变化的图示：tPA的活性形式(红色条的顶部)，PAI-1的活性形式(蓝色条的底部)和惰性复合物(紫色条的中部。健康的人具有广泛的有活性的PAI-1的储备，少量的复合物和几乎没有活性的tPA(参见图33，左侧条)。在创伤的纤维蛋白溶解亢进中，总tPA水平显著上升，驱动游离tPA进入复合物。请注意，图33右侧条中纤维蛋白溶解亢进创伤患者中有活性的PAI-1作为蓝色条的量非常低。
因此，具有出血性休克的创伤中的纤维蛋白溶解亢进是由tPA水平的大量增加驱动的，而不是由PAI-1的破坏驱动的。通过驱动共价PAI-1/tPA复合物的形成，大量过量的tPA使PAI-1失活，其随后被清除。
为了临床应用，开发了本文所述的测定。在一些实施方案中，开发了本文所述的新TEG测定，其中在运行TEG之前，将患者的血液与小浓度的tPA一起孵育。tPA的这种外源性攻击揭示了tPA过量和相对PAI-1缺乏的这种状况。该测定比传统的TEG提供了比传统TEG更明确的纤维蛋白溶酶系统状态的信号，比免疫测定快得多，并且还揭示潜在的纤维蛋白溶解亢进的、可能刚刚在失代偿阈值的患者。如图34所示，与正常健康志愿者相比，纤维蛋白溶解亢进患者在进行TEG测量前，用75ng/ml tPA孵育他们的血液时，血纤蛋白溶解明显高于正常健康志愿者(由LY30测量)。
总之，有活性的PAI-1的酶促降解不是创伤诱导的纤维蛋白溶解亢进的显著特征，而是PAI-1的群体从其游离的活性形式转移至具有tPA的无活性复合物。tPA攻击的TEG是在创伤性损伤过程中早期的tPA过量的演变的简单功能测定。
实施例9：纤维蛋白溶解停止
止血紊乱在创伤中是常见的-但止血(当然)不仅仅是凝血。止血是维持血液在被期望流动的地方流动，以及预防血液在不应该流动的地方流动--预防出血-血液从血管隔离区逃脱。出血和凝血之间的这种体内平衡由两个相互关联和平衡的系统保持：凝血和纤维蛋白溶解(见图35)。这一平衡主要由凝血酶和纤维蛋白溶酶的各自活性驱动(图36)，其催化凝块的纤维蛋白基质的建立和溶解并保持止血平衡(图37)。
纤维蛋白溶解系统在创伤中经常紊乱。虽然如上在实施例8中所述发生创伤性诱导性凝血病(TIC)的环境中的纤维蛋白溶解亢进的致死现象，但是该病理学仅包括在创伤中观察到的纤维蛋白溶解活性谱的一小子集。纤维蛋白溶解有三种不同的表型，在谱一端具有纤维蛋白溶解亢进，发生率低于20％，最常见的状态“纤维蛋白溶解停止”(包括严重受损伤的创伤接纳者的>60％)在谱另一端(参见图3和38)。与生理水平纤维蛋白溶解的患者相比，在这两种纤维蛋白溶解活性极端，死亡率升高，产生“U型”死亡率分布(见图38)。在纤维蛋白溶解停止的情况下，死亡率主要是由于晚期原因，如多器官功能衰竭，而不是出血-严重质疑这些类型的患者是否会通过经验性地使用抗纤维蛋白溶解药如TXA(见图39)而得到帮助。
纤维蛋白溶解是严格调节的内稳态系统的一部分，其主要末端效应物是纤维蛋白溶酶。tPA催化酶原纤维蛋白溶酶原转变为纤维蛋白溶酶，其活性，纤维蛋白溶解形式(参见图16和17)。PAI-1是tPA的同源抑制剂，与其形成相互抑制性共价复合物，关闭纤维蛋白溶酶系统(参见图18)。
tPA在纤维蛋白溶解亢进中占主导地位。促进PAI-1活性抑制(图32，左图)的升高的tPA活性(图32，右图)是创伤中纤维蛋白溶解亢进的主要特征。在纤维蛋白溶解停止(例如升高的PAI-1，促进tPA活性的抑制)的环境中获得了这种情况的逆转。因此，创伤性损伤中的纤维蛋白溶解停止可能主要是由于升高的PAI-1。
为了测试这一点，收集了来自47次连续创伤激活的现场血液和血浆样品，其中纤维蛋白溶解停止。为了本研究的目的，纤维蛋白溶解停止被保守地定义为<0.8％TXA可逆纤维蛋白溶解，这基于他们的接纳(admission)血栓弹性图。通过TEG筛查47例连续最高水平的创伤激活患者的纤维蛋白溶解停止(患者具有中位数ISS 17，中位数BD 7)。将他们与正常纤维蛋白溶解的14名健康志愿者通过两种测定进行比较：用外源性tPA攻击的TEG-以检测对患者纤维蛋白溶酶系统激活的功能抗性程度，以及三元ELISA(triple ELISA)，其用于有活性的PAI-1，有活性的tPA和PAI-1/tPA的无活性复合物。
图9B和40显示来自健康志愿者患者33的血液样品的TEG曲线，其使用本文所述的tPA攻击的TEG测定，并且用于本研究中。该测定(有时称为tPA攻击的TEG)是在各种浓度的外源性tPA存在下采用全血运行的标准TEG。图9B和40显示了以下健康对照受试者的TEG迹线(tracing)：当TEG测定运行时血液未被处理的健康对照受试者(“天然的”TEG迹线(tracing))，血液在低量的75ng/ml的tPA存在下在TEG测定中运行的健康对照受试者(“低剂量(低量)tPA”)，血液在150ng/ml的高量tPA存在下在TEG测定中运行的健康对照受试者(“高剂量(高量)tPA”)。如预期的，由LY30测量的纤维蛋白溶解在健康个体中随着tPA-攻击剂量而增加。
然而，纤维蛋白溶解停止患者对外源性tPA具有抗性。如图41所示，基于创伤患者的接纳TEG无可检测的纤维蛋白溶解的创伤患者基于tPA攻击的(激发的)TEG显示对外源性tPA的抗性。图41显示了这些患者血液对高剂量(高量)tPA(150ng/ml)的反应。如图41显示，纤维蛋白溶解停止患者的中位tPA-攻击的LY30比健康对照低20％。
毫无疑问，有活性的PAI-1在创伤性纤维蛋白溶解停止患者中比健康志愿者几乎高6倍，有些患者达到正常水平的100倍左右(见图42)。
为了将这些数据放入全局上下文中，图43示出了有活性的PAI-1(在图43中的条底部为蓝色)有活性的tPA(在图43中的条的顶部为红色)和相互失活的复合物(在图43中的条中间为紫色)跨越三个不同群体的相对水平的图形表示：左侧的健康志愿者，中间的纤维蛋白溶解停止的创伤患者显示大量升高的PAI-1，以及右侧的纤维蛋白溶解亢进创伤患者。有趣的是，纤维蛋白溶解停止的创伤患者显示出升高的总tPA(条的红色和紫色部分的总和)，但是这几乎全部通过压倒性PAI-1(蓝色在图43中的条的底部)被驱动到非活性复合物。)。相反，在43图的右边，纤维蛋白溶解亢进的创伤患者有相反的关系，其具有升高的tPA水平，这驱动PAI-1进入无活性复合物。(另见图2)
总之，与健康对照相比，纤维蛋白溶解停止的创伤患者基于他们的接纳TEG(包括>60％严重受损伤的患者)显示出对外源性tPA的抗性增加和有活性的PAI-1增加6倍，而在这些患有纤维蛋白溶解停止的患者中，有活性的tPA被抑制到接近零。
从临床适用性的角度来看，作为功能测定的tPA攻击的(激发的)TEG可以用于区分具有异常升高的PAI-1和完全非功能性纤维蛋白溶酶系统的创伤患者，与基于他们的TEG仅仅没有明显的纤维蛋白溶解证据的创伤患者。图44是在健康志愿者(绿色菱形)和创伤患者(紫色方块)中作为高剂量(高量)tPA-攻击的(激发的)TEG反应的函数的有活性的PAI-1水平的简单散点图。如图44所示，PAI-1异常升高的所有创伤患者显示其对外源性tPA攻击的反应的抑制，意味着该测定具有优异的阴性预测值。因此，该测定是用于严重纤维蛋白溶解停止的良好功能筛选工具。
因此，大多数严重受损伤的患者由于其PAI-1水平的大幅提高，对tPA具有抗性，因此如果给予抗纤维蛋白溶解剂，则潜在地存在不良事件的风险。本文所述的tPA攻击的(激发的)TEG测定提供了在这些创伤患者中快速筛选和诊断纤维蛋白溶解停止的手段，并因此避免不必要的和可能有害的抗纤维蛋白溶解治疗。
上述本发明的实施方案仅仅是示例性的；许多变化和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。所有这些变化和修改旨在在如任何所附权利要求所限定的本发明的范围内。
要求保护的是：

Claims (64)

1.一种用于检测患者中的异常纤维蛋白溶解的方法，所述方法包括
a)在已知量的血栓溶解剂的存在下使来自患者的血液样品进行粘弹性分析，以获得患者的凝血特征值；和
b)将患者的凝血特征值与健康个体的凝血特征值或一组健康个体的平均凝血特征值进行比较，通过使来自健康的血液样品在已知量的血栓溶解剂存在下进行粘弹性分析获得所述健康个体的凝血特征值，通过使来自一组健康个体的血液样品在已知量的血栓溶解剂存在下进行粘弹性分析获得所述一组健康个体的平均凝血特征值，
其中与健康个体的凝血特征值或一组健康个体的平均凝血特征值相比，患者的凝血特征值的差异将患者鉴定为具有异常的纤维蛋白溶解。
2.权利要求1的方法，其中所述凝血特征值是LY30值或LI30值。
3.权利要求1的方法，其中血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。
4.权利要求1的方法，其中所述血栓溶解剂选自由以下组成的组：人tPA，人单链tPA，人双链tPA，来自非人哺乳动物物种的tPA，阿替普酶，瑞替普酶，替奈普酶，阿尼普酶，血清激酶，链激酶，尿激酶和激肽释放酶。
5.权利要求1的方法，其中所述已知量是低量的，并且所述异常纤维蛋白溶解状况是纤维蛋白溶解亢进。
6.根据权利要求5所述的方法，其中与健康个体的凝血特征值或与一组健康个体的平均凝血特征值相比，患者的凝血特征值的增加将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解亢进。
7.权利要求5的方法，其中所述低量为约1ng/ml至约100ng/ml血栓溶解剂。
8.权利要求5的方法，其中所述血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，并且所述低量为约75ng/ml。
9.权利要求1的方法，其中所述已知量是高量的，并且所述异常纤维蛋白溶解状况是纤维蛋白溶解停止。
10.权利要求9的方法，其中与健康个体的凝血特征值或一组健康个体的平均凝血特征值相比，患者的凝血特征值的降低将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。
11.权利要求8的方法，其中所述高量为约110ng/ml至约1200ng/ml血栓溶解剂。
12.权利要求9的方法，其中所述血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，并且所述低量为约150ng/ml。
13.权利要求1的方法，其中所述粘弹性分析使用在容器的内部容纳所述样品的容器进行。
14.权利要求1的方法，其中所述粘弹性分析使用容器和销(pin)进行，其中所述销(pin)相对于所述容器移动。
15.权利要求1的方法，其中所述粘弹性分析使用容器和销(pin)进行，其中所述容器相对于所述销(pin)移动。
16.权利要求13的方法，其中所述容器缺少底面。
17.权利要求1的方法，其中所述患者是人或非人动物。
18.权利要求1的方法，其中所述患者具有或正在经历选自由以下组成的组的状况：手术，疾病状况，危重疾病，创伤，出血和血栓栓塞事件。
19.权利要求5的方法，其中鉴定为具有纤维蛋白溶解亢进的患者被施用治疗相关量的增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂。
20.权利要求19的方法，其中增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂选自由以下组成的组：抗纤维蛋白溶解剂，全血，血浆，低温沉淀物，因子XIII，纤维蛋白原，其他特异性凝血因子浓缩物，以及前述物质的一种或多种的组合。
21.权利要求19的方法，其中基于所述患者的凝血特征值来确定增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂的治疗相关量。
22.权利要求9的方法，其中被鉴定为具有纤维蛋白溶解停止的患者被施用治疗相关量的减弱血凝块或加速血凝块的溶解的治疗剂。
23.权利要求22的方法，其中所述减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂选自由以下组成的组：阿司匹林，肝素，氯吡格雷，华法林，直接凝血酶抑制剂，因子Xa抑制剂，tPA，抗凝血剂，血栓溶解剂，抗纤维蛋白原剂，抗因子XIII剂，糖蛋白IIb/IIIa抑制剂和抗血小板剂。
24.权利要求22的方法，其中基于所述患者的凝血特征值来确定所述减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂的治疗相关量。
25.一种用于检测患者中潜在的纤维蛋白溶解亢进或纤维蛋白溶解停止的方法，所述方法包括
a)在低量的血栓溶解剂的存在下使来自患者的第一血液样品进行粘弹性分析，以获得患者的低凝血特征值；
b)在高量血栓溶解剂的存在下使来自患者的第二血液样品进行粘弹性分析，以获得患者的高凝血特征值；
c)将患者的低凝血特征值与健康个体的低凝血特征值或一组健康个体的平均低凝血特征值进行比较，通过使来自健康个体的血液样品在低量的血液溶解剂的存在下进行粘弹性分析获得所述健康个体的低凝血特征值，以及通过使来自一组健康个体的血液样品在低量的血液溶解剂的存在下进行粘弹性分析获得所述一组健康个体的平均低凝血特征值，
d)将患者的高凝血特征值与健康个体的高凝血特征值进行比较，通过使来自健康个体的血液样品在高量的血栓溶解剂的存在下进行粘弹性分析获得所述健康个体的高凝血特征值，
其中患者的低凝血特征值与健康个体的低凝血特征值或与一组健康个体的平均低凝血特征值相比的差异将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解亢进(例如潜在的纤维蛋白溶解亢进)并且其中患者的高凝血特征值与健康个体的高凝血特征值或与一组健康个体的平均高凝血特征值相比的差异将该患者鉴定为具有纤维蛋白溶解停止。
26.权利要求25的方法，其中所述血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。
27.权利要求253的方法，其中所述血栓溶解剂选自由以下组成的组：人单链tPA人双链tPA，来自非人哺乳动物物种的tPA，阿替普酶，瑞替普酶，替奈普酶，阿尼普酶，血清激酶，链激酶，尿激酶，和激肽释放酶。
28.权利要求25的方法，其中所述低量为约1ng/ml至约100ng/ml血栓溶解剂。
29.权利要求25的方法，其中所述血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，并且所述低量为约75ng/ml。
30.权利要求25的方法，其中与健康个体的低凝血特征值或与一组健康个体的平均低凝血特征值相比，患者的低凝血特征值的增加将患者鉴定为具有纤维蛋白溶解亢进。
31.权利要求25的方法，其中所述高量为约110ng/ml至约1200ng/ml血栓溶解剂。
32.权利要求25的方法，其中所述血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，并且高量为约150ng/ml。
33.权利要求25的方法，其中与健康个体的高凝血特征值或与一组健康个体的平均高凝血特征值相比，患者的高凝血特征值的降低将患者认定为纤维蛋白溶解停止。
34.权利要求25的方法，其中所述粘弹性分析使用在所述容器的内部容纳所述样品的容器进行。
35.权利要求34的方法，其中使用容器和销(pin)进行所述粘弹性分析，其中所述销(pin)相对于所述容器移动。
36.权利要求34的方法，其中所述粘弹性分析使用容器和销(pin)进行，其中所述容器相对于所述销(pin)移动。
37.权利要求34的方法，其中所述容器缺少底面。
38.权利要求25的方法，其中所述凝血特征值选自基本上由LY30值和LI30值组成的组。
39.权利要求25的方法，其中所述患者是人类或非人类动物。
40.权利要求25的方法，其中所述患者具有或正在经历选自由以下组成的组的状况：手术，疾病状况，危重疾病，创伤，出血和血栓栓塞事件。
41.权利要求25的方法，其中鉴定为具有纤维蛋白溶解亢进的患者被施用治疗相关量的增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂。
42.权利要求41的方法，其中增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂选自以下组成的组：抗纤维蛋白溶解剂，全血，血浆，低温沉淀物，因子XIII，纤维蛋白原和其他特异性凝血因子浓缩物。
43.权利要求40的方法，其中基于所述患者的低凝血特征值来确定增强血凝块或减缓血凝块溶解的治疗剂的治疗相关量。
44.权利要求25的方法，其中被鉴定为具有纤维蛋白溶解停止的患者被施用治疗相关量的减弱血凝块或加速血凝块的溶解的治疗剂。
45.权利要求44的方法，其中减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂选自由以下组成的组：阿司匹林，肝素，氯吡格雷，华法林，直接凝血酶抑制剂，因子Xa抑制剂，tPA，抗凝血剂，血栓溶解剂，抗纤维蛋白原剂，抗因子XIII剂，糖蛋白IIb/IIIa抑制剂和抗血小板剂。
46.权利要求44的方法，其中基于患者的高凝血特征值来确定减弱血凝块或加速血凝块溶解的治疗剂的治疗相关量。
47.一种适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解亢进的容器，其包含具有包含低量血栓溶解剂的涂层的内部。
48.权利要求47的容器，其中所述血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。
49.如权利要求47的容器，其中所述低量为约1ng/ml至约100ng/ml血栓溶解剂。
50.权利要求47的容器，所述血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，并且其中所述低量为约75ng/ml。
51.一种适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解停止的容器，包含具有包含高量血栓溶解剂的涂层的内部。
52.权利要求51的容器，其中所述血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。
53.权利要求51的容器，其中所述高量为约110ng/ml至约1200ng/ml血栓溶解剂。
54.权利要求51的容器，其中所述血栓溶解剂是人单链组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，并且其中高量为约150ng/ml。
55.一种试剂盒，其包括适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解亢进、包含具有包含低量溶血溶解剂的涂层的内部的第一容器，适于使用粘弹性分析、检测血液样品中的纤维蛋白溶解停止、包含具有包含高量血栓溶解剂的涂层的内部的第二容器；以及对血液样品进行粘弹性分析的说明书。
56.一种包括用于检测血液样品中的异常纤维蛋白溶解的多个容器的药筒(cartridge)，其中所述容器中的至少一个包含具有包含低量血栓溶解剂的涂层的内部，并且至少一个容器包含具有包含高量的血栓溶解剂的涂层的内部。
57.权利要求56所述的药筒(cartridge)，其中所述血栓溶解剂是组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。
58.权利要求56所述的药筒(cartridge)，其中所述高量为约110ng/ml至约1200ng/ml血栓溶解剂。
59.权利要求56所述的药筒(cartridge)，其中所述血栓溶解剂是组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，并且其中高量为约150ng/ml至。
60.权利要求56所述的药筒(cartridge)，其中所述低量为约1ng/ml至约100ng/ml血栓溶解剂。
61.权利要求56所述的药筒(cartridge)，其中所述血栓溶解剂是组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，其中所述低量为约75ng/ml。
62.权利要求56所述的药筒(cartridge)，其中所述容器缺少底面。
63.权利要求20的方法，其中所述抗纤维蛋白溶解剂选自由以下组成的组：氨甲环酸，氨基己酸或抑肽酶。
64.权利要求42的方法，其中所述抗纤维蛋白溶解剂选自由以下组成的组：氨甲环酸，氨基己酸或抑肽酶。
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