KR20200118428A

KR20200118428A - 활성탄을 사용하여 지혈 장애를 진단하는 방법

Info

Publication number: KR20200118428A
Application number: KR1020207022812A
Authority: KR
Inventors: 조나단 두필스; 데미안 끌로드 조셉 겔도프; 쟝-미셸 폴 니콜라스 도그네
Original assignee: 유니베르시테 드 나무르 에이에스비엘
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2019-02-06
Publication date: 2020-10-15
Also published as: CN111684284A; EP3749962A1; CA3087222A1; WO2019154853A1; US20210048443A1; JP2021513650A; AU2019219044A1

Abstract

본 출원은 a) 대상체로부터 얻은 혈장 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계; b) 상기 활성탄으로부터 상기 혈장 샘플을 회수하는 단계; 및 c) 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 시료의 응고 능력을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 혈장 시료의 응고 능력은 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도, 및 임의로 지혈 장애의 성질의 표지인 것을 특징으로 하는, 대상체로부터 얻은 혈장 샘플에서 지혈 장애의 시험관 내 진단 방법을 제공한다.

Description

활성탄을 사용하여 지혈 장애를 진단하는 방법

본 발명은 지혈 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항응고제로 치료된 환자에서와 같이 지혈 장애를 진단하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.

전체적으로, 이유 없는 정맥 혈전 색전증(VTE) 환자는 항응고제 요법을 중단하면 재발 위험이 높다. 실제로 재발성 VTE의 누적 위험은 1 년에 약 10%, 5 년에 30%, 10 년에 50%이다. 정기 및 특정 응고 검사는 지혈 장애를 감지하기 위한 유용한 선별 검사이다. 여러 유전 조건(예 : 활성화된 단백질 C 내성, 단백질 C 및 S 결핍, 안티트롬빈 결핍 및 상승된 제VIII 인자)은 재발성 혈전 색전증의 위험을 증가시킨다. 위험 정도는 이전 상태에 따라 다르므로 혈전발현성 위험 요인에 대한 검사는 일반 인구 선별 검사로 수행하지 말고 혈전 색전증이 있거나 가족력이 알려진 선별된 환자에서 수행해야 한다. 이 환자들은 종종 혈전 색전증으로 치료 받으므로, 결과의 해석은 항 응고 약물의 효과로 인해 복잡하다. 또한, 항 혈전 치료를받는 환자는 비타민 K 결핍, 간 질환 또는 후천성 혈우병과 같은 치료 시작 후 발달된 지혈 장애를 진단하기 위해 응고 검사가 요구될 수 있다. NICE(National Institute of Health and Care Excellence)의 정맥 혈전 색전증 질환에 대한 지침은 이러한 검사의 임상적 관련성을 인정하지만, 신뢰할 수있는 진단을 가능하게 하기 위해서는 환자가 조사 단계 동안 보호 받거나 치료받지 않아야 한다는 것을 암시하기 때문에 사용이 편안하고 최적인 것은 아니다.

2008 년 이후, 새로운 종류의 항응고제가 항 응고 시장에 나왔다: 직접 경구 항응고제(DOAC). 이 화합물에는 1 개의 트롬빈 억제제(다비가트란 에텍실레이트- Pradaxa®)와 3 가지 Xa 억제제(리바록사반-Xarelto®; 아픽사반-Eliquis®; 및 에독사반-Lixiana®)가 포함되며, 이전에 사용한 비타민 K 길항제 및 저 분자량 헤파린(LMWH)과 달리 항 응고에 대한 일상적인 모니터링이 필요하지 않다. 그러나 포인트 측정은 여러 상황에서 유용할 수 있으며 특정 테스트를 수행해야한다는 증거가 있다. 다른 한편으로, 응고의 한 인자를 직접 표적으로 하는 약물의 도입은 해당 응고 인자를 포함하는 여러 지혈 시험에 영향을 미쳐, 위-양성(거짓 양성) 또는 위-음성(거짓 음성) 결과를 초래한다. 따라서, 진단을 용이하게 하고 혈전성 사건의 병인에 대한 적절한 평가를 보장하기 위해 응고 시험에서 직접 항응고제의 영향을 피할 필요가 있다.

혈액 샘플로부터 염료와 같은 저 분자량 화합물의 제거를 위한 도구가 확인되었다(WO9934914A1에서와 같이). 그러나, 이들은 일반적으로 큰 배치의 혈장에 사용하기 위한 것으로 예상된다. 또한, 지혈 장애 진단의 맥락에서 이러한 기술의 관련성은 아직 고려되지 않았다.

본 발명자들은 혈장 시료로부터 직접 항응고제(예를 들어, DOAC)를 제거하기 위해 지혈 장애를 진단하기 위한 시험관 내 시험을 위해 혈장의 제조에 활성탄이 사용될 수 있음을 발견하였다. 본원에 개시된 바와 같은 방법은 응고 능력에 대한 직접적인 항응고제(예를 들어, DOAC)의 간섭 효과없이, 피험자로부터 얻은 혈장의 응고 능력을 결정함으로써, 상기 피험자에서 지혈 장애의 존재를 정확하게 검출할 수 있게 한다. 또한, 본 발명은 샘플에서 항응고제의 존재에 기초하여 지혈 장애의 위험을 결정할 수 있게 한다.

특정 실시 양태에서, 대상체로부터 얻은 혈장 샘플에서 지혈 장애의 시험관 내 진단 방법은 상기 DOAC를 상기 활성탄 상으로 흡착시킬 수 있도록 상기 대상체로부터 얻은 혈장 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계; 상기 흡착된 활성탄을 샘플로부터 분리하고, 이렇게 얻어진 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 방법은 (a) 상기 대상체로부터 얻은 혈장 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계; (b) 상기 활성탄으로부터 상기 혈장 샘플을 회수하는 단계; 및 c) 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계를 포함한다. 이들 방법에서, 상기 혈장 샘플의 응고 능력은 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도, 및 선택적으로 지혈 장애의 성질을 효과적으로 나타낸다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 혈장의 응고 능력에 기초하여 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도를 결정하는 단계 (d)를 포함한다.

특정 구체 예에서, 혈장 샘플은 필터를 통해 혈장 샘플을 통과시킴으로써 활성탄으로부터 회수된다. 추가의 구체 예에서, 필터는 0.22 내지 0.65 마이크로미터 사이의 공극 크기를 갖는 필터로서, 혈장에 여전히 존재하는 혈소판, 혈소판 단편 및/또는 혈액 세포 및 활성탄이 혈장으로부터 제거된다. 실제로, 특정 실시 양태에서, 방법은 혈소판 및 DOAC가 한 단계에서 샘플로부터 제거되고 혈장 샘플을 혈장 샘플로부터 제거하는 별도의 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.

본원에 개시된 바와 같은 방법은, 예를 들어, 관찰된 감소된 응고 능력(예를 들어, 혈액 응고 부족)이 환자의 샘플에 항응고제의 존재로 인한 지혈 장애 또는 감소된 응고 능력(예를 들어, 혈액 응고 부족)에 기인할 수 있는지를 결정하기 위해, 시험관 내 진단 분석에 의해 지혈 장애의 빠르고 신뢰할 수있는 평가를 허용한다. 특정 실시 양태에서, 상기 혈장의 응고 능력에 기초하여, 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도를 결정하는 단계는 상기 샘플의 응고 능력을 표준 또는 기준 값과 비교함으로써 수행된다.

따라서, 제 1 측면은 다음 단계를 포함하는 대상체로부터 얻은 혈장 샘플에서 지혈 장애의 시험관 내 진단 방법을 제공한다 :

a) 상기 대상으로부터 얻은 혈장 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계;

b) 상기 활성탄으로부터 상기 혈장 샘플을 회수하는 단계; 및

c) 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계;

상기 혈장 샘플의 응고 능력은 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도, 및 선택적으로 지혈 장애의 성질을 나타낸다. 특정 실시 양태에서, 상기 단계 (b)는 혈장 샘플을 필터를 통해 통과시킴으로써 수행된다. 다른 특정 구체 예에서, 상기 혈장 샘플은 0.22 내지 0.65㎛의 기공 크기를 갖는다. 특정 구체 예에서, 활성탄으로부터 혈장를 회수하는 단계는 원심 분리 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 활성탄의 농도는 3mg/㎖ 이상, 바람직하게는 5mg/㎖ 이상이다. 특정 실시 양태에서, 혈장 샘플은 2 분 이상, 바람직하게는 5 분 이상 동안 활성탄과 접촉된다.

특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지혈 장애의 시험관 내 진단 방법은 단계 (c) 이전에 혈장 샘플로부터 혈소판, 혈소판 단편 및 잔류 혈액 세포 중 하나 이상을 제거하는 추가 단계를 포함하지 않는다.

특정 실시 양태에서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 혈장 샘플을 응고 활성화제와 접촉시킴으로써 수행된다.

특정 실시 양태에서, 응고 활성화제는 인간 칼슘 트롬빈, 토끼 또는 재조합 인간 조직 인자, 합성 인지질, 러셀 살모사 독, 에카린, 텍스타린 또는 실리카, 콜로이드성 실리카 활성화제, 트롬보모둘린, 활성화된 단백질 C, 동결 건조된 소 트롬빈 및 트롬빈 CBS 61.50의 발색 기질, 뱀독으로부터의 제V인자 활성화제 및 뱀독으로부터 분리된 제V인자a-의존성 프로트롬빈 활성화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특정 실시 양태에서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 상기 혈장 샘플을 단계 (c) 이전에 면역 고갈된 혈청 또는 혈장과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.

특정 실시 양태에서, 면역 결핍된 혈청 또는 혈장은 인자 VIII 또는 IX또는 X 또는 XI 또는 XII 또는 XIII 또는 VII 또는 V 또는 II 결핍 혈청 또는 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 실시 양태에서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 프로트롬빈 시간(PT), 활성화된 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 루푸스 항응고 시험, 피브리노겐 분석(클라우스 및 PT 유도 피브리노겐 방법 모두), 트롬빈 시간, 응고 인자 활동 분석(FVIII, FIX, X, XI, XII, XIII; VII, V, II, X) ), 활성화된 단백질 C 내성(APCR) 분석, 단백질 C 활성 분석, 단백질 S 활성 분석, 안티트롬빈 활성 분석 및 트롬빈 생성 분석을 포함하는 목록으로부터 선택된 응고 테스트에 의해 수행된다.

특정 실시 양태에서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 섬유소원 결핍증, 프로트롬빈 결핍증, 제V인자 결핍증, 응고제V인자 레이든, 단백질 C 결핍증, 단백질 S 결핍증, 안티플라스민 결핍증, 항트롬빈 결핍증, 플라스미노겐 결핍, 상승된 D-dimer, 항인지질항체 증후군, 헤파린 유도 혈소판 감소증, 복합 제V인자 및 VIII 결핍증, 제VII인자 결핍증, 제VIII인자 결핍증(혈우병 A), 제IX인자 결핍증(혈우병 B), 제X인자 결핍증, 제XI인자 결핍증, 제XIII인자 결핍증, 혈소판 무력증, 베르나르-술리에 증후군, 비스코트-알드리히 증후군 또는 백혈구 부착 결핍증을 결정하기 위한 혈액 응고 기반 방법을 사용하여 결정되고, 상기 지혈 장애의 성질의 표시를 추가로 제공한다.

특정 실시 양태에서, 대상체는 직접 항응고제, 바람직하게는 직접 경구 항응고제(DOAC)로 처치된 환자이다.

특정 실시 양태에서, 대상체는 병력이 알려지지 않았거나 및/또는 확인할 수 없는 대상체이다.

추가의 측면은 하기를 포함하는 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 진단 키트를 제공한다:

- 활성탄; 및

-지혈 장애의 시험관 내 진단에 필요한 하나 이상의 화합물. 특정 구체 예에서, 키트는 필터를 포함하는 바이알을 포함한다. 추가의 구체 예에서, 필터는 0.22 내지 0.65㎛의 기공 크기, 예컨대 0.45㎛의 기공 크기를 갖는다. 본 발명은 또한 진단 시험을 위해 샘플, 특히 지혈 장애의 샘플을 제조하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 100㎕ 내지 10000㎕의 부피의 바이알; 활성탄 및 기공 크기가 0.22 내지 0.65㎛인 필터를 포함한다.

추가 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 샘플을 제조하는 방법을 포함한다 :

a) 바이알에서 상기 혈장 샘플 100㎕ 내지 10000㎕의 부피를 활성탄과 접촉시키는 단계; 및

b) 0.22 내지 0.65 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시킴으로써 상기 활성탄으로부터 상기 혈장 샘플을 회수하는 단계.

도 1은 원심 분리에 의해 혈소판 부족 혈장을 얻기 위한 예시적인 표준 제조 방법을 도시한다.
도 2는 증가하는 농도의 직접 경구 항응고제(DOAC)를 갖는 혈소판-빈약 혈장의 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)(a) 및 프로톰빈 시간(PT)(b)을 도시한다.
도 3은 밀봉가능한 에펜도르프 튜브(3)에 배치된 본 명세서에 개시된 바와 같은 활성탄(2)이 로딩된 예시적인 스핀 필터를 도시한다. 혈장(1)은 스핀 필터에 로딩될 수 있고, 스핀 필터의 원심 분리에 의해 DOACS, 혈소판 및 활성탄이 없는 혈장은 밀봉가능한 에펜도르프 튜브(3)에서 회수될 수 있다.
도 4는 DOAC의 농도가 증가함에 따라 본원에 개시된 바와 같은 방법에 적용되는 혈장의 aPTT(a) 및 PT(b)를 도시한다.
도 5는 증가된 농도의 리바록사반 및 증가된 농도의 활성탄으로 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법에 적용되는 혈장의 aPTT(a) 및 PT(b)를 도시한다.
도 6은 LA로부터 고통받는 것으로 의심되는 환자의 혈장 샘플의 부분 트롬보플라스틴 시간-홍반성 항응고제 스트린(PTT LA), PTT LA confirm(Staclot LA), Dilute Russel Viper Venom Time Screen(DRVVT) 및 DRVVT confirm을 나타내며, 이 혈장은 혈소판이 불량한 혈장(체크된 패턴) 또는 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따른 혈장(회색)이다.
도 7: LA- 진단 1 차 분석에 대한 DOAC 영향;(A) DRVVT 스크린;(B) DRVVT confirm;(C) PTT-LA

본 발명에 사용된 본 방법 및 장치가 설명되기 전에, 본 발명은 설명된 특정 방법, 분자 또는 용도로 제한되지 않으며, 이러한 방법, 분자 또는 용도는 물론 변할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본 명세서에서 사용된 용어는 제한적인 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해해야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다.

본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서, 단수 형태 "하나", "한" 및 "그"는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 참조를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "포함하는", "포함한" 및 "포함되는"은 "함유하는", "함유한" 또는 "함유되는"과 동의어이며, 포괄적이거나 개방적인 것이며 추가의 인용되지 않은 부재, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다 , .

"포함하는", "포함한" 및 "포함되는"이라는 용어는 또한 "구성되는"이라는 용어를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 파라미터, 양, 지속 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 특정된 값으로부터 +/- 10% 이하, 바람직하게는 +/- 5% 이하, 보다 바람직하게는 +/- 1% 이하, 더욱 더 바람직하게는 +/- 0.1% 이하를 의미하고, 이러한 변형은 개시된 발명에서 수행하기에 적합하다. "약"이 지칭하는 값 자체도 구체적으로, 그리고 바람직하게 개시된 것으로 이해되어야 한다.

종말점에 의한 수치 범위의 인용은 인용된 종말점뿐만 아니라 각각의 범위 내에 포함된 모든 수 및 분율을 포함한다.

하기 구절에서, 본 발명의 상이한 측면 또는 실시 양태가 보다 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 양태 또는 실시 형태는 달리 명확하게 표시되지 않는 한 임의의 다른 양태 또는 실시 형태(들)와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.

본 명세서 전체에서 "일 실시 예", "실시 예"는 실시 예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시 예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체의 여러 곳에서 "일 실시 예에서"또는 "실시 예에서"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시 예를 지칭하는 것은 아니지만, 가능할 수 있다. 또한, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시 예에서 본 개시로부터 당업자에게 명백한 바와 같이 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 일부 실시 예는 몇몇 특징을 포함하고 그 외 특징은 다른 그 외의 실시 예에 포함되는 경우, 다른 실시 예의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있고, 당업자가 이해하는 바와 같이 다른 실시 예를 형성하는 것을 의미한다. 예를 들어, 첨부된 청구 범위에서, 청구된 실시 예 중 임의의 것이 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 프로트롬빈 시간(PT) 또는 활성화된 트롬보플라스틴 시간(aPTT)과 같은 스크리닝 시험에 대한 직접적인 항응고제(예 : DOAC)의 영향은 환자가 받는 치료법을 항상 인식하지 못하는 실험에는 문제가 있다. 무의식 또는 외상 환자에서 생명을 위협하는 출혈의 근본 원인을 신속하고 확실하게 판단하여 적절한 환자 관리를 보장해야 한다. 직접 항응고제(예 : DOAC)에 민감하거나 민감하지 않은 선별 검사를 이용할 수 있으면 직접 항응고제(예 : DOAC)의 존재에 대해 실험실에 신속하게 알릴 수 있다. 이것은 쓸모없고 값 비싸고 시간이 많이 걸리는 조사를 아끼고 신뢰할 수있는 진단을 제공할 것이다. 또한, 샘플에 직접 항응고제(예 : DOAC)가 존재하면 표적 응고 인자를 포함하는 지혈 장애를 평가하는데 사용되는 테스트에 영향을 미쳐서 위-양성 또는 위-음성 결과를 초래한다. 이러한 테스트 중 일부는 헤파린에 둔감하게 적용되지만, 직접 항응고제(예 : DOAC)가 있는 경우에는 수행하도록 설계되지 않았다. 따라서, 이러한 응고 시험에서 직접 항응고제(예를 들어, DOAC)의 영향을 피하여 응고항진성의 신뢰성있는 평가를 제공할 필요가 있다.

본 발명자들은 혈장 시료로부터 직접 항응고제(예를 들어, DOAC)를 제거하기 위해 지혈 장애를 진단하기 위한 시험관 내 시험을 위해 혈장의 제조에 활성탄이 사용될 수 있음을 발견하였다. 본원에 개시된 바와 같은 방법은 응고 능력에 대한 직접적인 항응고제(예를 들어, DOAC)의 간섭 효과없이 혈장의 응고 능력을 측정하는 것을 허용한다. 또한, 혈장 샘플이 활성탄 처리에 추가하여, 혈장 샘플을 필터, 예를 들어 0.22 내지 0.65 마이크로미터, 또는 보다 특히 0.22 내지 0.65 마이크로미터, 예를 들어 0.40 내지 0.65 마이크로미터의 공극 크기를 갖는 필터를 통과시킴으로써 여과하는 경우, 혈장에 여전히 존재하는 혈소판, 혈소판 단편 및/또는 혈액 세포 및 활성탄이 혈장으로부터 제거될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같은 방법은, 예를 들어, 관찰된 감소된 응고 능력(예를 들어, 혈액 응고 부족)이 지혈 장애 또는 환자의 샘플에 항응고제의 존재로 인한 감소된 응고 능력(예 : 혈액 응고 부족)에 기여할 수 있는지를 측정하기 위한, 시험관 내 진단 분석에 의해 지혈 장애의 빠르고 신뢰할 수있는 평가를 허용한다. 활성탄을 필터, 예를 들어 0.22 내지 0.65㎛ 사이의 공극 크기를 갖는 필터, 예를 들어 본원에 개시된 방법에 의해 제공된 0.45㎛의 필터와 조합하여 사용함으로써, 혈액 응고 장애를 평가하는데 신뢰성 있게 사용될 수 있는 직접 응고 방지제, 혈소판, 혈소판 단편 및/또는 혈액 세포가 없는(실질적으로) 혈장 샘플을 얻는 데 필요한 단계의 수 및/또는 원심 분리 시간을 감소시켜 평가 동안 귀중한 시간을 절약할 수 있다

본원에 사용된 용어 지혈 장애는 출혈과 응고 사이의 평형 장애를 지칭한다. 이 장애는 선천적이거나 후천적일 수 있다. 지혈 장애는 과도한 출혈이나 혈전증의 위험이 있다.

본 발명의 제 1 측면은 하기 단계를 포함하는 대상체에서 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 방법을 제공한다 :

a) 상기 대상체로부터 얻은 혈장 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계;

c) b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계;

상기 혈장 샘플의 응고 능력은 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도, 및 선택적으로 지혈 장애의 성질을 나타내는 것을 특징으로 한다.

잘 조절된 지혈은 건강에 중요하며, 유전성 질환 혈우병과 같은 부적절한 응고와 혈전증에서와 같이 과도한 응고는 출혈 및 혈전증과 같은 과감한 결과를 초래할 수 있다. 지혈 장애는 두 가지 주요 그룹, 즉 유전 또는 획득으로 나누어질 수 있으며, 응고 인자 결핍, 혈소판 장애, 혈관 장애 및 섬유소 용해성 결함으로 더 분류된다. 지혈 장애의 비 제한적 예는 섬유소원 결핍증, 프로트롬빈 결핍증, 제V인자 결핍증, 응고제V인자 레이든, 단백질 C 결핍증, 단백질 S 결핍증, 안티플라스민 결핍증, 항트롬빈 결핍증, 플라스미노겐 결핍, 상승된 D-dimer, 항인지질항체 증후군, 헤파린 유도 혈소판 감소증, 복합 제V인자 및 VIII 결핍증, 제VII인자 결핍증, 제VIII인자 결핍증(혈우병 A), 제IX인자 결핍증(혈우병 B), 제X인자 결핍증, 제XI인자 결핍증, 제XIII인자 결핍증, 혈소판 무력증, 베르나르-술리에 증후군, 비스코트-알드리히 증후군 또는 백혈구 부착 결핍증이 있다.

지혈 장애는 발색성 항-제X인자 활성 분석, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 분석, 프로트롬빈 시간, 트롬빈 시간, 활성화 응고 시간, 혈전 탄성 검사, 트롬빈 생성 분석, 렙틸라제 시간법, dRVVT(dilute Russell's viper venom time), 에카린 응고 시간, 카올린 응고 시간, 국제표준화비율(INR), 섬유소원 검사(Clauss), 트롬빈 시간(TT), 혼합 시간 및 유글로불린 용해 시간을 포함하지만 이에 국한되지 않는 혈장의 응고 능력을 측정하는 다양한 방법으로 진단할 수 있다. 이들 방법은 다양한 응고 파라미터를 결정하는 데 도움이되며 당업자에게 공지되어 있다. 과잉 응고를 유발하는 지혈 장애는 대부분 응고 억제제로 치료된다. 응고 억제제(본원에서 항응고제라고도 함)는 응고 과정을 억제하는 분자이다. 예시적인 응고 억제제는 안티트롬빈 활성화제(예를 들어, 비분획화 헤파린 및 LMWH), 인자 IIa 억제제 및 인자 Xa 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 항응고제 효과는 응고 캐스케이드의 증식을 막는 것으로부터 생기는 응고 억제제의 효과이다. 항 응고 효과의 비 제한적 예는 안티트롬빈 활성의 상향 조절, 감소된 인자 Xa 활성, 감소된 인자 IIa 활성, 증가된 혈액 손실, 및 응고 인자의 활성 또는 농도가 혈액 응고 형성을 억제하는 방식으로 변경되는 임의의 다른 증상을 포함한다.

상기 지시된 바와 같이, 지혈 장애는 전형적으로 (과도한) 출혈 또는 출혈성 소인, 파종성 혈관내응고증, 혈전증과 같은 질병 및 장애에 대한 대상체의 위험을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 방법은 지혈 장애로부터 생기는 질병이나 장애의 증가된 위험을 측정하게 한다. 본원에 사용된 용어 "직접 항응고제"는 트롬빈 및/또는 인자 Xa의 효소 활성을 직접 표적으로 하는 항응고제를 지칭한다. 직접 항응고제는 경구 및 정맥 직접 트롬빈(인자 IIa) 억제제 및 경구 직접 인자 Xa 억제제를 포함한다. 직접 항응고제의 비 제한적 예는 다비가트란 에텍실레이트(PRADAXA®), 리바록사반(XARELTO®), 아픽사반(ELIQUIS®), 에독사반(LIXIANA®), 폰다파린(ARIXTRA®) 및 아르가트로반(ARGATROBAN®)과 같은 항응고제를 포함한다.

직접 트롬빈 억제제인 경구 항응고제 PRADAXA®, 다비가트란 에텍실레이트 메실레이트의 화학명은 β-알라닌, N-[[2-[[[4-[[[((헥실옥시)카르보닐]아미노]이미노-메틸]페닐]아미노]메틸]-1-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일]카르보닐]-N-2-피리디닐 에틸에스테르, 메탄설포네이트이다. 다비가트란 및 그의 아실 글루쿠로니드는 경쟁적 직접 트롬빈 억제제이다. 트롬빈(인자 IIa, 세린 프로테아제)은 응고 캐스케이드 동안 피브리노겐의 피브린으로의 전환을 가능하게 하기 때문에, 그 억제는 혈전의 발생을 방지한다.

인자 Xa 억제제인 리바록사반(rivaroxaban)은 XARELTO®의 활성 성분이며, 화학 이름이 5-클로로-N-({(5S)-2-옥소-3-[4-(3-옥소-4-모르폴리닐)페닐]-1,3-옥사졸리딘-5-일}메틸)-2-티오펜 카르복스아미드이다. 리바록사반은 순수한 (S)-거울상 이성질체이다. XARELTO®는 인자 Xa의 활성 부위를 선택적으로 차단하고 활동을 위해 보조 인자(예 : 안티트롬빈 III)를 필요로 하지 않는 경구 생체이용가능한 인자 Xa 억제제이다.

아픽사반 또는 ELIQUIS®는 1-(4-메톡시페닐)-7-옥소-6-[4-(2-옥소피페리딘 -1-일)페닐]-4,5-디하이드로피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카르복스아미드이다. 유럽에서 승인된 경구 투여된 직접 인자 Xa 억제제이며, 정맥 투여 혈전 색전증 예방 등을 위해 현재 미국에서 3 상 시험을 받고 있다.

에독사반 또는 LIXIANA®는 N'-(5-클로로피리딘-2-일)-N-[(1S, 2R, 4S)-4-(디메틸카르바모일)-2-[(5-메틸-6,7-디하이드로-4H)-[1,3]티아졸로[5,4-c]피리딘 -2-카보닐)아미노]사이클로헥실]옥사미드이다. 에독사반은 직접 인자 Xa 억제제이며, 정맥 혈전 색전증 예방에 사용되는 것으로 일본에서 승인되었다.

ARIXTRA®는 폰다파리눅스 소듐이다. 활성화된 인자 X(Xa)의 합성 및 특이 적 억제제이다. 폰다파리눅스 소듐은 메틸 O-2-데옥시-6-0-설포-2-(설포아미노)-α-D-글루코피라노실-(1 → 4)-0-PD-글루코피라누로노실-(1 → 4)-0-2-데옥시-3,6-디-0-설포-2-(설포아미노)-αD-글루코피라노실-(1 → 4)-0-2-0-설포-α-L-이도피라누로노실-(1 → 4)-2-데옥시-6-0-설포-2-(설포아미노)-α-글루코피라노시드, 데카소듐 염이다. 인자 Xa의 중화는 혈액 응고 캐스케이드를 방해하여 트롬빈 형성 및 혈전 발생을 억제한다. 항 -Xa 분석을 검정하기 위해 폰다파리눅스만 사용할 수 있다. 헤파린 또는 LMWH의 국제 표준은 이 용도에 적합하지 않다.

ARGATROBAN®은 L-아르기닌에서 유도된 합성 직접 트롬빈(인자 IIa) 억제제이다. ARGATROBAN®의 화학명은 1-[5-[(아미노이미노메틸)아미노]-1-옥소-2-[[((1,2,3,4-테트라히드로-3-메틸-8-퀴놀리닐)설포닐]아미노]펜틸]-4-메틸-2-피페리딘 카르복실산, 일 수화물이다. ARGATROBAN®은 트롬빈 활성 부위에 가역적으로 결합하는 직접 트롬빈 억제제이다. ARGATROBAN®은 항 혈전 활성을 위해 보조 인자 안티트롬빈 III을 필요로하지 않다. 본 발명에서 사용되는 용어 "혈장 샘플"은 본원에 개시된 바와 같은 방법으로 진단될 대상 또는 환자로부터 얻은 샘플을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "혈장"은 통상적으로 정의된 바와 같이 신선한 혈장, 해동된 냉동 혈장, 용매/세제-처리된 혈장, 가공된 혈장 또는 이들 중 임의의 둘 이상의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 혈장은 신선한 혈장이다. 혈장은 일반적으로 항응고제(예를 들어 헤파린, 시트레이트, 옥살레이트 또는 EDTA)와 함께 제공되거나 접촉된 전혈 샘플로부터 얻어진다. 후속적으로, 혈액 샘플의 세포 성분은 적절한 기술, 전형적으로 원심 분리(예를 들어, 실온에서 1500g에서 15분 동안 적혈구로부터 혈장을 분리 함)에 의해 액체 성분(혈장)으로부터 분리된다. 용어 "혈장"은 인간 또는 동물 신체의 일부를 형성하지 않는 조성물을 지칭한다. "혈장"이라는 용어는 특정 실시 양태에서 구체적으로 가공된 혈장, 즉 전혈로부터 분리된 후 그의 조성물, 구체적으로 그의 화학적, 생화학적 또는 세포 조성물을 변경시키는 하나 이상의 처리 단계로 처리된 혈장을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "혈소판-부족 혈장"은 대부분(예 : 적어도 95%) 또는 모든 혈소판, 및 임의로 대부분(예 : 적어도 95%) 또는 모든 세포 성분이 제거되는 혈장을 지칭할 수 있다. 혈소판 부족 혈장은 전혈의 샘플로부터 얻어질 수 있으며, 여기서 혈액 샘플의 세포 성분은 적절한 기술, 전형적으로 원심 분리(원심 분리 단계 1; 예를 들어 1500g에서 15 분)에 의해 액체 성분(혈장)으로부터 분리되고 후속적으로 혈장 내 잔류 세포 성분 및/또는 혈소판은 적절한 기술, 전형적으로 원심 분리(원심 분리 단계 2; 예를 들어 실온에서 1500g에서 15 분)에 의해 혈장으로부터 거의 완전히 제거된다. 예를 들어, 혈소판 부족 혈장은 최대 1.0x10⁴혈소판/㎕을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "혈소판 없는 혈장"은 모든(즉, 99.9% 이상) 혈소판, 및 임의로 모든(즉, 99.9% 이상) 세포 성분이 제거되는 혈장을 지칭할 수 있다.

특정 실시 양태에서, 혈장 샘플은 응고 인자 및 피브리노겐/피브린을 포함한다.

특정 실시 양태에서, 혈장 샘플은 단계 (c) (즉, 상기 혈장 샘플의 응고 능력 측정 단계) 이전에 혈장 샘플로부터 혈소판, 혈소판 단편 및 잔류 혈액 세포(예를 들어 추가 원심 분리 단계) 중 하나 이상을 제거하는 추가 단계를 거치지 않는다. 실제로, 본 발명자들은 본원에 개시된 바와 같은 방법을 사용함으로써(즉, 활성탄으로부터 혈장 샘플을 회수하는 단계를 포함하여), 혈장의 응고 활성의 정확한 측정을 위해 혈소판 또는 잔류 혈액 세포를 제거하는 추가 단계가 필요하지 않다는 것을 발견했다 .

그러나, 특정 구체 예에서, 단계 (b)(즉, 활성탄으로부터 혈장 샘플을 회수하는 단계)는 상기 혈장 샘플을 필터를 통과시키는 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 단계 (b)가 상기 혈장 샘플을 필터를 통해 통과시키는 것을 포함하는 경우, 필터는 바람직하게는 기공 크기가 0.22 내지 0.65㎛, 예컨대 기공 크기가 0.45㎛ 인 필터이다. 바람직하게는, 이들 구체 예에서, 단계 (c) (즉, 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계) 이전에, 혈장 샘플은 혈장 샘플로부터 하나 이상의 혈소판, 혈소판 단편 및 잔류 혈액 세포(예를 들어, 추가 원심 분리 단계)를 제거하는 추가 단계 (예를 들어, 단계 (b)에 추가)를 거치지 않는다.

특정 구체 예에서, 활성탄과 접촉되는 혈장 샘플의 부피는 100㎕ 내지 2000㎕, 250㎕ 내지 1500㎕, 250㎕ 내지 1000㎕, 또는 500㎕ 내지 1000㎕일 수 있다. 바람직하게는, 활성탄과 접촉되는 혈장 샘플의 부피는 500㎕ 내지 1000㎕이다.

본 발명의 방법이 대상체의 건강 상태를 측정하는데 특히 관심이 있다는 것을 고려하면, 혈장은 고려중인 대상체의 샘플인 것이 상기 대상체로부터 온 것이 적절하다. 검출 단계 동안 샘플을 참조 샘플과 혼합하는 것이 흥미로울 수 있지만, 이는 참조 샘플의 특성이 알려져 있고 혼합 단계가 검출 방법과 관련이 있음을 의미한다.

본 발명의 방법은 혈액 희석제, 특히 직접 항응고제로 치료받는 환자에 의한 심방 세동과 관련된 뇌졸중의 위험을 감소시키도록 치료되는 환자에서 지혈 장애를 진단하는데 특히 관심이 있다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 혈장 샘플을 수득한 대상체 또는 환자는 직접 항응고제, 바람직하게는 DOAC, 더욱 바람직하게는 다비가트란 에텍실레이트, 리바록사반, 아픽사반 및 에독사반으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DOAC로 치료받는 환자 그룹으로부터 선택된다.

특정 실시 양태에서, 방법은 알려지지 않은 대상체 또는 환자의 혈장 샘플에서 지혈 장애의 시험관 내 진단, 보다 구체적으로 응고 능력이 측정될 필요가 있는 시점에, 환자 또는 환자의 병력이 알려지지 않았거나 확립될 수 없고 및/또는 확인할 수 없는 경우와 같이 응고 억제제로 치료 받았는지 아닌지를 진단하는데 사용된다. 특정 실시 양태에서, 상기 방법은 외상 및/또는 무의식 상태인 대상체 또는 환자의 혈장 샘플에서 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위해 사용된다.

특정 실시 양태에서, 대상체는 하나 이상의 직접 항응고제, 바람직하게는 베 트릭사반, 아르가트로반, 다비가트란 에텍실레이트, 리바록사반, 아픽사반 및 에독사반으로 이루어진 목록으로부터 선택된 직접 항응고제로 치료받은 환자이다.

특정 실시 양태에서, 대상체는 하나 이상의 직접 경구 항응고제(DOAC), 바람직하게는 다비가트란 에텍실레이트, 리바록사반, 아픽사반 및 에독사반으로 이루어진 목록으로부터 선택된 DOAC로 치료된 환자이다.

대상의 혈장 샘플을 활성탄과 접촉시키는 것이, 상기 대상에서 혈액 조혈 장애의 검출을 보장하기에 충분히 신뢰할 수 있는 정도로, 더 이상 DOAC를 함유하지 않는 혈장 샘플을 초래한다는 것이 입증된 것은 처음이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 항응고제 검출 효율을 향상시키고 샘플에 DOAC의 존재로 인한 위-양성을 피할 수 있는 능력을 제공한다. 따라서 상기 방법은 샘플에서 DOAC의 존재와 상관없이 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 것을 허용한다.

본원에 사용된 용어 "활성탄", "활성화된 탄소"는 미세 다공성 탄소를 지칭한다. 미세 다공성 탄소는 탄소를 처리하여 표면적을 증가시킴으로써 얻을 수 있다. 표면적이 증가된 탄소는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 비 제한적인 예는 화학적으로 또는 물리적으로(예를 들어, 탄화 또는 산화) 활성화 탄소에 의한 소량의 작은 부치의 기공을 도입하는 것이다. 예를 들어, 1 그램의 활성탄은 표면이 3000㎡ 이상일 수 있다.

특정 구체 예에서, 활성탄은 분말이다. 보다 특정한 실시 양태에서, 활성탄은 평균 크기가 0.5 내지 5㎛, 1 내지 4㎛, 또는 2.5 내지 3.5㎛ 인 활성탄 입자, 예를 들어, 평균 크기가 3㎛ 인 활성탄 입자로 구성된 분말이다.

본원에 사용된 용어 "평균 크기"는 활성탄 입자가 구형인 경우 평균 직경을 나타내고, 활성탄 입자가 비-구형인 경우 평균 부피 기반 입자 크기를 지칭한다. 부피 기반 입자 크기는 주어진 입자와 동일한 부피를 갖는 구의 직경과 같다. 부피 기반 입자 크기는 비-구형 입자의 부피 기반 입자 크기를 결정하기 위해 당 업계에 공지된 임의의 수단에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어하기 식을 사용한다 : D = 2 *(3V/4π)^1/3; 여기서 D는 대표적인 구의 직경이고 V는 입자의 부피이다.

특정 구체 예에서, 활성탄의 최소 직경은 0.5㎛ 이상, 0.6㎛ 이상, 0.7㎛ 이상, 0.8㎛ 이상, 0.9㎛ 이상, 1㎛ 이상, 1.5㎛ 이상, 2 이상㎛ 또는 2.5㎛ 이상이다.

특정 구체 예에서, 활성탄의 최대 직경은 최대 1000㎛, 최대 500㎛, 최대 250㎛ 또는 최대 100㎛이다.

사용되는 활성탄의 절대량은 혈장 샘플의 크기에 의존할 것임이 이해 될 것이다. 활성탄의 평균 양은 혈장 1 밀리리터당 2mg 내지 20mg으로 다양할 것이다. 특정 구체 예에서, 혈장 샘플은 혈장 밀리 리터당 2mg 이상, 3mg 이상, 4mg 이상, 5mg 이상, 6mg 이상, 7mg 이상, 8mg 이상, 9mg 이상, 10mg 이상, 11mg 이상, 12mg 이상, 13mg 이상, 14mg 이상, 15mg 이상, 16mg 이상, 17mg 이상, 18mg 이상, 19mg 이상 또는 20mg 이상의 활성탄과 접촉(또는 배양) 될 수 있다. 바람직하게는, 혈장 샘플은 혈장 밀리 리터당 적어도 3mg의 활성탄과 접촉(또는 배양)될 수 있다. 보다 바람직하게는, 혈장 샘플은 혈장 1 밀리 리터당 적어도 5mg의 활성탄과 접촉될 수 있다.

특정 실시 양태에서, 혈장 샘플은 혈장 밀리 리터당 2 내지 20mg의 활성탄, 혈장 밀리 리터당 2 내지 15mg의 활성탄, 혈장 밀리리터 5 내지 15mg의 활성탄, 혈장 밀리 리터당 5 내지 12mg의 활성 활성탄, 혈장 밀리 리터당 8 내지 12mg의 활성 활성탄, 또는 혈장 밀리 리터당 9 내지 11mg의 활성탄과 접촉(또는 배양)될 수 있다. 바람직하게는, 혈장 샘플은 혈장 밀리 리터당 5 내지 15mg의 활성탄, 예컨대 5mg/㎖, 6mg/㎖, 7mg/㎖, 8mg/㎖, 9mg/㎖, 10mg/㎖, 11mg/㎖; 12mg/㎖, 13mg/㎖, 14mg/㎖ 또는 15mg/㎖과 접촉(또는 배양)된다. 보다 바람직하게는, 혈장 샘플은 1 밀리리터의 혈장 당 10mg의 활성탄과 접촉(또는 배양)된다.

특정 실시 양태에서, 접촉 단계 (또는 인큐베이션 단계)는 2 분 이상, 3 분 이상, 4 분 이상, 5 분 이상, 6 분 이상, 7 분 이상, 8 분 이상, 9 분 이상 또는 10분 이상, 바람직하게는 2 분 이상, 보다 바람직하게는 5 분 이상 동안 수행될 수 있다.

당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법이 무의식 또는 외상 환자에서 생명을 위협하는 출혈과 같은 긴급한 상황에서 사용될 수 있으므로, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법의 단계는 가능한 한 짧은 것이 바람직하지만, 여전히 신뢰할 수 있는 결과를 제공함을 이해할 것이다. 따라서, 특정 구체 예에서, 혈장은 원심 분리 전에 3 분 동안 활성탄과 접촉되는 것으로 예상된다.

방법이 수행되는 온도는 중요하지 않지만 바람직하게는 실온 부근이다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 접촉 단계 (또는 배양 단계)는 실온(즉, 주위 온도)에서 수행될 수 있다.

이 방법은 일반적으로 멸균된 재료가 있는 실험실 환경에서 수행된다. 혈장 샘플을 취급하기 위한 적절한 툴은 당 업계에 공지되어 있다. 특정 구체 예에서, 접촉 단계 (또는 배양 단계)는 용기에서 수행될 수 있다. 용기의 비 제한적인 예는 에펜도르프 튜브, 다중 벽 플레이트, 바이알, 스핀 필터 및 (원심 분리) 튜브이다.

혈장 샘플을 활성탄과 접촉시킨 후, 혈장 샘플의 추가 시험에서 활성탄의 간섭을 방지하기 위해 활성탄을 샘플의 전부 또는 일부로부터 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 구체 예에서, 적어도 일부의, 바람직하게는 모든 혈장이 샘플로부터 회수되고, 즉 활성탄과의 물리적 접촉으로부터 제거된다. 특정 실시 예로, 활성탄으로부터 혈장를 회수하는 단계는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "필터"는 이것이 부유 물질 또는 고체 입자를 제거하고 /하거나 고체를 회수하기 위해 액체가 통과하는 다공성 물질, 장치 또는 막을 의미한다는 일반적인 의미를 갖는다.

본 발명의 맥락에서, 특정 실시 양태에서, 필터는 미세 다공성 플라스틱 필름과 같은 막 필터이다.

"기공 크기"라는 용어는 막 표면 또는 필터상의 기공의 평균 크기를 지칭한다. 기공 크기는 또한 특정 크기의 입자를 걸러내는 필터의 능력과 관련이 있다. 예를 들어, 공극 크기가 0.50㎛ 인 멤브레인 필터는 여과 스트림에서 직경이 0.50㎛ 이상인 입자를 걸러낸다. 기공 크기는 주사 전자 현미경 법, 다공성 측정법 및/또는 입자 챌린지를 이용한 육안 검사와 같은 기공 크기를 결정하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 기공은 원통형 또는 스폰지 기공 일 수 있다.

본 발명의 특정 구체 예에서, 활성탄으로부터 혈장을 회수하는 단계는 0.10 내지 0.75㎛, 0.20 내지 0.70㎛, 0.22 내지 0.70㎛, 0.22 내지 0.65㎛, 가장 바람직하게는 0.40 내지 0.65㎛, 0.50 내지 0.65㎛, 또는 0.60 내지 0.65㎛ 기공 크기의 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구체 예에서, 필터는 0.45㎛의 기공 크기를 갖는다. 바람직하게는, 활성탄으로부터 혈장를 회수하는 단계는 0.22 내지 0.65 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성탄으로부터 혈장를 회수하는 단계는 0.65 ㎛의 공극 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시 예에서, 필터를 통한 혈장 샘플의 통과는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 필터를 통한 혈장 샘플의 통과는 중력, 진공 또는 압력에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 필터를 통한 혈장 샘플의 통과는 원심 분리에 의해 달성된다. 따라서, 특정 구체 예에서, 활성탄으로부터 혈장를 회수하는 단계는 원심 분리 단계를 포함하고 상기 혈장 샘플을 필터, 바람직하게는 0.22 내지 0.65㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통과시키는 단계를 포함할 수 있다.

특정 실시 예에서, 원심 분리 단계는 필터를 통해 혈장를 이동시키는 데 사용된다. 이들 구체 예에서, 원심 분리 단계의 지속 시간은 2 내지 10분, 2 내지 7 분, 또는 2 내지 5 분일 수 있다. 바람직하게는, 2 내지 5 분의 원심 분리 단계가 사용된다. 또한, 원심력은 100 내지 500g, 100 내지 400g, 100 내지 300g, 또는 100 내지 200g일 수 있다. 바람직하게는, 원심 분리 단계는 100g의 원심 분리력으로 수행된다.

대안적인 실시 예에서, 활성탄으로부터 혈장를 회수하는 것은 필터를 사용하지 않는 원심 분리 단계를 포함할 수 있다. 활성탄 및 혈장의 혼합물의 원심 분리는 혼합물을 혈장 상(즉, 상부 상) 및 활성탄 상(즉, 하부 상 및/또는 펠렛)으로 분리할 수 있다. 이어서, 응고 시험을 수행하기 위해 혈장 상을 원심 분리 바이알로부터(예를 들어 피펫 또는 자동 주사기에 의해) 다른 용기로 물리적으로 제거할 수 있다.

샘플을 혈장 상 및 활성탄 상으로 분리하기 위한 원심 분리 단계의 지속 시간 및 원심력은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 방법이 혈장 샘플로부터 혈소판 또는 다른 세포 또는 단편을 개별적으로 제거할 필요성은 없는 것이 예상되지만, 특정 구체 예에서, 상기 방법은 혈장 샘플로부터 실질적으로 모든 혈소판, 혈소판 단편 및/또는 혈액 세포를 제거하기 위한 추가 원심 분리 단계를 포함할 수 있다. 원심 분리 단계가 혈장 샘플로부터 실질적으로 모든 혈소판, 혈소판 단편 및/또는 혈액 세포를 제거하도록 의도된 경우, 원심 분리 단계의 지속 시간은 5 내지 30분, 10 내지 20분, 15 내지 20분일 수 있다. 또한, 원심력은 1000g 내지 3000g, 1200g 내지 1800g, 또는 1500g 내지 1800g 일 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 단계 (b)에서 얻은 혈장은 하나 이상의 직접 항응고제를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 특히 적절한 필터 및/또는 추가 원심 분리 단계가 사용되는 실시 양태에서, 단계 (b) 후에 얻은 혈장은 또한 혈소판, 혈소판 단편, 잔류 혈액 세포 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 당업자는 필터의 기공 크기가 단계 (b)에서 얻어진 혈장에 혈소판 단편이 여전히 존재할지 여부를 결정할 것이라는 것을 이해할 것이다. 상기 방법이 0.22 내지 0.65㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함하는 경우, 얻은 샘플에는 혈소판(일반적으로 평균 크기가 0.5 내지 2.5㎛ 인), 혈소판 단편 및 잔류 혈액 세포(일반적으로 평균 크기는 6 ~ 14㎛인)가 실질적으로 없을 것이며, 추가 원심 분리가 필요하지 않다.

상기와 관련하여, 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계 이전에 혈장 샘플로부터 (실질적으로 모든 또는 모두) 하나 이상의 혈소판, 혈소판 단편 및 잔류 혈액 세포를 제거하는추가의 단계( 예를 들어 단계 (b)에 더하여)를 포함하지 않는다. 보다 구체적으로, 활성탄으로부터 혈장 시료를 회수하는 단계가 상기 혈장 시료를 필터, 바람직하게는 공극 크기가 0.22 내지 0.65㎛ 인 필터를 통해 통과시키는 것을 포함하는 경우, 상기 방법은 이러한 추가 원심 분리 단계를 포함하지 않는다. 전혈 샘플로부터 출발하여 혈소판이 없는 혈장을 수득하는 표준 방법은 전형적으로 적어도 15 분(예를 들어 1500g)의 2 개의 원심 분리 단계를 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 혈소판이 없는 혈장을 얻는 더 빠른 접근법을 제공하고, 표준 방법에서 대부분의 혈소판 및/또는 잔류 혈액 세포를 제거하는 대신 혈장 샘플로부터 혈소판 및/또는 잔류 혈액 세포를 제거할 수 있게 한다.

특정 실시 양태에서, 활성탄으로부터 혈장 샘플을 회수하는 단계가 샘플로부터 혈소판, 혈소판 단편 및 잔류 혈액 세포를 제거하기에 충분히 작은 공극 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함하지 않는 경우, 본원에 개시된 방법 단계 (c) (즉, 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계) 이전에, 혈장, 혈소판 단편 및 잔류 혈액 세포 중 하나 이상을 예를 들어 본원에 기재된 원심 분리에 의해 혈장으로부터 제거하는 추가 단계를 포함할 수 있다. .

본 발명의 방법이 혈장으로부터 직접 항응고제를 제거하도록 의도된 경우, 본 방법은 혈장에 존재하는 항응고제를 중화시키기 위해 범용 또는 특정 항 응고 반전제를 사용할 필요가 없다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 단계 (c) 또는 응고 분석을 수행하기 위한 샘플의 제조에서 하나 이상의 범용 또는 특정 항응고제 반전제와 혈장 샘플을 접촉시키는 것을 포함하지 않는다.

본 발명의 방법은 샘플에 존재하는 직접 항응고제의 잠재적인 간섭없이 혈장 샘플의 응고 능력을 측정할 수 있게 한다. 이것은 활성탄으로 존재할 수 있는 직접 항응고제를 제거함으로써 달성된다. 본 발명의 방법은 샘플에 존재하는 직접 항응고제의 총량의 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 바람직하게는 99% 이상을 제거하고; 또는 샘플에 존재하는 실질적으로 모든 직접 항응고제를 제거하게 한다. 본 발명의 방법은 직접 항응고제를, 샘플에서 지혈 장애의 시험관 내 진단을 방해할 수 없는 수준으로, 제거할 수 있게 한다.

특정 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법은 혈장 밀리 리터당 하나 이상의100ng 이상의 직접 항응고제, 혈장 밀리 리터당 하나 이상의 250ng 이상의 직접 항응고제, 혈장 밀리 리터당 하나 이상의 500ng 이상의 직접 항응고제, 혈장 밀리리터당 하나 이상의 750ng 이상의 직접 항응고제, 혈장 밀리리터 당 하나 이상의 1000ng 이상의 직접 항응고제, 혈장 밀리리터 당 하나 이상의 1500ng의 이상의 직접 항응고제, 혈장 밀리리터 당 하나 이상의 2000ng 이상의 직접 항응고제, 또는 혈장 밀리 리터당 하나 이상의 3000ng 이상의 직접 항응고제를 제거할 수 있게 한다. 바람직하게는, 본원에 기술된 방법은 혈장 밀리 리터당 하나 이상의 1000ng 이상의 직접 항응고제를 제거할 수 있게 한다.

특정 실시 양태에서, 방법은 혈장으로부터 임의의 잠재적 직접 항응고제를 제거한 후, 혈장의 응고 능력을 측정하는 단계를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "응고 능력"은, 임의로, 응고 캐스케이드의 하나 이상의 활성화제의 존재하에, 혈장의 응고 능력; 및/또는 고유 및/또는 외부 응고 경로에서 하나 이상의 응고 인자의 기능성 및/또는 활성에 대한 것이다. 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 응고 능력을 결정하기 위해 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 비 제한적인 예는 응고 분석, 예를 들어 응고 검출(예를 들어, 기계적, 광-광학적 또는 점탄성 기법에 의한), 활성화된 응고 시간, 트롬빈 생성 시험, 프로트롬빈 시간(PT), 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 루푸스 항응고 시험 , 피브리노겐 분석(클라우스 및 PT 유래 피브리노겐 방법), 트롬빈 (응고) 시간(TCT), 특정 인자 활성 분석(예 : FVIII, FIX, X, XI, XII, XIII; VII, V , II 또는 X에 대한 응고 분석 또는 발색 분석), 비타민 K 길항제 또는 부재(PIVKA) 검사 또는 혈전 시험에 의해 유도된 단백질, 활성화된 단백질 C 저항성(APCR) 분석, 단백질 C 활성 분석, 단백질 S 활성 분석, 안티트롬빈 활성 분석 및 트롬빈 생성 분석 및 dRVVT(dilute Russell Viper Venom Test/Time)이다.

특정 실시 양태에서, 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 하나 이상의 광학적, 면역학적, 발색성 및/또는 형광성 응고 분석법을 포함한다.

특정 실시 양태에서, 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는, 임의로, 응고 캐스케이드의 하나 이상의 활성화제의 존재하에, 응고를 형성하는 혈장 샘플의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 응고 형성은 광학적으로 또는 기계적으로 측정될 수 있다. 혈장 샘플이 응고할 수 없다는 것은 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도, 및 선택적으로 지혈 장애의 성질을 나타낸다.

특정 실시 양태에서, 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 특정 인자-결핍 혈장의 연장된 응고 시간을 정규화하기 위한 혈장 샘플의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 인자-결핍 혈장의 연장된 응고 시간을 정규화할 수 없는 대상체의 상기 혈장 샘플의 무능력은 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도, 및 선택적으로 지혈 장애의 성질을 나타낸다.

특정 실시 양태에서, 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 형광성/발색성 연결된 기질을 절단하는 특정 응고 인자의 능력을 평가하는 것을 포함한다. 상기 혈장 시료가 형광성/발색성 연결된 기질을 절단할 수 없다는 것은 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도, 및 선택적으로 지혈 장애의 성질을 나타낸다.

특정 실시 양태에서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 혈장 샘플을 응고 활성화제와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.

특정 실시 양태에서, 응고 활성화제는 인간 칼슘 트롬빈, 토끼 또는 재조합 인간 조직 인자, 합성 인지질, 러셀 살모사 독, 에카린, 텍스타린 또는 실리카, 콜로이드성 실리카 활성화제, 트롬보모둘린, 활성화된 단백질 C, 동결 건조된 소 트롬빈 및 트롬빈 CBS 61.50의 발색 기질, 뱀독으로부터의 제V인자 활성화제 및 뱀독으로부터 분리된 제V인자a-의존성 프로트롬빈 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

특정 실시 양태에서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 상기 혈장 샘플을 단계 (c) 이전에 면역 고갈된 혈청 또는 혈장과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 상기 면역 고갈된 혈청 또는 혈장은 인자 VIII 또는 IX 또는 X 또는 XI 또는 XII 또는 XIII 또는 VII 또는 V 또는 II 결핍 혈청 또는 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가의 특정 실시 양태에서, 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 프로트롬빈 시간, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 트롬빈 시간 또는 피브리노겐, 활성화된 단백질 C 저항성 평가, 트롬빈 생성 분석 수행, 루푸스 항응고 시험, 또는 단백질 C, S 및 안티트롬빈 측정 중 하나 이상을 포함한다.

예를 들어, 홍반성 항응고제(LA)는 인지질-결합 단백질, 특히 β2 당 단백질 I 및 프로트롬빈에 대해 직접 연결되지만 항 인지질 항체(APA)로 분류된다. 지속적인 LA의 존재는, 고상 분석(aCL & aβ2GPI)에서 검출된 기준 항체보다, 혈전증, 임신 이환율 및 재발과 더 큰 연관성이 있다. LA는 인지질-의존적 응고 분석에서 그들의 거동에 기초하여 추론에 의해 검출될 수 있는 자가항체의 이종 그룹이다. 그러나, 이는 응고 시간 증가의 다른 가능한 원인이 배제될 것이 요구된다. 특정 실시 양태에서, 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 프로트롬빈 시간(PT), 활성화된 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 루푸스 항응고 시험, 피브리노겐 분석(클라우스 및 PT 유도 피브리노겐 방법 모두), 트롬빈 시간, 응고 인자 활동 분석(FVIII, FIX, X, XI, XII, XIII; VII, V, II, X) ), 활성화된 단백질 C 내성(APCR) 분석, 단백질 C 활성 분석, 단백질 S 활성 분석, 안티트롬빈 활성 분석 및 트롬빈 생성 분석을 포함하는 목록으로부터 선택된 응고 테스트에 의해 수행된다. 실제로, 특정 실시 양태에서, 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는, 상기 샘플을 인자 VIII 또는 IX 또는 X 또는 XI 또는 XII 또는 XIII 또는 VIIV 또는 II-고갈된 혈장으로부터 선택된 하나 이상의 유형의 면역 고갈된 혈장과 접촉시킴으로써 샘플이 면역 고갈된 혈장을 교정할 수 있는지 여부를 결정하는 것을 포함한다.

특정 실시 양태에서, 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 섬유소원 결핍증, 프로트롬빈 결핍증, 제V인자 결핍증, 응고제V인자 레이든, 단백질 C 결핍증, 단백질 S 결핍증, 안티플라스민 결핍증, 항트롬빈 결핍증, 플라스미노겐 결핍, 상승된 D-dimer, 항인지질항체 증후군, 헤파린 유도 혈소판 감소증, 복합 제V인자 및 VIII 결핍증, 제VII인자 결핍증, 제VIII인자 결핍증(혈우병 A), 제IX인자 결핍증(혈우병 B), 제X인자 결핍증, 제XI인자 결핍증, 제XIII인자 결핍증, 혈소판 무력증, 베르나르-술리에 증후군, 비스코트-알드리히 증후군 또는 백혈구 부착 결핍증을 결정하기 위한 혈액 응고 기반 방법을 사용하여 결정되고, 상기 방법은 상기 지혈 장애의 성질의 표시를 추가로 제공한다.

특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 방법에 기재된 바와 같은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 하기 시험 중 하나 또는 이들의 조합을 사용하여 수행된다:

● 바람직하게는 과량의 동결 건조된 인간 칼슘 트롬빈을 단계 (b)에서 얻어진 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 피브리노겐의 정량적 측정.

● 바람직하게는 동결 건조된 인간 칼슘 트롬빈을 단계 (b)에서 얻어진 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 트롬빈 시간(TT) 시험.

● 바람직하게는 토끼 또는 재조합 인간 조직 인자, 합성 인지질 및 안정 화제를 단계 (b)에서 얻어진 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 프로트롬빈 시간(PT) 시험.

● 바람직하게는 콜로이드성 실리카 활성화제를 함유하는 합성 인지질 시약을 단계 (b)에서 얻어진 혈장에 첨가하거나 혼합함으로써, 활성화된 부분 혈전 플라 스틴 시간(aPTT)의 결정.

● 바람직하게 러셀 살모사 독, 에카린, 텍스타린 또는 실리카, 인지질 및 칼슘을 단계 (b)에서 얻어진 혈장에 첨가하여 혼합함으로써, 혈장에서 홍반성 항응고제의 검출(dRVVT, 텍스타린, 에카린, 또는 aPTT 방법 중 하나를 사용).

● 바람직하게는 면역 흡착에 의해 제VIII인자가 제거된 동결 건조 시트레이트화된 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제VIII인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 면역 흡착에 의해 제IX인자가 제거된 동결 건조 시트레이트화된 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제IX인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 면역 흡착에 의해 제XI인자가 제거된 동결 건조 시트레이트화된 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제XI인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 면역 흡착에 의해 제XII인자가 제거된 동결 건조 시트레이트화 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제 XII인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 면역 흡착에 의해 제VII인자가 제거된 동결 건조 시트레이트화된 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제VII인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 제V인자에 대해 인공적으로 동결 건조 시트레이트화된 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제V인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 제II인자에 대해 인공적으로 동결 건조 시트레이트화된 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제II인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 세팔린 및 제XII인자 활성화제, 카올린을 단계 (b)에서 얻어진 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써 카올린-활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)의 결정.

● 바람직하게는 뱀 독으로부터의 제V인자 활성화제 및 뱀 독으로부터 단리된 인자 Va 의존성 프로트롬빈 활성화제를 단계 (b)에서 얻어진 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 제V인자 라이덴 돌연변이에 의해 생기는 활성화된 단백질 C에 대한 내성의 결정.

● 바람직하게는 동결 건조된 소 트롬빈 및 트롬빈 CBS 61.50의 발색 기질을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써 안티트롬빈 활성 수준의 정량적 측정.

특정 구체 예에서, 본 발명의 방법은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는데 필요한 대조군의 감소를 허용한다. 실제로, 특히 환자에 의해 이를 확인할 수 없는 경우, 얻은 결과에 대한 항응고제의 영향을 배제하기 위한 추가 시험이 일반적으로 필요하다. 따라서, 특정 구체 예에서, 본 발명의 방법은 단지 하나 또는 제한된 수의 분석을 사용하여 상기 혈장의 응고 능력을 측정하는 단계를 포함한다.

특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 환자의 혈장에서 항응고제 인자의 대표적인 측정을 허용한다. 실제로, 본 발명에 따른 DOAC의 제거는 잘 확립된 분석법을 사용한 대표적인 결과를 허용한다.

예를 들어, 특정 실시 양태에서, 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 혈장 내 홍반성 항응고제의 검출을 포함한다. 일반적으로 홍반성 항응고제의 시험에는 스크리닝, 확인 및 혼합 시험이 필요하다. 스크리닝 시험은 일반적으로 희석 인지질을 사용하여 LA의 시험관 내 항응고제 효과를 강조하며, 존재하는 경우 응고 시간을 연장시킨다. 그러나 스크리닝 시험은 LA 이외의 이유로(즉, 인자 결핍, 항응고 요법) 연장될 수 있으므로, 모든 상승된 스크리닝 시험은 이상 특성을 정의하는 데 도움이되는 후속 분석이 필요한다. 확인 시험은 일반적으로 인지질 농도가 현저하게 증가되는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 스크리닝 시험을 수행하는 것을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 루푸스 항응고 시험은 dRVVT(dilute Russell's viper venom time), LA-반응성 APTT 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, 루푸스 항응고 시험은 실리카 활성화제 및 LA-반응성 인지질 유형의 조성물로 구성된 저농도의 인지질을 사용하는 희석 APTT(dAPTT)의 사용을 포함한다. 본 발명에 따른 DOAC의 사전 제거는 이들 방법을 사용하여 샘플에서 LA의 대표적인 검출을 허용할 것이다.

직접 항응고제의 효과를 역전시킴으로써, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 경구 또는 비경구의 직접 항응고제로 치료된 환자에서 지혈 장애의 진단에 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법은 관찰된 혈액 응고 부족이 조혈 장애 또는 상기 환자로부터의 혈장 샘플에서 직접 항응고제의 존재에 의한 것인지를 용이하게 결정할 수 있게 한다.

혈장 샘플에서 항응고제의 존재에 의해 가장 큰 영향을 받는 응고 시험 또는 분석은 응고 억제제가 지시하는 응고 인자를 포함하여 위-양성 또는 위-음성 결과를 초래하는 시험일 것이다(표 1).

표 1은 다양한 응고 기능 평가를 통한 직접 경구 항응고제의 간섭을 나타낸다.

시험	다비가트란	리바록사반	아픽사반	에독사반	베트릭사반	비고
PT/응고 인자	↓	↓↓/↓↓↓	↓/↓↓	↓↓	↓↓	-모든 인자가 영향을 받음 -리바록사반에 가장 민감
aPTT/응고 인자	↓↓↓	↓↓	↓/↓↓	↓/↓↓	↓↓	-모든 인자가 영향을 받음 -다비가트란에 가장 민감
루푸스 항응고제	↑/↑↑	↑/↑↑	-/↑	↑/↑↑	ND	-높은 스크린 / 확인 분석 비율로 인한 위-양성
APCR	↑	↑	↑	↑	ND	-aPTT 기반 분석은 대부분 영향을받음 -Pefakit APCR Factor V Leiden®과 리바록사반의 간섭 없음
단백질 C 활성	- /↑	- /↑	- /↑	-	ND	-발색 분석 : 영향을 받지 않음 - 항원 기반 분석 : 영향을받지 않음 -응고 기반 분석 : 영향을 받음
단백질 S 활성	- /↑	- /↑	- /↑	↑	ND	- 항원 기반 분석 : 영향을받지 않음 -응고 기반 분석 : 영향을 받음
항트롬빈 활성	- /↑	- /↑	- /↑	- /↑	ND	-항-트롬빈 기반 분석은 다비가 트란의 영향을 받음-항-인자 Xa 기반 분석은 인자 Xa 억제제의 영향을받음

APCR, 활성화된 단백질 C 저항성; aPTT, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간; PT, 프로트롬빈 시간; ND, 미완료

본원에 개시된 바와 같은 방법, 바람직하게는 활성탄으로부터 혈장 샘플을 회수하는 단계는 0.22 내지 0.65 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함하는 방법의 사용은, 지혈 장애의 진단의 신뢰성의 증가를 허용하고, 보다 특히 상기 환자로부터의 혈장 샘플에서(직접) 응고 억제제의 존재 또는 지혈 장애로 인한 감소된 응고 능력(예를 들어, 혈액 응고 부족) 사이의 차별화를 허용한다. 본원에 개시된 바와 같은 방법, 바람직하게는 활성탄으로부터 혈장 샘플을 회수하는 단계는 0.22 내지 0.65㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함하는 방법의 사용은, 다른 병인으로부터 항 혈전 치료와 관련된 감소된 응고 능력의 차별화를 가능하게 한다.

바람직하게는 활성탄으로부터 혈장 샘플을 회수하는 단계가 0.22 내지 0.65 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 방법의 사용은, 환자가 상기 정보를 제공할 수 없는 상황에서와 같이 환자가 (직접) 응고 억제제로 치료되었는지 여부를 알 수 없는 환자 샘플의 분석에 특히 관심이 있다. 실제로, 본 발명은(직접) 응고 억제제로 환자의 사전 치료가 진단에 영향을 미치지 않도록 보장하므로, 이는 환자의 사전 치료가 알려지지 않은 경우 잘못된 진단의 위험을 피한다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 방법의 특정 실시 양태에서, 환자의 병력은 알려져 있지 않다. 또한, 본 발명은 환자가 (직접) 응고 억제제로 치료된 경우에 중요하다.

추가의 측면은, 다음을 포함하는, 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 및/또는 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 혈장 샘플을 제조하기 위한 진단 키트에 관한 것이다:

- 활성탄;

- 필터, 바람직하게는 0.22 내지 0.65 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 포함하는 바이알;

및 선택적으로 조혈 장애의 시험관 내 진단에 필요한 하나 이상의 화합물. 특정 실시 양태에서, 진단 키트는 바이알 당 2mg 내지 20mg, 2mg 내지 10mg, 2.5mg 내지 7.5mg, 또는 2.5mg 내지 5mg의 활성탄을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 진단 키트, 더 구체적으로 제공되는 바이알은 바이알 당 2.5mg 내지 10mg의 활성탄을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 바이알은 4 내지 8mg의 활성탄, 예컨대 5 내지 7mg의 활성탄을 함유한다.

특정 실시 양태에서, 바이알은 100㎕ 내지 10000㎕, 100㎕ 내지 5000㎕, 250㎕ 내지 2500㎕, 250㎕ 내지 2000㎕, 250㎕ 내지 1500㎕, 또는 500㎕ 내지 1000㎕의 부피를 가질 수 있다. 바람직하게는, 바이알은 100㎕ 내지 1000㎕, 예컨대 500㎕ 내지 1000㎕의 부피를 갖는다. 실제로, 본 발명은 특히 환자 샘플의 분석에서 상기 방법의 사용을 고려하며, 이는 전형적으로 100㎕ 내지 10000㎕의 바이알, 예컨대 500㎕의 바이알에서 제한된 양의 혈액의 수집을 포함한다.

특정 구체 예에서, 필터는 0.10 내지 0.75㎛, 0.20 내지 0.70㎛, 0.22 내지 0.70㎛, 0.22 내지 0.65㎛, 0.40 내지 0.65㎛, 0.50 내지 0.65㎛, 또는 0.60 내지 0.65 ㎛의 기공 크기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 필터는 0.22 내지 0.65㎛의 기공 크기, 예컨대 0.45㎛의 기공 크기를 갖는다

특정 실시 양태에서, 필터는 바이알에 배치하기에 적합한 필터 장치 내에 위치되며, 이에 의해 바이알의 원심 분리시 필터 장치 내에 배치된 유체는 필터를 통해 바이알로 통과한다. 특정 실시 양태에서, 필터 장치는 250㎕ 내지 2000㎕의 Eppendorf 튜브에 배치하기에 적합하다.

특정 실시 양태에서, 필터 장치는 활성탄을 추가로 포함한다. 추가의 구체 예에서, 필터 장치는 5 내지 7mg의 활성탄을 포함한다.

특정 구체 예에서, 바이알은 진공채혈관 또는 에펜도르프 튜브일 수 있다.

특정 실시 양태에서, 지혈 장애의 시험관 내 진단에 필요한 하나 이상의 화합물은 응고 캐스케이드 및/또는 면역 결핍 혈장의 하나 이상의 활성화제이다.

진단 키트는 즉시 사용 가능한 기질 용액, 세척 용액, 희석 완충제 및 추가 화합물(예 : 인지질, 뱀 독, 칼슘, 염화칼슘, 조직 인자, 실리카, 셀라이트, 카올린, 엘라그산, 인간 또는 동물 기원 응고 인자)을 더 포함할 수 있다. 진단 키트는 또한 양성 및/또는 음성 대조군 샘플을 포함할 수 있다. 예: 가용화된 응고 억제제, 바람직하게는 트롬빈 및 인자 Xa 억제제, 더욱 바람직하게는 다비가트란 에텍실레이트, 리바록사반, 아픽사반 또는 에독사반.

지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 하나 이상의 화합물은 지혈 장애를 검출할 수 있는 화합물이다. 특정 실시 양태에서, 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 하나 이상의 화합물은 응고 활성화제를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 진단 키트는 하기 시험 또는 이들의 조합 중 임의의 것을 수행하기 위해 필요한 화합물을 포함한다 :

● 바람직하게 러셀 살모사의 독,에카린, 텍스타린 또는 실리카, 인지질 및 칼슘을 단계 (b)에서 얻어진 혈장 첨가하여 혼합함으로써, 혈장에서 홍반성 항응고제의 검출(dRVVT, 텍스타린, 에카린 또는 aPTT 방법 중 하나를 사용하여).

● 바람직하게는 면역 흡착에 의해 제XII인자가 제거된 동결 건조 시트레이트화 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제XII인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 제V인자가 인공적으로 고갈된 동결 건조된 시트레이트화된 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제V인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 제II인자가 인공적으로 고갈된 동결 건조된 시트레이트화된 인간 혈장을 단계 (b)에서 얻은 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 혈장에서의 제II인자 활성의 결정.

● 바람직하게는 세팔린 및 인자 XII 활성화제, 카올린을 단계 (b)에서 얻어진 혈장에 첨가 또는 혼합함으로써, 카올린-활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)의 결정.

특정 실시 양태에서, 진단 키트는 예를 들어 분광 광도계 또는 기계적 응고 검출에 의해 환자의 혈장 샘플의 응고 능력의 시각화 및/또는 정성적 판독을 허용하는 캐리어를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "캐리어"는 응고 반응이 수행되는 작은 용기를 지칭한다. 전형적으로, 용기가 보유할 수 있는 최소 부피는 응고 반응이 발생하는데 필요한 최소 총 부피보다 크다. 선택적으로, 이들 캐리어는 캐스케이드 테스트를 허용할 수도 있다. 담체의 비 제한적인 예는 반투명 미세적정판, 반투명 스트립웰(stripwell) 또는 반투명 튜브이다.

바람직하게는, 진단 키트에 포함된 설명서는 명확하고 간결하며 당업자에게 이해될 수 있다. 설명서는 일반적으로 키트 내용물, 혈장 샘플을 얻는 방법, 방법론, 실험 판독 및 해석 및 주의 및 경고에 대한 정보를 제공한다.

본 발명은하기 비 제한적인 실시 예에서 추가로 설명된다.

실시 예

실시 예 1 : 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 aPTT 및 PT 분석에 대한 혈청 샘플에 존재하는 DOAC의 영향

예를 들어, 병원 실험실에서, 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 표준 시험은 일반적으로 환자로부터 얻은 혈장 샘플에 대해 수행된다. 이러한 혈장 시료의 준비를 위해, 환자의 혈액 시료의 혈액 성분은 일반적으로 15분 동안 2500g에서 두 개의 원심 분리 단계로 분리된다(도 1). 첫 번째 원심 분리 단계는 고형 물질(예 : 적혈구 및 백혈구)(즉, 하부 상)과 혈장(즉, 상부 상)으로 혈액을 분리한다. 이어서, 혈장을 수집하고 제 2 원심 분리 단계로 보내, 잔류 혈액 세포 및/또는 혈소판을 펠렛화한다. 제 2 원심 분리 단계에 의해 얻은 상부 상(즉, 혈소판 부족 혈장)은 지혈 시험에 사용될 수 있다. 그러나, 표준 방법에 의해 얻은 혈소판 부족 혈장은 환자가 치료되는 경우 직접 항응고제(예를 들어 DOAC)를 포함 할 것이며, 이는 여러 응고 시간 시험을 방해할 수 있다(표 1).

리바록사반, 아픽사반, 에독사반, 다비가트란 및 베트릭사반과 같은 DOAC는 혈소판 부족 혈장(즉, 두 번째 원심 분리 단계 후 얻은 혈장)의 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)(도 2a) 및 프로트롬빈 시간(PT)(도 2b)을 연장했다. 또한, 응고 시간의 연장은 DOAC의 농도에 비례한다.

실시 예 2 : 본원에 개시된 바와 같은 방법은 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 aPTT 및 PT 분석에 대한 DOAC의 영향을 제거한다

대상체로부터 수득한 혈액 샘플을 15분 동안 2500g에서 원심 분리하여 혈액을 고체 물질(예를 들어, 적혈구 및 백혈구)(즉, 하부 상) 및 혈장(즉, 상부 상)으로 분리하였다.

첫 번째(및 유일한) 원심 분리 단계에서 얻은 혈장을 5분 동안 활성탄(10mg/㎖의 혈장)과 함께 배양한 후 0.65㎛의 기공을 가진 필터를 통해 혈장을 통과시켜 활성탄으로부터 혈장을 회수하였다(도 3). 필터를 통해 혈장를 통과시키는 것은 짧은 원심 분리에 의해 달성되었다. 0.65㎛의 기공을 갖는 필터는 혈액 응고 시험에 대한 최소한의 간섭으로 혈장에서 활성탄 및 잔류 혈액 세포 및/또는 0.65㎛보다 큰 크기의 혈소판을 효율적으로 제거할 수 있게 했다.

따라서, 필터를 통해 혈장를 통과시킴으로써 활성탄으로부터 혈장를 회수하는 것은 제 2 원심 분리 단계를 대체하여 실시 예 1에 개시된 바와 같이 혈소판이 불량한 혈장를 얻는 것으로 보인다.

여과된 혈장을 aPTT 및 PT 분석에 사용하였다. 본 발명의 결과는 aPTT 및 PT 분석에 대한 DOAC의 효과가 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법에 의해 1000ng/㎖와 같은 고농도의 DOAC에서도 완전히 제거되었음을 보여준다(도 4a 및 4b). 본 명세서에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 DOAC로 치료된 환자에서 응고 캐스케이드를 탐색할 수 있게 하고 혈장 샘플의 응고 능력에 대한 신뢰성있는 평가를 제공한다.

실시 예 3 : aPTT 및 PT 분석에 대한 DOAC의 영향 제거에 대한 활성탄 농도의 영향

실시 예 2에 기재된 바와 같이 대상체로부터 얻은 혈액 샘플을 한번 원심 분리함으로써 혈장을 수득하였다. 혈장 샘플을 상이한 농도의 활성화된 활성탄(즉, 5mg/㎖, 10mg/㎖ 또는 15mg/㎖)과 5분 동안 배양하였다. 이어서, 혈장을 짧은 원심 분리에 의해 0.65㎛ 공극 및 활성탄을 갖는 필터를 통해 혈장를 통과시킴으로써 활성탄으로부터 회수하였다.

여과된 혈장 샘플을 aPTT 및 PT 분석에 사용하였다. 이의 결과는 aptT 및 PT 분석에 대한 리바록사반의 효과가, 1000ng/㎖와 같은 고농도의 리바록사반에서도, 완전히 제거되었음을 보여준다(도 5a 및 5b). 또한, 5mg의 활성탄/㎖이 이 효과를 얻기에 이미 충분했다.

실시 예 4 : 본원에 개시된 바와 같은 방법은 임상 환경에서 응고 시험에 대한 DOAC의 영향을 제거한다

본원에 개시된 바와 같은 방법의 효능이 임상 상황에서 평가되었다. 도 6은 혈전증성 질환인 홍반성 항응고제(LA)로 고통받는 것으로 의심되는, 리바록사반으로 처리된 환자로부터 얻은 혈장 샘플(혈장 1 ml 당 339ng 리바록사반을 포함하는 혈장 샘플)에 대한 결과를 보여준다. LA 진단을 위해, 부분 혈소판 플라스틴 시간 -홍반성 항응고제 스크린(PTT LA), PTT LA 확인(Staclot LA), DRVVT(Dilute Russel Viper Venom Time) 스크린 및 DRVVT 확인을 포함하여 환자의 혈장에 대해 여러 체외 진단 분석이 수행되었다.

도 6은 모든 LA 진단 분석, 특히 DRVVT 및 DRVVT 확인에 대해, 처리되지 않은 혈장(즉, 본원에 개시된 바와 같은 방법으로 처리되지 않음; 실시 예 1에서 얻은 혈소판 부족 혈장)에 대한 응고 시간이 연장되었음을 보여준다. 따라서,이 시험으로부터 환자가 LA를 가지고 있다는 결론을 내릴 수 있다.

한편, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법으로 처리된 (즉, 실시 예 2에서 얻은) 혈장이 LA 진단 분석에 사용된 경우, 결과는 응고 시간이 정상 범위 내에 있음을 분명히 보여준다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 방법으로 치료된 혈장을 사용한 시험으로부터 환자가 LA를 갖지 않는다는 결론을 내릴 수 있었다.

위의 관점에서, 환자의 혈장에 리바록사반의 존재는 모든 LA 진단 분석에 대한 응고 시간을 연장시키고 이것은 잘못된 진단으로 이어질 수있는 것으로 보인다. 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의한 혈장의 처리는 제 2 원심 분리 단계를 대체하여 실시 예 1에 개시된 바와 같이 혈소판이 불량한 혈장을 수득하고, 따라서 표준 방법보다 더 짧은 방법이다. 또한, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 LA 진단 검정, 예컨대 PTT LA, Staclot LA, DRVVT 및 DRVVT 확인에서 응고 시간에 대한 DOAC의 존재의 영향을 제거할 수 있게 한다.

실시 예 5 : 홍반성 항응고제의 시험관 내 측정에 대한 혈장 샘플에 존재하는 DOAC의 영향.

LA 검출에는 스크리닝, 혼합 테스트 및 확인의 사용이 포함된다. 스크리닝 시험은 일반적으로 LA의 체외 항응고제 효과를 강조하기 위해 낮은 인지질 함량 시약을 사용하여 응고 시간을 연장시킨다. LA 이외의 이유(즉, 인자 결핍, 항 응고 요법)로 스크리닝 시험이 연장될 수 있으므로, 모든 상승된 스크리닝 시험은 후속 분석을 통해 어떠한 이상의 성질을 정의하는 데 도움이 된다. 확인 시험은 일반적으로 인지질 농도가 현저하게 증가되는 것을 제외하고는 동일한 환경에서 스크리닝 시험을 수행하는 것을 포함한다. 이는 LA를 부분적으로 또는 완전히 압도하는 효과가 있어 스크리닝 시험보다 응고 시간이 짧아져 인지질 의존성을 입증한다. 응고 시간은 분석 변동성 문제를 완화하기 위해 비율로 변환된다. 확인 비율이 10% 이상인 스크린 비율의 수정은 LA의 존재와 일치하는 것으로 간주되어, 응고 시간이 증가한 다른 원인은 제외된다.

불가피한 희석 효과가 분석의 이 측면을 손상시킬 수 있지만, 저해를 입증하고 간섭을 감소시키기 위해 시험 및 정상 혈장의 1:1 혼합물에 대해 스크린 및 확인 테스트를 수행함으로써 진단 특이성이 개선된다. 항체 이질성 및 시약 가변성은, 허용 가능한 검출 속도를 달성하기 위해, 상이한 분석 원리의 적어도 2가지 분석법의 사용을 필요로한다. 1차 분석법은 가장 임상적으로 중요한 항체를 검출할 수 있는 조합인, LA-민감성 APTT(PTT-LA)의 조합에서 dRVVT(dilute Russell's viper venom time)이다.

실험실에서 다수의 샘플에서 LA를 테스트하기 위해, dRVVT 및 LA-민감성 APTT의 조합이 사용되었으며, 이는 실리카 활성화제, 및 LA- 민감성 인지질 유형의 조성물로 구성된, 저농도 인지질을 사용한다. 확인 시험은 농축된 혈소판 유래 인지질의 첨가를 포함하였다. dRVVT 분석을 위해, 러셀 살모사(Daboia russellii)의 독으로부터의 희석된 FX 활성화제, LA 반응성인 인지질 유형의 조성물로 구성된 저농도의 인지질 및 칼슘 이온을 사용하였다. 확인 시험은 동일한 인지질 제제가 더 높은 농도로 사용되는 것을 제외하고는 동일한 시약을 포함한다. 모든 상승된 APTT 및 dRVVT 스크린 결과는 확인 테스트, 스크린 및 혼합 테스트를 수용하는데 반영되어 해석 주석으로 보고된다. LA 환자는 PTT-LA & dRVVT 검사 메들리 중 하나 또는 둘 다에서 양성일 수 있다.

LA 시험에서 DOAC의 간섭을 나타내기 위해, 건강한 공여자로부터의 정상 풀링된 혈장(NPP)은 0-100-300-1000ng/㎖의 최종 농도에서 다비가트란, 아픽사반, 리바록사반 또는 에독사반으로 스파이크되었다. 그 다음 두 가지 조건이 시험되었다: i) 스파이크된 NPP는 dRVVT- 스크린/확인 및 PTT-LA 둘 다에 대해 직접 시험됨 또는 ii) 5분간 장치(5 내지 7mg/필터의 양으로 활성탄 함유하는)에서 배양되고 2분 동안 200g으로 설정된 원심 분리 단계로 여과하였다. 바이알에 수집된 혈장은 DOAC를 고갈시키고, DOAC의 영향을 받지 않고 DRVVT 스크린/확인 및 PTT-LA 분석을 테스트할 수 있다.

위에서 언급한 두 가지 조건의 결과는 도 7에 나와 있다.이 결과는 DOAC를 포함하는 혈장 샘플이 모든 조사된 응고 테스트에서 참조 범위를 벗어난 연장된 응고 시간을 보여 위-양성(거짓 양성) 결과를 초래했음을 보여준다. 이들 샘플은 본 발명에 따라 DOAC가 제거될 때 기준 범위로 복귀한다. 이 결과는 DOAC의 존재로 인한 LA 진단에 대한 위-양성이 방지됨을 보여준다. 따라서, 1 차 분석은 DOAC의 존재에 의해 영향을 받고, DOAC의 제거는 dRVVT 스크린/확인 비율에 대한 도 7A 및 7B 및 LA에 민감한 APTT에 대한 도 7C에 도시된 바와 같이 기준값(즉, NPP가 임의의 DOAC와 스파이크되지 않은 경우)의 회복을 허용한다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 대상체로부터 얻은 혈장 샘플에서 지혈 장애의 시험관 내 진단 방법:
a) 상기 대상으로부터 얻은 혈장 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계;
b) 상기 활성탄으로부터 상기 혈장 샘플을 회수하는 단계;
c) 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계; 및
d) 상기 혈장의 응고 능력에 기초하여, 상기 대상체에서 지혈 장애의 존재, 진행 또는 중증도, 및 선택적으로 지혈 장애의 성질을 결정하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 활성탄으로부터 혈장 샘플을 회수하는 단계는 0.22 내지 0.65 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시키는 단계를 포함하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 활성탄으로부터 혈장을 회수하는 단계가 원심 분리 단계를 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성탄의 농도가 3mg/㎖ 이상, 바람직하게는 5mg/㎖ 이상인 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 샘플을 2 분 이상, 바람직하게는 5 분 이상 동안 활성탄과 접촉시키는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 이전에 혈장 샘플로부터 혈소판, 혈소판 단편 및 잔류 혈액 세포 중 하나 이상을 제거하는 추가 단계를 포함하지 않는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 시료의 응고 능력을 측정하는 단계는 혈장 시료를 응고 활성화제와 접촉시킴으로써 수행되는 방법.
제 7 항에 있어서, 응고 활성화제가 인간 칼슘 트롬빈, 토끼 또는 재조합 인간 조직 인자, 합성 인지질, 러셀 살모사 독, 에카린, 텍스타린 또는 실리카, 콜로이드성 실리카 활성화제, 트롬보모둘린, 활성화된 단백질 C, 동결 건조된 소 트롬빈 및 트롬빈 CBS 61.50의 발색 기질, 뱀독으로부터의 제V인자 활성화제 및 뱀독으로부터 분리된 제V인자a-의존성 프로트롬빈 활성화제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는, 상기 혈장 샘플을 단계 (c) 전에 면역 고갈된 혈청 또는 혈장과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 9 항에 있어서, 면역 고갈된 혈청 또는 혈장이 인자 VIII 또는 IX또는 X 또는 XI 또는 XII 또는 XIII 또는 VII 또는 V 또는 II 결핍된 혈청 또는 혈장으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는, 프로트롬빈 시간(PT), 활성화된 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 루푸스 항응고 시험, 피브리노겐 분석(클라우스 및 PT 유도 피브리노겐 방법 모두), 트롬빈 시간, 응고 인자 활동 분석(FVIII, FIX, X, XI, XII, XIII; VII, V, II, X) ), 활성화된 단백질 C 내성(APCR) 분석, 단백질 C 활성 분석, 단백질 S 활성 분석, 안티트롬빈 활성 분석 및 트롬빈 생성 분석을 포함하는 목록으로부터 선택된 응고 테스트에 의해 수행되는 방법..
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 섬유소원 결핍증, 프로트롬빈 결핍증, 제V인자 결핍증, 응고제V인자 레이든, 단백질 C 결핍증, 단백질 S 결핍증, 안티플라스민 결핍증, 항트롬빈 결핍증, 플라스미노겐 결핍, 상승된 D-dimer, 항인지질항체 증후군, 헤파린 유도 혈소판 감소증, 복합 제V인자 및 VIII 결핍증, 제VII인자 결핍증, 제VIII인자 결핍증(혈우병 A), 제IX인자 결핍증(혈우병 B), 제X인자 결핍증, 제XI인자 결핍증, 제XIII인자 결핍증, 혈소판 무력증, 베르나르-술리에 증후군, 비스코트-알드리히 증후군 또는 백혈구 부착 결핍증을 결정하기 위한 혈액 응고 기반 방법을 사용하여 결정되고, 상기 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 방법은 상기 지혈 장애의 성질의 지표를 추가로 제공하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 얻은 상기 혈장 샘플의 응고 능력을 측정하는 단계는 루푸스 항응고 시험에 의해 수행되는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 루푸스 항응고 시험은 dRVVT(dilute Russell's viper venom time) 및 LA-responsive APTT를 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 직접 항응고제, 바람직하게는 직접 경구 항응고제(DOAC)로 처치된 환자인 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 병력이 알려지지 않았거나 확인될 수 없는 대상체인 방법.
하기를 포함하는 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 진단 키트:
- 활성탄;
- 필터를 포함하는 바이알-상기 바이알의 부피는 100㎕ 내지 10000㎕; 및
- 선택적으로 지혈 장애의 시험관 내 진단에 필요한 하나 이상의 화합물, 선택적으로 상기 필터는 0.22 내지 0.65㎛, 보다 특히 0.40 내지 0.65㎛의 기공 크기를 갖는다.
하기 단계를 포함하는, 지혈 장애의 시험관 내 진단을 위한 샘플을 제조하는 방법:
a) 바이알에서 100㎕ 내지 10000㎕의 혈장 샘플을 활성탄과 접촉시키는 단계; 및
b) 0.40 내지 0.65㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 상기 혈장 샘플을 통과시킴으로써 상기 활성탄으로부터 상기 혈장 샘플을 회수하는 단계.