WO2014166508A1 - Способ определения функционального состояния системы гемостаза - Google Patents

Способ определения функционального состояния системы гемостаза Download PDF

Info

Publication number
WO2014166508A1
WO2014166508A1 PCT/EA2014/000010 EA2014000010W WO2014166508A1 WO 2014166508 A1 WO2014166508 A1 WO 2014166508A1 EA 2014000010 W EA2014000010 W EA 2014000010W WO 2014166508 A1 WO2014166508 A1 WO 2014166508A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
clot
time
patient
growth
sample
Prior art date
Application number
PCT/EA2014/000010
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Фазоил Иноятович АТАУЛЛАХАНОВ
Михаил Александрович ПАНТЕЛЕЕВ
Татьяна Алексеевна ВУЙМО
Анна Николаевна БАЛАНДИНА
Елена Александровна СЕРЁГИНА
Елена Николаевна ЛИПЕЦ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация"
Publication of WO2014166508A1 publication Critical patent/WO2014166508A1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/4905—Determining clotting time of blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors

Definitions

  • the invention relates to medicine, in particular to clinical laboratory research, and for the diagnosis of disorders of the blood coagulation system, including screening, diagnosis, monitoring, planning and evaluation of the effectiveness of therapy.
  • the closest analogue of the proposed solution can be called a method for determining coagulological characteristics, disclosed in US patent 6,432,657, publ. 08/13/2002.
  • fibrinogen degrades with thrombin without clot formation and the time-scattering dependence of the light scattering intensity is measured in the clot forming in the sample.
  • the disadvantages of the mentioned methods include the fact that they are not close to the physiological process of clot formation, i.e. activation of the coagulation process takes place in the entire sample volume and the amount of activator itself exceeds several times the physiological need, and thus cannot be sensitive to all pathologies and at the same time reflect all violations of the state of the hemostatic system.
  • the task to which the invention is directed is the timely prediction and prevention of the occurrence of thrombosis, bleeding and other pathologies of the hemostasis system; revealing the trend in the course of diseases associated with impaired functioning of the blood coagulation system, and evaluating the effectiveness of the patient's therapy.
  • the technical result obtained from the use of the proposed solution lies in the information content and complexity of assessing the state of hemostasis, i.e. the ability to evaluate the integral state of the coagulation system and its links in a single test, as well as as close as possible to in vivo conditions, which makes it easier to interpret processes.
  • the claimed technical solution consists in determining the optimal number of characteristics of the spatial dynamics of the processes of clot formation in the test sample, the subsequent comparison of the obtained data with the established norm, and if these characteristics deviate from the norm, deciding whether the patient has hypercoagulation or hypocoagulation, then there are tendencies to the main clinical manifestations of the pathology of hemostasis, thrombosis or bleeding, respectively. Based on the data obtained on the change in the state of the coagulation system, the doctor decides on the appointment and correction of patient therapy.
  • This problem is solved by creating a method for determining the functional state of the hemostatic system, which includes the following steps: a) preparation of a blood sample or its products; B) under established conditions, the determination of spatial dynamics in vitro of at least one of the processes of coagulation or lysis of a clot in a test sample; c) comparing the results obtained in step b) with the norm and determining the direction and severity of the deviations in the patient.
  • step b the following processes are recorded in the test sample: clot growth from an activator, spontaneous clot growth, fibrinolysis, or a combination thereof.
  • the characteristics of the indicated processes in the test sample are determined: the light scattering intensity in the clot, the delay time of clot formation, the clot growth rate, the area under the distance dependence of the light scattering curve, the speed of the thrombin wave; thrombin peak, clot size at a given point in time, fibrinolysis start time, change in fibrinolysis front in time, change in thrombosis front in time, change in clot size in time.
  • Clot growth rate (V beg, V st), initial, stationary, etc. - an integral indicator of the patient's plasma ability to form a clot
  • Registration of these processes in the test sample and determination of these characteristics is carried out by means of an effective and time-saving (no more than 30-45 min) diagnostic system for measuring the formation or lysis of a clot in the sample, which allows to obtain reproducible results.
  • the spatial dynamics of at least one of the processes in the test sample is determined by means of a specially developed test, by studying the dynamics of growth and lysis of a bunch in a spatially inhomogeneous medium, which was carried out as follows.
  • Blood is taken from the patient and a test sample is prepared. Next, the sample is mixed with the reagent to inhibit the contact activation of the coagulation of the sample and the reagent is added.
  • a sample in the form of whole blood or its products (plasma, etc.) may be freshly obtained or it may be frozen, for example, in the case of samples containing no cells.
  • the sample may also contain mixtures of purified natural, synthetic or recombinant proteins and / or other preparations / reagents with hemostatic, fibrinolytic or antifibrinolytic activity.
  • the sample can be obtained from healthy subjects or from subjects that may or may not suffer from a blood clotting disorder.
  • tissue factor can be selected as said activator.
  • TF tissue factor
  • the growth of a clot in the space of the test sample is recorded as a function of time.
  • a feature of the test is the local activation of coagulation by a surface with an activator immobilized on it, and the registration of a growing clot in an immiscible thin layer of the test sample, by light scattering, by the dark field method. Coagulation occurs at a set temperature.
  • immobilized “suggests as simple immobilization on the carrier by lyophilization, and immobilization by interaction with the carrier or by attaching to the carrier, such as covalent attachment to the carrier w directly or via a linker molecule.
  • the duration of the test can be 45 minutes, preferably 30 minutes, and a sample is taken every 15 seconds.
  • the delay time of clot formation (t lag), (coagulation initiation time is the moment at which the clot size becomes nonzero); the initial growth rate of the bunch (the slope of the straight line approximating the least squares method of the curve of the dependence of the size of the bunch near the activator); stationary clot growth rate (the slope of the straight line approximating the plot of the dependence of the clot size far from the activator).
  • FIG. 1 shows the dependence of light scattering on the distance by which the bunch has grown on the surface of the activator.
  • figure 2 presents the dependence of the size of the bunch on time;
  • Fig. 3 illustrates the growth of a clot at different times from the start of the experiment;
  • FIG. 4 illustrates examples of spontaneous thrombosis (clot formation away from the activator);
  • FIG. 5 presents examples of clot lysis;
  • figure 6 shows the dependence of light scattering on the distance by which the clot grows on the boundary of the surface of the activator for the case of thrombus lysis;
  • FIG. Figure 7 shows the dependences of the propagation of a thrombin wave in time and space for different concentrations of the active XI factor.
  • Figure 1 shows the dependence of the intensity of light scattering in a bunch on the size of the bunch (the distance by which it grew from the boundary of the activator surface) during the test, which is typical for the norm, hypercoagulation state and hypocoagulation state of the coagulation system.
  • the data shown in figure 1, simultaneously show the size and quality of the clot, its density, which characterizes the content of fibrinogen, which is another main characteristic of the first process in the test sample - the area under the curve of light scattering versus distance (S cr).
  • the clot growth characteristic “clot formation delay time (t lag)” describes the initial coagulation reaction, which is determined by the graphs shown in FIG. 2.
  • the delay time of clot formation (ti ag ) is calculated as the time before the start of clot formation at the activator boundary insertion.
  • the clot formation delay time '(ti ag ) reflects the time required to start the growth of the visible fibrin clot, so if the clot growth delay time (t
  • Lengthening the delay time can be a consequence of the reduced, compared with the normal state, plasma ability to form a clot, which can be associated both with anticoagulant therapy and with a different violation of the blood coagulation system and cause the patient to bleed.
  • the integral indicator is determined - “clot size at a given point in time (h cg)”, from which the basic characteristics of the clot growing from the activator are calculated: “clot growth rate (V beginning, V st)” - initial, stationary, etc. depending on specific tasks.
  • the initial clot growth rate is calculated as the slope of the straight section (Fig. 2).
  • the time delay (tiag) of clot growth and the initial speed calculated over a certain period of time reflect the external pathway of coagulation activation, and may be sensitive to drugs such as NOVOSEVEN®. While the stationary speed reflects the internal pathway of coagulation activation, being sensitive, for example, to hemophilia.
  • the stationary clot growth rate is the clot growth rate far from the activator, calculated as the slope of the straight section (Fig. 2).
  • Any other necessary clot growth rates are calculated in the selected time range.
  • the clot size was calculated as the coordinate at which the light scattering intensity was 50% of the maximum intensity, which corresponds to the conversion of half of all fibrinogen to fibrin.
  • spontaneous thrombosis characterizes a state of increased tendency to thrombosis (hypercoagulation).
  • hypercoagulation Normally, a clot grows only from activator, however, with hypercoagulation ⁇ there is a phenomenon of activator-independent coagulation - the appearance and growth of fibrin clots far from the activator in the volume of the test sample. This phenomenon will hereinafter be referred to as spontaneous thrombus formation, and such clots as spontaneous clots.
  • spontaneous thrombus formation and such clots as spontaneous clots.
  • spontaneous clots The presence of spontaneous clots and their characteristics indicate that the patient’s blood sample contains a large number of active components that trigger coagulation. The risk of blood clots in a patient in such cases is especially high.
  • FIG. Figure 4 presents examples of spontaneous thrombosis (clot formation away from the activator).
  • Spontaneous clot formation indicates the presence of coagulation activating components in the test sample (increased content of active factors or, for example, phospholipid surfaces), the indicator does not depend on the action of the activator, and shows a strong tendency to thrombosis. This process reflects the characteristics of clots that form independently of the activator.
  • Spontaneous clots and their characteristics are special indicators of thrombogenicity in patients. It is they that make it possible to assess the presence of a pronounced tendency to pathological thrombosis and / or the initial stages (hypercoagulation phase) of the DIC syndrome in a patient.
  • the third process to be determined in the test sample of the proposed method “fibrinolysis” is the thrombus lysis process, estimated by the delay time of fibrinolysis, the average rate of lysis of the clot obtained from the fibrinolysis front, the light scattering function and the distance from time x (t) and y (t), which are reflected in FIG. 5-6.
  • a characteristic of clot growth is also the propagation of a thrombin activity wave in space and time using the developed video microscopy method using a fluorogenic substrate. Coagulation is also triggered by the activator and spreads from it in the space of the cell. However, a thrombin-specific protein fluorogenic substrate was added to the test sample. In the process of coagulation in the test sample, the resulting thrombin promotes the production of fluorescent molecules, which can be used to judge the propagation of the thrombin activity wave.
  • FIG. Figure 7 shows the dependences of the propagation of a thrombin wave in time and space for different concentrations of the active XI factor.
  • the thrombin concentration nM is indicated along the y axis, the distance in mm along the x axis, and time in minutes along the z axis.
  • FIG. 7a and 76 reflect the situation of deficiency of the XI coagulation factor OED / ml and 0.2 U / ml.
  • FIG. 7c shows the normal thrombin wave for a normal factor XI content of 1 U / ml.
  • FIG. 7g reflects a thrombin wave for a high content of XI factor 5ED / ml.
  • Example 1 Patient A with a severe form of hemophilia type A was taken a blood sample. Platelet-free plasma (pip) was prepared from blood taken from a patient.
  • pip Platelet-free plasma
  • 120 ⁇ l of plasma pfp was mixed with a reagent to inhibit contact activation of the coagulation of the sample, after which they were incubated for 15 minutes in a thermostat, and then, adding a reagent for recalcification, immediately placed the sample in a cuvette, brought the contents of the cuvette into contact with the activator and started the study on a diagnostic tool as stated earlier.
  • FIG. 1c shows graphs of clot growth profiles.
  • concentration of the curves in the range from 0 to 1000 ⁇ m indicates the hypocoagulation state of the patient's hemostasis, as well as this condition can be judged by photographs, which clearly show that the growth of the clot is practically absent.
  • Example 2 Patient B, the early postoperative period after hip replacement.
  • a blood sample of this patient was prepared and tested by the method indicated in Example 1.
  • FIG. 16 shows graphs of clot growth profiles.
  • the curves are distributed over almost the entire length of the distance coordinate, which indicates the hypercoagulable state of the patient's hemostasis, and this state can also be judged from the photographs in FIG. 4, which clearly shows the formation of spontaneous clots and accelerated clot growth, which confirms the state of hypercoagulation.
  • the patient has an increase in the initial clot growth rate to 62 ⁇ m / min and a stationary speed to 46 ⁇ m / min.
  • the time of complete overgrowing was 42 minutes.
  • Bee et ”characteristics 1 confirm the patient’s hypercoagulable state, that is, the patient has a very high risk of thrombosis, and, therefore, he needs anticoagulant therapy.
  • Example 3 Donor C, a conditionally healthy person. A blood sample of this patient was prepared and tested by the method indicated in Example 1.
  • Example 4 Patient D with hemophilia A, undergoing replacement therapy with the preparation of recombinant Villa coagulation factor, in a standard dosage. A blood sample of this patient was prepared and tested by the method indicated in Example 1.
  • the results of the test clearly showed that before the start of substitution therapy, the patient was in a state of hypocoagulation with a reduced stationary rate of clot growth of 17 ⁇ m / min. These characteristics confirm the patient's bleeding tendency. After administration of the drug, the obtained characteristics of the test show that the condition of hemostasis of this patient was normalized, i.e. the stationary clot growth rate began to be 27 ⁇ m / min. We can conclude that the test clearly showed the effect of the drug administered to the patient and made it possible to confirm the correct choice of its dosage.
  • Example 5 Patient E with portal vein thrombosis undergoing anticoagulant therapy. A blood sample of this patient was prepared and tested by the method indicated in Example 1.
  • the results of the test clearly showed that the patient was in a state of hypercoagulation with increased initial and stationary clot growth rates of 65 ⁇ m / min and 37 ⁇ m / min, respectively, and an increased clot size of 1374 ⁇ m. These characteristics confirm the patient's tendency to pathological thrombosis.
  • the obtained test characteristics show that the condition of hemostasis of this patient was brought into a state of mild hypocoagulation with a stationary clot growth rate of 15 ⁇ m / min, which is necessary to prevent the progression of thrombosis.
  • Example 6 Patient F with newly occurred portal vein thrombosis receives anticoagulant therapy and, at the same time, fibrinolytic therapy. A blood sample of this patient was prepared and tested by the method indicated in Example 1.
  • Clot growth retardation min 0.8 0.3-1.5 The initial clot growth rate, ⁇ m / min 14 ⁇ 36-56
  • Example 7 Patient G ,. early postoperative period, pneumonia. I have not received anticoagulation therapy due to thrombocytopenia. On the 2nd day after surgery, the patient developed portal vein thrombosis.
  • the test described here has the ability to predict and can be used to prescribe therapy for the correction of hemostasis.
  • the given examples confirm the fact that if the determined characteristics deviate from the established norms, the patient may have the presence of hypercoagulation or hypocoagulation in time, that is, a tendency to the main clinical manifestations of hemostasis pathology, thrombosis, or bleeding, respectively. Based on the data obtained, the doctor may decide on the appointment and correction of patient therapy.
  • This forecasting method is applicable to patients with various pathologies of hemostasis.
  • the totality of the characteristics determined as a result of the test allows you to diagnose a tendency to thrombosis, bleeding and other pathologies of the hemostasis system. It also allows you to monitor changes and conditions of coagulation during the replacement therapy of coagulation factors, anticoagulant, fibrinolytic therapy and therapy with other drugs that affect the blood coagulation system.
  • Example 8 A blood sample was taken from patient H with hemophilia C. In vitro 4 samples of platelet-rich prp plasma were prepared. A sample without the addition of the active XI factor (Fig. 7a) and 3 samples into which the active XI factor was added, which is necessary for the formation and propagation of a thrombin wave, at concentrations of 0.2 U / ml (Fig. 7b), 1 U / ml (Fig. 7c) and 5ED / ml (Fig. 7d), respectively. Normal is considered a concentration of 1U / ml (pigv)
  • Example 9 Patient I, a conditionally healthy person, took a blood sample. A sample of platelet-poor plasma PPP was prepared, on which the study was conducted.
  • the obtained indicators are within the range of normal values, which confirms the lack of data for pathology.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, в частности, к клиническим лабораторным исследованиям, и касается диагностики нарушений свертывающей системы крови, включая скрининг, постановку диагноза, мониторинг, планирование и оценку эффективности терапии. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является своевременное прогнозирование и предупреждение возникновения тромбозов, кровотечений и других патологий системы гемостаза; выявление тенденции течения заболеваний, связанных с нарушением работы свертывающей системы крови, и оценка эффективности проводимой терапии пациента. Указанная задача решается путем создания способа определения функционального состояния системы гемостаза, включающего следующие шаги: а) подготовка образца крови или ее продуктов; b) при установленных условиях определение пространственной динамики in vitro, по меньшей мере, одного из процессов свертывания или лизиса сгустка в исследуемом образце; с) сравнение результатов, полученных на этапе b) с нормой и определение направленности и степени выраженности отклонений у пациента. А также тем, что на этапе b) регистрируют следующие процессы в исследуемом образце: рост сгустка от активатора, рост спонтанных сгустков, фибринолиз или их комбинацию, где определяют характеристики указанных процессов в исследуемом образце: интенсивность светорассеяния в сгустке, время задержки формирования сгустка, скорость роста сгустка, площадь под кривой зависимости светорассеяния от расстояния, скорость распространения тромбиновой волны; пик тромбина, размер сгустка в заданный момент времени, время начала фибринолиза, изменение фронта фйбринолиза во времени, изменение фронта тромбообразования во времени, изменение размера сгустка во времени, а на основании указанных характеристик определяют состояние системы гемостаза у пациента или донора; проводят мониторинг терапии препаратами, воздействующими на систему гемостаза; осуществляют индивидуальный подбор терапии; исследуют механизм действия лекарственного препарата; скрининг пациента.

Description

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ
СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
Область назначения
Изобретение относится к медицине, в частности, к клиническим лабораторным исследованиям, и касается диагностики нарушений свертывающей системы крови, включая скрининг, постановку диагноза, мониторинг, планирование и оценку эффективности терапии.
Уровень техники
Из уровня техники известен способ определения состояния системы свертывания крови у пациента, заявка на изобретение US2009/0130645, опубл. 21.05.2012г. Указанный способ основан на определении скорости формирования сгустка, плотности сгустка в зависимости от времени, максимальной плотности сгустка и степени фибринолиза. Указанные характеристики определяются известным способом вискоэластометрией, а затем сравниваются с референсными значениями.
Из уровня техники известен способ определения формирования и лизиса фибринового сгустка у пациента, раскрытый в заявке US 2008/268483 опубл. 30.10.2008. Данный способ позволяет прогнозировать тромбозы и кровотечения посредством определения времени задержки (лагтайма, tiag), максимальной амплитуды (плотности исследуемого образца), времени достижения максимальной плотности и времени падения плотности исследуемого образца.
Известен способ диагностики патологий системы гемостаза, патент RU2449281 , кл. G01N 33/48, опубл. 27.04.2012г. Указанный способ основан на определении времени свертывания, тромбопластинового времени, тромбинового времени и ряда других характеристик, с помощью которых осуществляют постановку предварительного диагноза или прогнозирование исхода заболеваний.
В качестве ближайшего аналога заявляемого решения можно назвать способ определения коагулологических характеристик, раскрытый в патенте US 6,432,657, опубл. 13.08.2002. Где в исследуемом образце происходит деградация фибриногена с тромбином без образования сгустка и измеряется зависимость интенсивности светорассеяния от времени в сгустке, формирующемся в образце. В качестве недостатков упомянутых способов можно назвать то, что они не приближены к физиологическому процессу формирования сгустка, т.е. активация процесса свертывания происходит во всем объеме образца и количество самого активатора превышает в несколько раз физиологическую потребность, и таким образом не могут быть чувствительными ко всем патологиям и одновременно отражать всех нарушений состояния системы гемостаза.
Следовательно, для применения указанных способов необходимо провести большое количество определений, что требует затрат дополнительного времени и делает данные способы неудобными и не точными, приводящими к погрешностям, возникающим в процессе работы с ними.
Таким образом, существует потребность в диагностической системе, которая позволяет определять и оценивать как первоначальное состояние свертывающей системы крови и её способность к образованию сгустка, отслеживать ухудшение этого состояния при прогрессировании заболевания, так и оценивать эффективность лечения в ходе проводимой терапии, и которая позволила бы преодолеть вышеуказанные недостатки.
Существо заявляемого решения
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является своевременное прогнозирование и предупреждение возникновения тромбозов, кровотечений и других патологий системы гемостаза; выявление тенденции течения заболеваний, связанных с нарушением работы свертывающей системы крови, и оценка эффективности проводимой терапии пациента.
Технический результат, получаемый от использования заявляемого решения, заключается в информативности и комплексности оценки состояния гемостаза, т.е. возможности оценить интегральное состояние системы свертывания и ее звеньев в рамках одного теста, а также в максимальном приближении к условиям in vivo, что позволяет проще интерпретировать процессы.
Заявляемое техническое решение заключается в определении оптимального количества характеристик пространственной динамики процессов образования сгустка в исследуемом образце, последующего сравнения полученных данных с установленной нормой, и при отклонении упомянутых характеристик от нормы, принятии решения о наличии у пациента гиперкоагуляции или гипокоагуляции, то есть склонности к основным клиническим проявлениям патологии гемостаза, тромбообразованию или кровотечению соответственно. На основании полученных данных об изменении состояния системы свертывания врачом принимается решение о назначении и коррекции терапии пациента.
Указанная задача решается путем создания способа определения функционального состояния системы гемостаза, включающего следующие шаги: а) подготовка образца крови или ее продуктов; Ь) при установленных условиях определение пространственной динамики in vitro, по меньшей мере, одного из процессов свертывания или лизиса сгустка в исследуемом образце; с) сравнение результатов, полученных на этапе Ь) с нормой и определение направленности и степени выраженности отклонений у пациента.
А также тем, что на этапе Ь) регистрируют следующие процессы в исследуемом образце: рост сгустка от активатора, рост спонтанных сгустков, фибринолиз или их комбинацию.
А также тем, что на этапе Ь) определяют характеристики указанных процессов в исследуемом образце: интенсивность светорассеяния в сгустке, время задержки формирования сгустка, скорость роста сгустка, площадь под кривой зависимости светорассеяния от расстояния, скорость распространения тромбиновой волны; пик тромбина, размер сгустка в заданный момент времени, время начала фибринолиза, изменение фронта фибринолиза во времени, изменение фронта тромбообразования во времени, изменение размера сгустка во времени.
А также тем, что на основании указанных характеристик определяют состояние системы гемостаза у пациента или донора; проводят мониторинг . терапии препаратами, воздействующими на систему гемостаза; осуществляют индивидуальный подбор терапии; исследуют механизм действия лекарственного препарата; скрининг пациента.
Авторами было обнаружено, что необходимым и достаточным является определение, по меньшей мере, одного из следующих процессов в исследуемом образце:
1. Рост сгустка от активатора
Основные характеристики: - Интенсивность светорассеяния в сгустке, характеризует качество сгустка
- Время задержки формирования сгустка (t lag), характеризует начальные реакции свертывания,
- Скорость роста сгустка (V нач, V ст), начальная, стационарная и др. - интегральный показатель способности плазмы больного к образованию сгустка,
Характеристики в случае волны тромбина:
- Скорость распространения тромбиновой волны;
- Пик тромбина.
Дополнительные характеристики:
- Площадь под кривой зависимости светорассеяния от расстояния (S сг), характеризует одновременно размер и качество.
- Размер сгустка в заданный момент времени (h сг), интегральный показатель.
2. Рост спонтанных сгустков
Основные характеристики:
- Время формирования первого спонтанного сгустка (t спонт)
- Время полумаксимального зарастания сгустками исследуемого образца
- Интенсивность светорассеяния вдали от активатора в заданный момент времени
Дополнительные характеристики:
- Время полного зарастания исследуемого образца
- Скорость зарастания спонтанными сгустками.
3. Фибринолиз Основные характеристики: Время задержки фибринолиза Средняя скорость лизиса сгустка Дополнительные характеристики: Изменение размера сгустка со временем
Регистрация указанных процессов в исследуемом образце и определение указанных характеристик осуществляется посредством эффективной и не требующей больших затрат времени (не более 30-45 мин) диагностической системы для измерения образования или лизиса сгустка в образце, которая позволяет получать воспроизводимые результаты.
Пространственная динамика, по меньшей мере, одного из процессов в исследуемом образце определяется посредством специально разработанного теста, путем изучения динамики роста и лизиса сгустка в пространственно-неоднородной среде, который осуществляли следующим образом.
Производят забор крови у пациента и готовят исследуемый образец. Далее образец смешивают с реагентом для ингибирования контактной активации свертывания образца и добавляют реагент для рекальцификации.
Образец (в виде цельной крови или ее продуктов (плазмы и др.)) может быть свежепо лученным или он может находиться в замороженном состоянии, например, в случае образцов, не содержащих клеток. Образец также может содержать смеси очищенных природных, синтетических или рекомбинантных белков и/или другие препараты/реагенты, обладающие гемостатической, фибринолитической или антифибринолитической активностью. Образец может быть получен от здоровых субъектов или от субъектов, которые могут страдать или страдают от нарушения свертывания крови.
Подготовленный указанным способом образец помещают в кювету, обеспечивают приведение в контакт исследуемого образца с аналогом физиологического активатора коагуляции. Где в качестве упомянутого активатора может быть выбран тканевый фактор (TF). Далее, посредством разработанного для данного теста прибора (созданный заявителем - ООО «ГемаКор», Россия), регистрируют рост сгустка в пространстве исследуемого образца, как функцию времени. "Особенностью теста является локальная активация свертывания поверхностью, с иммобилизованным на ней активатором, и регистрация растущего сгустка в неперемешиваемом тонком слое исследуемого образца, по светорассеянию, методом темного поля. Свертывание происходит при установленной температуре. При этом, термин «иммобилизованный» предполагает как простую иммобилизацию на носителе путем лиофилизации, так и иммобилизацию путем взаимодействия с носителем или путем присоединения к носителю, такого как ковалентное присоединение к носителю непосредственно или через линкерную молекулу.
В результате проведенного теста получают графическую и визуальную (фото) информацию, которую обрабатывают с использованием разработанного программного обеспечения. В частности, длительность теста может составлять 45 мин, предпочтительно 30 мин, а каждые 15 сек производится фотосъемка образца.
При обработке данных по светорассеянию все полученные фотографии полагались симметричными относительно перпендикуляра к активатору. Это позволяет перейти от двумерных распределений интенсивности к одномерным на отрезках, проведенных перпендикулярно активатору, вдоль направления роста сгустка. Для этого в данном направлении выбиралась узкая полоса, вдоль которой для всех моментов времени вычислялись кривые интенсивности регистрируемого сигнала светорассеяния - графики зависимости средней интенсивности светорассеяния (полученной из значений интенсивности пикселей) от расстояния от активатора. Для каждой кривой зависимости интенсивности светорассеяния от времени рассчитывался размер сгустка как координата, при которой интенсивность светорассеяния равнялась 50% от максимальной интенсивности. На основании зависимостей размера сгустка от времени, были рассчитаны следующие характеристики роста сгустка в пространстве: время задержки формирования сгустка (t lag), (время инициации свертывания - момент времени, при котором размер сгустка становится ненулевым); начальная скорость роста сгустка (тангенс угла наклона прямой, аппроксимирующей методом наименьших квадратов участок кривой зависимости размера сгустка вблизи активатора); стационарная скорость роста сгустка (тангенс угла наклона прямой, аппроксимирующей участок зависимости размера сгустка вдали от активатора).
Заявляемый способ может быть проиллюстрирован следующими фигурами чертежей, где ^на фиг;- 1 (а-в) представлена зависимость светорассеяния от расстояния, на которое вырос сгусток от поверхности активатора. на фиг.2 представлена зависимость размера сгустка от времени; фиг.З иллюстрирует рост сгустка в разное время от начала эксперимента; фиг. 4 иллюстрирует примеры спонтанного тромбообразования (образования сгустка вдали от активатора); на фиг. 5 представлены примеры лизиса сгустка; на фиг.6 представлена зависимость светорассеяния от расстояния, на которое растет сгусток от границы поверхности активатора для случая лизиса тромба; на фиг. 7 приведены зависимости распространения тромбиновой волны во времени и пространстве для разных концентраций активного XI фактора.
Одной из основных характеристик первого процесса в исследуемом образце «Роста сгустка от активатора» является «интенсивность светорассеяния в сгустке», которую определяют исходя из визуальной информации, пример которой представлен на фиг. 3. Она иллюстрирует рост фибринового сгустка в разное врем от начала проведения теста. По данным, полученным на фотографиях фиг. 3, посредством программного обеспечения строятся графики, проиллюстрированные на фиг. 1 и 2.
На фиг.1 представлена зависимость интенсивности светорассеяния в сгустке от размера сгустка (расстояния, на которое он вырос от границы поверхности активатора) за время проведения теста, характерная для нормы, гиперкоагуляционного состояния и гипокоагуляционного состояния системы свертывания. Данные, отображенные на фиг.1, показывают одновременно размер и качество сгустка, его плотность, характеризующую содержание фибриногена, являющейся еще одной основной характеристикой первого процесса в исследуемом образце - площадь под кривой зависимости светорассеяния от расстояния (S сг).
Характеристика роста сгустка - «время задержки формирования сгустка (t lag)» описывает начальные реакции свертывания, которую определяют посредством графиков, представленных на фиг.2. Время задержки формирования сгустка (tiag) рассчитывается, как время до начала образования сгустка на границе активатора- вставки. Время задержки формирования сгустка' (tiag) отражает время, которое требуется для старта роста видимого фибринового сгустка, так если время задержки роста сгустка (t|ag) меньше нормального значения, то можно сделать вывод о повышенной, по сравнению с нормальным состоянием, способности плазмы к образованию сгустка. Удлинение времени задержки может быть следствием сниженной, по сравнению с нормальным состоянием, способности плазмы к образованию сгустка, что может быть связано как с проведением антикоагулянтной терапии, так и с иным нарушением работы свертывающей системы крови и обуславливать склонность пациента к кровотечениям.
О сниженной способности к образованию фибринового сгустка, и соответственно о риске кровотечения также говорят укороченные скорости роста сгустка.
Здесь же определяют интегральный показатель - «размер сгустка в заданный момент времени (h сг)», из которого рассчитывают основные характеристики сгустка, растущего от активатора: «скорость роста сгустка (V нач, V ст)» - начальную, стационарную и др. в зависимости от конкретных задач.
Начальная скорость роста сгустка - скорость роста сгустка вблизи активатора, рассчитывается как тангенс угла наклона участка прямой (фиг. 2). Время задержки (tiag) роста сгустка и начальная скорость, рассчитываемая на определенном промежутке времени, отражают внешний путь активации свертывания, и могу быть чувствительными к таким препаратам, как NOVOSEVEN®. В то время как стационарная скорость отражает внутренний путь активации свертывания, являясь чувствительной, например, к гемофилии. Стационарная скорость роста сгустка— это скорость роста сгустка вдали активатора, рассчитывается как тангенс угла наклона участка прямой (фиг. 2).
Любые другие необходимые скорости роста сгустка рассчитываются в выбранном диапазоне времени.
Для каждой кривой рассчитывался размер сгустка, как координата, при которой интенсивность светорассеяния равнялась 50% от максимальной интенсивности, что соответствует превращению половины всего фибриногена в фибрин.
Второй определяемый процесс в исследуемом образце заявляемого способа «спонтанное тромбообразование» характеризует состояние повышенной склонности к тромбообразованию (гиперкоагуляции). В норме сгусток растет только от активатора, однако при гиперкоагуляции^ наблюдается феномен активатор- независимого свертывания - появление и рост фибриновых сгустков вдали от активатора в объеме исследуемого образца. Этот феномен здесь и далее будет обозначаться как спонтанное тромбообразование, а такие сгустки - как спонтанные сгустки. Наличие спонтанных сгустков и их характеристики указывают на то, что в образце крови пациента содержится большое количество активных компонентов, запускающих свертывание. Риск тромбообразования у пациента в таких случаях особенно высок.
На Фиг. 4 представлены примеры спонтанного тромбообразования (образования сгустка вдали от активатора). Спонтанное образование сгустков показывает наличие в исследуемом образце активирующих свертывание компонентов (повышенное содержание активных факторов или, к примеру, фосфолипидных поверхностей), показатель не зависит от воздействия активатора, показывает сильную склонность к тромбообразованию. Этот процесс отражает характеристики сгустков, которые образуются независимо от активатора. Для оценки этого процесса существуют специфические характеристики: время формирования первого спонтанного сгустка (t спонт), время полумаксимального зарастания сгустками исследуемого образца (процент зарастания образца в какой-то момент времени), время полного зарастания исследуемого образца, интенсивность светорассеяния вдали от активатора в заданный момент времени, скорость спонтанного зарастания сгустками.
Спонтанные сгустки и их характеристики являются особыми показателями тромбогенности у пациентов. Именно они позволяют оценить наличие выраженной склонности к патологическому тромбообразованию и/или начальные стадии (гиперкоагуляционную фазу) ДВС-синдрома у пациента.
Третий определяемый процесс в исследуемом образце заявляемого способа «фибринолиз» - процесс лизиса тромба, оценивается по времени задержки фибринолиза, средней скорости лизиса сгустка полученной из фронта фибринолиза, функции светорассеяния и расстояния от времени x(t) и y(t), которые отражены на фиг. 5 - 6.
При фибринолизе можно наблюдать сниженные скорости роста сгустка, а так же с помощью дополнительных показателей оценивать выраженность фибринолиза у пациента и принимать решение о необходимости в коррекции терапии. На фиг.5 представлены фотографии примера лизиса тромба, когда спустя какое-то время тромб начинает лизировать сверху вниз от активатора (при определенной терапии пациента, заболевании или определенной постановке теста in vitro для проверки медикаментозных средств, получаемых, пациентом).
Зависимость, приведенная на фиг.6, светорассеяния от расстояния, на которое вырос сгусток, для случая лизиса сгустка, позволяет определить показатели для оценки фибринолиза, на основе которых строятся графики зависимости фронта фибринолиза от времени, фронта тромбообразования от времени, зависимость изменения светорассеяния и размера сгустка от времени. Для оценки лизиса существуют характеристики - время задержки фибринолиза, средняя скорость лизиса сгустка (t л).
Характеристикой роста сгустка так же является распространение волны активности тромбина в пространстве и времени с помощью разработанного метода видеомикроскопии с использованием флуорогенного субстрата. Свертывание так же запускается активатором и распространяется от него в пространстве кюветы. Однако в исследуемый образец добавлен тромбин-специфический белковый флуорогенный субстрат. В процессе свертывания в исследуемом образце образующийся тромбин способствует производству флуоресцентных молекул, по которым и можно судить о распространении волны активности тромбина. На фиг. 7 приведены зависимости распространения тромбиновой волны во времени и пространстве для разных концентраций активного XI фактора. По оси у указана концентрация тромбина нМ, по оси х - расстояние в мм, по оси z— время в мин. Фиг. 7а и 76 отражает ситуацию дефицита XI фактора свертывания крови ОЕД/мл и 0,2ЕД/мл. Фиг. 7в отображает нормальную волну тромбина для нормального содержания фактора XI 1ЕД/мл. Фиг. 7г отражает волну тромбина для высокого содержания XI фактора 5ЕД/мл. С помощью этих фигур рассчитывается скорость распространения тромбиновой волны и пик тромбина.
Все три указанные выше основных процесса в исследуемом образце заявляемого способа определяются постановкой одного теста, описанного выше.
Далее настоящее изобретение иллюстрируется с помощью приведенных примеров, но не ограничивается ими.
Для проведения контрольных тестов и определения диапазона референсных значений характеристик процессов было использовано 74 образца плазмы здоровых добровольцев. Возрастной диапазон добровольцев составил от 20 до 62 лет. На основании анализа процессов в исследуемом образце и сравнения их характеристик с референсными значениями, делается вывод о направленности и степени выраженности отклонений в системе свертывания пациента. На основании определения гиперкоагуляционного или гипокогуляционного состояния врачом принимаются дальнейшие диагностические и терапевтические решения по отношению к конкретному пациенту.
Пример 1. У пациента А с тяжелой формой гемофилии типа А взяли образец крови. Из забранной у пациента крови была приготовлена свободная от тромбоцитов плазма (pip).
120 мкл pfp плазмы смешали с реагентом для ингибирования контактной активации свертывания образца, после чего 15 минут инкубировали в термостате, и далее, добавив реагент для рекальцификации, сразу поместили .образец в кювету, привели содержимое кюветы в контакт с активатором и запустили исследование на диагностическом приборе, как было указано ранее.
В результате проведенного теста были получены следующие данные:
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста сгустка, мин 1.1 0.3-1.5
Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 25 36-56
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 12 20-30
Размер сгустка на 30 мин, мкм 530 740-1120
Плотность сгустка, усл.ед. 13776 14000-30000
Данный тест позволяет определять не только количественные характеристики, но и иллюстрационный материал в виде графиков и фотографий. Так на фиг. 1в приведены графики профилей роста сгустка. Сосредоточение кривых в промежутке от 0 до 1000 мкм, говорит о гипокоагуляционном состоянии гемостаза пациента, а так же о данном состоянии можно судить по фотографиям, на которых наглядно отражено, что рост сгустка практически отсутствует.
Существенно пониженные начальная и стационарная скорости роста сгустка, и пониженный размер сгустка на 30 минуте исследования, указывают на состояние гипокоагуляции у пациента, он склонен к кровотечениям и нуждается в определенной терапии.
Пример 2. Пациент В, ранний послеоперационный период после протезирования тазобедренного сустава.
Образец крови данного пациента готовили и тестировали указанным в Примере 1 способом.
В результате проведенного теста были получены следующие данные:
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста сгустка, мин 1.4 0.3-1.5
Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 62 36-56
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 46 20-30
Размер сгустка на 30 мин, мкм 1501 740-1120
Плотность сгустка, усл.ед. 14664 14000-30000
Время полумаксимального тромбирования 24 Не образца, мин обнаружено
Время полного тромбирования (зарастания) 42 Не образца, мин обнаружено
Время образования первого спонтанного сгустка, 9 Не мин обнаружено
Так на фиг. 16 приведены графики профилей роста сгустка. Кривые распределены практически по всей длине координаты расстояния, что говорит о гиперкоагуляционном состоянии гемостаза пациента, а так же о данном состоянии можно судить по фотографиям на фиг. 4, на которых наглядно отражено образование спонтанных сгустков и ускоренный рост сгустка, что подтверждает состояние гиперкоагуляции .
У пациента наблюдается повышение начальной скорости роста сгустка до 62 мкм/мин и стационарной скорости - до 46 мкм/мин. Время полного зарастания составило 42 минуту. Первый спонтанный сгусток образовался уже через 9 минут. Bee эт» характеристики1 подтверждают гиперкоагуляционное состояние у пациента, то есть у пациента очень высок риск тромбообразования, и, следовательно, он нуждается в проведении антикоагулянтной терапиии.
Пример 3. Донор С, условно здоровый человек. Образец крови данного пациента готовили и тестировали указанным в Примере 1 способом.
В результате проведенного теста были получены следующие данные:
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста сгустка, мин 0.7 0.3-1.5
Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 54 36-56
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 27 20-30
Размер сгустка на 30 мин, мкм 1072 740-1 120
Плотность сгустка, усл.ед. 16155 14000-30000
По полученным данным можно сделать вывод о том, что все показатели находятся в пределах диапазона нормальных значений, что подтверждает отсутствие данных за патологию.
Пример 4. Пациент D с гемофилией А, находящийся на заместительной терапии препаратом рекомбинатного Villa фактора свертывания крови, в стандартной дозировке. Образец крови данного пациента готовили и тестировали указанным в Примере 1 способом.
Данные теста до введения препарата:
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста сгустка, мин 0.5 0.3-1.5
Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 46 36-56
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 17 20-30
Размер сгустка на 30 мин, мкм 755 740-1120
Плотность сгустка, усл.ед. 19456 14000-30000 Данные теста через полчаса после введения препарата:-
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста сгустка, мин 0.6 0.3-1.5
Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 52 36-56
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 27 20-30
Размер сгустка на 30 мин, мкм 1029 740-1120
Плотность сгустка, усл.ёд. 19723 14000-30000
Результаты проведенного теста наглядно показали, что до начала заместительной терапии пациент находился в состоянии гипокоагуляции с пониженной стационарной скоростью роста сгустка 17мкм/мин. Данные характеристики подтверждают склонность пациента к кровотечениям. После введения препарата, полученные характеристики теста показывают, что состояние гемостаза данного пациента было приведено в норму, т.е. стационарная скорость роста сгустка стала составлять 27мкм/мин. Можно делать вывод о том, что проведенный тест наглядно отобразил действие введенного пациенту препарата и позволил подтвердить правильный выбор его дозирования.
Следовательно, данный тест позволяет быстро и наглядно проводить мониторинг заместительной терапии у пациентов с нарушениями свертывания крови.
Пример 5. Пациент Е с тромбозом портальной вены, находящийся на терапии антикоагулянтами. Образец крови данного пациента готовили и тестировали указанным в Примере 1 способом.
Данные теста до введения антикоагулянта:
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста сгустка, мин 0.7 0,3-1,5
Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 65 36-56
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 37 20-30
Размер сгустка на 30 мин, мкм 1374 740-1 120
Плотность сгустка, усл.ед. 17844 14000-30000 Данные теета через 3 часа после введения антикоагулянта:
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста cry стка^ мин 0.7 0,3-1,5
Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 56 36-56
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 15 20-30
Размер сгустка на 30 мин, мкм 840 740-1 120
Плотность сгустка, усл.ед. 17398 14000-30000
Результаты проведенного теста наглядно показали, что пациент находился в состоянии гиперкоагуляции с повышенными начальной и стационарной скоростями роста сгустка 65 мкм/мин и 37 мкм/мин соответственно, и увеличенным размером сгустка 1374 мкм. Данные характеристики подтверждают склонность пациента к патологическому тромбообразованию. После введения антикоагулянтного препарата, полученные характеристики теста показывают, что состояние гемостаза данного пациента было приведено в состояние легкой гипокоагуляции со стационарной скоростью роста сгустка 15 мкм/мин, что является необходимым для предотвращения прогрессирования тромбоза. Можно делать вывод о том, что проведенный тест наглядно отобразил действие введенного пациенту препарата и позволил определить правильный выбор его дозирования.
Следовательно, данный тест позволяет быстро и наглядно проводить мониторинг эффективности антикоагулянтной терапии у пациентов с нарушениями свертывания крови.
Пример 6. Пациент F с только что произошедшим тромбозом портальной вены получает терапию антикоагулянтами и, одновременно, фибринолитическую терапию. Образец крови данного пациента готовили и тестировали указанным в Примере 1 способом.
В результате проведенного теста были получены следующие данные:
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста сгустка, мин 0.8 0.3-1.5 Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 14 · 36-56
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 12 20-30
Размер сгустка на 30 мин, мкм 405 740-1 120
Плотность сгустка, усл.ед. 20874 14000-30000
Время задержки фибринолиза, мин 31
Скорость лизиса сгустка, мкм/мин 3,5
В результате тестирования образца крови данного пациента было зарегистрировано появление фронта фибринолиза (фронта растворения образовавшегося сгустка) и рассчитаны его характеристики, время задержки фибринолиза 31 мин и скорость лизиса сгустка - 3,5 мкм/мин. Характеристики позволяют судить о том, что у данного пациента препарат для расщепления тромба работает. Размер сгустка и скорости образования сгустка рассчитываются по зависимости фронта тромбообразования и светорассеяния данного образца от расстояния. Пониженные характеристики образования сгустка отражают действие антикоагулянтной терапии.
Пример 7. Пациент G,. ранний послеоперационный период, пневмония. Не получал антикоагуляционной терапии в связи с тромбоцитопенией. На 2ой день после операции у пациента развился тромбоз воротной вены.
Данные теста перед тромбозом:
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста сгустка, мин 1 0,3-1,5
Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 59 36-56
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 34 20-30
Размер сгустка на 30 мин, мкм 1227 740-1 120
Плотность сгустка, усл.ед. 14602 14000-30000
Образец крови данного пациента был протестирован в первый день после оперативного вмешательства и результаты теста показали увеличение начальной и стационарной скоростей роста сгустка (59 и 34 мкм/мин соответственно), что уже подтвердило склонность данного пациента к патологическому тромбообразованию. Однако пациенту не была назначена необходимая терапия, а случившийся на второй -день после операции тромбоз явился следствием данного патологического состояния.
Описанный здесь тест обладает способностью прогноза и может использоваться для назначения терапии по коррекции состояния гемостаза.
Приведенные примеры подтверждают тот факт, что при отклонении определяемых характеристик от установленных норм может быть вовремя выявлено наличие у пациента гиперкоагуляции или гипокоагуляции, то есть склонности к основным клиническим проявлениям патологии гемостаза, тромбообразованию или кровотечению соответственно. На основании полученных данных врачом может приниматься решение о назначении и коррекции терапии пациента.
Данный способ прогнозирования применим к пациентам с различными патологиями гемостаза.
Таким образом, совокупность характеристик, определяемых в результате проведения упомянутого теста, позволяет диагностировать склонность к тромбообразованию, кровотечению и другим патологиям системы гемостаза. А также позволяет следить за изменениями и состояниями коагуляции при проведении заместительной терапии факторов свертывания, антикоагулянтной, фибринолитической терапии и терапии другими препаратами, влияющими на свертывающую систему крови.
Пример 8. У пациента Н с гемофилией С взяли образец крови. Было приготовлено 4 образца богатой тромбоцитами плазмы prp in vitro. Образец без добавления активного XI фактора (фиг.7а) и 3 образца, в которые был добавлен активный XI фактор, необходимый для формирования и распространения тромбиновой волны, в концентрациях 0,2ЕД/мл (фиг.7б), 1ЕД/мл (фиг.7в) и 5ЕД/мл (фиг.7г) соответственно. Нормальной считается концентрация в 1ЕД/мл (фиг.7в)
Figure imgf000019_0001
Наблюдался феномен не распространения тромбиновой волны в случаях, когда концентрация активного XI фактора была меньше 1ЕД/мл (фиг.7а и фиг.7б). Это явилось подтверждением того, что недостаток XI фактора у пациентов с гемофилией С является их природой склонностью к кровотечениям.
Пример 9. У пациента I, условно здорового человека, взяли образец крови. Был приготовлен образец бедной тромбоцитами плазмы ррр, на котором проведено исследование.
В результате проведенного теста были получены следующие данные:
Характеристики роста сгустка показания норма
пациента
Задержка роста сгустка, мин 0.7 0,4-1,6
Начальная скорость роста сгустка, мкм/мин 52 39-63
Стационарная скорость роста сгустка, мкм/мин 26 22-37
Размер сгустка на 30 мин, мкм 1021 1073-1308
Плотность сгустка, усл.ед. 21560 14000-30000
Полученные показатели находятся в пределах диапазона нормальных значений, что подтверждает отсутствие данных за патологию.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ определения функционального состояния системы гемостаза, включающий следующие шаги:
a) подготовка образца крови или ее продуктов;
b) определение пространственной динамики in vitro; по меньшей мере, одного из процессов свертывания или лизиса сгустка в исследуемом образце, при установленных условиях;
c) сравнение результатов, полученных на этапе Ь) с нормой и определение направленности и степени выраженности отклонений у пациента.
2. Способ по п.1, где на этапе Ь) регистрируют следующие процессы в исследуемом образце: рост сгустка от активатора, рост спонтанных сгустков, фибринол из или их комбинацию.
3. Способ по п.1, где на этапе Ь) определяют характеристики указанных процессов в исследуемом образце: интенсивность светорассеяния в сгустке, время задержки формирования сгустка, скорость роста сгустка, площадь под кривой зависимости светорассеяния от расстояния, скорость распространения тромбиновой волны; пик тромбина, размер сгустка в заданный момент времени, время начала фибринолиза, изменение фронта фибринолиза во времени, изменение фронта тромбообразования во времени, изменение размера сгустка во времени.
4. Способ по любому из п. п.1-3, где на основании указанных характеристик определяют направленность и степень выраженности изменений состояния системы гемостаза у пациента или донора; проводят мониторинг терапии препаратами, воздействующими на систему гемостаза; осуществляют индивидуальный подбор терапии; исследуют механизм действия лекарственного препарата; скрининг пациента.
PCT/EA2014/000010 2013-04-11 2014-04-11 Способ определения функционального состояния системы гемостаза WO2014166508A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201300329A EA026282B1 (ru) 2013-04-11 2013-04-11 Способ определения функционального состояния системы гемостаза
EA201300329 2013-04-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014166508A1 true WO2014166508A1 (ru) 2014-10-16

Family

ID=51688972

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EA2014/000010 WO2014166508A1 (ru) 2013-04-11 2014-04-11 Способ определения функционального состояния системы гемостаза

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA026282B1 (ru)
WO (1) WO2014166508A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112162102A (zh) * 2020-07-22 2021-01-01 三诺生物传感股份有限公司 一种用于凝血四项测试的校正方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2703541C1 (ru) * 2019-03-15 2019-10-21 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) Способ определения фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы и оценка его функциональности
RU2712643C1 (ru) * 2019-10-23 2020-01-30 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) Способ определения фибриногена и оценка его функциональности

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2063037C1 (ru) * 1992-09-22 1996-06-27 Научно-производственное объединение "Меднорд" Способ оценки функционального состояния системы гемостаза
RU2151401C1 (ru) * 1998-07-16 2000-06-20 Сибирский государственный медицинский университет Способ диагностики повреждения системы гемостаза у больных с циркуляторным шоком
RU2186521C2 (ru) * 2000-10-11 2002-08-10 Российский центр функциональной хирургической гастроэнтерологии Способ диагностики функционального состояния системы гемостаза
RU2282855C2 (ru) * 2004-04-12 2006-08-27 Иван Илларионович Тютрин Способ оценки функционального состояния системы гемостаза

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19756773A1 (de) * 1997-12-19 1999-06-24 Dade Behring Marburg Gmbh Neues Verfahren und Diagnosemittel zur Hämostase-Diagnostik

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2063037C1 (ru) * 1992-09-22 1996-06-27 Научно-производственное объединение "Меднорд" Способ оценки функционального состояния системы гемостаза
RU2151401C1 (ru) * 1998-07-16 2000-06-20 Сибирский государственный медицинский университет Способ диагностики повреждения системы гемостаза у больных с циркуляторным шоком
RU2186521C2 (ru) * 2000-10-11 2002-08-10 Российский центр функциональной хирургической гастроэнтерологии Способ диагностики функционального состояния системы гемостаза
RU2282855C2 (ru) * 2004-04-12 2006-08-27 Иван Илларионович Тютрин Способ оценки функционального состояния системы гемостаза

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SOSHITOVA NATALYA PAVLOVNA.: "Vyyavlenie narusheny gemostaza pri sepsise s pomoschiu metoda prostranstvennogo rosta sgustka.", AVTOREFERAT DISSERTATSII, 2012, Retrieved from the Internet <URL:http://www.dissercat.com/content/vyyavlenie-narushenii-gemostaza-pri-sepsise-s-pomoshchyu-metoda-prostranstvennogo-rosta-sgus#ixzz3C8gkYc1B> *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112162102A (zh) * 2020-07-22 2021-01-01 三诺生物传感股份有限公司 一种用于凝血四项测试的校正方法
CN112162102B (zh) * 2020-07-22 2023-09-08 三诺生物传感股份有限公司 一种用于凝血四项测试的校正方法

Also Published As

Publication number Publication date
EA026282B1 (ru) 2017-03-31
EA201300329A1 (ru) 2014-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7496449B2 (ja) 凝固分析を使用した抗凝固剤の検出および分類
Toulon et al. Point-of-care versus central laboratory coagulation testing during haemorrhagic surgery
EP1885873B1 (en) Method and system for absolute platelet percent aggregation determination
JP5662802B2 (ja) フォン−ビルブランド病ならびにフォン−ビルブランド病および血小板機能の後天性または先天性障害に関連する出血リスクの増加を評価するためのインビトロ診断法
JP6526717B2 (ja) 線維素溶解及び線溶亢進を検出するための方法及び試薬
JP6877340B2 (ja) 血栓溶解剤の存在下における粘弾性解析を用いた新規病態の確認
AU766888B2 (en) Novel method of platelet function analysis using platelet count
Hvas et al. Platelet function tests: preanalytical variables, clinical utility, advantages, and disadvantages
JP4733326B2 (ja) 患者サンプル中の止血機能障害の存在を予測する方法
van Ryn et al. Measurement of dabigatran in standardly used clinical assays, whole blood viscoelastic coagulation, and thrombin generation assays
Deb et al. Varying effects of tyrosine kinase inhibitors on platelet function—A need for individualized CML treatment to minimize the risk for hemostatic and thrombotic complications?
US20190111431A1 (en) Methods And Devices For Detection Of Anticoagulants In Plasma And Whole Blood
WO2014166508A1 (ru) Способ определения функционального состояния системы гемостаза
Bialkower et al. Paper diagnostic for direct measurement of fibrinogen concentration in whole blood
Mason et al. The current role of platelet function testing in clinical practice
MacIvor et al. 27 How do we integrate thromboelastography with perioperative transfusion management? _3728 1386.. 1392
JP6883899B1 (ja) 血液凝固検査試薬、および血液凝固検査方法
RU2660706C1 (ru) Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК)
RU2601111C1 (ru) Способ оценки гемостатической активности тромбоцитов
WO2018066207A1 (ja) 血小板凝集能解析方法、血小板凝集能解析装置、血小板凝集能解析用プログラム及び血小板凝集能解析システム
US11630101B2 (en) Method for diagnosing anomalies in the coagulation of blood
Škiljić et al. Dijagnostičko-terapijski pristup kompleksnoj koagulopatiji uslijed recidivirajućeg krvarenja iz mokraćnog sustava
Giansante et al. Monitoring of hemostasis
JP6319308B2 (ja) 合成コラーゲンを用いる、アスピリン応答および反応性試験、ならびにアスピリンコンプライアンス試験
EA042763B1 (ru) Набор реагентов для оценки состояния систем свертывания и фибриндеструкции при диагностике нейрозаболевания

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14782701

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14782701

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1