TWI513466B - 抗凝血劑解毒劑 - Google Patents

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Description

抗凝血劑解毒劑
本發明係關於醫藥領域，特定言之係指抗凝血劑治療之領域。
抗凝血劑為預防血液凝固之物質；意即，抗凝血劑可以使血液停止凝固。抗凝血劑廣泛用於作為治療人類血栓性疾病之藥物，例如，預防易感者一級及次級深靜脈血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞及中風。
一類重要的口服抗凝血劑係藉由拮抗維生素K效應而作用的，例如，包括華法林(warfarin)在內之香豆素。第二類化合物是經由輔因子(諸如，抗凝血酶III或肝素輔因子II)間接抑制凝血，此包括數種低分子量之肝素產物，該等肝素產物係經由抗凝血酶III主要催化抑制Xa因子(及針對凝血酶之程度較小)(貝米肝素(bemiparin)、舍托肝素(certoparin)、達肝素(dalteparin)、依諾肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕肝素(parnaparin)、瑞肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin)、小鏈寡糖(方達帕魯(fondaparinux)、艾屈帕魯(idraparinux))經由抗凝血酶III僅抑制Xa因子。類肝素(達那肝素(danaparoid)、舒洛地特(sulodexide)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate))經由兩種輔因子起作用，且抑制Xa因子及凝血酶兩者。第三類則為凝血之直接抑制劑。直接Xa因子抑制劑包括阿哌沙班(apixaban)、伊多沙班(edoxaban)、奧米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)，及直接凝血酶抑制劑包括二價水蛭素(比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(lepirudin)、地西盧定(desirudin))、及單價化合物阿加曲班(argatroban)及達比加群(dabigatran)。
由於血液凝固係停止出血之生物機制，因此抗凝血劑治療之副作用是可能發生有害的出血情況。因此需要提供一種能夠阻止當此等抗凝血劑相關出血情況發生時之解毒劑(Zikria及Ansell，Current Opinion in Hematology 2009,16(5): 347-356)。一種實現此目標之方法係在投與抗凝血劑後，中和病患體中所存在之抗凝血劑化合物活性。
目前可使用之抗凝血劑解毒劑為魚精蛋白(用於中和肝素)及維生素K(用於中和類似華法林之維生素K拮抗劑)。對於罹患嚴重創傷及嚴重出血且接受低分子量肝素治療之病患而言，新鮮冰凍血漿及重組因子VIIa亦可作為非特異性解毒劑使用(Lauritzen B.等人，Blood，2005，607A-608A.)。亦有報導指出魚精蛋白片段(美國專利第6,624,141號)及小合成肽(美國專利第6,200,955號)可作為肝素或低分子量肝素解毒劑之用；及凝血酶蛋白變體(美國專利第6,060,300號)可作為凝血酶抑制劑之解毒劑之用。已有報導指出凝血酶原中間體及衍生物可作為水蛭素及合成凝血酶抑制劑解毒劑之用(美國專利第,817,309號及第6,086,871號)。對於直接Xa因子抑制劑而言，已有報導指出失活Xa因子類似物可作為解毒劑之用(WO 2009042962)。此外，重組VIIa因子業已用以逆轉間接抗凝血酶III依賴性Xa因子抑制劑(諸如，方達帕魯及艾屈帕魯)之效應(Bijsterveld NR等人，Circulation,2002,106:2550-2554；Bijsterveld NR等人，British J. of Haematology,2004(124): 653-658)。有關抗凝血劑逆轉之方法之綜述提供於Schulman及Bijsterveld，Transfusion Medicine Reviews 2007: 21(1),37-48中。
需要提供針對抗凝血劑療法提供經改良之解毒劑，且特定言之，係針對類似達比加群之直接凝血酶抑制劑提供解毒劑，此特異性解毒劑至今尚無人揭示。
在一個態樣中，本發明係關於一種能夠中和抗凝血劑之活性之抗體分子。
在另一態樣中，該抗體分子針對抗凝血劑具有結合特異性。
在另一態樣中，該抗凝血劑係一種直接凝血酶抑制劑、Xa因子抑制劑、或維生素K拮抗劑。
在另一態樣中，該抗凝血劑係達比加群(dabigatran)、阿加曲班(argatroban)、美拉加群(melagatran)、希美加群(ximelagatran)、水蛭素(hirudin)、比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(lepirudin)、地西盧定(desirudin)、阿哌沙班(apixaban)、奧米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)、去纖維蛋白多核苷酸(defibrotide)、雷馬曲班(ramatroban)、抗凝血酶III、或地克精-α(drotrecogin alpha)。
在另一實施例中，該抗凝血劑係通式(I)之經二取代之二環系雜環，及其互變異構體、立體異構體及鹽：
Ra -A-Het-B-Ar-E　,(I)
其中A表示連接至該Het基之苯并基、吡啶并基或噻吩并基部份基團之羰基或磺醯基，B表示伸乙基，其中連接至該Ar基之亞甲基可經氧或硫原子或經-NR1 -基置換，其中R1 表示氫原子或C1-4 -烷基，E表示Rb NH-C(=NH)-基，其中Rb 表示氫原子、羥基、C1-9 -烷氧基羰基、環己氧基羰基、苯基-C1-3 -烷氧基羰基、苯甲醯基、對-C1-3 -烷基-苯甲醯基或吡啶醯基，同時上述C1-9 -烷氧基羰基之2-位置中之乙氧基可再經C1-3 -烷基磺醯基或2-(C1-3 -烷氧基)-乙基取代，Ar表示視情況經氯原子或經甲基、乙基或甲氧基取代之1,4-伸苯基，或其表示2,5-伸噻吩基，Het表示1-(C1-3 -烷基)-2,5-伸苯并咪唑基、1-環丙基-2,5-伸苯并咪唑基、2,5-伸苯并噻唑基、1-(C1-3 -烷基)-2,5-伸吲哚基、1-(C1-3 -烷基)-2,5-伸咪唑并[4,5-b]吡啶基、3-(C1-3 -烷基)-2,7-伸咪唑并[1,2-a]吡啶基或1-(C1-3 -烷基)-2,5-伸噻吩并[2,3-d]咪唑基，及Ra 表示R2 NR3 -基，其中R2 係C1-4 -烷基，其可經羧基、C1-6 -烷氧基羰基、苄氧基羰基、C1-3` -烷基磺醯胺基羰基或1H-四唑-5-基取代，C2-4 -烷基，其可經羥基、苄氧基、羧基-C1-3 -烷基胺基、C1-3 -烷氧基羰基-C1-3 -烷基胺基、N-(C1-3 -烷基)-羧基-C1-3 -烷基胺基或N-(C1-3 -烷基)-C1-3 -烷氧基羰基-C1-3 -烷基胺基取代，同時在上述基團中，與氮原子相鄰之α-位置中之碳原子可未經取代，R3 表示C3-7 -環烷基、炔丙基(其中該不飽和部份可不直接連接至該R2 NR3 基之氮原子)、視情況經氟或氯原子、或經甲基或甲氧基取代之苯基、視情況經甲基取代之吡唑基、嗒唑基或吡啶基，或R2 及R3 與在其之間的氮原子一起表示5-或7-員伸環烷基亞胺基，其視情況經羧基或C1-4 -烷氧基羰基取代，其可再與苯基環稠合。
在另一實施例中，該抗凝血劑係選自以下之化合物：
(a)　2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并噻唑-5-羧酸-N-苯基-N-(2-羧乙基)-醯胺、
(b)　2-[N-(4-甲脒苯基)-N-甲基-胺基甲基]-苯并噻唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(c)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(d)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(3-羥基羰基丙基)-醯胺、
(e)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(羥基羰基甲基)-醯胺、
(f)　1-甲基-2-[2-(2-甲脒基噻吩-5-基)乙基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(g)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(h)　1-甲基-2-[2-(4-甲脒苯基)乙基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(i)　1-甲基-2-[2-(4-甲脒苯基)乙基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(j)　1-甲基-2-[2-(4-甲脒苯基)乙基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-[2-(1H-四唑-5-基)乙基]-醯胺、
(k)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-[2-(1H-四唑-5-基)乙基]-醯胺、
(l)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-N-甲基-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(m)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-N-甲基-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(3-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(n)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-N-甲基-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(o)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-[(N-羥基羰基乙基-N-甲基)-2-胺基乙基]-醯胺、
(p)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(3-氟苯基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(q)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(4-氟苯基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(r)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒基-2-甲氧基-苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(s)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒基-2-甲氧基-苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(t)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)胺基甲基]-吲哚-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-甲氧基羰基乙基)-醯胺、
(u)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)胺基甲基]-噻吩并[2.3-d]咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(v)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(w)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(x)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒基-2-甲氧基-苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(y)　1-甲基-2-[N-[4-(N-正己氧基羰基甲脒基)苯基]-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-乙氧基羰基乙基)-醯胺、及
其互變異構體、立體異構體及鹽。
在另一態樣中，該抗體分子係多株抗體、單株抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體之片段(特定言之Fab、Fab'、或F(ab')2 片段)、單鏈抗體(特定言之單鏈可變片段(scFv))、域抗體、奈米抗體、雙功能抗體、或DARPin。
在另一態樣中，本發明係關於一種如上所述之抗體分子，其係用於醫藥中。
在另一態樣中，本發明係關於一種如上所述之抗體分子，其係用於治療抗凝血劑療法所產生之副作用。
在另一態樣中，該副作用係出血。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療抗凝血劑療法所產生之副作用的方法，該方法包括將有效量之如上所述抗體分子投與有此需要之病患。
在一個態樣中，本發明係關於一種能夠中和抗凝血劑之活性之抗體分子。
抗體(亦稱為免疫球蛋白，縮寫為Ig)係發現於脊椎動物血液或其他體液之γ球蛋白蛋白質，且可藉由免疫系統用以識別及中和外來物體，諸如細菌及病毒。該等抗體通常係由各具有兩個大重鏈及兩個小輕鏈之基本結構單元所組成，以形成(例如)具有1個單元之單體、具有2個單元之二聚體或具有5個單元之五聚體。抗體可藉由非共價鍵相互作用而結合至所謂的抗原之其他分子或結構。此結合係具有特異性的，也就是抗體會以高親和力方式僅結合至特定結構。被抗體所識別之抗原的獨特部分稱為抗原決定基或抗原決定簇。結合至該抗原決定基之抗體部分有時稱為互補位，且位於該抗體之所謂的可變域或可變區(Fv)中。該可變域包括三個被框架區(FR)隔開之所謂的互補決定區(CDR)。
在本發明上下文中，所稱提及CDR係根據Chothia的定義(Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 1987,196: 901-917)、及Kabat(E.A. Kabat、T.T. Wu、H. Bilofsky、M. Reid-Miller 及H. Perry，Sequence of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health，Bethesda(1983))。
相關技藝業已進一步開發出抗體，且使該等抗體成為醫學及技術中具有多功能的工具。因此，在本發明上下文中，術語「抗體分子」或「抗體」(本文係以同義詞使用)並不但包括自然界中所發現的抗體，此抗體包括(例如)兩條輕鏈及兩條重鏈，或僅兩條重鏈(如在駱駝物種中)，也包括所有包含至少一個具有抗原結合特異性之互補位及具有與免疫球蛋白可變域類似結構之分子。
因此，本發明抗體分子可為多株抗體、單株抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體之片段(特定言之Fv、Fab、Fab'、或F(ab')2 片段)、單鏈抗體(特定言之單鏈可變片段(scFv))、小模組化免疫藥劑(SMIP)、域抗體、奈米抗體、雙功能抗體。
多株抗體意謂具有不同胺基酸序列之抗體分子的集合，且可藉由技術所熟知之方法，從經接受抗原免疫後之脊椎動物的血液中獲得。
單株抗體(mAb或moAb)係胺基酸序列相同之單一特異性抗體，單株抗體係藉由融合瘤技術，從(被稱為融合瘤)雜交細胞株製備產生的，該稱為融合瘤之雜交細胞係指可產生特異性抗體之B細胞與骨髓瘤(B細胞癌)細胞融合之純系(Kohler G、Milstein C，Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7.)。或者，可藉由在宿主細胞中之重組表現法，製備單株抗體(Norderhaug L、Olafsen T、Michaelsen TE、Sandlie I.(1997年5月)，「Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells」，J Immunol Methods 204(1):77-87；參見下文)。
對應用於人類而言，降低原來衍生自其他物種(如小鼠)之抗體的免疫原性往往才會令人滿意。此可藉由構建嵌合抗體，或藉由稱為「人源化」之方法來實現。在本文中，「嵌合抗體」應理解成包含衍生自一種物種(例如，小鼠)之序列部分(例如，可變域)融合至衍生自不同物種(例如，人類)之序列部分(例如，不變域)之抗體。「人源化抗體」係一種包括原來衍生自非人類物種之可變域的抗體，其中某些胺基酸經發生突變，使該可變域整體序列更類似接近於人類可變域之序列。抗體之嵌合化及人源化之方法也是相關技術所熟知的(Billetta R、Lobuglio AF，「Chimeric antibodies」. Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76；Riechmann L、Clark M、Waldmann H、Winter G(1988)，「Reshaping human antibodies for therapy」，Nature:332:323)。此外，業已開發以衍生自人類基因序列為基礎以產生抗體之技術，例如藉由噬菌體呈現技術或使用轉殖基因動物(WO 90/05144；D. Marks、H.R. Hoogenboom、T.P. Bonnert、J. McCafferty、A.D. Griffiths及G. Winter(1991)，「By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.」J. Mol. Biol.,222,581-597；Knappik等人，J. Mol. Biol. 296: 57-86,2000；S. Carmen及L. Jermutus，「Concepts in antibody phage display」，Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203；Lonberg N、Huszar D，「Human antibodies from transgenic mice」，Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93；Brggemann M、Taussig MJ，「Production of human antibody repertoires in transgenic mice」，Curr Opin Biotechnol. 1997年8月，8(4):455-8)。此等抗體係本發明上下文中之「人類抗體」。
本發明抗體分子亦包括保有抗原結合特性之免疫球蛋白片段，如Fab、Fab'、或F(ab')2 片段。藉由免疫球蛋白之斷裂(例如藉由蛋白質消化)或藉由重組表現此等片段可獲得此等片段。例如，藉由常規技術，例如，使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶(WO 94/29348)、或內切蛋白酶Lys-C(Kleemann等人，Anal. Chem. 80,2001-2009,2008)可完成免疫球蛋白消化作用。以木瓜蛋白酶或Lys-C消化抗體通常會產生兩個相同稱為Fab片段之抗原結合片段(每一片段具有單一的抗原結合位點)及殘留之Fc片段。經胃蛋白酶處理則會產生F(ab')2 。藉由宿主細胞中重組表現製備Fab分子之方法詳細說明於下文中。
已開發出多種技術，以將免疫球蛋白可變域、或衍生自此等可變域之分子置於不同的分子背景內。根據本發明，此等亦應視為「抗體分子」。一般而言，此等抗體分子在尺寸上小於免疫球蛋白，且包括單一胺基酸鏈或由數條胺基酸鏈組成。例如，單鏈可變片段(scFv)係免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變區的融合體，利用短鏈結(通常係絲胺酸(S)及甘胺酸(G))連在一起(WO 88/01649；WO 91/17271；Huston等人，International Reviews of Immunology，第10卷，1993,195-217)。「單域抗體」或「奈米抗體」在單一之類Ig域中具有抗原結合位點(WO 94/04678；WO 03/050531；Ward等人，Nature. 1989年10月12日;341(6242):544-6；Revets等人，Expert Opin Biol Ther.5(1):111-24,2005)。一或多個具有針對相同或不同抗原之結合特異性之單域抗體可連在一起。雙功能抗體係由兩條胺基酸鏈(其包括兩個可變域)組成之二價抗體分子(WO 94/13804；Holliger等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 1993年7月15日;90(14):6444-8)。類抗體分子之其他實例係免疫球蛋白超級家族抗體(IgSF；Srinivasan及Roeske，Current Protein Pept. Sci. 2005,6(2): 185-96)。有一種不同概念導致所謂之小模組化免疫藥劑(SMIP)，其包括連接至單鏈鉸鏈之Fv域及缺乏不變域CH1之效應物域(WO 02/056910)。
在另一態樣中，本發明抗體分子甚至可能與免疫球蛋白可變域僅具有遠距結構相關性，或根本沒有此等相關性，只要其具有相當於免疫球蛋白可變域之一定的結合特異性及親和力即可。此等非免疫球蛋白「抗體模擬物」(有時稱為「蛋白質主幹」)可能基於蛋白質A、載脂蛋白、纖維網蛋白域、錨蛋白共同序列重複域、及硫氧還蛋白之基因(Skerra，Current Opinion in Biotechnology 2007,18(4): 295-304)。本發明上下文中之較佳實施例係抗體分子設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin's；Steiner等人，J Mol Biol. 2008年8月24日；382(5): 1211-27；Stumpp MT、Amstutz P，Curr Opin Drug Discov Devel. 2007年3月；10(2): 153-9)。
可將抗體分子融合(成為融合蛋白)或另外連接(藉由共價鍵或非共價鍵)至對該抗體分子之特性具有所需影響之其他分子實體。例如，可能需要改善抗體分子之藥物動力學性質、(例如)體液(如血液)中之安定性，特定言之在單鏈抗體或域抗體之情況下。已在此方面開發諸多技術，特定言之延長此等抗體分子在循環中之半衰期(如聚乙二醇化)(WO 98/25971；WO 98/48837；WO 2004081026)、將抗體分子與對血清蛋白質(如白蛋白)具有親和力之另一抗體分子融合或共價附接(WO 2004041865；WO 2004003019)、或使抗體分子表現為具有全部或部份血清蛋白(如，白蛋白或轉鐵蛋白)之融合蛋白質(WO 01/79258)。
在另一態樣中，抗體分子具有針對抗凝血劑之結合特異性。「結合特異性」意指抗體分子對該抗凝血劑的結合親和力顯著高於對結構上無關之分子的結合親和力。
親和力係抗體分子上之單一抗原結合位點與單一抗原決定基之間的相互作用。其以締合常數KA =kass /kdiss 、或離解常數KD =kdiss /kass 表示。
在本發明之一態樣中，如藉由表面電漿共振分析法(Malmqvist M.,「Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.」，Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.)所測定，該抗體與抗凝血劑之結合親和性之KD 值範圍為1 pM至100 μM，較佳係1 pM至1 μM。亦可使用動態排除檢定(KinExA)技術，測量抗體親和性(Darling,R.J.及Brault P-A.，「Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions.」，ASSAY and Drug Development Technologies. 2004年12月，2(6): 647-657)。
可藉由稱為親和性成熟之方法，來增強抗體分子之結合親和性(Marks等人，1992,Biotechnology 10:779-783；Barbas,等人，1994,Proc. Nat. Acad. Sci,USA 91:3809-3813；Shier等人，1995,Gene 169:147-155)。因此，本發明亦包括親和性成熟之抗體。
在本發明另一態樣中，該抗體分子能夠中和抗凝血劑之活性。意即，在與該抗體分子結合之後，該抗凝血劑即無法發揮其抗凝血活性，或此活性程度已顯著下降。當針對所討論之抗凝血劑採用適當活性試驗，特定言之係採用對凝血酶敏感之凝血試驗，如蛇靜脈酶(ecarin)凝血時間或凝血酶凝血時間測定時(H. Bounameaux、Marbet GA、Lammle B，等人，「Monitoring of heparin treatment. Comparison of thrombin time,activted partial thromboplastin time,and plasma heparin concentration,and analysis of the behaviour of antithrombin III」，American Journal of Clinical Pathology 1980 74(1): 68-72)，抗體結合後之抗凝血劑活性會下降至少2倍、5倍、10倍、或100倍較佳。
為製造本發明抗體分子，熟習此項技術者可自多種相關技術已熟知之方法中選擇(Norderhaug等人，J Immunol Methods 1997,204(1): 77-87；Kipriyanow及Le Gall，Molecular Biotechnology 26: 39-60,2004；Shukla等人，2007,J. Chromatography B,848(1): 28-39)。
抗凝血劑係相關技藝已熟知，如上文所述。在本發明另一態樣中，該抗凝血劑係直接凝血酶抑制劑、Xa因子抑制劑、或維生素K拮抗劑。維生素K拮抗劑之實例係包括華法林在內之香豆素。Xa因子之間接主要抑制劑實例係經由抗凝血酶III之活化產生作用之肝素類物質，其包括數種低分子量之肝素產物(貝米肝素(bemiparin)、舍托肝素(certoparin)、達肝素(dalteparin)、依諾肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕肝素(parnaparin)、瑞肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin))、某些寡醣(方達帕魯(fondaparinux)、艾屈帕魯(idraparinux))、類肝素(達那肝素(danaparoid)、舒洛地特(sulodexide)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate))，及Xa因子之直接抑制劑(阿哌沙班(apixaban)、奧米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban))。凝血酶抑制劑之實例包括二價水蛭素(比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(lepirudin)、地西盧定(desirudin))、及單價化合物阿加曲班(argatroban)及達比加群(dabigatran)。
因此，在另一態樣中，該抗凝血劑係達比加群、阿加曲班、美拉加群(melagatran)、希美加群(ximelagatran)、水蛭素、比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(lepirudin)、地西盧定(desirudin)、阿哌沙班、奧米沙班、利伐沙班、去纖維蛋白多核苷酸、雷馬曲班(ramatroban)、抗凝血酶III、或地克精-α。
在另一實施例中，該抗凝血劑係通式(I)之經二取代之二環系雜環，及其互變異構體、立體異構體及鹽：
Ra -A-Het-B-Ar-E　,(I)
其中A表示連接至該Het基之苯并基、吡啶并基或噻吩并基之羰基或磺醯基，B表示伸乙基，其中連接至該Ar基之亞甲基可經氧或硫原子或經-NR1 -基置換，其中R1 表示氫原子或C1-4 -烷基，E表示Rb NH-C(=NH)-基，其中Rb 表示氫原子、羥基、C1-9 -烷氧基羰基、環己氧基羰基、苯基-C1-3 -烷氧基羰基、苯甲醯基、對-C1-3 -烷基-苯甲醯基或吡啶醯基，同時上述C1-9 -烷氧基羰基之2-位置中之乙氧基可再經C1-3 -烷基磺醯基或2-(C1-3 -烷氧基)-乙基取代，Ar表示視情況經氯原子或經甲基、乙基或甲氧基取代之1,4-伸苯基，或其表示2,5-伸噻吩基，Het表示1-(C1-3 -烷基)-2,5-伸苯并咪唑基、1-環丙基-2,5-伸苯并咪唑基、2,5-伸苯并噻唑基、1-(C1-3 -烷基)-2,5-伸吲哚基、1-(C1-3 -烷基)-2,5-伸咪唑并[4,5-b]吡啶基、3-(C1-3 -烷基)-2,7-伸咪唑并[1,2-a]吡啶基或1-(C1-3 -烷基)-2,5-伸噻吩并[2,3-d]咪唑基，及Ra 表示R2 NR3 -基，其中R2 係C1-4 -烷基，其可經羧基、C1-6 -烷氧基羰基、苄氧基羰基、C1-3 -烷基磺醯胺基羰基或1H-四唑-5-基取代，C2-4 -烷基，其可經羥基、苄氧基、羧基-C1-3 -烷基胺基、C1-3 -烷氧基羰基-C1-3 -烷基胺基、N-(C1-3 -烷基)-羧基-C1-3 -烷基胺基或N-(C1-3 -烷基)-C1-3 -烷氧基羰基-C1-3 -烷基胺基取代，同時在上述基團中，與氮原子相鄰之α-位置中之碳原子可未經取代，R3 表示C3-7 -環烷基、炔丙基(其中該不飽和部份可不直接連接至該R2 NR3 基之氮原子)、視情況經氟或氯原子、或經甲基或甲氧基取代之苯基、視情況經甲基取代之吡唑基、嗒唑基或吡啶基，或R2 及R3 與在其之間的氮原子一起表示5-或7-員伸環烷基亞胺基，其視情況經羧基或C1-4 -烷氧基羰基取代，可再與苯基環稠合，式(I)化合物、該等化合物之製法及其作為抗凝血劑之用途已描述於WO 98/37075中。
在另一實施例中，該抗凝血劑係選自以下之化合物：
(a)　2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并噻唑-5-羧酸-N-苯基-N-(2-羧乙基)-醯胺、
(b)　2-[N-(4-甲脒苯基)-N-甲基-胺基甲基]-苯并噻唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(c)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(d)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(3-羥基羰基丙基)-醯胺、
(e)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(羥基羰基甲基)-醯胺、
(f)　1-甲基-2-[2-(2-甲脒基噻吩-5-基)乙基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(g)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(h)　1-甲基-2-[2-(4-甲脒苯基)乙基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(i)　1-甲基-2-[2-(4-甲脒苯基)乙基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(j)　1-甲基-2-[2-(4-甲脒苯基)乙基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-[2-(1H-四唑-5-基)乙基]-醯胺、
(k)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-[2-(1H-四唑-5-基)乙基]-醯胺、
(l)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-N-甲基-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(m)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-N-甲基-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(3-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(n)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-N-甲基-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(o)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-[(N-羥基羰基乙基-N-甲基)-2-胺基乙基]-醯胺、
(p)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(3-氟苯基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(q)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(4-氟苯基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(r)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒基-2-甲氧基-苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(s)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒基-2-甲氧基-苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(t)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)胺基甲基]-吲哚-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-甲氧基羰基乙基)-醯胺、
(u)　1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)胺基甲基]-噻吩并[2.3-d]咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(v)1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(w)1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(x)1-甲基-2-[N-(4-甲脒基-2-甲氧基-苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺、
(y)1-甲基-2-[N-[4-(N-正己氧基羰基甲脒基)苯基]-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-乙氧基羰基乙基)-醯胺、及
其互變異構體、立體異構體及鹽，其等全部描述於WO 98/37075中。
本發明上下文中較佳的抗凝血劑係達比加群(CAS 211914-51-1，3-[(2-{[4-(己氧基羰基胺基-亞胺基-甲基)-苯基胺基]-甲基}-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基)-吡啶-2-基-胺基]-丙酸乙酯)，其具有化學式(II)：
達比加群係自WO 98/37075已知，其揭示具有凝血酶抑制作用及延長該凝血酶時間之作用之化合物，名稱為1-甲基-2-[N -[4-(N -正己氧基羰基甲脒基)苯基]-胺基-甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N -(2-吡啶基)-N -(2-乙氧基羰基乙基)-醯胺。亦可參見Hauel等人，J Med Chem 2002,45(9): 1757-66。
達比加群係呈式(III)前藥提供：
該式(III)化合物(稱為達比加群酯(dabigatran etexilate)，CAS 211915-06-9)進入人體後即轉化為活性化合物(II)。
達比加群主要適應症係手術後預防深靜脈血栓形成、治療經確診之深靜脈血栓形成及預防罹患心房纖維性顫動病患中風(Eriksson等人，Lancet 2007,370(9591): 949-56；SchulmanS等人，N Engl J Med 2009,361(24): 2342-52；Connolly S等人，N Engl J Med 2009,361(12): 1139-51)。
在人體內，羧酸根部分基團之葡糖醛酸化係達比加群之主要人體代謝途徑(Ebner等人，Drug Metab. Dispos. 2010,38(9): 1567-75)。其結果形成了1-O-醯基葡糖苷酸(β雙旋異構體)。該1-O-醯基葡糖苷酸除了少數水解為糖苷配基外，亦可在水溶液中發生非酶性醯基轉移，導致形成2-O-、3-O-、及4-O-醯基葡糖苷酸。使用純化之1-O-醯基葡糖苷酸及其異構性重排產物之實驗顯示，其使活化部份凝血酶原時間延長之效力與達比加群相等。
在本發明另一態樣中，該抗體分子會結合達比加群及達比加群酯。
在本發明另一態樣中，該抗體分子會結合達比加群及達比加群之O-醯基葡糖苷酸，特定言之為達比加群之1-O-醯基葡糖苷酸。
在本發明另一態樣中，該抗體分子進一步會結合達比加群之2-O-、3-O-、及4-O-醯基葡糖苷酸。
在本發明另一態樣中，該抗體分子能夠中和達比加群及達比加群之O-醯基葡糖苷酸的活性，特定言之為達比加群之1-O-醯基葡糖苷酸之活性。
在本發明另一態樣中，該抗體分子對達比加群具有結合特異性，且包括如圖5及6中所述之CDR序列。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述之重鏈CDR序列，及如圖6中所述之輕鏈CDR序列。
在本發明之另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述之重鏈可變域序列，及如圖6中所述之輕鏈可變域序列。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名稱為DBG 13 VH之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱為DBG 13 VK之輕鏈可變域序列。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名稱為DBG 14 VH之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱為DBG 14 VK之輕鏈可變域序列。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名稱為DBG 22 VH之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱為DBG 22 VK之輕鏈可變域序列。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名稱為Eng VH# 14之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱為Eng VK# 11之輕鏈可變域序列。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名稱為Eng VH# 15之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱為Eng VK# 17之輕鏈可變域序列。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名稱為Eng VH# 15之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱為Eng VK# 18之輕鏈可變域序列。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名稱為Eng VH# 31之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱為Eng VK# 18之輕鏈可變域序列。
在本發明另一態樣中，該抗體分子對達比加群具有結合特異性，且包括具有選自由SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2組成之群之CDR1及選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、及SEQ ID NO: 8組成之群之CDR2、及選自由SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10組成之群之CDR3之重鏈可變域，及具有選自由SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、及SEQ ID NO: 13組成之群之CDR1、SEQ ID NO: 14之CDR2、及SEQ ID NO: 15之CDR3之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括具有SEQ ID NO: 1之CDR1、選自由SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、及SEQ ID NO: 8組成之群之CDR2、SEQ ID NO: 10之CDR3之重鏈可變域，及具有SEQ ID NO: 13之CDR1、SEQ ID NO: 14之CDR2、SEQ ID NO: 15之CDR3之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括選自由SEQ ID NO: 16、18、20、22、24、及26組成之群之重鏈可變域，及選自由SEQ ID No: 17、19、21、23、25、及27組成之群之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 16之重鏈可變域，及SEQ ID No: 17之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 18之重鏈可變域，及SEQ ID No: 19之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 20之重鏈可變域，及SEQ ID No: 21之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 22之重鏈可變域，及SEQ ID No: 23之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 24之重鏈可變域，及SEQ ID No: 25之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 24之重鏈可變域，及SEQ ID No: 27之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 26之重鏈可變域，及SEQ ID No: 27之輕鏈可變域。
在本發明另一態樣中，該抗體分子係scFv分子。在此情況下，本文所揭示之可變域可利用適宜的鏈結肽(例如，選自由SEQ ID No: 28、29、30、或31組成之群)彼此融合。該構築體可依N末端至C末端順序包括此等元素：(重鏈可變域)-(連接肽)-(輕鏈可變域)、或(輕鏈可變域)-(連接肽)-(重鏈可變域)。
在本發明另一態樣中，該抗體分子係scFv分子，其包括SEQ ID NO: 32，或SEQ ID NO: 33。
提供可編碼sFv構築體之核酸在宿主細胞(如，大腸桿菌(E. coli)、畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、或哺乳動物細胞系，例如CHO或NS0)中重組表現以產生功能性scFv分子之方法是相關技術已熟知的(參見(例如)：Rippmann等人，Applied and Environmental Microbiology 1998,64(12): 4862-4869；Yamawaki等人，J. Biosci. Bioeng. 2007,104(5): 403-407；Sonoda等人，Protein Expr. Purif. 2010,70(2): 248-253)。
特定言之，可如下製備本發明scFv抗體分子。可在可誘導之啟動子之控制下，於不同大腸桿菌菌株(如W3110、TG1、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、MM294)中表現該構築體。該啟動子可選自lacUV5、tac、T7、trp、trc、T5、araB。培養基較佳係完全根據Wilms等人，2001(Wilms等人，Biotechnology and Bioengineering 2001，73(2): 95-103)、DeLisa等人，1999(DeLisa等人，Biotechnology and Bioengineering 1999,65(1): 54-64)所限定或為其等效物。然而，可能宜在批次培養基及/或補料培養基中補充諸如異亮胺酸、亮胺酸、賴胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸之胺基酸或諸如大豆蛋白腖或酵母提取物之複合培養基組分。以補料-分批模式進行發酵製程。條件：溫度20至40℃、pH 5.5至7.5、DO保持在20%以上。消耗初始碳源之後，用如上所述之補料培養基(或等效物)補充該培養物。當發酵槽中之細胞乾物重達到40至100 g/L時，用對應於所使用之啟動子系統(例如，IPTG、乳糖、阿拉伯糖)之適當誘導物誘導該培養物。可由各誘導物長時間饋入發酵槽中，依脈衝式全誘導或部份誘導之形式或其組合方式，來進行該誘導。生產階段應持續至少4小時。藉由在碗式離心機、管碗式離心機或多盤式離心機中離心，回收該等細胞，捨棄培養物上清液。
將大腸桿菌細胞塊懸浮於4-至8-倍量之溶胞緩衝液(磷酸鹽或Tris緩衝液，pH 7至8.5)中。較佳藉由高壓均質化溶解細胞，接著於碗式、管碗式或多盤式離心機中離心回收細胞集結塊。用20 mM Tris、150 mM NaCl、5 mM EDTA、2 M尿素、0.5% Triton X-100，pH 8.0清洗含有scFv包涵體之細胞塊2至3次，接著使用20 mM Tris、150 mM NaCl、5 mM EDTA，pH 8.0清洗兩個步驟。最終，藉由碗式、管碗式或多碟式離心機離心，回收scFv包涵體。可於含有離液劑(如6 M胍-HCl或8至10 mM尿素)之100 mM甘胺酸/NaOH、5 mM EDTA、20 mM二硫蘇糖醇、pH 9.5至10.5溶液中溶解scFv包涵體。在培養30至60分鐘之後，將溶液離心，並回收含有目標蛋白質之上清液，用於隨後之復性。較佳以分批補料模式，藉由將該蛋白質溶液於復性緩衝液中以1:10至1:50稀釋至0.1至0.5 mg/ml之最終蛋白質濃度，來進行復性。復性緩衝液可含有50至100 mM Tris及/或50至100 mM甘胺酸、50至150 mM NaCl、1至3 M尿素、0.5至1 M精胺酸、2至6 mM之氧化還原系統，例如，半胱胺酸/胱胺酸或氧化/還原谷胱甘肽，pH 9.5至10.5。在4℃下，培養24至72小時之後，視情況使用0.22 μm過濾器過濾復性溶液，稀釋並將pH調整至pH 7.0至8.0。經由結合模式之陽離子交換層析(例如，Toyopearl GigaCap S-650M、SP瓊脂糖凝膠FF或S HyperCelTM )在pH 7.0至8.5下，分離蛋白質。藉由線性遞增的NaCl梯度，進行洗脫。合併含有目標蛋白質之溶離份，且隨後在以非結合模式之陰離子交換管柱(例如，Toyopearl GigaCap Q-650M、Q-Sepharose FF、Q HyperCelTM )上分離，接著進行陽離子交換純化步驟(例如，SP瓊脂糖凝膠HP)。合併含有純度最少90%之目標蛋白質之溶離份，且藉由透析或尺寸排除層析法，於PBS中調配。藉由還原性SDS-PAGE，分析所製備之scFv分子之同質性及產物品質，其中該可在約26 kDa處單一主要條帶中檢測到該scFv。該scFv之其他特徵分析法包括質譜、RP-HPLC及SE-HPLC。
在本發明另一態樣中，該抗體分子係免疫球蛋白，較佳係IgG1、或其效應物功能剔除、或IgG4型之免疫球蛋白在本發明另一態樣中，該抗體分子係免疫球蛋白，其具有包括SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 40之重鏈、及包括SEQ ID NO: 35之輕鏈。
在本發明另一態樣中，該抗體分子係Fab分子。在此情況下，以上所揭示之可變域各可與較佳係人源性之免疫球蛋白不變域融合。因此，該重鏈可變域可與CH1 域融合(所謂之Fd片段)，且該輕鏈可變域可與CL域融合。
在本發明另一態樣中，該抗體分子係Fab分子，其具有包括SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 38之Fd片段及包括SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 39之輕鏈。在本發明另一態樣中，該抗體分子係Fab分子，其具有包括SEQ ID NO: 36之Fd片段、及包括SEQ ID NO: 37之輕鏈。在本發明另一態樣中，該抗體分子係Fab分子，其具有包括SEQ ID NO: 38之Fd片段、及包括SEQ ID NO: 39之輕鏈。在本發明另一態樣中，該抗體分子係Fab分子，其具有由SEQ ID NO: 36組成之Fd片段、及由SEQ ID NO: 37組成之輕鏈。在本發明另一態樣中，該抗體分子係Fab分子，其具有由SEQ ID NO: 38組成之Fd片段、及由SEQ ID NO: 39組成之輕鏈。
可使用編碼Fab構築體之核酸，以在宿主細胞(如，大腸桿菌(E. coli)、畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、或哺乳動物細胞系(例如，CHO或NS0))中表現此等重鏈及輕鏈。相關技術已知可提供此等鏈之適當摺疊、締合、及二硫鍵合至包括Fd片段及輕鏈之功能性Fab分子之方法(Burtet等人，J. Biochem. 2007,142(6),665-669；Ning等人，Biochem. Mol. Biol. 2005,38: 204-299；Quintero-Hernandez等人，Mol. Immunol. 2007,44: 1307-1315；Willems等人，J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003;786:161-176.)。
特定言之，可如下於CHO細胞中製備本發明Fab分子。根據製造商的指示，使用LipofectamineTM 及PlusTM 試劑(Invitrogen)，用編碼該Fab分子之重鏈及輕鏈之表現構築體轉染在不含血清之培養基之懸浮液中生長之CHO-DG44細胞(Urlaub G.、Kas E.、Carothers,A.M.、及Chasin,L.A.(1983). Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells. Cell 33,405-412.)。48小時後，在含有200 μg/ml之抗生素G418且不含次黃嘌呤及胸腺嘧啶之培養基中篩選出該等細胞，以產生經安定轉染之細胞群。隨後，依遞增濃度(至高100或400 nM)添加甲胺喋呤(MTX)至培養基，使該等安定轉染物進行基因擴增。該等細胞一旦適應，則進行10至11天之分批補料發酵，以製備Fab蛋白質物質。
於化學上受限制之不含血清之培養基中，培養CHO-DG44細胞及其安定轉染物之懸浮液培養物。每隔2至3天，分別以3×105 至2×105 細胞/mL之接種密度傳代培養原種培養物。細胞於5% CO2 、37℃及120 rpm下之Multitron HT培養器(Infors)中之搖瓶中生長。對於補料分批實驗而言，在不含抗生素或MTX之BI-專用生產培養基中，將細胞以3×105 細胞/ml接種至搖瓶中。在37℃及5% CO2 (隨後，隨著細胞數增加，其降至2%)下，以120 rpm攪拌該等培養物。每日測定包括細胞數、存活率、pH、葡萄糖及乳酸濃度之培養參數，且根據需要，使用碳酸鹽將pH調整至pH 7.0。每隔24小時，添加BI-專用補料溶液。在不同時間點，自上清液取樣，藉由ELISA測定Fab產物濃度。10至11天後，藉由離心，收穫該細胞培養液，並轉移至純化實驗室。
藉由層析及過濾法，自該等補料-分批培養物之上清液純化Fab分子。採用親和層析法(例如，蛋白G或蛋白L)作為主要捕獲步驟。或者，在低結合親和性及能力下，藉由利用該分子之pI之陽離子交換層析(CEX)，來捕獲該Fab。藉由其他正交純化步驟，移除宿主細胞蛋白質及雜質，例如，DNA或病毒。
藉由電泳分析法(例如，SDS-PAGE)，分析所製備之Fab分子之同質性及產物品質，藉由SDS-PAGE，可在約50 kDa處之單一主要條帶檢測到Fab。該Fab產物之其他特徵分析法包括質譜、等電點聚焦及尺寸排除層析。隨後，藉由BIAcore分析法分析結合活性。
經由夾心酶聯免疫吸附檢定(ELISA)，定量該等細胞培養物上清液中之Fab或全長IgG分子。可使用對抗人類-Fc片段(Jackson Immuno Research Laboratories)及人類κ輕鏈(過氧物酶-共軛，Sigma)所產生之抗體檢測該全長IgG。藉由山羊多株抗人類IgG(H及L，Novus)固定該Fab片段，並藉由對抗人類IgG所產生之綿羊多株抗體(過氧物酶-共軛，該結合位點)檢測。
亦可藉由酶裂解，自全長抗體分子產生Fab分子。此方法之優點係可應用穩健且高效的發酵及純化之平臺製程，其適於在所需產物品質下擴大規模及高產率。對於純化而言，可採用重組蛋白A樹脂之親和層析法作為主要捕獲步驟，其通常產生高純度。
為此目的，將編碼Fab序列之重鏈融合至人類IgG抗體分子之Fc區域。隨後，使用脂質轉染法，將所得之表現構築體轉染至在不含血清之培養基懸浮液中生長之CHO-DG44細胞中。48小時之後，在含有200 μg/ml之抗生素G418且不含次黃嘌呤及胸腺嘧啶之培養基中選拔該等細胞，以產生經安定轉染之細胞群。隨後，依遞增濃度(至高100或400 nM)添加甲胺喋呤(MTX)至培養基，使該等安定轉染物進行基因擴增。該等細胞一旦適應，即進行10至11天之補料分批發酵，以製備IgG蛋白質物質。
使用重組蛋白A-親和層析法，自該培養物上清液純化該IgG蛋白。為了獲得所需之中和Fab片段，則在木瓜蛋白酶之存在下，培養該全長IgG，其在該鉸鏈區內裂解IgG，藉此釋放兩個Fab片段及Fc-部份。
藉由親和層析法(例如，蛋白質G或蛋白質L)，單離Fab分子。或者，在低結合親和性及能力下，利用該分子之pI之陽離子交換層析(CEX)，來捕獲Fab。藉由其他正交純化步驟，移除宿主細胞蛋白質及雜質，例如，木瓜蛋白酶、DNA或病毒。
在本發明之另一態樣中，該抗體分子係如本文所述之抗體分子之胺基酸序列變體。
可藉由引入適當的核苷酸改變抗體DNA，或藉由肽合成，來製備抗體之胺基酸序列變體。此等變體包括(例如)刪除及/或插入及/或取代本文實例之抗體之胺基酸序列內之殘基。可進行刪除、插入、及取代之任何組合，以形成最終構築體，限制條件為該最終構築體具有所需特性。胺基酸變化亦可改變該人源化或變體抗體之轉譯後製程，如改變醣基化位點之數量或位置。
鑒定抗體之某些殘基或區域係突變較佳位置之適用方法係稱為「丙胺酸掃描突變」，如Cunningham及Wells所述(Science,244:1081-1085(1989))。此處，藉由中性或帶負電荷之胺基酸(通常係丙胺酸)，來識別(例如，帶電殘基，如arg、asp、his、lys、及glu)及置換目標殘基之殘基或基團，以影響該等胺基酸與抗原之相互作用。隨後，藉由在取代位點處或為其進一步引入或引入其他變體，來純化彼等對該等取代官能展現敏感度之胺基酸位置。因此，雖然預定引入胺基酸序列變體之位點，但是無需預定突變本身之性質。例如，為了分析在指定位點之突變之性能，在該目標密碼子或區域進行丙胺酸掃描或隨機突變，並針對所需活性，篩選表現之抗體變體。
胺基酸序列插入法包括長度範圍為自一個殘基至含有100個或更多殘基之多肽之胺基-及/或羧基-末端融合體，及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入體。末端插入體之實例包括與抗原決定基標籤融合之抗體。抗體分子之其他插入變體包括與酶或多肽之抗體之N-或C-末端之融合體，其延長該抗體之血清半衰期。
另一類型之變體係胺基酸取代變體。此等變體已移除該抗體分子中至少一個胺基酸殘基及一個插入其位置之不同殘基。取代突變最受關注之位點包括高可變區，但是亦包括FR變化。保留性取代基係示於以下表中，標題為「較佳取代基」。如果此等取代造成生物活性之變化，則可引入稱為「示例性取代基」、或如下參考胺基酸類別進一步所述之更實質性變化，並篩選產物。
在蛋白質化學中，吾人普遍認為：可在保持以下各項性質下選拔具有顯著不同效用的取代法，來達成抗體之生物學特性：(a)取代區中之多肽骨架之結構，例如呈片型或螺旋構象，(b)在目標位點之分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈之體積。基於共同側鏈性質將天然存在之殘基分為以下群組：
(1)　疏水性：正亮胺酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)　中性親水性：cys、ser、thr；
(3)　酸性：asp、glu；
(4)　鹼性：asn、gin、his、lys、arg；
(5)　影響鏈定向之殘基：gly、pro；及
(6)　芳香性：trp、tyr、phe。
非保留性取代將會使此等類型中之一成員改變成另一類型。
任何不參與保持該人源化或變體抗體之適當構象之半胱胺酸殘基亦可經(一般經絲胺酸)取代，以提高該分子之氧化安定性、避免異常交聯、或為細胞毒性或細胞生長抑制性化合物提供可建立之共軛點。反之，可使該抗體增加半胱胺酸鍵(群)，以提高其安定性(尤其係該抗體係抗體片段(如Fv片段)時)。
一類取代變體涉及取代親本抗體(例如，人源化或人類抗體)之一或多個高可變區殘基。一般而言，用於進一步開發所選拔之所得變體將比其所產生之親本抗體具有改善之生物特性。產生此等取代變體之一方便方法係使用噬菌體呈現法之親和性成熟。簡而言之，使數個高可變區位點(例如，6至7個位點)突變，以在各位點產生所有可能的胺基取代。因此所產生之抗體變體會以單價方式，由絲狀噬菌體顆粒呈現與各顆粒內包裝之M13之基因III產物之融合體。隨後，針對其生物活性(例如，結合親和性)，篩選該等噬菌體呈現之變體。為了識別用於修飾之候選高可變區位點，可進行丙胺酸掃描突變，以識別主要負責抗原結合之高可變區殘基。或者，或此外，可能宜分析該抗原-抗體錯合物之晶體結構，以識別該抗體與人類達比加群之間的接觸點。根據本文所述之技術，此等接觸殘基及鄰近殘基係候選之取代基。一旦產生此等變體，則使一組變體接受如本文所述之篩選，且可在一或多個相關檢定法中，選拔具有卓越特性之抗體，用於進一步發展。
另一類抗體之胺基酸變體改變該抗體之初始醣基化模式。「改變」意指刪除一或多個該抗體中出現之碳水化合物部份、及/或添加一或多個該抗體中不存在之醣基化位點。
在某些實施例中，需要改良本發明抗體，以添加醣基化位點。抗體之醣基化通常係N-連接或O-連接。N-連接係指該碳水化合物部份附接在天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸以外之任何胺基酸)係碳水化合物部份經酶促附接天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中出現其中任一種三肽序列即產生可能的醣基化位點。O-連接之醣基化係指由糖類N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、木糖中之一附接羥基胺基酸(最常使用絲胺酸或蘇胺酸)，但是亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。因此，為了使既定蛋白質(例如抗體)醣基化，將該蛋白質之胺基酸序列經工程改造為含有一或多個上述三肽序列(針對N-連接之醣基化位點)。亦可藉由添加、或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基來改變原抗體之序列(針對O-連接之醣基化位點)。
藉由各種相關技術已知之方法，製備編碼抗體之胺基酸序列變體之核酸分子。該等方法包括(但不限於)自天然來源中分離(若天然存在胺基酸序列變體時)或藉由如本文所述之抗體分子之先前製備之變體或非變體型的寡核苷酸-介導(或定點)之突變、PCR突變、及序列盒誘變法製備。如上所述，本發明抗體分子之抗原係抗凝血劑。使用該抗原，藉由為動物免疫接種、或藉由如噬菌體呈現方法，自序列庫選拔抗體序列，以產生抗體分子。
動物之免疫接種法係相關技術已熟知。為了獲得適當的免疫反應，可能需要將該抗原與佐劑(如，磷酸鋁、氫氧化鋁、角鯊烯、或佛氏(Freund)完全/不完全佐劑)組合。
本發明上下文中之抗原(如達比加群)大多數係相當小的有機分子，有時在投與給動物後，其無法刺激抗體形成。因此，可能需要將該抗原附接至大分子(如半抗原)上。
在另一態樣中，本發明係關於一種如上所述之抗體分子，其用於醫學中。
在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包括如上所述之抗體分子、及醫藥載劑。
為了用於治療，將抗體分子併入有利於投藥給動物或人類之適當醫藥組合物中。可藉由將該抗體分子與生理上可接受之載劑、賦形劑或安定劑混合，以凍乾或其他乾調配物或水溶液或水性或非水性懸浮液之形式，來製備該抗體分子之典型調配物。載劑、賦形劑、修飾劑或安定劑之使用劑量及濃度應無毒性。其等包括緩衝液系統，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及其他無機或有機酸及其鹽；抗氧化劑，其包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，如十八烷基二甲基苄基氯化銨、氯化己烷雙胺、氯化苄二甲烴銨、氯化苄乙氧銨、苯酚、丁基或苄基醇、對羥基苯甲酸烷基酯(如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯)、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇、及間甲酚；蛋白質，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮或聚乙二醇(PEG)；胺基酸，如甘胺酸、谷胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、或離胺酸；單醣、雙醣、寡醣或多醣及其他醣類，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、糊精或葡聚糖；螯合劑，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽之抗衡離子，如鈉；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；及/或離子或非離子界面活性劑，如TWEENTM (聚山梨醇酯)、PLURONICSTM 或脂肪酸酯類、脂肪酸醚類或糖酯類。該抗體調配物中亦可含有有機溶劑，如乙醇或異丙醇。該賦形劑亦可具有修飾釋放性或修釋吸收性之功能。
在一態樣中，該醫藥組合物包括濃度為10至20 mg/ml之含抗體分子之水性緩衝溶液，或由此溶液製成之凍乾物。
較佳的施用模式係非經腸式，藉由輸注或注射(靜脈內、肌肉內、皮下、腹腔內、皮內)，但是亦可採用其他施用模式，如藉由吸入、透皮、鼻內、頰內、口服。
在另一態樣中，本發明係關於一種如上所述之抗體分子，其用於治療抗凝血劑療法之副作用，尤其係出血。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療抗凝血劑療法之副作用之方法，其包括投與有效量之如上所述之抗體分子給有此需要之病患。
所投與抗體之「治療上有效量」係預防、減輕或治療抗凝血劑療法之副作用所需之最小量，特定言之可有效止血之最小量。此點可使用化學計量之抗體分子達成。
例如，達比加群以推薦劑量給予時，可達到200 nM之血漿濃度。當使用分子量為約50 kdal之單價抗體分子時，例如，當使用團藥經靜脈注射時，可在約1 mg/kg之劑量下達到中和。在另一實施例中，施用至人類患者之Fab分子之劑量可以每次施用50至1000 mg，例如100、200、500、750、或1000 mg。適當劑量可根據所投與之抗凝血劑之類型及劑量、自投藥後所經歷之時間、該抗原分子之性質、該患者之病症、及其他因素而不同。熟練的專家已知確定治療上有效且安全劑量之方法。
在另一態樣中，本發明係關於一種抗體分子，其具有與達比加群及/或達比加群酯之結合親和性。較佳地，如(例如)藉由表面電漿共振分析(Malmqvist M.,「Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.」Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.)或動態排除檢定(KinExA)技術(Darling,R.J.、及Brault P-A.,「Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions.」ASSAY and Drug Development Technologies. 2004年12月2(6): 647-657)所測定，該抗體分子與達比加群及/或達比加群酯結合之親和性之KD 值範圍為1 pM至100 μM，較佳係1 pM至1 μM。
本發明抗體分子亦可用於分析及診斷程序，例如以確定檢體(如血漿、血清、或其他體液)中之抗原濃度。例如，該抗原分子可用於酶聯免疫吸附檢定法(ELISA)，如彼等實例中所述者。因此，在另一態樣中，本發明係關於包含如本文所述之抗體分子之分析及診斷套組，及關於各自的分析及診斷方法。
在另一態樣中，本發明係關於一種製造如先前技術方案中任一項之抗體分子之方法，其包括：
a.　提供一種宿主細胞，其包括一或多個編碼與表現調控序列功能相關之抗體分子之核酸，
b.　培養該宿主細胞，及
c.　自該細胞培養物回收該抗體分子。
實例 I.　多株抗達比加群抗體之製法
為了製備多株抗達比加群抗體，用兩種不同的半抗原及不同的半抗原與載體蛋白(BSA)之莫耳輸入比，來製備3種不同的免疫原。
為了篩選，製備酵素辣根過氧化物酶(HRP)-共軛物，並展開酶-免疫吸附檢定法(ELISA)。
藉由在蛋白質A瓊脂糖凝膠FF上之親和層析法，進一步純化多株抗體。
1.　材料及方法
測試化合物(達比加群)
1.1　用於合成免疫原及示蹤物之半抗原
1.2　半抗原之合成法
如下合成該等半抗原(半抗原1及半抗原2)：
半抗原12-[(4-甲脒基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羧酸[2-(4-胺基-丁基胺甲醯基)-乙基]-苯基-醯胺
1a 3-[(4-甲基胺基-3-硝基-苯甲醯基)-苯基-胺基]-丙酸甲酯
在室溫下，將三乙胺(50.2 mmol)在攪拌下，滴加至含於80 mL無水四氫呋喃(THF)中之4-甲基胺基-3-硝基-苯甲醯氯(23.3 mmol)及3-苯基-胺基-丙酸甲酯(23.3 mmol)之溶液中。三小時後，將該反應混合物蒸發至乾燥，用水研磨剩餘固體，並經由過濾單離該固體產物。
產率：99%
C18 H19 N3 O5 (357.36)
TLC(矽膠；二氯甲烷/乙醇19:1)：Rf =0.48
1b 　3-[(3-胺基-4-甲基胺基-苯甲醯基)-苯基-胺基]-丙酸甲酯
在室溫下，於乙醇中，使用Pd(10%，木炭上)作為觸媒進行氫化反應，還原產物1a之硝基。
產率：99%
C18 H21 N3 O3 (327.38)
TLC(矽膠；二氯甲烷/乙醇9:1)：Rf =0.23
質譜(ESI)：[M+H]+ =328
1c 　3-({3-[2-(4-氰基-苯基胺基)-乙醯胺基]-4-甲基胺基-苯甲醯基}-苯基-胺基)-丙酸甲酯
在室溫下，使1b產物(23.2 mmol)及N-(4-氰基-苯基)-甘胺酸(23.2 mmol)與CDI(23.2 mmol)於無水THF中偶聯。反應完成後，將該混合物蒸發至乾燥，且未再進一步純化即使用該粗產物。
產率：97%
C27 H27 N5 O4 (485.54)
質譜(ESI)：[M+H]+ =486
1d 　3-({2-[(4-氰基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-苯基-胺基)-丙酸甲酯
將含於100 mL濃乙酸中之1c產物(22.6mmo1)之溶液加熱至回流，持續1小時。隨後，將該溶液蒸發至乾燥，用水研磨剩餘固體，並在攪拌下，將pH調整至約8至9。經由乙酸乙酯萃取，單離該粗產物，並經矽膠層析法(洗脫液：二氯甲烷/乙醇1:1)純化。
產率：58%
C27 H25 N5 O3 (467.52)
TLC(矽膠；二氯甲烷/乙醇9:1)：Rf =0.71
質譜(ESI)：[M+H]+ =468
1 e 　3-({2-[(4-氰基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-苯基-胺基)-丙酸
將氫氧化鈉(20.0 mmol)添加至含於100 mL甲醇中之1d產物(13.0 mmol)之溶液中。在40℃下，攪拌該混合物2.5小時，且隨後蒸發至乾燥。用100 mL水攪拌剩餘固體，並用濃乙酸將pH調整至約6。藉由過濾單離沉澱產物，用水清洗，並在60℃下乾燥。
產率：88%
C26 H23 N5 O3 (453.49)
TLC(矽膠；二氯甲烷/乙醇9:1)：Rf =0.33
質譜(ESI)：[M+H]+ =454
1f 　{4-[3-({2-[(4-氰基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-苯基-胺基)-丙醯胺基]-丁基}-胺基甲酸第三丁酯
在室溫下，攪拌含於20 mL DMF中之1e產物(5.23 mmol)、四氟硼酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(TBTU，5.23 mmol)及N-甲基-嗎啉(5.23 mmol)之溶液30分鐘。隨後，添加(4-胺基-丁基)-胺基甲酸第三丁酯(5.23 mmol)，並在室溫下再攪拌該混合物24小時。隨後，用水(100 mL)稀釋該混合物，並經由乙酸乙酯萃取，單離該產物。
產率：92%
C35 H41 N7 O4 (623.75)
TLC(矽膠；二氯甲烷/乙醇9:1)：Rf =0.51
1g 2-[(4-甲脒基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羧酸[2-(4-胺基-丁基胺甲醯基)-乙基]-苯基-醯胺
將1f產物(4.81 mmol)溶於飽和HCl之乙醇溶液(250 mL)中，並在室溫下攪拌該混合物過夜，且隨後在30℃下蒸發至乾燥。將剩餘之粗物質溶於200 mL無水乙醇中，隨後添加碳酸銨(48.1 mmol)，並在室溫下攪拌該混合物過夜。蒸發該溶劑之後，用約5 mL乙醇研磨剩餘粗物質，過濾分離未溶解之物質，且在30℃下蒸發該溶劑。隨後，將該產物溶於30 mL水中，並用約2 g木炭攪拌該溶液，過濾並蒸發至乾燥。
產率：90%
C30 H36 N8 O2 (540.67)
TLC(逆相RP-8；甲醇/5% NaCl水溶液9:1)：Rf =0.79
質譜(ESI)：[M+H]+ =541
[M+Cl]- =575/7
半抗原2 　2-[(4-甲脒基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羧酸[2-(2-胺基-乙基胺甲醯基)-乙基]-吡啶-2-基-醯胺
2a 　3-({2-[(4-氰基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-吡啶-2-基-胺基)-丙酸
將3-({2-[(4-氰基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-吡啶-2-基-胺基)-丙酸乙酯(41.4 mmol)添加至含於500 mL乙醇及50 mL水中之氫氧化鈉(50.0 mmol)之溶液中。在室溫下，攪拌該混合物3小時，隨後蒸餾出約350 mL乙醇，添加約100 mL水，並將pH調整至6。隨後，添加乙醚(50 mL)，並攪拌該混合物過夜。藉由過濾單離該產物，且無需進一步純化使用。
產率：78%
C25 H22 N6 O3 (454.48)
2b 　{2-[3-({2-[(4-氰基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-吡啶-2-基-胺基)-丙醯胺基]-乙基}-胺基甲酸第三丁酯
在室溫下，攪拌含於無水四氫呋喃(100 mL)中之2a產物(2.20 mmol)、四氟硼酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(TBTU,2.20 mmol)及N-甲基-嗎啉(2.20 mmol)之溶液15分鐘。隨後，添加(2-胺基-乙基)-胺基甲酸第三丁酯(2.20 mmol)，並在室溫下再攪拌該混合物24小時。用40 mL水稀釋該混合物，經由乙酸乙酯萃取，單離該產物，並藉由層析法(矽膠；二氯甲烷/甲醇15:1)純化。
產率：61%
C32 H36 N8 O4 (596.68)
質譜(ESI)：[M+H]+ =597
[M+H]- =595
2c 　2-[(4-甲脒基-苯基胺基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羧酸[2-(2-胺基-乙基胺甲醯基)-乙基]-吡啶-2-基-醯胺
將2b產物(1.34 mmol)添加至含於無水乙醇(30 mL)中之飽和HCl溶液中。在室溫下，攪拌該溶液5小時，隨後在30℃下蒸發至乾燥。添加乙醇(30 mL)及碳酸銨(13.0 mmol)，並在室溫下攪拌該混合物過夜。隨後，蒸發該溶劑，殘留物使用約4 mL二氯甲烷/甲醇(30:1)之混合物研磨5次，過濾並蒸發，以自無機鹽中分離該產物。
產率：27%
C27 H31 N9 O2 (513.61)
質譜(ESI)：[M+Cl]- =548/50
[M+HCl+Cl]- =584/6
[M+H]+ =514
2.　化學品 2.1　用於試劑合成之化學 品
2.2　用於ELISA之化學品
2.3　用於ELISA之緩衝液
使用自Elgastat Maxima-HPLC超純水處理系統之水，製備緩衝溶液。
3.　免疫原之合成法
為了刺激兔子的免疫系統，以製備對抗達比加群之多株抗體，使用1,4-苯并醌或1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)作為偶聯劑，使該等半抗原(半抗原1及半抗原2)與載體蛋白偶聯，來合成三種免疫原(批號GL256 、GL258 、及GL262 )。
合成GL256 時，使用1,4-苯并醌作為具有兩個反應性位點之均雙官能性化合物。首先，在酸性pH下，僅在該兩個位點中之一處與胺基反應，且在鹼性pH下，另一位點係在最低聚合度下反應。
使用1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)作為偶聯劑，用不同的半抗原對載體蛋白之輸入比，合成GL258 及GL262 。
3.1　GL256之合成法
將0.416 mMol 1,4-苯并醌(含於1.5 mL乙醇中)添加至含於8.5 mL 0.1 M KH2 PO4 -緩衝液(pH=4.5)中之0.75 μMol BSA之溶液中，並在室溫及黑暗下，培養1.5 h。隨後，使該溶液通過於0.15 M NaCl中平衡之sephadex G25管柱，以除去過量之1,4-苯并醌(最終體積12.5 mL)。
在攪拌下，將2.5 mL(0.15 μMol)純化BSA-溶液緩慢添加至溶於2 mL 0.1 M NaHCO3 /Na2 CO3 -緩衝液(pH=8.5)中之525 μMol半抗原(半抗原1)之溶液中。在添加該BSA溶液期間，將pH調整至約8.0。該半抗原與該載體蛋白之莫耳輸入比係3500:1。
在室溫下培養過夜之後，由該免疫原相對於1公升蒸餾水透析6次。薄層層析法顯示，沒有未結合之半抗原之斑點殘留於該半抗原-載體共軛物中。
取該免疫原分裝冷凍儲存在-20℃下。藉由UV吸收光譜在302 nm處測定，該免疫原上清液中之BSA經半抗原取代之程度係約1:18。最終溶液中之免疫原含量係0.75 mg GL256/mL。
3.2 GL258之合成法
在室溫下，製備含於6.3 mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之158 μMol半抗原2之溶液。添加158 μMol 1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)，並先在10℃下培養4小時，且隨後在室溫下培養30分鐘。用薄層層析法檢查該化學反應，且係約20-25%。
隨後，將0.75 μMol BSA溶於2 mL 0.13 M NaHCO3 中，並在攪拌下滴加1 mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)。將pH調整至約8.3。隨後，在攪拌下，將該半抗原溶液(6.3 mL)及4 mL 0.13 M NaHCO3 滴加至該BSA溶液中，且將pH調整至8.4。針對該免疫原GL258而言，該半抗原與該載體蛋白之莫耳輸入比係210:1。
在攪拌及室溫下，培養過夜之後，由該免疫原相對於1公升蒸餾水透析6次。薄層層析法顯示，沒有未結合半抗原之斑點殘留於該半抗原-載體共軛物中。
該免疫原分裝冷凍儲存在-20℃下。藉由UV吸收光譜在302 nm處測定，該免疫原上清液中之BSA經半抗原取代之程度係約1：5。最終溶液中之免疫原含量係0.28 mg GL258/mL。
3.3　GL262之合成法
在室溫下，製備含於8.75 mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之225 μMol半抗原2之溶液。添加225 μMol 1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)，並在10℃下培養4小時。用薄層層析法檢查該化學反應，且係約20至25%。
隨後，將0.49 μMol BSA溶於2 mL 0.13 M NaHCO3 中，並在攪拌下滴加1 mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)。將pH調整至約8.2。隨後，在攪拌下，將該半抗原溶液(8.75 mL)及6 mL 0.13 M NaHCO3 滴加至該BSA溶液中，且將pH調整至8.3。針對該免疫原GL262而言，該半抗原與該載體蛋白之莫耳輸入比係460:1。
在攪拌及室溫下，培養過夜之後，由該免疫原相對於1公升蒸餾水透析6次。薄層層析法顯示，沒有未結合半抗原之斑點殘留於該半抗原-載體共軛物中。
該免疫原分裝冷凍儲存在-20℃下。藉由UV吸收光譜在302 nm處測定，該免疫原上清液中之BSA經半抗原取代之程度係約1：32。最終溶液中之免疫原含量係0.71 mg GL262/mL。
4.　共軛物之合成法 4.1　GL261之合成
在室溫下，製備含於1.5 mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之37.4 μMol半抗原2之溶液。添加37.5 μMol 1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)，且先在10℃下培養4小時，隨後在室溫下培養30分鐘。用薄層層析法檢查該化學反應，且係約20至25%。
隨後，將1.125 μMol酵素辣根過氧物酶(HRP)溶於0.4 mL 0.13 M NaHCO3 中，並在攪拌下滴加0.267 mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)。將pH調整至約8.2。隨後，在攪拌下，將該半抗原溶液(22.5 μMol)及0.57 mL 0.13 M NaHCO3 滴加至該HRP溶液中，且將pH調整至8.4。針對該HRP共軛物GL261而言，該半抗原與該HRP之莫耳輸入比係20:1。
在室溫及攪拌下培養過夜之後，藉由凝膠層析法，將該HRP共軛物自有機溶劑及過量之半抗原中分離。使該溶液通過經0.1 M磷酸鹽緩衝液pH 7.0平衡之sephadex G25管柱。在半抗原-HRP共軛物(示蹤物，5.64 mg/mL)之最終濃度中加上BSA(其造成約10 mg/mL之濃度)、等體積之甘油(以避免結凍)及百里酚晶體(以避免細菌生長)。將該示蹤物溶液標為批號GL261並分裝儲存在-20℃下。
藉由UV光譜在302 nm處測定，HRP經半抗原取代之程度係約1：0.2。
使用鄰苯二胺(OPD)作為受質及使用天然HRP作為參考物質，於BSA-阻斷之微量滴定盤中，測量該示蹤物之比活性。在黑暗中，培養經稀釋之HRP標準物或該半抗原-HRP共軛物與受質溶液之混合物30分鐘，用硫酸停止反應，並在490 nm處測量吸光度。殘留活性係天然HRP的94%，且該共軛物調配物於甘油中之比活性係611 U/mL。
示蹤物規格之匯總：
5.　抗體之免疫接種及製法 5.1　兔子之免疫接種
用含於0.5 mL 0.9% NaCl溶液及0.5 mL完全佛氏佐劑(CFA)中之100 μg免疫原GL256、GL258及GL262之乳液，使12隻3個月大的雌性金吉拉兔子(Chinchilla Rabbit)免疫。在下一個月進行數次追加免疫接種。針對第三次免疫接種，使用0.5 mL非完全佛氏佐劑(IFA)。每次都在四個皮下位點及四個肌肉內位點處進行免疫接種。
A組-免疫原GL256
兔子1　#50
兔子2　#51
兔子3　#52
兔子4　#53
B組-免疫原GL258
兔子5　#54
兔子6　#55
兔子7　#56
兔子8　#57
C組-免疫原GL262
兔子9　#46
兔子10　#47
兔子11　#48
兔子12　#49
免疫接種方案
*1至12號兔子在第5次免疫接種後10天完全放血。
在使用甲苯噻嗪(Rompun，Bayer，Leverkusen，德國)及鹽酸氯胺酮(Ketavet，Parke-Davis，Freiburg，德國)之麻醉下之，自頸動脈放血。
5.2　兔子血清之分析
由凝固之兔血離心，來製備血清。藉由硫酸銨沉澱法及經由Sephadex G25管柱之脫鹽，獲得蛋白質組分。
藉由標準ELISA程序，在該兔血清所分離之各蛋白質組分中篩選抗達比加群效價。
篩選-ELISA：
5.3　於兔血清中檢測抗達比加群抗體 最後三個管柱：針對達比加群之值 第2次抽血
最後抽血
自第2次抽血篩選所有兔子之蛋白質組分之後，顯然，兔子5號(#54)與較佳的半抗原(半抗原2)具有抗達比加群抗體之最高效價。此外，僅使用低濃度之分析物(達比加群)即可置換抗體結合位點之示蹤物。
在最後之第3次抽血之篩選中，因為缺少關於所用免疫原之資訊，所以使用低濃度之分析物(達比加群)置換抗體結合位點之示蹤物用作主要決定標準。因此，兔子2、3及5號係用於進一步純化。
5.4　多株抗體之純化
兔子5號(#54)第2次抽血及兔子2、3及5號第3次抽血(最後一次抽血)之抗血清使用硫酸銨沉澱。在10℃下，以4500 U/min離心該沉澱30分鐘，自該溶液分離，並再溶於Tris緩衝液中。重複此程序。藉由在蛋白質A瓊脂糖凝膠FF上之親和層析法進一步純化。該管柱緩衝液係0.01 M Tris pH=7.5，且使用0.1 M甘胺酸pH=3.0洗脫。合併含有兔子IgG之溶離份。藉由在280 nm之UV光譜，測定蛋白質濃度。
抗體規格說明：
II.　達比加群之中和
進行兩個系列之實驗，以顯示該等抗體於活體外對抗達比加群抗凝血劑活性之效果。在實驗室中收到四種多株抗體，並在人類血漿中進一步測試。此係在功能檢測法中(凝血酶凝血時間)測試。
檢測法描述：
簡言之，抽取全血至3.13%檸檬酸鈉中，獲得人類血漿。隨後離心，獲得不含血小板之血漿，並轉移至分離試管中，並冷凍，直至在檢測當天需要時。在檢測當天，使血漿在37℃下解凍。
凝血酶凝血時間操作如下。首先，將凝血酶在所提供之緩衝液(Dade Behring測試套組)中稀釋至製造商規格(3 IU/ml凝血酶)，並預熱至37℃。在製成後2小時以內使用。所有檢測法均在市售之CL4凝血機(Behnk Electronics,Norderstadt,德國)上進行。用吸管吸取50 μL血漿加至所提供具有磁力攪拌子之測光管中，並在CL4機器中已預熱至37℃之孔中攪拌2分鐘。此時，添加100 μL凝血酶溶液，並由該CL4自動記錄血漿樣品凝固所需之時間。在添加凝血酶及開始測量之前，將達比加群先於所提供之測光管中之血漿中預先培養5分鐘。如果亦測試抗體(至多50 μL原液)，則在開始凝固之前，需另外在37℃下培養5分鐘(即，與達比加群一共培養10分鐘，與抗體一共培養5分鐘，且隨後用凝血酶啟動凝血)。
首先，藉由將濃度遞增之達比加群添加至人類血漿中，並測量在添加凝血酶之後的凝血時間，製成達比加群標準曲線(圖1)。隨著達比加群之濃度增加，該凝血酶凝血時間隨濃度增加。
對於第一組中和實驗而言，將臨床相關濃度之200 nM達比加群添加至所有血漿樣品中用於中和。所有4種抗體製劑均能使含有達比加群之血漿之凝血時間縮短(圖2)。中和之程度係與各抗體製劑中之蛋白質濃度相關。隨後，將具有最高濃度(D)之抗體溶液連續稀釋，並在另一組實驗中，測試其中和200 nM達比加群抗凝血劑活性之能力。在圖3中可看到，隨著抗體濃度增加，達比加群引起之抗凝血劑活性隨濃度變化而受抑制。此外，當將非特異性兔子多株抗體(藍色方塊)添加至含有達比加群之血漿中時，其沒有中和抗凝血劑活性之能力。其依賴濃度之變化及無法中和非特異性抗體之結果表示該抗體逆轉之抗凝血作用係特異針對達比加群。
然而，達比加群之此等濃度係臨床相關性，且使用更高濃度可能發生出血或過量。因此，亦在圖1中標準曲線之最高達比加群濃度(500 nM)下測試抗體抑制抗凝血劑活性之能力。圖4說明抗體D亦可抑制高濃度之達比加群。
III.　單株抗達比加群抗體之製法及特徵分析
1.　單株抗達比加群抗體及Fab之製法
使用與載體蛋白質(如血藍蛋白及免疫球蛋白)共軛之半抗原1(參見實例1.1)為小鼠免疫接種，並根據標準程序，產生融合瘤。藉由ELISA檢測培養物上清液(如實例5.2中所述)，來識別表現針對達比加群之抗體特異性之純系。使自該培養物上清液純化之單株抗體結合至達比加群-蛋白質共軛物，且可與溶液中之達比加群競爭結合，其最大抑制性之半值在1至10 nM範圍內之濃度下。藉由木瓜蛋白酶裂解該等單株抗體，隨後經由蛋白質A消除Fc域，產生Fab。
使用標準方法，選殖該等小鼠抗體之重鏈及輕鏈之可變區並定序。藉由該等抗體之蛋白質質譜分析及N-末端定序，來證實該等序列。產生編碼嵌合抗體之DNA構築體，其包含特異性小鼠可變區及人類IgG不變區，並於HEK 293T細胞中表現該蛋白質，並純化。
2.　單株抗達比加群抗體及Fab之特徵分析
依實例II中所述之凝血酶凝血時間檢測法，測試小鼠單株抗體純系22中和人類血漿中之達比加群抗凝血劑活性之能力。該抗體以隨劑量變化之方式完全逆轉達比加群在人類血漿中所介導依賴凝血酶之凝血時間之延長(圖7)。該抗體亦有效抑制人類全血中之達比加群功能。自此抗體產生之Fab阻斷人類血漿中之達比加群活性，其證明單價抗原結合域可中和化合物之抗凝血劑活性(圖8)。純系22之可變域之胺基酸序列係描繪於圖5(DBG 22 VH，重鏈)及圖6(DBG 22 VK，輕鏈)中。
達比加群在人體中之主要代謝途徑係經由羧基部份基團之葡糖醛酸化。達比加群醯基葡糖苷酸已顯示藥理活性(Ebner等人，Drug Metab. Dispos. 2010,38(9):1567-75)。為了測試該小鼠單株抗體純系22是否能中和此等代謝產物，自經達比加群處理之恒河猴之尿液中純化達比加群醯基葡糖苷酸，並在凝血酶凝血時間檢測法中評估。該抗體隨劑量變化來逆轉達比加群醯基葡糖苷酸在人類血漿中所介導依賴凝血酶之凝血時間之延長，其與使用達比加群所觀察到之效力類似(圖9)。因此，該抗體可有效阻斷出現在人體中之達比加群代謝產物之抗凝血劑活性。
使用Kinexa技術，測定該Fab及包括純系22、13及14之可變域及人類免疫球蛋白不變區之小鼠-人類嵌合抗體之親和性。由恆定濃度之Fab或嵌合抗體與多種不同濃度之達比加群培養，直至達成平衡。此培養之後，藉由與生物素共軛之達比加群模擬物所耦合之中性鏈親和素(neutravidin)珠捕獲該抗體，來測定游離抗體之濃度。用經FITC標籤之抗小鼠IgG(Fab特異性)F(ab')2 片段，檢測所捕獲之Fab。用與Cy5共軛之抗人類IgG，檢測所捕獲之嵌合抗體。使用1:1結合模型，計算離解常數。此等實驗之結果匯總於下表中。
抗達比加群抗體之親和性
該Fab及該嵌合抗體皆以高親和性結合達比加群。
3.　人源化單株抗達比加群抗體及Fab之產生
為降低投與人類後之潛在免疫原性，將小鼠單株抗體進行「人源化」。以框架同源性、CDR結構、保守性典型殘基、保守性連接填裝殘基及其他參數為基礎，針對小鼠前導鏈選擇人類框架序列。在此等框架位置中胺基酸殘基之特異性取代可改善各種態樣之抗體性能，其包括結合親和性及/或安定性，優於彼等在藉由CDR或HVL「直接交換」進入人類生殖框架區所形成之人源化抗體中所顯示者。選擇顯示比嵌合親本Fab更佳或相等之結合且可提高表現之Fab，用於進一步分析特徵。該等人源化Fab可變域之胺基酸序列係描繪於圖5(Eng VH 14、15與31)及圖6(Eng VK 11、17與18)中。將包括Eng VH 15及Eng Vk 18之Fab轉換成以IgG1KO格式之全長IgG。IgG1KO(效應物功能之基因剔除)在Fc區具有兩個突變(Leu234A1a及Leu235A1a)，其可降低效應物功能，如FcgR與補體之結合。該IgG格式係描述於文獻資料(參見(例如)Hezareh等人，(2001)Journal of Virology 75: 12161-12168)中。該等人源化抗達比加群抗體視情況包括共同或生殖框架區中之特定胺基酸取代。在HEK 293T細胞中表現該18/15抗體，並純化。完整抗體藉由Lys-C裂解後可產生Fab片段，而Fab係經蛋白質A藉以消除Fc域而經純化。
4.　抗達比加群Fab之特徵分析
在實例II中所述之凝血酶凝血時間檢測法中測試該18/15 Fab片段中和人類血漿中達比加群抗凝血劑活性之能力。該Fab完全逆轉達比加群延長人類血漿中所介導依賴凝血酶的凝血時間是一種隨劑量變化方式，其IC50 為2.6 nM(圖10)。
利用SPR技術，在BIAcore儀器上，測定該18/15 Fab之親和性。在室溫下，將該Fab與濃度遞增之達比加群預先培養30分鐘。使該混合物流過塗佈經固定的生物素-共軛之達比加群模擬物之感測器晶片，並監測游離Fab之結合性。利用此溶液競爭檢測設計，測得該Fab針對達比加群之Kd 為210 pM(圖11)。
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<400>　40
圖1：利用凝血酶凝血時間檢測法，可觀察到凝血時間會隨著達比加群濃度增加而增長。200 nM濃度會造成凝血時間比基線增加~5倍，且係用於第一組及第二組實驗中。最後一組實驗中採用500 nM濃度(超過治療濃度)。
圖2：四種針對達比加群之不同抗體(A至D)均可使人類血漿中達比加群所延長的凝血時間中和。人類血漿中之基線凝血時間係10.9秒，當使200 nM達比加群與血漿預先培養時，凝血時間延長至51秒。將各抗體添加至經200 nM達比加群預先培養之血漿中，並再培養5分鐘。隨後，藉由添加凝血酶，開始凝血酶凝血時間。各抗體會使達比加群之凝血時間逆轉至不同程度。濃度最高的溶液會造成抗凝血劑活性之最大逆轉。
圖3：濃度遞增之多株抗體(抗體D)添加至已與200 nM達比加群預先培養之人類血漿中之影響。基線凝血時間係11秒，添加達比加群延長凝血時間至63.7秒。隨後，測試增加抗體稀釋度對逆轉達比加群所延長凝血酶凝血時間之影響。最低濃度將凝血酶凝血時間降低至43.9秒。較高濃度將凝血酶凝血時間完全降至基線水準，並造成達比加群之抗凝血作用之完全中和。添加非特異性兔子多株抗體(方塊)對逆轉達比加群之抗凝血作用無影響。
圖4：濃度遞增之多株抗體(抗體D)添加至已與500 nM達比加群預先培養之人類血漿中之影響。基線凝血時間係10.9秒，添加此較高濃度達比加群時，延長凝血時間至111.7秒(增加~10倍)。抗體之1：2稀釋液或原液逆轉達比加群所延長凝血酶凝血時間之效應與濃度具有相關性。最高濃度亦會使凝血酶凝血時間完全逆轉至基線水準，並使甚至超過達比加群治療濃度之抗凝血作用完全中和。
圖5：抗達比加群抗體分子重鏈之序列。
圖6：抗達比加群抗體分子輕鏈之序列。
圖7：小鼠單株抗體(純系22)會逆轉人類血漿及人類全血中達比加群之抗凝血作用。將濃度遞增之小鼠單株抗體添加至已與30 nM達比加群預先培養之人類血漿或全血中。藉由添加1.5至2 U/ml之凝血酶開始該檢測法，並測量凝血時間。以存在及不存在該化合物下之凝血時間差異定義為100%達比加群活性。該抗體會以隨劑量變化方式抑制達比加群所介導延長之凝血時間。
圖8：自該純系22抗體產生之小鼠Fab會逆轉人類血漿中達比加群之抗凝血作用。將濃度遞增之小鼠Fab添加至已與7 nM達比加群預先培養之人類血漿中。亦測試完整抗體，作為陽性對照組。藉由添加0.4 U/ml之凝血酶開始該檢測法，並測量凝血時間。以完全阻斷達比加群所介導凝血時間增加定義為100%抑制性。該Fab會以隨劑量變化方式抑制達比加群在人類血漿中所誘發之凝血時間延長。
圖9：小鼠單株抗體(純系22)會逆轉人類血漿中之達比加群醯基葡糖苷酸之抗凝血作用。將濃度遞增之小鼠抗體添加至已與7 nM達比加群醯基葡糖苷酸或達比加群預先培養之人類血漿中。藉由添加0.4 U/ml之凝血酶開始該檢測法，並測量凝血時間。以完全阻斷該化合物所介導凝血時間增加定義為100%抑制性。該抗體會以隨劑量變化方式抑制達比加群醯基葡糖苷酸在人類血漿中所誘發之凝血時間延長。
圖10：人源化Fab(Fab 18/15)會逆轉人類血漿中達比加群之抗凝血作用。將濃度遞增之Fab 18/15添加至已與7 nM達比加群預先培養之人類血漿中。藉由添加0.4 U/ml之凝血酶開始該檢測法，並測量凝血時間。以完全阻斷達比加群所介導凝血時間增加定義為100%抑制性。該Fab會以隨劑量變化方式抑制達比加群在人類血漿中所誘發之凝血時間延長。
圖11：使用SPR技術(BIAcore)測定該人源化Fab(Fab 18/15)對達比加群之結合親和性。將中性鏈親和素固定於經由胺偶聯之CM5感測器晶片上。隨後，在該中性鏈親和素表面上捕獲與生物素共軛之達比加群類似物。在室溫下，將1 nM Fab與達比加群(0至20 μM)預先培養至少30分鐘，使Fab/達比加群混合物以50 μl/分鐘之速率流過該晶片(接觸時間=420秒，離解=720秒)，並測定游離Fab之結合性。使用1:1結合模型，計算Kd。
(無元件符號說明)

Claims (15)

  1. 一種對達比加群具結合特異性之抗體分子，其包括具有選自由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2組成之群之CDR1及選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、及SEQ ID NO：8組成之群之CDR2、及選自由SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10組成之群之CDR3之重鏈可變域，及具有選自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、及SEQ ID NO：13組成之群之CDR1、SEQ ID NO：14之CDR2、及SEQ ID NO：15之CDR3之輕鏈可變域。
  2. 如請求項1之抗體分子，其包括具有SEQ ID NO：1之CDR1、選自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、及SEQ ID NO：8組成之群之CDR2、SEQ ID NO：10之CDR3之重鏈可變域，及具有SEQ ID NO：13之CDR1、SEQ ID NO：14之CDR2、SEQ ID NO：15之CDR3之輕鏈可變域。
  3. 如請求項1或2之抗體分子，其包括選自由SEQ ID NO：16、18、20、22、24、及26組成之群之重鏈可變域，及選自由SEQ ID No：17、19、21、23、25、及27組成之群之輕鏈可變域。
  4. 如請求項3之抗體分子，其包括SEQ ID NO：16之重鏈可變域，及SEQ ID No：17之輕鏈可變域；或SEQ ID No：18之重鏈可變域，及SEQ ID No：19之輕鏈可變域；或SEQ ID No：20之重鏈可變域，及SEQ ID No：21之輕鏈可變域；或SEQ ID No：22之重鏈可變域，及SEQ ID No： 23之輕鏈可變域；或SEQ ID No：24之重鏈可變域，及SEQ ID No：25之輕鏈可變域；或SEQ ID No：24之重鏈可變域，及SEQ ID No：27之輕鏈可變域；或SEQ ID No：26之重鏈可變域，及SEQ ID No：27之輕鏈可變域。
  5. 如請求項1或2之抗體分子，其係多株抗體、單株抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體之片段或單鏈抗體。
  6. 如請求項5之抗體分子，其中該抗體之片段係Fab、Fab'、或F(ab')2 片段且該單鏈抗體係單鏈可變片段(scFv)。
  7. 如請求項5之抗體分子，其係scFv，其中該重鏈可變域及輕鏈可變域經由選自由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、及SEQ ID NO：31組成之群之連接肽連接。
  8. 如請求項7之抗體分子，其包括SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：33。
  9. 如請求項5之抗體分子，其具有包括SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：40之重鏈及包括SEQ ID NO：35之輕鏈。
  10. 如請求項5之抗體分子，其係具有包括SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38之Fd片段，及包括SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：39之輕鏈之Fab分子。
  11. 如請求項10之抗體分子，其具有包括SEQ ID NO：36之Fd片段，及包括SEQ ID NO：37之輕鏈。
  12. 如請求項1或2之抗體分子，其用於醫藥中。
  13. 如請求項1或2之抗體分子，其用於治療或預防抗凝血劑療法之副作用。
  14. 如請求項13之抗體分子，其中該副作用係出血。
  15. 一種製造如請求項1至14中任一項之抗體分子之方法，其包括a.提供一包括一或多個可編碼該抗體分子之核酸之宿主細胞，該核酸與一表現控制序列係以功能性之方式聯合，b.培養該宿主細胞，及c.自該細胞培養物回收該抗體分子。
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