BR112012018021B1 - molécula de anticorpo capaz de neutralizar a atividade de dabigatrano e seu método de fabricação - Google Patents

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Abstract

MOLÉCULA DE ANTICORPO CAPAZ DE NEUTRALIZAR A ATIVIDADE DE DABIGATRANO, SEU MÉTODO DE FABRICAÇÃO, KIT E USO. A presente invenção refere-se a moléculas de anticorpo contra anticoagulantes, em particular dabigatrano, e seu uso como antídotos de tais anticoagulantes.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA TÉCNICA
[0001] A presente invenção refere-se ao campo de Medicina, emparticular ao campo de terapia anticoagulante.
INFORMAÇÃO ANTECEDENTE
[0002] Anticoagulantes são substâncias que previnem coagulação;isto é, elas param a coagulação do sangue. Anticoagulantes são amplamente usados em terapia humana como uma medicação para distúrbios trombóticos, por exemplo, prevenções primária e secundária de trombose de veia profunda, embolia pulmonar, infartos do miocárdio e derrames naqueles que são predispostos.
[0003] Uma classe importante de anticoagulantes orais age atravésda antagonização dos efeitos de vitamina K, por exemplo, as cumarinas que incluem warfarina. Uma segunda classe de compostos inibe a coagulação indiretamente através de um cofator tal como antitrombina II ou cofator de heparina II. Isto inclui vários produtos de heparina de peso molecular baixo que catalisam a inibição de fator Xa predominantemente (e a um grau menor trombina) através de antitrombina II (bemiparina, certoparina, delteparina, enoxaparina, nadroparina, parnaparina, reviparina, tinzaparina). Oligossacarídeos de cadeia menores (fondaparinus, idraparinux) inibem apenas fator Xa através de antitrombina III. Heparinoides (danaparoide, sulodexida, dermatan sulfato) agem através de ambos cofatores e inibem ambos o fator Xa e a trombina. A terceira classe representa os inibidores diretos de coagulação. Inibidores diretos de fator Xa incluem apixaban, edoxaban, otamixaban, rivaroxaban e inibidores diretos da trombina incluem as hirudinas bivalentes (bivalirudina, lepirudina, desirudina) e os compostos monovalentes argatrobano e dabigatrano.
[0004] Como coagulação sanguínea é um mecanismo biológicopara parar o sangramento, um efeito colateral de terapia anticoagulante podem ser eventos de sangramento indesejados. É então desejável prover um antídoto que seja capaz de parar tais eventos de sangramento relacionados com anticoagulante quando eles ocorrem (Zirkria e Ansell, Current Opinion in Hematology 2009, 16(5): 347-356). Um meio de obter isso é através da neutralização da atividade do composto anticoagulante presente no paciente após administração. Antídotos anticoagulantes atualmente disponíveis são protamina (para neutralização de heparina) e vitamina K para neutralização de antagonistas de vitamina K tal como warfarina. Plasma congelado fresco e fator recombinante VIIa foram também usados como antígenos não-específicos em pacientes sob tratamento com heparina de peso molecular baixo, sofrendo de um trauma grande ou hemorragia severa (Lauritzen, B. e outros, Blood, 2005, 607A- 608A). São também relatados fragmentos de protamina (Patente U.S. No. 6.624.141) e peptídeos sintéticos pequenos (Patente U.S. No. 6.200.955) como antídotos para heparina ou heparina de peso molecular baixo; e muteínas de trombina (Patente U.S. No. 6.060.300) como antídotos para inibidor de trombina. Intermediários de pró- trombina e derivados foram relatados como antídotos para a hirudina e inibidores de trombina sintéticos (Patentes U.S. Nos. 5.817.309 e 6.086.871). Para inibidores diretos de fator Xa, análogos de fator Xa inativos foram propostos como antídotos (WO2009042962). Ainda, o fator VIIa recombinante tem sido usado para reverter o efeito de inibidores indiretos de fator Xa dependentes de antitrombina III tais como fondaparinux e idraparinux (Bijsterveld, N.R. e outros, Circulation, 2002, 106: 2550-2554; Bijsterveld, N.R. e outros, British J. of Haematology, 2004 (124): 653-658). Uma revisão de métodos de reversão anticoagulante é provida em Schulman e Bijsterveld, Transfusion Medicine Reviews 2007, 21(1): 37-48.
[0005] Há a necessidade de prover antídotos aperfeiçoados paraterapia anticoagulante, e em particular prover antídotos para inibidores diretos de trombina tal como dabigatrano para os quais quaisquer antídotos específicos foram revelados até agora.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0006] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a umamolécula de anticorpo capaz de neutralizar a atividade de um anticoagulante.
[0007] Em um aspecto adicional, a molécula de anticorpo temespecificidade de ligação para o anticoagulante.
[0008] Em um aspecto adicional, o anticoagulante é um inibidordireto da trombina, um inibidor de Fator Xa ou um antagonista de vitamina K.
[0009] Em um aspecto adicional, o anticoagulante é dabigatrano,argatrobano, melagatrano, ximelagatrano, hirudina, bivalirudina, lepirudina, desirudina, apixaban, otamixabano, edoxabano, rivaroxabano, defibrodita, ramatrobano, antitrombina III ou drotrecogina alfa.
[00010] Em uma modalidade adicional, o anticoagulante é um heterociclo bicíclico dissubstituído de fórmula geralR - A - Het - B - Ar - E ,(I)em queA significa um grupo carbonila ou sulfonila ligado à porção benzo, pirido ou tieno do grupo Het,B significa um grupo etileno onde o grupo metileno ligado ao grupo Ar pode ser substituído por um átomo de oxigênio ou enxofre ou por um grupo -NR1-, ondeR1 significa um átomo de hidrogênio ou um grupo C1-4 alquila,E significa um grupo RbNH-C(=NH)- ondeRb significa um átomo de hidrogênio, um grupo hidróxi, C1-9- alcoxicarbonila, ciclo-hexiloxicarbonila, fenil-C1-3-alcoxicarbonila,benzoíla, p-C1-3-alquil-benzoíla ou piridinoíla, enquanto a porção etóxi na posição 2 do grupo C1-9-alcoxicarbonila mencionado acima pode ser adicionalmente substituída por um grupo C1-3-alquilsulfonila ou 2- (C1-3-alcoxi)-etila,Ar significa um grupo 1,4-fenileno opcionalmente substituído por um átomo de cloro ou por um grupo metila, etila ou metóxi ou ele significa um grupo 2,5-tienileno.
[00011] Het significa um grupo 1-(C1-3-alquil)-2,5-benzimidazolileno, 1-ciclopropil-2,5-benzimidazolileno, 2,5-benzotiazolileno, 1-(C1-3-alquil)- 2,5-indolileno, 1-(C1-3-alquil)-2,5-imidazo[4,5-b]piridinileno, 3-(C1-3-alquil)-2,7-imidazo[1,2-a]piridinileno ou 1-(C1-3-alquil)-2,5-tieno[2,3-d]imidazolileno eRa significa um grupo R2NR3-, ondeR2 é um grupo C1-4-alquila que pode ser substituído por um grupo carbóxi, C1-6-alquiloxicarbonila, benziloxicarbonila, C1-3- alquilsulfonilaminocarbonila ou 1H-tetrazol-5-ila,um grupo C2-4-alquila substituído por um grupo hidróxi, benzilóxi, carbóxi-C1-3-alquilamino, C1-3-alcoxicarbonil-C1-3-alquilamino, N-(C1-3-alquil)-carbóxi-C1-3-alquilamino ou N-(C1-3-alquil)-C1-3-alcoxicarbonil-C1-3-alquilamino, enquanto nos grupos mencionados acima o átomo de carbono na posição α para o átomo de nitrogênio adjacente pode não ser substituído,R3 significa um grupo C3-7-cicloalquila, um grupo propargila, onde a parte insaturada pode não ser ligada diretamente ao átomo de nitrogênio do grupo R2NR3, um grupo fenila opcionalmente substituído por um átomo de flúor ou cloro ou por um grupo metila ou metóxi, um grupo pirazolila, piridazolila ou piridinila opcionalmente substituído por um grupo metila ouR2 e R3 junto com o átomo de nitrogênio entre eles significam um grupo cicloalquilenoimino de 5 a 7 membros, opcionalmente substituído por um grupo carbóxi ou C1-4- alcoxicarbonila, ao qual um anel fenila pode ser adicionalmente fundido,os tautômeros, os estereoisômeros e sais dos mesmos.
[00012] Em uma modalidade adicional, o anticoagulante é um composto selecionado de(a) N-fenil-N-(2-carboxietil)-amida do ácido 2-[N- (4-amidinofenil)-aminometil]-benzotiazol-5-carboxílico,(b) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 2-[N-(4- amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benztiazol-5-il-carboxílico,(c) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1-metil-2- [N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(d) N-fenil-N-(3-hidroxicarbonilpropil)-amida do ácido 1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(e) N-(2-piridil)-N-(hidroxicarbonilmetil)-amida do ácido-1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(f) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1- metil-2-[2-(2-amidinotiofen-5-il)etil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(g) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(h) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1- metil-2-[2-(4-amidinofenil)etil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(i) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1-metil-2- [2-(4-amidinofenil)etil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(j) N-fenil-N-[2-(1H-tetrazol-5-il)etil]-amida do ácido-1-metil-2-[2-(4-amidinofenil)etil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(k) N-fenil-N-[2-(1H-tetrazol-5-il)etil]-amida do ácido 1-metil- 2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(l) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benzimidazol-5-il- carboxílico,(m) N-(3-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benzimidazol-5-il- carboxílico,(n) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1-metil- 2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(o) N-fenil-N-[(N-hidroxicarboniletil-N-metil)-2-aminoetil]-amida do ácido-1-metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol- 5-il-carboxílico,(p) N-(3-fluorfenil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido- 1-metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(q) N-(4-fluorfenil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido- 1-metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(r) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1-metil-2- [N-(4-amidino-2-metóxi-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(s) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1- metil-2-[N-(4-amidino-2-metóxi-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il- carboxílico,(t) N-fenil-N-(2-metoxicarboniletil)-amida do ácido 1-metil-2- [N-(4-amidinofenil)aminometil]-indol-5-il-carboxílico,(u) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1-metil-2- [N-(4-amidinofenil)aminometil]-tieno[2.3-d]imidazol-5-il-carboxílico,(v) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1-metil-2- [N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(w) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida ácido 1-metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(x) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1- metil-2-[N-(4-amidino-2-metóxi-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il- carboxílico,(y) N-(2-piridil)-N-(2-etoxicarboniletil)-amida do ácido-1-metil-2-[N-[4-(N-n-hexiloxicarbonilamidino)fenil]-aminometil]- benzimidazol-5-il-carboxílico, eos tautômeros, estereoisômeros e os sais dos mesmos.
[00013] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo contra dabigatrano, dabigatrano etexilato e/ou uma O-acilglucuronida de dabigatrano.
[00014] Em um aspecto adicional, a molécula de anticorpo é um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um fragmento de um anticorpo, em particular um fragmento Fab, Fab' ou F(ab')2, um anticorpo de cadeia simples, em particular um fragmento variável de cadeia simples (scFv), um anticorpo de domínio, um nanocorpo, um diacorpo ou um DARPin.
[00015] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo conforme descrito acima para uso em Medicina.
[00016] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo conforme acima descrito para uso na terapia ou prevenção de efeitos colaterais de terapia anticoagulante.
[00017] Em um aspecto adicional, o efeito colateral é um evento de sangramento.
[00018] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de tratamento ou prevenção de efeitos colaterais de terapia anticoagulante compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo conforme acima descrito a umpaciente com necessidade do mesmo.
[00019] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit compreendendo uma molécula de anticorpo conforme descrito, junto com um recipiente e um rótulo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00020] Figura 1: Tempo maior para coagulação visto com concentrações altas de dabigatrano usando o ensaio de tempo de coagulação de trombina. A concentração de 200 nM resultou em uma elevação de ~5 vezes em tempo de coagulação com relação à linha de base e foi usada nos primeiro e segundo conjuntos de experimentos. A concentração de 500 nM (supraterapêutica) foi usada no último conjunto de experimentos.
[00021] Figura 2: Quatro anticorpos diferentes para dabigatrano (AD) todos neutralizaram o tempo de coagulação prolongado de dabigatrano em plasma humano. Coagulação de linha de base em plasma humano foi 10,9 segundos, quando dabigatrano 200 nM foi pré-incubado com plasma, coagulação foi prolongada para 51 segundos. Cada anticorpo foi adicionado a plasma pré-incubado com 200 nM de dabigatrano e incubado mais por 5 minutos. O tempo de coagulação de trombina foi então iniciado através da adição de trombina. Cada anticorpo foi capaz de reverter o tempo de coagulação de dabigatrano para graus diferentes. A solução mais concentrada resultou na reversão maior de atividade anticoagulante.
[00022] Figura 3: O efeito de concentrações altas de anticorpo policlonal (anticorpo D) adicionadas a plasma humano que tinha sido pré-incubado com 200 nM de dabigatrano foi medido. Tempo de coagulação de linha de base foi 11 segundos, adição de dabigatrano prolongou a coagulação para 63,7 segundos. O efeito de diluições altas de anticorpo sobre a reversão do tempo de coagulação de trombina prolongado com dabigatrano foi então testado. A concentração menor reduziu o tempo de coagulação de trombina para 43,9 segundos. Concentrações maiores reduziram completamente o tempo de coagulação de trombina para níveis de base e resultaram em neutralização completa do efeito anticoagulante de dabigatrano. Adição de um anticorpo policlonal de coelho não-específico (quadrado) não teve nenhum efeito sobre a reversão do efeito anticoagulante de dabigatrano.
[00023] Figura 4: O efeito de concentrações altas de anticorpo policlonal (anticorpo D) adicionadas a plasma humano que tinha sido pré-incubado com 500 nM de dabigatrano foi medido. Tempo de coagulação de linha de base foi 10,9 segundos, adição desta concentração maior de dabigatrano prolongou a coagulação para 111,7 segundos (aumento ~10 vezes). O efeito de uma diluição 1:2 de anticorpo ou solução de estoque reverteu o tempo de coagulação de trombina prolongado com dabigatrano de uma maneira dependente da concentração. A concentração mais alta também reverteu completamente o tempo de coagulação de trombina para níveis de linha de base e resultou em neutralização completa do efeito anticoagulante até mesmo de concentrações supraterapêuticas de dabigatrano.
[00024] Figura 5: Sequências de regiões variáveis de cadeias pesadas de molécula de anticorpo antidabigatrano.
[00025] Figura 6: Sequências de regiões variáveis de cadeias leves de molécula de anticorpo antidabigatrano.
[00026] Figura 7: Um anticorpo monoclonal de camundongo (Clone 22) reverteu o efeito anticoagulante de dabigatrano em plasma humano e em sangue integral humano. Concentrações altas de anticorpo de camundongo foram adicionadas a plasma humano ou sangue integral que tinham sido pré-incubados com 30 nM de dabigatrano. O ensaio foi iniciado através da adição de 1,5-2 U/mL de trombina e o tempo de coagulação foi medido. A atividade de dabigatrano 100% foi definida como a diferença em tempo de coagulação na presença e na ausência de composto. A dose de anticorpo inibiu dependentemente o prolongamento mediado por dabigatrano de tempo de coagulação.
[00027] Figura 8: Um Fab de camundongo gerado do anticorpo Clone 22 reverte o efeito anticoagulante de dabigatrano em plasma humano. Concentrações altas de Fab de camundongo foram adicionadas a plasma humano que tinha sido pré-incubado com 7 nM de dabigatrano. O anticorpo intacto foi também testado como um controle positivo. O ensaio foi iniciado através da adição de 0,4 U/mL de trombina e o tempo de coagulação foi medido. Inibição de 100% foi definida como o bloqueio completo do aumento mediado por dabigatrano em tempo de coagulação. A dose de Fab inibiu dependentemente o prolongamento induzido por dabigatrano em tempo de coagulação em plasma humano.
[00028] Figura 9: Um anticorpo monoclonal de camundongo (Clone 22) reverte o efeito anticoagulante de acilglucuronida de dabigatrano em plasma humano. Concentrações altas de anticorpo de camundongo foram adicionados a plasma humano que tinha sido pré- incubado com 7 nM de acilglucuronida de dabigatrano ou dabigatrano. O ensaio foi iniciado através da adição de 0,4 U/mL de trombina e o tempo de coagulação foi medido. Inibição de 100% foi definida como o bloqueio completo do aumento mediado pelo composto em tempo de coagulação. A dose de anticorpo inibiu dependentemente o prolongamento induzido por acilglucuronida de dabigatrano em tempo de coagulação em plasma humano.
[00029] Figura 10: Um Fab humanizado (Fab 18/15) reverteu o efeito anticoagulante de dabigatrano em plasma humano. Concentrações altas de Fab 18/15 foram adicionadas a plasma humano que tinha sido pré-incubado com 7 nM de dabigatrano. O ensaio foi iniciado pela adição de 0,4 U/mL de trombina e o tempo de coagulação foi medido. Inibição de 100% foi definida como o bloqueio completo do aumento mediado por dabigatrano em tempo de coagulação. A dose de Fab inibiu dependentemente o prolongamento induzido por dabigatrano em tempo de coagulação em plasma humano.
[00030] Figura 11: O tempo de coagulação de trombina em sangue integral ex vivo (3,0 U/mL de trombina) em ratos recebendo dabigatrano como uma infusão contínua com uma administração de bolo de Fab equimolar em t=0. A linha com círculos sólidos representa tratamento de veículo sem fármaco. A linha com quadrados sólidos representa atividade anticoagulante de dabigatrano sem Fab. A linha com triângulos sólidos representa atividade anticoagulante após administração de Fab. Os dados são expressos como a média ± SE, n=4 animais por grupo de tratamento.
[00031] Figura 12: aPTT de sangue integral ex vivo em ratos recebendo dabigatrano como uma infusão contínua com uma administração de bolo de Fab equimolar em t=0. Os círculos sólidos representam tratamento com veículo sem fármaco. A linha com quadrados sólidos representa atividade anticoagulante de dabigatrano sem Fab. A linha com triângulos sólidos representa atividade anticoagulante após administração de Fab. Os dados são expressos como a média ± SE, n=4 animais por grupo de tratamento.
[00032] Figura 13: O tempo de coagulação de trombina de sangue integral ex vivo (3,0 U/mL de trombina) em ratos recebendo dabigatrano como uma infusão contínua com uma administração de bolo de doses altas de Fab em t=0. A linha com círculos sólidos representa tratamento com veículo sem fármaco. A linha com quadrados sólidos representa atividade anticoagulante de dabigatrano sem Fab. A linha com triângulos sólidos representa atividade anticoagulante após administração equimolar de Fab e a linha pontilhada 50% de dose equimolar. Os dados são expressos como a média ± SE, n=4 animais por grupo de tratamento.
[00033] Figura 14: aPTT de sangue integral ex vivo em ratos recebendo dabigatrano como uma infusão contínua com uma administração de bolo de doses altas de Fab em t=0. Os círculos sólidos representam tratamento com veículo sem fármaco. A linha com quadrados sólidos representa atividade anticoagulante de dabigatrano sem Fab. A linha com triângulos sólidos representa atividade anticoagulante após administração de Fab equimolar e a linha pontilhada 50% da dose equimolar. Os dados são expressos como média ± SE, n=4 animais por grupo de tratamento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00034] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo capaz de neutralizar a atividade de um anticoagulante.
[00035] Anticorpos (também conhecidos como imunoglobulinas, abreviada Ig) são proteínas gama globulina que podem ser encontradas em sangue e outros fluidos corporais de vertebrados e são usados pelo sistema imune para identificar e neutralizar objetos estranhos, tais como bactérias e vírus. Eles são tipicamente feitos de unidades estruturais básicas - cada uma com duas cadeias pesadas grandes e duas cadeias leves pequenas - para formar, por exemplo, monômeros com uma unidade, dímeros com duas unidades ou pentâmeros com cinco unidades. Anticorpos podem se ligar, através de interação não-covalente, a outras moléculas ou estruturas conhecidas como antígenos. Esta ligação é específica no sentido que um anticorpo vai se ligar apenas a uma estrutura específica com alta afinidade. A única parte do antígeno reconhecido por um anticorpo é chamada um epítopo ou determinante antigênico. A parte do anticorpo se ligando ao epítopo é algumas vezes chamada parátopo e reside no chamado domínio variável ou região variável (Fv) do anticorpo. O domínio variável compreende três chamadas regiões de determinação de complementaridade (CDR's) espaçadas por regiões de estrutura principal (RF's).
[00036] Dentro do contexto da presente invenção, referência a CDR's é baseada na definição de Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917), junto com Kabat (E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller e H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)).
[00037] A técnica desenvolveu ainda anticorpos e os tornou ferramentas versáteis em Medicina e tecnologia. Desta maneira, no contexto da presente invenção, os termos "molécula de anticorpo" e "anticorpo" (usados sinonimamente) não incluem anticorpos como eles podem ser encontrados na natureza, compreendendo, por exemplo, duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, ou apenas duas cadeias pesadas como em espécie camelídeo, mas ainda compreendem todas as moléculas compreendendo pelo menos um parátopo com especificidade de ligação para um antígeno e similaridade de estrutura com um domínio variável de uma imunoglobulina.
[00038] Desta maneira, uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um fragmento de um anticorpo, em particular um fragmento Fv, Fab, Fab' ou F(ab')2, um anticorpo de cadeia simples, em particular um fragmento variável de cadeia simples (scFv), um Imunofarmacêutico Modular Pequeno (SMIP) (Small Modular Immunopharmaceutical), um anticorpo de domínio, um nanocorpo, um diacorpo.
[00039] Anticorpos policlonais representam uma coleção de moléculas de anticorpo com sequências de aminoácido diferentes e podem ser obtidos do sangue de vertebrados após imunização com o antígeno através de processos bem conhecidos na técnica.
[00040] Anticorpos monoclonais (mAb ou moAb) são anticorpos monoespecíficos que são idênticos em sequência de aminoácido. Eles podem ser produzidos através de tecnologia de hibridoma a partir de uma linhagem de célula híbrida (chamado hibridoma) representando um clone de uma fusão de uma célula B de produção de anticorpo específica com uma célula mieloma (câncer de célula B) (Kohler, G., Milstein, C. "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature 1975;256:495-7.). Alternativamente, anticorpos monoclonais podem ser produzidos através de expressão recombinante em células hospedeiro (Norderhaug, L., Olafsen, T., Michaelsen, T.E., Sandlie, I. (Maio, 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells."J Immunol Methods 204 (1): 77-87; vide também abaixo).
[00041] Para aplicação em homem, é frequentemente desejável reduzir a imunogenicidade de anticorpos originalmente derivados de outras espécies, tal como camundongo. Isto pode ser feito através da construção de anticorpos quiméricos ou através de um processo chamado "humanização". Neste contexto, um "anticorpo quimérico" é compreendido ser um anticorpo compreendendo uma parte desequência (por exemplo, um domínio variável) derivada de uma espécie (por exemplo, camundongo) fundida a uma parte desequência (por exemplo, os domínios constantes) derivada de uma espécie diferente (por exemplo, humana). Um "anticorpo humanizado"é um anticorpo compreendendo um domínio variável originalmente derivado de uma espécie não-humana, onde certos aminoácidos foram mutados para lembrar a sequência geral deste domínio variável mais proximamente de uma sequência de um domínio variável humano. Métodos de quimerização e humanização de anticorpos são bem conhecidos na técnica (Billetta R., Lobuglio, A.F. "Chimeric antibodies". Int. Rev. Immunol. 1993;10(2-3):165-76; Riechmann, L., Clark M, Waldmann, H., Winter, G. (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature: 332:323.).
[00042] Ainda, foram desenvolvidas tecnologias para criação de anticorpos com base em sequências derivadas do genoma humano, por exemplo, através de exibição de fago ou usando animais transgênicos (WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths e G. Winter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage."J.Mol.Biol., 222, 581-597; Knappik e outros, J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen e L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203; Lonberg, N., Huszar, D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93.; Brüggemann, M., Taussig, M.J. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice". Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.).
[00043] Moléculas de anticorpo de acordo com a presente invenção também incluem fragmentos de imunoglobulinas que retêm propriedades de ligação de antígeno, tais como fragmentos Fab, Fab' ou F(ab')2. Tais fragmentos podem ser obtidos através da fragmentação de imunoglobulinas, por exemplo, através de digestão proteolítica, ou através de expressão recombinante de tais fragmentos. Por exemplo, digestão de imunoglobulina pode ser realizada por meio de técnicas de rotina, por exemplo, usando papaína ou pepsina (WO 94/29348) ou endoproteinase Lys-C (Kleemann e outros, Anal. Chem. 80, 2001-2009, 2008). Digestão com papaína ou Lys-C de anticorpos tipicamente produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, os chamados fragmentos Fab, cada um com um sítio de ligação de antígeno simples, e um fragmento Fc residual. Tratamento com pepsina dá um F(ab')2. Métodos de produção de moléculas de Fab através da expressão recombinante em células hospedeiro são mostrados em mais detalhes abaixo.
[00044] Várias tecnologias foram desenvolvidas para colocação de domínios variáveis de imunoglobulinas, ou moléculas derivadas de tais domínios variáveis, em um contexto molecular diferente. Essas devem ser também consideradas "moléculas de anticorpo" de acordo com a presente invenção. Em geral, essas moléculas de anticorpos são menores em tamanho comparado com imunoglobulinas e podem compreender uma cadeia de aminoácido única ou ser compostas de várias cadeias de aminoácido. Por exemplo, um fragmento variável de cadeia única (scFv) é uma fusão das regiões variáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulinas, ligadas junto com um ligante curto, geralmente serina (S) ou glicina (G) (WO 88/ 01649; WO 91/17271; Huston e outros; International Reviews of Immunology, Volume 10, 1993, 195 - 217). "Single domain antibodies" or „nanobodies" harbour an antigen-binding site in a single Ig-like domain (WO 94/04678; WO 03/050531, Ward e outros, Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6; Revets e outros, Expert Opin. Biol .Ther. 5(1):111-24, 2005). Um ou mais anticorpos de domínio simples com especificidade de ligação para o mesmo antígeno ou um diferente podem ser ligados juntos. Diacorpos são moléculas de anticorpo bivalentes consistindo em duas cadeias de aminoácido compreendendo dois domínios variáveis (WO 94/13804, Holliger e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8). Outros exemplos de moléculas tipo anticorpo são anticorpos da superfamília de imunoglobulina (IgSF; Srinivasan e Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96). Um conceito diferente leva ao chamado Imunofarmacêutico Modular Pequeno (SMIP) que compreende um domínio Fv ligado a domínios de impedimento e efetores de cadeia simples destituídos do domínio constante CH1 (WO 02/056910).
[00045] Em um aspecto adicional, uma molécula de anticorpo da invenção pode até ter apenas relação estrutural remota com um domínio variável de imunoglobulina, ou relação alguma, contanto que ela tenha certas especificidade e afinidade de ligação comparáveis com um domínio variável de imunoglobulina. Tais "imitadores de anticorpo"não imunoglobulina, algumas vezes chamados "proteínas de base", podem ser baseados nos genes de proteína A, nas lipocalinas, um domínio de fibronectina, um domínio de repetição de consenso anquirina e tiorredoxina (Skerra, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18(4): 295-304). Uma modalidade preferida no contexto da presente invenção são proteínas de repetição anquirina projetadas (DARPin's; Steiner e outros, J. Mol. Biol. 2008 Oct 24;382(5): 1211-27; Stumpp, M.T., Amstutz, P. Curr Opin Drug Discov Devel. 2007 Mar;10(2):153-9).
[00046] A molécula de anticorpo pode ser fundida (como uma proteína de fusão) ou de outra maneira ligada (através de ligações covalentes ou não covalentes) a outras entidades de molécula tendo um impacto desejado sobre as propriedades da molécula de anticorpo. Por exemplo, pode ser desejável melhorar as propriedades farmacocinéticas de moléculas de anticorpo, estabilidade, por exemplo, em fluidos do corpo tal como sangue, em particular no caso de anticorpos de cadeia simples ou anticorpos de domínio. Várias tecnologias foram desenvolvidas com relação a isso, em particular para prolongar a meia-vida de tais moléculas de anticorpo na circulação, tal como peguilação (WO 98/25971; WO 98/48837; WO 2004081026), fundindo ou de outro modo ligando covalentemente a molécula de anticorpo a outra molécula de anticorpo tendo afinidade para uma proteína do soro tal como albumina (WO 2004041865; WO2004003019) ou expressão da molécula de anticorpo como proteína de fusão com toda ou parte de uma proteína do soro tal como albumina ou transferrina (WO 01/79258).
[00047] Em um aspecto adicional, a molécula de anticorpo tem especificidade de ligação para o anticoagulante. "Especificidade de ligação"significa que a molécula de anticorpo tem uma afinidade de ligação significantemente maior com o anticoagulante do que com moléculas estruturalmente não relacionadas.
[00048] Afinidade é a interação entre um sítio de ligação de antígeno único em uma molécula de anticorpo e um epítopo único. Ela é expressa pela constante de associação KA = Kass/Kdiss ou a constante de dissociação KD = kdiss/kass.
[00049] Em um aspecto da invenção, o anticorpo se liga ao anticoagulante com uma afinidade, conforme determinado, por exemplo, através de análise de ressonância de plasmon de superfície (Malmqvist, M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.", Curr. Opin. Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.), com um valor KD variando de a partir de 0,1 pM a 100 μM, preferivelmente 1 pM a 100 μM, preferivelmente 1 pM a 1 μM. Afinidade de anticorpo pode ser também medida usando tecnologia de ensaio de exclusão de cinética (KinExA) (Darling, R.J. e Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions."ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657).
[00050] A afinidade de ligação de uma molécula de anticorpo pode ser aumentada através de um processo conhecido como maturação por afinidade (Marks e outros, 1992, Biotechnology 10:779-783; Barbas e outros, 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier e outros 1995, Gene 169:147-155). Anticorpos amadurecidos por afinidade são então compreendidos também na presente invenção.
[00051] Em um aspecto adicional da invenção, a molécula de anticorpo é capaz de neutralizar a atividade do anticoagulante. Isto é, quando da ligação à molécula de anticorpo, o anticoagulante não é mais capaz de exercer sua atividade anticoagulante ou exerce sua atividade em uma magnitude significantemente menor. Preferivelmente, a atividade anticoagulante é diminuída pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes ou 100 vezes quando da ligação ao anticorpo, conforme determinado em um ensaio de atividade que é apropriado para o anticoagulante em questão, particularmente um ensaio de coagulação que é sensível à trombina, tal como o tempo de coagulação de ecarina ou o tempo de coagulação de trombina (H. Bounameaux, Marbet, G.A., Lammle B. e outros. "Monitoring of heparin treatment. Comparison of thrombin time, activated partial thromboplastin time, and plasma heparin concentration, and analysis of the behaviour of antithrombin III". American Journal of Clinical Pathology 1980 74(1): 68-72).
[00052] Para fabricação das moléculas de anticorpo da invenção, o versado na técnica pode escolher de uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica (Norderhaug e outros, J. Immunol. Methods 1997, 204 (1): 77-87; Kipriyanow e Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39- 60, 2004; Shukla e outros, 2007, J. Chromatography B, 848(1): 28-39).
[00053] Anticoagulantes são bem conhecidos na técnica, conforme mostrado acima. Em um aspecto adicional da invenção, o anticoagulante é um inibidor direto da trombina, um inibidor de Fator Xa ou um antagonista de vitamina K. Exemplos de antagonistas de vitamina K são as cumarinas, que incluem warfarina. Exemplos de inibidores predominantemente indiretos de fator Xa são o grupoheparina de substâncias que agem através da ativação de antitrombina III incluindo vários produtos de heparina de peso molecular baixo (bemiparina, certoparina, dalteparina, enoxaparina, nadroparina, parnaparina, reviparina, tinzaparina), certos oligossacarídeos (fondaparinux, idraparinux), heparinoides(danaproide, sulodexida, sulfato de dermatano) e os inibidores diretos de fator Xa (apixabano, otamixabano, rivaroxabano). Exemplos de inibidores de trombina incluem as hirudinas bivalentes (bivalirudina, lepirudina, desirudina) e os compostos monovalentes agatrobano e dabigatrano.
[00054] Desta maneira, em um aspecto adicional, o anticoagulante é dabigatrano, argatrobano, melagatrano, ximelagatrano, hirudina, bivalirudina, lepirudina, desirudina, apixabano, endoxabano, otamixabano, rivaroxabano, defiprotida, ramatrobano, antitrombina III ou drotrecogina alfa.
[00055] Em uma modalidade adicional, o anticoagulante é um heterocíclico bicíclico dissubstituído da fórmula geralR - A - Het - B - Ar - E ,(I)em queA significa um grupo carbonila ou sulfonila ligado à porção benzo, pirido ou tieno do grupo Het,B significa um grupo etileno onde o grupo metileno ligado ao grupo Ar pode ser substituído por um átomo de oxigênio ou enxofre ou por um grupo -NR1-, ondeR1 significa um átomo de hidrogênio ou um grupo C1-4 alquila,E significa um grupo RbNH-C(=NH)- ondeRb significa um átomo de hidrogênio, um grupo hidróxi, C1-9- alcoxicarbonila, ciclo-hexiloxicarbonila, fenil-C1-3-alcoxicarbonila, benzoíla, p-C1-3-alquil-benzoíla ou piridinoíla, enquanto a porção etóxi na posição 2 do grupo C1-9-alcoxicarbonila mencionado acima pode ser adicionalmente substituída por um grupo C1-3-alquilsulfonila ou 2-(C1-3- alcoxi)-etila,Ar significa um grupo 1,4-fenileno opcionalmente substituído por um átomo de cloro ou por um grupo metila, etila ou metóxi ou ele significa um grupo 2,5-tienileno.Het significa um grupo 1-(C1-3-alquil)-2,5-benzimidazolileno, 1-ciclopropil-2,5-benzimidazolileno, 2,5-benzotiazolileno, 1-(C1-3-alquil)- 2,5-indolileno, 1-(C1-3-alquil)-2,5-imidazo[4,5-b]piridinileno, 3-(C1-3-alquil)-2,7-imidazo[1,2-a]piridinileno ou 1-(C1-3-alquil)-2,5-tieno[2,3-d]imidazolileno eRa significa um grupo R2NR3-, ondeR2 é um grupo C1-4-alquila que pode ser substituído por um grupo carbóxi, C1-6-alquiloxicarbonila, benziloxicarbonila, C1-3-alquilsulfonilaminocarbonila ou 1H-tetrazol-5-ila,um grupo C2-4-alquila substituído por um grupo hidróxi, benzilóxi, carbóxi-C1-3-alquilamino, C1-3-alcoxicarbonil-C1-3-alquilamino, N-(C1-3-alquil)-carbóxi-C1-3-alquilamino ou N-(C1-3-alquil)-C1-3-alcoxicarbonil-C1-3-alquilamino, enquanto nos grupos mencionados acima o átomo de carbono na posição α para o átomo de nitrogênio adjacente pode não ser substituído,R3 significa um grupo C3-7-cicloalquila, um grupo propargila, onde a parte insaturada pode não ser ligada diretamente ao átomo de nitrogênio do grupo R2NR3, um grupo fenila opcionalmente substituído por um átomo de flúor ou cloro ou por um grupo metila ou metóxi, um grupo pirazolila, piridazolila ou piridinila opcionalmente substituído por um grupo metila ouR2 e R3 junto com o átomo de nitrogênio entre eles significa um grupo cicloalquilenoimino de 5 a 7 membros, opcionalmente substituído por um grupo carbóxi ou C1-4-alcoxicarbonila, ao qual umanel fenila pode ser adicionalmente fundido,os tautômeros, os estereoisômeros e sais dos mesmos. Compostos de fórmula (I), preparação desses compostos e seu uso como anticoagulantes foram descritos no WO 98/37075.
[00056] Em uma modalidade adicional, o anticoagulante é um composto selecionado de(a) N-fenil-N-(2-carboxietil)-amida do ácido 2-[N- (4-amidinofenil)-aminometil]-benzotiazol-5-carboxílico,(b) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 2-[N-(4- amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benzotiazol-5-il-carboxílico,(c) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1-metil-2- [N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(d) N-fenil-N-(3-hidroxicarbonilpropil)-amida do ácido 1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(e) N-(2-piridil)-N-(hidroxicarbonilmetil)-amida do ácido 1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(f) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1- metil-2-[2-(2-amidinotiofen-5-il)etil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(g) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(h) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida ácido 1-metil- 2-[2-(4-amidinofenil)etil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(i) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida ácido 1-metil-2-[2- (4-amidinofenil)etil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(j) N-fenil-N-[2-(1H-tetrazol-5-il)etil]-amida do ácido 1-metil- 2-[2-(4-amidinofenil)etil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(k) N-fenil-N-[2-(1H-tetrazol-5-il)etil]-amida do ácido 1-metil- 2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(l) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(m) N-(3-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benzimidazol-5-il- carboxílico,(n) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1-metil- 2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(o) N-fenil-N-[(N-hidroxicarboniletil-N-metil)-2-aminoetil]-amida do ácido-1-metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol- 5-il-carboxílico,(p) N-(3-fluorfenil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido- 1-metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(q) N-(4-fluorfenil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1-metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(r) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1-metil-2- [N-(4-amidino-2-metóxi-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(s) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1- metil-2-[N-(4-amidino-2-metóxi-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il- carboxílico,(t) N-fenil-N-(2-metoxicarboniletil)-amida do ácido-1-metil-2- [N-(4-amidinofenil)aminometil]-indol-5-il-carboxílico,(u) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1-metil-2- [N-(4-amidinofenil)aminometil]-tieno[2.3-d]imidazol-5-il-carboxílico,(v) N-fenil-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1-metil-2- [N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(w) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1- metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico,(x) N-(2-piridil)-N-(2-hidroxicarboniletil)-amida do ácido 1- metil-2-[N-(4-amidino-2-metóxi-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il- carboxílico,(y) N-(2-piridil)-N-(2-etoxicarboniletil)-amida do ácido 1- metil-2-[N-[4-(N-n-hexiloxicarbonilamidino)fenil]-aminometil]- benzimidazol-5-il-carboxílico, eos tautômeros, estereoisômeros e os sais dos mesmos, todos foram descritos no WO 98/37075.
[00057] Um anticoagulante preferido no contexto da presente invenção é dabigatrano (CAS 211914-51-1, N-[2-(4-Amidinofenilaminometil)-1-metil-1H-benzimidazol-5-ilcarbonil]-N-(2- piridil)-beta-alanina) tendo a fórmula química (III):
Figure img0001
[00058] Dabigatrano é conhecido do WO 98/37075, que revela compostos com um efeito de inibição de trombina e o efeito de prolongamento do tempo da trombina, sob o nome N-(2-piridil)-N-(2- hidroxicarboniletil)-amida do ácido-1-metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-carboxílico. Vide também Hauel e outros, J. Med. Chem. 2002, 45 (9): 1757-66.
[00059] Dabigatrano é aplicado como um pró-fármaco de fórmula (III):
Figure img0002
[00060] O composto de fórmula III (chamado dabigatrano etexilato, CAS 211915-06-9; etil 3-[(2-{[4-(hexiloxicarbonilamino-imino-metil)- fenilamino]-metil}-1-metil-1H-benzimidazol-5-carbonil)-piridin-2-il- amino]-propionato) é convertido no composto ativo (II) após entrar no corpo. Um polimorfo preferido de dabigatrano etexilato é mesilato de dabigatrano etexilato.
[00061] As principais indicações para dabigatrano são a prevenção pós-operatória de trombose de veia profunda, o tratamento de trombose de veia profunda estabelecida e a prevenção de derrames em pacientes com fibrilação atrial (Eriksson e outros, Lancet 2007, 370 (9591): 949-56; Schulman, S. e outros, N. Engl. J. Med. 2009, 361 (24): 2342-52; Connolly S. e outros, N. Engl. J. Med. 2009, 361 (12): 1139-51; Wallentin e outros, Lancet 2010, 376 (9745): 975-983).
[00062] No corpo humano, glucuronidação da porção carboxilato é o curso metabólico humano principal de dabigatrano (Ebner e outros, Drug Metab. Dispos. 2010, 38(9):1567-75). Ele resulta na formação da 1-O-acilglucuronida (anômero beta). A 1-O-acilglucuronida, em adição à hidrólise menor do aglicon, pode sofrer migração de acila não- enzimática em solução aquosa, resultando na formação das 2-O-, 3-O- e 4-O-acilglucuronidas. Experimentos com a 1-O-acilglucuronida purificada e seus produtos de rearranjo isoméricos revelaram prolongamento equipotente do tempo de tromboplastina parcial ativado comparado com dabigatrano.
[00063] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo se liga a ambos o dabigatrano e o dabigatrano etexilato.
[00064] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo se liga a ambos o dabigatrano e as O-acilglucuronidas de dabigatrano, em particular a 1-O-acilglucuronida de dabigatrano.
[00065] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo se liga ainda às 2-O-, 3-O- e 4-O-acilglucuronidas de dabigatrano.
[00066] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é capaz de neutralizar a atividade de dabigatrano e O-acilglucuronidasde dabigatrano, em particular a 1-O-acilglucuronida de dabigatrano.
[00067] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo tem especificidade de ligação para dabigatrano e compreende sequências de CDR conforme mostrado nas figuras 5 e 6.
[00068] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende sequências de CDR de cadeia pesada conforme mostrado na figura 5 e sequências de CDR de cadeia leve conforme mostrado na figura 6.
[00069] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada conforme mostrado na figura 5 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve conforme mostrado na figura 6.
[00070] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada mostrada com a designação DBG 13 VH na figura 5 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve conforme mostrado com a designação DBG 13 VK na figura 6.
[00071] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada mostrada com a designação DBG 14 VH na figura 5 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve conforme mostrado com a designação DBG 14 VK na figura 6.
[00072] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada mostrada com a designação DBG 22 VH na figura 5 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve conforme mostrado com a designação DBG VK na figura 6.
[00073] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada mostrada com a designação Egn VH No. 14 na figura 5 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve conforme mostrado com a designação Egn VK No. 11 na figura 6.
[00074] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada mostrada com a designação Eng VH No. 15 na figura 5 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve conforme mostrado com a designação Eng VK No. 17 na figura 6.
[00075] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada mostrada com a designação Eng VH No. 15 na figura 5 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve conforme mostrado com a designação Eng VK No. 18 na figura 6.
[00076] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada mostrada com a designação Eng VH No. 31 na figura 5 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve conforme mostrado com a designação Eng VK No. 18 na figura 6.
[00077] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo tem especificidade de ligação para dabigatrano e compreende um domínio variável de cadeia pesada com uma CDR1 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, uma CDR2 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e uma CDR3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, e um domínio variável de cadeia leve com uma CDR1 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 de SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de SEQ ID NO: 14 e uma CDR3 de SEQ ID NO: 15.
[00078] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada com uma CDR1 de SEQ ID NO:1, uma CDR2 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, uma CDR3 de SEQ ID NO: 10, e um domínio variável de cadeia leve com uma CDR1 de SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de SEQ ID NO: 14 e uma CDR3 de SEQ ID NO: 15.
[00079] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada com uma CDR1 de SEQ ID NO:1, uma CDR2 de SEQ ID NO:7, uma CDR3 de SEQ ID NO:10 e um domínio variável de cadeia leve com uma CDR1 de SEQ ID NO:13, uma CDR2 de SEQ ID NO:14 e uma CDR3 de SEQ ID NO:15.
[00080] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada com uma CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de SEQ ID NO: 5, uma CDR3 de SEQ ID NO: 10, e um domínio variável de cadeia leve com uma CDR1 de SEQ ID NO: 11, uma CDR2 de SEQ ID NO: 14 e uma CDR3 de SEQ ID NO: 15.
[00081] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16, 18, 20, 22, 24 e 26 e um domínio variável de cadeia leve selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 17, 19, 21, 23, 25 e 27.
[00082] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID No: 17.
[00083] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID No: 19.
[00084] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:20, e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID No: 21.
[00085] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID No: 23.
[00086] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID No: 25.
[00087] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID No: 27.
[00088] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID No: 27.
[00089] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de scFv. Neste formato, os domínios variáveis revelados aqui podem ser fundidos uns aos outros com um peptídeo ligante adequado, por exemplo, selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31. O construto pode compreender esses elementos na ordem, do terminal N para o terminal C, (domínio variável de cadeia pesada)-(peptídeo ligante)-(domínio variável de cadeia leve) ou (domínio variável de cadeia leve)-(peptídeo ligante)- (domínio variável de cadeia pesada).
[00090] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de scFv compreendendo SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:33. Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de scFv consistindo em SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:33.
[00091] São conhecidos na técnica processos que permitem a expressão recombinante de ácidos nucleicos codificando construtos de scFv em células hospedeiro (tal como E. coli, Pichia pastoris, ou linhas de célula de mamífero, por exemplo, CHO ou NS0), dando moléculasde scFv funcionais (vide, por exemplo, Rippman e outros, Applied and Environmental Microbiology 1998, 64(12): 4862-4869; Yamawaki eoutros, J. Biosci. Bioeng. 2007, 104(5): 403-407; Sonoda e outros, Protein Expr. Purif. 2010, 70(2): 248-253).
[00092] Em particular, as moléculas de anticorpo scFv da invenção podem ser produzidas como segue. Os construtos podem ser expressos em linhagens de E. coli diferentes tais como W3110, TG1, BL21, BL21(DE3), HMS174, HMS174(DE3), MM294 sob o controle de um promotor induzível. Este promotor pode ser escolhido de lacUV5, tac, T7, trp, trc, T5, araB. Os meios de cultivo são preferivelmente integralmente definidos de acordo com Wilms e outros, 2001(Wilms e outros, Biotechnology and Bioengineering 2001, 73(2): 95-103), DeLisa e outros, 1999 (DeLisa e outros, Biotechnology and Bioengineering 1999, 65(1): 54-64) ou equivalente. No entanto, suplementação do meio de batelada e/ou meio de alimentação com aminoácidos tais como isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina ou componentes de meio complexos tal como peptona de soja ou extrato de levedura pode ser benéfica. O processo para fermentação é realizado em um modo em batelada. Condições: Temperatura 20-40° C, pH 5,5 - 7,5, DO é mantido acima de 20%. Após consumo da fonte de carbono inicial a cultura é alimentada com o meio de alimentação declarado acima (ou equivalente). Quando um peso de célula seco de 40 a 100 g/L é atingido no fermentador a cultura é induzida com um indutor apropriado correspondendo ao sistema promotor usado (por exemplo, IPTG, lactose, arabinose). A indução pode ser ou realizada como uma indução integral pulsada ou como uma indução parcial através da alimentação do respectivo indutor no fermentador durante um período de tempo prolongado ou uma combinação dos mesmos. A fase de produção deve durar 4 horas pelo menos. As células são recuperadas através de centrifugação em centrífugas de bacia, centrífugas de bacia tubulares ou centrífugas de pilha de disco, o sobrenadante de cultura é descartado.
[00093] A massa de célula de E. colié ressuspensa em quantidade de 4 a 8 vezes de tampão de lise (tampão de fosfato ou Tris, pH 78,5). A lise de célula é realizada preferivelmente através de homogeneização de alta pressão seguido por recuperação do pelete através de centrifugação em centrífugas de bacia, bacia tubular ou pilha de disco. Pelete contendo corpos de inclusão de scFv é lavado 23 vezes com Tris 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Ureia 2 M, Triton X-100 0,5%, pH 8,0 seguido por duas etapas de lavagem usando Tris 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0. Corpos de inclusão de scFv são finalmente recuperados através de centrifugação em centrífugas de bacia, bacia tubular ou pilha de disco. Solubilização de corpos de inclusão de scFv pode ser realizada em Glicina/NaOH 100 mM, EDTA 5 mM, ditiotreitol 20 mM, pH 9,5-10,5 contendo agentes caotrópicos tal como Guanidina-HCl 6 M ou Ureia 8-10 mM. Após incubação por 30-60 minutos solução é centrifugada e o sobrenadante contendo a proteína alvo recuperado para redobra subsequente. Redobra é preferivelmente realizada em modo de batelada de alimentação através da diluição da solução de proteína 1:10-1:50 em tampão de redobra para uma concentração de proteína final de 0,1-0,5 mg/ml. Tampão de redobra pode conter Tris 50-100 mM e/ou Glicina 50-100 mM, NaCl 50-150 mM, ureia 1-3 M, arginina 0,5-1, 2-6 mM de sistema redox tal como, por exemplo, cisteína/cistina ou glutationa oxidada/reduzida, pH 9,5-10,5. Após incubação por 24-72 horas a 4° C solução de redobra é opcionalmente filtrada usando um filtro de 0,22 μm, diluído e o pH ajustado para pH 7,0-8,0. A proteína é separada através de cromatografia de troca de cátion em modo de ligação (por exemplo, Toyopearl GigaCap S-650M, SP Sepharose FF ou S HiperCel®) em pH 7,0-8,5. Eluição é realizada através de um gradientede NaCl alto linear. Frações contendo a proteína alvo são agrupadas e subsequentemente separadas em coluna de troca de ânion em modo de não-ligação (por exemplo, Toyopearl GigaCap Q-650M, Q- Sepharose FF, Q HiperCel®) seguido por uma etapa de polimento de troca de cátion (por exemplo, SP Sepharose HP). Frações contendo a proteína alvo com um nível de pureza de minimamente 90% são agrupadas e formuladas através de diafiltragem ou cromatografia de exclusão de tamanho em PBS. Identidade e qualidade de produto da molécula de scFv produzida são analisadas através da redução de SDS-PAGE onde o scFv pode ser detectado em uma faixa maior de aproximadamente 26 kDa. Ensaio adicional para caracterização do scFv inclui espectrometria de massa, RP-HPLC e SE-HPLC.
[00094] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma imunoglobulina, preferivelmente uma imunoglobulina de tipo IgG1, ou inativação da função efetora da mesma, ou IgG4. Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma imunoglobulina tendo uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:40 ou SEQ ID NO:42 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:35 ou SEQ ID NO:43.
[00095] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma imunoglobulina tendo uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:34 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:35 ou uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:40 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:35. Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma imunoglobulina tendo uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:42 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:43.
[00096] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma imunoglobulina tendo uma cadeia pesada consistindo em SEQ ID NO:34 e uma cadeia leve consistindo em SEQ ID NO:35 ou uma cadeia pesada consistindo em SEQ ID NO:40 e uma cadeia leve consistindo em SEQ ID NO:35. Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma imunoglobulina tendo uma cadeia pesada consistindo em SEQ ID NO:542 e uma cadeia leve consistindo em SEQ ID NO:43.
[00097] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de Fab. Neste formato, o domínio variável revelado acima pode ser, cada um, fundido em um domínio constante de imunoglobulina, preferivelmente de origem humana. Desta maneira, o domínio variável de cadeia pesada pode ser fundido a um domínio CH1 (um chamado fragmento Fd) e o domínio variável de cadeia leve pode ser fundido a um domínio CL.
[00098] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de Fab tendo um fragmento Fd compreendendo SEQ ID NO:36 ou SEQ ID NO:38 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:37 ou SEQ ID NO:39. Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de Fab tendo um fragmento Fd compreendendo SEQ ID NO:38 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:39. Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de Fab tendo um fragmento Fd compreendendo SEQ ID NO:41 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:37. Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de Fab tendo um fragmento Fd consistindo em SEQ ID NO:36 e uma cadeia leve consistindo em SEQ ID NO:37. Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de Fab tendo um fragmento Fd consistindo em SEQ ID NO:38 e uma cadeia leve consistindo em SEQ ID NO:39. Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma molécula de Fab tendo um fragmento Fd consistindo em SEQ ID NO:41 e uma cadeia leve consistindo em SEQ ID NO:37.
[00099] Ácidos nucleicos codificando construtos de Fab podem ser usados para expressar tais cadeias pesadas e leves em células hospedeiros, tais como E. coli, Pichia pastoris, ou linhagens de célula de mamífero (por exemplo, CHO ou NS0). São conhecidos na técnica processos que permitem dobra, associação e ligação dissulfeto apropriadas dessas cadeias em moléculas de Fab funcionais compreendendo um fragmento Fd e uma cadeia leve (Burtet e outros, J. Biochem. 2007, 142(6), 665-669; Ning e outros, Biochem. Mol. Biol. 2005, 38: 204-299; Quintero-Hernandez e outros, Mol. Immunol. 2007, 44: 1307-1315; Willems e outros, J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003;786:161-176.).
[000100] Em particular, moléculas de Fab da invenção podem ser produzidas em células CHO como segue. Células CHO-DG44 (Urlaub, G., Kas, E., Carothers, A.M. e Chasin,L.A. (1983). "Deletion of the diploid dihidrofolate reductase locus from cultured mammalian cells."Cell 33, 405-412.) cultivadas em suspensão em meio livre de soro são transfectadas com construtos de expressão codificando cadeias pesada e leve da molécula de Fab usando reagentes Lipofectamine® e Plus® (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após 48 horas, as células são submetidas à seleção em meio contendo 200 μg/mL do antibiótico G418 e sem hipoxantina e timidina para gerar populações de célula estavelmente transfectadas. Esses transfectantes estáveis são subsequentemente submetidos à amplificação de gene através da adição de metotrexato (MTX) em concentrações altas (até 100 ou 400 nM) no meio de cultura. Uma vez as células tendo se adaptado, elas são submetidas a fermentações em batelada durante 10 a 11 dias para produzir material de proteína Fab.
[000101] Culturas de suspensão de células CHO-DG44 e seus transfectantes estáveis são incubadas em meios de cultivo livres de soro, quimicamente definidos. Culturas de estoque em semente são subcultivadas a cada 2-3 dias com densidades de semeadura de 3 x 105 - 2 x 105células/mL, respectivamente. As células são cultivadas em frascos de agitação em incubadores Multitron HT (Infors) em CO2 5%, 37° C e 120 rpm. Para experimentos de alimentação em batelada, as células são semeadas em 3x105 células/mL em frascos de agitação em meio de produção da proprietária Bl sem antibióticos ou MTX. As culturas são agitadas a 120 rpm em 37° C e CO2 5% que é mais tarde reduzido para 2% conforme os números de célula aumentam. Parâmetros de cultura incluindo contagem de célula, viabilidade, pH, concentrações de glicose e lactato são determinados diariamente e o pH é ajustado para pH 7,0 usando carbonato conforme necessário. Solução de alimentação da proprietária Bl é adicionada a cada 24 horas. Amostras do sobrenadante são obtidas em pontos de tempo diferentes para determinar a concentração de produto de Fab através de ELISA. Após 10 a 11 dias, o fluido de cultura celular é coletado através de centrifugação e transferido para os laboratórios de purificação.
[000102] A molécula de Fab é purificada a partir do sobrenadante das culturas em batelada por meio de cromatografia e filtragem. Como etapa de captura primária cromatografia de afinidade, por exemplo, Proteína G ou Proteína L, é aplicada. No caso de afinidades e capacidades de ligação baixas, o Fab é capturado através de cromatografia de troca de cátion (CEX) explorando o PI da molécula. Proteínas e contaminantes de célula hospedeira, por exemplo, DNA ou vírus, são removidos através da adição de etapas de purificação ortogonais adicionais.
[000103] Identidade e qualidade de produto da molécula de Fab produzida são analisadas através de métodos eletroforéticos, por exemplo, SDS-PAGE, através dos quais Fab pode ser detectada como uma faixa principal de aproximadamente 50 kDa. Ensaios adicionais para caracterização do produto de Fab incluem espectrometria de massa, foco isoelétrico e cromatografia de exclusão de tamanho. Atividade de ligação é seguida por análise BIAcore.
[000104] Quantificação de moléculas de Fab ou IgG de comprimento integral no sobrenadante das culturas de célula é realizada através de ensaio imunoabsorvente ligação à enzima intercalada (ELISA). A IgG de comprimento integral pode ser detectada usando anticorpos criados contra fragmento Fc humano (Jackson Immuno Research Laboratories) e cadeia leve kappa humana (conjugada à peroxidase, Sigma). O fragmento Fab é imobilizado por IgG anti-humana policlonal de cabra (H e L, Novus) e detectado através de anticorpos policlonais de ovelha criados contra IgG humana (conjugados à peroxidase, The Binding Site).
[000105] Moléculas de Fab podem ser também geradas a partir de moléculas de anticorpo de comprimento integral através de clivagem enzimática. A vantagem desta abordagem é que processos de plataforma para fermentação e purificação robustas e eficientes são aplicáveis, os quais são condescendentes a aumento e rendimentos altos na qualidade de produto desejada. Para purificação cromatografia por afinidade usando uma resina de Proteína A recombinante pode ser usada como etapa de captura primária que geralmente resulta em purezas altas.
[000106] Para este propósito, as sequências de Fab codificando cadeia pesada são fundidas à região Fc de uma molécula de anticorpo IgG humana. Os construtos de expressão resultantes são então transfectados para células CHO-DG44 cultivadas em suspensão em meio livre de soro usando lipofecção. Após 48 horas, as células são submetidas à seleção em meio contendo 200 μg/mL do antibiótico G418 e sem hipoxantina e timidina para gerar populações de célula estavelmente transfectadas. Esses transfectantes estáveis são subsequentemente submetidos à amplificação de gene através da adição de metotrexato (MTX) em concentrações altas (até 100 ou 400 nM) no meio de cultura. Uma vez as células tendo se adaptado, elas são submetidas a fermentações em batelada durante 10 a 11 dias para produzir material de proteína IgG. A proteína IgG é purificada do sobrenadante de cultura usando cromatografia de afinidade-Proteína A recombinante. Para obter o fragmento Fab de neutralização desejado a IgG de comprimento integral é então incubada na presença de papaína que cliva a IgG dentro da região de união, desta maneira liberando dois fragmentos Fab e a porção Fc. Uma molécula de Fab compreendendo uma cadeia de Fd de SEQ ID NO:41 é um exemplo de uma molécula de Fab obtida através da digestão com papaína de uma proteína IgG de comprimento integral.
[000107] A molécula de Fab é isolada através de cromatografia de afinidade, por exemplo, Proteína G ou Proteína L. Alternativamente, no caso de afinidades e capacidades de ligação baixas, o Fab é capturado através de cromatografia de troca de cátion (CEX) explorando o pI da molécula. Proteínas e contaminantes de célula hospedeira, por exemplo, Papaína, DNA ou vírus, são removidos através de etapas de purificação ortogonais adicionais.
[000108] Em outro aspecto da invenção, a molécula de anticorpo é uma variante de sequência de aminoácido de uma molécula de anticorpo conforme aqui descrito.
[000109] Variantes de sequência de aminoácido de anticorpos podem ser preparadas através da introdução de mudanças de nucleotídeo apropriadas no DNA do anticorpo ou através de síntese de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácido dos anticorpos dos presentes exemplos. Qualquer combinação de deleções, inserções e substituições é feita para chegar ao construto final, contanto que o construto final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácido podem também alterar processos pós-traducionais do anticorpo humanizado ou variante, tal como mudança do número ou posição de sítios de glicosilação.
[000110] Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são locais preferidos para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham e Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos-alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (tipicamente alanina) para realizar a interação dos aminoácidos com antígeno. Essas localizações de aminoácido demonstrando sensibilidade funcional às substituições então são refinadas através da introdução de mais ou outras variantes no, ou para, os sítios de substituição. Desta maneira, embora o sítio para introdução de uma variação de sequência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da mutação per senão precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, mutagênese de varredura ou aleatória de alanina é conduzida no códon ou região-alvo e as variantes de anticorpo expressas são avaliadas quanto à atividade desejada.
[000111] Inserções de sequência de aminoácido incluem fusões amino- e/ou carboxila-terminais variando em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácido simples ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo fundido a um tag de epítopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem uma fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida no soro do anticorpo.
[000112] Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Essas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de FR são também compreendidas. Substituições conservativas são mostradas na Tabela abaixo sob o cabeçalho de "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem em uma mudança em atividade biológica, então as mudanças mais substanciais, chamadas "substituições exemplares", ou como descrito mais abaixo em referência a classes de aminoácido, podem ser introduzidas e os produtos avaliados.Resíduo Substituições Exemplares SubstituiçõesOriginal PreferidasAla (A) val; leu; ile valArg (R) lys; gln; asn lysAsn (N) gln; his; asp, lys; arg glnAsp (D) glu; asn gluCys (C) ser; ala serGln (Q) asn; glu asnGlu (E) asp; gln aspGly (G) ala alaHis (H) arg; asn; gln; lys; argIle (I) leu; val; met; ala; fe; leunorleucina Leu (L) ile; norleucina; val; met; ala; ilefe Lys (K) arg; gln; asn argResíduo Substituições Exemplares SubstituiçõesOriginal PreferidasMet (M) leu; fe; ile leuFe (F) tyr; leu; val; ile; ala; tyrPro (P) ala alaSer (S) thr thrThr (T) ser serTrp (W) tyr; fe tyrTyr (Y) fe;trp; thr; ser feVal (V) leu; ile; met; fe ala; leunorleucina;
[000113] Em química de proteína, é geralmente aceito que as propriedades biológicas do anticorpo possam ser obtidas através da seleção de substituições que sejam bastante diferentes em seu efeito sobre manutenção (a) da estrutura da estrutura principal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helical, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) da massa da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos baseados em propriedades de cadeia lateral comuns:(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, val, leu, ile;(2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr;(3) ácida: asp, glu;(4) básica: asn, gin, his, lys, arg;(5) resíduos que influenciam na orientação de cadeia: gly, pro; e(6) aromática: trp, tyr, phe.
[000114] Substituições não conservativas vão compreender troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[000115] Qualquer resíduo cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo humanizado ou variante pode ser também substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula, prevenir reticulação aberrante ou prover pontos estabelecidos de conjugação a um composto citotóxico ou citostático. Por outro lado, ligação(ões) cisteína(s) pode ser adicionada ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo for um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).
[000116] Um tipo de variante substitucional envolve substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Em geral, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá propriedades biológicas aperfeiçoadas com relação ao anticorpo parental a partir do qual ela(s) é(são) gerada(s). Um meio conveniente para geração de tais variantes substitucionais é maturação por afinidade usando exibição de fago. Em suma, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácido possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpo então geradas são exibidas de uma maneira monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusões com o produto de gene III de M13 embalado dentro de cada partícula. As variantes exibidas em fago são então avaliadas quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). A fim de identificar sítios de região hipervariável candidatos para modificação, mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de região hipervariável contribuindo significantemente para ligação de antígeno. Alternativamente, ou em adição, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo de antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e Dabigatrano humano. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez tais variante sendo geradas, o painel de variantes é submetido à avaliação conforme aqui descrito e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.
[000117] Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por "alterar" significa deletar uma ou mais porções carboidrato encontradas no anticorpo e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.
[000118] Em algumas modalidades, pode ser desejável modificar os anticorpos da invenção para auxiliar sítios de glicosilação. Glicosilação de anticorpo é tipicamente ou N-ligada ou O-ligada. Ligantes N referem-se à ligação da porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desta maneira, a presença de qualquer uma dessas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O- ligada refere-se à ligação de um ou mais açúcares N- acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxâmico, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina possa ser também usada. Desta maneira, a fim de glicosilar uma dada proteína, por exemplo, um anticorpo, a sequência de aminoácido da proteína é engenheirada para conter uma ou mais das sequências tripeptídeo descritas acima (para sítios de ligação N- ligados). A alteração pode ser também feita através da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação N-ligados).
[000119] Moléculas de ácido nucleico codificando variantes de sequência de aminoácido do anticorpo são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação através de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada a sítio), mutagênese por PCR e mutagênese de cassete de uma variante preparada antecipadamente ou uma versão não variante de uma molécula de anticorpo conforme descrito aqui. Conforme acima mostrado, o antígeno da molécula de anticorpo da invenção é um anticoagulante. O antígeno é usado para gerar a molécula de anticorpo, ou através da imunização de um animal, ou através da seleção de sequências de anticorpo das bibliotecas de sequência, como com métodos de exibição de fago.
[000120] Protocolos de imunização para animais são bem conhecidos na técnica. Para obter uma resposta imune apropriada, pode ser necessário combinar o antígeno com um adjuvante, tal como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, esqualeno ou adjuvante completo/incompleto de Freund. Os antígenos no contexto da presente invenção, tal como dabigatrano, são principalmente moléculas orgânicas comparavelmente pequenas, que algumas vezes não estimulam formação de anticorpo quando da administração a um animal. Pode ser então necessário ligar o antígeno a uma macromolécula, como um hapteno.
[000121] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo conforme descrito acima para uso em medicina.
[000122] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de anticorpo conforme descrito antes e um veículo farmacêutico.
[000123] Para ser usada em terapia, a molécula de anticorpo está incluída em composições farmacêuticas apropriadas para facilitar administração a animais ou seres humanos. Formulações típicas da molécula de anticorpo podem ser preparadas misturando a molécula de anticorpo com carreadores, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis, na forma de formulações liofilizadas ou de outro modo secas ou soluções aquosas ou suspensões aquosas ou não aquosas. Carreadores, excipientes, modificadores ou estabilizadores são não tóxicos nas dosagens e concentrações empregadas. Eles incluem sistemas tampão tais como fosfato, citrato, acetato e outros ácidos anorgânicos ou orgânicos e seus sais; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservativos tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool de fenila, butila ou benzila; alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); proteínas, tal como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona ou polietileno glicol (PEG); aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos ou polissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, sacarose, trealose, dextrinas ou dextrano; agentes de quelação tal como EDTA; álcoois de açúcar tal como manitol ou sorbitol; contraíons de formação de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos iônicos ou não-iônicos tais como TWEEN® (polissorbatos), PLURONICS® ou ésteres do ácido graxo, éteres do ácido graxo ou ésteres de açúcar. Também solventes orgânicos podem estar contidos na formulação de anticorpo tal como etanol ou isopropanol. Os excipientes podem também ter uma função de modificação de liberação ou modificação de absorção.
[000124] Em um aspecto, a composição farmacêutica compreende a molécula de anticorpo em uma solução tamponada, aquosa, em uma concentração de 10-20 mg/ml ou um liofilizado feito de tal solução.
[000125] O modo de aplicação preferido é parenteral, através de infusão ou injeção (intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intradermal), mas outros modos de aplicação, tais como inalação, transdermal, intranasal, bucal, oral, podem ser aplicáveis.
[000126] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo conforme descrito acima para uso na terapia ou prevenção de efeitos colaterais de terapia anticoagulante, em particular eventos de sangramento.
[000127] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo conforme acima descrito para uso na reversão de uma superdosagem de um anticoagulante, em particular dabigatrano ou dabigatrano etexilato.
[000128] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo conforme descrito acima para uso como um antídoto de um anticoagulante, em particular dabigatrano ou dabigatrano etexilato.
[000129] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de tratamento ou prevenção de efeitos colaterais de terapia anticoagulante compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo conforme descrito acima a um paciente com necessidade do mesmo.
[000130] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um evento de overdose em terapia anticoagulante compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo conforme acima descrito a um paciente com necessidade do mesmo.
[000131] A "quantidade terapeuticamente eficaz" do anticorpo a ser administrada é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar os efeitos colaterais de terapia anticoagulante, em particular a quantidade mínima que é eficaz para parar o sangramento. Isto pode ser obtido com quantidade estequiométricas de molécula de anticorpo.
[000132] Dabigatrano, por exemplo, pode atingir uma concentração no plasma na magnitude de 200 mM quando dado na dose recomendada. Quando uma molécula de anticorpo monovalente com um peso molecular de cerca de 50 kD é usada, neutralização pode ser obtida, por exemplo, em uma dose de cerca de 1 mg/kg, quando intravenosamente dada como um bolo. Em outra modalidade, a dose de uma molécula de Fab aplicada a um paciente humano pode ser 501000 mg por aplicação, por exemplo, 100, 200, 500, 750 ou 1000 mg. Dependendo da situação, por exemplo, quando dabigatrano foi aplicado em uma overdose em um paciente, pode ser adequado aplicar uma dose ainda maior, por exemplo, 1250, 1500, 1750 ou 2000 mg por aplicação. A dose apropriada pode ser diferente, dependendo do tipo e dose de anticoagulante administração, o tempo decorrido desde tal administração, a natureza da molécula de antígeno, a condição do paciente e outros fatores. O versado na técnica conhece métodos para estabelecer doses que são ambos terapeuticamente eficazes e seguros.
[000133] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo com afinidade de ligação para dabigatrano e/ou dabigatrano etexilato. Preferivelmente, a molécula de anticorpo se liga ao dabigatrano e/ou dabigatrano etexilato com uma afinidade, conforme determinado, por exemplo, através de análise de ressonância de plasmon de superfície (Malmqvist, M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibodyantigen affinity and kinetics. "Curr Opin Immunol. 1993 Abr;5(2):282-6.) ou tecnologia de ensaio de exclusão cinético (KinExA) (Darling, R.J. e Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions."ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dez 2(6): 647-657), com um valor KD variando de a partir de 0,1 pM a 100 μM, preferivelmente 1 pM a 100 μM, mais preferivelmente 1 pM a 1 μM.
[000134] As moléculas de anticorpo da invenção podem ser também usadas para procedimentos analíticos e de diagnóstico, por exemplo, para determinar a concentração de antígeno em amostras tal como plasma, soro ou outros fluidos do corpo. Por exemplo, as moléculas de antígeno podem ser usadas em um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), tais como aqueles descritos nos exemplos. Desta maneira, em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a kits analíticos e de diagnóstico compreendendo moléculas de anticorpo conforme aqui descrito e a respectivos métodos analíticos e de diagnóstico.
[000135] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de fabricação de uma molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações acima compreendendo(a) provisão de uma célula hospedeiro compreendendo um ou mais ácidos nucleicos codificando a dita molécula de anticorpo em associação funcional com um controle de expressão(b) cultivo da dita célula hospedeiro, e(c) recuperação da molécula de anticorpo a partir da cultura de célula.
[000136] A invenção provê ainda um artigo de fabricação e um kit contendo materiais úteis para neutralização de anticoagulantes orais, particularmente inibidores diretos da trombina. O artigo de fabricação compreende um recipiente com um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tal como vidro, metal, plástico ou combinações dos mesmos. O recipiente contém uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo descrito aqui ou dabigatrano, dabigatrano etexilato, um profármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. O agente ativo na composição farmacêutica é o anticorpo particular ou dabigatrano, dabigatrano etexilato, um profármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. O rótulo no recipiente do anticorpo indica que a composição é usada para neutralização ou neutralização parcial de dabigatrano, dabigatrano etexilato, um pró-fármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo in vivo.
[000137] O kit da invenção compreende um ou mais dos recipientes descritos acima. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis a partir de pontos de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso.
[000138] Em uma modalidade da invenção, o kit compreende um anticorpo de qualquer um dos anticorpos descritos aqui ou uma composição farmacêutica do mesmo. Por exemplo, o kit pode compreender (1) qualquer um dos anticorpos descritos aqui ou uma composição farmacêutica do mesmo, (2) um recipiente e (3) um rótulo.
[000139] Em outra modalidade, o kit compreende um anticorpo de qualquer um dos anticorpos descritos aqui ou uma composição farmacêutica do mesmo e dabigatrano, dabigatrano etexilato, um profármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A forma de dabigatrano, dabigatrano etexilato, um pró-fármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode estar na forma de um sólido, líquido ou gel. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável de dabigatrano etexilato é um sal de mesilato. Em ainda outra modalidade preferida, a resistência por unidade de dosagem do dabigatrano, dabigatrano etexilato, profármaco de dabigatrano ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo está entre cerca de 50 mg e cerca de 400 mg, cerca de 75 mg e cerca de 300 mg, cerca de 75 mg e 150 mg ou cerca de 110 mg e cerca de 150 mg, dada uma vez por dia (QD) ou duas vezes por dia (BID). Por exemplo, o kit pode compreender (1) qualquer um dos anticorpos descritos aqui ou uma composição farmacêutica do mesmo, (2) uma composição farmacêutica de dabigatrano, dabigatrano etexilato, um profármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, (3) um recipiente e (4) um rótulo.
[000140] Em uma modalidade alternativa, o kit compreende (1) uma primeira composição farmacêutica compreendendo dabigatrano, dabigatrano etexilato, um profármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, (2) uma segunda composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos descritos aqui ou combinação dos mesmos, (3) instruções para administração separada das ditas primeira e segunda composições farmacêuticas a um paciente, onde as ditas primeira e segunda composições farmacêuticas estão contidas em recipientes separados e a dita segunda composição farmacêutica é administrada a um paciente requerendo neutralização ou neutralização parcial de dabigatrano ou 1- O-acilglucuronia de dabigatrano. A invenção também provê um método de diagnóstico para neutralizar ou parcialmente neutralizar dabigatrano ou 1-O-acilglucuronida de dabigatrano em um paciente sendo tratado com dabigatrano, dabigatrano etexilato, um profármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo compreendendo administrar qualquer um dos anticorpos descritos aqui, uma combinação dos mesmos ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Especificamente, a invenção provê um método para neutralização ou neutralização parcial de dabigatrano ou 1-O- acilglucuronida de dabigatrano em um paciente compreendendo as etapas de (a) confirmação que um paciente estava sendo tratado com dabigatrano, dabigatrano etexilato, um profármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e a quantidade que foi tomada pelo paciente; (b) neutralização de dabigatrano ou 1-O- acilglucuronida com qualquer um dos anticorpos descritos aqui ou combinações dos mesmos antes da realização de um teste ou ensaio de coagulação onde dabigatrano ou a 1-O-actilglucuronida de dabigatrano interferiria com a leitura precisa dos resultados de teste ou ensaio; (c) realização do teste ou ensaio do e coagulação em uma amostra obtida do paciente para determinar o nível de formação de coágulo sem dabigatrano ou 1-O-acilglucuronida de dabigatrano presente; e (d) ajuste de uma quantidade de dabigatrano, dabigatrano etexilato, um pró-fármaco de dabigatrano ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo administrado ao paciente a fim de obter o equilíbrio apropriado entre formação de coágulo e degradação em um paciente. A razão molar de anticorpo para dabigatrano ou 1-O-acilglucuronida de dabigatrano está na razão molar entre 0,1 e 100, preferivelmente entre 0,1 e 10. A leitura precisa do resultado de teste ou ensaio pode ser uma leitura precisa de níveis de fibrinogênio, resistência de proteína C ativada ou testes relacionados.
EXEMPLOS I. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTIDABIGATRANO POLICLONAIS
[000141] Para a produção de anticorpos antidabigatrano policlonais, 3 imunógenos diferentes foram produzidos com dois haptenos diferentes e razões de registro molar diferentes do hapteno e da proteína carreadora (BSA).
[000142] Para a avaliação, um conjugado de enzima de peroxidase de rábano silvestre (HPR) foi produzido e um ensaio imunoabsorvente de enzima (ELISA) desenvolvido.
[000143] Purificação adicional dos anticorpos policlonais foi realizada através de cromatografia de afinidade em proteinase A Sepharose FF.
1. MATERIAIS E MÉTODOS
[000144] Composto de teste (dabigatrano)
Figure img0003
1.1 HAPTENOS USADOS PARA SÍNTESE DE IMUNÓGENO ETRAÇADOR
Figure img0004
1.2 SÍNTESE DE HAPTENOS
[000145] Os haptenos Hapteno1 e Hapteno2 foram sintetizados como segue:Haptenol - [2-(4-Amino-butilcarbamoil)-etil]-fenil-amida do ácido 2-[(4-carbamimidoil-fenilamino)-metil]-1-metil-1H-benzoimidazol- 5-carboxílico
Figure img0005
HN1a - Metil éster do ácido 3-[(4-metilamino-3-nitro-benzoil)-
Figure img0006
fenil-amino]-propiônico
[000146] A uma solução de cloreto do ácido 4-metilamino-3-nitro- benzoico (23,3 mmoles) e metil éster do ácido 3-fenil-amino-propiônico (23,3 mmoles) em 80 mL de tetraidrofurano seco (THF) trietilamina (50,2 mmoles) foi adicionada em gotas sob agitação em temperatura ambiente. Após três horas a mistura de reação foi evaporada até secar, o sólido restante triturado com água e o produto sólido isolado através de filtragem.Rendimento: 99%C18H19N3O5 (357.36)TLC (sílica-gel; Diclorometano/etanol 19:1): Rf = 0,481b - Metil éster do ácido 3-[(3-amino-4-metilamino-benzoil)- fenil-amino]-propiônico
Figure img0007
[000147] O grupo nitro do produto 1a foi reduzido através de hidrogenação em temperatura ambiente em etanol com Pd(10% em carvão) como catalisador.Rendimento: 99%C18H21N3O3 (327,38)TLC (sílica-gel; Diclorometano/etanol 9:1): Rf = 0,23Espectro de massa (ESI): [M+H]+ = 328 1c - Metil éster do ácido 3-({3-[2-(4-ciano-fenilamino)-acetilamino]-4-metilamino-benzoil}-fenil-amino)-propiônico
Figure img0008
[000148] O produto de 1b (23,2 mmoles) e N-(4-ciano-fenil)-glicina (23,2 mmoles) foi acoplado a CDl (23,2 mmoles) em THF seco em temperatura ambiente. Após o término da reação a mistura foi evaporada até secar e o produto bruto foi usado sem purificação adicional.Rendimento: 97%C27H27N5O4 (485,54)Espectro de massa (ESI): [M+H]+ = 4861d - Metil éster do ácido 3-({2-[(4-ciano-fenilamino)-metil]-1-metil-1H-benzoimidazol-5-carbonil}-fenil-amino)-propiônico
Figure img0009
[000149] Uma solução do produto 1c (22,6 mmoles) em 100 mL de ácido acético concentrado foi aquecida para refluxo por uma hora. A solução foi então evaporada até secar, o sólido restante triturado com água e sob agitação o pH foi ajustado para cerca de 8-9. O produto bruto foi isolado através de extração com acetato de etila e purificado através de cromatografia em sílica-gel (eluente: diclorometano/etanol 1:1).Rendimento: 58%C27H25N5O3 (467,52)TLC (sílica-gel; Diclorometano/etanol 9:1): Rf = 0,71Espectro de massa (ESI): [M+H]+ = 4681e - Ácido 3-({2-[(4-ciano-fenilamino)-metil]-1-metil-1H-benzoimidazol-5-carbonil}-fenil-amino)-propiônico
Figure img0010
[000150] A uma solução do produto 1d (13,0 mmoles) em 100 mL de metanol hidróxido de sódio (20,0 mmoles) foi adicionado. A mistura foi agitada por 2,5 horas a 40° C e então evaporada até secar. O sólido restante foi agitado com 100 mL de água e o pH foi ajustado para cerca de 6 com ácido acético concentrado. O produto precipitado foi isolado através de filtragem, lavado com água e seco a 60° C.Rendimento: 88%C26H23N5O3 (453.49)TLC (sílica-gel; Diclorometano/etanol 9:1): Rf = 0,33Espectro de massa (ESI): [M+H]+ = 4541f - terc-Butil éster do ácido {4-[3-({2-[(4-ciano-fenilamino)-metil]-1-metil-1H-benzoimidazol-5-carbonil}-fenil-amino)- propionilamino]-butil}-carbâmico
Figure img0011
[000151] Uma solução do produto de 1e (5,23 mmoles), tetrafluorborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU, 5,23 mmol) e N-metil-morfolina (5,23 mmol) em 20 mL de DMF foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos. Então terc-butil éster do ácido (4-amino-butil)-carbâmico (5,23 mmol) foi adicionado e a mistura agitada em temperatura ambiente por mais 24 horas. A mistura foi então diluída com água (100 mL) e o produto foi isolado através de extração com acetato de etila.Rendimento: 92%C35H41N7O4 (623.75)TLC (sílica-gel; Diclorometano/etanol 9:1): Rf = 0,511g - [2-(4-Amino-butilcarbamoil)-etil]-fenil-amida do ácido 2- [(4-carbamimidoil-fenilamino)-metil]-1-metil-1H-benzoimidazol-5- carboxílico
Figure img0012
[000152] O produto de 1f (4,81 mmoles) foi dissolvido em uma solução saturada de HCl em etanol (250 mL), a mistura foi agitada em temperatura ambiente da noite para o dia e então evaporada até secar a 30° C. A matéria-prima restante foi dissolvida em 200 mL de etanol seco, então carbonato de amônio (48,1 mmoles) foi adicionado e a mistura agitada em temperatura ambiente da noite para o dia. Após evaporação do solvente a matéria-prima restante foi triturada com cerca de 5 mL de etanol, o material não-dissolvido separado através de filtragem e o solvente evaporado a 30° C. O produto foi então dissolvido em 30 mL de água, a solução agitada com cerca de 2 g de carvão, filtrada e evaporada até secar.Rendimento: 90%C30H36N8O2 (540,67)TLC (RP-8 de fase reversa; metanol/solução de NaCl aquosa 5% 9:1): Rf = 0,79Espectro de massa (ESI): [M+H]+ = 541[M+Cl]- = 575/7Hapteno 2 - [2-(2-Amino-etilcarbamoil)-etil]-piridin-2-il-amida do ácido 2-[(4-carbamimidoil-fenilamino)-metil]-1-metil-1H- benzoimidazol-5-carboxílico
Figure img0013
2a - Ácido 3-({2-[(4-ciano-fenilamino)-metil]-1-metil-1H-benzimidazol-5-carbonil}-piridin-2-il-amino)-propiônico
Figure img0014
[000153] A uma solução de hidróxido de sódio (50,0 mmoles) em 500 mL de etanol e 50 mL de água foi adicionado etil éster do ácido 3-({2- [(4-ciano-fenilamino)-metil]-1-metil-1H-benzimidazol-5-carbonil}-piridin- 2-il-amino)-propiônico (41,4 mmol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por três horas, então cerca de 350 mL de etanol foram destilados, cerca de 100 mL de água foram adicionados e o pH foi ajustado para 6. Então dietiléter (50 mL) foi adicionado e a mistura agitada de um dia para o outro. O produto foi isolado através de filtragem e usado sem purificação adicional.Rendimento: 78%C25H22N6O3 (454,48)2b - terc-Butil éster do ácido {2-[3-({2-[(4-ciano-fenilamino)- metil]-1-metil-1H-benzimidazol-5-carbonil}-piridin-2-il-amino)- propionilamino]-etil}-carbâmico
Figure img0015
[000154] Uma solução de produto de 2a (2,20 mmoles), tetrafluorborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU, 2,20 mmoles) e N-metil-morfolina (2,20 mmoles) em tetraidrofurano seco (100 mL) foi agitada em temperatura ambiente por 15 minutos. Então terc-butil éster do ácido (2-amino-etil)-carbâmico (2,20 mmoles) foi adicionado e a mistura agitada em temperatura ambiente por mais 24 horas. A mistura foi então diluída com 40 mL de água, o produto foi isolado através de extração com acetato de etila e purificado através de cromatografia (sílica-gel; diclorometano/metanol 15:1).Rendimento: 61%C32H36N8O4 (596.68)Espectro de massa (ESI): [M+H]+ = 597[M+H]- = 5952c - [2-(2-Amino-etilcarbamoil)-etil]-piridin-2-il-amida do ácido 2-[(4-carbamimidoil-fenilamino)-metil]-1-metil-1H-benzoimidazol- 5-carboxílico
Figure img0016
[000155] O produto de 2b (1,34 mmol) foi adicionado a uma solução de HCl saturada em etanol seco (30 mL). A solução foi agitada em temperatura ambiente por 5 horas, então evaporada até secar a 30° C. Etanol (30 mL) e carbonato de amônio (13,0 mmoles) foram adicionados e a mistura agitada em temperatura ambiente da noite para o dia. O solvente foi então evaporado, o material residual foi triturado 5 vezes com cerca de 4 mL de uma mistura de diclorometano/metanol (30:1), filtrado e evaporado a fim de separar o produto de sais inorgânicos.Rendimento: 27%C27H31N9O2 (513.61)Espectro de massa (ESI): [M+Cl]- = 548/50[M+HCl+Cl]- = 584/6 [M+H]+ = 514 2. AGENTES QUÍMICOS2.1 AGENTES QUÍMICOS PARA SÍNTESE DE REAGENTE
Figure img0017
59/84Petição 870190100866, de 08/10/2019, pág. 66/98AGENTES QUÍMICOS PARA ELISA
Figure img0018
60/84Petição 870190100866, de 08/10/2019, pág. 67/98TAMPÕES PARA ELISA
Figure img0019
61/84Petição 870190100866, de 08/10/2019, pág. 68/98
[000156] Água de um sistema de processamento de água ultrapura Elgastat Maxima-HPLC foi usada para preparar soluções tampão.
3. SÍNTESE DE IMUNÓGENOS
[000157] A fim de estimular o sistema imune de coelhos para produzir anticorpos policlonais contra dabigatrano, três imunógenos (lotes nos. GL256, GL258 e GL262) foram sintetizados através de acoplamento dos haptenos HAPTENO1 e HAPTENO2 à proteína veículo albumina de soro bovino (BSA) usando 1,4-benzoquinona ou 1,1'-carbonil-di-(1,2,4-triazol) como reagente de acoplamento.
[000158] Para a síntese de GL256, 1,4-benzoquinona foi usada como um composto homobifuncional com dois sítios reativos. Primeiro ela reage em um pH ácido com grupos amino em apenas um dos dois sítios e em um pH alcalino no outro sítio com polimerização mínima. GL258 e GL262 foram sintetizados usando 1,1'-carbonil-di-(1,2,4- triazol) como reagente de acoplamento com razões de registro diferentes do hapteno com a proteína veículo.
3.1 SÍNTESE DE GL256
[000159] À solução de 0,75 μMol de BSA em 8,5 mL de tampão de KH2PO4 0,1 M (pH = 4,5), 1,4-benzoquinona 0,416 mMol (em 1,5 mL de etanol) foi adicionada e incubada por 1,5 hora no escuro em temperatura ambiente. Em seguida, a solução passou por uma coluna Sephadex G25 equilibrada em NaCl 0,15M para eliminar o excesso de 1,4-benzoquinona (volume final de 1,25 mL).
[000160] 2,5 mL (0,15 μmol) da solução de BSA purificada foram adicionados lentamente sob agitação a uma solução do hapteno HAPTENO1 525 μMol dissolvido em 2 mL de tampão de NaHCO3/Na2CO3 0,1 M (pH 8,5). Durante a adição da solução de BSA o pH foi ajustado para aproximadamente 8,0. A razão de entrada molar do hapteno e da proteína carreadora era 3500:1.
[000161] Após incubação em temperatura ambiente da noite para o dia o imunógeno foi dialisado 6 vezes contra 1 litro de água destilada. Cromatografia de camada final mostrou que quaisquer pontos de hapteno não-ligado permaneceram nos conjugados hapteno/veículo.
[000162] O imunógeno foi armazenado congelado em alíquotas a - 20° C. O grau de substituição de BSA com hapteno no sobrenadante do imunógeno foi cerca de 1:18 conforme determinado através de espectrometria de absorção de UV a 302 nm. O teor de imunógeno na solução final foi 0,75 mg de GL256/mL.
3.2 Síntese de GL258
[000163] Uma solução de 158 μMol de HAPTENO2 em 6,3 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) foi preparada em temperatura ambiente. 158 μmol de 1,1'-carbonil-di-(1,2,4-triazol) foram adicionados e incubados primeiro por 4 horas a 10° C e em seguida por 30 minutos em temperatura ambiente. A reação química foi checada com cromatografia de camada fina e era cerca de 20-25%. Então 0,75 μMol de BSA foram dissolvidos em 2 mL de NaHCO3 0,13M e 1 mL de N,N- dimetilformamida (MDF) foi adicionado em gotas sob agitação. O pH foi ajustado para aproximadamente 8,3. Em seguida, a solução de hapteno (6,3 mL) e 4 mL de NaHCO3 0,13 M foram adicionados em gotas à solução de BSA sob agitação e o pH foi ajustado para 8,4. A razão de entrada do hapteno e da proteína carreadora foi 210:1 para o imunógeno GL258.
[000164] Após incubação em temperatura ambiente da noite para o dia sob condições de agitação, o imunógeno foi dialisado 6 vezes contra 1 litro de água destilada. Cromatografia de camada fina mostrou que quaisquer pontos de hapteno não ligado permaneceram nos conjugados hapteno-veículo.
[000165] O imunógeno foi armazenado congelado em alíquotas a - 20° C. O grau de substituição de BSA com hapteno no sobrenadante do imunógeno era cerca de 1:5 conforme determinado através deespectrometria de absorção de UV a 302 nm. O teor de imunógeno na solução final foi 0,28 mg de GL258/mL.
3.3 SÍNTESE DE GL262
[000166] Uma solução de 225 μmol de HAPTENO2 em 8,75 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) foi preparada em temperatura ambiente. 225 μMol de 1,1'-carbonil-di-(1,2,4-triazol) foram adicionados e incubados por 4 horas a 10° C. A reação química foi checada com cromatografia de camada fina e era cerca de 20-25° C.
[000167] Então 0,49 μMol de BSA foi dissolvido em 2 mL de NaHCOs 0,13 M e 1 mL de N,N-dimetilformamida (MDF) foi adicionado em gotas sob agitação. O pH foi ajustado para aproximadamente 8,2. Em seguida, a solução de hapteno (8,75 mL) e 6 mL de NaHCO3 0,13 M foram adicionados em gotas à solução de BSA sob agitação e o pH foi ajustado para 8,3. A razão de entrada molar do hapteno e da proteína veículo foi 460:1 para o imunógeno GL262.
[000168] Após incubação em temperatura ambiente da noite para o dia sob condições de agitação, o imunógeno foi dialisado 6 vezes contra 1 litro de água destilada. Cromatografia de camada fina mostrou que quaisquer pontos de hapteno não-ligado permaneceram nos conjugados hapteno-veículo.
[000169] O imunógeno foi armazenado congelado em alíquotas a - 20° C. O grau de substituição de BSA com hapteno no sobrenadante do imunógeno foi cerca de 1:32 conforme determinado através de espectrometria de absorção de UV a 302 nm. O teor de imunógeno na solução final foi 0,71 mg de GL262 / mL.
4. SÍNTESE DE CONJUGADO 4.1 SÍNTESE DE GL261
[000170] Uma solução de 37,4 μMol de HAPTENO2 em 1,5 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) foi preparada em temperatura ambiente. 37,5 μM de 1,1'-carbonil-di-(1,2,4-triazol) foram adicionados e incubados primeiro por 4 horas a 10° C e em seguida por 30 minutos em temperatura ambiente. A reação química foi checada com cromatografia de camada fina e era cerca de 20-25%.
[000171] Então 1,125 μMol da enzima peroxidase de rábano silvestre (HRP) foi dissolvido em 0,4 mL de NaHCO3 0,13 M e 0,267 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) foi adicionado em gotas durante agitação. O pH foi ajustado para aproximadamente 8,2. Em seguida, 0,9 mL da solução de hapteno (22,5 μMoles) e 0,57 mL de NaHCOs foram adicionados em gotas à solução de HRP sob agitação e o pH foi ajustado para 8,4. A razão de entrada molar do hapteno e da HRP foi 20:1 para o conjugado de HRP GL261.
[000172] Após incubação em temperatura ambiente da noite para o dia sob condições de agitação, o conjugado de HRP foi separado dos solventes orgânicos e o excesso de hapteno através de cromatografia em gel. A solução passou por uma coluna Sephadex G25 equilibrada com tampão de fosfato 0,1 M pH 7,0.
[000173] A concentração final de conjugado hapteno-HRP (traçador, 5,64 mg/mL) foi salpicada com BSA dando uma concentração de cerca de 10 mg/mL, um volume igual de glicerina para prevenir congelamento e um cristal de timol para prevenir crescimento bacteriano. A solução traçadora foi marcada como lote no. GL261 e armazenada em alíquotas a -20° C.
[000174] O grau de substituição de HRP com hapteno foi 1:0,2 conforme determinado através de espectroscopia a 302 nm.
[000175] A atividade específica do traçador foi medida em placas de microtitulação bloqueadas com BSA usando o-fenileno-diamina (OPD) como substrato e HRP nativa como material de referência. A mistura de padrões de HRP diluídos ou o conjugado de hapteno-HRP e solução de substrato foram incubados por 30 minutos no escuro, parada com ácido sulfúrico e absorção medida a 490 nm. A atividade restante foi 94% da HRP nativa e a atividade específica a formulação de conjugado em glicerina foi 611 U/mL.Sumário de especificações de traçador:
Figure img0020
5. IMUNIZAÇÃO E PRODUÇÃO DE ANTICORPOS 5.1 IMUNIZAÇÃO DE COELHOS
[000176] Doze coelhos chinchila fêmeas, 3 meses de vida, foram imunizados com uma emulsão de 100 μg de imunógenos GL256, GL258 e GL262 em 0,5 mL de solução de NaCl 0,9% e 0,5 mL de adjuvante completo de Freund (CFA). Várias imunizações de reforço seguiram no mês seguinte. Para a terceira imunização, 0,5 mL de adjuvante de Freund incompleto (IFA) foi usado. Cada imunização foi realizada em quatro sítios subcutâneos e quatro intramusculares.Grupo A - imunógeno GL256Coelho 1 No. 50Coelho 2 No. 51Coelho 3 No. 52Coelho 4 No. 53Grupo B - imunógeno GL258Coelho 5 No. 54Coelho 6 No. 55Coelho 7 No. 56Coelho 8 No. 57Grupo C - imunógeno GL262Coelho 9 No. 46Coelho 10 No. 47Coelho 11 No. 48Coelho 12 No. 49Esquema de ImunizaçãoDia 1 Primeira imunização com 100 μg de imunógeno / mL poranimal em CFADia 29 Segunda imunização com 100 μg de imunógeno / mL por animal em CFADia 57 Terceira imunização com 100 μg de imunógeno / mL por animal em IFAo estado do coelho de saudável poderia mudar para o piorcom o uso de imunógenos GL256 e GL258coelho 7 No. 56 não foi tratadoDia 67 Primeiro sangramento (2 mL por animal)Dia 81 Quarta imunização com 100 μg de imunógeno / mL poranimal em CFADia 91 Segundo sangramento (25 mL por animal)Dia112 Quinta imunização com 100 μg de imunógeno /mL poranimal em CFADia 122 Transferência dos números dos animais foi feita em lugar erradoTerceiro sangramento final (Exsanguinação)
5.2 ANÁLISE DE SOROS DE COELHO
[000177] Soro foi preparado através de centrifugação do sangue de coelho coagulado. Uma fração de proteína foi obtida através de precipitação com sulfato de amônio e dessalinização através de uma coluna Sephadex G25.
[000178] As frações de proteína individuais de soros de coelho foram avaliadas quanto a título de antidabigatrano através de um procedimento ELISA padrão.Avaliação ELISA:
Figure img0021
Figure img0022
5.3 DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTIDABIGATRANO EM SOROS DE COELHO
[000179] As três últimas colunas: valores são para dabigatranoSangramento 2
Figure img0023
Figure img0024
Figure img0025
Sangramento final
Figure img0026
Figure img0027
Figure img0028
[000180] Após avaliação das frações de proteína de todos os coelhos do sangramento 2, ficou óbvio que o coelho no. 5 (no. 54) tinha o título mais alto de anticorpos antidabigatrano com o hapteno preferido HAPTENO2. Ainda, foi possível deslocar o traçador dos sítios de ligação de anticorpo com apenas concentrações baixas de analito (dabigatrano).
[000181] Para avaliação do sangramento final 3, o deslocamento do traçador do sítio de ligação de anticorpo com concentrações baixas de analito (dabigatrano) foi usado como critério de decisão principal, por causa da falta de informação sobre o imunógeno usado. Desta maneira os coelhos nos. 2, 3 e 5 foram usados para purificação adicional.
5.4 PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS
[000182] O antissoro de coelho no. 5 (no. 54) do sangramento no. 2 e coelhos nos. 2, 3 e 5 do sangramento no. 3 (sangramento final) foi precipitado com sulfato de amônio. O precipitado foi centrifugado por 30 minutos a 10° C a 4500 U/min, separado da solução e redissolvido em tampão de Tris. Este procedimento foi repetido. Purificação adicional foi realizada através de cromatografia de afinidade sem proteína A Sepharose FF. O tampão da coluna era Tris 0,01 M pH 7,5 e glicina 0,1 M pH = 3,0 foi usada para eluição. Frações contendo a IgG de coelho foram combinadas. A concentração de proteína foi determinada através de espectroscopia de UV a 280 nm. Sumário de especificações de anticorpo:
Figure img0029
II. Neutralização de dabigatrano
[000183] Duas séries de experimento foram realizadas para mostrar o efeito dos anticorpos contra atividade anticoagulante de dabigatrano in vitro. Os quatro anticorpos policlonais foram recebidos no laboratório e testados mais em plasma humano. Este foi testado no ensaio funcional, o tempo de coagulação de trombina.Descrição do ensaio:
[000184] Rapidamente plasma humano é obtido absorvendo sangue integral em citrato de sódio 3,13%. Isto é então centrifugado para obter plasma livre de pelete e transferido para um tubo separado e congelado até necessário no dia do ensaio. O plasma é descongelado a 37° C no dia do ensaio.
[000185] O tempo de coagulação de trombina é realizado como segue. Primeiro trombina é diluída para especificação do fabricante (3 UI/mL de trombina) no tampão provido (Dabe Behring Test kit) e preaquecida para 37° C. Ela é usada dentro de 2 horas de ser preparada. Todos os ensaios foram realizados em uma máquina de coagulação CL4 comercialmente disponível (Behnk Eletronics, Nordestadt, Alemanha). Cinquenta μL de plasma são pipetados nos cadinhos providos com um agitador magnético e deixados agitar por 2 minutos na cavidade preaquecida para 37° C na máquina CL4. Neste ponto 100 μL da solução de trombina são adicionados e o tempo requerido para a amostra de plasma coagular é registrado automaticamente pela CL4. Dabigatrano é pré-incubado por 5 minutos em plasma nos cadinhos providos, antes da adição de trombina e início da medição. Se anticorpo for também testado (até 50 μL de solução de estoque), há mais 5 minutos de incubação a 37° C antes de começar a coagulação (isto é, incubação total de 10 minutos com dabigatrano, 5 minutos de incubação total e então coagulação é iniciada com trombina).
[000186] Inicialmente uma curva-padrão de dabigatrano foi realizada através da adição de concentrações altas de dabigatrano a plasma humano e medição do tempo para coagulação após adição de trombina (figura 1). Houve um aumento dependente da concentração no tempo de coagulação com trombina com concentrações altas de dabigatrano.
[000187] Para o primeiro conjunto de experimentos de neutralização, uma concentração clinicamente relevante de 200 nM de dabigatrano foi adicionada a todas as amostras de plasma para neutralização. Todas as 4 preparações de anticorpo foram capazes de encurtar o tempo para coagulação em plasma contendo dabigatrano (figura 2). A extensão de neutralização foi relacionada à concentração de proteína em cada preparação de anticorpo. A solução de anticorpo com a concentração mais alta (D) foi então serialmente diluída e testada quanto à habilidade em neutralizar 200 nM de atividade anticoagulante de dabigatrano em um conjunto de experimentos separado. Pode ser visto na figura 3, houve uma inibição dependente da concentração de atividade anticoagulante induzida por dabigatrano com concentrações altas de anticorpo. Ainda, quando um anticorpo policlonal de coelho não-específico (quadrado azul) foi adicionado ao plasma contendo dabigatrano, ele não teve nenhuma habilidade em neutralizar a atividade anticoagulante. A dependência da concentração e a falta de neutralização de um anticorpo não específico indica que a reversão de anticoagulação pelo anticorpo é específica para dabigatrano.
[000188] No entanto, essas concentrações de dabigatrano são clinicamente relevantes, e sangramento ou overdosesvão provavelmente ocorrer com concentrações maiores. Desta maneira, a habilidade de um anticorpo em inibir a atividade anticoagulante da concentração mais alta de dabigatrano (500 nM) na curva padrão na Figura 1 foi também testada. A figura 4 ilustra que o anticorpo D poderia também inibir concentrações altas de dabigatrano.
III. PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTIDABIGATRANO MONOCLONAIS 1. Produção de anticorpos antidabigatrano monoclonais e Fabs
[000189] Os camundongos foram imunizados com Hapteno1 (vide Exemplo 1.1) conjugado a proteínas carreadoras tais comohemocianina e imunoglobulina e hibridomas foram gerados de acordo com procedimentos padrão. Anticorpos monoclonais purificados dos sobrenadantes de cultura se ligaram a conjugados de dabigatrano- proteína e esta ligação poderia ser competida com dabigatrano em solução com inibição metade-máximo em concentrações na faixa de 1 a 10 nM. Fabs foram gerados através de clivagem com papaína dos anticorpos monoclonais com eliminação subsequente do domínio Fc pela Proteína A.
[000190] As regiões variáveis das cadeias pesada e leve dos anticorpos de camundongo foram clonadas e sequenciadas usando métodos padrão. As sequências foram confirmadas através de análise de proteína através de espectrometria de massa e sequenciamento N- terminal dos anticorpos. Construtos de DNA codificando anticorpos quiméricos compreendendo as regiões variáveis de camundongo específicas e regiões constantes de IgG humanas foram gerados e proteína foi expressa em células HEK 293T e purificada.
2. Caracterização de anticorpos antidabigatrano monoclonais e Fabs
[000191] As sequências dos domínios variáveis dos três clones de anticorpo monoclonal são mostradas nas figuras 5 e 6. As sequências de aminoácido dos domínios variáveis do clone 13 são mostradas na figura 5 (DBG 13 VH, cadeia pesada, SEQ ID NO:16) e na figura 6 (DBG 13 VK, cadeia leve, SEQ ID NO:17). As sequências de aminoácido dos domínios variáveis do clone 14 são mostradas na figura 5 (DBG 14 VH, cadeia pesada, SEQ ID NO:18) e na figura 6 (DBG 14 VK, cadeia leve, SEQ ID NO:19). As sequências de aminoácido dos domínios variáveis do clone 22 são mostradas na figura 5 (DBG 22 VH, cadeia pesada, SEQ ID NO:20) e na figura 6 (DBG 22 VK, cadeia leve, SEQ ID NO:21).
[000192] O anticorpo monoclonal de camundongo clone 22 foi testado quanto à sua habilidade em neutralizar atividade anticoagulante de dabigatrano em plasma humano no ensaio de tempo de coagulação de trombina mostrado no Exemplo II. O anticorpo reverteu completamente o prolongamento mediado por dabigatrano de coagulação dependente de trombina em plasma humano de uma maneira dependente da dose (figura 7). O anticorpo também inibiu eficazmente função do dabigatrano em sangue integral humano. Um Fab gerado a partir deste anticorpo bloqueou atividade de dabigatrano em plasma humano demonstrando que domínios de ligação de antígeno monovalentes podem neutralizar atividade anticoagulante do composto (figura 8).
[000193] O curso metabólico principal de dabigatrano em humanos é através da glucuronidação da porção carboxilato. Dabigatrano acilglucuronidas foram mostradas ser farmacologicamente ativas (Ebner e outros, Drug Metab. Dispos. 2010, 38(9):1567-75). Paratestar se o anticorpo monoclonal de camundongo clone 22 poderia neutralizar esses metabolitos, dabigatrano acilglucuronidas foram purificadas da urina de macacos rhesus tratados com dabigatrano e avaliadas no ensaio de tempo de coagulação de trombina. A dose de anticorpo reverteu dependentemente o prolongamento mediado por dabigatrano acilglucuronida de coagulação dependente de trombina em plasma humano com potência similar àquela vista com dabigatrano (figura 9). Desta maneira o anticorpo é eficaz no bloqueio da atividade anticoagulante de metabolitos de dabigatrano encontrados em seres humanos.
[000194] As afinidades de Fab e dos anticorpos quiméricos camundongo-humano compreendendo os domínios variáveis de clones 22, 13 e 14 e regiões constantes de imunoglobulina humana (região constante de cadeia leve: SEQ ID NO:4; região constante de cadeia pesada: SEQ ID NO:45) foram determinadas usando tecnologia Kinexa. Uma concentração constante de Fab ou anticorpo quimérico foi incubada com várias concentrações de dabigatrano até equilíbrio ser atingido. Após esta incubação a concentração do anticorpo livre foi determinada através da captura do anticorpo em contas Neutravidin acopladas a análogo de dabigatrano conjugado à Biotina. O Fab capturado foi detectado com um fragmento F(ab')2 (específico de Fab) de IgG anti-camundongo marcado com FITC. Os anticorpos quiméricos capturados foram detectados com uma IgG anti-humana conjugada com Cy5. As constantes de dissociação foram calculadas usando um modelo de ligação 1:1. Os resultados desses experimentos são sumarizados na tabela abaixo.Afinidade de anticorpos antidabigatrano
Figure img0030
[000195] Ambos o Fab e os anticorpos quiméricos se ligam a dabigatrano com alta afinidade.
3. Geração de anticorpos antidabigatrano monoclonais humanizados e Fabs
[000196] A fim de reduzir a imunogenicidade potencial seguindo administração no homem, os anticorpos monoclonais de camundongo foram 'humanizados'. Sequências de estrutura principal humanas foram selecionadas para os camundongos principais com base na homologia de estrutura principal, estrutura de CDR, resíduos canônicos conservados, resíduos de packing de interface conservados e outros parâmetros. A substituição específica de resíduos de aminoácido nessas posições de estrutura principal pode melhorar vários aspectos de desempenho de anticorpo incluindo afinidade e/ou estabilidade de ligação, com relação àqueles demonstrados em anticorpos humanizados formados por "troca direta" de CDRs ou HVLs nas regiões de estrutura principal de linha germinativa humana. Fabs que mostram ligação melhor ou igual e expressão aperfeiçoada comparado com Fab quimérico de origem foram selecionados para caracterização adicional. As sequências de aminoácido dos domínios variáveis dos Fabs humanizados são mostradas na figura 5 (Eng VH 14, SEQ ID NO:22; ENG VH 15, SEQ ID NO: 24; e ENG VH 31, SEQ ID NO: 26) e na figura 6 (Eng VK 11, SEQ ID NO: 23; ENG VK 17, SEQ ID NO: 25; e ENG VK 18, SEQ ID NO: 27). Um Fab compreendendo Eng VH 15 e Eng VK 18 (cadeia leve: SEQ ID NO: 37; cadeia pesada: SEQ ID NO: 36) foi diretamente expresso em células CHO e purificado usando seleção de capa e resinas de Proteína G.
[000197] O Fab compreendendo Eng VH 15 e Eng VK 18 foi também convertido em uma IgG de comprimento integral no formato IgG1KO (cadeia leve: SEQ ID NO:35; cadeia pesada: SEQ ID NO:40). IgG1KO (inativação de funções efetoras) tem duas mutações na região Fc, Leu234Ala e Leu235Ala, que reduziram a função efetora tal como FcgR e ligação de complemento. O formato de IgG é descrito na literatura (vide, por exemplo, Hezareh e outros (2001) Journal of Virology, 75: 12161-12168). Os anticorpos antidabigatranohumanizados incluem opcionalmente substituições de aminoácido especificas nas regiões de consenso ou de estrutura principal de linha germinativa. O anticorpo 18/15 foi expresso em células HEK 293T ou células CHO e purificado. Fragmentos Fab foram gerados ou através de clivagem com Lys-C ou papaína do anticorpo intacto e purificados com eliminação do domínio Fc através da Proteína A.
4. Caracterização de Fabs antidabigatrano
[000198] Fragmento Fab 18/15 gerado através de clivagem com Lys- C do anticorpo intacto foi testado quanto à sua habilidade em neutralizar a atividade anticoagulante de dabigatrano em plasma humano no ensaio de tempo de coagulação de trombina mostrado no Exemplo II. O Fab reverteu completamente o prolongamento mediado por dabigatrano de coagulação dependente de trombina em plasma humano de uma maneira dependente da dose com uma IC50 de 2,6 nM (figura 10). O fragmento Fab diretamente expresso e o fragmento Fab gerado através de clivagem com papaína do anticorpo intacto também neutralizaram atividade anticoagulante de dabigatrano com IC50's de 2,6 e 2,7, respectivamente.
[000199] As afinidades de Fab 18/15 gerado através de clivagem com Lys-C do anticorpo intacto e do Fab diretamente expresso foram determinadas em um instrumento BIAcore utilizando tecnologia SPR. Os FABs foram pré-incubados com concentrações altas de dabigatrano por 30 minutos em temperatura ambiente. A mistura foi fluida por cima de um sensor revestido com análogo de dabigatrano conjugado à biotina imobilizado e a ligação do Fab livre foi monitorada. Usando este projeto de ensaio de competição de solução, os valores KD dos Fabs para dabigatrano foram determinados ser 0,16 pM para os Fabs gerados por Lys-C e 0,45 pM para os diretamente expressos. Experimentos in vivo com Fab gerado através de clivagem com papaína
[000200] Ratos (Wistar machos, ~300 g) foram anestesiados com pentobarbital como um bolo (60 mg/kg i.p.) e uma infusão contínua para manutenção da anestesia (20 mg/kg i.p.) e foram postos em uma almofada de aquecimento a 37° C para manter a temperatura interna do corpo. A artéria carótida foi isolada e canulada para amostragem de sangue e a veia jugular direita para administração de substância. Dabigatrano foi iniciado como um bolo (0,3 μM/kg) e seguido por uma infusão (0,1 μM/kg/h) durante 20 minutos para obter níveis de plasma de estado uniforme. Após 20 minutos, o Fab foi injetado i.v. como um bolo simples em concentrações equimolares ou metade equimolares através da veia jugular esquerda. Amostras de sangue (diluição 1/10 em citrato de sódio 3,13%) são obtidas na linha de base (-20, -2 min) e em intervalos variáveis por 30 minutos pós-injeção de Fab.
[000201] Os efeitos anticoagulantes de dabigatrano foram medidos como tempos de coagulação de sangue integral, incluindo o tempo de trombina (TT) e tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT). Em suma, o tempo de trombina é apresentado em um coagulômetro através da adição de 50 μL de sangue integral em uma cavidade que é preaquecida para 37° C. Trombina (Siemens Healthcare, Marburg, Alemanha) em concentrações de 3,0 U/mL é adicionada (volume de 100 μL) e o tempo requerido para coagular a amostra é medido. O aPTT de sangue integral é apresentado preaquecendo 50 μL de sangue integral para 37° C em um coagulômetro e adicionando 50 μL de reagente de aPTT (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) por 3 minutos. O tempo de coagulação é iniciado adicionando 50 μL de cloreto de cálcio preaquecido (37° C) 0,025M. O tempo requerido para coagular a amostra de sangue integral é então registrado.
[000202] Os resultados de 18/15 Fab (cadeia leve: SEQ ID NO:37, fragmento Fc de cadeia pesada: SEQ ID NO:41; produzido através de clivagem com papaína de imunoglobulina integral expressa em células CHO) dado como uma injeção i.v. única em uma dose equimolar de dabigatrano são mostrados nas figuras 11 e 12. Houve uma inibição rápida, quase imediata, de atividade anticoagulante de dabigatrano, medida ambos como TT (figura 11) e aPTT (figura 12) neste modelo.Dentro de um minuto de injeção, a atividade anticoagulante de dabigatrano foi completamente neutralizada de volta para os níveis de linha de base. Isto foi mantido por mais de 20 minutos, apesar da infusão contínua em andamento de dabigatrano i.v.
[000203] Quando a dose menor, metade da dose molar, de dabigatrano foi dada, houve também uma redução inicial de ambos o TT (figura 13) e o aPTT (figura 14). Isto, no entanto, não foi mantido a não ser pela dose maior sob as condições da infusão de dabigatrano contínua em andamento.
[000204] Desta maneira, esses resultados demonstram uma neutralização previsível, dependente da dose e muito rápida da atividade anticoagulante de dabigatrano após uma administração i.v. única de Fab antidabigatrano neste modelo animal.

Claims (8)

1. Molécula de anticorpo caracterizada pelo fato de que tem especificidade de ligação para dabigatran e que compreende um domínio variável de cadeia pesada com uma CDR1 de SEQ ID NO:1, uma CDR2 de SEQ ID NO:7, uma CDR3 de SEQ ID NO:10 e um domínio variável de cadeia leve com uma CDR1 de SEQ ID NO:13, uma CDR2 de SEQ ID NO:14 e uma CDR3 de SEQ ID NO:15.
2. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 27.
3. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um fragmento de um anticorpo, em particular um fragmento Fab, Fab' ou F(ab')2, um anticorpo de cadeia simples, em particular um fragmento variável de cadeia simples (scFv), um Imunofarmacêutico Modular Pequeno (SMIP) ou um diacorpo.
4. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que é um scFv, em que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável leve são ligados um ao outro através de um peptídeo ligante selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:31.
5. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que apresenta uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:40 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:35.
6. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é uma molécula de Fab tendo um fragmento Fd compreendendo SEQ ID NO:36 ou SEQ ID NO:41 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:37.
7. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que tem um fragmento Fd compreendendo SEQ ID NO:36 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:37.
8. Método de fabricação de uma molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) provisão de uma célula hospedeira compreendendo um ou mais ácidos nucleicos codificando a dita molécula de anticorpo em associação funcional com uma sequência de controle de expressão,(b) cultivo da dita célula hospedeira, e(c) recuperação da molécula de anticorpo a partir da cultura de célula.
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