DE19605126A1

DE19605126A1 - Thrombinmuteine als Antidot für Thrombininhibitoren

Info

Publication number: DE19605126A1
Application number: DE19605126A
Authority: DE
Inventors: Claus Dr Bollschweiler; Martin Dr Schmidt; Martin Dr Raditsch; Klaus Dr Ruebsamen; Hans Wolfgang Dr Hoeffken; Juergen Dr Schweden; Thomas Dr Friedrich
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1996-02-12
Publication date: 1997-08-14
Also published as: HUP9900574A2; ZA971107B; NO983677L; US6060300A; HRP970077A2; AR005797A1; KR19990082479A; NO983677D0; CZ247798A3; EP0880591A1; IL125077A0; CA2245546A1; CO4600682A1; BR9707280A; CN1211280A; WO1997029198A1; JPH11512621A; AU1768497A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Thrombinmuteine, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Antidot für Thrombin inhibitoren.

Antikoagulantien, die nach dem Prinzip der direkten Thrombinhem mung wirken, gewinnen für eine antithrombotische Therapie zuneh mend an Bedeutung. Eine zwingende Voraussetzung für eine breite Anwendung von Antikoagulantien ist die Möglichkeit, die Wirkung bei Überdosierungen, bei einem gestörten Abbau oder einer ver langsamten Ausscheidung zu neutralisieren, um so die dann drohen den hämorrhagischen Nebenwirkungen, wie z B. Blutungen im Bereich des Peritoneums, des Pericards, der Pleura zu unterbinden. Wäh rend bei Heparin mit Protaminsulfat, Polylysin und Platelet Fac tor 4 hochwirksame Antidote zu Verfügung stehen, fehlt derzeit ein für die Anwendung am Menschen geeignetes Antidot zur Neutra lisierung von Thrombininhibitoren.

In der Literatur werden verschiedene Antidotprinzipien beschrie ben. Fareed diskutiert aktivierte Plasmafraktionen wie z. B. Au toplex-Präparate oder FEIBA als Prinzip zur Neutralisierung von Hirudin: Sie sind jedoch wegen der thromboplastinähnlichen Aktivität für eine Neutralisierung ungeeignet. (Fareed, Fed Proc 1989; 3: A 328; Walenga Sem. Thromb. Hemost. 1989; 15: 316-333).

Markwardt (Thrombosis Research, Vol 74, No 1, pp1-23, 1994) be schreibt die Verwendung von Thrombinen und Thrombinderivaten. Beispiele hierfür sind -Thrombin, Thrombin-2-Macroglobulin- Kom plexe und Meizothrombin. Beschrieben wird auch der der Einsatz von chemisch inaktivierten Thrombinen wie z. B. DFP-Thrombin oder Benzoyl-Thrombin für die Neutralisierung von Hirudin (Markwardt, Pharmazie 1989; 44; 648-649).

Diese Präparate sind jedoch als Antidot für eine Anwendung am Menschen wegen der Gerinnungsaktivität und der bis zu 1000fach geringeren Affinität zu Hirudin ungeeignet: (F. Doyle in Methods Enzymol; Vol. 222, pp299 ff, Moriata in Methods Enzymol; Vol 80, pp 303 ff, Stone et al. Biochemistry; 1987, 26, 4617-4624, Markwardt, Pharmazie; 44, 1989, pp 648-649).

Humanes Thrombin ist bekannt und wird bei Davie et al. (Biochemi try, Vol 22, 1983, pp2087-2097) beschrieben. Die Aminosäure sequenz des humanen Thrombins ist auch in SEQ ID NO:14 angegeben.

In der Literatur finden sich verschiedene Zählweisen für die hu mane Thrombinsequenz, weshalb im folgenden - wenn nicht anders angegeben - die Zählweise bzgl. SEQ ID NO:14 benützt wird.

Ein gentechnisch hergestelltes, enzymatisch inaktives Thrombin wird von Lentz (Lentz et al, JBC; Vol 266, No 15, pp 9598-9604) beschrieben. Hier führt der Austausch des für die Katalyse not wendigen Serin Restes an Position 205 (Position 241 in SEQ ID NO:14) gegen Alanin zu einer enzymatisch inaktiven Thrombinva riante, die keine Spaltungsaktivität gegenüber synthetischen Sub straten und dem natürlichen Substrat Fibrinogen aufweist (Lentz et al, JBC Vol 266, Nr. 15, Seite 9598-9604), aber eine niedri gere Bindungsaffinität gegenüber dem Thrombininhibitor Dansylar ginin-N-(3-Ethyl-1,5-Pentanediyl)amid aufweist.

Aus Arbeiten von Stone et al. (Biochemistry; Vol 30, 6392-6397) ist die natürliche Thrombinvariante Quick II bekannt. Quick II- Thrombin unterscheidet sich lediglich an der Position 238 (Posi tion 274 in SEQ ID NO:14) vom natürlichen Thrombin. Hier ist der im natürlichen Thrombin vorkommende Glycinrest 238 gegen den hy drophoben Rest Valin mutiert. Dieser geringfügige Austausch in der P1-Tasche des Enzyms führt zu einer deutlich reduzierten Spaltungsrate für Fibrinogen (2% der ursprünglichen Aktivität) und gleichzeitig zu einer drastischen Verminderung der Bindung sowohl von niedermolekularen Substraten als auch von Hirudin. Stone zeigte, daß die Bindungskonstante dieses Muteines für Hirudin sich um mehr als einen Faktor 1000 verschlechtert hat und erklärt dieses Ergebnis sowohl mit einer sterischen Blockie rung der Bindetasche als auch mit einer konformellen Reorganisa tion der Umgebung des aktiven Zentrums.

Die bisher bekannten Thrombinmuteine sind als Antidot für Thrombininhibitoren nicht geeignet, da sie entweder eine zu ge ringe Affinität zum Thrombininhibitor aufweisen oder eine zu hohe Bindung und enzymatische Aktivität bezüglich Fibrinogen besitzen.

Es bestand daher die Aufgabe, neue Thrombinmuteine bereitzustel len, die enzymatisch weitgehend inaktiv sind, eine gute Bindung des Thrombininhibitors aufweisen und gleichzeitig das natürliche Substrat Fibrionogen mit geringerer Affinität binden als das unmodifiziertes Thrombin.

Gegenstand der Erfindung sind Thrombinmuteine, die gegenüber dem natürlichen Thrombin folgende Sequenzunterschiede aufweisen

(a) Austausch eines Gly nach Ala, wobei sich das Gly in der Se quenzumgebung Tyr-Gly-Phe befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO: 14) die Position 274 besitzt;
(b) mindestens einen Austausch oder eine Deletion der folgenden Reste
(b1) His, das sich in der Sequenzumgebung Ala-His-Cys befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO: 14) die Posi tion 79 besitzt;
(b2) Asp, das sich in der Sequenzumgebung Arg-Asp-Ile befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Posi tion 135 besitzt;
(b3) Ser, das sich in der Sequenzumgebung Asp-Ser-Gly befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO: 14) die Posi tion 241 besitzt;

Die neuen Thrombinmuteine können ausgehend von bekannten natürli chen Thrombinen wie etwa Thrombin vom Menschen, und anderen Säu gern, beispielsweise Primaten, Rind, Schwein, Hund, Katze, Maus, Ratte, hergestellt werden. Unter natürlichem Thrombin ist eine Polypeptidsequenz zu verstehen, die Thrombinaktivität besitzt und natürlicherweise in einem Organismus vorkommt.

Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine können auch ausgehend von bekannten Proteolyseprodukten des Thrombin hergestellt werden, beispielsweise β-Thrombin, γ-Thrombin, ω-Thrombin oder auch Vor stufen des Thrombins wie Prothrombin, Prothrombin-Intermediate oder auch Meizothrombine, die dann ggf. durch geeignete Spaltungs methoden beispielsweise mittels Faktor Xa, Fraktionen des Schlan gengiftes aus Echis carinatus oder auch Oxyranus scutellatus in die aktiven Thrombinmoleküle überführt werden können.

Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine sind geeignet zur Neutrali sierung von Hirudin, Hirudinderivaten oder anderen Thrombin inhibitoren.

Bevorzugt ist die gentechnische Herstellung, bei der ein entspre chendes Gen für das Thrombinmutein hergestellt wird und dieses Gen in einem geeigneten Wirtsorganismus exprimiert wird.

Die neuen Thrombinmuteine besitzen gegenüber natürlichem Thrombin mindestens zwei Sequenzunterschiede, wobei der erste Unterschied ein Austausch eines Glycinrestes zu einem Alaninrest ist. Die Po sition des Austausches ist abhängig von Herkunft des natürlichen Ausgangsthrombins unterschiedlich. Es handelt sich jedoch um die Glycinposition, die sich in der Sequenzumgebung Tyr-Gly-Phe be findet und die im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Position 274 besitzt.

Der zweite Sequenzunterschied ist entweder ein Austausch oder eine Deletion eines Aminosäurerestes an einer der drei Positionen (His, Asp, Ser), die die katalytische Triade der Protease Thrombin bilden. Diese Positionen sind beim natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Positionen 79 für His, 135 für Asp und 241 für Ser. Bei anderen nicht-humanen Thrombinen können diese Positionen abhängig von der Gesamtlänge des Moleküls etwas verschoben sein. Die Sequenzumgebung, d. h. die Aminosäurereste vor und nach der entsprechenden Aminosäure ist jedoch bei den Throm binen konserviert und daher ist es leicht möglich, die genaue Po sition des entsprechenden Aminosäurerestes anhand der Sequenzum gebung festzulegen.

Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine können auch mehrere Verän derungen (Deletionen oder Substitutionen) an der katalytischen Triade besitzen. Bevorzugt sind Thrombinmuteine, die eine ein zige Veränderung an der katalytischen Triade aufweisen.

Bevorzugte Veränderungen sind solche bei denen Substitutionen der Aminosäuren der katalytischen Triade vorgenommen wurden. Bevor zugte Substitutionen für den Histidinrest sind solche durch po lare oder hydrophobe Aminosäuren, insbesondere durch Phe, Tyr, Ala oder Val. Der Aspartatrest wird bevorzugt durch andere polare Aminosäuren, beispielsweise Gln oder Asn substituiert.

Besonders bevorzugt sind Thrombinmuteine, bei denen der Serinrest verändert wird, insbesondere Substitutionen des Serins durch Ami nosäuren, die keine Hydroxyfunktion besitzen, insbesondere sol che, die eine ähnliche Raumerfüllung wie Ser besitzen. Ganz be sonders wird die Substitution Ser nach Ala bevorzugt.

Die Thrombinmuteine können in ihrer Wirksamkeit weiter verbessert werden durch das Einbringen weiterer Veränderungen des Moleküls. So ist z. B. denkbar, daß die proteolytische Stabilität weiter verbessert wird, um beispielsweise eine längere Wirkdauer in vivo zu ermöglichen. Hier können beispielsweise die basischen Reste Arg 109, Lys 181, Arg 106 oder Arg 98 (SEQ ID NO:14) gegen eine andere nicht basische Aminosäure ausgetauscht werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, insbesondere DNA Sequenzen, die für die beschriebenen Thrombinmu teine codieren. Diese lassen sich leicht durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz in die entsprechende DNA-Sequenz gemäß dem genetischen Code ermitteln. Bevorzugt verwendet man solche Co dons, die im gewünschten Wirtsorganismus zu einer guten Expres sion führen.

Die Nukleinsäuresequenz können entweder ausgehend von der natür lichen Thrombingensequenz durch ortsspezifische Mutagenese oder auch vollsynthetisch durch DNA-Synthese hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine eignen sich vor besonders als Antidot für Thrombininhibitoren wie Hirudine, Hirudinderivate und niedermolekulare Thrombininhibitorern.

Hirudine sind ursprünglich aus Blutegeln isolierte Proteine, be stehend aus 65 Aminosäuren, die sich durch eine extrem hohe Affi nität zum Thrombin (ki = 10^-12 Mol/l) und hervorragende Selektivität für Thrombin auszeichnen. Die Wirksamkeit von Hirudinen ist sowohl im Tierexperiment als auch beim Menschen ge zeigt. Neben den ursprünglich isolierten Hirudinen gibt es auch zahlreiche Hirudinmuteine und auch Isohirudine, die gegenüber dem natürlichen Hirudin Sequenzveränderungen aufweisen. Unter Hirudine sind daher neben den natürlichen Hirudinen auch solche Hirudine zu verstehen, die ein oder mehrere Sequenzveränderungen bezogen auf das Hirudin aus Hirudo medicinalis tragen und die mindestens eine gleichgroße Affinität zum Thrombin besitzen.

Hirudine sind leicht mit Hilfe von gentechnischen Methoden zug änglich. Ihre Halbwertszeit beträgt beim Menschen etwa 45 Minu ten.

Bekannt sind auch Derivate des Hirudins bei dem durch chemische Modifikation die Pharmakokinetik des Hirudins modifiziert wurde. Markwardt beschreibt Konjugate aus Dextran und Hirudin mit ver längerter Wirkdauer. Aus EP 345616, EP 502962 und EP 557199 sind langwirksame Polymer-Konjugate bekannt. In WO 9515183 werden langwirksame hydrophobe Hirudin-Derivate beschrieben. Depot-For men sowie langwirksame Hirudin-Dimere (WO 9504823) sind ebenfalls bekannt. Weitere Thrombininhibitoren sind niedermolekulare Thrombininhibitoren, die beispielsweise aus EP 236164, DE 28 01 478, EP 293881 oder EP 185390 bekannt sind.

Weitere Thrombininhibitoren sind rekombinant hergestellte Desul fato-Hirudine, Hirudin-Muteine, Polymer-modifizierte Hirudine wie z. B. Dextran-Hirudine, PEG-Hirudine, hydrophob derivatisierte Hirudine sowie Hirudin-Muteine mit verlängerter Wirkdauer.

Weiterhin können die neuen Thrombine eingesetzt werden zur Anta gonisierung von Hirudisinen, verkürzten Hirudinen, sowie von Hirudin und dessen Teilsequenzen abgeleiteten Hirudin-Analogen wie z. B. Niruloge oder C-terminalen Hirudinpeptiden. Neutrali siert werden können auch andere peptidische Thrombininhibitoren, die z. B. aus blutsaugenden Organismen beschrieben wurden und nach gentechnischer Herstellung zur Therapie eingesetzt werden, wie z. B. Rhodniin; Infestin.

Beispiele für neutralisierbare Thrombininhibitoren sind auch syn thetische, vorzugsweise niedermolekulare Thrombininhibitoren, wie beispielsweise Derivate des Tripeptids D-Phe-Pro-Arg, NAPAP, Bo ronsäurederivate, Arginale oder Benzamidinderivate.

Die erfindungsgemäße Verwendung als Antidot ist auf alle der vor stehenden Thrombininhibitoren anwendbar.

Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine neutralisieren die Thrombininhibitoren besser als die bislang beschriebenen Prinzi pien zur Neutralisierung von Thrombinibhibitoren. Die erfindungs gemäßen Thrombine sind selbst bei einer Überdosierung sicher in der Anwendung, und ermöglichen daher in Notfallsituationen eine schnelle und wirkungsvolle Neutralisierung der Thrombin inhibitoren.

Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine liegen in einer für eine parenterale Verabreichung, d. h. für die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung geeigneten Form vor. Die intrave nöse Verabreichung ist bevorzugt. Gegebenenfalls können die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine auch als Dauerinfusion verab reicht werden. Die Menge des zu verabreichenden inaktiven Thrombins richtet sich z. B. nach dem Ausmaß der Überdosierung, dem Körpergewicht und der gewählten Verabreichungsform ab. Das Ausmaß der Überdosierung kann von einem Fachmann vor oder auch während der Thrombinanwendung durch geeignete Tests ermittelt werden.

Die erfindungsgemäßen Thrombinmuteine sind mit Hilfe von gentech nischen Methoden herstellbar. Bevorzugt ist die gentechnische Herstellung einer Vorläuferform des Thrombinmuteins (analog zum Prothrombin) aus der das Thrombinmutein mittels proteolytischer Aktivierung freigesetzt wird.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Er findung, ohne diese jedoch einzuschränken.

Prothrombin wurde nach der Publikation von Degen et al (Biochemie 1983, 22, S. 2087-97) aus einer humanen Leber cDNA Bank klo niert.

Durch gezielte Mutagenese im Thrombinteil wurden die erfindungs gemäßen Muteine hergestellt.

Beispiel 1 Herstellung von Ala₅₅₈ Prothrombin

Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon GGC für die Aminosäure (As)Glycin in Position 558 (Position 274 in SEQ ID NO:14) des hu manen Prothrombin zum Codon GCC für die As Ala mutiert.

Hierzu wurden das Oligonukleotid SEQ ID NO: 5 in Sinnrichtung des Gens und das dazu komplementäre Oligonukleotid SEQ ID NO: 6 in Gegensinnrichtung mit dem entsprechenden Nukleotidaustausch syn thetisiert. Entsprechend dem 5′Ende des Prothrombingens wurde in Sinnrichtung das Oligonukleotid SEQ ID NO: 1 synthetisiert. Die sem wurde am 5′Ende zusätzlich die Sequenz für die Restriktions schnittstelle Eco R1 angefügt. Entsprechend dem 3′ Ende des Pro thrombingens wurde in Gegensinnrichtung das Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 synthetisiert und diesem am 5′Ende ebenfalls die Sequenz für die Restriktionsschnittstelle Eco R1 angefügt.

Mit 50 ng der humanen Prothrombin cDNA als Template und jeweils 50 pMol der Oligos SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 2 wurde nach Zu gabe von 2nM dNTPs, Polymerasepuffer und Pfu-Polymerase ( Strata gene) eine PCR Reaktion mit 35 Zyklen zu je 1 min bei 94°C, 2 min bei 55°C und 3 min bei 72°C durchgeführt. Dem entsprechend wurde eine zweite PCR mit dem gleichen Template und den Oligos SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 1 durchgeführt. Die beiden so entstandenen DNA-Fragmente wurden nach einer Standardvorschrift (PCR purifi cation kit, Quiagen, Hilden) aufgereinigt. Je 0,1 pMol der bei den Fragmente wurden zusammengegeben, für 5 min auf 95°C zur Dena turierung erhitzt und 1 h bei Raumtemperatur zur Renaturierung gehalten. Um den vollständigen DNA-Doppelstrang zu erzielen, wur den nach Zugabe von 2 nM dNTPs, Polymerasepuffer und Pfu Polymerase 10 Zyklen bei je 1 min 94°C und 5 min 72°C durchge führt. Zur Amplifikation des Vollängenfragments wurden dem Ansatz für eine weitere PCR je 50 pMol der außenliegenden Oligos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 zugegeben und nach nochmaliger Zugabe von Pfu-Polymerase 35 Zyklen zu je 1 min bei 94°C, 2 min bei 55°C und 3 min bei 72°C durchgeführt. Die so hergestellte mutierte Prothrombin cDNA mit dem Austausch von Gly nach Ala in Position 558 wurde nach Standardvorschrift aufgereinigt, mit der Restriktionsendonuklease Eco R1 nachgeschnitten und mit einer T4-Ligase nach Standardvorschrift in den ebenfalls Eco R1 ge schnittenen Vektor pUC 18 (Pharmacia Biotech Europe GmbH, Frei burg) kloniert. Zu Kontrolle wurde die DNA sequenziert.

Beispiel 2 Herstellung von Ala 525, Ala 558 Prothrombin

Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon AGT für die As Ser in Position 525 (Position 241 in SEQ ID NO: 14) des humanen Prothrombin zum Codon GCT für die As Ala und das Codon GGC für die As Gly in Position 558 (Position 274 in SEQ ID NO:14) zum Codon GCC für die As Ala mutiert.

Hierzu wurde auf Basis der Prothrombinmutein DNA aus Beispiel 1 und dem Oligo SEQ ID NO: 3 mit dem entsprechenden Nukleotidau stausch zum Ala an der Position 525 in Sinnrichtung sowie dem Oligo SEQ ID NO: 2 (3′Ende Prothrombin) eine PCR durchgeführt. Die Versuchsbedingungen entsprachen denen aus Beispiel 1. Eine zweite PCR wurde mit dem zu SEQ ID NO: 3 komplementären Oligo SEQ ID NO: 4 und dem Oligo SEQ ID NO: 1 (5′Ende Prothrombin) durchge führt. Die so erzielten DNA Fragmente wurden denaturiert, hybri disiert, zum Doppelstrang aufgefüllt und dann entsprechend Bei spiel 1 eine weitere PCR mit den außenliegenden Oligos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 durchgeführt.

Die so hergestellte Prothombin-Mutein cDNA wurde aufgereinigt, mit Eco R1 nachgeschnitten, in den Vektor pUC 18 kloniert und zu Kontrolle sequenziert.

Beispiel 3 Herstellung von Ala 363, Ala 558 Prothrombin

Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon AGT für die As His in Position 363 (Position 79 in SEQ ID NO:14) des humanen Prothrombin zum Codon GCA für die As Ala und das Codon GGC für die AS Gly in Position 558 (Position 274 in SEQ ID NO:14) zum Codon GCC für die As Ala mutiert.

Hierzu wurde auf Basis der Prothrombinmutein DNA aus Beispiel 1 und dem Oligo SEQ ID NO:10 mit dem entsprechenden Nukleotidau stausch zum Ala an der Position 363 in Sinnrichtung sowie dem Oligo SEQ ID NO: 2 (3′Ende Prothrombin) eine PCR durchgeführt.

Die Versuchsbedingungen entsprachen denen aus Beispiel 1. Eine zweite PCR wurde mit dem zu SEQ ID NO: 10 komplementären Oligo SEQ ID NO:11 und dem Oligo SEQ ID NO: 1 (5′Ende Prothrombin) durchgeführt. Die so erzielten DNA Fragmente wurden denaturiert, hybridisiert, zum Doppelstrang aufgefüllt und dann entsprechend Beispiel 1 eine weitere PCR mit den außenliegenden Oligos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 durchgeführt.

Beispiel 4 Herstellung von Asn 419, Ala 558 Prothrombin

Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon GAC für die As Asp in Position 419 (Position 135 in SEQ ID NO:14) des humanen Prothrombin zum Codon GCA für die As Asn und das Codon GGC für die AS Gly in Position 558 (Position 274 in SEQ ID NO:14) zum Co don GCC für die As Ala mutiert.

Hierzu wurde auf Basis der Prothrombinmutein DNA aus Beispiel 1 und dem Oligo SEQ ID NO: 12 mit dem entsprechenden Nukleotidau stausch zum Asn an der Position 419 in Sinnrichtung sowie dem Oligo SEQ ID NO: 2 (3′Ende Prothrombin) eine PCR durchgeführt. Die Versuchsbedingungen entsprachen denen aus Beispiel 1. Eine zweite PCR wurde mit dem zu SEQ ID NO: 12 komplementären Oligo SEQ ID NO: 13 und dem Oligo SEQ ID NO: 1 (5′Ende Prothrombin) durchgeführt. Die so erzielten DNA Fragmente wurden denaturiert, hybridisiert, zum Doppelstrang aufgefüllt und dann entsprechend Beispiel 1 eine weitere PCR mit den außenliegenden Oligos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 durchgeführt.

Beispiel 5 Herstellung von Ala525-Prothrombin

Durch gezielte Mutagenese wurde das Codon AGT für die As Ser in Position 525 (Position 241 in SEQ ID NO: 14) des humanen Prothrombin zum Codon GCT für die As Ala mutiert.

Hierzu wurde auf Basis der Prothrombin-DNA und dem Oligo SEQ ID NO: 3 mit dem entsprechenden Nukleotidaustausch zum Ala an der Position 525 in Sinnrichtung sowie dem Oligo SEQ ID NO: 2 (3′Ende Prothrombin) eine PCR durchgeführt. Eine zweite PCR wurde mit dem zu SEQ ID NO: 3 komplementären Oligo SEQ ID NO: 4 und dem Oligo SEQ ID NO: 1 (5′Ende Prothrombin) durchgeführt. Die so erzielten DNA Fragmente wurden denaturiert, hybridisiert, zum Doppelstrang aufgefüllt und dann eine weitere PCR mit den außenliegenden Oli gos SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 durchgeführt.

Beispiel 6 Konstruktion von Expressionsvektoren für humane Prothrombin muteine

Zur sekretorischen rekombinanten Expression in CHO Säugerzellen wurde an die 5′Enden der mutierten Prothrombin cDNAs (siehe Bei spiel 1 bis 5) die Sektretionsleader Sequenz des humanen tPA Gens angefügt (Pennica et al Nature 301, 214-221, 1983). Ausgehend von einer tPA cDNA wurde mit den synthetischen Oligonukleotiden SEQ ID NO: 9 (5′Ende des tPA leaders und Eco R1 Stelle) sowie SEQ ID NO: 8 (3′Ende tPA-Leader, 5′Ende Prothrombin) die tPA-Sektre tionsleader cDNA auf Basis PCR amplifiziert. Mit dem zu SEQ ID NO: 8 komplementären Oligo SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 2 wurden jeweils die mutierten Prothrombinmuteinfragmente amplifiziert. Die tPA-leader-Fragmente wurden zu den jeweiligen Prothrombinmu teinfragmenten zugegeben. Die Ansätze wurden denaturiert, hybri disiert zum Doppelstrang aufgefüllt und mit einer weiteren PCR mit den Oligonukleotiden SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 2 die jewei ligen tPA-Leader-Prothrombinmutein-DNAs hergestellt. Diese wurden Eco R1 geschnitten, in pUC 18 kloniert und zur Kontrolle sequen ziert.

Zur Expression in CHO Zellen wurden diese DNAs mit Eco R1 aus den pUC 18 Vektoren herausgeschnitten, isoliert und in die Eco R1 Schnittstelle des Vektors pc DNA3 neo (Invitrogen, San Diego, USA) eingefügt. Die Transkription der Prothrombin cDNA steht in diesem Vektor unter der Kontrolle des starken Cytomegalievirus promotors. Die Selektion auf transfizierte Zellen wird über das im Plasmid liegende Neomycin-Resistenzgen durchgeführt, das nur G 418-resistenten Kolonien das Wachstum erlaubt.

Vor der Transfektion wurden die entsprechenden DNAs, die für eine Expression in CHO-Zellen vorgesehen waren, mit dem Restriktions enzym PvuI linearisiert, präzipitiert und in 10 mM Tris-Puffer (pH8,5) steril aufgenommen.

Beispiel 7 Expression von Prothrombin-Muteinen in Säugerzellen

Die DNA der Expressionsvektoren wurde mit Lipofektamin (Fa. Gibco; Life Technologies GmbH; Dieselstraße 5, 76334 Eggenstein, Deutschland; Nr. 530-8324SA) in Säugerzellen transfiziert. Die verwendeten Zellen waren CHO-K1 (ATCC CCL 61); 293 (ATCC CRL 1573).

Je 2×10⁵ Zellen/ml wurden in 3 ml Wachstumsmedium pro Napf einer 6-well-Kulturplatte eingesät. Am nächsten Tag wurde die Trans fektion durchgeführt. Hierzu wurden die Zellen einmal mit serum freiem Medium gewaschen. Die Transfektion mit Lipofektamin wurde nach Angaben der Herstellerfirma Fa. Gibco durchgeführt (Focus (1993), 15 Nr. 3, 73-78). Jeder Napf erhielt 1 µg DNA und 6 µl Li pofektamin, die in zusammen 1000 µl serumfreiem Zellkulturmedium aufgebracht wurden. Nach 6 stündiger Inkubation bei 37°C wurde das Transfektionsmedium abgesaugt und die Zellen mit normalem Wachstumsmedium (inklusive foetalem Kälberserum, FCS) über Nacht inkubiert.

Beispiel 8

Transiente Expression von Prothrombinmuteinen in 293-Zellen 293-Zellen werden in DMEM-Medium (Gibco Nr. 41965) + 10% FCS (Biowhittaker Nr. 14601 B) gehalten.

Die Transfektion wurde durchgeführt wie oben beschrieben. Dabei wurde zur Erhöhung der Expression eine Co-Transfektion mit dem Plasmid pAdVantage (Fa. Promega Nr. E1711) durchgeführt. 0,2 µg der pAdVantage-DNA, sowie 0,8 µg der DNA des jeweiligen Prothrom binmuteins im Expressionsvektor pcDNA3 wurden transfiziert wie oben beschrieben. Am 1.Tag nach Transfektion wurde das serumhal tige Medium abgesaugt und durch serumfreies Medium (ohne Phenol rot) ersetzt. Am dritten Tag nach Transfektion wurde der Zell kulturüberstand abgenommen und bis zum Test bei -20°C gelagert.

Beispiel 9 Stabile Expression von Prothrombinmuteinen in CHO-K1-Zellen

Die Transfektion wurde durchgeführt wie oben beschrieben. CHO- Zellen werden in DMEM/F12 = 1 : 1 (Gibco Nr. 21331-020) + 10% FCS gehalten und gezüchtet. Am 1.Tag nach Transfektion wurden die Zellen gesplittet, so daß aus einem Napf einer 6-Napfplatte 20 bis 100 10 cm Petrischalen ausgesät wurden. Gleichzeitig wurde begonnen, die rekombinanten Zellen durch Behandlung mit G418 (Fa. Gibco, 1200 µg/ml in Medium) zu selektionieren. Die erhaltenen resistenten Kolonien wurden durch die "cloning cylinder" Methode vereinzelt und nach Hochzüchten und Erreichen genügender Zellzah len auf Expression der entsprechenden Thrombinmuteine untersucht. Hierzu wurde das Medium von konfluenten Zellen abgesaugt und durch frisches, serumfreies Medium ersetzt. Nach festen Zeitpunk ten wie z. B. nach 24 Stunden, 48 Stunden wurde der inkubierte Zellkulturüberstand abgenommen und auf Vorliegen des Prothrombins mit Hilfe des ELISA getestet.

Teilweise wurden die erhaltenen rekombinanten Zellen zur Steige rung der Expression durch Vereinzelung in Mikrotiterplatten klo niert.

Um genügende Mengen des serumfreien Zellkulturüberstandes bereit zustellen, wurden gut exprimierende CHO-Zellen in verschiedenen Kulturgefäßen bis zur Konfluenz in Medium mit 10% FCS gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit serum freiem DMEM /F12-Medium (DMEM: Gibco-Nr.11880-028; F12: Gibco Nr.21765-029 Mischung besteht aus gleichen Volumenanteilen) inkubiert. Das für diese Zwecke benutzte DMEM war frei von Phe nolrot. Nach zwei bzw. drei Tagen erfolgte jeweils ein Medien wechsel ("Ernte"), um den Prothrombinmutein enthaltenden Zell kulturüberstand zu ernten. Auf diese Art konnte bis zu 10-mal aus einem Kulturgefäß geerntet werden. Verschiedene Ernten aus ver schiedenen Kulturgefäßen wurden dabei vereinigt, um ein für die Aufreinigung akzeptables Volumen zu erreichen.

Beispiel 10 Nachweis der Expression von rekombinanten Prothrombinmuteinen

Zellen, die Prothrombin exprimieren und in das Zellkulturmedium sezernieren, wurden auf Vorliegen des rekombinanten Prothrombin getestet, indem der Zellkulturüberstand von konfluenten Zellen auf Vorliegen von Prothrombin mittels ELISA oder nach Spalten des Prothrombins auf Thrombin-Aktivität bzw. Thrombin-Antigen unter sucht wurde.

Hierzu wurde der serumfreie Zellkulturüberstand nach unterschied lich langer Kulturdauer abgenommen. Spaltung des in dem Zell kulturüberstand vorliegenden Prothrombins wurde mittels snake ve nom (Fa. Sigma; Kat. Nr. V3129) erreicht. Jeder Ansatz wurde fol gendermaßen durchgeführt:
388 µl Probe (serumfreier Zellkulturüberstand oder Prothrombin)
63 µl snake venom (0,2 mg/ml in H₂O)
50 µl Puffer (1 M NaCl; 100 mM CaCl₂; 200 mM Tris pH7,4)
100 µl H₂O.

Die Spaltungsansätze wurden für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurde das entstandene Thrombin in verschiedenen Tests charakterisiert.

Beispiel 11 Nachweis von Prothrombinmuteinen und Thrombinmuteinen durch ELISA

Der ELISA zur Bestimmung von Prothrombin und Thrombin wurde nach folgendem Schema durchgeführt:

- Microtiterplatten beschichten mit 0,1 ml/well anti-Thrombin- Antikörpern; 5 µg/ml 0,05 M NaHCO3, pH 9,2; 16 Stunden/4°C.
- Absättigen mit 1% BSA/PBS; 0,3 ml/well; 0,5-1 Stunde/RT
- 3× Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS
- 11 Standardverdünnungen von human-Thrombin (Calbiochem 605195; 3,159 NIH U/mg),
angefangen mit 10 ng/ml 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS in 2er Schritten; parallel dazu Verdünnungen der zu bestimmenden Proben; 0,1 ml/well; 2-4 Stunden/RT
- Waschen wie oben
- 0,1 ml/well biotinylierter anti-Thrombin-Antikörper 1 : 200;
verdünnt in 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS; 2-4 Stunden/RT
- Waschen wie oben
- 0,1 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex (B.M. 1089153); 1 : 10000 verdünnt in 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS; 30 Minuten /RT
- Waschen wie oben
- 0,1 ml/well Peroxidasesubstrat
- Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2 M H2SO4
- Messung der Absorption bei 450 nm Peroxidasesubstrat: 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-acetat pH 4,9) mischen; dann Zusatz von 14,7 µl 3% H2O2.

Beispiel 12 Herstellung von Antikörpern gegen humanes Thrombin

Zur Induktion von polyklonalen Antikörpern wurden Kaninchen wie folgt immunisiert:
Tag 1 200 µg humanes Thrombin in 0,5 ml PBS/complete Freund′s Adjuvant (Sigma F5881)
Tag 14 200 µg humanes Thrombin in 0,5 ml PBS/incomplete Freund′s Adjuvant (Sigma F5506)
Tag 28 200 µg humanes Thrombin in 0,5 ml PBS/incomplete Freund′s Adjuvant
Tag 42 200 µg humanes Thrombin in 0,5 ml PBS.

7 Tage nach der letzten Immunisierung erfolgte die Blutabnahme aus der Ohrvene der Kaninchen.

Die Reinigung der polyklonalen Kaninchen-Antikörper aus dem ge wonnenen Serum erfolgte über Protein A Sepharose (gemäß Hersteller Pharmacia) mit einer Ausbeute von 65 mg IgG/10 ml Serum. Vor der Biotinylierung wurden die Antikörper gegen 0,05 M NaHCO3 pH 9,0 (2×2 l) dialysiert, dann Zusatz von 200 µl Biotin-X-NHS- Ester (Calbiochem 203189; 1 mg/ml H2O) pro 600 µl Antikörper (2,4 mg/ml) und 2 Stunde/RT schütteln. Abschließend wurde 3mal gegen PBS dialysiert.

Mit den gewonnenen Antikörpern wurde ein sandwich-ELISA aufge baut:

- Mikrotiterplatten beschichten mit 0,1 ml/well anti-Throm bin-AK 5 µg/ml in 0,05 M NaCO3, pH 9,2; 16 Stunden/4°C
- Absättigen mit 1% BSA; 0,3 ml/well; 0,5 Stunden/RT
- 3x waschen mit 0,05% Tween 20/PBS
- 11 Standardverdünnungen von human Thrombin (Calbiochem 605195) angefangen mit 10 ng/ml 0,1% BSA/PBS/0,05% Tween 20 in 2er Schritten; parallel dazu Verdünnungen der zu bestim menden Proben; 0,1 ml/well; 2 Stunden/RT
- Waschen wie oben
- 0,1 ml/well biotinylierter anti-Thrombin-AK 1:200, verdünnt in 1% BSA/PBS/0,05% Tween 20; 2 Stunden/RT
- Waschen wie oben
- 0,1 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex (B.M. 1089153), 1:10000 verdünnt in 0,1% BSA/PBS/0,05% Tween 20; 30 Minuten/RT
- 0,1 ml/well Peroxidasesubstrat
- Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2M H2SO4
- Messung der Absorption (OD) bei 450 nm.

In Abb. 1 ist die Absorption (OD) gegen die Thrombinkonzen tration aufgetragen.

Peroxidase-Substrat: 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-Acetat pH 4,9) mischen; dann Zusatz von 14,7 µl 3% H2O2.

Nachweis von Prothrombinmuteinen und Thrombinmuteinen durch ELISA.

- Microtiterplatten beschichten mit 0,1 ml/well anti-Thrombin- Antikörpern; 5 µg/ml 0,05 M NaHCO₃, pH 9,2; 16 Stunden/4°C.
- Absättigen mit 1% BSA/PBS; 0,3 ml/well; 0,5-1 Stunde/RT
- 3× Waschen mit 0,05% Tween 20/PBS
- 11 Standardverdünnungen von human-Thrombin (Calbiochem 605195; 3,159 NIH U/mg), angefangen mit 10 ng/ml 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS in 2er Schritten; parallel dazu Ver dünnungen der zu bestimmenden Proben; 0,1 ml/well; 2-4 Stun den/RT
- Waschen wie oben
- 0,1 ml/well biotinylierter anti-Thrombin-Antikörper 1 : 200; verdünnt in 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS; 2-4 Stunden/RT
- Waschen wie oben
- 0,1 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex (B.M. 1089153); 1 : 10000 verdünnt in 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS; 30 Minuten/RT
- Waschen wie oben
- 0,1 ml/well Peroxidasesubstrat
- Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2 M H₂SO₄
- Messung der Absorption bei 450 nm.

Peroxidasesubstrat: 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM TMB in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-acetat pH 4,9) mischen; dann Zusatz von 14,7 µl 3% H₂O₂.

Beispiel 13a Reinigung von Humanthrombin aus Blutplasma

Die Reinigung von humanen Prothrombin aus humanem Citratplasma erfolgte wie in Henrikson (Methods in Enzymology, Vol 222, pp 312-3279 beschrieben. Die Prothrombinspaltung und Reinigung des Thrombins durch Heparinchromatographie erfolgte wie in Beispiel 14 und 15 angegeben. Die Thrombinhaltigen Fraktionen wurden mit Hilfe des chromogenen Thrombinassays mit S 2238 ermittelt und durch Ultrafiltration auf 1 mg/ml aufkonzentriert und gegen PBS diafiltriert.

Bestimmung der Thrombinaktivität mit dem chromogenen Substrat S 2238

Die Aktivität der Thrombinmuteine wird durch die Spaltung eines Tripeptides ermittelt. Hierzu wird nach folgendem Pipettierschema verfahren:
50 µl Probe (Thrombin 0,5 U/ml; oder gespaltenes Prothrombin in verschiedenen Verdünnungen)
100 µl H₂O
50 µl S-2238 (1 mg/ml in H₂O; Fa. Chromogenix, Mölndal; Schweden).

Die Ansätze werden für 10-15 Minuten bei 37°C inkubiert. An schließend wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nM gemessen und die Thrombinmenge anhand einer Eichkurve zwischen 0,01 und 1 U/ml ermittelt.

Beispiel 13b Reinigung von Prothrombinmuteinen durch Anionenaustauschchromato graphie

35 1 des Prothrombin-haltigen Zellkulturüberstandes aus der CHO- Zellkultur wird zunächst durch Ultrafiltration bei 4C (SPS 400 Membran, Fresenius, St. Wendel) bis auf 400 ml aufkonzentiert und gegen dann gegen 10 mM Tris pH 7,5 diafiltriert bis die Leitfä higkeit 1,1 mS/cm beträgt. Das entsalzte Filtrat wird dann auf eine Q-Sepharose FF Säule (5 cm Durchmesser, Vol 530 ml) mit einer Flußrate von 6 ml/min aufgetragen, die Säule mit Start puffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5) gewaschen und anschließend mit einem Gradienten nach 400 mM NaCl über 15 Säulenvolumen ent wickelt. Die Prothrombin-haltigen Fraktionen werden mittels ELISA identifiziert. Das Prothrombinmutein eluiert ab 280 mM NaCl. Es werden etwa 150-200 mg Protein aus dieser Säule isoliert.

Beispiel 14 Freisetzung der Thrombinmuteine aus Prothrombin

Die auf Amicon YM 30 aufkonzentrierten Fraktionen (20 ml Endvo lumen, 175 mg Gesamtprotein) der Q-Sepharose Chromatographie wer den gegen 2 Liter 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 100 mM NaCl dialysiert und für die Spaltung durch Zusatz von 1 M CaCl₂, 20 mM Tris pH 7,5 auf eine Endkonzentration von 10 mM eingestellt. Nach Zugabe von 30 mg Schlangengift aus Oxyranus scutellatus wird bei 4°C unter Rühren gespalten und die Reaktion nach 12 h durch Zusatz von 2 ml 20 mM EGTA-Lösung, pH 7,5 abgestoppt.

Beispiel 15 Reinigung der Thrombinmuteine durch Heparinchromatographie

Der Thrombin-haltige Spaltansatz aus Beispiel 14 wird anschlie ßend auf eine Heparinsepharose-Säule (14 cm × 1 cm, Pharmacia) mit einer Flußrate von 38 cm/h aufgetragen. Nach Waschen der Säule mit 20 ml 20 mM Na-Phosphat, 0,1 M NaCl pH 7,5 0,01% Pluriol F68 wird die Säule mit einem linearen Gradienten nach 600 mM NaCl, 20 mM Na-Phosphat, pH 7,5, 0,01% Pluriol F68 über 150 ml entwickelt. Die Thrombinmuteine werden dann durch ELISA ermittelt. Die Muteine eluieren bei etwa 400 mM NaCl. Es wurden 30 ä35 mg Mutein erhalten und nach Zugabe von BSA (1 mg/ml) gegen PBS, 0,01% Pluriol F68 dialysiert und bei -20°C gelagert.

Beispiel 1-6 Neutralisierung von Hirudin im in vitro System

Die Antidot-Wirkung der inaktiven rekombinanten Thrombine auf Hirudin wurde in einem Thrombin-Aktivitätstest nachgewiesen. Hierzu wurden Hirudin; das zu testende Thrombinmutein; aktives Thrombin und S-2238 miteinander inkubiert. Das diesem Test zugrundeliegende Prinzip ist die Neutralisation (oder Kompeti tion) von Hirudin durch das zu testende inaktive Thrombin, sowie die daraus resultierende höhere Aktivität des aktiven Thrombins.

Hierzu wurde nach folgendem Pipettierschema verfahren:
100 µl Hirudin HL20 (1,5 U/ml) bzw. 0,1% BSA in TBS pH 7,5 und 100 µl Thrombinmutein (hergestellt in Beispiel 2) wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. Nach Zugabe von 50 µl aktivem Thrombin (0,5 U/ml) wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl S-2238 (1 mg/ml in H₂O; Fa. Chromogenix, Mölndal; Schweden) gestartet. Die Ansätze wurden für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 410 nm gemessen. Neutralisation des Hirudins durch das inaktive Thrombinmutein führte zu einer Erhöhung der Absorption (Abb. 2).

Beispiel 17 Neutralisierung von PEG-Hirudin im Hund

Beagle-Hunden (9,8-13,5 kg) wurde subcutan PEG-Hirudin in einer Dosis von 10 mg/kg appliziert.180 min nach der PEG-Hirudin Injek tion wurde die das nach Beispiel 2 hergestellte Thrombinmutein (Thrombinmut #3) als eine intravenöse Infusion mit einer Dosie rung von 20g/kg über 50 min appliziert. Blutproben wurden den Hunden durch Punktion der V. brachialis zu Beginn des Experiments und weitere Proben nach 150 über einen Zeitraum bis zu 6 h ent nommen. Aus dem Citrat-Blut wurde das Plasma durch Zentrifugation bei 2000 g für 20 min gewonnen und bis zur Analyse bei -20°C auf bewahrt.

In den Plasmaproben wurde die Antithrombin-Aktivität wie in Span nagel et al., Blood Coagulation Fibrinolysis, 1991, 2:, 121-127 beschrieben bestimmt. Die antikoagulatorische Aktivität (aPTT) wurde mit Hilfe des Pathromtin-Systems (Behring) bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Abb. 3 zusammengefaßt. Während in den Kon trolltieren die Antithrombinaktivität nach Applikation von PEG- Hirudin rapide anstieg, konnte in den mit dem Antidot behandelten Tieren ein Anstieg der Antithrombinaktivität (Abb. 3B) verhin dert werden. Nach Beendigung der Antidot-Infusion stieg der PEG- Hirudin Plasmaspiegel dann mit einer den Kontrolltieren ver gleichbaren Rate weiter. Der qualitativ gleiche Verlauf wird auch bei der aPTT beobachtet (Abb. 3A).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Thrombinmuteine, die gegenüber dem natürlichen Thrombin fol gende Sequenzunterschiede aufweisen

(a) Austausch eines Gly nach Ala, wobei sich das Gly in der Sequenzumgebung Tyr-Gly-Phe befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Position 274 besitzt;
(b) mindestens einen Austausch oder eine Deletion der folgen den Reste
- (b1) His, das sich in der Sequenzumgebung Ala-His-Cys befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Position 79 besitzt;
- (b2) Asp, das sich in der Sequenzumgebung Arg-Asp-Ile befindet und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Position 135 besitzt;
- (b3) Ser, das sich in der Sequenzumgebung Asp-Ser-Gly befin det und im natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) die Position 241 besitzt.

2. Thrombinmuteine nach Anspruch 1, die gegenüber dem natürlichen humanen Thrombin (SEQ ID NO:14) folgende Sequenzunterschiede aufweisen

(a) Austausch des Gly nach Ala, an der Position 274 und
(b) mindestens einen Austausch oder eine Deletion der folgen den Reste
- (b1) His an der Position 79;
- (b2) Asp an der Position 135;
- (b3) Ser an der Position 241.

3. Thrombinmuteine nach Anspruch 2, wobei der sequenzunterschied (b) ein Austausch an der Position 241 ist.

4. Thrombinmuteine nach Anspruch 3, wobei der Sequenzunterschied (b) ein Austausch von Ser nach Ala ist.

5. Nukleinsäuresequenz codierend für ein Thrombinmutein gemäß Anspruch 1 bis 4.

6. Verwendung von Thrombinmuteinen nach Anspruch 1 bis 4 bei der Behandlung von Gerinnungsstörungen.

7. Verwendung nach Anspruch 6 als Antidot für Thrombin inhibitoren.

8. Verwendung nach Anspruch 7 als Antidot für Hirudine, Hirudin muteine oder Hirudinderivate.

9. Verwendung nach Anspruch 8 als Antidot für Hirudinderivate, die mit Polyethylenglykol modifiziert sind.

10. Antidot für Thrombininhibitoren, enthaltend ein Thrombinmu tein nach Anspruch 1 bis 4 zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen.