HRP970077A2 - Thrombin muteins as antidotes for thrombin inhibitors - Google Patents
Thrombin muteins as antidotes for thrombin inhibitors Download PDFInfo
- Publication number
- HRP970077A2 HRP970077A2 HR19605126.6A HRP970077A HRP970077A2 HR P970077 A2 HRP970077 A2 HR P970077A2 HR P970077 A HRP970077 A HR P970077A HR P970077 A2 HRP970077 A2 HR P970077A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- thrombin
- seq
- prothrombin
- sequence
- mutant
- Prior art date
Links
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 title claims description 93
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 title claims description 92
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 title claims description 22
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 title claims description 22
- 239000000729 antidote Substances 0.000 title claims description 16
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 title description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 57
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 56
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 55
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 40
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 32
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 32
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 21
- 101000651439 Homo sapiens Prothrombin Proteins 0.000 claims description 18
- 229940039715 human prothrombin Drugs 0.000 claims description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- NOOMDULIORCDNF-IRXDYDNUSA-N Tyr-Gly-Phe Chemical group [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O NOOMDULIORCDNF-IRXDYDNUSA-N 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 3
- ANGAOPNEPIDLPO-XVYDVKMFSA-N Ala-His-Cys Chemical group C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N ANGAOPNEPIDLPO-XVYDVKMFSA-N 0.000 claims description 2
- KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N Asp-Ser-Gly Chemical group OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 30
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 24
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 20
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 12
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 12
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 12
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 12
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 12
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 229920002266 Pluriol® Polymers 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 108010039231 polyethyleneglycol-hirudin Proteins 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YDMBNDUHUNWWRP-VJBWXMMDSA-N (2s)-1-[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]piperidine-2-carboxamide Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 YDMBNDUHUNWWRP-VJBWXMMDSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 101150092823 ppa gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091007045 Cullin Ring E3 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100031636 Dynein axonemal heavy chain 9 Human genes 0.000 description 1
- 241000122860 Echis carinatus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101000575170 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) 50S ribosomal protein L12 Proteins 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 241000237903 Hirudo Species 0.000 description 1
- 101000866325 Homo sapiens Dynein axonemal heavy chain 9 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010080798 N(alpha)-(2-naphthylsulfonylglycyl)-4-amidinophenylalanine piperidide Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- NTUPOKHATNSWCY-JYJNAYRXSA-N Phe-Pro-Arg Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NTUPOKHATNSWCY-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010039286 S 2238 Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010018823 anti-inhibitor coagulant complex Proteins 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000003937 benzamidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical class OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 229940105776 factor viii inhibitor bypassing activity Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 210000004224 pleura Anatomy 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108010071286 prethrombins Proteins 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000003869 thrombin derivative Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
Predloženi izum odnosi se na nove mutante trombina, njihovu proizvodnju i njihovu upotrebu kao antidota za inhibitore trombina.
Antikoagulanti, koji djeluju na načelu izravnog suzbijanja trombina, dobivaju sve veći značaj za terapiju protiv tromboze. Nužna pretpostavka za široku primjenu antikoagulanata je mogućnost neutralizacije djelovanja kod prekomjernog doziranja, poremećajne razgradnje ili produljenog izlučivanja, da bi se tada zaustavilo opasna hemoralgijska sporedna djelovanja, kao npr. krvarenja u području peritoneuma, perikarda, pleure. Dok kod heparina s protaminsulfatom, polilizinom i platelet faktorom 4 stoji na raspolaganju vrlo učinkovit antidot, za primjenu na ljudima još uvijek nedostaje prikladni antidot za neutralizaciju inhibitora trombina.
U literaturi su opisana različita načela antidota. Fareed raspravlja o aktiviranim plazma frakcijama kao npr. pripravcima autokompleksa, ili FEIBA, kao načelu neutralizacije hirudina. Međutim, zbog djelovanja sličnog tromboplastičnosti, oni nisu prikladni za neutralizaciju. (Fareed, Fed Proc 1989; A 328; Walenga Sem. Thromb. Hemost. 1989; 15: 316-333).
Markwardt (Thrombosis Research, Vol 74, br. 1, str. 1-23, 1994) opisuje upotrebu trombina i derivata trombina. Primjeri za to su kompleksi. trombina, trombin-2-makroglobulina i meizotrombin. On također se opisuje upotrebu kemijski inaktiviranog trombina, kao npr. DFP-trombina ili benzoil-trombina, za neutralizaciju hirudina (Markwardt, Pharmazie 1989; 44; 648-649).
Međutim, ti pripravci nisu prikladni kao antidot za primjenu na ljudima zbog zgrušavaiućeg djelovanja i zbog do 1000 puta manjeg afiniteta prema hirudinu: (F. Doyle u Methods Enzymol; vol. 222, str. 299 i dalje, Moriata in Methods Enzymol; Vol 80, str. 303 i dalje, Stone et al., Biochemistry; 1987, 26, 4617-4624, Markwardt, Pharmazie; 44, 1989, str. 648-649).
Humani protrombin je poznat i opisali su ga Friezner et al., (Biochemistry, Vol 22, 1983, str. 2087-2097). Aminokiselinska sekvenca humanog protrombina navedena je također i u SEQ ID NO: 14. U literaturi se mogu naći različiti načini brojenja za humane sekvence trombina, zbog čega će se u nastavku - ako nije navedeno drugačije koristiti način brojenja, odnosno SEQ ID NO:14.
Lentz (Lentz et al., JBC; Vol 266, br. 15, str. 9598-9604) opisali enzimski inaktivan trombin proizveden genskom tehnologijom. Zamjena serinskog ostatka, potrebnog za katalizu, na položaju 205 (položaj 525 i SEQ ID NO: 14), s alaninom dovodi, ovdje do enzimski inaktivne varijante trombina, koja prema sintetičkim supstratima i prirodnim supstratima fibrinogena ne pokazuje nikakvu aktivnost cijepanja (Lentz et al., JBC Vol 266, br. 15, str. 9598-9604), ali pokazuje niži afinitet vezanja prema inhibitiru trombina densilarginin-N-(3-etil-l,5-penta-dienil)amidu.
Iz radova Stonea i sur. (Biochemistry; Vol 30, 6392-6397) poznata je prirodna varijanata trombina Qick II. Quick II-trombin razlikuje se od prirodnog trombina samo na položaju 238 (položaj 558 u SEQ ID NO: 14). Ovdje je glicinski ostatak 238 prirodnog trombina mutiran s hidroforbnim ostatkom valina. Ta neznatna izmjena u P1-džepu enzima dovodi do značajnog smanjenja cijepanja fibrinogena (2% prvobitne aktivnosti) i istovremeno do drastičnog smanjenja vezanja kako niskomolekulskih supstrata, tako također i hirudina. Stone je pokazao da se je konstanta vezanja te mutante za hirudin pogoršala za faktor veći od 1000, i taj rezultat objašnjava kako steričkim blokiranjem veznog džepa, tako također i s konformacijskom reorganizacijom okoline aktivnog središta.
Dosada poznate mutante trombina nisu prikladne kao antidot za inhibitore trombina, jer one imaju ili premali afinitet prema inhibitoru trombina, ili previše vežu fibrinogen i prema njemu pokazuju preveliku enzimsku aktivnost.
Zadatak se je stoga sastojao u pripravi nove mutante trombina, koja je enzimski maksimalno inaktivna, koja pokazuje dobro vezanje inhibitora trombina i istovremeno, kao nemodificirani trombin, veže prirodni supstrat fibrinogena s neznatnom aktivnošću.
Predmet izuma su mutante trombina, koje prema prirodnom trombinu pokazuju slijedeće razlike sekvenci:
(a) zamjena jednog Gly s Ala, pri čemu se Gly nalazi u okruženju sekvence Tyr-Gly-Phe, i u prirodnom humanom protrombinu (SEQ ID NO: 14) zauzima položaj 558;
(b) najmanje jedna zamjena ili delecija slijedećih ostataka:
- (b1) His koji se nalazi u okruženju sekvence Ala-His-Cys i u prirodnom humanom protrombinu (SEQ ID NO:14) zauzima položaj 363;
- (b2) Asp koji se nalazi u okruženju sekvence Agr-Asp-Ile i u prirodnom humanom protrombinu (SEQ ID NO:14) zauzima položaj 419;
- (b3) Ser koji se nalazi u okruženju sekvence Asp-Ser-Gly i u prirodnom humanom protrombinu (SEQ ID NO:14) zauzima položaj 525.
Nove mutante trombina mogu se proizvesti polazeći od poznatih prirodnih trombina, kao eventualno ljudskog trombina, i drugih sisavaca, primjerice, primata, goveda, svinje, psa, mačke, miša, štakora. Pod prirodnim trombinom podrazumijeva se polipeptidna sekvenca koja pokazuje aktivnost trombina i prirodnim putem nastaje u organizmu.
Pod mutantama trombina ne podrazumijevaju se samo dvolančane molekule premoštene s disulfidom (A- i B-lanac), već također i lančaste molekule kao pretrombin ili proteini koji se sastoje samo iz B-lanca ili dijelova B-lanca, ponajprije iz N- i/ili C-terminalno skraćenih B-lanaca. Za mutante trombina prema izumu presudno je da pokazuju učinkovitost, odnosno vežu inhibitor trombina.
Mutanti trombina prema izumu mogu se proizvesti također i polazeći od poznatih proizvoda proteolize, primjerice β-trombina, γ-trombina, ω-trombina ili također od predstupnjava trombina, kao protrombinskih intermedijata, ili također meizotrombina, koji se zatim, po potrebi, mogu prevesti u aktivne molekule trombina prikladnom metodom cijepanja, primjerice pomoću faktora Xa, s frakcijama zmijskih otrova iz Echis carinatus ili također iz Oxyranus scutellatus.
Mutante trombina prema izumu prikladne su za neutralizaciju hirudina, derivata hirudina ili drugih inhibitora trombina.
Prednost se daje proizvodnji genskom tehnologijom, pri čemu se proizvede odgovarajući gen za mutantu trombina i taj gen se eksprimira u prikladnom mikroorganizmu.
U suporedbi s prirodnim trombinom nove mutante trombina imaju najmanje dvije sekvencne razlike, pri čemu prva razliku predstavlja zamjena jednog glicinskog ostatka s alaninskim ostatkom. Položaj zamjene ovisi o podrijetlu prirodnog polaznog trombina. Međutim, radi se ipak o položaju glicina, koji se nalazi u okruženju sekvence Tyr-Gly-Phe, i koji u prirodnom humanom protrombinu (SEQ ID NO: 14) zauzima položaj 558.
Druga sekvencna razlika je ili zamjena, ili delecija aminokiselinskog ostatka na jednom od tri položaja (His, Asp, Ser), koji tvore katalitičku trijadu proteaze trombina. Ti položaji u prirodnom humanom protrombinu (SEQ ID NO: 14) su položaj 363 za His, 419 za Asp i 525 za Ser. Kod ostalih, ne-humanih trombina, ti položaji mogu biti malo pomaknuti, ovisno o ukupnoj duljini molekule. Međutim, okruženje sekvence, tj. aminokiselinski ostatak ispred i iza odgovarajuće amino kiseline, je kod trombina konzerviran, i stoga se pomoću sekvencnog okruženja lako mogu utvrditi točni položaji odgovarajućih aminokiselinskih ostataka.
Mutante trombina prema izumu mogu također imati i više promjena (delecija ili supstitucija) na katalitičkim trijadama. Prednost se daje mutantama trombina koje imaju jednu jedinu promjenu na katalitičkoj trijadi.
Promjene kojima se daje prednost su one kod kojih su izvršene supstitucije amino kiselina katalitičkih trijada. Supstitucije histidinskog ostatka su ponajprije one s polarnim ili hidrofobnim amino kiselinama, naročito s Phe, Tyr, Ala ili Val. Aspartatski ostatak se ponajprije supstituira s drugim polarnim amino kiselinama, primjerice Gln ili Asn.
Posebnu prednost imaju mutante trombina kod kojih je promijenjen serinski ostatak, naročito supstitucije serina s amino kiselinama koje nemaju nijedne hidroksi funkcionalne skupine, naročito takve koje imaju sličnu prostornu popunjenost. Posve osobitu prednost ima supstitucija Ser sa Ala.
Što se tiče njihove učinkovitosti, mutante trombina mogu se dalje poboljšati unošenjem drugih promjena molekule. Tako se npr. može zamisliti daljnje poboljšanje proteolitičke stabilnosti da se primjerice omogući dulje trajanje djelovanja in vivo. Ovdje se primjerice bazični ostaci Arg 393, Lys 465, Arg 390 ili Arg 382 (SEQ ID NO:14) mogu zamijeniti s nekom nebazičnom amino kiselinom.
Daljnji predmet izuma su sekvence nukleinskih kiselina, naročito sekvence DNA koje kodiraju za opisane mutante trombina. One se mogu lako odrediti retranslacijom polipeptidne sekvence u odgovarajuću DNA sekvencu prema genetičkom kodu. Ponajprije se upotrebljavaju takvi kodoni koji u željenom organizmu domaćina dovode do dobre ekspresije.
Sekvence nukleinske kiseline mogu se proizvesti polazeći od prirodnih sekvenci trombina lokalno specifičnom mutagenezom, ili također potpuno sintetički sintezom DNA.
Mutante trombina prema izumu prikladne su naročite kao antidot za inhibitore trombina, kao hirudine, derivate hirudina i niskomolekulske inhibitore trombina.
Hirudini su proteini prvobitno izolirani iz pijavica, koji se sastoje iz 65 amino kiselina i koji se odlikuju ekstremno visokim afinitetom prema trombinu (ki = 10-12 mol/l) i istaknutom selektivnošću prema trombinu. Učinkovitost hirudina pokazana je kako u pokusima na životinjama, tako također i kod ljudi. Pored prvobitno izoliranih hirudina, postoje također i brojne mutante hirudina, a također i izohirudini, koji u usporedbi s prirodnim hirudinom imaju sekvencne promjene. Pod hirudinima se stoga, osim prirodnih hirudina, podrazumijevaju također i takvi hirudini koji u odnosu prema hirudinu iz Hirudo medicalis nose jednu ili više sekvencnih promjena i posjeduju barem jednako velik afinitet prema trombinu.
Hirudini su lako dostupni pomoću metoda genske tehnologije. Njihovo vrijeme poluraspadanja kod ljudi je otprilike 45 minuta.
Također su poznati derivati hirudina kod kojih je farmakokinetika modificirana pomoću kemijske kinetike. Markwardt opisuje konjugate dekstrana i hirudina s različitim trajanjem djelovanja. Iz EP 345616, EP 502962 i EP 557199 poznati su polimerni konjugati dugotrainog djelovanja. U WO 9515183 opisani su hidrofobni derivati hirudina dugotrajnog djelovanja. Također su poznati depot oblici kao i dimeri hirudina dugotrajnog djelovanja (W0 9504823) Daljnji inhibitori trombina su niskomolekulski inhibitori trombina, koji su poznati primjerice iz EP 236164, DE 2801478, EP 293881 ili EP 185390.
Daljnji inhibitori trombina su rekombinantno proizvedeni desulfato-hirudini, hirudin-mutante, polimerno modificirani hirudini, kao npr. dekstran-hirudini, PEG-hirudini, hidrofobno derivatizirani hirudini, kao i mutante hirudina s produljenim trajanjem djelovanja. Nadalje, novi trombini mogu se upotrijebiti za antagoniziranje hirudisina, skraćenih hirudina, kao i za analoge hirudina izvedene od hirudina i njegovih djelomičnih sekvenci, kao npr. hiruloga ili C-terminalnih hirudinskih peptida. Neutralizirati se mogu također i drugi peptidni inhibitori trombina, koji su bili opisani u organizmima koji sisaju krv i proizvedeni genskom tehnologijom upotrebljavaju se za terapiju, kao npr. rodnin; infestin.
Primjeri inhibitora trombina koji se mogu neutralizirati su također sintetički, ponajprije niskomolekulski inhibitori trombina, kao primjerice derivati tripeptida D-Phe-Pro-Arg, NAPAP, derivati borne kiseline, arginali ili derivati benzamidina.
Upotreba prema izumu kao antidota može se primijeniti na sve prethodno navedene inhibitore trombina.
Mutante trombina prema izumu neutraliziraju inhibitore trombina bolje od dosada opisanih principija za neutralizaciju inhibitora trombina. Trombini prema izumu sigurni su u primjeni samo kod prekomjernog doziranja, i stoga u slučaju potrebe omogućuju brzu i potpuno učinkovitu neutralizaciju inhibitora trombina.
Mutante trombina prema izumu postoje obliku prikladnom za parenteralno davanje, ti. subkutano, intramuskularno ili intravensko. Prednost se daje intravenskom davanju.
Mutante trombina prema izumu mogu se po potrebi dati također i kao trajna infuzija. Količina datog inaktivnog trombina ravna se npr. po mjeri prekomjernog doziranja, tjelesnoj težini i odabranom načinu doziranja. Veličinu prekomjernog doziranja može odrediti stručnjak ili se također može odrediti prikladnim ispitivanjem tijekom aplikacije trombina.
Mutante trombina prema izumu mogu se proizvesti metodama genske tehnologije. Prednost se daje proizvodnji genskom tehnologijom prethodnog oblika mutante trombina (analgnog protrombinu) iz kojeg se mutanta trombina oslobađa proteolitičkim aktiviranjem.
Daljnji način proizvodnje, kojem se daje prednost, prije svega za mutantu trombina koja se sastoji samo iz B lanca, je ekspresija gena za B lanac, promijenjen prema izumu, u mikroorganizmima, ponajprije u bakterijama kao E. coli.
Dobiveni proizvod ekspresije mora se po potrebi renaturirati metodama poznatim stručnjacima, da se dobije učinkovitu molekulu mutante trombina. Kod ekspresije B lanca u bakterijama pokazalo se je također od prednosti Cys-ostatak, koji u prirodnom humanom trombinu doprinosi S-premoštenju, zamijeniti s drugim aminokiselinskim ostatkom, primjerice Ser ili Ala.
Slijedeći primjeri služe za daljnje objašnjenje izuma, međutim izum se ne graničava na njih.
Protrombin je kloniran prema publikaciji Degena i sur. (Biochemie 1983, 22, str. 2087-97) iz cDNS banke humane jetre.
Ciljanom mutagenezom u dijelu trombina proizvedene su mutante prema izumu.
Primjer 1
Priprava Ala 558 protrombina
Ciljanom mutagenezom mutiran je kodon GGC za amino kiselinu (As)glicin u položaju 558 (SEQ ID NO: 14) humanog protrombina u kodon GCC za As Ala.
U tu svrhu sintetiziran je oligonukleotid SEQ ID NO: 5 u analognom smjeru gena i njemu komplementaran oligonukleotid SEQ ID NO: 6 u suprotnom smjeru s odgovarajućom nukleotidnom zamjenom. Sukladno 5' kraju protrombinskog gena sintetiziran je u analognom smjeru oligonukleotid SEQ ID NO: 1. Njemu je na kraju 5' dodatno naljepljena sekvenca za restrikcijsko presjecište Eco Rl. Sukladno kraju 3' protrombinskog gena u suprotnom smjeru sintetiziran je oligonukleotid SEQ ID NO: 2 i njenu je također na završetku 5' naljepljena sekvenca za restrikcijsko presjecište Eco Rl .
S 50 mg humane protrombin cDNA kao kalupa i svaki puta po 50 pmolova oligonukleotida SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO. 2, nakon dodatka 2 nM dNTPs, polimeraznog pufera i Pfu-polimeraze (Stratagene) PCR reakcija je provedena u 35 ciklusa od po 1 minute pri 94°C, 2 minute pri 55°C i 3 minute pri 72°C. Sukladno tome provedena je druga PCR s istim kalupom i oligonukleotidima SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 1. Obadva tako nastala fragmenta DNA očišćena su po standardnom propisu (PCR purification kit, Quiagen, Hilden). Po 0,1 pmola obaju fragmenata stavljeno je zajedno, zagrijano 5 minuta na 95°C za denaturiranje i držano 1 sat pri sobnoj temperaturi za renaturiranje. Da bi se postiglo potpunu DNA dvostruku uzvojnicu, nakon dodatka 2 nM dNTPs, polimeraznog pufera i Pfu polimeraze, provedeno je 10 ciklusa od po 1 minutu pri 94°C i po 5 minuta pri 72°C. Za povećanje ukupnih duljina fragmenata za slijedeću PCR reakcijskoj smjesi dodana je po 50 pmolova vanjskih oligonukleotida SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 i nakon još jednog dodatka Pfu-polimeraze provedeno je još 35 ciklusa od po 1 minutu pri 94°C, 2 minute pri 55°C i 3 minute pri 72°C. Tako proizvedena mutirana protrombin cDNA sa zamjenom Gly s Ala u položaju 558 očišćena je po standardnom propisu, naknadno je presječena s restrikcijskom endonukleazom Eco Rl i s T4 ligazom po standardnom propisu klonirana u vektor pUC 18 također presiječen u Eco Rl (Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg).
Primjer 2
Priprava Ala 525, Ala 558 protrombina
Ciljanom mutagenezom mutiran je kodon AGT za As Ser u položaju 525 (SEQ ID NO: 14) humanog protrombina u kodon GCT za As Ala i kodon GGC za As Gly u položaju 558 (SEQ ID NO: 14) u kodon GCC za As Ala.
U tu svrhu provedena je PCR na osnovi protrornbinske mutante DNA iz primjera 1 i oligonukleotida SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 3 s odgovarajućom nukleotidnom zamjenom u Ala na položaju 525 u analognom smjeru, kao i s oligo-nukleotidom SEQ ID NO: 2 (kraj 3' protrombina). Uvjeti pokusa bili su isti kao u primjeru 1. Druga PCR provedena je s cligonukleotidom SEQ ID NO: 4, koji je komplementaran sa SEQ ID NO: 3, te SEQ ID NO: 1 (5' kraj protrombina) Tako dobiveni fragmenti DNA su denaturirani, hibridizirani, popunjeni u dvostruku uzvojnicu i zatim je u skladu s primjerom 1 provedena slijedeća PCR s vanjskim oligonukleotidima SEQ ID NO: li SEQ ID NO: 2.
Tako proizvedena protrombin - mutanta cDNA je očišćena, presiječena s Eco Rl, klonirana u vektor pUC 18 i sekvencirana za kontrolu.
Primjer 3
Priprava Ala 363, Ala 558 protrombina
Ciljanom mutagenezom mutiran je kodon AGT za As His u položaju 363 (SEQ ID NO: 14) humanog protrombina u kodon GCA za As Ala i kodon GGC za As Gly u položaju 558 (SEQ ID NO: 14; u kodon GCC za As Ala.
U tu svrhu provedena je PCR na osnovi protrombinske mutante DNA iz primjera 1 i oligonukleotida SEQ ID NO: 12 s odgovarajućom nukleotidnom zamjenom u Asm na položaju 419 u analognom smjeru, kao i s oligonukleotidom SEQ ID NO: 2 (kraj 3' protrombina). Uvjeti pokusa bili su sukladni onima iz primjera 1. Druga PCR provedena je s oligonukleotidom SEQ ID NO: 13, koji je komplementaran sa SEQ ID NO:12 i sa oligonukleotidom SEQ ID NO: 1 (5' kraj protrombina). Tako dobiveni fragmenti DNA su denaturirani, hibridizirani, nadopunjeni u dvostruku uzvojnicu i zatim je u skladu s primjerom 1 provedena slijedeća PCR s vanjskim oligonukleotidIma SEQ ID NO:1i oligom SEQ ID NO: 2.
Tako dobivena protrombin - mutanta cDNA je očišćena, zatim presiječena s Eco Rl, klonirana u vektor pUC 18 i sekvencirana za kontrolu.
Primjer 4
Ciljanom mutagenezom mutiran je kodon GAC za As Asp u položaju 419 (SEQ ID NO: 14) humanog protrombina u kodon GCA za As Asn i kodon GGC za As Gly u položaju 558 (SEQ ID NO: 14) u kodon GCC za As Ala.
U tu svrhu provedena je PCR na osnovi protrombinske mutante DNA iz primjera 1 i oligonukleotida SEQ ID NO: 12 s odgovarajućom nukleotidnom zamjenom u Asm na položaju 419 u analognom smjeru, kao i oligonukleotidom SEQ ID NO: 2 (kraj 3' protrombina). Uvjeti pokusa bili su sukladni onima iz primjera 1. Druga PCR provedena je s oligonukleotidom SEQ ID NO: 13, koji je komplementaran sa SEQ ID NO: 12 i sa oligonukleotidom SEQ ID NO: 1 (5' kraj protrombina). Tako dobiveni fragmenti DNA su denaturirani, hibridizirani, nadopunjeni u dvostruku uzvojnicu i zatim je u skladu s primjerom 1 provedena slijedeća PCR s vanjskim oligonukleotidima SEQ ID NO: li oligom SEQ ID NO: 2.
Tako dobivena protrombin - mutanta cDNA je očišćena, presječena s Eco Rl, klonirana u vektor pUC 18 i sekvencirana za kontrolu.
Primjer 5
Priprava Ala 525 protrombina
Ciljanom mutagenezom mutiran je kodon AGT za As Ser u položaju 525 (SEQ ID NO: 14) humanog proteina u kodon GCT za As Ala.
U tu svrhu provedena je PCR na osnovi protrombinske mutante DNA iz primjera 1 i oligonukleotida SEQ ID NO: 3 s odgovarajućom nukleotidnom zamjenom u Ala na položaju 525 u analognom smjeru kao i oligonukleotida
SEQ ID NO: 2. (kraj 3' protrombina). Druga PCR provedena je s oligonukleotidom SEQ ID NO: 4 koji je komplementaran sa SEQ ID NO: 3, kao i s oligonukleotidom SEQ ID NO: 1 (5' kraj protrombina) . Tako dobiveni fragmenti DNA su denaturirani, hibridizirani, nadopopunjeni u dvostruku uzvojnicu i zatim je u skladu s primjerom 1 provedena slijedeća PCR s vanjskim oligonukleotidima SEQ ID NO: li SEQ ID NO: 2.
Tako dobivena protrombin - mutanta cDNA je očišćena, presječena s Eco R1., klonirana u vektor pUC 18 i sekvencirana za kontrolu.
Primjer 6
Konstrukcija vektora ekspresije za humanu mutantu protrombina
Za sekretorijsku rekombinantnu ekspresiju u CHO stanicama sisavca na 5' krajeve mutirane protrombin cDNA (vidi primjere 1 do 5) naljepljene su sekrecijske liderske sekvence humanoa pPA gena (Pennica et al., Nature 301, 214-221, 1983). Polazeći od jedne tPA cDNA sa sintetičkim oligonukleotidima SEQ ID NO: 9 (kraj 5' pPA lidera i Eco RI mjesto) kao i SEQ ID NO: 8 (3' kraj tPA lidera, 5' kraj protrombina) tPA sekrecijski lider cDNA povećan je na osnovi PCR. Mutirani fragmenti mutante protrombina povećani su svaki puta s oligonukleotidom SEQ ID NO: 7, koji je komplementaran sa SEQ ID NO: 8, i sa oligonukleotidom SEQ ID NO: 2. tPa liderski fragmenti dodani su dotičnim fragmentima mutante protrombina. Reakcijska smjesa je denaturirana, hibridizirana i nadopunjena u dvostruku uzvojnicu i dotične tPA-lider-protrombin mutante DNA proizvedene su slijedećom PCR provedenom s oligo-nukleotidima SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 2. One su presječene s Eco Rl, klonirane u pUC 18 i sekvencirane za kontrolu.
Za ekspresiju u CHO stanicama te DNA su presječene s Eco R1 iz pUC 18 vektora, izolirane i ponovno uljepljene u Eco Rl presjecišta vektora pc DNA3 neo (Invitrogen, San Diego, SAD). Transkripcija protrombin cDNA stoji u tom vektoru pod kontrolom jakog citomegalivirusanog promotora. Selekcija na transficirane stanice provodi se preko neomicin rezistentnog gena, koji se nalazi u plazmidu, koji omogućuje rast samo G 418 rezistentnih kolonija.
Za transfekciju odgovarajuće DNA, predviđene za ekspresiju u CHO stanicama, linearizirane su s restrikcijskim enzimom PvuI, precipitirane i sterilno preuzete u 10 mM TRIS-pufera (pH 8, 5).
Primjer 7
Ekspresija protrombinske mutante u stanicama sisavca DNA ekspresijskog vektora transificirana je s lipofektaminom (tvrtka Gibco; Life Technologies GmbH; Diesel straβe 5, 76334 Eggenstein, Njemačka; br. 530-8324SA) u stanice sisavca. Upotrijebljene stanice bile su CHO-K1 (ATCC CCL 61); 293 (ATCC CRL 1573).
Po 2x105 stanica /ml stavljeno je u 3 ml medija za rast po jamici ploče za uzgoj kultura sa 6 jamica. Transfekcija je provedena slijedećeg dana. U tu svrhu stanice su jednom isprane s medijem bez seruma. Transfekcija je provedena s lipofektaminom prema podacima proizvođača, tvrtke Gibco (Focus, 1993, 15, br. 3, 73-78). Svaka jamica sadržavala je 1 µg DNA i 6 µl lipofektamina, koji su stavljeni zajedno u 1000 µl medija za staničnu kulturu bez seruma. Nakon 6 sati inkubacije pri 37°C transfekcijski medij je odsisan i stanice su inkubirane preko noći s normalnim medijem za rast (koji je sadržavao fetalni teleći serum, FCS).
Primjer 8
Transijentna ekspresija protrombinskih mutanti u 293 stanicama držane su u DMEM mediju (Gibco br. 41965) + 10%
FCS (Biowhittaker br.11601B).
Transfekcija jc provedena kako je gore opisano. Pri tome, za povišenje ekspresije provedena je ko-transfekcija s plazmidom pAdVantage (tvrtka Promega br. E1711). 0,2 µg pAdVantagE DNA, kao i 0,8 µg DNA dotične protrombinske mutante transficirano je u vektor ekspresije pcDNA3, kako je gore opisano. Prvi dan nakon transfekcije odsisan je medij koji je sadržavao serum i nadomješten je s medijem bez seruma (bez fenolnog crvenog). Treći dan nakon transfekcije uzet je ostatak stanične kulture i do ispitivanja je odložen pri -20°C,
Primjer 9
Stabilna ekspresija protrombinske mutante u CHO-K1 stanicama.
Transfekcija je provedena kako je gore opisano. CHO stanice držane su i hranjene u DMEM/F12 = 1:1 (Gibco br. 21331-020) + 10% FCS. Prvi dan nakon transfekcije stanice su smrvljene, tako da je iz jedne jamice 6 jamične ploče zasijano 20 do 100 Petrijevih zdjelica veličine 10 cm. Istovremeno započeta je selekcija rekombinantnih stanica obradom s G148 (tvrtka Gibco, 1200 µg/ml u mediju). Dobivene rezistentne kolonije podijeljene su metodom "cilindra za kloniranje" i nakon obilnog hranjenja kad se je dobio dovoljan broj stanica, ispitane su što se tiče ekspresije mutante trombina. U tu svrhu odsisan je medij od konfluentnih stanica i nadomješten je sa svježim medijem bez seruma. Nakon utvrđenog vremena, npr. nakon 24 sata, 48 sati uzet je ostatak stanične kulture i ispitan što se tiče prisutnog protrombina pomoću ELlSA.
Za povećanje ekspresije dobivene rekombinantne stanice djelomično su klonirane prorjeđivanjem u mikrotitarskim pločama.
Da bi se pripremile dovoljne količine ostatka stanične kulture bez seruma, dobro eksprimirajuće CHO stanice hranjene su s 10% FCS-a u različitim posudama za kulture do konfluencije u mediju. Na kraju, stanice su isprane s PBS-om i inkubirane s DMEM/F12 mediju (DMEM: Gibco br. 11880-028; F12: Gibco br. 21765-029 mješavina se sastoji iz jednakih volumnih udjela). DMEM koji se je koristio za tu svrhu bio je bez fenolnog crvenog. Nakon dva, odnosno tri dana uvijek je slijedila zamjena medija ("žetva"), da se pokupi ostatak stanične kulture koji sadrži protrombinsku mutantu. Na taj način moglo se je pokupiti do 10 puta iz jedne posude za kulture. Pri tome su različite žetve iz različitih posuda za kulture sjedinjene da se postigne volumen dovoljan za čišćenje.
Primjer 10
Dokazivanje ekspresije rekombinantne mutante protrombina
Stanice, koje eksprimiraju protrombin i secerniraju u mediju za staničnu kulturu, ispitane su na prisutnost rekombinantnog protrombina, tako da je ostatak stanične kulture od konfluentnih stanica ispitan na prisutnost protrombina pomoću ELISA, ili nakon cijepanja protrombina, na trombinsku aktivnost, odnosno trombin-antigen.
U tu svrhu uzet je ostatak stanične kulture bez seruma nakon različitog trajanja kulture. Cijepanje protrombina prisutnog u suvišku stanične kulture postignuto je pomoću snake vernoma (tvrtka Sigma; kat. br. V3129). Svaka reakcijska smjesa obrađena je na slijedeći način:
388 µl uzorka (ostatka stanične kulture ili protrombina bez seruma),
63 µl snake venoma (0,2 mg/ml u H20) ,
50 µl pufera (1 M NaCl; 100 mM CaCl2; 200 mM TRIS, pH 7,4),
100 µl H20.
Reakcijska smjesa za cijepanje inkubirana je 45 minuta pri sobnoj temperaturi.
Na kraju je nastali trombin karakteriziran različitim ispitivanjima.
Primjer 11
Dokazivanje mutanti protrombina i mutanti trombina pomoću ELISA
ELISA za određivanje protrombina i trombina provedena je po slijedećoj shemi:
- Mikrotirarske ploče prevučene su sa 0,1 ml/jamici anti-trombin-antitijela; 5 µg/ml 0,05 M, NaHC03, pH 9,2; 16 sati/4°C,
- hranjenje s 1% BSA/PBS; 0,3 ml/jamici; 0,5-1 sat pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje 3x sa 0,5% Tween 20/PBS,
- 11 standardno razrjeđenje humanog trombina
(Calbiochem 605195; 3,159 NIH U/mg), započeto s 10 ng/ml 0,1% BSA/0,05% Tween 20/PBS u drugoj fazi; paralelno s tim razrjeđenje uzoraka za ispitivanje; 0,1 ml/jamici; 2-4 sata pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje kao gore,
- 0,1 ml/jamici biotiniliranih anti-trombin-antitijela
1:200; razrijeđeno u 0,1% BSA/0,05% Tween 20/ PBS; 2-4 sata pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje kao gore,
- 0,1 ml/jamici kompleksa streptavidin-peroksidaze
(B.M. 1089153); razrijeđeno 1:10000 u 0,1% BSA/0,05% Tween 20/PBS; 30 minuta pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje kao gore,
- 0,1 ml/jamici peroksidaznog supstrata,
- zaustavljanje reakcije s 0,1 ml/jamici 2 M H2S04,
- mjerenje apsorpcije pri 450 nm, peroksidazni supstrat: 0,1 ml TBM otopine (42 mM TBM u DMSO) i 10 ml supstratnog pufera, (0,1 M natrijevog acetata pH 4,9), miješanje; zatim dodatak 14,7 µl 3%-tnog H202.
Primjer 12
Priprava antitijela prema humanog trombinu
Za indukciju poliklonalnih antitijela imuniziraju se kunići kako slijedi:
1. dan: 200 µg humanog trombina u 0,5 ml PBS/cjelovit Freundov dodatak (Sigma F5881),
14. dan: 200 µg humanog trombina u 0,5 ml PBS/nepotpun Freundov dodatak (Sigma F5506),
28. dan: 200 µg humanog trombina u 0,5 ml PBS/nepotpun Freundov dodatak,
42. dan: 200 µg humanog trombina u 0,5 ml PBS~a.
7 dana nakon posljednje imunizacije slijedilo je uzimanje krvi iz vene uha kunića.
Čišćenje poliklonalnih kunić-antitijela iz dobivenog seruma slijedilo je preko proteina A Sepharose (po uputama proizvođača, tvrtka Pharmacia) s iskorištenjem od 65 mg IgG/10 ml seruma. Prije biotinilacije antitijela su dijalizirana prema 0,05 M NaHC03, pH 9,0 (2x2 1), zatim je slijedio dodatak 200 µl Biotin-X-NHS-estera (Calbiochem 203189; 1 mg/ml H20) na 600 µl antitijela (2,4 mg/ml) i mućkano je 2 sata pri sobnoj temperaturi. Na kraju je dijalizirano 3 puta prema PBS-u.
S dobivenim antitijelima izgrađen je sendvič-ELISA:
- Mikrotirarske ploče prevučene su sa 0,1 ml/jamici anti-trombin-antitijela; 5 µg/ml u 0,05 M NaHC03, pH 9,2; 16 sati/4°C,
- hranjenje s 1% BSA; 0,3 ml/jamici; 0,5 sata pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje 3x sa 0,05% Tween 20/PBS,
- 11 standardno razrjeđenje humanog trombina
(Calbiochem 605195) hvatanje s 10 ng/ml 0,1% BSA/PBS/0,05% Tween 20 u drugoj fazi; paralelno s tim razrjeđenje uzoraka za ispitivanje; 0,1 ml/jamici; 2 sata pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje kao gore,
- 0,1 ml/jamici biotiniliranih anti-trombin-antitijela
1:200; razrijeđeno u 0,1% BSA/PBS 0,05% Tween 20; 2 sata pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje kao gore,
- 0,1 ml/jamici kompleksa streptavidin-peroksidaze
B.M. 1089153); razrjeđenje 1:10000 u 0,1% BSA/PBS/0,05% Tween 20; 30 minuta pri sobnoj temperaturi,
- 0,1 ml/jamici peroksidaznog supstrata,
- zaustavljanje reakcije s 0, 1 ml/jamici 2 M H2S04,
- mjerenje apsorpcije (OD) pri 450 nm.
Na slici 1 prikazana je apsorpcija (OD) u ovisnosti o koncentraciji trombina.
Peroksidazni supstrat: 0,1 ml TBM otopine (42 mM TBM u DMSO) i 10 ml supstratnog pufera (0,1 M natrijevog acetata pH 4,9), miješanje; zatim dodatak 14,7 µl 3%-tnog H202.
Dokazivanje protrombinskih mutanti i mutanti trombina pomoću ELISA:
ELISA za određivanje protrombina i trombina provedena je po slijedećoj shemi:
- Mikrotirarske ploče prevučene su sa 0,1 ml/jamici anti-trombin-antitijela; 5 µg /ml u 0,05 M NaHCO3, pH 9,2; 16 sati/4ºC
- hranjenje s 1% BSA/PBS; 0,3 ml/jamici; 0, 5-1 sat pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje 3x sa 0,05% Tween 20/PBS,
- 11 standardno razrjeđenje humanog trombina
(Calbiochem 605195; 3,159 NIH U/mg), hvatanje s 10 ng/ml 0,1% BSA/0,05% Tween 20/PBS u drugoj fazi; paralelno s tim razrjeđenje uzoraka za ispitivanje; 0,1 ml/jamici; 2-4 sata pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje kao gore,
- 0,1 ml/jamici biotiniliranih anti-trombin-antitijela 1:200; razrijeđeno u 0,1% BSA/0,05% Tween 20/PBS; 2-4 sata pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje kao gore,
- 0,1 ml/jamici kompleksa streptavidin-peroksidaze
(B.M. 1089153); razrjeđenje 1:1000 u 0,1% BSA/PBS/0,05% Tween 20/PBS; 30 minuta pri sobnoj temperaturi,
- ispiranje kao gore,
- 0,1 ml/jamici peroksidaznog supstrata,
- zaustavljanje reakcije s 0,1 ml/jamici 2 M H2S04,
- mjerenje apsorpcije pri 450 nm.
Peroksidazni supstrat: 0,1 ml TBM otopine (42 mM TBM u DMSO) i 10 ml supstratnog pufera (0, 1 M natrijevog acetata pH 4,9), miješanje; zatim dodatak 14,7 µl 3%-tnog H202.
Primjer 13a
Čišćenje humanog trombina iz krvne plazme
Čišćenje humanog protrombina iz humane citraplazme izvršeno je kako je opisao Henrikson (Methods in Enzymology, Vol 222, str. 312-3279). Cijepanje protrombina i čišćenje trombina izvršeno je heparinskom kromatografijom kako je opisano u primjerima 14 i 15. Frakcije koje su sadržavale trombin određene su kromogenim ispitivanjem trombina sa S 2238 i skoncentrirane ultrafiltracijom na 1 mg/ml i dijafi1trirane prema PBS-u.
Određivanje aktivnosti trombina s kromogenim supstratom S 2238
Aktivnost mutante trombina određuje se cijepanjem jednog tripeptida. U tu svrhu postupa se po slijedećoj shemi pipetiranja:
50 µl zorka (trombin 0,5 U/ml; ili rascijepljeni protrombin različitih razređenja),
100 µl vode,
50 µl S-2238 (1 mg/ml u vodi; tvrtka Chromogenix, Mölndal, Švedska).
Reakcijske smjese inkubiraju se 10-15 minuta pri 37°C. Na kraju se mjeri apsorpcija pri valnim duljinama od 405 nM i količine trombina se odrede pomoću baždarne krivulje između 0,01 i 1 U/ml.
Primjer 13b0
Čišćenje protrombinske mutante kromatografijom s anionskom i zmjenom
35 l ostatka stanične kulture iz CHO stanične kulture, koji sadrži protrombin, najprije se koncentrira ultrafiItracijom pri 4C (SPS 400 Membran, Fresenius, St. Wendel) na 400 ml i dijafiltrira se prema 10 mM TRIS pH 7,5 dok se dobije vodljivost od 1,1 mS/cm. Odsoljeni filtrat se zatim prenese na Q-Sepharosnu FF kolonu (promjera 5 cm, volumena 530 ml) s brzinom protoka od 6 ml/min, kolonu se ispere s početnim puferom (20 mM TRIS/HC1 pH 7,5) i na kraju se razvije s gradijentima nakon 400 mM NaCl preko 15 volumena kolone. Frakciie koje sadrže protrombin identificiraju se pomoću ELISA. Protrombmska mutanta ispire se od 280 mM NaCl. Iz te kolone izolira se otprilike 150 - 200 mg proteina.
Primjer 14
Oslobađanje mutante trombina iz protrombina
Frakcije koncentrirane na Amiconu YM 30 (krajnji volumen 20 ml, ukupno 170 mg proteina) Q-Sepharose kromatografije dijaliziraju se prema 2 litre 20 mM TRIS/HC1 pH 7,5, 100 mM NaCl i za cijepanje se namjeste na krajnju koncentraciju od 10 mM dodatkom 1 M CaCl2, 20 mM TRIS HC1 pH 7,5. Nakon dodatka 30 mg zmijskog otrova iz Oxiranus scutellatus cijepa se uz miješanje pri 4°C i reakciju se zaustavi nakon. 12 sati dodatkom 2 ml 20 mM otopine EGTA, pH 7,5.
Primjer 15
Čišćenje mutante trombina heparinskom kromatografijom
Reakcijska smjesa za cijepanje iz primjera 14, koja sadrži trombin, prenese se na kraju na kolonu heparinske Sepharose (14 cm x 1 cm, Pharmacia) s brzinom protoka od 38 cm/h. Nakon ispiranja kolone s 20 ml 20 mM Na fosfata, 0,1 M NaCl, pH 7,5, 0,01% Pluriola F 68, kolonu se razvije s linearnim gradijentima nakon 600 mM NaCl, 20 mM Na fosfata, pH 7,5, 0,01% Pluriola F68 preko 150 ml. Mutanta trombina odredi se pomoću ELISA. Mutante se ispiru pri otprilike 400 mM NaCl. Dobiveno je 30 - 35 mg mutante i nakon dodatka BSA (1 mg/ml) dijalizirano je prema PBS-u, 0,01% Pluriola F68 i odloženu pri 20ºC.
Primjer 16
Neutralizacija hirudina u sistemu in vitro
Antidot djelovanje inaktivnih rekombinantnih trombina na hirudin dokazano je ispitivanjem aktivnosti trombina. U tu svrhu zajedno su inkubirani hirudin, ispitna mutanta trombina, aktivni tromibn i S-2238. Ovo ispitavanje temelji se na načelu neutralizacije (ili kompeticije) hirudina s ispitnim inaktivnim trombinom, kao i višom aktivnošću aktivnog trombina koja iz toga proizlazi.
U tu svrhu postupilo se je po slijedećoj shemi pipetiranja:
100 µl hirudina HL20 (1,5 U/ml), odnosno 0,1 BSA u TBS pH 7,5 i 100 ul mutante trombina (proizvedene u primjeru 2) prethodno je inkubirano 5 minuta pri sobnoj temperaturi. Nakon dodatka 50 µl aktivnog trombina (0,5 U/ml) reakcija je započeta dodatkom 50 µl S-2238 (1 mg/ml u vodi; tvrtka Chromogenix, Mölndal, Švedska). Reakcijske smjese inkubirane su 15 minuta pri 37°C. Na kraju je izmjerena apsorpcija pri valnim duljinama od 410 nM. Neutralizacija hirudina s inaktivnom mutantom trombina dovodi do povišenja apsorpcije (Slika 2).
Primjer 17
Neutralizacija PEG hirudina u psu
Psima Beagle (9,81-13,5 kg) subkutano je apliciran PEG-hirudin dozom od 10 mg/kg. 180 minuta nakon injekcije aplicirana je mutanta trombina (trombin mut#3), proizvedena kao u primjeru 2, kao intravenska infuzija s dozom od 20 mg/kg tijekom 50 minuta. Uzorci krvi psima su uzeti punkcijom vene brachialis na početku pokusa, a slijedeći uzorci uzimani su nakon 150 minuta u vremenskom razdoblju do 6 sati. Iz citrat-krvi plazma je dobivena centrifugiranjem pri 2000 g tijekom 20 minuta i do analize je odložena pri -20°C.
U uzorcima krvi. određena je antitrombinska aktivnost kako su opisali Spannagel et al., Blood Coagulation Fibrinolvsis, 1991, 2; 121-127. Antikoagulacijska aktivnost (aPTT) određena je pomoću Pathromtin sistema (Behring).
Rezultati su prikazani na slici. Dok u kontrolnim životinjama nakon aplikacije PEG-hirudina antitrombinska aktivnost brzo raste, kod životinja obrađenih s antidotom moglo se je spriječiti antitrombinsku aktivnost (slika 3b). Po završetku infuzije antidota, plazma razina PEG-hirudina rasla je dalje brzinom sličnom onoj u kontrolnih životinja.
Prilog: Protokol sekvenci
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: Carl-Bosch-Strasse 38
(C) ORT: Ludwigshafen
(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 67056
(G) TELEPHON: 0621/6048526
(H) TELEFAX: 0621/6043123
(I) TELEX: 1762175170
(ii) ANMELDETITEL: Neue Thrombinmuteine und ihre Verwendung als Antidot
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 14
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GGGGGGGAAT TCGCCAACAC CTTCTTGGAG GAG 33
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
GGGGGGGAAT TCCTACTCTC CAAACTGATC AAT 33
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEOUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
GGATGCCTGT GAAGGTGACG CTGGGGGACC CTTTGTCATG 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
CATGACAAAG GGTCCCCCAG CGTCACCTTC ACAGGCATCC 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
GACCGGGATG GGAAATATGC CTTCTACACA CATGTGTTCC 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
GGAACACATG TGTGTAGAAG GCATATTTCC CATCCCGGTC 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
TCCATGCCCG ATTCAGACGC GCCAACACCT TCTTGGAGGA 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
TCCTCCAAGA AGGTGTTGGC GCGTCTGAAT CGGGCATGGA 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
GGGGGGGAAT TCGTGAAGCA ATCATGG 27
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
CTCACCGCCG CCGCATGCCT CCTGTACCCG 30
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
CGGGTACAGG AGGCACACGG CGGCGGTGAG 30
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
GAACCTGGAC CGGAACATTG CCCTGAT 27
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS zu mRNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
ATCAGGGCAA TGTTCCGGTC CAGGTTC 27
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEOUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 579 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
[image] [image]
Claims (10)
1. Mutanta trombina, naznačena time, da u usporedbi s prirodnim trombinom ima slijedeće sekvencne razlike
(a) zamjena jednog Gly s Ala, pri čemu se Gly nalazi u okruženju sekvence Tyr-Gly-Phe i u prirodnom humanom protrombinu (SEQ ID NO: 14) zauzima položaj 558;
(b) najmanje jedna zamjena ili delecija slijedećih ostataka.
(b1) His koji se nalazi u okruženju sekvence Ala-His-Cys i u prirodnom humanom protrombinu (SEQ ID NO: 14) zauzima položaj 363
(b2) ASp koji se nalazi u okruženju sekvence Agr-Asp-Ile i u prirodnom humanom, protrombinu (SEQ ID NO: 14) zauzima položaj 419;
(b3) Ser koji se nalazi u okruženju sekvence Asp-Ser-Gly i u prirodnom humanom protrombinu (SEQ TD NO: 14) zauzima po1ož aj 525.
2. Mutanta trombina prema zahtjevu 1, naznačena time, da u usporedbi s prirodnim protrombinom (SEQ ID NO: 14) ima slijedeće sekvencne razlike
(a) zamjena Gly sa Ala, na položaju 558 i
(b) najmanje jedna zamjena ili delecija slijedećih ostataka
(b1) His na. položaju 363;
(b2) Asp na položaju 419;
(b3) Ser na položaju 525.
3. Mutanta trombina prema zahtjevu 2, naznačena time da je sekvencna razlika (b) zamjena na položaju 525.
4. Mutanta trombina prema zahtjevu 3, naznačena time, da je sekvencna razlika (b) zamjena Ser s Ala.
5. Sekvenca nukleinske kiseline, naznačena time, da kodira za mutantu trombina prema zahtjevima 1 do 4 .
6. Upotreba mutante trombina prema zahtjevima 1 do 4, naznačena time, da se rabi kod liječenja poremećaja zgrušavanja.
7. Upotreba prema zahtjevu 6, naznačena time, da se primjenjuje kao antidot za inhibitore trombina.
8. Upotreba prema zahtjevu 7, naznačena time, da se primjenjuje kao antidot za hirudine, mutante hirudina ili derivate hirudina.
9. upotreba prema zahtjevu », naznačena time, da se primjenjuje kao antidot za derivate hirudina modificirane s polietilen glikolom.
10. Antidot za inhibitore trombina, naznačen time, da sadrži mutantu trombina prema zahtjevima 1 do 4 zajedno s farmaceutski uobičajenim pomoćnim tvarima.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19605126A DE19605126A1 (de) | 1996-02-12 | 1996-02-12 | Thrombinmuteine als Antidot für Thrombininhibitoren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP970077A2 true HRP970077A2 (en) | 1998-04-30 |
Family
ID=7785198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR19605126.6A HRP970077A2 (en) | 1996-02-12 | 1997-02-11 | Thrombin muteins as antidotes for thrombin inhibitors |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6060300A (hr) |
| EP (1) | EP0880591A1 (hr) |
| JP (1) | JPH11512621A (hr) |
| KR (1) | KR19990082479A (hr) |
| CN (1) | CN1211280A (hr) |
| AR (1) | AR005797A1 (hr) |
| AU (1) | AU1768497A (hr) |
| BR (1) | BR9707280A (hr) |
| CA (1) | CA2245546A1 (hr) |
| CO (1) | CO4600682A1 (hr) |
| CZ (1) | CZ247798A3 (hr) |
| DE (1) | DE19605126A1 (hr) |
| HR (1) | HRP970077A2 (hr) |
| HU (1) | HUP9900574A2 (hr) |
| IL (1) | IL125077A0 (hr) |
| NO (1) | NO983677D0 (hr) |
| WO (1) | WO1997029198A1 (hr) |
| ZA (1) | ZA971107B (hr) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20000018933A (ko) * | 1998-09-07 | 2000-04-06 | 김승수 | 내피세포 성장억제 활성을 가지는 사람 프로트롬빈 크링글단백질 및 이를 암호하는 유전자 |
| GB2355161B (en) * | 1999-10-05 | 2001-09-12 | 3Com Corp | Network device incorporating selective compression of stored data packets |
| KR20020008471A (ko) * | 2000-07-20 | 2002-01-31 | 김승수 | 내피세포 성장 억제활성을 가지는 인간 프로트롬빈크링글, 그것의 재조합벡터 및 이를 발현하는 재조합 숙주 |
| JP2009528843A (ja) * | 2006-03-06 | 2009-08-13 | ヒューマジーン・インコーポレイテッド | 組換えヒトトロンビンおよびフィブリノゲンの調製法 |
| CN103446579B (zh) | 2007-09-28 | 2015-04-22 | 普托拉制药有限公司 | 用于因子xa抑制剂的解毒剂和其使用方法 |
| NZ592837A (en) | 2008-11-14 | 2012-10-26 | Portola Pharm Inc | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same in combination with blood coagulating agents |
| EP2414517B1 (en) | 2009-03-30 | 2016-09-21 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| US9056106B2 (en) | 2009-07-15 | 2015-06-16 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor Xa inhibitors and methods of using the same |
| ES2620421T3 (es) * | 2009-10-30 | 2017-06-28 | Senova Gesellschaft für Biowissenschaft und Technik mbH | Peptidasas acopladas a polímero |
| AR079944A1 (es) | 2010-01-20 | 2012-02-29 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpo neutralizante de la actividad de un anticoagulante |
| AP2013007046A0 (en) | 2011-03-30 | 2013-08-31 | Boehringer Ingelheim Int | Anticoagulant antidotes |
| KR102245264B1 (ko) | 2014-05-26 | 2021-04-28 | 아카데미슈 지켄후이스 라이덴 | 출혈 치료를 위한 프로혈액응고 단백질 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4203965A1 (de) * | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Max Planck Gesellschaft | Antidot fuer hirudin und synthetische thrombininhibitoren |
-
1996
- 1996-02-12 DE DE19605126A patent/DE19605126A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-02-11 AU AU17684/97A patent/AU1768497A/en not_active Abandoned
- 1997-02-11 EP EP97903254A patent/EP0880591A1/de not_active Withdrawn
- 1997-02-11 CZ CZ982477A patent/CZ247798A3/cs unknown
- 1997-02-11 CO CO97006960A patent/CO4600682A1/es unknown
- 1997-02-11 IL IL12507797A patent/IL125077A0/xx unknown
- 1997-02-11 US US09/117,708 patent/US6060300A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-11 CN CN97192210A patent/CN1211280A/zh active Pending
- 1997-02-11 HR HR19605126.6A patent/HRP970077A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1997-02-11 BR BR9707280A patent/BR9707280A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-11 JP JP9528173A patent/JPH11512621A/ja active Pending
- 1997-02-11 HU HU9900574A patent/HUP9900574A2/hu unknown
- 1997-02-11 WO PCT/EP1997/000612 patent/WO1997029198A1/de not_active Application Discontinuation
- 1997-02-11 KR KR1019980706212A patent/KR19990082479A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-02-11 ZA ZA971107A patent/ZA971107B/xx unknown
- 1997-02-11 CA CA002245546A patent/CA2245546A1/en not_active Abandoned
- 1997-02-12 AR ARP970100548A patent/AR005797A1/es unknown
-
1998
- 1998-08-11 NO NO983677A patent/NO983677D0/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9707280A (pt) | 1999-07-20 |
| NO983677L (no) | 1998-08-11 |
| ZA971107B (en) | 1998-08-11 |
| CN1211280A (zh) | 1999-03-17 |
| JPH11512621A (ja) | 1999-11-02 |
| NO983677D0 (no) | 1998-08-11 |
| IL125077A0 (en) | 1999-01-26 |
| DE19605126A1 (de) | 1997-08-14 |
| KR19990082479A (ko) | 1999-11-25 |
| WO1997029198A1 (de) | 1997-08-14 |
| US6060300A (en) | 2000-05-09 |
| CO4600682A1 (es) | 1998-05-08 |
| CA2245546A1 (en) | 1997-08-14 |
| CZ247798A3 (cs) | 1999-03-17 |
| EP0880591A1 (de) | 1998-12-02 |
| HUP9900574A2 (hu) | 1999-06-28 |
| AR005797A1 (es) | 1999-07-14 |
| AU1768497A (en) | 1997-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU744428B2 (en) | Factor X analogues with a modified protease cleavage site | |
| EP1781782B1 (en) | Modified vitamin k dependent polypeptides | |
| AU643247B2 (en) | Activatable fibrinolytic and anti-thrombotic proteins | |
| JP2004525074A (ja) | 炎症を治療するための方法 | |
| AU732953B2 (en) | Factor X deletion mutants and analogues thereof | |
| US20060234935A1 (en) | Mutants of the factor VII epidermal growth factor domain | |
| HRP970077A2 (en) | Thrombin muteins as antidotes for thrombin inhibitors | |
| AU646633B2 (en) | Soluble analogs of thrombomodulin | |
| US5876971A (en) | Thrombin inhibitor from the saliva of protostomia | |
| EP0861326A1 (en) | Hybrid factor viii with modified activity | |
| AU741798B2 (en) | Recombinant protein C and protein S variants | |
| US20150337284A1 (en) | Factor ix variants | |
| Meulien et al. | Increased biological activity of a recombinant factor IX variant carrying alanine at position+ 1 | |
| US8088372B2 (en) | Thrombin mutant | |
| AU2003212739A1 (en) | Recombinant protein c variants | |
| MXPA99007817A (en) | Factor x deletion mutants and analogues thereof | |
| MXPA99007768A (en) | Factor x analogues with a modified protease cleavage site |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| ODBC | Application rejected |