KR20020008471A

KR20020008471A - 내피세포 성장 억제활성을 가지는 인간 프로트롬빈크링글, 그것의 재조합벡터 및 이를 발현하는 재조합 숙주

Info

Publication number: KR20020008471A
Application number: KR1020000041650A
Authority: KR
Inventors: 김승수
Original assignee: 김승수
Priority date: 2000-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2002-01-31
Also published as: WO2002008276A1; AU2001271111A1

Abstract

본 발명은 내피세포 성장 억제활성을 가지는 인간 프로트롬빈 크링글 단백질 및 이를 발현하는 재조합벡터 및 그 벡터로 형질전환된 재조합 대장균에 관한 것으로, 본 발명의 단백질은 암 또는 관절염 등 내피세포 비정상적 성장과 관련된 질병의 치료에 이용할 수 있다.

Description

내피세포 성장 억제활성을 가지는 인간 프로트롬빈 크링글, 그것의 재조합벡터 및 이를 발현하는 재조합 숙주{Human prothrombin kringle with endothelial cell growth inhibitory activity, vector and host thereof}

본 발명은 내피세포 성장 억제활성을 가지는 인간 프로트롬빈 크링글 및 이를 발현하는 재조합벡터 및 그 벡터로 형질전환된 재조합 대장균에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 사람 프로트롬빈으로부터 유래되었으며 내피세포 성장 억제활성을 가지는, '인간 프로트롬빈 크링글 1'과 '인간 프로트롬빈 크링글 1-2'로 명명된, 크링글 구조를 포함하는 두 가지 단백질과 이를 발현하는 재조합 대장균에 관한 것이다.

일반적으로 세포증식은 살아있는 생명체에서 진행되는 과정이고, 규칙적인 세포주기를 유지하기 위해서는 많은 인자들과 신호들이 관여한다. 세포분열의 일반적인 과정은 핵분열과 세포질분열로 나뉘고, 생명체는 계속 성장하고, 세포들이 계속 대체되므로, 세포분열은 생명현상에 있어서, 매우 중요한 과정이다. 세포의 성장과 분열은 세포의 성장공간, 특정 촉진 및 저해인자를 포함하는 다양한 피드백조절기작에 의해 조절된다.

정상적인 세포분열이 깨지면, 생물학적 질병이 일어나게 된다. 성장의 파괴는 여러 신호화합물의 부족이나 과잉 또는 환경변화등과 같은 다양한 인자들에 의해 일어날 수 있다. 그런 병들로는 암, 배의 비정상발생, 황체의 비정상적 형성, 상처치료의 어려움 및 면역반응의 이상 등이 있다.

암은 비정상적인 세포증식에 의한 것으로, 암세포는 다른 조직에 침투하는 능력과 혈관 형성을 유도하는 능력 등 숙주에게 치명적인 성질들을 갖는다. 암세포의 특징 중 하나가 정상세포에서의 분열을 조절하는 능력을 상실하여 숙주세포가 죽을 때 까지 계속 분열하는 것이다.

혈관형성(angiogenesis) 및 이와 관련된 질병은 세포성장과 밀접한 관련이 있다. 여기서 혈관형성이란 조직이나 장기 속으로 새로운 혈관이 형성되는 것을 의미한다. 정상적인 생리적 조건하에서 인간이나 동물들은 상처를 아물게 하거나 배발생 등의 아주 제한된 상황하에서만 혈관형성을 한다.

본 발명에서 "내피"란 심장, 혈관 , 림프관과 몸의 장액성 공간을 둘러싸는 상피의 층을 의미하는 것이고, 이 세포들을 "내피세포"라 한다. "내피세포저해활성"이란 일반적으로 혈관형성을 억제하는 분자의 능력을 의미하는 것이고, 내피세포증식의 저해도 혈관형성의 저해를 일으킨다. 혈관형성은 유사한 형태로 진행되는 것으로 생각되어 진다. 기저막에 의해 둘러쌓인 내피세포와 혈관주위세포가 모세혈관을 형성한다. 혈관형성은 내피세포와 백혈구에 의해 분비된 효소에 의해 기저막이 파괴되면서 시작된다. 그 후에 내피세포가 기저막을 통하여 튀어나온다.혈관형성 촉진물질이 내피세포가 파괴된 기적막을 통하여 이동하게 하고, 이동한 세포가 원래혈관에 스프라우트(sprout)를 형성하며, 여기서 내피세포가 핵분열과 증식을 진행한다. 내피스프라우트가 서로 연결되어 모세 루프(loop)를 형성하여 새로운 혈관을 만든다.

계속적이고, 조절되지 않는 혈관형성은 많은 질병의 상태, 암전이 및 내피세포에 의한 비정상적인 성장에서 일어난다. 비조절된 혈관형성이 존재하는 다양한 병리학적 질병을 맥관유래의(angiogenic)이라고 한다. 이들 질병은 비정상적이고, 바람직하지 않은 세포증식 특히 내피세포증식의 결과이다.

종양의 성장이 혈관형성이다라는 가설은 1971년 Judah Folkman(N. Engl. Jour. Med. 285:1182-1186,1971)에 의해 처음 제안되었다. 그 가설은 일단 종양"take"가 일어나면 종양세포군의 증가마다 종양에 모인 새로운 모세혈관의 증가가 선행되어야 한다는 것이다. 현재 종양"take"는 종양세포가 수백만 이하인 종양성장의 전혈관(prevascular)기를 나타내는 것으로 이해된다. 이 시기를 넘어서 종양체적의 팽창은 새로운 모세혈관의 유도를 필요로 한다.

종양성장이 혈관형성에 의존한다는 간접적 증거들이 미국특허 제5,885,735에 기재되어 있다.

따라서, 세포증식 특히 내피세포의 증식이 암의 전이에 중요한 역할을 하고, 만약 이 비정상적인 증식활성이 저해될 수 있다면, 암은 성장하지 않을 것이므로, 비독성이고, 부작용이 없는 내피세포의 증식을 저해하여 종양 혈관의 형성 등을 억제하는 물질을 개발할 필요성이 있었다.

본 발명은 상기한 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 내피세포 성장 억제활성을 가지는 인간 프로트롬빈 크링글 1 및 1-2를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 인간 프로트롬빈 크링글 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 인간 프로트롬빈크링글을 발현하는 재조합 대장균을 제공하는 것이다.

도 1은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 의하여 증폭된 인간 프로트롬빈 크링글 1 및 1-2의 cDNA를 1.5% 아가로오스 젤 전기영동으로 분석한 사진이다.

도 2는 인간 프로트롬빈 크링글 1을 발현하는 재조합 발현벡터 pEF-32hK1을 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 3은 인간 프로트롬빈 크링글 1-2를 발현하는 재조합 발현벡터 pEF-hK1-2를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 4는 인간 프로트롬빈 크링글 1의 cDNA가 pET32b+ 벡터에, 인간 프로트롬빈 크링글 1-2의 cDNA가 pET22b+ 벡터에 클로닝되었음을 보여주는 1.5% 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.

도 5는 인간 프로트롬빈 크링글 1이 미생물 대장균 AD494(DE3)pLysS에서 과량 발현되는 것을 보여주는 사진이다.

도 6은 인간 프로트롬빈 크링글 1-2가 미생물 대장균 BL21(DE3)pLysS에서 과량 발현되는 것을 보여주는 사진이다.

도 7은 인간 프로트롬빈 크링글 1을 대장균으로부터 분리하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 8은 대장균으로부터 분리, 정제된 인간 프로트롬빈 크링글 1을 SDS-PAGE로 분석한 젤 사진이다.

도 9는 인간 프로트롬빈 크링글 1의 혈관형성 억제활성을 보여주는 그래프이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열정보 1에 기재된 내피세포 성장 억제활성을 가지는 인간 프로트롬빈 크링글 1 단백질 및 서열정보 2에 기재된 인간 프로트롬빈 크링글 1-2 단백질을 제공한다.

또 본 발명의 인간 프로트롬빈 크링글 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터로 일반적으로 많이 사용하는 프라스미드 벡터나 바이럴 벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 크링글 1 단백질을 발현하는 재조합벡터로 pEF-32hK1 및 인간 프로트롬빈 크링글 1-2 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터 pEF-hK1-2을 제공한다.

또한 본 발명의 크링글 단백질을 발현하는 숙주세포로는 원핵 및 진핵세로를 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 대장균 숙주세포를 사용하였다.

본 발명의 재조합 크링글 단백질은 일반적인 단백질 정제방법을 통하여 정제될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 대장균추출물을 이온교환수지 크로마토그래피에 적용하고, 히스티딘-태그를 이용하여 태그 결합된 인간 프로트롬빈 크링글 1을 수득하고, 엔테로카이네이즈를 처리하여 태그를 제거하는 단계를 포함하는 정제방법을 사용하였다.

또한 본 발명은 재조합 인간 프로트롬빈 크링글 1을 이용하여 포유동물의 내피세포 성장 억제방법을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

혈액응고 과정의 주 조절물질인 트롬빈(thrombin)의 전구체인 프로트롬빈(prothrombin)은 분자량이 72kDa인 혈장 내 당단백질(glycoprotein)로, 간세포에서 합성되어 글리코실화(glycosylation), 감마-카르복실화(γ-carboxylation) 등의 전사 후 변형과정을 거쳐 혈관으로 분비된다. 혈액응고가 시작되면 비활성 형태의 프로트롬빈은 Factor Xa에 의하여 두 개의 크링글(kringle)구조를 포함하는 N-말단부와 활성형의 트롬빈으로 가수분해되는데, 이때 생성된 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 변화시킴으로서 혈액응고를 유도한다. 이 과정에서 프로트롬빈의 N-말단을 이루는 프로트롬빈 프래그먼트(fragment) 1과 2가 잘려나오는데, 프래그먼트 1 부분은 전사 후 변형을 통해 글리코실화되어 있는 반면, 프래그먼트-2 부분은 변형되지 않은 크링글 구조를 그대로 가지고 있다(참조: Esmon, C.T., Owen, W.G. and Jackson, C.M.,J. Biol. Chem.,249:8045(1974)).

크링글이란 혈액응고와 혈전용혈 등에 관여하는 세린 프로테아제(serine protease)계 단백질에서 공통적으로 발견되는 영역(domain)을 일컬으며, 독특한 3차 구조를 형성하게 하는 세 개의 이항화 결합(disulfide bond)을 포함하는 80여개의 아미노산 잔기들로 구성되어 있다(참조: Furie, B. and Furie, C.B.,Cell,53:505-518(1988)). 이러한 구조는 혈액응고 과정에서 중요한 역할을 하는 프로트롬빈에서 처음 발견되었는데, 이외에도 플라스미노겐(plasminogen), 유로키나제(urokinase), tPA(tissue-type plasminogen activator) 및 Factor XII 등의 혈액응고 및 용혈과정에 관여하는 단백질 가수분해 효소들과 지방 전달과정에 중요한 역할을 하는 아포리포단백질 에이(apolipoprotein A) 및 사람 간세포 성장인자(human hepatocyte growth factor)에 이르기까지 혈액 내에 존재하는 매우 다양한 종류의 단백질들에서 발견되고 있다. 또한, 크링글 구조는 단백질간에서만이 아니라 종(種)간에서도 유사성이 높아, 적어도 5억년 이상 보존된 구조로 생각되고 있다. 한편, 크링글 구조는 혈액 단백질에서 집중적으로 발견되고 있는 점으로 미루어 혈액응고 조절 및 세포간 인식과정의 도구물질일 가능성이 매우 높은 것으로 추측되고 있을 뿐, 독립된 크링글의 구조 및 기능에 관한 구체적인 연구보고는 미미하였다.

그러나, 최근에 이르러 포크만(Folkman, J) 등을 중심으로 한 연구진이 안지오스태틴(angiostatin)과 엔도스태틴 (endostatin) 등, 크링글 구조를 갖는 단백질들이 내피세포의 성장을 억제하는 기능이 있다는 보고를 하여 주목을 받고 있다(참조: Cao, Y., Ji, R.W., Davidson, D., Schaller, J., Marti, D., Sohndel, S., McCance, S.G., O'Reilly, M.S., Llinas, M. and Folkman, J.,J. Biol. Chem.,271:29461-29467(1996)). 이들에 의하면, 총 4개의 크링글 구조를 포함하는 분자량 38kDa의 안지오스태틴은 물론, 이 단백질을 구성하는 각각의 크링글 부위 또한bFGF(basic fibroblast growth factor)에 의존하여 성장하는 내피세포의 성장을 50%정도 억제하는 것으로 밝혀졌는데, bFGF-의존적 내피세포의 성장은 비 정상적인 혈관형성 과정(angiogenesis)과 직접적으로 연관되어 있어 더욱 주목을 끌고 있다.

일반적으로 일련의 발생과정을 거친 정상적인 성체의 경우, 내피세포가 분열하거나 자라나는 경우는 거의 없다(참조: Engerman, R.L., Pfaffenbacvh, D. and Davis, M.D.,Lab Invest.,17:738-743(1967)). 그러나, 상처의 치료 또는 여성의 생식과 관련하여 새로운 혈관형성이 필요한 경우 또는 악성종양 세포의 성장과 전이가 일어나는 경우에, 특정한 성장인자(growth factor)가 분비되고 이 성장인자가 성장이 거의 멈춰있는 내피세포를 자극하여 분열과 성장을 유도함으로써, 새로운 혈관형성이 이루어지게 된다(참조: Auerbach, W. and Auerbach, R.,Pharmacol. Ther., 63:265-311(1994); Cockerill, G.W., Gamble, J.R. and Vadas, M.A.,Int. Rev. Cytol.,159:113-160(1995); Adams, J.M. and Cory, S.,Science,254:1161-1167(1991)). 또한, 분화가 끝난 성체에서 일어나는 비 정상적인 혈관형성은 류마티스 관절염, 혈관종과 같은 비교적 발병율이 높으면서도 치료가 어려운 질환과 아주 밀접하게 연관되어 있다는 사실들이 알려지면서, 혈관형성의 조절에 대한 관심이 급속하게 증가하고 있는 것이 당 분야의 추세이다.

따라서, 혈관형성 과정을 인위적으로 조절함으로써 비 정상적인 혈관형성과 관련된 여러 질환을 치료 및 예방할 수 있을 것으로 판단되고 있다. 특히, 악성종양의 경우, 종양세포의 성장 및 전이에 혈관형성 과정은 필수적이기 때문에, 혈관형성 억제물질의 개발은 악성종양에 대한 효과적인 대응책이 될 수 있을 것으로 예측되고 있다. 실제로, 이사야(Isaiah, J)등의 연구진은 혈관형성의 억제를 통해 암 전이를 막는 방법을 개발 중에 있다(참조: Isaiah, J. and Ellis, L.M.,Cell,79:185-188(1994); Wu, Z., O'Reilly, M.S., Folkman, J. and Shing, Y.,Biochem. Biophys. Res. Commun.,236:651-654(1997); Abraham, J.A., Mergia, A., Whang, J.L., Tumolo, A., Friedman, J., Hjerrild, K.A., Gospodarowicz, D. and Fiddes, J.C.Science,233:545-548(1986)).

한편, 본 발명자들은 바실러스 칼메트-게린으로 감작시키고 내독소로 처리한 뉴질랜드산 흰 토끼의 혈청으로부터 내피세포의 성장을 억제하는 프로트롬빈 크링글 2 단백질을 발견하고, 전기 단백질을 순수 분리하여, 특성을 규명하고 아미노산 서열을 결정하였으며, 프로트롬빈 크링글 2의 cDNA를 클로닝한 바 있다(참조: 대한민국 특허출원 제 97-82347; 대한민국 특허출원 제 97-82346). 이에, 본 발명자들은 인간 프로트롬빈으로부터 유래된, 크링글 구조를 포함하는 N-말단 프래그먼트("크링글 단백질") 또한 내피세포 성장 억제활성을 가지고 있을 것으로 예상하고, 이를 조사한 결과, 인간 프로트롬빈 크링글 1 및 인간 프로트롬빈 크링글 2 단백질이 토끼 프로트롬빈 크링글 2에 준하는 내피세포 성장 억제활성을 지니고 있음을 확인한데 이어, 인간 프로트롬빈 크링글 2의 cDNA를 대장균 발현벡터에 클로닝하여 그것의 재조합 대장균으로부터 인간 프로트롬빈 크링글 2를 분리하여 내피세포 성장 억제활성을 지니고 있음을 확인하였다. (참조 :대한민국 특허출원 제 98-36786) 이에 본 발명자들은 프로트롬빈 크링글 1 및 1-2 의 대량 생산을 도모할 수 있는 발현 벡터와 발현 균주를 만드는 한편 두 물질의 정제 방법을 아울러 제시하였다.

본 발명자들은 인간 프로트롬빈 cDNA를 주형으로 하는 중합효소 연쇄반응에 의하여 인간 프로트롬빈 크링글 1 및 -1-2의 cDNA를 대장균 발현벡터에 클로닝하였다. 이 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 대장균으로부터 인간 프로트롬빈 크링글 1을 과다 발현시키고 이로부터 인간 프로트롬빈 크링글 1을 분리, 정제하였다. 이어서, 소의 모세혈관 내피세포를 사용한 세포성장 실험과 CAM(chick chorioallantoic membrane) 분석으로 전기 정제된 인간 프로트롬빈 크링글 1이 우수한 내피세포 성장 억제활성 및 혈관형성 억제기능을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 대장균으로부터 인간 프로트롬빈 크링글 1-2를 과다 발현시키는데 성공하였다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 인간 프로트롬빈 크링글 1과 인간 프로트롬빈 크링글 1-2를 대장균에서 발현할 수 있는 재조합 벡터들을 제조하고자, 인간 프로트롬빈 크링글 1과 인간 프로트롬빈 크링글 1-2 각각의 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열들에 근거하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 사용하여, 인간 프로트롬빈 cDNA를 주형으로 하는 중합효소 연쇄반응에 의하여 인간 프로트롬빈 크링글 1과 -1-2의 cDNA 절편들을 각각 증폭하고, 이들을 대장균 발현벡터에 클로닝하여, pEF-32hK1 벡터와 pEF-hK1-2 벡터를 제조하였다. 재조합 대장균으로부터 과다 발현된 인간 프로트롬빈 크링글 1을 이온교환수지 크로마토그래피에 적용하고, 염화나트륨 직선농도구배를 이용한 후, 히스티딘 tag을 이용하여 affinity 크로마토그래피에 적용하여 tag이 붙어 있는 인간 프로트롬빈 크링글 1(32bK1)을 순수하게 분리, 정제하였다. 이와 같이 정제된 인간 프로트롬빈 32b 크링글 1은 트롬빈을 처리한 후, 다시 affinity 크로마토그래피에 적용하여 인간 프로트롬빈 크링글 1만을 순수하게 분리, 정제하였다. 이 단백질의 내피세포 성장 억제활성을 조사하고자, 정제된 크링글 1을 농도별로 소의 모세혈관 내피세포(BCE cell)에 가하고, bFGF를 처리하여 세포성장을 유도한 다음, 일정시간 경과 후에 세포수를 측정한 결과, 인간 프로트롬빈 크링글 1이 내피세포의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인간 프로트롬빈 크링글 1과 -1-2의 cDNAs의 클로닝

[표 1]

인간 프로트롬빈 크링글 1과 -1-2의 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열

	N-말단	C-말단
사람 프로트롬빈 크링글 1	FWAKYTACET	VTVAMTPR
사람 프로트롬빈 크링글 1-2	FWAKYTACET	SDRAIEGR

인간 프로트롬빈 크링글 1 및 -1-2의 cDNA들을 클로닝하기 위하여, 먼저 상기 표 1에서 보여지는 크링글 1과 -1-2 각각의 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열에 근거하여, 다음과 같은 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 합성하였다:

인간 프로트롬빈 크링글 1:

N-말단 프라이머:

PheTrpAlaLysTyrThr

5´-GGATCCTTTCTGGGCCAAGTACACA - 3´

BamHI

C-말단 프라이머:

AlaMetThrProArgTermination

5´- GCGATGACTCCACGCTAG GAGCTCC - 3´

SacI

인간 프로트롬빈 크링글 1-2:

N-말단 프라이머:

PheTrpAlaLysTyrThr

5´-GGATCCTTTCTGGGCCAAGTACACA - 3´

BamHI

C-말단 프라이머:

AlaIleGluGlyArgTermination

5´- GCCATCGAAGGGCGTTAG GAGCTCC - 3´

SacI

이어서, 서열정보 3에 보여지는 염기서열을 가지는 인간 프로트롬빈 cDNA를 주형으로 삼아 전기 프라이머를 이용하여, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 94℃, 57℃, 72℃에서 각각 1분씩 36회 반복실시하여 인간 프로트롬빈 크링글 1 및 -1-2의 cDNA를 각각 증폭시켰다. 증폭된 cDNA 절편들을 1.5% 아가로오스 젤로 전기영동하여 크기를 확인하고(참조: 도 1), 각각 단백질 발현벡터인 pET32b+ 벡터(Invitrogen, USA)와 pET22b+ 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝하여, 인간 프로트롬빈 크링글 1 cDNA를 포함하는 pEF-32hK1 벡터와 인간 프로트롬빈 크링글 1-2 cDNA를 포함하는 pEF-hK1-2 벡터를 제조하였으며(참조: 도 2, 도 3), 목적 cDNA의 삽입여부를 제한효소 처리에 이은 아가로오스 젤 전기영동으로 확인하였다(참조: 도 4). 한편, 전기 pEF-32hK1 벡터로 형질전환된 대장균을 ' E.coli AD494(DE3)/pEF-32hK1'이라 명명하고, 전기 pEF-hK1-2 벡터로 형질전환된 대장균을 ' E.coli BL21(DE3)/pEF-hK1-2'이라 명명하였으며, 이들을 2000년 3월 20일자로 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센타(소재: 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 'KCCM-10182', 'KCCM-10183'로 기탁하였다.

실시예 2: 인간 프로트롬빈 크링글 1의 발현

재조합 대장균E.coliAD494(DE3)pLysS에서 발현되도록 구축된 인간 프로트롬빈 크링글 1을 앰피실린이 최종 50㎍/㎖, 가나마이신이 최종 15㎍/㎖, 클로람페니콜이 최종 34㎍/㎖ 이 되도록 첨가된 LB 배지에서 600nm에서의 흡광도가 1.0이 될 때까지 37℃에서 200rpm으로 흔들어주면서 배양하였다. 600nm에서의 흡광도가 1.0일 때, IPTG를 최종 1mM이 되도록 첨가한 후, 3시간 더 배양하였다. 배양한 대장균을 4,500rpm, 4℃, 20min에서 원심분리하여 세포만을 모으고 파쇄완충용액(10mM sodium phosphate, 50mM sodium chloride, 1mM PMSF, pH 7.0)에 용해시켜 초음파파쇄기에 의해 파쇄했다. 이를 14,000rpm, 4℃, 30min에서 원심분리하여 세포의 침전물을 제거하고 용액만을 정제에 사용하였다.

실시예 3: 이온교환 크로마토그래피에 의한 인간 프로트롬빈 크링글 1의 정제

인간 프로트롬빈 크링글 1을 분리, 정제하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 이온교환 크로마토그래피를 실시하였다: 먼저, 전기 실시예 2로부터 수득한 대장균 파쇄용액을 디이에이이(DEAE) 완충용액(10mM sodium phosphate, 50mM sodium chloride, pH 7.0)으로 평형화되어 있는 디이에이이(DEAE) 칼럼(구입처:Pharmacia)에 로딩하고, 50mM 에서 500mM에 이르는 염화나트륨 직선 농도구배를 형성시켜 단백질을 용출하였다. 이때, 280nm에서의 흡광도를 측정함으로써 프로트롬빈 크링글 1을 포함하는 것으로 예상되는 단백질 분획들을 수집하고, 각 분획들에 대하여 SDS-PAGE를 수행하여 프로트롬빈 크링글 1을 포함하는 단백질 분획을 수집하여 동결건조하여 농축하였다.

실시예 4: 히스티딘-태그를 이용한 인간 프로트롬빈 크링글 1의 정제

전기 실시예 3으로부터 동결건조하여 농축한 단백질 가루를 증류수에 용해한 후, 10,000배 부피의 히스티딘 결합용액(5mM Imidazole, 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7.9)에 대하여 투석하였다. 히스티딘 결합 컬럼(구입처: Novagen)은 미리 활성용액(50mM NiSO4)으로 활성화시킨 후 히스티딘 결합용액으로 평형화시켰으며, 투석이 끝난 단백질 시료를 로딩하고 세척용액(60mM imidazole, 20mM Tris-HCl,500mM NaCl, pH 7.9)으로 충분히 세척한 후, 용출용액(1M imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 용출하였다. 이어서, SDS-PAGE를 수행한 결과, 태그 결합된 프로트롬빈 크링글 1이 단일밴드로 나타남으로써 태그 결합된 프로트롬빈 크링글 1이 성공적으로 분리, 정제되었음을 확인하였다(참조: 도 8).

실시예 5: 태그 결합된 프로트롬빈 크링글 1으로부터 프로트롬빈 크링글 1의 분리

태그 결합된 인간 프로트롬빈 크링글 1으로부터 프로트롬빈 크링글 1만을 분리하기 위하여, 에스-태그(S-tag)을 이용하였다. 전기 실시예 4로부터 수득한 단백질을 에스-단백질(S-protein) 결합용액(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 7.5)에 대하여 투석한 후, 배치 형식으로 에스-단백질 아가로즈 레진(구입처: Novagen)에 로딩하고 세척용액(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 7.5)으로 충분히 세척하였다. 여기에 재조합 엔테로카이네이즈(rEK)(구입처: Novagen)를 단백질 50ug당 1 unit을 첨가하여 실온에서 16시간 동안 반응시켜 태그와 프로트롬빈 크링글 1 사이를 자른 후, EKapture 아가로즈(구입처: Novagen) 현탁액을 혼합하여 실온에서 10분간 놔둔 후에 원심분리형 여과기로 옮겨서 500 x g 에서 5분간 원심분리하여 프로트롬빈 크링글 1만을 여과시켰다. 여과된 단백질 시료를 SDS-PAGE를 수행하여 프로트롬빈 크링글 1이 성공적으로 분리되었음을 확인하였다.

실시예 6: 인간 프로트롬빈 크링글 1의 내피세포 성장 억제활성측정

소의 모세혈관 내피세포(BCE cell, 구입처와 catalog no.: 본 발명자들이 일차배양하여 제조함)를 열처리된 10% 송아지혈청(bovine calf serum)과 3ng/ml의 재조합 인간 bFGF(R&D Inc. USA)를 포함하는 성장배지를 사용하여 젤라틴으로 코팅된 플레이트에서 유지하였다. 전기 배양된 세포들을 0.05% 트립신(trypsin) 용액을 이용하여 분리시킨 다음, 10% 송아지혈청을 포함하는 성장 배지로 0.5ml 당 약 12,500개의 세포를 포함하도록 희석하였다. 전기 희석된 세포액 0.5ml을 젤라틴으로 코팅된 24웰-플레이트의 각 웰에 가하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배지를 5% 송아지혈청을 포함하는 신선한 성장배지 0.25ml로 교체하였다. 이어서, 전기 실시예 5로부터 수득한 정제된 인간 프로트롬빈 크링글 1을 각각 0.5, 1, 2, 4 및 10μg/ml의 농도로 전기 세포에 가하고, 30분 후에 배지의 부피를 0.5ml로 맞춘 다음, bFGF를 최종 1ng/ml의 농도로 처리하였다. 72시간이 경과한 다음, 세포들을 트립신으로 분리하여 세포수를 측정함으로써 인간 프로트롬빈 크링글 1의 내피세포 성장 억제활성을 조사하였다. 그 결과, 재조합된 인간 프로트롬빈 크링글 1 역시 내피세포 성장 억제 단백질로 확인된 재조합된 인간 프로트롬빈 크링글 2와 유사하게 내피세포 성장 억제활성을 가지고 있음이 확인되었다(참조: 도 9).

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 우수한 내피세포 성장 억제활성을 가지는 인간 프로트롬빈 크링글 단백질을 제공하여 내피세포성장의 이상에서 올 수 있는 류마티스, 암 등의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

내피세포 성장 억제활성을 갖는 서열정보 1에 기재된 인간 프로트롬빈 크링글 1 단백질.
제 1 항의 크링글 1 단백질을 코딩하는 서열정보 2에 기재된 DNA.
내피세포성장 억제활성을 갖는 서열정보 3에 기재된 인간 프로트롬빈 크링글 1-2 단백질.
제 3 항의 크링글 1-2 단백질을 코딩하는 서열정보 4에 기재된 DNA.
제 2 항의 인간 프로트롬빈 크링글 1 단백질 유전자를 함유한 재조합 발현벡터 pEF-32hK1.
제 4 항의 인간 프로트롬빈 크링글 1-2 단백질 유전자를 함유한 재조합 발현벡터 pEF-hK1-2.
제 5 항의 발현벡터 pEF-hK1-2로 형질전환된 재조합 대장균 E.coli BL21(DE3)/pEF-hK1-2(KCCM-10183).
제 6 항의 발현벡터 pEF-32hK1으로 형질전환된 재조합 대장균 E.coli AD494(DE3)/pEF-32hK1(KCCM-10182).
a) 제 7 항 또는 제 8 항의 재조합 대장균추출물을 이온교환수지 크로마토그래피에 적용하여 용출시키는 단계;

b) 상기 용출된 단백질을 히스티딘-태그를 이용하여 태그 결합된 인간 프로트롬빈 크링글 단백질을 수득하는 단계; 및

c) 상기 수득된 크링글 단백질에 효소를 처리하여 태그를 제거하는 단계를 포함하는 인간 프로트롬빈 크링글의 분리 및 정제방법.
재조합 인간 프로트롬빈 크링글 1을 이용한 인간을 제외한 포유동물의 내피세포 성장 억제방법.