JP3191111B2 - （前駆体）タンパクのエンドタンパク分解的プロセシングのための方法 - Google Patents
（前駆体）タンパクのエンドタンパク分解的プロセシングのための方法Info
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Description
【０００１】 本発明は、タンパク特に前駆タンパクをエンドタンパ
ク分解活性酵素でプロセシングすることによるタンパク
のインビトロでの開裂のための方法に関する。
ク分解活性酵素でプロセシングすることによるタンパク
のインビトロでの開裂のための方法に関する。
【０００２】 本文に記載された発明は、フリン（furin）（欧州特
許出願Ａ−0246709号公報に記載されたヒトタンパク、
それはヒトfes/fps癌原遺伝子の上流のゲノム中に位置
するfur遺伝子の発現生成物である）の可能な生理的意
味へのさらなる研究の結果である。同じ研究グループに
より言及された特許出願及び他の出版物〔ロイブロイク
（Roebroek）他、Molec.Biol.Rep.11巻（1986年）,117
−125頁；ロイブロイク他、EMBO J.5巻（1986年）,2197
−2202頁；及び、シャルケン（Schalken）他、J.Clin.I
nvest.80（1987年）,1545巻−1549頁〕は、当時入手し
得た限られたDNAデータに基づき、fur遺伝子の生成物の
機能を決定するのは不可能であったと言うことを示して
いる。決定され得たことは、フリンはおそらく、特定の
認識構造（recognition struc−tures）が役割を演じる
ところの機能を有する膜関連タンパク（membrane−asso
ciated protein）であると言うことである。その時にま
た、fur遺伝子は、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺及び脳中で
4.5kbメッセンジャーRNAとして発現され、肺組織での発
現は非常に僅かであることが観察され；一方、非小細胞
肺癌において非常に増加した発現の起こることが見出さ
れ、それに基づいて、fur遺伝子は腫瘍マーカーとして
の有用性を有することが示唆された。
許出願Ａ−0246709号公報に記載されたヒトタンパク、
それはヒトfes/fps癌原遺伝子の上流のゲノム中に位置
するfur遺伝子の発現生成物である）の可能な生理的意
味へのさらなる研究の結果である。同じ研究グループに
より言及された特許出願及び他の出版物〔ロイブロイク
（Roebroek）他、Molec.Biol.Rep.11巻（1986年）,117
−125頁；ロイブロイク他、EMBO J.5巻（1986年）,2197
−2202頁；及び、シャルケン（Schalken）他、J.Clin.I
nvest.80（1987年）,1545巻−1549頁〕は、当時入手し
得た限られたDNAデータに基づき、fur遺伝子の生成物の
機能を決定するのは不可能であったと言うことを示して
いる。決定され得たことは、フリンはおそらく、特定の
認識構造（recognition struc−tures）が役割を演じる
ところの機能を有する膜関連タンパク（membrane−asso
ciated protein）であると言うことである。その時にま
た、fur遺伝子は、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺及び脳中で
4.5kbメッセンジャーRNAとして発現され、肺組織での発
現は非常に僅かであることが観察され；一方、非小細胞
肺癌において非常に増加した発現の起こることが見出さ
れ、それに基づいて、fur遺伝子は腫瘍マーカーとして
の有用性を有することが示唆された。
【０００３】 上記の研究の枠内において、fur遺伝子を含有する約2
1kbpのゲノムDNAフラグメントの完全なヌクレオチド配
列が決定された〔ファン・デン・オウエランド（Van de
nOuweland）他、Nuc.Acids Res.17巻（1989年）,7101−
7102頁〕一方で、対応するfur相補DNAのヌクレオチド配
列がまた決定された〔ファン・デン・オウエランド他、
Nucl.Acids Res.18巻（1990年）,664頁〕。それに基づ
き、fur遺伝子を、ゲノム組織化構造のレベルの及びエ
ンコードする配列のレベルの両者にて完全に同定するこ
とが、現在、可能である。これらのエンコードするヌク
レオチド配列より、フリンのアミノ酸配列がまた導かれ
る。
1kbpのゲノムDNAフラグメントの完全なヌクレオチド配
列が決定された〔ファン・デン・オウエランド（Van de
nOuweland）他、Nuc.Acids Res.17巻（1989年）,7101−
7102頁〕一方で、対応するfur相補DNAのヌクレオチド配
列がまた決定された〔ファン・デン・オウエランド他、
Nucl.Acids Res.18巻（1990年）,664頁〕。それに基づ
き、fur遺伝子を、ゲノム組織化構造のレベルの及びエ
ンコードする配列のレベルの両者にて完全に同定するこ
とが、現在、可能である。これらのエンコードするヌク
レオチド配列より、フリンのアミノ酸配列がまた導かれ
る。
【０００４】 このアミノ酸配列のコンピューター分析により、フリ
ンは、クリュイフェロマイセス・ラクティス（Kluyvero
myceslactis）のKEX1遺伝子及びサッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のKEX2遺伝子によ
り酵母中でエンコードされるような、ズブチリシン類似
プロテアーゼに非常に類似であり、フリンは明らかにこ
れらエンドプロテアーゼのより真核的な形（ヒト及び動
物例えばサル、ネコ、ラット、マウス、ニワトリ及びシ
ョウジョウバエ中に見られる）であると言うことが今、
驚くべきことに示された。より詳しくは、該フリンは、
従来記載されたバクテリアズブチリシン（約20の酵素）
例えばサーモアクチノミセス・ブルガリス（Thermoacti
nomyces vulgaris）のサーミ ターゼ（thermitase）及
びバチルス・アミロリクイファシエンス（Bacillus amy
loliquefaciens）のズブチリシンBPN′の触媒的ドメイ
ンとある程度の相同を示し、ズブチリシン類似プロテア
ーゼ例えば酵母クリュイフェロマイセス・ラクティス
（Kluyveromyces lactis）のKEX1遺伝子の発現生成物及
び酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）のKEX2遺伝子の発現生成物と顕著に高い相同
を示すと言うことが見出された。該フリン（794のアミ
ノ酸を含有する）は、該アミノ酸97〜577のドメイン
中、前記KEX1遺伝子の発現生成物のアミノ酸123〜584と
約80.0％の総体的相同（すなわち、41.6％の同一のアミ
ノ酸及び38.3％の保存的置換）及び前記KEX2遺伝子の発
現生成物のアミノ酸134〜597と約78.9％の総体的相同
（すなわち、39.4％の同一のアミノ酸及び39.5％の保存
的置換）を示す。酵母プロテアーゼのこれらアミノ酸領
域は、ズブチリシン類似触媒的ドメインを含む。フリン
のズブチリシン類似ドメインは、アミノ酸108〜464を含
有するアミノ末端フリンフラグメント中に位置する。
ンは、クリュイフェロマイセス・ラクティス（Kluyvero
myceslactis）のKEX1遺伝子及びサッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のKEX2遺伝子によ
り酵母中でエンコードされるような、ズブチリシン類似
プロテアーゼに非常に類似であり、フリンは明らかにこ
れらエンドプロテアーゼのより真核的な形（ヒト及び動
物例えばサル、ネコ、ラット、マウス、ニワトリ及びシ
ョウジョウバエ中に見られる）であると言うことが今、
驚くべきことに示された。より詳しくは、該フリンは、
従来記載されたバクテリアズブチリシン（約20の酵素）
例えばサーモアクチノミセス・ブルガリス（Thermoacti
nomyces vulgaris）のサーミ ターゼ（thermitase）及
びバチルス・アミロリクイファシエンス（Bacillus amy
loliquefaciens）のズブチリシンBPN′の触媒的ドメイ
ンとある程度の相同を示し、ズブチリシン類似プロテア
ーゼ例えば酵母クリュイフェロマイセス・ラクティス
（Kluyveromyces lactis）のKEX1遺伝子の発現生成物及
び酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）のKEX2遺伝子の発現生成物と顕著に高い相同
を示すと言うことが見出された。該フリン（794のアミ
ノ酸を含有する）は、該アミノ酸97〜577のドメイン
中、前記KEX1遺伝子の発現生成物のアミノ酸123〜584と
約80.0％の総体的相同（すなわち、41.6％の同一のアミ
ノ酸及び38.3％の保存的置換）及び前記KEX2遺伝子の発
現生成物のアミノ酸134〜597と約78.9％の総体的相同
（すなわち、39.4％の同一のアミノ酸及び39.5％の保存
的置換）を示す。酵母プロテアーゼのこれらアミノ酸領
域は、ズブチリシン類似触媒的ドメインを含む。フリン
のズブチリシン類似ドメインは、アミノ酸108〜464を含
有するアミノ末端フリンフラグメント中に位置する。
【０００５】 該ズブチリシン類似プロテアーゼに関して、以下の出
版物が参照される：タンギュイ−（Tanguy−Rougeau）
ロイギュー他、FEBS Letters 234巻（1988年）,464−47
0頁；ミズノ（Mizuno）他、Biochem.Biophys.Res.Comm
n.156巻（1988年）,246−254頁；メロウン（Meloun）
他、FEBS Letters 183巻（1985年）,195−200頁；マー
クラン（Marklan）他、J.Biol.Chem.242巻（1967年）,5
198−5211頁；ミズノ他、Biochem.Biophys.Res.Commn.1
59巻（1989年）,305−311頁；バサースト（Bathurst）
他、Science 235巻（1987年）,348−350頁；トーマス
（Thomas）他、Science 241巻（1988年）,226−230頁；
フォスター（Foster）他、Biochemistry 29巻（1990
年）,347−354頁；フュラー（Fuller）他、PNAS USA 86
巻（1989年）,1434−1438頁；ジュリアス（Julius）
他、Cell 37巻（1984年）,1075−1089頁；ボーボネイス
（Bourbonnais）他、J.Biol.Chem.263巻（1988年）,153
42−15347頁；コスマン（Cosman）他、Dev.Biol.Stand.
69巻（1988年）,9−13頁；シューベルト・ライト（Schu
bert Wright）他、Nature 221巻（1969年）,235−242
頁；カニンガム（Cunningham）他、Yeast 5巻（1989
年）,25−33頁；デビッドソン（Davidson）他、Nature
333巻（1988年）,93−96頁。
版物が参照される：タンギュイ−（Tanguy−Rougeau）
ロイギュー他、FEBS Letters 234巻（1988年）,464−47
0頁；ミズノ（Mizuno）他、Biochem.Biophys.Res.Comm
n.156巻（1988年）,246−254頁；メロウン（Meloun）
他、FEBS Letters 183巻（1985年）,195−200頁；マー
クラン（Marklan）他、J.Biol.Chem.242巻（1967年）,5
198−5211頁；ミズノ他、Biochem.Biophys.Res.Commn.1
59巻（1989年）,305−311頁；バサースト（Bathurst）
他、Science 235巻（1987年）,348−350頁；トーマス
（Thomas）他、Science 241巻（1988年）,226−230頁；
フォスター（Foster）他、Biochemistry 29巻（1990
年）,347−354頁；フュラー（Fuller）他、PNAS USA 86
巻（1989年）,1434−1438頁；ジュリアス（Julius）
他、Cell 37巻（1984年）,1075−1089頁；ボーボネイス
（Bourbonnais）他、J.Biol.Chem.263巻（1988年）,153
42−15347頁；コスマン（Cosman）他、Dev.Biol.Stand.
69巻（1988年）,9−13頁；シューベルト・ライト（Schu
bert Wright）他、Nature 221巻（1969年）,235−242
頁；カニンガム（Cunningham）他、Yeast 5巻（1989
年）,25−33頁；デビッドソン（Davidson）他、Nature
333巻（1988年）,93−96頁。
【０００６】 上記刊行物により示されるように、良く研究されかつ
同定されてきたのは、特に、酵母種サッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のKEX2遺伝子の
発現生成物である。それは、膜関連の、カルシウムイオ
ンに依存する、対を成す塩基性アミノ酸残基のための酵
素特異性を有するエンドペプチダーゼであり；基質のタ
ンパクは、アルギニンを含有する塩基性アミノ酸対のカ
ルボキシル部位でこの酵素〔それはここで、“制限”エ
ンドペプチダーゼ（所定のヌクレオチド配列がDNAの開
裂の決定因であるところの制限エンドヌクレアーゼにお
ける命名法に対する類比より）と定義される〕によって
開裂される。該酵素の配置は、恐らくゴルジ複合体の構
造中にある。ズブチリシン類似ドメイン及びCa2+活性化
配列は、該タンパクのアミノ末端部分にある。酵母サッ
カロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
においては、エンドペプチダーゼは、キラー毒素及び対
を成すフェロモンα因子の前駆体、すなわちプロキラー
毒素及びプロα因子のタンパク分解プロセシングに関与
する。さらに、該エンドペプチダーゼは、特定の変異哺
乳類細胞系中に阻害された（disturbed）タンパク分解
プロセシングで導入された後、マウスニュロエンドシン
ペプチド前駆体プレプロ−オピオメラノコルチン（opio
melanocortin）を正確に開裂することが可能であり、プ
ロアルブミンを成熟アルブミンへとプロセシングするこ
とが可能であり、血漿Ｃタンパクの前駆体をプロセシン
グすることが可能であることが見出された。
同定されてきたのは、特に、酵母種サッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のKEX2遺伝子の
発現生成物である。それは、膜関連の、カルシウムイオ
ンに依存する、対を成す塩基性アミノ酸残基のための酵
素特異性を有するエンドペプチダーゼであり；基質のタ
ンパクは、アルギニンを含有する塩基性アミノ酸対のカ
ルボキシル部位でこの酵素〔それはここで、“制限”エ
ンドペプチダーゼ（所定のヌクレオチド配列がDNAの開
裂の決定因であるところの制限エンドヌクレアーゼにお
ける命名法に対する類比より）と定義される〕によって
開裂される。該酵素の配置は、恐らくゴルジ複合体の構
造中にある。ズブチリシン類似ドメイン及びCa2+活性化
配列は、該タンパクのアミノ末端部分にある。酵母サッ
カロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
においては、エンドペプチダーゼは、キラー毒素及び対
を成すフェロモンα因子の前駆体、すなわちプロキラー
毒素及びプロα因子のタンパク分解プロセシングに関与
する。さらに、該エンドペプチダーゼは、特定の変異哺
乳類細胞系中に阻害された（disturbed）タンパク分解
プロセシングで導入された後、マウスニュロエンドシン
ペプチド前駆体プレプロ−オピオメラノコルチン（opio
melanocortin）を正確に開裂することが可能であり、プ
ロアルブミンを成熟アルブミンへとプロセシングするこ
とが可能であり、血漿Ｃタンパクの前駆体をプロセシン
グすることが可能であることが見出された。
【０００７】 上記の公知のエンドペプチダーゼとフリンとの間の確
立された類似性に基づいて、フリンは、タンパクのプロ
セシング、特にポリペプチドホルモン、成長因子、毒
素、酵素または他のタイプの生物学的に関連するタンパ
クの前駆体のプロセシングのために使用することのでき
る制限エンドペプチダーゼであるとみなされる。この関
係において、一方でインビトロでの使用が、他方で治療
上の処理の体系内での使用を包含するインビボでの使用
が考えられる。そのような使用のために、ヒトフリン
は、ヒト以外の源の上記の公知のエンドペプチダーゼよ
りも適当であり得、より一般的に、動物“フリン”は下
等有機体からのエンドペプチダーゼよりも適当であり得
る。同じことは、そのフリンが最初に見出された代表で
あるところの制限エンドタンパク分解酵素のより大きな
族に属する、まだ単離されていないフリンの類似体また
は関連物（本文中ではフリン類似酵素と称する）にも当
てはまる。この族の種々のものが高い構造上の類似を示
すであろうが、配列の相同は極めて低く、多分50％未満
のような低い相同であろう。この族中において、いくつ
かの酵素のクラス、例えば構造的に分泌されたタンパク
のプロセシングに関与するフリン類似酵素の群、及びそ
の分泌が調節されている（分泌顆粒を通じての分泌）タ
ンパクのプロセシングに関与するフリン類似酵素の群を
区別することが可能であろう。これらフリン類似酵素の
夫々を、酵素がプロセシング酵素として活性であるとこ
ろの限定された数の細胞タイプにおいて特徴的に発現さ
れることができる。これら酵素の細胞及び組織分布の間
における限定された程度の重複がまた考えられ、細胞の
タイプに依存する前駆体の差別的プロセシングの公知の
現象の原因に、非常になり得る。
立された類似性に基づいて、フリンは、タンパクのプロ
セシング、特にポリペプチドホルモン、成長因子、毒
素、酵素または他のタイプの生物学的に関連するタンパ
クの前駆体のプロセシングのために使用することのでき
る制限エンドペプチダーゼであるとみなされる。この関
係において、一方でインビトロでの使用が、他方で治療
上の処理の体系内での使用を包含するインビボでの使用
が考えられる。そのような使用のために、ヒトフリン
は、ヒト以外の源の上記の公知のエンドペプチダーゼよ
りも適当であり得、より一般的に、動物“フリン”は下
等有機体からのエンドペプチダーゼよりも適当であり得
る。同じことは、そのフリンが最初に見出された代表で
あるところの制限エンドタンパク分解酵素のより大きな
族に属する、まだ単離されていないフリンの類似体また
は関連物（本文中ではフリン類似酵素と称する）にも当
てはまる。この族の種々のものが高い構造上の類似を示
すであろうが、配列の相同は極めて低く、多分50％未満
のような低い相同であろう。この族中において、いくつ
かの酵素のクラス、例えば構造的に分泌されたタンパク
のプロセシングに関与するフリン類似酵素の群、及びそ
の分泌が調節されている（分泌顆粒を通じての分泌）タ
ンパクのプロセシングに関与するフリン類似酵素の群を
区別することが可能であろう。これらフリン類似酵素の
夫々を、酵素がプロセシング酵素として活性であるとこ
ろの限定された数の細胞タイプにおいて特徴的に発現さ
れることができる。これら酵素の細胞及び組織分布の間
における限定された程度の重複がまた考えられ、細胞の
タイプに依存する前駆体の差別的プロセシングの公知の
現象の原因に、非常になり得る。
【０００８】 下垂体タンパクPC1及びPC2〔最近、セイダ（Seidah）
他により、DNA and Cell Biol.9巻（1990年）,415−424
頁に記載された〕は、上記フリン類似酵素の例を構成す
る。
他により、DNA and Cell Biol.9巻（1990年）,415−424
頁に記載された〕は、上記フリン類似酵素の例を構成す
る。
【０００９】 組換えDNA法を通じて、多量のタンパクフリンを得る
ことが可能である。原核生物において、fur遺伝子はβ
−ガラクトシダーゼ（pURベクター系）またはアントラ
ニレートシンセターゼ（pATHベクター系）と共に融合
（fusion）タンパクとして発現され得る。他の可能性
は、融合タンパクグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ−フリン（pGEX）の合成である。このアプローチの利
点は、フリンがトロンビンによって切断されることであ
る。フリンはまた、原核生物中で、相補DNAを正しい様
式で適当なプロモーターの後に置くことによってそのま
ま合成することができる。pUR及びpATHベクター系は、
先に述べた欧州特許出願公報中に記載されている。pGEX
は市販されている。強いSV40プロモーターを用いると、
fur相補DNAは適当な真核細胞中で発現し得る。タンパク
のグリコシル化に関連して、このアプローチは特定の目
的のために好ましい。
ことが可能である。原核生物において、fur遺伝子はβ
−ガラクトシダーゼ（pURベクター系）またはアントラ
ニレートシンセターゼ（pATHベクター系）と共に融合
（fusion）タンパクとして発現され得る。他の可能性
は、融合タンパクグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ−フリン（pGEX）の合成である。このアプローチの利
点は、フリンがトロンビンによって切断されることであ
る。フリンはまた、原核生物中で、相補DNAを正しい様
式で適当なプロモーターの後に置くことによってそのま
ま合成することができる。pUR及びpATHベクター系は、
先に述べた欧州特許出願公報中に記載されている。pGEX
は市販されている。強いSV40プロモーターを用いると、
fur相補DNAは適当な真核細胞中で発現し得る。タンパク
のグリコシル化に関連して、このアプローチは特定の目
的のために好ましい。
【００１０】 フリンは、標準的な生化学的方法により、タンパク分
解酵素阻害剤の存在下で精製することができる。フリン
は、（分泌顆粒中で起こるような）5.5のpHの比較的酸
性の媒質中で活性であるが、該タンパクはpH7.5におい
てもまた、その活性を保つ。これによって、0.2Mの酢酸
ナトリウム緩衝液（pH5.5）またはトリス−HCl緩衝液
（7.0）をインビトロで使用することができる。酵素フ
リンの活性は、Ca2+イオンの存在に依存する。インビト
ロでの酵素活性のために、２〜5mMのカルシウム濃度が
最適であると見出された。EDTAのような金属キレーター
の存在はフリンの活性を著しく阻害する。さらに、重金
属イオン例えばZn2+、Hg2+及びCu2+の存在は避けるべき
である。ｏ−フェナントロリン物質はCa2+以外の重金属
と結合し、それ故フリンの酵素活性に悪影響を有さな
い。5mMまでの低濃度のフェニルメチルスルホニルフル
オライド（PMSF）及びジイソプロピルフロロホスフェー
ト（DFP）は、阻害作用を有さない。PMSFのより高い濃
度において、酵素機能は阻害される。開裂されるべきタ
ンパクのプロセシングのためには、37℃で２時間のイン
ビトロでのイン キュベーションで十分である。
解酵素阻害剤の存在下で精製することができる。フリン
は、（分泌顆粒中で起こるような）5.5のpHの比較的酸
性の媒質中で活性であるが、該タンパクはpH7.5におい
てもまた、その活性を保つ。これによって、0.2Mの酢酸
ナトリウム緩衝液（pH5.5）またはトリス−HCl緩衝液
（7.0）をインビトロで使用することができる。酵素フ
リンの活性は、Ca2+イオンの存在に依存する。インビト
ロでの酵素活性のために、２〜5mMのカルシウム濃度が
最適であると見出された。EDTAのような金属キレーター
の存在はフリンの活性を著しく阻害する。さらに、重金
属イオン例えばZn2+、Hg2+及びCu2+の存在は避けるべき
である。ｏ−フェナントロリン物質はCa2+以外の重金属
と結合し、それ故フリンの酵素活性に悪影響を有さな
い。5mMまでの低濃度のフェニルメチルスルホニルフル
オライド（PMSF）及びジイソプロピルフロロホスフェー
ト（DFP）は、阻害作用を有さない。PMSFのより高い濃
度において、酵素機能は阻害される。開裂されるべきタ
ンパクのプロセシングのためには、37℃で２時間のイン
ビトロでのイン キュベーションで十分である。
【００１１】 フリンは、種々のタンパクのエンドタンパク分解プロ
セシングに使用することができる。これにより、例え
ば、インビトロで作られた前駆タンパクを特異的に開裂
して、該前駆体が全くまたは不十分な程度にしか開裂さ
れないところの病気の処置のための付加的な剤として使
用し得る生物学的に活性な組成物を生じることが可能と
なる。概して、フリンは生物学的に関連するタンパクの
プロセシングに適していると言って良い。
セシングに使用することができる。これにより、例え
ば、インビトロで作られた前駆タンパクを特異的に開裂
して、該前駆体が全くまたは不十分な程度にしか開裂さ
れないところの病気の処置のための付加的な剤として使
用し得る生物学的に活性な組成物を生じることが可能と
なる。概して、フリンは生物学的に関連するタンパクの
プロセシングに適していると言って良い。
【００１２】 タンパクフリンはまた、医薬としての用途が見出さ
れ、それ故、エンドプロテアーゼの不足した患者をフリ
ンの投与によって処置することができ、それ故、前駆タ
ンパクの適当なプロセシングがなおも可能である。その
結果、開裂生成物はそれらの機能を行い得、妨害的に高
いレベルの前駆タンパクを減じることができる。
れ、それ故、エンドプロテアーゼの不足した患者をフリ
ンの投与によって処置することができ、それ故、前駆タ
ンパクの適当なプロセシングがなおも可能である。その
結果、開裂生成物はそれらの機能を行い得、妨害的に高
いレベルの前駆タンパクを減じることができる。
【００１３】 フリンはまた、（例えば血液循環系中の）基質タンパ
クの沈着を除去するために適する可能性があり、それ
故、生命維持組織の閉塞症をフリンの投与によって治療
することができる。 フリンはさらにまた、あらゆる種類の生物学的に活性
な物質（例えば他の酵素）の工業的製造において、もし
プロセシングがそれにおける製造工程であるのならば、
使用できる。
クの沈着を除去するために適する可能性があり、それ
故、生命維持組織の閉塞症をフリンの投与によって治療
することができる。 フリンはさらにまた、あらゆる種類の生物学的に活性
な物質（例えば他の酵素）の工業的製造において、もし
プロセシングがそれにおける製造工程であるのならば、
使用できる。
【００１４】 タンパク分解活性は、その中にトランスメンブランド
メインを伴うカルボキシ末端領域が分離されても、保持
される。それ故、本発明に従い、完全なフリンまたはフ
リン類似酵素の代わりに、タンパク分解活性の原因とな
る部分を尚も含有する酵素のフラグメントを用いること
ができる。一つの適当なフラグメントは、例えば、アミ
ノ酸108〜464から成るフリンフラグメントである。
メインを伴うカルボキシ末端領域が分離されても、保持
される。それ故、本発明に従い、完全なフリンまたはフ
リン類似酵素の代わりに、タンパク分解活性の原因とな
る部分を尚も含有する酵素のフラグメントを用いること
ができる。一つの適当なフラグメントは、例えば、アミ
ノ酸108〜464から成るフリンフラグメントである。
【００１５】 フリンまたはフリン類似酵素、またはそのエンドタン
パク分解活性なフラグメントの活性は、さらに変異の導
入によって操作することができる。それ故、本発明はま
た、なおもエンドタンパク分解活性を有するフリンまた
はフリン類似酵素の誘導体に及ぶ。
パク分解活性なフラグメントの活性は、さらに変異の導
入によって操作することができる。それ故、本発明はま
た、なおもエンドタンパク分解活性を有するフリンまた
はフリン類似酵素の誘導体に及ぶ。
【００１６】 上記医薬組成物の本発明に従う好ましい態様に従い、
該組成物中で用いられるフリンもしくはフリン類似酵
素、またはエンドタンパク分解活性を有するフリンもし
くはフリン類似酵素のフラグメントもしくは誘導体は、
フリン、フリン類似酵素、フリンまたはフリン類似酵素
のフラグメントまたは誘導体を発現する能力を組換えDN
AまたはRNAを用いての遺伝子工学を通して獲得した原核
生物のまたは真核生物の細胞から、融合タンパクの形で
またはそうでなく得られて来た。ここで、フリン、フリ
ン類似酵素、フリンまたはフリン類似酵素のフラグメン
トまたは誘導体が融合タンパクとして細胞により作られ
る場合には、該融合タンパクはプロセシングされて、該
融合タンパクからのフリン、フリン類似酵素、フリンま
たはフリン類似酵素のフラグメントまたは誘導体を分離
する。
該組成物中で用いられるフリンもしくはフリン類似酵
素、またはエンドタンパク分解活性を有するフリンもし
くはフリン類似酵素のフラグメントもしくは誘導体は、
フリン、フリン類似酵素、フリンまたはフリン類似酵素
のフラグメントまたは誘導体を発現する能力を組換えDN
AまたはRNAを用いての遺伝子工学を通して獲得した原核
生物のまたは真核生物の細胞から、融合タンパクの形で
またはそうでなく得られて来た。ここで、フリン、フリ
ン類似酵素、フリンまたはフリン類似酵素のフラグメン
トまたは誘導体が融合タンパクとして細胞により作られ
る場合には、該融合タンパクはプロセシングされて、該
融合タンパクからのフリン、フリン類似酵素、フリンま
たはフリン類似酵素のフラグメントまたは誘導体を分離
する。
【００１７】 しかしながら他の可能性は、用いられるフリンまたは
フリン類似酵素の源が本来フリンまたはフリン類似酵素
を作ることのできる細胞例えば適当な腫瘍細胞系である
ことである。
フリン類似酵素の源が本来フリンまたはフリン類似酵素
を作ることのできる細胞例えば適当な腫瘍細胞系である
ことである。
【００１８】 本発明はさらに、タンパクをエンドタンパク分解活性
な酵素で処理することによるタンパクのインビトロでの
開裂のための方法（そこにおいて、本発明に従い、該タ
ンパクはCa2+イオンの存在下で、エンドタンパク分解活
性な酵素としてのフリンもしくはフリン類似酵素または
フリンもしくはフリン類似酵素のエンドタンパク分解活
性なフラグメント、誘導体もしくは融合タンパクで処理
される）に関する。
な酵素で処理することによるタンパクのインビトロでの
開裂のための方法（そこにおいて、本発明に従い、該タ
ンパクはCa2+イオンの存在下で、エンドタンパク分解活
性な酵素としてのフリンもしくはフリン類似酵素または
フリンもしくはフリン類似酵素のエンドタンパク分解活
性なフラグメント、誘導体もしくは融合タンパクで処理
される）に関する。
【００１９】 該処理は普通、生理的に生じるpH及び温度の値、すな
わち４〜９の範囲内のpH及び約37℃の温度にて行われ
る。 好ましくは、該処理は５〜7.5、より好ましくは5.5〜
7.0のpHで行われる。 また、本発明に従い、処理を20〜50℃、より好ましく
は30〜40℃の温度で行うのが好ましい。 さらに、本発明に従い、該処理を１〜10mM、より好ま
しくは２〜5mMのカルシウム濃度で行うのが好ましい。
本発明の特に好ましい態様に従い、該処理は、ｏ−フェ
ナントロリン、またはカルシウム以外の重金属に結合す
るための同等の試剤の存在下で行うのが好ましい。
わち４〜９の範囲内のpH及び約37℃の温度にて行われ
る。 好ましくは、該処理は５〜7.5、より好ましくは5.5〜
7.0のpHで行われる。 また、本発明に従い、処理を20〜50℃、より好ましく
は30〜40℃の温度で行うのが好ましい。 さらに、本発明に従い、該処理を１〜10mM、より好ま
しくは２〜5mMのカルシウム濃度で行うのが好ましい。
本発明の特に好ましい態様に従い、該処理は、ｏ−フェ
ナントロリン、またはカルシウム以外の重金属に結合す
るための同等の試剤の存在下で行うのが好ましい。
【００２０】 本発明に従う方法は、プロセシングされる基質そのも
のをフリン（またはフリン類似酵素）そのままで、すな
わち単離されたまたは精製された形のフリンで処理する
ことを含み、しかしまた、フリンが発現される細胞特
に、遺伝子工学された哺乳類の細胞を用いてのまたはそ
の中での処理をも含む。好ましくは、これらは注意深く
選択された、fur遺伝子及びプロセシングされる基質を
エンコードする遺伝子の高レベルの発現を伴う、遺伝子
工学された哺乳類の細胞（例えばCOS−１細胞、CHO細胞
及び内皮細胞）である。当業者に周知なように、遺伝子
増幅によりまたは強いプロモーターを用いることによ
り、非常に強められた発現を認識することができる。本
発明はトランスジェニックな動物を包含する用途にさえ
も及び、それ故インビトロでのタンパク製造及びタンパ
ク開裂プロセスに限定されない。本発明はそれ故、フリ
ンまたはフリン類似酵素をエンコードし、フリンまたは
フリン類似酵素を発現し得る組換えDNAから生じるDNAを
含有する哺乳類の細胞及び哺乳動物をまた含む。内皮細
胞は、それらの体全体にわたる（血管表面、肺組織等に
おける）分布の故に、及びそれらと体液循環（血流等）
におけるあらゆる種類の成分との相互作用のために、例
えば治療用遺伝子（therapeutic genes）及び遺伝子生
成物の体内の輸送のための哺乳類の細胞として特に理想
的である。それ故、プロ−タンパクのプロセシングにお
ける阻害よりもたらされる病気に苦しむ患者の内皮細胞
を、活性fur遺伝子を導入することによって該欠陥を治
療するため、体から単離した後に遺伝子工学することが
でき、続いて、遺伝子修飾された細胞を患者に再移植す
ることができる。そのような遺伝子治療は、しかしなが
ら、内皮細胞に限定されない。
のをフリン（またはフリン類似酵素）そのままで、すな
わち単離されたまたは精製された形のフリンで処理する
ことを含み、しかしまた、フリンが発現される細胞特
に、遺伝子工学された哺乳類の細胞を用いてのまたはそ
の中での処理をも含む。好ましくは、これらは注意深く
選択された、fur遺伝子及びプロセシングされる基質を
エンコードする遺伝子の高レベルの発現を伴う、遺伝子
工学された哺乳類の細胞（例えばCOS−１細胞、CHO細胞
及び内皮細胞）である。当業者に周知なように、遺伝子
増幅によりまたは強いプロモーターを用いることによ
り、非常に強められた発現を認識することができる。本
発明はトランスジェニックな動物を包含する用途にさえ
も及び、それ故インビトロでのタンパク製造及びタンパ
ク開裂プロセスに限定されない。本発明はそれ故、フリ
ンまたはフリン類似酵素をエンコードし、フリンまたは
フリン類似酵素を発現し得る組換えDNAから生じるDNAを
含有する哺乳類の細胞及び哺乳動物をまた含む。内皮細
胞は、それらの体全体にわたる（血管表面、肺組織等に
おける）分布の故に、及びそれらと体液循環（血流等）
におけるあらゆる種類の成分との相互作用のために、例
えば治療用遺伝子（therapeutic genes）及び遺伝子生
成物の体内の輸送のための哺乳類の細胞として特に理想
的である。それ故、プロ−タンパクのプロセシングにお
ける阻害よりもたらされる病気に苦しむ患者の内皮細胞
を、活性fur遺伝子を導入することによって該欠陥を治
療するため、体から単離した後に遺伝子工学することが
でき、続いて、遺伝子修飾された細胞を患者に再移植す
ることができる。そのような遺伝子治療は、しかしなが
ら、内皮細胞に限定されない。
【００２１】 本発明の好ましい態様は、プロ−形のタンパク及びフ
リンを発現する遺伝子工学された細胞を培養し、好まし
くは生成した該タンパクを単離することによる、タンパ
クの（微）生物生産のための方法である。この目的のた
めに、原核及び真核細胞の両者を使用することができる
が、より高等な真核の細胞が好ましい。例えば、酵母細
胞またはより良い植物細胞を使用することができる。し
かしながら、使用に特に好ましいのは、遺伝子工学され
た哺乳類の細胞である。
リンを発現する遺伝子工学された細胞を培養し、好まし
くは生成した該タンパクを単離することによる、タンパ
クの（微）生物生産のための方法である。この目的のた
めに、原核及び真核細胞の両者を使用することができる
が、より高等な真核の細胞が好ましい。例えば、酵母細
胞またはより良い植物細胞を使用することができる。し
かしながら、使用に特に好ましいのは、遺伝子工学され
た哺乳類の細胞である。
【００２２】 “プロ−形”と言う言葉は、プロセシングにより所望
のタンパクへと転化されるべきまたはされ得るタンパク
の形を意味する。それはタンパクの自然のプロ−形また
はプレプロ−形であり得るが、所望のタンパクをコード
する遺伝子が、付加されたシグナルまたはリーダーシー
クエンスによって先行されるところの組換えDNA構造物
の結果であるところの合成プロ−形でも良い。
のタンパクへと転化されるべきまたはされ得るタンパク
の形を意味する。それはタンパクの自然のプロ−形また
はプレプロ−形であり得るが、所望のタンパクをコード
する遺伝子が、付加されたシグナルまたはリーダーシー
クエンスによって先行されるところの組換えDNA構造物
の結果であるところの合成プロ−形でも良い。
【００２３】 プロセシングされる基質に関して、概して、対を成す
塩基性アミノ酸残基を有するタンパク分を基質として供
することができる。開裂部位に対して−４位（すなわち
開裂部位の４位前）での塩基性アミノ酸残基の追加的な
存在は、より高い有効性を導き出すであろう。以下の例
は、フリンによるプロセシングのための可能な基質とし
て挙げられるが、これらが総てではない：成長及び分化
因子の形質転換成長因子β（TGF−β）遺伝子の族（例
えばTGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、TGF−β４、TG
F−β５、アクチビブ（activiv）、インヒビン、アフリ
カツメガエル（Xenopus laevis）Vg1遺伝子生成物、抗
ミュラー管ホルモン（MIS）、ショウジョウバエ胚と骨
形態形成タンパクのデカペンタペプチド遺伝子複合体、
スポーン（Sporn）及びロバーツ（Roberts）のAnal.N.
Y.Acad.Sci.593巻（1990年）,1−６頁を見よ）によりエ
ンコードされた前駆体、成長因子の前駆体、例えばβ−
神経成長因子（β−NGF）及びインシュリン、血液凝固
（clotting）因子の前駆体例えばフォンウィルブランド
因子、タンパクＣ、第IX因子及び第Ｘ因子、ホルモン及
び神経ペプチド、例えばプロオピオメラノコルチン、プ
ロエンケファリン（Proenkephalin）、プロダイノルフ
ィン（Prodynorphin）、プロバソプレシン（Provasopre
ssin）、プロオキシトシン（Prooxytocin）、プロCRF
（ACTH放出ホルモン）、プロGRF（成長ホルモン放出因
子）、プソソマトスタチン（Prosomatostatin）、プロ
グルカゴン、プロカルシトニン（Pocal citonin）、プ
ロCGRP（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）、プロVIP
（血管作働性腸管ペプチド）、プロカエルリン（Procae
rulin）及びプロELH（タマゴにあるホルモン（egg layi
ng hormone）），インターロイキン、インターフェロ
ン、及び造血因子。
塩基性アミノ酸残基を有するタンパク分を基質として供
することができる。開裂部位に対して−４位（すなわち
開裂部位の４位前）での塩基性アミノ酸残基の追加的な
存在は、より高い有効性を導き出すであろう。以下の例
は、フリンによるプロセシングのための可能な基質とし
て挙げられるが、これらが総てではない：成長及び分化
因子の形質転換成長因子β（TGF−β）遺伝子の族（例
えばTGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、TGF−β４、TG
F−β５、アクチビブ（activiv）、インヒビン、アフリ
カツメガエル（Xenopus laevis）Vg1遺伝子生成物、抗
ミュラー管ホルモン（MIS）、ショウジョウバエ胚と骨
形態形成タンパクのデカペンタペプチド遺伝子複合体、
スポーン（Sporn）及びロバーツ（Roberts）のAnal.N.
Y.Acad.Sci.593巻（1990年）,1−６頁を見よ）によりエ
ンコードされた前駆体、成長因子の前駆体、例えばβ−
神経成長因子（β−NGF）及びインシュリン、血液凝固
（clotting）因子の前駆体例えばフォンウィルブランド
因子、タンパクＣ、第IX因子及び第Ｘ因子、ホルモン及
び神経ペプチド、例えばプロオピオメラノコルチン、プ
ロエンケファリン（Proenkephalin）、プロダイノルフ
ィン（Prodynorphin）、プロバソプレシン（Provasopre
ssin）、プロオキシトシン（Prooxytocin）、プロCRF
（ACTH放出ホルモン）、プロGRF（成長ホルモン放出因
子）、プソソマトスタチン（Prosomatostatin）、プロ
グルカゴン、プロカルシトニン（Pocal citonin）、プ
ロCGRP（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）、プロVIP
（血管作働性腸管ペプチド）、プロカエルリン（Procae
rulin）及びプロELH（タマゴにあるホルモン（egg layi
ng hormone）），インターロイキン、インターフェロ
ン、及び造血因子。
【００２４】 本発明はまた、それ自身がエンドタンパク分解プロセ
シングを必要としないタンパクにも適用することができ
る。例は、良好なプロセシング（グリコシル化）または
迅速な精製（分泌）の故に、所望のタンパクをエンコー
ドする配列が、先に提案されたような適当なシグナル配
列、例えばエリオット（Elliott）他〔Gene79巻（1989
年）,167−180頁〕によって酵母細胞中のエリスロポイ
エチンの製造のために、遺伝子構造である。その出版物
において、遺伝子構造はエリスロポイエチン配列の前に
置かれたプレプロ−α因子のリーダー領域から記載され
ている。生じた合成前駆体のプロセシングは、そこに存
在するKEX2遺伝子生成物により酵母細胞中で実施され
る。
シングを必要としないタンパクにも適用することができ
る。例は、良好なプロセシング（グリコシル化）または
迅速な精製（分泌）の故に、所望のタンパクをエンコー
ドする配列が、先に提案されたような適当なシグナル配
列、例えばエリオット（Elliott）他〔Gene79巻（1989
年）,167−180頁〕によって酵母細胞中のエリスロポイ
エチンの製造のために、遺伝子構造である。その出版物
において、遺伝子構造はエリスロポイエチン配列の前に
置かれたプレプロ−α因子のリーダー領域から記載され
ている。生じた合成前駆体のプロセシングは、そこに存
在するKEX2遺伝子生成物により酵母細胞中で実施され
る。
【００２５】 本発明のさらなる説明が、付随した図面を参照して与
えられる、ここで、 図１は794のアミノ酸から成るプリンのアミノ酸配列
（一文字コードにて）を示し； 図２はフリン遺伝子、相補DNA及びタンパクを図式的に
示す。 a.fur遺伝子の一部のゲノム構成。エクソン１（約120b
p）はエクソン２の7.2kb上流に位置する。エクソン２上
の星印は、開始コドンの位置を、エクソン16上の三角は
停止コドンを示す。コードしない配列は、黒い箱により
表されている。Ｂ＝BemH I;E＝EcoR I;K＝Kpn I;S＝Sal
I;P＝Pst I;X＝Xba Iである。 b.furの相補DNA中でのエクソンの分布図。 c.フリン中の種々のタンパクドメインの推定上の配置。
最大のエクソン（エクソン16）は、システインに富むド
メインほぼ全体、トランスメンブランドメイン及び細胞
質ドメインを暗号化する。エクソン２〜12は、推定され
るプレプロ及び触媒ドメインを示し、エクソン５、７及
び10に夫々活性部分残基Asp46（Ｄ）、His87（Ｈ）及び
Ser261（Ｓ）のためのコドンを有する。このイントロン
／エクソン分布は、セリンプロテアーゼのトリプシン族
において観察されるのと同じ程度の複雑さのものであ
る。垂直の矢印は、潜在的自動プロセシング部位である
塩基性残基の対（Arg−Arg、Lys−Arg）を示し；塩基性
アミノ酸残基の対Arg310−Lys311及びArg341−Lys342は
たぶんタンパク分解的開裂に関与する。提案された開裂
部位に対して−４位のアルギニン残基（arg104）が開裂
能率を促進することが見出されたので、成熟タンパクの
Ｎ−末端は、潜在的開裂部位（Lys−Arg−Arg−Thr−Ly
s−Arg）のトリプレットのすぐ後のアミノ酸残基108で
開始すると考えられる。
えられる、ここで、 図１は794のアミノ酸から成るプリンのアミノ酸配列
（一文字コードにて）を示し； 図２はフリン遺伝子、相補DNA及びタンパクを図式的に
示す。 a.fur遺伝子の一部のゲノム構成。エクソン１（約120b
p）はエクソン２の7.2kb上流に位置する。エクソン２上
の星印は、開始コドンの位置を、エクソン16上の三角は
停止コドンを示す。コードしない配列は、黒い箱により
表されている。Ｂ＝BemH I;E＝EcoR I;K＝Kpn I;S＝Sal
I;P＝Pst I;X＝Xba Iである。 b.furの相補DNA中でのエクソンの分布図。 c.フリン中の種々のタンパクドメインの推定上の配置。
最大のエクソン（エクソン16）は、システインに富むド
メインほぼ全体、トランスメンブランドメイン及び細胞
質ドメインを暗号化する。エクソン２〜12は、推定され
るプレプロ及び触媒ドメインを示し、エクソン５、７及
び10に夫々活性部分残基Asp46（Ｄ）、His87（Ｈ）及び
Ser261（Ｓ）のためのコドンを有する。このイントロン
／エクソン分布は、セリンプロテアーゼのトリプシン族
において観察されるのと同じ程度の複雑さのものであ
る。垂直の矢印は、潜在的自動プロセシング部位である
塩基性残基の対（Arg−Arg、Lys−Arg）を示し；塩基性
アミノ酸残基の対Arg310−Lys311及びArg341−Lys342は
たぶんタンパク分解的開裂に関与する。提案された開裂
部位に対して−４位のアルギニン残基（arg104）が開裂
能率を促進することが見出されたので、成熟タンパクの
Ｎ−末端は、潜在的開裂部位（Lys−Arg−Arg−Thr−Ly
s−Arg）のトリプレットのすぐ後のアミノ酸残基108で
開始すると考えられる。
【００２６】 フリン、及びKex1［クリュイフェロマイセス・ラクテ
ィス（Kluyveromyces lactis）］及びKex2［サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）］のア
ミノ酸配列が類似性を示すところの領域は、一部のプレ
プロドメイン、触媒的ドメイン全体（322の残基中の47
％の同一性）及び中間ドメイン全体（138の残基中の26
〜31％の同一性）の一部を含む。トランスメンブランと
細胞質ドメインには有意の類似性がなく、一方、システ
インに富むドメインは二つの酵母タンパク中には存在し
ない。
ィス（Kluyveromyces lactis）］及びKex2［サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）］のア
ミノ酸配列が類似性を示すところの領域は、一部のプレ
プロドメイン、触媒的ドメイン全体（322の残基中の47
％の同一性）及び中間ドメイン全体（138の残基中の26
〜31％の同一性）の一部を含む。トランスメンブランと
細胞質ドメインには有意の類似性がなく、一方、システ
インに富むドメインは二つの酵母タンパク中には存在し
ない。
【００２７】 図３は、（hfur）ヒトフリン、（kex1）Kex1プロテア
ーゼ、（kex2）Kex2プロテアーゼ、（ther）サーミター
ゼ、（subC）ズブチリシン・カールスベルグ（subtilis
in Carlsberg）、及び（subB）ズブチリシンBPN′のア
ミノ酸配列の比較を含む。
ーゼ、（kex2）Kex2プロテアーゼ、（ther）サーミター
ゼ、（subC）ズブチリシン・カールスベルグ（subtilis
in Carlsberg）、及び（subB）ズブチリシンBPN′のア
ミノ酸配列の比較を含む。
【００２８】 右手側に、成熟酵素の想定Ｎ−末端からのアミノ酸残
基の番号を示し、フリンについては上にも示す。おそら
く、フインは配列Lys−Arg−Arg−Thr−Lys−Arg（それ
は自動活性化のための三つの潜在的開裂部位を有する）
で停止する107の残基のプレプロセグメントを有する。 （▽）六つ総ての配列における同一の残基及び（．）保
存的置換（conservative substitution）；（：）少な
くとも四つの配列における同一の残基。フリン、Kex1及
びKex2における塩基性残基の対は、下部の小文字にて示
されている。配列の配置は、セリンプロテアーゼの20を
越えるズブチリシン族の複合配置、及びＸ−線結晶解析
より決定されたサーミターゼ、ズブチリシン・カールス
ベルグ及びズブチリシンBPN′の三次元構造の重ね合わ
せから取られる。この三次元構造の重ね合わせは、実線
により示されるように、拡張された一致する核（extend
ed consensuscore）を導き、位相学的に等しいＣα原子
間の距離は1.5A未満である。三つの総てのタンパクに共
通の二次の構造要素は、（α）α−ヘリックス、（β）
β−シート、（ｔ）β−ターン及び（ｓ）ベンドとして
示されている。
基の番号を示し、フリンについては上にも示す。おそら
く、フインは配列Lys−Arg−Arg−Thr−Lys−Arg（それ
は自動活性化のための三つの潜在的開裂部位を有する）
で停止する107の残基のプレプロセグメントを有する。 （▽）六つ総ての配列における同一の残基及び（．）保
存的置換（conservative substitution）；（：）少な
くとも四つの配列における同一の残基。フリン、Kex1及
びKex2における塩基性残基の対は、下部の小文字にて示
されている。配列の配置は、セリンプロテアーゼの20を
越えるズブチリシン族の複合配置、及びＸ−線結晶解析
より決定されたサーミターゼ、ズブチリシン・カールス
ベルグ及びズブチリシンBPN′の三次元構造の重ね合わ
せから取られる。この三次元構造の重ね合わせは、実線
により示されるように、拡張された一致する核（extend
ed consensuscore）を導き、位相学的に等しいＣα原子
間の距離は1.5A未満である。三つの総てのタンパクに共
通の二次の構造要素は、（α）α−ヘリックス、（β）
β−シート、（ｔ）β−ターン及び（ｓ）ベンドとして
示されている。
【００２９】 サーミターゼ、ズブチリシン・カールスベルグ及びズ
ブチリシンBPN′中に主鎖または領域の相互作用を通じ
て結合している基質またはインヒビター中に含まれるこ
とが公知の残基は、星印でマークしてある。活性部位
（Ｄ、Ｈ及びＳ）及びオキシアニオンホール（oxyanion
hole）（Ｎ）の主要な残基は下線を付してある。サー
ミターゼ中の最強のCaイオン結合部位に相当するループ
は、〈＝＝Ca＝＝〉により示されている。 フリンの推定的な触媒的ドメインの配列をエンコード
するエクソンの境界は、残基17、60、86、115、173、24
4、278、311及び352の後に位置する。
ブチリシンBPN′中に主鎖または領域の相互作用を通じ
て結合している基質またはインヒビター中に含まれるこ
とが公知の残基は、星印でマークしてある。活性部位
（Ｄ、Ｈ及びＳ）及びオキシアニオンホール（oxyanion
hole）（Ｎ）の主要な残基は下線を付してある。サー
ミターゼ中の最強のCaイオン結合部位に相当するループ
は、〈＝＝Ca＝＝〉により示されている。 フリンの推定的な触媒的ドメインの配列をエンコード
するエクソンの境界は、残基17、60、86、115、173、24
4、278、311及び352の後に位置する。
【００３０】 図４はフリンの触媒ドメインのモデル図を示す。該モ
デルは、ズブチリシンの帯状図に基づく。残基Asp46、H
is87及びSer261から成る活性部位は、中央上部に位置す
る。追加的なドメインを含有するＣ末端延伸（ダッシュ
で示す）は、触媒ドメインの反対側から始まる。
デルは、ズブチリシンの帯状図に基づく。残基Asp46、H
is87及びSer261から成る活性部位は、中央上部に位置す
る。追加的なドメインを含有するＣ末端延伸（ダッシュ
で示す）は、触媒ドメインの反対側から始まる。
【００３１】 ズブチリシンに対して延長されたＮ末端を含む、８の
短い挿入の予測される位置（黒ベタ）は、表面ループ中
及び保存されたα−ヘリックスとβ−シート二次構造要
素との間の結合中に位置して見える。
短い挿入の予測される位置（黒ベタ）は、表面ループ中
及び保存されたα−ヘリックスとβ−シート二次構造要
素との間の結合中に位置して見える。
【００３２】 二つの安定化カルシウムイオン（サーミターゼにおけ
るようなCa1及びCa2）の予測される位置は、外のループ
98〜105及び68〜77の夫々において、斜線付きの球によ
り示されている。サーミターゼ中のこれら二つのカルシ
ウムイオンに配位するために必要な総ての側鎖カルボキ
シル基はまた、フリン中にこれらループ中の位相的に等
しい残基中に存在し；さらに、サーミターゼ及びズブチ
リシンにおけるようにAsp8及びAsp55がCa1に配位するた
めに存在し、そこでは位相的に等しい位置において配位
子はGlnまたはAspである。 予測されるジスルフィド架橋Cys104−Cys253及びCys1
96−Cys226（またはCys198−Cys226）は、点線にて示
す。
るようなCa1及びCa2）の予測される位置は、外のループ
98〜105及び68〜77の夫々において、斜線付きの球によ
り示されている。サーミターゼ中のこれら二つのカルシ
ウムイオンに配位するために必要な総ての側鎖カルボキ
シル基はまた、フリン中にこれらループ中の位相的に等
しい残基中に存在し；さらに、サーミターゼ及びズブチ
リシンにおけるようにAsp8及びAsp55がCa1に配位するた
めに存在し、そこでは位相的に等しい位置において配位
子はGlnまたはAspである。 予測されるジスルフィド架橋Cys104−Cys253及びCys1
96−Cys226（またはCys198−Cys226）は、点線にて示
す。
【００３３】 フリン分子の基質結合部位（上部）上のマイナスに帯
電した側鎖基は、フォーク状の柄で示し、残基46、47、
84、121、123、126、150、151、152、192、194、199、2
41、248及び255に対応する。これらの電荷の殆どは、ズ
ブチリシン及びサーミターゼにおける同等の位置には存
在しない。これらのマイナスに帯電した残基の多くは、
それらがおそらくはリシン及び／またはアルギニンのP1
及びP2結合ポケット中にまたは近くに位置するので、基
質中の対を成す塩基性残基と直接相互作用することがで
きる。
電した側鎖基は、フォーク状の柄で示し、残基46、47、
84、121、123、126、150、151、152、192、194、199、2
41、248及び255に対応する。これらの電荷の殆どは、ズ
ブチリシン及びサーミターゼにおける同等の位置には存
在しない。これらのマイナスに帯電した残基の多くは、
それらがおそらくはリシン及び／またはアルギニンのP1
及びP2結合ポケット中にまたは近くに位置するので、基
質中の対を成す塩基性残基と直接相互作用することがで
きる。
【００３４】 フリンの触媒的ドメインのために記載されたモデルは
また、上記の重要な要素の本質的に総てが三つ総てのタ
ンパク中に存在する故に、Kex1及びKex2プロテアーゼに
も妥当する。
また、上記の重要な要素の本質的に総てが三つ総てのタ
ンパク中に存在する故に、Kex1及びKex2プロテアーゼに
も妥当する。
【００３５】 図５は、野生型のフォンウィルブランド因子のプレプ
ロ−vWF（上部）及び変異vWFgly763のプレプロ−vWFgly
763（下部）の構造上の構成を図式的に示す。内側の相
同なドメインは、四角い枠により示され;A1、A2及びA3
は三重のドメインを表し;Bは相同なドメインB1、B2及び
B3を表し;C1及びC2は二重のドメインを表し;D1、D2、D3
及びD4は四つの繰り返しドメインを表し、Ｄ′は部分的
に重複するドメインを表す。実線は残りのアミノ酸配列
を示す。アミノ末端部分は22のアミノ酸残基のシグナル
ペプチドを含有する。位置763のアルギニン残基の後の
開裂部位（それは一対の塩基性アミノ酸残基から成る）
は、矢印でマークしてある。開裂部位の周囲のDNA領域
のヌクレオチド配列が示されており、推定されるアミノ
酸配列は一文字の命名法により表されている。プロ−vW
Fgly763中の点変異は、星印でマークしてある。
ロ−vWF（上部）及び変異vWFgly763のプレプロ−vWFgly
763（下部）の構造上の構成を図式的に示す。内側の相
同なドメインは、四角い枠により示され;A1、A2及びA3
は三重のドメインを表し;Bは相同なドメインB1、B2及び
B3を表し;C1及びC2は二重のドメインを表し;D1、D2、D3
及びD4は四つの繰り返しドメインを表し、Ｄ′は部分的
に重複するドメインを表す。実線は残りのアミノ酸配列
を示す。アミノ末端部分は22のアミノ酸残基のシグナル
ペプチドを含有する。位置763のアルギニン残基の後の
開裂部位（それは一対の塩基性アミノ酸残基から成る）
は、矢印でマークしてある。開裂部位の周囲のDNA領域
のヌクレオチド配列が示されており、推定されるアミノ
酸配列は一文字の命名法により表されている。プロ−vW
Fgly763中の点変異は、星印でマークしてある。
【００３６】 以下に、フリンのエンドタンパク分解活性が基質とし
てのフォンウィルブランド因子の前駆体（プロ−vWF）
のプロセシングに用いられるところの本発明に従う方法
の例が与えられる。プレプロ、プロ及び成熟vWFの構造
に関して、フェルベ（Verweij）他、EMBO J.5巻（1986
年）,1839−1847頁、及びフェルベ他、J.Biol.Chem.263
巻（1988年）,7921−7924頁が参照される。プロ−vWF
は、プロ−ポリペプチド（741アミノ酸残基）及び（Ｃ
末端での）成熟vWF（2050アミノ酸残基）から成る。上
記の文献において説明されているように、成熟vWFは対
を成す塩基性アミノ酸Lys762−Arg763の隣のタンパク分
解プロセシングによりプロ−vWFから生成し、COS−１細
胞はプレプロ−vWF相補DNA全長のトランスフェクション
の後に構造的に分泌されるvWFの合成のための宿主とし
て適している。エンドタンパク分解プロセシングにおけ
るフリンの活性を、フォールベルグ（Voor berg）他に
より記載された〔EMBO J.9巻（1990年）,797−803頁〕
プロ−vWF及び変異プロ−vWFgly763の両者について試験
した。この変異プロ−vWFgly763をコードするDNAは、全
長プレプロ−vWF相補DNAの2407位置に、アデノシンの代
わりにグアノシンを含有する。この変異の結果として、
プロポリペプチドの開裂部位Lys762−Arg763は、プロ−
vWF前駆タンパク変異体中のLys762−Gly763によって置
き換えられる。
てのフォンウィルブランド因子の前駆体（プロ−vWF）
のプロセシングに用いられるところの本発明に従う方法
の例が与えられる。プレプロ、プロ及び成熟vWFの構造
に関して、フェルベ（Verweij）他、EMBO J.5巻（1986
年）,1839−1847頁、及びフェルベ他、J.Biol.Chem.263
巻（1988年）,7921−7924頁が参照される。プロ−vWF
は、プロ−ポリペプチド（741アミノ酸残基）及び（Ｃ
末端での）成熟vWF（2050アミノ酸残基）から成る。上
記の文献において説明されているように、成熟vWFは対
を成す塩基性アミノ酸Lys762−Arg763の隣のタンパク分
解プロセシングによりプロ−vWFから生成し、COS−１細
胞はプレプロ−vWF相補DNA全長のトランスフェクション
の後に構造的に分泌されるvWFの合成のための宿主とし
て適している。エンドタンパク分解プロセシングにおけ
るフリンの活性を、フォールベルグ（Voor berg）他に
より記載された〔EMBO J.9巻（1990年）,797−803頁〕
プロ−vWF及び変異プロ−vWFgly763の両者について試験
した。この変異プロ−vWFgly763をコードするDNAは、全
長プレプロ−vWF相補DNAの2407位置に、アデノシンの代
わりにグアノシンを含有する。この変異の結果として、
プロポリペプチドの開裂部位Lys762−Arg763は、プロ−
vWF前駆タンパク変異体中のLys762−Gly763によって置
き換えられる。
【００３７】
COS−１細胞へとトランスフェクションされた全長fur相
補DNAによりエンコードされた翻訳生成物の同定 fur遺伝子生成物フリンをさらに同定するために、こ
のタンパクを真核細胞中、SV40後期プロモーターの制御
下で合成し、その機能を明らかにするためのアプローチ
にこの物質を使用する実験を行った。fur遺伝子の翻訳
生成物を同定するために、免疫学的なアプローチを選択
した。“物質及び方法”中に記載されたような、組換え
フリンハイブリッドタンパクに対してラビット中で生じ
たポリクロナール抗血清を用いた。pMJ109、pMJ119また
はpEM1DNAでトランスフォームされたバクテリアの全溶
解物中のタンパクのウエスタンブロット分析において、
ポリクローナル抗血清は夫々、β−gal−Δフリン１、3
36trpE−AS−Δフリン１及びGST−Δフリン２を認識し
た。対照実験において、該抗血清はアントラリネートシ
ンセターゼまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼのtrpE−エンコードされたポリペプチド鎖と反応しな
かった。この抗血清を用いて、pSVLfurでトランスフェ
クションされたCOS−１細胞中のfur遺伝子でエンコード
されたタンパクを検出するため、ウエスタンブロット分
析を行った。fur相補DNAのヌクレオチド配列データに基
づき、87kDaの計算値の分子量を有する主たる翻訳生成
物の合成を予期することができる。夫々約97kDa及び100
kDaの見掛けの分子量を有する二つのタンパクを、トラ
ンスフェクションされたCOS−１細胞中で、トランスフ
ェクションされていないCOS−１細胞と比較して検出し
た（結果は記載しない）。
補DNAによりエンコードされた翻訳生成物の同定 fur遺伝子生成物フリンをさらに同定するために、こ
のタンパクを真核細胞中、SV40後期プロモーターの制御
下で合成し、その機能を明らかにするためのアプローチ
にこの物質を使用する実験を行った。fur遺伝子の翻訳
生成物を同定するために、免疫学的なアプローチを選択
した。“物質及び方法”中に記載されたような、組換え
フリンハイブリッドタンパクに対してラビット中で生じ
たポリクロナール抗血清を用いた。pMJ109、pMJ119また
はpEM1DNAでトランスフォームされたバクテリアの全溶
解物中のタンパクのウエスタンブロット分析において、
ポリクローナル抗血清は夫々、β−gal−Δフリン１、3
36trpE−AS−Δフリン１及びGST−Δフリン２を認識し
た。対照実験において、該抗血清はアントラリネートシ
ンセターゼまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼのtrpE−エンコードされたポリペプチド鎖と反応しな
かった。この抗血清を用いて、pSVLfurでトランスフェ
クションされたCOS−１細胞中のfur遺伝子でエンコード
されたタンパクを検出するため、ウエスタンブロット分
析を行った。fur相補DNAのヌクレオチド配列データに基
づき、87kDaの計算値の分子量を有する主たる翻訳生成
物の合成を予期することができる。夫々約97kDa及び100
kDaの見掛けの分子量を有する二つのタンパクを、トラ
ンスフェクションされたCOS−１細胞中で、トランスフ
ェクションされていないCOS−１細胞と比較して検出し
た（結果は記載しない）。
【００３８】 pSVLfurDNAでトランスフェクションされたCOS−１細
胞中のフリンの二つの形の存在は、フリンが翻訳後修飾
を受けていると言うことを示す。100kDaタンパクが約90
kDaの主生成物のグリコシル化された形であることが可
能である。しかしながら、100kDaポリペプチドがプロ−
形を表し、一方90kDaポリペプチドが残基107と108の間
のペプチド結合のタンパク分解的（自動）プロセシング
により生じた成熟フリンを表すと考えることも、また魅
力的である。
胞中のフリンの二つの形の存在は、フリンが翻訳後修飾
を受けていると言うことを示す。100kDaタンパクが約90
kDaの主生成物のグリコシル化された形であることが可
能である。しかしながら、100kDaポリペプチドがプロ−
形を表し、一方90kDaポリペプチドが残基107と108の間
のペプチド結合のタンパク分解的（自動）プロセシング
により生じた成熟フリンを表すと考えることも、また魅
力的である。
【００３９】 トランスフェクションされていないCOS−１細胞はま
た、90、60及び40kDaの見掛け分子量を有する小量の免
疫反応性物質を含有すると言うことが注意される。これ
らタンパクの同一性は確定されなければならないが、90
kDaのタンパクは少量の内在性フリンを表すと言うこと
が考えられる。データは、トランスフェクションされた
fur遺伝子配列は、実際、複写され翻訳されて、fur生成
物の生物的機能を試験することを可能とする。
た、90、60及び40kDaの見掛け分子量を有する小量の免
疫反応性物質を含有すると言うことが注意される。これ
らタンパクの同一性は確定されなければならないが、90
kDaのタンパクは少量の内在性フリンを表すと言うこと
が考えられる。データは、トランスフェクションされた
fur遺伝子配列は、実際、複写され翻訳されて、fur生成
物の生物的機能を試験することを可能とする。
【００４０】 フリンのタンパクプロセシング活性 10μｇのpSVLvwf DNAを用いてのトランスフェクション 実験において、360kDaのプロ−vWF前駆タンパク及び2
60kDa成熟vWFタンパクが、調整した媒質中でほぼ等割合
にて見出された。トランスフェクションにより得られた
細胞中の成熟vWFの生成は、内在性フリン（それは、COS
−１細胞から単離されたメッセンジャーRNAのノーザン
ブロック分析により及びポリクロナールラビット抗フリ
ン血清を用いての免疫沈降分析により示されるように、
COS−１細胞中で発現される）によるプロセシングに帰
せられる。
60kDa成熟vWFタンパクが、調整した媒質中でほぼ等割合
にて見出された。トランスフェクションにより得られた
細胞中の成熟vWFの生成は、内在性フリン（それは、COS
−１細胞から単離されたメッセンジャーRNAのノーザン
ブロック分析により及びポリクロナールラビット抗フリ
ン血清を用いての免疫沈降分析により示されるように、
COS−１細胞中で発現される）によるプロセシングに帰
せられる。
【００４１】 10μｇのpSVLvWFgly763DNAを用いてのCOS−１細胞の
類似のトランスフェクション実験において、プロ−vWFg
ly763が生じ、培養媒質中で360kDaタンパクとして構造
的に分泌された。成熟vWF（260kDa）へのエンドタンパ
ク分解プロセシングはなかった。
類似のトランスフェクション実験において、プロ−vWFg
ly763が生じ、培養媒質中で360kDaタンパクとして構造
的に分泌された。成熟vWF（260kDa）へのエンドタンパ
ク分解プロセシングはなかった。
【００４２】 ５μｇのpSVLvWFgly763DNA及び５μｇのpSVLfur DNA
を用いての同時トランスフェクションを行った場合に、
同じ結果が見出された。プロ−vWFgly763の成熟vWFへの
プロセシングは観察されなかった。
を用いての同時トランスフェクションを行った場合に、
同じ結果が見出された。プロ−vWFgly763の成熟vWFへの
プロセシングは観察されなかった。
【００４３】 一方、COS−１細胞を５μｇのpSVLvWF DNA及び５μｇ
のpSVLfur DNAを用いて同時トランスフェクションする
場合、プロ−vWFの成熟vWFへの完全なプロセシングが見
出された。
のpSVLfur DNAを用いて同時トランスフェクションする
場合、プロ−vWFの成熟vWFへの完全なプロセシングが見
出された。
【００４４】 物質及び方法 分子クローニング pSVLfurは、4.1kbの全長fur相補DNAフラグメントを含
有し、AGT出発コドンの上流の117ヌクレオチドから出発
し、pSVLのEcoR I部位にクローンされたポリ−Ａ付加部
位の下流の21ヌクレオチドで終わる〔ウェルズ（Well
s）他、Nucl.Acids Res.11巻（1983年）,7911−7925
頁〕。pSVLfurにおいて、fur相補DNA配列の発現は、SV4
0後期プロモーターの制御下にある。pMJ109は、プラス
ミドpUR291のHind III部位へと分子的にクローンされた
2.2kbのSma I/Sma Iヒトfur相補DNAフラグメントから成
り；該2.2kb fur相補DNAはフリンのカルボキシ末端領域
を包含し、pMJ109中のそれは、lacZ中の停止コドンの直
前に構成されたポリリンカー領域を用いてβ−ガラクト
シダーゼ（β−gal）エンコーディング配列に相中（in
phase）融合される。pMJ119は、同じ2.2kbのfur相補DNA
フラグメントから成るが、しかし、ここで、プラスミド
pATH1のSma I部位へと分子的にクローンされており、こ
れはアントラニレートシンセターゼのtrpE−エンコード
された部分の初めの336アミノ酸残基（336trpE−AS）へ
のフリンの相中融合をもたらす。最後に、pEW1の場合に
おいて、3.5kbのBgl II/EcoR Ifur相補DNAフラグメント
がpGEX−3Xへとクローンされ、そしてグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（GST）へと相中融合される。
有し、AGT出発コドンの上流の117ヌクレオチドから出発
し、pSVLのEcoR I部位にクローンされたポリ−Ａ付加部
位の下流の21ヌクレオチドで終わる〔ウェルズ（Well
s）他、Nucl.Acids Res.11巻（1983年）,7911−7925
頁〕。pSVLfurにおいて、fur相補DNA配列の発現は、SV4
0後期プロモーターの制御下にある。pMJ109は、プラス
ミドpUR291のHind III部位へと分子的にクローンされた
2.2kbのSma I/Sma Iヒトfur相補DNAフラグメントから成
り；該2.2kb fur相補DNAはフリンのカルボキシ末端領域
を包含し、pMJ109中のそれは、lacZ中の停止コドンの直
前に構成されたポリリンカー領域を用いてβ−ガラクト
シダーゼ（β−gal）エンコーディング配列に相中（in
phase）融合される。pMJ119は、同じ2.2kbのfur相補DNA
フラグメントから成るが、しかし、ここで、プラスミド
pATH1のSma I部位へと分子的にクローンされており、こ
れはアントラニレートシンセターゼのtrpE−エンコード
された部分の初めの336アミノ酸残基（336trpE−AS）へ
のフリンの相中融合をもたらす。最後に、pEW1の場合に
おいて、3.5kbのBgl II/EcoR Ifur相補DNAフラグメント
がpGEX−3Xへとクローンされ、そしてグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（GST）へと相中融合される。
【００４５】 pMJ109、pMJ119またはpEW1でトランスフォームされた
バクテリアにおけるタンパク合成を適当に誘導すると、
比較的多量のβ−gal−Δフリン１（分子量170kDa）、3
36trpE−AS−Δフリン１（分子量90kDa）及びGST−Δフ
リン２（分子量100kDa）の生成が夫々観察された。
バクテリアにおけるタンパク合成を適当に誘導すると、
比較的多量のβ−gal−Δフリン１（分子量170kDa）、3
36trpE−AS−Δフリン１（分子量90kDa）及びGST−Δフ
リン２（分子量100kDa）の生成が夫々観察された。
【００４６】 ポリクロナール抗フリン抗体の調製及び免疫ブロッティ
ング ポリクロナール抗フリン抗体を、pMJ109でトランスフ
ォームされたバクテリア中で合成されたβ−gal−Δフ
リン１ハイブイッドタンパクに対してラビット中で生じ
させた。免疫化のために、部分的に精製したハイブリッ
ドタンパク調製物を使用した。SDA−PAGEによるバクテ
リアタンパクのサイズ分別の後に、ハイブリッドタンパ
クを含有するゲル領域は切除され、該タンパク含有分は
電気泳動により除去された。トランスフェクションされ
たCOS−１細胞の抽出物を用いてのウエスタンブロット
実験を以下のようにして行った。10μｇのpSVLfur DNA
でトランスフェクションされたCOS−１細胞を、血清不
含の媒質中で48時間のトランスフェクション後処理に保
った。この時点で、該細胞を10mMのリン酸ナトリウム
（pH7.4）、0.14MのNaClで二回洗浄し、次に10mMのトリ
ス−HCl（pH7.8）、150mMのNaCl、5mMのEDTA、１％（v/
v）Nonidet P−40、10mMのベンザミジン、5mMのＮ−エ
チルマレイミド及び1mMのフェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（PMSF）から成る“免疫沈降緩衝液（IP
B）”中で溶解した（lyzed）。細胞の抽出物の一部を８
％（w/v）のSDS−ポリアクリルアミドゲル上の還元条件
下で処理し、続いて、タンパクをニトロセルロースへと
移した〔シュライヒャー（Schleicher）及びシュール
（Schuell）〕。フリンの検出は、該ブロット（blot）
を上記のラビット抗フリン血清を用いてインキュベート
することにより行った。
ング ポリクロナール抗フリン抗体を、pMJ109でトランスフ
ォームされたバクテリア中で合成されたβ−gal−Δフ
リン１ハイブイッドタンパクに対してラビット中で生じ
させた。免疫化のために、部分的に精製したハイブリッ
ドタンパク調製物を使用した。SDA−PAGEによるバクテ
リアタンパクのサイズ分別の後に、ハイブリッドタンパ
クを含有するゲル領域は切除され、該タンパク含有分は
電気泳動により除去された。トランスフェクションされ
たCOS−１細胞の抽出物を用いてのウエスタンブロット
実験を以下のようにして行った。10μｇのpSVLfur DNA
でトランスフェクションされたCOS−１細胞を、血清不
含の媒質中で48時間のトランスフェクション後処理に保
った。この時点で、該細胞を10mMのリン酸ナトリウム
（pH7.4）、0.14MのNaClで二回洗浄し、次に10mMのトリ
ス−HCl（pH7.8）、150mMのNaCl、5mMのEDTA、１％（v/
v）Nonidet P−40、10mMのベンザミジン、5mMのＮ−エ
チルマレイミド及び1mMのフェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（PMSF）から成る“免疫沈降緩衝液（IP
B）”中で溶解した（lyzed）。細胞の抽出物の一部を８
％（w/v）のSDS−ポリアクリルアミドゲル上の還元条件
下で処理し、続いて、タンパクをニトロセルロースへと
移した〔シュライヒャー（Schleicher）及びシュール
（Schuell）〕。フリンの検出は、該ブロット（blot）
を上記のラビット抗フリン血清を用いてインキュベート
することにより行った。
【００４７】 DNAトランスフェクション、細胞の放射性同位元素によ
るラベル及び免疫沈降分析 サルの腎臓のCOS−１細胞を、牛胎仔血清（10％v/v）
及び抗生物質〔ペニシリン（100U/ml）及びストレプト
マイシン（100マイクロg/ml）〕を補われたイスコーブ
の修飾された（Iscove's modified）最小培地中で増殖
させた。播種の後24時間経つと、半集密的細胞（semi−
confluent cell）を、200μg/mlのDEAE−デキストラン
を補われた2mlのイスコーブの修飾された最少培地中
で、20μｇのDNAを用いてトランスフェクションした。
用いたトランスフェクション操作は、クロロキンショッ
ク〔ルスマン（Luthman）及びマグナッソン（Magnusso
n）、Nucl.Acids Res.11巻（1983年）,1295−1308〕を
包含した。トランスフェクションの後、細胞を上記の培
地中に48時間保った。放射性同位元素によるラベル（ra
diolabelling）に先立ち、培地を除去し、細胞をRPMI培
地中メチオニンなしで１時間インキュベートした。続い
て、［35S］メチオニン（10μCi/ml、比放射能＞800Ci/
mmol）の存在下で４時間細胞をラベルし、続いてラベル
されていないメチオンニン（最終濃度1mM）で14時間追
跡した。13,000×ｇで５分間の遠心分離の後、ラベルさ
れた培養培地を１×IPBに調節した。ゼラチン−セファ
ロース（gelatin−Sepharose）を用いて、続いてラビッ
ト免疫前血清とプロテインＡ−セファロース（Protein
A−Sepharose）との予備生成した複合体を用いて二回イ
ンキュベートすることにより、培地の予備クリアランス
を行った。放射性同位元素でラベルされたvWF−関連タ
ンパクの免疫沈降を、ラビット抗−vWF〔ダコパッツ（D
akopatts）、グロストラプ（Glostrup）、デンマーク〕
とプロテインＡ−セファロースとから誘導されたIgG調
製物の予め形成された複合体により、行った。免疫沈降
物をIPBを用いて徹底的に洗浄し、夫々0.5％のデスオキ
シコレート（desoxy−cholate）及び10mMのトリス−HCl
（pH7.8）を補われたIPB中に溶解された非連続的な10〜
20％（w/v）のショ糖勾配によりペレット化した。免疫
沈降物は、還元条件下、５％SDS−ポリアクリルアミド
ゲル上で分析した。
るラベル及び免疫沈降分析 サルの腎臓のCOS−１細胞を、牛胎仔血清（10％v/v）
及び抗生物質〔ペニシリン（100U/ml）及びストレプト
マイシン（100マイクロg/ml）〕を補われたイスコーブ
の修飾された（Iscove's modified）最小培地中で増殖
させた。播種の後24時間経つと、半集密的細胞（semi−
confluent cell）を、200μg/mlのDEAE−デキストラン
を補われた2mlのイスコーブの修飾された最少培地中
で、20μｇのDNAを用いてトランスフェクションした。
用いたトランスフェクション操作は、クロロキンショッ
ク〔ルスマン（Luthman）及びマグナッソン（Magnusso
n）、Nucl.Acids Res.11巻（1983年）,1295−1308〕を
包含した。トランスフェクションの後、細胞を上記の培
地中に48時間保った。放射性同位元素によるラベル（ra
diolabelling）に先立ち、培地を除去し、細胞をRPMI培
地中メチオニンなしで１時間インキュベートした。続い
て、［35S］メチオニン（10μCi/ml、比放射能＞800Ci/
mmol）の存在下で４時間細胞をラベルし、続いてラベル
されていないメチオンニン（最終濃度1mM）で14時間追
跡した。13,000×ｇで５分間の遠心分離の後、ラベルさ
れた培養培地を１×IPBに調節した。ゼラチン−セファ
ロース（gelatin−Sepharose）を用いて、続いてラビッ
ト免疫前血清とプロテインＡ−セファロース（Protein
A−Sepharose）との予備生成した複合体を用いて二回イ
ンキュベートすることにより、培地の予備クリアランス
を行った。放射性同位元素でラベルされたvWF−関連タ
ンパクの免疫沈降を、ラビット抗−vWF〔ダコパッツ（D
akopatts）、グロストラプ（Glostrup）、デンマーク〕
とプロテインＡ−セファロースとから誘導されたIgG調
製物の予め形成された複合体により、行った。免疫沈降
物をIPBを用いて徹底的に洗浄し、夫々0.5％のデスオキ
シコレート（desoxy−cholate）及び10mMのトリス−HCl
（pH7.8）を補われたIPB中に溶解された非連続的な10〜
20％（w/v）のショ糖勾配によりペレット化した。免疫
沈降物は、還元条件下、５％SDS−ポリアクリルアミド
ゲル上で分析した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ファン デ フェン，ウィレム，ヤン, マリー ベルギー国，3051 セント ジョリス― ベールト，カステールストラート 19 (72)発明者 ファン デン オウェランド，アンナ, マリア，ウィルヘルミナ オランダ国，6668 エーエヌ ランドヴ ィーク，カークストラート 17 (72)発明者 ファン デューインホヘン，ヨハネス, ランベルタス，ペトラス オランダ国，5703 シーゼット ヘルモ ンド，ウェルシャップレイン 26 (72)発明者 ロイブロイク，アントニウス，ヨハネ ス，マリア オランダ国，6121 エックスシー ボル ン，ハンズブロイク 22 (72)発明者 コニング，ピエト，ニコ，マリア オランダ国，2343 ジェイビー エーゲ ストゲースト，アブツポエルホフ ８ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/06 ZNA C12N 9/64 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】タンパクをエンドタンパク分解活性な酵素
で処理することによる、タンパクをインビトロで開裂す
る方法であって、該タンパクをCa2+イオンの存在下、前
記エンドタンパク分解活性な酵素としてのフリンもしく
はフリン類似酵素またはフリンもしくはフリン類似酵素
のエンドタンパク分解活性フラグメント、誘導体もしく
は融合タンパクを用いて処理することを含む方法。 - 【請求項２】処理が、５〜7.5の、好ましくは5.5〜7.0
のpHで行われる、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】処理が、１〜10mM、好ましくは２〜5mMの
カルシウム濃度にて行われる、請求項１または２に記載
の方法。 - 【請求項４】処理が、ｏ−フェナントロリン、またはカ
ルシウム以外の重金属のイオンを結合するための同等の
試剤の存在下で行われる、請求項１〜３のいずれか一つ
に記載の方法。 - 【請求項５】処理が、20〜50℃、好ましくは30〜40℃の
温度にて行われる、請求項１〜４のいずれか一つに記載
の方法。 - 【請求項６】処理が、ポリペプチドホルモン、成長因
子、毒素、酵素、または他のタイプの生物学的に関係す
るタンパクの前駆タンパクに適用される、請求項１〜５
のいずれか一つに記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8902651A NL8902651A (nl) | 1989-10-25 | 1989-10-25 | Farmaceutisch preparaat met endoproteolytische activiteit; werkwijze voor endoproteolytische processing van eiwitten. |
| NL8902651 | 1989-10-25 | ||
| NL9000917 | 1990-04-18 | ||
| NL9000917A NL9000917A (nl) | 1989-10-25 | 1990-04-18 | Farmaceutisch preparaat met endoproteolytische activiteit; werkwijze voor endoproteolytische processing van (precursor) eiwitten en voor de (micro) biologische bereiding van eiwitten. |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05504051A JPH05504051A (ja) | 1993-07-01 |
| JP3191111B2 true JP3191111B2 (ja) | 2001-07-23 |
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|---|---|---|---|
| JP51489590A Expired - Lifetime JP3191111B2 (ja) | 1989-10-25 | 1990-10-12 | （前駆体）タンパクのエンドタンパク分解的プロセシングのための方法 |
| JP2000381776A Expired - Lifetime JP3270760B2 (ja) | 1989-10-25 | 2000-12-15 | フリンによるタンパクの微生物的生産方法及びその生産のための細胞 |
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|---|---|---|---|
| JP2000381776A Expired - Lifetime JP3270760B2 (ja) | 1989-10-25 | 2000-12-15 | フリンによるタンパクの微生物的生産方法及びその生産のための細胞 |
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| DE (1) | DE69029663T3 (ja) |
| DK (1) | DK0497828T4 (ja) |
| ES (1) | ES2099714T5 (ja) |
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| GR (1) | GR3023013T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5935815A (en) * | 1989-10-25 | 1999-08-10 | Katholieke Universiteit Leuven | Process for micro biological production of proteins |
| IE914102A1 (en) * | 1990-11-26 | 1992-06-03 | Genetics Inst | Expression of pace in host cells and methods of use thereof |
| US6348327B1 (en) | 1991-12-06 | 2002-02-19 | Genentech, Inc. | Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells |
| DK52293D0 (ja) * | 1993-05-05 | 1993-05-05 | Novo Nordisk As | |
| US6005077A (en) * | 1995-11-10 | 1999-12-21 | Immuno Aktiengesellschaft | Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation |
| AT404838B (de) * | 1995-11-24 | 1999-03-25 | Immuno Ag | Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen |
| US6596526B1 (en) | 2000-06-09 | 2003-07-22 | Baxter Aktiengesellschaft | Furin polypeptides with improved characteristics |
| WO2005103245A1 (en) * | 2004-04-23 | 2005-11-03 | Novozymes A/S | Method for obtaining mature protease by enzymatic digestion |
| SI2157177T1 (sl) | 2007-05-22 | 2013-05-31 | Baxter International Inc. | Preparativni postopek čiščenja humanega furina |
| PT2235197T (pt) | 2007-12-27 | 2017-10-11 | Baxalta Inc | Processos para cultura de células |
| JP5806465B2 (ja) | 2007-12-31 | 2015-11-10 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ | 実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンおよび実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを作製するための方法 |
| US20130149295A1 (en) | 2010-05-12 | 2013-06-13 | Martine Cohen-Solal | Furin and biologically active derivatives thereof for use in the prevention or treatment of an inflammatory disease |
| RU2610436C2 (ru) | 2011-06-02 | 2017-02-10 | Баксалта Инкорпорейтед | Составы рекомбинантного фурина |
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|---|---|---|---|---|
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| CA1340740C (en) * | 1987-12-08 | 1999-09-14 | Eileen R. Mulvihill | Co-expression in eukaryotic cells |
-
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1997
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