상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3의 인간 혈청 알부민 유전자 및 팀프-2 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 3의 인간 혈청 알부민 유전자 및 팀프-2 유전자를 포함하는 염기서열로부터 번역된 폴리펩타이드를 제공한다.
또한 본 발명은
(a) 프로모터;
(b) 서열번호 3의 인간 혈청 알부민 유전자 및 팀프-2 유전자; 및
(d) 전사종결인자;
를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는 pHSATIMP이다.
또한 본 발명은 상기 벡터가 도입된 형질전환주, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 Y2805/pHSATIMP(KCTC 10131BP)인 것인 형질전환주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 형질전환주로부터 제조된 융합단백질을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자는 팀프-2 단백질의 발현효율 및 발현안정성을 향상시키기 위하여 인간 혈청 알부민을 팀프-2 단백질에 융합시켜 제조하였다.
본 발명은 인간 혈청 알부민 유전자 및 팀프-2 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3으로 기재하였다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 재조합 벡터는 프로모터, 전사종결인자 및 선별인자를 포함하며, 목적 단백질의 세포외 분비신호를 추가로 포함한다. 상기 분비신호서열은 통상적으로 알려진 모든 종류의 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 인간 혈청 알부민 분비신호서열이다.
본 발명에서 일예로 제조한 벡터는 pHSATIMP이다. pHSATIMP는 하기 표 1 및 도 1의 구성을 가진다.
|
pHSATIMP |
프로모터 |
GAL10프로모터 (서열번호 1) |
분비신호 |
HSA 프리신호서열 (서열번호 2) |
유전자 |
HSA-팀프-2 융합 유전자(서열번호 3) |
전사종결신호 |
GAL7터미네이터 (서열번호 4) |
영양요구성 표지(auxotrophic marker) |
URA3유전자 |
복제 원점(origin of replication) |
2 ㎛ |
본 발명의 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 세포에 도입하여 제조된 형질전환주를 제조하였다. 상기 세포는 효모 등을 비롯한 통상의 모든 세포가 바람직하다. 형질전환주의 일예는 사카로마이세스 세레비지애 Y2805/pHSATIMP(KCTC 10131BP)이다.
사카로마이세스 세레비지애 Y2805/pHSATIMP의 배양배지는 아미노산 결핍 효모 질소베이스 0.67 % 및 글루코스 2 %를 포함하는 최소배지이고, 목적 단백질 발현배지는 갈락토스를 포함하는 배지이다. 가장 바람직하게는 효모추출물 1 %, 박토펩톤 2 %, 글루코스 1 % 및 갈락토스 2 %를 포함하는 발현배지에 2 일간 30 ℃로 배양하는 것이 좋다.
서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환주는 약 87.6 kDa의 재조합 융합단백질을 발현 및 세포외 분비한다. 상기 재조합 융합단백질은 인간 혈청 알부민-팀프-2가 융합된 형태이다. 형질전환주에서 발현 후 정제방법은 통상적인 이온교환컬럼법이며, 발현효율은 플라스크 배양 시 배양액 1 L당 약 30 내지 50 mg이다. 팀프-2는 그 자체만으로 사카로마이세스 세레비지아에서 거의 발현되지 않아 생산하기 어려웠으나, 본 발명에서는 융합단백질 형태로 발현시켜 발현량을 50 내지 100 배 이상 증가시켰다.
따라서, 본 발명은 효모(S. cerevisiae)에서 발현이 거의 되지 않는 팀프-2를 팀프-2 활성을 유지하는 융합단백질의 형태로 변형해서 대량으로 생산할 수 있는 방법을 개발하였으며, 융합단백질로 사용된 혈청 단백질은 혈액 내에 가장 많이 존재하는 단백질로서 혈액으로 대량 투여되어도 부작용이 없어 의약적 사용가능성을 만족시킨다.
본 발명의 재조합 융합단백질은 MMP 활성을 저해(도 4)할 뿐만 아니라 혈관내피세포의 관형성을 억제한다.(도 5) 따라서, 본 발명의 재조합 융합단백질은 팀프-2 활성을 가지므로 MMP억제 및 혈관신생억제용도로 사용할 수 있다. 재조합 융합단백질은 바람직하게는 암세포의 전이억제제 또는 혈관신생과 연관된 질병치료제로 활용될 수 있으며, 인간혈청 알부민이 융합되어 있어, 인체 내에서 더욱 안정하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 벡터의 제조
(1) pHSATIMP 벡터의 제조
GAL10프로모터-HSA프리신호서열-HSA유전자-팀프-2 유전자-GAL7터미네이터를 포함하는 pHSATIMP 벡터를 제조하였다.
인간 혈청 알부민 유전자(HSA)는 pHSA 플라스미드(리드바이오(주))를 주형으로 서열번호 5의 프라이머(5' 프라이머,EcoRI 부위 포함)와 서열번호 6의 프라이머(3' 프라이머, 서열번호 7의 프라이머와 상보적인 15개의 염기 서열 포함)로 PCR 증폭하여 수득하였다.
팀프-2 유전자는 pMY2 플라스미드((주)안지오랩)를 주형으로 서열번호 7의 프라이머(5' 프라이머)와 서열번호 8의 프라이머(3' 프라이머,HindⅢ 부위 포함)를 이용하여 PCR로 증폭하였다.
상기에서 수득한 인간 혈청 알부민 유전자 절편과 팀프-2 유전자절편은 인간혈청 알부민 유전자 서열의 3' 말단과 팀프-2 유전자의 5' 말단이 서로 상보적이다. 따라서, 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 8을 프라이머로 하여 PCR을 수행함으로써 인간 혈청 알부민 유전자와 팀프-2 유전자가 in-frame으로 정확하게 연결된 PCR 산물을 얻을 수 있었다.
상기 PCR 산물은 양 말단에EcoRI과HindⅢ 절단부위를 가지고 있어, 동일한 제한효소 절단부위를 포함하는 pHSA 벡터에 클로닝하여 pHSATIMP 재조합 벡터를 제조하였다.
실시예 2: 형질전환주 제조
실시예 1에서 제조된 pHSATIMP를 사카로마이세스 세레비지애에 리티움 아세테이트(lithium acetate) 방법(Ito 등,J. Bacteriol.153, 163-168, 1983)으로 형질도입하였다. 발현벡터가 세포 내로 들어갔는지는 영양요구성 선별 배지(SC-URA)에서 정상적으로 자라는 클론을 얻어 확인하였다.
pHSATIMP로 형질전환된 세포는 사카로마이세스 세레비지애 Y2805/pHSATIMP로 명명하고, 2001년 12월 3일에 KCTC(Korean Collection for Type cultures) 10131BP로 기탁하였다.
실시예 3: 인간 혈청 알부민-팀프-2 융합 단백질의 발현
상기 형질전환주는 발현배지(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 글루코스 1%, 갈락토스 2%)에서 30 ℃로 2 일간 배양하였다. 배지내 갈락토스가GAL10프로모터의 작용을 유도하여 혈청 알부민-팀프-2 융합 단백질이 발현된다. 24 시간, 48 시간을 배양한 후 배양상등액 20 ul를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석하였다.
도 2는 사카로마이세스 세레비지애 Y2805/pHSATIMP을 배양한 상등액을 전기영동 및 웨스턴 블롯한 사진이다. 레인 1은 분자량을 나타내는 마커이고, 레인 2는 대조군이고, 레인 3은 24시간 배양한 사카로마이세스 세레비지애 Y2805/pHSATIMP 상등액이고, 레인 4는 48시간 배양한 사카로마이세스 세레비지애 Y2805/pHSATIMP 상등액을 분석한 것이다. 레인 3과 4에서 87.6 kDa의 융합단백질이 발현됨을 확인하였다.
실시예 4: 재조합 융합 단백질의 정제
배양액으로부터 재조합 인간 혈청 알부민-팀프-2 융합 단백질을 정제하기 위하여 배양액을 10,000 x g에서 10분간 원심분리하여 효모세포를 제거한 상등액을 얻었다. 상등액에 황산암모늄을 70 % 포화시켜 생성된 침전물을 15,000 x g에서 30분간 원심분리하였다. 펠렛은 50 mM HEPES(pH 8.0) 완충용액에 녹이고, 투석한 후 불용성물질을 여과하였다. 상기 과정은 4 ℃에서 실시하였다. 이렇게 하여 얻은 배양 농축액을 DEAE-sepharose(Pharmacia 제품) 컬럼에 주입하고, 50 mM HEPES(pH 8.0) 완충액으로 세척하고 0.1-0.5 M NaCl을 이용하여 선상구배(linear gradient)로 용출시켰다.
재조합 인간 혈청 알부민-팀프-2 융합 단백질은 0.24 M NaCl에서 용출되었으며 정제된 단백질의 순도를 SDS-PAGE로 분석하였다.
도 3의 순수분리한 재조합 융합단백질의 SDS-PAGE 사진으로, 87.6 kDa의 단백질이 분리되었다. 배양액에서 정제된 재조합 인간 혈청 알부민-팀프-2 융합 단백질의 수율은 배양액 1 L당 약 20 mg이며, 80 % 이상의 순도를 가진다.
실시예 5: 재조합 융합 단백질의 MMP 효소 억제활성 측정
실시예 4에서 정제한 재조합 융합 단백질의 매트릭스 메탈로프로테이즈(MMP) 억제 활성을 확인하였다.
(1) MMP 효소의 제조
MMP-2 cDNA(GENEBANK No. XM_048244)를 pBlueBac4.5 전이벡터(Invitrogen 사, Cat no. V1995-20)에 클로닝하고, 상기 클로닝 벡터를 벡-N-블루 트랜스펙션 키트(Bac-N-Blue Trnasfection Kit, Invitrogen 사, Cat no. K855-01)를 이용하여 Sf9 세포에 형질감염시켰다. Sf21 세포는 10 % 태아소혈청(fetal bovine serum)이 있는 TNM-FH (Sigma, St.Louis, MO, U.S.A)배지에서 27 ℃, 배양한 다음, 원심분리하고 107cell/㎖의 농도가 되도록 배지에 재현탁(resuspension)시켰다. 현탁물에 클로닝 벡터를 포함하는 바이러스와 함께 상온에서 1시간 배양하였다. 감염된 Sf21 세포는 72시간동안 키우고 배지를 수거하여 배지로부터 MMP-2를 젤라틴-세파로즈 친화성 컬럼(gelatin-sepharose affinity column)을 이용하여 정제하였다.
(2) MMP 활성 억제 측정 실험
분광형광계(Spectrofluorometer, Perkin-Elmer LS50B)를 이용하여 MMP효소 활성 억제를 측정하였다.
상기에서 제조한 MMP-2는 활성측정에 사용하기 전 1 mM APMA(p-아미노페닐 머큐릭 아세테이트)로 활성화시킨 후 사용하였다. MMP-2기질로는 Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-NH2(서열번호 9), BACHEM사 제품 Cat.No. M-1895)를 사용하였다.
2 ㎖의 큐벳에 서열번호 9의 기질 10 uM을 포함하는 완충용액(50 mM Tricine(pH 7.5), 10 mM CaCl2, 200 mM NaCl) 2 ㎖, MMP-2 10 nM을 넣었다. 혼합물은 분광형광계를 이용하여 실온에서 2분 간격으로 20분동안 형광도 변화를 측정하여 대조군으로 두었다. 여기파장(Excitation wavelength)은 280 nm, 방사파장(Emission wavelength)은 360 nm에서 측정하였다.
동일한 방법으로 기질을 포함하는 완충용액에 MMP-2 10 nM과 실시예 4의 재조합 융합단백질 7.5 ㎍/㎖ 또는 15 ㎍/㎖을 넣은 후, 분광형광계를 이용하여 시간 변화에 따른 형광도를 측정하였다.
도 4는 본 발명의 재조합 융합 단백질에 의한 MMP의 활성억제율을 나타낸 그래프이다. 7.5 ㎍/㎖의 재조합 융합단백질은 MMP-2의 활성을 37% 억제하였으며, 15 ㎍/㎖의 재조합 융합단백질은 MMP-2의 활성을 55% 억제하였다.
실시예 6: 재조합 융합단백질의 혈관신생억제 활성측정
재조합 융합단백질의 혈관신생에 대한 효과를 알아보기 위하여 사람의 제대혈관 내피세포에 의한 모세혈관과 같은 구조 형성에 미치는 영향을 관찰하였다.
사람의 제대혈관 내피세포인 HUVE 세포(Human Umbilical Vein Endothelial cell)를 얻기 위하여 제왕절개수술로 얻은 신선한 사람의 탯줄에서 정맥의 내피세포를 분리한 후 혈관내피세포를 배양하였고, 배양한 세포는 Ⅷ 인자의 항체를 이용한 세포면역학적 염색으로 HUVE 세포임을 확인하였다. 상기 HUVE 세포를 젤화된 마트리젤(Matrigel, Collaborative Biomedical Products)상에서 37 ℃, 16 - 18시간 배양하였고, 상기 실시예 4의 재조합 융합단백질을 6.5 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 관형성을 무처리군과 비교하였다.
도 5a는 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포가 망상의 관구조를 형성한 것을 관찰한 것으로, 혈관형성의 한 과정인 망상의 관구조가 생성되고 있음을 알 수 있었다.
도 5b는 재조합 융합단백질을 6.5 ㎍/㎖농도로 처리하여 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포를 관찰한 것으로, 망상의 관구조 연결이 끊어지는 것을 볼 수 있었다.
마트리젤상에서 형성된 튜브의 면적을 이미지 프로 플러스(Image-Pro Plus, Media Cybernetics사)로 분석하였을 경우 정제된 재조합 인간 팀프-2 단백질을 6.5 ㎍/㎖ 농도로 처리한 실험군이 처리하지 않은 군에 비하여 관 형성 면적이 19 % 밖에 되지 않아 혈관신생을 81 % 억제하였다.