CZ287994B6 - Plazmidy, způsob jejich výroby a jejich použití pro získávání aktivátoru plazminogenu - Google Patents

Abstract

Plazmidy, vhodné pro expresi předstupně rscu-PA proteinu s výtěžkem exprese alespoň 10 % hmotnostních celkového vytvořeného proteinu v Enterobakteriaceae, s výhodou ve kmenech Eschericia coli, ve kterých operon obsahuje regulovatelný promotor, Shine-Dalgarnovou sekvenci účinnou jako vazebné místo ribozomů, startovací kodon, syntetický strukturní gen pro urin-plazminogenový aktivátor "scuPA" s jedním řetězcem obsahujícím 411 zbytků aminokyselin a ve směru po proudu dolů od strukturního genu jeden až dva terminátory. Dále je popsán způsob výroby nových plazmidů, při kterém se do plazmidu pBR 322, ze kterého byl odstraněn nic/bom-region a/nebo alespoň část genu rezistentního vůči tetracyklinu, mezi místa řezu Eco RI a Hind III vloží "multi cloning site" se sekvencí nukleotidů uvedenou na obr. 2, která má mezi místy řezu Xba I a Nde I Shine-Dalgarnovou sekvenci a ve vzdálenosti 6 až 12 nukleotidů, obsahuje startovací kodon ATG a s jejich pomocí o sobě známým způsobem vestavěné jeden nebo dŕ

Description

Plazmidy, způsob jejich výroby a jejich použití pro získávání aktivátoru plazminogenu

Oblast techniky

Vynález se týká nových plazmidů, způsobu jejich výroby a jejich použití pro získávání aktivátoru plazminogenu.

Dosavadní stav techniky

Při léčení ucpávání cév, podmíněných fibrinem, jako například infarktu srdce, plicních embolií, onemocnění končetin, které je spojeno s ucpáváním arterií atd. hrají aktivátory plazminogenu významnou roli. Asi od počátku padesátých let je známé, že v lidské moči je obsažen proteolytický enzym, který vyvolává přeměnu plazminogenu na plazmin, to znamená na enzym, který způsobuje štěpení fibrinu na rozpustné polypeptidy a tím uvolní ucpání podmíněná fibrinem. Tento aktivátor plazminogenu byl nazván urokináza a ukázalo se, že skutečně existují různé formy urokinázy. Všechny tyto formy se ale odvozují přímo od stejného předchůdce molekuly zymogenu prourokinázy, známého asi od poloviny 70tých let. Poté co se ukázal, že tato prourokináza má strukturu s jedním řetězcem, byla označena jako scu-PA (Single Chain Urinary Plazminogen Activator). Tento scu-PA sestává ze 411 aminokyselin a je v přirozeně se vyskytující formě glykosylován na aminokyselině 302.

Z různých prací je známa genově technologická výroba neglykosylované části proteinu scu-PA, která byla označena jako „rscu-PA (rekombinantní scu-PA), nebo také volným názvem „sarupláza“. Při terapeutickém nasazení rscu-PA se ukázalo, že tento s ohledem na účinek a snášenlivost předčí tradiční fibrinolytika (srov. Lancet 1989, str. 863-868).

Pro výrobu neglykosylovaného aktivátoru plazminogenu rscu-PA se používají prokaryonty, o čemž bylo v literatuře již uvedeno několik údajů. Až dosud známé postupy pro rscu-PA spočívají na expresi strukturního genu scu-PA, izolovaného z lidských tkání. Bohužel se při tom dosáhly jen nízké výnosy exprese, které nedovolují vyrábět hospodárně žádaný produkt ve větších množství. Tak popisuje například Hibino a kol. vAgric. Biol. Chem. 52, 329-336 (1988) pro rscu-PA výrobu v E. coli jen 2% výnos exprese, měřeno na celkovém proteinu bakterií. Na druhé straně nejsou v evropské patentové přihlášce 92 182 A2 ani Holmesem et al. (10) dosažené výnosy exprese přesně uváděny. Při dopracování těchto údajů se ale získalo u různých kmenů méně než 2% výnosu rscu-PA v proteinu bakterií.

Je třeba poukázat na to, že stejně jako v mnoha případech exprese eukaryontických proteinů v bakteriích i rscu-PA v buňce - kteiý se zde dále označuje jako „protein předstupně“ - vzniká ve formě denaturovaného vměstkového tělesa, které se po intermediámí izolaci musí proteinochemicky zpětně sestavit na správnou terciární strukturu rscu-PA. Takto získaný produkt se může potom pro zjištění vytvořeného množství rscu-PA převést například přídavkem plazminu na neglykosylovanou urokinázu se dvěma řetězci („rtcu-PA“), jejíž enzymatická aktivita se zjišťuje a může sloužit jako míra vzniklého množství rscu-PA. Přirozeně se ale může zjistit výtěžek proteinu předstupně popřípadě rscu-PA a tím i výnos exprese například denzitometrickým vyhodnocením elektroforetického gelového dělení veškerých proteinů.

Podstata vynálezu

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že pomocí plazmidy transformovaných bakterií podle vynálezu se dosáhne mnohokrát vyššího výsledku exprese než s identickými hostitelskými kmeny transformovanými plazmidy známými ze stavu techniky. Plazmidy podle vynálezu jsou v souladu s tím co bylo uvedeno lepší než všechny dosud známé plazmidy pro získávání rscu-PA

-1 CZ 287994 B6 popřípadě jeho proteinu předstupně. Pro úplnost je nutné se zmínit o tom, že se o sobě známým způsobem pomocí již shora pro analytické účely zmíněným štěpením rscu-PA, například s plazminem, může získat rtcu-PA i v technickém měřítku, poté co se v důsledku předloženého vynálezu stal rscu-PA dobře přístupným.

Předmětem předloženého vynálezu tedy jsou nové plazmidy pro expresi předstupně rscu-PA proteinu s výtěžkem exprese alespoň 10 % hmotnostních celkového vytvořeného proteinu v Enterobakteriaceae, s výhodou ve kmenech Eschericia coli, ve kterých operon obsahuje regulovatelný promotor, Shine-Dalgamovou sekvenci účinnou jako vazebné místo ribozomů, startovací kodon, syntetický strukturní gen pro urin-plazminogenový aktivátor „scuPA“ s jedním řetězcem obsahujícím 411 zbytků aminokyselin a ve směru po proudu dolů od strukturního genu jeden až do terminátory.

Jako regulovatelný promotor je výhodně vestavěn promotor Trp nebo Tac pomocí Multi cloning site, syntetický promotor Trp s nukleotidovou sekvencí podle obr. 8 nebo promotor Tac z plazmidu ptač SDT (DSM 5018).

Jako po sobě následující transkripční terminátory je vestavěn terminátor trp A a/nebo test A/ort L z TN 10 do operonu nových plazmidů.

Pomocí Multi cloning site je výhodně vestavěn v dílčích krocích strukturních gen se sekvencí nukleotidů podle obr. 15.

Předmětem předloženého vynálezu je dále způsob výroby nových plazmidů, při kterém se do plazmidu pBR322, ze kterého byl odstraněn nic/bom-region a/nebo alespoň část genu rezistentního vůči tetracyklinu, mezi místa řezu Eco Rl a Hind III vloží „multi cloning site“ se sekvencí nukleotidů uvedenou na obr. 2, která má mezi místy řezu Xba I a Nde I ShineDalgamovou sekvenci a ve vzdálenosti 6 až 12, s výhodou 8 až 10 nukleotidů, obsahuje startovací kodon ATG a s jejich pomocí o sobě známým způsobem vestavěné jeden nebo dva transkripční terminátory, syntetické dílčí sekvence scu-PA strukturního genu, s výhodou počínaje od konce 3' strukturního genu, jakož i regulovatelný promotor.

Pod dojmem „multi cloning site“ se rozumí úsek sekvence v plazmidu, který obsahuje rozeznávací místa pro různé třídy restrikčních endonukleáz. Rozeznávací místa způsobují, že sekvence DNA může být štěpena restrikčními enzymy. „Nic/bom-region“ může způsobit výměnu úseků sekvencí dvou DNA-plazmidů. Odstraněním nic/bom-regionu z plazmidu se tato výměna potlačí a zvýší se biologická bezpečnost.

Výhodně se Eco Rl x Hind ΙΠ fragment z plazmidu vestaví o sobě známým způsobem jako expresní kazeta do jiného plazmidu, schopného autonomního rozmnožování v Enterobakteriaceae, s výhodou v E. coli.

Výhodně se v plazmidu prodlouží vzdálenost mezi Shine-Dalgamovou sekvencí a startovacím kodonem řezem s Nde I, vyplněním vzniklých míst řezu a následující ligací vzniklých bluntkonců.

Plazmidy, které lze získat podle vynálezu se dále vyznačují tím, že jejich operon vykazuje regulovatelný, popřípadě syntetický promotor, Shine-Dalgarovu sekvenci, účinnou jako vazné místo ribozomů, startovací kodon, syntetický strukturní gen pro scu-PA a směrem dolů od strukturního genu alespoň jeden terminátor S výhodou jsou přítomny dva po sobě následující terminátory, u nichž se zejména jedná o trp A terminátor a/nebo tet A/ort L terminátor z Tn 10, srovnej Schollmeier ct al. (6).

V kontrolním regionu plazmidu vyrobeného podle vynálezu činí vzdálenost mezi ShineDalgamovou sekvencí a startovacím kodonem 6-12, s výhodou 8-10 nukleotidů.

-2CZ 287994 B6

U konstrukce strukturního genu, který lze zavádět do nových plazmidů se vestavují s výhodou sekvence bází kódující právě přítomné aminokyseliny, uvedené v následující tabulce 1. Při tom nemusí být ve strukturním genu splněny současně všechny tyto znaky.

Dále je předmětem předloženého vynálezu způsob získávání aktivátoru plazminogenu za použití plazmidu podle vynálezu, při kterém se plazmidem o sobě známým způsobem transformuje kmen Enterobakteriacae, s výhodou kmen E. coli, indukuje se exprese scu-PA strukturního genu, vzniklý rscu-PA protein předstupně se oddělí od média a rozložených buněk bakterií, protein předstupně se solubilizuje a potom se působením redox systému složí zpět na rscu-PA.

Výhodně se plazmidem transformuje kmen species E. coli, s výhodou kmen E. coli K12.

Tabulka 1

Aminokyseliny	triplet
Argin	CGT
Leucin	CTG
Valin	GTT
Prolin	CCG
Glycin	GGT

Na druhé straně je při výstavbě strukturního genu výhodné zabránit tak dalece jak jen je to možné použití následujících kodonů pro dále uvedené aminokyseliny (přičemž opět nemusí být splněny tyto znaky pro všechny aminokyseliny):

kodon, kterému je třeba se vyhnout	aminokyselina
ATA GTC CCC AAG AGG, AGA, CGG, CGA GGA, GGG	izoleucin valin prolin lysin arginin glycin

Výběr kodonů podle vynálezu pro jednotlivé aminokyseliny ve strukturní genu jakož i vpředu uvedených znaků kontrolního regionu se co možná nejvíce zabrání vytvoření stabilních sekundárních struktur mezi strukturním genem a kontrolním regionem.

Pro získání syntetického strukturního genu se nejdříve syntetizují jako monoprovazec oligonukleotidy v úsecích o 40 až 80 bázích. S výhodou se tyto vyrobí v 1 pmolekulovém měřítku metodou pevných fází popsanou Adamsem et al. (7) pomocí DNA-syntetizéru (model Biosearch 8 600 firmy New Brunswick Scientific Co.). Jako monomemí synthony se při tom používají v obchodě běžné β-kyanoethylem chráněné diizopropylaminofosforamidity nyní potřebných desoxyribonukleotidů. Po odštěpení od nosiče se koncové provazce chráněné ještě tritylem deionizují za sterilních podmínek gelovou filtrací a předčistí a potom se ve dvou krocích podrobí prvnímu dělení pomocí HPLC s obrácenými fázemi („reversed phase“-HPLC). Získaný hlavní produkt se detrityluje a po dvou dalších čisticích krocích pomocí HPLC s obrácenými fázemi („reversed phase“-HPLC) se získá požadovaný oligonukleotid vysoce čistý, jak to ukazuje gelová elektroforetická analýza (PAGE).

Ze skupin 4 až 9 těchto jednotlivých provazců se potom získá asi 200 nukleotidů dlouhých dvouprovazcových fragmentů tím, že se jednoprovazcové oligonukleotidy, které nestojí na konci, na konci 5' fosforylují a nyní získané komplementární provazce se anelují a ligují soligo

-3CZ 287994 B6 nukleotidy, které stojí na konci. Po ligaci se vytvořené klonování schopné dvouprovazcové fragmenty použijí potom ve vhodných linearizovaných vektorech. Další postup vyplývá z níže uvedených příkladů.

Zkratky použité v předložené přihlášce vynálezu mají následující význam:

bp:	párové báze
DE 52:	aniontoměnič firmy Whatman
EDTA:	ethylendiamintetraoctová kyselina
IPGT:	izopropyl-p-D-thiogalaktopyranosid
PAGE:	polyakrylamidová gelová elektroforéza
PU:	Ploug units
SDS:	natriumdodecylsulfát
S.D.-sekvence:	Shine-Dalgamova sekvence
Tris-HCl:	trishydroxymethylaminomethanhydrochlorid
Tween 80:	polyethylenoxyd(20)sorbitanmonooleát

Pro konstrukci nových plazmidů podle vynálezu se vychází s výhodou od komerčního plazmidu pBR 322 (4363 bp). S výhodou se z tohoto eliminuje nic/bom-region a/nebo gen rezistentní vůči tetracyklinu. Při tom není nutné gen s rezistencí vůči tetracyklinu dokonale odstranit, spíče postačí, když se odstraní do té míry, že plazmid nepropůjčí jím transformovaným kmenům bakterií žádnou rezistenci vůči tetracyklinu. Pomocí těchto opatření (odstraněním nic/bom regionu a alespoň části genu rezistentního vůči tetracyklinu) se získá tak zvaný „vysoce bezpečný plazmid“.

Výhodná strategie konstrukce nového plazmidu podle vynálezu, vycházející, jak je vpředu uvedeno, od modifikovaného plazmidu pBR 322 (nebo jiného zde uvedeného předem známého plazmidu) spatřuje další krok ve vestavbě syntetického „Multi cloning site“ mezi místa řezu Ec Rl a Hind III. Tento multi cloning site (srov. obr. 2) vykazuje pevně určený sled míst řezu, mezi těmito se nacházející báze jsou voleny libovolně s výjimkou sekvence mezi Xba I a Nde I, která obsahuje vazné místo ribozomů (Shine-Dalgomovu sekvenci) z B. subtilis Xyl operonu 5 AAGGAG-3'(4) jakož i pevně stanovenou vzdálenost mezi S.D. sekvencí a startovacím kodonem ATG. Báze GAAAT následující po sekvenci S.D. jsou převzaty ze (4) a pomocí CATATG místa řezu Nde I spojeny. Tím tedy činí vzdálenost mezi S.D. sekvencí a ATG 8 párových bází. Vzdálenosti mezi jednotlivými místy řezu Multi cloning site by měly s ohledem na technickoklonovací důvody mít délku minimálně asi 20 nukleotidů, čímž se usnadní oddálení mezifragmentů.

Pomocí tohoto Multi cloning site se do plazmidu zavedou řezná místa, - která s výhodou po vestavbě transkripčního terminátoru - umožní po sobě následující stavbu dílčích sekvencí scuPA strukturního genu, s výhodou počínaje od konečného C požadovaného proteinu, tedy od konce 3' provazce DNA strukturního genu, který se má vyrobit, jakož i vestavbu například syntetického plazmidu nebo i plazmidu izolovaného z jiného plazmidu nebo i komerčního Trp promotoru. Dokonalá sekvence nukleotidu takto získaného scu-PA strukturního genu je s údajem aminokyselin odpovídajících jednotlivému kodonu znázorněná na obr. 15.

Jiné z nových plazmidů se dají podle vynálezu získat z plazmidu konstruovaného jak bylo vpředu uvedeno, například tím, že se řezy s Eco Rl a Hind III získá syntetický scu-PA strukturní gen se všemi regulačními jednotkami a potom se vestaví do jiného plazmidu, který je schopen se v Enterobakteriaceích, zejména v E. coli autonomně rozmnožovat, a který se za tímto účelem linearizuje a zkrátí řezy s Eco Ri a Hind III. V principu stejným způsobem, ale za využití míst řezu EcoRi a Xba se dá vyměnit například Trp promotor za Tac promotor (a obráceně) v plazmidu získaném podle vynálezu.

-4CZ 287994 B6

Analogicky se může vyjít také od jiných známých plazmidů, které obsahují singulární Eco Ri a Hind III místa řezu, jako například pUC 9, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19 a jiné.

Nové plazmidy s prodlouženou vzdáleností mezi Shine-Dalgamovou sekvencí a startovacím kodonem ATG se dají podle vynálezu získat tím, že se plazmid, konstruovaný jak bylo shora popsáno, ve kterém uvedená vzdálenost činí například 8 nukleotidů, řeže s Nde I, rezultující místa řezu se doplní a potom se vznikající blunt-konce ligují, čímž se vytvoří požadovaný nový plazmid, ve kterém vzdálenost mezi S.D-sekvencí a startovacím kodonem činí například 10 nukleotidů.

Jak již bylo řečeno vykazují bakterie transformované plazmidy vyrobenými podle vynálezu mnohonásobně vyšší expresní výtěžek než bylo možné dosáhnout u těch, u kterých byla transformace prováděna plazmidy známými ze stavu techniky. Obzvláště vhodné hostitelské organismy pro plazmidy, které lze získat podle vynálezu, jsou kmeny druhu E. coli a příbuzných Enterobakteriaceae, jako například kmeny Pseudomonas, Salmonela, Enterobacter, Klebsiella nebo Serratia.

Výhodné hostitelské organismy jsou kmeny druhu E. coli jako například E. coli GRT-1 a zejména kmeny E. coli podskupiny K12 jako například E. coli K12 JM101 (ATCC 33876), E. coli K12 JM103 (ATCC 39403), E. coli K12 JM 105 (DSM 4162), E. coli - K12 - kmen ATCC 31466 nebo i E. coli K12 DH1 (ATCC 33849).

Zavedení exprese do expresních systémů E. coli, které obsahují Tac promotor, se může provádět například přídavkem laktózy nebo odejmutím glukózy, s výhodou ale přídavkem izopropyl-β-Ε)thiogalaktopyranosidu. Jestliže je ale v plazmidu přítomen Trp promotor, pak se indukce provádí s výhodou kyselinou indolylakrylovou, indolyloctovou nebo indolylpropionovou. Samozřejmě se mohou použít stejným způsobem i jiné známé induktory.

Po indukci a dosažení předem stanovené hustoty buněk se buňky odstředí a zbytek po odstředění se po rozmíchání ve vodném roztoku soli převede například do homogenizátoru, ve kterém se buňky pomocí tlakového rozdílu nechají popraskat. Po opakovaném odstředění se získá ve zbytku protein rscu-PA přestupně vedle ve vodě nerozpustných zlomků buněk atd. Zpracováním s roztokem guanidhydrochloridu přejde protein přestupně do roztoku a po novém odstředění se zbylý roztok zpracuje s redox systémem (například obsahující redukovaný a oxidovaný glutathion), čímž se vytvoří přirozená konformace tzn. vyvolá se tvorba požadovaného rscu-PA. Tento je potom přítomný v reakční směsi v rozpuštěné formě a může se izolovat obvyklými čisticími kroky (například chromatografií a následující lyofilizaci) v čisté formě.

Pro analytické účely se s výhodou postupuje tak, že se kmeny E. coli transformované plazmidem, který se má zkoumat, fermentují a po dosažení předem stanovené optické hustoty suspenze buněk se exprese rscu-PA proteinu předstupně indukuje vhodným induktorem. Po odpovídající době trvání fermentace se alikvotní části odeberou a z těchto částí odstředěné buňky se potom rozloží lysozymem (1 mg lysozymu pro 50 ml 50 mM Tris-hydrochloridového pufru s pH 8,0, 50 mM EDTA a 15 % sacharózy). Homogenizát lyžovaných buněk se solubilizuje ve 4 až 5 M roztoku guanidinhydrochloridu a po zředění na 1,2 M guanidinhydrochlorid se za přídavku redukčního činidla (glutathionu, merkaptoethanolu nebo cysteinu) podrobí na dobu 2 až 5 hodin reakci zpětného řasení (srov. B. Winkler et al. in (11)). Takto získaná rscu-PA s jedním řetězcem se po přídavku plazminu převede na rtcu-PA se dvěma řetězci, jejichž aktivita se potom určuje se substrátem S2444 (pyroGlu-Gly-Arg-p-nitroanilid; Kabi Diagnostika, Švédsko), který se dá odštěpit pouze aktivními urokinázami se dvěma řetězci. Tato aktivace rscu-PA plazminem se provádí v 50 mM Tris-pufru, 12 mM natriumchloridu, 0,02 % Tween při pH 7,4 a 37 °C. Poměr rscu-PA k plazminu by měl činit asi 100 až 1 500 k 1, vztaženo na molaritu, nebo asi 8 000 až 36 000 ku 1 vztaženo na jednotky enzymu. Testovací inkubace se provádí v 50 mM Trispufru, 38 mM natriumchloridu při pH 8,8 a v přítomnosti 0,36 μΜ aprotinu (pro inhibici plazminu) a 0,27 mM S 2444 při 37 °C. Vždy podle obsahu rscu-PA ve vzorku se reakce zastaví po 5 až 60ti

-5CZ 287994 B6 minutové inkubaci přídavkem 90 % kyseliny octové a při 405 nm se změří extinkce. Podle údajů výrobce substrátu S 2444 představuje při tomto postupu změna extinkce 0,05 za minutu při 405 nm aktivitu 25 Plug - jednotek/ml testovaného roztoku.

Výtěžky rscu-PA, které se získají při použití různých plazmidů vyrobených podle vynálezu v proteinu předstupně získaném u různých bakterií, byly reprodukovány na obr. 10,12 a 14.

Jak vyplývá z obr. 11, jakož i dále uvedených údajů níže následujících příkladů - zejména tabulky 1 a tabulky 2 -, vyvolávají plazmidy, které lze získat podle vynálezu s výhodou ve kmenech E. coli tvorbu předstupně proteinu rscu-PA s výtěžkem exprese 10 až 25 % hmotn., zejména 14 až 20 % hmotn. vytvořeného celkového proteinu. Výtěžek exprese je tedy při použití nových plazmidů při nejmenším 10 až 15krát vyšší než výtěžek získaný se známými plazmidy, jako například pUK 54 trp 207 -1.

Přehled obrázků na výkresech

Přiložené výkresy znázorňují:

Obr. la a lb: konstrukci plazmidů pBF 158 z komerčního plazmidů pBR322. Při tom se popořádku oddálí nic/bom-region a velká část genu rezistentního vůči tetracyklinu.

Obr. 2: sekvenci nukleotidu syntetického „multicloning site“.

Obr. 3: konstrukci plazmidů pBF 158-01. Znázorněna je vestavba syntetického multi cloning site do plazmidů pBF 158 mezi místy řezu Eco RI a Hind III.

Obr. 4: konstrukci plazmidů pBF 158—01 T. Fragment CIA I x Hind ΠΙ se nahradí odpovídajícím fragmentem „I“ z plazmidů pRT 61 (5), na kterém se nachází tet A/orf L terminátor z Tn 10 (6).

Obr. 5a až 5g: sekvence nukleotidu syntetických fragmentů pro gen kódující humánní scu-PA (jejichž vestavba je popsána za vytvoření strukturního genu pro scu-PA v plazmidů podle vynálezu, vycházeje od plazmidů pBF 158-01 T v příkladech ld až lf a znázorněna na obr. 6,7 a 9).

Obr. 6a až 6c: konstrukci plazmidů pBF 158-02 T až pBF 158-06 T vestavbou fragmentů oligonukleotidu M 4 až M 8, počínaje C-koncem požadovaného proteinu (v souladu s 3' koncem DNA provazce) počínaje plazmidem pBF 158-01 T.

Obr. 7a až 7c: konstrukci plazmidů pBF 158-08 T pomocí pomocné konstrukce v plazmidů pVC 19 (srovnej příklad lc).

Obr. 8: sekvence nukleotidu syntetického Trp-promotoru.

Obr. 9: konstrukci expresního plazmidů pro protein předstupně humánní rscu-PA, pBF 160. Strukturní gen pro scu-PA je znázorněn černým pruhem mezi místy řezu Nde I a Cla I.

Obr. 10: Výtěžky exprese proteinu předstupně humánní rscu-PA (stanoveno jako aktivita rteuPA po zpětném zřasení a aktivaci) v různých kmenech E. coli transformovaných pBF 160 (o—o) nebo plazmidem pUK 54 trp 207-1 (10) (·—·) za kontroly Trppromotoru v závislosti na čase po indukci kyselinou indolakiylovou k časovému okamžiku O. Udány jsou aktivity rtcu-PA zjištěné se substrátem S 2444 v Ploug-Units na ml fermentačního média s optickou hustotou rovnou 1 při 578 nm.

-6CZ 287994 B6

Obr. 11: dezitogram SDS-PAGE proteinů zE. coli transformovaných pBF 161 K12 JM 103— buněk po fermentaci před (A) po 6 hodin po přídavku (B) kyseliny indolakrylové jako induktoru.

Obr. 12: výtěžky exprese proteinu předstupně humánního rscu-PA (stanoveno jako rtcu-PA aktivita po zpětném složení s aktivací) vE. coli k 12 JM103 transformováno pBF 171, tzn. za kontroly Tac-promotoru. Indukce se prováděla v čase OIPTG. Uvedena je zjištěná aktivita rtcuPA vůči substrátu S v Ploug-Units na 1 ml fermentačního média s optickou hustotou 1 při 578 nm.

Obr. 13: Prodloužení vzdálenosti mezi Shine-Dalgamovou sekvencí (SD) a startovacím kodonem ATG z 8 na 10 bází vyplněním míst řezu NDe I a následující ligací vzniklých blunt-konců.

Obr. 14: výtěžky exprese proteinu přestupně humánního rscu-PA (stanoveno jako rtcu-PA aktivita po zpětném zřasení a aktivaci) za kontroly promotoru Trp v E. coli GRT-1 transformováno plazmidem pBF 161 (o—o) nebo pBF 163 (Δ---Δ). Indukce se prováděla kyselinou indolakrylovou bezprostředně po časovém okamžiku O. Uvedeny jsou rtcu-PA aktivity zjištěné se substrátem S 2444, v Ploug-Units na ml fermentačního média s optickou hustotou rovnou 1 při 578 nm.

Obr. 15a a 15b: dokonalá nukleotidová sekvence scu-PA strukturního genu s údajem aminokyselin odpovídajících jednotlivým kodonům.

Příklady provedení vynálezu

Restrikční enzymy používané v příkladech provedení se běžně prodávají (srov. např. nachr. Chem. Techn., Lab. 35,939,1987).

Kultivační médium používané v příkladech pro selekci kleonů obsahuje v litru: 7,8 g peptonu z masa, 7,8 g peptonu zkaseinu, 10 g extraktu kvasnic, 5,6 g natriumchloridu a lOg glukózy. Toto médium se za tepla doplní 10 g agaru na litr a nalije se na desky.

Příklad 1

Konstrukce expresního plazmidu pBF 160 pro protein předstupně rscu-PA se syntetickým scuPA- genem za kontroly Trp promotoru

a) Konstrukce plazmidu pBF 158

i) Z plazmidu pBR 322 (Pharmacia, č. 27-4902, 4363 hp) se nic/bon region, který se nachází mezi bázemi 2207 a 2263 (1) oddálí následovně (srov. i obr. 1) pBR 322 se u báze 2298 rozřízne Nde I a tím linearizuje. Přečnívající konce se vyplní pomocí „fill in“ reakce, a tím se získají blunt-konce. Potom se rozštěpí u báze 2068 a Pvu II a oba blunt konce zbylé části pBR 322 a opět ligují pomocí běžné techniky s T4 ligázou. Potom se ligovaný podíl transformuje v kompetentní buňky E. coli K12 103 (ATCC 39403) (3). Transformované buňky se kultivují na médiu za přídavku 150 pg ampicilinu/ml. Ze získaných klonů se vyberou ty, které obsahují plazmid pBF 157, který se liší od výchozího plazmidu pBR322 a)PstI x BspM II b)PstI x Bal x Bal-, c)PstI x Ava I-fragmenty menšími o 228 nukleotidů. Obě singulární místa řezu PvuII a Nde I obsažená v pBR 322 nejsou již v plazmidu pBF 157 přítomna.

ii) Z pBF 157 se oddálí velká část renu rezistentního vůči tetracyklinu říznutím s Eco RV x Nru I a následující ligací vznikajících blunt konců. Po transformaci v E. coli K12 JM 103 a kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu/ml se získají klony, ze kterých se vyberou ty, které obsahují

-7CZ 287994 B6 plazmid pBF 158. Tento je o 787 nukleotidů menší než pBF 157 a liší se kromě toho tím, že chybí místo řezu Bam HI. Transformace kmenů bakterií pBF 158 neposkytuje těmto žádnou rezistenci vůči tetracyklinu.

b) konstrukce pBF 158-01, vestavba syntetického site s velkým počtem klonů.

Z pBF 158 se řezem s Eco Rl x Hind III oddálí fragment obsahující 31 nukleotidů a do mezery se liguje syntetický multi cloning site, jehož sekvence je znázorněna na obr. 2. Po transformaci podílu ligace vE.coli K12 JM 103 a kultivaci na médiu 150 pg ampicilinu/ml se vyberou ty klony, které obsahují plazmid pBF 158-01. Tento se liší od pBF 158 přídavnými singulárními místy řezu Xba I, Nde I, Sac I, Eag I, Κρη I, Spe I jakož i druhým Pst-I místem řezu. (Obr. 3.)

c) konstrukce pBF 158 01 T, vestavba transkripčního terminátoru

ZpBF 158-01 se oddálí fragment Clal x Hind III multi cloning site a nahradí se fragmentem Cla I x Hind ΠΙ z pRT 61 (5), na kterém se nachází tet A/orf L terminátor z Tn 10(6).

Po transformaci do kmene E. coli K12 JM 103 a kultivaci na médiu 150 pg ampicilinu/ml se vyberou ty klony, které obsahují plazmid pBF 158—01 T. Tento se liší od pBF 158-01 fragmentem Cla I x Hind III, který je větší o 297 nukleotidů. (Obr. 4.)

d) vestavba syntetického fragmentu M 4 - M 8 pro scu-PA-gen, konstrukce plazmidu pBF 158— 02 T-pBF 158-06 T

Všechny syntetické fragmenty jsou popsány na obr. 5 a až 5 g. Tyto jsou vloženy do příslušných vektorů jako fragmenty dvojitých provazců o délce asi 200 nukleotidů. Za tím účelem se vektory s restrikčními enzymy, odpovídající právě uvedeným místům řezu, rozříznou a oddělí se od fragmentu, který se má oddálit elektroforézou na agarózovém gelu, elektroelucí a čištěním přes DE 52. Potom následuje ligace s příslušným dvouprovazcovým syntetickým fragmentem pomocí T4 ligázy, transformace v E.coli K.12 103 (obr. 6a až 6c) a selekce na médiu obsahujícím ampicilin.

f) Ligace fragmentu M 8 mezi Bam HI a Cla I v plazmidu pBF 158-01 T.

Vznikne plazmid pBF 158-02 T.

Oligonukleotid 019 kóduje C-terminální sekvenci scu-PA. Za Stop-kodonem TAA se nachází místo řezu Nhel, následované přídavnými transkripčními terminálními sekvencemi trpA terminátoru (8) až Cla I.

ii) Ligace fragmentu M 7 mezi Spe I a Bam HI v plazmidu pBF 158-02 T

Vznikne plazmid pBF 158-03 T.

iii) Ligace fragmentu M 6 mezi Κρη I a Spe I v plazmidu pBF 158-03 T.

Vznikne pBF 158-04 T.

iv) Ligace fragmentu M 5 mezi Eag I a Κρη I v plazmidu pBF 158-04 T.

v) Ligace fragmentu M 4 mezi Sac I a Eag I v plazmidu pBF 158-05 T.

Ze získaných klonů i - v se vyberou ty, které se od předchůdců liší přítomností vestavěného nového fragmentu v přezkoušené správné sekvenci.

-8CZ 287994 B6

e) vestavba syntetických fragmentů M 2 a M 3 pro scu-PA gen; konstrukce pBF 158-08 T

Vzhledem k tomu, že pro vestavbu fragmentů M 2 a M 3 je nezbytný Pst I-řez a na plazmidů pBF 158 až dosud pro tento účel používaném se nachází ještě jedno místo řezu Pstl (v genu rezistentním vůči ampicilinu), které by při následujícím klonování rušilo, postupuje následovně (obr. 7 a až 7c):

i) Z Plazmidů pUC 19, který se obvykle prodává (např. Pharmacia) se multi cloning site a dodatečně 212 nukleotidů ve směru vzhůru po proudu oddálí jako fragment Nde I x Hind III. Do vzniklé mezery se potom liguje syntetický multi cloning site z plazmidů pBF 158-04-3 T jako fragment Ndel x HindlII. Tento plazmid pBF 158-04-3 T se získá z plazmidů pBF 158-02 T (srov. příklad Idi) vestavbou fragmentu M 6 oligonukleotidu a odpovídá plazmidů pBF 158-04 T bez fragmentu M 7. Po transformaci v buňkách E. coli K 12 JM 103 a kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu/ml se vyberou ty klony, které obsahují plazmid pUC 19-04-3. Tyto se liší od pUC 19 přítomností fragmentu Nde I x Hind ΠΙ o délce 712 nukleotidů.

ii) Z pUC 19-04-3 se oddálí fragment Pst I x Sac I, izoluje se linearizovaný vektor a liguje se sfragmentem oligonukleotidu M3. Po transformaci vE.coli K12 JM 103 a kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu/ml se vyberou ty klony, které obsahují plazmid pUC 19-07. Tento se liší od pUC 19-04-3 fragmentem Pst I x Sac o délce 189 nukleotidů, který obsahuje fragment M 3 se správnou sekvencí.

iii) Z plazmidů pUC 19-07, který byl vpředu popsán se oddálí fragment I x Pst a do mezery se liguje fragment M 2. Po transformaci v E. coli K L2 JM 103 a kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu/ml se vyberou ty klony, které obsahují plazmid pUC 19-08. Tyto se liší od pUC 19-07 přítomností Nde I x Pst 1 fragmentu M 2 o délce 246 bp se správně přezkoušenou sekvencí.

iv) Z plazmidů pUC se oddálí fragmenty M 2 a M 3 jako fragment Nde I x Sac I a do větší části pBF 158-06 T získané po řezu s Nde I x Sac I se liguje. Po transformaci v E. coli K12 JM 103 a kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu se vyberou ty klony, které obsahují plazmid pBF 158-08 T. Tento se liší od pBF 158—06 přítomností Nde I x Sac I o délce 435 nukleotidů.

f) Konstrukce plazmidů pBF 160, vestavba syntetického Trp promotoru

Sekvence Trp promotoru popsaná pod (9) se převezme až k místu řezu Xba I a na konci 5' se prodlouží sekvencí 5' - AATTCTGAAAT-3'. Tím se konstruuje místo řezu Eco-RI (obr. 8, fragment Μ 1). Jednotlivé provazce 021 a 021 A se anelují a ligují do plazmidů pBF 158-08 T říznutého Eco RI x Xba I (obr. 9). Po transformaci do E. coli K12 JM 103 a kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu/ml se vyberou ty klony, které obsahují pBF 160. Plazmid pBF 160 se liší od všech shora popsaných předchůdců tím, že tím transformované kmeny bakterií E. coli za přídavku kyseliny indolakrylové exprimují protein předstupně rcsu-PA.

g) Test na expresi

Různé kmeny E. coli transformované plazmidem pBF 160, například E. coli GRT-1, E. coli K12 JM103 jakož i E.coli K12 ATCC 31446, se za stejných podmínek fermentují v médiu, sestávajícím ze 38 mM amoniumsulfátu, 56 mM fosforečnanového pufru pH 7,0, 1 mM magneziumsulfátu, 1% kvasničního extraktu, 1% glukózy, které obsahuje 150 mg ampicilinu na litr, a indukuje se 62 mg kyseliny indolakrylové exprese proteinu předstupně rscu-PA. Pro srovnání se vpředu uvedené kmeny transformují předepsaným plazmidem, který obsahuje gen pro lidskou prourokinázu z banky cDNA, získaný zDetroit562 buněk mRNA (10), a nese označení pUK 54 trp 207-1, a potom se za stejných podmínek fermentuje a podrobí indukci.

-9CZ 287994 B6

Před indukcí a každou hodinu po indukci se po dobu celkem 6 hodin buňky odpovídající suspenzi buněk s optickou hustotou (OD) 1 odstřeďují při 578 nm a pro testování se použije výtěžek exprese.

ii) zpětné zřasení proteinu předstupně na rscu-PA, jeho štěpení na rtcu-PA a měření aktivity

Odstředěné buňky se, jak je zde dále popsáno, rozloží lysozymem a potom se homogenát rozložených buněk použije jak je shora popsáno pro měření aktivity.

Zjištěné výtěžky exprese po měření aktivity rtcu-PA vytvořeného z rscu-PA (získaného z proteinu předstupně) jsou znázorněny na obr. 10. Z toho vyplývá, že kmeny E. coli, které byly transformovány plazmidem pBF 160 poskytují 10 až 15krát vyšší výtěžek exprese než stejné kmeny E. coli transformované plazmidem pUK 54 trp 207-1 (10) známým z literatury. Kromě toho vyplývá z toho, že výtěžek exprese ve všech kmenech se v závislosti na plazmidu použitém pro transformaci pohybuje na přibližně stejných hodnotách, tj., že zejména kmeny transformované plazmidem pBF 160 (nezávisle na jednotlivém kmeni E. coli) poskytují vždy několikanásobně vyšší výtěžek exprese než identické kmeny transformované známým plazmidem pUK 54 trp 207-1.

Příklad 2

a) Konstrukce expresního plazmidu pBF-161 pro protein předstupně rscu-PA se syntetickým scu-PA genem za kontroly promotoru Trp

Plazmid 322 se řeže EcoRI a HindlII. Vznikající fragment o délce 31 nukleotidů se oddělí preparativní elektroforézou na agarózovém gelu. Zbývající podíl pBR 322 se eluuje z gelu elektroelucí a čistí chromatografií před DE 52.

Plazmid pBF 160 (příklad lf) se rovněž řeže Eco Rl a Hind III a fragment Eco Rl x Hind III o délce 1684 nukleotidů, který obsahuje syntetický scu-PA gen se všemi jednotkami regulace (promotor Trp) se oddělí elektroforézou na agarózovém gelu a eluuje a čistí jak je shora popsáno.

Takto získané fragmenty se ligují obvyklým způsobem ligázou T4 a potom se v E. coli K12 JM 103 transformují. Po kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu/ml se vyberou ty klony, které obsahují fragment EcoRI x HindlII o délce 1684 nukleotidů a po přídavku kyseliny indolakrylové produkují protein předstupně rscu-PA. Tyto klony obsahují plazmid pBF 161.

b) Test na expresi

E. coli GRT-I, E. coli K12 JM 103 a E. coli K 1 atcc 31 446 se transformují pBF 161 a potom se fermentují způsobem popsaným v příkladě lg) a výsledek exprese se testuje. Výtěžky proteinu předstupně rscu-PA se určují jako rtcu-PA aktivita, po 1 až 6 hodinách po indukci jsou srovnatelné s hodnotami výtěžku znázorněnými na obr. 10 pro použití plazmidu pBF 160 pro transformaci.

Buněčná peleta získaná odstřeďováním analogicky jako v příkladě lgi) se může rozložit i vařením v 0,25 M Tris HCI pufru, pH 8,0 se 4 % SDS, 1 % merkaptoethanolu a 20 % glycerinu. Takto rozpuštěné proteiny se oddělí SDS-PAGE a zviditelní se obarvením Coomassieblue. Obarvené gely se vyhodnotí denzitometricky a plochy pod píky se integrují. Podíl proteinu předstupně rscu-PA vytvořený po indukci s kyselinou indolakrylovou se zjišťuje odečtením plochy pásu identifikovaného jako protein předstupně před indukcí od pásu zjištěného po indukci. Na obr. 11 je znázorněn denzitogram proteinů získaných z buněk E. coli K 12 JM 103. V předloženém příkladu činí podíl proteinu předstupně rscu-PA po indukci 17,9 % hmotn. veškerého bakteriálního proteinu. Další příklady jsou uvedeny v tabulce.

-10CZ 287994 B6

Tabulka 1

Podíl proteinu předstupně rscu-PA v celkovém proteinu v procentech

kmen E. coli	transformováno
	pBF 161	pUK54 trp 207-1 (10)
K 12 ATCC 31446	14	1,5
K12JM 103	17,9	1,9
GRT-1	17,8	1,7

Příklad 3

Konstrukce expresního plazmidu pro protein předstupně rscu-PA se syntetickým scu-PA genem za kontroly promotoru trp v pBR 322 s delecí v genu rezistentním vůči tetracyklinu

a) Konstrukce plazmidu pBR 322 del

Plazmid pBR 322 se řeže Eco RV a Nru I. Vznikající fragment velikosti 787 nukleotidů se oddálí elektroforézou na agarózovém gelu, zbytkový podíl pBR 322 se eluuje z gelu elektroelucí a čistí se přes DE 52. Konce blunt pBR 322 Eco RV x Nru I zbytkového podílu se ligují obvyklým způsobem T4 ligázou. Po transformaci v E. coli K12 JM 103 a po kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu/ml se vyberou ty klony, z nichž alikvotní část po přenesení na médium s 25 pg tetracyklinu/ml na tomto neroste, tj. nemá rezistenci vůči tetracyklinu. Klony obsahují plazmid pBR 322 del, který se liší od pBR 322 tím, že je o 787 nukleotidů menší a nelze ho již řezat Eco RV a Nru I.

b) Konstrukce plazmidu pBF 162 pBR322 del se řeže EcoRI a Hind III. Vznikající fragment o délce 31 nukleotidů se oddělí preparativní elektroforézou na agarózovém gelu, zbylý podíl pBR322 del se eluuje z gelu elektroelucí a čistí se přes DE 52.

Z pBR se získá stejným způsobem Eco Rl x Hind III fragment s délkou 1684 nukleotidů, který obsahuje syntetický scu-PA gen se všemi regulačními jednotkami (promotyp trp).

Oba fragmenty se ligují obvyklým způsobem T4-ligázou a potom se transformují v buňkách E. coli K12 JM 103. Po kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu/ml se vyberou klony, které obsahují fragment EcoRI x HindIII o délce 1684 bp a po přídavku 62 pg idolakrylové kyseliny/ml produkují protein předstupně rscu-PA. Tyto klony obsahují plazmid pBF 162.

c) Test exprese

E. coli GRT-lse transformuje pBF 162, a potom se fermentuje způsobem popsaným vpříkladulg) a výsledek exprese se stanoví testem. Výtěžek proteinu předstupně rscu-PA stanovený 6 hodin po indukci činí 1 300 PU/ml buněčné suspenze s optickou hustotou 1 a je srovnatelný s hodnotami výtěžku znázorněnými na obr. 10 pro expresi po transformaci E. coli GRT-1 s plazmidem pBF 160.

Příklad 4

a) Konstrukce expresního plazmidu pBF 171 pro protein předstupně rscu-PA se syntetickým scu-PA genem za kontroly promotoru Tac

-11CZ 287994 B6

Plazmid pBF 162 se řeže Eco RI a Xba I. Vznikající fragment dlouhý 74 nukleotidů se oddělí preparativní elektroforézou na agarózovém gelu, zbytkový podíl plazmidu se eluuje elektroelucí a potom se čistí přes DE 52.

Z plazmidu ptač SDT (DSM 5018) se izoluje fragment Eco RI x Xba I, který obsahuje promotor Tac. K tomu se ptač SDT rozřízne Eco RI x Xba I a fragment se oddělí preparativní PAGE. Fragment se eluuje zahřátím na 65 °C v amoniumacetátovém/SDS pufru, pH 8,0, z mechanicky rozmělněného polyakrylamidu a čistí se vícenásobnou extrakcí fenolem, který je nasycen 1 M Trispufrem, pH 8.

Oba takto získané fragmenty se ligují obvyklým způsobem T4 ligázou a potom se transformují v E. coli K 12 JM 103. Po kultivaci na médiu 150 pg ampicilinu/ml se vyberou klony, které po přídavku IPTG produkují rscu-PA protein předstupně. Tyto klony obsahují plazmid pBF 171.

b) Test exprese

E. coli K 12 JM 103 se transformuje pBF 171, a potom se fermentuje způsobem popsaným v příkladu lg) a výsledek exprese se testuje. Indukce se provádí ale s IPTG (konečná koncentrace 0,5 mM).

Výtěžky rscu-PA proteinu předstupně, stanovené jako aktivita rtcu-PA 6 hodin po indukci jsou znázorněny na obr. 12. Tyto jsou srovnatelné s hodnotami výtěžků znázorněnými na obr. 10 pro použití plazmidu pBF 160 ve stejném kmenu E. coli.

Příklad 5

a) Konstrukce expresního plazmidu pBF 172 pro protein předstupně rscu-PA se syntetickým scu-PA se syntetickým scu-PA genem za kontroly promotoru Tac v pBR 322 s delecí v genu rezistentním vůči tetracyklinu

Plazmid pBR 322 del (viz příklad 3a) se řeže Eco RI x Hind III. Vznikající fragment s délkou 31 nukleotidů se oddělí preparativní elektroforézou na agarózovém gelu, zbytkový podíl pBR 322 del se eluuje z gelu elektroelucí a potom se čistí přes DE 52.

Z pBF 171 (příklad 4a) se stejným způsobem získá syntetický scu-PA gen se všemi regulačními jednotkami (promotor Tac).

Oba takto získané fragmenty se ligují obvyklým způsobem ligázou T4 a potom se transformují v buňkách E. coli K 12 JM 203. Po kultivaci na médiu se 150 pg ampicilinu/ml se vyberou klony, které produkují v přítomností 0,5 mM IPTG rscu-PA protein předstupně. Tyto klony obsahují plazmid pBF 172.

b) test exprese

E. coli K12 JM 103 se transformuje pBF 172, a potom se fermentuje způsobem popsaným v příkladu lg) a testuje se výsledek exprese. Indukce se provádí ale i IPGT (konečná koncentrace 0,5 mM). Výtěžky rscu-PA proteinu předstupně stanovené jako aktivita rtcu-PA 1 až 6 hodin po indukci činí asi IlOOPU/ml buněčné suspenze s optickou hustotou 1 a jsou srovnatelné s hodnotami výtěžků znázorněnými na obr. 10 pro použití plazmidu pBF 160 ve stejném kmenu E. coli.

-12CZ 287994 B6

Příklad 6

Změna vzdálenosti mezi Shine Dalgamovou sekvencí a startovacím kodonem v expresním plazmidu pro rscu-PA protein předstupně

Startovací kodon ATG ve všech konstrukcích, popsaných v příkladech 1 až 5 je součástí Nde Imísta řezu -CATATG-. Ndel řeže za prvním A hexanukleotidovou sekvenci a poskytuje 5'konce, které přečnívají o dvě báze. Jestliže se konec 3' doplní, tj. konstruují se tak blunt- konce, a pak se znovu liguje, prodlouží se dotyčná sekvence o 2 páiy bází. Současně se eliminuje Nde I místo. Jak je zřejmé z obr. 13, prodlouží se v tam znázorněných příkladech vzdálenost od S.D. sekvence až ke startovacímu kodonu o 8 až 10 párů bází. Dále je vysvětleno experimentální provedení na jednom příkladě:

a) Konstrukce plazmidu pBF 163

Plazmid pBF 161 se řeže Nde 1, a potom se přečnívající konce vyplní Klenowovým fragmentem polymerázy DNA I (2). Potom se DNA liguje jako obvykle ligázou T4 a potom se transformuje vE. coli K 12 JM 103. Po kultivaci na médiu obsahujícím ampicilin se vyberou klony, které obsahují plazmid pBF 163. Tento se liší od pBF 161 tím, že schází místo Ndel, a přídavnými bázemi v oblasti vodícího místa Nde I (srov. obr. 13).

b) test exprese

E. coli GRT 1 se transformuje plazmidem pBF 163, a potom se fermentuje způsobem popsaným v příkladu lg) a výsledek exprese se testuje. Výtěžky rscu-PA proteinu předstupně, stanovené po zpětném zřasení a aktivaci jako aktivita rtcu-PA po ml buněčné suspenze s optickou hustotou 1 až 6 hodin po indukci 62 mg kyseliny indolakrylové, jsou uvedeny na obr. 14. Tyto jsou srovnatelné s hodnotami výtěžku znázorněnými na obr. 10 pro použití plazmidu pBF 160 ve stejném kmeni E. coli.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Plazmidy pro expresi předstupně rscu-PA proteinu s výtěžkem exprese alespoň 10 % hmotnostních celkového vytvořeného proteinu v Enterobakteriaceae, ve kterých operon obsahuje regulovatelný promotor, Shine-Dalgamovou sekvenci účinnou jako vazebné místo ribozomů, startovací kodon, syntetický strukturní gen pro urin-plazminogenový aktivátor „scuPA“ s jedním řetězcem obsahujícím 411 zbytků aminokyselin a ve směru po proudu dolů od strukturního genu jeden až dva terminátory.
2. 2. Plazmidy podle nároku 1, ve kterých je jako regulovatelný promotor vestavěn promotor Trp nebo Tac pomocí „multi cloning site“.
3. 3. Plazmidy podle nároků 1 a 2, ve kterých je jako regulovatelný promotor vestavěn syntetický promotor Trp s nukleotidovou sekvencí podle obr. 8.
4. 4. Plazmidy podle nároků 1 a 2, ve kterých je jako regulovatelný promotor vestavěn promotor Tac z plazmidu ptač SDT DSM 5018.
5. 5. Plazmidy podle nároku 1, ve kterých jako po sobě následující transkripční terminátor je vestavěn terminátor trp A a/nebo tet A/orf L z TN 10 do operonu nových plazmidů.

   -13CZ 287994 B6
6. 6. Plazmidy podle nároku 1, ve kterých je pomocí multi cloning site vestavěn v dílčích krocích strukturní gen se sekvencí nukleotidů podle obr. 15.
7. 7. Způsob výroby plazmidů podle nároku 1, vyznačující se tím, že se do plazmidu pBR 322, ze kterého byl odstraněn nic/bom-region a/nebo alespoň část genu rezistentního vůči tetracyklinu, mezi místa řezu Eco Rl a Hind ΙΠ vloží „multi cloning sítě“ se sekvencí nukleotidů uvedenou na obr. 2, která má mezi místy řezu Xba I a Nde I Shine-Dalgamovou sekvenci a ve vzdálenosti 6 až 12, s výhodou 8 až 10 nukleotidů, obsahuje startovací kodon ATG a s jejich pomocí se vestaví jeden nebo dva transkripční terminátory, syntetické dílčí sekvence scu-PA strukturního genu, s výhodou počínaje od konce 3' strukturního genu, jakož i regulovatelný promotor.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se EcoRl x HindΠΙ fragment z plazmidu podle nároků 1 až 6 vestaví jako expresní kazeta do jiného plazmidu, schopného autonomního rozmnožování v Enterobakteriaceae, s výhodou v E. coli.
9. 9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se v plazmidu podle nároků 1 až 6 prodlouží vzdálenost mezi Shine-Dalgamovou sekvencí a startovacím kodonem řezem s Nde I, vyplněním vzniklých míst řezu a následující ligací vzniklých blunt-konců.
10. 10. Použití plazmidu podle nároku 1 až 6 pro získávání aktivátoru plazminogenu.
11. 11. Použití podle nároku 10, při kterém se plazmidem transformuje kmen E. coli, s výhodou kmen E. coli K12.