SK279873B6 - Spôsob výroby streptokinázy, streptokináza, farmac - Google Patents

Description

Vynález sa týka spôsobu výroby streptokinázy expresiou génu, takto získanej streptokinázy a farmaceutického prostriedku na jej báze. Ďalej sa vynález týka nukleovej kyseliny, expresívneho vektora a hostiteľskej bunky na expresiu génu kódujúceho streptokinázu.

Doterajší stav techniky

Streptokinázy sú aktivátormi plazmitiogénu z prokaryotických buniek. Zvyčajne sú vylučované z kultivačného média veľkým počtom druhov rodu Streptococcus. Tieto druhy majú odlišné sérotypy. Pretože ide o bielkoviny bakteriálneho pôvodu, našli sa k nim antigcnnc odpovede (Dykewicz, M. S., McGrath, K. G., Harris, K. E. a Patterson, R., 1985; Int. Árch. Allergy Appl. Immun. 78: 386 - 390; McGrath, K. G., Zeflren, B., Alexander, J.,Kaplan, K. a Patterson, R. J., 1985, Allergy Clin, Immunol. 76: 453 - 457). Ich molekulová hmotnosť je približne 47 000 daltonov.

Spôsob patogénneho pôsobenia rodu Streptococcus nie je presne známy, aj keď potenciálne musí prispievať k vylúčeniu alebo zabráneniu tvorby fibrinových bariér okolo infekcie.

Pri interakcii streptokinázy s plazminogénom, ktorý je v ľudskej plazme, sa zistilo, že táto bielkovina je schopná konvertovať plazminogén na plazmín. Plazmín má proteolytickú aktivitu a môže rozkladať zrazeniny fibrínu na rozpustné produkty.

Streptokináza, urokináza a aktivátor plazminogénu tkanivového typu sa v súčasnosti používajú ako trombolytické činidlá pri liečení chorôb, ktoré spoločne predstavujú jednu z najväčších príčin úmrtí na svete. Ide o infarkt myokardu, pľúcnu, tepnovú alebo žilnú trombózu, komplikácie pri chirurgických zákrokoch a iné prípady trombóz.

Aj keď všetky streptokinázy sú blízko príbuzné vzhľadom na svoju funkciu, existujú medzi nimi lekársko-chemické a imunologické rozdiely a rozdiely v substrátovej špecitite, ktoré svedčia o molekulovej heterogenite streptokináz odlišného pôvodu.

Pri produkcii streptokinázy sa dosahujú nízke výťažky, jej prírodný producent je patogénny a kmene rodu Streptococcus, používané na priemyselnú produkciu streptokinázy, vylučujú do kultivačného média iné produkty, ako sú deoxyribonukleázy, streptolyzín alebo hyaluromidáza a proteázy. Kombinácia týchto faktov spôsobuje, že proces čistenia žiadaného proteínu je ťažký. Na druhej strane však doteraz nebolo možné získať geneticky vylepšené kmene týchto producentov vzhľadom na nedostatočne rozvinutú metodológiu génového prenosu.

Uvedené nevýhody spôsobili, že sa skúšalo klonovanie rôznych izolovaných génov, ktoré kódujú uvedené bielkoviny, s použitím prokaryotických a eukaryotických hostiteľov.

Patent NDR číslo 249493, Int. Cl.: C 12 N 15/00 opisu je klonovanie a expresiu génu, ktorý kóduje streptokinázu, z kmeňa H46A Streptococcus equisimilis, patriacemu k rodu Streptococcus typ C, s použitím baktérie E. coli ako hostiteľského organizmu. Koncentrácie proteínu, ktorý' je vylučovaný do média, sú od 0,1 do 1,8 mg/1 v závislosti od veku kultúry.

Kódujúca sekvencia tohto génu, nazvaná SKC, bola neskôr stanovená vrátane svojho signálneho peptidu. Došlo aj k určeniu primárnej štruktúry susedných oblastí, ktoré sa podieľajú na riadení transkripcie a translácie nazvaného génu (Malke, H., Roe, B. a Ferretti, J. J., 1985, Gene 34: 357 362).

Stanovili sa iné nukleotidové sekvencie génov, ktoré kódujú streptokinázu z rodu Streptococcus typu G a A (Water, F., Siegel, M. aMalke, H.,Nucl. Acids Res. 17/13/: 1262). Najmä gén, ktorý kóduje streptokinázu typ A (gén SKA) z kmeňa 49 typ M Strentococcus piogenes bol klonovaný a exprimovaný v kmeni JM109 E. coli a v Streptococcus sanguis Challis 57E (Huang, T. T.,Malke, H. aFerreti, J. J., 1989, Molec. Microb. 3/2/: 197-205).

Koncentrácia produkovaného proteínu v prípade E. coli bola 0,64 mg/1 a v prípade S. sanquis 40 pg/l. V prípade E. coli bolo 94 % získaného množstva proteínu v periplazmatíckom priestore a 6 % v cytosóle, zatiaľ čo v prípade S. sanquis bol enzým produkovaný len extraceluláme. Okrem toho mnoho klonov, ktoré produkujú streptokinázu v E. coli, bolo veľmi nestabilných, pretože v niektorých prípadoch bol SKA-gén vyštiepený alebo hostiteľské bunky odumreli, čo spôsobila letálna aktivita produktu dotyčného génu.

V prípade S. sanquis bola veľkosť získanej proteínovej molekuly približne o 3000 daltonov menšia ako veľkosť prirodzenej streptokinázy. Zistila sa neprítomnosť 32 aminokyselín z C-konca, ale biologická aktivita nebola ovplyvnená (Bumett, N. N., 1981, Anál. Biochemistry 112: : 195 - 203).

Čo sa týka ťažkosti klonovania a expresie izolovaného SKC-génu v E. coli, zistilo sa ďalej, že génový produkt interferuje s normálnym fyziologickým stavom hostiteľskej bunky, čo je vidieť z mukozity buniek, ktoré obsahujú tento gén. Ďalej je to zrejmé z neúplného exportu streptokinázy do periplazmatického priestoru, zo štruktúrnej nestability plazmidov, ktoré obsahujú SKC-gén a ktoré sú skonštruované na expresiu vysokých koncentrácií uvedeného proteínu. Aj pri klonovaní génov pre streptokinázu z ďalších sérotypov rodu Streptococcus v plazmidoch E. coli sa stretávame s prekážkami a pokusy exprimovať heterológne gény riadené signálmi expresie-exkrécie zo samotného SKC-génu boli neúspešné (Muller, J., Reinert, H. a Malke, H., 1989, Journal of Bacteriology, apríl.:2202 - 2208).

Neskoršie spoločnosti Phillips Petroleum (patent DD257646, Int. Cl.: C 12 N 15/00 aHaggenson, M. J. a ďalší, 1989) uskutočnila expresiu streptokinázy v metylotrofnej kvasinke Pichla pastoris. Táto expresia bola riadená génovými regulačnými sekvenciami alkoholoxidázy. Pri použití kontinuálnej ťermentácie boli výťažky požadovaného produktu rádovo v rozmedzí 77 až 250 ml/1 kultivačného média so strednou bunkovou hustotou 46 g/1. Tento systém využíva SKC-gén, nachádzajúci sa v plazmide pMF5 v expresných vektoroch. Majiteľom patentu na plazmid pMF5 je uvedená spoločnosť, pričom licenciu jej poskytol Dr. J. J. Ferreti z Oklahoma University, USA.

Podstata vynálezu

Vynález je zameraný na získanie vysokého výťažku streptokinázy v rôznych hostiteľských systémoch s použitím expresných vektorov, ktoré obsahujú novú nukleotidovú sekvenciu. Táto sekvencia predstavuje doteraz neopísa2

SK 279873 Β6 ný genetický variant, ktorý kóduje bioaktívnu streptokinázu. Táto streptokináza obsahuje aktívnu časť, zodpovedajúcu streptokináze zo Streptococcus equisimilis typ C, kmeň ATCC-9542. Nový izolovaný gén sa nazýva SKC-2 a kóduje bielkovinu s rovnakou molekulovou hmotnosťou ako gén SKC. Základnou vlastnosťou tohto génu je jeho stabilita vo vektoroch z E. coli a kvasiniek. V žiadnom z pozorovaných prípadov neboli zistené nepriaznivé účinky na bunkový rast a životaschopnosť. Tieto vlastnosti umožňujú získať väčšie výťažky pri obidvoch doteraz opísaných hostiteľov, ako bolo až doteraz možné. To ukazuje, že získaný produkt je iná streptokináza, ako sú doteraz známe streptokinázy, ktorá má žiadanú biologickú aktivitu.

Predmetom vynálezu je spôsob výroby streptokinázy expresiou génu kódujúceho túto streptokinázu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa hostiteľská bunka transformuje expresným vektorom obsahujúcim gén streptokinázy, SKC-2, ktorý v podstate pozostáva z nukleotidovej sekvencie

ATT GCT GGA CCT GAG TO3 CTG CTA GAC CGT CCA TCT GTC AAC AAC AGG *8 CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT GTT GW5 GGG AOG AAT CAA GAC 96 ATT AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATT GAC CTK ACA TCA CGA CCT GCT CAT 1*4 GGA CCA AAC ACA GAG CAA GGC TTA AGT OCA AAA TCA AAA CCA TTT GCT 192 ACT GAT AGT GGC GCG ATG CCA CAT AAA CTT GAA AAA GCT GAC TTA CTA 2*0 AAG GCT ATT CAA GAA CAA TTC ATC GCT AAC GTC CAC AGT AAC GAC GAC 268 TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ACT GAT GGA 336 AAC GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT GGT ICG OTA ACC TT3 CCS 36* ACC CAA CCT GTC CAA GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA *32 CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA KAT CAA GCG AAA TCT GTT GAT GTO *80 GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CC C TTA AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA 526 CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAG CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC 57 6 ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ΆΓΓ TTA AAC <2* AAA ACC CAC CCA GGC TAT ACG ATT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC 67 2 ACT CAT GAC AAT GAC ΛΓΓ TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG 720 TTT ACT TAC CAT GTC AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT GAS ATC AAT AAA 768 AAA TCT GGT CTG AKT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GKC CTG ATC TCT GAG 816 AAA TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC ΤΓΓ GAT 66* CGC ACT CAC TTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC AAC ACC 912 AAC GAA TTG CTA AAA AGC GAG CAG CTC TTA ACA GCT AGC GAA CGT AAC 960 TIK GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GCT AAA CTA CTC 1006 TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA 1056 AAA OTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACC AAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT 1L0* ATG GGC AAG CGA. CCC GAA GGA GAG AAT GCT AGC TAT CAT TTA GCC TAT 11S2 GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAA CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG 12 00 CGT TAT ACA GGG ACA CCT ATA CCT GAT AAC CCT AAC GAC AAA TAA 12*5 _} ktorá je operatívne viazaná na účinný promótor a terminátor transkripcie, vzniknutá transformovaná hostiteľská bunka sa kultivuje a izoluje sa vyrobená streptokináza.

Vo výhodnom uskutočnení tohto spôsobuje gén SKC-2 izolovaný zo Streptococcus eguimilis typu C kmeňa ATCC 9542. Gén SKC-2 sa môže používať bez jeho oblasti kódujúcej signálny peptid alebo s touto oblasťou.

Hostiteľskou bunkou je výhodne baktéria lebo kvasinka.

Ak je hostiteľskou bunkou baktéria, ide výhodne o baktériu Escherichia coli, napríklad Escherichia coli kmeň W3110.

Ako expresný vektor sa v tomto prípade výhodne používa plazmid obsahujúci gén SKC-2 operatívne pripojený k tryptofánovému promótoru z Escherichia coli a terminátora transkripcie T4, napríklad plazmid pEKG3 nachádzajúci sa v Escherichia coli kmeň CBS 243.90.

Ak je hostiteľskou bunkou kvasinka, ide výhodne o kvasinku Pichia pastoris, napríklad Pichia pastoris his kmeňa MP-36, CBS 244.90.

Ako expresný vektor sa v tomto prípade výhodne používa plazmid obsahujúci gén SKC-2 operatívne pripojený k alkoholoxidázovému promotóru, AOX1, z Pichia pastoris a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázovej terminačnej sekvencii GAPt zo Saccharomyces cerevisiae. Tento expresný vektor môže obsahovať ako selekčný marker gén his nachádzajúci sa v Pichia pastoris kmeňa CBS 244.90. Expresným vektorom je napríklad plazmid pPESKC-4 nachádzajúci sa v Pichia pastoris kmeňa CBS 244.90. Tento expresný vektor môže obsahovať gén SKC-2 bez oblasti kódujúcej signálny peptid.

Predmetom vynálezu je ďalej izolovaná a purifikovaná neukleotidová kyselina v podstate sa skladajúca z uvedenej nukleotidovej sekvencie.

Predmetom vynálezu sú aj uvedené expresné vektory a hostiteľská bunka na produkciu streptokinázy expresiou génu kódujúceho túto streptokinázu, ktorá je transformovaná niektorým z uvedených vektorov.

Napokon je predmetom vynálezu i izolovaná a purifíkovaná streptokináza v podstate sa skladajúca z aminokyselinovej sekvencie kódovanej znázornenou nukleotidovou sekvenciou a farmaceutický prostriedok obsahujúci túto streptokinázu a farmaceutický vhodné riedidlo, nosič alebo excipient.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je znázornený plazmid pEKG-3 nesúci sekvenciu génu SKC-2 operatívne pripojenú k tryptofánovému promótoru z E. coli. Pri 3'-konci tohto génu je pripojený signál na termináciu transkripcie bakteriofágu T4 na účely dosiahnutia vyššej stability expresie.

Na obr. 2 je uskutočnené porovnanie medzi aminokyselinovými sekvenciami pochádzajúcimi zo základných sekvencii génov SKC-2, SKC, SKG a SKA.

Na obr. 3 sú znázornené plazmidy pPESKC-4 a pPISKC-6 na extracelulámu a intracelulámu expresiu v P. pastoris.

Gén SKC-2 bol získaný z genómu Streptococcus equisimilis typ C kmeň (ATCC-9542) génovou amplifikáciou s použitím reťazovej polymerizačnej reakcie (PCR) z troch syntetických oligonukleotidov nazvaných SK1, SK2 a SK3 so sekvenciami:

SXl 5' ---TGGAATTCATGAAAAATTACTTATCT. . .3 ¹

SK2 5' ---TGGATCCTTATTTGTCGTTAGGGTTATC...3'

SK3 5 ' ...GGAATTCATGATTGCTGGACCTGAGTGGCTG... 3¹

Tieto primery ďalej obsahujú reštrikčné miesta, ktoré sa nenachádzajú v géne a ktoré umožňujú priame klonovanie v expresívnom vektore. Na druhej strane oligonukleotid SK2, ktorý hybridizuje na 5'-konci, obsahuje kodón ATG, ktorý sa chová ako miesto na iniciáciu translácie a odstraňuje signálny peptid génu SKC-2. Uvedené tri oligonukleotidy sa syntetizovali podľa SKC sekvencii publikovaných v Malke, II., Roe, B. a Ferretti, J. J., 1985, Gene 34: 357 - 362. Pomocou týchto oligonukleotidov sa označili presne hranice fragmentov génu, ktorý kóduje zrelý proteín alebo hranice kompletného génu vrátane časti kódujúcej signálny peptid.

Na obr. 1 a 3 je znázornená rekombinantná DNA, ktorá obsahuje gén SKC-2, v podobe vektorov na expresiu tohto génu, v baktériách pEKG3 (obr. 1) a v kvasinkách pPESKC-4 a pPISKC-6 (obr. 3). Konkrétne na expresiu v E. coli sa gén SKC-2 so svojím signálnympeptidom alebo bez neho klonuje za riadenia promótorom pre tryptofán a so signálom pre termináciu transkripcie fágu T4. Pre kvasinky sa použil expresný vektor, ktorý je opísaný v kubánskej prihláške vynálezu 7/90, kde gén SKC-2 je umiestnený za signálnym peptidom invertázy sacharózy (SUC 2) a je riadený promótorom génu pre alkoholoxidázu (ΑΩΧ 1) z kvasinky Pichia pastoris. Tento expresný vektor ďalej obsahuje terminačný signál génu pre glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (GAPt) z kvasinky Saccharomyces cerevisiae pre extracelulámy variant expresie. Vektor bol označený pPESKC-4. Pre intracelulámu expresiu CKC-2 sa používa vektor pPISKC-6, ktorý’ neobsahuje signálny peptid SUC-2 za promótorom AOX1. To sa dosiahne inzerciou génu SKC-2 do expresívneho vektora pNAO (vektor pNAO láskavo poskytla firma Muzio, CIGB, Havana, Kuba) (obr. 3). Ako selekčný marker sa v obidvoch vektoroch použije gén HIS3 zo S. cerevisiae, opísaná expresívna kazeta sa lemuje 5'- a 3'-sekvenciami génu AOX z Pichia pastoris pre integráciu.

Mikroorganizmy, ktoré vznikli transformáciou baktérie E. coli kmeň W3110 vektorom pEKG3 a mutantu MP-36 kvasinky Pichia pastoris, ktorý je uvedený v kubánskej prihláške vynálezu 7/90 expresnými vektormi pPESKC-4 a pPISKC-6, majú vysoké úrovne expresie streptokinázy, dobrú životaschopnosť (produkt nemá negatívne efekty na bunkový rast) a majú vysokú stabilitu transformačných kmeňov.

Transformovaný kloň E. coli sa nazýva HSK-M a má úrovne expresie produktu génu SKC-2 väčšie ako 350 mg/1 kultivačného média.

Transformovaný kmeň Pichia pastoris MSK-M4 produkuje streptokinázu intraceluláme a kmeň MSK-M6 extraceluláme. Jej množstvo je medzi 1,0 až 1,2 g/1 kultivačného média.

Spôsobom opísaným v tomto vynáleze sa dosiahnu úrovne expresie, ktoré nikdy neboli pre tento produkt ohlásené. To umožňuje dosiahnuť optimálnu čistotu produktu na jeho podávanie ľuďom a zvieratám bez potreby vyvinúť komplexný a nákladný proces čistenia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady sú uvedené na ilustráciu a nie na to, aby vynález obmedzovali. V týchto príkladoch sa používajú ako hostiteľské systémy E. coli a Pichia pastoris, ale pre spôsob, opísaný v tomto vynáleze, sa dajú použiť aj iné eukaryotické a prokaryotické bunky.

Príklad 1

Na izoláciu genómovej DNA zo Streptococcus quisimilis typ C sa použije ako jej zdroj na klonovanie gén SI z kmeňa ATCC-9542. Bunky sa pestujú v mozgovo-srdcovom infuznom médiu Brain-Heart Infusion Médium (CIBCO) pri intenzite pretrepávania 240 ot/min. 12 hodín pri teplote 37 °C s tým, že ako inokulum sa použije 5 ml inokulačnej kultúry pestovanej 12 hodín v Erlemeyerovej banke s objemom 300 ml. Bunky sa zhromaždia odstredením pri 3000 ot/min. a resuspendujú sa v 8 ml lyzovacieho roztoku (4,5 ml glukózy; 1,86 g EDTA; 1,51 Tris-HCl, v 500 ml sterilnej vody, pH 8), pridá sa 80 μΐ lyzozýmu s koncentráciou 10 mg/ml a suspenzia sa inkubuje 30 minút pri 37 °C. Aby sa dosiahlo účinné prasknutie bunky, pridá sa 500 pm pronázy (Boehringer), 1 ml SDS s koncentráciou 10 % a 2 % μΐ EDTA s koncentráciou 0,5 M, pH 8. Suspenzia sa 2 hodiny inkubuje pri teplote 50 °C za mierneho miešania. Ďalej sa suspenzia čistí fenolom, zmesou fenolu a chloroformu a chloroformom agenómová DNA sa vyzráža absolútnym etanolom a octanom amónnym s koncentráciou 7, 5 M.

Získaný výťažok je 100 pg na 300ml Erlenmeyerovu kultivačnú banku. Prítomnosť génu, ktorý kóduje streptokinázu, sa potvrdí technikou southem blot (Maniatis, T., Frisch, E. F. aSambrook, J., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, USA).

Príklad 2

Na klonovanie v baktériách sa vezme 1 pg genómovej DNA zo Streptococcus equimilis typ C kmeň (ATCC-9542) a kódujúci SKC-2 sa zosilní reakciou PCR (Randall, K., Gelfond., D. H.,Stolľel, S.,Scharf, 5., Higuchi R., Hom, G. R., Mullis, K. B. aErlich, H. A., 1988,Science 239: 487 -491. Pritom sa použijú oligonukleotidy SK1 a SK2 na klonovanie s jeho signálnym peptidom a SK2-SK3 na klonovanie bez neho.

Pri reakcii sa použije vždy 100 pmol každého oligonukleotidu, 2 jednotky Tag-polymerázy (Perkin, Elmer, USA) a 200 pmol každého DNPT. Reakcia sa uskutočňuje v prostredí 10 mM MgC12, 100 mM dTT, 10 mM NaCl a 100 pg/ml želatíny.

Uskutoční sa tridsať amplifikačných cyklov, pričom v každom cykle sa reakcia 1 minútu inkubuje pri 95 °C, aby došlo k denaturácii, 45 sekúnd pri 52 °C, aby došlo k hybridizácii oligonukleotidov a 80 sekúnd pri 70 °C na účely predĺženia. Dosiahne sa účinnosť amplifíkácie väčšia ako 5%.

Na klonovanie v baktériách (E. coli sa použije genetický konštrukt, ktorý sa líši od doteraz opísaných konštruktov na expresiu tohto produktu. V tomto konštrukte sa použije tryptofánový promótor s E. coli a terminačný signál z bakteriofágu T4. Fragmenty, zosilnené pri reakcii PCR, sa štiepia BamHI a spoja ligáciou s vektorom ptrip-NcoI-Sl-BamHI (Estrada, M. P., Hemández, O. a de la Fuente, J. Interferon y Biotecnología 5: 152 - 156). Tento konštrukt sa transformuje do preparátu komplementárnych buniek, pripravených podľa Dagert, M. aEhriich, S. D., 1974,Gene 6: 23 - 28 aHanahan, D., 1983, J. Mol.Biol. 166: 557 - 580 z E. coli kmeň HB 101 [(rg-mB-), supE²^, ara-14, galK-2, lacYl, proA2, rpsL20, (StrR, xyl-5, mtl-5, mtl-1, racA13], ktoré majú frekvenciu transformácie väčšiu ako 10? transformantov na g DNA.

Získané kolónie sa nanesú na misky s LB médiom (10 g/1 tryptónu, 5 g/1 kvasnicového extraktu, 10 g/1 chloridu sodného) a s 50 pg/ml ampicilínu a hybridizujú sa podľa Maniatis, T., Frisch, E. F. aSambrook, J., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, USA. Ako hybridizačná vzorka sa použije fragment získaný amplifikáciou pri reakcii PCR, ktorý je označený dATP^Ž (Amersham UK) a Klenowov fragment DNA-polymerázy I z E. coli (Maniatis, T., Frisch, E. F. a Sambrook, J., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, USA). Hybridizácia sa uskutočňuje na filtroch Whatman 541 30 minút pri 37 °C a reakcia sa ukončí prídavkom EDTA a zohriatím. 4 % kolónií sú pozitívne klony. Tie sa skúmajú reštrikčnou analýzou a preukazujú rovnaký spôsob štiepenia s viac ako 10 reštrikčnými enzýmami. Napriek tomu sa pozitívne klony kontrolujú sekvencovaním dvojvláknovej DNA (Sanger, F.,Nickler, S. aCoulson, A. K., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 - 5467) s použitím oligonukleotidu so 17 bázami (5'...ATCATCGAACTAGTTAA..3'),

SK 279873 Β6 ktorý hybridizuje na 3-konci promótora. Tým sa potvrdí, že pripojenie tohto nukleotidu ku génu SKC-2 je také, ako sa žiadalo.

Vybraný kloň sa nazýva pEKG-3 (obr. 1). Tento kloň sa použije pri fermentácii na účely charakterizácie produktu.

Kloň plazmidu pEKG3 sa čistí s použitím koncentračného gradientu CsCl. Sekvencia génu SKC-2 sa stanoví zakaždým s použitím 2 g plazmidu a oligonukleotidov, ktoré sú uvedené ďalej ako priméry:

S SK- 01 5 ¹ .. . GAATCAAGACATTÁGTC.. . 3 ’

SSK-02 5 ’ . ..GTGGCGCGATGCCAC...3’ SSK-03 5'...GCAACCATTACTGATCG...3¹ SSK-04 5 ¹ . . . CCAGTACAAAATCAAGC. . . 3 ' SSK-05 5'...CTAGCTATCGGTGACAC...3 ' SSK-06 5 ' . . . CAGAGATCAGGTCAG. .. 3' ΞΞΚ-07 S ' . . . GTTAAGAGCTGCTCGC 3 ' SSK-0 8 5 ' .. . CCAGTTAAGGTATAGTC.. . 3 ' SSK-09 5'...TCTCGTTCTTCTTCGG... 3 '

Postupuje sa v zásade podľa Sanger, F., Nickler, S. a Coulson, A. K., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 - 5467). Použijú sa označené nukleotidy dATP32 _a s35aTP (Amersham, GB).

Obr. 2 porovnáva aminokyselinovú sekvenciu odvodenú od základnej sekvencie génu SKC-2 so sekvenciami odvodenými od génov SKC (Malke, H. aFerretti, J. J., 1985, Gene 34; 357 - 362), SKA a SKGWalter, F., Siegel, M. a Malke, H., 1989, Nucl. Acids Res. 17(3): 1262.

Plazmid pEKG3 sa transformuje v niekoľkých kmeňoch/?. coli ako sú W-3110, JM-101, LE392 a MC-1061, a potom sa porovnáva ich expresia streptokinázy. Najlepšie výsledky poskytuje kmeň W3110 (F^- supF supE hsdR galK TrpR metB lacY tonA. Preto sa tento kmeň vyberie a uskutočňuje sa s ním fermentácia. Získajú sa stabilné úrovne expresie. Viac ako 20 % celkového množstva bielkovín v bunkách tvorí streptokináza. Získa sa 350 - 400 mg streptokinázy na liter kultivačného média.

Príklad 3

Na klonovanie génu SKC-2 v kvasinkách sa ako hostiteľ použije kmeň MP36 Pichia pastoris. Vytvoria sa varianty na intracelulámu a etracelulámu expresiu z plazmidov pNAO a pPS7 (obr. 3). Pre extracelulámy konštrukt sa použije signálny peptid invertázy sacharózy. V obidvoch prípadoch (extra- aj intracelulámej expresie) sa gén klonuje za riadenia promótora pre alkoholoxidázu (AOX) s použitím terminátora na 3-konci terminačného signálu génu pre glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu z S. cerevisiae a s použitím nekódujúcej 3'-oblasti AOX génu na integráciu, čo je možné vzhľadom na homológiu genómu kvasiniek. Ďalej sa využíva gén kódujúci histidín 3 na selekciu v kmeni MP36 his.

Vektor pPESKC4 (plazmid na etracelulámu expresiu proteínu) sa získa z vektorového konštruktu pPS7-NcoI-Sl nukleáza-fosfatázy ligáciou s génom SKC-2, Gén SKC-2 je zosilnený reakciou PCR z pEKG3 s oligonukleotidom SK2 a novým primárom, ktorý hibridizuje s 5'-koncom génu a eliminuje kodón ATG, ktorý bol vložený do konštruktu na expresiu pri baktériách. V prípade intracelulámej expresie sa získa pPISKC6 (plazmid na intracelulámu expresiu proteínu) z vektora pNAO-Ncol-Ecol-Sl nukleáza-fosfatázy ligáciou s pásom génu SKC-2, ktorý je zosilnený reakciou

PCR s primérmi SK2 a SK3, čím sa získa presný gén, ktoiý kóduje streptokinázu s kodónom ATG na svojom 5'-konci (obr. 3). Obidva plazmidy sa transformujú v kmeni MP36 his* s použitím postupu podľa Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. aMadden, K. R., 1985, Mol. Celí. Biol. 5: 3376 -3385.

Pozitívne klony sa študujú technikou southem blot (Maniatis, T., Frisch, E. F. a Sambrook, J., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, USA). Podľa správnej integrácie sa v každom prípade vyberie najproduktívnejší kloň na charakterizáciu produktu.

Získaná extraceluláma expresia rekombinantnej streptokinázy v P. pastoris je 1 až 1,2 g/1 supematantu kultivačného média. V prípade intracelulámeho konštruktu je to viac ako 1,0 g/1 kultúry.

Pri použití konštruktu na extracelulámu expresiu sa získa glykozylovaný proteín s molekulovou hmotnosťou väčšou ako 67 000 D. Technikou westem blotting sa dá potvrdiť, že jeho molekulová hmotnosť sa po štiepení endoglvkozidázou H zníži na molekulovú hmotnosť prírodnej streptokinázy. Štiepenie sa uskutočňuje s proteínom s koncentráciou 1 mg/ml v roztoku citrátu sodného (koncentrácia 0,05 M, pH 5,5). Proteín sa denaturuje prídavkom SDS (konečná koncentrácia 0,02 %) a zohriatím na 100 °C počas 10 minút Potom sa reakčná zmes nechá vychladnúť na okolitú teplotu a pridá sa 200 milijednotiek (mU) endoglykozidázy H (endo H). Zmes sa nechá stáť 16 hodín pri teplote 37 °C. Nakoniec sa 5 minút zohrieva pri 100 °C, pridá sa 100 mU endo H a inkubuje sa 12 hodín pri 37 °C. Potom sa roztok nanesie na 12,5 % polyakrylamidový gél a porovná sa s nedeglykozylovanou vzorkou.

Streptokináza produkovaná v Pichia pastoris si pri použití obidvoch konštruktov udržiava svoju biologickú aktivitu, nemení svoju afinitu k plazminogénu a poskytuje v skutočnosti ďalšiu alternatívu na použitie tohto proteínu v klinickej medicíne.

Príklad 4

Na overenie biologickej aktivity produktu génu SKC-2 sa čistá rekombinantná streptokináza, získaná z baktérií alebo z kvasiniek, použije na testy akútnej a subakútnej toxicity na potkanoch. Získajú sa uspokojivé a prijateľné výsledky, ktoré dovoľujú používať streptokinázu v humánnom lekárstve a vo veterinárnej medicíne. Jej fibrinolytická aktivita in vivo sa overí v klinických testoch na zvieratách, v ktorých úspešne prebieha rozpúšťanie zrazenín fibrínu vo vencových a stehenných tepnách psov. Krvné parametre sa udržiavajú podobné, ako sú parametre opísané v literatúre s týmto typom produktu.

Produkt génu SKC-2 má špecifickú aktivitu 50 000 -

- 100 000 IU/mg, ktorá sa meria na miskách s agarózoufíbrínom (Astrup, T. aMullertz, S., 1952, Árch. Biochem. Biophys. 40: 346 - 351), s chromatogénnym substrátom (Fiberger, P., 1982, J. Clin. Lab. Invest. 42, Suppl. 162: 49 -

- 54) a in vitro podľa lýzy zrazenín (Westtund, L. E. a Anderson, L. O., 1985, Thrombosis Research 37: 213 -

- 223).

Príklad 5

Na overenie aminokyselinovej sekvencie, odvodenej od základnej sekvencie génu SKC-2, sa uskutoční analýza čistého produktu pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie v obrátenej fáze (HPLC-RP) s použitím

SK 279873 Β6 kolóny C8 4,6 x 250 mm (Baker, USA). Eluuje sa stupňovito s použitím gradientu tlmivého roztoku B v tlmivom roztoku A, pričom dĺžka jedného stupňa je 5 minút, koncentrácia tlmivého roztoku B sa mení od 0 do 90 % a celkový čas elúcie je 55 minút. Tlmivým roztokom A je kyselina trifluóroctová (TFA, Pierce, USA) s koncentráciou 0,1 % v destilovanej vode a tlmivým roztokom B je TFA s koncentráciou 0,5 % v acetonitrile (Lichrosolv, Merck, SRN). Prietoková rýchlosť sa udržiava na hodnote 0,8 ml/min.

Pri proteíne s vysokým stupňom čistoty sa aminokyselinová sekvencia, odvodená od základnej sekvencie získanej z génu SKC-2, overí sekvenovanim pomocou hmotnostnej spektrometrie.

Preto sa proteín štiepi rôznymi enzýmami a ich kombináciami. Použitými enzýmami sú chymotrypsín, endoproteináza Olu-C, endoproteináza Lys-C a trypsíli.

Z analýzy hmotnostných spektier peptidov, ktoré sa získajú pri každom štiepení rôznymi enzýmami, sa superpozíciou skonštruuje mapa aminokyselinovej sekvencie proteínu. Táto mapa umožní overiť, že v tomto prípade je 100 % korešpodencia medzi sekvenciou génu SKC-2 a aminokyselinovou sekvenciou získaného proteínu.

Uloženie kmeňov

Kmeň E. coli HSK-M (pEKG3), odvodený od kmeňa E. coli W3110 a obsahujúci plazmid pEKG3, bol uložený 11. júna 1990 v Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baam, Holandsko a získal depozitné číslo CBS 243.90.

Podobne kmeň Pichia pastoris MSK-M4 (pPESKC-4), odvodený od kmeňa Pichia pastoris MP-36 a obsahujúci plazmid pPESKC-4, bol uložený 11. júna 1990 v Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baam, Holandsko a získal depozitné číslo CBS 244.90.

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob výroby streptokinázy expresiou génu kódujúceho túto streptokinázu, vyznačujúci sa t ý m , že sa hostiteľská bunka transformuje expresným vektorom obsahujúcim gén streptokinázy, SKC-2, ktorý v podstate pozostáva z nukleotidovej sekvencie

   ΑΤΓ GCT cca cer GAG TGG· gtg cta gac caa cta gct ctt juse firr cer ggt act ATT AGT CCT AAA ΤΓΓ Tl'ľ GAA ATT GAC GGA GGA AAG ACA GAG CAA GGC TTA AGT ACT GAT AGT GGC GCG ATG CCA CAT ΑΛΑ AAC GCT ATT CAA GAA CAA TTG ATC GCT TAC ΤΓΓ GAG GTC ATT GAT CTT GGA AGC

   CÔT CCA TCT CTC AAC aac agc «a GŤT GAG cca ACO AAT 0Λ GRS 9f CTA ACA TCA CGA CCT GCT CAT 144 CCA AAA TCA AAA CCA TTT GCT 192 CTT GAA AAA GCT GAC TTÄ CTA 240 AAC OTC CAC AGT AAC GAC GAC 391 GAT GCA ACC ACT ACT GAT CSA 33í

   AAC GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT OGT TCG GTA ACC TTG CC® 384 ACC CAA CCT GTC CAA GAA CTT TTG CTA AGC GGA CAT GT3 CGC GCT AGA 431 CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AAT CAA GCG AAA TCT GCT GAT GT3 480

   GAA TAT ACT GTA CÄG TTT ACT CCC TTÄ AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA 528 CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAC CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC 576 ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTÄ CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC 624 AAA ACC CAC CCA GGC TAT ÄCG ACT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC «72 ACT CAT GAC AAT GAC ΑΤΓ TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA QAQ 720

   ΤΤΓ ACT TAC CAT GTC AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT GAG ATC AAT AAA 76B AAA TCT GCT CTG AAT GAA GAA ΑΤΆ AAC AAC ACT GAC CTO ATC TCT GAG 116 AAA TAT TAC GTC CIT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC CTT GAT 8« CGC AGT CAC TTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC AAC ACC 9 12 AAC GAA TTG CTA AAA AGC GAG CAG CTC TTÄ ACA GCT AGC GAA CGT AAC 9 60 TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GCT AAA CTA CTC 100«

   TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA 10 56

   AAA GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACC AAC CGT ATC ATA ACC GCT TAT 1104

   ATG GGC AAG OSA CCC GAA GGA GAG AAT GCT AGC TAT CAT CTA GCC TAT 1152 GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAA CGA GAA GCT TAC AGC TAC CTG 1200

   CGT TAT ACA GGG ACA CCT ΑΤΆ CCT GAT AAC CCT AAC GAC AAA TAA 1215 ktorá je operatívne viazaná k účinnému promótora a terminátora transkripcie, vzniknutá transformovaná hostiteľská bunka sa kultivuje a izoluje sa vyrobená streptokináza.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že gén SKC-2 je izolovaný zo Streptocoecus equisimilis typu C kmeňa ATCC 9542.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že gén SKC-2 sa používa bez jeho oblasti kódujúcej signálny peptid.
4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že gén SKC-2 sa používa s jeho oblasťou kódujúcou signálny peptid.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým , že hostiteľskou bunkou je baktéria.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým , že baktériou je Escheríchia coli.
7. 7. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa t ý m , že baktériou je Escheríchia coli kmeň W3110.
8. 8. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa t ý m , že expresným vektorom je plazmid obsahujúci gén SKC-2 operatívne pripojený k tryptofánovému promotóru z Escheríchia coli a terminátoru transkripcie T4.
9. 9. Spôsob podľa nároku 8, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že expresným vektorom je plazmid pEKG3 nachádzajúci sa v Escherchia coli kmeň CBS 243.90.
10. 10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým , že hostiteľskou bunkou je kvasinka.
11. 11. Spôsob podľa nároku 10, v y z n a č u j ú c i sa tým , že kvasinkou je Pichia pastoris.
12. 12. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa t ý m , že kvasinkou je Pichia pastoris his^- kmeň MP-36, CBS 244.90.
13. 13. Spôsob podľa nároku 10, kde expresným vektorom je plazmid obsahujúci gén SKC-2 operatívne pripojený k alkoholoxidázovému promotóru, AOX1, z Pichia pastoris a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázovej teiminačnej sekvencii GAPt zo Saccharomyces cerevisiae.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m , že expresný vektor obsahuje ako selekčný marker gén his 3 zo Saccharomyces cerevisiae.
15. 15. Spôsob podľa nároku 14, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že expresným vektorom je plazmid pPESKC-4 nachádzajúci sa v Pichia pastoris kmeň CBS

    244.90.
16. 16. Spôsob podľa nároku 14, v y z n a č u j ú c i sa t v m , že expresný vektor obsahuje gén SKC-2 bez oblasti kódujúcej signálny peptid.
17. 17. Izolovaná a purifikovaná nukleotidová kyselina v podstate sa skladajúca z nukleotidovej sekvencie znázornenej v nároku 1.
18. 18. Expresný vektor na expresiu streptokinázy v hostiteľskej bunke, ktorý obsahuje gén streptokinázy SKC-2 v podstate pozostávajúci z nukleotidovej sekvencie uvedenej v nároku 1, operatívne pripojený k účinnému promótora a terminátoru transkripcie.
19. 19. Expresný vektor podľa nároku 18 obsahujúci gén SKC-2 operatívne pripojený k tryptofánovému promotóru z Escheríchia coli a terminátoru transkripcie T4 na expresiu génu SKC-2 v baktérii.
20. 20. Expresný vektor podľa nároku 19, ktorým je plazmid pEKG3 nachádzajúci sa v Escheríchia coli kmeň CBS

    243.90.
21. 21. Expresný vektor podľa nároku 18 obsahujúci gén SKC-2 operatívne pripojený k alkoholoxidázovému promotóru ΛΟΧ1 z Pichia pastoris a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázovej terminačnej sekvencii OAPt zo Saccharomyces eerevisiae.
22. 22. Expresný vektor podľa nároku 21 obsahujúci ako selekčný marker gén his 3 zo Saccharomyces eerevisiae.
23. 23. Expresný vektor podľa nároku 22, ktorým je plazmid pPESKC-4.
24. 24. Hostiteľská bunka na produkciu streptokinázy expresiou génu kódujúceho túto streptokinázu, pričom táto hostiteľská bunka je transformovaná expresným vektorom, ktorý obsahuje gén streptokinázy SKC-2 v podstate pozostávajúci z nukleotidovej sekvencie uvedenej v nároku 1, operatívne pripojený k účinnému promótoru a terminátoru transkripcie.
25. 25. Hostiteľská bunka podľa nároku 24, ktorou je baktéria.
26. 26. Hostiteľská bunka podľa nároku 24, ktorou je Escherichia coli.
27. 27. Hostiteľská bunka podľa nároku 24, ktorou je Escherichia coli kmeň W3110.
28. 28. Hostiteľská bunka podľa nároku 24, ktorou je kvasinka.
29. 29. Hostiteľská bunka podľa nároku 24, ktorou je Pichia pastoris.
30. 30. Hostiteľská bunka podľa nároku 24, ktorou je Pichia pastoris his kmeň MP-36 (CBS 244.90).
31. 31. Izolovaná a purifikovaná streptokináza v podstate pozostávajúca z aminokyselinovej sekvencie kódovanej nukleotidovou sekvenciou znázornenou v nároku 1.
32. 32. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje izolovanú a purifikovanú streptokinázu podľa nároku 31a farmaceutický vhodné riedidlo, nosič alebo excipient.

    3 výkresy