HU216073B - Eljárás sztreptokináz előállítására - Google Patents

Eljárás sztreptokináz előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU216073B
HU216073B HU1770/91A HU177091A HU216073B HU 216073 B HU216073 B HU 216073B HU 1770/91 A HU1770/91 A HU 1770/91A HU 177091 A HU177091 A HU 177091A HU 216073 B HU216073 B HU 216073B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
aaa
dam
gaa
aac
gac
Prior art date
Application number
HU1770/91A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT62655A (en
HU911770D0 (en
Inventor
Roger Rubiera Chaplen
Pedro Rodriguez Collazo
Ricardo Serrano Doce
Alicida Pedraza Fernández
José de J. Fuenta García
Mario Pablo Garcia
Aimeé Pérez Hidalgo
Luciano F. Hernández Marrero
Luis S. Herrera Martínez
Walfrido Bravo Martínez
Emilio Amable Munoz Munoz
Anaisel Castro Ramírez
Magalys Campos Somavilla
Original Assignee
Centro de Ingenieria Genética y Biotecnologia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro de Ingenieria Genética y Biotecnologia filed Critical Centro de Ingenieria Genética y Biotecnologia
Priority to HU1770/91A priority Critical patent/HU216073B/hu
Priority claimed from CA 2043953 external-priority patent/CA2043953C/en
Publication of HU911770D0 publication Critical patent/HU911770D0/hu
Publication of HUT62655A publication Critical patent/HUT62655A/hu
Publication of HU216073B publication Critical patent/HU216073B/hu

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás sztreptőkináz előállítására sztreptőkináztkódőló gén kifejezésével őly módőn, hőgy egy gazdasejtet sztreptőkinázgént (SKC–2) tartalmazó kifejezővektőrral transzf rmálnak, ahől a génműködőképesen egy hatásős prőmőterhez és transzkripciós terminátőrhőzkapcsőlódik, majd a transzfőrmált gazdasejtet tenyésztik, és a termeltsztreptőkinázt izőlálják. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás sztreptokináz előállítására egy új nukleotidszekvencia gazdaszervezetbe történő transzformálásával, a transzformált gazdasejt tenyésztésével és a termelt sztreptokináz izolálásával.
A sztreptokinázok prokarióta sejtekből származó plazminogén aktivátorok, amelyek általában különböző szerotípushoz tartozó nagyszámú hemolitikus Streptococci szervezetéből választódnak ki a tenyészközegbe. Mivel bakteriális eredetűek, számos rájuk vonatkozó antigénválaszt detektáltak már (ilyeneket ismertetnek például Dykewies, M. S. és munkatársai 1985-ben és McGroth, K. G. és munkatársai 1985-ben). Molekulatömegük körülbelül 47 000 dalton.
A Streptococci patogén funkciója pontosan nem ismert, azonban potenciálisan részt kell vegyen a fertőzés körüli fibringátak megszüntetésében vagy elkerülésében.
A sztreptokináz és a humán plazmában található plazminogén kölcsönhatásakor a tapasztalatok szerint a fehérje képes a plazminogén proteolitikus aktivitású plazminná való átalakítására, és a fibrincsomók oldható termékekké való lebontására.
A sztreptokináz, urokináz és szövet típusú aktivátorok jelenleg a világon együttesen a legtöbb halált okozó betegség, mint például szívinfarktus, tüdőembólia, artériás és vénás trombózis, sebészeti komplikációk által okozott, valamint egyéb trombózisos megbetegedés kezelésére alkalmazott trombolitikus szerek.
A különböző eredetű sztreptokinázok molekulaheterogenitásuk miatt különböző fizikokémiai, immunológiai és anyagspecifikus viselkedésűek, azonban funkcióikat tekintve nagyon szoros rokonságot mutatnak.
Az ipari termelésben alkalmazott Streptococcus törzsek az alacsony hozamú fehéije-előállítás, valamint az eredeti gazdaszervezet patogenitása következtében a sztreptokináz kiválasztása egyéb termékek tenyészközegbe való bejuttatásával jár együtt. Ilyen termékek például a dezoxiribonukleázok, a sztreptolizin vagy hialuronidáz és a proteázok. A megfelelő géntranszferáló eljárás hiányában azonban ezekből a gazdaszervezetekből ma még nem lehet genetikusán jobb törzseket előállítani.
A fentiekben ismertetett akadályok miatt ezeket a fehérjéket kódoló, különböző izolált géneket prokarióta és eukarióta gazdaszervezetekkel próbálják klónozni.
A 249 493 számú NDK-beli szabadalmi leírásban a Streptococcus C típushoz tartozó Streptococcus equisimilis H46A törzsből származó sztreptokinázt kódoló gén klónozását és kifejezését ismertetik, az eljárásban gazdaszervezetként E. colit alkalmaznak, és a tenyészet korától függően, 0,1-1,8 mg/1 közegbe való kiválasztást kapnak.
Ezután saját szignálpeptidjével együtt meghatározták ezt az SKC-nek nevezett gént kódoló szekvenciát, és azonosították a géntranszkripció és -transzláció szabályozásában részt vevő szomszédos régiók primer szerkezetét (Maike, H. és munkatársai, 1985).
Egyéb, G és A típusú Streptococcusból származó sztreptokinázokat kódoló gén nukleotidszekvenciákat is ismertetnek (Water, F. és munkatársai, 1989). Különösen fontos az M49 típusú Streptococcus piogenes törzsből származó A típusú sztreptokináz (SKA gén). E. coli JM109 törzsben és a Streptococcus sanguis Challis 57E-ben való klónozása és kifejezése (Huang, Τ. T. és munkatársai, 1989). A két esetben 0,64 mg/1, illetőleg 40 pg/l fehérjeszint érhető el. Az E. coli esetén a protein 94%-át a periplazmikus térből és 6%-ot a citoszolból, míg az S. sanguis esetén az összes enzimet a sejten kívüli részből nyerik. Emellett számos, az E. coliban sztreptokinázt előállító klón nagyon instabil, és némely esetben az SKA gén kiesik, vagy a kérdéses géntermék bizonyos halált okozó tevékenysége miatt a gazdasejtek elpusztulnak.
Az S. sanguis esetén a kapott fehérje molekulatömege az eredeti sztreptokinázétól mintegy 3000 daltonnal kisebb, és a C-terminális végből 32 aminosav hiányzik; biológiai aktivitást azonban nem mutat (Huang, Τ. T. és munkatársai, 1989).
Az E. coliban izolált SKC gén klónozása és kifejezése hasonló nehézségekkel jár; azt tapasztalták ugyanis, hogy a géntermék zavarja a gazdaszervezet normál fiziológiáját, ami a gént hordozó sejtek nyálkásságában, a sztreptokináz periplazmikus térbe való nem teljes bevitelében, az SKC gént hordozó és a fehérje magas szintű kifejezésére szánt plazmidok szerkezeti instabilitásában, valamint a további Streptococcus szerotípusokból származó sztreptokináz gének E. coli plazmidokban való klónozásának nehézségeiben és magának az SKC gén expressziós-exkréciós szignáloknak az ellenőrzése alatt lévő heterogén gének sikertelen kifejezési nehézségeiben jelentkezik (Muller, J. és munkatársai, 1989).
A Phillips Petroleum társaság (257 646 számú NDKbeli szabadalmi leírás és Haggenson, M. J. és munkatársai, 1989) eljárásában a Pichia pastoris metilotropikus élesztőben az alkohol-oxidáz génszabályozó szekvencia ellenőrzése alatt végzett sztreptokináz kifejezésekor, folyamatos fermentálással 1 liter tenyészközegben 77-250 mg kívánt terméket kapnak; a közvetítősejt sűrűsége 46 g/liter. Ebben az eljárásban az SKC gént használják, amely apMF5 plazmidban található.
Figyelembe véve, hogy glikóz és glicerin alkalmazásával az újrakifejezés könnyen megvalósítható, és metanollal indukálható, a rendszer könnyen ellenőrizhető; azonban csak ebben a gazdaszervezetben alkalmazható.
A találmány tárgya eljárás sztreptokináz előállítására sztreptokinázt kódoló gén kifejezésével oly módon, hogy egy gazdasejtet sztreptokináz gént (SKC-2) tartalmazó kifejező vektorral transzformálunk, ahol a gén nukleotidszekvenciája lényegében
ATT GCT GGA CCT GAG TGG CTG CTA
CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT
ATT AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATT
CGT CCA TCT GTC AAC AAC AGC 48
GTT GAG GGG ACG AAT CAA GAC 96
CTA ACA TCA CGA CCT GCT CAT 144
HU 216 073 Β
GGA GGA AAG ACA GAG CAA GGC TTA AGT CCA AAA TCA AAA CCA TTT GCT 192
AVT GAT AGT GGC GCG ATG CCA CAT AAA CTT GAA AAA GCT GAC TTA CTA 240
AAG GCT AAT CAA GAA CAA TTG ATC GCT AAC GTC CAC AGT AAC GAC GAC 288
TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ACT GAT CGA 336
AAC GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT GGT TCG GTA AAC TTG CCG 384
ACC CAA CCT GTC CAA GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA 432
CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AAT CCA GCG AAA TCT GTT GAT GTG 480
GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CCC TTA AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA 528
CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAG CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC 576
ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC 624
AAA ACC CAC CCA GGC TAT ACG ATT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC 672
ACT CAT GAC AAT GAC ATT TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG 720
TTT ACT TAC CAT GTC AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT GAG ATC AAT AAA 768
AAA TCT GGT CTG AAT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GAC CTG ATC TCT GAG 816
AAA TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC TTT GAT 864
CGC AGT CAC TTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC AAC AAC ' 912
AAC GAA TTG CTA AAA AGC GAG CAG CTC TTA ACA GCT AGC GAA CGT AAC 960
TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GCT AAA CTA CTC 1008
TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA 1056
AAA GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACC AAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT 1104
ATG GGC AAG CGA CCC GAA GGA GAG AAT GCT AGC TAT CAT TTA GCC TAT 1152
GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAA CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG 1200
CGT TAT ACA GGG ACA CCT ATA CCT GAT AAC CCT AAC GAC AAA TAA 1245
és működőképesen egy hatásos promoterhez és transzkripciós terminátorhoz kapcsolódik, majd a transzformáit gazdasejtet tenyésztjük és a termelt sztreptokinázt izoláljuk.
A sztreptokináz előállítása különböző gazdarendszerekben megvalósítható egy nagy hozamú eljárással, amelyben a kifejezésre alkalmazott vektor egy korábban nem ismertetett genetikai változatot képviselő olyan, új nukleotidszekvenciát hordoz, amely az ATCC-9542 C típusú Streptococcus equisimilis törzsből származó sztreptokináznak megfelelő aktív részt tartalmazó bioaktív sztreptokinázt kódol. Az új, SKC-2-nek elnevezett izolált gén az SKC által kódolt fehéije molekulatömegével azonos molekulatömegű fehéijét kódol; E. coli és élesztővektorokban rendkívül stabil; a sejtszaporodást és életképességet nem befolyásolja, ezért az eddigiekben ismertetett mindkét gazdaszervezetben történt előállításhoz képest sokkal nagyobb hozamú termék-előállítást tesz lehetővé. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerint előállított sztreptokináz az eddig ismertektől különböző, kívánt biológiai aktivitású termék.
A találmány értelmében a sztreptokináz kódolására az SKC-2 gént alkalmazzuk, amely egy olyan új nukleotidszekvencia, amely kifejezi a 47 000 Dalion mole55 kulatömegű, fibrinolitikus aktivitású sztreptokinázt.
A fenti gén az 1. számú szekvenciának felel meg.
Ezt a gént ATCC-9542 C típusú Streptococcus equisimilis törzs genomjából állítottuk elő a következő szekvenciájú, SK1, SK2 és SK3-nak nevezett három szintetikus oligonukleotid alkalmazásával:
HU 216 073 Β
SKl 5'
SK2 5'
SK3 5'
IGGAATTCATGAAAAATTACTTATCT .
számú
TGGATCCTTATTTGTCGTTAGGGTTATC
GGAATTCATGATTGCTGGACCTGAGTGGCTG... 3 1 (4 . azonosipolimeráz láncreakcióval (PCR) végzett génamplifikálással. Ezek a primerek a génben nem található olyan restrikciós helyeket hordoznak, amelyek a kifejezésre alkalmazott vektorban közvetlen klónozást tesznek lehetővé. Emellett, az 5’ végnél hibridizáló SK2 egy ATG-t hordoz, amely a leolvasás kiindulópontjaként működik, és eltávolítja az SKC-2 szignálpeptidjét. Az SKC szekvenciákból előállított három oligonukleotidot Maike és munkatársai (1985) ismertetik; ezek segítségével jelöltük ki az érett fehérjét kódoló génfragmens pontos határait vagy a szignálpeptidet tartalmazó teljes gént.
Az eljárás másik új vonása az izolált gén baktériumokban és élesztőben való kifejezésének lehetősége.
Az eljárás kiindulási anyaga egy olyan rekombináns DNS, amely az SKC-2 gént tartalmazza, mint például ezt a gént pEKG3 baktériumban (1. ábra) vagy pPESKC-4 és pPISKC-6 élesztőben (3. ábra) kifejezővektor. E. coliban való kifejezés esetén például az SKC-2 gént szignálpeptidjével vagy a nélkül a triptofán promoter ellenőrzése alatt és a T4 fág transzkripciós terminációs szignállal klónozzuk. Élesztőkben 7/90 bejelentési számú kubai szerzői tanúsítvány szerinti kifejezővektort alkalmazzuk; ebben az SKC-2 gén a Pichia pastoris alkohol-oxidáz génpromoter (AOX1) által ellenőrzött szacharóz invertáz szignálpeptid (SUC2) mögött helyezkedik el, és a sejten kívüli kifejezéshez a Saccharomyces cerevisiae gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPt) gén terminációs szignálját tartalmazza; a vektor neve pPESKC-4. Az SKC-2 sejtközi kifejezésére az AOX1 promoter mögött SUC-2 szignálpeptidet nem tartalmazó pPISKC-6 vektort alkalmazunk, amelyet az SKC-2 gén pNAO kifejezővektorba való beültetésével állítunk elő (az eljárást Muzio, CIGB, Havanna, Kuba ismerteti) (3. ábra). Szelekciós markerként mindkét vektorban S. cerevisiae HIS3 gént alkalmazunk, és a fenti expressziós kazetta az integráláshoz a Pichia pastoris AOX gén 5’ és 3’ szekvenciákkal van szegélyezve.
A találmány szerinti eljárás megvalósítható úgy, hogy a W3110 E. coli törzset pEKG3 vektorral transzformáljuk, vagy a 7/90 bejelentési számú kubai szerzői tanúsítvány szerinti MP-36 mutáns Pichia pastoris törzset pPESKC-4 és pPISKC-6 kifejezővektorral transzformáljuk. Ezeket nagy sztreptokinázkoncentráció, jó életképesség (a termék nem befolyásolja a sejtszaporodást) és a transzformált törzsek nagy stabilitása jellemzi.
A transzformált E. coli klón neve HSK-M, és az SKC-2 gén termékének kifejezési szintje 1 liter tenyészközegben több mint 350 mg.
.3' (2. azonosítási szekvencia)
..3'(3. azonosítási számú szekvencia) tSsi számú szekvencia)
Az MSK-M4 és MSK-M6 transzformált Pichia pastoris törzsek sejten belüli és sejten kívüli sztreptokináztermelése 1,2 g/liter tenyészközeg.
A találmány eddigi eljárásokkal el nem érhető kifejezési szinten embernél és állatnál egyaránt alkalmazható, optimális tisztaságú termék előállítását teszi lehetővé; nem szükséges további összetett és költséges tisztítóeljárás.
A következő példákat a találmány részletesebb bemutatására ismertetjük. A példákban E. coli és Pichia pastoris gazdarendszereket alkalmazunk; azonban a találmány szerinti eljárás egyéb eukarióta és prokariota sejtekkel is megvalósítható.
1. példa
Az SK gén klónozásához ATCC-9542 C típusú Streptococcus equisimilis törzsből genomiális DNS-t izolálunk. Egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikban 12 órán át növesztett tenyészethez inokulumként 5 ml előtenyészetet alkalmazunk, amelyhez 37 °C-on, 12 órán át, 240 fordulat/perc mellett agy-szív infúziós közegben (Brain Heart Iníúsion Médium; GIBCO) Streptococcus equisimílist növesztünk. A sejteket 3000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással összegyűjtjük, 8 ml roncsoló folyadékban (4,5 g glükóz, 1,86 g EDTA, 1,51 g trisz-HCl, 500 ml steril vízben, pH=8) szuszpendáljuk, amelyhez 80 plitér 10 mg/ml koncentrációjú lizozimot adunk, és az így kapott szuszpenziót 30 percen át, 37 °Con inkubáljuk. Ezt követően a szuszpenzióhoz a hatékony sejtrepesztés érdekében 500 pliter pronázt (Boehringer), ml 10%-os SDS-t és 200 pliter 0,5 mol/1 EDTA-t adunk pH=8 értéken, és az így kapott szuszpenziót órán át, 50 °C-on, enyhe keverés közben inkubáljuk. Ezután egymás után fenollal, fenol/kloroform eleggyel és kloroformmal kezeljük, majd a genomiális DNS-t abszolút etanollal és 7,5 mol/1 ammónium-acetáttal kicsapatjuk.
így a 300 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő tenyészközegre számolva 100 pg terméket kapunk. A sztreptokinázt kódoló gén jelenlétét „Southern folt” (Southern biot) eljárással (Maniatis és munkatársai, 1982) azonosítjuk.
2. példa
Baktériumban való szubklónozáshoz 1 pg ATCC95 421 C típusú Streptococcus equisimilis törzsből származó genomiális DNS-t alkalmazunk; az SKC-2-t kódoló gént PCR-alkalmazással (Randall és munkatársai, 1988) amplifikáljuk; a gén saját szignálpeptidekkel való
HU 216 073 Β klónozásához SK1 és SK2 oligonukleotidokat és a szignálpeptidek nélküli klónozáshoz SK2-SK3 oligonukleotidokat alkalmazunk.
A reakciók mindegyikénél 100 pmol oligonukleotidot, 2 egység Taq polimerázt (Perkin Elmer, USA) és mindegyik ANTP-ből 200 pmol-t alkalmazunk, és a reakciók kivitelezését 10 mmol/1 magnézium-kloridot,
100 mmol/1 dTT-t, 10 mmol/1 nátrium-kloridot és 100 pg/ml zselatint tartalmazó elegyben végezzük.
amplifikáló ciklust folytatunk le, minden esetben a reakcióelegyet denaturálásra 95 °C-on, 1 percig, az oligonukleotidok hibridizálására 52 °C-on, 45 másodpercig, és növesztésre 70 °C-on, 80 másodpercig inkubáljuk. így több mint 5% hatékonyságú amplifikálást kapunk.
Baktériumban (E. coli) való klónozáshoz a termék kifejezésére alkalmazottól eltérő genetikai felépítésű szerkezetet, az E. coli triptofán promotert és a T4 bakteriofág terminációs szignált alkalmazzuk. A PCR-rel amplifikált fragmenseket BamHI-gyel emésztjük, és a ptrip-NcoI-Sl-BamHI vektorral ligáljuk (Estrada és munkatársai, 1988). Ezt a szerkezetet a Dagert és munkatársai, 1977 és Hanahan és munkatársai, 1983 által ismertetett eljárással előállított, HB101, E. coli [(rB mB supE44, ara14, galK 2, lacYl, proA2, rpsL20, (StrR), 25 xyl-5, mtl-5, mtl-1, recA13] törzsből származó kompetens sejtkészítménybe transzformáljuk, amelynek gyakorisága legalább 107 transzformáns/1 g DNS.
Az így kapott kolóniákat LB közeget (10 g/liter tripton, 5 g/liter élesztőkivonat, 10 g/liter nátrium-klorid) és 50 μg/ml ampicillint tartalmazó lemezekre visszük, és a Maniatis és munkatársai, 1982 által ismer5 tetett eljárással hibridizáljuk; próbaként dATP32-vel jelzett (Amersham, Nagy-Britannia), PCR-amplifikálásból származó fragmenst és az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmenst alkalmazzuk, Whatman 541 szűrőben 37 °C-on, 30 perc alatt végzett szűréssel; a reakciót 10 EDTA alkalmazásával és felmelegítéssel fejezzük be. A kolóniák 4%-a pozitív klón, amelyek meghatározása restrikciós elemzéssel történik, és több mint 10 restrikciós enzimmel ugyanazt az emésztési mintát mutatják; a pozitív kiónok meghatározását kettős láncú DNS15 szekvenálással (Sanger és munkatársai, 1977) is elvégezzük; ebben az eljárásban a promoter 3’ végét hibridizáló 17 bázisos oligonukleotidot (5’...ATCATCGAACTAGTTAA...3’, 5. azonosítási számú szekvencia) alkalmazunk; ez a meghatározás is megerősíti, hogy a 20 promoter a várakozásnak megfelelően az SKC-2-höz kapcsolódik.
A szelektált kiónt pEKG-3-nak nevezzük (1. ábra), és a termék jellegének meghatározására fermentálásnak vetjük alá.
A pEKG-3 klón plazmidot egy CsCl-gradienssel tisztítjuk, és így az SKC-2 génszekvenciát meghatározzuk. Minden alkalommal 2 g plazmidot és primerként a következő oligonukleotidokat alkalmazzuk:
SSK-01 5'
GAATCAAGACATTAGTC.. . 3 '
SSK-02 5'
GTGGCGCGATGCCAC...3 ’
SSK-03 5'
GCAACCATTACTGATCG.. . 3 '
SSK-04 5'
CCAGTACAAAATCAAGC. . . 3 '
SSK-05 5'
CTAGCTATCGGTGACAC...3 '
SSK-06 5’
CAGAGATCAGGTCAG...3'
SSK-07 5'
GTTAAGAGCTGCTCGC...3 '
SSK-08 5'
CCAGTTAAGGTATAGTC. . . 3 '
SSK-09 5’
TCTCGTTCTTCTTCGG...3 ' (6. számú azonosítási szekvencia) (7. számú azonosítási szekvencia) (8. számú azonosítási szekvencia) (9. számú azonosítási szekvencia) (10. számú azonosítási szekvencia) (11. számú azonosítási szekvencia) (12. számú azonosítási szekvencia) (13. számú azonosítási szekvencia) (14. számú azonosítási szekvencia).
HU 216 073 Β
A lefolytatott eljárás azonos a Sanger és munkatársai, 1977 által ismertetett eljárással, és dATP32 és S35dATP (Amersham, Nagy-Britannia) jelzést alkalmazunk.
A 2. ábrán az SKC-2 bázisszekvenciából származó aminosavszekvenciát és az SKC (Maike és munkatársai, 1986), SKA és SKG (Water, F. és munkatársai, 1989) gén által meghatározott szekvenciákat hasonlítjuk össze.
A pEKG3 plazmidot számos E. coli törzsbe, mint például W-3110-be, JM-101-be, LE392-be és MC-1061be transzformáljuk, és összehasonlítjuk a sztreptokináz kifejezését. A legjobb eredményt a W3110 (F supF spE hsdR galk TrpR metB lacY tonA) törzzsel kapjuk, ezért ezt fermentálással szelektáljuk, amelyben a kapott sejtek összes fehérjetartalmának több mint 20%-a stabil kifejezésre kerül, így 1 liter tenyészközegre számolva 350-400 mg sztreptokinázt kapunk.
3. példa
Az SKC-2 gén élesztőben való szubklónozásához gazdaszervezetként Pichia pastoris MP36 törzset alkalmazunk, a sejtközi és szacharóz invertáz szignálpeptiddel történő sejten kívüli kifejezést a pNAO és pPS7 plazmidból végezzük; a gén szubklónozást mindkét esetben az alkohol-oxidáz (AOX) promoter ellenőrzése alatt végezzük; terminátorként a 3’ végnél az S. cerevisiae gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz gén terminációs szignálját és az élesztőgenom homológ integrálására az AOX gén egy kódoló 3’ régióját alkalmazzuk; és emellett az MP36 his törzs szelektálásra alkalmazott hisztidin 3 kódoló génre is támaszkodunk.
A pPESKC4 vektort (a fehérjesejten kívüli kifejezésére alkalmas plazmid) a pPS7-NcoI-Sl vektor szerkezetből kapjuk, amit pEKG3-ból PCR-eljárással SK2 oligonukleotiddal és egy új printerrel, amely a gén 5’ végével hibridizál, és a baktériumban történő kifejezésre beépített ATG-t megszünteti, amplifikált SKC-2 génnel ligáljuk nukleáz-foszfatáz segítségével. Sejtközi kifejezéskor a pNAO-NcoI-EcoRI-Sl vektorból nyert pPISKC-6-t (a fehérje sejtközi kifejezésére alkalmas plazmid) olyan SKC-2-vel ligáljuk nukleáz-foszfatáz segítségével, amelyet az SK2 és SK3 primerekkel PCR-rel amplifikáltunk; és így pontosan a sztreptokinázt az 5’ végénél ATG-vel kódoló gént kapjuk (3. ábra). Mindkét plazmidot a Cregg, J. és munkatársai, 1985 által ismertetett eljárással, MP36 his törzsbe transzformáljuk.
A pozitív kiónok vizsgálatát „Southern folt” eljárással (Maniatis és munkatársai, 1982) végezzük; a megfelelő felépítésű, legjobb hozamú szerkezeteket tekintjük jellemző termékeknek.
A P. pastoris sejten kívüli kifejezésével kapott rekombináns sztreptokináz mennyisége 1 liter tenyészfelülúszóra számítva 1-1,2 g, míg sejtközi kifejezés esetén több mint 1,0 g.
Sejten kívüli kifejezéskor a glikozilezett fehérje molekulatömege több mint 67 000 dalton, ami a Western-féle hibridizálás szerint endoglükozidáz H-val végzett emésztéskor az eredeti sztreptokináz molekulatömegére csökken. Az emésztést úgy végezzük, hogy egy 0,05 mólos, 5,5 pH-jú nátrium-citrát-oldatban 1 mg/ml koncentrációjú oldatot SDS-sel (végkoncentráció: 0,02 tömeg%) denaturálunk, majd 10 percig 100 °C-on melegítünk, ezután szobahőmérsékletre hűtünk; az így kapott oldathoz hozzáadunk 20 milliegység (mU) endoglikozidáz H-t (endoH), 16 órán át 37 °C-on tartjuk, ezt követően 100 °C-on 5 percig melegítjük, majd 10 mU endoH-t adunk hozzá, 12 órán át 37 °C-on inkubáljuk, és a kapott elegyet 12,5 tömeg%-os poliakrilamid gélre visszük, és összehasonlítjuk a nem deglikozilezett mintával.
A Pichia pastorisban előállított sztreptokináz mindkét esetben megtartja biológiai aktivitását, nem változtatja plazminogénaffinitását, és a fehérje klinikai gyógyszerként való alkalmazásának egy másik változatát képezi.
4. példa
Az SKC-2 gén termékének biológiai hatásvizsgálatát patkányok akut és szubakut toxikológiai vizsgálatával, baktériumból és élesztőből nyert tiszta rekombináns sztreptokináz alkalmazásával végeztük. Az így kapott eredmények azt mutatják, hogy a termék humán- és állatgyógyászati célokra egyaránt alkalmazható. A termék in vivő fibrinolitikus aktivitását állatok klinikai vizsgálatával igazoltuk. A kutyákkal lefolytatott kísérletben a koronáriás és a combartériákban végzett vérrögoldás sikeres volt, a vérparaméterek hasonlóak lettek, mint a hasonló termékekkel végzett kísérletek irodalomban közölt értékei.
Az SKC-2 gén termékének fajlagos aktivitása 50 000-100 000 IU/mg. Ezt a jellemzőt agaróz-fibrin lemezeken (Astrup és munkatársai, 1952), kromogén szubsztráton (Friberger és munkatársai, 1982), valamint in vitro vérrögroncsolással (Westlund és munkatársai, 1985) mértük.
5. példa
Az SKC-2 gén bázisszekvenciából származó aminosavszekvencia igazolására végzett elemzéshez fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával vizsgáljuk a nagy tisztaságú terméket. A kromatografálás körülményei:
- C8 4,6 χ 250 mm kolonna (Baker, USA);
- 0%-os B pufferrel 5 perc gradiens;
90%-os B puffering 55 perc gradiens,
A puffer: trifluor-ecetsav (TFA, Pierce, USA),
0,1 tömeg%-os desztillált vízben, és B puffer: TFA, 0,5 tömeg%-os acetonitrilben (Lichrosolv, Merck, Németország);
- áramlási sebesség: 0,8 ml/perc.
A nagy tisztaságú fehéije SKC-2 gén bázisszekvenciájából származó aminosavszekvenciáját tömegspektrométeres szekvenálással határozzuk meg.
Erre a célra a fehérjét különböző enzimekkel és ezek kombinációival emésztésnek vetjük alá. Az alkalmazott enzimek: kimotripszin, Glu-C endoproteináz, Lys-C endoproteináz és tripszin.
A különböző enzimes emésztésekkel kapott peptidek külön-külön felvett tömegspektrumából szuperpo6
HU 216 073 Β nálással megszerkesztjük a fehérje aminosavszekvencia-térképét. Ezzel a vizsgálattal igazolhatjuk, hogy az SKC-2 szekvencia és a kapott fehéije-aminosavszekvencia egymással 100% összhangban van.
Törzsletét
A W 3110 E. coli törzsön alapuló pEKG3 plazmidot tartalmazó E. coli HSK.-M (pEKG3) törzs letétbe helyezése: 1990. június 11., Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Beám, Hollandia; letétbe helyezési száma: CBS 243.90.
Az MR36 Pichia pastoris törzsön alapuló, pPESKC-4 plazmidot tartalmazó törzs letétbe helyezése: 1990. június 11., Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baam, Hollandia; letétbe helyezési száma: CBS 244.90.
Szekvencialista
Szekvenciaazonosítási szám: 1
Szekvencia típusa: nukleotid megfelelő fehérjével
Szekvenciahossz: 1245 bázispár
Láncfajta: egyszeres
Szerkezeti felépítés: lineáris Molekulatípus: genom DNS Eredeti forrásszerkezet: Streptococcus equisimilis, a Langfield-féle meghatározás szerinti C típus
A kísérletnél alkalmazott forrás: ATCC-9542 törzs Jellemzők: 1 -1245 bp között érett peptid Tulajdonságok: - sztreptokináz gén
- a géntermék humán plazminogénhez kapcsolódik
- a géntermék egy humán plazminogén aktivátor
ATT Ile 1 GCT GGA CCT GAG TGG CTG CTA GAC CGT CCA TCT GTC AAC AAC AGC 48
Ala Gly Pro Glu 5 Trp Leu Leu Asp Arg 10 Pro Ser Val Asn Asn 15 Ser
CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT GTT GAG GGG ACG AAT CAA GAC 96
Gin Leu Val Val Ser Val Ala Gly Thr Val Glu Gly Thr Asn Gin Asp
20 25 30
ATT AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATT GAC CTA ACA TCA CGA CCT GCT CAT 144
Ile Ser Leu Lys Phe Phe Glu Ile Asp Leu Thr Ser Arg Pro Ala His
35 40 45
GGA GGA AAG ACA GAG CAA GGC TTA AGT CCA AAA TCA AAA CCA TTT GCT 192
Gly Gly Lys Thr Glu Gin Gly Leu Ser Pro Lys Ser Lys Pro Phe Ala
50 55 60
AVT GAT AGT GGC GCG ATG CCA CAT AAA CTT GAA AAA GCT GAC TTA CTA 240
Thr Asp Ser Gly Ala Met Pro His Lys Leu Glu Lys Ala Asp Leu Leu
65 70 75 80
HU 216 073 Β
AAG GCT AAT CAA GAA CAA TTG ATC GCT AAC GTC CAC AGT AAC GAC GAC 288
Lys Alá Ile Gin Glu 85 Gin Leu Ile Alá Asn Val 90 His Ser Asn Asp 95 Asp
TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ACT GAT CGA 336
Tyr Phe Glu Val Ile Asp Phe Alá Ser Asp Alá Thr Ile Thr Asp Arg
100 105 110
AAC GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT GGT TCG GTA AAC TTG CCG 384
Asn Gly Lys Val Tyr Phe Alá Asp Lys Asp Gly Ser Val Thr Leu Pro
115 120 125
ACC CAA CCT GTC CAA GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA 432
Thr Gin Pro val Gin Glu Phe Leu Leu Ser Gly His Val Arg Val Arg
130 135 140
CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AAT CCA GCG AAA TCT GTT GAT GTG 480
Pro Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Gin Asn Gin Alá Lys Ser Val Asp Val
145 150 155 160
GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CCC TTA AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA 528
Glu Tyr Thr Val Gin Phe Thr Pro Leu Asn Pro Asp Asp Asp Phe Arg
165 170 175
CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAG CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC 576
Pro Gly Leu Lys Asp Thr Lys Leu Leu Lys Thr Leu Alá Ile Gly Asp
180 185 190
ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC 624
Thr Ile Thr Ser Gin Glu Leu Leu Alá Gin Alá Gin Ser Ile Leu Asn
195 200 205
HU 216 073 Β
AAA ACC Lys Thr CAC His CCA GGC TAT ACG ATT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC 672
Pro Gly Tyr Thr 215 Ile Tyr Glu Arg Asp 220 Ser Ser Ile Val
210
ACT CAT GAC AAT GAC ATT TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG 720
Thr His Asp Asn Asp Ile Phe Arg Thr Ile Leu Pro Met Asp Gin Glu
225 230 235 240
TTT ACT TAC CAT GTC AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT GAG ATC AAT AAA 768
Phe Thr Tyr His Val Lys Asn Arg Glu Gin Alá Tyr Glu Ile Asn Lys
245 250 255
AAA TCT GGT CTG AAT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GAC CTG ATC TCT GAG 816
Lys Ser Gly Leu Asn Glu Glu Ile Asn Asn Thr Asp Leu Ile Ser Glu
260 265 270
AAA TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC TTT GAT 864
Lys Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Phe Asp
275 280 285
CGC AGT CAC TTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC AAC AAC 912
Arg Ser His Leu Lys Leu Phe Thr Ile Lys Tyr Val Asp Val Asn Thr
290 295 300
AAC GAA TTG CTA AAA AGC GAG CAG CTC TTA ACA GCT AGC GAA CGT AAC 960
Asn Glu Leu Leu Lys Ser Glu Gin Leu Leu Thr Alá Ser Glu Arg Asn
305 310 315 320
HU 216 073 Β
TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT
Leu Asp Phe Arg Asp Leu Tyr Asp
325
TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT
Tyr Asn Asn Leu Asp Alá Phe Gly
340
AAA GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC
Lys Val Glu Asp Asn His Asp Asp
355 360
ATG GGC AAG CGA CCC GAA GGA GAG
Met Gly Lys Arg Pro Glu Gly Glu
370 375
GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA
Asp Lys Asp Arg Tyr Thr Glu Glu
3Θ5 390
CGT TAT ACA GGG ACA CCT ATA CCT
Arg Tyr Thr Gly Thr Pro He Pro
405
Szekvenciaazonosítási szám: 2
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 26 bázis
TGGAATTCAT GAAAAATTAC TTATCT
Szekvenciaazonosítási szám: 3
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 28 bázis
TGGATCCTTA TTTGTCGTTA GGGTTATC
Szekvenciaazonosítási szám: 4
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 31 bázis
GGAATTCATG ATTGCTGGAC CTGAGTGGCT G
CCT CGT GAT AAG GCT AAA CTA CTC 1008
Pro Arg Asp Lys Alá Lys Leu Leu
330 335
ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA 1056
He 345 Met Asp Tyr Thr Leu Thr Gly 350
ACC AAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT 1104
Thr Asn Arg He Ile Thr Val Tyr 365
AAT GCT AGC TAT CAT TTA GCC TAT 1152
Asn Alá Ser Tyr His Leu Alá Tyr 380
GAA CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG 1200
Glu Arg Glu Val Tyr Ser Tyr Leu 395 400
GAT Asp 50 55 60 AAC CCT AAC GAC AAA TAA 1245 Asn Pro Asn Asp Lys 410 Szekvenciaazonosítási szám: 5 Szekvencia típusa: nukleotid Szekvencia hossza: 17 bázis ATCATCGAAC TAGTTAA Szekvenciaazonosítási szám: 6 Szekvencia típusa: nukleotid Szekvencia hossza: 17 bázis GAATCAAGAC ATTAGTC Szekvenciaazonosítási szám: 7 Szekvencia típusa: nukleotid Szekvencia hossza: 15 bázis GTGGCGCGAT GCCAC
HU 216 073 Β
Szekvenciaazonosítási szám: 8
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 17 bázis
GCAACCATTA CTGATCG
Szekvenciaazonosítási szám: 9
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 17 bázis
CCAGTACAAA ATCAAGC
Szekvenciaazonosítási szám: 10
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 17 bázis
CTAGCTATCG GTGACAC
Szekvenciaazonosítási szám: 11
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 15 bázis
CAGAGATCAG GTCAG
Szekvenciaazonosítási szám: 12
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 16 bázis
GTTAAGAGCT GCTCGC
Szekvenciaazonosítási szám: 13
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 17 bázis
CCAGTTAAGG TATAGTC
Szekvenciaazonosítási szám: 14
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 16 bázis
TCTCGTTCTT CTTCGG
Irodalmak listája
Astrup, T. és Mullertz, S.: Arch. Biochem. Biophys. 40, 346-351 (1952);
Burnett, N. N.: Anal Biochemistry 112, 195-203 (1981);
Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. és Madden, K. R.: Mól. Cell. Bioi. 5, 3376-3385 (1985);
Dagert, M. és Ehrlich, S. D.: Gene 6, 23-28 (1974); Dykewicz, M. S., McGrath, K. G., Harris, K. E. és
Patterson, R.: Int. Arch. Allergy Appl. Immun. 78, 386-390(1985);
Estrada, Μ. P., Hemández, O. és de la Fuente, J.: Interferon y Biotechnológia 5, 152-156;
Fiberger, P.: J. Clin. Láb. Invest. 42, Suppl. 162, 49-54 (1982);
Hanahan, D.: J. Mól. Bioi. 166, 557-580 (1983); Huang, T. T., Maike, H. és Ferretti, J. J.: Molec.
Microb. 3(2), 197-205 (1989);
Maike, H. és Ferretti, J. J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
57,3557-3561 (1984);
Maike, H., Roe, B. és Ferretti, J. J.: Gene 34, 357-362 (1985);
Maniatis, T., Frisch, E. F. és Sambrook, J.: Cold Spring Harbor Laboratory, USA (1982);
McGrath, K. G., Zeffren, B., Alexander, J., Káplán, K. és Patterson, R. J.: Allergy Clin. Immunoi. 76, 453-457 (1985);
Muller, J., Reinert, H. és Maike, H.: Journal of Bacteriology, Apr., 2202-2208 (1989);
Randall, K., Gelfond, D. H., Stoffel, S., Scharf, S., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis K. B. és Erhlich, H. A.: Science 239, 487-491 (1988);
Sanger, F., Nickler, S. és Coulson, A. K.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977);
Tombin, H., Stahelin, T. és Gordon, J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 (1979);
Walter, F., Siegel, M. és Maike, H.: Nucl. Acids. Rés. 77(3), 1262 (1989);
Westtund, L. E. és Andersen, L. O.: Thrombosis Re35 search 37, 213-223 (1985).

Claims (16)

1. Eljárás sztreptokináz előállítására sztreptokinázt kódoló gén kifejezésével, azzal jellemezve, hogy egy gazdasejtet sztreptokináz gént (SKC-2) tartalmazó kifejezővektorral transzformálunk, ahol a gén nukleotid szekvenciája lényegében
ATT GCT GGA CCT GAG TGG CTG CTA GAC CGT CCA TCT GTC AAC AAC AGC 48 CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT GTT GAG GGG ACG AAT CAA GAC 96 ATT AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATT GAC CTA ACA TCA CGA CCT GCT CAT 144 GGA GGA AAG ACA GAG CAA GGC TTA AGT CCA AAA TCA AAA CCA TTT GCT 192 AVT GAT AGT GGC GCG ATG CCA CAT AAA CTT GAA AAA GCT GAC TTA CTA 240 AAG GCT AAT CAA GAA CAA TTG ATC GCT AAC GTC CAC AGT AAC GAC GAC 288 TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ACT GAT CGA 336
HU 216 073 Β
AAC GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT GGT TCG GTA AAC TTG CCG 384 ACC CAA CCT GTC CAA GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA 432 CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AAT CCA GCG AAA TCT GTT GAT GTG 480- GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CCC TTA AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA 528 CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAG CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC 575 ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC 624 AAA ACC CAC CCA GGC TAT ACG ATT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC 672 ACT CAT GAC AAT GAC ATT TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG 720 TTT ACT TAC CAT GTC AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT GAG ATC AAT AAA 768 AAA TCT GGT CTG AAT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GAC CTG ATC TCT GAG 816 AAA TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC TTT GAT 864 CGC AGT CAC TTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC AAC AAC 912 AAC GAA TTG CTA AAA AGC GAG CAG CTC TTA ACA GCT AGC GAA CGT AAC 960 TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GCT AAA CTA CTC 1008 TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA 1056 AAA GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACC AAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT 1104 ATG GGC AAG CGA CCC GAA GGA GAG AAT GCT AGC TAT CAT TTA GCC TAT 1152 GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAA CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG 1200 CGT TAT ACA GGG ACA CCT ATA CCT GAT AAC CCT AAC GAC AAA TAA 1245
és működőképesen egy hatásos promoterhez és transzkripciós terminátorhoz kapcsolódik, majd a transzformáit gazdasejtet tenyésztjük és a termelt sztreptokinázt izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ATCC-9542 C típusú Streptococcus equisimilis törzsből izolált SKC-2 gént alkalmazunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szignálpeptidet kódoló szakasztól mentes SKC-2 gént alkalmazunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szignálpeptidet kódoló szakaszt tartalmazó SKC-2 gént alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként baktériumot alkalmazunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként Escherichia colit alkalmazunk.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként Escherichia coli W3110 törzset alkalmazunk.
8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejezővektorként működőképesen Escherichia coli triptofán promoterhez és T4 transzkripciós terminátorhoz kapcsolódó SKC-2 gént tartalmazó plazmidot
45 alkalmazunk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejezővektorként Escherichia coli CBS 243.90 törzsben található pEKG3 plazmidot alkalmazunk.
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez50 ve, hogy gazdasejtként élesztőt alkalmazunk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztőként Pichia pastorist alkalmazunk.
12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztőként Pichia pastoris MP-36 his törzset
55 (CBS 244.90) alkalmazunk.
13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejezővektorként működőképesen Pichia pastoris alkohol-oxidáz promoterhez (AOX1) és Saccharomyces cerevisiae gliceraldehid-3-foszfát
60 dehidrogenáz terminátor szekvenciához (GAPt) kap12
HU 216 073 Β csolódó SK.C-2 gént tartalmazó plazmidot alkalmazunk.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekciós markerként Saccharomyces cerevisiae his3 gént tartalmazó kifejezővektort alkalmazunk.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejezővektorként Pichiapastoris CBS 244.90 törzsben található pPESKC-4 plazmidot alkalmazunk.
16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez5 ve, hogy szignálpeptidet kódoló szakasztól mentes
SKC-2 gént tartalmazó kifejezővektort alkalmazunk.
HU1770/91A 1991-05-27 1991-05-27 Eljárás sztreptokináz előállítására HU216073B (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU1770/91A HU216073B (hu) 1991-05-27 1991-05-27 Eljárás sztreptokináz előállítására

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU1770/91A HU216073B (hu) 1991-05-27 1991-05-27 Eljárás sztreptokináz előállítására
CA 2043953 CA2043953C (en) 1991-06-05 1991-06-05 Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant dna and transformed microorganisms

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU911770D0 HU911770D0 (en) 1991-12-30
HUT62655A HUT62655A (en) 1993-05-28
HU216073B true HU216073B (hu) 1999-04-28

Family

ID=25674643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1770/91A HU216073B (hu) 1991-05-27 1991-05-27 Eljárás sztreptokináz előállítására

Country Status (1)

Country Link
HU (1) HU216073B (hu)

Also Published As

Publication number Publication date
HUT62655A (en) 1993-05-28
HU911770D0 (en) 1991-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5416195A (en) Polypeptide derivatives of granulocyte colony stimulating factor
KR920007666B1 (ko) 변형된 섬유소 용해제의 제조방법
RU1776276C (ru) Способ получени полипептида со свойствами гирудина
Härtlein et al. Transport of hemolysin by Escherichia coli
CA2185343A1 (en) Enhanced secretion of polypeptides
HU204563B (en) Process for producing recombinant serine-protease inhibitors and dns sequencyes for them
Wu et al. Specificity of Escherichia coli mutD and mutL mutator strains
EP0802983A2 (en) Expression of urokinase plasminogen activator inhibitors
US5728571A (en) Expression and secretion of mature human beta interleukin-1 in Bacillus subtilis and means and methods for its achievement
US6248715B1 (en) Method of treating a urokinase-type plasminogen activator-mediated disorder
AU659130B2 (en) Vector
EP0251730A2 (en) Production of human lysozyme
AU644657B2 (en) Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant dna and transformed microorganisms
HU216073B (hu) Eljárás sztreptokináz előállítására
EP0218652B1 (en) A dna sequence
JPH01501996A (ja) 脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター
JP3376453B2 (ja) 糸状菌及び細菌に対する溶菌活性を有するイネキチナーゼ相補ｄｎａを含む形質転換体
HU214698B (hu) Eljárás rekombináns deszulfátó-hirudin HV-1 peptidek előállítására
AU618011B2 (en) Preparation of novel protein sweeteners-monellin type
CZ225691A3 (en) PROCESS OF ISOLATING AND EXPRESSION OF A GENE, ENCODING STREPTOKINASE, ITS NUCLEOTIDE SEQUENCES, RECOMBINANT dna AND TRANSFORMED MICRO-ORGANISMS
CA2043953C (en) Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant dna and transformed microorganisms
RU2107726C1 (ru) Фрагмент днк, соответствующий гену skc-2, способ экспрессии фрагмента днк, соответствующего гену skc-2, плазмидный вектор pek g3, обеспечивающий экспрессию фрагмента днк, соответствующего гену skc-2, плазмидный вектор pes kc-4, обеспечивающий экспрессию фрагмента днк, соответствующего гену skc-2, штамм бактерий escherichia coli, содержащий плазмидный вектор pekg3 и используемый для экспрессии гена skc-2, и стрептокиназа, полученная при использовании штамма бактерий escherichia coli hsk-m
US6515106B1 (en) Lysozyme-analogous polypeptides with an anti-microbial effect, their production and use
EP0323489A1 (en) Preparation of novel protein sweeteners
Taguchi Streptomyces subtilisin inhibitor: genetical characterization and its application

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee