PT96310B - Processo para a preparacao do promotor de transcricao da piruvato-cinase de a.niger, vectores hibridos que o contem e hospedeiros transformados com estes vectores - Google Patents

Description

Ο invento está relacionado com o campo de enqenharia genética e proporciona novas moléculas de DMA compreendendo um promotor fúngico» .As novas moléculas de DMA são úteis na construção de vectores híbridos que expressem genes íitf ^;unqos filamentoFundamento do invento

Se bem que em engenharia genética, sejam já conhecidos numerosos sistemas de expressão de polípeptxdeos para hospedeiros procarióticas e eucarióticos, existe uma necessidade contínua de novos sistemas que tenham ve.ntaqens sobre outros já conhecidos.

São largamente usado como hospedeiros células “π!

procarióticas de Esc herichia I e ved u r as, s»g ____' as células sucsnóLiuas de

Saccharomyces cerevisiae„ oara as quais foram desenvolvidos um grande número de de diferentes vectores de expressão na. sua maioria plasmídeos» A desvantagem dos hospedeiros E- coli é que eles geralmente não secretam os polipeptídeos para o meio nutritivo, mas secretam apenas para o espaço periplasmático. Hospedeiros eucarióticos superiores, tais como células cancerosas de mamífero são capazes de glicosilar e secretar para o meio nutritiva, no entanto, a sua cultura é muito lenta e dispendiosa e existe o perigo de poderem ser isolados •ácidos nucleicos oncogénicos juntamente com o -peptídeo pretendido»

Na procura de- outros hospedeiros, foram estudados fungos filamentosos tais como Neurospora crassa, Aspergi 11 us nldulans e Aspergi1lus niger» A sua aplicação em engenharia genética tem ficado para trás principalmente devido à ausência de um sistema de transformação adequado» Ao contrário de Saccharomyces cerevisiae os funqos filamentosos não contêm

naturalmente plasmídsos que possam ssr usados para a introdução de genes estranhos» é no entanto possível transformar fungos filamentosos com plasmídsos estranhos contendo uma. marca seleccionável» Sua.se todos os vectores até agora descritos para os fungos filamentosos não se replicam autónomamamente, enquanto a maior parte dos das leveduras □ fazem, mas antes são integrados no cromossoma do fungo» Ss hem que este acontecimento ocorra apenas com uma frequência muito baixa, com vantagem a transformação integrativa torna os transformantes mitóticamente estáveis, mesmo em condições não selectivas» Foi descrita a integração de mais de uma centena de cópias» primeiro vector descrito para fungos filamentosos continha o gene qa—2 de Nau,rospora crassa como marca selectiva. [Case, M»E», Bchweizer» M« Kushner, S»R»

Proc» Natl» Acad» Sei» USA 76, 5259-5263? Case, M.E.

Siles, M»H» (1979) em?

Senetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A», De Moss, D», Kaplan, 8», Konisky, J» Savaqe, D» e Nolfs, , eds»> pp» 8/-100, Plsnuml»

Em Asoergi1lus nidulans que tem um ciclo sexuado e é portanto adequado âs manipulações genéticas, foram identificados sistemas de selecçSo positiva e negativa baseados em marcas auxotróficss ou marcas ds selecção dominante» (Ballance et al», BBRC í 12,, 284, 1983? Timberlake, J. Cell Biochem» Suppl» 9C, 173, 1985? Johnstone et al „ » EMBO J» 4, 1307» 1983? Tilburn et al» » Serie 26, 205, 1983? Wemars et al», Curr» Senet» 9, 361, 1985? Kelly, J,,N» et al», EMBO J» 4, 475, 1985)»

Comparada com N. crassa ου. A, nidulans, A. niqer é de longe o organismo mais importante umas vez que è o mais usado na produção industrial de enzimas, alimentar» A» niqer secreta na indústria, de enzimas e»g» para usar u m a v a r i e d a d e

hidrolíticas, e = g» glucoamilase, a-amilase, pectinase, celulase, p-giucanase, p-galactosidase, naringinase, pentosanase, protease ácida e linhinase, o complexo de glucoamilase e pectinase sendo os mais importantes»

Os processos clássicos de mutação e seiseção em A, niqer conseguiram grandes melhoramentos de estirpes na secreção de enzimas hidrolíticas» A. niqer não tem um ciclo sexuado conhecido» As mutações podem ser combinadas apenas via recombinação meiótica em diplóides selsccionados seguido de haploiainação» pene heteróloqo amds (Kelly e Hymes, EMBu J» 4.

1985) e o gene arqB CBuxton et al,, iõene 57 438? WO 86/06097), ambos obtidos a partir de gene homólogo pyrA ívan Hartingsvsldt et

1985? EP

475. í tí^z ai

A» nxdulans, ou o , Mol» Sen» Senet»

20671-75, 1987? Soosen et al« , Curr» Genet» 11, 499-503, 1987) •foram usados como marca selectiva para a transformação de A» niqer»

A» niqer é o organismo mais importante para a produção industrial de enzimas degradativas de pectina, e»g = poligal-acturonsses, pectina-liases ou pectina-estearases»

H = poligalacturonase e suas misturas de enzimas no processamento de fruta e vegetais (Tabela 1) foram desenvolvidos a partir da utilização original de enzimas pécticas no tratamento de frutos moles para assegurar elevados rendimentos ds sumo e pigmentos quando da prensagem e da clarificação de sumos brutos de prensagem» As preparações técnicas de enzimas para usar nestes processos contêm pectina-estearases» poligalacturonases e pectina-liases em quantidades variáveis juntamente com outras enzimas tais

cansses, gl icosidases e proteases..

TABELA 1 (retirado de Voragen, A«S=J„_? Food enzymess prospects and limitations. Eros J.P. Roozen et al,, eds», Food Sciences Basic Research for Technological Progress» PlíDOCWagen ingen, The Netheriands, 19B9)s Utilização de poligalacturonases e suas misturas na indústria de frutas a vegetais»

ENZIMAS

UTILIZftçSD

Po1iga1ac turonase

Pectinesterase + Poligalacturonase e/ou Pec tina1iase

Pec tinestearase/Poligalacturonase/ /Pectina1iase ·+· (Hemi-) Celulases Ce1u1ases ©•s-teabi 1 i zscMo/r©ducSo d-s viscosidase ds sumos de citrinos

Clarificação de sumos, extracção de sumos/óleo, óleo da pele ds citrinos, lavagem da polpa de cítrinos

Liquefacção, sumos 1írapidos/turvos Aumento da extracção do produto natural Va1ori zação de b i osiassa / a1i men to («ui-Acas e celulolíticas as paredes celulares- das polpas das Trutas podem ser degradadas até ao estado de quase liquefação- completa» A presença de ΣΟϊΤίΟ de enzimas endo- e exo-|s-í,4 glucanases (celulases) assim pêcticas é essencial (ref» Renard C»M»C»6» Protopectins preliminary study of enzymatic Roozen J»P„ et al», eds», Food

Technological Progress. PUDQC,

1989)» ócίence! Basic Waqeningen, The et ai., Apple e x t ra c t i on = Eros c Research for Nether1ands,

úteis para a liquefação s sacarificação de biomassa, por exemplo, para a -produção ds polissacáridos fermentáveis a partir de células vegetais (Beldman, 8» et al», Enzyme Micros» Tecbnol. 6, 503-507, 1984) ou para a modificação de pectinas (para revisão ver Voragem ft.G.J» Food enzymess prospects and limitations» Ems Roozen J»P» et al», op» cit»)»

Em ft, nzqer proteínas do complexo pé-ctico não expressas constitutivamente-, i»e» na seus produtos de degradação ft» niqer crsssnca ds pectina ou expressa as enzimas í dos rtr;

referidas, desde que outras fontes de carbono, tais como glucose

Devido á importância industrial de ft.__niqer e das suas enzimas existe uma necessidade contínua de novos sistemas de expressão para melhoramento da estirpe e/ou produção de produtos de genes homólogos ou heterólogos» Por exemplo é de grande interesse a produção de enzimas degradadoras de pectinas individuais ou de suas misturasdefinidas» presente invento proporciona novas moléculas de DMA compreendendo um promotor vantajoso derivado do gene da piruvato-cinase (pki) de ft» niqer o qual pode ser usado na construção ds novos vectores para a expressão ds genes estruturais homólogos ou hstréiogos sm fungos filamentosos, especialmente em ft» niqer» □ gene codificador da piruvato-cinase ds ft, niqer ínome sistemático ATPspiruvato-fosfotransferase, EC2»7=1»4@) é altamente expresso, indicando que a transcrição está sob o controle de um promotor forte» íi 0 )

5Kb do

Clonou-se um fragmento de restrição Bgl11/Hindi 11 de genoma de A.-, niger N 4Θ® que hibrida com um fragmento da região codificadora do gene da piruvato-cinase de levedura» 0 clone resultante foi designado pSWÍ10@« As experiências de cotransformação com o plasmídeo pSW613 compreendendo o gene pyrft como marca selsctiva s com pSWílOO conduzirão a níveis aumentados de piruvato-cinase em oito ds onze transformantes -estudados» A partir destes resultados concluiu-se que pSWií££ codifica a piruvato-cinase de A»_niger e contem o gene funcional completo

C!_»H« de Sraaff, The structure and expression of the pyruvate kina.se gene of Aspergi Ilus nidulans and Aspergi Ilus niger, Ph.D, Thesis, Agricuítural University of Waganingen, 1989)»

Partindo destes dados desenvolveram-se novas moléculas de DNA compreendendo o promotor pki no presente invento e foram usadas na construção de novos vectores de expressão para a super-produção de um produto de gene homólogo, e»g, pectina~lia.se, ou para a expressão de um gene estrutural heterólogo em A„ niger, e«g» um gene de interferão»

OBJECTO DO INVENTO

Os objectivos do invento são novas moléculas de DNA compreendendo o promotor pki de A,niqer, vectores híbridos úteis para a expressão de genes estruturais sob o controle do referido promotor, hospedeiros transformatíos com os novos vectores híbridos e processos para a produção das novas moléculas ds DNA, vectores híbridos e hospedeiros transformados e para a produção de polipeptídeos recombinantes por meio dos referidos hospedeiros transformatíos»

' · ,_τ' - ,ί 3 ΰ >

DE DNA COMPREENDENDO O PROMOTOR DA PIRUVATO-CINAS

DE

A, NISER ramotor ds. pir uvana molécula ds DNA ncia de identifica— ou fragmento com

O presente invento diz respeito ao ρ to-cinase (pki ) de A, niqer que está inserida que tem a sequência, de nucleótidos com a. sequê ção NS (SES ID NO.) 1_? ou um seu derivada actividade de promotor.

A sequência de nucleótidos com s. SES ID NO»1 compreende todo o gene funcional da piruvato-cinase (pki) de A, niqer incluindo o promotor, 0 promotor pki prolonga—se da posição de nucleótidos 1 até ao primeiro nucleótitío da. região codificadora da piruvato-cinase na posição 1Q42, 0 promotor pki liga-se à RNA-pelimere.se assim como às proteínas reguladoras e pode controlar a expressão de um gene estrutural operacíonalmsnte ligado a ele» 0 promotor de pk.1 de A, niqer é um promotor forte» 0 invento diz portanto respeito a uma molécula de DNA da sequência de nucleótidos que se estende da posição 1 até à posição 1042 ou

AÍS fragmento ou derivado deste promotor retend* promotor que pode ou não ser regulada.

uma actividade de promotor pki completo de A, niqer pode ser regulado pois compreende elementos reguladores que tornam o nível da transcrição dependente da fonte de carbono usada na cultura das cé'lulas de A, niqer compreendendo o referido promotor» A utilização de uma fonte de carbono gluconeogénica como seja acetato conduz a um nível de expressão baixo enquanto que a utilização de uma fonte de carbono glicolítica, e.g» glucose, conduz a um nível de transcrição elevado»

No promotor contido na sequência de nucleótidos com ShS ID NO»Í uma potencial caixa T.ATA está situada entre as posições

V .de nucleótidos 92/ e 9ó4, uma potencial caixa Cftft! entre as posições 83© s 836 e grandes extensões ricas em CT (blocos CT) entre as posições 848 e 1041» Esta última pode ser encontrada, no promotor/regiões de regulação ds muitos genes altemente expressos derivados de leveduras e de fungos»

Um fragmento do invento ê por exemplo um fragmento seleccionado do grupo de fragmentos com actividade de promotor que começa com qualquer um dos nucleótidos na posição í atê atê creca da. posição 950 e terminando com um nucleótido por volta da õçSo 1041 na sequência de nucleótidas com SEQ ID NO»Í» preferido um fragmento começando con? um nucleótido por volta, da. posição 300 e terminando com um nucleótido por volta da. posição Í041na referida sequência de nucleótidos» Os fragmentos do invento podem por exemplo começar num sitio de clivagem por enzimas de restrição situado dentro da sequência de nucleótidos com a tíEQ ID NO.Í, e.

o sítio BamHl (por volta da posição 300) ou nos sítios seguintes (posições aproximadas entre parêntesis)s Sphl (441), Smai (859), Xmal (859)»

Um fragmento preferido é o fragmento que começa no sítio BamHl por volta da posição 300 e prolonga—se até á posição 1041» Este fragmento s parte do fragmento BamHI/Pvu.II que se estende desde o sítio BamHí por volta da posição 300 até ao sítio PvuII por volta da posição 1352 e que é usado daqui em diante nos exemplos para inserção ds um sítio de clivagem por enzimas de restrição.

Um derivado de acordo com o invento ê, por exemplo, um mutante, um derivado recombinante ou um derivado recombinante de um mutante do promotor pki contido na molécula ds DNA tendo a sequência de nucleótidos com SEQ ID IMO.l ou de um seu fragmento» i

Um derivada de acorda cora o invento compreende unia actividade de promotor pki que pode ou n'S.c pr ϋ&'ϊtubi «πιε·, sequência com „_req_Ux_aij_De

Um mutante de acordo com o invento pode ser um mutante natural ou preferenciaImente um mutante artificial» Os mutantes do promotor pki do inventa são em particular os que têm novos sítios de clivagem por enzimas de restrição, por exemplo para as enzimas de restrição Nsil, BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, Sall, Ncol e similares» έ preferido um mutante compreendendo um novo sítio de clivagem por enzimas de restrição por volta, da posição 1041 da sequência com SEQ 1D Ν0»1, o qual pode ser usado para a inserção de um gene estrutural 3^? relativamente ao promotor o qual é então operacional men te ligado a. ele» Tal mutante é por exemplo caracterizado por a sequência de nucleótidos com SEQ ID N0»2 substituir a sequência que se estende entre a posição 1034 e 1054 na sequência da nucleótidos com SEQ ID ND.l e por um sítio Nsil estar situado imediatamente adjacente à posição 1041 de SEq ID iMO.l»

Um mutante de acordo com o invento é também um mutante de um fragmenta a significado do qual foi aqui dado anteriormente» Um mutante preferido de um fragmento compreende um novo sítio de clivagem por enzimas de restrição a jusante do promotor pki para ligar operacionalmente um gene estrutural ao promotor» Tal mutante preferido ds um fragmento está por exemplo compreendido no fragmentoBamHI/PvuII de 1053 pb ou no fragmento BamHI/Nsil de 742 pb contido no DMA RF de M13mplQ-PK (BamHI-Nsil-PvuII)» 0 fragmento BamHI/PvuII de 1053 do M13mp-18-PK CBamHI-Nsil-PvulI) tem uma sequência de nucleótidos estendendo-se desde o sítio BamHI por volta da posição 300 até ao sítio PvulI por volta, da posição 1352 de uma sequência com SEQ ID MQ.l o qual foi mutagenizado por a sequência SEQ IE* NO»2 substituir os nucleótidos desde a posição 1034 até à posição 1054» 0 fragmentoBamHI/NsiI de

2

p 0 λ

742 pb estende-se desde o referido sitio BamHI até ao sítio Nsil na região substituída. Em ambos os mutantes um sitio Nsil está situado imediatamente adjacente à posição 1041 de SEQ ID NO.Í.

Um derivado de acordo com o invento é também uma molécula de DNA recombinante. Tal molécula de DMA recombinante é caracterizada, por exemplo, por conter um oligonucleótido adaptador ligado ao extremo 3^? e/ou 5’ de uma molécula de DNA do invento com actividade de promotor pki que proporciona uma ligação com êxito a outras moléculas de DNA_? e.g. sequências de vsctores, 0 adaptador pode compreender um ou mais sítios ds clivagem por enzimas de restrição e/ou extremos parcialmente de cadeias simples (extremos coesivos) e/ou extremos csrses.

Um derivado de acordo com o invento é também uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma molécula de DNA do invento com f 1 FÍJ2

?.de do oromotor pki e um qene estrutural homólogo ou heterálogo com ou sem intrões, o qual está operacionalmente ligado ao promotor pkí e facultativamente um oliqonu— cleótido adaptador. Um derivado de acordo com o inventa pode compreender uma outra sequência de controle da expressão em adição ao promotor pki que está também operacionalmente ligado ao referido gene estrutural. Tal sequência de controle da expressão é por exemplo um potenciador, região de ligação ao in:

Uma lação ou um rioossoma·, um sitio oe sítio de terminação da tradução ou uma sequência sinal_s s.g. uma sequência sinal de um gene da pectina-Iisse de A. nioer, e.g, para o gene PLA, B₅ C ou D_? ou para o gene da poligalacturonase., e,q» PGI, PSC ou PGII.

Senes estruturais homólogos são aqueles que derivam de A. niger. Eles são codificadores por exemplo ds enzimas_? preferencialments as que são úteis na indústria.,

e.g 'ídústria alimentar ε pec tino litic:

1ac turonase arabinases.

de rações» Tais enzimas são por exemplo enzimas ts tais como pectina—esteara.se» endo— e exo—poliqa— giicusidases e similares» < PS), pec tina-1 iase C PL) ₅ a1ac tanases, x i1anases, ce1u1 ramnoqa1ac turonase ou ases, 1 = 4 g 1 ucartasss,

A sequência de nucleótidos do qene estrutural codificador de PL.D de A» niqer peia com a publicação estã descrito no pedido de Patente EuroNS EP-A2-0 278 355« Os penes estruturais para outras PLs ds A»_niqer„ particularmente PLA» estão descritos no Pedido de Patente Europeia com a publicação N2 EP-A2-® 353 188« Os genes estruturais para PSs ds A»____niqer, particularmente PBII, estão descritos no Pedido de Patente tíd com o Pedido MS 8919884=0«

Células E« coli HBÍ01 ou JM1©9 transformadas com os plasmídeos pGI4 82©, 83©, 85© e 18©© compreendendo ganes estruturais de A» niqer« foram depositadas de acordo com o Tratado de Budapeste na Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen., Mascheroder Weg ib. D—33©β Braunschweig. As sequências de nucleótidos das partes do qene estrutural para PSII que codificam os extremos M e C_s respectivamente, estão descritas na listagem de sequências» Para mais informação ver Tabela 2»

sabela 2

I J	1		i	1 s
jBene estn	jtural|	E, coli Transformada	jDepósito NS	| SEU ID NO» j
| para j	I		i i 1 ... ................	1 í i 1 I i
í	{		f	{ i
1 PLA í	1	HB1©1/pSW82©	1 DSM 4388	1 i
J PLB	i	HBí©í/pSWS30	i DSM 4389	1 1
| PLC	J	HB101/pSW850	j DSM 4390	ί i ! ί
| PGII	j	J Μ109/pGW1800	j .DSM 5505	j 3 íÍM-termina 1} j
!_	í Ϊ		1 !.	|4(N~terminal)j .... i

Ds genes homólogos dentro do âmbito do invento são também derivados dos genes PL e PS aqui referidos atrás, incluindo fragmentos, mutantes- e sequências de DMA que são geradas de acordo com o código genético por um número ilimitado de nucleótidos serem substituídos por outros nucleótidos sem alteração da sequência de aminoàcidos do polipeptideo codificado»

Senes estruturais heterólogos derivam de vírus, células procarióticas ou células eucarióticas a podem derivar de DNA qenómico ou de cDNA preparado pela via do mRNA ou podem ser sintetizados quimicamente e são codificadorss de uma larga variedade de polipeptídeos úteis, incluindo polipeptídeos glicosilados, em particular de animais eucarióticos superiores, especialmente mamíferos e mais particularmente de origem humana, tais como enzimas que podem ser usadas por exemplo para a produ-

ção de nutr	ientes e para a realiz-	d©
química, ou	de polipeptídeos que	ss j am	úteis e
tratamento-	de doenças de humanos	ou de	animais
prevenção ,	por exemplo hormonas.	pol .1. pep	tídeos c·

i mu n omod u 1 a d o r a s.

3RC virais am

-tumor a x propriedades anticorpos,

SSo exemplos d© tais genes estruturais e.g» os codificadores de hormonas tais como sscrstina, timosina, relaxina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona paratiróide, adrenocorticotropina, hormona estimuladora de melanócitos, β-lipotropina, urogastrona ou insulina, factores de crescimento, tais como factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento tipo insulina. (ISF), e.g» ISF-Ie 1BF-1I, factor de crescimento de mastócitos, factor de crescimento de células nervosas, factor de crescimento das células nervosas derivadas da. glia. ou factor de crescimento transformante íTSF), tais como IGF o: ou ΤΒΤβ, e.g. TBF0Í, 02 ou 03, hormona, de crescimento, como seja hormona de crescimento humana ou bovina, interleuquina, como seja interleuquina-í ou -2, factor inibidor da migração de macrófagos humano íMIFl, interferões, tais como interferão o: humano, por exemploexemplo interferão-uA, «B, «D ou «F, 0-interferão, gama-interíerãoou um interferão híbrido, por exemplo um interferão híbrido gíA—cíD ou «B—aD, especialmente o interferão híbrido BDBB, inibidores de proteínases tais como «í-antitripsina, SLPJ e similares, antigénios do vírus da hepatite, tais como antigénio da superfície ou do nucleóide do vírus da hepatite B ou. anfcigénio do vírus da hepatite A ou antigénio da hepatite não A-não B, actívadores do plasminogénio, tais- como activador do plasminogénio tipo tecido ou urocinase, factor de necrose tumoral, somatostatina, renina, β-endorfina, imunoglobulinas, tais como cadeias leve e/ou pesada de imunoglobulIna D, E ou S, ou imunoglobulinas híbridas humano-murganho, factores de ligação a imunoglobulina, factores de ligação á imunoglobulina E, e.g. sCB23, calcitonina, peptídeo relacionado com a calcitonina humana, factores de coagulação do sangue, tais como factor IX ou VIIIc, eritropoietina, eglina, como seja eglina C, hirudina, dessulfato-hirudina, como seja

tase humana., timidina-cinase virai, ϊϊ-lsetamase, glucose-isomerase» Qs genes preferidos são os codificadores do «-interfsrão humano ou do interferão híbrido, particularmente interferão híbrido BDBB, activador do plasminogénio tipo tecido humano (t-PA), antigénio da superfície do vírus da hepatite B CHBVsAg), factor de crescimento tipo insulina I e II, eglina C e dessulfato-hirudina, e»g» variante HV1» Numa molécula de DNA do presente invento, o presente promotor é operacionalmente ligado à região codificadora do poiipeptídeo· de forma a assegurar a expressão eTicaz do poiipeptídeo».

As moléculas de DNA do invento, incluindo seus fragmentos e derivados, podem ser usadas no despiste de bibliotecas de DNA ou de mRNA relativamente a outros DNAs ou mRNAs semelhantes»

□ invento diz respeito ainda a. vetores híbridos compreendendo como inserção uma molécula de DNA do invento compreendendo a actividade do promotor pki. As referidas moléculas de DNA do invento incluem o promotor pki, seus fragmentos ou derivados, s.g. mutantes ou a fusão de um gene estrutural aqui referido atrás com o promotor ou um seu fragmento- Os vectores híbridos do invento são utilizáveis para clonagem em hospedeiros tais como bactérias, fungos ou células animais» Tais vectores híbridos são derivados de qualquer vector útil na área da engenharia genética, tais como fagos cosmídeos, plsmídeos ou DNA cromossémico, como sejam derivados do DNA do fago lambda, e=g» NM 989, ou do fago M13, e„g» M13mpl8 ou do fago M13mpl9, plasmídeos bacterianos, e.g. p0R322, pUNX2í, pUCiS ou plasmídeos de levedura, e«g = plasmídeo 2μ de levedura ou também DNA cromóssómico, derivado e»g» de Asoerqi11 us». e»g» A» nxqer, por exemplo os proporcionados por EP 1B4 43B, ou fagos defectivos ou plasmídeos defectivos na presença de um fago auxiliar ou de um plasmídeo auxiliar

permitindo a replicação dos referidos fagos ou plasmídeos defectivos, e»g» vector M13ÍOKS na presença, de e»g« fa.go auxiliar MÍ3KÔ7»

Um vector híbrido do invento compreende, além das moléculas de DNA do invento, um sítio de replicação e caso se pretenda., um gene marcador e/ou uma sequência, de controle da expressão adicional diferente do promotor qki, e»g = um potênciador, um term.ina.dor da transcrição, uma região de ligação aos ribossomas, um sítio de iniciação ou de terminação da tradução, ou uma. sequência sinal, e«g« a. sequência sinal do gene estrutural da pectina-lisse A, B, C ou D poligalaciuronase de A» niqer,·, s»g« PBI ou II»

Um vector híbrido do invento não é pGW'11®®.

No entanto, um vector híbrido do invento pode compreender fragmentos de pGWlí®® com actividade do promotor pki« Um exemplo de tal vector híbrido ê Mi3mpi8-PK íBamHI-Pvu11 ί , o qual compreende o fragmento de restrição BamHI/pvuII de 1053 ph estendendo-se desde o sítio BamHI por volta, da posição de nucleótidos 3®0 até ao sítio PvuII por volta da posição 1352 da sequência SEQ 1.0 N0.1.

Um outro vector híbrido do invento é tal que compreenda uma. mutação no promotor pk 1 de A» niqer» A referida mutação pode gerar um novo sítio de clivagem por enzimas de restrição, particularmente um que seja adequado à inserção de um gene estrutural que ê então operacionalmente ligado ao promotor pki» Um exemplo de tal vector é em particular o M13mpí8-PK íBamHI~NsII-PvuII) que compreende uma molécula de DNA mutagenizada do invento com um novo sítio Nsii no sito de iniciação da tradução do gene estrutural da piruvato-cinase de A» niqer»

Um vector híbrido do inventa pode também compreender um gene estrutural homólogo excepto o pene estrutural da piruvsto-cinase de fi. niqer ou um gene estrutural heterólogo que está operacionalmente ligado ao promotor pfci. Tal vector híbrido é por exempla pPK-PLB que compreende a fragmento BamHI/Nsi de 742 pb do Mí3mpí8-F’K ÍBamHI-Nsi-PvuII) e o fragmento BamHI/NsiJ. de 2,6 Kb do pGWSSÔ. 0 referido vector híbrido compreende o gene estrutural codificador de PLB incluindo a sua sequência. sinal.

São vectores híbridos pPKIssIFN-2, pPK-PLB, M13mpl8-PK

CBamHI-Nsi-PvuII)» preferidos CBamHl-PvulI)_; pPKI-IFN-2,

M13mpíS-PK

EBSraoB-SKi^EjA.uiX^Râ-DOSJ^OT mLéC.UUAJBE---SNfíLE_JjQS£gailSDS^ .......REFERIDOS i£ÊISRES„iyBaiDOS □utro objectivo do invento é um processo para a. preparação de uma molécula de DNA. do invento, e,g„ um processo caracterizado pela, preparação de tal molécula, de DNA através de uma síntese in vitro ou cultura de um hospedeiro que contenha tal sequência, de DNA,

A cultura de hospedeiros é realizada num .meio nutritivo convencional que pode ser suplementado ou não com compostos químicos que permitam uma selecção negativa ou positiva dos transformantes, i»e, hospedeiros contendo a molécula de DNA pretendida juntsmsnte com uma marca selectiva, de entre os não transformantes, i,e« os hospedeiros sem a molécula de DNA pretendida.»

Pode ser usado qualquer hospedeiro transformável útil ι>>

na área, e«g» bactérias, Saccharomyces cerevisiae„ tais como E. coli, fungos, tais como ou em particular fungos filamentosos, tais como Aspergi1lus, e»g» A» nidulans, A» oryzae, A. carbonarius,, A» japonicus, A. awamori e especial mente A» niger. A transformaçao dos hospedeiros é realizada segundo métodos convencionais»

Uma molécula de DNA do invento pode ser obtida a partir ds Ásperoi11us niger contendo o gene da piruvato-cinase (pki), em particular a partir de uma sua biblioteca genómica ou também através de um mRNA usado para preparar uma molécula de cDNA»

A seguir descreve-se mais detalhadamente a de uma molécula de DMA do presente inventa»

Uma biblioteca genómica pode ser preparada e»g» por digestão parcial de DNA genómico de uma estirpe ds A» niger, e»g, NW756 ou N40€í, com e»g» Sau2-AI ou íTool e clonagem dos fragmentos de DNA de alto peso molecular num vector hospedeiro adequado, e»g» o plasmideo pUN121 de E» col1. ou um vector lambda, e»g = EMBL4„

Para fazer um despiste com 'êxito da biblioteca genómica relativamente a sequências de DNA compreendendo o pki, é necessária uma sonda de DNA hibridante» Esta pode ser uma sonda de DNA sintético ou um outro gene de piruvato-cinase ou parte dele, que hibride com o pkí de A» niger, por exemplo o gene estrutural da piruvato-cinase de levedura contido no plasmideo pPYKl CBurke et. al», 1983)»

Para fins de despiste as sondas de DNA são marcadas radioactivamente por métodos conhecidos na área, e»g» no extrema

/Λ’» //-

„ ' ΐ-' <

^¾. ->'ί Z f λ Df/¹ usando garoa^-p-ATP e cinase de T4. Os m^R^^^hismos hospedeiros portadores dos ácidos nucleicos do presente invento como uma inserção sSo identificados por hibridação com a sonda de DMA marcado era réplicas sobre filtros da biblioteca de genes. As moléculas de DNA que hibridam com a sonda são isoladas e, caso se pretenda, são subclonadas de acordo com métodos convencionais plasmideo pBWÍÍOO é um desses subclones de um clone genómico uma biblioteca em A. nlqer N4@0. Ele compreende um fragmenta BglII/HindiII do genaraa de A. niqer que compreende todo o gene funcional da piruvato—cinase ds A. niqer.

de pki ou fragmentos de gene? sequenciados. A sequência completa do identifiçados foram então pki funcional de A. niqer contida em pbWHOD está descrita na listagem de sequências com o nome SEQ ID NQ.Í.

D pl-asmídeo pBWÍiô® foi usado para preparar moléculas de E>Nft do invento. Tais moléculas de DNA são preparadas ds forma convencional aplicando enzimas ds restrição, adaptadores, processos de mutagénese, ligação, amplificação e isolamento convencionais.

ΟFragmentos· ds nucleótidos SEQ ID NO.í um método caracterizado DNA com nucleasss, e.g. endonucleasss tais coroo uroa molécula de DNA com a sequência são por exemplo, preparados de acorda pelo tratamento da referida molécula exonucleases tais coroo Bal3i ou ExoII enzimas de restrição.

de ae ou

Derivados de uma molécula de .DNA tendo a sequência de nucleótidos coro SEQ ID ND.Í ou de um seu fragmento são preparados, por exemplo, por mutagénese de acordo com métodos convencionais Lver o artigo de revisão de M.J. Zoller e M. Smith, Methods Enzymol. 10®, 468 (1983), D. Botstein e D.

1193 (1985? ou

Norri-

Um mutante contendo um novo sítio de restrição pode ser preparado usando um oligonueleótido mutagénico de acordo com métodos convencionais. Um exemplo de tal oligonueleótido mutagénico para a introdução de uma mutação na sequência com SEQ ID N0.1 é a molécula de DNA descrita em SEQ ID N0-.2»

Um derivado recombinante de uma molécula de DNA tendo a sequência de nucleótidos com a SEQ ID NG.l, de um fragmento ou de um seu. mutante pode ser preparado, por exemplo por tecnologia de DNA recombinante, e.g. por um método caracterizado pelo corte de uma tal molécula de DNA, seu fragmento ou mutante com uma enzima de restrição e/ou sua ligação a uma outra molécula de DNA» e.g. com um oligonueleótido adaptador ou com uma molécula de DNA compreendendo um gene estrutural, sequência sinal e/ou região de terminador»

Todas as moléculas de DNA do presente invento podem também ser preparadas através de uma síntese in vitro de aoordo com métodos convencionais» A síntese in vitre aplicável para a preparação de moléculas de DNA do invento pequenas « mais

Um vector híbrido do invento é preparado de acordo com métodos convencionais de engenharia genética, e.g. por um método compreendendo a ligação de um vector útil na área da engenharia genética o qual é linearizado, e.g» cortando com uma enzima de restrição, a uma molécula de DNA do invento, transformação de uma célula hospedeira adequada com amistura de ligação e identificação e/ou seleccão dos transformantes»

? 0 /’

As células hospedeiras forma ransformaâas por um método al e os transíormantes foram identifiçados e/ou selecpor exemplo, pela sua resistência, e»g» contra a na ou por comolamentação ds marcas auxotróíioas, s»q, convencion cionados, tetracicii pyrft.

Em particular os vectores de expressão descritos são amplificados em estirpes hospedeiras adequadas de E» coll, tais como HBlOíj JK109, MH1, DH5a e similares, transformadas e seleccionadas por métodos convencionais» 0 DNA ds plasmídeo amplificado foi isolado a partir de bactérias por métodos convencionais, em particular como descrito por Birnboim & Doly CNucIeic Acids Res» 7, 1513-1523, 1979)»

Uma molécula de DNA do invento ou um vector híbrido do invento, em particular compreendendo um gene estrutural homólogo ou heterólogo, pode também ser usado para transformar fungos filamentosos, tais como Aspergi1lus, Trichoderma» Penicil1ium ou

Cepha1osporium=, e.g» fi,. nidulans, A, japonicus, carbonarius, ft» awamori e especialmente A, niqer.

A,

Para se poder fazer a. sei ecção dos fungos transformados de entre os não transformados, os vectores híbridos do invento podem ser portadores de uma marca selectiva ou alternativamente, os fungos podem ser cotransfarmados com um segundo vector contendo tal marca selectiva» Tal como noutros sistemas de expressão tal marca selectiva é um gene estrutural expressâvel, o polipeptídeo expresso proporciona ao recipiente resistência contra compostos tóxicos ou completa sistemas enzimãtícos de um mutante que não possua tal polipeptídeo essencial» Tais genes marcadores são por exemplo os genes qa-2, pyrG, troCamdS ou srgB»

Coma descrita em EP 2/S.355 um gene marcador, designado pyrA, foi isolado a partir da biblioteca genómica de A» niger» o qual está relacionado e tem uma função semelhante a pyrS de A.

nldulans e pyr4 de N» crassa, nomeadamente produtor da enzima 5 orotidina ^?~fosíato descarboxila.se» Esta enzima catalisa a descarboxilação da orotidina 5^?-fosfato para ácido uridilico íuridina

-fosfsro) e também :ido τxuoro-orocico para fluoro-uridina tóxica» A partir de E« co1iBq5 i83/pC659D7 que está depositada na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen com o número de acesso DSM 3968, isolou-se o plasmídeo pC859D7 compreendendo o gene pyrA e usou-se para cotransfsctar um mutants pirA de A» niger» Tal mutante pyrA ê 5’-fosfato descarboxils.se e portanto correspondente enzima» Tais mutantes defectivo para o gene orotidina incapaz de produzir sao por exempio, nigeriM593 ou A. nigerAnS, este último está depositado ne Deutsche Sammlung von Mikroorganismen com o N2 DSM3917. Os mutantes foram preparados por tratamento de conidiósporos de A. niger com radiação UV mutagenicante e seleccionadas as colónias sobreviventes na presença de ácido fluoro-orótico e uridina» As colónias sobreviventes na presença ds ácido fluorótico e na ausência de uridina forma eliminadas» invento diz respeito ainda» a hospedeiros transformados com um vector do invento» Tais transformantes sao por exemplo ^F·· ^j~oli ou fungos filamentosos» tais como bactérias, tais come Aspergi1lus, nidulans» A» coli

Penlclllium ou Cepha1osporium e em particular a» .laponicusq A» oryzas, A. ca r bon a r i us» A» awamgri ou de preferência A» niger, e.g» A» niger

N593» niger Ana ou

Em particular é preferido E, colíJMIOl ou DH5o transformado com pPKI-IFW-2, pPKlssIFM—2 ou pPK—PLB, Aspergi11us niqer

N393 ou AnS transformado com pPK-PLB, pPKI-IFM-2 ou pPKIssIFW-2 e f acul Lativamen te cosa o plasmídeo pCB59D7.

invento diz também respeito a um método para a preparação de tais transfarroantes caracterizada pelo tratamento de um hospedeiro em condições transformantes com uma molécula de DNA recombinante ou um vector híbrido do invento, facultativamente juntamente com um gene de uma marca de selecção e» caso seja necessário, selecção dos transformantes»

PROCESSO PARA A PREPARApãO DE POLIPEPTÍDEOS invento diz ainda ainda respeito a um método para a preparação de polipeptídeos, caracterizada por um gene· estrutural codificador de um polipeptídeo, e.g» como sejam aqueles cujo significado é dado abaixo, de preferência os codificadores de um interferão a humano ou ds um interferão híbrido, particularmente o irsterferão híbrida BDBB, activador da plasrainogénio humana tipa tecido Ct-PA), antigénio de superfície do vírus da hepatite B CH.BV.sAg), factor de crescimento tipo insulina I e II, eglina C e dessulíato-hirudina, e.g» variante HVí, é operacionalmente ligada ao promotor kpi e é expresso num hospedeiro adequado» Quando necessário o polipeptídeo é isolado de forma convencional» Dependendo da construção do vector os produtos são produzidos na célula hospedeira ou, se estiver presente uma sequência sinal, são produzidos na célula e secretados » Um hospedeiro adequado é ds preferência uma. espécie de Aspergillus, e.g» A» niqer., em particular A» niqer AnS ou N593» Um hospedeiro adequado ê também um outro fungo filamentoso, e.g» Neurospora crassa, ou. uma levedura, e.g. Saccharomvces cerevisiae ou Kluweromyces lactis.

que podem é possível produzir um único produto da um gene ser aplicados vários métodos» Por exemplo, um para o método

para a produção ds uma única poligalacturonass PG òu pectina-Iiase F‘L, de preferência PLB, caracteriza~se por um hospedeiro adequado que não é capaz de expressar PG ou Pl ou que expressa PBs ou Pis eai pequena quantidade, ser transformado com um vector híbrido compreendendo um gene estrutural codificador de PG ou de

PL, e.g. PLB e por o referido gene ser expresso» Usando o promotor pki como região de controle é agora também possível produzir um único produto do gene, e.g» PLB, num hospedeiro transformado adequado que pode produzir oCs) produto(s) do gene endógeno correspondente ou endógeno, e.g. PLA, B, C, D, E ou F, apenas nas condições de indução, e.g» se existir no meio pectina ou produtos de degradação da. pectina, através da cultura do referido hospedeiro transformado em condições que não permitem a expressão dois) geneís) estrutural Cais! endógenoCs) mas apenas a expressão do gene estrutural que está sob o controle do promotor pki„ Tal condição dá-se por exemplo se se usar um meio mínimo com glucose como fonte de carbono e de energia» Se se usar um hospedeiro incapaz de expressar qualquer PG ou PL ou se fôr o caso de não se poder dar a produção de PLs endógenas, a referida PG ou PL simples pode ser obtido na forma pura, ou seja não contaminado por qualquer outra PG ou PL»

□ produto do gene isolado que é produzido num hospedeiro adequado transformado com uma molécula de DNA ou vector híbrido do invento, o qual codifica tal produto do qene, e seus •sais fisiológicamente aceitáveis são também objectivos do presente invento. São preferidas- as enzimas de A. niqer, particularmen— te as que são úteis na indústria alimentar s de rações, e.g. PGs ou PLs, em particular PLB. 0 invento diz respeito aos referidos polipeptídeos sempre que produzidos por um método de acordo com o presente invento.

invento diz

respeito ainda a u/n processo para a. preparação de composições enzimáticas compreendendo um ou mais de um polipeptídeo produzido por um método de acordo com o invento, e»g„ de uma só PL e/ou seu derivado com actividade PS e/ou seus sais fisiológicamente aceitáveis facultativamente numa combinação predeterminada com uma ou mais enzimas adequadas tendo outras activídades além de PL ou PS, respectivamente,

Enzimas adequadas tendo outra actividade diferente de PL podem ser de degradação e modificação de polímeros celulares, Tais enzimas são e.g, pectina-esterases, endo- e exo-poligalacturon ases, c e 1 u. 1 ases,

-endo-q lucanases mistas» bem iceiu1ases, χ 11 anstsBE, similares.

ír auinasss, qa1ac xanases.

JS-Qi

Enzimas adequadas tendo outra actividade diferente de PS podem ser de degradação e modificação de polímeros celulares, Tais enzimas são E.g, pectina-esterases, pectina-liases, celulases, endo-glucansses mistas, hemícelulases, xilanases, arabinases, galactanases a- e β-glicosidases e similares»

PGs ou PLs simples ou seus derivados com actividade PG ou PL, respectivamente, produzido de acordo com um presente do invento ou suas composições enzimáticas são úteis e.g» na clarificação de sumos de vegetais ou de frutos, para o aumento do rendimento de sumos na produção de sumos vegetais ou de fruta e do rendimento da prensagem de sementes ou frutos contendo óleo, para estabilização de sumos ds vegetais ou de fruta, para a redução da viscosidade de sumos de vegetais ou de fruta» parai a liquefação de biomassa, para a maceração, para o aumento da extracção de produtos naturais como sejam pigmentos naturais» aromas e sabores, para a valorização de biomassa, alimentos ou rações s similares»

Preferencialmente o invento diz respeito a um promotor pki de A» niger du um seu derivado ou fragmento com actividade de promotor, um vector híbrido, um hospedeiro transformada, um ds A» niger ou de promotor, um proceum processo para um processo para processo para a preparação do promotor pki seu fragmento ou derivada com actividade de para a preparação de um vector híbrido, preparação de' um hospedeiro transformado e um ·χ·Ο preparação de um hospedeiro adequado e um processo para a preparação de um polipeptídeo, como aqui descrito nos exemplos,

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar invento, no entanto não pretendem de forma alguma restringi-lo

J

AS ABREVIATURAS TÊM

SEGUI I

-s X

J

Amp

ATP

BSA bp

CIP d ATP dCTP d .e.

dSTP

DNA dNTP

DTT dTTP

EDTA

ESTA

IFN kDa kpb

bISNIFIUAbOS ampici1ina trifosfato ds adenosina albumina sêrica bovina pares de bases fosfatas® alcalina de intestino de vitela trifosfato de 2⁵—desoxi—adenosina t r i f os f a to de 2⁵ -deso ;·; i ~c i t i d I na grau ds esterificsçâo trifosfato de 2^?-desoxi”guanasina ácido desoxirribonueleico trifosfato de 2⁵—desoxi—nucleótido 1,4-d i ti otrei to1 trifosfato ds 2’-desoxi-tiií5Ídina sal di ácido ssódico do ácido etilenodiaminatstracético bis--·í aminoeti 1 >~g 1 icoléter-N, hlN⁹ ₅hi· -tetracético interfsrão quilodalton quilopares de bases

J

Km	constante de Michaelis-Menten
LMP	ponto de fusão baixo
D»0«	densidade óptica
!“··Ρ·Ει
! L’t\	1 UícV—UtóLÍ fcíUí UsádèrXc». UOlB UUlUU&f ώ*»£?
PEG	po1ie ti1enog1ico1
pki	gene da piruvato-cinas© de fi« ni
PLS	pectina-liase B
RNA	ácido ribonucleico
rpm	rotações por minuto
SDS	dodecilsulfato de sódio
QCp	citrato dissódico Côsi5M NaCl 5 c
Tc	te tracic1ina
T ris	trisC hidroximetil)-aminometano
U	unidades

3. to de sódio 0₉ô

J

MEIOS:

MEIO L.C

1% tripticase peptona CBBL), 0,5% extracto de levedura CBBL), ©,8% NaCl, 1 ml ds Tris-HCl pH por 1 x tro

MEIO 2xYT por litro 16 g ds tripticase peptona CtíBL), 10 g ds extrasto ds levedura, 5 g de NaCl

MEIO MíNIMO í litro contem 1,5 g KH_oP0-, 0,5 g KC1, 0,5 g pa.r-a ji~ f

A, niger MgSO_A,7H.-.0, 4,0 g de NH&C1, 10,0 g de glucose, vestígios de FeSQ„. MnSO,, ZnCl«, a.justado a pH 6,5 com NaOH

MEIO COMPLETO para. A» niger meio mínimo mais 0,2% de tripticase peptona para CBBL) 0,1% casaminoécidos CDifco), 0,1% de extracto de levedura CBBL), 0,05% de sal sádico de ácido rifaonucleico de levedura C1CN, Cleveland, USA), 2 ml de solução de vitaminas por litro»

SOUJçKO DE rxfooTlavina para 100 ml, 10 mg de tiamina, 100 mg de vitaminas 10 mg de ácido pantoté-nico, 2 mg de biotina, 10 mg de ácido p-aminobenzóico, 100 mg de nicotinamída, 50 mg de piridoxina--HCI

Para as placas todos os meios foram solidificados pela adição de 1,5% de agar CBBL), para agarCose) de topo usou-se 0,7% de agar ÍBBL) ou agarose ÍSeakem)»

J

USARAM-SE -AS SESUINTES

TIRPESi

E»	coli	JM 101 (Messing, 1979)
E.	col i	RZ 1032 (Pbarmac i a)
c U. «	coli	DH5« (Bethesda Research	LaboratO'
E»	coli	DH5a (Bethesda Research	Laborato
E»	coli	BW313 Kunkel, 19855
A»	niger	• AnS (DSM 3917, EP-A~02'	78355)
A»	niger	• N593

USARAM-SE QS SEGUINTES VECTORES?

PBR322

Descrito ent Sutcliffe, (1983) ou Bolivar et al» (1977) í1979), Peden» K»W»C.

□ewói3

Este plasmídeo foi descrito por Soosen et al» (198/)»

Fago Mlõmp

Os vectores M13mplS e M13mpl9 (Norrander ·*· ·* i »

-- dr. X π / são derivadas do bacteriáfago de DNA de cadeia simples M13 e foram projectados para facilitar a sequenciação cíe DNA ao permitir a clonagem de fragmentos de DNA num sítio poli-adaptador versátile a clonagem do mesmo fragmento de restrição em ambas as orientações possíveis» As sequências clonadas nestes vectores podem ser fácilmente usadas como moldes para reacções de sequenciação ou para a produção de sondas de cadeia simples usando oligodesoxirribonucleótido iniciador e o fragmento Klenow da DNA-polimerase I ds E« coli. 0 DNA vector e portador do promotor do operão lac e da informação genética dos 145 primeiros aminoácidos da β-galactosidase. As sequências de poli—adaptador contendo múltiplos sítios de restrição foram inseridas na sequência lacZ» 0 poli-adaptador mantém a grelha de leitura LacZ e o vector dâ complementação alélica de uma estirpe hospedeira LacZa, dando placas a?;uis nas placas contendo IPTS e X-gal» Os fagos recombinaniss contêm inserções que destroem a grelha de leitura ou que de outro modo interferem com a expressão do peptídeo lacZ são por placas incolores»

Γ cfVE:

-zelados pC859D7

Este plasmideo estã descrito em tP 88 1®1 õ97»3 e pode ser obtido a partir de Escherichia coli BJ5í83/pCG59D7 CDSM 37685» □ plasmideo compreende o gene pyrfi e foi usado na cotransformacão de mutantes pyrA de A» niqer»

M13 ΚΘ7

Fago auxiliar M13, e»g» para MÍ3< + 5!<S» Descrito em Mead et al» <19865 s Dotto e Zinder <19845» pPYK 1

Compreende o gene da piruvato-cinase ds 8» cerevisiae. Descrito em Burke et al», 1983»

Compreende o gene- PSII de A» niqer» Uma estirpe E» coli

JMÍ09 compreendendo pGWlSO® foi depositada como Deutsce Sammlung von tiikroorganismen»

DSM

J

Λ.

ν pSWSó©

Compreende ο gene qelB de A. niger. Uma estirpe de coIiHBl©! compreendendo pSfefS3© foi depositada como DQM 438'? Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.

E».

na pTZISR

Adquirido â Pharmacia pBM1í 00

Compreende o gene pki de A» niger» Descrito em L.H. Graaff, 1989 s depositado como E. coli DH5«F^?/pSWlIO© com número 5747 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.

ds o

pJDB2©7-IFNAMl19

Descrito no dido de Patente Europeia t.P-A-© 2©O 4©^

J

EXEMPLO 1

EXEMPLO 1»í s Isolamento de um fragmento de DNA compreendendo o gene da píruvato-cinase de levedura plasmídeo pPYKl compreendendo o fragmento EcoRI de 1,8 Kb do gene da piruvato-cinase de Saccharomyces cerevisiae (Burke et al«, 1983) foi digerido com EcoRI, usando as condiçSes cedidas peio fornecedor ÍBRL>» Os fragmentos resultantes foram separados por electroforese num gel de ©,6/ ds agarosa de baixo ponto de fusão (LMP)» 0 pedaço de LMP agarose contenda o fragmento EcoRI de 1,8 Kb foi cortada do gel e o DMA extraído pelo <Í0 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH agarose para um volume final de agarose foi fundida· por processo que se segues tampão TE 8,0)foi adicionado ao pedaço de 500 μΐ, seguido de 250 μΐ d efenol» A incubação a 65°C durante í© min e mistura da solução» Após adição ds 250 μΐ de CIA (Clorofórmio/alcool isoamílico 24sl) as fases

aradas por centr	ifugação	C centrífuga·
a 14 000 x g»	A fase	orgânica foi
i extraída mais	uma vez	por incubação
• 10 min a 65°C,	subsequs	nte adição de
ação das fases»	f ****-£*?	orgânica foi

mais 1Z2 vol de CIA e separação das rejeitada novamente e a fase aquosa foi sequenciadamente extraída à temperatura ambiente com um volume igual de fenol/CIA ílsl) e com um volume igual de CIA» Finalmente o DNA foi precipitado a partir da fase aquosa pela adição de 0,1 vc<I de NaAcetato 3M, pH sedimentado por centrifugação Ccenu© min a 14 ©©© x g a temperatura ambiente» Após remoção do sobrenadante o sedimento de DNA é seco usando uma centrífuga de vácuo Savant Speedvac» 0 DN.A ê finalmen— te dissolvido em 10 μΐ de TE e a ε

5,6 e 2 vol etanol» 0 DNA trífuga Eppendorf) durante concentração é determinada por

eiectroforese em gel de egarose usando uma quantidade conhecida de DNA de lamba que migra em simultâneo como referência,

EXEMPLO l,3s Marcação de fragmentos de DNA com ‘“'^P

100 ng do fragmento· EcoRI ds 1,8 kb isolado a partir do plasmídeo pPYKÍ como descrito no Exemplo 1,1 foi marcado por nick-translation₅ essencialmente como descrito por Maniatis et al., 1982, pp, 109-112= Cinco μΐ de α-*“Ρ—dATP (10 pCi/μί , 3000

Ci/mMol), 1 μΐ (5 U/μΙ) de DNA-polimerase I, 100 pg de DNAse I, IO© ng do fragemnto EcoRI de 1,8- Kb do pPYKÍ e adicionou-se ãgua estéril a 40 μΐ de tampão de reacção (consistindo em 25 μΜ dSTP, 25 μΜ dCTP, 25 μΜ dTTP, 5 mM final de 50 μΐ= A mistura de rei eacção foi parada pe; r bibovbr o a— ” P—d ATE

is/HCl	pH /,5)	para um	volume
'ao foi	incubada	durante	duas h
adição	de 5 μΐ	500 mM E;	DTA, pH
ão incorporada	da mis	tura., 0

Γ*:.. m.

r cir ci

8,0 volume é alargado para 188 μΙ com TE ε o ©-'^P-dATP foi removido por fraccionamento numa coluna de Sephadex 850 (Pharmacia), As fracções contendo o fragmento- EcoRI de 1,8 kb marcado radíoactivamente foram colhidas e reunidas, 0 DNA marcado foi desnaturado por incubação durante três minutos a 100°C e mantido na forma ds cadeia simples por arrefecimento rápido em gelo, antes de ser adicionado & solução de hibridação descrita no Exemplo 1.4.

EXEMPLO l=5s Isolamento ds DNA de alto peso molecular a partir de A. niqer

DNA de A, niqer foi isolado ligeiramente modificado usado para isolar 1985), Colheu—se o micélio que tinha cresc meio mínimo líquido, lavou-se com soro fi ats- syéij de um RNA vegetal ido durante a processo (S1ater , noite s® ΐ&ΧΟ 1 o€JXU0 3 F ÍO» CUHCjtef lou-se em azoto liquido e guardou—se a ~8©°C= foram isolados por disrupção de 0,5 g de micé

Os ácidos nucleicos io congelado usando um microdesmembrador (Braun). 0 pó ds micélio obtido extraido

co® tampão de extracção preparado de fresco, O tampão de ção foi preparado como se segues 1 ml de ácido tri-isopropilnaf·taleno sulfónico (TNS) <2© mg/ml) foi bem misturado com 1 ml de ãcido p-aminossalicilico (PAS) (120 mg/ml5 e adicionado £,5 ml de tampão RNB 5 x <5 x RNB contem 121,1© g Tris, 73,©4 g de NaCl e 95,10 g ESTA em í 1, pH 8,5), Após a adição de 1,5 ml de fenol, o tampão de extracção foi equilibrado durante 1© min a 55°C, 0 tampão aquecida foi então adicionado ao pó de micélio e a -suspensão foi bem agitado durante 1 min. Após adição de 1 ml de clorofoi novamente misturada durante 1 min» Após xg durante 10 min a fase aquosa foi extraída ,1 ds fenol/'clorofórmio < Is 1) e foi então

Taraio a suspensão com um volume .quaj extraído duas vezes com clorofórmio» 0 DNA foi isolado a partir da fase aquosa usando o processo que se segue; 0 DNA foi imediatamente precipitado a partir da. fase aquosa com 2 voi de etanol è temperatura ambiente, subsequentemente colhido por centrifugação 4 a 10 x g ourante 1© min e lavado duas vezes por redxssolução do DNA em água destilada estéril e precipitação novamente com etanol» Finalmente, o DNA foi redissolvido em tampão TE, o RNA foi então removido pela adição de RNase A (2© pg/ml) =

EXEMPLO 1,4; Determinação das condições de hibridação heterólocas

DNA de alto peso molecular isolada a partir de A, niger como descrito no Exemplo 1»3 foi digerido com EcoRI e BamHI» Ds fragmentos resultantes foram separados por electroforese em gel de agarose e transferidos para nitrocelulose como descrito por Maniatis et al, (1982) pp» 3S3—389» As condições de hibridação heterólogas foram determinadas e as- experiências de hibridação foram realizadas como anteriormente descrito por de Graaff et al» (1988). As condições de hibridação para o despiste da biblioteca e para a hibridação de transferências Southern com o fraqmento

EcoRI do gene de levedura como sonda sãos pré—hibridação em 6 x SSC, 0,1%. SDS, 0_ftí5% pirofosfato ds sódio e 20 pg/ml ds DMA ds esperma de salmão desnaturado a 56°C durante 3-5 h, hibridação em 6x SSC, 0,1% SDS, 0,05% pirofosfato de sódio e 2® pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturada a 56*C durante Í5-Í8 horas, seguido ds duas lavagens em 5x SSC, 0,1% SDS a 56*C e duas lavagens em 2x SSC- a 56'-’C» Os filtros foram autorradiografados durante a. noite -a ~7®*C usando filmes de raios X Konica e cassetes Kodak X-Dmatic com écrans de intensificação normais»

EXhMPLQ í»5; Despiste da biblioteca de genes com o fragmento radioactivo EcRI de 1,,8 kb gene pki de A» niger foi isolado por hibridação heterólogs usando o fragmento EcoRI ds 1,8 kb do pPYKl como sonda» Preparou-se uma biblioteca genómica de A» niqsr W400, de acordo com o método descrito em EP-A-D278355, fez-se o despiste com o fragmento EcoRI de 1,8 Kb do pPYKl por um processo de hibridação de acordo com o método descrito no Exemplo 1»4. 0 despiste resulta no isolamento de clones positivos» A partir dos clones que deram os sinais de hibridação mais fortes isolou—se DMA de plasmírieo por islamento em minipreparaçSes (Maniatis et al», 1982, pp» 368-36’?}» A análise Southern e de restrição foi usado para testar se um clone contem o gene pki completo de A» niger» 0 fragmento BglII/HindIII de 5 Kpb deste clone e o fragmento vector BamHI/HindiII de 4,0 kpb do vsctor pBR322 de E» coli foram isolados de acordo com o método da agarose LMP descrito no Exemplo 1»1» 0 fragmento BgIII/HindIII

Kpb foi ligado ao fragmento vector BamHI/HindiII de - 4,0 kpb do pBR322, resultando no plasmídeo pSWil®0, pelo processo que se segue? 100 ng do fragmento de pBR322foi misturado com 25® ng do referida

Bglil/riindlIX os 5 Kpb e 4 ρ 1 de tampão de 1xqaçâo ox çãos 250 mH Tris/HCl pH 7,6§ 50 mM MgCl^p 50 mM DTT; 5 mM ATP?

rragmento (composX-

espermidina 5mM? 5® pg/ml BSA) s 1 μΐ (1,2 U/μΙ) de DNA-ligase (BRL) foi adicionada à mistura num volume final de 2© μΐ» Após incubação durante 16 horas a Í4°C a mistura foi diluída para 1©© μιI com água estéril» ί© μΐ da mistura diluida foi usado para transformar células competentes ds E» coli JM1©1, as quais foram preparadas de acordo com o método CMÍ, CM2 descrito no Pharmacia Manual para b sistema ds clonagem/sequenciação M13» pSWlí©© foi isolado em larga escala (Maniatis, 1982, p»Só), purificado por centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio e extracção com fenol, precipitado com etanol e dissolvido em tampão TE» 0 plasmídeo p6Wlí©© foi ainda analisado por análise de restrição e a orientação do gene pki foi determinada por hibridação nas condições descritas no Exemplo 1=4 usando fragmentos contendo o extremo do qene da piruvatu-cinase de cerevisiae, um fragmento EcoRI/BglII de i=© Kpb e um fragmento EcoRI/BglII de ©,88 Kpb, respectivamente como sondas»

Exemplo í»6: Determinação da sequência do gene da piruvato-cinase de A»_n iger

A sequência do gene pki de niger, incluindo a região do promotor, o gene estrutural e determinada por subclonagem dos pM13mpiS/mpí9» Para análise da sequência de nucleótidos foram isolados como descrito no Exemplo i»l e foram ligados com os vectores de DNA RF do bacteriófago M13mpí8/19 linearizada’ (Messing, 1983-^ Norrander et al», 1983) como descrito no Exemplo a região de terminação, poi fragmentos de pSWíi©© em rorarn dererminatías usando o processo de terminação de cadeias de didesoxinucleótidos (Sanger et al», 1977) como descrito sm M13 Cloning/Didesoxy Sequencinq Instruction Manual BRL, ρρ» 50-73« A sequência determinada está a presentada na listagem de sequências com a designação SEQ ID MO»1»

EXEMPLO 25 Construção de vectores de expressão

EXEMPLO 2.1 s 1ntroduç3 o de um novo sitio de restrição no codão de iniciação da tradução do gene da píruvato-cinase

EXEMPLO 2.1«ís Preparação de DMA molde MÍSmplB-PK (BamHI-PvuII) con tendo uraci1o bacteriófago M13mpl8-PK (BamHI—Pvulϊ> obtidc no

Exemplo l«ó, foi propagado por inoculação de uma cultura de 5 ml de En coli JMÍÔÍ em meio nutritivo 2x YT numa D.O»¹ cm a 600 nm ~ 0,1 com uma única placa» Após crescimento durante a noite a 37°C, as bactérias foram removidas por centrifugação <1® &&& x g, 10 min») e o sobrenadante foi usado como stock de fagos na preparação de um molde de DMA de cadeia simples contendo uracilo.

U molde contendo uracilo foi preparado de acordo com Kunkel et al. (1985) e Ner et al., (19S8) como se segues í® ml de meio 2x YT contendo uridina 5 mM foi inoculado com E« coli R'Z1®32 e acultura foi cultivada a 37^C‘C até uma D.O»^ “^!,i a 55© nm de €ϊ,3 = Desta cultura 2,5 ml foram diluidos em 1® ml de meio 2x YT contendo uridina 5 mH» Esta cultura foi infectada pela adição de í 2 g 1 do sobrenadar· te con tendo Μ13mp í 8-PK C BamHI -Pvu I í ) como descrito atrás» A cultura infectada foi cultivada durante 5 horas a 37°C» ftpós este período de crescimento as bactérias foram removidas da cultura como descrito atrás e o sobrenadante contendo fagos foi usado para a realização da um segundo ciclo de crescimento de fagos em E» coli RZ1032 como descrito atrás» Num terceiro ciclo de crescimento, 4© ml de meio 2x YT contendo uridina 5 mM foram misturados com 10 ml de uma cultura de E» coliRZ 1032 e adicionados 5© p.l do sobrenadante contendo fagos resultante do segundo ciclo de crescimento, As bactérias foram cultivadas durante 5 horas a 37°C e as bactérias foram removidas

Τ Π Π >

da sobrenadante par centrifugação como descrito atrás» 0 sobrenadante foi centrifugado uma segunda vez antes dos fagos serem precipitados pela adição de 8 ml de 20% polietilenogiícol-ó000/3M NaCl» Os fagos foram colhidos por centrifugação durante 10 minutos a 10 000 ressuspenso em , â- _ _ -ί < g« 0 sedimento de fagos resultantes foi 2,5 ml de tampão TE» A proporção de uracilo contendo fagos foi determinada semeando diferentes diluições desta solução de fagos em E» coli 3M10íCnão permissivo! assim canso em E« coli RZÍ032 (permissiva)» uroi encontrada uma proporção de fagos sem uracilo para com uracilo de i para í&~‘» 0 DNA de cadeia simples de M13mpl8~F'K CBamHl-FvulI)» foi isolado a partir da solução de fagos por extracção com fenol-clorofórmio, precipitado com etanol como descrito no Exemplo l»í e ressuspenso em 125 μΐ de tampão TE»

EXEMPLO 2.1» 2 s Introdução de um sítio Nsil no sitio de iniciação da tradução do gene pki de- A» niqer por nsutaqénese in vitro

Um sítio de iniciação da tradução do gene da piruvato cinase foi criado um sítio Nsil por mutagénese in vitro (Ti—Zi Su e Raafat El-Gewely, 1988) do DMA de cadeia simples de M13mpl8-PI< (BamHI-Fvul1) descrito no exemplo 2»l»í usando o oligonucleótido mutagénico 5926 que tem a sequência de nucleótidos com a SEQ ID NO» 2.

oligonucleótido 5926 con its em 29 nuclsótidos cuja sequência é idêntica à sequência à volta do sítio de iniciação da tradução do gene pki excepto nas posições Í2 e 14 do oligonucleótido» A sequência dos nucleótidos nas posições 12 a 14, que na região de iniciação dai tradução original de pki se lê 8CC, é CAT no oligonucleótido» Portanto» o oligonucleótido tem um sítio Nsl nas posições

14.

Para a imitação .n vxtru do oene oki 5fc? pmoles do

oligonucleótido 5v26 foram fosforilados no extremo 5^? (Maniatis, 1982) com ÍW pmoles de ATP, Esta reacção foi realizada durante 3© min a 37*C com 10 U de pol.inucleótido-cina.se de T4 (BRL) em 50 81 de tampão cinase como recomendado pelo fornecedor, A reacção foi terminada pela, adição de 2 μ.1 de uma solução de 500 mM EDTA, A mistura foi extraída com fenol e clorofórmio como descrito no Exemplo 1,1» €í,2 pmoles de DNA de cadeia simples de M13mplB-PK íBamHI-PvuII) contendo uracilo de acordo com o exemplo 2,1.1, foi misturado com 0,5 pMoles do oligonucleótido 5926 fosforilado em 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl_o, 25 mH NaCl num volume final de 10 p.l = A mistura foi incubada durante 5 min a 65^OC, lentamente arrefecida até à temperatura ambiente durante 6© min e colocada em gelo durante 15 min. Em seguida adicionou-se 2 μΐ de 500 μΜ dNTPs, 1,5 μ! de 1© mM ATP, 1 ml de DNA-polimersse de T7 (12 U/μΙ) (Pharmacia) e ί μΐ de DNA-ligase de T4 (1,2 U/μΙ) (BRL) á mistura e esta mistura de polimerização foi incubada durante 15' min a 37°C. A reacção foi terminada por aquecimento a 65°C durante 5 min. A mistura de polimerização foi então diluída um volume final de 1©0 gl e amostras da mistura diluida usadas para transfectar células competentes de E, coliJM10í permissiva) e E, coli RZÍ032 (permissiva) no Exemplo 1,5, As células c orno o esc rito semeadas como descrito também no Exemplo 1 para foram (não que foram preparadas transfectadas foram

EXEMPLO

Análise da sequência do Ml-5mpl8-PK mutaqenizado

C BsmH í-PvuII)

Doze placas foram repicadas das caixas de petri contendo E, coli JMÍ01 transformadas, os fagos foram propagados com E.

foi

coli JMÍ'31 como hospedeiro e a partir dos fagos isolados extraído DMA de cadeia simples como descrito no Exemplo 2.1.1. 0

DNA de cadeia simples isolado destes fagos foi analisado por análise B-track, como descrito no manual de clonagem e sequenciação em M13 da BRL. Três dos fagos com o padrão S previsto para a mutação precenozoa foram analisaoos· por análise de sequências, como descrito no Exemplo i»6» Us Tagos compreendem o fragmento BamHI-PvuII de 1053 ph previsto tendo o sítio Msil no sítio de iniciação da tradução do gene pki. Os fagos mutagenizados foram designados Mí3mp'18-PK (BamHl-Nsil-Rvull) =

EXEMPLO 2»2s Construção de pPK-PLB fragmento BamHI/Nsil de 720 ph contendo a região do promotor pki foi isolado a partir de DNA RF ds M13mpi8-PK CBamHI-Nsil-Pvul 1'}, enquanto que um fragmento BamHI/Nsil de 2,6 Kb contendo o gene estrutural da pectina-liase B (pel B5, foi isolado a partir do plasmídeo pGW830 de acordo o método descrito no Exemplo í.l. Ambos os fragmentos foram ligados a um vector pBR322 desfosforilado digerido com BamHl (Fig. 4) como se segues 100 ng de DNA do pBR322 digerido com BamHl foi misturado com 250 ng do fragmento BamHI/Nsil de pelB e com 250 ng do fragmento BamHl/Nsi de 742 pb do pki. A mistura foi ligada como descrito no Exemplo 1.5» Amostras diluídas da mistura de ligação foram usadas para transformar células competentes de E. coliJMlúi, preparadas como descrito no Exemplo 1,5. A mistura de transformação foi semeada em placas LC contendo 50 pg/ml de ampicilina ε incubada a 37'-C durante a noite» Os transformastes foram repicados da placa e cultivados durante 5 horas a 37°C em meio líquido LC contendo 50 pg/ml de ampicilina» 0 DNA do plasmídeo foi Isolado a partir dos transf orsisn tes através de isolamento em minipreparaçSes (Maniatis et al., 1982, pp.368-369)» Um transformante contendo um plasmídeo que revela os apos diyestao com

Bamh'1, Sphl, Smal e com a combinação de BaisHi s Msil foi ainda analisado por análise da sequência, usando um oligonucleótido especifico de psíB como iniciador» A sequêncii :οπ tósponde sequência prevista do gene fundido pki-pel B. D plasmídeo foi designado pPK-PLB e foi propagado e purificado como descrito no Exemplo 1»5„

EXEMPLO 3j

EXEMPLO 3.1s·Introdução do pPK-PLB em A» nioer plasmídeo pPK-PLB, obtida na Exemplo 2 7iido em A» niger por cotransformação de A» niger N593 com os plasmídeos pSWólS e pPK-PLB. pGW613 compreende o gene da marca selectiva pyrA» foi introduProtoplastos de A» niqerhl593 forampreparados a partir de micélio por crescimento de A» niger N593 em suplementado com ©,5% de extracto de levedura, ©,2X de casaminoácidos, glucose 5© mM e uridina í© mM durante 2© preparação ds protoplastos de A» niger Nb93 do gene pelB, me

Sinifflo

EXEMPLu 3»2: Análise ds·: transformantes PK-PLB de A.

3©°C =	A
Sf-yiSÕJ	de
et a	1. ,
•ados	no
•xpres	são
• N593
iplo	3» í
•el. B,	a
•ante	18
7 *=:
• 5 / « -~J	y
L S Π ? 13	de

Os transformantes de A» niger obtidos no exemplo 3»1 foram analisados quanto à formação do produto do gene pel. B» proteína PLtí» Lies foram seleccionados e cultivados durante horas em meio contendo 1© g de pectina 72% esterifícada de NHJMO-»., ©,5g de KC1, ©,5 g de MgSO_a, í,5 g de fC,PO_r? ©,S g

......

casaminoácidos, 0_?5 g de extracto de levedura e ô = 5 ml de solução stock de elementos com esporos, Η^,Ο para 1 litro, pH 6,0 =

X.

A solução stock dos elementos com esporos consiste por litro em 1Θ g de EDTA, 4 = 4 g de ZnSQ^«7H=.,0, í,@í g 11.001,-,= 414=.,0.

CaCl,-.«2H„D e í₃© g de FeSO , = 7H_0 = Após crescimento o m;

Z. x~ X removido por filtração e o filtrado da cultura foi analisado por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, usando um gel contendo 1©% de acrilamida» A proteína PLB foidetectada por ensaio de transferência Western (como descrito no manual do aparelho 2117 Multiphor para transferência a semi-ssco da LKB) usando anticorpos policlonais contra PLII induzidos em

•1 de	uma
; ? pH A.	j€í»
litro	em
1». 4 / q	de
è 1 IO	foi
sado	por

c oe1hos ί van

Houdenhoven, 1975) e sor anti-anticorpos de .US 1 hos conjugado com fosfatase alcalina (Bio Rad) de acordo com instruções do fabricante» Dos cransTormances anausados, cerca.

ds ser posteriormente trabalhado» Daqui em diante o transformante é

70a produz a. proteína PLB» Um transiormante foi seleccionado para ser posteriormente trabalhado» referido como A» niqer/PK-PLB»

Northern analysis so transformante pPK-PLB de A, niqer transformante de A» niger, A» niger/PK-PLB selsccion.ado de acordo com o Exemplo 3 = 2 foi analisado relativamente ã formação de mRNA específico de peIE; = 0 transformante foi cultivado durante 16 horas a 3€?-'C num meio como descrito no Exemplo 3,2 excepto a fonte de carbono que foi de 2a íp/v> de D-glucose« Após colheita, o micélio foi rápidamente seco por prensagem entre folhas de papel e foi imediatamente imerso em azoto líquido para ser triturado» Uma grama de micélio em pó foi então ressuspenso em 3 ml de tampão Ctiocianato de guanidinio 4,0 M, 5© mM Tris-HCl pH 7,5, 1a de β-mercaptoetanol, 2% de lauriIsarcosianto de sódio) e agitado com vortex durante 1 min» Após centrifugação Cíô min, 1@ 000 xg à temperatura ambiente) recuperou—se o sobrenadante» A cada z

CsCl, 0,1 M EDTA ípH 7,5) num tubo de ultracsntrifuga Beckman SW50» A centrifugação fc<i realizada durante iè horas a 30 000 rpm a 20°C usando um rotor Beckman SW50» Os sedimentos de RNA foram dissolvidos em água destilada estéril» A qu-antidade de RNA dasamostras foi ajustada a aproximadamente iguais concentraçSes após electroforese em gel de agarose» Quantidades de -aproximadamente 25 pg de RNA foram corridas usando desnaturação com glioxal CManiatis et al. (1982) Molecular Clonings A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York Página 2003» 0 RNA foi transferido para Bene-bind (Pharmacia) usando 10x SSC como tampão de transferência e incubado durante 1 hora a 80°C. A hibridação foi realizada durante 16 horas em tampão de hibridação descrito por Church e Silbert CProc» Matl» Acad» Sei» USA 81s1991-1995 (1984)3 (1% BSÃ, 1 mM EDTA, 0,5M NaJ-v pH 7,2, 7/í SDS) a 60°C usando como sonda o fragmento Xhd de 2,8 kp-b marcado radioactivamente no qual está situado o gene pe!8„ As transferências foram lavadas duas vezes durante min com 2x SSC, 0,1% SDS & depois duas vezes durante 30 min com 0,2x SSC, 0,1’/. SDS a 60*C» A exposição das transferências foi realizada durante a. noite a —70^C‘C usando filme de raios X Konica e écrans intensificadores. Esta análise indicou um sinal forte de mRNft específico· de pelB no transformante e nenhum sinal na estirpe testemunha A» niger N400 cultivada de forma semelhante.

EXEMPLO 3,4; Produção, purificação & caracterização da pectina-1 ias-e B_(PLB) a partir de A» n i qer / PKP-PLB

EXEMPLO 5»4»15 Condições de cultura para preparar pectina·-!iase B e isolamento da enzima

Esporos de A, niqerZPK—PLB foram usados para inocular éí

600 ml de meio de cultura para uma densidade de / x ίθ esporos/ml» 0 meio tem a seguinte composição? 20 g de glucose, 7,5 g de NH^NQ^, o,5 g de KCI, 0,5 g de MgS0₄»7H_{2r0 J5 d=} ^2^4^{3 5} g de extracto de levedura, 0,5 g de ácidos ribonucleiccs, 0,5 ml de uma solução stock de elementos de esporos, H.-.0 para i litro, pH é,0. A solução stock dos elementos, com esporos consiste em 10 g de EDTA, 4,4 g de ZnSO» «7'H._₌0, 1,01 g linCl^»4H._,D, 0,3=2 g de

CoC1._„ ,,„0, 0,315 g de CuS0„«5H^0, 0,22 g de CNH»), Mo^u.-,» »4H_0, ** τ ·* * * *“ ^s~*' -·* * * »·· *** ? ·* aL ·· *

1,47 g de CaC 1 .2H„0 s 1,0 g n© Fe-S0,.7H^D por litro» A cultura foi cultivada durante 3 horas a 30°C num agitador orbital Brunswick e depois transferida para um frasco de 1® 1 contendo 4 1 do mesmo meio» A cultura foi arejada usando pulverizador no fundo do frasco para distribuir o ar comprimido e agitar a cultura» 0 crescimento continuou durante 16 horas a 30^&C» Após este período de crescimento o pH do meio era de 5,8« □ micélio foi removido por filtração e PLB foi isolado a partir do filtrado de cultura pelo seguinte processos

A enzima foi recuperada, quase quantitativamente por precipitação com sulfata de amónio . (957 de saturação) a 0°C seguido de centrifugação (15 min», 8 500xg>» A enzima precipitada foi dissolvida em tampão fosfato de sódio 50 mM pH6,0, dialisado contra o mesmo tampão e guardado a —20°C» A actividade de pectina-lia.se foi testada a 25°C usando uma concentração final de 0,3% <p/v> ds pectina (grau de esterificação 94,ó%) em tampão 50

mM Tris/HCl, 1 mli CaCl^, pH 8,5 usando o processo métrico descrito por vari Houdenhoven, 1975, p» 11» es pec tr o f o to···

A análise do filtrado da cultura por electroforese em SDS-poliacrilamida e transferências Western indica uma banda proteica predominante correspondendo a PLB e enzima quase pura no precipitado e na fracção dialisada» A actividade específica de pectina-liase no filtrada da cultura é de 48 U/mg de proteína e no precipitado e fracção dialisada. é de 216 U/mg de proteínas a concentração de proteína é de 380 mg, respectivamente, conforme determinado pelo ensaio Pierce BCA»

ΕXEMPLQ 3.4.2; Propriedades da proteína PLB peso molecular aparente de PLB conforme isolado no exemplo 3.1.3= é de 39,5 KDa conforme determinado por slectrofo-

amida usando	néi s	ds?	10%. A	sn
o fosfato ds	SoCi io	50	mM pH 6,	0 9
pH mais alto	£«ga	Sfll	tampão	50

mM

Tris/HCl pH 7,5. Esta, inactivação é reversível e a actividade pode ser largamente recuperada por diálise da solução de enzima contra tampão fosfato pH 6,0» A PLB preparada no Exemplo 3=1.3 é uma endo-pectina-liase típica, como pode ser concluido dos produtos de degradação oligoméricos que surgem da pectina altamente esterificada íd»e = 94,6%). A enzima prefere pectina altamente esterificada como se mostra na Tabela 1»

Tabela í; Actividade de PLB em -pectina de maçã com diferentes graus de esterificação®.

grau de esterificação da substracto pectina Ca) actividade enzimática relativa de PLB C %)

94,6

72,8

34,8

5Ã.

Condições do ensaios ®,3%

Tris/HCl ρΗ 8,5 contendo ©,5 M NaCl a 25°C.

em tampão 5© míi

Os parâmetros de Michaelis-Menten para PLB foram também determinados, usando que foi guardada em tampão fosfato de sódio pH è₃o« A actividade foi testada a 25°C em tampão 5© mM Tris/HCl pH 8_S5 na presença de 0,5 M NaCl, usando diferentes concentrações de pectina altamente esterificada Cd.e, 94,6%). Encontrou-se um valor de Km de 9 mM Cna base de monómero) e um número de substituição de 5150®,

EXEMPLO 4s Expressão de interferão híbrido humano BDbB sob o controle do promotor pki

EXEMPLO 4.1¾ Construção da precursor plasmídeo POII-H-IM AM1Í9 plasmídeo pGW18©0 que foi isolado a partir ds E» co1i JM109/pSWi8©® CDS-M 5505), foi digerido com EcoRI e tratado com polimerase de T4 como abaixo. A religação deste DNA e transformação de £, coli DH5«F’ permite o isolamento de um plasmídeo

pSW 1800—E, d qual s o mesmo de pGWISO®, excepto ter sido eliminado o sítio ds clivagem EcoRI» plasmideo pGN1800-E foi digerido com Bglll e tratado com fosfatase alcalina bacteriana CBRL) na presença de 50 mM Tris-HCl pH 8,0 e 50 mM NaCl durante 1 hora a 65°C= A fosfatase alcalina foi inactivada por digestão com proteinase K (Boehringer Mannheim) e extracção com fenol= O DNA foi subsequentemente precipitado com etanol, seco e redissolvido em água» Em seguida como aoaixo» plasmideo pJDB207-lFN AMÍ19 CEP 205 404) foi digerido com HindiII e Ciai» Os extremos coesivos destes fragmentos lineares foram preenchidos com DNA—polimerase de T4 (Boehringer Mannheim) na presença ds dCTP, dGTP, dATP e dTTP 0,1 mM cada mais 67 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,7 mM MgCl_?, 16,7 mM CNH₄)^80» e 5 mM DTT durante 30 min a 37'^:'C= A reacção foi parada por aquecimento s 65°C durante 5 min» Os fragmentos foram separados num gel de 0,8% de agarose de temperatura de fusão baixa CBioRad) e o fragmento com í Kpb, que compreende a região codificadora do IFN AM119, foi removida e o DNA purificado numa coluna Elutip D (Schleicher & Schull) e precipitado com etanol CSchmitt & Cohen, 1983)= u¹

100 p.q do fragmento IFN AM119 e o vector pSW Í800-E preparado atrás foram ligados em 5 μ.Ι de 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MqClr,.„, 10 mM DTT, 1 mM ATP e 1 unidade de BNA--1 igase de T4 (Boehringer Mannheim) durante 2 horas à temperatura ambiente» Esta mistura foi usada para transformar células competentes de E» col iDH5o.F ?» Despistaram-se transiormantes resistentes à ampicilina por digestão do DNA de plasmideo para identificar os portadores do precursor plasmideo pGll-IFN AMÍ19»

EXEMPLO 4

:s Geração ds pGIIss-IFN ANÍÍ9 usando PCR método PCR sequido é como descrito por R»M = Horton et ai = _? (1989)» pSWiSô® foi linearizado, por digestão com Xbal e precipitado com etanol» Após resstsspensão em água, í®D pg deste DNA foi sujeito a amp.lif icação por reacção em cadeia com polimerase (PCR 5 usandoos oliqonucíeótidos A e C CBEQ ΪΌ NC?» 5 e 6, respectivamente) num ciclizador térmico automático durante 25 ciclos (cada um consistindo em 1 min a 94 °C, 2 min a 4®°C e 3 min a 72°C) seguido de 10 min a 72‘'C» 100 pM de cada um dos oligonucleótidos e ®,5 μι de polimerase Taq (Perkin Elmer Cetus) foram usados para cada reacção num volume de 100 μΐ usando o tampão de reacção recomendado pelo fornecedor» Isto dá DNA 2 C8EQ ID NO» 7) »

De forma semelhante pJDB207-IFN AN119 linearizado com BamHI e sujeito a PCR com os aligonucleótidos D (SEQ ID NO» 8) e F (SEQ ID NO» 9) dá o DNA 3 CSEB ID NO,1®)»

Estas misturas de reacção foram precipitadas com etanol, redissolvido em áqua e uma amostra foi t sa num qel para determinar ras» :oncentração dos fragmentos de DNA nas mistuusando as mesmas condições de atrás DNA 2 e 3 foram sujeitos a PCR com oliçionucleótidos A e F para dar uma sequência de DNA que compreende uma fusão perfeita das grelhas de leitura da sequência sinal PGII ligado ao fragmento promotor PGII com a região codificadora do interferão híbrido maduro BDBB»

U fragmento BamHI-EcoKl deste DNA, o qual contem

Tusáo perfeita oí de

Íts;Xi.urc±, ϋι 1 lyãdu ao precursor pGII-IFN AM119 cortado com BamHI-EcoRI para gerar o plasmideo

pGIIss-IFN AMI19= A parte da sequência de pGIIss-IFN AM1Í9 compreendendo a sequência sinal PGII, o gene IFN AM1Í9 do híbrido BDBB, o terminador ds levedura pH05 está descrita com a designação SEQ ID N0.11.

EXEMPLO 4 = 3? Construção do plasmídeo pPKI-IFN-1

Duas pg de pBWllDD foi aberto com a endonuclease de restrição Msil num sítio no extremo 3^S do gene aki = Este DNA foi tratado com polimera.se de T4 durante 30 min a 37'’C em 20 pl ds mistura de reacção contendo? 2 pg de DNA, 67 mM Tris/HCl pH 8,8,

6,/ mM MgCl.-j, mM (NH=)=,SU,= 5 mM ditiotreitol, dSTP, dATP, •R- xl· ** ’ * dCTP e dTTP 50 μΜ, 1 U de polimerase de T4« Após precipitação com etanol 100 ng deste DNA foi ligado com 10 ptide oligonucleótido adaptador EcoRI desfosforilado com a sequência 5⁵GSAATTCC à temperatura ambiente drante 2 horas em 5 pl de mistura de reacção contendo? ISO nq de DNA, 10 pM de adaptador, 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM MgCL.-i, 1© mM ditiotreitol, í mM ATP e í U de ligase. Esta mistura foi usada para transformar E. coIiDHSaF’ e seleccionadas as células- contendo plasmídsos em 2x Y’T mais 50 pg/ml de ampicilina. Após extracção de DNA de 18 colónias e despiste por digestão com enzimas de res-trição, e identificado o plasmídeo pGW1100-E compreendendo a sequência de adaptador EcoRI e sem o sítio Nsil« plasmídeo pBIIss-IFWAMÍ19 que foi preparado de acordo com o Exemplo 4 = 2 contem o promotor PGII tíe Asperqi11us niqer e a sequência sinal fundida a um gene IFN qus é seguido do terminador de PH05 de Sacbaromyces cersvisiae e do terminador de PGII, Este plasmídeo foi cortada com PstI no final do promotor de PH05 e dotado de extremos cerses com polimerase de T4 e ligado ao o 1 igonuc leótido adaptador Sphl com a sequência 5^S8-SCAT8CC a usado

para transformar E. coli DH5a exactamente como atrás, para criar o plasmídeo pSIIss-IHMAMl19Sph»

5© ng de cada um dos quatro fragmentos purificados que se seguem foram ligados uns aos outros como atrásϊ

- 0 fragmento BamHI/Nsil de 742 pares de bases, contendo a região do promotor pki, do DNA RF de M13mpi8-PK (BamHI-NsiI-PvulI)» 0 sitio Nsil foi removido por tratamento do plasmídeo cortado com Nsil com polimera.se ds T4 antes de cortar com BamHI»

- Q fragmento BamHI/Sphl de aproximadamente 1,1 Kpb, contendo o extremo 3⁵ do promotor de PBII mais a sequência sinal de PBIl mais o gene IFÍM, do PSI Iss-IFNAMl 19SRh« 0 sitio BamHI foi preenchido com polimerase de 74 antes de cortar com Sphl.

- 0 fragmento Sphl/EcoRI de 41/ pb contendo a região do terminador do gene pki„ do pBW1100-E»

- 0 fragmento de aproximadamente 2,8 Kb do pTZiSR (Pharmacia) cortado com BamHI/EcoRI»

Após transformação de E» coli DH5«F^? e despiste foi identificado o plasmídeo PK1 — IFÍM— 1»

EXEMPLO 4»4s Mutagénese de ρΡΚΖ—IFN—1 para criar ρΡΚΙ—IFN—2 e pPKIssIFN-2 plasmídeo pPKI-IhN-í foi usado para transformar uma colónia, de E» coli dut“ung~ estirpe BW313» Esta foi super-infectada com M13K07 para dar o fago de cadeia simples substituído com uracilo a partir do plasmídeo» Este DNA fágico foi preparado e mutagenicado como descrito atrás com os dois oligonucleótidos

diferentes XFN-i s Ii-H-2₅ respectivamente, as sequências dos quais estão descritas na listagem de sequências com SEQ IE? NO» 12 λ·_·₅ respectivamente» A mutaqenização com o oligonucleótido

1FN-1 dá pPKX-IFN-i e com o 1FN-2 dá pPKIssIFN-2. Ambos os plasmídeos compreendem fusões perfeitas das grelhas de leitura» pPKI-IFN-2 tem o promotor pki fundido com um codão de iniciação da metionína e em seguida o resto do gene IFN e pPKIssIFM~2 tem o gene pki fundido com a sequência sinal PBII seguido do gene IFN»

As sequências de nucleótidos pPK.IssIFN-2 estendendo-se desde das regiões do pPKI-IFN-2 e o promotor pki até à reqiião terminadora da transcrição estão descritas em SEQ ID NO» 14 e 15. respec t i vamen te.

EXEMPLO 4.5; Transfarmação do plasmídeo de expressão PKI-IFN em ftsperq i I lus n i_ger

Os plasmídeos pPKX-IFN-;

formados em ft»_riiqerN593 usando o gene pyrA de marca selsctiva no plasmídeo pGWóX3 como descrito e pPKIssIFN-2 foram cotransEXEMPLO 4»6 s Análise dos transformantes

A» niner como

Os transformantss do exemplo 4,5 foram analisados quanta à produção de IFN por análise Western como descrito no Exemplo 3»2 mas usando um anticorpo induzido contra IFN Cem vez de um anticorpo anti—PLIIÍ»

MICR0QRSANÃSKD3 DEPOSITADOS

E, collDHSuf-VpGWl Í00 foi depositado como N2 DtíM 5747 em IS de Janeiro» 1990 e A» niger N593 como NS DSM 5/56 em 2ó de

Janeiro de 199Ό de acordo com o Tratado ds Budapeste na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkultursn, riascheroder Weg íb, D-3300 Braunschweig»

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Listagem de sequências

SEQ IS NQnl

TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com a correspondente proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 3605 pb TIPO DE CADEIA: dupla

TOPOLUb1A s iinssr

TIPO DE MOLÉCULA: genoma

ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Aspergillus niger N4Ô0

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA: Plasmideo pBWllOO de E. col DH5«F’/pGWl10®

CARACTERÍSTICAS?. desde 1 até 1®4Í pb região promotor pki desde 831 até 8-35 pb caixa putativa CAAT desde 928 até 933 pb caixa putativa TATA desde 849 até 1040 pb região rica em CT

□ esae	1042	até 3096	pb	r SyiSO	codif ic<
piruvõ	ito-c	inase
desde	í 1 66	até 1266	pb	intrão	1
desde	1312	atê 1370	pb	intrão	2
desde	1418	até 1472	pb	intrão
	1545	atê 1606	pb	intrão	.4 T
desde	1729	até 1828	pb	intrãcf	tn/
desde	2663	até 2711	Pb	in trão	6 desde
	2851	pb intrão	*7

AAACCTCCAA	ATGGAAGAGA	AAACCTCCGA	GTACTTACTT	40
AGGGTCCCTG	TCTACTGGCC	AGAGTCTCGT	CCTCATTACT	80
ATGATTAATT	ACCCACTGGA	CAAAAAAATA	AAATAAAATA	120
AAAATAAAAA	GGGAGACAGC	TTCTCCATAA	CTGGCAACTG	160
GGTCCGTCCG	AGCAGAGCAA	AATTCAGCCT	TATGGGTTCC	200
GATGGAGTCA	GGGAAATAGT	TCTTGCGAAG	GGCATTGGGC	240
TTTTTTGCGA	GGAGAAAATT	CAGCACCGAC	AAAGCATCCA	280
AATCCACCTC	GCTAGGAGAG	AATGGATCCG	CGACGATGTG	320
GGGTCAACTG	GACAGAGTGA	GAGGGTATCA	TGTGGTCCTG	360
CCAGATACTT	CGCAGAATGT	TG-GTGGGTG	TCTGATTGTG	400

.. '·,? f C X

GCTTGGGCGT GAATTGCTTT TGGTCTTCCC	AACCAATTAT	440
TATGCAAGCC GCCGAAGAAA GCCCGAAAAG	CCCCGAAGGA	480
AAGGGCCCGA AGAAGGAAGG GAAAAAAGCC	GCCGAACCCC	520
GGGCCGAAAA CCCTGGCCGA ACAAGGAAAA	AAACCGAACG	560
AAGCAACAAG GGGAACCAAC AACAAAAAAA	AAGAACAAAA	600
CAAGGAAAAG GGGAACAACC AACAAAAAAA	TGAAGTTTGA	640
AAACCAACCA AAAGGCCCGG GGGGAAAAAA	AAGTCATTAA	680
TAATGGGAAT TATGTAGGCG ATGGGAAGTG	TGATTGTAAC	720
TACTCCGTAG CTGGAGGCAC AACTAACAAG	CCAGCTCTCA	760
ACCCGCGGGG AACCGACCGA CAGAAAAAAG	CGTCCCAAAG	800
CAGGAATCCC ACCAAAAAGG GCCGATCCAG	CCAATCACCG	840
CCGCCAACAT TTTTCCTTCC CGGGCACCCC	TCCTCTAGTC	880
CACCATCTCT CTCTTCTCTC GCTCACCGGC	CCCGTCTTTT	920
CCTTCCCTAT TATCTCTCCC TCTTCTCCTC	CCTTCTCTCC	960
CTCCATTCTT TCTCCCATCT TCATCAATCC	CTTCTCTTCT	1000
GTCTTCCCCC CCGGTTCAGT AGAGATCAAT	CATCCGTCAA	1040
G ATG GCC GCC AGC TCT TCC CTC GAC CAC CTG AGC AAC	1077
Met Ala Ala Ser Ser Ser Leu Asp His Leu Ser Asn
5	10
CGC ATG AAG TTG GAG TGG CAC TCC AAG CTC AAC ACT	1113

Arg Met Lys Leu Glu Trp His Ser Lys Leu Asn Thr

20

GAG

ATG

GTG

CCC

TCC

AAG

AAC

TTC

CGC

CGC

ACC

TCC

1149

Glu

Met

Vai

Pro

Ser

Lys

Asn

Phe

Arg

Arg

Thr

Ser

25

30

35

ATC ATC GGA ACC ATC GGTACGTTCC TGCCAGTTGT GTCGTTGCGA 1194 Ile Ile Gly Thr Ile

TTGCCATCTC TTGATGAGGA CCTCGCACCC CGCACTTGAC 1234

CTCATCCGAG CTAACCTGCG ATTTTTCTTC AG GC CCC AAG ACC 1277

Gly Pro Lys Thr 45

AAC TCC GTG GAG AAG ATC AAC TCT CTC CGC ACT 1310

Asn Ser Vai Glu Lys Ile Asn Ser Leu Arg Thr

55

GGTACGAGCG ATAAAACATA TAACCTCTGG GAGTTATCAA 1350

TCAGCTGACT AGCTTGCAG CC GGT CTT AAC GTT GTT CGC ATG 1393

Ala Gly Leu Asn Vai Vai Arg Met

ACC TTC TCC CAC GGT TCT TAT GAG GTAAGAAGGG AACCCATCCG 1437

Asn Phe Ser His Gly Ser Tyr Glu

70

TGCATTGGCA CATGACGATA TGCTGACCCG CCCAG TAC CAC CAA 1481 Tyr His Gin

TCT Ser

GTT ATC GAC AAC

GCC Ala

CGC Arg

GAG GCC GCC AAG ACC

1517

Vai

Ile

Asp

Asn 80

Glu

Ala Ala 85

Lys

Thr

CAG

GTC

GGA

CGT

CCT

CTC

GCC

ATT

GCT

CTT

GAT

ACC

1553

Gin

Vai

Gly

Arg

Pro

Leu

Ala

Ile

Ala

Leu

Asp

Thr

90

95

GTAAGTTCGG GTCCCTTGGC TGGTCGCGAT CCTCCAAATT 1593

AACTCCTCTG TAG AAA GGA CCC GAG ATC CGT ACC GGA 1630

Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Gly 100 105

AAC ACC CCC GAT GAT AAG GAT ATC CCT ATC AAG CAG 1666

Asn Thr Pro Asp Asp Lys Asp Ile Pro Ile Lys Gin

110 115

GGC Gly 120

CAC GAG CTC AAC ATC ACC ACC GAC GAG CAA TAT

1702

His Glu Leu Asn

Ile Thr Thr 125

Asp

Glu

Gin 130

Tyr

GCC

ACC

GCC

TCC

GAC

GAC

AAG

AAC

AT i

3TAAGATTCC

1738

Ala

Thr

Ala

Ser

Asp

Asp

Lys

Asn

Met

135

140

TCCCCGCGTC CTTCCGATCT TGCCAGTGGA TTCGGGAGAC ' 1778 CAGCGCAGAT GTAGTCTGTG CATAGACTCC GCTGACAAGT 1818 CGGATTGTAG G TAC CTC GAC TAC AAG AAC ATC ACC AAG 1856

Tyr Leu Asp Tyr Lys Asn Ile Thr Lys 145

GTG Vai 150

ATC Ile

TCT CCT GGC AAG CTC ATC TAT GTT GAT

GAC Asp

1892

Ser

Pro

Gly

Lys Leu 155

Ile

Tyr

Vai

Asp 160

GGT

ATC

CTT

TCC

TTC

GAG

GTC

CTC

GAA

GTC

GTA

GAT

1928

Gly

Ile

Leu

Ser

Phe

Glu

Vai

Leu

Glu

Vai

Vai

Asp

165

170

GAC

AAG

ACC

ATC

CGC

GTC

CGG

TGC

TTG

AAC

AAC

GGC

1964

Asp

Lys

Thr

Ile

Arg

Vai

Arg

Cys

Leu

Asn

Asn

Gly

175

180

185

AAC

ATC

TCT

TCC

CGC

AAG

GGT

GTT

AAC

TTG

CCC

GGC

2000

Asn

Ile

Ser

Ser

Arg

Lys

Gly

Vai

Asn

Leu

Pro

Gly

190

195

ACT

GAC

GTT

GAC

CTC

CCC

GCC

CTT

TCC

GAG

AAG

GAC

2036

Thr

Asp

Vai

Asp

Leu

Pro

Ala

Leu

Ser

Glu

Lys

Asp

200

205

ATT

GCC

GAT

CTC

AAG

TTC

GGT

GTT

AGG

AAC

AAG

GTC

2072

Ile

Ala

Asp

Leu

Lys

Phe

Gly

Vai

Arg

Asn

Lys

Vai

210

215

220

GAC

ATG

GTC

TTC

GCT

TCT

TTC

ATC

CGC

CGC

GGT

AGC

2108

Asp

Met

Vai

Phe

Ala

Ser

Phe

Ile

Arg

Arg

Gly

Ser

225

230

GAC

ATT

CGC

CAC

ATC

CGT

GAG

GTT

CTG

GGT

GAG

GAG

2144

Asp

Ile

Arg

His

Ile

Arg

Glu

Vai

Leu

Gly

Glu

Glu

235

240

245

GGC

AAG

GAG

ATC

CAG

ATC

ATT

GCC

AAG

ATT

GAG

AAC

2180

Gly

Lys

Glu

Ile

Gin

Ile

Ile

Ala

Lys

Ile

Glu

Asn

250

255

CAG

CAG

GGT

GTC

AAC

AAC

TTC

GAC

GAG

ATC

CTC

GAA

2216

Gin

Gin

Gly

Vai

Asn

Asn

Phe

Asp

Glu

Ile

Leu

Glu

260

265

GAG

ACT

GAC

GGT

GTC

ATG

GTT

GCC

CGT

GGT

GAC

CTT

2252

Glu

Thr

Asp

Gly

Vai

Met

Vai

Ala

Arg

Gly

Asp

Leu

270

275

280

GGT

ATC

GAG

ATC

CCC

GCC

CCC

AAG

GTC

TTC

ATC

GCC

2288

Gly

Ile

Glu

Ile

Pro

Ala

Pro

Lys

Vai

Phe

Ile

Ala

285

290

CAG

AAG

ATG

ATG

ATC

GCC

AAG

TGT

AAC

ATC

AAG

GGT

2324

Gin

Lys

Met

Met

Ile

Ala

Lys

Cys

Asn

Ile

Lys

Gly

295

300

305

AAG

CCC

GTC

ATC

TGT

GCC

ACT

CAG

ATG

CTC

GAG

TCC

2360

Lys

Pro

Vai

Ile

Cys

Ala

Thr

Gin

Met

Leu

Glu

Ser

310

315

S $ .

ATG ACA

TAC Tyr 320

AAC Asn

CCT Pro

CGT CCT ACT

CGT GCC GAG GTG

2396

Met

Thr

Arg Pro

Thr 325

Arg

Ala

Glu Vai

TCC

GAT

GTT

GCC

AAC

GCC

GTC

CTT

GAC

GGT

GCC

GAC

2432

Ser

Asp

Vai

Ala

Asn

Ala

Vai

Leu

Asp

Gly

Ala

Asp

330

335

340

TGT

GTC

ATG

CTG

TCG

GGA

GAG

ACC

GCC

AAG

GGT

AAC

2468

Cys

Vai

Met

Leu

Ser

Gly

Glu

Thr

Ala

Lys

Gly

Asn

345

350

TAC

CCC

AAC

GAG

GCC

GTC

AAG

ATG

ATG

TCC

GAG

ACC

2504

Tyr

Pro

Asn

Glu

Ala

Vai

Lys

Met

Met

Ser

Glu

Thr

355

360

365

TGC

CTG

CTC

GCC

GAG

GTT

GCC

ATC

CCC

CAC

TTC

AAT

2540

Cys

Leu

Leu

Ala

Glu

Vai

Ala

Ile

Pro

His

Phe

Asn

370

375

GTG

TTC

GAT

GAG

CTC

CGC

AAC

CTT

GCT

CCT

CGC

CCC

2576

Vai

Phe

Asp

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu

Ala

Pro

Arg

Pro

380

385

ACC

GAC

ACT

GTC

GAG

TCC

ATC

GCC

ATG

GCT

GCC

GTT

2612

Thr

Asp

Thr

Vai

Glu

Ser

He

Ala

Met

Ala

Ala

vai

390

395

400

AGC

GCC

AGT

CTG

GAA

CTC

AAC

GCT

GGT

GCC

ATT

GTC

2648

Ser

Ala

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Ala

Gly

Ala

Ile

Vai

405 410

GTC TTG ACT ACC AG GTGAGTTGTA AATATCCAGA TGGGTAGGAT 2692 Vai Leu Thr Thr Ser

415

2733

GATTGTCGAC AGATCGCAGC GGT AAA ACT GCT CGC TAC CTT Gly Lys Thr Ala Arg Tyr Leu

420 425

TCC

AAG

TAC

CGC

CCC

GTC

TCG

CCC

ATT

GTC

ATG

GTT

2769

Ser

Lys

Tyr

Arg

Pro

Vai

Cys

Pro

Ile

Vai

Met

Vai

430

435

ACC

CGT

AAC

CCC

GCT

GCC

TCC

CGG

GTAAGTCGAG

2803

Thr

Arg

Asn

Pro

Ala

Ala

Ser

Arg

440

445

AAGCGTAGTG TTGTTTCGAG AGGTCGTGTG CTAACGTGTT

2843

GAATCCAG TAC TCT CAC CTG TAC CGT GGT GTC TGG CCC

2883

Tyr Ser His Leu Tyr Arg Gly Vai Trp Pro

450

455

TTC

CTC

TTC

CCC

GAG

AAG

AAG

CCC

GAC

TTC

AAC

GTC

2919

Phe

Leu

Phe

Pro

Glu

Lys

Lys

Pro

Asp

Phe

Asn

Vai

460

4 65

AAG

GTC

TGG

CAG

GAG

GAT

GTT

GAC

CGC

CGT

CTC

AAG

2955

Lys

Vai

Trp

Gin

Glu

Asp

Vai

Asp

Arg

Arg

Leu

Lys

470

475

TGG

GGT

ATC

AAC

CAC

GCT

CTT

AAG

CTC

GGC

ATC

ATC

2991

Trp

Gly

Ile

Asn

His

Ala

Leu

Lys

Leu

Gly

Ile

Ile

480

485

490

AAC

AAG

GGT

GAC

AAC

ATC

GTC

TGT

GTC

CAG

GGA

TGG

3027

Asn

Lys

Gly

Asp

Asn

Ile

Vai

Cys

Vai

Gin

Gly

Trp

95

500

CGC

GGC

GGT

ATG

GGC

CAC

ACC

AAC

ACC

GTC

CGT

GTG

3063

Arg

Gly

Gly

Met

Gly

His

Thr

Asn

Thr

Vai

Arg

Vai

505

510

515

-:fí

GTC CCT GCT GAG GAG AAC CTT GGC CTG GCT GAG TAA 3099

Vai Pro Ala Glu Glu Asn Leu Gly Leu Ala Glu

520 525

ATGCAAAAGC	AGTCTGGCAT GCCACCGGTT GGTGGATGAC	3139
ACGGTAACGA	CAGCGATTGG ATAGAAAGCG TCAAGGGTGT	3179
GTCTCTGGAT	ATCGTAGACC GGTCTCGCCG CCATGCGATG	3219
ACTCAGGTAG	TCTCCCCGCG GGCAGGCTGC TTGTGTCTTC	3259
ACTGCGAGAC	TCGTTAGTCG GGGCAGGACG AGGAGCACCA	3299
GGAGTGCGCA	CTTGCGTCTA CCACCACATT CACTTTGAGC	3339
CCGAAACGCG	CTGGGGGAAG ACACACACCT TGGGAACGTA	3379
ATGTGTATGT	ATCTTGATTT GACGTTAGTT AGCCAGCCAT	3419
GTTTGGTGGA	CTTTGCTGCG ATCAAAAGCT AGAATTTAAT	3459
GAGTTGTTCA	CAATGCCTCG ATGAGATAAA GCACAGCATC	3499
CTGAGTGTCA	GTCAGTATGA TTTGTTAGTG GAAATGCATT	3539
CCGAATCCCT	TGAGGATCAG TTTCTGAAGG TAAACTCATC	3579
ACCCCCAAGC	TGGCTATATA GAAACC	3605

TIPO DE SEQUÊNCIA; Nucleótidos uQMPKlMENTO DA SEQUêNCirs 21 bases

TIPO DE CADEIAs simples

TOPOLOGIAs linear

TIPO DE MOLÉCULAs oligonueleótido sintético desde í até 7 complementa? a 1048 de pki ds A, niqer dos nucleótidos iuo4 (SEQ ID

NO.Í >

desde í até 7 complementar dos nucleótidos Í04Í a 1034 (SEQ ID

NO.i )

Dligonucleótido	routsciénico 5926 para	a introdução
de um sítio Nsil	nas posições 1042 a	1047 do gene
pki de A. niqer,.

AGCTSSCATG CATCTT6ACG .5

X- X

SEQ ID MQ

ΤΪΡΟ DE SEQUÊNCIAs Nucleótidos com o correspondente polipeptideo COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA? 821 pb TIPO DE CADEIAs dupla

T0P0L061A ϊ 1inear

TIPO DE MOLÉCULA? genómica

ORGANISMO FONTE ORIGINALs A. niqer N4O0

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA? pGW1800 de E. coli DMÍ09/pGW1800 CARACTERÍSTICAS? desde 1 até 203 pb região do promotor PGII desde 204 até 26Í pb peptídeo sinal desde 262 até 8ÍS pb parte M-terminal do pro-PGlí

PROPRIEDADES? Parte terminalS⁵ do gene PGII de A. niqer compreendendo a região do promotor, sequência sinal

N—terminal de pro—PGII.

AACGAGGATC CAGGGTCCTA CATTTCCTCC AGGGGCTGTC 40

GGCAGTTATG AACTTTTCGA CCGGAAAAGA TTCGCAATAG 80

TCGTGAGTAT AAGAACCTCG TACCTGCTCA CACTGATGTC 120

TACTTGCTCA TCATTCCACA CTCATTCAAA ATGTTACCAA 160

CAACACTCCT TCTGTCATTC TTTTCTATTG TTAACAATTA ATC ATG 206

MET

J

CAC

TCG

TTT

GCT

TCT

CTT

CTC

GCC

TAC

GGC

CTG

GTC

242

His

Ser

Phe

Ala

Ser

Leu

Leu

Ala

Tyr

Gly

Leu

Vai

-15

-10

GCC

GGC

GCC

ACC

TTC

GCT

TCT

GCC

TCT

CCT

ATC

GAA

278

Ala

Gly

Ala

Thr

Phe

Ala

Ser

Ala

Ser

Pro

Ile

Glu

-5

5

GCT

CGA

GAC

AGC

TGC

ACG

TTC

ACC

ACC

GCT

GCC

GCT

314

Ala

Arg

Asp

Ser

Cys

Thr

Phe

Thr

Thr

Ala

Ala

Ala

10

15

GCT AAA Ala Lys

GCG GGC AAG GCG AAA TGC

TCT ACT ATC ACC

350

Ala Gly

Lys Ala Lys 25

Cys

Ser

Thr

Ile

Thr 30

20

CTT

AAC

AAC

ATC

GAA

GTT

CCA

GCT

GGA

ACC

ACC

CTC

386

Leu

Asn

Asn

Ile

Glu

Vai

PrO

Ala

Gly

Thr

Thr

Leu

35

40

GAC

CTG

ACC

GGT

CTC

ACC

AGC

GGT

ACC

AAG

GTC

ATC

422

Asp

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

Ser

Gly

Thr

Lys

Vai

Ile

45

50

TTC

GAG

GGC

ACC

ACG

ACC

TTC

CAG

TAC

GAA

GAA

TGG

458

Phe

Glu

Gly

Thr

Thr

Thr

Phe

Gin

Tyr

Glu

Glu

Trp

55

60

65

GCA

GGC

CCC

TTG

ATC

TCC

ATG

AGT

GGC

GAA

CAT

ATC

494

Ala

Gly

Pro

Leu

Ile

Ser

Met

Ser

Gly

Glu

His

Ile

70

75

ACC

GTC

ACT

GGT

GCC

TCC

GGC

CAC

CTC

ATC

AAT

TGC

530

Thr

Vai

Thr

Gly

Ala

Ser

Gly

His

Leu

Ile

Asn

Cys

80

85

90

GAT

GGT

GCG

CGC

TGG

TGG

GAT

GGC

AAG

GGA

ACC

AGC

566

Asp

Gly

Ala

Arg

Trp

Trp

Asp

Gly

Lys

Gly

Thr

Ser

95

100

GGA

AAG

AAG

AAG

CCC

AAG

TTC

TTT

TAC

GCC

CAT

GGC

602

Gly

Lys

Lys

Lys

Pro

Lys

Phe

Phe

Tyr

Ala

His

Gly

105

110

CTT

GAC

TCC

TCG

TCT

ATT

ACT

GGA

TTA

AAC

ATC

AAA

638

Leu

Asp

Ser

Ser

Ser

Ile

Thr

Gly

Leu

Asn

ile

Lys

115 120 125

AAC Asn

ACC CCC CTT ATG

GCG Ala

TTT AGT GTC CAG GCG AAT

674

Thr Pro

Leu Met 130

Phe

Ser

Vai 135

Gin

Ala

Asn

GAC

ATT

ACG

TTT

ACC

GAT

GTT

ACC

ATC

AAT

AAT

GCG

710

Asp

Ile

Thr

Phe

Thr

Asp

Vai

Thr

Ile

Asn

Asn

Ala

140

145

150

GAT

GGC

GAC

ACC

CAG

GGT

GGA

CAC

AAC

ACT

GAT

GCG

746

Asp

Gly

Asp

Thr

Gin

Gly

Gly

His

Asn

Thr

Asp

Ala

155

160

TTC

GAT

GTT

GGC

AAC

TCG

GTC

GGG

GTG

AAT

ATC

ATT

782

Phe

Asp

Vai

Gly

Asn

Ser

Vai

Gly

Vai

Asn

Ile

Ile

165

170

AAG

CCT

TGG

GTC

CAT

AAC

CAG

GAT

GAC

TGT

CTT

GCG

GTT

821

Lys

Pro

Trp

Vai

His

Asn

Gin

Asp

Asp

Cys

Leu

Ala

Vai

175

180

185

SEQ J..D NO, 4

TIPO DE SEOUêNClAs Wucleótidos com o correspondente polipeptideo COMPRIMENTO DA SEQUêNCIAs 653 pb TIFO DE CADEIA£ dupla

TOPOLOGIA s 1inear

TIPO DE MOLÉCULAϊ genóraica

ORGANISMO PONTE ORIGINALs A, niqer N4O©

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATAs pBWlSOô de E. coli JJIi09/pGWÍ800 ÍDSM 5505)

CARACTERíSTICASs desde 1 ate 116 pb região codificadora da parte C-termin-sI de pro-PGII

PROPRIEDADESs parte terminal 3⁵ do gene PGII compreendendo a parte C-terminal de pro-PQII.

J

TGG ACC TGG GAC GAT GTG AAA GTT ACC GGG	GGG AAG Gly Lys	74
Trp Thr Trp Asp Asp Vai Lys Vai	Thr	Gly
	15	20
AAG TCC	ACC	GCT TGC AAG AAC TTC	CCT	TCG	GTG GCC	110
Lys Ser	Thr	Ala Cys Lys Asn Phe	Pro	Ser	Vai Ala
25		30			35
TCT TGT	TAG	GCTGCTAGGT TGGTGAGTTG TAGCCCTAGC	149

Ser Cys END

TGAAATTCGT	CTGCTTCGTC	TGCTTCGTCT	GCTTCGTCTG	189
CTTCGTCTGC	TTCTTCTGCT	TCGTCTGCTT	TGTCTGCTTT	229
GTCTGCTTCG	TCCACTTCGT	CCACTTCGAC	TGGTTAGATG	269
GGCCTTGTAA	TAGTTTTTAG	AGAGAACAGA	ATATGTACAG	30 9
TAAGCCTTAG	AGGTGGTACC	GAGTTGTATA	TTTATTTAAA	349
ATGTTACCTA	TCGCGTGTCT	TTATATTTAT	AGCCTTTTAC	389
ATATATACGG	AGCTACAGTG	GATTATCTTA	CAGCCCACAC	429
TCATCGTGCT	GGGAACTACG	TGAATGAATG	CTCGGTTAGA	469
AGGCCTTGCT	CACTGCCACA	ACCAACCAGG	AACCTTGGCA	509
GGTACATGCT	TGGGCATTTT	TGTCTGGCCC	TATCTCTTTC	549
CAGATGGTGG	TCTGGATGAG	TCACGGCACG	AGTAGATTGA	589
CCGCTACTCC	AACCCGCGCA	TAAAGCATAC	GCCAGAAGTG	629
CAAGGGATAC	AAGACAGCCA	GCTG		653

SEQ ID NO,5

TIPO DE SEQUÊNCIAS Nucleótidos

COMPRIMENTO Dft SEQUÊNCIAs 20 bases

TIPO DE CADEIAs simples

TOPOLOGIA; 1inear

TIPO DE MOLÊCULAs sintética

CARACTERíSTICASsIdêntica â SEQ ID NO»ó com as bases 1 a 20 da cadeia codificadora ds sequência de PSII»

PROPRIEDADESs 01igonucleótido A para a construção de fusSes precisas de PGII com um gene heterólogo usando PCR

AAC8AG8ATC CA8GGTCCTA 20

5fcQ ID NO»6

TIPO Dfc. SEQUÊNCIA? Nucleótidos

COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 32 bases

TIPO DE CADEIA; simples

T OF‘OL 081A ; 1 i n e a r

TIPO DE MOLÉCULA; sintética

CARACTER!STICASs ds 1 a Í2 complementar da região do gene IFN

AMI 19 codificador dos aminoá.cidos 1 a 4 do IFN maduro» de 13 a 32 complementar das posições de bases 268 a 241 da cadeia codificadora da sequência PGII c om SEQ ID NQ6»

PROPRIEDADES; 01igonucleótido C útil na construção de genes de fusão precisa PBIIss-IFN AMI19»

ASGCAGATCA CAAGCGAAGS TGGCGCCG6C GA

SEQ ID NO.

TIPO DE BESUêSMCIAs Nucleótidos

COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIAs 272 pb

TIPO DE CADEIA? simples, cadeia codificadora

TOPOLOSIAs linear

TIPO DE MOLéCULAs recombinante

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA? PCR

CARACTERíST1CASs desde í até 2©3 região do promotor PGII de A» nxqer desde 2©4 até 2SB sequência sinal de PB11 de ft» niqer desde 259 até 27€* extremo N do híbrido IFN BDBB (IFN AMÍ195

PROPRIEDADES? DNA2 compreende uma fusão perfeita, de grelhas de leitura da sequência sinal ds PGII de A.__niqer e dos' aminoácidos N-terminais 1 a 4 do IFN AMI19 maduro (híbrido BDBB)« útil para a construção ds vectores de expressão para a produção de IFN secretaoo a pamr de nospedeiros h» nxqer»

J

AACGAGGATC CAGGGTCCTA CATTTCCTCC AGGGGCTGTC 40 GGCAGTTATG AACTTTTCGA CCGGAAAAGA TTCGCAATAG 80 TCGTGAGTAT AAGAACCTCG TACCTGCTCA CACTGATGTC 120 TACTTGCTCA TCATTCCACA CTCATTCAAA ATCTTACCAA 160 CAACACTCCT TCTGTCATTC TTTTCTATTG TTAACAATTA ATC ATG 206

MET

CAC His

TCG TTT GCT TCT

CTT CTC GCC TAC GGC CTG GTC

242

Ser Phe

Ala Ser -15

Leu Leu

Ala

Tyr -10

Gly

Leu

Vai

GCC

GGC

GCC

ACC

TTC

GCT

TGT

CAT

CTG

CCT

272

Ala

Gly

Ala

Thr

Phe

Ala

Cys

Asp

Leu

Pro

-5

J

.s s a v

SEQ ΙΌ NO»8

TIPO DE SEBUÊHCIAs Nucleótidos

COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIAs 32 bases

TIPO DE CADEIAs simples

TOPOLOGIA? linear

TIPO DE MOLÉCULAs sintética

CARACTERÍSTICAS? de 1 a 12 pb idêntica a SEQ ID N0„6 com as bases 249-26Í da cadeia codificadora do gene PGII de 13 a 32 pb idêntico à região codificadora dos aminoácidos N—terminais 1 a 7 do IFN AM 119 maduro (híbrido BDBB)

PROPRIEDADESs Oligonucleótido D para a construção de fusões precisas das grelhas de leitura das regiões codificadoras da sequência sinal ΡΘΣΙ de ft» niger e de 1!- N AM ί 19 κ

GCC í GMuAcT uê

J

SEQ ID NO »9

TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos

COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 20

U-ãVíS-èíS

TIPO DE CADEIA: simples

TOPOLOGIA5 1inear

TIPO DE MOLÉCULAs sintética

CARACTER íSTICAS; Complementar de um segmento na região não codificadora 3^? da cadeia codificadora do gene IFN AM1Í9 (híbrido BDBB)» Compreende um sítio EcoRI.

PROPRIEDADES: 01igonucleótido F para a construção de vectores de expressão para a expressão de IFN AM119»

CCTBBGGSAA TTCAAABTCA

SEQ ID NO»10

TIPO DE StQOÊNCIA; Linear

COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 133 bases TIPO DE CADEIA: simples TOPOLOGIA; linear TIPO DE MOLÉCULA; recombinante

de 1	a 12
PGi I	ds A
ds 13	; a i:
. tu ra	da. p(
niqer	e ds

rtxí para construção de vac tares de expressão para a produção de IFN secretado a partir de hospedeiros A„ nioer»

GCC ACC TTC

GCT TGT GAT CTG CCT CAG ACT CAC AGC

36

Ala

Thr

Phe

Ala

Cys

Asp Leu

Pro Gin

Thr His

Ser

CTG

GGT

AAC

AGG

AGG

GCC

TTG

ATA

CTC

CTG

GCA

CAA

72

Leu

Gly

Asn

Arg

Arg

Ala

Leu

Ile

Leu

Leu

Ala

Gin

ATG

CGA

AGA

ATC

TCT

CCT

TTC

TCC

TGC

CTG

AAG

GAC

108

Met

Arg

Arg

Ile

Ser

Pro

Phe

Ser

Cys

Leu

Lys

Asp

AGA

CAT

GAC

TTT

GAA

TTC

CCC

CAG

G

133

Arg

His

Asp

Phe

Glu

Phe

Pro

Gin

J

TIPO Dt SEQUfeNCIAs Nucleótidos

COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIAs 990 pb

TIPO DE CADEIA5 dupla

TOPOLOGIA? linear

TIPO DE MOLÉCULA? recombinante

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA? Plasmídeo PSIIssIFN AMI19 CARACTERISTICASs desde í até 178 pb nrosiotor de A« niger

PROPRIEDADE?

desde 199 até		pb sequência sinal de	PS II de
A» niqer
desde 256 até	753	pb IFN AMI 19 maduro ('	híbrido
BDBB)
desde 756 até	Opil i M* t	pb terminador de PH05	ds
levedura
desde 1 até 6	pb	sítio BamHI
desde 364 até	-5-6V	pb sitio EcoRI
desde 364 até		pb sítio EcoRI
d ε s d e 8 85 a t é	990	pb sitio PstI
igmento BamHI-P	‘stl	do pPGIIssIFN Alfí 19

compreendendo o sí qual contem a fusS da sequência sinal

Interferão AMI19 C PGIT e terminador tio BamHI-EcoRI gerado por PCR o to perfeita de grelhas de leitura de PGII e do gene estrutural do híbrido BDBB) ligado ao promotor de PH05„

J

GG ATCCAGGGTC CTACATTTCC TCCAGGGGCT GTCGGCAGTT 42

ATGAACTTTT CGACCGGAAA AGATTCGCAA TAGTCGTGAG TATAAGAACC 92

TCGTACCTGC TCACACTGAT GTCTACTTGC TCATCATTCC ACACTCATTC 142

AAAATCTTAC CAACAACACT CCTTCTGTCA TTCTTTTCTA TTGTTAACAA 192

TTAATCATGC ACTCGTTTGC TTCTCTTCTC GCCTACGGCC TGGTCGCCGG 242

CGCCACCTTC GCTTGTGATC TGCCTCAGAC TCACAGCCTG GGTAACAGGA 292

GGGCCTTGAT ACTCCTGGCA CAAATGCGAA GAATCTCTCC TTTCTCCTGC 342

CTGAAGGACA	GACATGACTT	TGAATTCCCC	CAGGAGGAGT	TTGATGATAA	392
ACAGTTCCAG	AAGGCTCAAG	CCATCTCTGT	CCTCCATGAG	ATGATCCAGC	442
AGATCTTCAA	CCTCTTTACC	ACAAAAGATT	CA-TCTGCTGC	TTGGGATGAG	492
GACCTCCTAG	ACAAATTCTG	CACCGAACTC	TACCAGCAGC	TGAATGACCT	542
GGAGTCCTGT	GTGATGCAGG	AAGTGGGGGT	GATAGAGTCT	CCCCTGATGT	592
ACGAGGACTC	CATCCTGGCT	GTGAGGAAAT	ACTTCCAAAG	AATCACTCTA	642
TATCTGACAG	AGAAGAAATA	CAGCTCTTGT	GCCTGGGAGG	TTGTCAGAGC	692
AGAAATCATG	AGATCCTTCT	CTTTATCAAT	CAACTTGCAA	AAAAGATTGA	742
AGAGTAAGGA	ATGAGACCTG	GTACAACACG	GAAATGATTC	TTATAGACTA	792
ATACAGCAGC	TCACACTTCG	TCGAGGGTCA	GCAGCGTCAG	TAACTCTACT	842
GAATTGACCT	TCTACTGGGA	CTGGAACACT	ACTCATTACA	ACGCCAGTCT	892
ATTGAGACAA	TAGTTTTGTA	TAACTAAATA	ATATTGGAAA	CTAAATACGA	942

ATACCCAAAT TTTTTATCTA AATTTTGCCG AAAGATTAAA ATCTGCAG 990

J

3EQ ID N0.Í2

TIPu DL SEBUêNCIfts Nucleótidos

COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIAs 45 bases

ΓΙΡΟ DE CfiDElAs simples

TOPOLOGIA 5 1inear λHO Dl nULéCULM» sintética

CARACTERíSTICASs desde a base 1 até à ió idêntico às bases 1026 1041 da região do promotor pki íSEbí iu NO,. 1) desde a base 17 até á base 19 codão de iniciaçã A s ΰ desde a base 2® até á base 45 aminoãcidos í a 9 do IFN AM ÍÍ9 thíbrido BDBB)

PROPRIEDADES? 01igonucleótido IFIM-Í, útil para a preparação de fusões perfeitas do promotor pki de A. niqer e o qene estrutural de IFN AK-119 usando PCR

TCAATCATCC GTCAAGATST GTGATCTGCC ASCCT

TCAGACTCAC

4ô

SEQ ID NQ

TIPO DE SEQUãNClA; Nucleótidos

COMPRIMENTO DA StláUSiNC IA s 42 bases

TIPO DE CADEIAS simples

TOPOLOGIA? linear

TIPO DE MOLÉCULAS sintética

CARACTERíSTICASs desde a base 1 até à 2Í idêntico às bases 1031 a 1041 da cadeia codificadora do gene pki CSEQ ID NQ-Ι, região do promotor?» aesde a base 22 srè a oase 4z xdêntico ãs oases 204 a 224 da cadeia codificadora do gene PGII CSEQ ID NO=6, sequência sinal)»

PROPRIEDADES; Oligonucleótido IFN-2, útil para a preparação de fusões perfeitas do promotor pki de A» niger e a sequência sinal de PGII de A» niger usando PCR»

AG Αΰ AiCAA! CAlCCGTCAA GA 1 GoACTCt TT

SEQ ID NO.14

TIPO DE SEQUÊNCIA; Nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 1901 ph TIPO DE CADEIA; dupla

TOPOLOGIAs linear

TIPO DE MOLÉCULA; recombinante

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA; CARACTERfSTICAS; desde 1 até

TTT6CTTCTC í -”5

P1asmi deo pPKI — IFN—2 6 pb sitio BaffiHI desde i até 742 pb idêntico ao fragmento do promotor pki estendendo-se desde até 1041 di sequência designada SEQ ID Nli.i desde /42 até 744 ob codão de iniciação ATG

desde	/45 at-é 1	243 '	pto gene estrutural do ΪΗΜ
AM 119	C híbrido	BDBB	Z u
desde	1244 até	1245	pb	codão de paragem ΤΘΑ
desde	1 «ώΉ* e tí	1476	pb	fragmento terminador de
PH05 d	e levedur	a
desde	1477 até	1842	pb	sítio Sphl
desoe	1483 até	f f-sfi Λ ÍQ74	pb	terminador pki de A»
niqer
desde	1898 até	19© 1	pb	sitio EcoRI

PROPRIEDADESs fragmento BamHI/EcoRI de pPK.I-IFiM-2» Compreende um fragmento promotor pki de ft, niqer fundido com uma -sequência de DNA compreendo um codão de iniciação, o qene estrutural IFN AM119 e parte da região do terminador PHO5> de levedura assim como o terminado pki de ft. niqer»

GGATCCGCGAC GATGTGGGGT CAACTGGACA GAGTGAGAGG GTATCATGTG 51

GTCCTGCCAG ATACTTCGCA GAATGTTGTG TGGGTGTCTG ATTGTGGCTT 101

GGGCGTGAAT TGCTTTTGGT CTTCCCAACC ΑΑΤΤΑΤΤΑΤΤ GCATGCGGCG 151

TATGAATGCC TGAGATGCGC GGAGGGAAGG TGCCTGAGGA TGTAGTGGAC 201

AAATGCTGCT GATCGCTGGG CGGAAACCCT TGGCTGACCA GTGAAAAGAG 251

CGGACGGAGG CAGCAGGTGT ATCTACGATC AAAGAATAGT AGCAAAGCAG 301

TGAAAGGTGG ATCACCCAGC AAATAATTGA GTTTTGATAC CCAGCGATAG 351

TGCCGGGGGG GAGAAAAAGT CATTAATAAT GGGAATTATG TAGGCGATGG 401

GAAGTGTGAT	TGTAACTACT	CCGTAGCTGG	AGGCACAACT	AACAAGCCAG	451
CTCTCAACCC	GCGGGGAACC	GACCGACnGA	TAAAAAAAAG	CGTCCCAAAG	501
CAGGAATCCC	ACCAAAAAGG	GCCGATCCAG	CCAATCACCG	CCGCCAACAT	551
TTTTCCTTCC	CGGGCACCCC	TCCTCTAGTC	CACCATCTCT	CTCTTCTCTC	601
GCTCACCGGC	CCCGTCTTTT	CCTTCCCTAT	TATCTCTCCC	TCTTCTCCTC	651
CCTTCTCTCC	CTCCATTCTT	TCTCCCATCT	TCATCACTCC	CTTCTCTTCT	701
GTCTTCCCCC	CCGGTTCAGT	AGAGATCAAT	CATCCGTCAA	GATGTGTGAT	751
CTGCCTCAGA	CTCACAGCCT	GGGTAACAGG	AGGGCCTTGA	TACTCCTGGC	801
ACAAATGCGA	AGAATCTCTC	CTTTCTCCTG	CCTGAAGGAC	AGACATGACT	851
TTGAATTCCC	CCAGGAGGAG	TTTGATGATA	AACAGTTCCA	GAAGGCTCAA	901
GCCATCTCTG	TCCTCCATGA	GATGATCCAG	CAGATCTTCA	ACCTCTTTAC	951
CACAAAAGAT	TCATCTGCTG	CTTGGGATGA	GGACCTCCTA	GACAAATTCT	1001
GCACCGAACT	CTACCAGCAG	CTGAATGACC	TGGAGTCCTG	TGTGATGCAG	1051
GAAGTGGGGG	TGATAGAGTC	TCCCCTGATG	TACGAGGACT	CCATCCTGGC	1101
TGTGAGGAAA	TACTTCCAAA	GAATCACTCT	ATATCTGACA	GAGAAGAAAT	1151
ACAGCTCTTG	TGCCTGGGAG	GTTGTCAGAG	CAGAAATCAT	GAGATCCTTC	1201
TCTTTATCAA	TCAACTTGCA	AAAAAGATTG	AAGAGTAAGG	AATGAGACCT	1251

GGTACAACAC GGAAATGATT CTTATAGACT AATACAGCAG CTCACACTTC 1301

GTCGAGGGTC	AGCAGCGTCA	GTAACTCTAC	TGAATTGACC	TTCTACTGGG	1351
ACTGGAACAC	TACTCATTAC	AACGCCAGTC	TATTGAGACA	ATAGTTTTGT	1401
ATAACTAAAT	AATATTGGAA	ACTAAATACG	AATACCCAAA	TTTTTTATCT	1451
AAATTTTGCC	GAAAGATTAA	AATCGGCATG	CCACCGGTTG	GTGGATGACA	1501
CGGTAACGAC	AGCGATTGGA	TAGAAAGCGT	CAAGGGTGTG	TCTCTGGATA	1551
TCGTAGACCG	GTCTCGCCGC	CATGCGATGA	CTCAGGTAGT	CTCCCCGCGG	1601
GCAGGCTGCT	TGTGTCTTCA	CTGCGAGACT	CGTTAGTCGG	GGCAGGACGA	1651
GGAGCACCAG	GAGTGCGCAC	TTGCGTCTAC	CACCACATTC	ACTTTGAGCC	1701
CGAAACGCGC	TGGGGGAAGA	CACACACCTT	GGGAACGTAA	TGTGTATGTA	1751
TCTTGATTT&	ACGTTAGTTA	GCCAGCCATG	TTTGGTGGAC	TTTGCTGCGA	1801
TCAAAAGCTA	GAATTTAATG	AGTTGTTCAC	AATGCCTCGA	TGAGATAAAG	1851

CACAGCATCC TGAGTGTCAG TCAGTATGAT TTGTTAGTGG AAAGGAATTC 1901

pb idêntico ao fragmento do 'f I PO DE SEuUÊNC I A s Nuc 1 eó t i d os

COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA; 2020 pb

TIPO DE CADEIA; dupla

T OPOLOGIA s li near

TIPO DE MOLÉCULAs recombinante

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA? Plasmídeo pPKIssIFN-2 CARACTERÍSTICAS; desde í até 6 pb sítio BamHl desde í até promotor pki estendendo—ss desde a posição 300 até 1041 da sequência designada SEQ ID M0.1 desde 743 até 799 pb sequência sinal de PGII de A.-, niqer desde 800 até 1297 pb do gene estrutural de IFN AM1í 9 (híbrido BDBB) desde 1298 até 130€* pb codão de paragem TBA desde 13©lafcé 1528 pb fragmento terminador de PH05 de levedura desde 1519 atê Í534 pb sitio Sphl desde 1535 até 1948 pb terminador pki de A» niqer desde 1950 até

1955 pb sítio EcoRI fragmento BamHl/EcoRI do pPKIssIFN—2» Compreende um fragmento promotor pki de A. niqer fundido com uma sequência de DNA compreendo um codão de iniciação, o gene estrutural IFN AM119(híbrido BDBB) e parte da região do terminador PHO5 de levedura assim como o terminador pki de ft. niqer»

PROPRIhDADtS s

s . f. i?

GGATCCGCGAC GATGTGGGGT CAACTGGACA GAGTGAGAGG GTATCATGTG

GTCCTGCCAG

GGGCGTGAAT i

TATGAATGCC

AAATGCTGCT

CGGACGGAGG

TGAAAGGTGG

TGCCGGGGGG

GAAGTGTGAT

CTCTCAACCC

ATACTTCGCA GAATGTTGTG

TGCTTTTGGT CTTCCCAACC

TGAGATGCGC GGAGGGAAGG

GATCGCTGGG CGGAAACCCT

CAGCAGGTGT ATCTACGATC

ATCACCCAGC AAATAATTGA

GAGAAAAAGT CATTAATAAT

TGTAACTACT CCGTAGCTGG

GCGGGGAACC GACCGACNGA

TGGGTGTCTG ATTGTGGCTT

AATTATTATT GCATGCGGCG

TGCCTGAGGA TGTAGTGGAC

TGGCTGACCA GTGAAAAGAG

AAAGAATAGT AGCAAAGCAG

GTTTTGATAC CCAGCGATAG

GGGAATTATG TAGGCGATGG

AGGCACAACT AACAAGCCAG

TAAAAAAAAG CGTCCCAAAG

101

151

201

251

301

351

401

451

501

CAGGAATCCC ACCAAAAAGG GCCGATCCAG CCAATCACCG CCGCCAACAT 551

TTTTCCTTCC	CGGGCACCCC	TCCTCTAGTC	CACCATCTCT	CTCTTCTCTC	601
GCTCACCGGC	CCCGTCTTTT	CCTTCCCTAT	TATCTCTCCC	TCTTCTCCTC	651
CCTTCTCTCC	CTCCATTCTT	TCTCCCATCT	TCATCACTCC	CTTCTCTTCT	701
GTCTTCCCCC	CCGGTTCAGT	AGAGATCAAT	CATCCGTCAA	GATGCACTCG	751
TTTGCTTCTC	TTCTCGCCTA	CGGCCTGGTC	GCCGGCGCCA	CCTTCGCTTG	801
TGATCTGCCT	CAGACTCACA	GCCTGGGTAA	CAGGAGGGCC	TTGATACTCC	851
TGGCACAAAT	GCGAAGAATC	TCTCCTTTCT	CCTGCCTGAA	GGACAGACAT	901
gactttgaat	TCCCCCAGGA	GGAGTTTGAT	GATAAACAGT	TCCAGAAGGC	951
TCAAGCCATC	TCTGTCCTCC	ATGAGATGAT	CCAGCAGATC	TTCAACCTCT	1001
TTACCACAAA	AGATTCATCT	GCTGCTTGGG	ATGAGGACCT	CCTAGACAAA	1051
TTCTGCACCG	AACTCTACCA	GCAGCTGAAT	GACCTGGAGT	CCTGTGTGAT	1101
GCAGGAAGTG	GGGGTGATAG	AGTCTCCCCT	GATGTACGAG	GACTCCATCC	1151
TGGCTGTGAG	GAAATACTTC	CAAAGAATCA	CTCTATATCT	GACAGAGAAG	1201
AAATACAGCT	CTTGTGCCTG	GGAGGTTGTC	AGAGCAGAAA	TCATGAGATC	1251
CTTCTCTTTA	TCAATCAACT	TGCAAAAAAG	ATTGAAGAGT	AAGGAATGAG	1301
ACCTGGTACA	ACACGGAAAT	GATTCTTATA	GACTAATACA	GCAGCTCACA	1351
CTTCGTCGAG	GGTCAGCAGC	GTCAGTAACT	CTACTGAATT	GACCTTCTAC	1401

TGGGACTGGA ACACTACTCA TTACAACGCC AGTCTATTGA GACAATAGTT 1451

TTGTATAACT	AAATAATATT	GGAAACTAAA	TACGAATACC	CAAATTTTTT	1501
ATCTAAATTT	TGCCGAAAGA	TTAAAATCGG	CATGCCACCG	GTTGGTGGAT	1551
GACACGGTAA	CGACAGCGAT	TGGATAGAAA	GCGTCAAGGG	TGTGTCTCTG	1601
GATATCGTAG	ACCGGTCTCG	CCGCCATGCG	ATGACTCAGG	TAGTCTCCCC	1651
GCGGGCAGGC	TGCTTGTGTC	TTGACTGCGA	GACTCGTTAG	TCGGGGCAGG	1701
ACGAGGAGCA	CCAGGAGTGC	GCACTTGCGT	CTACCACCAC	ATTCACTTTG	1751
AGCCCGAAAC	GCGCTGGGGG	AAGACACACA	CCTTGGGAAC	GTAATGTGTA	1801
TGTATCTTGA	TTTGACGTTA	GTTAGCCAGC	CATGTTTGGT	GGACTTTGCT	1851
GCGATCAAAA	GCTAGAATTT	AATGAGTTGT	TCACAATGCC	TCGATGAGAT	1901
AAAGCACAGC	ATCCTGAGTG	TCAGTCAGTA	TGATTTGTTA	GTGGAAAGGA	1951

ATTC

1955

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   V ·'

   epa? ração do promotor de trans- A n Π X Q t? ¹ contida na sequência der i vado ou fragmento com ado por c empreender a prepara-

   ção de tal molécula de DNA por uma síntese in vitro, oor tecnologia de DNA recombinante ou isolamento da referida sequência de EíNA a partir de um hospedeiro que possua tal sequência de DNA =

   - Processo de acordo com a reivindicação í caracterizado por se preparar um fragmento gue se estende desde um nucleótido por volta da posição 300 ate um nucleótido à volta da posição 1042 da sequência de DNA com a SEQ TO NO=1»
2. 3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1₅ caracterizado por se preparar um derivado gue é um mutante, um derivado recombinante ou um derivado recombinante de um mutante de uma molécula de DNA contida na sequência de nucleótidos com a SEQ ID NO,1 ou um seu fragmento mantendo a actividade ds promotor.
3. 4s„ - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se preparar um mutante tendo um novo sítio de clivagem com enzima de restrição a jusante do promotor pki que pode ser usado para inserção de um gene estrutural que é então operacionalmente ligado ao promotor pki.
4. 5ã« - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado po se preparar o fragmento BamHI/Nsil de 720 pb inserido no DNA RF de Mí3mpi8-F*I< (BamHl-NsiI-PvulI), os. — Processo ae acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se preparar um derivado recombinante que contem um oligonucleótido adaptador ligado a um extremo o⁵ e/ou 5^! de uma
5. 7â, - Processo d-e acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se preparar um derivado recombinante que compreende uma actividade de promotor pki e um gene estrutural homólogo ou heterólogo com ou sem intrSes, exceptuando o gene estrutural homólogo pki „ o qual é operacionalmente ligado ao promotor pki e facultativamente um oligonucleótido adaptador e/ou uma outra sequência de controle da expressão além do promotor pki que é operacionalmente ligada ao referido gene estrutural,

   Sê, -· Processo para a preparação de um vector híbrido compreendendo como umas inserção o promotor pki inserido na sequência ds DNA com SEQ 1D NO,Í ou um seu derivada ou fragmenta com actividade de promotor excepto pGWlíOD, caracterizado por compreender a ligação de um vector linearizado útil em engenharia genética com um promotor da transcrição da piruvato-cinase (pki) de A»· niqer inserido na sequência de DNA com SEQ 1D N0.1 ou um seu fragmento ou derivado com actividade de promotor, a transformação de uma célula adquada com a mistura de ligação, a identificação e/ou a selecção dos transformantes s o isolamento do vector hí bri do pre ten d ido.
6. 9ê, - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ser produzido Mi3mplQ—F'K í JtísínHI—Msil—Pvul I) =

   Í0â, - Processo de acordo com -a reivindicação 8, caracterizado por ser produzido um vector híbrido compreendendo um gene estrutural homólogo ou heterólogo diferente do gene estrutural da piruvato-cinase de A, niqer operacionalmente ligado ao promotor pki da reivindicação í ou um seu fragmento ou derivado com actividade ds promotor.

   1 lã, — Processe caracterizado por ser produ

   122, - Processo de acordo com caracterizado por ser produzido pPKIssIFM-2, í-iâ» - Processo de acordo com caracterizado por ser produzido pPK-PLB» a reivindicação 8.

   ivindicaçãc 8, t4ã =

   Processo de acord·:

   com . v ma ícaçáo 8, caracterizado por ser produzido M13mpíS-PK(BamHI-PvulI)

   15ã, - Processo de aerdo -com a reivindicação 8, carac terizado por ser produzido M13mpl8-PK(BamHI-ÍMsiI-PvuI I ϊ.

   16ã» — Processo para a preparação de um hospedeiro transformado com um vector híbrido compreendendo como uma inserção o promotor pki compreendido na sequência de DNA com SEQ ID NO,1 ou um seu derivado ou fragmento com actividade de promotor, excepto pGWÍ100, caracterizados por compreender o tratamento ds um hospedeiro adequado em condições de transformação com uma molécula de DNA ou vector híbrido do invento, facultativamente juntamente com um gene de marca selsctiva,

   Í7ã = - Processo de acordo com s reivindicação 16, caracterizado por o hospedeiro transformada ser seleccionado de entre um grupo de hospedeiros transformados consistindo em E, co 11 i3HÍ0l transformada com pf-ΊίI — ihiM—2, pKIssIFhí—2 ou pKfC—PLB, E, coli DH5u transformada com pPKI-IFN-2, pKIssIFN-2 ou pPK~PLB, Aspergillus niqer An8 transformado- com pPK-PLB, pPKI-IFM-2 ou pKIssIFN-2 a facultativamente com o plasmídeo da marca selsctiva pGW-613 ou pCS59D7 e Aspergillus niqer N59-3 transformado com

   -•ií

   COlTi í ppfí-PLB, pPK I — IFN-2 ou pPKIssIFN·

   Taci ul-ta-ciVamen te o plasmídeo da marca selectiva pGWóló ou pCGo9D7

   Í8â» - Processo para, a preparação de um polipeptídeo caracterizado por um gene estrutural codificador de tal polipe ptideo ser operacionalmente ligado ao promotor pki ou um ses fragmento ou mutante com actividade de promotor e ser expresse num hospedeiro adequado»

   Processo de acordo com rei v ι η α i c a ç a o caracterizado por ser produzido o interferão híbrido humano BDBB

   Processo de acordo com a reivindicação Itó caracterizado por ser produzida pectina-1iase da A» niqer»

   21ã» — Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por ssr produzida poligalacturonase de A» niqer» .isboa, 21 de Dezembro de