KR0166956B1 - 펙틴 리아제의 발현 시스템을 암호화하는 재조합 dna분자 - Google Patents

Abstract

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Description

펙틴 리아제의 발현 시스템을 암호화하는 재조합 DNA 분자

제1도는 pel A 유전자를 함유하는 pGW 820의 제한 지도이다.

제2도는 pel B 유전자를 함유하는 pGW 830의 제한 지도이다.

제3도는 pel C 유전자를 함유하는 pGW 850의 제한 지도이다.

제4도는 pel D 유전자를 함유하는 pGW 840의 제한 지도이다.

제5도는 pel E 유전자를 함유하는 pGW 880의 제한 지도이다.

제6도는 pel F 유전자를 함유하는 pGW 860의 제한 지도이다.

제7도는 pel A 유전자에 대한 서열화 방법을 나타낸 것이다.

제8도는 pel B 유전자에 대한 서열화 방법을 나타낸 것이다.

제9도는 pel C 유전자에 대한 서열화 방법을 나타낸 것이다.

제10도는 PLA를 암호화하는 유전자를 함유하는 서열식(I)의 DNA 분자 pel A의 서열을 나타낸 것이다.

제11도는 PLB를 암호화하는 유전자를 함유하는 서열식(II)의 DNA 분자 pel B의 서열을 나타낸 것이다.

제12도는 PLC를 암호화하는 유전자를 함유하는 서열식(III)의 DNA 분자 pel C의 서열을 나타낸 것이다.

제13도는 PLD, PLA 및 PLC 간의 아미노산 서열 수준에서의 상동성을 나타낸 것이다.

제14도는 하이브리드 인터페론 BDBB를 암호화하는 유전자를 함유하는 벡터 pUC 19/pel A-IFN AM 119의 작제를 도시한 것이다.

제15도는 pel A 시그날 서열의 결실 돌연변이 처리를 위해 사용된 올리고 뉴클레오타이드 프라이머와 정렬된, 고리지어 제거되는 시그날 서열이 있는 플라즈미드 pel A-IFN AM 119상의 pel A-IFN 융합체 일부의 비암호화 쇄를 나타낸 것이다.

본 발명은 유전 공학 분야의 발현 시스템에 관한 것으로, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)의 몇몇 펙틴 리아제(pectin lyase)를 암호화 하는 DNA 서열 및/또는 이의 프로모터(promoter), 시그날(signal) 및 터미네이터(terminator) 서열을 함유하는 DNA 분자를 제공한다. 이 DNA 분자는 아스퍼질러스에서 펙틴 리아제의 과생성 및/또는 사상균(filamentous fungi) 및 다른 진균류에서 외래 유전자를 발현시키는 하이브리드 벡터의 작제에 유용하다. 이에 따라 다른 펙틴 리아제로의 오염 없이 단일 펙틴 리아제를 생성할 수 있게 되었다.

유전 공학 기술에 있어서 원핵 및 진핵성 숙주를 위한 많은 폴리펩타이드 발현 시스템이 이미 공지되어 있지만, 공지된 시스템보다 더 유리한 새로운 시스템은 계속 필요하다.

매우 광범위하게 사용되는 것은 원핵성 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 숙주 및 진핵성 효모 숙주, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)이며, 이를 위해 많은 상이한 발현 하이브리드 벡터(대부분 플라즈미드)가 개발 되어 왔다. 이.콜라이 숙주의 결점은 형성된 폴리펩타이드를 글리코실화할 수 없다는 것과 분비할 수 없기 때문에 외래성 펩타이드가 숙주 세포내에 축적되어 더 이상의 성장을 방해할 수 있다는 것이다. 그러나, 효모 숙주는 글리코실화 할 수 있으나, 이.콜라이와 같이, 매우 작은 폴리펩타이드를 제외하고는 영양 배지 내로 분비하지 못한다. 효모는 단지 세포외질 공간에 분비한다. 좀 더 고등한 진핵성 숙주는 글리코실화할 수 있고 영양 배지로 분비할 수 있는 포유 동물의 암세포이지만, 이의 배양은 매우 느리고 비용이 비싸고, 발암성 핵산이 목적하는 펩타이드와 함께 분리되는 위험이 따른다.

다른 숙주에 대한 필요성으로, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 및 아스퍼질러스 니거와 같은 사상균이 연구되어 왔다. 이러한 진균류는 산업 목적을 위해 이미 널리 사용되어 왔지만 유전 공학 기술에 이를 적용시키는 것은 적합한 형질전환 시스템이 없기 때문에 지연되고 있다. 사카로마이세스 세레비지에와 달리 사상균은 외래성 유전자의 도입 및 표현형 선별에 사용될 수 있는 플나즈미드를 함유하지 않는다. 그러나, 선별 가능한 마커(marker) 유전자를 함유하는 외래성 플라즈미드로 사상균을 형질전환시키는 것이 가능해졌다. 사상균에 대해 이제까지 설명된 모든 벡터는 자가 복제하지 못하지만, 효모에서와 마찬가지로, 진균의 염색체내에 통합된다. 이러한 과정은 단지 매우 낮은 빈도로 일어난다. 한편, 유리하게는 통합성 형질전환으로 형질 전환체가 비선별성 조건하에서도 유사분열적으로 매우 안정해진다. 백개 이상의 복사체를 갖는 안정한 통합화가 보고되어 있다.

설명된 사상균에 대한 첫 번째 벡터는 뉴로스포라 크라사의 qa-2 유전자를 선별 마커로서 함유한다. 이 유전자는 이화작용의 데하이드로퀴나제 효소를 암호화하며 엔.크라사의 aro 돌연변이체의 작용적 보완에 사용될 수 있다[참조: Case, M. E., Schweizer, M., Kushner, S. R. 및 Giles, N. H. (1979) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263]. Aro 돌연변이체는 방향족 아미노산 공급 없이는 최소배지에서 성장할 수 없다. qa-2 벡터로 엔.크라사를 형질전환하면 플라즈미드 단일 복사체가 엽색체내로 통합된다. 안정한 Aro⁺통합체의 30%가 박테리아 플라즈미드 서열에 결합된 채로 통합된 qa-2 유전자를 보유한다[참조: Case, M. E. (1982) in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A., DeMoss, D., kaplan, S., Konisky J., Savage, D. 및 Wolfe, R.S., eds), pp 87-100, Plenum]. 이러한 관찰은 선별성 서열과 함께 비-선별성 DNA 서열이 동시 형질전환되는 것이 가능한 일이라는 것을 나타낸다.

아스퍼질러스 니둘란스는 성 주기를 가지므로 고전적인 유전자 조작법을 수정할 수 있고, 음성 및 양성 선별 시스템이 확인되어 왔다. 엔.크라스로부터의 이질성 DNA 또는 상동성 DNA를 사용하여, pyr G 유전자를 함유하는 플라즈미드로 형질전환시킴으로 에이. 니둘란스 pyr G 돌연변이체의 작용적 보완을 얻는다[참조: Ballance et al, BBRC 112, 284 1983; Tilburn et al., Gene 26, 205, 1983]. 다른 시스템 돌연변이체에 있어서는, trp C 또는 arg B 좌위에서, 적당한 플라즈미드로 형질전환시킴으로써 작용적 보완이 일어난다[참조: Yelton et al. PNAS 81, 1470, 1984; Yelton et Timberlake J. cell, Biochem. Suppl. 9C 173, 1985; Johnstone et al., EMBO J. 4, 1307, 1983].

에이. 니둘란스로부터 분리된 amd S 유전자를 이용하는 우성 양성 선별 시스템이 개발되어 이로써 형질전환된 에이. 니거를 유일한 질소원으로서의 아세트아미드상에서 자랄 수 있도록 할 수 있다[참조: Tilburn et al., Gene 26, 205, (1983); Wernars et al., Curr. Genet. 9, 361, (1985); Kelly, J. M. et al., EMBO J. 4, 475, (1985)].

엔. 크라사 또는 에이. 니둘란스에 비해, 에이. 니거는 훨씬 중요한 유기체이다. 이것은 효소의 산업적 생산에 널리 사용되며, 예를 들어 식품 산업에 사용된다. 에이. 니거는 분비 능력, 즉 많은 가수 분해 효소, 예를 들어 글루코아밀라제, α-아밀라제, 펙틴아제, 셀룰라제, β-글루카나제, β-갈락토시다제, 나린기나제, 펙토산아제, 산 프로테아제 및 리그나제, 가장 중요하게는 글루코아밀라제 및 펙틴아제 복합체를 분비한다는 점에서 에이. 니둘란스와 다르다.

에이. 니거는 성 주기가 공지되어 있지 않다. 따라서, 돌연변이 처리는 감수분열성 재조합에 의해 도입될 수 없다. 고전적인 돌연변이처리 및 선별 방법에 의해, 가수분해 효소의 분비에 있어서 광범위한 균주의 개선이 이루어져 왔다.

에이. 니거 효소의 유전자 중에서 단지 글루코아밀라제(Boel et al., EMBO J. 3, 1581, 1984) 및 알코올 및 알데히드 데하이드로게나제(WO 86/06097)의 유전자만이 이의 프로모터 및 시그날 서열과 함께 특징화되었으며 에이. 니둘란스 및 에이. 니거를 각각 형질전환시키는 실험에 사용되었다.

에이. 니거에 대한 선별 마커로서 amd S 유전자(Kelly and Hynes, EMBO 3. 4, 475, 1985) 및 arg B 유전자(Buxton et al., Gene 37, 207, 1985; EP 184 438; WO 86/06097)가 사용되어 왔으며, 이 둘은 에이. 니둘란스로부터 수득된 것이다.

에이. 니거는 펙틴 분해 효소의 산업적 생산을 위한 가장 중요한 유기체이다. 펙틴은 α-1, 4-글리코사이드 결합된 D-갈락투론산 중합체로 이루어져 있는 고분자량(20000 내지 40000D)의 폴리갈락투로나이드이고 천연적으로는 고등 식물 세포의 구성 물질로서 생성되며, 셀룰로즈 분자에 결합되고 주로 1차 세포벽 및 중층 라멜라에서 발견된다. 펙틴이 풍부한 공급원에는 레몬 및 오렌지 껍질이 있고, 여기에는 이 폴리사카라이드가 약 30% 함유되어 있다. 펙틴성 효소는 α-1, 4-글리코사이드 결합의 가수 분해(폴리갈락투로나제) 또는 펙틴 분자로부터 α-4, 5-불포화 갈락투론산 잔기의 제거(다른 펙틴 리아제)에 의해 탄수화물 중합체 기질을 분해한다. 펙틴 리아제의 분류명은 펙틴 트랜스 엘리미나제(EC 4.2.2.10)이다.

에이. 니거에서 펙틴성 복합체 단백질은 구성적으로 발현되지 않는 다. 펙틴 또는 이의 분해산물을 사용하는 유도 조건 하에서, 에이. 니거는, 글루코즈 또는 슈크로즈와 같은 다른 탄소원이 제한되는 경우, PLI를 포함하여 상기 언급된 효소를 발현한다. 표면 배양물에서, 펙틴 효소는 세포 외벽과 결합된 채로 있으려는 경향이 있다. 배지중 펙틴 및 Ca²⁺농도가 증가되면 완전히 분리될 수 있다.

PLI와 같은 펙틴아제는 주로 과즙 청정화를 위한 식품 재료 산업에 사용된다.

에이. 니거로부터의 두가지 상이한 펙틴 리아제, PLI 및 PLII는 에프.이.에이. 폰 하우덴호벤(F.E.A. Von Houdenhoven) (22)에 의해 정제 및 부분적으로 특징 조사되었다. PLI은 만노즈 4개 잔기를 함유하는 반면, PLII는 각각 만노즈 및 글루코즈를 2개 잔기씩 가진다. 이 효소들은 상이한 분자량을 가진다(PLI: 37.5KD, PLII: 36KD). PLI의 아미노산 서열은 결정되어 있고 EP 제88 101 397.3호에 기재되어 있다. 이 발명은 이 단백질의 관련 부분을 암호화하는 DNA 프로브를 합성할 수 있게 하는 펙틴 리아제 Ⅰ(PLI)의 부분적 구조 결정을 기준으로 한다. DNA 프로브에 의해, 에이. 니거의 유전자 라이브러리로부터, PLI를 암호화하는 DNA를 이의 전- 및 후-서열과 함께 선별 및 분리할 수 있다.

에이. 니거의 게놈 라이브러리에 PLI 유전자 부분을 하이브리드화시킴으로써 본 발명의 대상물인 추가의 PL 유전자를 검출하였다. 에이. 니거 N 756으로부터 수득된 N-말단 플랭킹 영역이 있는 PLI 구조 유전자는 이의 N-말단부에서 에이. 니거 N400으로부터 수득된 PLD유전자와 동일하다. 따라서, PLD 유전자는 본 발명의 일부가 아니다. 본 발명의 PLA는 PLII라 불리는 이미 정체된 PL 혼합물의 일부이다.

하기에서, PLI은 PLD라 명명하고 PLI 구조 유전자는 pel D라 언급한다.

본 발명의 목적은 펙틴 리아제 발현 시스템을 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체, 예를 들어 상기 펙틴 리아제의 구조 유전자 및 이에 상응하는 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 시그날 및 터미네이터 서열)을 함유하는 재조함 DNA 분자, 및 상동성 또는 이질성 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유한 하이브리드 벡터를 포함하여 상응하는 DNA룰 함유하는 하이브리드 벡터, 상기 벡터로 형질전환시킨 숙주, 특히 사상균, 예를 들어 아스퍼질러스 숙주, 상기 재조합 DNA 분자 및 상기 숙주를 제조하는 방법 및 발현 시스템을 제조하기 위한 재조합 DNA 분자의 용도이다. 또한 상기 DNA 및 숙주에 의한 폴리펩타이드의 제조도 목적하는 것이다.

신규한 펙틴 리아제 발현 시스템은 펙틴 리아제 유전자의 프로모터, 시그날 서열, 구조 유전자 및 터미네이터를 암호화하는 DNA 서열을 함유한다. 신규한 펙틴 리아제는 PLA, PLB, PLC, PLE 및 PLF라 명명한다.

좀 더 특히, 본 발명의 목적은 PLA, PLB, PLC, PLE 및 PLF의 프로모터, 임의로는 이러한 단백질의 시그날 서열, 및 임의로는 이의 터미네이터를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 하이브리드 벡터의 작제이다. 이러한 하이브리드 벡터는 특정한 단백질을 암호화하는 유전자의 혼입 및 사상균, 예를 들어 아스퍼질러스, 페니실륨(Penicillium) 및 세팔로스포륨(Cephalosporium)의 형질전환에 사용된다. 두가지 상이한 플라즈미드로 에이. 니거를 동시 형질전환시키는 것은 가능하며, 이 때 플라즈미드 중 하나는 본 발명의 신규한 하이브리드 벡터 그룹 중에서 선택되고, 다른 하나는 사상균의 돌연변이된 균주가 관련되어 특별히 작제된 선별 플라즈미드이다.

본 발명은 또한 아스퍼질러스 종에서 상기 펙틴 리아제의 과생산 및 다른 PL로 오염되지 않은 단일 PL의 생성 또는 미리 결정된 이의 인공적 혼합물의 제조에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 재조합 PL DNA 존재하에 또는 이의 조절하에 발현될 수 있는 단백질 구조 유전자의 제조에도 관한 것이다.

본 발명의 여러 가지 목적은 하기의 상세한 설명으로 명백해질 것이다.

[재조합 DNA 분자]

특히, 본 발명은 펙틴 리아제 PLA, PLB, PLC, PLE 및 PLF의 발현 시스템을 암호화하는 DNA 서열 또는 이의 유도체를 함유하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.

발현 시스템이란 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 DNA 서열을 의미하며 프로모터, 시그날 서열, 구조 유전자 및 터미네이터를 함유한다.

신규한 DNA 서열과 관련하여 사용되는 경우 유도체에는 인접 서열을 함유한 큰 유도체, 상기 DNA 서열의 단편, 돌연변이체, 특히 자연 발생적 돌연변이체 및 유전적 암호에 따라 축퇴된 DNA 서열이 포함된다.

재조합 DNA 분자의 큰 유도체는 에이. 니거 게놈으로부터 절단될 수 있으며 제1 내지 3도, 5도 및 6도에서와 같은 DNA를 함유하는 것으로, 핵산을 단편화하고 단편을 적합한 제한 효소(예를 들어, EcoRI, BamHI 또는 HindIII)로 처리하여 적합한 벡터(예를 들어, 람다 파아지 및 플라즈미드 pBR 322)에 결합시키고 예를 들어 이.콜라이에 클로닝시킨 후 동일 제한 효소로 재절단하여 수득된 에이. 니거 N400의 게놈 라이브러리에서 발견할 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들어 제1도, 2도, 3도, 4도, 5도 및 제6도에 나타낸 바와 같은 플라즈미드 pGW 820, pGW 830, pGW 840, pGW 850, pGW 860 및 pGW 880의 삽입체이다.

서열식(Ⅰ)의 DNA 서열의 단편(제10도)은 이러한 플라즈미드의 두 제한 부위 사이에 걸쳐있으며 프로모터, 시그날, 구조 유전자 또는 터미네이터 작용물을 보유하고 있다.

바람직한 단편은 프로모터 서열, 시그날 서열, 신규한 PL의 구조 유전자 또는 터미네이터 서열 또는 다른 이의 조합체를 함유하는 것이다.

DNA 서열의 단편은 다른 DNA 분자에의 성공적인 결합을 위해 링커(linker)를 함유할 수 있다.

PL 프로모터 서열은 구조 유전자 앞의 DNA 영역에 함유되며 약 2000개 까지, 바람직하게는 약 1000 내지 1400개의 뉴클레오타이드를 함유한다. pGW 820에서는, 프로모터가 Sal Ⅰ(1240)과 Pst Ⅰ(2420) 제한 부위 사이의 서열에 위치한다. 프로모터 서열을 위해 TATAA 박스(box)는 RNA-폴리머라제 인식 부위로서 중요하다. pel A 상에서 TATAA 박스는 위치 1221(제10도)에 위치하고, pel B 상에서는 위치 951(제11도)에, pel C 상에서는 위치 1261(제12도)에 위치한다. TATAA 박스 주위에서부터 시그날 서열의 개시까지의 짧은 프로모터는 폴리펩타이드의 비-유도된 발현을 위한 특정 관심 대상중 하나이다. 펙틴 유도 발현이 요구되는 경우 TATAA 박스의 상향 서열은 프로모터의 강도를 조절하는데 필요하다. 적합한 링커를 이러한 단편에 결합시킬 수 있다.

에이. 니거의 PLI의 프로모터는 유도성(유도 가능)이다. 즉, 이에 결합된 구조 유전자, 예를 들어 PL을 암호화하는 구조 유전자 또는 다른 외래 유전자의 발현은 배지에 펙틴 또는 펙틴 분해 산물을 첨가함으로써 유도된다. 펙틴의 부재 및 충분한 글루코즈의 존재하에서 프로모터는 작동되지 않는다. 상향 조절 서열이 없는 경우 프로모터는 구성적인 것이 된다.

시그날 서열을 암호화하는 DNA는 프로모터의 끝과 성숙한 단백질을 암호화하는 서열의 개시점 사이에 걸쳐있다. PLA 및 PLB에서 시그날 서열은 약 20개 아미노산을 함유하고, pel C에서는 약 18개 아미노산을 함유한다. 이에 상응하는 암호화 영역은, pel A에서는 위치 1361의 ATG 코돈에서부터 하향 위치 1420의 Pst Ⅰ 절단 부위까지, pel B에서는 위치 1134부터 적어도 위치 1191까지, 및 pel C에서는 위치 1368부터 위치 1422까지 연장된다.

서열식(I), (II), (III)에서 알 수 있듯이, PLA, PLB 및 PLC의 구조 유전자는 몇몇 인트론을 함유한다. 또한 구조 유전자는 적합한 링커를 함유할 수 있다.

터미네이터는 중지코돈(예, TAA)에서 시작하여 상기 서열내의 제한 부위중 하나까지 연장될 수 있다. 터미네이터 단편은 적어도 300bp를 함유하고 적합한 링커를 함유할 수 있다.

상기 단편에 적합한 링커는 단편을 결합시킬 DNA의 제한 부위에서 적합한 DNA 서열을 가진다. 이것은 미리 결정된 제한 부위를 함유할 수 있다.

본 발명의 DNA 서열의 단편을 또한 소단편, 예를 들어 프로모터, 프로모터 및 시그날 또는 구조 서열, 시그날 및 구조 서열, 또는 인트론이 없는 구조 유전자 등과 같은 것을 함유하는 단편으로 이루어진다.

본 발명의 DNA 서열의 돌연변이체는 예를 들어 자연 발생한 돌연변이체이다. 본 발명은 또한 유사하거나 동일한 소수성 프로필을 갖는 시그날 서열의 자연적 또는 합성 돌연변이체를 포함하는데, 예를 들면 극성 아미노산 리신(K^σ+), 티로신(Y^σ-) 및 아르기닌(R^σ+)에 대한 코돈을 유사한 전하를 갖는 다른 아미노산에 대한 코돈으로 교환시키고, 소수성 아미노산 알라닌(A), 로이신(L) 및 트레오닌(T)의 코돈은 다른 소수성 아미노산에 대한 코돈으로 대체시킨다. 예를 들어, 양전하를 띤 리신에 대한 코돈을 아르기닌에 대한 코돈으로 및 그 반대로 대체시킬 수 있고, 음전하를 띤 티로신에 대한 코돈은 글루타메이트 또는 아스파테이트에 대한 코돈으로, 및/또는 비극성이며, 소수성인 알라닌에 대한 코돈은 트레오닌, 프롤린, 발린, 이소로이신, 로이신, 메티오닌 또는 페닐알라닌에 대한 코돈중 하나로 대체시킬 수 있다. 다른 돌연변이체는 침묵 돌연변이체로, 하나 또는 소수의 다른 뉴클레오타이드가(예를 들어 약 30개 까지) 하나 이상의 다른 뉴클레오타이드로 대체되지만 새로운 코돈이 동일 아미노산(들)을 암호화하는 것이다.

본 발명의 축퇴된 DNA 서열은, 침묵 돌연변이체와 같이, 비제한 수의 뉴클레오타이드가 이들이 암호화하는 아미노산 서열의 변화 없이 다른 뉴클레오타이드로 대체된다는 점에서 유전 암호의 의미내에서 축퇴된 것이다. 이러한 축퇴된 DNA 서열은 이의 상이한 제한 부위 때문에 유용할 수 있다.

본 발명의 DNA 서열을 함유하는 재조함 DNA 분자 또는 이의 유도체는 특히 삽입체로서 이러한 DNA를 함유하는 재조합 벡터, 다르게는 하이브리드 벡터로 불리우는 것이다. 이들은 숙주, 예를 들어 박테리아, 진균류 또는 동물 세포와 같은 숙주 내에 클로닝시키는데 사용된다. 이러한 하이브리드 벡터는 유전 공학 기술에 유용한 벡터, 예를 들어 파아지, 코즈미드, 플라즈미드 또는 염색체성 DNA, 예를 들어 파아지 λ의 유도체(예, NM 989) 또는 Bam HI 절단으로 선형화시킨 파아지 M13의 유도체(예, M13 mp 8 파아지 DNA, 참조문헌 15), 박테리아성 플라즈미드, 예를 들어 pBR 322, pUN 121, pUC 18, 또는 효모 플라즈미드, 예를 들어 효모 2μ 플라즈미드, 또는 아스퍼질러스(예, 에이. 니거)로부터 유래된 염색체성 DNA, 예를 들어 EP 제184 438호에 의해 제공된 염색체성 DNA, 또는 결핍성 파아지 또는 플라즈미드의 복제를 허용하는 헬퍼(helper) 파아지 또는 헬퍼 플라즈미드 존재하의 결핍성 파아지 또는 결핍성 플라즈미드, 예를 들어 M13K07 헬퍼 파아지 존재하의 M13(+)KS 벡터로부터 유도된 것이다.

본 발명의 하이브리드 벡터는, 본 발명의 DNA 서열 또는 이의 유도체 이외에, 복제 부위 및 임의로는 DNA 유도체의 유형에 따라, 인핸서(enhancer)서열, 상향 활성화 부위, 프로모터 및 시그날 서열, 및/또는 이에 상응하는 기존의 에이. 니거-유도된 서열과 다른 구조 유전자와 같은 발현 조절 서열을 함유한다. 이러한 인핸서 서열은 파이사룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum)의 염색체외 리보좀 DNA로부터 유도될 수 있거나 (PCT/EP 8500278), 산 포스파타제 PH05 유전자(유럽 특허원 제86 111 820.6호) 또는 PH05, trp, PH05-GAPDH 하이브리드(유럽 특허원 제 86 111 820.6호) 또는 이와 같은 프로모터로부터의 상향 활성화 부위일 수 있다.

본 발명의 프로모터, 시그날 및/또는 터미네이터 서열에 결합된 구조 유전자는, 펙틴 리아제 PLA, PLB, PLC, PLE 및 PLF를 인트론과 함께 또는 인트론이 없이 암호화하는 서열 이외에, 영양제의 생산 및 화학에서 효소 반응을 수행하기 위해 사용될 수 있는 효소와 같은, 고등 진핵성, 특히 동물 또는 특히 사람과 같은 포유동물에서의 글리코실화된 폴리펩타이드, 또는 사람 및 동물의 질병을 치료하거나 이의 예방에 유용하며 중요한 폴리펩타이드, 예를 들어 호르몬, 면역 조절성, 항 바이러스성 및 항 종양 특성이 있는 폴리펩타이드, 항체, 바이러스 항원, 백신, 응고 인자, 식료품 등을 포함하여, 광범위하게 유용한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자로, 상동성의 다른 펙틴 리아제 유전자, 예를 들어 PLD(또는 PLI) 유전자, 또는 다른 아스퍼질러스 유전자 및 바이러스, 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 유래되고 게놈 DNA 또는 mRNA 경로를 통해 제조된 cDNA로부터 유래되거나 화학적으로 합성될 수 있는 이질성 구조 유전자이다.

이러한 이질성 구조 유전자의 예는 세크레틴, 티모신, 레락신, 칼시토닌, 황체 형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 아드레노코르티코트로핀, 멜라노사이트-자극 호르몬, β-리포트로핀, 우로가스트론 또는 인슐린과 같은 호르몬, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자(IGF)(예, IGF-I 및 IGF-II), 비만 세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 글리아(glia) 유도 신경 세포 성장 인자 또는 전환 성장 인자 (TGF)(예, TGF β)와 같은 성장 인자, 사람 또는 소의 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬, 인터루킨 -1 또는 -2와 같은 인터루킨, 사람의 대식 세포 이동 억제 인자(MIG), 사람의 α-인터페론, 예를 들어 인터페론-αA, αB, αD 또는 αF, β-인터페론, γ-인터페론과 같은 인터페론 또는 하이브리드 인터페론, 예를 들어 αA-αD 또는 αB-αD-하이브리드 인터페론, 특히 하이브리드 인터페론 BDBB, α_1-항 트립신, SLPI 등과 같은 프로테인아제 억제제, 간엽 바이러스 항원, 예를 들어 B형 간염 바이러스 표면 또는 코어(core) 항원 또는 A형 간염 바이러스 항원, 또는 비 A-비 B형 간염 항원, 플라즈미노겐 활성제, 예를 들어 조직 플라즈미노겐 활성제 또는 우로키나제, 종양 괴사 인자, 소마토스타틴, 레닌, β-엔돌핀, 면역글로불린, 예를 들어 면역글로불린 D, E 또는 G의 경쇄 및/또는 중쇄, 또는 사람-쥐(mouse) 하이브리드 면역글로불린, 면역글로불린 결합 인자, 예를 들어 면역글로불린 E 결합 인자, 칼시토닌, 사람의 칼시토닌- 관련 펩타이드, 혈액 응고 인자, 예를 들어 인자 Ⅸ 또는 Ⅷc, 에리트로포이에틴, 에글린 예를 들어 에글린 C, 히루딘, 데설페이토히루딘, 예를 들어 데설페이토히루딘 변이체 HV1, HV2 또는 PA, 사람의 수퍼옥사이드디스무타제, 바이러스 티미딘 키나제, β-락타마제, 글루코즈 이소머라제를 암호화하는 유전자이다. 바람직한 유전자는 사람의 α-인터페론 또는 하이드리드 인터페론, 사람의 조직 플라즈미노겐 활성제(t-PA), B형 간염 바이러스 표면 항원(HBVs Ag), 인슐린-유사 성장 인자 Ⅰ 및 Ⅱ, 에글린 C 및 데설페이토히루딘, 예를 들어 변이체 HV 1을 암호화 하는 것이다. 본 발명의 하이드리드 벡터에서, 프로모터 및/또는 시그날 서열은 폴리펩타이드의 효과적인 발현을 확실히 하기 위해 폴리펩타이드 암호화 영역에 작동적으로 결합시킨다.

본 발명의 DNA 분자는 형질전환시켜 선별하고 클론화시키게 될 숙주에 따라 좌우되는 선별 마커를 함유할 수 있다. 마커의 표현형적 발현에 기인하여 형질전환체의 선별이 용이해지는 어떠한 마커 유전자도 사용할 수 있다. 적합한 마커는 특히 항생물질 내성, 예를 들어 테트라사이클린 또는 암피실린에 대한 내성을 발현하는 마커, 또는 종속 영양체 효모 돌연변이체의 경우 숙주의 결점을 보완하는 유전자이다. 이에 상응하는 유전자는 예를 들어 항생 물질 사이클로헥시미드에 대한 내성을 부여하거나, 종속 영양체 효모 돌연변이체에 자가 영양성을 부여하며, 예를 들어 ura 3, leu 2, his 3 또는 trp 1 유전자이다. 형질전환되는 숙주가 마커에 의해 발현되는 생성물에 대해 종속 영양성인 경우, 마커로서 자가 복제하는 단편과 연결된 구조 유전자를 사용할 수 도 있다.

특히 중요한 것은 에이. 니거 숙주의 결점을 보완하는 마커 유전자, 예를 들어 에이. 니거 또는 에이. 니둘란스(EP 184 438)로부터 유래된 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제를 암호화하는 arg B 유전자 또는 엔. 크라사 pyr 4 유전자에 상동적인 에이. 니둘란스 DNA 단편(26)이다.

본 발명의 바람직한 양태는 구조 유전자, 특히 이질성 구조 유전자가 본 발명의 프로모터 및 시그날 서열에 작동적으로 결합되어 있는 하이브리드 벡터이다. 이러한 바람직한 하이브리드 벡터는 예를 들어 pUC 19/pel A-IFN AM 119이다. 또 다른 바람직한 하이브리드 벡터는 예를 들어 M13(+)KS/pel A-IFN AM 119이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 구조 유전자, 특히 이질성 구조 유전자가 본 발명의 프로모터 서열에 직접 작동적으로 결합되는 것이다. 이러한 바람직한 하이브리드 벡터는 예를 들어 M13(+)KS/pel A△ss-IFN AM 119이다.

단편을 포함하여, 본 발명의 DNA 분자 및 이의 유도체는 유사한 DNA 또는 mRNA에 대해 DNA 유전자 뱅크(bank) 또는 mRNA를 선별하기 위해 사용될 수 있다.

[재조합 DNA 분자의 제조방법]

본 발명은 팩틴 리아제 발현 시스템을 암호화하는 DNA 서열 또는 이의 유도체를 함유하는 DNA 분자로 형질전환시킨 숙주를 배양하여 목적하는 재조합 DNA 분자 또는 이의 유도체를 분리하거나 시험관내 합성에 의해 제조함을 특징으로 하여, 펙틴 리아제 PLA, PLB, PLC, PLE 또는 PLF 발현 시스템 또는 이의 유도체를 암호화하는 재조합 DNA 분자를 제조하는 방법에도 관한 것이다.

숙주의 배양은, 비형질전환체, 즉 목적하는 DNA 분자가 결핍된 숙주로부터 형질전환체, 즉 선별 마커와 함께 목적하는 DNA 분자를 함유하는 숙주의 음성적 또는 양성적 선택을 허용하는 화학 물질을 첨가할 수 있거나 빼낼 수 있는 통상적인 영양 배지에서 수행한다.

당해 기술분야에서 유용한 어떠한 형질전환가능한 숙주도 사용될 수 있고, 예를 들면 이.콜라이와 같은 박테리아, 사카로마이세스 세레비지에와 같은 진균류, 특히 아스퍼질러스, 예를 들면 에이. 니둘란스, 에이. 오리자에, 에이. 카보나리우스, 에이. 아와모리 및 특히 에이. 니거와 같은 사상균이다. 바람직한 숙주는 에이. 니거 An 8로 이것은 하기하는 바와 같이 pyr A 유전자가 없는 신규한 돌연변이체이다. 숙주의 형질전환은 통상적인 방법에 의해 수행한다.

PL 발현 시스템을 암호화하는 DNA 서열은 이러한 시스템을 함유하는 사상균, 특히 이의 게놈 라이브러리로부터 또는 mRNA를 통해 수득된다.

하기에는 본 발명의 PL 발현 시스템의 제조를 상세히 설명한다.

게놈 라이브러리는 에이. 니거 균주, 예를 들어 N756 또는 N400의 게놈 DNA를 예를 들어 Sau3AI 또는 Mbo I으로부터 절단하고 적합한 숙주 벡터, 예를 들어 이.콜라이 플라즈미드 pUN 121 또는 람다 벡터, 예를 들어 EMBL 4에 고분자량 DNA 단편을 클로닝시켜 제조할 수 있다.

목적하는 PL을 생성하는 다른 에이. 니거 균주도 게놈 라이브러리를 위한 공급원이 될 수 있고 또한 다른 적합한 벡터도 단편을 위한 수용체로서 사용할 수 있다.

PL를 암호화하는 DNA 서열에 대해 게놈 라이브러리를 성공적으로 선별하기 위해 하이브리드용 DNA 프로브가 필요하다. 이것은 목적하는 PL의 서열이 공지되어 있는 경우 합성 DNA 프로브일 수 있거나 공지된 유전자 또는 이의 일부일 수 있다. 최초의 시도는 EP 제88 101 397.3호에 설명된 바와 같이 PLI 유전자를 밝히는 것이었다. 본 발명에서는 두 번째 접근을 시도하였다. PLI 유전자의 전체 DNA 서열이 이용가능하기 때문에, 전체 유전자 또는 적어도 약 14bp를 가지는 이의 일부를 함유하는 DNA 프로브를, PL 시스템을 암호화하는 mRNA에 대한 선별을 포함하여, 선별을 위해 사용할 수 있다.

선별 목적을 위하여, DNA 프로브를 γ³²P-ATP 및 T4 키나제를 사용하여 당해 기술에 공지된 방법으로 5' 방사능 표지화한다. 삽입체로서 본 발명의 핵산을 수반하는 숙주 미생물은, 유전자 라이브러리의 필터 레플리카(replica) 상에서 표지된 DNA 프로브와 하이브리화시켜 확인한다.

하나 이상의 DNA 프로브와 하이브리드화 반응을 보이는 클론을 분리하여 증폭시킨다.

사용된 하이브리드화 조건은 다소 엄격할 수 있다. 예를 들어, 간단히는 상이한 온도를 선택하고, PLI(또는 PLD) 유전자로부터 유도된 상이한 DNA 프로브의 사용과 병행하여, 예를 들어 pCG 3B11또는 pGW 840(제4도)으로부터의 완전한 1.6kbp BamHI/ Pst I 단편, 649bp Bam HI/Xho I 단편(N-말단부 단편) 및 244bp Xho I/Pst I 단편 (C-말단부 단편)에 대한 다양한 하이브리드화 반응을 측정함으로써 클론은 이들의 상동성 정도를 기준으로 하여 상이한 부류로 나눌 수 있다(표2 또는 4). 5개의 λ-벡터(λ-PL113, λ-PL122, λ-PL109, λ-PL102 및 λ-PL116)가 최종적으로 동정되고 이것을 제한처리하고 pBR 322 내에 이의 pel 유전자를 서브클로닝시켜 플라즈미드 pGW 820, pGW 830, pGW 850, pGW 860 및 pGW 880을 제조한다(제1 내지 3도, 5도 및 제6도). 이러한 클론의 5개 유전자를 각각 pel A, pel B, pel C, pel E 및 pel F라 언급한다.

유전자는 서열화할 수 있다. pel A, pel B 및 pel C의 전체 서열은 서열식(I), (II) 및 (III)이다(제10도, 11도 및 제12도).

인트론 내부 서열 뿐만 아니라 엑손/인트론 스플라이싱 연접부의 컨센서스 서열에 대한 컴퓨터 조사[참조: Boel E. et al. (24) 및 Mount S. M. (25)]로 pel D에서와 같이 pel A 및 pel B에서 4개의 인트론(제10도 및 제11도) 및 pel C에서 3개의 인트론(제12도)의 존재가 유추된다.

플라즈미드 pGW 820, pGW 830, pGW 850, pGW 860 및 pGW 880은 본 발명의 다른 재조합 DNA 분자를 제조하는데 사용된다. 이러한 다른 DNA 분자는 통상적인 제한 효소, 링커, 결합, 증식 및 분리 방법을 적용시킴으로써 통상적인 방법으로 제조된다.

예를 들어, 플라즈미드 pGW 820을 Hind III로 절단한다. 3.9kbp Hind III 단편을 pBR 322의 Hind III 부위에 서브클로닝시킨다. pel A 유전자를 함유하는 수득된 플라즈미드 pGW 822의 3.3kbp Bam HI-Hind III 단편을 벡터 pUC 19의 Bam HI 및 Hind III 부위에 클로닝시켜 벡터 pUC 19/pel A를 수득한다. pel A의 구조 유전자를 Sal I 및 Pst I으로 절단한다. pel A 프로모터, 시그날 및 터미네이터 서열을 함유하는 잔여 단편에서, 인터페론 하이브리드 BDBB를 암호화하는 유전자를 시그날과 터미네이터 서열 사이에 적합한 링커에 의해 결합시킨다. 수득된 플라즈미드는 pUC 19/pel A-IFN AM 119라 명명하는데(제14도). 이는 pUC 19의 Hind III-bam HI 단편에 결합된 pel A의 프로모터 및 시그날 서열, IFN BDBB 유전자 및 pel A 터미네이터를 함유한다. 이 플라즈미드는 pCG 59D7과 함께 우리딘 종속 영양체 에이. 니거 돌연변이체 An 8(DSM 3917)을 동시 형질전환시키는데 사용한다. 형질전환체를 아르기닌 및 박토-아가(Bacto-Agar)를 함유하는 최소 배지에서 선별하여 인터페론 발현에 대해 분석한다.

본 발명의 다른 양태에서는, pel A의 시그날 서열이 결실될 수 있다. 수득된 플라즈미드는 M13(+)KS/pelAΔss IFN AM 119라 명명하며, 이는 Bluescript M13(+) 벡터의 Hind III-Bam HI 단편에 결합된 pel A의 프로모터 서열, IFN BDBB 유전자 및 pel A 터미네이터를 함유한다. pCG 59D7과 함께 이 플라즈미드로 우리딘 종속 영양체 에이. 니거 돌연변이체 An8(DSM 3917)을 동시 형질전환시킨다. 형질전환체를 아르기닌 및 박토-아가를 함유하는 최소 배지에서 선별하고 인터페론 발현에 대해 분석한다.

새로운 제한 부위를 함유하는 돌연변이체는, 예를 들어 통상적인 방법에 따라 부위-지시적 돌연변이 처리에 의해 시험관 내에서 제조할 수 있다[참조: M. J. Zoller 및 M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein and D. Shortle, Science 229, 1193 (1985) 또는 K. Norris et al., Nucl. Acids Res. 11, 5103 (1983)].

높은 발현율을 위해, 진핵 세포의 터미네이터 서열을 구조 유전자의 끝에 결합시킬 수 있다.

박테리아를 통상적인 방법에 의해 형질전환시키고 형질전환체를 이의 내성, 예를 들어 테트라사이클린에 대한 내성과 같은 것에 의해 확인한다.

특히, 설명된 발현 벡터는 당해 기술의 통상적인 방법에 의해 형질전환시켜 선별한 HB101과 같은 적합한 이.콜라이 숙주 균주에서 증폭시킨다. 증폭된 플라즈미드 DNA는 통상적인 방법에 의해, 특히 번보임 및 돌리(Birnboim Doly)(23)에 의해 설명된 방법으로 박테리아로부터 분리한다.

유사한 방법으로 다른 상동성 또는 이질성 유전자를 함유한 다른 플라즈미드를 작제할 수 있다.

본 발명의 DNA 분자는 또한 통상적인 방법에 따라 시험관내 함성에 의해 제조할 수 있다. 시험관내 합성은 특히 PL 발현 시스템의 소단편, 예를 들어 PL의 프로모터 또는 시그날 서열을 암호화하는 DNA 서열 또는 이의 돌연변이체의 제조에 적용시킬 수 있다.

PL 프로모터 및 임의로는 PL 시그날 서열, 구조 유전자, 다른 이질성 구조 유전자 및/또는 PL 터미네이터를 함유하는 본 발명의 DNA 분자는 사상균, 예를 들면 아스퍼질러스, 페니실륨 또는 세팔로스포륨(예, 에이. 니둘란스, 에이. 오리자에, 에이. 카보나리우스, 에이. 아와모리 및 특히 에이. 니거)을 형질전환 시키는데 사용할 수도 있다.

비-형질전환된 진균류로부터 형질전환된 것을 선별하기 위하여, 본 발명의 DNA 분자는 선별 마커를 수반하거나, 다르게는 진균류를 이러한 선별 마커를 함유하는 제2의 벡터로 동시 형질전환시킨다. 다른 시스템에서와 같이 이러한 선별 마커는, 발현된 폴리펩타이드(효소)가 형질전환체에 독성인 화합물에 대한 내성을 제공하거나 필수적인 폴리펩타이드가 결핍되는 돌연변이체의 효소 시스템을 보완하는 발현가능한 구조 유전자이다. 이러한 마커 유전자는, 예를 들어 공지된 qa-2, pyr G, pyr 4, trp C, amd S 또는 arg B 유전자이다.

EP 제88 101 397.3호에 설명된 바와 같이, pyr A라 명명된 신규한 마커 유전자는 에이. 니거의 게놈 라이브러리로부터 분리되었으며, 에이. 니둘란스의 pyr G 및 엔.크라사의 pyr 4와 관련되고 이와 유사한 작용, 즉 효소 오로티딘 5＇-포스페이트 데카복실라제를 생성하는 작용을 갖는다. 이 효소는 오로티딘 5＇-포스페이트가 우리딜산(우리딘 5＇-포스페이트)으로 및 플루오로-오로트산이 독성의 플루오로-우리딘으로 탈카복실화 되는 반응을 촉매한다. pyr A 유전자를 함유하는 이.콜라이 클론은 pyr 4 유전자의 일부를 함유하는 pDJB 2(24)의 1.1Kb Hind III단편과 하이브리드시켜 확인되지만, 오로티딘-5＇-포스페이트 데카복실라제를 암호화하는 다른 pyr 유전자의 DNA를 사용할 수 있다. 이.콜라이 B75183/pCG 59D7이라 명명된 양성 클론으로부터, pyr A 유전자를 함유하는 플라즈미드 pCG 59D7을 분리하여 에이. 니거 pyr A^-1돌연변이체의 동시 형질전환에 사용한다. 이러한 pyr A^-1돌연변이체는 오로티딘 5＇-포스페이트 데카복실라제 유전자가 결핍된 것이므로 이에 상응하는 효소를 생성할 수 없다. 이러한 돌연변이체는 에이. 니거 N756의 분생포자를 돌연변이처리 UV- 조사하에 처리하여 제조하고 플루오로-오로트산 및 우리딘의 존재하에 생존하는 콜로니를 선별한다. 플루오로오로트산의 존재 및 우리딘의 부재하에 생존하는 콜로니는 제거한다. 형질전환될 수 있는 능력에 따라. 나머지 우리딘-요구성 돌연변이체는 2개의 보완 그룹 pyr A 및 pyr B에 속하게 되고 각각 돌연변이체 An 8 및 An 10으로 나타낸다. 이들을 원형질체의 형태에서 pyr A 함유 플라즈미드 pCG 59D7을 사용하여 형질전환 조건하에 처리한다. pUN 121의 DNA와 이의 절단된 DNA의 하이브리드화 능력에 의해 증명되듯이 단지 An 8만이 형질전환되어 pyr A 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 또한 본 발명의 하이브리드 벡터로 형직전환시킨 숙주 및 이의 제조방법에도 관한 것이다. 이러한 형질전환체는 예를 들어 박테리아(예, 이.콜라이) 또는 사상균(예, 아스퍼질러스, 페니실륨 또는 세팔로스포륨 및 특히 에이. 니둘란스, 에이. 오리자에, 에이. 카보나리우스, 에이. 아와모리 또는 바람직하게는 에이. 니거, 예를 들어 에이. 니거 An 8)이다. 또한 본 발명은 숙주를 본 발명의 재조합 DNA 분자, 특히 하이브리드 벡터로, 임의로는 선별 마커 유전자와 함께 형질전환 조건하에 처리하고 형질전환체를 선별함을 특징으로 하는 상기 형질전환체의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 유용한 상동성 또는 이질성 폴리펩타이드를 발현하는 하이브리드 벡터의 제조에 있어서 재조합 DNA 또는 이의 유도체의 용도에도 관한 것이다. 상기 유용한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 예는 상기에 설명되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 하이브리드 벡터가 적합한 벡터에서 발현됨을 특징으로 하는 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 필요시, 폴리펩타이드는 통상적인 방법으로 분리한다. 벡터의 작제에 따라 생성물이 발현되거나, 시그날 서열이 존재하는 경우 발현되어 분비된다.

이러한 방법은 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 숙주를 배양시켜, 예를 들어 아스퍼질러스 종과 같은 적합한 숙주에서 유용한 상동성 또는 이질성 단백질을 생성시키는 것이다. 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 예는 상기에 설명되어 있다.

다른 PL로 오염되지 않은 순수한 형태의 단일 폴리펩타이드 PLA, PLB, PLC, PLD, PLE 또는 PLF를 제조할 수 있게 되었고 이에 의해 여러 가지 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, PLA, PLB, PLC, PLD, PLE 또는 PLF로 이루어진 그룹중에서 선택되는 단일 폴리펩타이드의 한가지 제조 방법은 어떠한 펙틴 리아제 PL도 발현할 수 없는 숙주를 PLA, PLB, PLC, PLD, PLE 또는 PLF의 생성물을 발현하는 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨다는 점에서 특징적이다.

어떠한 펙틴 리아제 PL도 발현할 수 없는 숙주는 이에 상응하는 유전자를 가지지 않은 미생물, 예를 들어 PL^-아스퍼질러스 균주, 아스퍼질러스 속이 아닌 다른 진균류 또는 다른 진핵 또는 원핵 미생물, 또는 PL의 생성이 적당하게 조절된 성장배지에서 억제되는 아스퍼질러스 균주이다. 예를 들어 단일 PL 유전자는 에이. 니거 또는 에이. 아와모리의 글루코아밀라제 프로모터의 조절하, 에스. 세레비지에의 pH 05 프로모터의 조절하 또는 PL^-에이. 니거 균주의 PL 프로모터의 조절하에 발현할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하는 것이지 이를 제한하려는 것이 아니다.

약자는 하기 의미를 갖는다:

[완충액, 배지, 시약]

플레이트용으로는 모든 배지에 1.5% 아가(BBL)를 첨가하여 고형화시킨다. 톱-아가(로즈)용으로 0.7% 아가(BBL) 또는 아가로즈(Seakem)를 사용한다.

하기 균주가 사용된다.

하기 벡터가 사용된다.

[EMBL4]

EMBL4는 클로닝 수용능이 9 내지 23kbp인 람다 대체 벡터이다[참조: Frischauf, et al., 참조 문헌(2)]. 이는 λ 암(arm)과 비필수적인 스터퍼(stuff) 영역 사이에 다중 클로닝 영역을 함유한다. 이것으로 관심의 외래 DNA를 삽입하는 경우 벡터 암에 스터퍼가 재결합되는 것이 감소되도록 다중 제한 효소 절단을 수행할 수 있다. 이 벡터는 또한 재조합체에 대한 직접 선별을 제공하는 Spi 표현형을 이용한다[참조: Zissler et al., 참조문헌(20)].

[pCG 3 B11]

이 플라즈미드는 유럽 특허원 제88 101 397.3호에 설명되어 있고, pBR 322에 클로닝된 에이. 니거 N756의 pelD(PLI) 유전자를 함유한다.

[pPL 29-5]

이 플라즈미드는 유럽 특허원 제 88 101 397.3호에 설명되어 있고, pelD(PLI) 유전자의 N-말단 EcoRI 단편을 함유한다.

[pPL 35-5]

이 플라즈미드는 유럽 특허원 제 88 101 397.3호에 설명되어 있고, pelD(PLI) 유전자의 C-말단 EcoRI 단편을 함유한다.

[pBR 322]

플라즈미드 pBR 322는 항생물질 암피실린(

) 및 테트라사이클린(

)에 대한 내성 유전자를 수반한다. 이 플라즈미드는 몇몇 독특한 클로닝 부위를 함유하는데, 이중 몇몇은 amp 또는 tet 유전자내에 위치하므로 클론된 DNA 삽입으로 항생물질-민감성 박테리아가 된다.

[pEMBL 18 및 pEMBL 19]

이 플라즈미드는 덴트(Dente) 등에 의한 문헌(7, 8)에 설명되어 있다.

[pGW 613]

이 플라즈미드는 구센(Goosen) 등의 문헌(12)에 설명되어 있다.

[M13mp 파아지]

M13mp 18 및 M13mp 19 벡터(Norrander et al., 참조문헌 21)는 단쇄 DNA 박테리오 파아지 M13의 유도체이고, 다양한 폴리링커 부위에 DNA 단편을 클로닝시켜 DNA 서열화를 용이하게 하며 두가지의 가능한 방향으로 동일한 제한 단편의 클로닝을 용이하게 하도록 고안된 것이다. 이러한 벡터에 클로닝시킨 서열은 서열화 반응을 위한 주형으로서 또는 표준 올리고데옥시리보뉴클로레오타이드 프라이머 및 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편을 사용한 단쇄 프로브의 생성에 용이하게 사용될 수 있다. 벡터 DNA는 이.콜라이 lac-오페론 프로모터 및 β-갈락토시다제의 처음 145개 아미노산의 유전적 정보를 수반한다. 다중 제한 부위를 함유하는 폴리링커 서열을 lacZ 서열에 삽입시킨다. 폴리링커는 lacZ 판독 프레임을 보유하며 이 벡터는 LacZα 숙주 균주의 대립 형질 상보체를 제공하여 IPTG 및 X-gal이 함유된 플레이트상에 청색 플라그를 나타낸다. 판독 프레임을 파괴하거나 lacZα 펩타이드의 발현을 방해하는 삽입체를 함유하는 재조합 파아지는 무색 플라그로 나타난다.

[pCG 59D7]

이 플라즈미드는 EP 제88 101 397.3호에 설명되어 있고, 에쉐리키아 콜라이 BJ 5183 / pCG 59D7(DSM 3968)로부터 수득할 수 있다. 이 플라즈미드는 pyr A 유전자를 함유하며 에이. 니거 pyr A^-돌연변이체를 동시 형질전환시키는데 사용된다.

[M13mp (+) KS (Bluescript) (STRATAGENE, San Diego, CA, USA)]

M13 파아지의 복제 개시점을 함유하는 ds DNA 벡터. 헬퍼 파아지, 예를 들어 M13K07(참조문헌 29) 또는 R408(참조문헌 9)의 존재하에 벡터의 (+)-가닥이 복제되고, 팩킹되어 배지에 분비된다.

[M13 K07]

M13 (+) KS에 대한 헬퍼 M13 파아지[참조: Mead et al., 참조(29)].

[R408]

M13 (+) KS에 대한 헬퍼 M13 파아지[참조: Russell et al., 참조(9)].

[실시예 1]

[아스퍼질러스 니거의 게놈 라이브러리 작제]

[실시예 1.1]

[에이. 니거로부터 고분자량 DNA의 분리]

아스퍼질러스 니거 균주 N400의 분생포자를 최종 포자 밀도 10⁶개 포자/ml로 최소 배지 200ml에 접종하고 뉴 브룬스위크(New Brunswick) 회전 진탕기를 사용하여 28℃에서 24시간 동안 300rpm으로 1ℓ 삼각플라스크에서 진탕한다. 미라클로쓰(Myracloth)가 있는 부흐너(Buchner) 깔때기를 사용하여 여과함으로써 균사체를 회수하고, 냉 멸균 염수로 세척하여 액체 질소로 동결시키고 -60℃에서 저장하거나 직접 사용한다. 게놈 라이브러리를 제보하기 위한 DNA의 분리 방법은 옐톤(Yelton) 등의 방법(참조문헌 1)을 기본으로 한다. 이 방법으로의 DNA 수율은 약 50 내지 100μg/g 균사체이다.

라이브러리 작제를 위해, 10g 균사체를 브라운 미세-분할기(Braun micro-dismembrator)에서 1g 분획으로 액체 질소로 연마한다. 연마된 균사체는, 200ml 추출 완충액(50mM EDTA pH 8.5, 0.2% SDS) 및 200μl 디에틸피로카보네이트를 함유하는 1ℓ 멸균 삼각플라스크에 옮긴다. 혼합물을 서서히 실온까지 가열시킨 후 때때로 진탕하면서 68℃까지 20분 동안 가열한다. 현탁액을 실온까지 냉각시키고 12000xg에서 15분 동안 원심분리하고 8M 칼륨 아세테이트 용액(pH 4.2) 1/16 용적을 상등액에 가한 후 혼합물을 1시간 동안 얼음 위에서 정치시킨다. 침전물은 원심 분리하여 제거한다. (20분, 16000xg, 4℃), 핵산은 15분 동안 얼음 위에서 0.6용적의 이소프판올과 함께 항온 처리하여 상등액으로부터 침전시킨다. 펠렛은 원심분리(10분, 6000xg, 4℃)하여 회수하고, 70% 에탄올로 세척하여 간단히 건조한다. 펠렛을 20μg/ml RNase A(Boehringer, Mannheim)가 함유된 10ml TE에 현탁시키고 37℃에서 15분 동안 항온처리한다. DNA는 37℃에서 1시간 동안 뉴클레아제가 없는 프로나제(1mg/ml 최종 농도)(Kochlight Coinbrook)로 처리한다. TE 완충액 중의 프로나제 저장 용액은 뉴클레아제를 절단시키기 위해 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 효소 20mg/ml를 함유한다.

8.5g CsCl을 9ml DNA 용액에 용해시키고, 0.2ml의 10mg/ml 에티디움 브로마이드를 가하여 이 용액을 벡크만 SW41 로터로 33000rpm에서 60시간 동안, 또는 급속 밀봉관이 있는 벡크만 50Ti 로터로 45000rpm에서 40시간 동안 원심 분리한다. DNA 밴드는 튜브의 측면에 구멍을 뚫어 모은다. 에티디움 브로마이드는 물- 및 NaCl 포화 이소프로판올로 수회 추출하여 제거한다. 5용적의 TE를 가하고, DNA를 TE-포화 페놀, 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 25:24:1 및 클로로포름/이소아밀 알코올 24:1로 추출한다. DNA는, 0.1 용적의 3M 나트륨 아세테이트 pH 5.2, 2.5 용적의 에탄올을 가하고 -20℃에서 밤새 항온처리하여 침전시킨다. 침전물은 원심분리(1시간, 3000xg, 4℃)하여 회수하고, 70% 에탄올로 세척하여 건조시키고 400μl 낮은 TE 완충액에 용해시킨다.

[실시예 1.2]

[MboI으로 에이. 니거 DNA의 부분적 절단 및 단편의 분리]

13.6과 23kbp 사이의 가장 큰 단편을 제공하는 MboI 농도에 대해 시험하기 위하여, 에이. 니거 N400 DNA 1μg 분획을 37℃에서 1시간 동안 10㎕의 용적으로 감소량의 Mbo I(0.5-0.001U)를 갖는 적합한 완충액 중에서 절단한다. 반응을 1μl 0.25M EDTA의 첨가로 중지시키고 샘플을 1μg/ml 에티디움브로마이드가 함유된 TBE중의 0.6% 아가로즈 겔 상에 적하한다. 편리한 마커는 람다 DNA 및 Bgl II로 절단하여 49, 22.8, 13.6, 9.8, 2.3kbp 밴드 및 볼 수 없는 0.45kbp의 단편 밴드를 제공하는 람다 DNA의 혼합물이다. 목적하는 13.6 내지 23kbp 단편의 고수율을 위해 필요한 MboI 농도는 0.02U/μg DNA이다. 따라서 총 용적 2ml중의 DNA 200μg을 절단하고 효소 첨가 후 즉시 동일 크기의 20분획으로 나눈다. 37℃에서 1시간 후에 절단물을 얼음 위에 놓고 1μg 샘플을 적당한 절단에 대해 시험하기 위하여 겔상에서 진행시킨다. 결과가 양성인 경우, EDTA를 25mM의 최종 농도로 가하여 반응을 중지시키고, 효소를 65℃에서 10분 동안 열-불활성화시키고, 샘플을 모아 DNA를 침전, 세척, 건조 및 400μl TE에 용해시킨다.

단편화된 DNA를 0.4% 예비 아가로즈 겔(중심 웰 120x1.5mm) 상에서 밤새 분리한다. BglII로 절단한 람다 DNA는 4℃ 및 40V(3V/cm)에서 전기 영동하여 부분적으로 절단된 DNA 단편의 크기를 결정하기 위한 마커로서 사용한다. 정확한 크기의 단편을 함유하는 겔 부분을 겔로부터 절단해 내어 DNA를 2ml TBE 중의 멸균 투석 튜빙에서 100V, 2 내지 3시간 동안 겔로부터 전기 용출시킨다. 전류는 30초 동안 역류되고 DNA를 함유하는 완충액을 회수한다. 그 다음 단편을 에탄올 침전시켜 농축하고 100μl 낮은 TE 완충액에 용해시킨다.

[실시예 1.3]

[벡터 DNA의 제조 및 에이. 니거의 고분자량 DNA 단편의 EMBL 4로의 클로닝]

에이. 니거 균주 N400의 게놈 라이브러리를 람다 벡터 EMBL 4내로 작제한다. 람다 벡터 EMBL4는 0 내지 23kbp의 클로닝 수용능을 가지며 프리샤우프(Frischauf) 등(참조문헌 2) 및 칸(Karn) 등(참조문헌 3)의 문헌에 설명되어 있으며 프로메가바이오텍 인코포레이션(Promega Biotech. Inc.)으로부터 시판되어 왔다. 게놈의 상이한 부분으로부터 유래된 이중 삽입을 막기 위해, 본 발명자는 클로닝을 위해 13.6kbp의 최소 단편 길이를 사용하였다.

10μg 람다 EMBL 4 DNA를 BamHI 50 유니트로 37℃, 2시간 동안 100μl 용적의 적합한 완충액 중에서 완전히 절단한다. 효소를 65℃에서 10분동안 불활성화시킨다. NaCl 농도를 150mM로 증가시키고 SalI 50 유니트를 가한 후 37℃에서 다시 2시간 동안 항온처리한다. EDTA를 25mM까지 가하고 효소를 불활성화(65℃, 10분)시킨 후 용액을 동일 용적의 페놀(TE-포화), 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 25:24:1, 클로로포름/이소아밀알코올로 추출한다. 작은 BamHI/SalI 폴리링커 단편을, 소단편을 제거하기 위하여, DNA를 0.1용적의 3M 나트륨 아세테이트 pH 5.2를 가한후 0.6 용적의 이소프로판올을 가하여 침전시킨다. 얼음에서 15분 정치시키고 12000xg 및 4℃에서 원심분리시킨 후 침전물을 70% 에탄올로 완전히 세척하고, 건조시켜 40μl 낮은 TE 완충액에 용해시킨다.

[실시예 1.4]

[게놈 에이. 니거 DNA 단편의 결합 및 시험관내 팩캐이징]

실시예 1.3에 따라 제조한 벡터를 cos 부위를 결합 반응 전에 어닐링시키는 것은 필수적인 것이다. 100mM Tris-HCl pH 7.5 및 10mM MgCl₂중의 벡터를 65℃에서 10분 동안 가열시키고 42℃에서 1시간 동안 어닐링시킨다. 시험 결합으로부터 벡터 대 단편이 약 1:1 (중량에 대해)인 경우 최대 재조합체가 수득되는 것이 밝혀졌다. 결합은 50mM Tris HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DTT 및 1mM ATP 중에서, 9.5μg의 벡터 및 10μg의 DNA 단편을 사용하여 총 용적 100μl로 하여 수행한다. 그 다음 DNA 리가제(BRL)를 0.5U/μg DNA 농도로 가하고 결합 혼합물을 14℃에서 밤새 항온처리한다. 결합에 대해 시험하기 위하여 결합된 DNA의 샘플을 아가로즈겔상에 진행시킨다. 또한, 0.5μg의 벡터를 단편을 가하지 않고 5μl 용적으로 결합시킨다.

큰용적의 결합 혼합물을 에탄올 침전시켜 농축하고 시험관내 팩캐이징시키기 전에 20μl 저 TE에 용해시킨다. 시험관내 팩캐이징은 DNA 1μg 팩매이징에 10μl 분획량을 사용하는 제조업자의 지시에 따라 프로메가 팩카진(Packagene) 추출물로 수행한다. 추출물이 공급되는 고분자량 λCI857 Sam 7 중 1μg을 대조용으로 따로 팩캐이징시킨다. 팩캐이징 후 500μl의 파아지 용액 완충액(PSB)을 가하고 5μl 클로로포름을 가한다. 재조합 파아지 스톡은 4℃에서 저장할 수 있다. 수득된 라이브러리는 두가지 분리된 결합 실험으로부터 작제된 것이다.

[실시예 1.5]

[에이. 니거 균주 N400 게놈 라이브러리의 역가측정 및 증폭]

이. 콜라이 NM 539의 세포를 0.2% 말토즈, 10mM MgSO₄ 및 1mM CaCl₂를 함유하는 LC 배지에서 흡광도(600nm) 1.0까지 배양한다. 이 배양물의 분취량 0.2ml를 PSB 중의 파아지 희석물 시리지 0.1ml에 가한다. 37℃에서 20분 동안 파아지의 흡착이 일어난 후, 45℃에서 3ml 0.6% LC 톱아가를 가하고 혼합물을 LC 아가 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양한다. 파아지 현탁액 ml당 플라그 형성 단위(pfu)의 수로서 표현된, 실시예 1.4에 따라 제조된 두 파아지 스톡에 대한 역가측정 결과는 12x10⁵및 4.2x10⁵pfu/ml이다. 단편이 없이는 대조용 결합물로부터 계산된 기저값(각기 17% 및 40%)을 뺀 후 재조합체의 절대 수는 게놈 길이의 20배가 넘는 6x10⁵이다.

라이브러리를 증폭시키기 위해, 두 파아지 스톡 분획량 80μl를 사용하여 이.콜라이 NM 539 세포를 감염시키고 LC 아가 플레이트 상의 LC 톱 아가로즈에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한다. 파아지를 실온에서 1시간 동안 플레이트 당 5ml PSB를 사용하여 플레이트를 조심스럽게 흔들어 아가로즈로부터 용출시킨다. PSB를 모아 원심 분리(10분, 6000xg)하여 박테리아를 제거하고 클로로포름을 가한다(0.5% 최종 농도). 두 파아지 스톡을 같은 정도로 증폭시키며, 이것을 혼합하여 (40ml 스톡) 적정하고 (8x10⁹pfu/ml) 4℃에서 저장한다.

[실시예 2]

[펙틴 리아제 D 유전자(pelD)에 대한 에이. 니거 N400의 게놈 라이브러리 선별 및 유전자의 분리]

[실시예 2.1]

[라이브러리의 선별]

실시예 1에 설명된 것과 같이 수득된 람다 게놈 라이브러리로부터 pelD 유전자를 분리하기 위하여, 2.5x10⁴개 파아지를 액화시킨 LC 톱-아가로즈와 혼합하여 5개 LC 아가 플레이트상에 도말한다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하고 4℃에서 2시간 동안 냉각시킨다. 각 플레이트로부터 2개의 레플리카를 벤톤 및 데이비스(Benton and Davis, 참조문헌 4)의 플라그 하이브리드화 방법에 따라 제조한다. 제 1 필터 (Schleicher and Schull BA85 또는 Millipore HATF 085)를 1분 동안 플레이트 상단에 놓고, 제 2 레플리카는 2분 동안 놓고, 레플리카의 위치는 인디아 잉크를 사용하여 표시한다.

필터를 제거한 후 이것을 변성 용액(1M NaCl, 0.5M NaOH) 100ml를 함유하는 접시에 1분 놓았다가 100ml 재생 용액 (0.5M Tris/HCl pH 7.5, 1.5M NaCl)에 1분 동안 놓는다. 그 다음 필터를 3 x SSC(SSC=0.15M NaCl, 0.015M 나트륨 시트레이트 pH 7.0)를 함유하는 접시에 옮긴다. 필터를 장갑낀 손으로 문질러 박테리아 파편을 제거하고 3xSSC가 함유된 새 접시에 옮긴 후 실온에서 20분동안 조심스럽게 진탕시킨다. 필터를 와트만 3MM 페이퍼에 블로팅하고 실온에서 10분 동안 건조시킨다. 필터를 80℃ 오븐에서 2시간 동안 3와트만 MM 페이퍼 상에서 굽는다. 계속해서 이들을 실온에서 0.5시간 동안 6 x SSC 중에 세척하고 예열시킨(56℃) 예비하이브리드화 혼합물[50mM Tris/HCl pH 7.5, 10mM EDTA, 1M NaCl, 0.5% SDS, 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 10 x 덴하르트 (50 x 덴하르트 = 1% BSA, Boehringer fraction V; 1% 폴리비닐피롤리딘 -40;1% Ficoll 400) 함유] 50ml에 옮긴다. 예비하이브리드화 혼합물에 0.1mg/ml 변성된 연어 정자 DNA[참조: Maniatis et al., 327, 참조문헌 5] 및 0.01mg/ml 폴리 rA를 가한다. 예비하이브리드화는 조심스럽게 흔들면서 56℃에서 4시간 동안 수행한다. 하이드리드화를 위해 사용된 프로브는 닉 해독된 pPL-35-5의 3.5kpb EcoRI 단편으로, 에이. 니거 n756 균주의 pelD 유전자의 C-말단 영역을 함유한다(이.콜라이 BJ 5183/PCG3B1l, DSM 3916으로부터 이용 가능, EP 제88 101 397.3호). 단편은 미리 저융점 아가로즈 겔에서 분리하여 이 단편 0.3μg을 닉-해독한다[참조: Maniatis, et al., 109-112, 참조문헌 5]. 닉-해독된 DNA는 끓는 수용에서 10분동안 변성시키고 얼음 위에서 냉각시켜 예열시킨 예비하이브리드화 혼합물 50ml에 가하다. 예비하이브리드된 필터를 하나씩 하이브리드화 혼합물에 옮긴다. 하이브리드화는 조심스럽게 진탕시키면서 56℃에서 밤새 수행한다. 필터는 56℃에서 0.5ℓ4 x SSC, 0.1% SDS로 30분씩 2회, 및 2 x SSC, 0.1% SDS로 30분씩 2회 세척한다. 필터를 3MM 페이퍼에 블로팅하여 1시간 동안 공기로 건조시킨다. 이것의 3MM 페이퍼에 찍고 방사성 표지된 잉크로 적당히 표시한 후, 필터를 사란 랩(Saran wrap)으로 덮어 코니카 X-선 필름 및 통상의 증감 스트린이 있는 코닥 X-오매틱 카세트를 사용하여 -70℃에서 밤새 자동-방사선 사진을 촬영한다. 이 방법에서, 44개 양성 시그날이 스크린화된 5개 플레이트로부터 나타난다. 플레이트를 잉크 마커를 사용하여 방사선 사진상에 조심스럽게 위치시켜 양성 플라그를 멸균된 파스퇴르 피펫으로 골라낸다. 양성 플라그를 함유하는 아가 조각을 1ml PSB에 현탁시킨다. 파아지를 가끔씩 볼텍싱하면서 실온에서 1시간 동안 아가로부터 확산되도록 한다. 아가 및 박테리아 세포 파편을 5분 동안 원심분리하여 제거하고, 10μl 클로로포름을 가하여 파아지스톡을 4℃에서 저장한다. 양성 클론은 λ-PL1 내지 λ-PL44로 명명한다. 파아지는 고밀도로 도말되기 때문에, 양성 플라그는 이를 저밀도(± 100파아지/플레이트; 파아지 스톡의 10³배 희석액 0.1ml)로 도말하고 레플리카 도말, 하이브리드화 및 양성 플라그 선택의 전 과정을 반복함으로써 2회 정제하여야 한다.

[실시예 2.2]

[람다 DNA의 분리]

제조합 클론으로부터 DNA를 분리하기 위하여, 파아지를 우선 실시예 1.5에 설명된 것과 같이 정제된 클론으로부터 파아지 스톡 0.1ml로 이.콜라이 NM 539를 감염시키고 이 세포를 LC 아가 플레이트상의 LC 톱-아가로즈에 도말하여 증폭시킨다. 이것은 지시 박테리아의 융합성 분해가 일어나는 플레이트를 제공한다. 5ml PSB를 플레이트상에 분포시키고 파아지를 조심스럽게 진탕시키면서 2시간 동안 용출시킨다. 용출된 파아지를 회수하고, 세포 파편을 원심 분리하여 제거하고 클로로포름을 1%까지 가한다. 그 결과 생성된 플레이트 분해물은 4℃에서 저장한다. 일반적으로 이것은 약 10¹¹pfu/ml의 역가를 가진다.

플레이트 분해물 스톡으로부터 및 소규모 액체 배양물로부터의 소규모 분리방법[Maniates et al., pp 65-68; 참조문헌 5]은 항상 절단 간단한 DNA를 수득할 수 있는 것은 아니기 때문에 파아지를 25ml 분해물로부터 분리한다. 이것은 숙주 이.콜라이 NM 539를 LC+0.2% 말토즈 10mM MgSO₄, 1mM CaCl₂에서 0.D.₆₀₀이 0.3이 될 때까지 배양시킨 후 플레이트 파편 약 10⁶pfu를 가하여 제조한다. 추가 배양에 따라 박테리아는 4시간 내에 분해한다.

분해물에 최종 농도 2μg/ml로 RN_ase및 DN_ase를 가하고 실온에서 1시간 동안 정치시킨다. 세포 파편을 원심분리하여(20분, 실온, 10,000xg) 제거한다. 14.8g NaCl 및 25g PEG 6000을 상등액에 용해시켜 최종 농도 1M NaCl 및 25% (w/v) PEG를 수득한다. 파아지를 얼음 위에서 1시간 또는 4℃에서 밤새 정치하여 침전시키고 원심 분리(20분, 10,000xg, 4℃)하여 회수한다. 펠렛을 3ml의 람다 희석 완충액(LDB; =10mM Tris/HCl pH 7.5, 20mM MgCl₂, 100mM NaCl)에 현탁시킨다. 2.5g CsCl을 파아지 현탁액 4ml에 용해시키고 혼합물을 5ml 백크만 급속 밀봉관에 피펫팅한 후 LDB 중의 동일 농도의 CsCl로 채운다. 튜브를 밀봉하여 벡크만 VTi 65.2 로터로 5000rpm 및 4℃에서 밤새 원심 분리한다. 일반 램프하에서 볼 수 있는 탁한 파아지 밴드를 튜브의 측면에 구멍을 뚫어 수득한다. CsCl은 멸균 튜빙 내에서 2ℓ의 10mM Tris/HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 50mM NaCl에 대해 4℃, 4시간 동안 투석하여 제거한다. 완충액은 1회 교체한다. 파아지는 멸균된 그라이너(Greiner) 튜브에 모으고, 용적을 투석 완충액으로 1ml까지로 조절하고, 50μl 10% SDS, 50μl 0.5M EDTA pH 8.0 및 25㎕ 20mg/ml 뉴클라아제-유리 프로나제를 가하고 튜브를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 용적은 TE로 3ml까지 증가시키고 이 용액을 등용적의 TE-포화 페놀, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 25:24:1 및 클로로포름/이소아밀 알코올 24:1로 추출한다. 0.1 용적의 3M 나트륨 아세테이트 pH 5.2 및 2.5 용적의 에탄올을 가한 후, DNA를 -20℃에서 밤새 침전시켜 원심분리(1시간, 2000xg, 4℃)하여 회수한다. 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 건조시켜 200μl 저 TE에 용해시킨다. 파아지 DNA의 수율은 약 200μg/250ml 분해물이다.

[실시예 2.3]

[pelD 클론의 제한 분석]

양성 파아지로부터, 추가 분석을 위해 임의로 10개를 선택한다. 파아지 DNA 1μg을 제조업자가 지시한 완충액 중에서 37℃ 2시간 동안 20μl 용적으로 10단위의 EcoRI 또는 BglII로 절단한다. 샘플은 마커로서 HindIII로 절단한 람다 cI857 Sam 7 DNA(람다 x HindIII) 1μg 및 대조용으로서 EocRI으로 절단한 pCG 3B11 DNA 및 EMBL 4 DNA를 이용하여 0.6% 아가로즈 겔상에서 분리한다. 겔을 폴라로이드 667 필름(4s, 조리개 8)을 사용하여 UV 투사기로 사진을 찍는다. DNA를 쉴라이허 및 쉴(Schleicher and Schull) BA85 니트로셀룰로즈 필터에 서던(Southern)(1975) 방법에 따라 옮긴다[참조: Maniatis, pp 382-386, 참조문헌 5]. 필터를 전체 유전자를 함유하는 pel D 유전자의³²P 표지된 (닉-해독된) 단편의 혼합물과 하이브리드화시킨다. 이러한 단편은 pPL 29-5의 2.9kbp EcoRI 단편 및 pPL 35-5의 3.5kbp EcoRI 단편이다. 하이브리드화 및 세척 조건은 실시예 2.1에 설명된 것과 동일하다.

밴드 길이는 사진 및 자동 방사선 사진으로부터 세미로그 페이퍼 상에서 그래프상으로 공지된 마커 밴드와 비교함으로써 계산한다. 클론의 제한 지도는 제1지도에 나타나 있다. 클론 λ-PL 4, -14 및 -40은 pCG 3B11에서 발견되듯이 2.9 및 3.5kbp EcoRI 하이브리드 단편을 함유한다. λ-PL 5, -6, -10 및 -33은 또다른 하이브리드 EcoRI 단편과 함께 3.5kbp EcoRI 단편을 함유한다. 클론 λ-PL 26 및 -28은 다른 하이브리드 단편과 함께 2.9kbp EcoRI 단편을 함유하는 반면, λ-PL 9는 단지 작은 1.2kbp 하이브리드 EcoRI 단편을 함유한다. 전체 구조 pelD 유전자를 함유하는, pCG 3B11의 완전한 5.0kbp Bgl II 단편은 단지 클론 λ-PL 4, -14 및 -40에만 존재한다. pCG 3B11에는 없고 클론 λ-PL 5, -6, -10, -14, -33 및 -40에 존재하는 3.7kbp 하이브리드화 밴드는 5.0kbp 단편에 있는 pelD 유전자의 상향에 위치한다. 몇몇 하이브리드화 Bal II 단편은 벡터의 우측 암의 1.2kbp를 함유하고 있다. 모든 클론은 또한 동일한 비하이브리드화 단편을 함유한다. 따라서 이것은 구조 유전자의 제한 양식 및 유전자 환경이 모든 클론에서 동일하다는 것을 나타내기 때문에, 이들이 동일한 유전자, 즉 에이. 니거 균주 N400의 pelD 유전자로부터 유래된 것이라고 결론지을 수 있다. 평균 삽입체 길이가 15kbp인 25000개 클론에 대한 도말된 클론의 수 및 추축된 게놈 길이 3 x10⁷bp로부터 적어도 12개 pelD 클론이 밝혀질 것으로 생각된다. 분석된 10개 클론중 단지 2개만이 동일하기 때문에, 라이브러리의 복잡성은 가정한 것보다 훨씬 높다(참조, 실시예 3).

[실시예 2.4]

[pelD 단편의 서브클로닝]

각각 에이. 니거 N400 및 N756의 pelD 유전자를 함유하는 λ-PL 4 및 pCG 3B11의 5.0kbp Bgl II 단편을 플라즈미드 pBR322의 BamHI 분위에 서브클로닝시킨다(클로닝 벡터 참조). λ-PL 4의 4μg 및 pCG 3B11 2μg을 20μl으로 하여 Bgl II 10U로 37℃, 2시간 동안 완전히 절단한다. 단편을 50볼트에서 TBE + 1μg/ml 에디티움 브로마이드 중의 1% 저융점 아가로즈(BRL)상에서 분리한다 5.0kbp 단편을 겔로부터 절단해 내어, 0.4ml TE로 희석하고 동용적의 페놀을 가한 후 혼함물을 65℃에서 10분 동안 가열하여 아가로즈를 녹인다. 에펜도르프 5414S 테이블 원심분리기로 12000rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후, 수성상을 페놀/클로로포름 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시켜 세척하고 건조하여 최종으로 10μl 낮은 TE완충액에 용해시킨다.

대규모 플라즈미드 제조방법[참조: Maniatis, et al., p 86, 참조문헌 5]에 의해 제조하여 CsCl 구배 원심분리하여 정제한 1μg pBR322 DNA를 용적 20μl로 하여 5U BamHI으로 37℃, 2시간 동안 절단한다. 2μl 10 x CIP 완충액 및 0.02단위의 CIP를 가하고 다시 30분 동안 항온 처리를 계속한다. EDTA는 최종 농도 25mM까지 가하고 혼합물을 65℃, 10분 동안 가열한다. 용액을 TE로 200μl로 희석하고 TE-포화 페놀로 3회, 페놀/클로로포름으로 1회 및 클로로포름으로 1회 추출한다. 에탄올로 침전시킨 후 DNA를 50μl 낮은 TE 완충액에 용해시킨다.

단편 DNA 100ng을 용적 20μl로, 실시예 1.4에 설명된 조건하에서 벡터 DNA 20ng과 결합시킨다. 결합 혼합물의 반을 사용하여 CaCl₂방법[참조: Maniatis, et al., p250, 참조문헌 5]으로 제조한 이.콜라이 MH1 컴피텐트 세포를 형질전환시킨다. 세포를 50μg/ml 암피실린이 함유된 LC 아가 플레이트상에 도말하여 37℃에서 밤새 항온처리한다. 20μg/ml TC가 함유된 LC 플레이트 상에 먼저 콜로니를 도말한 다음 다시 LC + amp 플레이트상에 도말함으로서 형질전환체를 테트라사이클린 감성에 대해 시험한다. 형질전환체를 37℃에서 5ml의 LC + amp 중에서 밤새 항온 처리하고 DNA를 알칼리성 분해 미니프렙(miniprep) 방법[참조: Maniatis et al., p 368; 참조 5]을 사용하여 1.5ml 배양물로부터 분리한다.

미니프렘 DNA를 BamHI 및 Pst I으로 절단하고 단편을 1% 아가로즈 겔상에서 분석한다. 반대 방향으로 5.0kbp Bgl II 단편을 함유하는, λ-PL 4로부터 유래된 두 플라즈미드를 pGW 840 및 pGW 841라 명명한다. 또한 pCG 3B11로부터 유래된 플라즈미드는 pGW 870 및 pGW 871이라 명명한다. 이를 함유하고 있는 MH 1 세포는 -70℃에서 글리세롤상에 유지시킨다. 이러한 클론의 0.5ℓ 배양물로부터의 플라즈미드 DNA를 대규모로 분리하고 [참조: Maniatis et al., p86, 참조문헌 5] CsCl 원심 분리, 페놀 처리, 에탄올 침전 및 400μl 낮은 TE 완충액에 용해시켜 정제한다. 수율은 약 500μg이다. 이 플라즈미드들의 제한 지도를 만든다. 플라즈미드 pGW 840에 대한 지도는 제2도에 나타내었고, 이는 PGS 870과 구별할 수 없다. 또한 서로 반대 방향으로 단편을 함유하는 플라즈미드 pGW 841 및 pGW 871도 구별이 되지 않는다. 이는 에이. 니거 균주 N 400 및 N 756으로부터의 pelD 유전자의 동일성을 가리키는 것이다.

[실시예 3]

[pelD와 관련된 유전자의 선별, 분리 및 특징화]

[실시예 3.1]

[에이. 니거 N400 DNA의 게놈 블롯 분석에 의한 하이브리드화 조건 설정]

실시예 1.1에 설명된 것과 같이 분리된, 에이.니거 균주 N400의 2μg DNA 샘플을 20μl 용적으로 HHA B/g 완충액 중의 BamHI(BRL) 또는 HindIII(BRL)를 사용하여 37℃에서 4시간 동안 절단한다. 절단된 샘플을 40V에서 18시간 동안 0.6% 아가로즈 겔상에서 전기영동하여 분리한다. DNA를 니트로 셀룰로즈 필터에 옮겨 실시예 2.3.에 설명된 것과 같이 굽는다. (예비) 하이브리드화 용액은 실시예 2.1에 설명된 것과 동일하다.

예비하이브리드화 동안 사용되는 온도는 항상 하이브리드화 온도와 동일하다. pelD 유전자의 암호화 영역을 함유하는 pGW 840의 닉 해독된 1.6kbp BamHI/Pst I 단편이 프로브로서 사용되어 왔다. 하이브리드화는 16시간 및 40시간 동안 상이한 온도(52, 60 및 68℃)에서 수행한다. 다음 두 세척 조건을 3가지 다른 온도에서 사용한다: 2 x 30분 5 x SSC, 0.1% SDS; 이어서 2 x 30분 3 x SSC, 0.1% SDS(4 x 30분 5 x SSC, 0.% SDS와 비교됨), 68℃ 세척을 위해 2 x SSC, 0.1% SDS로 2회 및 0.2 x SSC, 0.1% SDS로의 2회 세척이 포함된다. 0.2 x SSC 세척을 이용한 68℃에서는 단지 상동성 하이브리드화가 일어난다. 고염 농도를 사용하는 것은 몇몇 다른 약한 시그날을 나타내기도 한다. 52℃에서, 기저값은 높고 하이브리드화는 약하다. 이질성 하이브리드화의 경우에 밝혀진 최상의 조건은 60℃에서 40시간 동안 5 x SSC 및 3 x SSC의 세척 조합을 이용하는 것이다. 이것은 5 x SSC 및 3 x SSC의 조합대신 4 x SSC 와 2 x SSC의 조합을 이용하여도 또한 최적화 할 수 있다. 프로브로 pGW 840의 1.6kbp BamHI/Pst I 단편을 사용하는 경우 에이. 니거 N400의 이러한 게놈 블롯에 나타난 시그날이 표 1에 요약되어 있다.

[실시예 3.2]

[라이브러리의 선별]

N400 람다 라이브러리로부터 2.5 x 10⁴개 파아지를 5개 플레이트에 도말하고 실시예 2.1에 설명된 것과 같이 각 플레이트로부터 3개의 니트로셀룰로즈 레플리카를 제조한다. (예비) 하이브리드화 완충액은 실시예 2.1에 설명되어 있다. 각 플레이트의 제1 레플리카는 pGW 840의 1.6kbp BamHI/Pst I 단편과 40시간 동안 60℃에서 하이브리드화시키고, 그 온도에서 실시예 3.1에서 설명한 것과 같이 4 x SSC, 0.1% SDS로 30분 동안 2회 및 2 x SSC, 0.1% SDS로 30분 동안 2회 세척한다. 이러한 조건은 이질성 조건에 대한 것이다. 각 플레이트의 제2 레플리카는 68℃에서 동일 단편으로 하이브리드화시켜, 그 온도에서 2 x SSC, 0.1% SDS로 30분 동안 2회 및 0.2 x SSC, 0.1% SDS로 30분 동안 2회 세척한다. 이러한 조건은 상동성 조건에 대한 것이다. 각 플레이트의 제3 레플리카는 pGW 840의 0.35kbp BamHI 단편과 상동적으로 하이브리드하여 1.6kbp BamHI/Pst I 단편에 바로 인접한 pelD의 프로모터 영역에 위치된다. 상동적인 아닌 이질적으로(또는 상동적으로 매우 약하게) 하이브리드한 29개 플라그를 수득한다. 이것을 λ-PL 101 내지 λ-PL 129라 명명한다. BamHI/Pst I 프로브와 강하게 상동적으로 및 이질적으로 하이브리드된 19개 플라그가 수득된다. 이것은 λ-PL 130 내지 λ-PL 148이라 명명하고 pelD 클론이라고 생각된다. 이들 중 2개는 단지 0.35kbp BamHI 프로브 λ-PS 145 내지 λ-PL 146과 약하게 하이브리드화 되므로 아마도 프로모터 영역의 일부만을 함유할 것이다. 다른 것은 강하게 하이브리드화된다. 단지 0.35kbp BamHI 프로브와 하이브리드되는 단지 1개의 클론이 수득된다(λ-PL 149).

모든 클론을 택해서, 2회에 걸쳐 도말 및 1.6kbp BamHI/Pst I 프로브와의 이질적 화이브리드화로 정제한다. 2차 선별 시험에서는 23개 pelD 클론 및 25개 다른 클론이 추가로 수득된다(λ-PL 151 내지 λ-PL 198).

[실시예 3.3]

[pelD로부터 유도된 상이한 프로브를 사용하는 플라그 하이브리드화 시그날에 의한 람다 클론의 특징화]

이 실험에서는, 프로브로서 pelD의 암호화 영역의 상이한 부분을 사용함으로써 분리된 클론의 분류에 대해 기술한다. λ-PL 101 내지 -130, -145가 포함되고 λ-PL4를 양성 대조물로서 사용한다. 클론을 도말하고 단지 하나의 레플리카를 만들어 6부분으로 나눈다. 이것은 레플리카 사이의 하이브리드화 시그날에 있어서의 차이를 배제시키기 위한 것이다. 레플리카의 분리된 부분을 하기의³²P 표지시킨 프로브와 상동적으로 및 이질적으로 하이브리드화 시킨다:

1: pGW 840으로부터의 완전한 1.6kbp BamHI/Pst I 단편

2: pGW 840으로부터의 649bp BamHI/Xho I 단편

(pelD의 N-말단 암호화 부분)

3: pGW 840으로부터의 244bp Xho I/Pst I 단편 (pelD의 C-말단 암호화 부분)

λ-PL 101 뿐만 아니라 λ-PL 4, -130 및 -145는 pelD 클론에 대해 기대했던 것과 같이 상동적 및 이질적인 조건하에 상기 프로브와 강하게 하이브리드화된다. 클론 λ-PL 101은 실시예 3.2에서의 필터의 가장자리에 위치하므로 1차 선별에서 pelD로서 기록되지 않는다. 상기 언급한 클론들은 제 I형(pelD) 클론으로서 분류된다. λ-PL 112, -126 및 -127은 이 실험에서 음성으로 판명되었다. 다른 모든 클론은 다른 두 부류로 나눌 수 있다: 제 II형은 모든 프로브뿐만 아니라 N-말단 프로브와도 이질적으로 하이브리드화된다. 상동적 하이브리드화는 프로브로서 전체 pelD 유전자를 사용하는 경우에만 약하다. 제 III형 클론은 N-말단 프로브로 전혀 하이브리드하지 않으며 모든 프로브와 상동적으로 하이브리드화되지 않는다. C-말단 프로브는 제 II형 및 제 III형 클론과 하이브리드화되지 않는다. 이 실험으로부터 분리된 클론 중 적어도 2개의 관련 유전자가 있다고 결론지을 수 있다. 제 II형 클론에 속하는 것은 λ-PL 104, -105, -109, -113, -114, -115, -119, -122, -124, -125, -128 및 -129이다. 제 III형 클론에 속하는 것은 λ-PL 102, -103, -106, -107, -108, -110, -111, -116, -117, -118, -120, -121 및 -123이다.

[실시예 3.4]

[분리된 람다 클론(제 I형, 제 II형)의 제한 분석]

플레이트 분해물 스톡, 250ml 액체 분해물 및 이러한 분해물로부터의 대규모 파아지 DNA는 실시예 2.2에 설명된 것과 같이 제조한다. 이것은 24개 클론에 대해 수행하고, 이중 3개는 pelD 클론이다(λ-PL 4, -130, -145). 클론 DNA 하나가 DNA 분리 동안 상실되었다(λ-PL 124). 상기 클론들로부터 분리된 DNA를 총 용적 20μl중 샘플 1μg으로 하여 10단위의 효소로 절단한다. 모든 클론을 EcoRI, BamHI, HindIII, EdoRI/BamHI, BamHI/HindIII, EdoRI/HindIII 및 EdoRI/BamHI/HindIII로 절단한다. 단편을 0.6% 아가로즈 겔상에서 분리하고 실시예 2.3에서 설명한 것과 같이 니트로셀룰로즈 필터에 옮긴다. 블롯을 실시예 3.1에서 설명한 것과 같이 PGW 840의 1.6kbp BamHI/Pst I 단편과 이질적으로 하이브리드화시킨다. 두 개의 클론은 하이브리드화되지 않는다(λ-PL 112 및 λ-PL 129). 사진 및 자동 방사선 사진으로부터 밴드 길이를 계산한다. λ-PL 113 클론을 제외한 모든 클론은 너무 많은 단편을 함유하므로 완전한 지도를 얻을 수 없다.

그러나, 하이브리드화 영역의 지도를 알아낼 수 있고, 다른 하이브리드화되지 않은 밴드상의 데이터를 조합하여 어떤 동일한 유전자로부터 유래되었는지 알 수 있다. 분명히, 분석된 나머지 18개 제 II형 및 제 III형 중에 5개의 유전자가 존재한다. 이것을 pelA, pelB, pelC, pelE 및 pelF라 언급한다. 이러한 유전자에 대한 클론의 지정은 표 2에 요약되어 있다.

분리된 유전자의 하이브리드화 단편 길이 및 게놈 DNA 블럿으로부터의 하이브리드화 단편 길이의 비교는 표 3과 같다. 이러한 데이터로부터, 게놈 블롯에서 하이브리드한 모든 밴드는 분리된 클론에 존재하며, 이러한 하이브리드화 조건 하에서 다른 관련 유전자는 분리될 수 없다고 결론지을 수 있다. 플라그 하이브리드 결과(실시예 3.3)는, 부분적인 클론을 고려하지 않는다면, 모든 유전자가 시험된 프로브와 특이한 하이브리드 패턴을 가진다는 것을 나타낸다. 이것은 표 4에 요약되어 있다.

[표 4]

실시예 3.3에 설명된 실험에 따른 상이한 pelD 프로브와의 상동성 및 이질성 플라그 하이브리드화에 있어서 상이한 유전자의 시그날 세기 비교, 하이브리드화 정도는 + 표시의 수로 표현한다.

상동성 pelD 유전자는 적어도 10개의 +표시로 하이브리드한다:

±, 매우 약한 하이브리드화; -, 하이브리드화되지 않음.

[실시예 3.5]

[pelD 관련 유전자의 pBR322로의 서브클로닝]

실시예 3.3에서 설명된, λ 클론으로부터 수득된 하이브리드화 단편의 서브 클론은, EcoRI, BamHI 또는 HindIII로 절단하여 탈인산화한 벡터 pRB322에 제조한다. LMP 아가로즈 겔로부터 단편 분리, 벡터 제조, 결합, 이.콜라이 MH1의 형질전환, 미니프렙 DNA 분리 및 대규모 플라즈미드 분리는 실시예 2.4에 설명된 표준 방법을 이용하여 수행한다.

단편을 실시예 2.4에 설명된 것과 같이 적당한 벡터와 결합시킨다. 형질전환시킨 이.콜라이 MH1 세포는 LC + 50μg/ml Amp상에 도말한다. 형질전환체를 테트라사이클린 감성에 대해 시험한다. EcoRI 클론은 모두 내성이 있다. 미니프렙 DNA를 정확한 삽입체에 대해 시험하고 단편의 방향을 결정하기 위하여 적합한 효소로 절단한다. 선별된 플라즈미드는 표 5에 요약되어 있다. 이는 함유하는 세포는 글리세롤상 -70℃에서 저장한다.

플라즈미드 pGW820, -830, -850, -860 및 -880은 대규모로 분리하여 제한지도를 작성한다. 이러한 플라즈미드의 지도는 제1도 내지 제6도에 나타내었다.

유전자 위치 및 방향을 결정하기 위하여, 플라즈미드 절단체의 서던 블럿을 pGW840의 1.6kbp BamHI/PstI 단편과 이질적으로 하이브리드화시키고, 동일 블럿을 동일 플라즈마의 N-말단 단편과 이질적으로 하이브리드화시키는데, pGW820 및 -830의 지도 작성을 위해서는 649bp BamHI/Xhol 단편 및 pGW850 및 -860에 대해서는 766bp BamHI/EcoRI 단편을 사용한다.

플라즈미드 pGW820, -830, -850, -860 및 -880은 이.콜라이 HB101에 클로닝시켜 1988년 2월 1일에 기탁기관에 기탁하였다[기탁기관 Deutsche Sammlug von f

r Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braumschweig]. 이들의 기탁번호는 각각 DSM-4388, 4389, 4390, 4391 및 4392이다.

[실시예 4]

[pelD, pelA, pelB 및 pelC 유전자의 서열결정]

[실시예 4.1]

[에이.니거 균주 N400으로부터의 pelD 유전자의 부분서열 및 에이.니거 균주 N756으로부터의 pelI과의 동일성]

적합한 제한단편을 실시예 2.4에 설명된 것과 같이 LMP 아가로즈 겔 전기영동한 후 pGW840으로부터 분리한다. 이것을 BRL M13 클로닝/디데옥시 서열화 지침서(pp 26, 27; 참조문헌 6)에 따라 M13mp 18RF 및 M13mp 19RF 벡터에 결합시킨다. 이.콜라이 JM103을 형질전환시키고, 최소 X-gel 지시 플레이트상에 도말하고 재조합 파아지로부터 단쇄 DNA를 분리하는 것도 동일한 지침서(pp 29-34)의 지시에 따라 수행한다. 몇몇 클론을 BRL 지침서의 p38-74에 설명된 생거(Sanger) 디데옥시쇄 말단화 방법을 사용하여 서열화한다.

뉴클레오타이드 -457과 +100 사이에 결정된 서열은 에이.니거 N756으로부터 유도된 PLI 유전자의 상응하는 서열과 동일하며 플라즈미드 pCG3B11에 존재한다(EP88 101 397.3). 위치 -457의 BamHI으로부터 위치 +100까지 결정된 서열은 프로모터 서열 457개 뉴클레오타이드, 시그날 서열을 암호화하는 57개 뉴클레오타이드 및 성숙 PLD 단백질의 처음 13개 N-말단 아미노산을 암호화하는 43개 뉴클레오타이드를 함유한다.

pGW840의 N400 pelD 유전자 및 pCG 3B11의 N756 pelD의 동일한 제한지도 및 완전히 동일한 N-말단 서열 데이터로부터 두 유전자가 동일하다고 추정된다. 따라서 PLD 단백질은 이전의 PLI 단백질과 동일하다고 생각된다.

[실시예 4.2]

[pelA, pelB 및 pelC 유전자의 서열 결정]

pGW820, pGW830 및 pGW850 의 단편을 M13mp18RF 및 M13mp19RF(참조: 실시예 4.1) 또는 플라즈미드 pEMBL18 및 pEMBL19(참조: Dente et al., 참조 7, 8.)에 서브클로닝시킨다. 플라즈미드 클론의 단쇄 DNA는 헬퍼 파아지 R408(참조: Russell et al., 참조문헌 9)로 감염시킴으로써 수득한다.

엑소뉴클레아제 III 결실 클론은 헤니코프(Henikoff) (참조문헌 28)의 방법에 의해 pGW850으로부터 제조한다. pelC 유전자가 위치하고 있는 pGW850으로부터의 3.0kb Smal-BglII 단편을 pEMBL19에 서브클로닝시킨다. 이 클론 50μg을 SmaI 및 SacI으로 절단하고 페놀/클로로포름 추출 후 에탄올 침전시켜 엑소뉴클레아제 III로 절단한다. 샘플을 상이한 시간 간격으로 취하고, NaCl 및 ECTA를 첨가하고 70℃에서 10분 동안 항온처리하여 엑소뉴클레아제 III를 불활성화시킨다. 돌출성 ssDNA 말단은 S1 뉴클레아제로 제거하고 점착성 말단은 T4 DNA 폴리머라제로 평활말단으로 만든다. 자가결합 및 이러한 결실 클론으로의 이.콜라이 JM103의 형질 전환 후, 단쇄 DNA를 헬퍼 파아지 R408로 감염시켜 수득한다. pGW820은 위치 1000의 PvuII 부위로부터 위치 4175의 ClaI 부위까지 서열화한다(제1도 참조). pGW830의 경우 2774 bp XhoI 단편을 서열화한다(제2도 참조). pGW850은 위치 0의 EcoRI 부위부터 위치 3168까지 서열화한다(제3도 참조).

이러한 유전자에 대한 서열화 방법을 제7도, 제8도 및 제9도에 나타내었다. 몇몇 올리고뉴클레오타이드를 어플라이드 바이오시스템(모델 380B) 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 캐루터스(Caruthers)(참조문헌 10)의 포스포아미다이트 방법으로 합성한다. 이것은 서열화 프라이머로서 사용되고 이의 위치는 제7도 및 제8도에 나타나있다.

pelA 유전자의 전체 서열은 제9도에 5＇→ 3＇ 방향으로 제공되어 있다. 3175bp 서열은 pGW820에서 위치 1000의 PvuII 부위의 첫 번째 뉴클레오타이드로 시작하여 pGW820에서 위치 4175의 ClaI 부위의 마지막 뉴클레오타이드에서 끝난다.

pelA 서열은 프로모터 영역의 1360개 뉴클레오타이드, 구조 유전자 부분의 1355개 잔기 및 터미네이터 영역의 360 뉴클로에타이드로 이루어져 있다.

PLA의 아미노산 서열(실시예 6.3 참조)앞에는 뉴클레오타이드 서열로부터 추정될 수 있는 20개 아미노산의 시그날 서열이 있다.

pelD 유전자의 시그날 서열과의 상동성은 별표한 것이다. 또한, 성숙 단백질의 처음 5개 잔기는 pelA 및 pelD에서 동일한 아미노산 서열을 가진다.

pelB 유전자의 전체 서열은 제10도에 5＇→ 3＇ 방향으로 나타내었다. 2774bp 서열은 pGW830의 Xhol 부위의 첫 번째 뉴클레오타이드로 시작하여 두 번째 Xhol 부위의 마지막 뉴클레오타이드에서 끝난다.

pelB 서열은 프로모터 영역의 1133개 뉴클레오타이드, 구조 유전자 부분의 1373개 잔기 및 터미네이터 영역의 268개 뉴클레오타이드로 이루어져 있다. pelB 유전자는 적어도 20개 아미노산의 시그날 서열을 암호화한다.

pelC 서열은 프로모터 영역의 1367개 뉴클레오타이드, 구조 부분의 1340개 잔기 및 터미테이터 영역의 416개 뉴클레오타이드를 함유한다. pelC 유전자는 18개 아미노산의 시그날 서열을 암호화한다.

pelA, pelB 및 pelD 유전자의 시그날서열과의 상동성은 각 위치에 별표로 나타내었다. X는 서열의 배열에 포함된다.

진균류의 엑손/인트론 스플라이싱 연접부에 대한 컨센서스 서열 및 인트론 내부 서열(Ballance, 참조문헌 11.)에 대한 조사로 pelA, B 및 C 유전자내 4개의 인트론의 존재를 추정할 수 있다. 이러한 pel 유전자의 암호화 영역내에서 인트론의 위치는 잠정적으로 5개의 인트론 위치가 있지만 각 유전자에서 상이한 인트론이 결핍되어 있다는 면에서 보존된다. 그러나, pelC 유전자의 경우는 단지 3개의 인트론만이 추정된다. 이러한 것들중 단지 하나만이 pelD 및 pelA에서의 인트론의 위치(인트론 5)에 상응하는 위치에서 발견된다. 이러한 인트론의 위치 및 이의 각각의 길이는 표6a에 요약되어 있다.

4개의 pel 유전자중에서 인트론 사이의 엑손의 길이는 이러한 경우에 동일하다. 제13도에, PLA, PLB, PLC, 및 PLD의 추정된 아미노산 서열의 배열이 나타나 있다. pelA, pelB 및 pelD 의 암호화 영역의 N-말단 부분에서, 뉴클레오타이드 서열 상동성을 기준으로 하여 약 80% 상동성이 관찰되고 아미노산 서열 상동성을 기준으로는 80%가 넘는다. pelC의 경우, 이러한 백분율은 훨씬 낮다. 성숙 단백질의 잔기 285(제13도에서 잔기 305에 상응)를 지나 pelA, pelB 및 pelD의 C-말단 부분에서는, 상동성 상당한 정도까지 상실되고 단지 C-말단에 근접해서만 회복된다.

스플라이싱 시그날 및 5＇- 및 3＇- 스플라이싱 부위의 컨센서스 서열(표6b)을 제외하고, 인트론에서 상동성은 발견되지 않는다.

단백질 PLA, PLB, PLC 및 PLD에 대한 유추된 아미노산 서열은 처음 두 단백질에 대해 총 359개 잔기, PLC에 대해 360개 및 PLD에 대해 354개 잔기를 가리킨다. N-글리코실화에 대해, 하나의 잠정적 글리코실화 부위가 4개의 모든 단백질에서 위치 109(성숙 단백질) (PLC의 경우 이것은 비-정력화 서열에서의 위치 105와 일치한다)에 존재한다. PLB에서 두 번째 잠정적 위치는 위치 232에 존재하지만, PLD에서는 두 개의 다른 잠정적 글리코실화 부위가 잔기 255 및 329에 존재한다.

[실시예 5]

[선별 마커로서 에이.니거 pyrA 유전자 및 동시 형질전환용 플라즈미드로서 다양한 에이. 니거 pel 유전자를 사용한 에이.니거의 동시형질전환]

[실시예 5.1]

[에이.니거를 형질전환시키기 위해 사용되는 플라즈미드의 증식 및 정제]

모든 플라즈미드를 이. 콜라이 균주 MH1에서 증식시키고 플라즈미드 DNA는 문헌[Maniatis et al., pp. 90-91, 참조문헌 5]에 설명된 것과 같은 500ml 밤샘 배양물로부터 회수한다. 1mg이하의 DNA를 함유하는 TE중의 2.5ml DNA 용액에 2.2g CsCl 및 1ml 에티디움 브로마이드(물중 10mg/ml)를 가한다. 용액을 급속 밀봉관에 넣고 채워 제조업자(Beckman)의 지시에 따라 밀봉한다. VTi 65.2 로터에서 20℃, 16시간 동안 45000rpm으로 원심분리한다. 자외선광하에 보이는 두 형광 밴드중, 플라즈미드 DNA를 함유하는 하단 밴드를 튜브의 측명에 구멍을 뚫어 분리한다. DNA 용액 (약 1ml)을 에티디움 브로마이드를 제거하기 위하여 수-포화 부탄올로 5회 추출한다. 그 다음, DNA를 에탄올로 침전시키고, TE에 재현탁시켜, 페놀/클로로포름 및 클로로포름으로 1회씩 추출하고 다시 침전시켜 -20℃에서 저장한다.

5kbp 에이.니거 DNA 단편상에 OMP-데카복실라제 유전자(pyrA)를 수반하는 플라즈미드 pGW613을 사용하여 형질전환체를 선별한다[참조: Goosen et al., 참조문헌 12]. 플라즈미드 pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 및 pGW880은 실시예 3.5에 설명되어 있고, 동시 형질전환용 플라즈미드로서 사용된다.

[실시예 5.2]

[원형질체 제조 및 우리딘 종속영양성 돌연변이체 에이.니거 균주 N593의 형질전환]

모균주 N400의 유도체인 에이.니거 균주 N593(cspA, pyrA)은, 효모에서와 같이[참조: Boeke et al., 참조문헌 13], 문헌[참조: Goosen et al., 참조문헌 12]에 설명된 것과 같이 우리딘 존재하에 독성 동족체 5-플루오로오르트산에 대한 양성 선별에 의해 수득되었다.

0.5% 효모 추출물, 0.2 카사미노-산, 10mM 우리딘(Janssen Chemica) 및 50mM 글루코즈가 첨가된 액체 최소배지에 ml당 에이. 니거 n593의 10⁶개 분생 포자를 접종하여 30℃에서 20시간 동안 뉴 브룬스위크 궤도 진탕기에서 배양한다. 균사체를 여과하고, 미라클로쓰에 통과시켜 회수하고 등삼투(STS) 최소 배치(STC) [조성: 1.33M 소비톨, 10mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM CaCl₂, 1.7m0sm으로 조절]로 세척한다. 약 1g의 균사체를 20ml STC에 재현탁시킨다. 250mg의 필터-멸균시킨 Novozym 234(Novo Industries, Denmark) 가하고 진탕기에서 30℃, 95rpm으로 혼합물을 배양함으로써 2기간내에 균사체로부터 원형질체가 방출된다. 원형질체는 유리솜 마개로 덮는 깔때기를 사용하여 여과시켜 잔여 균사체로부터 원심분리(10분, 2500rpm)하여 펠렛을 STC에 재현탁시켜 정제한다.

형질전환을 위해 5 x10⁶개 원형질체를 200㎕로 취하여 플라즈미드 pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 또는 pGW880중 하나의 플라스미드 10μg(20㎕ 용적 미만) 및 1μg pGW613과 함께 항온처리 한다. pGW840의 경우는 1:3의 비를 사용하여 6㎍의 pGW613를 취한다. 원형질체에 플라즈미드 DNA를 가한 후, 50㎕ PCT(10mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM CaCl₂, 25% PEG 6000)를 가하고 항온처리 혼합물을 빙상에서 20분 동안 유지시킨다.

다시 2ml PCT를 가하고 혼합물을 실온에서 추가로 5분 동안 항온처리 한다. 최종으로, 4ml STC를 가한 후 혼합한다. 이 최종 형질전환용액 1ml 분취량을 0.95M 슈크로즈(1.7m0sm으로 조절)로 안정화시킨 4ml 액화 등삼투성 MM 톱-아가와 혼합한다. 원형질체 혼합물을 즉시 동일한 등-삼투 최소배지를 함유하는 아가 플레이트상에 도말하고, 30℃에서 항온처리 한다. 적합한 대조 실험은 플라즈미드 DNA 없이 2.5mM 우리딘이 함유된 안정화시키지 않은 최소 배지상에서 유사하게 처리된 원형질체를 포함한다.

30℃에서 3일 항온처리 한 후, 잘 성장된 형질전환체는 포자를 형성한다(50내지 150개 형질전환체/μg pGW613). 그외에, 성장부진한 많은 형질전환체도 나타난다. 각각의 형질전환체의 포자를 취하여 50mM 를르코즈 최소 배지상에 따라 도포하여 추가의 형질전환 분석을 위해 포자를 증식시키는데 사용하는 단일 콜로니를 수득한다.

각 경우에 있어서 적어도 10개의 형질전환체를 액체 최소 배지에 배양하고, DNA를 추출하고 동시 형질전환용 플라즈미드 DNA의 존재에 대해 분석한다. 진균류의 DNA는 식물 RNA를 분리하는데 사용된 방법을 약간 변형시켜 분리한다[참조: Slater, 참고문헌 14]. 균사체를 염수로 세척하고 액체 질소로 동결시켜 0.5g을 미세분쇄기(Braun)를 사용하여 파괴한다. 균사체 분말은 새로 제조한 추출 완충액으로 추출한다. 추출 완충액은 하기와 같이 제조한다: 1ml 트리-이소프로필나프탈렌 설폰산(TNS) 20mg/ml를 1ml p-아미노살리실산(PAS) (120mg/ml) 및 0.5ml 5xRNB 완충액(5xRNB는 1ℓ에 121.1g Tris, 73.04g NaCl 및 95.1 EGTA (pH 8.5)를 함유한다)과 혼합한다. 1.5ml 페놀을 가한 후, 추출 완충액을 55℃에서 10분동안 평형시킨다. 가온한 완충액을 균사체 분말에 가하고 현탁액을 볼텍스 혼합기를 사용하여 1분 동안 완전히 혼합한다. 그 다음 1ml 클로로포름을 가하고 1분 동안 혼합한다.

원심분리(10분, 10000xg)하여 수성상을 분리하고 등용적의 페놀/클로로포름(1:1)로 1회 이상 및 이어서 클로로포름으로 2회 추출한다.

수성상은 RNA 및 DNA를 함유한다. DNA는 실온에서 2용적 에탄올로 침전시키고 원심분리(20분, 1000xg)하여 회수하고, 증류된 멸균수에 재용해시키고 다시 에탄올로 침전시켜 2회 세척한다. RNA는 최종 용액에 RN_aseA(20㎍/ml)를 가함으로써 제거한다. 그 결과 고분자량 DNA(100 내지 200kbp)가 약 300㎍ DNA/g 균사체의 수율로 수득되고 이것을 추가로 필수적으로 CsCl/ 에티디움 브로마이드 밀도 구배 원심분리하여 정제한다[참조: Maniatis et al., p. 93, 참조문헌 5].

염색체성 DNA 절단체(2㎍)는 pelA(pGW820) 및 (pGW850) 형질전환체에 대해 EcoRI, pelB(pGW830) 형질전환체는 HindIII, pelD 형질전환체는 EcoRI 또는 BglII와 함께 37℃에서 2시간 동안 항온처리하여 제조한다. 모든 경우에 있어서, 처음에 제한효소 20U를 사용한 후 다시 20U의 제한효소를 가하고 추가로 2시간 동안 항온처리 한다. 절단은 BRL에 의해 공급된 적합한 반응 완충액중에서 수행한다.

그 다음 DNA를 0.6% 아가로스 상에서 분획화하고 니트로셀룰로즈에 블로팅한 후 문헌[Maniatis et al., pp382-386, 참조문헌 5]에 설명된 것과 같이 필수적으로 이에 상응하는

표지된 프로브를 사용하여 하이브리드화시킨다.

하기의 동시 형질전환 빈도가 밝혀졌다: pGW820(pelA) 70%; pGW830(pelB) 70%; pGW840(pelD) 15%; pGWpelC) 60%.

pGW613 대 동시 형질전환용 플라즈미드 pGW820, pGW830, pGW850 및 pGW840(1:3)의 매쓰비는 관찰되는 대부분의 경우에서 동시형질전환용 플라즈미드의 염색체 통합을 다중복제되도록 유도한다.

[실시예 5.3]

[pelA 형질화된 에이.니거 균주 A15의 게놈 분석]

실시예 5.2에 설명된 많은 다중복제 형질전환체가 분석되었으며 pelA 형질전환체 A15의 분석을 상세히 설명한다.

에이.니거 균주 N593의 DNA 및 다중복제 형질전환체 pelA 균주 A15의 DNA를 분리하여 실시예 3.1에 설명된 것과 같이 서던 블롯의 하이브리드화로 분석한다. pelA 프로브로서 7.3kbp EcoRI 단편을 사용한다(참조 제3a도). 게놈 블롯에서 7.4kbp의 강한 밴드가 형질전환 균주 A15에서 발견되는데 이는 제 I형 및/또는 제 II형 통합에 기인한 것이다[참조: Hinnen et al., 참조문헌 14a]. 재배열체의 제 II형 통합이 일어나는 경계 단편인 몇몇 다양한 길이의 소밴드가 밝혀졌다.

에이.니거 pelA 형질전환체 A15 및 에이.니거 N593 자동 방사선 사진에서 7.4kbp EcoRI 밴드의 광학적 밀도는 울트로스캔 (Ultroscan) XL(LKB)을 사용하여 스캐닝한다. 그 값을 양균주에서 단일복사체로서 존재하는, 피루베이트 키나제 유전자와 하이브리드화하는 제 2 프로브를 사용하여 수득된 밀도를 스캐닝함으로써, N593과 형질전환체 A15 사이에 DNA 농도에 있어서 약간의 차이에 대해 보정한다. 이러한 데이터로부터 pelA 형질전환체 A15 사이의 약 19개의 온전한 복사체가 존재한다고 계산된다.

프로브로서 pGW830의 HindIII 삽입체(제3b도)를 사용한, 형질전환된 균주 A15의 서던 블롯 분석은 pelA 서열의 통합이 pelB 좌위에서는 일어나지 않는다는 것을 나타낸다. 유사하게는, 형질전환된 pelB 균주 B13, pelC 균주 C16 및 pelD 균주 D12의 이에 상응하는 적합한 프로브로의 분석은 약 15,50 및 10개의 복사체수를 제공한다.

[실시예 5.4]

[pelA 형질전환시킨 에이.니거 균주 A15 및 에이.니거 N400의 유도된 및 비-유도된 균사체의 노던 블롯 분석]

사과의 펙틴 1%(W/V) (Brown Ribbon, d.e. 72.8%, Obipektin AG, Bischofszell) 또는 50mM 글루코즈를 함유하는 최소 배지(250ml)에 형질전환체 A15의 포자 또는 야생형 균주 N400의 포자를10⁶개 포자/ml 포자밀도로 접종하고 30℃에서 30시간 배양한 후 회수한다. 배양배지(2ml)의 샘플도 모아 4℃에서 2ℓ의 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 대해 투석하고 -20℃에서 저장한다.

핵산은 실시예 5.2에서 설명된 것과 같이 균사체로부터 분리한다. RNA는 클로로포름 추출후 8M LiCl의 ⅓ 용적을 가함으로써 수성상으로부터 침전시킨다. 이 용액을 완전히 혼합하고 0℃에서 밤새 항온처리 한다. RNA는 MSE 수퍼-마이너(Super-Minor) 원심분리를 사용하여 원심분리시켜(300rpm, 30분) 모으고 냉(-20℃) 2M LiCl로 1회, 냉(-20℃) 96% 에탄올로 1회 세척한다. 최종적으로 RNA를 약 1mg/ml의 농도로 증류수에 용해시킨다. 실질적으로 DNA가 없는 제제는 균사체당 1내지 2mg RNA가 수득된다. 약 10㎍의 RNA를 문헌[참조: Maniatis et al., pp202-203, 참조문헌 5]에 따라, 분자량 마커로서 BRL로부터 구입한 RNA 래더(ladder) 또는 HindIII 절단한 람다 DNA를 사용하여 변성용 포름알데히드 1% 아가로즈 겔상에서 진행시킨다. 겔을 블로팅하고, 제조업자의 지시에 따라 Nytran(Schleicher and Schuell) 상에서 굽고 68℃에서 16시간동안 7.4kbp EcoRI pelA DNA프로브와 하이브리드시킨다. 하이브리드화 및 세척 방법은 실시예 3.2.에 따른 상동성 조건하의 DNA 하이브리드화에 대해 설명된 것과 같다.

에이.니거 두 균주는 약 1.6kbp 길이의 펙틴-유도성 mRNA를 생성한다. 두 자동방사선 사진의 흡광도에 대한 스캐닝은 A15 형질전환체와 야생형 균주사이의 강도에 있어서 15 내지 20배의 차이를 나타내는데, 이는 서던 블럿 분석으로부터 계산된 복사체수의 증가와 상관관계가 있다.

[실시예 5.5]

[형질전환시킨 에이.니거 균주 D12에 의한 펙틴 리아제 생성]

실시예 5.2에 따라 수득된 에이.니거 pelD 형질전환체 D12를 폴리갈락투로나제의 생성을 위하여 문헌[참조: Hermersdorfer et al., 참조문헌 27]에 설명된 방법과 유사하게 2단계의 배양방법으로 배양한다. 사탕무우 펄프(4%) 및 NH₄NO₃(1%) pH 4.5로 이루어진 예비 배양배지(PCM) ml당 10⁶개 포자로 조절하여 액체 배양물 상단에 균사체 층이 형성되게 한다. 30℃에서 5일 배양된 후 배지 30ml에 배양된 균사체를 염수로 세척하고 주요 배양배지(MCM) 50ml에 옮긴다. 이 배양물을 궤도진탕기에서 100rpm으로 30℃에서 배양한다. MCM의 조성물은 배지ℓ당 글루코즈(5%), 펙틴(d.e.72.8%;0.1%), NH₄NO₃(0.75%), KH₂PO₄(0.5%), FeSO₄.7H₂O(0.03%), MgSO₄.7H₂O(0.03%), CaCO₃(0.03%), NaNO₃(0.03)(pH 4.5)를 함유한다. 샘플을 상이한 시간 간격으로 24시간 동안 취하여 SDS 폴리하크릴아미드 전기영동에 의해 분석한다. pelD의 발현은 이미 배양 7시간 내에 최대화된다. 단백질은 참조로서 사용된 PLI와 동일하게 이동한다.

[실시예 5.6]

형질전환된 에이.니거 균주 A15 및 에이.니거 N400에 의한 펙틴 리아제 A 생성

투석시킨 배양믈 여과액(실시예 5.4.)을 동결건조시키고, 0.2ml 증류수에 재현탁시키고 표준방법[참조: Laemmli, 참조문헌 15]를 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(10% 겔) 한다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로즈[참조: Towbin et al., 참조문헌 16]에 옮긴다. 블롯을 실온에서 5시간 동안 0.35M NaCl이 함유된 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)중의 1% BSA 용액으로 포화시킨다. 그 다음, 150mM NaCl, 0.5% BSAm, 1% 트리톤 X100. 0.5% 데옥시콜레이트 및 0.1% SDS를 함유하는 동일 완충액 50ml 중에서 반 하우데호벤(van Houdehoven)(1975)에 따라 정제한 두 개의 펙틴 리아제에 대한 폴리클로날 항체(0.1%)와 함께 실온에서 16시간 동안 항온처리한다. 블럿을 PBS 200ml로 5회 세정한 후 50ml당 2차 항체로서 30㎕ 염소 항-래빗 IgG-HRP (Sigma 제조)와 함께 항온처리하고 다시 PBS로 5회 세척한다. 블롯은 최종적으로 기질로서 4-클로로-1-나프톨을 사용하여 염색한다. 기질 40mg을 96% 에탄올 0.5ml에 용해시키고 100ml의 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 30㎕의 30% 과산화수소와 합한 후 블롯에 가한다.

[실시예 5.7]

[펙틴-함유 고체 배지상의 할로-형성에 의한 pelA 형질전환된 균주의 선별]

pelA 형질전환된 균주의 분생포자를 멸균 페이퍼 필터(Schleicher and Schuell)상의 페트리접시 당 약 40개 콜로니의 포자 밀도로 접종하고, 탄소원으로서 사과의 펙틴(1%, d.e. 72.8% Obipektin) 및 0.01% 트리톤-X100을 함유하는 1% 아가-고형화 최소배지의 상단에 붓는다. 30℃에서 72시간동안 배양하여 각각의 콜로니(2 내지 4mm)를 얻는다. 페이퍼 필터를 다른 멸균 페트리접시에 옮기고 배지를 함유하는 접시를 증류수중의 루테늄 레드(0.1% w/v) 용액 5㎖ 이상으로 염색하고, 2시간 동안 항온처리한 후 증류수로 수회 세척하여 흡착되지 않은 염료를 제거하고, 실수적으로 리드 및 콜머[참조: Ried and Collmer, 참조문헌 17]에 의해 설명된 방법에 따라, 폴리갈락투로네이트에 대해 박테리아의 펙테이트 리아제 효소 활성을 특징 조사한다.

PLA 단백질을 과잉생성하는 형질전환체는 모균주 N400과 비교하여 각각의 콜로니 주위의 할로(halo)-직경의 증가에 의해 검출한다.

[실시예 6]

[에니. 니거 pelA 형질전환체 A15로부터의 펙틴 리아제 A(PLA)의 분리, 정제 및 특징화]

[실시예 6.1]

[펙틴 리아제 A를 제조하기 위한 배양 조건]

실시예 5에 설명된 에이.니거 pelA 형질전환체 A15를 28℃에서 3일동안 페트리 접시내의 완전 배지에서 배양하여 분생포자를 생성하게 한다. 이러한 플레이트로부터, 0.005% 트윈 80이 함유된 5ml 멸륜 염수에 포자를 현탁시켜 분생포자를 회수한다. 현탁액을 그리핀(Griffin) 진탕기상에서 20분 동안 심하게 교반시킨다. 사과 펙틴(Brown Ribbon, d.e. 72.8%; Obipekin AG, Bischofzell) 1%가 함유된 최소 배지(참고문헌 21)를 1ℓ 실리콘화 삼각플라스크중의 배지 250ml에 포자밀도 10⁶개 포자/ml로 접종한다. 균사체는 갤런캠프(Gallenkamp) 궤도 진탕기를 사용하여 30℃, 200rpm으로 40시간동안 배양시킨다. 배양후 균사체를 부흐너 깔때기를 사용하여 미라클로쓰상에서 여과함으로써 제거한다. 배양물 여액(참조문헌 21)은 증류수(참조문헌 21)로 희석하고, 여액의 pH(pH 3.7)를 1N NaOH로 pH 6.0까지로 맞춘 후 와트만 1 여과지를 사용하여 다시 여과한다.

[실시예 6.2]

[ PLA의 정체]

희석된 배양물 여액(4ℓ)을 미리 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 예비 평형시킨 DEAE-세파로즈 급속 유동 칼럼(Pharmacia, 10cmx2.6cm)에 적용시킨다. 칼럼을 280nm에서 흡광도가 0.D. 0.1미만이 될 때까지 동일 완충액으로 용출시킨다. 펙틴 리아제 활성은 20mM 인산나트륨 완충액(150ml)으로 구성된 선형구배를 적용시킴으로서 칼럼으로부터 용출시킨다.

반 하우덴호벤(참조문헌 18. p11)에 의해 설명된 방법에 따라 기질로서 브라운 리본(Brown Ribbon) 펙틴(d.e. 71.8%)을 사용하여 활성인 펙틴 리아제의 존재에 대해 분획을 분석한다. 활성은 염 구배물중 0.43M NaCl의 농도주위에서 나타난다. 활성인 분획을 모아 20mM 피페라진 HCl 완충액 pH 5.5 (샘플 크기: 45.5ml) 1ℓ에 대해 2회 투석한다.

다음 단계에서, 투석한 샘플을 동일 크기로 3분획으로 나누어 파마시아 FPLC 시스템과 함께 표준 파마시아 MONO Q 칼럼을 사용하여 독립적으로 3개의 음이온 교환 크로마토 그래피를 수행한다. 칼럼은 미리 20mM 피페라진-HCl 완충액 pH 5.5로 평형시킨다. 효소 샘플 적하후 칼럼은 다시 기저 흡광도에 달할때까지 1ml/분 유속으로 동일 완충액을 사용하여 용출시킨다. 그 다음 선형 염 구배를 적용시킨다. 칼럼에 적용시킨 용출 완충액 22ml 이내에서 0.6M NaCl의 최종농도에 이른다.

활성 분획(4.4ml)을 모아, 평형 완충액을 사용하여 25ml 까지 희석하고 동일한 크로마토그래피 방법을 반복한다.

활성 효소를 함유하는 두 분획(총 용적 3ml)을 25mM 피페라진 완충액 pH 5.0에 대해 투석하고 1ml 분취량씩, 동일 완충액으로 미리 평형시킨 MONO P 칼럼(Pharmacia)상에 주입한다. 주입 후 pH 구배는 폴리완충액 TM 74(4N HCl을 사용하여 pH 3.0에 고정시킨 증류수중의 것) 5% 용액을 사용하여 형성시킨다. 활성 효소(3.2ml)는 약 pH 3.2 정도에서 나타난다. 제제를 50mM 인산나트륨 완충액 pH 6.0에 대해 광범위하게 투석하여 -20℃에서 저장한다. 정제 결과는 표 7a에 요약하였고 에이.니거 균주 N400(표 7b)에 의해 생성된 펙틴 리아제에 대해 유사하게 정제한 것과 비교한다.

단백질 농도는 제조업자의 지시에 따라 BCA 단백질 분석 시약(Pierce)을 사용하여 측정한 것이다.

야생형 총 활성에 비해 pGW820으로 형질전환시킨 에이.니거 N592의 총 활성은 정제후 약 10배 증가되었고 특이적 활성은 약 3배 증가되었다.

[실시예 6.3]

[펙틴 리아제 A의 N-말단 부분의 아미노산 서열 결정]

실시예 6.2에 따라 정제한 펙틴 리아제(PLA) 50μg을 밀리포어 여과한 증류수 1ℓ에 대해 3회 투석하여 동결건조시킨다. 아미노산 서열은 어플라이드 바이오시스템 모델 470A 단백질 서열분석기로, 120A PTH 분석기와 온-라인 연결시켜, 헌카필러(Hunkapiller)(참조문헌 17)에 의해 설명된 방법에 따라 결정한다.

하기 N-말단 아미노산 서열이 효소에 대해 결정된 것이다:

VAL-GLY-VAL-SER-GLY-SER-ALA-GLU-GLY-PHE-ALA-GLU-?-VAL-THR-GLY-GLY-GLY-ASP-ALA.

상기의 결정된 아미노산은 pelA 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기준으로 한 것(실시예 4.2 참조)과 정확히 일치한다.

[실시예 6.4]

[펙틴 리아제 A의 특성]

에이.니거 균주 N 400 및 pelA 형질전환체 A15를 실시예 6.1에 설명된 것과 같이 배양하고 실시예 6.2의 방법에 따라 배양물 여액으로부터 효소를 정제한다. 수득된 두 효소 제제를 반 하우덴호벤(참조문헌 18)에 따라 정제한 펙틴 리아제 II와 비교한다.

10% 겔을 사용하여 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동한 결과 각 경우 2 내지 5㎍ 단백질을 적용시킨 3 경우 모두에서 동일한 분자량의 단일 밴드가 수득된다.

등전점 집적법(isoelectric focussing)을 표준 방법에 따라 수행한다[참조: Pharmacia의 지시 인쇄물, Isoelectric Focussing, (1982)]. FSBE-3000 장치 및 이에 상응하는 전원 ECPS 3000/150(Pharmacia)을 사용한다. 수득된 PLA는 등전점 집적법에 따르면 균일하며 반 하우덴호벤(참조문헌 18)에 따라 3.75로 보고된 PLII보다 낮은 등전점(0.2 pH 단위)을 가진다. N 400 배양물 여액으로부터 정제된 PLII는 등전점 집적법 결과 이질성이다. 주 밴드는 PLA 단백질 위치에 상응한다. 두개의 소밴드는 음극을 향하여 약간 이동되어 있다. 따라서 에이.니거 다중복제 형질전환체 A15에서는, N 400에서 나타나는 작은 효소 형태가 결핍되어 있다.

기질로서 95% 에스테르화된 사과 펙틴을 사용한 PLA 및 PLII의 역학적 매개변수의 직접 비교는 두 효소에 대한 동일한 Km 및 Vmax 값을 나타내는데, 후자의 경우는 반 하우덴호벤(참조 18)에 의해 확립된 것이다.

[실시예 7]

[에이.니거 pelD 형질전환체 D12로부터의 펙틴 리아제 D (PLD)의 분리, 정제 및 특징화]

[실시예 7.1]

[펙틴 리아제 D를 제조하기 위한 배양 조건]

실시예 5.2에 따라 수득된 에이.니거 pelD 형질전환체 D12는 우선 300ml 분취량으로 실시예 5.5에 따라 배양한다. 30℃에서 PCM중에 5일 배양한 후, 균사체 매트(mat)를 0.1M 염화나트륨이 함유된 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)에 옮긴다. 궤도 진탕기로 200rpm에서 2시간 동안 150ml중의 균사체를 진탕시켜 대부분의 펙틴리아제를 배지내로 방출시킨다.

[실시예 7.2]

[PLD의 정제]

여과에 의해 균사체를 제거한 후, 효소 용액을 0.2M 염화나트륨이 함유된 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 미리 평형시킨 DEAE-세파로즈 급속 유동 칼럼(25cmx1.25cm) (Pharmacia)에 적용시킨다. 칼럼을 280nm에서 흡광도가 0.1미만이 될 때까지 동일 완충액으로 용출시킨다. 펙틴 리아제 활성은 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0) (800ml 총 용적)중 선형 염화나트륨 구배(0.2 내지 0.7M)을 적용시켜 컬럼으로부터 용출시킨다. 실시예 5.6에서 설명한 바와 같이 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅[참조: Towbin et al., 참조문헌 16]에 의해 분획을 펙틴 리아제 D의 존재에 대해 선별한다. 펙틴 리아제 D가 함유된 분획을 모아, 0.15 염화나트륨이 함유된 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)에 대해 투석하고 FPLC 시스템과 함께 표준 파마시아 MONO Q 컬럼을 사용하여 음이온 교환 크로마토 그래피한다. 적하 후, 칼럼을 동일 완충액으로 세척하고 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 중에 50ml 선형 염화나트륨 구배를 적용시킨다. 활성 분획을 모아 1ml 분취량을, 0.2M 염화나트륨이 함유된 20mM 인산나트륨 (pH 6.0)으로 평형시킨, FPLC 시스템과 연결된 100ml 수퍼로즈-12 겔 투과 칼럼에 적용시킨다. GPC 컬럼으로부터 수득된 활성 효소 분획(각각 1ml)을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 분석하고 수득된 펙틴 리아제의 순도를 확인한다.

[실시예 7.3]

[펙틴 리아제 D의 N-말단 부분의 아미노산 서열 결정]

실시예 6.2에 따라 정제된 펙틴 리아제 D 500㎍을 1ℓ의 밀리포어 여과된 증류수에 대해 3회 투석하고 동결건조시킨다. 헌카필러(참조문헌 19)의 방법에 따라, 120A PTH 분석기와 온-라인 연결된 어플라이드 바이오시스템 모델 470A 단백질 서열분석기를 사용하여 아미노산 서열을 결정한다.

효소에 대해 하기 N-말단 아미노산이 결정된다 :

결정된 아미노산 서열은 pelD 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기준으로 한 것과 정확히 일치한다.

[실시예 8]

[에이.니거 형질전환체 B13으로부터의 펙틴 리아제 B (PLB)의 분리, 정제 및 특징화]

[실시예 8.1]

[펙틴 리아제 B를 제조하기 위한 배양조건]

실시예 5.2에 따라 수득한 에이.니거 pelB 형질전환체 B13을 실시예 5.3에 따라 이의 다중복제 특징에 대해 분석한다. 실시예 5.4의 방법에 따른 노던(Northern) 블롯 분석은 약 1.6kb 길이의 펙틴-유도성 mRNA가 생성되는 것을 나타낸다. 1%(w/v) 밀감 펙틴(d.e. 72.8%) 및 1% 밀기울이 함유된 최소 배지에서 30℃, 35시간 동안 배양하여 실시예 5.4에 설명된 것과 같이 효소를 생성시킨다. 효소는 또한 사탕무우 펄프 4%(w/v) 및 NH₄HO₃1%로 이루어진 배지를 사용하여도 생성된다.

[실시예 8.2]

[PLB의 정제]

배양물 여액을 증류수로 2배 희석하고 pH를 1N NaOH로 pH 6.0까지 조절한 후 와트만 1 여과지를 사용하여 다시 여과한다. 희석된 여액(2ℓ)을, 50mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.0)으로 미리 평형시킨 DEAE-세파로즈 급속 유동(Pharmacia) 칼럼(9cmx3.2cm)에 적용시킨다. 브라운 리본 펙틴 (d.e. 72.8%) 또는 고도로 에스테르화된 펙틴(d.e. 94%)을 사용하여 반 하우덴호벤(참조문헌 18., p 11)의 방법에 의해 분석할 수 있는 바와 같이, 펙틴 리아제 활성의 일부가 용출물중에 존재한다. 펙타 리아제 활성 대부준을 염 구배를 적용시켜 용출시킬 수 있다. 이 활성은 염구배에서 나타나며 용출 양상 및 실시예 6에 설명된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동상의 외견상 분자량을 기준으로 하여 PLA와 동일하다는 것이 밝혀졌다.

DEAE 급속유동 칼럼의 용출물을 증류수에 대해 투석하고, 미리 20mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 평형시킨 MONO S 칼럼(Pharmacia)에 적용시키다. 동일 완충액중 0 내지 1.0M 염화나트륨 염 구배를 적용시켜 컬럼으로부터 효소를 용출시킨다. 효소는 컬럼으로부터 거의 즉시 용출된다. 활성 분획을 모아 증류수로 약 4배 희석한다. 효소용액의 재크로마토그래피 결과, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 기준으로 하여, 순수한 PLB 단백질을 함유하는 분획이 수득된다.

[실시예 8.3]

[펙틴 리아제 B의 특성]

실시예 8.2에 따라 pelB 형질전환체 B13으로부터 정제된 효소의 특성을 조사하여 펙틴 리아제 A 및 D와 비교한다.

10% 겔을 사용한 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과 39.7kDa의 외견상 분자량을 갖는 단일 밴드가 수득된다. 동일 조건하에 PLA 및 PLD의 외견상 분자량은 각각 49.1kDa 및 52.3kDa이다.

등전점 집적법은 실시예 6.4에 설명된 것과 같이 수행한다. pH 3과 7사이의 pH 구배를 사용한 PLB의 등전점은 6.0이다. 샘플은 pH 5.0에 상응하는 위치에 대략 적용된다.

정제된 효소 PLB는 또한 웨스턴 블럿 분석에 의해 시험된 것과 같이 PLI 및 PLII에 대해 제조된 폴리클로날 항체와 반응한다. PLD, A 및 B는 이의 외견상 분자량 값에 의해 쉽게 구별될 수 있다.

[실시예 8.4]

[PLB의 역학적 특성]

실시예 8.2에 따라 정제한 효소를 역학적으로 특징화한다. 효소는 펙틴 리아제 반응을 촉매하여, 상이한 pH 값의 Mc 일베인(Ilvaine) 완충액(μ=0.5)중에서 시험되는 넓은 pH 범위(pH 5 내지 9.5)에 걸쳐 활성이 있다(van Houdenhoven, 참조문헌 18). 최적 pH는 넓다(pH 7.5-8.5). pH 6.0에서, 활성은 약 55%이고; pH 9.5에서는 pH 8.0에서의 85% 활성을 그대로 유지한다. 에스테르화 정도가 낮은 브라운 리본 사과 펙틴 (d.e. 72.8%, Obipektin AG Bischoffzell)과 같은 펙틴 뿐만 아니라 고도로 에스테르화된 펙틴(d.e. 94%)도 기질로서 사용할 수 있다. 그러나, 가장 높은 활성은 고도로 에스테르화된 펙틴을 사용하여 얻을 수 있다. 효소는 폴리갈락투로네이트와는 반응하지 않는다.

PLB에 의해 촉매된 펙틴 리아제 반응은 반응 혼합물(최종 농도 3mM이 사용됨)에 EDTA를 가하여 억제시킬 수 있고; 효소는 과량의 Ca²⁺- 이온을 가하여 재활성화시킨다. 따라서, pelB는 Ca²⁺- 의존적인 펙틴 리아제를 암호화한다. 25℃에서 기질로서 고도로 에스테르화된 펙틴을 사용하는 경우 효소는 약 6500의 전환수(turn-over number)를 가지며 Km값이 2.5mM 이다. 이러한 값은 반 하우덴호벤(참조문헌 18)의 방법에 따라 pH 8.0의 Mc 일베인 완충액(μ=0.5)을 사용하여 측정한다.

[실시예 9]

[pelA 프로모터 조절하에 외래 유전자의 발현 및 분비]

플라즈미드 pGW820의 3.9kb HindIII 단편을 pBR322의 HindIII 부위에 서브클론시킨다. 암피실린-내성 형질전환체의 플라즈미드 DNA는 HindIII 및 SaII 제한 절단하여 분석한다. pelA 삽입체를 시계방향으로 함유하는 클론 하나를 pGW822라 언급한다. 에이.니거에서 외래 유전자를 발현시키기 위해 pelA의 유도성 프로모터를 사용한다. 완전한 pelA 유전자가 플라즈미드 pGW822상에 존재하게 된다. 프로모터 및 pelA 시그날 서열은 1kb BamHI-PstI 단편상에 있다. 뉴클레오타이드 위치 1420에 있는 PstI 절단부위(제10도)는 시그날 서열의 3' 말단과 부합되며 외래 단백질의 암호화 서열에 프레임내 융합을 위해 사용할 수 있다. pelA의 전사 종결 시그날은 13kb SalI-HindIII 단편상에 있다.

[실시예 9.1]

[벡터 pUC19에 pelA 유전자의 서브클로닝]

플라즈미드 pGW822의 3.3kb BamHIII 단편은 pelA 유전자를 함유한다. 단편은 BamHI alc HindIII로 절단한 벡터 pUC19 (Pharmacia)에 클로닝시킨다. 단편을 정제하여 결합시킨다. 결합 혼합물 분취량을 Ca²⁺처리된 컴피턴트 JM 109 세포를 형질전환시키는데 사용한다. pUC19에 3.3kb BamHI-HindIII 단편이 성공적으로 클로닝된 것은 X-gal 및 IPTG의 존재하에 암피실린 플레이트상에서 선별한다[참조: T. Maniatis et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, (1982) p. 52]. 백색의 암피실린-내성 형질전환체를 선택한다. 이러한 콜로니의 플라즈미드 DNA를 BamHI/HindIII 이중 절단하여 분석한다. 정확한 삽입체를 함유하는 형질전환체 하나를 pUC19/pelA로 언급한다. pUC18를 이용하여 유사하게 작제한 결과 pUC18/pelA를 수득한다.

[실시예 9.2]

[pelA 프로모터 조절하에 사람의 하이브리드 인터페론 BDBB의 발현]

[실시예 9.2.1]

[플라즈미드 pUC19/pelA-IFN AM199의 작제 (제14도 참조)]

플라즈미드 pUC19/pelA를 SalI으로 절단한다. 선형 단편의 점착 말단을 dCTP, dGTP, dATP, dTTP 각각 0.1mM, 60mM Tris·HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂의 존재하에 클레나우 DNA 폴리머라제 I(BRL)의 반응으로 실온에서 30분동안 메꾼다. 이 반응은 EDTA를 최종농도 12.5mM까지 가하여 중지시킨다. DNA를 에탄올 침전시킨다. 선형 DNA 단편은 PstI으로 절단한다. 페놀/클로로포름 추출 후 DNA를 에탄올로 침전시킨다.

하기 서열식의 올리고데스옥시뉴클레오타이드 링커를 선형 플라즈미드의 PstI 부위에 결합시킨다.

링커는, pelA 시그날 서열의 말단과 일치하며 인터페론 BDBB의 암호화 서열에의 프레임내 융합을 일으키는 PstI 부위의 3' 목한 말단을 메꾼다. 서열식(I)은 DdeI 제한부위까지의 인터페론 BDBB 유전자의 5' 말단 뉴클레오타이드 서열이다.

올리고뉴클레오타이드(I) 및 (II) 각각 200pmoles을 인산화하여 어닐링시킨다. PstI 절단 pUC19/pelA 플라즈미드 및 100배 몰과량의 이본쇄 링커 DNA를 60mM Tris·HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 5mM DTT 및 400 유니트의 T4 DNA 리가제 중에서 15℃, 16시간동안 결합시킨다. DNA 리가제는 85℃에서 10분동안 불활성화시킨다. 과량의 링커는 10mM EDTA, 300mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0) 및 0.54 용적의 이소프로판올의 존재하에 침전시켜 제거한다.

큰 5kb 단편이 예비 0.6% 아가로즈 겔상에서 분리된다. 이 단편은 pUC19 벡터내에 pelA 프로모터 및 시그날 서열(BamHI- [PstI]/링커) 및 pelA 터미네이터 ([SalI]평활-HindIII)를 함유한다.

플라즈미드 pJDB207/PH05-IFN AM 119(EP 205404)는 효모의 산 포스파타제(PH05)의 조절된 프로모터 제어하의 하이브리드 α-인터페론 BDBB에 대한 유전자를 함유한다. 플라즈미드 DNA를 BamHI 및 HindIII로 절단하여, 1.3kb BamHI- HindIII 단편을 분리하는데, 이 단편은 PH05 프로모터, IFN BDBB 암호화 서열 및 PH05 전사종결 서열을 함유한다. 이 단편은 DE52 크로마토그래피 및 에탄올 침전으로 정제하고 다시 TaqI으로 절단한다. TaqI 제한단편의 점착말단을, dCTP 및 dGTP 각각 0.1mM, 60mM Tris·HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂의 존재하에 실온에서 30분 동안 클레나우 DNA 폴리머라제 I(BRL) 반응으로 메꾼다. 반응은 EDTA를 최종 농도 12.5mM까지 가하여 중지시킨다. DNA 단편을 에탄올로 침전시켜 DdeI으로 절단한다. DNA 단편을 예비 0.8% 아가로즈 겔상에서 분리한다. 549bp DdeI-[TaqI]평활 단편을 겔로부터 전기용출시켜, DE52이온 교환 크로마토그래피 및 에탄올 침전에 의해 정제한다. DNA 단편을 약 0.1pmole/㎕ 농도로 물에 재현탁시킨다.

0.2pmole의 549bp DdeI-[TaqI] 평활단편 및 0.1pmole의 5kb 벡터 단편을 60mM Tris.HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 3.5mM ATP, 5mM DTT 및 200단위의 T4 DNA 리가제(Biolabs) 10㎕ 중에서 15℃, 16시간동안 결합시킨다. 결합혼합물 1㎕ 분취량을, Ca²⁺처리된 컴피턴트 HB101 세포를 형질전환시키는데 사용한다.

플라즈미드 DNA를 12개 암피실린-내성 형질전환 콜로니부터 제조하여 EcoRI, PvuII, ClaI 및 EcoRI/HindIII 절단에 의해 분석한다. 예상된 제한 패턴을 갖는 클론을 선택한다. pelA 시그날 서열 및 인터페론 BDBB의 완전한 암호화 서열의 올바른 프레임내 융합이 DNA 서열 분석에 의해 검증된다. 선택된 클론의 플라즈미드 DNA는 pUC19/pelA-IFN AM119로 언급한다.

pUC18/pelA로 유사하게 작제하여 플라즈미드 pUC18/pel-IFN AM119를 수득한다.

[실시예 9.2.2]

[pCG59D7 및 pUC19/pelA-IFN AM199로 아스퍼질러스 니거 변이체 An8의 동시형 질전환]

우리딘 종속영양성 변이체 An8(= DSM 3917, EP 88 101. 397.3에 기재되어 있음)을 플라즈미드 pCG 59D7로 형질전환시켜 우리딘 자가 영양체를 수득한다. 형질전환용 플라즈미드와 함께 비-선별성 플라즈미드 pUC19/pelA-IFN AM119를 가하여 동시 형질전환에 따른 임의의 동시통합체를 수득한다.

에이.니거 An8의 분생 포자를 포자형성 될 때까지 완전 배지에서 28℃, 4일 동안 충분히 배양한다. 2 x 10⁸개의 분생 포자를 1g/l 아르기닌 및 우리딘이 첨가된 200ml 최소배지를 접종하는데 사용한다.

28℃에서 180rpm으로 20시간 배양한 후, 미라클로쓰에 여과시켜 균사체를 회수하고, 10ml 0.8M KCl, 50ml CaCl₂로 2회 세척하고 0.8M KCl, 50ml CaCl₂, 0.5mg/ml Novozym 234(Novo Industries) 20ml에 재현탁시킨다. 혼합물을 최대 원형질체 분비가 현미경적으로 검출될 수 있을 때까지(90 내지 120분) 진탕수욕(30℃, 50rpm)에서 배양한다. 원형질체 현탁액을 깔때기내의 유리솜 플러그에 여과시켜 균사체 파편을 제거한다. 원형질체를 실온에서 온화하게 원심분리(10분, 2000rpm)시키고 10ml 0.8M KCl, 50mM CaCl₂로 2회 세척한다. 원형질체를 최종적으로 200 내지 500㎕의 0.8M KCl, 50mM CaCl₂에 재현탁시켜 1 x 10⁸개/ml 농도를 수득한다.

형질전환을 위해 원형질체 분산액 200㎕ 분취량을 5㎍의 pCG59D7 및 10㎍ pUC19/pelA-IFN AM119 DNA, 50㎕ PCT(10mM Tris.HCl, pH 7.5, 50mM CaCl₂, 25% PEG 6000)와 함께 배양한다. 배양 혼합물을 빙상에서 20분동안 유지시키고 다시 2ml PCT를 가한후 추가로 5분동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 4ml 0.8M KCl, 50mM CaCl₂를 가하고 최종 형질전환 용액 1ml 분취량을 목질화한 최소 아가 배지(최소배지+1g/l 아르기닌+10g/l 박토-아가(Difco)와 혼합하고, 0.8M KCl로 안정화시킨다. 혼합물을 즉시 동일배지의 아가 플레이트상에 붓고 28℃에서 배양한다.

28℃에서 2 내지 3일 배양한 후, 안정한 형질전환체는 수백개의 작은 발육부진 형질전환체의 기저 배양상에 왕성하게 성장하는 포자형성 콜로니로서 나타난다.

[실시예 9.2.3]

[pelA 프로모터의 조절하 하이브리드-인터페론 BDBB 유전자의 발현]

동시 형질전환 실험(실시예 9.2.2)의 37개 형질전환체를 뽑아서 인터페론 발현에 대해 분석한다. 인터페론 활성은 암스트롱[참조: J.A. Armstrong, Appl. Microbiol. 21, 732 (1971)]의 방법에 따라, 사람의 CCL-23 세포 및 공격 바이러스로서 VSV(vesicular stomatitis virus)를 사용하여 측정한다.

형질전환체로부터의 분생 포자를 각각 50ml의 예비 배양 배지[Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) 3g/l, NH₄Cl 2g/l, KH₂PO₄0.5g/l, NaCl 0.5g/l, Mg₂SO₄x 7H₂O 0.5g/l, Ca₂SO₄x 2H₂O 0.5g/l, pH 7.0]에 예비배양한다. 이 배양액을 250rpm으로 28℃에서 72시간동안 배양한다. 10% 예비 배양액을 50ml의 주배양배지(Soybean fluor 20g/l, 펙틴 슬로우 세트 5g/l)에 접종한다. 배양물을 250rpm으로 28℃에서 72내지 96시간동안 배양한다.

다양한 시간에서(매 20시간) 샘플을 취하고, 세포를 원심분리시켜 펠렛화시키고 초음파 파쇄시킨다. 상등액 및 세포 추출물을 상기 설명한 것과 같이 인터페론 활성에 대해 시험한다. 대부분의 인터페론 활성물이 배지에 분비된다.

[실시예 10]

[플라즈미드 M13(+)KS/pelAΔSS-IFN AM119의 작제]

플라즈미드 M13(+)KS/pelAΔSS-IFN AM119의 2.8kb 발현 카세트는 Bluescript M13(+)KS 벡터상에 유도성에 pelA 프로모터, 하이브리드 인터페론 BDBB의 암호화 서열 및 pelA 전사 터미네이터를 함유한다. 하이브리드 인터페론 BDBB가 발현되어 숙주 세포내에 위치할 것이다. 플라즈미드 M13(+)KS/pelAΔSS-IFN AM119는 pUC18/pelA-IFN AM119(실시예 9.2.1 참조)로부터 유도된 것이다. pelA 시그날 서열(ss)은 부위-지시 변이화에 의해 고리모양으로 제거된다(제15도 참조). 시그날 서열이 없는 작제물로부터 발현된 하이브리드 인터페론은 세포질에 위치하는 것으로 생각된다.

[실시예 10.1]

[Bluescript M13(+)KS 벡터에 pelA-IFN AM119 카세트의 서브클로닝]

플라즈미드 pUC18/pelA-IFN AM119 (실시예 9.2.1 참조)를 BamHI 및 HindIII로 절단한다. 2.8kb BamHI-HindIII 단편은 pelA 프로모터, 시그날 서열, IFN BDBB 암호화 서열 및 pelA 터미테이터를 함유한다. BamHI-HindIII 단편을 분리하여, BamHI 및 HindIII로 절단한 Bluescript M13(+)KS (Strategene) 벡터에 결합시킨다. 결합혼합물 분취량을 Ca²⁺- 처리된 컴피턴트 JM 109 세포를 형질전환시키는데 사용한다. M13(+)KS에 2.8kb BamHI-HindIII 단편의 성공적인 클로닝을 X-gal 및 IPTG의 존재하에 암피실린 플레이트상에서 선별한다. 12개의 백색, 암피실린 내성 콜로니를 뽑는다. 이러한 콜로니의 플라즈미드 DNA를 BamHI/BglII 이중절단하여 분석한다. 정확한 삽입체를 함유하는 형질전환체 하나를 M13(+)KS/pelA-IFN AM119로 명명한다.

[실시예 10.2]

[Bluescript M13(+)KS 플라즈미드를 함유하는 세포로부터 단쇄 DNA의 회수]

플라즈미드 M13(+)KS/pelA-IFN AM119를 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 균주 CJ236(dut-1, ung-1, thi-1, relA-1; pCJ 105 (Cm^γc); BIO-RAD Muta-Gene M13 시험관내 돌연변이와 키트)을 형질전환시킨다. 이 균주는 DNA에 우라실을 혼입시킬 수 있다. CJ236을 100mg/l 암피실린이 함유된 LB 배지 10ml에서 배양한다. CD₆₀₀0.5 에서, 세포를 파아지 M13K07[참조: Mead et al., 참조문헌 29]로 50의 다중감염도로 초감염시킨다. 37℃에서 1시간후에 카나마이신 (50mg/l)을 가하고 배양물을 37℃에서 진탕기상에 5 내지 6시간동안 배양한다. 플라즈미드 M13(+)KS/pelA-IFN AM119의 pelA-IFN AM119 삽입체에 대해 비-암호화 쇄를 합성하고, 팩캐이징시켜 배지로 방출한다. 단쇄 DNA를 쿤겔(Kunkel) 등의 문헌(참조30)에 따라 배양 상등액으로부터 제조한다.

[실시예 10.3]

[단쇄 DNA 주형상의 부위-지시된 올리고뉴클레오타이드 돌연변이화]

부위-지시적 결실 돌연변이화를 pelA 시그날 서열을 고리화하여 제거하기 위해(제15도) 비-암호화 단쇄 pelA-IFN AM119 주형상에서 수행한다.

돌연변이유발 프라이머는 ATG(제10도에서 뉴클레오타이드 위치 1343 내지 1363) 및 성숙 IFN BDBB의 아미노산 1에서 7을 암호화하는 21개 뉴클레오타이드를 포함한 pelA 프로모터 서열의 부분으로 이루어진다.

돌연변이화를 위해, 200pmole의 돌연변이유발 프라이머를 20㎕의 50mM Tris·HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 5mM DTT 및 0.5mM ATP중에서 8단위의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer)를 사용하여 인산화한다. 37℃에서 1시간 후, 65℃에서 10분동안 가열하여 반응을 중지시킨다.

0.2pmole의 단쇄 주형을 30㎕의 20mM Tris. HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂50mM NaCl, 1mM DTT중의 10pmole의 인산화된 돌연변이유발 올리고데옥시리보튜클레오타이드 프라이머 및 10pmole 통상적인 M13 서열화 프라이머와 함께 80℃에서 5분동안 항온처리한다. 용액을 30분에 걸쳐 실온까지 서서히 냉각시킨다. 어닐된 혼합물에 1㎕ 완충액[0.2M Tris.HCl pH 7.5, 0.1M MgCl₂], 5㎕ 2mM dnTP 혼합물, 0.5㎕, 20mM ATP, 1㎕ 0.2M DTT, 0.5㎕ T4 DNA 리가제(Biolabs, 400U/㎕) 및 1.2㎕ 클레나우 DNA 폴리머라제(BRL, 5U/㎕)를 함유하는, 10㎕의 효소-dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 용액을 가한다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 항온처리한다. 65℃에서 10분동안 항온처리하여 반응을 중지시킨다.

결합 혼합물 1㎕ 및 3㎕를 사용하여, 보수-상실(repair-minus) 균주 이.콜라이

의 컴피턴트 세포 0.2ml를 형질전환시킨다. 균주 MV 1190은 BIO-RAD MUTA-GENE M13 시험관내 돌연변이화 키트에 대한 설명서에 설명되어 있다. 12개의 암피실린 내성 콜로니를 뽑는다. 플라즈미드 DNA를 제조하여 ScaI 절단하여 분석한다. pelA 시그날 서열의 성공적인 고리화 제거로 ScaI 부위가 제거된다. 정확한 플라즈미드는 Bluescript 벡터내의 ScaI 부위에서 선형화된다. 플라즈미드 하나를 추가로 분석한다. pelA 프로모터와 ATG가 포함된 하이브리드 IFN BDBB의 암호화 서열사이의 정확한 연접은 함께 DNA 서열분석에 의해 확인된다. 올바른 작제물 하나를

명명한다.

[실시예 10.4]

[에이.니거의 동시형질전환 및 하이브리드 인터페론의 발현]

플라즈미드 M13(+)KS/pelAΔSS-IFN AM119 및 pCG59D7을 실시예 8.2.2에 따라 에이.니거 변이체 An8을 동시형질전환시키는데 사용한다. 형질전환체를 실시예 8.2.3에 설명한 것과 같이 배양한다. 다양한 시간에 (매 20시간) 샘플을 취하여, 세포를 원심분리시켜 펠렛화시키고 초음파 파쇄시킨다. 세포 추출물을 인터페론 활성에 대해 시험한다(상기 참조). 대부분의 인터페론 활성물이 세포내에서 발견된다.

[미생물의 기탁]

하기 미생물들은 부다페스트 조약하에 기탁기관 [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig]에 기탁되었다.

[미생물 기탁번호 기탁일]

에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW820 DSM 4388 1988년 2월 1일

에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW830 DSM 4389 1988년 2월 1일

에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW850 DSM 4390 1988년 2월 1일

에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW860 DSM 4391 1988년 2월 1일

에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW880 DSM 4392 1988년 2월 1일

[참조 문헌]

Claims (36)

1. 제10도에 따른 핵산 서열을 갖는 펙틴 리아제 pelA, 제11도에 따른 핵산 서열을 갖는 펙틴 리아제 pelB, 제12도에 따른 핵산 서열을 갖는 펙틴 리아제 pelC를 암호화 하거나, 제5도에 나타낸 pGW880(DSM4392)에 포함된 pelE를 암호화하는 DNA 분자 또는 제6도에 나타낸 pGW860 (DSM4391)에 포함된 pelF를 암호화하는 DNA 분자를 에쉐리키아 콜라이, 사카로마이세스 세레비지에 또는 아스퍼질러스 숙주에 도입시키고 이를 증폭시킨 후 재조합 DNA 분자를 정제하여 수득되는 펙틴 리아제 pelE 또는 pelF를 암호화하는, DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
2. 제1항에 있어서, 펙틴 리아제 유전자의 구조 유전자 앞의 DNA 영역에 위치되는 2000개 이하의 뉴클레오타이드의 프로모터; 프로모터 말단과 성숙 단백질을 암호화 하는 서열의 개시점 사이의 DNA 영역에 위치하는 시그날 서열; 구조 유전자; 또는 정지 코돈으로 시작하는 터미테이터 또는 이러한 단편들의 조합체를 포함하는 재조합 DNA 분자.
3. 제1항에 있어서, pGW820(DSM4388)인 재조합 DNA 분자.
4. 제1항에 있어서, pGW830(DSM4389)인 재조합 DNA 분자.
5. 제1항에 있어서, pGW850(DSM4390)인 재조합 DNA 분자.
6. 제1항에 있어서, 플라즈미드 pGW820(DSM4388), pGW830(DSM4389), pGW850(DSM4390), pGW880(DSM4392) 또는 pGW860(DSM4391)의 두 제한 부위 사이에 걸쳐 있고 프로모터, 시그날, 구조 또는 터미네이터 작용 서열 또는 이러한 단편의 조합체를 보유하는 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자.
7. 제1항에 있어서, pelA의 프로모터 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
8. 제1항에 있어서, pelA, pelB, pelC, pelE 또는 pelF의 프로모터 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
9. 제1항에 있어서, pelA, pelB, pelC, pelE 또는 pelF의 시그날 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
10. 제1항에 있어서, pelA, pelB, pelC, pelE 또는 pelF의 PLI 구조 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자.
11. 제1항에 있어서, pelA, pelB, pelC, pelE 또는 pelF의 인트론 없는 구조 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자.
12. 제1항에 있어서, pelA, pelB, pelC, pelE 또는 pelF의 터미네이터를 포함하는 재조합 DNA 분자.
13. 제1항에 있어서, 아스퍼질러스 니거와 이질성인 구조 유전자를 포함하는 재조합 하이브리드 벡터인 재조합 DNA 분자.
14. 제1항에 있어서, 하이브리드 인터페론 BDBB를 암호화하는 이질성 구조 유전자를 포함하는 재조합 하이브리드 벡터인 재조합 DNA 분자.
15. 제1항에 있어서, 하이브리드 벡터 pUC19/pelA-IFN AM119인 재조합 DNA 분자.
16. 제1항에 있어서, 하이브리드 벡터 M13(+)KS/pelAΔss-IFN AM119인 재조합 DNA 분자.
17. 제1항에 있어서, 하이브리드 벡터 M13(+)KS/pelA-IFN AM119인 재조합 DNA 분자.
18. 펙틴 리아제 PLA, PLB, PLC, PLE 또는 PLF 발현 시스템을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자로 형질전환시킨 에쉐리키아 콜라이, 사카로마이세스 세레비지에 또는 아스퍼질러스 숙주를 배양하고, 목적하는 재조합 DNA 분자를 분리하거나, 이를 시험관내 합성에 의해 제조하는 것을 특징으로 하여, 제1항에 따른 재조합 DNA 분자를 제조하는 방법.
19. 제1항에 따른 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환된 에쉐리키아 콜라이, 아스퍼질러스, 페니실륨 또는 세팔로스포륨 숙주.
20. 제19항에 있어서, 에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW820(DSM4388)인 형질전환된 숙주.
21. 제19항에 있어서, 에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW830(DSM4389)인 형질전환된 숙주.
22. 제19항에 있어서, 에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW850(DSM4390)인 형질전환된 숙주.
23. 제19항에 있어서, 에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW860(DSM4391)인 형질전환된 숙주.
24. 제19항에 있어서, 에쉐리키아 콜라이 HB101/pGW880(DSM4392)인 형질전환된 숙주.
25. 제19항에 있어서, 제1항에 따른 재조합 DNA 분자 및 선별 마커 플라즈미드 pCG59D7로 형질전환시킨 아스퍼질러스 니거 An8(DSM 3917)인 형질전환된 숙주.
26. 제20항에 있어서, pUC19/pelA-IFN AM119 및 선별 마커 플라즈미드 pCG59D7로 형질전환시킨 아스퍼질러스 니거 An8(DSM 3917)인 형질전환된 숙주.
27. 제20항에 있어서, M13(+)KS/pelAΔss-IFN AM119 및 선별 마커 플라즈미드 pCG59D7로 형질전환시킨 아스퍼질러스 니거 An8(DSM 3917)인 형질전환된 숙주.
28. 제20항에 있어서, M13(+)KS/pelA-IFN AM119 및 선별 마커 플라즈미드 pCG59D7로 형질전환시킨 아스퍼질러스 니거 An8(DSM 3917)인 형질전환된 숙주.
29. 에쉐리키아 콜라이, 아스퍼질러스, 페니실륨 또는 세팔로스포륨 숙주를 형질전환 조건하에서 선별 마커 유전자와 함께 또는 선별 마커 유전자 없이 제1항에 따른 재조합 DNA 분자로 처리하고 형질전환체를 선별함을 특징으로 하여, 제24항에 따른 형질전환된 에쉐리키아 콜라이, 아스퍼질러스, 페니실륨 또는 세팔로스포륨 숙주를 제조하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 아스퍼질러스 니거 An8을 제1항에 따른 재조합 DNA 분자 및 선별 마커 플라즈미드 pCG59D7로 동시 형질전환시키는 방법.
31. 제16항에 따른 하이브리드 벡터를 아스퍼질러스 숙주에서 발현시킴을 특징으로 하는 폴리펩타이드 제조 방법.
32. 제31항에 있어서, 펙틴 리아제 PLA, PLB, PLC, PLE 또는 PLF의 발현 및 분비를 위한 발현 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 아스퍼질러스 숙주를 배양함을 특징으로 하여, 아스퍼질러스 종에서 상기 펙틴 리아제들을 과생산하는 방법.
33. 제31항에 있어서, 하이브리드 인터페론 BDBB의 발현을 위한 발현 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 아스퍼질러스 숙주를 배양함을 특징으로 하여, 아스퍼질러스 종에서 상기 하이브리드 인터페론 BDBB를 과생산하는 방법.
34. 제1항에 따른 DNA 서열로 암호화되는 순수한 형태의 펙틴 리아제 PLA, PLB 및 PLC.
35. 제1항에 따라 수득되는 DNA에 의해 암호화되는 순수한 형태의 펙틴 리아제 PLE 및 PLF.
36. 제1항에 있어서, 제14도에 따른 하이브리드 벡터 pUC19/pelA-IFN AM119인 재조합 DNA 분자.

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