JP3576549B2 - 真核生物発現系 - Google Patents

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Description

〔産業上の利用分野〕
本発明は遺伝子工学の分野に関し、そしてポリガラクチュロナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA配列、及び／又はそれに天然に連結されているプロモーター、シグナル及び／又は転写ターミネーター配列を含んで成る新規なDNA分子を提供する。この新規なDNA分子は、糸状真菌においてポリガラクチュロナーゼの製造のため、又は外来遺伝子の発現のための発現カセットの作成のために有用である。
〔従来の技術〕
遺伝子工学技術においては原核性又は真核性宿主のための多くのポリペプチド発現系が知られているが、従来の系に卓越する利点を有する新規な系が常に必要とされている。
非常に広く使用されている宿主は原核性勿である大腸菌（Escherichia coli）及び真核生物である酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces c erevisiae）であり、これらのために多数の異る発現ハイブリドベクターが開発されており、そのほとんどがプラスミドである。大腸菌宿主の欠点は、それらがポリペプチドをグリコシル化できないこと、及び外来遺伝子の細胞内発現が宿主細胞内での蓄積を導きそして更なる増殖を妨害することである。酵母はグリコシル化を行うが、しかしながら大腸菌と同様にポリペプチドを分泌せず、例外的に少量のみ培地中にではなくペリプラズム空間に分泌するのみである。哺乳類癌細胞のごときより高等な真核宿主はグリコシル化を行いそして培地中に分泌することができるが、しかしながらその培養は遅く、高価であり、そして発癌性核酸が目的ペプチドと一緒に単離される危険が存在する。
他の宿主の研究において、糸状真菌（filamentous fvngi）、例えばニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillu s nidulans）及びアスペルギルス・ニガー（Aspergill us niger）も研究されている。遺伝子工学技術におけるこれらの適用は、適当な形質転換系が存在しないことを主な理由として、遅れている。サッカロミセス・セレビシエーとは異り、糸状真菌は外来遺伝子の導入及び表現型選択のために使用し得るプラスミドを含有しない。しかしながら、糸状真菌を選択マーカー遺伝子を含有する外来プラスミドにより形質転換することは可能である。糸状真菌のために今まで記載されているほとんどのベクターは酵母のそれのように自律複製できず、真菌染色体に組込まれる。この現象は一般に低頻度で起こる。しかしながら、組込み形質転換は、非選択的条件下においてさえ形質転換体を有糸分裂的に非常に安定なものとする。百を超えるコピーの安定な組込みが報告されている。
糸状真菌のための記載された最初のベクターは選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサのqa−２遺伝子を含有していた〔Case,M.E.,Schweizer,M.,Kushner,S.R.及びGiles,N.H.（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76,5259−5263;Case,M.E.（1982）,Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals（Hollamder,A.,DeMoss,D.,Kamplan,S.,Konisky,J.,Savage,D.及びWdfe,R.S.編）、87−100頁、Plenum〕。
性周期を有しそしてそれ故に古典的な遺伝的操作を可能にするアスペルギルス・ニドランスにおいては、負及び正の両者の選択系が記載されている（Ballanceら、BBRC 112,284,1983;Tilbumら、Gene 26,205,1983;Yeltonら、PNAS 81,1470,1984;Yelton及びTimberlake,J.Cell.Biochem.Suppl.9C,1732,1985;Johnstoneら、EMBO J.４,1307,1983;Tilburmら、Gene 26,205,1983;Wernarsら、Curr.Genet.９,361,1985;Kelly,J.M.ら、EMBO J.４,475,1985）。
A.クラッサ又はA.ニドランスに比べて、A.ニガーは例えば食品工業において使用するための酵素類の工業的製造において広く使用されているため非常に重要な生物である。A.ニガーは、種々の加水分解酵素、例えばグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ナリンジナーゼ、ペントサナーゼ、酸性プロテアーゼ及びリグナーゼを分泌することが知られており、グルコアミラーゼ及びペクチナーゼ複合体は最も重要なものである。
A.ニガーの性周期は知られていない。従って、減数分裂組換えにより変異を導入することはできない。しかしながら、古典的な変異及び選択法により加水分解酵素の分泌における非常な菌株改良が達成されている。
A.ニガー酵素の遺伝子の内、グルコアミラーゼ（Boelら、EMBO J.３,1581,1984）並びにアルコール及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（WO 86/06097）のみがそれらのプロモーター及びシグナル配列と共に特徴付けられており、そしてA.ニドランス及びA.ニガーを用いる形質転換実験において使用されている。
A.ニガーのための選択マーカーとして、いずれもA.ニドランスから得られたヘテロロガス（heterologous）am ds遺伝子（Kelly及びHynes,EMBO J.４,475,1985）、及びarbB遺伝子（Buxtonら、Gene 37,207,1985;EP 184438;WO 86/06097）が使用されている。
A.ニガーは、ペクチン分解酵素、例えばポリガラクチュロナーゼ、ペクチンリアーゼ又はペクチンエステラーゼの工業的製造のための最も重要な生物である。ペクチンは、α−1,4−グリコシド結合したＤ−ガラクチュロン酸ポリマーから成る高分子（2000〜4000D）のポリガラクチュロニドである。ウロン酸基の幾つかはメタノールによりエステル化されており、これはペクチンエステラーゼにより開裂され得る。ペクチンは高等植物細胞の構成成分として天然に存在し、これらは、一次細胞壁及び中間ラメラに主として存在するセルロース分子に結合している。ペクチンが特に豊富なのはレモン及びオレンジの皮であり、これらは約30％のこのポリサッカライドを含有している。ペクチン酵素はα1,4−グリコシド結合の加水分解（エンドー及びエキソ−ポリガラクチュロナーゼ）又はトランスエレミネーション（transelemination）（ペクチンリアーゼ）のいずれかにより炭水化物ポリマー基質を分解し、飽和の及びα−4,5−不飽和のポリ又はオリゴガラクチュロニドを導く。エンド−ポリガラクチュロナーゼの組織的名称は（ポリ−（1,4−α−Ｄ−ガラクチュロニド））グリカンヒドロラーゼ（EC3,2,1,15）であり、エキソ−ポリガラクチュロナーゼのそれは（ポリ−（1,4−α−Ｄ−ガラクチュロニド））−ガラクチュロ／ヒドロラーゼ（EC3,2,1,67）である。他の関連あるペクチン分解ガラクチュロナーゼ酵素は、α−Ｄ−ガラクチュロネートとＬ−ラムノースとの間の結合を加水分解するラムノガラクチュロナーゼである。
ペクチンリアーゼは高度エステル化ペクチンに対して特異的であるが、ポリガラクチュロナーゼは低エステル化ペクチンを加水分解する。ペクチンエステラーゼ及びポリガラクチュロナーゼの組合わされた作用がまた、高度エステル化ペクチンを脱重合することができる。
果物及び野菜加工におけるポリガラクチュロナーゼ及び酵素混合物の使用は、圧搾後のジュース及び色素の高収量を確保するため及び圧搾原料ジュースの清澄化のために軟質果実を処理するためのペクチン酵素のもともとの使用から発展した。これらの加工のための使用における技術的酵素調製物には種々の量のペクチンエステラーゼ、ポリガラクチュロナーゼ及びペクチンリアーゼ、並びに他の酵素、例えばアラビナナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、β−1,4−グルカナーゼ、グリコシダーゼ及びプロテアーゼが含まれる。
主としてエンドポリガラクチュロナーゼを含み、そしてペクチンエステラーゼを含有しない真菌ペクチナーゼ調製物は、機械的−熱的工程により製造される製品に比べて可溶性固形分、色素及び栄養の含量が高く且つよりなめらかなキメを有するパルプ状ネクターの製造のための軟化酵素として好結果に使用される。
Figure 0003576549
ペクチンエステラーゼ／ポリガラクチュロナーゼの組合せの一般的脱重合活性のため、ペクチンエステラーゼの存在は純粋なポリガラクチュロナーゼの軟化活性を細胞分解活性に変える。
ペクチン酵素及びセルロース分解酵素の使用により、果実パルプの細胞壁はほとんど完全な液化の段階まで分解され得る。エンド−及びエキソ−β−1,4−グルカナーゼ（セルラーゼ）の両者及びペクチン酵素の存在が必須である（参考文献31）。
ポリガラクチュロナーゼ及びその酵素混合物はまた、バイオマスの液化又は糖化のため、例えば植物細胞からの発酵性ポリサッカライドの製造（参考文献33）のため、又はペクチンの修飾のため（概観のためには参考文献32を参考のこと）にも有用である。キシラナーゼと組合わされたポリガラクチュロナーゼはまた、例えば紙パルプ工業においても有用である（参考文献44）。
A.ニガーにおいては、ペクチン複合体の蛋白質は構成的に発現されない。ペクチン又はその分解生成物を用いる誘導条件下において、他の炭素源、例えばグルコース又はシュークロースが増殖制限的である場合に、A.ニガーは上記の酵素を発現する。表面培養において、ペクチン酵素は外部細胞壁に合会したままでいる傾向がある。
Figure 0003576549
及びMarkovic（参考文献29）並びにRombouts及びPilnik（参考文献15）の両者は、アスペルギルス・ニガー及び他の真菌並びに細菌及び植物から得られた多数のポリガラクチュロナーゼを開示しており、これらは精製されたと記載されている。しかしながら、構造的データーが与えられていないので、高い比活性を有する単一ポリガラクチュロナーゼの必要性がなお存在する。有利には、それらはそれらのアミノ酸配列の決定が可能なだけ十分に純粋であるべきである。
以後、ポリガラクチュロナーゼ類はPGとも称する。
〔発明の対象〕
本発明の対称は天然宿主から又は形質転換された宿主からの精製された単一PGである。
本発明は、単一PG類、例えばPG I,PG II,PG III A,PG III B,PG IV、特にPG I又はPG IIの精製又は部分的構造決定に基礎を置いてあり、これは蛋白質の有意義な部分をコードするDNAプローブの合成を可能にするものである。
本発明の１つの対象は、PG II又はPG IをコードするDNA配列を、最終的にはそのプレー及びポスト配列と共に、A.ニガーの遺伝子ライブラリーから、DNAプローブを用いてスクリーニングし又は単離することである。他の対象は、PG II遺伝子（pga IIと称する）又はPG I遺伝子（pga Iと称する）の部分を真菌株の、例えばA.ニガーの遺伝子ライブラリーとハイブリダイズせしめることにより更なるPG遺伝子を同定することである。
更なる対象は、ポリガラクチュロナーゼの構造遺伝子、そしてさらに場合によってはPG遺伝子のイントロン配列、及び／又は制御配列、例えばプロモーター、シグナル配列及び又は転写ターミネーター配列を含んで成るポリガラクチュロナーゼ遺伝子発現カセットをコードする組換えDNA分子である。本発明の更なる組換えDNA分子は、例えば、本発明のPG遺伝子に由来するDNAを含んで成るハイブリドベクターである。
更なる対象は、前記ベクターにより形質転換された宿主特に糸状真菌、例えばアスペルギルス宿主、組換えDNA分子及び形質転換された宿主の製造方法、並びに新規な発現カセット又はハイブリドベクターの製造のための組換えDNA分子の使用である。
本発明の対象はまた、例えばアスペルギルス種でのPGの過剰生産（overproduction）、及び他のPGが夾雑していない単一PG又はその所定の人為的混合物の使用である。
他の対象は、その構造遺伝子が本発明の組換えPG DNAの制御のもとで発現され得る任意の外来蛋白質の製造に関する。
本発明の種々の対象は以後の本発明の詳細な記載から明らかになるであろう。
〔発明の詳細な記載〕
組換えDNA分子
本発明は、
ａ）pGW1800又はpGW1900のアスペルギルス・ニガー（As pergillus niger）DNA挿入部、
ｂ）前記ａ）のDNA挿入部に含まれる成熟PG II又はPG Iのコード領域にハイブリダイズし、そしてガラクチュロナーゼ又はポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドの構造遺伝子並びに場合によってはプロモーター、シグナルもしくはリーダーペプチドのためのコード領域及び／又は転写ターミネーターを含んで成るDNA配列、
ｃ）前記ａ）又はｂ）において定義されたDNA配列の誘導体、又は
ｄ）成熟PG又はそのシグナルペプチドもしくはリーダーペプチドをコードし、そして前記ａ）,b）又はｃ）のDNA配列に関して遺伝子コードの意味において縮重しているDNA配列、
から選択されたDNA配列を含んで成る組換えDNA分子に関する。
さらに具体的には、本発明は、
ａ）pGW1800のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）DNA挿入部、
ｂ）前記ａ）のDNA挿入部に含まれる成熟PG IIのコード領域にハイブリダイズし、そしてポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドの構造遺伝子並びに場合によってはプロモーター、シグナルもしくはリーダーペプチドのためのコード領域及び／又は転写ターミネーターを含んで成るDNA配列、
ｃ）前記ａ）又はｂ）において定義されたDNA配列の誘導体、又は
ｄ）成熟PG又はそのシグナルペプチドもしくはリーダーペプチドをコードし、そして前記ａ）,b）又はｃ）のDNA配列に関して遺伝子コードの意味において縮重しているDNA配列、
から選択されたDNA配列を含んで成る組換えDNA分子；あるいは、
ａ）pGW1900のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）DNA挿入部、
ｂ）前記ａ）のDNA挿入部に含まれる成熟PG Iのコード領域にハイブリダイズし、そしてポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドの構造遺伝子並びに場合によってはプロモーター、シグナルもしくはリーダーペプチドのためのコード領域及び／又は転写ターミネーターを含んで成るDNA配列、
ｃ）前記ａ）又はｂ）において定義されたDNA配列の誘導体、又は
ｄ）成熟PG又はそのシグナルペプチドもしくはリーダーペプチドをコードし、そして前記ａ）,b）又はｃ）のDNA配列に関して遺伝子コードの意味において縮重しているDNA配列、
から選択されたDNA配列を含んで成る組換えDNA分子に関する。
プラスミドpGW1800及びpGW1900は大腸菌株JM109/pGW1800及びDH5αＦ′/pGW1900にそれぞれ含有されており、
Figure 0003576549
に寄託されている。
本明細書において、ポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドはまたポリガラクチュロナーゼ（PG）とも称する。この用語は、天然のポリガラクチュロナーゼの断片又は変異体であって酵素活性を維持しているものをも包含する。本明細書において使用する場合、ポリガラクチュロナーゼ又はPGなる用語はまた、ガラクチュロネートを含有するオリゴ又はポリサッカライドを基質として有する他のガラクチュロナーゼ、例えばガラクチュロネートを開裂せしめるオリゴガラクチュロナーゼ又はラムノースとガラクチュロネートとのコポリマーを開裂せしめるラムノガラクチュロナーゼ、あるいは酵素活性を維持しているこれらの断片又は変異体をも包含する。「リーダーペプチド」とは、成熟PGの形成の間に切断されるプレプロ−PGの配列を意味する。「シグナルペプチド」は小胞体中の「シグナルペプチダーゼ」により最初の段階において切断される。
本発明の組換えDNA分子は、例えば、pGW1800又はpGW1900のアスペルギルス・ニガーDNA挿入部を含んで成る。
pGW1800（第２図）の4.1kb長のA.ニガーN400挿入部はXha I制限部位（マップ位置１）からEcoR I制限部位（マップ位置4100）に伸びる。この挿入部はPG II遺伝子のプロモーター及び転写ターミネーター領域pga II並びにイントロンを含むプレプロ−PG IIのコード領域を含んで成る。第２図に示すおよそマップ位置１から始まりそしておよそマップ部位3050のPvu IIで終るpga IIを含んで成るA.ニガー挿入部のDNA配列は決定されており、そして配列番号（SEQ ID No.）２のもとに配列表（Sequence Listing）に記載されている。
pga IIのプロモーター領域は配列番号（SEQ ID No.）２のこのDNA配列の1357位まで伸びる。プレプロ−PG IIのリーダーペプチドのコード領域は1357位から1437位にわたる。シグナルペプチドはヌクレオチド1357〜1419によりコードされている。成熟PG IIのコード領域は位置1438位から2494位に伸びる。次に、2499位から始まる転写ターミネーター領域が存在する。
pGW1900（第３図）の8.6kbp長のA.ニガーN400挿入部は、第３図に示されるマップ位置１のBamH Iからおよそマップ位置8600のBamH Iまで伸びる。およそマップ位置6280からおよそ3880位まで伸びるDNA配列は配列番号（SEQ ID No.）１のもとに配列表に示される。
8.6kbp挿入部のプロモーター領域は配列番号（SEQ ID No.）１のDNA配列の910位まで伸びる。プレプロ−PG Iの31アミノ酸長のリーダーペプチドのコード領域は910位から1002位まで伸びる。シグナルペプチドはヌクレオチド910〜963によりコードされている。成熟PG Iのコード領域は1003位で始まりそして2127まで伸びる。転写ターミネーター領域は位置2131から始まる。
pGW1900又はpGW1800のA.ニガーN400挿入部に由来するPG I又はPG IIをコードするDNA配列は、PG I又はPG II遺伝子の又はA.ニガーN400由来のその断片のコード領域と、ホモロガス（homologous）条件下でハイブリダイズする。A.ニガーN400 PG I又はPG IIコード領域に少なくとも部分的に相同でありそしてPG活性を有する蛋白質をコードするDNA配列はPG遺伝子群の構成員である。部分的にのみ相同なDNA配列は、A.ニガーN400 PG I又はPG II由来配列と、ホモロガス条件よりストリンジエンシーの低いいわゆる「ヘテロロガス」（heterologous）条件下でハイブリダイズする。「ヘテロロガス」条件下でのみハイブリダイズするPG遺伝子群の構成員は、PG I又はPG II以外のA.ニガーN400のPG遺伝子、あるいはA.ニガーN400以外のPG生産性真菌株のPG I,PG II又は他のPG遺伝子であることができる。この様な真菌株は、例えば、アスペルギルスの種、例えばA.ジャポニカス（A. japo nicus）、A.オリゼー（A. oryzae）、A.ニドランス、又はN400以外のA.ニガー株、トリコデルヌ・スペシス（Trichoderma spec.）、ボトリティス・スペシス（Bo trytis spec.）、スクレロチニア・スペシス（Sclerot inia spec.）、フザリウム・スペシス（Fusarium spe c.）、あるいは他の植物病原性真菌並びに酵母、PG生産性クルイベロミセス・スペシス（Kloyveromyces spe c.）、）、例えばK.フラギリス（K. fragilis）に由来することができる。この様な株の好ましい例はA.ニガーNW756でる。従って、本発明のPG遺伝子群は、PG I,PG II,PG III A,PG III B,PG IV及び他のPG類であって好ましくはアスペルギルス・スペシス、さらに好ましくはA.ニガー、最も好ましくはN400又はNW756株、しかしさらに他のPG生産性真菌株に由来するものをコードする遺伝子を含んで成る。PG遺伝子群の構成員を「PG遺伝子」と称する。
PG遺伝子群の構成員の蛋白質生成物には、ガラクチュロネートを含有するオリゴー又はポリサッカライドを開裂させることができる酵素（ガラクチュロナーゼ）、例えばオリゴガラクチュロナーゼ、ラムノガラクチュロナーゼ、そして特にポリガラクチュロナーゼが包含される。
常用のハイブリダイゼーション法は、例えばBenton及びDavis（参考文献７）により記載されている。ホモロガス及びヘテロロガスハイブリダイゼーション条件は後でさらに正確に定義される。
「誘導体」なる語は、本発明の新規なDNA配列に関して使用される場合、フランキング（flanking）配列を含むより長い誘導体、該DNA断片の断片及び変異体、特に人工変異体を包含することが意図される。
新規DNA断片のより大きな誘導体は、A.ニガーのゲノムから切り出され、そしてpGW1800又はpGW1900のアスペルギルス・ニガーDNA挿入部に含有される成熟PG II又はPG Iのコード領域とハイブリダイズしそしてポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしそしてpGW1800又はpGW1900のアスペルギルス・ニガーDNA挿入部と同じか又はそれとは異るプロモーター、シグナル及び／又は転写ターミネーター配列を含有することがあるDNA配列を含んで成るものである。この様な誘導体は、核酸の断片化、適当な制限酵素、例えばEcoR I,BamH I又はHind IIIにより該断片の処理、適当なベクター、例えばλファージ又はプラスミドpBR322への連結、例えば大腸菌へのクローニング及び適当な制限酵素による再度の切り出しにより得られるA.ニガーN400又はNW756のゲノムライブラリー中に見出すことができる。
「ヘテロロガス」条件下でA.ニガーN400のPG I又はPG II遺伝子のコード領域とハイブリダイズするDNA配列の誘導体の好ましい例は、λPG−A9,λPG−A10,λPG−A43,λPG−B4,λPG−B35,λPG−B36,λPG−C1,λPG−C16,λPG−C20,λPG−C37,λPG−D8,λPG−D11,λPG−D12,λPG−E6,λPG−E38,λPG−F5,λPG−G17,λPG−G27,λPG−X31,λPG−X33,pGW1756及びpGW1910から成るベクターの群から選択されたベクターの挿入部又はその断片である。最後の１つはλPG−C20に由来するA.ニガーN400 PG Cをコードする構造遺伝子pgaＣを含んで成る。pGW1756（第６図）は、A.ニガーN400 PG II遺伝子とは異る制限パターン及びDNA配列（配列番号３を参照のこと）を示すA.ニガーNW756由来PG II遺伝子を含んで成る。従って、NW756及びNW400は密接には類縁ではなく、そして糸状真菌の異る種に属するであろう。従って、A.ニガーN400 PG I又はPG II構造遺伝子はヘテロロガス条件下で他の種のPG遺伝子ともハイブリダイズすることができる。
プラスミドpGW1756は約4,000bp長のpEMBL18ベクター断片及び約5,500bp長のA.ニガーNW756 DNA断片から構成されている。PG IIコード遺伝子pga IIは約3,300bp長のHinc II制限断片内に位置する。pGW1756はDSMに寄託されている。
A.ニガーNW756 pga IIのプロモーター領域は配列表に示される配列番号（SEQ ID No.）３のDNA配列中のヌクレオチド889の前に伸びる。プレプロ−PG IIのリーダーペプチドのコード領域はおそらく890位から970位まで伸び、他方シグナルペプチドはヌクレオチド890〜952によりコードされている。成熟蛋白質のコード領域はヌクレオチド971から始まり2028位の終止コドンで終り、そしておそらく１個のイントロンを含有する。コード領域に続き、2031位から始まる転写ターミネーター領域が存在する。
プラスミドpGW1910（第７図）はλPG−C20由来の約7,800bp長の挿入部とベクターpUC9とから成る。A.ニガーN400挿入部内にポリガラクチュロナーゼ遺伝子pgaＣが位置する。ほぼ完全なpgaＣ遺伝子のDNA配列が配列表中に配列番号（SEQ ID No.）４のもとに与えられている。
A.ニガーN400 pgaＣのプロモーターはヌクレオチド663の前に延びる。pgaCによりコードされるプレプロ−PGのリーダーペプチドはおそらくヌクレオチド663から782まで伸び、そしてシグナルペプチドをコードする663位〜710位のDNA配列を含む。成熟PGはヌクレオチド783から1995まで伸びそして幾かのイントロンを含む配列によりコードされる。転換ターミネーター領域は1999位の終止コドンの後から始まる。
本発明に含まれるハイブリダイズするDNA配列の誘導体は、pGW1800又はpGW1900中のものと同じプロモーター、シグナル及び／又は転写ターミネーター配列又はポリガラクチュロナーゼ遺伝子群の他の遺伝子に由来するであろう他のプロモーター、シグナル及び／又は転写ターミネーター配列を含んで成る。さらに、所望のPGが発現されるべき宿主に依存して、他のプロモーター、シグナル及び／又は転写ターミネーター配列を、ハイブリダイズするDNA配列に付加することができる。
広範囲の種類のプロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターを用いることができる。プロモーターは一般に原核性、真核性又はウイルス性遺伝子の５′−非コード領域から得られ、他方転写ターミネーターは３′−非コード領域から得られる。シグナル配列は、細胞の分泌経路に導入される蛋白質の５′−コード領域から得られる。プロモーターの例を後に記載する。
本発明に関してシグナル配列は、本発明のプレプロ−PGのシグナルペプチド又はリーダーペプチドをコードするDNA配列である。
本発明の意味においてフランキング配列はさらに、ゲノム中のPG遺伝子を挾む（flanking）配列に由来しない配列である。この様なフランキング配列は例えば制御機能、例えばプロモーター機能を有し、又はペプチドをコードし、例えば構造遺伝子であり、又は制御配列と構造遺伝子とを正しいリーディングスレーム及び距離におくリンカーであり、又は発現プラスミドの作製において使用されるベクター、例えばファージ又はプラスミドに由来する配列である。この様なフランキング配列は発現カセット又は融合遺伝子に生ずるであろう。
「断片」なる語は、新規DNAに関して使用する場合、より大きな誘導体の断片、特にプロモーター、シグナル、構造又は転写ターミネーター機能を保持しているものをも包含する。これらは２個の制限部位間に伸びるであろう。
好ましいDNA断片は、プロモーター領域を含み、プレプロ−PGのリーダー又はシグナルペプチドをコードし、又はポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、又は転写ターミネーター領域を含むものである。従って、本発明のDNA配列はまたこれらの断片の任意の組合せを含有するものであり、例えばプロモーター、及び／又はリーダーもしくはシグナルペプチドのコード領域、及び／又はPGのコード領域、及び／又は転写ターミネーター、等を含有するものである。
PGプロモーター領域を含んで成る断片はDNA配列中をプレプロ−PG構造遺伝子の前から約2000まで、好ましくは約500〜1400ヌクレオチド上流まで伸びる。プロモーター領域はRNAポリメラーゼ及び制御蛋白質と結合する。
PG I遺伝子pga Iのプロモーター領域を含んで成る断片は例えば配列番号（SEQ ID No.）１の配列の１位から909位まで伸びる。A.ニガーN400のPG II遺伝pga IIのプロモーター領域を含んで成る断片は、例えば配列番号（SEQ ID No.）２の配列の１位から1356位まで伸びる。pGW1756のA.ニガーNW756挿入部において、pga IIのプロモーター領域を含んで成る断片は配列番号（SEQ ID No.）３における１位から889位まで伸びる。pGW1910のA.ニガー挿入部において、pgaＣのプロモーター領域を含んで成る断片は配列番号（SEQ ID No.）４の配列の１位から662位まで伸びる。
プレプロ−PGのリーダーペプチドをコードするDNA配列を含んで成る断片は例えばプロモーターの終点と成熟蛋白質をコードする配列の始点との間に伸びる。シグナルペプチドのコード領域は対応するリーダーペプチドのそれよりも短い。これもプロモーターの終点で始まり、そしてシグナルペプチド開裂部位のコード領域まで伸びる。A.ニガーN400プレプロ−PG IIにおいて、リーダーペプチドは27アミノ酸を含んで成る。リーダーペプチドをコードするDNA断片は例えば、配列番号（SEQ ID No.）２のDNA配列の1357位のATGコドンから1429位のXho I開裂部位まで伸びる。プレプロ−PG Iにおいて、リーダーペプチドは31アミノ酸を有する。このリーダーペプチドをコードするDNA断片は例えば配列番号（SEQ ID No.）１のDNA配列の910位と1002位との間で伸びる。A.ニガーNW756プレプロ−PG IIのリーダーペプチドはおそらく27アミノ酸を有し、そしてそれ故に該リーダーペプチドをコードするDNA断片は配列番号（SEQ ID No.）３のDNA配列の889位と971位との間に伸びる81−bp長のDNA断片である。A.ニガーN400のpgaＣ生成物のおそらく40アミノ酸のリーダーペプチドをコードするDNA断片は配列番号（SEQ ID No.）４の配列の663位から782位まで伸びる。
それぞれのシグナルペプチドのコード領域は、例えば、次のアミノ酸断片上に位置する：配列番号（SEQ ID No.）１の911位〜963位、配列番号（SEQ ID No.）２中の1358位〜1419位、配列番号（SEQ ID No.）３中の890〜952、及び配列番号（SEQ ID No.）４中の663〜710。
成熟PG Iのための完全なコード領域を含んで成る断片は、例えば、配列番号（SEQ ID No.）１の配列の1003位から2127位まで伸びる。成熟A.ニガーN400 PG IIのための完全なコード領域を含んで成る断片は、例えば配列番号（SEQ ID No.）２の配列の1430位から2497位まで伸びる。成熟A.ニガーNW756 PG IIは、例えば、配列番号（SEQ ID No.）３の配列の953位から2027位に伸びるDNA断片によりコードされ、そして成熟pgaＣ遺伝子生成物は、例えば、配列番号（SEQ ID No.）４の配列の塩基No.782とNo.1,996との間に位置するDNA断片によりコードされている。
PG II又はPG I及び他のPG類の構造遺伝子は、多くの真菌遺伝子と同様にイントロンを含有する場合がある。しかしながら、イントロンを有しないPG構造遺伝子、例えばゲノムDNA配列としてイントロンを含有しないもの又はcDNAから得ることができるものも本発明の範囲に含まれる。
転写ターミネーターを含んで成る断片は、例えば、PGのコード領域の終点の終止コドン、例えばTAA,TAG又はTGAから下流方向に約200〜2000、好ましくは約500〜1000塩基対まで伸びる。
この様な断片は、例えば、配列番号（SEQ ID No.）１の配列の塩基位置2131から2495位まで、配列番号（SEQ ID No.）２の配列中の2498位から3031位まで、配列番号（SEQ ID No.）３の配列中の2031位から3047位まで、そして配列番号（SEQ ID No.）４の配列中の1999位から2304位まで、それぞれ伸びる。
しかしながら、前記の断片は天然５′−フランキング配列によって延長されることができ、５′−又は３′−末端において短縮されることができ、そしてそれにも拘らずプロモーター又は転写ターミネーター活性を維持することができ、あるいはコードされたポリペプチドはシグナルペプチド又はガラクチュロナーゼ活性を維持することができる。この様な断片もまた本発明の範囲に含まれる。
前記の断片は、他のDNA分子への好結果の連結を提供しそして／又は制御機能を有するかもしくはポリペプチドをコードするDNA断片、例えばプロモーター及び構造遺伝子を正しいリーディングフレーム又は距離に置くリンカーを含有することができ、又は末端に有することができる。
前記断片への適当なリンカーは、断片が連結されるべきDNAの制限部位に適合するDNA配列を有する。
本発明のDNA配列の変異体は例えば天然変異体である。本発明はまた、類似の又は同一の疎水性プロフィールを有するシグナル又はリーダーペプチドのコード領域の天然又は合成変異体を含み、この場合例えば、極性アミノ酸であるヒスチジン（Ｈδ＋）、チロシン（Ｙδ−）及びアルギニン（Ｒδ＋）のコドンが類似の電価を有する他のアミノ酸のコドンと交換されており、そして疎水性アミノ酸であるアラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）及びスレオニン（Ｔ）のコドンが他の疎水性アミノ酸のコドンにより置き換えられている。例えば、正に荷電したリジンのコドンをアルギニンのコドンにより置き換えることができそしてこの逆も可能であり、負に荷電したチロシンのコドンをグルタミン酸もしくはアスパラギン酸のコドンにより置き換えることができ、そして／又は非極性疎水性アラニンのコドンをスレオニン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン又はフェニルアラニンのコドンの１つにより置き換えることができる。
本発明の組換えDNA分子はまた、コードされるアミノ酸配列を変えることなく多数のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置き換えられるように遺伝子コードの意味において縮重しているDNA配列をも含む。この様な縮重DNA配列はそれらの異る制限部位のために、又は特定の宿主における好ましいコドンの使用のために有用である。
本発明の組換えDNA分子は、pGW1800,pGW1900,pGW1756,pGW1910,λPG−A9,λPG−A10,λPG−A43,λPG−B4,λPG−B35,λPG−B36,λPG−C1,λPG−C16,λPG−C20,λPG−C37,λPG−D8,λPG−D11,λPG−D12,λPG−E6,λPG−E38,λPG−F5,λPG−G17,λPG−G27,λPG−X31、及びλPG−X33から成るハイブリドベクターの群から選択されたハイブリドベクターのアスペルギルス・ニガーDNA挿入部、又はPG遺伝子のプロモーター領域を含んで成るその断片、又はシグナルペプチド、リーダーペプチド、プレプロ−PG、PCもしくはポリガラクチュロナーゼ活性を有するPGの断片のためのコード領域、又はPG遺伝子の転写ターミネーター領域を主として含んで成る。
本発明はまた、前記のベクターの群から選択された１つのベクターに主として由来する本発明のプロモーター領域、リーダー又はシグナルペプチドをコードするDNA断片、構造遺伝子及び／又は転写ターミネーター領域を含んで成る発現カセットである組換えDNA分子に関する。
「発現カセット」なる語は、ポリペプチドを発現することができそしてプロモーター、所望によりシグナル配列、さらに構造遺伝子、所望により転写ターミネーター、及び場合によっては転写エンハンサー、リボゾーム結合部位及び／又は更なる制御配列を含んで成るDNA配列を意味する。
本発明の発現カセットにおいては、PG遺伝子由来の機能的断片が他の遺伝子に由来する機能的断片と組合わされる場合がある。
宿主細胞の性質に依存して広範囲の種類のプロモーター配列を用いることができる。強力であり且つ同時によく制御されるプロモーターが最も有用である。翻訳の開始のための配列は例えばシャイン−ダルガーノ（Shine−Dalgano）配列である。転写の開始及び停止並びにmRNAの安定化のために必要な配列は一般に、例えば発現宿主からのウイルス性又は真核性cDNAのそれぞれ非コード５′−領域及び３′−領域から得られる。
プロモーターの例は、λPL,λPR,大腸菌lac,trp,tac、酵母TRP1−,ADH I−,ADH II−,PHO3−,PHO5−又は解糖系プロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（PG K）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グリコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼの遺伝子のプロモーター、あるいは真核性ウイルス、例えばSV40、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス、パポバウイルス及びサイトメガロウイルス由来のプロモーター、又は哺乳類細胞由来のプロモーター、例えばアクチン、コラーゼン、ミオシン又はβ−グロビン遺伝子由来のプロモーターである。真核性プロモーターを増強配列（enhancing sequence）、例えば酵母上流活性化配列（UAS）あるいはウイルス性又は細胞性エンハンサー、例えばサイトメガロウイルスIEエンハンサー、SV40エンハンサー、免疫グロブリン遺伝子エンハンサー等と組合わせることができる。
エンハンサーは、例えば、ウイルス、例えばシミアン（Simian）ウイルス、ポリオーマウイルス、ウシパピローマウイルスもしくはモロネー（Moloney）肉腫ウイルス由来の、又はゲノム由来の、転写刺激DNA配列である。エンハンサー配列また、フィザリウム・ポリセファルム（Physarum polycephalum）の染色体外リボゾームDNA（PCT/EP 8500278）に由来することができ、あるいはそれは酸性ホスファターゼPHO5遺伝子（EP出願No.86111820.6）、又はPHO5,trp,PH5−GAPDHハイブリド（EP出願No.86111820.6）、又は類似のプロモーターからの上流活性化部位であることができる。
シグナル配列は、例えば、ポリペプチドの分泌を指令するプレ配列又は分泌リーダー、等である。シグナル配列は、例えば、プレプロ−PG I、プレプロ−PG II又はプレプロ−PG Cのシグナル又はリーダーペプチドである。更なるシグナル配列は文献から既知であり、例えばvon Heijne,G.,Nucleic Acids Res.14,4683（1986）中に編集されているものである。
これに関連して、構造遺伝子は、PG I又はPG IIをコードするものの外に、他のPG類及び誘導体、特にPG活性を有するその断片をコードするもの又は他のアスペルギルス遺伝子、及びウイルス、原核細胞又は真核細胞に由来しそしてゲノムDNA又はmRNAルートを介して調製されるcDNAから誘導することができ又は化学的に合成することができ、特に高等真核生物特に哺乳類、例えば動物又は特にヒト由来の、グリコシル化ポリペプチドを含めての広範な有用なポリペプチド、例えば、栄養の製造のため及び化学において酵素反応を行うための酵素、ヒト及び動物の疾患の治療又は予防のために有用で且つ価値があるポリペプチド、例えばホルモン、免疫調節性を有するポリペプチド、抗−ウイルス性及び抗−腫瘍性蛋白質、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝固因子、食品等をコードする構造遺伝子である。
この様な構造遺伝子の例は、例えば、ホルモン、例えばセクレチン、チモシン、レラキシン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、アドレノコルチコトロピン、色素細胞刺激ホルモン、β−リポトロピン、ウロガストロンもしくはインシュリン、成長因子、例えば上皮細胞成長因子、インシュリン様成長因子（IFG）例えばIGF−Ｉ及びIFG−II、マスト細胞成長因子、神線成長因子、グリア由来神経細胞成長因子、又は形質転換成長因子（TGF）、例えばTGFβ、成長ホルモン、例えばヒト又はブタ成長ホルモン、インターロイキン、例えばインターロイキン−１もしくは−２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（MIF）、インターフェロン、例えばヒトα−インターフェロン、例えばインターフェロンαA,αB,αＤもしくはαＦ、β−インターフェロン、γ−インターフェロン又はハイブリドインターフェロン、例えば、αＡ−αＤ−又はαＢ−αＤ−ハイブリドインターフェロン、特にハイブリドインターフェロンBDBB、プロテイナーゼインヒビター、例えば、α１−アンチトリプシン、SLP I等、肝炎ウイルス抗原、例えば肝炎Ｂウイルス表面もしくはコアー抗原又は肝炎Ａウイルス抗原、又は肝炎非Ａ−非Ｂ抗原、プラスミノーゲン活性化因子、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子もしくはウロキナーゼ、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エンドルフィン、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンD.EもしくはＧのライト鎖及び／又はヘビー鎖、又はヒト−マウスハイブリド免疫グロブリン、免疫グロブリン結合因子、例えば免疫グロブリンＥ結合因子、カルシトニン、ヒトカルシトニン関連ペプチド、血液凝固因子、例えばファクターIXもしくはVIIIc、エリスロポイエチン、エグリン、例えばエグリンＣ、ヒルジン、デスルファトヒルジン、例えばデスルファトヒルジン変形体HV1,HV2又はPA、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ウイルスチミジンキナーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラーゼ等をコードする遺伝子である。好ましい遺伝子は、ヒトα−インターフェロン又はハイブリドインターフェロン、特にハイブリドインターフェロンBDBB、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）、肝炎Ｂウイルス表面抗原（HBVsAg）、インシュリン様成長因子Ｉ及びII、エグリンＣ及びデスルファトヒルジン、例えば変形体HV1をコードする遺伝子である。本発明のハイブリドベクターにおいては、本発明のプロモーター及び／又はシグナル配列がポリペプチドコード領域に作用可能に連結されており、これによりポリペプチドの効率的な発現が保証される。
本発明はまた、組換えベクターあるいはハイブリドベクターとも称される組換えDNA分子に関し、該ベクターは、
ａ）pGW1800又はpGW1900のアスペルギルス・ニガーDNA挿入部、
ｂ）前記ａ）のDNA挿入部に含まれる成熟PG II又はPG Iのコード配列にハイブリダイズするDNA配列、
ｃ）前記ａ）又はｂ）において定義されたDNA配列の誘導体、又は
ｄ）成熟PG又はそのシグナルペプチドもしくはリーダーペプチドをコードしそして遺伝子コードの意味において縮重している前記ａ）,b）又はｃ）のDNA配列、
から選択されたDNA配列を含んで成る。
これらは、細菌、真菌又は動物細胞のごとき宿主でのクローニング及び／又は発現のために有用である。
これらのハイブリドベクターは、遺伝子工学の分野において有用な任意のベクターから、例えばウイルス、ファージ、コスミド、プラスミド又は染色体DNA、例えばSV40の誘導体、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、ファージλ、例えばNM898もしくはEMBLL、又はファージM13、例えばBamH I消化により線状化されたM13mp8ファージDNA（参考文献15）、細菌プラスミド、例えばpBR322,pUC18、又は酵母プラスミド、例えば酵母２μプラスミド、又はさらにアスペルギルスの種例えばA.ニガーのごとき糸状真菌に由来する染色体DNA、例えばEP 184,483に記載されているもの、あるいは欠陥のあるウイルス、ファージ又はプラスミドの複製を可能にするヘルパーウイルス、ファージ又はプラスミドの存在下での欠陥を有するウイルス、ファージ又はプラスミド、例えばM14KO7ヘルパーファージの存在下でのM13（＋）KSベクター、から誘導することができる。
本発明のハイブリドベクターは、染色体外要素として又は宿主染色体への組込みによって、適当な宿主中での目的のDNAの複製及び場合によっては発現をもたらす。本発明のクローン化DNAの組込み及び発現のために幾つかの可能なベクター系が利用可能である。原理的には、選択された宿主中で本発明の発現カセット中に含まれる目的のポリペプチド遺伝子を複製及び／又は発現するすべてのベクターが適当である。ベクターは、形質転換のために予想される宿主細胞に依存して選択される。一般に、この様な宿主細胞は原核性又は真核性の微生物、例えば細菌、真菌、例えば酵母又は糸状真菌、又は高等真核性の細胞、例えば脊椎動物例えば哺乳類の細胞である。適当な宿主細胞は後でさらに詳細に検討する。原理的には、本発明のハイブリドベクターは、前記のようなDNA、複製起点又は自律複製配列、優性マーカー配列、場合によっては、目的のDNAの転写及び翻訳のために必須の発現制御配列、及び場合によっては、目的の生成物の分泌のための配列、及び場合によっては、追加の制限部位を含んで成る。
複製起点又は自律複製配列（染色体外要素に自律複製能力を付与するDNA要素）は、シミアンウイルス（SV40）又は他のウイルス源由来のごとき異種源を含めるベクターの作製により、あるいは宿主細胞の染色体機構によって提供される。
本発明のハイブリドベクターは、形質転換され、選択されそしてクローン化されるべき宿主に依存して選択マーカーを含有することができる。マーカーの表現型発現により形質転換体の選択を促進する任意のマーカー遺伝子を用いることができる。適当なマーカーは特に、例えばテトラサイクリンもしくはマンピシリンに対する抗生物質耐性を示すもの、又は栄養要求性真菌変異株の場合には、宿主の欠陥を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は例えば、抗生物質シクロヘキシミドに対する耐性を提供し、又は栄養要求酵母変異体、例えばura3，leu 2，his3又はtrp1遺伝子において原栄養性を提供する。形質転換されるべき宿主がマーカーにより発現される生成物について栄養要求性であれば、自律複製セグメントと関連する構造遺伝子をマーカーとして用いることも可能である。
特に重要なものは、A.ニガー宿主の欠陥を補完するマーカー遺伝子、例えば、A.ニガーもしくはA.ニドランス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードするargＢ遺伝子（EP 184,438）、又はN.クラッサ（N. crassa）pyr4遺伝子に相同なA.ニドランスDNA断片である。
本発明の好ましい具体例は本発明の発現カセットを含んで成るハイブリドベクターであり、例えば構造遺伝子及び／又はプロモーター及び／又はリーダーもしくはシグナルペプチドをコードするDNA配列及び／又は本発明のPG遺伝子由来の転写ターミネーターを含んで成るものである。
本発明の発現カセットを含んで成るハイブリドベクターの例は、pGW1800,pGW1900,pGW1910,pG II−IFN AM119,pG IISS−IFN AM119,pGW1756,λPG−A10,λPG−A43,λPG−D8、及びλPG−D11である。
本発明の対象は、前記のPC遺伝子由来挿入部を含んで成る組換えDNA分子のみならず、PG生産性真菌株、例えばアスペルギルスの種、例えばA.ジャポニクス（A. ja ponicus）、A.オリゼー（A. oryzae）、A.ニドランス（A. nidulans）、A.ニガー（A.neger）、トリカデルマ・スペシス（Trichoderma spec.）、ボトリチス・スペシス（Botrytis spec.）、スクレロチニア・スペシス（Sclerotinia spec.）、フザリウム・スペシス（Fu sarium spec.）、又は他の植物病原性真菌、並びに酵母、例えばPG生産性クルイベロミセス・スペシス（Kluy veromyces spec.）、例えばK.フラギリス（K. fragil is）から単離することができる、PG遺伝子又はその機能的断片を含んで成るDNA分子、例えばプロモーター、シグナルペプチド、リーダーペプチド又はPG活性を有する蛋白質のコード領域又は転写ターミネーター領域それ自体を含んで成るものである。A.ニガーから単離されるDNA分子が好ましい。
本発明のDNA分子及び断片を含めてのその誘導体は、更なる類似のDNA又はmRNAを得るために、DNA遺伝子ライブラリー又はmRNAをスクリーニングするために用いることができる。
組換えDNA分子の製造方法
本発明の更なる対象は前記の組換えDNA分子の製造方法であり、この方法は、そのような組換えDNA分子により形質転換された宿主を培養し、又はそれをインビトロで合成することを含んで成る。
宿主の培養は、非形質転換体すなわち目的のDNA分子を欠く宿主からの形質転換体すなわち目的のDNA分子を選択マーカーと共に含有する宿主の負の又は正の選択を可能にする化学物質を補充した又はこれを欠く常用の栄養培地中で行われる。
当業界において有用な任意の形質転換可能な宿主、例えば細菌、例えば大腸菌、真菌、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、又は特に糸状真菌、例えばアスペルギルス、例えばA.ニドランス、A.オリゼー、A.アワモリそして特にA.ニガーを使用することができる。好ましい宿主は後にさらに記載するpyrＡ遺伝子を欠く変異株であるA.ニガーAn8、又はA.ニガーN593である。宿主の形質転換は常法により行われる。
本発明の組換えDNA分子中に含まれるDNA配列はポリガラクチュロナーゼを発現する真菌のゲノムから得ることができ、又は本発明の組換えDNA分子により形質転換された宿主を培養しそして所望によりそこから目的のDNAを単離するか、又はヌクレオチド縮合による化学合成により製造することができる。
特に、この様なDNAは、
ａ）適当な真菌細胞からゲノムDNAを単離し、例えばDNAプローブを用いて又は適当な発現系を用いて目的のDNAを選択し、そして目的のポリペプチドの発現について選択し；あるいは、
ｂ）適当な真菌細胞からmRNAを単離し、例えばDNAプローブとのハイブリダイゼーションにより又は適当な発現系での発現により目的のmRNAを選択しそして目的のポリペプチドの発現についてスクリーニングし、そのmRNAに対して相補的な単鎖cDNAを調製し、次にそこから二本鎖cDNAを調製し；あるいは、
ｃ）cDNAライブラリーからcDNAを単離し、そして例えばDNAプローブを用いて又は適当な発現系を用いて目的のcDNAを選択し、そして目的のポリペプチドの発現についてスクリーニングし；そして／又は
ｄ）前記段階ａ）,b）又はｃ）の二本鎖DNAを適当なベクターに導入し；
ｅ）得られたハイブリドベクターにより適当な宿主細胞を形質転換し；
ｆ）目的のDNAを含有する形質転換された宿主細胞を未形質転換宿主細胞から選択し、そして形質転換された宿主細胞を増幅し；そして、所望により、
ｇ）目的のDNAを単離し、そして／又は該DNAをその変異体又は断片に転換する；
ことにより製造することができる。
ゲノムDNAを単離しそして目的のDNAについてスクリーニングすることができる（段階ａ）。ゲノムDNAは、PG活性を有する蛋白質を発現する適当な真菌株から単離される。そこから、確立された方法に従っての適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化及び適当なベクターへの導入によりゲノムDNAライブラリーを調製する。このゲノムDNAライブラリーを後記のDNAプローブを用いてスクリーニングし、又は適当な発現系において発現せしめそして得られたポリペプチドを常法に従ってスクリーニングする。ゲノムライブラリーからの本発明のDNA分子の単離については後で詳細に記載する。
ポリアデニル化メッセンジャーRNAは既知の方法により適当な細胞から単離される（段階ｂ）。単離方法は、例えば、洗剤及びリボヌクレアーゼ阻害剤、例えばヘパリン、グアニジニウムイソチオシアナート又はメルカプトエタノールの存在下でホモジナイズし、場合によっては塩及び緩衝液、洗剤及び／又は陽イオンキレート剤の存在下で適当なクロロホルム−フェノール混合物によりmRNAを抽出し、そしてmRNAを残りの水性塩含有相からエタノール、イソプロパノール等によりmRNAを沈澱せしめることを含む。単離されたmRNAは、塩化セシウムグラジエント中での遠心分離及びそれに続くエタノール沈澱及び／又はクロマトグラフィー法、例えばアフィニティークロマトグラフィー、例えばオリゴ（dT）セルロース又はオリゴ（Ｕ）セファロース上でのクロマトグラフィーによりさらに精製することができる。好ましくは、このようにして精製された全mRNAを、勾配遠心分離により、例えば直線シュークロース勾配中で、又は適当なサイズ画分カラム、例えばアガロースゲル上でのクロマトグラフィーにより、サイズに従って分画する。
目的のmRNAは、DNAプローブを用いてmRNAを直接スクリーニングすることにより、あるいは適当な細胞系又は無細胞系での翻訳及び得られたポリペプチドのスクリーニングにより、選択される。
目的mRNAの選択は好ましくはDNAハイブリダイゼーションプローブを用いて行われ、これにより追加の翻訳段階が回避される。適当なDNAプローブは、少なくとも17ヌクレオチドから成る既知ヌクレオチド配列のDNA、例えば合成DNA、目的のポリペプチドをコードするmRNAからのcDNA、又は天然源からもしくは遺伝子操作された微生物から単離された隣接DNA配列を含んで成るゲノムDNA断片である。
合成DNAプローブは、後記のように既知の方法に従って、好ましくは固相ホスホトリエステル法、ホスファイトトリエステル法又はホスホラミダイト法を用いる段階的縮合により例えばホスホトリエステル法によるジヌクレオチドカップリングユニットの縮合により合成される。これらの方法は、Y.Ike（Nucleic Acids Research 11,477,1983）により記載されているように適切な縮合段階での対応するジヌクレオチドカップリングユニット又は保護された形の2,3又は４ヌクレオチドdA,dC,dG及び／又はdTの混合物を用いることにより、目的のオリゴヌクレオチドの混合物を合成するように適合される。
ハイブリダイゼーションのため、DNAプローブは標識される。例えばよく知られているキナーゼ反応により放射能標識される。標識を含有するDNAプローブとサイズ分画されたmRNAとのハイブリダイゼーションは既知の方法に従って、すなわち緩衝液、及び助剤、例えばカルシウムキレーター、粘度調節剤、蛋白質、ヘテロロガスDNA等を含有する塩溶液中で、選択的ハイブリダイゼーションに好都合な温度、例えば０℃〜80℃、例えば25℃〜50℃又は約65℃、好ましくはハイブリド二本鎖DNAの溶融温度より約20℃低い温度において行われる。
分画されたmRNAは、細胞、例えばカエル細胞中で、又は無細胞系、例えば網状赤血球溶解物又は小麦胚芽抽出物系において翻訳され得る。得られたポリペプチドは、酵素活性について、又は生来のポリペプチドに対して生じた抗体との反応について、例えばイムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ又は蛍光マーカーを用いるイムノアッセイにおいてスクリーニングされる。これらのイムノアッセイ並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の製造方法は当業界においてよく知られており、そしてそれ故に適用される。
選択されたmRNA鋳型からの単鎖相補的DNA（cDNA）の調製は当業界においてよく知られており、単鎖DNAからの二本鎖DNAの調製も同様である。mRNA鋳型は、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、場合によっては放射能標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート（反応の結果をスクリーニングできるようにするため）、プライマー配列、例えばmRNAのポリ（Ａ）テイルとハイブリダイズするオリゴdT残基、及び適当な酵素、例えばトリ骨髄芽球溶解ウイルス（avianmyeloblastosis vivus:AMV）からの逆転写酵素、の混合物と同にインキュベートする。例えばアルカリ加水分解による鋳型mRNAの分解の後、cDNAをデオキシヌクレオシドトリホスフェート及び適当な酵素との混合物と共にインキュベートして二本鎖DNAを得る。適当な酵素は例えば、逆転写酵素、大腸菌DNAポリメラーゼＩのKlenow断片又はT4 DNAポリメラーゼである。通常、単鎖cDNAにより自然に形成されるヘアーピンループ構造が第二鎖の合成のためのプライマーとして作用する。このヘアーピン構造はS1ヌクレアーゼによる消化によって除去される。あるいは、mRNA鋳型の加水分解に先立って単鎖DNAの３′−末端がまずホモポリマーデオキシヌクレオチドテイルにより延長され、そして次に第二cDNA鎖が合成される。
あるいは、cDNAライブラリーから二本鎖cDNAが単離されそして目的cDNAについてスクリーニングされる（段階ｃ）。このcDNAライブラリーは、適当な細胞からmRNAを単離し、そしてそこから前記のようにして単鎖及び二本鎖cDNAを調製することにより作製される。このcDNAは適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化され、そして確立されている方法に従ってλファージ、例えばλシャロン4A又はλgt11に導入される。ニトロセルロース膜上に複製されたcDNAライブラリーは、上記のDNAプローブを用いてスクリーニングされ、あるいは適当な発現系により発現されそして得られたポリペプチドが目的化合物に対して特異的な抗体との反応についてスクリーニングされる。
二本鎖cDNA又はゲノムDNAを適当な宿主に導入する（段階ｄ）のための種々の方法が当業界において知られている。例えば、対応するデオキシヌクレオシドトリホスフェート及び酵素、例えばターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下で二本鎖DNA及びベクターDNAの両者に相補的ホモポリマートラクトを付加する。次に、相補的ホモポリマーテイル間の塩基対合によりベクター及び二本鎖DNAを連結し、そして最後に、リガーゼのごとき特異的連結酵素により結合させる。他の可能性は、平滑末端連結又は接着末端連結による、二本鎖DNAの末端への合成リンカーの付加又はベクターへの二本鎖DNAの導入である。適当なベクターは後で詳細に記載する。
得られたハイブリドベクターによる適当な宿主細胞の形質転換（段階ｅ）並びに形質転換された宿主細胞の選択及び増加（段階ｆ）は当業界においてよく知られている。これらの方法の例を後に記載する。ハイブリドベクター及び宿主細胞はDNAの製造、又は目的ポリペプチドの製造のために特に適当なものであることができる。
本発明に従う目的DNA、変異体及びその断片の単離は当業界において知られている方法、例えばフェノール及び／又はクロロホルムにより抽出により行われる。場合によっては、変異体を得るための変異剤による処理、又は断片を得、ベクターへの導入を容易にするために一方又は両方の末端を変更し、逆転配列を除去する、等のための制限酵素による消化、によりDNAをさらに操作することができる。
本発明のDNAのヌクレオチド配列は、それ自体既知の方法により、例えば末端標識DNAを用いるMaxam−Gilbert法又はSangerのジデオキシ・チェイン・ターミネーション法により決定することができる。
本発明のPG遺伝子配列はまた、常法によるインビトロ合成により製造することができる。インビトロ合成は特に、PG発現カセットのより小さい断片、例えば、前記のDNA分子特にλ−シャロン中に含まれるPG遺伝子の例えば、PG I,PG II又はpgaＣ遺伝子のプロモーター又はシグナルペプチドあるいはその変異体をコードするPG遺伝子のDNA配列の調製のために特に適当である。
DNAの合成のための適当な方法はS.A.Narang（Tetrahedron 39,3,1983）により要約の形で提示されている。既知の合成技法は、120塩基までの長さのポリヌクレオチドの良好な収率での、高純度での且つ比較的短時間での調製を可能にする。適切に保護されたヌクレオチドはホスホジエステル法（K.L.Agarwalら、Angew,Chemie 84,489,1972）、より効率的なホスホトリエステル法（C.B.Reese,Tetrahedron 34,3143,1972）、ホスファイトトリエステル法（R.L.Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.98,3655,1976）、又はホスホラミダイト法（S.L.Beaucage及びM.H.Carruthers,Tetrahedron 22,1859,1981）により相互に連結される。ヌクレオチド鎖が適当なポリマーに結合される固相法によりオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの合成の簡素化が可能にされる。H.Rinkら（Nucl.Acids Research 12,6369,1984）は個々のヌクレオチドの代りにトリヌクレオチドを用い、そしてそれらを固相合成においてホスホトリエステル法により連結している。こうして、ポリヌクレオチドを短時間に高収量で得ることができる。実際の二本鎖DNAは両DNA鎖からの化学的に調製されたオーバーラップするオリゴヌクレオチドから酵素的に組立てられ、この場合それらは塩基対合により正しい配置で一緒に保持されそして次に酵素DNAリガーゼにより化学的に連結される。
もう一つの可能性は、２つのDNA鎖からのオーバーラップする単一オリゴヌクレオチドを、必要な四種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、DNAポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩのKlenow断片、又はT4 DNAポリメラーゼ、又はAMV（トリ骨髄芽球溶解ウイルス）逆転写酵素と共にインキュベートすることを含んで成る。これにより、二本のオリゴヌクレオチドが塩基対合によって正しい配置で一緒に保持され、そして必要なヌクレオチドが酵素により補充されて完全な二本鎖DNAが得られる（S.A.Narangら、Anal.Biochem.121,356,1982）。
次に、ゲノムライブラリーからの本発明の組換えDNA分子の調製並びにPG遺伝子群の構成員を同定するためのホモロガス及びヘテロロガスハイブリダイゼーション条件をさらに詳細に記載する。
ゲノムライブラリーは、例えば、A.ニガー株例えばNW756又はN400のゲノムDNAを例えばSau3A I又はMbo Iにより部分消化し、そして高分子量DNA断片を適当なベクター、例えば大腸菌プラスミドpUN 121又はλベクター、例えばEMBL4にクローニングすることにより調製することができる。
所望のPGを生産する他の真菌株、例えばアスペルギルス・スペシス、例えばA.ジャポニクス、A.オリゼー、A.ニドランス、A.キガー、トリコデルス・スペシス、ボトリチス・スペシス、スクレロチニア・スペシス（Sclero tinia spec.）、フザリウム・スペシス又は他の植物病原真菌、並びに酵母、例えばPG生産性クルイベロミセス・スペシス、例えば、K.フラギリスがゲノムライブラリー源として役立つことができ、そして他の適当なベクター、例えば前に記載したものが断片のための受容体（recipient）として使用され得る。
PG類をコードするDNA配列についてゲノムライブラリーを好結果にスクリーニングするためにはハイブリダイズするDNAプローブが必要である。目的のPGのアミノ酸配列又はその部分が知られていればそれは合成DNAであることができ、あるいは目的のPG遺伝子にハイブリダイズする他のPG遺伝子又はその部分であることができる。本発明の前に、PG配列及びPG遺伝子又はその部分のいずれも知られていなかったので、PGの精製、PGのＮ−末端配列の決定及び有用なDNAプローブの調製の問題がまず解決された。
本発明のPG類の精製のため、それを含有する任意の入手源を用いることができる。例えば、粗原料、例えばアスペルギルス・ニガーから得られる酵素混合物、例えば市販のペクチン分解酵素混合物であるラピダーゼ（Rapidase）（商標）が原料として役立つ。
精製は常用の精製法、例えば塩析、脱塩、異る塩の形成における再沈澱、クロマトグラフィー、例えば架橋アルギン酸上でのアフィニティークロマトグラフィー、例えばDEAE−セファデックス（Sephadex）又はセファロース（Sepharose）カラム上でのイオン交換クロマトグラフィー、例えばセファクリル（Sephacryl）カラム上でのゲル浸透クロマトグラフィー、例えばSDS−ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動、等電点沈澱等、又はこれらの組合わせに従う。
本発明においては、ラピダーゼ（Rapidase）（商標）からPG I,PG II,PG III A,PG III B、及びPG IVから単離された。前記PG類は次の理化学的性質を有するエンド−ポリガラクチュロナーゼ（E.C.3,2,1,15）である。PG Iは分子量55K、等電点（IEP）3.2〜3.5、及び酵素活性のための最適pH4.9を有する。PG IIの値は、分子量38K、IEP4.6〜5.9、最適pH4.8であり;PG III Aは、分子量57K、IEP3.3、及び最適pH4.3を有し;PG III Bは、分子量57K、IEP3.3、及び最適pH4.5を有する。最後に、PG IVは分子量59K、IEP3.7及び最適pH4.8を有する。分子量はSDS−ポリアクリルアミドゲルにより決定されたものであり、IEPは薄層等電点沈澱による。
PG IのＮ−末端配列決定は次の配列：
Figure 0003576549
を示した。PG Iの21kDaのBrCN−断片のＮ−末端配列決定は次の配列：
Figure 0003576549
すなわち、PG IのＮ−末端配列を示し、そして5.5kDaのBrCN−断片の配列決定は、次の配列：
Figure 0003576549
を示した。
PG IIのＮ−末端配列決定は次の配列：
Figure 0003576549
を示し、そして17kDaのBrCN−断片の配列決定は次の配列：
Figure 0003576549
を示した。
配列中のX3及びX4はその当時同定されなかった。
PG Iの5.5kDaのBrCN−断片のアミノ酸配列に基いて、次のオリゴヌクレオチド混合物を合成した。
Figure 0003576549
PG IIの17kDaのBrCN−断片のアミノ酸配列に基いて次の２種類のオリゴヌクレオチド混合物を合成した。
Figure 0003576549
上記オリゴヌクレオチド配列において、Ｉはイノシンであり、R1はＴ又はＣであり、R2はＡ又はＧであり、そしてR3はT,G又はＡである。
上記混合物を放射能標識し、そしてアスペルギルス・ニガーN400のゲノムライブラリーをそれぞれPG I遺伝子及びPG II遺伝子についてスクリーニングするために使用した。
次に、同定された遺伝子及び遺伝子断片を常法に従って配列決定する。A.ニガーN400のPG I遺伝子及びPG II遺伝子の配列を、それぞれ配列番号（SEQ ID No.）１及び配列番号（SEQ ID No.）２の配列として配列表に示す。
スクリーニング目的のため、DNAプローブは、当業界において知られている方法により、例えば、使用されるプローブのタイプに依存してγ32P−ATPとT4キナーゼ、又はα32P−dATPと大腸菌ポリメラーゼＩを用いて標識される。本発明の核酸を挿入部として担持する宿主微生物は遺伝子ライブラリーのフィルターレプリカ上で、標識されたDNAプローブとのハイブリダイゼーションにより同定される。
１又は複数のDNAプローブに対してハイブリダイゼーション応答を示すクローンを単離しそして増幅する。
使用されるハイブリダイゼーション条件は常用のものであり幾分ストリンジエントであることができる。
ストリンジエント条件は、高度な相同性を有するDNA配列のみがハイブリダイズし得るようなもの（「ホモロガス」（homologous）ハイブリダイゼーション条件）である。「ヘテロロガス（heterologous）又は低ストリンジエント条件下では低度の相同性を有する関連するDNA配列をもハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジエンシーは、例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄温度、ホルムアミド又は塩の濃度、DNAのＧ＋Ｃ含量、ハイブリダイゼーション時間の長さ及びDNAプローブの長さにより影響される。限定的ではなく例示として「ホモロガス」及び「ヘテロロガス」ハイブリダイゼーション条件を実施例において記載する。
PG I又はPG II遺伝子由来の１又は複数のDNAプローブ、特にそのコード領域の少なくとも部分を含んで成るものを用いて、例えばA.ニガーの、好ましくはA.ニガーN400又はA.ニガーNW756のゲノムライブラリー由来のハイブリダイズするクローンを同定することができ、そして相同性の程度及び観察されるハイブリダイズする制限断片に基いて、異るクラスに分けることができる。A.ニガーN400ライブラリーに由来する好ましいクローンの例は、λPG−A9,λPG−A10,λPG−A43,λPG−B4,λPG−B35,λPG−B36,λPG−C1,λPG−C16,λPG−C20,λPG−C37,λPG−D8,λPG−D11,λPG−D12,λPG−E6,λPG−E38,λPG−F5,λPG−G17,λPG−G27,λPG−X31及びλPG−X33である。これらの調製は実施例において詳細に記載する。A.ニガーNW756に由来する好ましいクローンの例はプラスミドpGW1756である。
これらのクローン並びにプラスミドpGW1800,pGW1803,pGW1900,pGW1902及びpGW1910を用いて本発明の他の組換えDNA分子、特にこれらに含まれるPG遺伝子配列の断片を含有するものを調製することができる。この様な他の組換えDNA分子は常法に従って、常用の制限酵素、リンカー、連結、増幅及び単離法を用いて調製される。好ましくは、原核性もしくは真核性ベクター又は原核細胞及び真核細胞の両者において増加するためのシャトルベクターである発現ベクターが調製される。この様なシャトルベクターの例は当業界においてよく知られている。発現ベクターは同種性又は異種性遺伝子を含有することができる。この様の遺伝子の例は後で記載する。
本発明の組換えDNA分子の挿入部又はその断片は常法により、例えば組換えDNAを適当な制限酵素により開裂せしめそして所望のDNA断片をアガロースゲル電気泳動により単離した後に得ることができる。
新たな制限部位を含む本発明の特にPG遺伝子のDNA分子の変異体はまた常法による部位特定変異誘導によりインビトロで調製することができる〔M.J.Zolleu及びM.Smith,Mothods Enzymol.100,468（1983）の総説;D.Botstein及びD.Shortle,Science 229,1193（1985）；又はK.Norrisら、Nucl.Acids Res.11,5103（1983）を参照のこと〕。
本発明はまた、構造遺伝子の発現のためのハイブリドベクターの製造のための本発明の組換えDNA分子の使用に関する。
形質転換された宿主
さらに、本発明は、本発明の組換えDNA分子を増幅するため、特に本発明の組換えDNA分子中に含まれる発現カセットを発現させるための形質転換された宿主細胞に関する。
特に本発明の組換えDNA分子の増幅のために適当な宿主の例には、制限酵素又は修飾酵素が欠けているか又は少ない微生物、例えば細菌、特に大腸菌の株、例えばE.コリ（E. coli）X1776、E.コリY1090、E.コリW3110、E.コリHB101/LM1035、E.コリJA221、E.コリDH5α、又は好ましくはE.コリDH5αＦ′,JM109,MH1もしくはHB101、又はE.コリK12株、バシルス・ズブチリス（Bacillus s ubtilis）、バシルス・ステアロサーモフィルス（Bacil lus stearothermophilus）、シュードモナス（Pseadom onas）、ヘモフィルス（Heamophilus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）等、及び酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisia e）、例えばS.セレビシエーGRF18である。更なる適当な宿主細胞は高等生物の細胞、特に樹立された永続ヒト又は動物セルライン、例えばヒト胎児肺繊維芽細胞L132、ヒト性黒色腫Bowes細胞、HeLa細胞、アフリカミドリザルのSV400ウイルスで形質転換された腎細胞COS−７、又はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である。
本発明の発現カセットの発現のために適当な宿主の例は前記の細胞、そして特に糸状真菌、例えばペニシリウム（Penicillium）、セファロスポリウム（Cephalospor ium）又は好ましくはアスペルギルス・スペシス、例えばA.カルボナリウム（A. carbonarium）、A.アワモリ又は好ましくはA.ニガー、A.ニドランスもしくはA.オリゼーである。
好ましく形質転換された宿主はpGW1800もしくはpGW1803により形質転換されたE.コリMH1,pGW1800もしくはpGW1803により形質転換されたE.コリJM109,pGW1900,1902,1756もしくは1910,pG II−IFN AM119又はpG II SS−IFN AM119により形質転換されたE.コリDH5αＦ′、又はpG II−IFN AM119もしくはpG II SS−IFN AM119及び場合によっては選択マーカープラスミドpCG59D7により形質転換されたアスペルギルス・ニガーAn8もしくはN593又はアスペルギルス・ニドランスである。
本発明はまた、この様は形質転換体の製造方法に関し、この方法は適当な宿主細胞を形質転換条件下で本発明の組換えDNA分子、特に本発明のハイブリドベクターにより、場合によっては選択マーカー遺伝子と一緒に処理し、そして場合によっては形質転換体を選択する、ことを含んで成る。
微生物の形質転換は文献に記載されているように常法に従って、例えばS.セレビシエー（A.Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929,1978）、B.ズブチリス（Anagnostopoulouら、J.Bacteriol,81,741,1961）、及び大腸菌（M.Mandelら、J.Mol.Biol.53,159,1970）について記載されているようにして行われる。
従って、大腸菌の形質転換法は、例えば、DNAの取込みを可能にするためのCa2+による細胞の処理、及びハイブリドベクターとのインキュベーションを含む。形質転換された細胞の次の選択は例えばベクターDNAのマーカー配列の性質に依存して親細胞からの形質転換細胞の分離を可能にする選択増殖培地への細胞の移送によって達成することができる。好ましくは、ベクターを含有しない細胞の増殖を許容しない増殖培地が使用される。酵母の形質転換は、例えば、グリコシダーゼによる酵母細胞壁の酵素的除去の段階、ポリエチレングリコール及びCa2+の存在下でのベクターによる得られたスフェロプラストの処理、並びに寒天へのスフェロプラストの封埋による細胞壁の再生を含む。好ましくは、再生寒天は、上記の形質転換された細胞の再生と選択を同時に可能にするように調製される。
高等真核細胞、例えば哺乳類セルラインの形質転換は好ましくはトランスフェクションにより行われる。トランスフェクションは常用技法により、例えばリン酸カルシウム沈澱、マイクロインゼクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、すなわち細胞膜の透過性を一時的に増加せしめる短い電気パルスによるDNAの導入により、又はヘルパー化合物、例えばジエチルアミノエチルギキストラン、ジメチルスルホキシド、グリセロールもしくはポリエチレングリコール等の存在下で行われる。トランスフェクション法の後、選択マーカーの性質に依存して選択される選択培地、例えば対応する抗生物質を含有する標準的培養培地、例えばダルベコの改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle medium;DMEM）、最少必須培地、RPMI1640培地等での培養により同定されそして選択される。
培地は好ましくは、選択圧を生じさせそして形質転換されなかったか又はハイブリドベクターを失った細胞の増殖を防止するように選択される。すなわち、例えば、ハイブリドベクターがマーカーとして抗生物質耐性遺伝子を含有する場合には抗生物質が培地に添加される。例えば、必須アミノ酸について栄養要求性がある宿主細胞が使用され、ハイブリドベクターが宿主の欠陥を補完する酵素をコードする遺伝子を含有している場合、形質転換された細胞を培養するために該アミノ酸を欠く最少培地が使用される。
高等真核生物の細胞、例えば哺乳類細胞は、場合によっては増殖促進物質及び／又は哺乳類血清が補完された市販の培地、例えばダルベコ改変イーグル培地（DMEM）、最少必須培地、RPMI1640培地等を用いて組織培養条件下で培養される。組織培養条件下での細胞培養の技法は当業界においてよく知られており、そして、これには例えば、エアーリフト反応器もしくは連続撹拌反応器中での均一懸濁培養、又は中空繊維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上、多孔性ガラスビーズ上、セラミックカートリッジ上又は他のマイクロキャリヤー上での固定化もしくは捕捉細胞培養が包含される。
培養は当業界において知られている方法により行われる。培養条件例えば温度、培地のpH値、及び発酵時間は、本発明のポリペプチド又は誘導体の最大力価が得られるように選択される。すなわち、大腸菌又は酵母株は好ましくは好気的条件下液中培養により、振とう又は撹拌を行いながら約20℃〜40℃の温度にて、好ましくは約30℃及び４〜８のpH値、好ましくは約pH7にて、約４〜30時間、好ましくは本発明のポリペプチド又は誘導体の最大収量が達成されるまで培養される。
非形質転換細胞からの形質転換細胞の選択を可能にするため、本発明のDNA分子は選択マーカーを含有し、あるいは、そのようなマーカーを含有する第二のベクターにより細胞が同時形質転換される。他の系におけるのと同様に、この様な選択マーカーは発現可能な構造遺伝子であり、該遺伝子の発現されたポリペプチド（酵素）が受容生物に対して毒性の化合物に対する耐性を提供し、又は該遺伝子はそのような必須ポリペプチドを欠く変異株の酵素系を完全なものにする。形質転換された糸状真菌細胞の選択のために適当なこれらのマーカー遺伝子は例えば既知のqa−２，pyrG,pyr4,trpC,amdS又はargB遺伝子である。
EP278,355に記載されているように、pyrAと称するマーカー遺伝子は、酵素オロチジン５′−ホスフェートデカルボキシラーゼを生産する、A.ニドランスのpyrＧ及びN.クラッサのpyr4に関連しておりそして類似の機能を有するものであり、A.ニガーのゲノムライブラリーから単離されたものである。この酵素はオロチジン５′−ホスフェートのウリジル酸（ウリジン５′−ホスフェート）への脱カルボキシル化及びフルオロ−オロチン酸の毒性フルオロ−ウリジンへの脱カルボキシル化を触媒する。pyrA遺伝子を含有する大腸菌クローンが、pyr4遺伝子の部分を含有するpDJB2（参考文献25）の1.1kb Hind III断片とのハイブリダイゼーションによって同定された。しかしながら、オロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼをコードする他の任意のpyr遺伝子を使用することができる。E.コリB75183/pCG59D7と称する陽性クローンから、pyrA遺伝子を含んで成るプラスミドpCG59D7が単離され、そしてA.ニガーpyrA-変異株の同時形質転換のために使用された。この様なpyrA-変異株はオロチジン５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ遺伝子に欠陥を有し、そしてそれ故に対応する酵素を生産することができない。この変異株は、A.ニガーN756の分生胞子を変異性UV−照射のもとで処理し、そしてフルオロオロチン酸及びウリジンの存在下で生存するコロニーを選択することにより調製された。フルオロオロチン酸の存在下及びウリジンの非存在下で生存するコロニーは除去される。残ったウリジン要求変異株は、形質転換可能性についてのその能力によって２つの相補群pyrＡ及びp yrＢに属し、それぞれ変異株An8及びAn10により代表される。これらをそのプロトプラストの形で形質転換条件下でpyrＡ含有プラスミドpCG59D7により処理する。An8コロニーのみが形質転換されそしてpyrＡ遺伝子を含有することが見出された。これはその消化されたDNAとpUN121のDNAとのハイブリダイゼーションにより証明された。
ポリペプチドの製造
本発明はさらに、ポリペプチドの製造方法に関し、この方法は本発明の発現カセットに挿入された前記の意味における同種又は異種構造遺伝子が適当な形質転換された宿主中で常法に従って発現されることを特徴とする。必要な場合、ポリペプチドが常法に従って単離される。発現カセットの構成に依存して、生成物が生産されるか、あるいはシグナル配列が存在する場合には生産されそして分泌される。通常、発現カセットはハイブリドベクター中に含まれ、しかしまた形質転換後宿主のゲノムに組込まれる場合がある。
同種又は異種構造遺伝子の発現のために本発明のPG遺伝子由来のプロモーター又は糸状真菌由来の他のプロモーターが使用される場合、適当な宿主は例えば真菌、例えば糸状真菌、特にアスペルギルスの株である。しかしながら、他のプロモーター、例えば原核生物又は高等真核生物由来のプロモーターが使用される場合、他の宿主、例えば細菌、例えば大腸菌、又は他の真核細胞がそれぞれ適当である。
A.ニガーのPG遺伝子のプロモーターはA.ニガー細胞中で誘導的である。すなわち、それに連結された構造遺伝子、例えばPG又は任意の外来遺伝子をコードする構造遺伝子は培地へのペクチン又はペクチン分解生成物の添加によって誘導される。しかしながら、A.ニガーの株、例えばAn8又はN593が宿主として使用される場合、十分なグルコースの存在下ではプロモーターは誘導されない。このことは、A.ニガーPGプロモーターの制御下にある遺伝子はA.ニガー中では「カタボライト抑制」されている、ことを意味する。しかしながら、他のアスペルギルスの株、好ましくはA.オリゼー又は最も好ましくはA.ニドランスが使用される場合、A.ニガーPGプロモーターの制御のもとにある遺伝子は構成的に発現される。すなわち、ペクチンの非存在下及び／又はグルコースの存在下でも発現される。従って、アスペルギルス・ニガーPGプロモーターの制御のもとにある遺伝子をA.ニガー以外のアスペルギルス宿主、好ましくはA.オリゼー、そして最も好ましくはA.ニドランスにおいて発現させるのが有利である。なぜなら、例えば、目的遺伝子の発現中にエネルギー源及び炭素源としてペクチンではなくグルコースを栄養培地に加えることができるからである。
本発明のPG遺伝子に由来しないプロモーターが、例えばPGをコードする構造遺伝子を含んで成る本発明の発現カセットの作製において使用される場合、発現宿主として他の宿主を用いることができる。適当な宿主は使用されるプロモーターに依存し、そして例えば細菌、例えば大腸菌、又は酵母、例えばS.セレビシエー又はクレイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）である。本発明のポリペプチドの製造のために適当な宿主及びプロモーターはまた、前記の形質転換のためにも適当である。
今や１又は複数の目的PGを過剰発現せしめることが可能であり、このために種々の方法を用いることができる。純粋な単一PGはPGを含有するペクチン分解酵素混合物を常用の精製法にかけることにより製造することができる。単一PG、主としてPG I,PG II又はpgaＣ遺伝子の生成物の製造のための他の方法は、いかなるPGも発現することができず、又はPGを少量発現し、又は導入されたPG遺伝子のために用いられる誘導条件下でPGを発現しない適当な宿主を、PG、例えばPG I,PG IIもしくはpgaC遺伝子生成物、又はPG活性を有するPGの断片をコードする構造遺伝子を含んで成るハイブリドベクターにより形質転換し、そして該構造遺伝子を発現させることを特徴とする。いかなるPGも発現することができない宿主が使用される場合、対応する単一PGを純粋な形で得ることができ、これは他のPGにより汚染されないことを意味する。単一ではなく二以上の目的とするPG遺伝子を場合によっては他の酵素をコードする遺伝子と共に、形質転換された宿主中で発現させることにより、PGの所望の混合物を場合によっては他の酵素と一緒に製造することができる。所定の混合物はまた、PG及び／又は他の酵素、例えばペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、セルラーゼ、混合エンドグルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、α−及びβ−グリディシダーゼ（glycodidase）等のための１又は複数の目的とする遺伝子を、１つの宿主株中で、場合によっては酵素生産のある種のバックグラウンドを有する宿主中で、発現せしめることによっても製造することができる。
本発明の単離されたPG遺伝子を用いて、当業界でよく知られている技法である「遺伝子分裂」（genedisruption）により宿主中で特定のPG遺伝子を分裂させることにより、酵素の所定の混合物を得ることができる。
PGも発現することができない宿主は、対応する遺伝子を有しない微生物、例えばPG-アスペルギルス株、他のPG-非−アスペルギルス真菌、又は他のPG-真核性又は原核性細胞であるか、あるいは、アスペルギルスの株、例えばA.オリゼー又はA.ニドランスであって、その内因性PG遺伝子の発現が適切に制限された増殖培地中で抑制され、例えば「カタボライト抑制」され（catabolite repressed）そして／又は誘導されず、他方目的のPG構造遺伝子に作用可能に連結された外来PGプロモーター、例えばA.ニガー由来プロモーターがこれらの条件下で活性であるか又はPG遺伝子が他のプロモーターと融合しているようなものである。
PGの製造のための他のプロモーター及び株は、発現カセットの説明において前に記載したものと同じである。
ポリペプチド及び組成物
ペクチン分解酵素混合物から、好ましくはアスペルギルス・ニガー由来のペクチン分解酵素混合物から特にラピダーゼ（Rapidase）（商標）から精製された単一PG、並びに本発明のDNA配列によりコードされたPG及びPG活性を有するその誘導体、特にそのようなPG又はPG活性を有するその誘導体をコードする発現ハイブリドベクターにより形質転換された適切な宿主において生産されたもの、及び生理的に許容されるその塩も本発明の対象である。アスペルギルス・ニガーの純粋な形のPG I,PG II,PG III A,PG III B及びPG IVが特に好ましい。本発明に、本発明の方法により製造された前記ポリペプチドに関する。
本発明はまた、この様な単一PG及び／又はPG活性を有するその誘導体及び／又は生物学的に許容されるその塩の１つ又は複数を、場合によってはPG活性以外の活性を有する１又は複数の適当な酵素との所定の組合わせにおいて含んで成る酵素組成物に関する。
前記酵素組成物の製造のために適当なPG活性以外の活性を有する酵素は植物細胞壁ポリマーを分解又は修飾するものである。この様な酵素は例えばペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、セルラーゼ、混合エンド−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、α−及びβ−グリディダーゼ等である。
本発明はさらに、常法により前記酵素組成物の製造に関する。
前記単一PG及び／又はPG活性を有するその誘導体及び／又は前記酵素組成物の植物材料加工における使用も本発明の対象である。
本発明の単一PG及び／又はPG活性を有するその誘導体又はこのようなPGもしくは誘導体を含んで成る酵素組成物は、例えば、野菜又は果物ジュースの清澄化、野菜又は果物ジュース製造におけるジュース収率の増強、含油種子又は果実の圧搾収率の増強、野菜又は果物ジュースの安定化、野菜又は果物ジュースの粘度の低下、バイオマスの液化、軟化（maceration）、天然色素、香料及び味料のごとき天然産物の抽出の強化、バイオマス、食品又は飼料の安定化（valorization）、純パルプ製造におけるセルロース繊維の回収の改良、等のために有用である。
本発明の最良の形態を後の実施例において記載する。
以後に記載する実施例は本発明を説明するものであって、本発明をなんら制限するものではない。
略号は次の意味を有する。
Amp アンピシリン
bis Tris
ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ−tris（ヒドロキシメチル）メタン
BSA ウシ血清アルブミン
DTT 1,4−ジチオスレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩
IPTG イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
kbp キロ塩基対
PEG ポリエチレングリコール
PTH フェニルチオヒダントイン
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
Tet テトラサイクリン
TFA トリフルオロ酢酸
TP トリプシン分解ペプチド
Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｘ−gal ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド
緩衝液、培地、試薬
SM 100mM NaCl、8.1mM MgSO4、50mM Tris−HCl（pH7.5）、0.01％ゼラチン
LB １％トリプチカーゼペプトン（BBL）、0.5％酵母エキス（BBL）、１％NaCl及び0.5mM Tris−HCl（pH7.5）
LM １％トリプチカーゼペプトン、0.5％酵母エキス（BBL）、10mM NaCl及び10mM MgCl2
PBS H2O 1l当り0.37g NaH2PO4、2.7g Na2HPO4、8.5g NaCl
SSC 0.15M NaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウム
PSB 10mM Tris−HCl（pH7.6）、100mM NaCl、10mM MgCl2、0.05％（w/v）ゼラチン
TE 10mM Tris−HCl（pH8.0）、0.1mM EDTA（pH8.0）
最少培地
1l当り1.5g KH2PO4、0.5g KCl、0.5g MgSO4・7H2O、0.9mg ZnSO4・7H2O、0.2mg MnCl2・4H2O、0.06mg CoCl2・6H2O、0.06mg CuSO4・5H2O、0.29mg CaCl2・62H2O、0.2mg FeSO4・7H2O、テキストに記載されている窒素源及び炭素源又は6g NaNO3、及び10gグルコース（これらの源が明示的に示されていない場合）、NaOHによりpH6.0に調整
完全培地
l当り6gのNaNO3及び10gのグルコースを含有する最少培地＋ｌ当り2gトリプチカーゼペプトン（BBL）、1gカザミノ酸（ディフコ）、1g酵母エキス（BBL）、0.5g酵母からのリボ核酸ナトリウム塩（ICN,leveland、米国）、2mlビタミン溶液、NaOHによりpH6.0に調整
ビタミン溶液
100ml当り10mgチアミン、100mgリボフラビン、10mgパントテン酸、2mgビオチン、10mg p−アミノ安息香酸、100mgニコチンアミド、50mgピリドキシン−HCl
TBE 1l当り4mlの0.5M EDTA溶液（pH8.0）、10.8g Tris及び5.5g H2BO3
フェノール
Maniatisら（参考文献6,438頁）により記載されているようにして処理したフェノール
サンプル緩衝液
10％（v/v）グリセロール、100mM EDTA（pH8.0）及び0.01％ブロモフェノールブルー
RNアーゼＡ
Maniatisら（参考文献6,451頁）により記載されているようにして処理したRNアーゼＡ
下記の菌株を使用する：
A.ニガーN400
野生型
A.ニガーN402
cspＡ
A.ニガーNW756
高ペクチナーゼ生産株
A.ニガーN756
高ペクチナーゼ生産株
A.ニガーAn8
DSM3917、ペクチナーゼ複合体高生産性株A.ニガーN756のウリジン要求変異体
A.ニガーN593
cspA,pyrＡ
大腸菌NM539
metB,supE,hsdM+,hsdR-,supF,（P2cox3）
大腸菌LE392
F-,hsdR514（rk-,mk+），supE44,supF58,lacY1,又は（lac1ZY）6,galK2,galT22,metB1,trpR55,λ−
大腸菌DH5αＦ′
F′，endA1,hsdR17,（rk -,mk +），supE44,thi−1,recA1,gyrA,relA1,）80φlacZM15,Δ（lacZYA−argＦ）U169,λ−
大腸菌JM109
endA1,recA1,gyrA96,thi，hsdR17（rk-,mk+），relA1,supE44,λ-,（lac−proAB），〔Ｆ′，traD36,proAB,laclqZM15〕
大腸菌JM110
rpsL,thr，leu，thi，lacY,galT,ara，tonA,t sx，dam，dcm，supE44,（lac−proAB），〔Ｆ′，traD36,proAB,laclqZM15〕
下記のベクターを使用する：
pGW613
このベクターはGoosenら（参考文献13）により記載されている。
M13mpファージ
M13mp18及びM13mp19ベクター（Norranderら、文献24）は単鎖DNAバクテリオファージM13の誘導体であり、多才なポリリンカー部位における種々のDNA断片のクローニング及び同じ制限断片の可能な両方向でのクローニンを可能にすることによりDNAの配列決定を促進するように設計されている。これらのベクターにクローン化された配列は、標準的オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー及び大腸菌DNAポリメラーゼＩのKlenow断片を用いる単鎖プローブの製造又は配列決定反応のための鋳型として容易に使用することができる。ベクターDNAは大腸菌lac−オペロンプロモーター及びβ−ガラクトシダーゼの最初の145アミノ酸の遺伝情報を担持している。多数制限部位を含有するポリリンカー配列がlacZ配列に挿入されている。該ポリリンカーはlacZリーディングフレームを維持しており、そして該ベクターはLacZa宿主株の対立遺伝子相補性を提供し、IPTG及びＸ−galを含有するプレート上で青色プラークをもたらす。リーディングフレームを破壊するか又はそれとは別にlacZaペプチドの発現を妨害する挿入部を含有する組換えファージは無色のプラークとして示される。
pGW635
このプラスミドはpGW613の短い変形体である。このものはpyrＡ遺伝子を含有している。これはGoosonら（参考文献42）により記載されている。
EMBL4
EMBL4は、９〜24kbpのクローニング容量を有するλ組換えベクターである（Frischaufら、参考文献９）。このものは、λアームと非−必須スタッファー（stuffer）領域との間に多クローニング領域を含有する。これは、外来DNA挿入部が挿入された時にベクターアームへのスタッファーの再連結が低下する様な態様で多数制限酵素消化が達成されることを可能にする。このベクターはまた組換体の直接選択を提供するためにSpiフェノタイプを用いる（Zisslerら、参考文献21）。
pEMBL18及びpEMBL19
これらのプラスミドはDenteら（参考文献10,22及び23）により記載されている。
実施例1. ポリガラクチュロナーゼの単離及び特徴付け
実施例1.1. ポリガラクチュロナーゼI,II,III A,III B 及びIVの精製
後記のようにして得られる酵素画分中の酵素活性は改変フェリシアミド試験（Robytら、参考文献３）を用いて前に記載されている（Rozieら、参考文献２）ようにして決定する。
ポリガラクチュロナーゼI,II,III A,III B及びIVを、アスペルギルス・ニガーから得られるペクチン分解酵素の市販混合物であるラピダーゼ（Rapidase）（商標）（Gist−brocades,
Figure 0003576549
フランス）から精製する。50gの粗酵素粉末（ロット番号K2B078）を190mlの20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.6）に溶解し、25,000×ｇに10分間遠心分離して固形物を除去し、そして同じ緩衝液中で平衡化されたSephadex G−50カラム（５×90cm）上で脱塩する。
精製法の第一段階は、Romboutsら（文献１）に記載されているようにして調製された架橋アルギネートを用いるアフィニティークロマトグラフィー段階である。5.2ml/gのベッドボリウムを有する架橋アルギネートをやはり20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.6）により平衡化する（カラム寸法2.5×30cm）。脱塩された酵素をこのカラムに付加し、そして次にそれぞれpH4.2及びpH5.6の100mM酢酸ナトリウム緩衝液（各400ml）を適用することにより洗浄する。PG I及びPG IIはアルギネートマトリクスに吸着するが、PG III A,III b及びIVは吸着しない。
実施例1.1.1. PG I及びPG IIの精製
吸着されたPG I及びPG II蛋白質を架橋アルギネートカラムから、前に使用された方法（Romboutsら、参考文献１）のわずかに変えた変法である100mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.6）中直線塩化ナトリウムグラジエント（０〜1M）により溶出する。PG IはPG IIと同時に約0.5M NaClにて溶出する。
PG I及びPG IIを含んで成る酵素画分を20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.7）に対して透析し、そして同じ緩衝液中で平衡化されたDEAE−Sephadex A−50カラム（2.5×30cm）に適用する。直線NaClグラジエント（０〜0.6M）を用いて酵素を溶出する。PG Iは約0.3M NaClにて溶出し、PG IIは約0.2Mにて溶出する。PG Iを含有する酵素画分及びPG IIを含有する酵素画分の別々に集め、20mM bis Tris−HCl緩衝液（pH5.8）に対して透析し、そして同じ緩衝液中で平衡化されたDEAE−Sepharose Fast Flowカラム上でクロマトグラフ処理する。NaClグラジエントを適用する際、PG IIは約120mM NaClにて溶出し、PG Iは約250mMにて溶出する。PG I又はPG IIを含有する活性酵素画分を、20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.7）に対して透析した後に、小DEAE−Sepharose Fast Flowカラム（1.6×10cm）上でこの緩衝液中1M NaClにより溶出することによって最終体積20mlに濃縮する。２種類の酵素PG I及びPG IIのそれぞれの最終精製を、0.1M酢酸ナトリウム（pH4.2）中Sephacryl S200（1.6×90cm）上でのゲル浸透クロマトグラフィーにより行う。
PG IIは、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に際して単一バンドを示し、そして38kDaの見かけ分子量を有する。0.075M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）において決定された比活性は2,760U/mg蛋白質である。等電点電気泳動の際、この酵素はわずかな不均一性（microheterogeneity）を示す。約pH5.2における顕著な主成分のほかに、多数の微小バンドがpH4.6〜5.9のpH範囲において観察される。
PG Iもまた、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドを示す。この酵素は55kDaの見かけ分子量を有する。0.075M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）において決定された比活性は550U/mg蛋白質である。等電点電気泳動の際、この酵素もわずかな不均一性を示す。pH3.2〜3.5のpH範囲において数本のバンドが観察される。
実施例1.1.2. PG III A,PG III B及びPG IVの精製
未結合のPG類を含有する架橋アルギネートカラム（実施例1.1.）の流出液を1M水酸化ナトリウムによりpH5.7に調製し、そして0.02M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.7）中で平衡化したDEAE−Sephadex A−50カラム（2.5×30cm）上に付加する。酵素をDEAE−Sephadexカラムから、直線塩化ナトリウムグラジエント（０〜1M）により溶出する。PG IVは0.38M塩化ナトリウムで溶出し、そしてPG III A及びPG III Bは0.5Mで溶出する。
5mlづつの２個の酵素画分を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）中Sephacryl S−200カラム（1.6×90cm）上で脱塩する。活性画分をプールし、蒸留水で４倍に稀釈し、そして0.02M bis−Tris/HCl緩衝液（pH5.8）中で平衡化したMONO Qカラム〔ファルマシア・ファイン・ケミカルス；（Pharmacia Fine Chemicals）、アプラサ（Uppsala）、スエーデン〕に付加する。20mlの直線塩化ナトリウムグラジエント（0.1〜0.4M）を適用する際、PG IVは0.32M塩化ナトリウムにて溶出し、他方PG III A及びPG III Bは0.4M塩化ナトリウムにて溶出する。
両酵素画分を別々に、上記と同じ条件下でMONO Qカラムにより再クロマトグラフ処理する。PG活性を含有する画分をプールし、0.025Mピペラジン/HCl緩衝液（pH6.0）に対して透析し、そして同じ緩衝液中で平衡化したMONO Pカラム（ファルマシア・ファイン・ケミカルス、アプサラ、スエーデン）で付加する。このカラムを10％（v/v）ポリ緩衝液74（ファルマシア・ファイン・ケミカルス、アプサラ、スエーデン）（pH3.0）により0.75ml/mlの流速で溶出する。
0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.2）中で平衡化したTSK SWカラム（0.75×30cm）〔LKB、ブロンマ（Promma）、スエーデン〕上で0.5ml/分の流速でゲル浸透クロマトグラフィーを行うことにより、最終精製を行う。
カラムを、次の蛋白質標準、すなわちウシ血清アルブミン（68kDa）、卵アルブミン（45kDa）及びキモトリプシノーゲンＡ（25kDa）により換算する。
ゲル浸透クロマトグラフィーによりPG IVについて53kDaの見かけ分子量が決定される。PG IVはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の際に単一バンドを示し、そして15％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により決定された見かけ分子量59kDaを有する0.075M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）中で決定された比活性は780U/mg蛋白質である。等電点電気泳動の際、この酵素はpH3.7においてシャープな単一バンドを示す。
PG IVについて記載したのと同じ条件下で、換算されたTSK G 3000 SWカラム上での、PG III A及びPG III Bを含有する活性画分のゲル浸透クロマトグラフィーは、それぞれ見かけ分子量32kDa及び52kDaの２種類の酵素の分離をもたらす。しかしながら、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（15％ポリアクリルアミドゲル）の際、両酵素は57kDaの同じ分子量の単一バンドを示す。0.075M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）中で測定する場合、PG III A及びIII Bはそれぞれ150U/mg蛋白質及び250U/mg蛋白質の比活性を有する。等電点電気泳動の再、両酵素は3.3のpH値においてシャープな単一バンドを示す。
実施例1.2. ポリガラクチュロナーゼ類の性質の比較及 びそれらの免疫学的関連性
50gのラピダーゼ（Rapidase）（Gist−brocades,Seclin、フランス）から出発して５種類のエンドポリガラクチュロナーゼを例1.1.に記載したようにして精製する。これらの精製された酵素の性質を第２表に要約する。
Figure 0003576549
PG IIがより小さい蛋白質（38kDa）と見られるのを除き、すべての精製酵素は15％SDS−ポリアクリルアミドゲル上で55〜59kDaの範囲の見かけ分子量を有する。PG IIの特殊な性質は、他のポリガラクチュロナーゼ類について決定される低い等電点値に対して比較的高い等電点により強調される。すべてのポリガラクチュロナーゼの至適pHは同じ範囲（4.3〜4.9）内にある。
精製されたPG I及びPG IIに対する特異的抗体を、Uitzetter（文献36）により記載されている免疫方式に従って、ニュージーランド・ホワイト・ラビットにおいて生じさせる。これら２つの抗血清と５種類の精製ポリガラクチュロナーゼとの間の交叉反応性を下に要約するようにして観察する。0.4〜1.0μｇの精製蛋白質を10％SDS−ポリアクリルアミドゲル上に付加し、そして電気泳動の後ゲルからニトロセルロース膜に、Bowenら（参考文献37）により記載されている方法により移行せしめた。特異的抗血清とニトロセルロースブロットとのインキュベーション、及びこれに続くパーオキシダーゼ標識ヤギ抗−ラビットIgGによる染色をUitzetter（参考文献36）に従って行う。PG I特異的抗血清とのインキュベーションの後、PG I、並びにPG III A,PG III B及びPG IVについて強いシグナルが見られる。PG IIはこの抗体についてわずかに弱いシグナルを与える。PG II特異的抗血清とブロットとのインキュベーションはPG IIについては高強度のバンドをもたらすが、他の４種類のポリガラクチュロナーゼについては弱いバンドのみをもたらす。
実施例1.3. ポリガラクチュロナーゼIIのシアノゲンブ ロミド断片のアミノ酸配列の決定
約100μｇのPG IIを150μｌの70％蟻酸に溶解し、そして固体シアノゲンブロミドを、メチオニン（酵素分子当り４残基存在する）の負信モル過剰で加える。この反応混合物を24時間室温にて密閉反応バイアル中で撹拌する。24時間後水を加え、そして調製物をN2によりフラッシュする。この段階を反復して蟻酸を除去する。
15％SDS−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の後、クマッシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie Brilliant Blue）により10個の個々のバンドを染色することができる。38kDaの分子量を有する無傷の蛋白質のほかに、33,30,27,19,17,12,10,7.5,6、及び5kDaのバンドが観察される。24時間の反応期間中規則的間隔でサンプルを採取し、そしてそれらをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析することによって、部分反応性成物及び最終反応生成物が現われる順序並びにそれらの相互位置が決定された。17kDa断片は内部断片であり、他方5kDa断片はＣ−末端又はＮ−末端のいずれかに位置する。次に24時間処理の断片を、マツダイラら（参考文献４）により記載されている方法に従って、ポリビニリデンジフルオリド膜（ミリホア）であるImmobilon−Ｐにブロットする。３種の断片、すなわち17kDa中間断片及び２個の小断片（５及び6kDa）を気相配列決定のために使用する。
アミノ酸配列は、アプライド・バイオシステムス120A PTH分析器にオンライン接続されたアプライド・バイオシステムスモデル470A蛋白質配列決定機により決定される。0.5〜1nmoleの特定のペプチドを含有する膜断片を洗浄し、気相配列決定機に付加し、そしてAmons（参考文献５）に記載されたプログラムに従って配列分析にかける。
5kDa断片について下記の配列が得られる。
Figure 0003576549
３位（Ｘ）にはアミノ酸が検出されない。使用した配列決定プログラムは、蛋白質があらかじめＳ−ピリジルエチル化されている場合にのみシステイン残基を検出するから、３位はシステインであろう（Amons、参考文献５）。12位及び13位には痕跡のalaが見出され、これをカッコ内に示す。12位の痕跡は明らかに前段階の不完全な反応から生ずるが、13位のalaはペプチドの13位のアミノ酸alaを示す。
17kDa断片の配列は下記の通りである。
Figure 0003576549
最後の２段階で観察される、カッコを付した痕跡のイソロイシン及びスレオニンは明らかに、前段階の不完全な反応から生じたものである。
実施例1.4. ポリガラクチュロナーゼＩのＮ−末端部分 のアミノ酸配列の決定
実施例1.1.1.に従って精製された100μｇのPG Iをミリポア（Millipre）濾過した水1lに対して３回透析し、そして凍結乾燥する。実施例1.3.に記載したようにしてアミノ酸配列を決定する。この酵素について、下記のアミノ酸配列が決定された。
Figure 0003576549
蛋白質中のシステイン残基は修飾されていないので検出されない。配列の４位（Ｘ）にシステインが存在するようである。PG IのＮ−末端アミノ酸配列は、ラピダーゼから単離されたPG IIの5kDaシアノゲンブロミド断片のアミノ酸配列（実施例1.3.）及びA.ニガー形質転換体N593/pGW1800−27から単離されたPG IIのＮ−末端アミノ酸配列と相同性を示す。この相同性は下記のスキームで要約され、ここではそれぞれPG I配列及びPG II配列の４位及び３位にシステインが存在するものと仮定している。
Figure 0003576549
ポリガラクチュロナーゼII配列中の２位のセリン残基と３位の推定上のシステイン残基との間の空欄は、両配列を並置するために導入される。
PG I配列中の８位セリン残基はPG II配列の対応する位置（７位）に存在しないが、後者の場合には類似タイプのアミノ酸、すなわち小形のヒドロキシアミノ酸（スレオニン）が存在する。
従って、PG I及びPG IIのＮ−末端アミノ酸配列は相同性を示すがしかし同一ではない。この相違は、これらが単一遺伝子の産物の部分的修飾、例えば部分的蛋白質分解的開裂、の結果ではあり得ないようなものである。PG I及びPG IIは同じ類の異る遺伝子によりコードされている。
実施例1.5. ポリガラクチュロナーゼＩのシアノゲンブ ロミド断片のアミノ酸配列決定
約100μｇのPG Iを150μｌの70％蟻酸に溶解し、そして実施例1.3.に記載したようにして固体シアノゲンブロミドを加えて蛋白質の断片を調製する。酵素分子当り４個のメチオニン残基が存在する。15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びクマッシー・ブリリアント・ブルーによる染色の後、39.5,35,21,19.5及び5.5kDaの分子量を有する主バンドが観察される。
実施例1.3.に記載したのと同じ装置及び方法を用いて21kDa及び5.5kDa断片を配列決定する。
21kDa断片のアミノ酸配列は下記の通りである。
Figure 0003576549
実施例1.3.及び1.4.において記載したように、配列の４位（Ｘ）にシステインが存在するであろう。21kDa断片のアミノ酸配列は、実施例1.4.に記載した無傷のPG I蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列と同一である。
5.5kDa断片は次の配列を有する。
Figure 0003576549
これらの配列から、5.5kDa断片はこの蛋白質のＮ−末端に対応しないと結論される。
実施例1.6. トリプシン分解ペプチドのアミノ酸配列決 定
PG IIを0.5％（v/v）蟻酸に対して透析することにより部分的に変性せしめ、そして次に凍結乾燥する。この酵素（1mg）を1mlの0.2M Ｎ−エチルモルホリノ−アセテート緩衝液（pH8.0）中に懸濁し、そして次にPG IIに対して1:50のモル比で添加したトリプシン（シグマ）と共に37℃にてインキュベートする。24時間後、酢酸の添加（最終濃度30％）により消化を停止せしめる。この消化物を凍結乾燥する。この消化物のサンプルを、2.5mMジチオスレイトールを含有する0.1％トリフルオロ酢酸に溶解し、そして37℃にて少なくとも１時間保持する。トリプシン分解ペプチド（100〜200μｇの蛋白質を含有するサンプル100μｌ）を、Nucleosil C−18カラム（4.6×150mm）（Supelco）及びVydacガードカラム（Chrompack）を装着したSpectra Physics SP 8000 HPLCを用いて分離する。カラム温度25℃、流速2ml/分、及び50分間で100％溶剤Ａ（水中0.1％TFA）から50％溶剤Ａ＋50％溶剤Ｂ（アセトニトリル中0.1％TFA）への直線グラジエントを用いる。ペプチドを214nmでのUV吸収により検出する。消化中に後期に放出されるペプチドの１つはこのクロマトグラムにおいて約21％アセトニトリルにて他のピークから良好に分離される。25℃にて乾燥空気でフラッシュすることによりこのペプチドを乾燥し、そして配列決定する。
実施例1.4.に記載した方法によりアミノ酸配列が決定される。次のアミノ酸配列が得られる。
Figure 0003576549
実施例2. アスペルギス・ニガーのゲノムライブラリー の作製
実施例2.1. A.ニガーN400からの高分子DNAの単離
アスペルギルス・ニガーN400株の分生胞子を200mlの最少培地に最終胞子密度が106胞子/mlとなるように接種し、そして1lのエルレンマイヤーフラスコ中で28℃にて24時間、300rpmにてNew Brunswickロータリーシェーカーを用いて振とうする。ミラクロス（Myracloth）を付したブフナー漏斗を用いる濾過により菌糸を収得し、冷無菌塩水で洗浄し、液体窒素中で凍結し、そして−60℃にて貯蔵するか、又はすぐに使用する。ゲノムライブラリーを調製するためにDNAの単離に用いた方法はYeltonら（参考文献18）により記載された方法に基く。
ライブラリーの作製のため、10gの菌糸を1gずつ、ブラウン（Broun）マイクロ−膜破砕機中で液体窒素中で粉砕する。粉砕された菌糸を、200mlの抽出緩衝液〔50mM EDTA（pH8.5）、0.2％SDS〕及び200μｌのジエチルピロカーボネートを含む1lの無菌エルレンマイヤーフラスコに移す。この混合物を徐々に室温まで加温し、そして時々振とうしながら、20分で68℃に加熱する。懸濁液を室温に冷却し、そして12,000×ｇにて15分間遠心分離する。この懸濁液に1/16容量の8M酢酸カリウム（pH4.2）を添加し、そして混合物を氷上に１時間置く。遠心分離（20分間;16,000×g;4℃）により沈澱を除去する。氷上で15分間0.6容量のイソプロパノールと共にインキュベートすることにより上清から核酸を沈澱せしめる。沈澱した核酸を遠心分離により集め（10分間;6,000×g;4℃）、70％エタノールにより洗浄し、そして短時間乾燥する。ペレットを、20μg/mlのルナーゼ（Rnase）Ａ（ベーリンガー・マンハイム）を含有する10mlのTE中に懸濁し、そして15分間37℃にてインキュベートする。DNAをヌクレアージ不含有プロナーゼ（最終濃度1mg/ml）（Kochlight Coinbrook）により37℃にて１時間処理する。TE緩衝液中プロナーゼストック溶液は、ヌークレアーゼを消化するために37℃にて１時間前インキュベートされた酵素20mg/mlを含有する。
8.5gのCsClを、得られたDNA溶液9mlに溶解し、0.2mlの10mg/mlエチジウムブロミドを添加し、そしてこの溶液をベックマンSW41ローター中で33,000rpmにて60時間、又はベックマン50Tiローター中で45,000rpmにて40時間遠心分離する。DNAバンドを集め、そしてエチジウムブロミドを、水中NaCl飽和溶液で平衡化したイソプロパノールでの多段抽出により除去する。５容量のTEを添加し、DNA溶液をTE飽和フェノール／イソアミルアルコール（24:1）フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25:24）、クロラムフェニコールにより処理する。0.1容量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び2.5容量のエタノールの添加並びに−20℃にて一夜のインキュベーションによりDNAを沈澱せしめる。沈澱を遠心分離（１時間;30,000×g;4℃）により集め、乾燥し、そして400μｌのTE中に溶解する。
実施例2.2. Mbo IによるA.ニガーN400のDNAの部分消化 及び断片の単離
13.6〜23kbpのDNA断片を最も多くもたらすMbo I濃度について試験するため、１μｇずつのA.ニガーN400のDNAを提供者により推奨される適当な緩衝液中で、減少する量のMbo I（0.5〜0.001V）を用いて37℃にて１時間10μｌの容量で消化する。１μｌの0.25M EDTAの添加により反応を停止し、そしてサンプルを、１μg/mlのエチジウムブロミドを含有するTBE緩衝液0.6％アガロースゲルに付加する。便利なサイズマーカーはλDNA及びBgl IIにより消化されたλDNAの混合物であり、このものは49,22.8,13.6,9.8及び2.3kbpのバンド並びに0.4kbpの見えない断片を提供する。目的とする13.6〜23kbp断片を高収量で提供するために必要なMbo I濃度は約0.02U/μg DNAである。従って、全容2ml中200μｇのDNAを消化し、そして酵素の添加直後に20個の等量のアリコートに分ける。37℃にて１時間の後、消化物を氷上に置く。１μｌのサンプルをゲル上で泳動させることにより適切な消化についてチェックした後、EDTAを最終濃度25mMとなるように添加し、酵素を65℃にて10分間熱失活せしめ、サンプルをプールし、そしてDNAを沈澱せしめ、洗浄し、そして400μｌのTEに溶解する。
断片化されたDNAを0.4％分取用アガロースゲル（中央ウエル120×1.5mm）上で分離する。マーカーとしてBgl II消化λDNAを用いて、４℃及び40V（3V/cm）での電気泳動後に部分消化DNA断片のサイズを決定する。正しいサイズの断片を含有するゲル領域をゲルから切り取り、そしてこのDNAを無菌透析チューブ中の2ml TBE中で100Vにて２〜３時間電気溶出する。電流を30秒間逆転せしめ、そしてDNAを含有する緩衝液を集める。次に、断片をエタノール沈澱により濃縮しそして100μｌのTE中に溶解する。
実施例2.3. ベクターDNAの調製及びA.ニガーN400の高 分子DNAのEMBL4へのクローニング
A.ニガーN400株のゲノムライブラリーをλベクターEMBL4中に作製する。９〜23kbpのクローニング容量を有するこのベクターはFrischaufら（参考文献９）及びKarnら（参考文献19）により記載されており、そしてプロメガ・バイオテック社（Promega Biotech Inc.）から販売されている。ゲノムの異る部分に由来する二重挿入を回避するため、最少断片長13.6kbpをクローニングのために用いる。
10μｇのλEMBL4 DNAを50ユニットのBamH Iにより、供給者により推奨される緩衝液中で100μｌの容量にて37℃で２時間消化する。酵素を65℃にて10分間不活性化する。NaCl濃度を150mMに上げ、そして50ユニットのSal Iを添加し、そして37℃でのインキュベーションをさらに２時間続ける。EDTAを25mMまで添加しそして酵素を不活性化（65℃にて10分間加熱）した後、溶液を等容量のフェノール（TE飽和）、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール25:24:1）、及びクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）により抽出する。小BamH I/Sal Iポリリンカー断片を除去するため、0.1容量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）を添加した後0.6容量のイソプロパノールによりDNAを沈澱せしめる。15分間氷上に置きそして12,000×ｇ及び４℃にて15分間遠心分離した後、沈澱を70％エタノールにて十分に洗浄し、乾燥し、そして40μｌのTEに溶解する。
実施例2.4. A.ニガーN400ゲノム断片の連結及びインビ トロパッケージング
実施例2.3.に従って調製されたベクターのcos部位が連結反応に先立ってアニールされることが必須である。ベクターを100mM Tris−HCl（pH7.5）及び10mM MgCl2中で65℃にて10分間加熱し、そして次に42℃にて１時間アニールする。試験連結の結果から、約1:1（重量）のベクター対断片の比率が最も多くの組換体をもたらすことが見出される。連結は、50mM Tris−HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、10mM DTT及び1mM ATP中で9.5μｇのベクター及び10μｇのDNA断片を用いて全容100μｌ中で行われる。DNAリガーゼ（BRL）を0.5U/μg DNAの濃度で加え、そして連結混合物を14℃にて一夜インキュベートする。連結について試験するため、連結されたDNAのサンプルをアガロースゲル上で泳動せしめる。さらに、対照として、0.5μｇのベクターを、断片を加えないで５μｌの容量にて連結する。
大容量連結混合物をエタノール沈澱により濃縮しそして20μｌのTEに溶解した後インビトロパッケージングのために用いる。インビトロパッケージングはPromega Packagene抽出物により、製造者の指示に従って、１μｇのDNAをパッケージするために10μｌずつ用いて行う。抽出物と共に提供される１μｇの高分子対照ファージλcI857 Sam7を別途対照としてパッケージする。パッケージングの後、500μｌのファージ溶液緩衝液（PSB）及び５μｌのクロロホルムを加える。組換えファージストックは４℃にて貯蔵することができる。得られるライブラリーは２つの別々の連結実験から作製する。
実施例2.5. A.ニガーN400株ゲノムライブラリーの力価 検定及び増幅
大腸菌NM539の細胞を、0.2％マルトース、10mM MgSO4及び1mM CuCl2を含有するLB培地上で1.0の光学濃度（600nm）まで増殖せしめる。この培養物の0.2mlのアリコートをPSB中の適当なファージ稀釈物0.1mlに加える。37℃にて20分間のファージの吸着の後、45℃の温度の3mlの0.6％LB上昇寒天を加え、混合物をLB寒天プレートにプレートし、そしてこれらを37℃にて一夜インキュベートする。ファージ懸濁液ml当りのプラーク形成単位（pfu）数は、実施例1.4.に従って調製された２つのファージストックについてそれぞれ12×105及び4.2×105である。断片を含まない対照連結物から計算されるバックグラウンド（それぞれ17％及び40％）を差引いて、組換体の絶対数は６×105である。組換体中に含まれるDNAは200個以上のアスペルギルス・ニガーのゲノムと同等である。
このライブラリーを増幅するため、両パッケージストックの80μｌのアリコートを用いて大腸菌NM539に感染せしめ、これをLB寒天プレート上のLB上層アガロースにプレートし、そして次に37℃にて一夜インキュベートする。プレートをプレート当り5mlのPSBと共に室温にて１時間おだやかに振とうすることによりファージをアガロースから溶出する。PSBを集め、遠心分離（6,000×ｇにて10分間）して細菌を除去し、そしてクロロホルムを加える（最終濃度0.5％）。およそ同程度に増幅された両ファージストックを混合し（40mlストック）、力価検定し（８×109pfu/ml）そして４℃で貯蔵する。
実施例3. ポリガラクチュロナーゼに関する核酸につい てのA.ニガーのゲノムライブラリーのスクリーニング
実施例3.1. ポリガラクチュロナーゼIIの17kDaシアノ ゲンブロミド断片をコードするオリゴヌクレオチド混合 物の合成
実施例2.に従って調製されたアスペルギルス・ニガーのゲノムライブラリーをスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドを、ホスホラミダイト法（M.H.Caruthers、参考文献８）を用いてアプライド・バイオシステム（モデル380B）オリゴヌクレオチド合成機により合成する。実施例1.2.に記載の17kDaシアノゲンブロミド断片は内部に位置するペプチドである。従って、実施例1.4.において決定されたアミノ酸配列をメチオニン残基を有するＮ−末端において延長することができる。遺伝コードの縮重を考慮して、合成されるオリゴヌクレオチドは複雑な混合物である。技術的な理由のため、混合物中のオリゴヌクレオチドの数を減少させる必要がある。10位及び11位における悪い組合わせTG及びACを有するオリゴヌクレオチドを除外するため、及び混合物のサイズを限定するため、遺伝コードの縮重を考慮しながら、コード鎖中の配列に相当するオリゴヌクレオチドの２つの別個の混合物を合成する。合成される29−merの４つの異る位置にウオブル（wobble）塩基としてイノシンを導入することにより必要なオリゴヌクレオチドの数をさらに減少せしめる。それ故に各混合物は16種の異るオリゴヌクレオチドから成る（オーツカら、参考文献16）。HR6195及びHR6196と称する２つの混合物は下記のアミノ酸配列をコードするDNAを代表しそして下記の組成を有する。
Figure 0003576549
上記配列中、Ｉはイノシンであり、R1はＴ又はＣであり、そしてR2はＡ又はＧである。
実施例3.2. ポリガラクチュロナーゼＩの5.5kDaシアノ ゲンブロミド断片をコードするオリゴヌクレオチド混合 物の合成
実施例1.5.に記載の5.5kDaシアノゲンブロミド断片はCNBr開裂により調製される内部に位置するペプチドである。従って、そのアミノ酸配列はメチオニン残基を有するＮ−末端において延長され得る。必要とされるオリゴヌクレオチドの数は、合成される32−merの５つの異る位置においてウオブル（wobble）塩基としてイノシンを導入することにより減少される。これが、混合物を24種の異るオリゴヌクレオチドに限定する。HR6298と称する混合物は下記アミノ酸配列をコードするDNAを代表し、そして下記の組成を有する。
Figure 0003576549
配列中、Ｉはイノシンであり、R1はＴ又はＣであり、そしてR2はT,C又はＡである。
実施例3.3. オリゴヌクレオチドの 32 P−標識
凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドHR6195,HR6196及びHR6198を29μＭの濃度で蒸留水に溶解する。これらの溶液のサンプルを10倍稀釈して反応混合物を調製する。反応混合物は、50mM Tris−HCl（pH7.6）、10mM MgCl2,5mM,DTT,0.1mM EDTA及び0.1mMスペルミジン（Maniatisら、参考文献6,122頁）から成るキナーゼ緩衝液50μｌ中、20pmoleのオリゴヌクレオチドHR6195と20pmoleのHR6196との組合わせか又は40pmoleのHR6298単独のいずれか、34pmoleの〔γ−32P〕−ATP（NEM,6,000Ci/mmol）、及び30ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（BRL）から構成される。インキュベーションは37℃にて30分間行う。４μｌの5M EDTA（pH8.0）点加により反応を停止せしめる。ゲノムライブラリーをスクリーニングするため（実施例3.4.）又はサザンブロット（Southern blot）をプローブするため（実施例3.6.）に精製することなく反応混合物を使用する。
実施例3.4. A.ニガーN400ライブラリーのスクリーニン グ
前記アスペルギルス・ニガーN400株ゲノムライブラリーの一部分をSM中に稀釈し、そして約2,000pfuを含有する0.1mlずつをプレートする。0.2％のマルトースを補充されたLB培地50mlにLB培地中大腸菌NM539の一夜培養物0.5mlを接種し、そして250rpmにて４時間、ガレンカンプ（Gallenkamp）回転振とう機上で37℃にて振とうし、次に0.5mlの1M MgSO4及び0.5mlの0.5M CaCl2を添加することにより宿主細胞を調製する。これらの細胞の0.2mlのアリコートをそれぞれ0.1mlづつのファージ懸濁液と混合し、そしてこれらの混合物を室温にて0.5時間インキュベートする。次に、47℃のLM培地中0.7％アガロース3mlを加え、短時間渦動撹拌し、そしてLM寒天プレート上にすぐにプレートする。これらのプレートを37℃にて一夜インキュベートしそして２時間４℃に冷却する。
各プレートから、Benton及びDavisのプラークハイブリダイゼーション法（参考文献７）に従って２枚のレプリカを作る。第一のフィルター（Schleicher＆Schuell BA85）はプレートの上面に１分間置き、第二のレプリカは２分間置き、そしてレプリカの位置をインディアインクを用いて標識する。フィルターを除去した後、これらを、100mlの変性溶液（1M NaCl,0.5M NaOH）を含有する皿に５分間入れ、そして次に100mlの中和溶液〔0.5M Tris−HCl（pH7.5）、1.5M NaCl〕を含む皿に入れられる。フィルターを、３×SSCを含有する皿に移し、細菌破片を除去するためグローブをつけた手で穏やかにこすり、そして３×SSCによりすすぐ。フィルターをブロットし、室温にて10分間乾燥し、そしてオーブン中ワットマン3MMペーパー上で80℃にて２時間乾熱する。
乾熱したフィルターを３×SSC中で湿し、この溶液中で室温にて１時間洗浄し、そして次に250mlのあらかじめ加温（65℃）されたプレハイブリダイゼーション混合物を入れた皿に移す。プレハイブリダイゼーション混合物は、オリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196が使用される場合には２×SSCから成り、そしてオリゴヌクレオチド混合物HR6298が使用される場合には１×SSCから成り、さらに10×デンハート（0.2％BSA、ベーリンガー画分U;0.2％Ficoll 400、ファルマシア;0.2％ポリビニルピロリドン−10、シグマ）、0.1％SDS、及び0.1mg/mlの剪断されそして新たに変性されたニシン精子DNAを含む。プレハイブリダイゼーションを65℃にて５時間、振とう水浴中で行う。次に、フィルターを250mlのあらかじめ加温したハイブリダイゼーション混合物中で0.5時間洗浄する。このハイブリダイゼーション混合物はニシン精子DNAが含まれない点を除きプレハイブリダイゼーション混合物と同じである。次に、フィルターを150mlのあらかじめ加温（65℃）されたハイブリダイゼーション混合物を含む別の皿に入れる。このハイブリダイゼーション混合物には、あらかじめ標識され一緒にされたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196（実施例3.1.）、又は標識された混合物HR6298が新しく加えられている。
HR6195及びHR6196が使用される場合、皿を65℃の振とう水浴に入れ、サーモスタットを47℃に調整しそしてハイブリダイゼーションを14時間進行させる。フィルターを250mlのあらかじめ加温した（47℃）ハイブリダイゼーション混合物中で47℃にて0.5時間１回洗浄し、次に250mlの２×SSCを２回交換してそれぞれ45分間ずつ室温にて洗浄する。250mlのあらかじめ加温された（63℃）６×SSC、0.05％ピロリン酸ナトリウムを含む皿にフィルターをまず移し、そして次に63℃の振とう水浴中で30分間インキュベートすることによりストリンジエント洗浄を行う。次に、フィルターを室温にて２×SSCを２回交換してそれぞれ30分づつ洗浄する。フィルターを空気乾燥し、ワットマン3MMペーパーのサポート上に固定し、プラスチックラップで覆い、そして増強スクリーンを使用してコダックXAR5フィルムに−60℃にて３日間暴露する。
こうして、スクリーニングされた６枚のプレートから６個の陽性シグナルが得られる。インクマーカーを用いてオートラジオグラム上にプレートを注意深く置くことにより無菌パスツールピペットを用いて陽性プラークを打ちぬく。陽性プラークを含む寒天片を1mlのSMに加え、2.5μｌのクロロホルムを加える。室温にて１時間時々渦動撹拌しながら、ファージを寒天から拡散せしめ、次に４℃にて一夜インキュベートする。５分間遠心分離することにより寒天及び細菌細胞破片を除去し、2.5μｌのクロロホルムを加え、そしてファージストックを４℃にて貯蔵する。
陽性クローンをλＣ〜λＧ及びλＩと命名する。ファージが高密度でプレートされているため、陽性プラークを低密度でプレートし、そしてレプリカプレート、ハイブリダイゼーション及び陽性プラークの拾い上げの完全な手順を２回繰り返すことにより陽性プラークを純化する。
オリゴヌクレオチド混合物HR6298を使用する場合、皿を65℃の振とう水浴に入れ、サーモスタットを52℃に調整し、そしてハイブリダイゼーションを14時間進行させる。次に、フィルターを１回250mlのあらかじめ加温された（52℃）ハイブリダイゼーション混合物中で0.5時間52℃にて洗浄し、次に室温にて250mlの２×SSCを２回交換してそれぞれ45分間洗浄する。次に、250mlのあらかじめ加温した（64℃）４×SSC,0.05％（w/v）ピロリン酸ナトリウムを含む皿にフィルターを移しそして次にそれを振とう水浴中64℃にて0.5時間インキュベートすることによりストリンジエント洗浄を行う。次に、フィルターを室温にて２×SSCを２回交換してそれぞれ30分間洗浄する。フィルターを空気乾燥せしめ、ワットマン3MMペーパーのサポート上に固定し、プラスチックラップで覆い、そして増強スクリーンを用いてコダックXAR5フィルムに−60℃にて３日間暴露する。
こうして、スクリーニングした６枚のプレートから９個の陽性シグナルが得られる。インクマーカーを用いてオートラジオグラム上にプレートを注意深く置くことにより、無菌パスツールピペットを用いて陽性プラークを打ちぬく。陽性プラークを含有する寒天片を1mlのSMに加え、2.5μｌのクロロホルムを加える。室温にて１時間、時々渦動撹拌しながらファージを寒天から拡散せしめ、そして次に４℃にて一夜インキュベートする。５分間の遠心分離により寒天及び細菌細胞破片を除去し、2.5μｌのクロロホルムを加え、そしてファージストックを４℃にて貯蔵する。
陽性クローンをPG I−λ１〜９と命名する。ハイブリダイゼーションのためのヘテロロガス（heterologous）プローブとしてpGW1803（実施例3.8.を参照のこと）の1.2kbpのBamH I/EcoR I断片を用いて低密度でプレートすることにより陽性プラークをさらに純化する。このハイブリダイゼーションは60℃にて行い、洗浄は２×SSC中で60℃にて行う。
実施例3.5. λDNAの単離
組換えクローンからDNAを単離するためのファージをまず増幅する。この目的のため、10mM MgSO4及び0.2％マルトースを補充したLB培地中で大腸菌LE392宿主細胞を1.0の光学濃度（600nm）まで増殖せしめる。次に、50μｌの純化ファージのストックを実施例2.5.に記載したようにして別々にプレートする。37℃にて一夜インキュベートした後、5mlのSMをプレートに拡げそして穏やかに振とうしながら２時間インキュベートすることにより非−コンフルエントのプレートからファージを溶出する。溶出されたファージを収得し、そして0.1mlのクロロホルムを加える。混合物を短時間渦動撹拌しそして遠心分離により細胞片を除去する。上清を回収し、クロロホルムを0.3％になるように加え、そして得られるプレート溶解物を４℃にて貯蔵する。
ファージDNAの単離のための出発材料としてコンフルエントに近いプレートを得るため、10μｌの前記プレート溶解物を大腸菌LE392宿主細胞と共にプレートする。37℃にて一夜のインキュベーションの後、コンフルエントに近いプレート３枚からアガロース上層をかき取る。これらの層を一緒にし、そして20mlのSM及び0.4mlのクロロホルムを加え、そして得られる混合物を37℃にて30分間振とうする。遠心分離により細胞破片及びアガロースを除去し、上清を回収し、そしてその体積をSMにより18mlに調整する。同体積のSM中2M NaCl,20％PEG 6000（BDH,Poole、英国）を加え、そしてこの溶液を混合しそして氷上に置く。75分間の後、12,000×ｇ及び４℃にて20分間の遠心分離によりファージをペレット化する。上清をデカント除去し、そして残留する流体をクリーネックス（Kleenex）ティシュにより除去する。ペレットを3mlのSMに再懸濁し、そして次に3mlのクロロホルムにより抽出する。水相をRNアーゼ（67μg/ml）及びDNアーゼＩ（33μg/ml）により37℃にて20分間処理する。次に、2mlのフェノールを加え、渦動撹拌し、1mlのクロロホルムを加え、再び渦動撹拌しそして遠心分離によって２相を分離することにより前記混合物を抽出する。水相をさらに２回それぞれ3mlのフェノール／クロロホルム（1:1）及び3mlのクロロホルムにより抽出する。次に、0.3mlの3M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）及び6mlのエタノールを次々に添加することにより水相からDNAを沈澱せしめる。この混合物を４℃にて16時間置き、そして次に遠心分離（10分間、12,000×ｇ、４℃）によりDNAを回収する。ペレットを0.4mlのTE緩衝液に溶解し、RNアーゼを200μg/mlとなるように加え、そして37℃にて１時間インキュベートする。38μｌの3M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）及び0.8mlのエタノールを添加することにより４℃にて１時間DNAを沈澱せしめる。遠心分離によりDNAを回収し、そして次に100μｌのTE緩衝液に溶解する。
実施例3.6. A.ニガーN400のPG II及びPG Iαクローン の制限分析
PG II遺伝子配列を含有する陽性ファージから、λＤ及びλＥを選択してさらに分析する。まず、両ファージがA.ニガーのゲノムの同じ領域からの挿入部を含有することを確立し、そして次にλＥの部分的制限地図を作製する。
２μｇのファージDNAを20ユニットのEcoR IもしくはBamH I又はこれらの酵素の組合せにより100μｌの容量中37℃にて３時間、供給者（BRL）の推奨する緩衝液中で且つ0.8mg/mlのRNアーゼＡの存在下で消化する。次に、10μｌの3M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）を添加し、そしてこの混合物を80μｌのクロロホルムで抽出する。250μｌのエタノールの添加により水相からDNAを沈澱せしめ、そして混合物を氷上に１時間置く。DNAを遠心分離により集め、25μｌのサンプル緩衝液中に溶解し、そして65℃にて10分間加熱する。Hind IIIにより消化した１μｇのλDNA（BRL）をサイズマーカーとして使用して、サンプルを0.7％アガロースゲル上で泳動せしめる。ポラロイド667フィルムを用いてUVトランスイルミネーター上でゲルの写真をとる。Maniatisら（参考文献６、382−386頁）に記載されているようにしてSouthern（1975）の方法に従って、DNAをSchleicher ＆ Schuell BA85ニトロセルロース膜に移す。次に、この膜を乾熱し、そして実施例3.3.に記載したように一緒にされ、標識されたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196とハイブリダイズさせる。
写真及びオートラジオグラムから既知マーカーバンドとの比較により断片の長さを計算する。EcoR I,BamH I及びこれらの酵素の組合わせによりファージλＤ及びλＥから単離される、DNA消化の後に得られる5kbpより小さい断片のサイズを第３表に示す。使用した電気泳動系の解像力によればより大きなサイズの断片を比較するのは無意味である。第３表に示されるEcoR I消化物中の低い強度の少数のバンドの存在から判断して、EcoR IはDNAを完全には消化していない。EcoR I/BamH I二重消化物中に存在するが単独消化物のいずれか１方には存在しない断片は、同じサイズ範囲中のBamH I断片のそれに匹敵する強度を有する。従って、これらは完全消化生成物を代表しなければならない。λＥの場合、組合わされたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及び6196とハイブリダイズする断片は、BamH I消化物中の10kbpより大きい断片、EcoR I消化物中の7.4kbp EcoR I断片及び10kbpより大きい断片、並びにBamH I/EcoR I二重消化物中の2.8kbp断片及び10kbpより大きい断片である。λＤの場合、組合わされたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196とハイブリダイズする断片は、BamH I消化物中の10kbpより大きな断片、EcoR I消化物中の5.8kbp断片及び10kbpより大きな断片、並びにBamH I/EcoR I二重消化物中の1.2kbp断片及び10kbpより大きな断片である。例えばEcoR Iによる消化物中で更なる断片が観察される場合、該一層大きな断片は部分開裂から生じた生成物と見なされる。λＤ及びλＥから得られる同じサイズの断片のオリゴヌクレオチド混合物とのハイブリダイゼーションは観察されない。
上に列挙したファージλＤとλＥとの間の相違から、ファージλＤ及びλＥは同一ではないと結論される。しかしながら、第３表は、λＤ及びλＥ中の同じサイズを有する２個のEcoR I断片、３個のBamH I断片及び少なくとも４個のBamH I−EcoR I断片を示している。アスペルギルスDNAをベクターに挿入するために使用されたBamH I部位及びこれらのBamH I部位を挟みそしてそれ故に挿入部を挾むEcoR I部位のほかにはこのベクターはEcoR I又はBamH I部位を含有しない（Frischaufら、参考文献９）から、前記の断片は前記のファージの挿入部から生じたものに違いない。従って、ファージλＤ及びλＥの挿入部はA.ニガーのゲノムの同じ領域に由来すると結論される。λＤからの意味のあるハイブリダイズするBamH I−EcoR I断片がλＥからの対応する断片より小さい、すなわち1.2kbp対2.8kbpであることと相まって、そして制限パターンにおいて観察される相違がクローニングの人工的な結果ではないと仮定すれば、λＤのハイブリダイズする1.2kbp BamH I−EcoR I断片のEcoR I部位はA.ニガーDNAに由来するのではなく、そしてそれはこのファージの挿入部を挾むEcoR I部位の１つである。さらに、一つの方向において、λＤの挿入部は、オリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズする配列を越えて最大1.2kbp延びていることになる。さらに、オリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズするλＥの配列は、ハイブリダイズする2.8kbp BamH I−EcoR I断片の端のBamH Iから1.2kbp以内に位置すると推論される。
Figure 0003576549
λＥの部分的制限地図を作成するため、ファージDNAをEcoR I,Xba I及びHind III並びにこれらの酵素の可能なすべての組合せにより消化する。これを２段階で行う。まず、６μｇのDNAを37℃にて105分間、200UのEcoR Iの存在下又は非存在下で、供給者（BRL）により推奨される緩衝液及びRNアーゼＡ（2mg/ml）を含有する200mlの容量中でインキュベートする。次に、この反応混合物を100μｌのフェノール／クロロホルム（1:1）により抽出しそして次に100μｌのクロロホルムにより抽出する。0.1容量の3M酢酸ナトリウム緩衝液及び２容量のエタノールの添加により水相からDNAを沈澱せしめる。氷上に10分間置いた後、遠心分離により沈澱を集める。ペレットを空気乾燥し、そして100μｌのTE緩衝液中に溶解する。次に、これらの溶液を、制限酵素の非存在下（EcoR Iで消化された材料のみ）、又はHind III,Xba Iもしくはこれらの酵素の組合わせの存在下でのインキュベーションのために使用する。このインキュベーションは37℃にて２時間、10μｌの対応するDNA溶液、RNアーゼＡ（2mg/ml）、10Uの対応する制限酵素及び供給者（BRL）により推奨される緩衝液を含有する20μｌの容量において行う。５倍濃度のサンプル緩衝液５μｌの添加によりインキュベーションを停止し、そして次にサンプルを前記のようにして分析する。
Hind III,Xha I又はこれら２種類の酵素の組合わせによる消化物中には10kbpより大きい単一のハイブリダイズするバンドがオートラジオグラム上に検出される。他のすべての消化物中に、強度は低いがおよそ同じサイズの１個のバンドが存在し、このことは、これら酵素がDNAを完全には消化しなかったことを示している。EcoR I消化物中の第２のそして最も強くハイブリダイズするバンドは7.4kbp断片を示す。このバンドは、より低強度ではあるが、EcoR Iと第二の酵素との消化物中にも存在し、やはり不完全消化を示している。さらに、EcoR I/Hind III二重消化物及びEcoR I/Hind III/Xba I三重消化物は3.6kbpのハイブリダイズする断片を与える。酵素EcoR I及びXba Iによる二重消化物中に4.1kbpのハイブリダイズする断片が検出される。この断片はまた、非常に低強度ではあるが、酵素EcoR I,Hind III及びXba Iによる三重消化物中にも存在する。後者の場合、4.1kbp断片は部分的開裂生成物であると考えられる。
組合わされたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196とハイブリダイズする7.4kbp EcoR I断片は酵素Xba I,Hind III又はBamH Iのいずれか１つによっても開裂され得ること、及びこれらの酵素の開裂部位の位置が第１図に示される通りでなければならないことが結論される。この図は部分的制限地図を与えているに過ぎず、例えば7.4kbp EcoR I断片は酵素Hind III,Xba I及びBamH Iのいずれか１つについて１個より多くの開裂部位をなお含有するかも知れず、この場合組合わされたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196とハイブリダイズする特定の配列に最も近い部位のみが示される。
ファージλＤについてはXba I又はHind III消化は行われないが、ファージλＥにおけるのと同様にXba I及びHind III制限部位が位置すると予想される。
PG I遺伝子配列を担持している９個の陽性クローンから４個のファージPG I−λ4,−λ5,−λ６及び−λ７を選んでさらに解析する。まず、これらのファージがA.ニガーのゲノムの同じ領域に由来する挿入部を含有することを確立し、そして次にファージＤ及びＥを含むPG II遺伝子配列について上に記載したようにしてλ５の部分的制限地図を作成する。DNAを酵素の供給者により推奨されるようにして制限酵素（酵素については第４表を参照のこと）により消化する。前記のようにして、断片をアガロースゲル上で分離しそしてニトロセルロース上にブロットする。次に、膜を乾熱し、次に、PG IIをコードする構造遺伝子のあらかじめニック−トランスレーションした1.2kb BamH I/EcoR I断片とハイブリダイズせしめる。この断片は、実施例3.8.に記載したプラスミドpGW1803に由来する。この断片をアガロースゲルのスライスから単離し、そして50ngのこの断片をManiatisら（参考文献ｂ、109〜112頁）により記載されているようにしてニックトランスレーションする。これをハイブリダイゼーション混合物を添加する前に、このニックトランスレーションされたDNAを沸騰水浴中で10分間変性させる。ニトロセルロースフィルターを実施例3.8.に記載したようにして放射性プローブとハイブリダイズさせるが、但しプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度は60℃とする。次に、膜を60℃において一連のあらかじめ加温した緩衝液を用いて洗浄する。まず膜を６×SSC中ですすぎ、そしてハイブリダイゼーション緩衝液中で0.5時間２回洗浄する。次にフィルターを４×SSC及び２×SSC中で次々と各緩衝液につき30分間ずつ洗浄する。これらの緩衝液は0.1％SDS及び0.1％Na4P2O7・10H2Oの両方を含有する。最終洗浄の後、膜を0.1×SSC中で短時間すすぎ、そしてこれらを乾燥させ、そして次にＸ−線フィルムに暴露する。
使用したプローブはPG IIプロモーター領域（200bp）の小部分及びコード配列の大部分を代表する。記載したハイブリダイゼーション条件下で、このプローブは、PG I遺伝子配列を含有する上に単離されたすべてのファージ（実施例3.4.を参照のこと）と共に強いシグナルを与える。
写真及びオートラジオグラムから、既知マーカーバンドとの比較により断片の長さを計算する。第４表にハイブリダイズする断片とそれらのおよそのサイズを挙げる。
Figure 0003576549
すべてのファージが6.4kbpのEcoR I断片及び2.0kbpのXho I/EcoR I断片を含有し、他方EcoR I/BamH I二重消化も6.4kbp断片をもたらすことが第３表から明らかである。ファージλ4,λ５及びλ７はまた、BamH I（8.6kbp）及びBamH I/Bal II（7.5kbp）で消化された時、同じ断片を有する。このベクターは、アスペルギルスDNAの断片を挿入するのに使用されたBamH I部位以外にBamH Iを含有しない（Frishaufら、参考文献９）。従って、これら３個のファージの挿入部はA.ニガーのゲノムの同じ領域に由来すると考えられる。
部分的制限地図を作成するため、λ５ファージDNAをさらにKpn I,Sma I,Sst I及びSal I、並びにこれらの酵素とBamH Iとの組合わせにより消化する。さらにBal II/Xho I消化物を分析する。Sma Iの場合（30℃）を除きこれらすべてのインキュベーションを37℃にて３時間、１μｇのファージDNAを含有する20μｌの容量中で行う。60℃にてPG IIプローブとハイブリダイズする断片を第５表に挙げる。
Figure 0003576549
ハイブリダイズする断片からPG I−λ５の制限地図をデザインすることができ、その制限地図から、ポリガラクチュロナーゼＩをコードする遺伝子が8.6kbp BamH I断片上に位置すると結論することができる。
実施例3.7. pGW1800及びpGW1803の作製
ファージλＤ及びλＥの有意義なEcoR I−Xba I制限断片をpEMBLベクター（Dente及びCortese、参考文献10）に挿入して、それぞれプラスミドpGW1803及びpGW1800を得る。
第１図及び実施例3.5.から、ファージλＤは、ファージλＥの4.1kbpのEcoR I−Xba I断片の一部分と同じ2.5kbpのEcoR I−Xba I断片を有するに相違ないことが推定される。６μｇのλD DNAを60UのXba Iを用いて２時間200μｌの容量中で、BRLにより推奨される緩衝液＋RNアーゼＡ（1.5mg/ml）中で消化する。次に、NaCl濃度を140mMに調整し、濃反応緩衝液を添加して体積の増加を補償し、60UのEcoR Iを加え、そして230μｌの容量にて2.5時間インキュベーションを続ける。次に、反応混合物を100μｌのクロロホルムで抽出し、そして0.1容量の3M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）及び２容量のエタノールの添加により水相からDNAを沈澱せしめる。４℃にて16時間のインキュベーションの後、遠心分離によりDNAを回収し、ペレットを空気乾燥し、そして次にサンプル緩衝液に溶解する。エチジウムブロミドを含有する0.5×TBE緩衝液中0.6％低融点アガロース（BRL）ゲル上で制限断片を分離する。DNA断片をUV光のもとで可視化し、そして2.5kbpのEcoR I−Xba I断片を含有するゲル片を単離する。
前記と実質的に同様にして、ファージλE DNAを制限酵素Xba I及びEcoR Iと共にインキュベーションする。クロロホルムによる抽出の後、DNAを沈澱せしめ、遠心分離によりペレット化し、サンプル緩衝液に溶解し、そして１×TBE緩衝液中0.6％アガロースゲル上での電気泳動にかける。4.1kbpのXba I−EcoR I断片を含有するゲル片を回収し、そして−20℃にて貯蔵する。シラン処理した（silanized）ガラス綿の栓を、60mlの高TE緩衝液（100mM Tris−HCl（pH8.0）,10mM EDTA）を含む0.5mlのマイクロ−遠心試験管に付す。ゲル片を解凍し、前記試験管に入れ、そして試験管を液体窒素中で凍結する。前記小さい試験管の底に小孔を空け、そして1.5mlのマイクロ−遠心試験管に入れ、そしてゲル片からのDNA及び緩衝液を遠心分離により集める。ゲル片の残りを50μｌの高TE緩衝液に再懸濁し、この懸濁液を液体窒素中で再度凍結し、そして遠心分離により緩衝液を集める。次に、これらの溶出液を一緒にし、そして100μｌのクロロホルムで抽出する。DNAを水相から沈澱せしめ、遠心分離により集め、そして40μｌのTE緩衝液に溶解する。Hind IIIにより消化したλDNA（BRL）を参照として用いて、DNA濃度をアガロースゲル電気泳動により予想し、そしてUV光のもとでのバンドの可視化を行う。
供給者（BRL）により推奨される条件下でXba I及びEcoR Iにより逐次消化することによりpEMBL18及びpEMBL19を調製する。フェノール、フェノール／クロロホルム（1:1）及びクロロホルムによるDNAの抽出、並びにエタノールによるDNAの沈澱をManiatis（参考文献６）に記載されているようにして行うが、クロロホルム溶液からイソアミルアルコールを省略し、そしてDNAの沈澱に用いる温度は４℃とする。
BRLにより推奨される緩衝液＋ATP（1mM）、1.5UのT4 DNAリガーゼ（BRL）、前記のようにして記載した100ngのベクターDNA、及び前記の有意義な制限断片を含有する25μｌの反応容量中でDNA断片を対応するベクターに連結する。Xba IとEcoR Iにより消化されたpEMBL18及び当量のλＥの精製された4.1kbpのXba I−EcoR Iを用いてpGW1800を作製する。
反応混合物を16℃にて16時間インキュベートし、そして次に125μｌの蒸留水を添加して凍結することにより反応を停止する。Xba IとEcoR Iにより消化されたpEMBL19をpGW1803の作製に用いる。この場合、λＤの2.5kbpのXba I−EcoR I断片を含有するアガロース片を60℃にて溶融し、そして約15ngのDNAを含有する４μｌを11μｌの蒸留水に添加し、次に反応混合物の他の成分を加える。20℃にて14時間連結反応を進行せしめ、そしてさらに１ユニットのT4 DNAリガーゼを加える。反応をさらに７時間続け、そして次に前記のようにして反応を停止せしめる。
BRL M13クローニング／ジデオキシ・シーケンシング・マニュアル（参考文献11、30〜33頁）に記載されているようにして、50μｌの前記連結反応混合物を用いて大腸菌を形質転換する。但し、フラスコを氷上に置く前に大腸菌DH5αＦ′及び大腸菌JM109をそれぞれ0.7及び0.9のOD550値に増殖せしめる。前記の菌株はλＤの断片を含む連結反応混合物により形質転換され、そして後者の菌株はλＥの断片を含む連結反応混合物を用いて形質転換される。ヒートショックの後、細胞を氷上で２分間インキュベートし、そして次に1mlのLB培地を添加し、そして細胞を37℃にて１時間インキュベートする。細胞を低速遠心分離によりペレット化し、1mlの上清を除去し、そして細胞を穏やかに再懸濁する。次に、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上に細胞をプレートし、この上にIPTG/X−gal溶液（200μｌのH2O、２％のＸ−galを含有するジメチルホルムアミド30μｌおよび水中24mg/mlのIPTG溶液20μｌ）を拡げる。プレートを37℃にて一夜インキュベートする。
数個の単一白色コロニーを用いて、0.1％グルコース及び75μg/mlアンピシリンを補充したLB培地中で一夜培養物を調製する。Holmes及びQuigley（参考文献12）のミニプレップ（miniprep）法を用いて、これらの培養物からプラスミドを単離する。供給者（BRL）の推奨に従って且つRNareA（0.5ml/ml）の存在下で、プラスミドを幾つかの制限酵素により消化し、そして生成物をアガロースゲル上で分析する。予想されるサイズのXba I−EcoR I断片、BamH I−EcoR I断片及びHind III断片を生ずるプラスミドを選択し、そしてそれらを担持する大腸菌細胞を−20℃にてグリセロール上に保持する。
２個の新規なプラスミドが作製される。pGW1800はベクターpEMBL18にファージλＥの4.1kbp Xba I−EcoR I断片が挿入されたものであり、pGW1803はベクターpEMBL19にファージλＤの2.5kbp Xba I−EcoR I断片が挿入されたものである。
実施例3.8. pGW1800及びpGW1803の制限分析
pGW1800とpGW1803との間の関係が延長された制限分析により確認される。組合わされたオリゴヌクレオチドHR6195及びHR6196とハイブリダイズする特定の配列がpGW1803の特定の領域に帰属される。プラスミドpGW1800から得られる制限断片とA.ニガーN400 DNAから得られる制限断片との比較により、クローニングの人工物、例えばA.ニガー由来DNA断片の欠失又は連結、が存在しないことが確立される。
pGW1800及びpGW1803をそれぞれ大腸菌JM109株及びDH5αＦ′株中で増加させ、そしてManiatisら（参考文献６、90〜91頁）に記載されているようにして0.1％グルコース及び100μg/mlアンピシリンを補充されたLB培地中での一夜培養物250mlからプラスミドを回収し、そして最後にTE緩衝液に再懸濁する。pGW1800はまたA.ニガーを形質転換するためにも使用されるので、それを塩化セシウム勾配でのバンド形成により精製する。TE中DNA溶液2.5mlに3.3gのCsCl及び1mlのエチジウムプロミド（10mg/ml水）を加える。ベックマンVTi 65.2ローター中20℃にて16時間、45,000rpmにて遠心分離を行う。UV光のもとで見える２本の蛍光バンドの内、共有結合により閉じられた環状プラスミドDNAを含有する低い方のバンドを、チューブの横に孔を空けることにより回収する。DNA溶液（約1ml）を水飽和ブタノールにより５回抽出することによりエチジウムブロミドを除去する。次に、体積を水で15mlに調整し、そしてDNAを30mlのエタノールの添加により沈澱せしめる。DNAを遠心分離により集め、そして次にペレットを75％エタノールでで１回洗浄し、そして次にこれをTE緩衝液に溶解しそして−20℃にて貯蔵する。pGW1803はCsCl勾配から単離されないが、しかしこれをより速い方法にかける。RNアーゼＡを4mlのDNA溶液に100μg/mlの濃度に加え、そしてこの混合物を37℃にて１時間インキュベートし、そして次に等量のフェノール、フェノール／クロロホルム（1:1）及びクロロホルムにより抽出する。次に、0.4mlの3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び8mlのエタノールの添加によりDNAを水相から沈澱せしめる。DNAを遠心分離により集め、生ずるペレットを75％エタノールにより洗浄し、空気乾燥し、そして次にTE緩衝液中に溶解する。
植物RNAを単離するのに使用された方法（Slater、参考文献21）をわずかに改変した方法によりA.ニガーDNAを単離する。菌糸を塩水で洗浄し、液体窒素中で凍結し、そして2.5gを小型膜破砕機（Braun）により破砕する。菌糸粉末を新たに調製した抽出緩衝液により抽出する。抽出後緩衝液は次のようにして調製する。5mlのトリ−イソプロピルナフタレンスルホン酸（TNS 20mg/ml）を5mlのｐ−アミノサリチル酸（PAS）（120mg/ml）及び2.5mlの５×RNB緩衝液（５×RNBは1l中に121.1gのTris,73.04gのNaCl及び95.1のEGTAを含有する;pH8.5）と混合する。7.5mlのフェノールを添加した後、抽出緩衝液を55℃にて10分間平衡化する。次に、温緩衝液を菌糸粉末加え、そして懸濁液を２分間混合する。次に、5mlのクロロホルムを加え、そして２分間混合する。遠心分離（10分間、10,000×ｇ）により相を分離し、そして水相を10mlのフェノール／クロロホルム（1:1）によりもう一度、そして次にクロロホルムにより２回抽出する。
水相はRNA及びDNAの両者を含有する。DNAを２容量のエタノールにより室温にて沈澱せしめ、そして遠心分離（10分間、10,000×ｇ）により集め、そして無菌蒸留水中での再溶液及びエタノールによる沈澱を行うことにより２回洗浄する。最終溶液にRNアーゼＡ（20μg/ml）を添加することによりRNAを除去する。
pGW1800及びpGW1803の物理的地図を作製するため、約１μｇのプラスミドDNA、1mg/ml濃度のRNアーゼＡ（pGW1803の場合のみ）、BRLにより推奨される緩衝液及び10ユニットの制限酵素を含有する幾つかの反応混合物を調製する。この場合、個々の反応混合物のために異るDNAを選択する。幾つかの場合、２種類の異る酵素の組合わせを用い、あるいはプラスミドDNAをある一種類の酵素又は複数の酵素の組合わせにより消化し、次に酢酸ナトリウム及びエタノールの存在下でDNAを沈澱せしめ、続いて遠心分離によりDNAを再度集め、次にこの材料を第二又は第三の制限酵素の基質として使用する。反応混合物を37℃にて１時間インキュベートし、次に５倍濃度のサンプル緩衝液の添加により反応を停止し、そして次に反応生成物をTBE緩衝液中１％アガロースゲル上で分析する。特定の断片の計算されたサイブから、ユニークXba I部位に便宜上選択された参照点に対する個々の制限酵素部位を推定する。pGW1800の制限地図を第２図に示す。pGW1803のA.ニガー由来DNAの制限地図（示していない）は、pGW1800の１位のXba I部位から2000位のHinc II部位までの地図と同一である。しかしながら、pGW1803はpGW1800中の2400位に存在するBgl II部位を含有しない。pGW1800の0.4kbpのHinc III−Bgl II断片は、A.ニガー由来挿入DNAの末端に位置するpGW1803のHinc II−EcoR I断片と同じ電気泳動移動度を示した。pGW1803のA.ニガー由来DNAは、１位のXba Iと2400位に非常に近いがこれを含まない位置との間において、pGW1800のA.ニガー由来DNAと同一であると結論される。従って、ファージλＤのEcoR I−Xba I断片の予想されるサイズ2.5kbp（実施例3.6）はわずかに大きすぎる予想を示す。
組合わされたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196とハイブリダイズする特定の配列の位置を決定するため、pGW1803のDNAを制限酵素処理し、そして生ずる断片を前記のようにして分離する。次に、DNAをニトロセルロース膜に移し、そして前記のようにして組合わされ標識されたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196とハイブリダイズせしめる。組合わされたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196とハイブリダイズする断片は、Hinc II消化物中の0.64kbpのHinc II断片及びNco I/EcoR I二重消化物中の0.62kbpのNco I−EcoR I断片中に存在する。組合わされたオリゴヌクレオチド混合物HR6195及びHR6196とハイブリダイズする特定の配列はpGW1803の制限地図の1750位のNco I部位と2000位のHinc II部位との間に位置すると結論され、この座標はpGW1800制限地図の同じ配列に対応する。
pGW1800からの制限断片をA.ニガーN400のDNAから得られる制限断片と比較することにより、クローニングの人工物が存在しないことが確立される。pGW1800の消化物を前記のようにして調製する。N400株の染色体DNAの消化物を、２μｇのDNA、0.5mg/mlのRNアーゼＡ、BRLにより供給される反応緩衝液（Xho I,Xba I,EcoR V及びBgl IIのためにはREact緩衝液2;Kpn IのためにはREact緩衝液4;そしてEcoR I及びSal IのためにはREact緩衝液３）及び80ユニットの各制限酵素から成る200μｌの反応容量において37℃にて調製する。反応混合物を２時間インキュベートし、そして次に100μｌのクロロホルムで抽出する。次に、20μｌの3M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）及び0.5mlのナトリウムの添加並びにこれに続く45分間の氷上放置によりDNAを沈澱せしめる。次に、DNAを遠心分離により集めそして空気乾燥する。DNAをサンプル緩衝液に溶解し、そしてこれらのサンプル及びpGW1800の消化物並びにλDNAサイブマーカーをTBE緩衝液中0.7％アガロースゲル上に付加する。電気泳動の後、生ずるパターンを記録し、そしてA.ニガー染色体DNAの消化物を含むレーン中のDNAをニトロセルロース膜に移行せしめる。いずれも前記のようにして行う。膜を乾熱し、そして２つの部分に切断し、これらを異るプローブとハイブリダイズせしめる。
ハイブリダイゼーションのために用いたプローブは、pGW1800のニックトランスレーションされた1.45kbp及び2.05kbpのEcoR V−Bgl II断片である。前記のようにして断片をアガロースゲルからあらかじめ単離し、そしてManiatisら（参考文献６、109〜112頁）により記載されているようにして100ngの断片を別の反応でニックトランスレーションする。ハイブリダイゼーション混合物に加える前、ニックトランスレーションされたDNAを沸騰水浴中で10分間変性する。
乾熱されたニトロセルロースフィルターを３×SSC中で湿し、そして次に、６×SSC,10mM EDTA,0.1mg/ml新しく加えられ、剪断されそして変性されたニシンの精子DNA、0.1％のNa4P2O7・10H2O、0.5％のSDS及び５×デンハート〔0.1％BSA（ベーリンガーフラクションＶ）、0.1％Ficoll 400（ファルマシア、0.1％ポリビニルピロリドン−10（シグマ）〕から成る100mlのあらかじめ加熱（68℃）されたハイブリダイゼーション緩衝液を含む別々の皿に移す。プレハイブリダイゼーションを68℃にて２時間振とう水浴中で行い、そして次にハイブリダイゼーション緩衝液を新しい緩衝液（75ml）と交換し、これにニックトランスレーションされたプローブを加える。ハイブリダイゼーションを68℃にて少なくとも16時間進行せしめる。次に膜を68℃にて、いずれも0.1％SDS及び0.1％Na4P2O7・10H2Oを含有するがしかし減少する量のSSCを含有する一連のあらかじめ加温された緩衝液を用いて洗浄する。まず膜を４×SSC中ですすぎ、そして次にそれらを４×SSC中で２回10分間洗浄する。次に、フィルターを４×SSC,2×SSC,0.5×SSC,0.2×SSC,及び0.1×SSC中で、緩衝液当り30分間次々と洗浄する。最終洗浄の後、膜を0.1×SSC中で短時間すすぎ、そして次にこれらを乾燥させ、そして次にＸ−線フィルムに暴露する。
1.45kbpのEcoR V−Bgl II断片によりプローブされた膜は次のハイブリダイズする断片を含有する:Xho I消化物中の2.4kbp断片、Kpn I消化物中の2.8kbp断片及び1.2kbp断片、並びにBgl II/EcoR V二重消化物中の1.3kbp断片。2.05kbpのEcoR V−Bgl II断片によりプローブされた膜は次の断片を含有する:EcoR I/Sal I二重消化物中の約11kbpの断片、Xho I消化物中の2.3kbp断片及び2.1kbp断片、Xho I/Xba I二重消化物中の2.3kbp断片及び1.4kbp断片、Kpn I消化物中の1.2kbp断片、並びにEcoR V/Bgl II二重消化物中の2.0kbp断片。
ハイブリダイズする断片の内の４断片、すなわち使用されたプローブと相同性を有するがしかしその一端がpGW1800中に存在する配列の外側にある断片については、その存在及び最小サイズのみがpGW1800の制限地図から推定することができる。これらの断片は、2.05kbpのEcoR V−Bgl IIプローブの場合にはEcoR I/Sal I中の断片、Xho I消化物中の2.1kbp断片及びKpn I消化物中の3.2kbp断片であり、そして1.45kbpのEcoR I−Bgl IIプローブの場合にはKpn I消化物中の2.8kbp断片である。これらの断片はいずれも、pGW1800の制限地図から推定される最小サイズより大である。A.ニガーのゲノムDNAの異るハイブリダイズする断片をpGW1800の消化物中に存在する関連づけることができ、そしてすべてがpGW1800の制限地図から推定されるサイブに非常に近い計算されたサイズを有する。pGW1800のA.ニガー由来DNAはA.ニガーがN400のゲノムの部分の忠実な代表であることが確認される。
実施例3.9. pGW1900及びpGW1902の作製並びにその制限 分析
PG IIコード配列とハイブリダイズするファージPG I−λ７の8.6kbp BamH I制限断片（実施例3.6.、第４表を参照のこと）をベクターpUC9（Vieira,J.及びMessing,J.1982,Gene 19,259−268）に挿入して、逆方法の挿入部を有するプラスミドpGW1900（第３図を参照のこと）及びpGW1901を得る。５μｌのTE緩衝液中、1.5μｇのPG I−λ7 DNAに、スペルミジンの10mMストック溶液１μｌ、20UのBamH I、BRLにより推奨される反応緩衝液及び無菌蒸留水を加えて最終容量30μｌとする。消化されたサンプルに４分の１（v/v）のローディング緩衝液（loading buffer）（ローディング緩衝液＝H2O中0.25％ブロモフェノールブルー、0.25％キシレンシアノール及び15％Ficoll）を加える。反応断片をエチジウムブロミド（１μg/ml）を含有する１×TAE緩衝液（1l当り50×TAE緩衝液＝242gのTris、57.1mlの酢酸及び100mlの0.5M EDTA,pH8.0）中0.6％アガロースゲル上で分離する。
DNA断片をUV光のもとで可視化し、そして8.6kbpのBamH I断片を含有するゲル片を単離する。DNA断片、常法に従って電気泳動的に単離し、溶出を100Uにて１時間わたって行う。DNAを集め、そして２容量のエタノールで沈澱せしめる。エッペンドルフ遠心管中で30分間遠心した後、沈澱を集め、Speedvac中で乾燥せしめ、そして10μｌのTE緩衝液に溶解する。ベクターpUC9（μｇ）を、10UのBamH Iを用いて37℃にて1.5時間、20μｌの合計反応容量中で推奨されるBRL緩衝液を用いて線状化する。次に、１μｌのCIP溶液（約2U）を加え、そして混合物を37℃にて30分間インキュベートする。線状化されたベクターも電気泳動により調製する。これを約50ng/μｌのDNA濃度に相当する20μｌのTEに溶解する。連結反応において、１μｌの線状化されそしてCIP処理されたpUC9ベクター（50ng）及び４μｌのBamH I断片（約100ng）を適当なリガーゼ緩衝液中で1.2UのDNAリガーゼにより連結する。反応を14℃にて14時間進行せしめ、そして次にこの混合物をTEにより50μｌに稀釈する。
50μｌの得られる連結反応混合物を用いて、BRL M30クローニング／ジデオキシ配列決定マニュアル（参考文献11、30〜33頁）に記載されているようにして大腸菌を形質転換する。但し、フラスコを氷上に置く前に大腸菌DH5aF′を0.5〜0.7のOD550値に増殖せしめる。ヒートショックの後、細胞を氷上で２分間インキュベートしそして次に1mlのLB培地を加え、そして細胞を37℃にて１時間インキュベートする。細胞を低速遠心分離によりペレット化し、1mlの上清を除去し、そして細胞を穏やかに再懸濁する。次に、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレートであって、その上にIPTG/T−gal溶液（200μｌのH2O、30μｌの２％Ｘ−gal含有ジメチルホルムアミド及び20μｌの水中24mg/ml IPTG溶液）が拡げられたものの上にプレートする。このプレートを37℃にて一夜インキュベートする。数個の単一白色コロニーを用いて、0.1％グルコース及び75μg/mlアンピシリンを補充したLB培地中で一夜培養物を調製する。これらの培養物を用いてHolmes及びQuigley（参考文献12）のミニプレップ（miniprep）法によりプラスミドを単離する。供給者（BRL）の推奨に従って且つRNアーゼＡ（0.5mg/ml）の存在下で幾つかの制限酵素によりプラスミドを消化し、そして生成物をアガロースゲル上で分析する。予想通りのBamH I断片を生じさせるプラスミドを選択し、そしてこれらを担持する大腸菌細胞を−20℃にてグリセロール上に保持する。逆方向に挿入部を有するこの新規プラスミド〔pGW1900（第３図に示す）〕及びpGW1901を更なる実験に用いる。
pGW1900を大腸菌DH5aF′中で増加せしめ、そしてManiatisら（参考文献６、90〜91頁）により記載されているようにして、0.1％グリコース及び100μg/mlアンピシリンを補充したLB培地中での250mlの一夜培養物からプラスミドDNAを回収し、そして最後にTE緩衝液に再懸濁する。pGW1900はA.ニガーを形質転換するためにも使用されるので、塩化セシウム勾配中でのバンドの形成によりこれを精製する。TE中2.5mlのDNA溶液に3.3gのCsCl及び1mlのエチジウムブロミド（水中10mg/ml）を加える。ベックマンVTi 65.2ローター中で20℃にて16時間45,000rpmにて遠心分離を行う。UV光のもとで見ることができる２本の蛍光バンドの内、共有結合により閉じられた環状プラスミドDNAを含有する低い方のバンドを、チューブの溝に孔を空けて回収する。DNA溶液（約1ml）を水飽和ブタノールで５回抽出してエチジウムブロミドを除去する。次に、体積を水により15mlに調整し、そしてDNAを30mlのエタノールの添加により沈澱せしめる。DNAを遠心分離により集め、そして次にペレットを75％エタノールで１回洗浄し、そしてこれをTE緩衝液に溶解し、−20℃にて貯蔵する。
さらに、pGW1900のKpn I消化物から、2.7kbpのKpn I DNA断片をアガロースゲルの片から電気泳動的に単離し、そしてpEMBL18（Dente及びCortese,参考文献10）に挿入してプラスミドpGW1902（第４図を参照のこと）及びpGW1903をそれぞれ得る。
pGW1900及びpGW1902の物理的地図を作成するため、約１μｇのプラスミドDNA,BRLにより推奨される適切な緩衝液、及び10ユニットの制限酵素又は２種類の異る制限酵素の組合せを含有する幾つかの反応混合物を調製する。反応混合物をTAE緩衝液中１％アガロースゲル上で分析する。特定の断片の計算されたサイズから、第３図及び第４図に示す個々の制限酵素部位をそれぞれ確立する。
実施例3.10. A.ニガーNW756のポリガラクチュロナーゼ II遺伝子（pga II）の分子クローニング
A.ニガーNW756のゲノムDNAを、プローブとしてA.ニガーN400のpga II遺伝子（すなわち、pGW1800の1.2kbpのBamH I−Bgl II断片）を用いてサザンブロット分析により分析する。実施例7.1.に記載されている事項について２つの変更を行う。この場合、A.ニガーN400 pga II遺伝子の構造部分内で切断する制限酵素を選択し、そしてハイブリダイゼーション条件を一層ストリンジェントにする。すなわち、実施例7.2.に記載の「ホモロガス」条件を用いる。ここで、BamH I消化物に3.3kbpの単一のハイブリダイズする断片が検出される。これらのハイブリダイゼーション条件下で単一の配列が検出され、従ってこの配列をA.ニガーNW756のpga II遺伝子と定義する。3.3kbpの単一のハイブリダイズするHinc II断片が観察され、これは構造遺伝子中にHinc II部位が存在しないことを示す。ハイブリダイズするXho I−Bgl II断片は5.5kbpである。これらの結果は実施例3.7.に示されるデータ配列表の配列番号（SEQ ID No.）２に示されるA.ニガーN400のpga IIのDNA配列と一致しない。及び従って、A.ニガーNW756のpga II遺伝子はA.ニガーN400のpga II遺伝子と同一ではないと結論される。
実施例2.においてN400株について記載した方法にわずかな変更を加えてA.ニガーNW756のゲノムライブラリーを作製する。アスペルギルスのDNAを消化するためにSau 3A Iがそのイソシツオマー（isoshizomerl）Mbo Iの代りに使用される。NW756株のライブラリーはEMBL4（参考文献９）の密接に関連するλでクロ−EMBL3において作製される。すでにBamH I及びEcoR Iにより消化されそしてホスファターゼにより処理されたEMBL3 DNAがプロメガ（Promega）からか販売されている。実施例3.3.に記載したようにして、得られるライブラリーの部分をプレートしそしてプラークリフトを調製する。次に、実施例7.2.に記載したホモロガス条件を用いて、フィルターをpGW1803の1.2kbp BamH I−EcoR I断片とハイブリダイズせしめる。陽性ファージを再スクリーニング段階において精製し、そして次にこれらのファージのDNAを実施例3.4.に記載されているようにして精製する。酵素Bgl II及びXho Iを用いてDNAを制限分析にかける。次に、この断片を含有する陽性ファージの１つの5.5kbp Xho I−Bgl II断片を実施例3.6.に記載したようにして単離する。次にこの断片を、BamH I及びSal Iで消化したpEMBL18に連結し、そして得られる連結混合物を用いて大腸菌JM109（実施例3.6.）を形質転換する。次に、形質転換体を、実施例7.3.において記載したようにして「ヘテロロガス」条件下でのコロニーハイブリダイゼーションにより分析する。陽性クローンのプラスミドDNAを精製し、そして次にこれを用いて物理的地図を作成する（実施例3.7.）。
pGW1756の制限地図を第６図に示す。pGW1756は、A.ニガーNW756 pga II遺伝子を含有する5.5kbpのXho I−Bgl II断片をベクターpEMBL18に挿入したものである。
実施例4. ポリガラクチュロナーゼ遺伝子のヌクレオチ ド配列の決定
実施例4.1. A.ニガーN400のポリガラクチュロナーゼII 遺伝子（pga II）
pGW1800及びpGW1803の適当な制限断片を用いてアガロースゲル電気泳動から単離し、そしてベクターに対して２〜10倍過剰の断片を用いてM13mp18RF及びM13mp19RFベクターに連結する。前記のようにして大腸菌JM109の形質転換を行う。すなわち、ヒートショックの後、BRL M13クローニング／ジデオキシ配列決定マニュアル（参考例11、34頁）に記載されているようにして細胞を直接プレートする。Ausubelら（参考文献40、セクション7,3,9）により記載されているようにして組換えファージからの単鎖DNA鋳型の単離を行う。上清と共に細胞を収得し、そして次にこれらの細胞を−20℃にてグリセロール培養物として貯蔵する。
次に、こうして得られた、pGW1803の2.4kbp Xba I−EcoR I断片をM13mp18のポリリンカーに挿入して成るクローンの１つを、それぞれHind III,Pst I,BamH I及びNco I部位からの配列決定データーが得られるように操作する。大腸菌JM109及び意味のあるクローンからYM培地での別々の一夜培養物を調製し、後者の場合には前記グリセロール培養物の一部を接種物として使用する。次に、200mlの２×YT培地に0.4mlのJM109培養物を接種し、そして次にこの培養物を37℃にて回転振とう機中で2.5時間インキュベートする。次に意味のあるクローンの一夜培養物20mlを加え、そして回転振とう機中でのインキュベーションを５時間続ける。次にpGW1803について前に記載したようにして複製型DNAをこれらの細胞から単離する。次に、このDNAをそれぞれHind III,Pst I,BamH I及びNco Iにより消化する。次に、BamH I及びNco Iにより消化されたDNAをSal Iにより消化し、次にフェノール／クロロホルム（1:1）及びクロロホルムにより抽出し、そして次にエタノール沈澱を行う。次に、非適合付着末端を５ユニットのT4 DNAポリメラーゼを用いてManiatisら（参考文献６、117頁）により記載されている緩衝液中でそして0.1mMずつのdCTP,dATP,dGTP及びdTTPの存在下でフィル−インする。25μｌの反応混合物を37℃にて５分間インキュベートし、そして次に５μｌの0.5M EDTA（pH8.0）を添加し、そしてこの混合物をフェノール抽出する。こうして得られた４個のDNA調製物中に存在する小DNA断片を0.7％低融点アガロースゲル（BRL）での電気泳動により除去し、そして大断片を含有するゲル片を単離する。次に、これらのDNA断片をT4 DNAリガーゼを用いて環化する。次に、得られる連結反応混合物を用いて、前記のようにして大腸菌JM109を形質転換する。
Bcl Iは基質のメチル化に対して感受性であるので、このものは大腸菌JM109または大腸菌DH5αＦ′から単離されたプラスミドDNAを切断することができない。従って、すでに単離されたpGW1800及びpGW1803を用いて大腸菌JM110（Yanisch−Perronら、参考文献29）を形質転換し、そして次に実施例3.8.に記載したようにしてプラスミドDNAを単離する。但し、大腸菌JM110の増殖のために用いられるすべての培地には、0.1％のカザミノ酸を加える。大腸菌JM101から単離されたプラスミドDNAを用いて、Bcl I部位からの配列分析を可能にするサブクローンを得る。
得られるクローンを、ファルマシカ製のT7 Sequencing（商標）キットにより、供給者により推奨される条件下で配列決定する。幾つかのケースにおいては、こうして得られた配列決定データーを用いて、Caruthers（参考文献８）の方法による特異的オリゴヌクレオチドの合成をプログラムする。これらのオリゴヌクレオチドは：
Figure 0003576549
である。次に、これらのオリゴヌクレオチドを、関連する鋳型のための特異的配列決定プライマーとして用いる。プライマーHR6439はM13に対して使用された場合２個の二重の配列決定ラダー（ladder）を提供し、そしてそれ故にこのプライマーは、ファルマシアの指示に従ってアルカリ変性されたpGW1800の二本鎖配列決定のために使用される。
pGW1800上に位置するPG IIをコードする遺伝子（pga II）の配列を両DNA鎖から得る。下流方向（１位のXba Iから約3028位のPvu IIの方向へ）の配列決定を、それぞれXba I（１位）、EcoR V（およそ334位）、Hind III（およそ557位）、Pst I（およそ827位）、Bcl I（およそ1056位）、BamH I（およそ1158位）、Hinc II（およそ1344位及びおよそ1974位）、Kpn I（およそ1565位及びおよそ2706位）、Nco I（およそ1749位）及びBgl II（およそ2379位）部位から行い、Bgl II部位の領域を配列決定するためにプライマーHR6425を用いる。逆方向の配列決定はPvu II（およそ3028位及びおよそ1442位）、Kpn I（およそ2706位及びおよそ1565位）、Bgl II（およそ2379位）、Hinc II（およそ1974位）、BamH I（およそ1158位）、Bcl I（およそ1056位）、Pst I（およそ827位）、Hind III（およそ557位）、及びEcoR V（およそ334位）部位から行い、Hinc II（およそ1974位）及びKpn I（およそ1565位）を越えて配列決定するのにプライマーHR6439及びHR6440をそれぞれ用いる。
pga IIの配列を配列表−配列番号（SEQ ID No.）２に示す。3031bpの配列がpGW1800の１位のXba Iの第一ヌクレオチドから始まり、そしてpGW1800の制限地図中のおよそのマップ位置3050に示されるPvu II部位の最終ヌクレオチドで終る。pga II遺伝子は、プロモーター領域の1356ヌクレオチド、構造部分の1138ヌクレオチド（52ヌクレオチドの仮定的イントロンを含む）及び転写ターミネーター領域の537ヌクレオチドを含んで成る。
シグナル配列からすぐ下流の配列及びXho I開裂部位は、システインが３位に存在するであろうという予想（実施例1.3.）のもとに、ポリガラクチュロナーゼIIの5kDa断片について得られる配列と完全に一致する配列をコードしている。
DNAは27個のアミノ酸のリーダーペプチドをコードしており、アルギニンが成熟蛋白質配列の前の最後のアミノ酸である。このリーダーペプチドは蛋白質分解的開裂により除去されなければならない。シグナルペプチド開裂部位はアルギニン残基のすぐ後に見出されず、そして一般に荷電したアミノ酸のすぐ後ではない（von Heijne;参考文献39）から、リーダーペプチドは少なくとも２つの蛋白質分解段階で除去される。すなわち、リーダーペプチドはプレプロ配列を表わす。この場合、シグナルペプチダーゼはプレ−配列、又はシグナル−ペプチド、を開裂し、他方、残りのプロ−配列は他のプロテアーゼにより開裂される。
ポリガラクチュロナーゼII構造遺伝子は１個のイントロンを含有し、1987位〜2038位のヌクレオチド配列から成る可能性が最も高い。この配列は、３種類すべての可能なリーディングフレーム中の終止コドンを含む。このイントロンの存在が、得られた蛋白質配列データー（実施例１を参照のこと）と一致するようにリーディングフレームを変える。イントロンの前のリーディングフレームはシアノゲンブロミド断片のアミノ酸配列（実施例1.3.）により確認され、イントロン後のリーディングフレームはトリプシン分解ペプチドTP4のアミノ酸配列（実施例1.5.）により確認され、この配列はまた2183位から2225位までのヌクレオチド配列からも推定することができる。イントロンの５′−スプライス部位GTAAGCは真菌５′−コンセンサス配列GTPuNGTに類似しており、他方３′−スプライス部位TAGは真菌コンセンサス３′スプライス部位PyAG（参考文献41）と完全に一致する）。
実施例4.2. A.ニガーN400のポリガラクチュロナーゼＩ （pga I）遺伝子
実施例3.9.に記載したようにしてpGW1900及びpGW1902からアガロースゲル電気泳動の後に適当な制限断片を単離する。これらをBRL M13クローニング／ジデオキシ配列決定マニュアル（参考文献11）に従ってM13mp18RF及びM13mp19RFベクターに連結する。M13クローニング／配列決定系についてのファルマシア・マニュアルに記載されているようにしてコンピテント細胞を調製する。Messingら（参考文献30により記載されているようにして大腸菌JM101の形質転換を行う。常法（例えば、参考文献11、29〜34頁を参照のこと）に従って組換えファージからの単鎖DNA鋳型の単離を行う。生ずるクローンの配列決定を、T7シーケンシング（商標）キット、ファルマシア（ウプサラ、スエーデン）により、供給者により推奨される条件を用いて行う。
pGW1900を、およそのマップ位置750のEcoR I部位からおよそ3790位のHind III部位の近くに位置するおよそのマップ位置3900のCla I部位まで配列決定する。Caruthers（参考文献８）の方法を用いて幾つかのオリゴヌクレオチド（304〜307）を合成する。これらのヌクレオチドは下記の配列を有する：
Figure 0003576549
これらを関連する鋳型のための特異的配列決定プライマーとして使用する。
T7シーケンシングキットについての供給者の指示に従って、オリゴヌクレオチド307を用いて、アルカリ変性したpGW1900の二本鎖配列決定を行う。pga I遺伝子の完全な配列は配列表−配列番号（SEQ ID No.）１に示される。この配列は両鎖について得られた配列決定データーに基く。
2,495bpのpga I配列はpGW1900のおよそのマップ位置6280のEcoR I部位の第一ヌクレオチドから始まり、そして3880位に示されるHind III部位に近いCla I部位の最後のヌクレオチドの後にヌクレオチドで終る。pga I配列は、プロモーター領域の909ヌクレオチド、52bp（イントロンＡ）及び62bp（イントロンＢ）の２個の仮定的イントロンを含む構造部分の1218ヌクレオチド、並びに転写ターミネーター領域の366ヌクレオチドを含んで成る。
成熟ポリガラクチュロナーゼＩ（実施例1.4.を参照のこと）及び21kDaシアノゲンブロミド断片（実施例1.5.）について得られるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から誘導することができ且つ1003位から始まるアミノ酸配列と完全に一致する。従って、DNA配列は31個のアミノ酸のリーダーペプチドをコードし、リジンは成熟蛋白質が始まる前の最終のアミノ酸である。リーダーペプチドがアルギニン残基で終るPG IIの場合と類似の理由により、このPG Iリーダーペプチドは、やはり少なくとも２段階の蛋白質分解段階において除去されるプレプロ−配列を表わす。プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列はヌクレオチド配列の1277位から始まる。実施例1.に記載した5.5kDaシアノゲンブロミドペプチド断片について決定したＮ−末端アミノ酸配列ヌクレオチド配列に基く仮定のアミノ酸配列との間に完全な一致が存在する。
ポリガラクチュロナーゼＩ構造遺伝子は２個のイントロンを含有する。イントロンＡは1138位〜1189位のヌクレオチド配列から成る。５′−スプライス部位GTATGTは真菌５′−スプライス・コンセンサス配列GTPuNGT（参考文献41）と一致し、そしてラリアト（rariat）配列GCTAAC及び３′−スプライス部位TAGも既知のコンセンサス配列PuCTPuAC及びPyAGと一致する。このイントロンの存在が、より遠くに存在する5.5kDaのシアノゲンブロミド断片について得られる蛋白質配列データー（実施例1.を参照のこと）と一致するようにリーディングフレームを変える。第二イントロン（Ｂ）はヌクレオチド配列1610位〜1671位から成る。ラリアト配列及び３′−スプライス部位の両者が既知のコンセンサス配列と一致する。５′−スプライス部位GCACGAはコンセンサス配列GTPuNGTと一致しないが、しかし５′−スプライス部位のGC及び５′−スプライス部位に対して＋６位のＡは他の幾つかの遺伝子において見出されている（参考文献41及び43を参照のこと）。
イントロンＢの存在は次の主張に基く：
ａ）これがリーディングフレームを変え、他の２つのリーディングフレーム中には早すぎる終止コドンが存在する。
ｂ）pga IIのイントロンが同じ位置に存在し、そしてこのイントロンに先行するアミノ酸配列Asn−Ser−Gly−Gluは両蛋白質において同じである。この仮定のイントロンのすぐ後のヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列間に強い相同性の領域が見出される。
Figure 0003576549
実施例4.3. A.ニガーN400のポリガラクチュロナーゼ類 の関の相同性
A.ニガーから単離されるポリガラクチュロナーゼPG I及びPG IIは、実施例1.2.に記載したように、同じ反応を触媒しそして免疫学的に相互に関連する。
これらの酵素をコードする遺伝子もまた密接に関連する。なぜなら、実施例7.2.に記載するように、pga II遺伝子によりA.ニガーN400ゲノムライブラリーから他のポリガラクチュロナーゼ遺伝子が単離されるからである。長さが２残基異るこれらの成熟酵素の仮定のPG I及びPG IIアミノ酸配列の比較は高度な相同性を示す。これらのデーターは、PG類をコードする遺伝子が密接に関連しており、そしてポリガラクチュロナーゼ遺伝子ファミリーの構成員を代表することを、明瞭に示している。
実施例5. 選択マーカーとしてのA.ニガーpyrA遺伝子及 び同時形質転換プラスミドとしてのポリガラクチュロナ ーゼＩ又はII遺伝子を有するプラスミドを用いてのA.ニ ガーの同時形質転換
実施例5.1. A.ニガーを形質転換するために使用される プラスミドの増加及び精製
pGW613（Goosenら、参考文献13）の一層短い変形体でありそしてやはりpyrＡ遺伝子を含有するプラスミドpGW635、及びポリガラクチュロナーゼII遺伝子を含有するプラスミドpGW1800をそれぞれ大腸菌MH1及びJM109において増加せしめる。プラスミドpGW1900は大腸菌DH5αＦ′において増加せしめる。Maniatisら（参考文献６、90〜91頁）及び実施例3.7.に記載されているようにして250ml一夜培養物からプラスミドDNAを回収する。
実施例5.2. ウリジン栄養要求性変異株N593のプロトプ ラストの調製及び形質転換
親株N400の誘導体であるA.ニガーN593株（cspA,pyrA）は、Goosenら（参考文献13）により記載されているようにして、プリンの存在下で酵母における場合（Boekeら、参考文献14）と同様にして毒性類似体５−フルオロ−オロチン酸に対する陽性選択により得られた。
0.5％酵母エキス、0.2％カザミノ酸、10mMウリジン（Janssen Chemie）及び50mMグルコースが補充された液体最少培地にA.ニガーN593の分生胞子106個/mlを接種し、そして30℃にて20時間、ニュー・ブルンスウィック（New Brunswick）回転振とう機においてインキュベートする。菌糸をミラクロス（Miracloth）を通して濾過により収得し、そして1.33Mソルビトール、10mM Tris−HCl（pH7.5）、50mM CaCl2の組成を有する等張最少培地（STC）により洗浄する。1gの菌糸を20mlのSTCに再懸濁する。150mlのフィルター除菌したノボチーム（Novozyme）234（ノボ・インダストリーズ、デンマーク）を添加し、そしてこの混合物を95rpmの振とう機で30℃にてインキュベートすることにより２時間以内に菌糸からプロトプラストを放出せしめる。ガラス綿の栓をした漏斗を用いて濾過することにより残留菌子からプロトプラストを分離する。次に、冷STCを40mlの容量まで加え、そして混合物を10分間氷上に置く。プロトプラストを遠心分離（2,500rpm、10分間）により回収し、そしてペレットを5mlのSTCに再懸濁する。プロトプラストをもう一度ペレット化し、そして最後に1mlの冷STCに再懸濁する。
形質転換のため、５×106個のプロトプラストを200μｌとし、次にこれを１μｌのpGW635及び20μｇのpGW1800又はpGW1900と共にインキュベートする。プロトプラストにプラスミドDNAを添加した後、50μｌのPCT（10mM Tris−HCl（pH7.5）、50mM CaCl2、25％ PEG6000）を加え、そしてインキュベーション混合物を氷上に20分間置く。次に、他の2mlのPCTを加え、そして混合物を室温にてさらに５分間インキュベートする。最後に、4mlのSTCを加え、そして混合する。この最終形質転換溶液の1mlのアリコートを、0.95Mシュークロースで安定化された液化した等張MM上層寒天4mlと混合する。このプロトプラスト混合物を、同じ等張最少培地を含有する寒天プレート上にプレートし、そしてこれらを30℃にてインキュベートする。適切な対照実験には、プラスミドDNAを用いないで及び2.5mMウリジンを含む非−安定化最少培地上で同様に処理されたプロトプラストを含む。
30℃にて３日間の増殖の後、胞子を形成しよく増殖する形質転換体が出現する（150個の形質転換体／μｇのpGW635）。他方、多数のおそらく失敗の形質転換体が出現する。pGW1800により約300の形質転換体が得られ、そしてpGW1900により約100の形質転換体が得られる。pGW1800及びpGW1900からのそれぞれの形質転換体の内、20個のコロニーを拾い上げ、個々の形質転換体の胞子を採取し、そして50mMグルコース最少培地上で別々にプレートすることによりコロニーを得、これを再度純化しそして次にこれを用いて更なる形質転換体分析のための胞子を増加せしめる。
実施例5.3. ペクチン含有固体培地上でのハロー形成に よるA.ニガーN593株のポリガラクチュロナーゼ過剰生産 同時形質転換体の選択
実施例5.2.により記載されたようにして得られた、pGW1800により形質転換された約200コロニー及びpGW1900により形質転換された約100コロニーを、先行する精製を伴わないコロニースクリーニング法によりポリガラクチュロニダーゼ活性の増加についてスクリーニングする。スクリーニングに使用される培地は２％（w/v）グルコース、0.5％リンゴペクチン（エステル化度34.8％、0bipectin、Bischoffszell）、最少培地塩及び胞子要素、6g/l NaNO3、0.2％配列エキス、0.2％ペプトン、0.004％Toriton X−100、及び1.2％の寒天を含んで成る。ペトリ皿の中央に接種しそして30℃にて２日間インキュベートする。コロニーを一夜冷所に貯蔵する。次に、5mlの0.05％ルテニウムレッド溶液の上層を添加し、これを振とうしながら５分間インキュベートする。次に、蒸留水にて５分間洗浄することにより未結合の色素を除去する。これらの条件下でのポリガラクチュロナーゼの生産は形成されたハローのサイズにより示される。こうして分析された形質転換体の約50％が野生タイプより強いポリガラクチュロナーゼ活性を有する。
pGW1800形質転換体の20個のコロニー及びpGW1900形質転換体の７個のコロニーをペクチン含有固体培地上に形成されるハローのサイズに基いて拾い上げられ、そして増殖の45時後のこれらの陽性コロニーの二次スクリーニングの後、形質転換体のそれぞれの６個を最終的に拾い、そして実施例5.2.に記載されているようにして純化される。
実施例5.4. ポリガラクチュロナーゼII形質転換A.ニガ ー株のゲノム分析
実施例5.2.又は5.3.に従って得られる形質転換体並びに野生型株N402を、0.5％酵母エキス、0.2％カザミノ酸、50mMグルコース及びNaNO3（6g/l）を補完した溶体最少培地で培養する。30℃にて18時間の増殖の後、DNAを抽出しそして同時形質転換されたプラスミドの存在について分析する。前にすでに記載したようにしてA.ニガーDNAを単離する。
染色体DNA（２μｇ）の消化物を、50mM Tris−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2、100mM NaCl及び4mMスペルミジンから成る200μｌの反応容量（反応混合物に添加する前にTris塩基によりpH7.5に調整してある）中で37℃にて調製する。20UのEcoR I及びSal Iを添加し、そして反応混合物を37℃にて２時間インキュベートする。次に、更なる20Uの両酵素を添加し、そしてインキュベーションをさらに２時間続ける。次に、反応混合物（200μｌ）を100μｌのクロロホルムにより抽出する。次に、1/10（v/v）の3M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）及び2.5容量のエタノールの添加によりDNAを水相から沈澱せしめる。４℃にて１時間のインキュベーション及び遠心分離の後、DNAペレットを空気乾燥し、そして20μｌのサンプル緩衝液に溶解する。EcoR I/Sal Iにより消化されたA.ニガーN403のDNA及び形質転換体のDNAを、PG IIプローブとしてpGW1800の1.2kbp BamH I−Bgl II断片との前記サザングロットのハイブリダイゼーションにより分析する。
同時形質転換頻度は75％以上であることが見出される。９形質転換体の幾つかがサザンブロットにより分析されている。プローブはN402において大ゲノム断片とハイブリダイズする。pGW1800配列を含有する形質転換体のゲノムブロットにおいて、4.1kbp EcoR I−Sal I断片が見出される。コピー数に依存して、このバンドの強度が異る。分析されたケースにおいて、野生型遺伝子を示すゲノム断片が常に見出され、ヘテロロガス組込が示される。以後N593/pGW1800−27と称するA.ニガー形質転換体におけるポリガラクチュロナーゼII生産の分析を詳細な例として記載する（実施例6.）。DNA稀釈シリーズから、コピー数は20オーダー以上であると推定される。野生型のハイブリダイズする断片及び4.1kbp断片のほかに、少数の微量のハイブリダイズする断片がこの株において見出され、これはタイプII組込み（integration）現象又は転移（rearrangement）のボーダー断片を示す。
実施例5.5. 形質転換されたA.ニガー株及びA.ニガーN4 02によるポリガラクチュロナーゼIIの生産
実施例5.2.に記載した20個のpGW1800形質転換体及び実施例5.3.に記載した６個のpGW1800形質転換体を、尿素（4.2g/l）、１％（w/v）リンゴペクチン（d.e.61.2％）及び１％（w/v）小麦糠が添加された最少塩培地から成る培地に増殖せしめる。250rpmのガレンカンプ（Gallenkamp）回転振とう機を用いて30℃にて43時間培養物を増殖せしめ、そして培養濾液を得る。ブフナー漏斗を用いミラクロス（Miracloth）により濾過して菌糸を除去する。これらのサンプルのPG II含量はウエスタンブロッティングにより行い、これはバイオラド（Biorad）指示マニュアルに従ってアルカリホスファターゼ検出法を用いて行う。ウエスタンブロットのシグナルに基いて、実施例5.2.において無作為に得られた20個の形質転換体の内、70％がA.ニガーN402より実質的に多くのポリガラクチュロナーゼIIを生産する。プラークスクリーニング法（実施例5.3.を参照のこと）を用いてハローのサイズに基いて選択された形質転換体はすべてが、A.ニガーN402より実質的に多くの酵素を生産する。
A.ニガーN402株、並びにN593/pGW1800−27、N593/pGW1800−30及びN593/pGW1800−37と称する３個の形質転換体を選んでポリガラクチュロナーゼ活性を選択する。後者の３株は実施例5.2.において得られたpGW1800形質転換体のセットからのものである。
N593/pGW1800−30及びN593/pGW1800−37の両者はpGW1800の多コピーを含有するがN593/pGW1800−27よりコピー数が少ない。これらの株を、１％（w/v）乾燥し且つ粉砕した甜菜パルプを添加した１％ペクチン培地（d.e.61.2％）で、前記の条件を用いて増殖せしめる。還元糖及びPG活性の阻害物質を除去するため、醗酵の後架橋アルギネートを用いてPG IIを部分精製する。1mlの培養濾液を1mlの20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）により稀釈し、そして次にこの緩衝液で平衡化した2mlのベッドボリウムの架橋アルギネート（5.2ml/g）を含む小カラムに付加する。次に、カラムを4mlの酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、そして次に1M NaClが添加された20mM酢酸ナトリウム（pH4.2）4mlを用いてカラムからPG IIをパルスする。次に、溶出液中のPG活性を記載されている（参考文献２）ようにして決定し、得られた値から培養濾液中のPG活性を計算する。
接種後20時間で得られた培養濾液から次の活性が計算された:N402株、N593/pGW1800−30株、N593/pGW1800−37株及びN593/pGW1800−27株につきそれぞれ2.2,5.6,5.8及び10.8ユニット/ml。40時間後に得られた培養濾液については、これらの値は同じ順序で2.8,13.5,16.4及び30.9ユニット/mlであった。
従って、pGW1800を用いて好結果にA.ニガーを形質転換することにより非常に高いPG活性を生成せしめることができることが明らかである。
実施例5.6. 形質転換されたA.ニガー株並びにA.ニガー N402及びN593株によるポリガラクチュロナーゼＩの生産
実施例5.2.に記載したpGW1900形質転換体17株及び実施例5.3.に記載したpGW1900形質転換体６株並びにA.ニガーN402株及びN593のpyr+形質転換体を、尿素（4.2g/l）、１％（w/v）リンゴペクチン（d.e.61.2％）及び１％甜菜パルプを添加した最少塩培地からなる培地に増殖せしめる。培養物を30℃にて64時間、ガレンカンプ回転振とう機を用いて250rpmにて増殖せしめ、そして培養濾液のサンプルを20時間後及び39時間後に採取する。これらのサンプルのPG I含量を実施例5.5.のPG II含量としてウエスタンブロットにより試験する。
ウエスタンブロットのシグナルに基いて、23個の形質転換体の内65％がA.ニガーN402より実質的に多くのPG Iを生産する。ハローサイズに基いて選択された形質転換体のすべてがA.ニガーN402より多くのPG Iを生産し、そして６形質転換体の内４株が高生産株である。活性が示すところによれば、この培地において20時間後の活性は39時間後のそれよりも高い。12の異るPG I形質転換A.ニガー株について、活性は2.8〜7U/mlの間で異り、他方非形質転換株N402及びA.ニガーN593/pGW653形質転換体にそれぞれ0.5及び0.8U/mlを生産する。この活性は少なくともPG I及びPG IIの両者の野性型レベルの結果であり、他方形質転換体における増加は更なるPG I発現の結果である。
実施例6. PG II生産性A.ニガー形質転換体N593/pGW180 0−27からのポリガラクチュロナーゼII単離、精製及び 特徴付け
実施例5.4.に記載したA.ニガーPG II形質転換体N593/pGW1800−27をペトリ皿中の完全培地上で30℃にて３〜４時間増殖せしめることにより分生胞子を生成せしめる。0.005％トウィーン80/皿を含有する5mlの無菌塩溶液中に分子胞子を収得する。この胞子懸濁液をグリフィン振とう機上で20分間撹拌し、そして胞子を計数した後106胞子/mlを、300mlの無菌増殖培地を含有する1lのシリコーン処理エルレンマイヤーフラスコに加える。この培地は、窒素源としての70mM塩化アンモニウム並びに炭素源としての１％（w/v）リンゴペクチン（エステル化の程度61.2％）及び１％（w/v）甜菜パルプを含有する最少培地である。ガレンカンプ回転振とう機を用い200rpm、30℃にて43時間菌糸を増殖せしめる。増殖後、ブフナー漏斗を用いミラクロスを通して濾過することにより菌子を除去する。1N NaOHを用いて培養濾液をpH4.2に調製する。微生物の増殖を回避するため、その後のすべての段階において0.02％のナトリウムアジドを添加する。
実施例6.2. A.ニガー形質転換体N593/pGW1800−27から 得られるポリガラクチュロナーゼIIの精製
培養濾液（約2.5l）を、20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）により平衡化した架橋アルギネートカラム（2.5×25cm）に適用する。付加の後、カラムを１ベッドボリウムの平衡緩衝液、１ベッドボリウムの20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.6）、前記緩衝液中1,200mlの直線塩グラジエント（０〜0.5M NaCl）、及び最後に同じ緩衝液中275mlの1M NaCl溶液により逐次溶出する。6mlずつの画分を集め、そしてそれらの酵素活性について実施例1.1.に記載したようにして試験する。活性画分の中心部分をプールし、そして20mM bis Tris−HCl緩衝液（pH6.0）に対して３回透析する。次に、最終酵素溶液（475ml）を、同じ緩衝液で平衡化したDEAS−Sepharose Fast Flowカラム（ファルマシア）に適用する。洗浄した後、NaClグラジエントを同じ緩衝液中で適用し、そしてポリガラクチュロナーゼ活性が約100mM塩化ナトリウムにおいて溶出する。活性画分をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をにより分析する。高PG II含量のこれらの画分をプールし（54ml）、20mM bis Tris−HCl緩衝液（pH6.0）に対し透析し、そしてさらに同じ緩衝液中で平衡化されたモノＱカラム（ファルマシア）上で精製する。付加した後、塩グラジエント（０〜1M NaCl）を適用することにより酵素を溶出する。塩化ナトリウムグラジエントの0.2〜0.26M部分及びグラジエントの0.26〜0.34Mに対応する２個の異るプールＡ及びＢに酵素を集める。両画分はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の際単一バンドを示しこれはPG IIと同じ位置である。
実施例6.3. ポリガラクチュロナーゼIIのＮ−末端部分 のアミノ酸配列の決定
実施例6.2.に従って精製された一緒にされたプールＡ及びＢからの200μｌのPG IIを、1lのミリホア濾過された蒸留水に対して３回透析する。実施例1.3.に記載されているようにしてアプライド・バイオシステム・モデル470A気相蛋白質配列決定機を用いてアミノ酸配列を決定する。この酵素について下記のＮ−末端アミノ酸配列が決定される：
Figure 0003576549
この蛋白質中のシステイン残基は修飾されていなかったので検出されない。これらは配列の３位（Ｘ）及び18位（Ｘ）に存在するようである（実施例1.3.を参照のこと）。最後の３アミノ酸残基は低レベルでのみ検出される。この純粋な酵素から得られた配列は、PG II遺伝子のヌクレオチド配列から推定されるPG IIのＮ−末端のアミノ酸配列（実施例4.及び第４図、式IIを参照のこと）に正確に対応する。対応するヌクレオチド配列はまた予想される位置、すなわち残基３及び18にシステイン残基を示す。この配残はまた、5kDaシアノゲンブロミド断片（実施例1.3.を参照のこと）について決定された配列に対応し、従ってこの配列は蛋白質のＮ−末端に対応する。
実施例6.4. 形質転換体N593/pGW1800−27から精製され たポリガラクチュロナーゼIIの性質
実施例6.2.に従って精製された酵素を実施例1.1.に記載したようにしてラピダーゼから精製した酵素と比較する。両酵素はSDS−ポリアクリルアミドゲル上で38kDaの同一の見かけ分子量を示す。PG IIの連続エピトープとのみ反応しそしてPG I,III A,III B又はIVとは反応しないモノクローナル抗体はまた実施例5.2.に従って精製された酵素と反応する。等電点電気泳動の際、実施例6.1.及び6.2.に従って生産されそして精製されたPG IIはPG IIのp I位（p I＝5.2）と同じp I値にシャープなバンドを示す。PG IIのわずかな不均一性のため、pH3−７又はpH3−10のpHグラジエントを使用する場合、より低いp I値が観察された。
実施例7. ポリガラクチュロナーゼII遺伝子に関連する 配列の検出及び単離
実施例7.1. ポリガラクチュロナーゼII遺伝子に関連す る配列の検出
前記の方法を用いてA.ニガーNW756からDNAを単離する。DNAを酵素BamH I,EcoR I及びこれらの酵素の組合わせにより、実施例5.4.に記載されているようにして消化する。次に、DNA断片を0.6％アガロースゲル上で分離し、そして次にこれらを実施例3.7.に記載したようにしてニトロセルロース膜に移す。乾熱した膜をあらかじめ加温されたハイブリダイゼーション緩衝液中で60℃にて２時間プレハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション緩衝液は、Church及びGilbert（参考文献38）に記載されているように、１％BSA（ベーリンガー）、1mM EDTA、0.5Mリン酸ナトリウム（pH7.2）（1l当り89.0gのNa2HPO4・2H2O及び4mlの85％H3PO4から成る）及び７％SDSから成り、そしてこれに剪断されそして変性されたニシン精子DNAが新しく0.1mg/mlの濃度に添加される。次に、実施例3.7.に記載されたようにして調製したpGW1800のニック−トランスレーションされた1.2kbp BamH I−Bgl II断片を加え、そして穏やかに振とうしながらハイブリダイゼーションを60℃にて44時間進行せしめる。次に、膜を２回あらかじめ加温された（60℃）ハイブリダイゼーション緩衝液（精子DNAを含まない）中で２回洗浄する。次に、膜を２回20分間60℃にて、５×SSC、0.1％SDS及び0.1％Na4P2O7・10H2Oから成るあらかじめ加温された緩衝液中で洗浄する。次に、膜を乾燥し、そして−60℃にて３日間コダックXAR5に暴露する。
これらの条件下で非特異的ハイブリダイゼーションは観察されないが、これはハイブリダイズするDNA断片の有意な汚れが存在せず、そしてλサイズマーカーとプローブとのハイブリダイゼーションが存在しないためである。各レーンにおいて幾つかのハイブリダイズするバンドが観察されるが、各レーンにおいて１つのバンドが他のバンドに比べて非常に強い。これらの強いバンドはBamH I消化物中の3.3kbp断片、EcoR I消化物中の20kbpより長い断片、及びBamH I/EcoR I二重消化物中の3.3kbp断片に相当する。低強度のバンドはBamH I消化物中の17,9.5,6.4及び20kbpの断片、EcoR I消化物中の15,6.5及び4.8kbpの断片、並びにBamH I/EcoR I二重消化物中の7.6,6.4,4.0,3.7及び2.0kbpの断片に対応する。
特異的ハイブリダイゼーションシグナルが観察されるという事実から、A.ニガーN400のPG II遺伝子を用いてA.ニガーNW756から得られたDNA中の特異的配列を検出することができる。強いハイブリダイゼーションシグナルを与える断片はPG II遺伝子を担持していると推定される。原理的には、使用したプローブと相同な領域内及びその末端に近いDNAを制限酵素が開裂された場合に弱いハイブリダイゼーション断片が生じ得る。しかしながら、これは本実施例において観察されるハイブリダイズする大断片の数を十分に説明することができない。従って、PG II遺伝子と相同様を共有するがそれと同一ではない特定のDNA断片が検出されたことになる。これらのDNA配列は異るPG遺伝子であると予想され、これはPG類が蛋白質レベルで相同性を有する（実施例1.4.を参照のこと）事実と一致する。
実施例7.2. ポリガラクチュロナーゼII遺伝子に関連す る遺伝子の単離
A.ニガーN400ライブラリーからの約１×104ファージを大腸菌LE392を用いて５枚のプレート上にプレートし、そして各プレートから実施例3.4.に記載したようにして３枚のニトロセルロースのレプリカを作る。この場合第三のフィルターはプレート上に５分間インキュベートする。各プレートの第一及び第二のフィルターは「ヘテロロガス」と称する条件を用いて処理する。第三のフィルターは「ホモロガス」と称するストリンジエント条件にかける。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及びフィルターの洗浄は、ヘテロロガス条件下60℃において及びホモロガス条件下68℃において行う。乾燥後、フィルターを３×SSC中で湿し、次に２時間、10×デンハート（実施例3.4.を参照のこと）、50mM Tris−HCl（pH7.5）、20mM EDTA（pH8.0）、1M NaCl,0.5％SDS及び0.1％ピロリン酸ナトリウムから成り、これに0.1mg/mlの剪断されそして変性されたニシン精子DNAを新しく加えたあらかじめ加温したハイブリダイゼーション緩衝液中でプレハイブリダイズする。次に、フィルターを、ニシン精子DNAを含みpGW1800のニックトランスレーションされたBamH I−Bgl II断片があらかじめ添加されている50mlのハイブリダイゼーション緩衝液を含むフラスコに一度に移す。ハイブリダイゼーションを40時間進行させ、そして次にフィルターをホモロガス条件又はヘテロロガス条件を用いて洗浄する。ホモロガス洗浄条件は次の通りである：フィルターを２×SSC、0.1％SDS及び0.1％ピロリン酸ナトリウム中で0.5時間ずつ２回、そして次に0.2×SSC、0.1％SDS及び0.1％ピロリン酸ナトリウム中で0.5時間ずつ２回洗浄する。ヘテロロガス条件は次の通りである：フィルターをハイブリダイゼーション緩衝液中で0.5時間ずつ２回、そして次に４×SSC、0.1％SDS及び0.1％ピロリン酸ナトリウム中で0.5時間、そして最後に２×SSC、0.1％SDS及び0.1％ピロリン酸ナトリウム中で洗浄する。フィルターを空気乾燥し、そして強化スクリーンを用いて−60℃にて３日間コダック−XAR5フィルムに暴露する。陽性シグナルを与えるファージを実施例3.4.に記載したようにして回収する。
ホモロガス条件にかけたフィルター上に７個の陽性シグナルが得られ、これらのシグナルはまた、ヘテロロガス条件にかけたフィルターの対応する位置にも存在する。これらのシグナルはPG II遺伝子を担持する組織λファージに由来すると見られる。これらのシグナルを除き、30個の陽性シグナルがヘテロロガス条件にかけたフィルター上に観察され、そしてこれらのシグナルは両フィルター上の対応する位置に存在する。これらの30個のシグナル間でシグナル強度は異る。これらのシグナルの多くはPG II遺伝子とは異るPG遺伝子を含有するファージによるものと見られる。
A.ニガーN400ゲノムライブラリーの二度目のスクリーニングを行う。プラークリフトを前記のようにして調製する。使用される温度を除き、前記のようにしてハイブリダイゼーションを行う。１つのプレートから得られた２枚のフィルターの内の一方についてはハイブリダイゼーション及び洗浄を62℃で行い、他のフィルターについては68℃にてハイブリダイゼーション及び洗浄を行う。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを高SSC（HSSC）条件を用いて62℃又は68℃のいずれかで洗浄する。HSSC条件は次の通りである。フィルターを４×SSC中で５分間ずつ２回洗浄し、次にフィルターを４×SSC中で0.5時間ずつ２回洗浄し、そして次に２×SSC中で0.5時間ずつ２回清浄する。ここで、使用されるSSC溶液はさらに0.1％SDS及び0.1％ピロリン酸ナトリウムを含有する。
86℃（「ホモロガス」ハイブリダイゼーション条件）にてインキュベートされたフィルター上には５個の強い陽性クローンが得られ、これらはまた62℃にてインキュベートされたフィルター上の対応する位置にも存在する。これらのファージの１つの制限分析が示すところによれば、このファージはPG IIをコードする遺伝子（pga II）が位置する挿入部を含む。従って、これら５個のファージはすべてpga IIを含有すると考えられる。さらに、62℃（「ヘテロロガス」ハイブリダイゼーション条件）にてインキュベートされたフィルター上には17個の陽性クローンが存在し、これらは68℃にてインキュベートされた対応するフィルター上にはハイブリダイズしないか又は弱くハイブリダイズするにすぎない。17個のシグナル間のシグナル強度は異る。
pga IIを含有しない、第一スクリーニングからの16ファージ及び第二スクリーニングからの10ファージを、選択してさらに特徴付ける。これらのファージを、それらの最初の検出のために用いられた条件を用いて精製する。特徴付けられたファージは第７表に挙げたファージ及び８個の追加のファージ（No.2,3,7,31,33,40,41、及び42）である。No.1〜30のファージはライブラリーの第一スクリーニングにおいて得られ、他方それより大きい番号のファージは第二スクリーニングにおいて得られた。
ポリガラクチュロナーゼＩ遺伝子を含有するファージと他のポリガラクチュロナーゼII関連配列を含有するファージとを区別するため、選択されたファージのプラークリフトをpGW1900のあらかじめニック−トランスレーションされた1.8kbpのHind III断片とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは62℃にて行い、他方洗浄も62℃で行い、そしていずれも0.1％SDS及び0.1ピロリン酸ナトリウムを含有する一連の緩衝液（４×SSC,2×SSC,1×SSC,0.5×SSC,0.2×SSC及び0.1×SSC;インキュベーションは緩衝液当り0.5時間である）を用いる。これらの条件を用いて、ファージ2,3,7,40,41及び42は、pga I遺伝子を担持するファージPG I−λ７（実施例3.6.を参照のこと）により得られるシグナルに匹敵する強いハイブリダイゼーションシグナルを与える。これらのファージの１つから得られたDNAの制限分析が示すところによれば、このファージはpga I遺伝子を有する挿入部を含有する。分析された他のファージ（1,8,31,33,35,36,37,38,43）はシグナルを与えるとしても弱いシグナルのみを与え、そしてそれ故にこれらのファージはpga I遺伝子を含有しない。
どのファージが同じ断片を含有するかを見出すため、第７表に示すファージから実施例3.5.に記載したようにしてDNAを単離し、そして実施例3.6.に記載したようにして消化し、そして次に生ずる断片をサザンブロット分析により特徴付ける。Hinf I及びHinc II消化物の分析のため、ゲルのアガロース含量を１％（v/v）に上げる。サザンブロットを60℃にて、pGW1803からあらかじめニック−トランスレーションされた1.2kbp BamH I/EcoR I断片とハイブリダイズせしめ、洗浄は60℃にて前記のHSSC条件を用いて行う。これらのファージの最初の分類を行うために有用であることが見出された制限酵素は、BamH IとBgl IIとの組合わせ、並びにHinf I及びHinc IIであり、後二者は別々に使用される。Hinc II及びHinf Iは通常、小さい制限断片を生じさせ、今の場合、これは生ずるハイブリダイズする断片が、pga II関連配列に加えて、EMBL4ベクターに由来するDNAを含有する機会を最小にする。
Figure 0003576549
第７表に示されるデーターから、ほとんどのファージクラスについて幾つかの対応するファージが独立に単離されていることが明らかである。最初のスクリーニングにおいてすべてのハイブリダイズするシグナルの選択が取られている事実から、各クラスについて見出されるλ−ファージの数（クラスA:3;B:3;C:4;D:3;E:2）は、異る遺伝子が類似の頻度で見出されることを示している。PG I遺伝子の場合この数は高く（分析された26ファージ中６）、PG II含有ファージが同じ頻度（分析された59ファージ中12）で見出される。クラスＧは、PG I遺伝子由来のプローブ及びPG II遺伝子由来のプローブのいずれとも一層弱くハイブリダイズする。No.17及び27のファージ中のそれぞれ3.0及び4.9kbのハイブリダイズする断片のほかに、両ファージにおいて同一でありそして挿入部に由来する幾つかの断片、すなわち5.6kbp,5.1kbp,1.45kbp、及び0.57kbpの断片がBgl II/BamH I消化物中に検出される。両ファージのHinc II消化物及びHinf I消化物もほとんど同じである。
この実施例において単離されたファージは次の通りである。
Figure 0003576549
実施例7.3. PGC遺伝子（pgaC）のサブクローニング;pG W1910の作製
ファージλPG−C20（実施例7.2.;ファージ20、クラスＣ）をBgl IIにより消化し、そして生ずる断片をアガロースゲル上で分離する。ハイブリダイズする7.8kbp Bgl IIを含有するゲル片を回収し、そして次に断片を実施例3.6.に記載したようにして単離する。Bgl II断片を、BamH Iで消化され且つCIP（ウシ腸ホスファターゼ）処理されたpUC9に連結する。連結反応混合物を使用して大腸菌JM109（実施例3.6.）を形質転換する。生ずる白色コロニーの幾つかを、アンピシリンが補充されたYT寒天上にストリークする。一夜の増殖の後、コロニーをニトロセルロースフィルターに吸着せしめる。次に、フィルター上のコロニーを溶解し、そして遊離したDNAをManiatisら（参考文献６、314頁）により記載されているようにして乾燥により固定する。乾熱されたフィルターを２×SSC中で湿し、そしてこれらを手袋を着けた手でこすって細菌細胞片を除去する。次に、実施例7.2.に記載したヘテロロガス条件（60℃、２×SSCによる洗浄）を用いて、前記フィルターをpGW1803の1.2kbpのBamH I−EcoR I断片とハイブリダイズせしめる。陽性クローンを選択し、そしてプラスミドDNAを前記の様にして精製する。次に、このプラスミドを用いて制限分析を行うことにより物理的地図を作成する。
こうして、新規プラスミドを作製した。pGW1910（第７図）はファージλPG−C20の7.8kbp Bgl II断片をベクターpUC9のBamH I部位に挿入したものである。このサブクローンはファージλPG−C20のハイブリダイズする断片、例えば1.1kbpのSma I断片及び1.6kbpのKpn I断片を含んで成る。pGW1910の物理的地図上のこれらの断片の位置から、このプラスミドが完全なPGC遺伝子（pgaＣ）を含有することが予想される。
実施例8. PG IIプロモーターの制御のもとでのヒトハ イブリドインターフェロンBDBBの発現
実施例8.1. プラスミドpG II−IFN AM119前駆体の作製 （第４図）
下記のようにして、プラスミドpGW1800をEcoR Iにより消化し、そしてT4ポリメラーゼにより処理する。このDNAの連結及び大腸菌DH5αＦ′の形質転換がプラスミドpGW1800−Ｅの単離を可能にする。このプラスミドは、EcoR I開裂部位が除去されている点を除きpGW1800と同じである。
プラスミドpGW1800−ＥをBgl IIで消化し、そして50mM Tris−HCl（pH8.0）及び50mM NaClの存在下で65℃にて１時間細菌アルカリホスファターゼで処理する。アルカリホスファターゼをプロテイナーゼＫ（ベーリンガー・マンハイム）による消化及びフェノール抽出によって不活性化する。次に、DNAをエタノール沈澱し、乾燥し、そして水中に再溶解する。次に、下記のようにして接着末端をT4DNAポリメラーゼによりフィル−インする。
プラスミドpJDB207−IFN AM119（EP205 404）をHind III及びCla Iにより消化する。これらの線状断片の接着末端を、0.1mMずつのdCTP,dGTP,dATP及びdTTP並びに67mM Tris−HCl（pH7.5）,6.7mM MgCl2,16.7mM（NH4）2SO4及び5mM DTTの存在下で37℃にて30分間フィルインする。65℃にて５分間加熱することにより反応を停止する。0.8％低ゲル化温度アガロース（バイオラド）ゲル中で断片を分離し、そしてIFN AM119コード領域を含んで成る1kbp断片を切り出し、そしてDNAを
Figure 0003576549
カラム上で精製し、そしてエタノール沈澱する（Schmitt ＆ Lohen、参考文献34）。
100ngのIFN AM119断片と調製されたpGW1800−Ｅベクターとを、５μｌの20mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,10mM DTT,1mM ATP及び１ユニットのT4 DNAアーゼ（ベーリンガーマンハイム）中で室温にて２時間連結する。この混合物をコンピテント大腸菌DH5αＦ′細胞に形質転換する。アンピシリン耐性形質転換体を、これらのプラスミドDNAの制限酵素消化によりスクリーニングしてプラスミドpG II−IFN AM119の前駆体を担持するプラスミドを同定する。
実施例8.2. PCRを用いての正確なpG II−IFN AM119とp G II SS −IFN AM119融合の生成
用いるPCR法はR.M.Hortonら（参考文献35）により記載されており、そして第５図に要約する。
pGW1800をXba I消化により線状化し、そしてエタノールにより沈澱せしめる。水中に再懸濁した後、100ngのこのDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりオリゴヌクレオチドＡ及びＢ（第５図）を用いて、自動熱サイクルにおいて25サイクル（それぞれ、94℃にて１分間、40℃にて２分間、及び72℃にて３分間から成る）にわたり増幅にかけ、次に72℃にて10分間処理する。供給者により推奨される反応を用いて100μｌの容量で各反応において100pMの各オリゴヌクレオチド及び0.5μｌのTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）を用いる。これによりDNA1が得られる（第５図）。
オリゴヌクレオチドＡ及びＣによりpGW1800を同様に処理することによりDNA2が得られる。
同様に、pJDB207−IFN AM119をBamH Iにより線状化し、そしてオリゴヌクレオチドＤ及びＦ又はオリゴヌクレオチドＥ及びＦを用いてPCRにかけることによりそれぞれDNA3及びDNA4を得る。
これらの反応混合物をエタノールで沈澱せしめ、水に再溶解し、そしてアリコートをゲル上でチェックして混合物中のDNA断片の濃度を決定する。
上記の同じ条件を用いてDNA1及びDNA4をオリゴヌクレオチドＡ及びＦと共にPCRにかけてDNA5を得、そして同じオリゴヌクレオチドと共にDNA3をPCRにかけてDNA6を得る（第５図）。
DNA5はBamH I部位から始まりそしてEcoR I部位で終り、そしてPG IIプロモーター断片にリンクしたもとの出発メチオニンコドンと成熟ハイブリドインターフェロンBDBBのコード領域との完全なインフレーム融合を含む。
DNA5のBamH I−EcoR I断片を、実施例8.1.において作製されたプラスミドpG II−IFN AM119前駆体であってBamH I−EcoR Iで切断したものに連結してプラスミドpG II−IFN AM119を作製する。
同様にして、PG IIプロモーター断片にリンクしたPG IIシグナル配列とヒトハイブリドインターフェロンBDBBのコード領域との完全なインフレーム融合を含むDNA6のBamH I−EcoR I断片をpG II−IFN AM119前駆体に挿入してプラスミドpG IISS−IFN AM119を生じさせた。
実施例8.3. pCG59D7とpG II SS −IFN又はpG II−IFNと によるアスペルギルス・ニガーAn8の同時形質転換
ウリジン栄養要求変異株An8（PSM 3917,EP 278355に開示されている）をプラスミドpCG59D7とプラスミドpG IISS−IFN又はpG II−IFN AM119とにより同時形質転換してウリジン系栄養株を得る。
A.ニガーAn8の分生胞子を完全培地中で28℃にて４日間十分に胞子を形成するまで増殖せしめる。1g/lのアルギニン及びウリジンを補充した200mlの最少培地に２×108個の分生胞子を接種する。
28℃及び180rpmにて20時間の増殖の後、菌糸をミラクロスを通しての濾過により収得し、10mlの0.8M KCl,50mM CaCl2により２回洗浄し、そして20mlの0.8M KCl,50mM CaCl2,0.5mg/mlノボチーム（Novozym）234（ノボ・インダストリーズ）中に再懸濁する。混合物を振とう水浴（30℃,50rpm）中で十分なプロトプラストが放出されるまで（90〜120分の後顕微鏡により観察される）インキュベートする。プロトプラスト懸濁液を漏斗中のガラス綿栓を通して濾過することにより菌糸片を除去する。室温での穏やかな遠心分離（10分間、2,000rpm）によりペレット化し、そして10mlの0.8M KCl,50mM CaCl2により２回洗浄する。最後にプロトプラストを200〜500μｌの0.8M KCl,50mM CaCl2中に再懸濁して濃度を１×108/mlにする。
形質転換のため、プロトプラスト懸濁液の200μｌのアリコートを５μｇのpCG59D7、50μｇのpG IISS−IFN AM119又はpG II−IFN AM109 DNA、50μｌのPCT〔10mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM CaCl2,25％PEG 6000〕と共にインキュベートする。インキュベーション混合物を氷上に20分間置き、さらに2mlのPCTを加え、そして混合物を室温にてさらに５分間インキュベートする。4mlの0.8M KCl,50mM CaCl2を加え、最終形質転換溶液の1mlのアリコートを、0.8M KClにより安定化された液化した最少寒天培地〔最少培地＋1g/lアルギニン＋10g/バクト−寒天（ディフコ）〕と混合する。次に、この混合物をすぐに同じ培地の寒天プレート上に注ぎ、そして30℃にてインキュベートする。
28℃にて２〜３日間の増殖の後、数百個の小さなおそらく失敗した形質転換体のバックグラウンド増殖の上に旺盛に増殖しそして胞子を形成するコロニーが出現する。
実施例8.4. PG IIプロモーターの制御のもとでのハイ ブリド−インターフェロンBDBB遺伝子の発現
同時形質転換実験（実施例8.3.）の形質転換体を拾い上げ、そしてインターフェロンの発現について分析する。ヒトCCL−23細胞及びチャレンジウイルスとしての水疱性口内炎ウイルス（VSV）を用いてArmstrong（J.A.Armstrong,Appl.Microbiol.21,732（1971）の方法に従ってインターフェロン活性を決定する。
形質転換体からの分生胞子を別々に50mlの前培養培地〔3g/lのPectin Slow Set L（Unipectin,SA,Redon、フランス）、2g/lのNH4Cl、0.5g/lのKH2PO4、0.5g/lのNaCl、0.5g/lのMgSO4・2H2O、0.5g/lのCaSO4・2H2O（pH7.0）、１％のアルギニン〕に前培養する。この前培養物を250rpm及び28℃にて72時間インキュベートする。10％の前培養物を50mlの主培地（20g/lの大豆粉、5g/lのPectin Slow Set、１％のアルギニン）に接種する。培養物を72〜96時間250rpm及び28℃にて増殖せしめる。
種々の時間（20時間毎）にサンプルを採取し、遠心分離により細胞をペレット化し、そして凍結及び解凍により破壊する。上清及び細胞抽出物の両者を前記のようにしてインターフェロン活性について試験する。pG IISS−IFN AM119を担持する形質転換体においてインターフェロン活性の大部分が培地に分泌され、他方pG II−INF AM119を担持する形質転換体においてはそれは主として細胞抽出物に存在することが見出される。
実施例9. 形質転換されたA.ニドランス株によるポリガ ラクチュロナーゼＩ及びポリガラクチュロナーゼIIの生 産
実施例9.1. A.ニドランスG191を形質転換するために用 いるプラスミドの大腸菌での増加及び精製
pGW635を大腸菌MH1中で、pGW1800を大腸菌JM109中でそしてpGW1900を大腸菌DH5αＦ′中で増加せしめる。
実施例9.2. ウリジン要求性A.ニドランス変異株のプロ トプラストの調製及び形質転換
A.ニドランス変異株G191（pyrG,pabaA1,fwA1,vaY9）はBallance及びTurner,1985（参考文献27）により記載されている。
A.ニガーについて記載されている（実施例5.2.を参照のこと）ようにして菌糸を37℃にて培養せしめるが、培地1l当り2mgのｐ−アミノ安息香酸を加える。A.ニガーについて記載した方法に従ってプロトプラストを調製する。形質転換のため５×106個のプロトプラストを200μｌのSTC中にとり、次にこれを１μｇのpGW635と20μｇのpGW1800又は25μｇのpGW1900と共にインキュベートする。プレートは37℃にて３日間インキュベートする。
この同時形質転換実験において１μｇのpGW635当り約50個の形質転換体が得られ、そして各実験において20個の形質転換体を50mMグルコース最少培地上でさらに精製する。次に、これらの株を使用して、さらに分析するために胞子を増加せしめる。
実施例9.3. 形質転換されたA.ニドランス株によるポリ ガラクチュロナーゼＩおよびII生産のウエスタンブロッ ト分析
同時形質転換プラスミドとしてpGW1800を用いて実施例5.2.に従って得られた同時形質転換体を、2mg/lのｐ−アミノ安息香酸、窒素源としての7.5g/lのNH4NO3並びに炭素源としての１％（w/v）のリンゴペクチン（d.p.61.2％）及び１％（w/v）甜菜パルプを用いて75mlの最少培地中で105個/mlの分生胞子から出発して液中培養する。ガレンカンプ回転振とう機を250rpmにて使用し、そして増殖温度は30℃に維持する。
増殖の43時間後及び68時間後にサンプルを取り、遠心分離し、そして上清を４℃にて一夜、0.02％（w/v）のナトリウムアジドを含む5mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）に対して透析する。これらのサンプルのPG II含量の分析を、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングにより試験する。モノクローナル抗体を用いて試験した場合、対照として用いたA.ニドランスのサンプルはPG II交叉反応性物質を含有しない。
分析した20個の形質転換体すべてがポリガラクチュロナーゼIIを生産するが、量は形質転換体の間で異る。予想される分子量（38kDa）の主バンドのほかに、分解生成物を示すと思われるより低分子の幾つかの弱いバンドが観察される。最も多くの酵素を生産する形質転換体はA.ニドランスG191/pGW1800−13である。この形質転換体のポリガラクチュロナーゼ活性を異る増殖培地を用いて受容細胞の活性と比較し、第８表に示す。
Figure 0003576549
形質転換体G191/pGW1800−13はペクチン基質の存在下で高レベルのPG IIを合成するので、他のA.ニドランス形質転換体のPG II生産もさらに分析する。この目的のため、19個の形質転換体及びG191/pGW635−１を、窒素源としての0.4％NH4Cl及び炭素源としての５％グルコースを用いる最少塩培地からなる培地にリン酸塩を高濃度に加えて（15g/l KH2PO4）培養する。46時間後及び69時間後に培養濾液を得、そして次にこれらを、あらかじめ濾液の濃縮及び透析を行うことなく、ウエスタンブロッティング及びモノクローナル抗体によるプロービングにより分析する。19株のA.ニドランスG191/pGW1800の形質転換体の内少なくとも17株がグルコース培地でPG IIを合成し、他方A.ニドランスG191/pGW635−１ではシグナルが得られない。明瞭なシグナルが得られるという事実は、実施例5.5.に記載したようなポリガラクチュロナーゼ誘導条件下で増殖したA.ニガーN402に比べて高い発現レベルを暗示する。なぜなら、未濃縮濾液及びモノクローナル抗体を用いる場合、非形質転換株の培養濾液のウエスタンブロット上で弱いPG IIシグナルのみが得られるからである。炭素源として５％グルコースの代りに１％甜菜パルプ＋１％ペクチンを含む蒸気の培地を用いてA.ニドランスG191/pGW1800−13及び６個の他のG191/pGW1800形質転換体のPG II生産を前記のようにして分析する。A.ニドランスG191/pGW1800−13とは対照的に、これら６個の形質転換体はペクチン及び甜菜パルプを含有する培地でより多くのPG IIを生産するが、やはりA.ニドランスG191/pGW635−１についてはシグナルは見出されない。
同時形質転換プラスミドとしてpGW1900を用いて、実施例9.2.に従って得られた形質転換体を２種類の異る培地上で増殖せしめる。第一の培地は、NH4Cl（4.0g/l）,1％（w/v）リンゴペクチン（d.e.61.2％）及び１％（w/v）甜菜パルプを添加した高リン酸塩最少塩培地から成り、幾つかの形質転換体はさらに、窒素源としてNH4Clの代りに尿素（4.2g/l）を含むこの培地中で増殖せしめる。前の低リン酸塩最少培地との相違は、1l当り1.5gではなく15gのKH2PO4を使用することである。第二の培地もまた高リン酸塩最少塩培地から成り、これに窒素源及び炭素源としてNH4Cl（10g/l）及び３％（w/v）グルコースが添加されている。いずれの培地にも2mg/lのｐ−アミノ安息香酸が添加される。ガレンカンプ回転振とう機250rpmを用いて培養物を30℃にて42時間増殖せしめ、そして培養濾液のサンプルを20時間後及び42時間後に採取する。形質転換体と類似の条件下で増殖したA.ニドランスG191のウエスタンブロットにおいて、精製されたポリガラクチュロナーゼＩに対して生じたポリクローナル抗体と交叉反応する蛋白質はほとんど又は全く検出されない。形質転換体の75％の培養濾液において、PG Iが有意なレベルで観察される。
複合培地中でやはり高リン酸塩、及び尿素ではなくNH4Clを用いることにより、生産されるポリガラクチュロナーゼＩの蛋白質分解的破壊がかなり低下する。ウエスタンブロッテイニグの結果及び活性測定に基き、形質転換体G191/pGW1900−６は、第６表に示すようにｌ当り1gを超える酵素を生産すると算定される。なぜなら、PG Iの比活性は5,50U/mgである（Kester及びVisser,1990年）からである。
Figure 0003576549
それぞれポリガラクチュロナーゼＩ及びIIをコードするpga I及びpga II遺伝子は、高遺伝子量を含む多コピー形質転換体においてさえ、グルコース含有培地上A.ニガーにおいては発現されない。しかしながら、それぞれG191/pGW1900−６株及びG191/pGW1900−10株並びにG191/pGW1800−13及びG191/pGW1800−20株のごときA.ニドランス形質転換体におけるこれらのA.ニガー遺伝子の発現は、A.ニドランスにおいてはこれらの遺伝子のカタボライト抑制が妨害されていることを示している。このことは、これらの異るアスペルギルスの種間でカタボライト抑制系の異る特異性を暗示する。これを、宿主自身のポリガラクチュロナーゼの発現を回避する条件下でA.ニドランスのごとき異る宿主において特定のA.ニガーポリガラクチュロナーゼ遺伝子を発現させるために用いることができる。こうして得られるポリガラクチュロナーゼ酵素は特に純粋である。
実施例10. A.ニドランスG191/pGW1800−13形質転換体 からのポリガラクチュロナーゼIIの単離、精製及び特徴 付け
実施例10.1. 形質転換体G191/pGW1800−13を用いてのP G IIの生産
A.ニドランスG191/pGW1800−13形質転換体を、1.5g/lではなく15g/lのKH2PO4を用いる点を除き実施例5.3.に記載した組成の１％甜菜パルプ＋１％ペクチン培地で100mlの培養において増殖せしめる。同様に、この形質転換体を低リン酸レベル及び高リン酸レベルで、炭素源として５％又は１％グルコースを用いる最少培地において、増殖せしめる。これらの培地はA.ニガーN402においては検出可能なポリガラクチュロナーゼIIを導かず、A.ニドランスG191自体は実施例9.3.に記載したようにPG IIを生産することができない。
５％グルコース及び高リン酸塩を用い72時間後に採取したA.ニドランスG191/pGW1800−13形質転換体の培養濾液のサンプル中には約860U/mlのPG活性が見出され、他方低リン酸塩を用いた場合この量は550U/mlである。１％グルコース及び高リン酸塩を用いる場合に観察される低下したレベルは主として、48時間後に炭素源が消耗された場合の蛋白質のターンオーバーの増加によるものである。１％グルコース及び低リン酸塩の場合、生産レベルは全培養期間を通じて低いままである。５％グルコース及び高リン酸塩を用いて培養濾液1l当りに得られる蛋白質の量は約1g/lである。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動が示すところによれば、形質転換体の培養濾液は、A.ニガーPG IIに相当する分子量の１個の蛋白質バンドを含む。
実施例10.2. A.ニドランスG191/pGW1800−13形質転換 体の培養濾液からのPG IIの単離及び精製
約4.9のpH値を有する培養濾液（約2l）を蒸留水により５倍に稀釈し、そして次に2N NaOHによりpH6.0にする。酵素を濃縮するため、この溶液を、高流速を可能にするためにブフナー漏斗に収容された、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）中で前平衡化された600mlのSephadex DEAE−A50に付加する。すべての酵素活性がこのイオン交換材料に吸着され、そして同じ緩衝液中1M NaClでの溶出により300mlに集められる（収率65％）。次に、この酵素溶液を10mM Bis Tris緩衝液（pH6.0）に対して透析し、そして同じ緩衝液中で平衡化されたSephasos DEAE Fast Flowカラム（ベッドボリウム60ml）上に付加する。緩衝液中０〜0.5M NaClグラジエントを適用することにより酵素活性はおよそ0.15M NaClにおいて溶出する（総回収率57％）。
実施例10.3. A.ニドランスG191/pGW1800−13形質転換 体の培養濾液から精製されたPG IIの性質
実施例10.2.に従って精製されたPG IIを、実施例1.1.に記載したようにしてラピターゼ（Rapidase）から精製した酵素（PG II−ケース）と比較した。両酵素はSDS−ポリアクリルアミドゲル上で38kDaの同一の見かけ分子量を有し、そしてこれらはポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体（実施例6.4.を参照のこと）と同様に反応する。等電点電気泳動の際、A.ニドランス形質転換体によって生産されそして実施例10.2.に従って精製されたPG IIはA.ニガーにより生産された酵素に比べて非常に低いマイクロヘテロゲナイティー（microheterogenity）を示す。なぜなら、主バンド（p I5.2）のほかにわずか１個の弱小バンドが見られるからである。
改変されたフェリシアニド試験を用い0.2〜1mg/mlの間でポリガラクチュロナーゼ濃度を変えながら25℃にて0.075M酢酸ナトリウム（pH4.2）中でポリガラクチュロナーゼ活性を測定することにより、両酵素の力学的性質を比較した。ハピダーゼからのA.ニガーPG IIについてはVmaxは2,760U/mg蛋白質であり、Kmは0.8mg/mlポリガラクチュロネート（USB）である。形質転換体由来のPG IIについては、Vmaxはわずかに高くて34,800U/mlであり、そしてKmは同一である。最後に、A.ニドランス形質転換体から精製されたPG IIを実施例1.3.（PG II−ケース）に従ってシアノゲンブロミドで処理した。これは、ラピダーゼから精製されたPG IIについて観察されたのと同じ断片のパターンを導く。
実施例11. 形質転換されたA.ニガーN593株におけるA. ニガーNW756のpga II遺伝子の発現
pGW1756（実施例3.10.）を用い、選択ベクターとしてpGW635（実施例5.2.を参照のこと）を用いてA.ニガーN593を形質転換する。無作為に拾い上げた８個の形質転換体を精製し、そして更なる分析のために使用する。これらを、塩化カンモニウム（4.0g/l）、１％ペクチン（d.e.61.2）及び１％の乾燥され且つ粉砕された甜菜パルプを添加した液体最少塩培地で、実施例5.5.に記載したようにして増殖せしめる。PG II特異的抗体を用いるウエスタンブロットにより、形質転換体の培養濾液へのPG IIの過剰生産（overproduction）が示される。２個のPG II過剰生産性形質転換体（N593/pGW1756−６及びN593/pGW1756−７）を選択し、そしてこれらの株及び対照株N402（実施例5.5.を参照のこと）をやはり前記の条件を用いて増殖せしめる。接種後44時間で培養濾液を得、そして粗濾液中のポリガラクチュロナーゼ活性を記載されている（参考文献２）ようにして決定し、この場合、酵素反応混合物は50mM酢酸ナトリウムを用いてpH4.8に緩衝化する。
結果が示すところによれば、pGW1756上のpga II遺伝子は機能的であり、そしてこのプラスミドを用いてA.ニガーを形質転換してポリガラクチュロナーゼ活性を過剰生産することができる。
実施例12. 形質転換されたA.ニドランス株によるポリ ガラクチュロナーゼＣ生産
実施例9.2.において記載したように、A.ニドランスG191をウリジン原栄養性に形質転換するために設計された実験において、A.ニガーN400のpgaＣ遺伝子を担持するプラスミドpGW1910を同時形質転換プラスミドとして使用する。得られた形質転換体10株を純化し、そして次にこれらを用いて、さらに分析するために胞子を増加せしめる。これらの株及びG191/pGW635−１を、2mg/mlのｐ−アミノ安息香酸、窒素源としての4.0g/lのNH4Cl並びに炭素源としての１％甜菜パルプ及び１％ペクチンが補充されておりそしてリン酸塩が高濃度で添加されている（15g/lのKH2PO4）液体最少塩培地中で増殖せしめる。接種は166胞子/mlでありそしてインキュベーションは30℃にてガレンカンプ回転振とう機中で250rpmで行う。接種の後65時間で培養濾液を得、そして次に濾液をあらかじめ精製又は濃縮することなく分析する。PG I及びPG II（実施例1.2.）に対して生じた抗体の混合物と共にウエスタンブロットをインキュベートする。0.25％のガラクチュロン酸（USB）を含有する50mM酢酸緩衝液（pH4.8）中で活性測定（参考文献２）を行う。
ウエスタンブロッティングによれば、得られた形質転換体のほとんどが多量のポリガラクチュロナーゼＣ（PGC）を生産する。この結果は、形質転換体及び対照株（pGW635により形質転換されたA.ニドランスG191）の上清中のPC活性を測定することにより確認される。
実施例13. 形質転換されたA.ニドランス株におけるA. ニガーpgaA及びpgaB遺伝子の発現
pga I,pga II及びpgaＣ遺伝子に加えて、A.ニガーのポリガラクチュロナーゼ遺伝子群の他の構成を用いてA.ニドランスを形質転換する。本実施例においては、ファージλ中のクローンを使用しプラスミドベクター中のそのサブクローンは使用しない。
実施例3.5.に記載したようにしてプレート溶解物からファージλDNAを調製し、そして次にフェノール及びクロロホルムにより再度抽出する。同時形質転換のため20μｇのλDNAを使用し、そして同じクラスの２つのファージ（例えばλPG−A43と組合わせたλPG−A10、又はλPG−D11と組合わせたλPG−D8）からDNAをおよそ等量得る。A.ニドランスG191の同時形質転換を実施例9.2.に記載したようにして行い、対照は今回は別々にpGW1900及びλPG I−７を用いる同時形質転換を含む。上記のようにして調製したλファージDNAを使用する場合、塩化セシウムグラジエント中のバンド形成により精製したプラスミドDNAに比べて形質転換頻度が低い。
有意義な形質転換体を純化し、そして実施例12.にpGW1910形質転換体について記載したようにして分析する。この場合は、形質転換体はまた炭素源として３％のグルコースを含有する培地（高リン酸塩、0.1％酵母エキス、１％塩化アンモニウム）にも増殖せしめる。
形質転換体A.ニドランスG191/λＡ−１及びG191/λＤ−１はそれぞれクラスPG−Ａ及びPG−Ｄファージを用いて前記のようにして得られた。接種の後65時間目における甜菜パルプ／ペクチン培地の培養濾液中のポリガラクチュロナーゼ活性は対照株G191/pGW635−１の場合より有意に高かった。従って、クラスＡ及びＤファージ中に存在するpga II関連配列はポリガラクチュロナーゼ活性を有する蛋白質をコードしている。ウエスタンブロットに基いて、これらの遺伝子生成物であるそれぞれポリガラクチュロナーゼＡ及びポリガラクチュロナーゼＤはPG Iに類似する電気泳動移動度をもって移動することが結論される。
A.ニドランスG191/λＡ−１は炭素源としてグルコースを含有する培地においてもポリガラクチュロナーゼＡを生産する。
実施例14. 形質転換されたA.ニドランス株におけるハ イブリドインターフェロンの発現
同時形質転換実験のため、約20μｇのプラスミドDNAであるpG II−IFN AM119又はpG IISS−IFN AM119を使用する。実施例9.2.に記載したようにしてA.ニドランスG191の同時形質転換を行う。
有意義な形質転換体を精製しそして実施例8.4.において形質転換体について記載したようにして分析する。この場合、形質転換体を炭素源として３％グルコースを含有する培地（高ホスフェート、0.1％酵母エキス、１％塩化アンモニウム）においても増殖せしめる。
種々の時間（20時間毎）にサンプルを採取し、遠心分離により細胞をペレット化し、そして凍結及び解凍により破壊する。上清及び細胞抽出物の両者を前記のようにしてインターフェロン活性について試験する。pG IISS−IFN AM119を担持する形質転換体においては多量のインターフェロン活性が培地中に分泌され、他方pG II−IFN AM119を担持する形質転換体においてはそれは主として細胞抽出物中に存在する。唯一の炭素源としてグルコース使用される場合にA.ニドランスはpG II−IFN AM119又はpG IISS−IFN AM119からIFNを生産することを示している。
実施例15. ポリガラクチュロナーゼII及びポリガラク チュロナーゼＩの軟化性
A.ニガーポリガラクチュロナーゼ類の軟化（maceration）活性を測定するためにキュウリの組織の細胞分離を用いる。他方の食品店からキュウリを購入し、そして次に、エタノールに浸したティシュペーパーにふくことにより又はジャベル（Javel）水（食品銘柄、0.5％次亜塩素酸ナトリウムに稀釈）に１時間浮べることにより表面を無菌化する。次にキュウリを切りきざみ、スライスの軟い内部を除去する。得られるスライスの内の２個を、ポリガラクチュロナーゼがあらかじめ添加されているか又は添加されていない軟化緩衝液25mlを収容した100mlのエルレンマイヤーフラスコに入れる。次に、30℃に調節された水浴中での穏やかな一方向振とうにより24時間インキュベーションを行う。次にフラスコを視覚観察する。完全な軟化は次の基準に合致する：（ｉ）巨視的観察において、キュウリの皮が付着組織を実質的に含まない；（ii）軟化緩衝液が非常に濁る；（iii）顕微鏡観察により判定する場合に無傷のように見える遊離細胞の高い比率により示されるように、細胞の分離と軟化緩衝液の高い濁度との間に正の関係が存在する。
実施例1.に記載したようにして調製したポリガラクチュロナーゼII及びポリガラクチュロナーゼＩを異る緩衝液中で試験する。軟化緩衝液Ａ（MBA）は50mM酢酸ナトリウム（pH4.8）である。軟化緩衝液Ｂ（MBB）はリン酸−クエン酸緩衝液〔イシイ（1976）、Phytopathology 6 6,281−289頁〕である。MBBは、0.1Mクエン酸溶液及び0.1M Na2HPO4溶液を目的pH値4.5が達成されるまで混合することにより調製し、そして次に等容量の蒸留水を加え、そして次に10mg/mlのウシ血清アルブミンを用いてウシ血清アルブミンを最終濃度10mg/25mlに加える。
MBA中１μｇのポリガラクチュロナーゼIIを用いてキュウリの組織が24時間以内に完全に軟化される。この緩衝液中でキュウリの組織はポリガラクチュロナーゼの非存在下又は１μｇのポリガラクチュロナーゼＩの存在下では軟化しない。MBB中でのキュウリの軟化をポリガラクチュロナーゼの非存在下、又は10μｇのポリガラクチュロナーゼＩもしくはポリガラクチュロナーゼIIの存在下で試験する。やはり、酵素の非存在下又はポリガラクチュロナーゼＩの存在下では軟化は観察されないが、ポリガラクチュロナーゼIIはキュウリ組織を完全軟化する。実施例10.に従って製造されたPG IIもまた軟化性を有する。
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寄託された微生物
下記の微生物及びファージがDeutsche Sammlung von Microorganismen und Zelkulturen（DSM）,Mascheroder Weg 16,D−3300 Braunschweigに寄託されている。
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〔配列表〕
配列番号１
配列の型 ：ヌクレオチド及び対応するペプチド
配列の長さ:2495
鎖 の 数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:genomic
起源生物 ：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）N400
直接実験源：プラスミドpGW1900（DSM5866）
特 徴:A.ニガーN400プレプロ−ポリガラクチュロナーゼＩをコードする遺伝子pga I
1−909 :プロモーター領域
901−963 :PG Iシグナルペプチドコード領域
901−1002:PG Iプレプロ−配列コード領域
1003−2127:成熟PG Iコード領域
1138−1189:イントロン
1610−1671:イントロン
2138−2130:終止コドン
2131−2495:3′−非コード領域、転写ターミネーター領域の部分
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配列番号２
配列の型 ：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド
配列の長さ:3031
鎖 の 数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:genomic
起源生物 ：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）N400
直接実験源：プラスミドpGW1800（DSM5505）
特 徴:A.ニガーN400プレプロ−ポリガラクチュロナーゼIIをコードする遺伝子pga II
1−1356:プロモーター領域
1357−1419:PG IIシグナルペプチドコード領域
1357−1437:PG IIプレプロ−配列コード領域
1438−2494:成熟PG IIコード領域
1987−2038:イントロン
2495−2497:終止コドン
2498−3031:3′−非コード領域、転写ターミネーター領域の部分
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配列番号３
配列の型 ：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド
配列の長さ:3047
鎖 の 数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:genomic
起源生物 ：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NW756
直接実験源:pGW1756（DSM5942）
特 徴:A.ニガーNW756プレプロ−ポリガラクチュロナーゼIIをコードする遺伝子pga II
1−889 :プロモーター領域
890−952 :PG IIシグナルペプチドコード領域
890−970 :仮定的PG IIプレプロ−配列コード領域
971−2027:仮定的成熟PG IIコード領域
1520−1571:イントロン
2028−2030:終止コドン
2031−3047:3′−非コード領域、転写ターミネーター領域の部分
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配列番号４
配列の型 ：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド
配列の長さ:2304
鎖 の 数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:genomic
起源生物 ：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）N400
直接実験源:pGW1910（DSM5943）
特 徴:A.ニガーN400プレプロ−ポリガラクチュロナーゼＣをコードする遺伝子pgaC
1−662 :プロモーター領域
663−710 :PG Cシグナルペプチドコード領域
663−782 :仮定的PG Cプレプロ−配列コード領域
783−1995:仮定的成熟PG Cコード領域
927−1001:イントロン
1428−1483:イントロン
1614−1666:イントロン
1996−1998:終止コドン
1999−2304:3′−非コード領域、転写ターミネーター領域の部分
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【図面の簡単な説明】
第１図は、PG II遺伝子の一部をコードする組換えDNAプローブHR6195及びHR6196とのハイブリダイゼーションによりA.ニガーのゲノムライブラリーから得られたファージλＤ及びλＥのEcoR I断片の部分的制限地図である。数値は右手のEcoR I部位からのおよその距離をkbpで示す。
第２図は、pGW1800の部分的制限地図であり、このプラスミドはA.ニガーN400 PG II遺伝子を含んで成るファージλＥから得られる4.1kbpのXba I−EcoR I挿入部及びベクターpEMBL18のDNAを含有する。Apはアンピシリン耐性遺伝子であり、そして矢印はA.ニガー由来のDNAを示す。
第３図は、pGW1900の部分的制限地図であり、このものはファージPG I−λ７の8.6kbpのBamH I断片及びpUC9ベクターから構成されている。
第４図は、プラスミドpG II−IFN AM119及びpG IISS−IFN AM119のクローニング方針を示す。
第５図は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によって、それぞれpG II−IFN AM119及びpG IISS−IFN AM119を作製するためのDNA挿入部であるDNA5及びDNA6の段階的調製方法を示す。
第６図は、pGW1756の部分的制限地図を示す。pGW1756は、A.ニガーNW756ポリガラクチュロナーゼII遺伝子を担持する5.5kbpのXho I−Bgl II断片がベクターpEMBL18中に挿入されたものである。該断片の以前のXho I及びBgl II部位も示されているが、これらはベクターのそれぞれSal I及びBamH I部位での挿入により破壊されている。
第７図は、pGW1910の部分的制限地図である。pGW1910はλファージλPG−C20の7.8kbpのBgl II断片がベクターpUC9のBamH I部位に挿入されたものである。

Claims (23)

  1. ａ）配列番号:1に記載の塩基配列を有するDNA配列、
    ｂ）前記ａ）のDNAに含まれる成熟PG Iのコード領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そしてガラクチュロナーゼ又はポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドの構造遺伝子、並びに場合によってはさらにプロモーター、シグナルもしくはリーダーペプチドのためのコード領域、及び／又は転写ターミネーターを含んで成るDNA配列、
    ｃ）配列番号:1に記載の塩基配列中の成熟PGをコードす るDNA配列またはそのDNA配列に関して遺伝子コードの意 味において縮重しているDNA配列、
    ｄ）配列番号:1に記載の塩基配列中のシグナルペプチド もしくはリーダーペプチドをコードするDNA配列または そのDNA配列に関して遺伝子コードの意味において縮重 しているDNA配列、
    から選択されたDNA配列を含んで成る組換えDNA分子。
  2. 配列番号:1に記載の塩基配列を有するDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアスペルギルス属由来のDNA分子であって、
    （１）配列番号:1に記載の塩基配列を有するDNAのコード領域にハイブリダイズし、そしてガラクチュロナーゼ又はポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列；
    （２）配列番号:1に記載の塩基配列を有するDNAのシグナルペプチドコード領域又はプレプロ配列コード領域にハイブリダイズし、成熟タンパク質コード領域に連結してアスペルギルス属宿主において使用されるシグナルもしくはリーダーペプチドをコードするDNA配列；あるいは
    （３）配列番号:1に記載の塩基配列を有するDNAのプロモーター領域にハイブリダイズし、コード配列に連結してアスペルギルス属宿主において当該コード配列を発現させるためのプロモーター活性を有するDNA配列；
    の少なくとも１つを含んで成る組換えDNA分子。
  3. 配列番号:1における１位のMetのコドンのすぐ上流のヌクレオチドから少なくとも500個上流のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含み、コード配列に連結してアスペルギルス属宿主において当該コード配列を発現させるためのプロモーター活性を有するDNA分子。
  4. 配列番号:1における１位のMetから31位のLysまでのアミノ酸配列を有し、成熟タンパク質に連結してアスペルギルス属宿主において当該タンパク質を分泌させるためのシグナル又はリーダーペプチドをコードするDNA分子。
  5. 配列番号:1における翻訳終止コドンから少なくとも約200ヌクレオチド下流までのヌクレオチド配列を含み、アスペルギルスのプロモーターとの組合せにおいて、コード配列に連結してアスペルギルス宿主において転写ターミネーターとして使用するための、ターミネーターDNA分子。
  6. 配列番号:1における１位のMetから368位のCysまでのアミノ酸配列を有するプレプロ−ガラクチュロナーゼ又は−ポリガラクチュロナーゼをコードするDNA分子。
  7. 配列番号:1における32位のAlaから368位のCysまでのアミノ酸配列を有する成熟ガラクチュロナーゼ又はポリガラクチュロナーゼをコードするDNA分子。
  8. （ａ）プロモーターに連結された、請求項１のａ）のDNA配列；
    （ｂ）プロモーターに連結された、請求項１のｂ）の構造遺伝子を含んで成るDNA配列；
    （ｃ）プロモーターに連結された、請求項１のｃ）のDN A配列；
    （ｄ）プロモーターに連結された、請求項２のDNA配列（１）；
    （ｅ）プロモーターに連結された、請求項６のDNA配列；及び
    （ｆ）プロモーターに連結された、請求項７のDNA配列；
    から成る群から選択されるDNA配列を含んで成り、アスペルギルス属宿主において使用される発現カセット。
  9. 前記プロモーターが、請求項２に記載の（３）のDNA配列を有するプロモーター、又は請求項３に記載のDNA分子を有するプロモーターである、請求項８に記載の発現カセット。
  10. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のDNA分子を含んで成り、アスペルギルス属宿主において使用されるハイブリドベクター。
  11. 請求項１に記載の組換えDNA分子の製造方法であって、
    ａ）アスペルギルス属の細胞からゲノムDNAを単離し、所望のDNAを例えばDNAプローブを用いて又は適当な発現系を用いて選択し、そして所望のポリペプチドの発現についてスクリーニングし；あるいは
    ｂ）アスペルギルス属の細胞からmRNAを単離し、所望のmRNAを例えばDNAプローブとのハイブリダイゼーションにより又は適当な発現系での発現により選択し、所望のポリペプチドの発現についてスクリーニングし、該mRNAに相補的な単鎖cDNAを調製し、次にそれから二本鎖cDNAを調製し；あるいは
    ｃ）cDNAライブラリーからcDNAを単離しそして所望のcDNAを例えばDNAプローブを用いて又は適当な発現系を用いて選択し、そして所望のポリペプチドの発現についてスクリーニングし；そして／あるいは
    ｄ）段階ａ）,b）又はｃ）の二本鎖DNAを適当なベクターに導入し；
    ｅ）得られたハイブリドベクターによりアスペルギルス属の宿主細胞を形質転換し；
    ｆ）所望のDNAを含有する形質転換された宿主細胞を未形質転換宿主細胞から選択し、又は形質転換された宿主細胞を増加せしめ；そして必要であれば
    ｇ）所望のDNAを単離しそして／又は該DNAをその変異体又は断片に転換する；
    ことを含んで成る方法。
  12. 請求項８又は９に記載の発現カセットにより形質転換されたアスペルギルス属の宿主。
  13. 請求項12に記載の形質転換されたアスペルギルス属の宿主の製造方法であって、アスペルギルス属の宿主細胞を、形質転換条件下で請求項８又は９に記載の発現カセットにより、場合によっては選択マーカー遺伝子と一緒に処理し、そして場合によっては形質転換体を選択する、ことを含んで成る方法。
  14. ポリペプチドの製造方法であって、請求 項２の（３）又は請求項３に記載のプロモーター活性を 有するDNAに連結された当該ポリペプチドをコードする 構造遺伝子を含んでなる発現カセット中に挿入されている当該構造遺伝子を、形質転換されたアスペルギルス属の宿主中で発現せしめ、そして場合によっては該ペプチドを単離する、ことを含んで成る方法。
  15. 宿主としてアスペルギルス・ニガーの株を使用する、請求項14に記載の方法。
  16. 宿主としてアスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）を使用する、請求項14に記載の方法。
  17. 前記構造遺伝子ハイブリドインターフェロンBDBBをコードしている、請求項14に記載の方法。
  18. 前記構造遺伝子がガラクチュロナーゼ活性又はポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている、請求項14に記載の方法。
  19. 請求項１のａ）、ｂ）もしくはｃ）、請 求項２の（１）、請求項６、又は請求項７のいずれかに記載のDNA分子、あるいは請求項８又は請求項９に記載の発現カセットの発現により得られるPGの粗原料を精製することを特徴とする単一PGの製造方法。
  20. アスペルギルス・ニガーから得られた粗酵素混合物からPGを精製された形で製造することを特徴とする請求項19に記載の方法。
  21. 請求項１のａ）、ｂ）もしくはｃ）、請 求項２の（１）、請求項６、又は請求項７のいずれかに記載のDNA配列、あるいは請求項８又は請求項９に記載の発現カセットによりコードされるガラクチュロナーゼ活性もしくはポリガラクチュロナーゼ活性を有するポリペプチド、及びそれらの生物学的に許容される塩。
  22. 請求項21に記載のポリペプチド、場合によってはPG活性以外の活性を有する１又は複数の酵素との所定の組合わせにおいて含んで成るペクチン分解剤。
  23. 請求項21に記載のポリペプチド又は請求項22に記載のペクチン分解剤を植物材料の加工において使用する方法。
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