HU220337B - Rekombináns DNS-molekulák, eljárás előállításukra és alkalmazásuk - Google Patents

Rekombináns DNS-molekulák, eljárás előállításukra és alkalmazásuk Download PDF

Info

Publication number
HU220337B
HU220337B HU726/90A HU572690A HU220337B HU 220337 B HU220337 B HU 220337B HU 726/90 A HU726/90 A HU 726/90A HU 572690 A HU572690 A HU 572690A HU 220337 B HU220337 B HU 220337B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
gene
pgw1800
pgw1900
fragment
Prior art date
Application number
HU726/90A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT54735A (en
Inventor
Hendrik Jan Dirk Bussink
Frank Buxton
Hermanus Cornelis Maria Kester
Jacob Visser
Leendert Hendrik De Graaff
Original Assignee
Novartis Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB898919884A external-priority patent/GB8919884D0/en
Application filed by Novartis Ag. filed Critical Novartis Ag.
Publication of HUT54735A publication Critical patent/HUT54735A/hu
Publication of HU220337B publication Critical patent/HU220337B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L21/00—Marmalades, jams, jellies or the like; Products from apiculture; Preparation or treatment thereof
    • A23L21/10—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products
    • A23L21/11—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products obtained by enzymatic digestion of fruit or vegetable compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgya egy poligalakturonáz- (PG-) enzimet kódolóexpressziós szerkezet (DNS-molekula), amely egy poligalakturonáz-enzimstruktúrgénjéből és/vagy a megfelelő szabályozószekvenciákból vagy egyPG génből származó DNS-szekvenciát tartalmazó hibrid vektorból áll. Atalálmány tárgyát képezik továbbá a fenti expressziós szerkezetteltranszformált gazdaszervezetek – különösen fonalas gombák –, valamintegy eljárás polipeptidek, például homogén poligalakturonáz-enzimekelőállítására a fenti DNS-molekulák és gazdaszervezetek segítségéveltranszformált szervezetekből. ŕ

Description

A találmány tárgyát génmanipulációval előállított, új DNS-molekulák képezik, amelyek poligalakturonázaktivitással rendelkező fehérjék struktúrgénjét és/vagy egymással természetes úton kapcsolódó promoter-, jelző- és/vagy terminátorszekvenciákat tartalmaznak. Ezekből a DNS-molekulákból expressziós szerkezetek készíthetők poligalakturonázok előállítására vagy idegen gének kifejezésére fonalas gombákban.
A találmány alapjai
Bár a génmanipulációs technikák segítségével számos, mind prokarióta, mind eukarióta gazdaszervezetekben működő expressziós szerkezetet állítottak már elő, egyre újabb, a korábbiakat meghaladó tulajdonságokkal rendelkező expressziós szerkezetekre van szükség.
Igen széles körben használják a prokarióta Escherichia colit és az eukarióta élesztők közül például a Saccharomyces cerevisiae-t különböző hibrid vektorok, főleg plazmidok kifejezésére. Az E. coli hátránya, hogy nem képes glikozilálni a polipeptideket, ezért a bennük kifejeződő idegen peptidek felhalmozódnak a sejtekben, és gátolják a szaporodásukat. Az élesztők képesek a glikozilálásra, azonban - az E. colihoz hasonlóan az egészen kis méretűek kivételével szintén nem szekretálják a polipeptideket a környezetükbe, csak a sejtfal külső rétegébe (a periplazmába). A magasabb rendű eukarióta szervezetek, így például az emlőstumorsejtek glikozilálják és szekretálják is a fehérjéket, azonban tenyésztésük lassú és költséges, ezenkívül fennáll az a veszély, hogy onkogén nukleinsavakat is izolálhatunk a kívánt fehérjékkel együtt.
A gazdaszervezetek kutatása során részletesen megvizsgálták a fonalas gombákat, többek között a Neurospora crassát, az Aspergillus nidulanst vagy az A. nigert is. Ezek bevezetése a génmanipulációs technikákba eddig igen lassú volt, mert hiányzott a megfelelő transzformációs rendszer. A Saccharomyces cerevisiae-vel szemben a fonalas gombák nem hordoznak plazmidokat, amelyeket az idegen gének bejuttatására használhatnánk fel, viszont transzformálhatok szelekcióra alkalmas marker géneket hordozó idegen plazmidokkal. A fonalas gombák transzformálására alkalmas plazmidok többsége - ellentétben az élesztők plazmidjaival - nem képes az autonóm replikációra, viszont képes integrálódni a gombakromoszómákba, bár ez csak igen kis gyakorisággal történik meg. A kromoszómákba integrálódott plazmidok által okozott transzformáció azonban igen stabil és még nem szelektív körülmények között is megnyilvánul; az irodalomban már száz fölött van a közölt esetek száma.
Az első, fonalas gombák számára létrehozott plazmid a Neurospora crassa qa-2 génjét tartalmazta [Case és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263; Case, in Genetic Engineering of Microorganisms fór Chemicals (Hollander és munkatársai, szerkesztő) 87-100 (Plenum Press, 1982)].
Az Aspergillus nidulans - mivel ivaros szaporodásra is képes - igen jól használható génmanipulációs célokra. Ezzel a gombával kapcsolatban már mind pozitív, mind negatív szelekciós rendszereket leírtak [Ballance és munkatársai, BBRC, 112, 284 (1983); Tilbum és munkatársai, Gene, 26, 205 (1983); Yelton és munkatársai, PNAS, 81, 1470 (1984); Yelton és Timberlake, J. Cell Biochem. Suppl., 9C, 173 (1985); Johnstone és munkatársai, EMBO J., 4, 1307 (1983); Wemars és munkatársai, Curr. Génét., 9, 361 (1985); Kelly és munkatársai, EMBO J., 4, 475 (1985)].
A Neurospora crassához vagy az Aspergillus nidulanshoz képest az Aspergillus niger igen fontos gomba, mivel az általa termelt enzimeket az ipar - elsősorban az élelmiszeripar - széles körben használja. Az A. niger egy sor hidrolázt, például glükamilázt, a-amilázt, pektinázt, cellulázt, β-glükanázt, β-galaktozidázt, naringinázt, pentozanázt, savas proteázt és ligninázt termel, amelyek közül a glükamiláz és a pektinázkomplex a fontosabbak.
Az Aspergillus niger ivaros alakja ismeretlen, ezért meiotikus rekombinációval nem hozhatók létre mutánsai. A szokásos mutagenetikus módszerekkel és szelekcióval azonban számos olyan törzsét sikerült előállítani, amelyek fokozott mértékben termelnek hidrolitikus enzimeket.
Az A. niger genomjából a glükamiláz [Boel és munkatársai, EMBO J., 3, 1581 (1984)] és az alkohol- és aldehid-dehidrogenáz (WO 86/06097 szabadalmi leírás) enzimek struktúrgénjeit a megfelelő promoter és jelzőszekvenciákkal együtt sikerült izolálni és transzformálni velük az A. nidulanst és A. nigert.
Az A. nigeren végzett transzformációs kísérletekben az A. nidulansból származó, heterológ amds-gétit [Kelly és Hynes, EMBO J., 4, 475 (1985)] vagy az argB-gént [Buxton és munkatársai, Gene, 37, 207 (1985); EP 184 438 és WO 86/06097 szabadalmi leírások] szokták szelekciós marker génként alkalmazni.
Ipari szempontból az A. niger a legfontosabb fonalas gomba, mivel a segítségével nyerik az élelmiszeriparban használt pektinbontó enzimeket, a poligalakturonázokat, a pektinliázokat vagy a pektinészterázokat. A pektinek nagy (20 000-40 000 d) molekulatömegű poligalakturonánok, amelyek alfa-l,4-glükozidkötéssel kapcsolódó D-galakturonsavegységekből állnak. A monomerek egy részének szabad karboxilcsoportja metanollal lehet észteresítve: ezt a kötést bontják a pektinészterázok. A pektinek a természetben a magasabb rendű növényekben fordulnak elő, ahol a cellulózmolekulákhoz kapcsolódva elsősorban a primer sejtfalban és a sejtek közötti rétegekben találhatok. A leggazdagabb pektinforrások közül is kiemelkednek a citrom és narancshéj, amelyek több mint 30% pektint tartalmaznak. A pektinbontó enzimek közül az endo- és exo-poligalakturonázok a polimer a-l,4-glükozid-kötéseit bontják, míg a pektinliázok nagyobb egységeket hasítanak le vagy helyeznek át a láncból (transzelimináció); az emésztés eredményeként telített vagy a-4,5helyzetben telítetlen poli- vagy oligogalakturonidok keletkeznek. Az endopoligalakturonázok neve [poli-(l,4a-D-galakturonid)]-glükánhidroláz (EC 3.2.1.15), a exopoligalakturonázoké [poli-( 1,4-a-D-galakturonid)]galakturonát-hidroláz (EC 3.2.1.67). A pektinbontó en2
HU 220 337 Β zimek közül fontosabbak még a ramnogalakturonázok, amelyek az α-D-galakturonsav és az L-ramnóz-monomerek közötti kötéseket bontják.
A pektinliázok a nagymértékben észteresített pektinekre specifikusak, a poligalakturonázok viszont a kismértékben észteresített pektint hidrolizálják. Nagymértékben észteresített pektineket a pektinészterázok és poligalakturonázok keveréke képes lebontani.
A poligalakturonázok és a különböző pektinbontó enzimkeverékek használata az élelmiszeriparban kezdődött, ahol a gyümölcs- és zöldséglevek előállításához használják azokat: alkalmazásuk a lágy növényi szövetek sajtolás előtti feltárásától a nyerspréslé derítéséig terjedhet (1. táblázat). Az ilyen célra használt technikai minőségű enzimkészítmények a pektinészterázok, -liázok és poligalakturonázok mellett változó mennyiségű arabinázokat, galaktonázokat, xilanázokat, béta-l,4-glükanázokat, glükozidázokat és proteázokat is tartalmazhatnak.
1. táblázat
A poligalakturonázok és keverékeik felhasználási területei az élelmiszeriparban [Voragen (32) nyomán]
Enzimek Felhasználás
Poligalakturonázok macerálás citruslé-stabilizálás és viszkozitáscsökkentés
Pektinészteráz+poligalakturonáz és/vagy pektinliáz présléderítés lé- vagy olajextrakció citrushéjolaj, citrusmassza-tisztítás
Pektinészteráz és/vagy poligalakturonáz és/vagy pektinliáz+(hemi)cellulozók elfolyósítás présléderítés feltárás emészthetőség javítása
A gombákból készített pektinázpreparátumok főleg endopoligalakturonázokat tartalmaznak és mentesek a pektinészterázoktól. Az ilyen enzimkészítményeket rostos gyümölcslevek előállításához használják a macerálás (feltárás) során, és az így nyert levek sokkal lágyabbak és sokkal több oldható tápanyagot, sót és festékanyagot tartalmaznak, mint a hőkezelést követő préseléssel előállított levek.
A pektinészterázok jelenléte a tiszta poligalakturonázok maceráló (szövetfeltáró) aktivitását sejtfeltáró hatássá változtatja a kétféle enzim együttes sejtfallebontó hatása miatt.
A pektin és cellulózlebontó enzimek együttes alkalmazásával a gyümölcspépek csaknem teljesen elfolyósíthatók, ha a pektinázok mellett endo- és exo-(béta1,4-glükanázok) is vannak jelen (31).
A poligalakturonázok és keverékeik alkalmasak biomasszák elfolyósítására és elcukrosítására is. Ezt a lehetőséget a növényi poliszacharidok fermentálása során (33) vagy a pektinek módosítására (32) szokták kihasználni. A poligalakturonázok és xilanázok keverékeit a papíripar hasznosítja a fapép előállítása során (44).
Az Aspergillus niger pektinbontó enzimei nem termelődnek folyamatosan (nem konstitutívak); csak a pektin vagy bomlástermékei jelenlétében indukálódik a kifejeződésük, ha a rendelkezésre álló szénforrás (a glükóz vagy szacharóz) mennyisége a növekedéshez szükséges kritikus szint alá csökken. Felületi kultúrákban a pektinbontó enzimek a gomba sejtfalához kötve maradnak.
Mind Rexova-Benkova és Markovié (29), mind Rombouts és Pilnik (15) leírtak tisztított poligalakturonázokat az A. nigerből, baktériumokból és növényekből, de nem közöltek semmit az enzimek szerkezetéről. A szerkezet felderítéséhez továbbra is szükség van egy magas specifikus aktivitású, homogén poligalakturonázra, előnyösen legalább olyan tisztaságúra, hogy az aminosavszekvenciája meghatározható legyen.
A továbbiakban a „poligalakturonázok” kifejezést „PG”-vel helyettesítjük.
A találmány tárgya
A találmány tárgya eljárás tisztított, homogén PG-k előállítására természetes vagy transzformált szervezetekből. A találmány homogén PG-k (például PG-I, -II, -IIIA, -IIIB vagy -IV, különösen a PG-I vagy PG-II) tisztításán és szerkezetük részleges meghatározásán alapul, ami lehetővé tette az enzimfehéijék fontos területeit kódoló DNS-szekvenciák (minta-DNS-ek) szintézisét.
A találmány tárgya továbbá eljárás a PG-II és PG-I enzimeket kódoló DNS-szekvenciák és lehetőleg az előttük és utánuk álló szekvenciák felkutatására és izolálására a fenti DNS-minták segítségével az A. niger génkészletéből, valamint további PG gének izolálása az így izolált PG-Π gén (a továbbiakban pgall) vagy PG-I gén (pgal) darabjaival végzett hibridizáció útján egy fonalas gomba, például az A. niger génkészletéből.
A találmány tárgya továbbá eljárás rekombináns DNS-molekulák előállítására, amelyek egy expressziós szerkezetbe foglalva poligalakturonáz-enzimek strukturgénjeit - előnyösen intronszekvenciákkal együtt és/vagy egy PG gén szabályozó- (promoter-, jelzőés/vagy termninátor-) szekvenciáit tartalmazzák. A találmány oltalmi köréhez tartoznak a találmány szerinti PG géneket hordozó rekombináns DNS-molekulák, például hibrid vektorok is.
A találmány tárgyát képezik a fent leírt vektorokkal transzformált gazdaszervezetek, különösen fonalas gombák, például Aspergillus-fajok is, valamint eljárás a rekombináns DNS-molekulák előállítására és transzformáit gazdaszervezetek létrehozására, illetve új expressziós szerkezetek és hibrid vektorok készítésére a fenti DNS-molekulák segítségével.
A találmány tárgya továbbá eljárás PG-k feleslegben történő termelésére például Aspergillus-faj okban, valamint homogén PG-k vagy meghatározott összetételű PG-keverékek előállítására. A találmány oltalmi köréhez tartozik továbbá bármilyen heterológ fehérje termelése a találmány szerinti rekombináns PG-DNS-ek szabályozóhatása alatt kifejeződő struktúrgének segítségével.
A találmány tárgyát képező eljárások sokféleségét a részletes leírás teszi érthetővé.
A találmány részletes leírása A rekombináns DNS-molekulák
A találmány oltalmi körébe tartozó rekombináns DNS-molekulák olyan DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek
HU 220 337 Β
a) a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidok Aspergillus nigerből származó inszertjét hordozzák, vagy
b) az a) inszertben elhelyezkedő teljes PG-II-t vagy PG-I-t kódoló szakasszal hibridizálódni képes DNSszekvenciát hordozzák, amely egy poligalakturonáz-aktivitással rendelkező polipeptid struktúrgénjéből és előnyösen egy promoterből, egy jelző- vagy vezetőpeptid struktúrgénjéből és/vagy egy terminátorszekvenciából áll, vagy
c) az a) vagy b) DNS-szekvenciák egy származékát hordozzák, vagy
d) egy teljes PG-t vagy annak egy jelző- vagy vezetőpeptidjét kódoló, az a), b) vagy c) DNS-szekvenciákhoz képest megváltozott genetikai kódú DNS-szekvenciát hordoznak.
A találmány oltalmi körébe különösen azok a rekombináns DNS-molekulák tartoznak, amelyek olyan DNSszekvenciákat tartalmaznak, amelyek
a) a pGW1800 plazmid Aspergillus nigerből származó inszertjét hordozzák, vagy
b) az a) inszertben elhelyezkedő teljes PG-II-t kódoló szakasszal hibridizálódni képes DNS-szekvenciát hordozzák, amely egy poligalakturonáz-aktivitással rendelkező polipeptid struktúrgénjéből és előnyösen egy promoterből, egy jelző- vagy vezetőpeptid struktúrgénjéből és/vagy egy terminátorszakaszból áll, vagy
c) az a) vagy b) DNS-szekvenciák egy származékát hordozzák, vagy
d) egy teljes PG-t vagy annak egy jelző- vagy vezetőpeptidjét kódoló, az a), b) vagy c) DNS-szekvenciákhoz képest megváltozott genetikai kódú DNS-szekvenciát hordoznak; vagy amelyek olyan DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek
a) a pGW1900 plazmid Aspergillus nigerből származó inszertjét hordozzák, vagy
b) az a) inszertben elhelyezkedő teljes PG-II-t kódoló szakasszal hibridizálódni képes DNS-szekvenciát hordozzák, amely egy poligalakturonáz-aktivitással rendelkező polipeptid struktúrgénjéből és előnyösen egy promoterből, egy jelző- vagy vezetőpeptid struktúrgénjéből és/vagy egy terminátorszakaszból áll, vagy
c) az a) vagy b) DNS-szekvenciák egy származékát hordozzák, vagy
d) egy teljes PG-t vagy annak egy jelző- vagy vezetőpeptidjét kódoló, az a), b) vagy c) DNS-szekvenciákhoz képest megváltozott genetikai kódú DNS-szekvenciát hordoznak.
A pGW1800 és pGW1900 plazmidokat Escherichia coli törzsekben, JM109/pGW1800 és DH5alfaF7pGW1900 jelzések alatt a Deutsche Sammlung íür Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM)-nél helyeztük letétbe.
Leírásunkban a poligalakturonáz-aktivitással rendelkező polipeptideket is poligalakturonáznak (PG-nek) nevezzük. Ez a fogalom magában foglalja a természetben előforduló poligalakturonázok azon fragmentumait vagy mutánsait is, amelyek megőrizték enzimaktivitásukat. Ide értjük továbbá azokat a galakturonázokat is, amelyek szubsztrátjai galakturonsavat tartalmazó oligo- vagy poliszacharidok, például az oligogalakturonátokat bontó oligogalakturonázt vagy a ramnóz és galakturonsav kopolimerjeit bontó ramnogalakturonázt vagy ezek azon fragmentumait vagy mutánsait, amelyek megőrizték enzimaktivitásukat. A „vezetőpeptid” fogalom alatt a prepro-PG-k azon szekvenciáját értjük, amely az „érett PG” képződésekor lehasad a polipeptidről. A Jelzőpeptid” az a szekvencia, amelyet az endoplazmatikus retikulum szignálpeptidáza hasít le a keletkező polipeptidről.
A találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák például a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidok Aspergillus nigerből származó inszertjét hordozzák.
A pGW1800 plazmid A. niger N400-ból származó inszertje 4,1 kbp hosszúságú, és a plazmid Xbal restrikciós helyétől (a géntérképen az 1. pozíció) az EcoRI restrikciós helyig (4100. pozíció) terjed (2. ábra). Ez az inszert a PG-Π pgall génjét tartalmazza: a PG-II promoter- és terminátorszakaszát, valamint a prepro-PG-II kódoló szakaszát intronokkal együtt. Az A. nigerből származó, a pgall gént tartalmazó, az 1. pozíciójú Xbal helynél kezdődő és a 3050. körüli pozíciójú PvuII helynél végződő DNS-szakasz szekvenciáját meghatároztuk, és (SEQID No. 2) jelzőszám alatt írtuk le.
A pgall promoterszakasza a (SEQ ID No. 2) szekvencia 1357. pozíciójáig, a vezetőpeptid kódolószakasza az 1357-től az 1437. pozícióig, a jelzőpeptid kódolószakasza ezen belül az 1357-től az 1419. pozícióig teijed. Az érett PG-II kódolószakasza az 1438-tól a 2494. pozícióig tart, amit a terminátorszakasz követ a 2499. pozíciótól.
A pGW1900 plazmid A. niger N400-ból származó inszertje (3. ábra) 8,6 kbp hosszúságú, és az 1. pozíciójú BamHI restrikciós helytől a 8600. pozíciójú BamHI helyig teijed. A 3880. és 6280. pozíciók közötti DNSszakasz szekvenciáját (SEQ ID No. 1) jelzőszám alatt írtuk le.
A promoterszakasz a (SEQ ID No. 1) jelzésű DNSszekvencia 910. pozíciójáig tart. A 31 aminosav hosszúságú vezetópeptidet a 910. és 1002. pozíciók közötti szakasz kódolja, ezen belül a jelzőpeptid szakasza a 910. és 963. pozíciók között van. Az érett PG-II-t kódoló szakasza az 1003. pozíciónál kezdődik és a 2127. pozícióig tart, míg a terminátorszakasz a 2131. pozíciónál kezdődik.
A pGW1900 és pGW1800 plazmidok A. niger N400-ból származó inszertjeinek PG-I vagy PG-II kódolószakaszai „homológ” körülmények között képesek hibridizálódni az A. niger N400 megfelelő PG-I vagy PG-II génjeivel vagy azok fragmentumaival. Azok a DNS-szakaszok, amelyek legalább részben homológok az A. niger PG-I és PG-Π kódolószakaszaival és egy PG-aktivitással rendelkező fehérjét kódolnak, mind a PG géncsalád tagjai. A részlegesen homológ DNS-szekvenciák csak úgynevezett „heterológ” körülmények között hibridizálódnak az A. niger N400 PG-I vagy PG-II génjeiből származó DNS-szekvenciákkal; a „heterológ” körülmények jóval kevésbé szigorúak a „homológ” körülményeknél. A PG géncsalád azon tagjai, amelyek csak heterológ körülmények között hibridizálódnak, vagy az A. niger N400 egyéb - a PG-I-től és
HU 220 337 B
PG-II-től eltérő - PG génjei lehetnek, vagy más gombafajok vagy törzsek PG-I, PG-II vagy egyéb PG génjei lehetnek. Ilyen gombafajok, illetve -törzsek lehetnek Aspergillus-fajok (például az A. japonicus, A. oryzae, A. nidulans vagy az A. niger N400-tól eltérő törzsei), Trichoderma-, Botrytis-, Sclerotinia- vagy Fusariumfajok, más növénykórokozó gombák vagy élesztők, mint a PG-termelő Kluyveromyces-fajok, például a K. fragilis. Az ilyen gombákra előnyös példa az Aspergillus niger NW756 jelzésű törzse. A fentiek szerint a találmány oltalmi körébe tartozó PG géncsaládba tartoznak a PG-I, PG-II, PG-ΠΙΑ, PG-IIIB, PG-IV és egyéb PG-k génjei, amelyek előnyösen Aspergillus-fajokból, még előnyösebben az A. nigerből, különösen az A. niger N400 vagy NW756 jelzésű törzseiből származnak, de származhatnak más PG-termelő gombatörzsekből is. A PG géncsalád tagjait „PG gének”-nek nevezzük.
A PG géncsalád tagjai által termelt fehérjék enzimek (galakturonázok), amelyek galakturonsavat tartalmazó oligo- és poliszacharidokat bontanak. Ilyen enzimek az oligogalakturonázok, ramnogalakturonázok vagy különösen a poligalakturonázok.
Egy szokványos hibridizálási eljárást Benton és Davis (7) írnak le. A homológ és heterológ körülményeket a későbbiekben pontosan meghatározzuk.
A „származék” kifejezés alatt a találmány szerinti, új DNS-szekvenciákat értjük. Származékoknak tekintjük az átlapolószekvenciákat is tartalmazó, nagyobb szekvenciákat, azok fragmentumait és a mutáns, különösen a mesterségesen létrehozott mutáns szekvenciákat.
Az új DNS-szekvenciák nagyobb származékai azok a DNS-szekvenciák, amelyek az A. niger genomjából származnak és hibridizálódni képesek a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidok A. niger-DNS inszertjének PG-II vagy PG-I kódolószakaszaival. Ezek a származékok egy poligalakturonáz-aktivitású polipeptidet kódolnak, és a pGW1800 vagy pGW1900 A. niger-DNS inszertjeiben találhatókkal megegyező vagy azoktól eltérő promoter-, jelző- és/vagy terminátorszekvenciát tartalmazhatnak. Ilyen származékok az A. niger N400 vagy NW756 génkönyvtárakban találhatók, amelyek a nukleinsavak feldarabolása, a fragmentumok megfelelő restrikciós enzimekkel (például EcoRI, BamHI vagy HindlII) való kezelése, egy megfelelő vektorba (például lambda-fágba vagy pBR322 plazmidba) való inszertálása, klónozása (például E. coliban), majd a vektorból egy megfelelő restrikciós enzimmel történő kimetszése útján hozhatók létre.
Az A. niger N400 PG-I vagy PG-II génjeinek kódolószakaszaival heterológ körülmények között hibridizálódni képes DNS-szekvenciák származékaira előnyös példák azok az inszertek vagy fragmentumok, amelyek a lambda-PG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36. -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 és -Y33 fágokban vagy a pGW1910 plazmidban találhatók. A pGW1910 plazmid az A. niger N400 PG-C pgaC struktúrgénjét hordozza a lambda-PG-C20 fágból. A pGW1756 (6. ábra) az A. niger NW756 PG-II génjét hordozza, amelynek restrikciós mintája és szekvenciája (SEQ ID No. 3) eltér az A.
niger N400 PG-II génjéétől. Eszerint az NW756 és N400 jelzésű törzsek nem lehetnek közeli rokonok, és az is lehetséges, hogy különböző fajokhoz tartoznak. Ugyanakkor azt is megállapíthatjuk, hogy az A. niger N400 törzsének PG-I vagy PG-II struktúrgénjei heterológ körülmények között hibridizálódhatnak más fajok PG génjeivel.
A pGW1756 plazmid egy körülbelül 4000 bp hosszúságú pEMBL18 vektor-fragmentumból és egy körülbelül 5500 bp hosszúságú A. niger NW756 DNS-fragmentumból áll. A PG-II-t kódoló pgall gén a körülbelül 3300 bp hosszúságú HincII restrikciós fragmentumban helyezkedik el. A pGW1756 plazmidot letétbe helyeztük a DSM-nél.
Az A. niger NW756 pgall a (SEQ ID No. 3) szekvencia 889. nukleotidja előtt kezdődik. A prepro-PG-II vezetőpeptidjének kódolószakasza a 890-970., a jelzőpeptidé a 890-952. nukleotidok. A érett fehérje kódolószakasza a 971. nukleotidtól a 2028. pozíciójú stopkodonig tart; ezt követi a 2031-től kezdődő terminátorszakasz.
A pGW1910 plazmid (7. ábra) egy körülbelül 7800 bp hosszúságú inszertet tartalmaz, ami a lambdaPG-C20-ból és a pUC9 vektorból származik. A pgaC gén az A. niger N400-ból származó inszertben helyezkedik el. A pgaC gén csaknem teljes DNS-szekvenciáját a (SEQ ID No. 4) mutatja be. A promoterszakasz a 663. nukleotid előtt kezdődik, a vezetőpeptidet feltehetőleg a 663-782., a jelzőpeptidet a 663-710. pozíciók közötti nukleotidok kódolják. Az érett PG-t a 783-1995. nukleotidok közötti szekvencia - számos beékelt intronnal - kódolja; a terminátorszakasz az 1999. pozíciójú stopkodon után kezdődik.
A találmány szerinti származék DNS-szekvenciák tartalmazhatnak a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidokéval megegyező promoter-, jelző- és terminátorszakaszokat, de tartalmazhatnak azoktól eltérő, a poligalakturonáz géncsalád más tagjából származókat is. Továbbmenve, a származék DNS-szekvenciák bármilyen eredetű promoter-, jelző- és terminátorszakaszokat tartalmazhatnak, ha az előnyös egy adott gazdaszervezetben történő kifejeződésük szempontjából.
A promoter-, jelző- és terminátorszakaszok nagy választékban állnak rendelkezésre. Prokarióta, eukarióta vagy virális gének 5’-néma szakaszai promoterként, 3’néma szakaszai terminátorként használhatók fel; jelzőszakaszok a sejtek által kiválasztásra kerülő preproteinek struktúrgénjeinek 5’-kódoló területeiből nyerhetők. A promoterekre a későbbiekben adunk példákat.
Jelzőszakasz alatt azt a DNS-szekvenciát értjük, amely egy prepro-PG jelző- vagy vezetőpeptidjét kódolja.
Átlapolószekvenciák alatt a találmányban nem azokat a DNS-szekvenciákat értjük, amelyek a PG géneket természetes helyükre illesztik a genomban. A találmány szerinti átlapolószekvenciáknak lehet regulátor (például promoter-) szerepe, kódolhatnak egy peptidet (azaz lehetnek struktúrgének is), de lehetnek egyszerű térkitöltő szekvenciák (linkerek) is; szerepük minden esetben az, hogy a gént a leolvasáshoz megfelelő hely5
HU 220 337 Β re illesszék. Az átlapolószekvenciák származhatnak a vektorokból (fágból vagy plazmidból) is, és mindig részt vesznek az expressziós szerkezet kialakításában.
Fragmentumok alatt - az új DNS-ekkel kapcsolatban használva a szót - a nagyobb, különösen a promoter-, jelző-, terminátor- vagy struktűrfiinkciójukat is megtartott származékokat értjük. Fragmentumok az olyan DNS-szekvenciák, amelyek két restrikciós hely között helyezkednek el.
Előnyösek azok a DNS-fragmentumok, amelyek egy promoterszakaszt tartalmaznak, egy prepro-PG vezető- vagy jelzőpeptidjét kódolják, egy poligalakturonáz-aktivitású polipeptidet kódolnak, vagy egy terminátorszakaszt tartalmaznak. A találmány szerinti DNSszekvenciák bármilyen kombinációban tartalmazhatják ezeket a fragmentumokat, azaz tartalmazhatnak egy promotert és/vagy egy vezető- vagy jelzőpeptid kódolóterületét és/vagy egy PG struktúrgénjét és/vagy egy terminátorszakaszt.
A promoterszakaszt tartalmazó DNS-szekvenciákban a promoter általában 2000, előnyösen 500-1400 nukleotidra terjed ki a prepro-PG struktúrgénje fölött. A promoterszakasz köti meg az RNS-polimerázt és/vagy a regulátorfehéijéket.
A pgal gén promoterszakaszát láthatjuk a (SEQ ID No. 1) 1-909. pozíciói között. Az A. niger N400 pgall génjének promotere a (SEQ ID No. 2) 1-1356. szekvenciája, a pGW1756 plazmid A. niger NW756 eredetű inszertje pgall génjének promotere a (SEQ ID No. 3) 1-889. szekvenciája, a pGW1910 plazmid A. niger eredetű inszertje pgaC génjének promotere a (SEQ ID No. 4) 1-662. szekvenciája.
Egy prepro-PG vezetőpeptidjét kódoló DNS-szakasz általában a promoterszakasz és az érett fehérjét kódoló struktúrgén-szekvencia között helyezkedik el. A jelzőpeptidek kódolószakasza mindig rövidebb a vezetőpeptid kódolószakaszánál, a promoter végénél kezdődik és a jelzőpeptidet lehasító peptidáz felismerő helyéig terjed. Az A. niger N400 prepro-PG-II vezetőpeptidje 27 aminosav hosszúságú. Egy vezetőpeptidet kódoló DNS-fragmentum például a (SEQ ID No. 2) 1357. pozíciójú ATG-kodonjától az 1429. pozíciójú Xhol restrikciós helyig terjedő szekvencia. A preproPG-I vezetőpeptidjének 31 aminosavát a (SEQ ID No. 1) szekvencia 910-1002. nukleotidjai kódolják. Az A. niger NW756 prepro-PG-II vezetópeptidje feltehetőleg 27 aminosav hosszúságú, így kódolószakasza az a 81 bp hosszúságú DNS-szekvencia lehet, amely a (SEQ ID No. 3) szekvencia 889-971. pozíciói között helyezkedik el. Az A. niger N400 pgaC génjén kifejeződő fehérje valószínűleg 40 aminosav hosszúságú vezetőpeptidjét a (SEQ ID No. 4) 663-782. pozíciói között elhelyezkedő fragmentum kódolja. A megfelelő jelzőpeptideket kódoló DNS-fragmentumok pozíciói a következők: 911-936. a (SEQ ID No. l)-ben, 1358-1419. a (SEQ ID No. 2)-ben, 890-952. a (SEQ ID No. 3)-ban és 663-710. a (SEQ ID No. 4)-ben.
Egy érett PG-I teljes kódolószakasza látható például a (SEQ IDNo. 1) 1003-2127. pozíciói között. Az A. niger N400 PG-II kódolószakasza a (SEQ ID No. 2)
1430-2497. pozíciók közötti szekvenciája, az érett A. niger NW756 PG-II kódolószakasz a (SEQ ID No. 3) 953-2027. pozíciók közötti szekvenciája, míg a pgaC gén érett termékének kódolószakasza a (SEQ ID No. 4) 782-1996. pozíciói között helyezkedik el. PG-aktivitásukat megtartott polipeptideket azonban a fentieknél rövidebb fragmentumok is kódolhatnak.
A gombák számos génjéhez hasonlóan a PG-II, a PG-I és a többi PG génjei is tartalmazhatnak intronokat, de a találmány tárgyához tartoznak az intronmentes vagy a cDNS-eredetű PG gének is.
A transzkripció végét jelző terminátorszakasz általában a struktúrgén stopkodonjától (TAA, TAG vagy TGA) kezdődik és 300-2000, előnyösen 500-1000 bázispár hosszúságú. Terminátorszakaszok a (SEQ ID No. 1) 2131-2495., a (SEQ ID No. 2) 2498-3031., a (SEQ ID No. 3) 2031-3047. és a (SEQ ID No. 4) 1999-2304. pozíciók közötti szekvenciái.
A találmány tárgyához tartoznak azonban azok a DNS-fragmentumok is, amelyeknek 5’-végén átlapolószekvenciák találhatók, vagy amelyeknek 5’- vagy 3’vége csonka, de még megőrizték promoter- vagy terminátorfunkciójukat, terméküknek jelzőpeptidje és galakturonázaktivitása van.
Az említett fragmentumok tartalmazhatnak linkereket vagy átlapolódhatnak linkerekkel annak érdekében, hogy más DNS-molekulákhoz kapcsolhatók legyenek, és/vagy ezáltal a regulátorszakaszok és struktúrgének a kifejeződéshez szükséges helyzetbe és távolságra kerüljenek egymáshoz viszonyítva. Az alkalmas linkerek olyan DNS-szekvenciák, amelyek az összekötni kívánt DNS-molekulák végein található restrikciós helyeknek megfelelnek. A linkerek tartalmazhatnak egy meghatározott restrikciós helyet is.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák mutánsai lehetnek például természetes mutánsok. A találmány tárgyához tartoznak a jelző- vagy vezetőpeptidek kódolószakaszának azok a természetes vagy szintetikus mutánsai is, amelyek nem okoznak változást a peptid hidrofilitásában, azaz a poláros aminosavak (hisztidin, tirozin és arginin) kodonjai hasonló töltésű aminosavak kodonjával, a hidrofób aminosavak (alanin, leucin és treonin) kodonjai pedig más hidrofób aminosavak kodonjával lettek kicserélve bennük. Ilyen mutánsokat kapunk például, ha a pozitív töltésű lizin kodonját az argininével cseréljük fel vagy fordítva, ha a negatív töltésű tirozin kodonját a glutaminsav kodonjával vagy ha a hidrofób alanin kordonját a treonin, prolin, valin, izoleucin, leucin, metionin vagy fenilalanin bármelyikének kodonjával cseréljük fel.
A találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák tartalmazhatnak degenerált DNS-szekvenciákat is, amelyek degeneráltak abban az értelemben, hogy bennük tetszőleges számú nukleotidot más nukleotid helyettesíthet a kódolt aminosavszekvencia megváltoztatása nélkül. Az ilyen degenerált DNS-szekvenciák a bennük fellelhető új restrikciós helyek vagy egy kiválasztott gazdaszervezethez való illeszkedés szempontjából lehetnek előnyösek.
A találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák előnyösen az alábbi hibrid vektorokból származó
HU 220 337 Β
Aspergillus niger eredetű inszertet tartalmazzák: pGW1800, pGW1900, pGW1756 és pGW1910 plazmidok, lambda-PG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 és -Y33 fágok. A fenti DNSmolekulák tartalmazhatják azonban az inszertek egy fragmentumát is, például egy PG gén promoterszakaszát, egy vezető- vagy egy jelzőpeptid, egy prepro-PG, egy érett PG vagy egy poligalakturonáz-aktivitással még rendelkező PG-töredék kódolószakaszát vagy egy terminátorszakaszát. A találmány tárgyához tartoznak egyébként maguk az inszertek is.
A találmány oltalmi körébe tartoznak továbbá azok a rekombináns DNS-molekulák, amelyek egy promoterszakaszt, egy vezető- vagy jelzőpeptid kódolószakaszát, egy struktúrgént és/vagy egy terminátorszakaszt tartalmaznak, és előnyösen a fent említett vektorok valamelyikéből származnak.
Az „expressziós szerkezet” kifejezés alatt olyan DNS-szekvenciát értünk, amely képes egy polipeptid kifejezésére, és egy promotert, adott esetben egy jelzőszekvenciát, továbbá egy struktúrgént, adott esetben egy terminátorszakaszt és előnyösen egy transzkripciót elősegítő riboszómakötő helyet és/vagy további regulátorszekvenciákat tartalmaz. A találmány szerinti expressziós szerkezetekben a PG génekből származó funkcionális fragmentumok más génekből származó funkcionális fragmentumokkal lehetnek kombinálva.
A promoterszekvenciákat széles körből, a gazdasejt sajátságaihoz igazodva válogathatjuk meg: a leghasználhatóbbak az erős, de jól szabályozható promoterek. A transzlációt megindító szekvenciák például az úgynevezett Shine-Dalgamo-szekvenciák. A transzkripció megindításához és leállításához és az mRNS stabilizálásához szükséges szekvenciák egyszerűen nyerhetők virális vagy eukarióta (például a gazdaszervezet) cDNSek 3’- és 5’-néma szakaszaiból.
A megfelelő promoterekre példaként említhetjük a lambda-PL és -PR fágok, az E. coli lac, trp vagy tac génjei, vagy az élesztők TRP1-, ADHII-, PHO3- vagy PHO5-génjei promotereit, a glikolitikus enzimek (enoláz, glicerin-aldehid-3-foszfát dehidrogenáz, 3-foszfoglicerinsav-kináz, hexokináz, piroszőlősav-dekarboxiláz, foszfo-fruktokináz, glükóz-6-foszfát izomeráz, 3foszfo-glicerinsav mutáz, piroszőlősav-kináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz vagy glükokináz) génjeinek promoterét, az eukarióta vírusokból (SV40, Rous-szarkóma-vírus, adenovírus 2, marha-papillomavírus vagy citomegalovírus) vagy emlőssejtekből (például az aktin-, kollagén-miozin- vagy a bétaglobin-génből) származó promotereket. Az eukarióta promotereket kombinálhatjuk serkentőszekvenciákkal, például az élesztők úgynevezett upstream aktiváló szekvenciájával (UAS), virális vagy eukarióta serkentőszekvenciával (citomegalovírus IE serkentő, SV40 serkentő, immunoglobulin génserkentő) is. Ezek a serkentők a transzkripciót elősegítő DNS-szekvenciák, származhatnak vírusokból (például a Simian-, a polioma-, a marha-papilloma- vagy a Moloney-szarkóma-vírusból) vagy eukarióta genomokból, de származhatnak a Physarum polycephalum extrakromoszomális riboszómaDNS-éből (PCT/EP 8500278 szabadalmi leírás), a savas foszfatáz (PH05) génjéből (EP 86 111 820 6 szabadalmi leírás), a PH05-GAPDH hibrid génből (EP 86 111 820 6) vagy bármely hasonló forrásból.
A jelzőszekvenciák például olyan DNS-szakaszok lehetnek, amelyek a polipeptidek szekréciójához szükséges peptidszakaszokat kódolják. Ilyen jelzőszekvenciák például a prepro-PG-I, -PG-II vagy -PG-C jelző- vagy vezetőpeptidjét kódoló DNS-szekvenciák. További jelzőszekvenciák leírását az irodalomban találhatjuk meg [von Heijne, Nucleic Acids Rés., 14, 4683 (1986)].
A fenti összefüggésekben struktúrgénnek tekinthetők a PG-I és PG-II enzimeket kódoló DNS-szekvenciák mellett a többi PG-t és származékaikat, különösen a PG-aktivitást megőrző fragmentumokat kódoló DNSszekvenciák vagy az Aspergillus niger egyéb génjei is. Struktúrgéneknek tekinthetők továbbá a használható polipeptideket kódoló, vírusokból, prokarióta vagy eukarióta genomokból (a genomhoz tartozó DNS-ból vagy mRNS-ből, vagy szintetikus úton készített cDNSből) származó szekvenciák is. „Használható” polipeptidek alatt például a glükozilált (szekretálódó) polipeptideket, még inkább a magasabb eukarióta szervezetek, különösen az állatok és az ember ilyen polipeptidjeit, például élelmiszerek előállításában vagy kémiai reakciókban alkalmazható enzimeket, vagy emberi és állati megbetegedések megelőzésére és gyógyítására alkalmazható polipeptideket, például hormonokat vagy immunmodulátor, antivirális vagy antitumor hatású polipeptideket, antitesteket, virális antigéneket, vakcinákat, véralvadási faktorokat és hasonlókat értünk.
Az ilyen struktúrgénekre példaként említhetjük azokat, amelyek hormonok (például szekretin, timozin, relaxin, kalcitonin, luteotrop hormon, paratireoid hormon, adrenokortikotropin, melanocitastimuláló hormon, β-lipotropin, urogasztron vagy inzulin), növekedési faktorok [például hámszövet-növekedésifaktor, inzulinszerű növekedési faktorok (IGF-I és IGF-II), emlősejt-növekedésifaktor, idegsejt-növekedésifaktor, gliasejt eredetű idegsejt-növekedésifaktor vagy transzformáló-növekedésifaktor (TGF-β)], növekedési hormonok (például emberi- vagy marha-növekedésihormonok), interleukinok (például interleukin-1 vagy -2), emberi makrofág mozgásgátló faktor (MIF), interferonok (emberi α-interferon, például interferon-α-Α, -a-B, -aD vagy a-F, β-interferon, gamma-interferon vagy hibrid interferonok, például α-Α-α-D vagy α-Β-α-D hibrid interferonok, különösen a BDBB hibrid interferon), proteinázinhibitorok (például α-1-antitripszin, SLPI vagy hasonlók), hepatitisvírus-antigének (például hepatitisz B-vírus felületi vagy köpeny-antigének, hepatitis A-vírus-antigén vagy hepatitis nonA-nonB-antigén). Plazminogén aktivátorok (például szöveti plazminogén-aktivátor vagy urokináz), tumomekrózis-faktor, szomatosztatin, renin, β-endorfm, immunoglobulinok (például az immunoglobulin-D, -E vagy -G könnyű és/vagy nehéz láncai, vagy ember-egér hibrid immunoglobulinok), immunoglobulin-kötő faktorok (például immunoglobulin-E-kötő faktor), kalcitonin, emberi
HU 220 337 B kalcitoninszerű peptid, véralvadási faktorok (például IX vagy VIIIc faktorok), eritropoetin, eglin, (eglin C), hirudin, deszulfato-hirudin (például a HV1, HV2 vagy PA variánsok), emberi szuperoxid-dizmutáz, virális timidinkináz, β-laktamáz vagy glükózizomeráz aminosavszekvenciáit kódolják. Előnyösek azok a struktúrgének, amelyek az emberi α-interferon vagy hibrid interferon (különösen a BDBB hibrid interferon), az emberi szöveti plazminogénaktivátor (t-PA), a hepatitis B-vírus felületi antigén (HBVsAg), az I és II inzulinszerű növekedési faktorok, az eglin C vagy a deszulfato-hirudin HV1 variánsának polipeptidláncait kódolják. A találmány szerinti hibrid vektorokban a promoter- és/vagy jelzőszekvenciák úgy kapcsolódnak a polipeptidet kódoló szekvenciához, hogy biztosítsák annak hatékony kifejeződését.
Ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartoznak azok a rekombináns DNS-molekulák, amelyek rekombináns - más szóval: hibrid - vektorok, és az alábbi DNS-szekvenciák valamelyikét tartalmazzák:
a) a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidok Aspergillus niger DNS eredetű inszertjét,
b) egy olyan DNS-szekvenciát, amely hibridizálódni képes az a) pont szerinti DNS-inszert érett PG-II vagy PG-I kódolószakaszával (struktúrgénjével),
c) az a) vagy b) pont szerinti DNS-szekvenciák egy származékát vagy
d) egy a), b) vagy c) pont szerinti szekvenciát, amely egy érett PG-t vagy annak egy jelző- vagy vezetőpeptidjét kódolja az eredeti szekvenciához képest megváltozott (degenerált) szekvenciával.
Az említett rekombináns vektorok alkalmasak gazdaszervezetekben (például baktériumokban, gombákban vagy állati sejtekben) történő klónozásra és/vagy kifejeződésre. Ilyen hibrid vektorokat bármelyik, a génmanipulációs eljárásokban ismert és használt vektorból, így vírusokból, fágokból, kozmidokból, plazmidokból vagy kromoszóma-DNS-ből hozhatunk létre. A célnak megfelelő vektorok lehetnek az SV40, a herpesz-, a papilloma-, a retro- vagy a baculovírusok származékai, a lambda-fágok származékai (NM989 vagy EMBL4), az M13 fág származékai [(BamHI emésztéssel linearizált fág DNS=M13mp8 (15)], bakteriális plazmidok (pBR322, pUC18), élesztőplazmidok (2u plazmid) vagy fonalas gombákból, így Aspergillus-fajokból, különösen az A. nigerből származó kromoszomális DNSffagmentumok (EP 184 438 szabadalmi leírás). Vektorok lehetnek továbbá defektív vírusok, fágok vagy plazmidok is egy segítő- - a defektív vírus, fág- vagy plazmidreplikációját lehetővé tevő - vírus, fág vagy plazmid jelenlétében: ilyen vektor például az M13(+)KS fág az M14K07 segítőfággal együtt.
A találmány szerinti hibrid vektorok lehetővé teszik a kívánt DNS-szekvencia replikációját és előnyösen kifejeződését is egy megfelelő gazdaszervezetben akár extrakromoszomális elemként, akár a gazdaszervezet kromoszómáiba integrálódva. Számos olyan vektorrendszer áll a rendelkezésünkre, ami lehetővé teszi a találmány szerinti, klónozott DNS-ek integrálódását és kifejeződését. Elvben minden olyan vektor, amely replikálja és/vagy kifejezi egy kívánt polipeptid génjét, megfelel egy - az adott gazdaszervezet sajátosságai szerint felépített - expressziós szerkezetnek. A vektort úgy választjuk meg, hogy alkalmas legyen a gazdaszervezet transzformálására; a gazdaszervezetek lehetnek prokarióta vagy eukarióta mikroorganizmusok, így baktériumok, gombák (élesztők vagy fonalas gombák) vagy magasabb rendű eukarióta szervezetek, így gerinces állatok, különösen emlősök sejtjei. A megfelelő gazdasejteket később részletesen tárgyaljuk. A találmány szerinti hibrid vektorok elvben mindig hordozzák az előbbiekben definiált DNS-szekvenciák valamelyikét, és amellett egy replikációt indító vagy autonóm módon replikálódni képes szekvenciát, egy domináns marker szekvenciát, előnyösen a kifejezni kívánt struktúrgén transzkripciójához és transzlációjához és adott esetben a termék kiválasztódásához szükséges regulátorszekvenciákat, és előnyösen járulékos restrikciós helyeik is vannak.
A replikációt megindító vagy autonóm módon replikálódó szekvenciák (olyan DNS-szakaszok, amelyek az extrakromoszomális elemeknek az önálló szaporodás lehetőségét biztosítják) vagy adottak a vektorban, vagy más forrásokból, például a Simian-vírusból (SV40) vagy más vírusból, vagy a gazdasejt kromoszómakészletéből származnak.
A találmány szerinti hibrid vektorok tartalmazhatnak a gazdaszervezettől függően megválasztott szelektálható markereket is. Bármely marker gén használható, amely kifejeződésével elősegíti a transzformánsok fenotípus szerint történő kiválasztását. Különösen azok a marker gének használhatók, amelyek antibiotikumrezisztenciát (például tetraciklin- vagy ampicillinrezisztenciát) kölcsönöznek a gazdaszervezetnek, vagy - a gombák auxotróf mutánsai esetében - pótolják a gazdaszervezet genomjából hiányzó gént. Ilyen gének például a cikloheximidrezisztencia génje vagy az auxotróf élesztőmutánsokat prototróffá transzformáló urai, leül, his3 vagy trpl gének. Marker gének lehetnek még olyan struktúrgének is, amelyek egy önállóan replikálódó elemhez kapcsolódva fejeződnek ki, feltéve, hogy a transzformált gazdaszervezet eredetileg auxotróf volt a struktúrgén termékére nézve.
Különös jelentőségűek azok a marker gének, amelyek az A. niger hiánymutánsait prototróffá transzformálhatják. Ilyen például az omitin-karbamoil-transzferáz génje (argB), amelyet A. nigerből vagy A. nidulansból (EP 184 438 szabadalmi leírás) vagy az A. nidulans olyan DNS-fragmentumából nyerhetünk, amelyek homológok a Neurospora crassa pyrA génjével (27).
A találmány megvalósításának előnyös módját jelentik azok a hibrid vektorok, amelyek egy találmány szerinti expressziós szerkezetet hordoznak, amely egy PG struktúrgénjéből és/vagy egy promoterszekvenciából és/vagy egy jelző- vagy vezetőpeptidet kódoló szekvenciából és/vagy egy terminátorszekvenciából épül fel. A találmány szerinti expressziós szerkezetet például a pGW1800, pGW1900, pGW1910, pGII-IFN AMI 19, pGIIss-IFN AMI 19, pGW1756, lambda-PGA43, lambda-PG-D8 vagy lambda-PG-Dl 1 hibrid vektorok hordozzák.
HU 220 337 Β
A találmány oltalmi körébe a fent leírt, egy PG génből származó inszertet hordozó, rekombináns DNSmolekulákon kívül azok a DNS-molekulák is beletartoznak, amelyek egy PG génjei vagy annak funkcionális fragmentumai. Az ilyen DNS-molekulák lehetnek a PG gének promoterei, jelző- vagy vezetőpeptidek kódoló szakaszai, PG-aktivitású fehérjék struktúrgénjei vagy terminátorszakaszok; közös jellemzőjük, hogy poligalakturonázokat termelő gombatörzsekből, így Aspergillus- (például A. japonicus, A. oryzae, A. nidulans vagy A. niger), Trichoderma-, Botrytis-, Sclerotiniavagy Fusarium-fajokból, más növénykórokozó gombákból vagy élesztőkből, például a PG-termelő Kluyveromyces-fajokból (K. fragilis) származnak. Előnyösek az A. nigerből izolált DNS-molekulák. A találmány szerinti DNS-molekulák, származékaik és fragmentumaik hasonló DNS-ek vagy mRNS-ek DNS-génkönyvtárakban vagy mRNS-preparátumokban történő felkutatására használhatók.
A rekombináns DNS-molekulák előállítása
A találmány tárgyát képezi a fent meghatározott rekombináns DNS-molekulák előállításának eljárása is, ami történhet egy ilyen molekulával transzformált gazdaszervezet szaporításával vagy in vitro, szintetikus úton történő előállításával is.
A gazdaszervezet tenyésztését szokásos tápközegben, így a transzformánsok pozitív vagy negatív szelekcióját lehetővé tevő, kiegészített vagy hiányos tápközegekben végezhetjük. A szelekciót a marker gén jelenléte, illetve a nem transzformált szervezetekben hiánya alapján hajthatjuk végre. Az eljáráshoz bármilyen ismert és széles körben használt gazdaszervezet, így baktériumok (például E. coli), gombák (például Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactís), előnyösen fonalas gombák (például Aspergillus nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori, különösen az A. niger), még előnyösebben az A. niger An8 törzse, pyrA hiánymutánsa vagy N593 törzse használhatók. A gazdaszervezetek transzformálása a szokásos módon történhet.
A találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák által hordozott DNS-szekvenciák poligalakturonázokat termelő gombák genomjából nyerhetők, vagy egy transzformált gazdaszervezet sejtjeiből izolálhatok, vagy szintetikus úton, nukleotidok összekapcsolásával állíthatók elő. Részletesebben az ilyen DNS-molekulák preparálása az alábbi utakon történhet:
a) izoláljuk egy megfelelő gombasejt DNS-tartalmát, majd kiválasztjuk belőle a kívánt DNS-molekulát egy minta-DNS segítségével, vagy egy alkalmas expressziós rendszerben kifejezzük a különböző géneket, és a termékük alapján szelektálunk; vagy
b) izoláljuk egy megfelelő gombasejt mRNS-tartalmát, majd kiválasztjuk belőle a kívánt mRNS-molekulát egy minta-DNS segítségével, vagy egy alkalmas expressziós rendszerben kifejezzük a különböző mRNS-eket, a termékük alapján szelektálunk, a kiválasztott mRNS-ról előbb egyszálú majd kettős szálú cDNS-másolatot készítünk; vagy
c) cDNS-könyvtárból egy minta-DNS segítségével izoláljuk a kívánt cDNS-molekulát vagy egy alkalmas expressziós rendszerben kifejezzük a különböző cDNSeket és a termékük alapján szelektálunk; és/vagy
d) az a), b) vagy c) pont szerint kapott kettős szálú DNS-molekulákat egy megfelelő vektorba inkorporáljuk,
e) egy megfelelő gazda sejtjeit transzformáljuk az így kapott hibrid vektorral,
f) kiválasztjuk a transzformált sejteket a nem transzformáltak közül, és szükség szerint szaporítjuk azokat, és
g) izoláljuk a kívánt DNS-molekulát a transzformált sejtekből, és/vagy megváltoztatjuk (mutánsokat készítünk) vagy fragmentáljuk azokat.
A genomot alkotó DNS-készletből az a) pont szerint nyerhetjük ki a kívánt DNS-molekulát. A genom-DNS-t fonalas gombák PG-aktivitású fehéqéket termelő törzseiből preparáljuk ki, majd restrikciós endonukleázokkal végzett emésztés és vektorokba inkorporálás útján elkészítjük a genom-DNS-könyvtárat. Ezt a könyvtárat egy minta-DNS-sel vizsgáljuk végig, vagy egy megfelelő expressziós rendszerben kifejeztetjük a könyvtárat alkotó géneket, és a megjelenő termék alapján szelektálunk. Az említett műveleteket jól bevált módszerekkel végezzük, amelyeket még részletesen leírunk.
A poliadenilezett mRNS-ek ismert módon a b) pont szerint izolálhatok a megfelelő sejtekből. Az izolálás úgy is történhet, hogy a sejteket egy detergens és egy ribonukleázinhibitor (heparin, guanidínium-izotiocianát vagy merkapto-etanol) jelenlétében elhomogenizáljuk, az mRNS-t kloroform/fenol eleggyel, adott esetben sóés pufferoldatok, detergensek és/vagy kationokat kelátoló reagensek jelenlétében extraháljuk, az extraktum vizes fázisából etanollal, izopropanollal vagy más alkohollal kicsapjuk. A kapott nyers mRNS-keverék tovább tisztítható például cézium-klorid-gradiensben centrifugálva és újra etanollal kicsapva, és/vagy kromatográfiás módszerekkel, például affmitáskromatográfiával oligo(dT) cellulóz- vagy oligo(U) agarózoszlopon. Az így tisztított mRNS-keveréket előnyös-gradienscentrifugálással (például szacharózgradiensben) vagy agarózgél oszlopon kromatografálással molekulaméret szerint osztályozni. A keverékből a kívánt mRNS-t közvetlenül egy minta-DNS-sel vagy közvetve egy megfelelő sejtben vagy sejtmentes rendszerben kifejezve és a kívánt polipeptidet megkeresve választhatjuk ki.
Előnyös, ha a kívánt mRNS-t egy minta-DNS-sel történő hibridizálással választjuk ki, mert így elkerülhetjük a kifejeztetésével (transzlációjával) járó többletmunkát. Az eljáráshoz szükséges minta-DNS-ek legalább 17 nukleotidból álló, ismert szekvenciájú DNSmolekulák, amelyek készülhetnek szintézis útján, de lehetnek a kívánt polipeptidet kódoló mRNS-ről készült cDNS-molekulák vagy genomból származó DNS-fragmentumok is; az utóbbiak egyformán származhatnak természetes vagy génmanipulált mikroorganizmusokból.
A szintetikus minta-DNS-ek a későbbiekben részletezett módon, ismert eljárásokkal állíthatók elő. Előnyösen alkalmazható Ike és munkatársai [Nucleic Acids Rés., 11, 477 (1983)] módszere, amely szerint a két, három vagy négy, védett formájú nukleotid (dA, dC, dG
HU 220 337 Β és/vagy dT) keverékét vagy megfelelő dinukleotidokat kapcsolunk össze egy kondenzációs reakcióval.
A hibridizációhoz a minta-DNS-eket radioaktivitással jelöljük a jól ismert kinázreakció segítségével, majd a méret szerint frakcionált mRNS-t ugyancsak jól ismert módon, például egy kalcium-kelátoló reagenst, viszkozitást szabályozó vegyületeket, fehérjéket, nem homológ DNS-t és hasonlókat tartalmazó só- és pufferoldatban, a szelektív hibridizációt elősegítő (0-80 °C közötti, például 25-50 °C közötti vagy 65 °C körüli, előnyösen a kettős szálú hibrid DNS olvadási hőmérsékleténél mintegy 20 °C-kal alacsonyabb) hőmérsékleten hibridizáljuk a jelölt minta-DNS-sel.
A frakcionált mRNS transzlációja történhet sejtekben (például béka-petesejtekben) vagy sejtmentes rendszerekben (például retikulocita-lizátumban vagy búzacsíra-kivonatban). A keletkező polipeptidek kiválasztása történhet az enzimaktivitás vizsgálatával vagy a natív polipeptid ellen készített antitesttel, azaz immunológiai módszerekkel (például rádióimmun- vagy enzimmel vagy fluoreszcensz markerrel kapcsolt immunvizsgálattal). Az ilyen immunvizsgálatok, valamint a szükséges poli- vagy monoklonális antitestek előállítása igen jól ismert, így a szokott módon végeztük azokat.
Az egyszálú, komplementer DNS (cDNS) előállítása a kiválasztott mRNS-en, valamint kettős szálú DNS készítése az egyszálú cDNS-ból szintén jól ismert módszerekkel történhet meg. A templátként szolgáló mRNS-t dezoxinukleozid-trifoszfátok keverékével inkubáljuk (előnyös, ha a nukleozidok radioaktivitással jelöltek, mert így a reakció követhető) egy megfelelő, például az avian mieloblaszt vírus=AMV reverz transzkriptáza jelenlétében, majd az mRNS-t például lúgos hidrolízissel lebontjuk, és a cDNS-ből nukleozidok keverékével és egy újabb enzim segítségével kettős szálú DNS-t szintetizálunk. Ehhez a reakcióhoz is használhatunk reverz transzkriptázt, de használhatunk DNS-polimerázokat, így az E. coli DNS-polimerázának KJenow-fragmentumát vagy a T4 DNS-polimerázt. Mivel a cDNS-ek általában hajlamosak a hajtűhurok képződésére, ezt az SÍ nukleázzal történő emésztéssel akadályozhatjuk meg. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy az mRNS templát eltávolítása előtt kialakítunk egy homopolimer „farkat” a cDNS 3’-végén, és ezután kezdjük meg a kiegészítőszál szintézisét.
Ha a c) pont szerint járunk el, úgy előbb egy kettős szálú cDNS-t izolálunk egy cDNS-könyvtárból, és abban keressük meg a megfelelő cDNS-t. A cDNSkönyvtár elkészítése úgy történik, hogy a sejtből izolált mRNS-ekről válogatás nélkül elkészítjük - a fent leírt módon - a kettős szálú cDNS másolatokat, majd restrikciós endonukleázzal történő emésztés után fágokba (például a lambda-charon-4A vagy a lambda-gtl 1 fágba) inkorporáljuk a fragmentumokat. Nitro-cellulózmembránon végzett szaporítás után a cDNS-könyvtárat egy minta-DNS-sel vizsgáljuk át, vagy ki fejeztetjük azokat, és a kívánt terméket keressük meg egy specifikus antitest segítségével.
Egy kettős szálú cDNS vagy egy genomból származó DNS-fragmentum vektorba inkorporálásához számos módszer áll a rendelkezésünkre [d) pont]. Eljárhatunk például úgy, hogy az inkorporálni kívánt DNS-en és a vektor-DNS-en egymással komplementer homopolimer farkakat alakítunk ki úgy, hogy a megfelelő dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében egy terminális dezoxinukleotidil-transzferáz enzimmel inkubáljuk azokat, majd összekeverjük a kétféle DNS-t, és a komplementer szekvenciákat egy ligázzal egyesítjük. Eljárhatunk úgy is, hogy a kettős szálú DNS-t egy szintetikus linkerrel egészítjük ki, de alkalmazhatjuk a „tompa” vagy a,/agadós” végek módszerét is. A cDNS-könyvtár kialakításához megfelelő vektorokat később még tárgyaljuk.
A megfelelő gazdasejt transzformálását az így kapott hibrid vektorral [e) pont], majd a transzformált sejtek kiválasztását és felszaporítását [f) pont] ugyancsak jól ismert módszerekkel végezhetjük, amire a későbbiekben adunk példákat. A megfelelően megválasztott hibrid vektor és gazdasejtrendszer szolgálhatja a DNSszaporítást vagy a kívánt polipeptid termelését.
A kívánt DNS-t, mutánsait vagy fragmentumait jól ismert módszerekkel, például fenol/kloroformos extrakcióval izolálhatjuk. Adott esetben az izolált DNS-t módosíthatjuk: például mutagén vegyületekkel vagy restrikciós enzimekkel történő kezeléssel, módosíthatjuk az egyik vagy mindkét végét, hogy elősegítsük a vektorhoz kapcsolását, eltávolíthatjuk belőle a felesleges, zavaró szekvenciákat, vagy hasonló módosításokat végezhetünk rajta.
A találmány szerinti DNS-ek szekvenciáját mások által kidolgozott módszerekkel, például a végek jelölésével (Maxam-Gilbert) vagy az úgynevezett didezoxiláncvégződés módszerrel (Sanger) lehet felderíteni.
A találmány szerinti PG géneket hagyományos módszerekkel, in vitro szintézissel lehet előállítani. Az in vitro szintézis különösen alkalmas módszer a PG expressziós szerkezet kisebb egységeinek, például a promotemek, a jelzőpeptidet kódoló szakasznak vagy a PG struktúrgénjének az elkészítésére, különösen a mutánsok vagy a lambda-klónok esetében.
A DNS-szintézis módszereiről jó összefoglalást találhatunk Narang [Tetrahedron, 39, 3 (1983)] közleményében. Az ismert módszerek lehetővé teszik akár 120 bp vagy hosszabb polinukleotidok szintézisét is jó hozammal, magas tisztasággal és aránylag rövid idő alatt. A foszfodiészter-módszer [Agarwal és munkatársai, Angew. Chem., 84, 489 (1972)], a sokkal hatékonyabb foszfotriészter-módszer [Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972)], a foszfit-triészter-módszer [Letsinger és munkatársai, J. Am. Chem. Soc., 98, 3655 (1976)] vagy a foszforamidát-módszer [Beaucage és Carruthers, Tetrahedron, 22, 1859 (1981)] mind megfelelően védett nukleotidok összekapcsolásán alapszik. A szintézis egyszerűsítését teszi lehetővé az úgynevezett szilárd fázisos eljárás, ahol a nukleotidláncokat egy polimer mátrixhoz kapcsolva, lépésenként hosszabbíthatjuk. Rink és munkatársai [Nucleic Acids Rés., 12, 6369 (1984)] újítása, hogy a szilárd fázisos eljárásban trinukleotidokat használhatunk az egyedi nukleotidok helyett és a foszfotriészter-módszerrel kapcsoljuk össze azokat: ez a módszer magas hozamú és igen gyors.
HU 220 337 B
A kettős szálú DNS-t a fenti módon előállított egyszálú DNS-ekből a megfelelő enzimekkel állíthatjuk elő. Az egyszálú DNS-molekulát a szükséges dezoxinukleozid-trifoszfátok és egy DNS-polimeráz (például a DNS-polimeráz I, ennek Klenow-fragmentuma, a T4 DNS-polimeráz) vagy az AMV reverz transzkriptáz segítségével egészíthetjük ki kettős szálúvá [Narang és munkatársai, Anal. Biochem., 121, 356 (1982)].
A következőkben a találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák génkönyvtárból történő előállításának módját, valamint a PG géncsalád tagjainak homológ és heterológ körülmények között végzett hibridizációval történő azonosítását írjuk le részletesen.
Génkönyvtárat az A. niger N400 vagy NW756 törzseinek genom-DNS-éből készíthetünk. A kipreparált DNS-t részlegesen emésztjük Sau3AI vagy Mbol nukleázokkal, és a magas molekulatömegű fragmentumokat egy megfelelő vektorba, például az E. coli pUN121 plazmidba vagy a lambda-EMBL4 fágba klónozzuk.
Génkönyvtárat más, PG-termelő gombafajok, illetve -törzsek genomjából, így Aspergillus-fajokból (például az A. japonicus, A. oryzae, A. nidulans vagy az A. niger más törzsei), Trichoderma-, Botrytis-, Sclerotinia- vagy Fusarium-fajokból, más növénykórokozó 25 gombákból vagy élesztőkből, mint a PG-termelő Kluyveromyces-fajokból, például a K. fragilisből is készíthetünk. A fragmentumok klónozására is használhatók a fent említetteken kívül más vektorok.
Ahhoz, hogy a génkönyvtárból kiválaszthassuk a 30 PG-ket kódoló DNS-szekvenciákat, egy azokkal hibridizálódni képes minta-DNS-re van szükség. Ez lehet egy szintetikus DNS-fragmentum is - ha a kívánt PG aminosavszekvenciáját legalább részben ismerjük -, de lehet egy másik PG gén vagy annak egy része is, ha az hibridi- 35 zálódik a kívánt génnel. Mivel találmányunk kidolgozása előtt sem egy PG szekvenciája, sem egy PG gén vagy legalább egy része nem volt ismert, a probléma megoldását a PG-k tisztításával és N-terminális szekvenciájuk meghatározásával kellett kezdenünk, és csak azután tud- 40 tűk előállítani a megfelelő minta-DNS-eket.
A tiszta PG-k előállítása bármely ismert fonásból lehetséges : az A. niger poligalakturonázainak kereskedelemben is kapható nyerskeveréke (Rapidase®) például megfelelő kiinduló anyag a tisztításhoz. A preparálás lényegében hagyományos elválasztástechnikai eljárások megfelelő sorrendben történő alkalmazása: kisózás, sómentesítés, újabb kicsapás más só formájában, kroma5 tográfia (például affinitáskromatográfia térhálósított algináton, ioncserélő kromatográfia DEAE-Sephadexen vagy Sepharoson, gélpermeációs kromatográfia Sephacryl oszlopon), elektroforézis SDS-poliakrilamid gélen, izoelektromos fokuszálás vagy hasonlók, illetve 10 ezek kombinációi.
A találmányunk kidolgozásához vezető munkánk során a PG-I, PG-II, PG-ΠΙΑ, PG-IIIB és PG-IV enzimeket izoláltuk a Rapidase-ból tiszta formában. A felsorolt PG-k endopoligalakturonázok (E.C. 3.2.1.15) az 15 alábbi fizikai-kémiai jellemzőkkel
Relatív moltömeg Izoelektromos pont pH-optimum
PG-I 55 000 3,2-3,5 4,9
PG-II 38 000 4,6-5,9 4,8
PG-IIIA 57 000 3,3 4,3
PG-IIIB 57 000 3,3 4,5
PG-IV 59 000 3,7 4,8
A relatív molekulatömeget SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, az izoelektromos pontot vékonyrétegben végzett izoelektromos fokuszálással határoztuk meg. A PG-I N-terminális szekvenciája a következő: alal-ser-thr-X4-thr5-phe-thr-ser-ala9.
A PG-I 21 kd-s bróm-cianid-fragmentumának N-terminális szekvenciája megegyezik a teljes enzimével: ala-ser-thr-X4-thr-phe-thr-ser-ala-ser-glu, míg az 5,5 kd-s bróm-cianid-fragmentum az alábbi szekvenciát mutatta:
ala-asp-gly-ala-val-ile-asp-gly-asp-gly-ser.
A PG-II N-terminális szekvenciája a következő : asp1-ser-X3-thr-phe5-thr-thr-ala-ala-ala10-ala-lys-ala12 és a 17 kd-s bróm-cianid-fragmentum szekvenciája ala-phe-ser-val-gln-ala-asn-asp-ile-thr-phe.
Az X3 és X4 aminosavakat ez ideig nem azonosítottuk.
A PG-I 5,5 kd-s fragmentumának aminosavszekvenciája alapján az alábbi oligonukleotidkeveréket szintetizáltuk:
me t a 1 a asp gly a 1 a va 1
HR 6298 5’(d) ATG GCI GAR, GGI GCI GTI
i 1 e asp gly asp gly
ATR3 GAR, GGI GAR, GG 3
A PG-II 17 kd-s fragmentumának aminosavszekvenciája után az alábbi két oligonukleotidkeveréket szintetizáltuk:
me t a 1 a phe ser va 1 gin
HR 6195 5 ’ (d) ATG GCI TTR, TCI GTI CAR2
HR 6196 5 ’ (d) ATG GCI TTR, ÁGI GTI car2
a 1 a asn asp i 1 e
HR 6195 GCI AAR, GAR, AT 3 ’
HR 6196 GCI AAR, GAR, AT 3 ’
A megadott nukleotidszekvenciákban I inozint, R, nint (G), R3 pedig timint, citozint vagy adenint jelent, timint (T) vagy citozint (C), R2 adenint (A) vagy gua- 60 A keverékeket radioaktivitással jelöltük, és a PG-I és
HU 220 337 B
PG-II gének kiválasztására használtuk az A. niger N400 génkönyvtárból.
Az azonosított gének vagy génfragmentumok szekvenciáját ismert módszerekkel határoztuk meg; az A. niger N400 PG-I és PG-II génjeinek felépítését a (SEQ ID No. 1) és (No. 2) mutatja be.
A minta-DNS-eket szokásos módon, 32P-ATP és T4 kináz vagy 32P-dATP és E. coli DNS-polimeráz I segítségével jelöltük meg, a szekvenciától függően választva meg a módszert. A találmány szerinti nukleinsavakat inszert alakjában hordozó mikroorganizmusokat a génkönyvtár membránmásolatain ezekkel a jelölt minta-DNS-ekkel azonosítottuk: azokat a kiónokat izoláltuk és szaporítottuk tovább, amelyek a minták legalább egyikével hibridizálódtak.
A hibridizálás körülményei a szokásosak voltak, és lehettek szigorúak vagy enyhébbek. A szigorú körülmények között csak azok a DNS-szekvenciák képesek hibridizálódni, amelyek nagymértékben homológjai egymásnak („homológ” hibridizáció), míg a „heterológ”, azaz enyhébb körülmények között már alacsonyabb fokú homológia esetén is létrejöhetnek a hibridek. A hibridizáció szigorúságát befolyásolhatja például a mosás hőmérséklete, a formamid- vagy a sókoncentráció, a DNS G+T tartalma, a hibridizálás időtartama vagy a minta-DNS hossza. A különböző hibridizációs körülményekre később adunk meg nem kizárólagos példákat.
A minta-DNS-ek segítségével - különösen azokkal, amelyek legalább részben a PG-I vagy PG-II gén kódolószakaszával mutattak homológiát - hibridizálódni képes kiónokat izoláltunk az A. niger N400 vagy NW756 génkönyvtárakból, és osztályokba soroltuk azokat a hibridizációban részt vevő restrikciós fragmentum és a homológia foka szerint. Az így kapott kiónok közül az előnyösen használhatókra példaként soroljuk fel a következőket: az A. niger N400 génkönyvtárból a lambda-PG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 és -Y33 fágokat, az NW756 génkönyvtárból pedig a pGW1756 plazmidot. A felsorolt kiónok létrehozásának módját a példákban írjuk le részletesen.
A fenti kiónokból és a pGW1800, pGW1803, pGW1900, pGW1902 és pGW1910 plazmidokból további, szintén a találmány oltalmi körébe tartozó rekombináns DNS-molekulákat készíthetünk. Az újabb rekombináns DNS-molekulákat szokványos módon, így különböző restrikciós enzimek és linkerek alkalmazásával, ligáláson, sokszorozáson és izolációs lépéseken keresztül állíthatjuk elő.
Az expressziós vektorok lehetnek pro- vagy eukarióta vektorok, vagy úgynevezett ingázó vektorok, amelyek mind pro-, mind eukarióta sejtekben használhatók. Az ingázó vektorok létrehozásának módja jól ismert az irodalomból. Az expressziós vektorok mind homológ, mind heterológ géneket tartalmazhatnak; az ilyen géneket később ismertetjük.
A rekombináns DNS-molekulák inszertjeit vagy az utóbbiak fragmentumait is szokásos módon, a rekombináns DNS restrikciós enzimekkel való emésztése és a kívánt fragmentum agaróz-gélelektroforézissel történő izolálása útján kaphatjuk meg.
A találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák mutánsait - különösen azokat, amelyek a PG génnek megfelelő szekvenciákban tartalmaznak újabb restrikciós helyeket - például irányított mutagenezissel hozhatjuk létre. Az erre alkalmas módszerek az irodalomból ismertek [Zoller és Smith, Methods Enzymol., 700, 468 (1983); Botstein és Shortle, Science, 229, 1193 (1985); Norris és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 77, 5103 (1983)].
A találmány oltalmi körébe tartozik a találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák felhasználása a struktúrgének kifejeződését biztosító hibrid vektorok létrehozására.
Transzformált gazdaszervezetek
A találmány tárgyához tartoznak továbbá a transzformáit gazdaszervezetek (-sejtek) is, amelyekben a rekombináns DNS-molekulák sokszorozása, különösen pedig a rekombináns DNS-molekulákat hordozó expressziós szerkezetek kifejeződése történik meg.
A DNS-molekulák sokszorozása előnyösen olyan mikroorganizmusokban történhet, amelyekben nincs vagy csak kevés restrikciós vagy más, a DNS-molekulákat módosítani képes enzim van. Az ilyen mikroorganizmusok különösen baktériumok, például az Escherichia coli különböző törzsei (X1766, Y1090, W3110, HB101/LM1035, JA221, DH5a, előnyösen a DH5aF’, JM109, JM110, MH1, HB101 vagy K12), más baktériumfajok (Bacillus subtilis, B. stearothermophilus, Pseudomonas sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp.) vagy élesztők (Saccharomyces cerevisiae GRF 18) lehetnek. Használhatók továbbá magasabb rendű szervezetek sejtjei, különösen folytonosan szaporodó emberi vagy állati sejtvonalak is, mint amilyenek az L132 emberi embrió tüdőfibroblaszt-sejtek, az emberi malignus melanoma Bowes-sejtjei, a HeLa-sejtek, az afrikai zöld majom SV40 vírussal transzformált COS-7 vesesejtjei vagy az aranyhörcsög petefészeksejtjei (CHO).
Az expressziós szerkezetek kifejezésére a felsorolt gazdaszervezeteken és sejteken kívül különösen fonalas gombák, például Penicillium-, Cephalosporium- vagy előnyösen Aspergillus-fajok, például az A. carbonarius, A. awamori vagy még előnyösebben az A. niger, A. nidulans vagy A. oryzae alkalmasak.
A transzformált gazdaszervezetek közül előnyösen használhatók a pGW1800 vagy 1803 plazmidokkal transzformált E. coli MH1 vagy JM109, a pGW1900, 1902, 1756, 1910, pGII-IFN AMI 19 vagy pGIIs-IFN AMI 19 plazmidokkal transzformált E. coli DH5aF’, vagy a pGII-IFN AMI 19, a pGIIss-IFN AMI 19 plazmidokkal vagy a pCG59D7 szelekciós marker plazmiddal transzformált Aspergillus niger An8 vagy N593 vagy az Aspergillus nidulans.
A találmány tárgyához tartozik az említett transzformánsok létrehozásának eljárása is, amely magában foglalja a gazdasejtek kezelését a rekombináns DNSmolekulákkal - különösen a hibrid vektorokkal, amelyek adott esetben egy szelekciós markert is hordoznak - a transzformációt elősegítő körülmények között, vala12
HU 220 337 Β mint a létrejött transzformánsok szelekcióját is. A transzformációt az irodalomból ismert, szokványosnak tekinthető módszerekkel végezhetjük el: a Saccharomyces cerevisiae transzformálására Hinnen és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], a Bacillus subtilis transzformálására Anagnostopoulos és munkatársai [J. Bacteriol., 81, 741 (1961)], az E. coli transzformálására Mandel és munkatársai [J. Mól. Bioi., 53, 159 (1970)] adnak útmutatást.
Ennek megfelelően az E. coli transzformálása például úgy történhet, hogy a sejteket előkezeljük kalciumionokkal a DNS felvételének elősegítésére, majd inkubáljuk a hibrid vektorral. Ezt követi a transzformáit sejtek kiválogatása, amit például szelektív táptalajok segítségével végezhetünk, amelyeken a transzformáit sejtekbe jutott vektor marker génje feltűnően érvényesül. Előnyösen olyan táptalajt is használhatunk, amelyeken a nem transzformált sejtek képtelenek a szaporodásra. Az élesztők transzformálása során először a sejtfalat kell eltávolítani glükozidáz enzimekkel, majd az így kapott szferoplasztot polietilénglikol és kalciumionok jelenlétében inkubáljuk a vektorral és végül megfelelő táptalajon regeneráltatjuk a szferoplasztokat. A szelektálás előnyösen a regeneráltató táptalajon is történhet.
A magasabb rendű szervezetek sejtjeinek transzformálása célszerűen transzfekcióval történhet. A transzfekció is hagyományos technikával történhet, például kalcium-foszfátos precipitációval, mikroinjekcióval, protoplasztfúzióval, elektroporációval (a DNS-nek rövid, a sejtmembránt átmenetileg fellazító elektromos impulzusokkal történő bejuttatásával) vagy segítő vegyületekkel (például dietil-amino-etil-dextránnal, dimetil-szulfoxiddal, glicerinnel vagy polietilén-glikollal). A transzfekció után a transzformált sejteket azonosítjuk és szelektáljuk egy, az adott markeltől függően megválasztott táptalajon, például a Dulbecco által módosított Eagle-táptalajon (DMEM), minimáltáptalajon vagy az RPMI 1640 táptalajon való tenyésztéssel, amelyek a megfelelő antibiotikumot tartalmazzák.
A transzformált gazdasejteket ismert módon, asszimilálható szénforrást, például szénhidrátokat (glükózt vagy laktózt), nitrogénforrást, például aminosavakat, peptideket, fehérjéket, ezek lebontásával kapott peptonokat vagy ammóniumsókat és különböző ásványi sókat, például nátrium-, kálium-, magnézium- és kalciumszulfátot, -foszfátot és/vagy -karbonátot tartalmazó tápfolyadékban tenyészthetjük. A tápfolyadék tartalmazhat szaporodásserkentő anyagokat, például nyomelemeket (vas, cink, mangán és hasonlók) is.
A tápközeget úgy választjuk meg, hogy gátolja a nem transzformálódott vagy a vektort elvesztett sejtek szaporodását. Ezt úgy valósíthatjuk meg a markerként antibiotikum-rezisztenciát tartalmazó vektorok esetében, hogy a tápközeghez antibiotikumot adunk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy auxotróf gazdasejtet választunk, és olyan vektorral transzformáljuk, amely a hiányzó metabolit génjét tartalmazza; ilyenkor a tápközegből kihagyjuk azt a vegyületet, amely nélkül a nem transzformáit sejtek képtelenek a szaporodásra.
A magasabb rendű szervezetek sejtjei, például az emlőssejtek a szövettenyésztés ismert módszereivel, például az említett tápfolyadékokban szaporíthatok. A tápfolyadékokat adott esetben szaporodásserkentő anyagokkal és/vagy emlősszérummal is kiegészíthetjük. A tenyésztés technikája is jól ismert: történhet homogén szuszpenziós tenyészetben (például airlift-reaktorban vagy folyamatosan kevert reaktorban) vagy immobilizált, illetve beágyazott tenyészetekben (például üresrostos, mikrokapszulás, agarózgyöngyös, üreges üveggyöngyös vagy kerámiahordozós tápfolyadékban).
A tenyésztés körülményei befolyásolhatják az eljárás eredményességét, ezért a hőmérsékletet, a pH-t és a tenyésztés időtartamát úgy választjuk meg, hogy a kívánt polipeptidet vagy származékát az elérhető maximális mennyiségben kapjuk. így az E. coli vagy élesztőtörzseket célszerűen aerob körülmények között, rázott vagy kevert folyadékkultúrában, 20-40 °C közötti, előnyösen 30 °C körüli hőmérsékleten, 4-8 közötti, előnyösen 7 körüli pH-értéken, 4-30 órán át, előnyösen a kívánt termék maximális koncentrációjának eléréséig tenyésztjük.
Annak érdekében, hogy a transzformálódott sejteket kiválaszthassuk a nem transzformalódottak közül, vagy a találmány szerinti DNS-molekuláknak kell egy szelekciós markert hordoznia, vagy a sejteket kell egyidejűleg egy másik, a szelekciós markert hordozó vektorral is transzformálni (kotranszformáció). Mint az előbbi esetekben, a szelekciós marker itt is egy kifejeződni képes struktúrgén lehet, amelynek terméke (általában egy enzim) megvédheti a sejtet egy toxikus anyagtól vagy lehetővé teszi egy életfontosságú metabolit szintézisét. A transzformált fonalas gombák szelektálására előnyösen alkalmazható markerek az ismert ga-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS vagy argB gének.
Amint az EP 278 355 szabadalmi leírásban olvashatjuk, az A. nigerből izolált pyr A, az A. nidulansból izolált pyrG és az N. crassából izolált pyr4 marker gének igen hasonlóak egymáshoz. A pyr géncsalád az orotidin-5’-foszfát dekarboxiláz enzimet termeli, amelynek funkciója az orotidin-5’-foszfát uridilsawá (uridin5-foszfáttá) alakítása, de képes az 5-fluor-orotsavat is átalakítani a toxikus 5-fluor-uridinné.
Egy pyr A gént hordozó E. coli-klónt azonosítottunk hibridizációs eljárással; a minta-DNS a pDJB2 plazmid (25) 1,1 kbp HindlII fragmentuma volt, amely a pyr4 gén egy részét tartalmazta, bár használhattuk volna bármelyik pyr gént erre a célra. A pyrA+ kiónból (E. coli B75183/pCG59D7) izoláltuk a pCG59D7 plazmidot - ami a pyr A gént hordozza -, és kotranszformáltunk vele egy A. niger pyrA~ mutánst, amely a gén hiányában nem képes a megfelelő enzim bioszintézisére. A pyr A mutánsokat úgy hoztuk létre, hogy a gomba konidiospóráit mutagén UV-sugárzással kezeltük, majd izoláltuk azokat a telepeket, amelyek 5-fluor-orotsav és uridin jelenlétében fejlődtek ki. Ezeket tovább szelektálva kizártuk az 5-fluor-orotsav jelenlétében, de uridin hiányában is fejlődőképes vonalakat, majd az így kapott uridinigényes mutánsokat transzformáltuk és két csoportba soroltuk annak alapján, hogy a pyr A vagy pyrB
HU 220 337 B gén hiányzik-e belőlük. A két csoportot az An8 és AnlO mutáns vonalak képviselik. ApyrA gént hordozó pCG59D7 plazmiddal való transzformálás (protoplaszton át) csak az An8 típusú telepek transzformálódtak, amelyekben a pyrA gén megjelenését a pUN121 plazmidból származó minta-DNS-sel végzett hibridizáció is igazolta.
Polipeptidek előállítása
A találmány tárgyához tartozik egy polipeptidek előállítására szolgáló eljárás, ami azzal jellemezhető, hogy egy homológ vagy heterológ gént - az előzőekben meghatározott értelmezés szerint - inszertálunk egy expressziós szerkezetbe, és azt egy transzformált gazdaszervezetben kifejeztetjük, majd - ha kell - a keletkezett polipeptidet szokásos módon izoláljuk. Az expressziós szerkezet felépítésétől függően a tennék vagy csak termelődik, vagy - ha egy jelzőszakasz is jelen van - ki is választódik a sejtből. Az expressziós szerkezet általában egy hibrid vektorban van, de integrálódhat is a gazda genomjába a transzformáció után.
Ha a találmány szerinti PG gén promotere fonalas gombából származik, úgy a megfelelő gazdaszervezetek is fonalas gombák, különösen Aspergillus-fajok lehetnek a homológ vagy heterológ struktúrgének kifejezésére. Ha azonban más, például prokarióta vagy magasabb rendű eukarióta promotereket használunk, úgy más gazdák, például baktériumok (E. coli) vagy magasabb rendű eukarióta sejtvonalak a megfelelőek.
Az A. niger PG génjeinek promoterei indukálhatok a gomba sejtjeiben, azaz a promoterekhez kapcsolódó struktúrgének - a PG gének vagy bármely idegen gén - kifejeződése megindul, ha a tápközegben pektin vagy lebontási termékei vannak jelen. Az An8 és N593 törzsekben a promoter glükóz jelenlétében nem indukálható, ami azt jelenti, hogy az A. nigerben a PG gének kifejeződése katabolit-represszióval is szabályozható. Ezzel szemben más Aspergillus-törzsekben, így előnyösen az A. oryzae, még előnyösebben az A. nidulans törzseiben az A. nigerből származó promoterhez kapcsolt PG gének kifejeződése konstitutív, azaz nem igényli pektin jelenlétét, de nem gátolja a glükóz jelenléte sem. Ezért előnyös lehet, ha géneket az A. niger PG-promoterének szabályozóhatása alatt, de nem A. nigerben, hanem célszerűen A. oryzae-ben vagy még célszerűbben A. nidulansban fejeztetünk ki, mert így például glükózt használhatunk szénforrásként a tápközegben pektin helyett a kívánt termék előállítása során.
Ha a találmány szerinti expressziós szerkezetben használt promoter nem egy PG génből származik, úgy más gazdaszervezetet kell használnunk. A gazda megválasztása ilyenkor a promoter eredetétől függ, és lehet egy baktérium (például E. coli) vagy egy élesztő (például S. cerevisiae vagy Kluyveromyces lactis). A polipeptidek előállításához ugyanazok a promoterek és gazdaszervezetek a megfelelőek, mint amelyeket a transzformáció bemutatása során leírtunk.
A fentiek szerint lehetséges egy vagy több kívánt PG „overexpressziója”, mégpedig több különböző módszer alkalmazásával. Egy tisztított PG előállítható pektinolitikus enzimek keverékéből a szokványos elválasztástechnikai módszerek használatával. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy egy homogén PG-t, előnyösen a PG-I-t, a PG-II-t vagy a pgaC gén termékét egy olyan gazdában termeltetjük, amely nem képes PG termelésére, vagy csak nagyon alacsony szinten termel más PG-t, vagy a bevitt PG gént indukáló körülmények között saját PG génjei nem indukálódnak. Ha a gazda önmagában nem képes PG-t termelni, úgy a transzformálás után benne kifejeződő PG-t tisztán, más PG-ktől mentes állapotban kapjuk meg. Lehetőség van arra is, hogy PG-k meghatározott arányú keverékét állítsuk elő, amely adott esetben még más enzimeket is tartalmazhat; ilyenkor úgy járhatunk el, hogy a transzformált gazdában egynél több PG gént és/vagy más enzimek génjeit fejeztetjük ki egyszerre. Meghatározott összetételű és arányú enzimkeverékeket úgy is előállíthatunk, hogy a kívánt más enzimet (például pektinészterázt, pektinliázt, cellulázt, kevert endoglükanázokat, hemicellulázt, xilanázt, arabinázt, galaktanázt, alfa- vagy bétaglükozidázokat és hasonlókat) önmagában termelő gazdaszervezetet transzformáljuk, és a bevitt gén(ek)en kifejeződő enzim(ek) együtt jelennek meg a gazda saját génjein kifejeződőkkel.
Előre meghatározott összetételű enzimkeverékek előállíthatok egy adott gén diszrupciójával is, ami jól ismert módon, a találmány szerinti izolált gének felhasználásával hajtható végre.
Azok a gazdaszervezetek, amelyek nem képesek PG-k szintézisére, vagy olyan szervezetek lehetnek, amelyekből hiányzik a PG gén (például PG Aspergillus vagy más gombatörzsek, prokarióta vagy eukarióta szervezetek), vagy olyanok, amelyekben az endogén PG gének szuppresszált állapotban vannak (például katabolit-represszió alatt állnak és/vagy nem indukálódnak).
Poligalakturonázok előállítására a fentieken kívül mindazok a promoterek és gazdaszervezet-törzsek alkalmasak, amelyeket az expressziós szerkezetek bemutatásánál leírtunk.
Polipeptidek és készítmények
A homogén poligalakturonázok, amelyeket pektinolitikus enzimek keverékéből, előnyösen egy Aspergillus nigerrel előállított keverékből, különösen a Rapidase®-ből tisztítással nyerünk, a PG-k és PG-aktivitású származékaik, amelyeket a találmány szerinti hibrid vektorok kifejeztetésével egy gazdaszervezetben előállítunk, valamint a fentiek fiziológiailag elfogadható sói mind a találmány tárgyához tartoznak. Különösen előnyösek az A. niger PG-I, PG-II, PG-IIIA, PG-ΠΙΒ és PG-IV enzimjei tisztított formában; ezek a polipeptidek előállításuk módjától függetlenül a találmány tárgyához tartoznak.
A találmány tárgyához tartoznak továbbá az olyan enzimkészítmények is, amelyek egy vagy több homogén PG-t és/vagy PG-aktivitású származékot és/vagy ezek biológiailag elfogadható sóit tartalmazzák előre meghatározott arányban, adott esetben egy vagy több, nem PG-aktivitású enzimmel együtt.
Az említett enzimkészítményekben szóba jöhetnek azok a nem PG-aktivitású enzimek, amelyek növények sejtfalat képesek lebontani vagy módosítani. Ilyen enzi14
HU 220 337 Β mek lehetnek a pektinészterázok, pektinliázok, cellulózok, vegyes endoglükanázok, hemicellulázok, xilanázok, arabinázok, galaktanázok, alfa- és béta-glükozidázok és hasonlók.
A találmány tárgyához tartozik továbbá az említett enzimkészítmények hagyományos módon való előállítása, valamint az említett enzimkészítményeknek, az azokat alkotó homogén PG-knek és származékaiknak növényi anyagok kezelésére való felhasználása is.
A találmány szerinti homogén PG-k és/vagy PGaktivitású származékaik vagy a fenti PG-ket tartalmazó enzimkészítmények, például gyümölcs- vagy zöldséglevek derítésére, kinyerésének fokozására, olajtartalmú gyümölcsök vagy magvak sajtolás előtti feltárására, zöldség- vagy gyümölcslevek stabilizálására vagy viszkozitásának csökkentésére, biomasszák elfolyósítására, macerálásra, természetes anyagok (például festékek, illat- vagy aromaanyagok) kivonásának elősegítésére, biomasszák, élelmiszerek vagy takarmányok emészthetőségének fokozására, a fa papíripari pépesítése során a cellulózrostok kinyerésének fokozására és hasonló célokra használhatók fel. A találmány legelőnyösebb megvalósítási lehetőségeit a példákban mutatjuk be.
Az ábrák rövid leírása
1. ábra. A lambda-D és lambda-E fágok EcoRI-fragmentumának részleges restrikciós térképe. A fragmentumot egy A. niger génkönyvtárból nyertük a HR6195 és HR6196 kombinált minta-DNS-ekkel, és a PG-II gén kódolószakaszát tartalmazza. A számok a jobb oldali EcoRI-helytől számított távolságot adják meg kbp-ban.
2. ábra. A pGW1800 plazmid részleges restrikciós térképe. A plazmid a pEMBL18 vektor DNS-ét és a lambda-E fág 4,1 kbp Xbal-EcoRI inszertjét tartalmazza; az utóbbi hordozza az A. niger N400 PG-II génjét. „Ap” az ampicillinrezisztencia génje, a nyilak az A. nigerből származó DNS-t jelölik.
3. ábra. A pGW1900 vektor részleges restrikciós térképe. A plazmidot a pUC9 vektor és a PGI-lambda-7 fág 8,6 kbp BamHI-fragmentuma alkotja.
4. ábra. A pGII-IFN AMI 19 és a pGIIss-IFN AMI 19 klónozásának stratégiája.
5. ábra. A DNS-5 és DNS-6 inszertek polimeráz-láncreakcióval (PCR-módszer) történő előállításának lépései a PGII-IFN AMI 19, illetve a pGIIss-IFN AMI 19 plazmidok létrehozása során.
6. ábra. A pGW1756 plazmid részleges restrikciós térképe: a plazmid az A. niger NW756 PG-II génjét hordozza az 5,5 kbp XhoI-BglII fragmentumban, amely a pEMBL18 vektorba van illesztve. Az ábrán feltüntettük az eredeti Xhol és BglII restrikciós helyeket is, bár ezek eltűntek, amikor az inszertet a vektor Sáli és BamHI restrikciós helyeire klónoztuk.
7. ábra. A pGW 1910 plazmid részleges restrikciós térképe. A lambda-PG-C20 fág 7,8 kbp BglIIfragmentumát a pUC9 vektor BamHI restrikciós helyére illesztettük; az A. niger N400-ból származó pgaC gén hozzávetőleges helyét megjelöltük.
A következő példák a találmány bemutatását szolgálják, de nem jelentik annak korlátozását a bemutatottakra.
A példákban a következő rövidítéseket használjuk:
Amp ampicillin
bisz-Tris bisz-(2-hidroxi-etil)-imino-trisz-(hidroxi- metil)-metán
BSA marha-szérumalbumin
DTT ditio-treitol
EDTA dinátrium-etilén-diamin-tetraacetát
IPTG izopropil-P-D-galaktopiranozid
kbp kilo-bázispár=bázispárx 1000
PEG polietilénglikol
PTH fenil-tio-hidantoin
SDS natrium-dodecil-szulfát
Tét tetraciklin
TFA trifluor-ecetsav
TP fehérjék tripszines emésztésével előállított peptidek
Tris trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán
X-gal (5-bróm-4-klór)-3-indolil-P-galaktozid
Pufferek, tápközegek, reagensek
SM 100 mmol NaCl, 8,1 mmol MgSO4, 50 mmol Tris-HCl (pH=7,5), 0,01% zselatin
LB 1% triptikáz-pepton (BBL), 0,5% élesztőkivonat (BBL), 1% NaCl, 0,5 mmol TrisHCl (pH=7,5)
LM 1% triptikáz-pepton (BBL), 0,5% élesztőkivonat (BBL), 10 mmol NaCl, 10 mmol MgCl2
PBS 0,37 g NaH2PO4, 2,7 g Na2HPO4, 8,5 g NaCl 11 vízben
SSC 0,15 mól NaCl, 0,015 mól trinátrium-citrát
PSB 10 mmol Tris-HCl (pH=7,6), 10 mmol NaCl, 10 mmol MgCl2,0,05% zselatin
TE 10 mmol Tris-HCl (pH=8,0), 0,1 mmol EDTA
Minimáltápközeg: 11 tápközegben 1,5 g KH2PO4,0,5 g KC1, 0,5 g MgSO4.7H2O, 0,9 mg ZnSO4.7H2O, 0,2 mg MnCl2.4H2O, 0,06 mg CoC12.6H2O, 0,06 mg
CuSO4.5H2O, 0,29 mg CaCl2.6H20,0,2 mg FeSO4.7H2O, nitrogén- és szénforrásváltozó (megadva a szövegben) vagy 6 g NaNO3 és 10 g glükóz; pH=6,0 (NaOH-dal beállítva)
Komplett tápközeg: minimál-tápközeg, amelynek 1 literében 6 g NaNO3, 10 g glükóz, 2 g triptikáz-pepton (BBL), 1 g kazaminosav (Difco), 1 g élesztőkivonat (BBL), 0,5 g élesztő-ribonukleinsav nátriumsó (ICN), 2 ml vitaminoldat pH=6,0 (NaOH-dal beállítva)
Vitaminoldat: 10 mg tiamin, 100 mg riboflavin, 10 mg pantoténsav, 2 mg biotin, 10 mg p-aminobenzoesav, 100 mg nikotinamid, 50 mg piridoxin-HCl 100 ml vízben
HU 220 337 Β
TBE 4 ml 0,5 mol-os EDTA-oldat (pH=8,0), 10,8 g Tris, 5,5 g H3BO311 vízben
Fenol Maniatis és munkatársai [(6), 438. oldal] szerint
Mintapuffer: 10 tömeg% glicerin, 100 mmol EDTA, 0,01% brómfenolkék (pH=8,0)
RNázA Maniatis és munkatársai [(6), 451. oldal] szerint
A használt mikroorganizmusok
A. niger N400 vad típus
A. niger N402 cspA
A. niger NW756 magas szintű pektináztermelő A. niger N756 magas szintű pektináztermelő A. niger An8 az N756 uridin-auxotrof mutánsa (DSM3917)
A. niger N953 cspA, pyrA
E. coliNM539 metB, supE, hsdM + , hsdR~, supE, (P2cox3)
E. coli LE392 F~, hsdR5l4 (rk~, mk+), j«/?E44, swpF58, /flcYl vagy (?aclZY)6, galK2, gaT[22, metBl, trpR55, lambdaE. coli DH5aF’ F’, endAl, hsdRll (rk_, mk+), s«pE44, thi-1, recAl, gyrA, relAl, 80-ómegalacT,- M15, deltafZacZYA-argF)U169, lambdaE. coli JM109 ent/Al, recAl, gyrA96, thi, hsdR17 (rk\ mk+), re/Al, supE44, lambda , (lac-proAB), [F’, íraD36, proAB, /uclqZ Ml 5]
E. coliJMllO rpsL, thr, leu, thi, lacY, gaíT, ara, tonA, tsx, dam, dcm, supE44, (lacproNS), [F’, ZraD36, proAB, /aclqZ M15]
A használt vektorok pGW613
A plazmidot Goosen és munkatársai írták le (13).
M13mp fágok
Az M13mpl8 és M13mpl9 vektorok [Norrander és munkatársai (24)] az M13 egy szálú DNS-fág származékai, és DNS-ffagmentumok klónozására lettek készítve, amit egy rugalmas polilinkerszakasz tesz lehetővé. Ezekben a fágokban ugyanaz a restrikciós fragmentum mindkét lehetséges irányultságú lehet.
Az ezekbe a fágokba klónozott szekvenciák egyszerűen használhatók szekvenálási reakciók templátjául vagy egyszálú minta-DNS-ek szintetizálására standard oligo-dezoxiribonukleotid primerek és a Klenow-fragmentum használatával. A vektor-DNS az E. coli lacoperonját és a β-galaktozidáz első 145 aminosavának kódolószakaszát hordozza; a polilinkerszekvenciák - amelyek a többszörös restrikciós helyeket tartalmazzák - a ZacZ-szakaszban helyezkednek el. A polilinker megőrizte a lacZ leolvasási keretét, és így a vektor képes a ZacZa típusú gazdák allélikus kiegészítésére: az ilyen gazdák körül sikeres transzformáció esetén kék tarfoltok képződnek az IPTG és X-gal-tartalmú táptalajokon. Az olyan fágok, amelyekben az inszert tönkretette a leolvasási keretet, vagy amelyekben a /acZa peptidjének kifejeződése más módon gátolt, a szokásos színtelen tarfoltot adják a fenti táptalajokon.
PGW635
Ez a plazmid a pGW613 rövidebb változata [Goosen és munkatársai (42)]; szintén hordozza a pyrA gént. EMBL4
Az EMBL4 egy lambda-fágból készült helyettesítő vektor 9-23 kbp klónozókapacitással [Frischauf és munkatársai (9)]. A többszörös klónozóterület a lambda-karok és egy nem lényeges „töltelékterület” között van, ami lehetővé teszi változó méretű inszertek beépítését a „töltelék” rovására. A vektorban az Spi fenotípust használhatjuk a rekombinánsok közvetlen szelekciójára [Zissler és munkatársai (21)].
pEMBL18 és pEMBL19
A plazmidokat Dente és munkatársai (10, 22, 23) írták le.
1. példa
Poligalakturonázok izolálása és tulajdonságaik
1.1. példa
A poligalakturonáz-I, -II, -IIIA, -ΠΙΒ és -IV tisztítása
Az enzimek aktivitását Rozié és munkatársai (2) által leírt módon, Robyt és munkatársai (3) ferri-cianidos eljárását módosítva mértük.
Mind az öt poligalakturonázt a Rapidase®-bőlr a Gist-Brocades (Seclin, Franciaország) kereskedelemben kapható, A. nigerből készített pektinolitikus enzimkeverékéből preparáltuk. 50 g nyers, por alakú készítményt (gyártási száma K2B 078) feloldottunk 190 ml nátrium-acetát-pufferben (pH =3,6), centrifugáltuk (25 000 g, 10 perc) és Sephadex G-25 oszlopon (5 χ 90 cm) sómentesítettük ugyanazon pufferrel.
A tisztítás eiső lépése egy affinitáskromatográfiás elválasztás térhálós algináton, amit Rombouts és munkatársai (1) nyomán készítettünk el. Az alginátot - aminek ágy térfogata 5,2 ml/g - 20 mmol-os nátrium-acetát-pufferrel (pH=3,6) ekvilibráltuk egy 2,5x30 cm-es oszlopban, majd a sómentesített enzimet az oszlopra vittük, és 100 mmol-os nátrium-acetát-pufferrel (400 ml pH=4,2 és 400 ml pH=5,6) mostuk. A PG-I és -II adszorbeálódott az algináton, a másik három enzim nem.
1.1.1. példa
A PG-I és -II tisztítása
Az alginátról a két enzimet 100 mmol-os nátriumacetát-pufferben (pH=5,6) készített lineáris nátriumklorid-gradienssel (0-1 mól), Rombouts és munkatársai (1) eljárását módosítva eluáltuk. Mindkét enzim együtt, körülbelül 0,5 mól nátrium-klorid-koncentráció mellett eluálódott.
Az enzimeket tartalmazó frakciót 20 mmol-os nátrium-acetát-pufferrel (pH=5,7) szemben dializáltuk és DEAE-Sephadex A-50 oszlopra (2,5x30 cm) vittük fel ugyanazon pufferben. Az elúció lineáris nátriumklorid-gradienssel (0-0,6 mól) történt; a PG-I körülbelül 0,3, a PG-II körülbelül 0,2 mól mellett eluálódott. A két enzimet külön fogtuk fel, majd mindkét frakciót dializáltuk 20 mmol-os Tris-HCl-pufferrel (pH=5,8) szemben, és ugyanazon pufferrel ekvilibrált DEAESepharose Fást Flow oszlopon kromatografáltuk nát16
HU 220 337 Β rium-klorid-gradienssel. A PG-II körülbelül 120 mmolnál, a PG-I körülbelül 250 mmol-nál eluálódott. Az enzimeket tartalmazó frakciókat előbb 20 mmol-os nátrium-acetát-pufferrel (pH=5,6) szemben dializáltuk, majd egy kisméretű (1,6 x 10 cm) DEAE-Sephadex Fást Flow oszlopon, 1 mól nátrium-kloriddal kiegészített pufferrel 25 ml végtérfogatra koncentráltuk azokat. Az utolsó tisztítási lépés egy gélpermeációs kromatografálás volt Sephacryl S-200 oszlopon (1,6x90 cm), 0,1 mólos nátrium-acetát-pufferben (pH=4,2).
A PG-II egy sávot adott az SDS-poliakrilamid elektroforézis során; molekulatömege 38 kd, specifikus aktivitása 2760 U/mg volt 0,075 mol-os nátrium-acetát-pufferben (pH=4,2) mérve. Az izoelektromos fokuszálás mikroheterogenitást mutatott ki: az enzim főtömegének izoelektromos pontja 5,2 volt, de nagyszámú minor frakció volt látható 4,6-5,9 között.
A PG-I ugyancsak egy sávot adott az elektroforézis során; molekulatömege körülbelül 55 kd, specifikus aktivitása 550 U/mg volt a fenti körülmények között, és ez az enzim is mikroheterogenitásokat mutatott 3,2-3,5 között.
1.1.2. példa
A PG-IIIA, -IIIB és -IV tisztítása
Az alginátoszlop (1.1. példa) mosófolyadékának pH-ját 5,7-re állítottuk 1 mol-os nátrium-hidroxid-oldattal és DEAE-Sephadex A-50 oszlopra (2,5x30 cm) vittük fel, amit 0,02 mol-os nátrium-acetát-pufferrel (pH=5,7) ekvilibráltunk. Az elúciót lineáris nátriumklorid-gradienssel (0-1 mól) végeztük; a PG-IV 0,38 mol-nál, a PG-IIIA és -IIIB 0,5 mol-nál együtt oldódott le.
Mindkét enzimfrakcióból 5-5 ml-t sótalanítottunk Sephacryl S-200 oszlopon (1,6x90 cm), 100 mmol-os nátrium-acetát-pufferben (pH=4,2). Az aktív frakciókat összegyűjtöttük, desztillált vízzel ötszörösre hígítottuk, és felvittük egy MONO Q oszlopra (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország), amit 0,02 mol-os bis-Tris/HCl pufferrel (pH=5,8) ekvilibráltunk. 20 ml lineáris nátrium-klorid-gradienssel (0,1-0,4 mól) eluálva a PG-IV 0,38 mol-nál, a másik két enzim 0,4 mol-nál oldódott le az oszlopról.
A frakciókat újra kromatografáltuk a MONO Q oszlopon a fenti körülmények között, majd dializáltuk 0,025 mol-os piperazin-HCl-pufferrel (pH=6,0) szemben és MONO P oszlopra vittük fel, amit ugyanazzal a pufferrel ekvilibráltunk. Az elúciót 10%-os polipufferrel (pH=3,0, Pharmacia) végeztük 0,75 ml/perc átfolyási sebességgel.
Az utolsó tisztítási lépés egy gélpermeációs kromatografálás volt egy TSK G 3000 SW oszlopon (0,75 x 30 cm, LKB, Bromna, Svédország) 0,05 mol-os nátrium-foszfát-pufferrel (pH=6,2), 0,5 ml/perc átfolyással. Az oszlopot ismert molekulatömegű fehérjékkel (BSA=68 kd, tojásalbumin=45 kd, kimotripszinogén A=25 kd) kalibráltuk. A PG-IV molekulatömege ezen az oszlopon 53 kd-nek bizonyult, míg SDSpoliakrilamid gélelektroforézissel (15%-os gélben) meghatározva 59 kd-nek. A fent megadott körülmények között mért specifikus aktivitás 780 U/mg volt, és az enzim egyetlen éles csíkot adott a pH=3,7 izoelektromos pontnál.
A PG-IIIA és PG-IIIB jól elkülönült a kalibrált TSK G 3000 SW oszlopon, és molekulatömegük 32 és 52 kd-nek bizonyult. Ezzel szemben a 15%-os SDSpoliakrilamid gélben mindkét enzim egy sávot adott, és molekulatömegük azonosnak (57 kd) bizonyult. Specifikus aktivitásuk 150 és 250 U/mg volt, izoelektromos pontjuk egyforma, és egy éles sávot adtak pH=3,3-nál.
1.2. példa
A poligalakturonázok tulajdonságainak összehasonlítása és immunológiai rokonságuk g Rapidase®-ből kiindulva öt endopoligalakturonázt izoláltunk és tisztítottunk meg az 1.1. példa szerint. Az enzimek tulajdonságait a 2. táblázatban foglaltuk össze:
Relatív móltömcg Izoelektromos pont pH-optimum
PG-I 55 000 3,2-3,5 4,9
PG-II 38 000 4,6-5,9 4,8
PG-IIIA 57 000 3,3 4,3
PG-IIIB 57 000 3,3 4,5
PG-IV 59 000 3,7 4,8
Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel meghatározott molekulatömeg szerint négy enzim közel azonos méretű, és csak a PG-II látszik jóval kisebb fehérjének. A PG-II eltérő voltát aláhúzza a többiekénél magasabb izoelektromos pontja is, bár pH-optimuma egybeesik a többiekével.
A PG-I és PG-II ellen új-zélandi fehér nyulakban készítettünk antiszérumot Uitzetter (36) immunizációs sémája szerint. A két antiszérum és az öt enzim keresztreakcióját a következő módon vizsgáltuk: 0,4-1,0 pg tisztított fehéqét 10%-os SDS-poliakrilamid gélen megfuttattunk, majd a gélből Bowen és munkatársai (37) szerint nitrocellulóz-membránra vittük át. A nitrocellulóz-membránokat inkubáltuk az antiszérumokkal, majd peroxidázzal kapcsolt kecske-antinyúl IgG-vel hívtuk elő Uitzetter (36) szerint. A PG-I antiszérummal a PG-I és PG-IIIA, -IIIB és -IV adott erős reakciót, a PG-Π kissé gyengébbet, míg a PG-II antiszérum csak a PG-II-vel adott erős reakciót, a másik négy enzimmel alig reagált.
1.3. példa
A poligalakturonáz-II cianogén-bromid-ffagmentumainak szekvenálása
100 pg PG-II-t feloldottunk 150 pl 70%-os hangyasavban, és a fehérje metionintartalmához (4 metionin/molekula) képest százszoros moláris mennyiségű szilárd cianogén-bromidot adtunk hozzá. A reakcióelegyet 24 órán át kevertük zárt edényben, szobahőmérsékleten, majd vízzel felhígítottuk és nitrogéngáz átfúvatásával szárazra párologtattuk. Az utóbbi lépést addig ismételtük, amíg a hangyasav teljesen el nem távozott.
HU 220 337 Β
Az elegyet 15%-os SDS-poliakrilamid gélen szétválasztva körülbelül 10 jól azonosítható sávot kaptunk, amelyeket Coomassie-kékkel tettünk láthatóvá: ezek a teljesen vagy részlegesen lebomlott fehérje fragmentumai. Az intakt fehérje 38 kd-s sávja mellett a következő molekulatömegű fragmentumok sávjait találtuk: 33, 30,27,19,17,12,10, 7,5,6 és 5 kd. Mivel a 24 órás lebontás alatt az elegyből rendszeres időközönként mintákat vettünk, lehetőség volt az egyes fragmentumok egymáshoz való viszonyának meghatározására is. Eszerint, a 17 kd-s fragmentum egy belső szakasz, míg az 5 kd-s vagy az N- vagy a C-terminális lehet. A fragmentumokat végül Immobilon-P membránra rögzítettük (polivinil-difluorid-membrán, Millipore) Matsudaira és munkatársai (4) szerint; a gázfázisú szekvenálást három fragmentumon (17, 6 és 5 kd) végeztük el.
Az aminosavszekvenciát az Applied Biosystems 470A aminosavszekvenátorával vizsgáltuk, amihez a 120A PTH analizátort kapcsoltuk. A feldarabolt membránból kimosott 0,5-1,0 nmol-nyi fehérjemintákat vittük a szekvenátorba, és az eredményeket Amons (5) programjával elemeztük.
Az 5 kd-s fragmentum szekvenciája a következő:
5 10 asp-ser-X-thr-phe-thr-thr-ala-ala-ala12 13
-ala-lys (ala)-(ala)
A 3. pozícióban nem sikerült az aminosavat meghatározni, mivel azonban a program csak akkor tudja a cisz- 20 teint kimutatni, ha a fehérjét előzőleg S-piridil-etiláltuk, valószínű, hogy X jelentése cisztein lehet [Amons (5)]. A 12. és 13. pozíciókban a zárójelben feltüntetett
A 17 kd-s fragmentum szekvenciája a következő:
5 ala-phe-ser-val-gln-ala-asn-asp-ile10
- thr (ile) -phe (thr)
A 10. és 11. pozíciókban kimutatott izoleucin- és treoninnyomok biztosan az előző aminosavak inkomplett reakciójának következménye.
1.4. példa 35
A poligalakturonáz-I N-terminális fragmentumának aminosavszekvenciája
100 pg, az 1.1.1. példában leírt módon tisztított PGI-et dializáltunk desztillált vízzel szemben, majd liofilizáltuk. A fragmentálást és a szekvencia meghatározását 40 az 1.3. példában leírt módon végeztük el. Az N-terminális fragmentum szekvenciája a következő:
PG-I a 1 a - ser-1hr-cys-1hr-phe-th
PG-II asp-ser- - cys -1hr-phe-1h alaninok közül csak a 13. esetében valószínűsíthető, hogy az aminosav az alanin, míg a 12. esetében inkább az előző négy alaninból eredő zavaró jel volt látható a lizin jele mellett.
5 9 ala-ser-thr-X-thr-phe-thr-ser-ala A leirt okok miatt valószínű, hogy X jelentése cisztein. A PG-I N-terminálisának szekvenciája homológiát mutat a PG-II 5 kd-s fragmentumának szekvenciájával (1.3. példa) és az A. niger N593/pGW1800-27 transzformáns törzs által termelt PG-II N-terminális szekvenciájával (6.3. példa). A homológiát jól mutatja a két szekvencia összevetése (feltételezve, hogy X cisztein) :
- se r- a 1 a -t hr- a 1 a
A PG-II szekvenciájának megszakítását az egyeztetés kívánta meg. Az eltérés a 8. pozícióban nem lényeges: mindkét aminosav azonos jellegű, hidroxilcsoportot tartalmaz.
A két enzim N-terminális szakasza tehát homológ, de nem egyforma. A különbségek kizárják, hogy a két enzim ugyanazon gén módosult (például részlegesen emésztett) termékei lennének, tehát bizonyítottnak tekinthető, hogy a PG-I és PG-II gének egy géncsalád jól megkülönböztethető tagjai.
1.5. példa
A poligalakturonáz-I cianogén-bromid-fragmentumainak szekvenálása
100 pg PG-I-t feloldottunk 150 ml 70%-os hangyasavban, és cianogén-bromidot adtunk hozzá, hogy az
1.3. példában leírt módon elvégezzük a fragmentálást.
Az enzim molekulánként 4 metionint tartalmaz. Az elegyet 15%-os SDS-poliakrilamid gélen szétválasztva és Coomassie-kékkel megfestve az alábbi molekulatömegű fragmentumok sávjait találtuk: 39,5, 35, 21, 19,5 és 5,5 kd, amelyek közül a 21 és 5,5 kd-s fragmentu55 mok szekvenciáit határoztuk meg az 1.3. példában leírt módon.
A 21 kd-s fragmentum aminosavszekvenciája a következő:
HU 220 337 Β
5 ala-ser-thr-X-thr-phe-thr-ser-alaA 4. pozícióban minden valószínűség szerint risztéin van, így ennek a fragmentumnak a szekvenciája
Az 5,5 kd-s fragmentum aminosavszekvenciája.
5 ala-asp-gly-ala-val-ile-asp-gly-as
A fentiek alapján a PG-II 5,5 kd-s fragmentuma nem lehet az enzim N-terminális szekvenciája.
1.6. példa
Egy tripszines emésztéssel kapott peptid aminosavszekvenciájának meghatározása
A PG-II egy mintáját részlegesen denaturáltuk 0,5%-os hangyasavval szemben dializálva, majd a mintát liofilizáltuk. A kapott anyag 1 mg-ját felszuszpendáltuk 1 ml 0,2 mol-os N-etil-morfolino-acetát-pufferben (pH=8,0), majd 37 °C-on inkubáltuk ötvenszeres moláris mennyiségű tripszinnel (Sigma). 24 óra emésztés után a reakciót ecetsavval (30% végkoncentráció) leállítottuk, és a reakcióelegyet liofilizáltuk, majd visszaolI 5 thr-ile-ser-gly-ala-thr-gly-ser-va
II 14 -glu-ile-thr-tyr
2. példa
Génkönyvtár készítése Aspergillus nigerből
2.1. példa
Magas molekulatömegű DNS izolálása az A. niger N400-ból
200 ml minimál-tápfolyadékot oltottunk az A. niger N400 konidiospóráival (106 spóra/ml), és 24 órán át ráztuk (300 fordulat/perc) 1 literes Erlenmeyer-lombikban, 28 °C hőmérsékleten. A micéliumot Büchner-tölcséren, Myracloth-szűrővásznon nyertük ki, steril fiziológiás sóoldattal mostuk, folyékony nitrogénben megfagyasztottuk, és vagy azonnal felhasználtuk, vagy -60 °C-on tároltuk. A génkönyvtár készítéséhez a DNS preparálását lényegében Yelton és munkatársai (18) nyomán végeztük.
g micéliumot elhomogenizáltunk 1 g-os adagokban, folyékony nitrogénben, Braun-mikrohomogenizátorban. A homogenizált micéliumot ezután egy 1 literes Erlenmeyer-lombikba, 200 ml extrakciós puffer (50 mmol EDTA, 0,2% SDS, pH=8,5) és 200 μΐ dietilpirokarbonát keverékébe tettük, majd 20 perc alatt felmelegítettük szobahőmérsékletről 68 °C-ra. Lehűtés után centrifugáltuk (12 000 g, 15 perc), a felülúszóhoz 1/16 térfogatnyi 8 mol-os kálium-acetát-oldatot (pH=4,2) adtunk, és a keveréket jégre tettük 1 órára. A csapadékot kicentrifugáltuk (16 000 g, 20 perc, 4 °C), majd a felülúszót 0,6 térfogatnyi izopropanollal összekeverve, 15 percig jégen inkubáltuk. A kivált nukleinsavakat centrifugálással összegyűjtöttük (6000 g, 10 perc, 4 °C), 70%-os etanollal mostuk és megszárítottuk, majd
-glu megegyezik a PG-I N-terminális szekvenciájával (1.4. példa).
y - s e r dottuk 0,1% trifluor-ecetsavban, ami 2,5 mmol ditiotreitolt is tartalmazott. Az oldatból 100 μΐ-t vittünk nagynyomású folyadékkromatográfba (Spectra Physics SP 8000), ahol egy Nucleosil C-18 (4,6 x 150 mm, Supelco) és egy Vydac A oszlopon, 25 °C kolonnahőmérsékleten, 2 ml/perc átfolyása sebességgel végeztük az elválasztást. Az elúció lineáris gradienssel történt, amely 50 perc alatt 100% A oldószerről (0,1% TFA vízben) az A és a B oldószer (0,1% TFA acetonitrilben) 1:1 arányú keverékéig változott. A peptidek egyike élesen elkülönült a többitől körülbelül 21% acetonitrilnél: ezt száraz levegővel megszárítottuk és szekvenáltuk.
Az 1.4. példa szerint végrehajtott analízis eredménye a következő:
e r 10 ml, 20 pg/ml RNázt (Boehringer, Mannheim, Németország) is tartalmazó TE-pufferben felszuszpendáltuk, és 15 percig inkubáltuk 37 °C-on. A DNS-t ezután egy órán át kezeltük 1 mg/ml nukleázmentes pronázzal (Kochlight) 37 °C-on; a 20 mg/ml-es pronáz törzsoldatot (TE-pufferben) egy órán át előinkubáltuk 37 °C hőmérsékleten a nukleázok elemésztése céljából.
A kapott DNS-oldat 9 ml-ében feloldottunk 8,5 g cézium-kloridot, hozzáadtunk 0,2 ml 10 mg/ml-es etidium-bromid-oldatot, majd vagy Beckman SW41 rotorral (33 000 fordulat/perc, 60 óra), vagy Beckman 50 Ti rotorral (45 000 fordulat/perc, 40 óra) centrifugáltuk. A DNS-sávokat izoláltuk, az etidium-bromidot telített nátrium-klorid-oldattal ekvilibrált izopropanollal kiráztuk, majd öt térfogatnyi TE-puffert adtunk az oldathoz, és sorrendben TE-pufferrel telített fenollal, fenol : kloroform: izoamil-alkohol=25:24:1 eleggyel és kloroform :izoamil-alkohol=24:1 eleggyel kezeltük. Az így előkészített oldatból a DNS-t 0,1 térfogatnyi, 3 molos nátrium-acetát-oldat (pH=5,2) és 2,5 térfogatnyi etanol hozzáadásával és -20 °C hőmérsékleten 12 órás inkubációval csaptuk ki. A csapadékot centrifugálással (30 000 g, 1 óra, 4 °C) kinyertük, 70% etanollal mostuk, megszorítottuk, és 400 ml TE-pufferben visszaoldottuk.
2.2. példa
Az A. niger N400 DNS-ének részleges emésztése Mbol endonukleázzal és a fragmentumok izolálása
Annak meghatározására, hogy milyen Mbol-koncentrációval kaphatjuk a legtöbb 13,6-23 kbp molekula19
HU 220 337 Β tömegű DNS-fragmentumot, a 2.1. példa szerint tisztított DNS 1-1 pg-ját csökkenő mennyiségű (0,5-0,001 U) Mbol-gyel emésztettük 10 μΐ térfogatokban, 37 °C-on, órán át. A reakciókat 1 μΐ 0,25 mol-os EDTA-val állítottuk le, és a mintákat 1 pg/ml etidium-bromidot tartalmazó TBE-pufferrel ekvilibrált, 0,6%-os agarózgélre vittük. Molekulaméret-jelzőnek a szokásos, BglII-vel emésztett lambda-DNS-keveréket használtuk, amely 49, 22,8, 13,6, 9,8 és 2,3 kbp méretű savókat és egy 0,45 kbp-s láthatatlan sávot ad. A kívánt méretű DNSfragmentumok maximális mennyiségét 0,02 U Mbol/pg DNS aránynál kaptuk.
Az előkísérlet alapján 200 pg DNS-t emésztettünk ml térfogatban, amit húsz részre osztottunk az enzim hozzáadása után. 1 órás, 37 °C-on végzett emésztés után az elegyeket jégre tettük, majd egy mintaelektroforézissel történt vizsgálata után 25 mmol végkoncentrációnyi EDTA-t adtunk hozzájuk, és a reakciót az enzim hőinaktiválásával (65 °C, 10 perc) megállítottuk. A mintákat egyesítettük, a DNS-t kicsaptuk, mostuk, megszárítottuk és visszaoldottuk 400 ml TE-pufferben. A fragmentált DNS-t 0,4%-os preparatív agarózgélen elválasztottuk (3 V/cm, 4 °C), a kívánt frakciókat tartalmazó területeket kivágtuk, és steril dialíziscsőbe téve 2 ml TBE-pufferrel szemben elektrodializáltuk 300 V feszültséggel. 2-3 óra múlva az áram irányát 30 mp-re megfordítottuk, majd a DNS-t tartalmazó puffért összegyűjtöttük, a fragmentumokat etanollal kicsaptuk, és visszaoldottuk 100 pl TE-pufferben.
2.3. példa
A vektor-DNS előkészítése és a magas molekulatömegű DNS-fragmentumok klónozása az EMBL4 vektorba
Az A. niger N400 génkönyvtárat az EMBL4 lambda-vektorban hoztuk létre. Ezt a vektort - amelynek klónozókapacitása 9-23 kbp - Frischauf és munkatársai (9), valamint Kam és munkatársai (19) írták le, és a Promega Biotech. Inc. forgalmazza. A kettős inszertek keletkezésének kizárására a klónozandó DNS-fragmentumok méretének alsó határát 13,6 kbp-ben határoztuk meg.
pg EMBL4 DNS-t emésztettünk 50 U BamHIgyel a forgalmazó által előírt pufferben (100 pl, 37 °C, 2 óra), majd az enzimet hővel inaktiváltuk (65 °C, 10 perc). Az oldat nátrium-klorid-koncentrációját 150 mmol-ra emeltük és 50 U SalI-gyel folytattuk az emésztést (37 °C, 2 óra), ezután 25 mmol EDTA-t adtunk hozzá és újra hőinaktiváltuk. Extrakció után (a már ismertetett fenol/TE, fenol/kloroform/izoamil-alkohol és kloroform/izoamil-alkohol elegyekkel) a DNS-t 0,1 térfogat, 3 mol-os nátrium-acetát-oldat (pH=5,2) és 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával kicsaptuk, amivel megszabadulunk a kisméretű BamHI-Sall polilinker fragmentumoktól is. Az oldatot 15 percig hidegen állni hagytuk, utána lecentrifugáltuk (15 perc, 12 000 g, 4 °C), a csapadékot alaposan mostuk 70%-os etanollal, megszárítottuk, és feloldottuk 40 ml TE-pufferben.
2.4. példa
Az A. niger N400 DNS-fragmentumainak ligálása
Elengedhetetlen, hogy a 2.3. példa szerint előkészített vektor cos területét a ligálás megkezdése előtt hőkezeljük. Ennek érdekében a vektort 10 mmol magnézium-kloridot tartalmazó 100 mmol-os Tris-HCl-pufferben (pH=7,5) 10 percig 65 °C-on, majd 1 órán át 42 °C-on tartottuk. Az előkísérletekben a vektor: fragmentum tömegarányt körülbelül 1:1-nek találtuk a legtöbb rekombináns esetében. A ligálást 100 pl össztérfogatú, 50 mmol-os Tris-HCl-pufferben (pH=7,5), 10 mmol MgCl2,10 mmol DTT és 1 mmol ATP jelenlétében, 9,5 pg vektor-DNS-sel és 10 pg DNS-fragmentummal végeztük. Az oldathoz 0,5 U/mg DNS ligázt (BRL) adtunk, és a keveréket 14 °C-on inkubáltuk egy éjszakán át. Kontrollként 0,5 pg vektor-DNS-t inkubáltunk a fragmentumok nélkül.
A nagy térfogatú ligációs keveréket etanolos kicsapással és 20 pl TE-pufferben való visszaoldással koncentráltuk az in vitro csomagolás - a DNS-nek a fág burkolófehérjéivel történő bevonása - előtt. Az in vitro csomagolást a Packagene (Promega Inc.) segítségével, a gyártó utasítása szerint végeztük, 10 pl-t használva 1 pg DNS-hez. Kontrollként 1 mg, magas molekulatömegű fág-DNS-t (cI857 Sam 7) használtunk (a Packagene tartozéka), amit külön csomagoltunk. A csomagolás után minden mintához 500 pl fágoldó puffért (PSB) és 5 pl kloroformot adtunk, majd 4 °C-on tároltuk a felhasználásig. A génkönyvtárt két, egymástól független ligációs kísérlettel hoztuk létre.
2.5. példa
Az A. niger N400 génkönyvtár titrálása és sokszorozása
Az E. coli NM539 törzsét LB tápfolyadékban tenyésztettük (0,2% maltóz, 10 mmol MgSO4, 1 mmol CaCl2) az 1,0 extinkciónak megfelelő sűrűségig, majd a tenyészet 0,2 ml-éhez 0,1 ml, megfelelően hígított fágmintát adtunk. Az adszorpció (37 °C, 20 perc) után a mintát 3 ml, 0,6% agart tartalmazó, 45 °C hőmérsékletű LB fedőtáptalajhoz kevertük, amit LB táptalajból öntött lemezek felszínére szélesztettünk. 16 órás inkubáció (37 °C) után a tarfoltképző egységek (pfú) száma 12 -105 és 4,2 105 volt a két, 2.4. példa szerint előállított fágkészítmény 1 ml-ére vonatkoztatva. A háttér (17% és 40%; a fragmentumok nélkül végzett kísérletből számolva) levonása után a keletkezett rekombinánsok abszolút számát 6 106-nek találtuk; az általuk tartalmazott DNS mennyisége több mint 200 A. niger genomnak felel meg.
A génkönyvtár sokszorozása érdekében 80-80 ml fágmintákkal fertőztünk E. coli NM539 sejteket, amelyeket agarózt tartalmazó LB fedőtáptalajban szélesztettünk LB lemezekre. 16 órás inkubáció után a fágokat 55 ml PSB-vel óvatosan kimostuk a lemezekből, majd a mosófolyadékokat egyesítve centrifugáltuk (6000 g, 10 perc), és a felülúszóhoz 0,5% kloroformot adtunk. A két párhuzamos készítményt egyesítettük (40 ml), titráltuk (8 · 109 pfú/ml), és 4 °C-on tároltuk.
3. példa
A poligalakturonázokkal kapcsolatos nukleinsavak kiválasztása az A. niger génkönyvtárból
HU 220 337 Β
3.1. példa
A PG-II 17 kd-s fragmentumát kódoló oligonukleotidkeverék szintézise
A 2. példa szerint létrehozott génkönyvtárban végzendő kereséshez szükséges oligonukleotidokat Caruthers (8) módszerével, az Applied Biosystem 380 B nukleotidszintetizerével állítottuk elő. A 17 kd-s peptid - mint azt az 1.2. példában leírtuk - a fehétjemolekula belsejében helyezkedik el, ezért az 1.4. példában bemutatott szekvenciát az N-terminális végén egy metionin- 10 nal egészítettük ki.
A szintetizált oligonukleotidok bonyolult keveréket alkotnak, amelyben mindenféle degenerált kód is nagy számban fordul elő, ezért technikai okokból szükséges a keverék alkotóinak számát csökkenteni. Különféle 5 módosításokkal elértük, hogy a kétféle keverék egyenként csak 16 különböző oligonukleotidot tartalmazott [Ohtsuka és munkatársai (16)]. A két keverék összetétele a következő:
me t a 1 a phe ser va 1 gin
HR 6195 5’ (d) ATG GCI TTRj TCI GTI car2
HR 6196 5 ’ (d) ATG GCI TTRj ÁGI GTI car2
a 1 a a sn asp i 1 e
HR 6195 GCI AAR, GAR, AT 3’
HR 6196 GCI AAR, GAR, AT 3’
ahol I jelentése inozin. Rq jelentése T vagy C, R2 jelentése pedig A vagy G.
3.2. példa
A PG-I 5,5 kd-s fragmentumát kódoló oligonukleotidkeverék szintézise
Az 5,5 kd-s peptid (1.5. példa) a fehérjemolekula belsejében helyezkedik el, ezért az ott bemutatott szék- 25
me t a 1 a asp gly
HR 6298 5’ (d) ATG GCI GAR! GGI
i 1 e asp gly asp
atr2 GARj GGI GAR
ahol a I, R, és R2 jelentése megegyezik a fent megadottakkal.
3.3. példa
Az oligonukleotidok radioaktív jelölése
A három oligonukleotidkeverékből liofílizálás után 35 pmol-os vizes oldatokat készítettünk, majd az ezekből vett mintákat tízszeresre hígítottuk és összekevertük. A reakcióelegy így 20 pmol HR6195, 20 pmol HR6196 és 40 pmol HR6298 nukleotidkeveréket, pmol 32P-ATP-1 (6000 Ci/mmol), 30 U T4 poli- 40 nukleotidkinázt tartalmazott 50 μΐ kinázpufferben [50 mmol Tris-HCl (pH-7,6), 10 mmol MgCl2, 5 mmol DTT, 0,1 mmol EDTA, 0,1 mmol spermidin; Maniatis és munkatársai (6), 122. oldal]. Az inkubáció 37 °C-on percig tartott; a reakciót 4 μΐ 0,5 mol-os EDTA 45 (pH=8,0) hozzáadásával állítottuk le. A reakcióelegyet tisztítás nélkül használtuk tovább a génkönyvtár vizsgálatához (3.4. példa) vagy a Southem-blot vizsgálatokhoz (3.6.).
3.4. példa
Az A. niger N400 génkönyvtár vizsgálata
A 2. példa szerint létrehozott génkönyvtár egy részét SM-pufferrel felhígítottuk, és 0,1 ml-es adagokban (körülbelül 2000 pfu) kiosztottuk. Az E. coli NM539 55 gazdasejteket 0,2% maltózt tartalmazó LB táptalajban tenyésztettük, a friss tenyészetből 0,2 ml-t adtunk a fágszuszpenziókhoz, és a keverékeket fél órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ezután a keverékeket 3 ml, 0,7% agarózt tartalmazó, 47 °C-os LM táptalajhoz ke- 60 venciát az N-terminális végén egy metioninnal egészítettük ki. A keletkező oligonukleotidok számát az inozinnak mint indifferens bázisnak öt helyre történt bevezetésével 24-re korlátoztuk, így az oligonukleotidkeverék összetétele a következő:
a 1 a va1
GCI GTI gly
GG 3’ vertük, és azonnal LM agarlemezekre szélesztettük, amiket 16 órán át inkubáltunk 37 °C-on, majd 2 órán át hűtöttünk 4 °C-on.
Minden lemezről két replikát (,,másolat”-ot) készítettünk Benton és Davis (7) tarfolt-hibridizációs módszere szerint. Az első szűrőt (Schleícher és Schüll BA85) egy percre, a másodikat két percre tettük a lemezre, és helyzetüket tussal bejelöltük. A szűrőket ezután 100 ml denaturáló oldatot (1 mól NaCl, 0,5 mól NaOH) tartalmazó tálba merítettük fél percre, majd 100 ml közömbösítő oldatban [0,5 mól Tris-HCl (pH=7,5), 1,5 mól NaCl] öblítettük egy percig, utána 3 χ SSC oldatban finoman lemostuk róla a baktériumok maradványait, végül leitattuk, 10 percig szárítottuk szobahőmérsékleten, és Whatman 3 MM szűrőpapíron besütöttük (80 °C, 2 óra).
A besütött szűrőket 3xSSC oldatban áztattuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd 250 ml előmelegített (65 °C) prehibridizációs keverékbe tettük, amely 2xSSC volt, ha a HR6195 és HR6196 oligonukleotidkeverékeket és 1 χ SSC volt, ha a HR6298 keveréket használtuk. A prehibridizációs keverékben ezenkívül 0,2% BSA, 0,2% Ficoll 400, 0,2% poli(vinil-pirrolidon), 0,1% SDS és 0,1% frissen denaturált heringsperma-DNS is volt. A prehibridizációt 5 órán át folytattuk rázott vízfürdőn, 65 °C hőmérsékleten, majd a szűrőket fél órán át mostuk 250 ml, 65 °C-os hibridizációs keverékben, ami csak annyiban különbözött a
HU 220 337 Β prehibridizációs keveréktől, hogy nem volt benne heringsperma-DNS. A félórás mosás után a szűrőket egyenként 150 ml hibridizációs keverékbe tettük, amihez frissen adtuk hozzá a jelölt oligonukleotidkeverékeket.
A HR6195 és HR6196 keverékekkel végzett hibridizáció esetében a csészéket 65 °C-os, rázott vízfürdőbe tettük, a termosztátot 47 °C-ra állítottuk be, és 14 órán át inkubáltuk. Ezután a szűrőket fél órán át mostuk 250 ml, 47 °C-os hibridizációs keverékben, majd kétszer 250 ml, szoba-hőmérsékletű 2xSSC oldatban, egyenként 45 percen át. Ezt követte egy erélyes mosás 250 ml, 63 °C-os 6xSSC oldatban, ami 0,05% nátrium-pirofoszfátot is tartalmazott (30 perc, rázott vízfürdő), majd a szűrőket kétszer 30 percen át mostuk x SSC oldatban, szobahőmérsékleten. Levegőn történt megszárítás után a szűrőket Whatman 3 MM papírra tettük, műanyag fóliába burkoltuk, és intenzitásfokozó szűrő közbeiktatásával Kodak XAR5 filmet exponáltunk velük -60 °C-on, három napon át.
A hat vizsgált szűrőn összesen hat pozitív jelet találtunk; az ezeknek megfelelő tarfoltokat steril Pasteurpipettával emeltük ki az eredeti agarlemezekből. Az agardarabkákat 1 ml SM-pufferbe tettük, 2,5 μΐ kloroformot adtunk hozzá, majd szobahőmérsékleten 1 órán át, utána 4 °C-on 16 órán át állni hagytuk, hogy a fágok kidiffundálhassanak az agárból. Az extrakció végén az agart és a baktériumsejtek törmelékeit centrifugálással eltávolítottak, 2,5 μΐ kloroformot adtunk az oldatokhoz, majd 4 °C hőmérsékleten tároltuk azokat.
Az így izolált pozitív kiónokat lambda-C, -G és -I kiónoknak neveztük, és még kétszer végrehajtottuk velük a teljes fenti eljárást annak érdekében, hogy minél tisztább és a korábbihoz képest kisebb sűrűségű kiónokat kapjunk.
A HR6298 oligonukleotidkeverékek esetében a csészéket 65 °C-os, rázott vízfürdőbe tettük, a termosztátot 52 °C-ra állítottuk be, és 14 órán át inkubáltuk. Ezután a szűrőket fél órán át mostuk 250 ml, 52 °C-os hibridizációs keverékben, majd kétszer 250 ml, szoba-hőmérsékletű 2 x SSC oldatban, egyenként 45 percen át. Ezt követte egy erélyes mosás 250 ml, 64 °C-os 4 x SSC oldatban, ami 0,05% nátrium-pirofoszfátot is tartalmazott (30 perc, rázott vízfürdő), majd a szűrőket kétszer 30 percen át mostuk 2 x SSC oldatban, szobahőmérsékleten. Levegőn történt megszárítás után a szűrőket Whatman
MM papírra tettük, műanyag fóliába burkoltuk, és intenzitásfokozó szűrő közbeiktatásával Kodak XAR5 filmet exponáltunk velük -60 °C-on, három napon át.
A hat szűrőn összesen kilenc pozitív jelet találtunk; az ezeknek megfelelő tarfoltokat steril Pasteur-pipettával emeltük ki az eredeti agarlemezekből. Az agardarabkákat 1 ml SM-pufferbe tettük, 2,5 μΐ kloroformot adtunk hozzá, majd szobahőmérsékleten 1 órán át, utána 4 °C-on 16 órán át állni hagytuk. Az extrakció végén az agart és a baktériumsejtek törmelékeit centrifugálással eltávolítottak, 2,5 μΐ kloroformot adtunk az oldatokhoz, és 4 °C hőmérsékleten tároltuk azokat.
Az így izolált pozitív kiónokat PG-I-lambda 1-9 kiónoknak neveztük, és még egyszer végrehajtottuk velük a hibridizációs eljárást egy heterológ minta-DNSsel, a pGW1803 plazmid 1,2 kbp BamHI/EcoRI fragmentumával.
3.5. példa
A lambda-DNS izolálása
Ahhoz, hogy a rekombináns klónokból DNS-t izolálhassunk, először sokszorozni kellett a fágokat. A sokszorozási E. coli LE392 sejtekben végeztük a 2.5. példában leírt módon; a kapott fágszuszpenziókat 4 °C-on tároltuk.
A fág-DNS izolálásához kiinduló anyagként olyan lemezeket választottunk, amelyen a tarfoltok összefolytak. Ezeket úgy állítottuk elő, hogy a fágszuszpenziók 10-10 μΐ-ével fertőztünk E. coli LE392 gazdasejteket, a lemezekről 16 órás inkubáció (37 °C) után lekapartuk a felső réteget, és 20 ml SM-pufferben, 0,4 ml kloroform jelenlétében ráztuk 30 percen át 37 °C hőmérsékleten. Ezután a sejttörmeléket és az agarózt kicentrifügáltuk, és a felülúszó térfogatát 18 ml-re egészítettük ki, majd azonos térfogatú, 2 mól nátrium-kloridot és 20% PEG 6000-t (BDH) tartalmazó SM-puffert adtunk hozzá. A fágokat 75 perc múlva centrifugálással (12 000 g, 20 perc, 4 °C) összegyűjtöttük, 3 ml SM-pufferben felszuszpendáltuk, és 3 ml kloroformmal extraháltak, majd a vizes fázist RNáz A-val (67 pg/ml) és DNaz Ivel (33 pg/ml) kezeltük 37 °C-on 20 percen át. Ezután a keverékeket előbb 2 ml fenollal, majd 1 ml kloroformmal összekevertük, a fázisokat centrifugálással elválasztottuk, a vizes fázist pedig még kétszer extraháltak 3 ml fenol:kloroform =1:1 eleggyel, illetve 3 ml kloroformmal. A vizes fázisból a DNS-t 0,3 ml, 3 mol-os nátrium-acetát-puffer (pH=5,2) és 6 ml etanol adagonkénti hozzáadásával csaptuk ki: az oldatot 16 órán át állni hagytuk 4 °C-on, majd a DNS-t centrifugálással (12 000 g, 10 perc, 4 °C) nyertük ki. A nyersüledéket 0,4 ml TE-pufferben feloldottuk, 200 pg/ml RNáz A-t adtunk hozzá, és 37 °C-on inkubáltuk 1 órán át. Az újabb kicsapást 38 μΐ nátrium-acetát-pufferrel és 0,8 ml etanollal végeztük 4 °C-on, 1 órán át, majd a centrifugált DNS-t 100 μΐ TE-pufferben oldottuk fel.
3.6. példa
Az A. niger N400 PG-II és PG-I lambda-klónjainak restrikciós analízise
A PG-II génszekvenciákat hordozó lambda-D és -E fágokat választottuk ki a további analízisre, amelynek során először meggyőződtünk arról, hogy mindkét fág az A. niger genomjának ugyanazon területéről származó inszertet hordoz, majd elkészítettük a lambda-E részleges restrikciós térképét.
pg fág-DNS-t emésztettünk 20 egység EcoRI vagy BamHI-nukleázokkal vagy a kettő keverékével 100 μΐ pufferben, 0,8 mg/ml RNáz A jelenlétében, 37 °C hőmérsékleten, 3 órán át. Ezután 10 μΐ 3 mol-os nátrium-acetát-puffert (pH=5,2) adtunk az oldathoz, és 80 μΐ kloroformmal extraháltak, majd a DNS-t a vizes fázisból 250 μΐ etanollal kicsaptuk, és jégre tettük 1 órára. A DNS-t centrifugálással összegyűjtöttük, 25 μΐ 1 xmintapufferben feloldottuk, és 10 percre 65 °C-ra
HU 220 337 Β melegítettük, majd 0,7%-os agarózgélben megfuttattuk 1 pg HindlII-mal emésztett lambda-DNS (BRL) mint molekulaméret-jelző - jelenlétében. A gélt UVfénnyel átvilágítva Polaroid 667 filmre lefényképeztük, majd a DNS-t átvittük SS BA85 nitro-cellulóz-membránra Southern (1975) módszerével, Maniatis és munkatársai [(6), 382-386. oldal] leírása nyomán. Ezután a membránt besütöttük, és a 3.3. példában leírt módon hibridizáltuk a HR6195 és HR6196 oligonukleotid-minták keverékével.
Az egyes fragmentumok hosszát az UV-fényképek és az autoradiogramok alapján, az ismert méretű markerekhez hasonlítva állapítottuk meg. Az 5 kbp-nél kisebb fragmentumokat a 3. táblázatban mutattuk be; az ennél nagyobbakat a használt elektroforézis-rendszerrel nem lehetett megkülönböztetni egymástól. Az EcoRI-gyel emésztett DNS-ben látható kevés és halvány sáv arra utal, hogy ez az enzim nem emészti teljesen a DNS-t. Ugyanakkor a két enzimmel együtt emésztett DNS-ben olyan sávok is láthatók, amelyek az egyes enzimekkel emésztett mintákban nem jelennek meg, így ez a minta tekinthető teljesen emésztettnek.
A lambda-E DNS-ből a következő fragmentumok hibridizálódtak a HR6195 és HR6196 oligonukleotidkeverékekkel: egy 10 kbp-nél hosszabb BamHI-fragmentum, egy 7,4 kbp EcoRI-ffagmentum, egy 10 kbpnél hosszabb EcoRI-ffagmentum és egy 2,8 kbp és egy 10 kbp-nél hosszabb BamHI/EcoRI-fragmentum. A lambda-E DNS-ből pedig a következő fragmentumok hibridizálódtak ugyanezen oligonukleotidkeverékekkel: egy 10 kbp-nél hosszabb BamHI-ffagmentum, egy 5,8 kbp EcoRI-ffagmentum, egy 10 kbp-nél hosszabb EcoRI-ffagmentum és egy 1,2 kbp és egy 10 kbp-nél hosszabb BamHI/EcoRI-fragmentum. A nagyobb fragmentumokkal való hibridizációt - mivel a nagyobb fragmentumok csak részlegesen emésztettnek tekinthetők - figyelmen kívül hagytuk. Az emésztéssel kapott lambda-D és -E fragmentumok között hibridizációt nem figyeltünk meg.
A fent felsorolt különbségek alapján megállapítható, hogy a két fág nem egyforma. Ennek ellenére a 3. táblázatban két EcoRI-, három BamHI- és legalább négy BamHI/EcoRI-fragmentum van, amelyek mérete mindkét fág esetében azonos. Ezek a fragmentumok bizonyosan az inszertekből származnak, mert a vektorban ilyen restrikciós helyek nincsenek, kivéve az inszertet fogadó BamHI-helyet és az utóbbi BamHIhelyet, s így szintén az inszertet beillesztő EcoRI-helyet [Frischauf és munkatársai (9)]. Az utóbbi tények arra utalnak, hogy a kétféle fág inszertjei az A. niger genomjának ugyanazon területéről származnak. A fenti adatokat összevetve azzal, hogy a két fág legfontosabb BamHI/EcoRI-fragmentumainak hossza különbözik (1,2, illetve 2,8 kbp), és feltéve, hogy a különbség oka nem technikai hiba, arra kell következtetnünk, hogy az
1,2 kbp BamHI/EcoRI-fragmentum EcoRI-helye nem az A. niger genomból ered, hanem az inszertet a vektorba rögzítő EcoRI-helyek egyike. Ebből az is következik, hogy a lambda-D inszertje az egyik irányban mintegy 1200 bp-vel hosszabb a hibridizálódó szekvenciánál, valamint az is, hogy a lambda-E hibridizálódó szekvenciája a 2,8 kbp BamHI/EcoRI-fragmentum BamHI-helyétől számított 1200 bázispáron belül helyezkedik el.
3. táblázat
EcoR I BamHI EcoRI+BamHI
D E D E D E
4,4 4,4
3,8 3,8
3,5 (P)
3,2 (P) 2,8
2,4 2,4 2,4 2,4
2,2 2,2 2,2 2,2
1,6 1,6 1,6 1,6
1,5 1,5
1,2,
0,98 0,84 0,84
0,72 0,72
0,68 0,68,
0,62 0,62 0,62 0,62
(P) az alig hibridizálódó fragmentumokat jelzi
A részleges restrikciós térkép megszerkesztése érdekében a lambda-E DNS-t EcoRI-, Xbal-, HindlIInukleázokkal, illetve ezek minden lehetséges kombinációjával emésztettük. Ezt két lépésben végeztük el. Először 6 pg DNS-t inkubáltunk 37 °C-on 105 percig 200 pl pufferben, 2 mg/ml RNáz és 200 U EcoRI jelenlétében vagy az utóbbi hiányában, majd az emésztett DNS-t a már leírt módon extraháltuk, kicsaptuk és visszaoldottuk. Az így kapott, részlegesen emésztett DNS-t emésztettük tovább a másik két nukleázzal és keverékükkel, majd a mintákat a már szintén leírt módon analizáltuk.
Az autoradiogramon csak egyetlen, 10 kbp-nél hosszabb hibridizálódó sáv volt látható a Hindin, Xbal vagy keverékük emésztetében. Ugyanezen sáv csökkent intenzitással ugyan, de látható volt a többi mintában is, ami azt jelzi, hogy ezek az enzimek csak részlegesen bontották el a DNS-t. Az EcoRI-gyel emésztett mintában a második és legerősebben hibridizálódó sáv egy 7,4 kbp fragmentum, ami a nem teljes mértékű emésztést bizonyítva jelen van csökkent intenzitással az EcoRI és egy másik enzim keverékében is. A fentiek mellett volt még egy 3,6 kbp hibridizálódó fragmentum az EcoRI/HindlII kettős és az EcoRI/HindlII/Xbal hármas mintában, valamint egy 4,1 kbp fragmentum az EcoRI/Xbal mintában. Mivel az utóbbi a hármas mintában is megjelent, de igen kis intenzitással, részleges bontásterméknek kell tartanunk.
Mindebből arra következtethetünk, hogy a 7,4 kbp EcoRI-ffagmentum mindhárom restrikciós enzimmel hasítható, és a restrikciós helyeknek ott kell lenniük,
HU 220 337 B ahol azokat az 1. ábrán feltüntettük. Mivel az ábrán csak részleges restrikciós térképet láthatunk, amelyen csak a hibridizálódó szekvenciához közeli hasítási helyeket tüntettük fel, nem kizárt, hogy a fragmentum még máshol is tartalmaz ilyeneket.
A lambda-D fágon nem végeztünk Xbal- és HindlIIemésztést, de feltételezzük, hogy e két enzim restrikciós helyei ugyanott vannak benne, mint a lambda-E fágban.
A PG-I gén szekvenciáját hordozó kilenc klón közül négyet (PG-I lambda-4, -5, -6 és -7) választottunk ki további vizsgálatra. Először meggyőződtünk arról, hogy a fágok az A. niger genomjának azonos szakaszait tartalmazzák, majd elkészítettük a lambda-5 részleges restrikciós térképét a korábban leírtakkal azonos technikával, de minta-DNS-ként a PG-II 1,2 kbp BamHI/EcoRI-fragmentumát használtuk. Ez a minta a PG-II promoterének egy kis részét (200 bp) és a kódolószekvencia egy nagyobb darabját tartalmazta. A hibridizációs kísérletekben ez a minta igen erős hibridizációt mutatott mind a négy, a PG-I szekvenciát hordozó fággal. A hibridizálódó fragmentumok és hozzávetőleges méretük a 4. táblázatban láthatók.
4. táblázat
Restrikciós enzim lamb- da-4 lamb- da-5 lamb- da-6 lamb- da-7
BamHI 8,6 8,6 >23 8,6
EcoRI 6,4 6,4 6,4 6,4
EcoRI+BamHI 6,4 6,4 6,4 6,4
Xhol >23 >23 >23 >23
Xhol+EcoRI 2,0 2,0 2,0 2,0
BamHI+BglII 7,5 7,5 >23 7,5
A 4. táblázatból világosan látható, hogy mind a négy fág hordozza a 6,4 kbp EcoRI- és a 2,0 kbp XhoI/EcoRIfragmentumot; az előbbi az EcoRI/BamHI kevert emésztéskor is megjelent. A lambda-4, -5 és -7 fágokból azonos fragmentumok keletkeztek a BamHI (8,6 kbp) és a BamHI/BglII (7,5 kbp) emésztés során. Mivel a vektor - az említett kivétellel - nem tartalmaz BamHI-helyet, a három fág inszertjei bizonyosan az A. niger genomból származtak.
A részleges restrikciós térkép elkészítése érdekében a lambda-5 fágot további restrikciós enzimekkel (KpnI, Smal, SstI, Sáli) és keverékeikkel is emésztettük; a hibridizálódó fragmentumokat az 5. táblázatban mutatjuk be.
5. táblázat
Enzim kbp Enzim kbp
BamHI 8,6
BglII 9,7 BamHI+BglII 7,5
KpnI 5,1; 2,7 BamHI+XhoI 4,2
EcoRI 6,4 BglII+Xhol 3,0
Smal 4,7 BamHI+KpnI 4,8; 2,8
Enzim kbp Enzim kbp
SstI 9,9 BamHI+SstI 8,3
Sáli 8,9 BamHI+Sall 8,5
A restrikciós térkép szerint, amit a fenti adatokból állítottunk össze, a poligalakturonáz-1 gén kódolószakasza a 8,6 kbp BamHI-fragmentumban van.
3.7. példa
A pGW1800 és pGW1803 plazmidok elkészítése
A lambda-D és -E fágok megfelelő EcoRI-Xbal fragmentumait pEMBL vektorokba [Dente és Cortese (10)] klónozva kaptuk a pGW1803 és pGW1800 plazmidokat.
Az 1. ábrából és a 3.5. példából látható, hogy a lambda-D fágnak egy olyan 2,5 kbp EcoRI-Xbal fragmentumot kell tartalmaznia, amely azonos a lambda-E fág 4,1 kbp EcoRI-Xbal fragmentumának egy részével. 6 pg lambda-D DNS-t emésztettünk 60 U Xbal nukleázzal 2 órán át, 37 °C hőmérsékleten, 200 pl, a gyártó által előírt pufferben, 1,5 mg/ml RNáz A jelenlétében, majd a nátrium-klorid-koncentrációt 140 mmólra emeltük, tömény pufferrel kompenzáltuk a térfogat növekedését, 60 U EcoRI-t adtunk az elegyhez, és tovább inkubáltuk 2,5 órán át 230 pl térfogatban. Ezután a reakcióelegyet 100 pl kloroformmal extraháltuk, és a DNS-t kicsaptuk a vizes fázisból 0,1 térfogatnyi, 3 mol-os nátrium-acetát-puffer (pH=5,2) és 2 térfogatnyi etanol hozzáadásával. Az elegyet 16 órán át 4 °C-on tartottuk, majd a DNS-t kicentrifugáltuk, levegőn megszárítottuk, és mintapufferben feloldottuk. A restrikciós fragmentumokat 0,6%-os LMP (=alacsony olvadáspontú) agarózgélben, 0,5 χ TBE-pufferben, etidium-bromid jelenlétében választottuk el, és a 2,5 kbp EcoRI-Xbal fragmentumot tartalmazó sávot kimetszettük a gélből.
A lambda-E fág 4,1 kbp EcoRI-Xbal fragmentumát a fentivel mindenben azonos módon állítottuk elő. A gélből kimetszett sávokat a feldogozásig -20 °C-on tároltuk; a DNS kivonása a gélből az alábbiak szerint történt. 0,5 ml-es mikro-centrifugacső aljába szilikonozott üveggyapot dugót tettünk, és 60 pl tömény TE-puffert [100 mmol Tris-HCl (pH=8,0), 10 mmol EDTA] töltöttünk rá, majd a gélszeletet megolvasztva a csőbe tettük, és az egészet megfagyasztottuk folyékony nitrogénben. A cső fenekén kis lyukat szúrtunk, a csövet egy 1,5 ml-es centrifugacsőbe tettük, és a puffért a gélszeletből kioldódott DNS-sel együtt átcentrifugáltuk a nagyobb csőbe. A gél maradványait (az üveggyapot dugóval együtt) 50 pl tömény ΤΕ-pufferben felszuszpendáltuk, újra megfagyasztottuk és centrifugáltuk, majd az oldatokat egyesítettük és kloroformmal extraháltuk. A DNS-t kicsapás után 40 pl TE-pufferben oldottuk fel; az oldat koncentrációját agarózgélben végzett futtatással határoztuk meg ismert mennyiségű fágDNS-hez viszonyítva.
A pEMBL 18 és pEMBL 19 vektorokat a forgalmazó előírása szerint, Xbal és EcoRI-nukleázokkal végzett sorozatos emésztéssel készítettük elő. A DNS kipreparálását Maniatis (6) nyomán végeztük azzal az elté24
HU 220 337 B réssel, hogy kihagytuk az izoamil-alkoholt az extraháláskor, és a kicsapást 4 °C-on végeztük.
A DNS-fragmentumok ligálását a vektorba 25 pl térfogatú pufferben, 1 mmol ATP, 1,5 U T4 DNS-ligáz és 100 ng vektor jelenlétében végeztük. A pGW1800 létrehozásához ekvimoláris mennyiségű, előemésztett pEMBL18 vektor-DNS-t és tisztított lambda-E 4,1 kbp Xbal-EcoRI fragmentumot használtunk. A reakciót 16 órán át folytattuk 16 °C-on, majd 125 pl desztillált víz hozzáadásával és fagyasztással állítottuk le.
A pGW1803 létrehozásához az előemésztett pEMBL19 vektort használtuk. A reakciót körülbelül 15 ng előkészített, 2,5 kbp lambda-D Xbal-EcoRI fragmentummal végeztük 14 órán át, 20 °C hőmérsékleten, majd újabb 1 U T4 DNS-ligázt adtunk hozzá, és még 7 órán át folytattuk. A leállítást a fenti módon végeztük.
Az így kapott reakcióelegyek 50 pl-ét használtuk transzformálásra. Az eljárást lényegében a (11) alapján végeztük azzal a különbséggel, hogy az E. coli DH5aF’ törzsét 0,7, JM109 törzsét pedig 0,9 extinkcióig tenyésztettük, mielőtt a tenyészeteket jégre tettük volna. Az első törzset a lambda-D, a másodikat a lambda-E fragmentumot hordozó vektorral transzformáltuk. Hősokkolás után a sejteket 2 percre jégre tettük, utána 1 órán át inkubáltuk 37 °C-on, majd óvatosan centrifugálva leülepítettük, 1 ml felülúszót leszívtunk, és a maradékban felszuszpendáltuk azokat. Ezután a baktériumokat 100 mg ampicillint vagy IPTG/X-gal oldatot (2% X-gal 200 pl víz és 30 pl dimetil-formamid keverékében oldva és 20 pl 24 mg/ml-es vizes IPTG-oldat) tartalmazó LB agarlemezekre szélesztettük, és 16 órán át inkubáltuk 37 °C-on.
A lemezekről a magányos, fehér telepeket tovább szaporítottuk 0,1% glükózt és 75 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajon, majd az így kapott sejtekből izoláltuk a plazmidot Holmes és Quigley (12) „miniprep.” módszerével. Az izolált plazmidokat RNáz A jelenlétében különböző restrikciós enzimekkel emésztettük, és a termékeket agarózgélben analizáltuk: a várt méretű Xbal-EcoRI, BamHI-EcoRI és HindlII-fragmentumokat hordozó baktériumsejteket összegyűjtöttük, és glicerinben, -20 °C hőmérsékleten tároltuk.
A leírt módon két új plazmidot hoztunk létre. A pGW1800 a lambda-E fág 4,1 kbp Xbal-EcoRI fragmentumát tartalmazza a pEMBL18 vektorba, a pGW1803 a lambda-D fág 2,5 kbp Xbal-EcoRI fragmentumát tartalmazza a pEMBL19 vektorba inszertálva.
3.8. példa
A pGW1800 és pGW1803 restrikciós analízise
A két plazmid hasonlóságát részletes restrikciós analízissel bizonyítottuk. A HR6195 és HR6196 oligonukleotidkeverékekkel hibridizálódni képes szekvenciát neveztük a pGW1803 specifikus területének. A klónozást műtermékek (például kiesések vagy felesleges szakaszok) jelenlétét a pGWl 800-ból kapott restrikciós fragmentumok és az A. niger N400 génkönyvtár összehasonlításával zártuk ki.
A pGW1800 és pGW1803 plazmidokat az E. coli JM109 és DH5aF’ törzseiben szaporítottuk. A plazmidDNS-t 250 ml, 0,1% glükózt és 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB tápfolyadékban tenyésztett baktériumokból vontuk ki Maniatis [(6) 90-91. oldal] szerint és TEpufferben tároltuk. Mivel a pGW1800 plazmidot az A. niger transzformálására is használtuk, megtisztítottuk cézium-klorid-gradiensben: 2,5 ml DNS-oldathoz (TEpufferben) 3,3 g cézium-kloridot és 1 ml etidium-bromid-oldatot (10 mg/ml vízben) adtunk. A centrifugálást Beckman VTi 65,2 rotorban, 20 °C-on, 45 000 fordulat/perc fordulatszámmal és 16 órán át végeztük. A két, UV-fényben látható sáv közül az alsó tartalmazta a kovalens kötéssel gyűrűvé zárt plazmid-DNS-t, ezért ezt a cső oldalába szúrt lyukon át kinyertük. A körülbelül 1 ml DNS-oldatot vízzel telített butanollal ötször extraháltuk az etidium-bromid eltávolítása érdekében, majd a térfogatát 15 ml-re egészítettük ki vízzel, és a DNS-t 30 ml etanollal kicsaptuk. A DNS-t kicentrifugáltuk, 75%-os etanollal egyszer átmostuk, majd feloldottuk TE-pufferben, és -20 °C-on tároltuk. A pGW1803 plazmidot egy gyorsabb eljárással tisztítottuk: 100 pg/ml RNáz A enzimet adtunk 4 ml DNS-oldathoz, 1 órán át inkubáltuk 37 °C-on, majd extraháltuk egyenlő térfogatú fenollal, fenol: kloroform = 1:1 keverékkel és kloroformmal. A vizes fázisból a DNS-t 0,4 ml, 3 mol-os nátrium-acetátpufferrel (pH=5,2) és 8 ml etanollal kicsaptuk, a DNS-t kicentrifugáltuk, 75%-os etanollal mostuk, levegőn megszárítottuk és TE-pufferben feloldottuk.
Az A. niger DNS-t a növényi RNS izolálására szolgáló eljárás [Slater (21)] módosításával végeztük. A micéliumot fiziológiai sóoldattal mostuk, folyékony nitrogénben megfagyasztottuk, és Braun mikrodezintegrátorban szétroncsoltuk (2,5 g). A micéliumport frissen készült extrakciós pufferrel extraháltuk. Az extrakciós puffer elkészítése a következő: 5 ml triizopropil-naftalinszulfonsav-oldatot (20 mg TNS/ml), 5 ml p-aminoszalicilsav-oldatot (120 mg PAS/ml) és 2,5 ml 5 xRNBpufifert [121,1 g Tris, 73,04 g NaCl, 95,1 g EGTA 11 vízben (pH=8,5)] összekeverünk, majd 7,5 ml fenolt adunk hozzá, és 55 °C-on 10 percig állni hagyjuk. A micéliumport a meleg pufferben keverjük 2 percen át, majd a fázisokat centrifugálással (10 perc, 10 000 g) elválasztjuk a vizes fázist még egyszer extraháljuk 10 ml fenol kloroform = 1:1 eleggyel és még kétszer kloroformmal.
A vizes fázis RNS-t és DNS-t is tartalmaz. A DNS-t kétszeres térfogat etanollal, szobahőmérsékleten kicsapjuk és kicentrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), visszaoldjuk desztillált vízben, és újra kicsapjuk etanollal. Az RNS-t RNáz A enzimmel (20 pg/ml) bontjuk le az oldatban.
A pGW1800 és pGW1803 fizikai térképének elkészítése érdekében számos reakcióelegyet készítettünk amelyek körülbelül 1 pg plazmid-DNS-t, a pGW1803 esetében 1 mg/ml RNáz A enzimet, a gyártók által javasolt puffereket és a restrikciós enzimek 10 egységét tartalmazták. Néhány esetben két különböző enzim kombinációját használtuk, vagy kipreparáltuk a DNS-t a reakcióelegyből, visszaoldottuk, és tovább emésztettük egy második vagy harmadik endonukleázzal. A reakciókat 37 °C hőmérsékleten. 1 órán át folytattuk, majd ötszörös tömény25
HU 220 337 B ségű mintapufferrel leállítottuk, és az eredményt 1%-os agarózgélben, TAE-pufferben analizáltuk. Az egyes restrikciós helyek pozícióját a fragmentumok hosszából számítottuk ki egy önkényesen kijelölt (az egyetlen Xbal) restrikciós helyre vonatkoztatva. A pGW1800 restrikciós térképét a 2. ábrán mutattuk be; a pGW1803 A. niger eredetű DNS-inszertje azonos a pGW1800 inszertjével az 1. pozíciójú Xbal és a 2000. pozíciójú HinclI helyek között, de hiányzik belőle a 2400. pozíciójú BglII restrikciós hely. A pGW1800 0,4 kbp HincII-BglII fragmentumának elektroforetikus mobilitása azonos a pGW1803 inszertjének végén elhelyezkedő HincIIEcoRI fragmentuméval, így arra következtettünk, hogy a pGW1803 inszertje azonos a pGW1800 inszertjének 1.-2400. szakaszával. Ebből úgy tűnik, hogy a lambdaD fág EcoRI-Xbal fragmentumának méretét (2,5 kbp,
3.6. példa) kissé túlbecsültük.
Annak érdekében, hogy lokalizálhassuk a HR6195 és HR6196 oligonukleotidkeverékekkel hibridizálódó szekvenciát, a pGW1803 DNS-t restrikciós enzimekkel emésztettük, és a fragmentumokat szeparáltuk, majd nitrocellulóz-membránon hibridizáltuk a jelölt mintakeverékekkel a már leírt módon. Az így talált fragmentumokból (egy 0,64 kbp HinclI- és egy 0,62 kbp NcolEcoRI fragmentum) arra következtethetünk, hogy a keresett specifikus szekvencia az 1750. pozíciójú Ncolés a 2000. pozíciójú HincII-helyek között helyezkedik el a pGW1803 restrikciós térképén, ami megegyezik a pGW1800 restrikciós térképének azonos területével.
A klónozás során esetleg keletkezett műtermékek jelenlétét a pGW1800 restrikciós fragmentumainak az A. niger N400 DNS restrikciós fragmentumaival való összehasonlítással zártuk ki. Az A. niger kromoszómái is DNS-ét 200 μΐ-es reakcióelegyekben, 37 °C-on emésztettük; a reakcióelegyek a megfelelő pufferekben 2 pg DNS-t, 0,5 mg/ml RNáz A enzimet és 80 U restrikciós enzimet tartalmaztak. 2 órás inkubáció után az elegyeket 100 μΐ kloroformmal extraháltuk, a DNS-t kicsaptuk a vizes fázisokból, kinyertük és visszaoldottuk, majd a pGW1800 fragmentumaival együtt 0,7%-os agarózgélben megfuttattuk. Az A. nigerből kapott fragmentumokat nitrocellulóz-membránra vittük át, és a leírt módon hibridizáltuk különböző minta-DNS-ekkel.
A hibridizációhoz használt minták a pGW1800 1,45 és 2,05 kbp EcoRV-BglII fragmentumai voltak. Ezeket a fragmentumokat korábban izoláltuk agarózgélből a leírt módon, és 100 ng-jukat külön-külön alkifejeztük Maniatis [(6), 109-112. oldal] szerint. A hibridizáció előtt a mintákat 10 perces forralással denaturáltuk. A hibridizációt a korábban részletesen leírt módon végeztük el.
Az 1,45 kbp EcoRV-BglII mintával a következő fragmentumok hibridizálódtak: egy 2,4 kbp Xhol-, egy 2,8 kbp és egy 1,2 kbp KpnI-, valamint egy 1,3 kbp BglII/EcoRV kettős fragmentum. A 2,05 kbp EcoRVBglII mintával a következők: egy körülbelül 11 kbp EcoRI/Sall kettős, egy 2,3 kbp és egy 2,1 kbp Xhol-, egy
2,3 kbp és egy 1,4 kbp Xhol/Xbal kettős, egy 1,2 kbp KpnI-, valamint egy 2,0 kbp EcoRV/BglII kettős fragmentum.
A hibridizálódó fragmentumok közül négynek csak a jelenlétére és a minimális méretére lehet következtemi a pGW1800 restrikciós térképéből. Ezek azok a fragmentumok, amelyek homológok az alkalmazott mintákkal, de egyik végük kívül esik a pGWl 800-ban jelen lévő szekvencián. Ezek a fragmentumok a következők: az EcoRI/Sall kettős fragmentum, a 2,1 kbp Xhol- és a 3,2 kbp Kpnl-ffagmentum a nagyobb, a 2,8 kbp Kpnlfragmentum pedig a kisebb mintával hibridizálódott. Ezek a fragmentumok mind nagyobbak annál, mint amekkorák a restrikciós térkép szerint lehetnének, míg a többi fragmentum megfelel a számítható méreteknek. A fentiekből arra következtethetünk, hogy a pGW1800 A. nigerből származó inszertje a gombagenom egy részének kiváló képviselője.
3.9. példa
A pGW1900 és pGW1902 létrehozása és restrikciós analízise
A PG-l-lambda-7 fág 8,6 kbp restrikciós fragmentumát - amely a PG-II kódolószekvenciájával hibridizálódik (3.6. példa, 4. táblázat) - a pCU9 vektorba [Vieira és Messing, Gene, 19, 259 (1982)] inszertálva kaptuk a pGW1900 és pGW1901 plazmidokat; az utóbbiban az inszert orientációja fordított.
A fág-DNS-t BamHI-nukleázzal emésztettük: 30 μΐ térfogatban 5 μΐ TE-puffer, 1,5 pg DNS, 1 ml spermidinoldat (10 mmol-os), 20 U BamHI és desztillált víz volt. A emésztett mintához % térfogatnyi futtatópuffert (0,25% brómfenolkék, 0,25% xilolkék és 15% Ficoll 400 vízben) adtunk, és 0,6%-os agarózgélben szeparáltuk TAE-pufferben, 1 pg/ml etidium-bromid jelenlétében.
Az elválasztás után a gélből UV-fény alatt kivágtuk a 8,6 kbp fragmentumot tartalmazó sávot, amiből elektroforézissel (100 V, 1 óra) kivontuk a DNS-t. Az oldatot 2 térfogatnyi etanollal kicsaptuk, Eppendorfcentrifugában (30 perc) ülepítettük, a DNS-csapadékot vákuumban megszárítottuk, és 10 μΐ ΤΕ-pufferben feloldottuk. A pUC9 vektort (1 pg) 10 U BamHI-nukleázzal linearizáltuk (20 pl előírt pufferben, 37 °C, 1,5 óra), majd 1 pl CIP-oldatot (körülbelül 2 U) adva hozzá a keveréket 30 percig inkubáltuk 37 °C-on. A linearizált vektort is elektroforézissel preparáltuk, majd 20 μΐ TEpufferben oldottuk fel, ami körülbelül 50 ng/μΐ DNSkoncentrációnak felelt meg.
A ligációs reakcióban 1 pl linearizált és CIP-vel kezelt pUC9 vektor-DNS-t (50 ng) és 4 pl BamHI-fragmentumot (100 ng) kapcsoltunk össze 1,2 U T4 DNSligázzal a megfelelő pufferben, 10 pl térfogatban. A reakciót 14 °C hőmérsékleten, 14 órán át folytattuk, majd az elegyet 50 μΐ-re hígítottuk TE-pufferrel.
Az így kapott reakcióelegyek 50 pl-ét használtuk transzformálásra. Az eljárást lényegében a (11) alapján végeztük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli DH5aF’ törzsét 0,7, extinkcióig tenyésztettük, mielőtt a tenyészeteket jégre tettük volna. Hősokkolás után a sejteket 2 percre jégre tettük, utána 1 órán át inkubáltuk 37 °C-on, majd óvatosan centrifugálva leülepítettük, ml felülúszót leszívtunk, és a maradékban felszusz26
HU 220 337 Β pendáltuk azokat. Ezután a baktériumokat 100 mg ampicillint vagy IPTG/X-gal oldatot (2% X-gal 200 pl víz és 30 μΐ dimetil-formamid keverékében oldva és 20 μΐ 24 mg/ml-es vizes IPTG-oldat) tartalmazó LB agarlemezekre szélesztettük, és 16 órán át inkubáltuk 37 °C-on. A lemezekről a magányos, fehér telepeket tovább szaporítottuk 0,1% glükózt és 75 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajon, majd az így kapott sejtekből izoláltuk a plazmidot Holmes és Quigley (12) „miniprep.” módszerével. Az izolált plazmidokat 0,5 mg/ml RNáz A jelenlétében különböző restrikciós enzimekkel emésztettük, és a termékeket agarózgélben analizáltuk: a várt méretű BamHI-fragmentumokat hordozó baktériumsejteket összegyűjtöttük, és glicerinben, -20 °C hőmérsékleten tároltuk. Az így létrehozott plazmidokat (pGW1900, 3. ábra és pGW1901), amelyek az inszertet egymáshoz képest fordított orientációban hordozzák, használtuk a további kísérletekben.
A pGW1900 plazmidot az E. coli DH5aF’ törzsében szaporítottuk. A plazmid-DNS-t 250 ml, 0,1% glükózt és 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB tápfolyadékban tenyésztett baktériumokból vontuk ki Maniatis [(6) 90-91. oldal] szerint, és TE-pufferben tároltuk. Mivel a pGW1900 plazmidot az A. niger transzformálására is használtuk, megtisztítottuk cézium-klorid-gradiensben: 2,5 ml DNS-oldathoz (TE-pufferben) 3,3 g cézium-kloridot és 1 ml etidium-bromid-oldatot (10 mg/ml vízben) adtunk. A centrifugálást Beckman VTi 65.2 rotorban, 20 °C-on, 45 000 fordulat/perc fordulatszámmal és 16 órán át végeztük. A két, UV-fényben látható sáv közül az alsó tartalmazta a kovalens kötéssel gyűrűvé zárt plazmid-DNS-t, ezért ezt a cső oldalába szúrt lyukon át kinyertük. A körülbelül 1 ml DNSoldatot vízzel telített butanollal ötször extraháltuk az etidium-bromid eltávolítása érdekében, majd a térfogatát 15 ml-re egészítettük ki vízzel, és a DNS-t 30 ml etanollal kicsaptuk. A DNS-t kicentrifugáltuk, 75%-os etanollal egyszer átmostuk, majd feloldottuk TE-pufferben, és -20 °C-on tároltuk.
A pGW1900 plazmidot KpnI-nukleázzal emésztve egy 2,7 kbp KpnI-fragmentumot kaptunk, amit agarózgélből izolálva a pEMBL18 vektorba [Dente és Cortese (10)] inszertálva kaptuk a pGW1902 (4. ábra) és pGW1903 plazmidokat.
A pGW1900 és pGW1902 fizikai térképének elkészítése érdekében számos reakcióelegyet készítettünk, amelyek körülbelül 1 pg plazmid-DNS-t, a gyártók által javasolt puffereket és a restrikciós enzimek 10 egységét tartalmazták. Néhány esetben két különböző enzim kombinációját használtuk. A keletkezett fragmentumokat 1%-os agarózgélben, TAE-pufferben analizáltuk. Az egyes restrikciós helyek pozícióját a fragmentumok hosszából számítottuk ki; az eredményt a 3. és
4. ábrán mutattuk be.
3.10. példa
Az A. niger NW756 poligalakturonáz-II (pgall) génjének molekuláris klónozása
Az A. niger NW756 genom-DNS-ét Southem-blot módszerrel vizsgáltuk, az A. niger N400 pgall génjét (azaz a pGW1800 1,2 kbp BamHI-BglII fragmentumát) használva mintának. Az 7.1. példában leírtakhoz képest két módosítást hajtottunk végre: olyan restrikciós enzimeket választottunk, amelyek az A. niger N400 pgall gén kódolószekvenciáján belül hasítanak, és a hibridizálás körülményeit sokkal szigorúbbra vettük, azaz a 7.2. példában leírt „homológ” körülményeket alkalmaztuk. A BamHI-gyel végzett emésztés után csak egy hibridizálódó fragmentumot (3,3 kbp) találtunk, amiről ilyen körülmények között megállapíthatjuk, hogy csak az A. niger NW756 pgall génje lehet. Találtunk egy 3,3 kbp HincII-ffagmentumot is, ami azt jelenti, hogy nincs ilyen restrikciós hely a struktúrgénen belül. Találtunk még egy 5,5 kbp XhoI-BglII fragmentumot is, aminek léte nem felel meg a 3.7. példa adatainak vagy a (SEQ 1D No. 2) szekvenciájának: ebből viszont arra következtethetünk, hogy az A. niger N400 és NW756 pgall génjei nem egyformák.
Az A. niger NW756 génkönyvtárat lényegében a 2. példában leírt módon hoztuk létre, kisebb eltérésekkel. Az Mbol-nukleáz helyett Sau3AI-enzimet használtunk; a két enzim ugyanazon szekvenciáknál hasít. A könyvtárat az EMBL3 fágban hoztuk létre, amely az EMBL4 közeli rokona (9); a fágot előemésztett és foszfatázzal kezelt állapotban forgalmazza a Promega Inc. A könyvtár sokszorozását és a fragmentumok izolálását a 3.3. példában leírtak szerint végeztük. A hibridizáció minta-DNS-e a pGW1803 1,2 kbp BamHl-EcoRl fragmentuma volt a 7.2. példában leírt szigorú körülmények között. A pozitív fágokat újabb hibridizációval tisztítottuk, majd a DNS-t a 3.4. példában leírtak szerint izoláltuk és BglII/XhoI keverékkel emésztettük. Azt a fágot, amely egy 5,5 kbp XhoI-BglII fragmentumot tartalmazott, a 3.6. példa szerint izoláltuk, majd ezt a fragmentumot ligáltuk a BamHI- és Sall-nukleázokkal emésztett PEMBL18 vektorba, és transzformáltuk vele az E. coli JM109 törzsét (3.6. példa). A transzformánsokat heterológ körülmények között végzett hibridizációval (7.3. példa) analizáltuk, a pozitív fágot megtisztítottuk, és elkészítettük a fizikai géntérképet.
A pGW1756 restrikciós térképe a 6. ábrán látható: ez a plazmid az A. niger NW756 pgall génje egy 5,5 kbp XhoI-BglII fragmentum alakjában a pEMBL18 vektorba inszertálva.
4. példa
A poligalakturonáz gének nukleotidszekvenciájának meghatározása
4.1. példa
Az A. niger N400 poligalakturonáz-II (pgall) génje
A pGW1800 és pGW1803 megfelelő restrikciós fragmentumait agaróz-gélelektroforézissel izoláltuk, és ligáltuk az M13mpl8RF és M13mpl9RF vektorokba. A ligáláshoz a fragmentumokat 2-10-szeres mennyiségben használtuk a vektorhoz képest. Az E. coli JM109 sejteket a korábban leírt módon transzformáltuk azzal az eltéréssel, hogy a hősokk után a sejteket azonnal a táptalajra szélesztettük. Az egyszálú DNS-templátok izolálását a rekombináns fágokból Ausubel és
HU 220 337 Β munkatársai [(40), 7.3.9. fejezet] szerint végeztük; a DNS-oldatok mellett a fágokat hordozó baktériumokat is összegyűjtöttük és glicerinben, -20 °C hőmérsékleten tároltuk.
Az így nyert kiónok egyikét, amelyben a pGW1803
2,4 kbp Xbal-EcoRI fragmentuma van az M13mpl8 polilinkerbe inszertálva, tovább manipuláltuk, hogy szekvenálhassuk a HindlII-, PstI-, BamHI- és Ncolnukleázokkal. 16 órás tenyészeteket készítettünk YT tápfolyadékban az E. coli JM109-ből és a megfelelő fágot hordozó kiónból (a glicerinben tárolt baktériumokat használva az oltáshoz), majd 200 ml 2xYT tápfolyadékot oltottunk a JM109 tenyészetének 0,4 miével, és 2,5 órán át inkubáltuk 37 °C-on. Ekkor adtuk a tenyészethez a fághordozó baktériumok tenyészetének 20 ml-ét, majd tovább inkubáltuk körkörös rázógépen 5 órán át. A replikatív DNS-t úgy izoláltuk ezekből a sejtekből, ahogy azt a pGW1803 esetében korábban leírtuk, majd ezt a DNS-t emésztettük a HindlII-, PstI-, BamHI- és Ncol-nukleázokkal. A BamHI- és Ncolenzimekkel emésztett DNS-t még Sall-gyel is emésztettük, majd fenol/kloroform eleggyel és kloroformmal végzett extrakció után etanollal kicsaptuk. A nem kompatibilis ragadós végeket Maniatis [(6), 117. oldal] szerint feltöltöttük: a 25 pl reakcióelegyben 5 U T4 DNSpolimeráz mellett 1-1 mmol dCTP, dATP, dGTP és dTTP volt. 5 perc 37 °C-os inkubáció után a reakciót 5 pl 0,5 mol-os EDTA-val (pH=8,0) leállítottuk, és az elegyet fenollal extraháltuk. A kis DNS-fragmentumokat 0,7%-os LMP agarózgélen eltávolítottuk, majd a nagyobb fragmentumokat tartalmazó agarózgélsávokat kivágtuk, és a DNS-t izoláltuk. Az így kapott fragmentumokat T4 DNS-ligázzal cirkularizáltuk, és a keverékkel E. coli JM109 sejteket transzformáltunk a már leírt módon.
A Bcll-nukleáz érzékeny a szubsztrát metiláltságára, ezért nem képes a JM109 és DH5aF’ E. coli törzsekben szaporított plazmidokat hasítani. Emiatt a korábban izolált pGW1800 és pGW1803 plazmidokkal az E. coli JM110 törzsét [Janisch-Perron és munkatársai (29)] transzformáltuk, majd a plazmid-DNS-t a 3.8. példa szerint izoláltuk, azzal a különbséggel, hogy 0,1% kazaminosavat adtunk a baktérium táptalajához. Az így kapott plazmid-DNS-ből olyan szubklónokat hoztunk létre, amelyek lehetővé tették a Bell használatát is.
A kiónokat a Pharmacia „17 Sequencing Kit”-je segítségével, a gyártó által előírt módon szekvenáltuk. Az így nyert szekvenciaadatok alapján az alábbi specifikus oligonukleotidokat szintetizáltunk Caruthers (8) eljárásával :
HR6425 5 ’-(d)CAAGAACGTCACCATCGAAC-3 ’ HR6439 5 ’ -(d)G A ATTGCTC ACGGTGG AGTG-3 ’ HR6440 5 ’-(d)ACTTGGGCTTCTTCTTTCCG-3 ’ Ezeket az oligonukleotidokat primerként használtuk a fontos templátok szekvenálásához. A HR6439 két átfedő szekvenáló „létrát” képez, ha M13 templáton használjuk, ezért ezt a prímért a lúggal denaturált pGW1800 kettős szálú szekvenálásához használtuk a Pharmacia előírásai szerint.
A /JgűII szekvenciája a pGW1800 plazmid DNSének mindkét szálán megtalálható. A lefelé végzett szekvenálás (az 1. pozíciójú Xbal helytől a 3028. pozíciójú PvuII helyig) a következő restrikciós helyeket mutatta ki: Xbal (1.), EcoRV (körülbelül 334.), HindlII (körülbelül 557.), PstI (körülbelül 827.), Bell (körülbelül 1056.), BamHI (körülbelül 1158.), HincII (körülbelül 1344. és 1974.), KpnI (körülbelül 1565. és 2706.), Ncol (körülbelül 1749.) és BglII (körülbelül 2379.); a BglII-hely területének szekvenálását a HR6425 primer segítségével végeztük. Az ellenkező irányban végzett szekvenálás eredménye a következő: PvuII (körülbelül 3028. és 1442.), KpnI (körülbelül 2706. és 1565.), BglII (körülbelül 2379.), HincII (körülbelül 1974.), BamHI (körülbelül 1158.), Bell (körülbelül 1056.), PstI (körülbelül 827.), HindlII (körülbelül 557.) és EcoRV (körülbelül 334.); a HincII-hely területének szekvenálását a HR6439, a KpnI (1565.) helyét pedig a HR6440 primer segítségével végeztük el.
A pgall teljes szekvenciáját a (SEQID No. 2) mutatja be. A 3031 bp hosszúságú szekvencia a Xbal restrikciós hely első nukleotidjával kezdődik, és a PuvIIhely utolsó nukleotidjával végződik; ez felel meg a pGW1800 restrikciós térképén a körülbelüli 3050. pozíciónak. A pgall gén a promoter 1356, a struktúrgén 1138 (benne egy 52 nukleotidos feltételezett intronnal) és a terminátorszakasz 537 nukleotidjából áll.
A jelzőszekvencia után közvetlenül következő szekvencia és az Xhol-hely szekvenciája együtt egy olyan aminosavszekvenciát kódolnak, amely teljesen megegyezik a pgall 5 kd-s fragmentumából levezetettél, beleértve a 3. helyen álló ciszteint is (1.3. példa).
A DNS által kódolt vezetőpeptid 27 aminosavból áll, és argininnel végződik. Ezt a vezetőpeptidet az úgynevezett szignálpeptidáz hasítja le a fehérjéről, de ennek hasítási helyét sem az arginin után, sem más töltéshordozó aminosav után nem találtuk meg. Ebből arra kell következtetnünk, hogy a vezetőpeptid legalább két fehérjebontási lépésen keresztül hasad le, azaz a vezetőpeptid egy preproszekvencia. Ilyen esetekben a szignálpeptidáz csak egy preszekvenciát hasít le, és a maradék „proszekvenciát” egy másik proteáz távolítja el.
A pgall struktúrgénje egy intront tartalmaz, amit minden valószínűség szerint az 1987.-2038. nukleotidok alkotnak. Ez a szekvencia mindhárom lehetséges terminátorkodont tartalmazza. Az intron jelenléte úgy változtatja meg a leolvasási keretet, hogy az megfelel az 1. példában bemutatott fehérjeszekvenciának. Az intron előtti nukleotidszekvenciát a cianogén-bromidos fehérjefragmentumok szekvenciája (1.3. példa), az intron utánit pedig a tripszines emésztéssel kapott TP4peptid aminosavszekvenciája (1.5. példa) hitelesítette. Az intron 5’ összekötő vége - a GTAAGC szekvencia - megfelel a gombákban szokásos GTPuNGT összekötő szekvenciának, és a 3’ vég TAG triplettje is megfelel a PyAG 3’ összekötő szekvenciának (41).
4.2. példa
Az A. niger N400 pgal génje
HU 220 337 B
A szekvenáláshoz szükséges restrikciós fragmentumokat a pGW1900 és pGW1902 plazmidokból izoláltuk agarózgél-elektroforézissel a 3.9. példában leírt módon. Ezeket azután az M13mpl8RF és M13mpl9RF vektorokba klónoztuk (11) szerint; a fogékony sejteket 5 is ismert módon állítottuk elő. Az E. coli JM101 transzformálását Messing és munkatársai (30) nyomán, az egyszálú DNS-templátok izolálását a rekombináns fágokból szokványos módon [(11), 29-34. oldal] végeztük. Az így kapott kiónokat a Pharmacia szekvenálókészletével, a gyártó utasításai szerint vizsgáltuk meg.
A pGW1900 plazmidot az 5750. pozíciójú EcoRIhelytől a 3900. pozíciójú Clal-helyig szekvenáltuk, amely a körülbelül 3790. pozíciójú HindlII-hely közelében van. Szekvenálóprimerként négy oligonukleotidot szintetizáltunk Caruthers (8) módszerével:
No . 304 5’(d)
No. 305 5 ’ (d)
No . 306 5’(d)
No. 307 5 ’ (d)
TTCAGCCCAAGCGTCAATCC3’ ACCTGAACGACTTCACCATC3’ TCTGTAGGACGTCTGGTTG 3’ TGGCGATAAAACCACCTAAC3’
A No. 307 oligonukleotidot a lúggal denaturált 15 pGW1900 kettős szálának szekvenálásához használtuk.
A kapott szekvenciát a (SEQ ID No. 1) alatt mutattuk be; a sorendet a két szálon kapott adatokból határoztuk meg.
A 2495 bp hosszúságú pgal gén szekvenciája a 20 pGW1900 körülbelül 6280. pozíciójú EcoRI-helyének első nukleotidjával kezdődik, és a 3880. pozíciójú HindlII-hely szomszédságában lévő Clal-hely utolsó nukleotidja után 12 nukleotiddal végződik. A gén a promoterszakasz 909, a struktúrgén 1218 [beleszámítva egy 25 52 bp-s (A) és egy 62 bp-s (B) intront] és a terminátorszakasz 366 nukleotidjából áll.
Az érett PG-I (1.4. példa) és a 21 kd-s cianogénbromidos fragmentum (1.5. példa) aminosavszekvenciái teljesen megfelelnek az 1003. pozíciónál kezdődő 30 nukleotidszekvenciából levezethető aminosavsorrendnek. Eszerint a DNS egy 31 aminosavból álló vezetőpeptidet kódol, aminek utolsó aminosava egy lizin. Az előző példában elemzett okok miatt ez a peptid is egy preproszekvencia, amelynek eltávolítása legalább két 35 proteolitikus lépést igényel. A minta-DNS-keverékkel hibridizálódó szekvencia az 1277. pozíciónál kezdődik. Ugyancsak teljes az egyezés az 5,5 kd-s N-terminális fragmentum megvizsgált aminosavszekvenciája és a nukleotidszekvenciából levezethető aminosavsorrend 40 között.
A pgal gén két intront is tartalmaz. Az intron-A-t az 1138.-1189. nukleotidok alkotják; 5’ kapcsolódó vége - GTATGT - megfelel a gombák GTPuNGT 5’ kapcsolódó végének (41), a GCTAAC „lasszó-szekvencia” és a 3’ vég TAG triplettje pedig az ismert PuCTPuAC és PyAG szekvenciáknak. Ennek az intronnak a jelenléte úgy változtatja meg a leolvasási keretet, hogy az megfelel a sokkal messzebb elhelyezkedő, 5,5 kd-s peptid aminosavszekvenciájának. Az intron-B-t az 1610.-1671. nukleotidok alkotják, amelyben mind a lasszó-szekvencia, mind a 3’ vég megfelel az ismert kapcsolódó szekvenciáknak, viszont az 5’ vég GCACGA nukleotidjai nem elégítik ki a GTPuNGT gombaszekvenciához kapcsolódás feltételeit. GC nukleotidokkal kezdődő és a 6. pozícióban adenint hordozó 5’ kapcsolódó szekvenciákat ugyanakkor más génekben is kimutatták már [(41), (43)].
Az intron-B létezése mellett a következő érvek szólnak:
a) ha nem változtatná meg a leolvasási keretet, a transzkripció idő előtt fejeződne be;
b) apgall intronja ugyanezen a helyen van, és az intront megelőző négy aminosav - asn-ser-gly-glu - mindkét fehérjében azonos, de erős homológia figyelhető meg az intronokat követő aminosavak esetében is:
PG-II asn-ile-trp-phe-thr-gly-gly-thr-cys PG-I ser-ile-ser-phe-thr-gly-gly-thr-cys PG-II ile-gly-gly-his-gly-leu-ser-ile-gly PG-I ser-gly-gly-his-gly-leu-ser-ile-gly
4.3. példa
Az A. niger N400 poligalakturonázok homológiája
Az A. niger PG-I és PG-II ugyanazt a reakciót katali- 50 zálják, és immunológiailag is hasonlítanak egymáshoz (1.2. példa). Hasonlítanak egymáshoz az enzimeket kódoló gének is, mivel a pgall-vel együtt más PG géneket is találtunk az A. niger N400 génkönyvtárban (7.2. példa). Az érett PG-I és PG-II valószínűsített aminosavszek- 55 venciái - annak ellenére, hogy hosszuk 2 aminosawal különbözik - is nagyfokú homológiát mutatnak. A fenti adatok világosan bizonyítják, hogy a PG-ket kódoló gének szorosan összefüggenek és egy géncsaládot alkotnak.
5. példa
Az A. niger kotranszformalása az A. niger pyrA gént (mint szelekciós markert) és egy pgal vagy pgall gént hordozó plazmiddal
5.1. példa
Az A. niger transzformálásához használt plazmidok szaporítása és tisztítása
A pGW635 - amely a pyrA gént hordozó pGW613 rövidített változata (13) - és a pGW1800 plazmidokat az E. coli MH1, illetve JM109 törzseiben szaporítottuk, a pGW1900 plazmidot a DH5aF’ törzseiben. A plaz29
HU 220 337 Β mid-DNS-t 250 ml-es, 16 órás tenyészetekből nyertük a 3.7. példa szerint.
5.2. példa
Az A. niger N593 uridin-auxotróf protoplasztok létrehozása és transzformálása
Az N593 jelzésű A. niger törzset (cspA, pyrA) - amely az N400 leszármazottja - a Boeke és munkatársai (14) által élesztőkre kidolgozott módszer nyomán, pozitív szelekcióval tettük toleránssá uridin jelenlétében a toxikus analóggal (az 5-fluor-orotsavval) szemben (13).
0,5% élesztőkivonattal, 0,2% kazaminosavval, 10 mmol uridinnel és 50 mmol glükózzal kiegészített minimál-tápfolyadékot 106 konidiospórával (N593) beoltottunk, és 30 °C-on, rázva inkubáltuk 20 órán át. A micéliumot szűréssel kinyertük, izozmotikus minimál-tápfolyadékkal [STC; 1,33 mól szorbitol, 10 mmol Tris-HCl (pH=7,5), 50 mmol NaCl] mostuk, majd felszuszpendáltuk STC-ben (20 ml/1 g micélium). A szuszpenzióhoz 150 mg Novozym 234 (Novo Industries, Dánia) sejtfalbontó enzimkeveréket adtunk, és 30 °C-on, 2 órán át rázattuk, majd a keletkezett protoplasztokat üveggyapoton szűrve kinyertük. A protoplasztszuszpenzió térfogatát hideg STC-vel 40 ml-re egészítettük ki, és jégre tettük 10 percre, majd a protoplasztokat lecentrifugáltuk (2500 fordulat/perc, 10 perc) és 5 ml STC-ben felszuszpendáltuk, újra lecentrifugáltuk, és végül 1 ml hideg STC-ben szuszpendáltuk fel.
A transzformáláshoz 5 106 protoplasztot inkubáltunk 200 μΐ térfogatban, 1 pg pGW635 és 20 pg pGW1800 vagy pGW1900 plazmidokkal. A plazmidDNS után 50 pl PCT-t [10 mmol Tris-HCl (pH=7,5), 50 mmol CaCl2, 25% PEG 6000] is adtunk az elegyhez, majd jégre tettük 20 percre. Ezután további 2 ml PCT-t adtunk hozzá, és 5 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, végül 4 ml STC-t adtunk hozzá, és alaposan összekevertük. Az elegyet ezután 1 ml-es adagokban 4-4 ml folyékony, izozmotikus, 0,95 mól szacharózzal stabilizált MM fedőagarhoz kevertük, és ugyanolyan táptalajból készült lemezekre öntöttük. A tenyészeteket 30 °C-on inkubáltuk; kontrollként plazmid nélkül kezelt és 2,5 mmol uridint tartalmazó, nem stabilizált táptalajba oltott protoplasztok szolgáltak.
Három nap múlva a jól növekedő transzformánsokon megindult a sporuláció (150 transzformáns/pg pGW635); mellettük nagyszámú abortív transzformáns is volt, összesen körülbelül 300 transzformánst kaptunk a pGW1800 és körülbelül százat a pGW1900 plazmidból. Ezekből kiválasztottunk 20-20 telepet, spóráikat összegyűjtöttük, és külön-külön leoltottuk 50 mmol glükózt tartalmazó minimál-táptalajra. A vonalakat egyegy jól elkülönült telepről vittük tovább, majd azok utódainak spóráit használtuk fel a vizsgálatokhoz.
5.3. példa
Poligalakturonáz-hipertermelő vonalak keresése a kotranszformánsok között
A pGW1800 plazmiddal transzformált telepek közül 200, a pGW1900 plazmiddal transzformáltak közül
100 telepet vizsgáltunk PG-termelésre. A táptalaj 2% glükózt, 0,5% almapektint (34,8%-ban észteresített Obipektin, Bischoffszell), a minimál-tápközeg sóit és nyomelemeit, 6 g/1 nátrium-nitritet, 0,2% peptont, 0,004% Triton-X-100 detergenst és 1,2% agart tartalmazott. A Petri-csészéket középen oltottuk, és 2 napon át inkubáltuk 30 °C-on, majd a tenyészeteket egy éjszakán át hidegen tároltuk; ezután az agarlemezeket megfestettük 5 ml 0,05%-os ruténiumvörös oldattal, amit 5 perc múlva desztillált vízzel lemostunk, és a lemezt még 5 percig desztillált víz alatt állni hagytuk. A PGtermelés mértékét a telep körül kialakult, nem festődő zóna mérete jelzi. A transzformánsok mintegy fele magasabb PG-aktivitást mutatott, mint a vadtípus-törzs.
A magas szintű aktivitásuk alapján 20 pGW1800 és pGW1900 transzformánst választottunk ki egy második, már csak a vad típusnál jobban termelő törzsekkel végzett vizsgálat után. Egy harmadik, 45 órás tenyésztés és ellenőrzés után hat transzformánst választottunk ki és tisztítottunk meg az 5.2. példa szerint.
5.4. példa
A PG-II-transzformált A. niger törzsek genomjának vizsgálata
Az 5.2. és 5.3. példák szerint kapott transzformánsokat és a vadtípus-törzset (N402) 0,5% élesztőkivonattal, 0,2% kazaminosavval, 50 mmol glükózzal és 6 g/1 nátrium-nitrittel kiegészített minimál-tápfolyadékban tenyésztettük 18 órán át, 30 °C hőmérsékletén, majd a már ismertetett módon kivontuk a micéliumból a DNS-t, és megvizsgáltuk a kotranszformáns plazmidok jelenlétére.
pg kromoszóma-DNS-t emésztettünk 200 pl össztérfogatban; a reakcióelegy 50 mmol Tris-HCl-t, (pH=8,0), 10 mg magnézium-kloridot, 100 mmol nátrium-kloridot, 4 mmol spermidint és 20-20 U EcoRIés Sall-nukleázokat tartalmazott. 2 óra inkubálás (37 °C) után újabb 20-20 U nukleázt adtunk az elegyhez, és tovább inkubáltuk még 2 órán át. Ezután többször extraháltuk 100-100 pl kloroformmal, a vizes fázisból kicsaptuk a DNS-t 3 mol-os nátrium-acetát-pufferrel (pH=5,2; 1/10 térfogat) és 2,5 térfogatnyi etanollal, a DNS-t kicentrifugáltuk (1 óra, 4 °C), az üledéket levegőn megszárítottuk és 20 pl mintapufferben feloldottuk. Az emésztett DNS-mintákat Southem-blot technikával vizsgáltuk, minta-DNS-ként a már leírt, a pGW1800 plazmidból származó, 1,2 kbp BamHI-BglII fragmentumot használva.
A kotranszformáció gyakoriságát 75%-nál magasabbnak találtuk. Részletesebben 9 transzformánst vizsgáltunk meg. A minta-DNS az N402 törzs genomjában egy nagy fragmentummal hibridizálódott, a transzformánsokban pedig egy 4,1 kbp EcoRI-Sall fragmentummal, bár a hibrid-DNS sávjának intenzitása törzsenként változó volt. Az egyik transzformáns (N593/pGW1800-27) PG-II termelését részletesen megvizsgáltuk, és az eredményt a 6. példában mutatjuk be; a plazmidmásolatok számát hígítássorozattal meghatározva legalább 20 példányt találtunk ebben a törzsben. A vad típusú hibridizálódó fragmentum és a 4,1 kbp fragmentum mellett né30
HU 220 337 B hány kisebbet is találtunk, amelyek az integrálódás és átrendeződés során keletkezett határszekvenciák lehettek.
5.5. példa
A transzformált A. niger törzsek és az A. niger N402 poligalakturonáz-II termelése
Húsz, az 5.2. példában leírt, és hat, az 5.3. példában leírt pGW1800 transzformánst 4,2 g/1 karbamiddal, 1% almapektinnel (61,2% észterifikáltság) és 1% búzakorpával kiegészített minimál-táptalajban tenyésztettünk 30 °C-on, 43 órán át, rázott tenyészetben. A micéliumot szűréssel eltávolítottuk, és a szűrletet használtuk a vizsgálatokra.
A minták PG-II-tartalmát a Biorad használati utasítása szerint, alkalikus foszfatázzal kapcsolt Westemblot technikával vizsgáltuk. Az 5.2. példa szerint, random módon kiválasztott 20 törzs 70%-a, a litikus zóna alapján kiválasztott 6 törzs mindegyike lényegesen több PG-II-t termelt, mint az A. niger N402.
Az enzimaktivitást három transzformáns (N593/pGW1800-27, -30 és -37) és az N402 tenyészlevéből mértük. A transzformánsok az 5.2. példa szerint kiválasztottak közül valók.
Az N593/pGWl 800-30 és -37 a pGW1800 többszörös kópiáit tartalmazták, de kevesebbet, mint a -27. A törzseket 1% pektint és 1% szárított és őrölt cukorrépaszeletet tartalmazó tápfolyadékban, a fenti körülmények között tenyésztettük. A redukálócukrok és a PG-aktivitást gátló vegyületek eltávolítása érdekében a fermentlevet térhálósított algináton megszűrtük, majd 1 ml szűrletet 1 ml, 20 mmol-os nátrium-acetát-pufferrel (pH=4,2) felhígítottunk, és 2 ml-es, 5,2 ml/g térhálósított algináttal töltött oszlopra vittünk fel. Az oszlopot először 4 ml nátrium-acetát-pufferrel mostuk, majd újabb 4 ml, 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel leoldottuk az enzimet is. A PG-aktivitást a (2) szerint határoztuk meg, amiből visszaszámoltuk a fermentlé PG-tartalmát.
Az N402, N593/pGWl 800-30, -37 és -27 törzsek fermentlevének PG-aktivitása a tenyésztés 20. órájában rendre 2,2, 5,6, 5,8 és 10,8 U/ml, a tenyésztés 40. órájában pedig 2,8,13,7,16,4 és 30,9 U/ml volt.
Az eredmények alapján megállapítható, hogy a pGW1800 plazmid sikeresen használható az A. niger transzformálására a magasabb poligalakturonáz-termelés elérése érdekében.
5.6. példa
A transzformált A. niger törzsek és az A. niger N402 és N593 poligalakturonáz-I termelése
Tizenhét, az 5.2. példában leírt, és hat, az 5.3. példában leírt pGW1900 transzformánst, valamint az A. niger N402-t és az N593 egy pyr+ transzformánsát 4,2 g/1 karbamiddal, 1% almapektinnel (61,2% észterifikáltság) és 1% cukorrépaszelettel kiegészített minimál-táptalajban tenyésztettünk 30 °C-on, 64 órán át, rázott tenyészetben. A fermentléból a 20. és 39. órákban vettünk mintákat, amelyek PG-I-tartalmát az 5.5. példában leírt módon, Westem-blot technikával mértük.
A vizsgálat alapján a 23 transzformáns 65%-a jelentősen több PG-I-et termelt, mint az N402. Az aktivitásuk alapján kiválasztott 6 transzformáns mind több PGI-et termel a vad törzsnél, és négy közülük kifejezetten hipertermelő. A vizsgálatok azt is kimutatták, hogy ebben a tápközegben az aktivitás a 20. órában magasabb, mint a 39. órában. Tizenkét különböző transzformánst véve alapul, az aktivitásuk 2,8 és 7,0 U/ml között változott, míg az N402 és az N593/pGW635 transzformáns aktivitása rendre 0,5 és 0,8 U/ml volt.
6. példa
A hipertermelő N593/pGW1800-27 transzformáns PGII enzimjének izolálása, tisztítása és jellemzése
6.1. példa
Tenyésztési körülmények a PG-II előállításához
Az 5.4. példában leírt N593/pGW1800-27 transzformánst komplett táptalajon, Petri-csészékben tenyésztettük 30 °C-on 3-4 napig, ekkor a telepekről a konídiumokat csészénként 5 ml, 0,005% Tween 80-at tartalmazó fiziológiás sóoldattal lemostuk. A spóraszuszpenziót 20 percen át intenzíven kevertük, majd megszámlálás után 106 spóra/ml töménységben beoltottuk vele az 1 1es, szilikonozott Erlenmeyer-lombikban lévő 300 ml tenyésztő tápfolyadékot. A tenyésztő tápfolyadék 70 mmol ammónium-kloridot (nitrogénforrás), 1% almapektint (61,2% észterifikáltság) és 1% cukorrépaszeletet tartalmazó minimál-táptalaj volt. A tenyésztést rázva (200 fordulat/perc), 30 °C-on, 43 órán át végeztük, majd a micéliumot szűréssel eltávolítottuk. A szűrlet kémhatását 1 mol-os nátrium-hidroxid-oldattal pH=4,2-re állítottuk be, és 0,02% nátrium-azid hozzáadásával tartósítottuk.
6.2. példa
A PG-II tisztítása
Mintegy 2,5 1 fermentlevet vittünk fel egy 2,5x25 cm-es, 20 mmol-os nátrium-acetát-pufferrel (pH=4,2) ekvilibrált térhálósított alginátot tartalmazó kromatográfiás oszlopra. Az elúciót lépésenként, sorrendben az alábbi oldatokkal végeztük: egy oszloptérfogatnyi ekvilibráló puffer, ugyanannyi 20 mmol-os nátrium-acetát-puffer (pH=5,6), 1200 ml lineáris NaClgradiens (0-0,5 mól) ugyanabban a pufferben és végül 275 ml 1 mol-os NaCl-oldat ugyancsak abban a pufferben. A frakciókat 6 ml-enként fogtuk fel, és megmértük bennük az enzim aktivitását az 1.1. példa szerint. Az aktív frakciókat egyesítettük, és háromszor dializáltuk 20 mmol-os bisz-Tris-HCl-pufferrel (pH=6,0) szemben, majd a kapott, 475 ml oldatot egy DEAE-Sepharose Fást Flow oszlopra vittük fel, amit előzőleg ugyanazzal a pufferrel ekvilibráltunk. Mosás után a leoldást NaCl-gradienssel végeztük; az enzimet körülbelül 100 mmol-nál kaptuk meg. Az aktív frakciókat SDSpoliakrilamid gélelektroforézissel analizáltuk, majd a magas enzimtartalmúakat egyesítettük (54 ml), a fenti bisz-Tris-pufferrel szemben dializáltuk, és tovább tisztítottuk ugyanazon pufferrel ekvilibrált Mono Q oszlopon. Az elúciót 0-1 mol-os NaCl-gradienssel végeztük; az oldatot két, önkényesen meghatározott frakcióban (0,2-0,26 mól NaCl=A frakció, 0,26-0,34 mól
HU 220 337 Β
NaCl=B frakció) fogtuk fel. Mindkét frakció egy éles fehérjesávot tartalmazott a PG-II-vel azonos pozícióban.
6.3. példa
A PG-II N-terminális részének aminosavszekvenciája
5 asp-ser-X-thr-phe-thr-thr-ala-ala15 ala-lys-ala-gly-lys-ala-lys-X-serAz eljárás a ciszteint nem mutatja ki, így csak valószínűsíteni lehetett a 3. és 18. aminosavakat (lásd 1.3. példa). Az utolsó három aminosav csak igen gyenge jelet adott.
A fenti szekvencia teljesen megfelel a PG-II gén nukleotidszekvenciájából levezethető aminosavsorrendnek (lásd 4. példa és 4. ábra); a nukleotidszekvencia a 3. és 18. pozíciókra ciszteint ad. Az eredmény az 5 kd-s cianogén-bromid-fragmentumból meghatározott aminosavszekvenciával (1.3. példa) is megegyezik.
6.4. példa
A PG-II jellemzése
A 6.2. példa szerint izolált és tisztított enzimet összehasonlítottuk a Rapidase-ból izolált enzimmel (1.1. példa). Mindkét enzim SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel mért molekulatömege 38 kd, és mindkettő azonos módon reagált a PG-II-re specifikus antitesttel. Azonos a két enzim izoelektromos pontja (pl=5,2), és a körülötte látható, a mikroheterogenitások által okozott mintázat is megegyezett.
7. példa
A poligalakturonáz-11 génhez hasonló szekvenciák kimutatása és izolálása
7.1. példa
A PG-II génhez hasonló szekvenciák kimutatása
Az A. niger NW756 DNS-ét a már leírt módon izoláltuk, majd BamHI- és EcoRI-nukleázokkal, illetve a két enzim keverékével emésztettük az 5.4. példában leírt módon. A fragmentumokat 0,6%-os agarózgélben szeparáltuk, majd nitrocellulóz-membránra vittük át a 3.7. példa szerint. A besütött membránokat előhibridizáltuk 60 °Con, 2 órán át, előmelegített hibridizáló pufferrel [1% BSA, 1 mmol EDTA, 0,5 mol-os nátrium-foszfát-puffer (pH=7,2), 7% SDS; Church és Gilbert (38); 0,1 mg/ml frissen denaturált heringsperma-DNS], majd a pGW1800 1,2 kbp BamHI-BglII fragmentumát (3.7. példa) adtuk az elegyhez, és folytattuk a hibridizálást 60 °Con, rázva, 44 órán át. A membránt ezután kétszer mostuk 60 °C-os hibridizáló pufferrel (heringsperma-DNS nélkül) 10-10 percig, majd 20 percig 5 x SSC pufferrel, ami 0,1% SDS-t és 0,1% nátrium-pirofoszfátot is tartalmazott. Ezután a membránt megszárítottuk, és Kodak XAR5 filmet exponáltunk vele -60 °C-on, 3 napon át.
A fenti körülmények között nem figyeltünk meg aspecifikus hibridizációt; a jelenségért a hibridizálódó
Az A és B frakciókat egyesítettük, majd 200 pg enzimet tartalmazó mennyiséget háromszor dializáltunk desztillált vízzel szemben és liofílizáltuk. Az aminosavszekvencia meghatározását az 1.3. példában leírt módon végeztük; az N-terminális szekvencia a következő:
-ile
DNS-fragmentumok jelentősebb méretű „szennyező” szakaszainak hiánya, illetve a minta és a fág eredetű szakaszok közötti hibridizáció hiánya a felelős. Ugyanakkor minden futtatásban számos, erősebben-gyengébben hibridizálódó sáv volt látható, amelyek közül egy 3,3 kbp BamHI-, egy 20 kbp-vel nagyobb EcoRI- és egy 3,3 kbp BamHI/EcoRI kettős fragmentum voltak a legerősebbek. Az alacsony intenzitású sávok a következők voltak: 17, 9,5, 6,4 és 2,0 kbp a BamHI-, 15, 12,
6,5 és 4,8 kbp az EcoRI-, 7,6, 6,4, 4,0 és 2,0 kbp a BamHI/EcoRI kettős emésztés esetén.
Miután lényegében csak specifikus hibridizációt találtunk, megállapíthatjuk, hogy az A. niger N400 PG-II génje alkalmas specifikus szekvenciák keresésére az A. niger NW756 DNS-ében. Az erősen hibridizálódó fragmentumokról feltételezhető, hogy a PG-II gént hordozzák. A gyengén hibridizálódó fragmentumok elvben úgy keletkezhetnek, hogy az emésztésre használt enzimek a DNS-t a homológ szakaszok közepén vagy végükhöz közel hasítják el, de ennek itt ellentmond a nagyméretű hibridizálódó fragmentumok nagy száma. Az egyetlen magyarázat az lehet, hogy a specifikus DNS-szekvenciák egy része csak homológ, de nem identikus a PG-II génnel; ezek a szekvenciák más PG génekből származhatnak, amelyek jelenléte és homológ volta összhangban van a különböző PG-k jelenlétével és fehéijeszinten is megnyilvánuló homológiájával.
7.2. példa
A pgall génhez hasonló gének izolálása
Az A. niger N400 génkönyvtárából mintegy 104 fágot szélesztettünk öt lemezen E. coli LE392 baktériumra, majd minden lemezről három nitrocellulózreplikát készítettünk a 3.4. példában leírt módon (a harmadik lemezt 5 percig inkubáltuk a lemezen). Az első és második membránt heterológ körülmények között, a harmadikat homológ körülmények között kezeltük tovább. Az előhibridizálást, hibridizálást és mosást a heterológ körülmények között 60, a homológ körülmények között 68 °C hőmérsékleten végeztük. A besütés után az eljárást a 3.4. példában leírt módon végeztük, a minta-DNS a pGW1800 1,2 kbp BamHI-BglII fragmentuma volt. Homológ körülmények között a membránokat először kétszer fél órán át mostuk 2xSSC-ben (0,1% SDS, 0,1% nátrium-pirofoszfát), majd kétszer fél órán át 0,2 x SSC-ben (azonos adalékok). Heterológ körülmények között a mosás kétszer fél órán át hibridizáló pufferrel, majd fél órán át 4 x SSC-vel (0,1% SDS,
HU 220 337 Β
0,1% nátrium-pirofoszfát) és fél órán át 2xSSC-vel (ugyanazon adalékok) történt. Szárítás után a membránokkal Kodak XAR5 filmet exponáltunk -60 °C-on, napig, majd a pozitív jelet adó fágokat a 3.4. példa szerint izoláltuk.
A homológ körülmények között kezelt membránokon 7 pozitív jelet kaptunk, amelyek mind jelen voltak a heterológ körülmények között kezelt membránokon is: ezek a rekombináns fágok hordozzák a PG-II gént. Ezeken kívül még 30 pozitív jel volt a heterológ körűimé- 10 nyék között kezelt membránokon, amelyek erőssége változó volt. Ezen jelek többségét olyan fágoktól kaphattuk, amelyek más, a PG-II-től eltérő PG géneket hordoznak.
Az A. niger N400 génkönyvtárat másodszor is megvizsgáltuk a fent leírt módon, kivéve a hibridizálás hőmérsékletét, ami 62 és 68 °C volt. A mosás igen szigorú körülmények között történt ugyanilyen hőmérsékleteken : kétszer 5 perc, majd kétszer fél óra 4 x SSC-ben, utána kétszer fél óra 2 χ SSC-ben, ahol minden oldat 0,1% SDS-t és 0,1% nátrium-pirofoszfátot is tartalmazott. 20
A homológ körülmények között (68 °C-on) kezelt membránokon öt erősen pozitív jelet találtunk, amelyek jelen voltak a heterológ körülmények között (62 °C-on) kezeiteken is. Az egyik ilyen fág restrikciós analízise kimutatta, hogy az inszert a pgall gént tártál- 25 mázzá, ez tételezhető fel tehát a másik négyről is.
A heterológ körülmények között 17 pozitív jelet találtunk, amelyek intenzitása változó volt.
Ez első vizsgálatból 16, a másodikból 10 olyan fágot választottunk ki további vizsgálatra, amelyek 30 nem a pgall gént hordozzák. Ezeket a korábban leírtakkal azonos módon megtisztítottuk és megvizsgáltuk: az eredményeket a 7. táblázatban mutatjuk be (kihagytuk a 2, 3, 7, 31, 33, 40, 41 és 42 jelzésű fágokat). Az 1-30 jelzésű fágok az első vizsgálatból, a magasabb 35 számmal jelöltek a második vizsgálatból származtak.
Annak kimutatására, hogy mely fágok hordozzák a PG-I gént, és melyek a PG-II gént és a hozzá hasonló szekvenciákat, a tarfoltokból izolált egyes fágokat a pGW1900 1,8 kbp HindHI fragmentumával (3.9. pél5 da) hibridizáltuk. A hibridizalást és a mosást egyaránt 62 °C-on végeztük; a mosópuffersorozat minden tagja (4xSSC, 2xSSC, lxSSC, 0,5xSSC, 0,2xSSC és 0,lxSSC) 0,1% SDS-t és 0,1% nátrium-pirofoszfátot tartalmazott, és fél-fél órán át inkubáltunk minden pufferben. A fágok közül a 2, 3, 7, 40, 41 és 42 jelzésűek adtak olyan erős hibridizációs jelet, amely összemérhető volt a pgal gént hordozó PG-I-lambda-7 fág hibridizációs jelével (3.6. példa). A fenti fágok egyikéből nyert DNS restrikciós analízise is megerősítette, hogy 15 az a fág a pgal gént tartalmazó inszertet hordoz, tehát feltételezhetjük, hogy mind a hat a PG-I gént tartalmazza. A többi fág (1, 8, 31, 33, 35, 36, 37, 38 és 43) - ha egyáltalán - csak gyenge hibridizációt mutatott, így ezek a fágok biztosan nem hordozzák a pgal gént.
Annak eldöntésére, hogy mely fágok tartalmaznak azonos fragmentumokat, az 5. táblázatban feltüntetett fágokból izoláltuk a DNS-t (3.5. példa), és emésztettük a 3.6. példa szerint. A kapott fragmentumokat Southemblot technikával azonosítottuk (a HinfI- és HincIIemésztések elválasztásához a gélagaróz-tartalmat 1%-ra emeltük), majd hibridizáltuk 60 °C hőmérsékleten a pGW1803 plazmid 1,2 kbp BamHI/EcoRI-fragmentumával a fent leírt körülmények között. A fágok osztályozására alkalmas restrikciós enzimek a BamHI és BglII, valamint a HinfI és HincII kombinációi, de az utóbbi két enzimet önmagukban is használhatjuk. A HincII és Hinfl rendesen kisebb restrikciós fragmentumokat adnak, amely ebben az esetben a minimumra csökkenti annak az esélyét, hogy a hibridizalódó fragmentumok az EMBL4 vektorból származzanak és ne a pgall génhez tartozó szekvenciákból.
5. táblázat
4 fágok osztályai
A B Ca D E F Gb
Besorolt fágok 9, 10, 43 4, 35, 36 1, 16, 20, 37 8, 11, 12 6, 38 5 17, 27
Restrikciós enzimek Fragmentumok hossza (kbp)
HincII 1,25 2,4 1,75 1,3 0,4 1,3 0,78 0,78 2,31
Hinfl 0,7 0,3 1,1 1,28 1,8 1,8 0,65 0,6
BglII/BamHI 7,2(10) 0,56 3,1(4) 8,7(20) 1,7 4,1(6) >23 3,0(17) 4,9(27)
Sáli 6,9 n. k. 6,8 (16; 20) 1,3 0,5 n. k.
aA 16 és 20 fágokból meg egy 1,64 kbp KpnI és egy 1,38 kbp HincII/KpnI-fragmentum is keletkezett. bA G-osztályú fágok csak gyengén hibridizálódtak a PG-II génnel heterológ körülmények között, n. k. nem - kimutatható
HU 220 337 Β
A 7. táblázatban bemutatott adatokból világosan látható, hogy az osztályok többségébe több, egymástól függetlenül izolált fág tartozik. Figyelembe véve, hogy eredetileg csak azokat a fágokat választottuk ki, amelyek az összes hibridizációs jelet mutatták, az egyes osztályokba tartozó fágok száma (A: 3, B: 3, C: 4, D: 3, E; 2) arra utal, hogy a különböző gének hasonló gyakorisággal fordulnak elő. A PG-I gén esetében ez a szám magasabb (6 a 26-ból), bár a PG-II gént hordozó fágok aránya hasonló volt (12 az 59-ből). A G-osztályú fágok mind a PG-I, mind a PG-II génekkel igen gyengén hibridizálódtak. A két hibridizálódó fragmentum (3,0 és 4,9 kbp) mellett a 17 és 27 fágokból számos, nem hibridizálódó fragmentum is keletkezett, amelyek mindkét fágban azonosak: ilyenek az 5,6, 5,1, 1,45 és 0,57 kbp BglII/BamHI-ffagmentumok, de a HincII és Hinfl restrikciós enzimekkel emésztve is mindkét fágból csaknem azonos fragmentumok keletkeztek.
Az ebben a példában izolált fágokat a továbbiakban a következő módon jelöltük:
Osztály Szám Új név
A 9 lambda-PG-A9
10 lambda-PG-A10
43 lambda-PG-A43
B 4 lambda-PG-B4
35 lambda-PG-B35
36 lambda-PG-B36
C 1 lambda-PG-Cl
16 lambda-PG-C16
20 lambda-PG-C20
37 lambda-PG-C37
D 8 lambda-PG-D8
11 lambda-PG-Dll
12 lambda-PG-D12
E 6 lambda-PG-E6
38 lambda-PG-E38
F 5 lambda-PG-F5
G 17 lambda-PG-G17
27 lambda-PG-G27
Nem besorolt 31 lambda-PG-X31
Nem besorolt 33 lambda-PG-Y33
7.3. példa
A PG-C gén (pgaC) szubklónozása: a pGW1910 plazmid létrehozása
A lambda-PG-C20 fágot BglII-nukleázzal emésztettük, és a kapott fragmentumokat agarózgélen elválasztottuk. A hibridizálódó 7,8 kbp BglII-ffagmentumot tartalmazó gélsávot kivágtuk, és a fragmentumot izoláltuk a 3.6. példában leírt módon, majd ligáltuk a BamHInukleázzal emésztett és CIP-vel (boíjúbél-foszfatáz) kezelt pUC9 vektorba. A ligációs keverékkel az E. coli JM109 törzsét transzformáltuk (3.6. példa). A kapott fehér telepek közül többet ampicillint tartalmazó YTagarra oltottunk, majd 16 órás inkubáció után a telepeket nitrocellulóz-membránra vittük át. A membránon a baktériumsejteket lizáltuk, és a felszabadult DNS-t besütöttük a membránba [Maniatis és munkatársai (6), 314. oldal]. A besütött membránt 2xSSC-vel megnedvesítettük, és finoman ledörzsöltük róla a sejtmaradványokat, majd a membránokat hibridizáltuk a pGW1803 plazmid 1,2 kbp BamHI-EcoRI fragmentumával, heterológ körülmények között (7.2. példa; 60 °C, mosás 2xSSC-vel). A pozitív kiónokat kiválasztottuk, és a plazmid-DNS-t a leírt módon megtisztítottuk, majd elkészítettük a restrikciós térképét.
Az új plazmidot ezen a módon hoztuk létre. A pGW1910 plazmid (7. ábra) a lambda-PGC20 7,8 kbp BglII-fragmentuma a pUC9 vektor BamHI helyére inszertálva. Ez a szubklón a lambda-PG-C20 fág hibridizáló fragmentumait, azaz az 1,1 kbp Smalés 1,6 kbp Kpnl-fragmentumait hordozza. Az említett fragmentumok helyzete a pGW1910 fizikai térképén arra utal, hogy ez a plazmid a teljes pgaC gént hordozza.
8. példa
A BDBB emberi hibrid interferon kifejeződése a PG-II promoter szabályozóhatása alatt
8.1. példa
A pGII-IFN AMI 19 prekurzor plazmid létrehozása
A pGW1800 plazmidot EcoRI-gyel emésztettük és T4 polimerázzal kezeltük. Az így kapott DNS-t újra ligáltuk és az E. coli DH5aF’ törzset transzformáltuk vele, majd izoláltuk a pGW1800-E plazmidot, amely csak abban különbözik a pGW1800 plazmidtól, hogy hiányzik belőle az EcoRI restrikciós hely.
A pGW1800-E plazmidot BglII-vel emésztettük, és baktérium alkalikus foszfatázzal (BRL) kezeltük 50 mmol nátrium-kloridot tartalmazó 50 mmol-os TrisHCl-pufferben (pH=8,0), 1 órán át, 65 °C hőmérsékleten. Az alkalikus foszfatázt proteináz-K-val (Boehringer) inaktiváltuk, az elegyet fenollal extraháltuk, a DNS-t etanollal kicsaptuk, megszárítottuk és vízben visszaoldottuk, majd a ragadós végeket T4 polimerázzal kitöltöttük.
A pJDB207-IFN AMI99 plazmidot (EP 205 404 szabadalmi leírás) HindlII- és Clal-nukleázokkal emésztettük, majd a lineáris fragmentumok végeit T4 polimeráz segítségével kitöltöttük 0,1-0,1 mmol dCTP-, dGTP-, dATP- és dTTP-nukleotidokkal 67 mmol-os Tris-HCl-pufferben (pH=7,5; 6,7 mmol MgCl2, 16,7 mmol (NH4)2SO4, 5 mmol DTT, 30 perc, 37 °C). A reakciót 5 perces melegítéssel (65 °C) állítottuk le; a fragmentumokat 0,8%-os agarózgélen elválasztottuk, izoláltuk az IFN AMI 19 kódolószakaszát hordozó, 1 kbp fragmentumot, a DNS-t Elutip D oszlopon (Schleícher & Schüll) megtisztítottuk és etanollal kicsaptuk [Schmitt és Lohen (34)].
100 ng IFN AMI 19 fragmentumot és előkészített pGW1800-E plazmidot 5 μΐ 20 mmol-os Tris-HClpufferben (pH = 7,5; 10 mmol MgCl2, 10 mmol DTT, 1 mmol ATP, 1 U T4 DNS-ligáz) ligáltunk 2 órán át, szobahőmérsékleten. A keverékkel fogékony E. coli DH5aF’ sejteket transzformáltunk, az ampicillinrezisztens transzformánsokat restrikciós analízissel megvizsgáltuk, és kiválasztottuk a pGII-IFN AMI 19 prekurzort hordozókat.
HU 220 337 Β
8.2. példa
A pGII-IFN AMI 19 és a pGIIss-IFN AMI 19 létrehozása PCR-rel (4. és 5. ábra)
A PCR-módszert Horton és munkatársai (35) nyomán végeztük el, és az 5. ábrán mutattuk be.
A pGW1800 plazmidot Xbal-nukleázzal linearizáltuk, a DNS-t etanollal kicsaptuk, vízben felszuszpendáltuk, és 100 ng DNS-sel kezdtük meg a láncreakciót az A és B nukleotidokkal. A reakciót egy automatikus, ciklikus hőmérsékletű termosztátban végeztük: 25 ciklus (1 perc 94 °C-on, 2 perc 40 °C-on és 3 perc 72 °C-on) után az elegyet 10 percig tartottuk 72 °C-on. A reakciókat 100 pl térfogatban, minden oligonukleotidból 100 pmollal és 0,5 pl Taq polimerázzal (Perkin Elmer Cetus) végeztük a gyártó által ajánlott pufferben. így kaptuk a DNS-1 jelzésű molekulát.
A pGW1800 plazmidot az A és C oligonukleotidokkal kezelve kaptuk a DNS-2 molekulát.
A DNS-3 és DNS-4 molekulákat úgy kaptuk, hogy a pJDB207-IFN AMI 19 plazmidot BamHI-nukleázzal linearizáltuk, majd a D és F, illetve az E és F oligonukleotidokkal végeztük a láncreakciót.
A reakcióelegyeket etanollal csaptuk ki, a DNS-t vízben visszaoldottuk, és egy mintát gélektroforézissel megvizsgáltunk a fragmentumok koncentrációjának meghatározására.
A fentiekkel azonos körülmények között végezve a reakciót, a DNS-1-ből és DNS-4-ből az A és F oligonukleotidokkal a DNS-5-öt, a DNS-2-ből és DNS-3ból ugyanazon oligonukleotidokkal pedig a DNS-6-ot kaptuk (5. ábra).
A DNS-5 egy BamHI restrikciós hellyel kezdődik, egy EcoRI-hellyel végződik, és egy teljes fúziós egységet tartalmaz, amelyben az eredetileg kezdő metioninkodonnal kapcsolódik egy PG-II promoterfragmentum a BDBB hibrid interferon kódolószakaszához.
A DNS-5 BamHI-EcoRI fragmentumát az ugyanezen nukleázokkal felnyitott pGII-IFN AMI 19 prekuizor plazmidba ligáivá kaptuk a pGII-IFN AMI 19 plazmidot.
Hasonló módon eljárva, a DNS-6 BamHI-EcoRI fragmentumát a prekurzor plazmidba ligáivá, kaptuk a pGIIss-IFN AMI 19 plazmidot. Az inszert a PG-II jelző- és promoterszekvenciáit tartalmazza a BDBB hibrid interferon kódolószakaszához kapcsolva.
8.3. példa
Az A. niger An8 mutáns törzs kotranszformálása a pCG59D7 és pGIIss-IFN vagy pGII-IFN plazmidokkal
Az uridin-auxotrof A. niger An8 mutánst (közel azonos az EP 278 355 szabadalmi leírásban szereplő, DSM 3917 jelzésű mutánssal) a pCG59D7 és a pGIIss-IFN vagy a pGII-IFN AMI 19 plazmidokkal kotranszformáltuk, hogy uridin-prototróf törzseket kapjunk.
Az An8 törzsét komplett táptalajon tenyésztettük 4 napon át, majd a tenyészetről nyert konidiospórákkal (2 · 108) 200 ml, 1 g/1 argininnel és uridinnel kiegészített minimál-tápfolyadékot oltottunk be. 20 órás inkubálás (28 °C, 180 fordulat/perc) után a micéliumot szűréssel kinyertük, kétszer mostuk 10-10 ml, 50 mmol kalciumkloridot tartalmazó 0,8 mol-os kálium-klorid-oldattal, majd felszuszpendáltuk a fenti oldat 20 ml-ében, ami 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) sejtfalbontó enzimet is tartalmazott. A keveréket addig inkubáltuk rázott vízfürdőn (30 °C, 50 fordulat/perc), amíg elég protoplaszt nem képződött: ez 90-120 percet vett igénybe a mikroszkóppal végzett ellenőrzés szerint. A micéliumtörmelék eltávolítása érdekében az elegyet szűrőbe tett üveggyapoton szűrtük. A protoplasztokat centrifügálással (2000 fordulat/perc, 10 perc) ülepítettük szobahőmérsékleten, kétszer mostuk 10-10 ml inkubálóoldattal, majd ugyanazon oldat 200-500 μΐ-ében felszuszpendáltuk 108 μΐ végkoncentrációban.
A transzformációhoz a fenti szuszpenzió 200 μΐ-es térfogatait használtuk, amelyeket 50 μΐ PCT pufferben [10 mmol Tris-HCl (pH=7,5), 50 mmol CaCl2, 25% PEG 6000] szuszpendált 5 mg pCG59D7 és 50 mg pGIIss-IFN AMI 19 vagy pGII-IFN AMI 19 plazmidokkal inkubáltunk. A keveréket 20 percig jégen tartottuk, 2 ml PCT-t adtunk hozzá, 5 percig állni hagytuk szobahőmérsékleten, ezután 4 ml, 50 mmol kalcium-kloridot tartalmazó 0,8 mol-os kálium-klorid-oldattal összekevertük, és az így kapott szuszpenziót 1 ml-es adagokban 1 g/1 argininnel kiegészített és 0,8 mól káliumkloriddal stabilizált, 1% agart tartalmazó minimál-táptalajhoz kevertük. A szuszpenziókat azonnal ugyanazon táptalajból készült lemezekre öntöttük és 30 °C-on inkubáltuk. 2-3 nap tenyésztés után a sikeres kotranszformánsok erélyesen növekedő és sporuláló telepek formájában emelkedtek ki a több száz, alig fejlődő, feltételezhetően abortív transzformánsok hátteréből.
8.4. példa
A BDBB hibrid interferon gén kifejeződése a PG-II promoter szabályozóhatása alatt
A 8.3. példa szerint létrehozott kotranszformánsokat izoláltuk, és megvizsgáltuk interferontermelő képességüket. Az interferon aktivitását Annstrong szerint [Appl. Microbiol., 21. 732 (1971)], CCL-23 emberi sejtvonallal és a vezikuláris sztomatitisz (hólyagos szájnyálkahártya-gyulladás) vírusával mértük.
A transzformánsokból egyenként előtenyészeteket indítottunk 50-50 ml tápfolyadékban [3 g/1 Pectin Slow Set L (Unipectin SA, Redon, Franciaország), 2 g/1 NH4C1, 0,5 g/1 KH2PO4, 0,5 g/1 NaCl, 0,5 g/1 MgSO4.7H2O, 0,5 g/1 CaSO4.2H2O, 10 g/1 arginin, pH=7,0], A rázott (250 fordulat/perc) tenyészeteket 72 órán át inkubáltuk 28 °C hőmérsékleten, majd 10 ml-ükkel indítottuk a főtenyészeteket (50 ml, 20 g/1 szójaliszt, 5 g/1 Pectin Slow Set L, 10 g/1 arginin), amelyeket 72-96 órán át inkubáltunk rázva (250 fordulat/perc), 28 °C hőmérsékléten.
A tenyészetekből minden 20. órában mintákat vettünk, a sejteket centrifugában leülepítettük, liofilizáltuk és szárazon eldörzsöltük, majd mind a fermentlevet, mind a sejtek extraktumát megvizsgáltuk interferonaktivitásra az említett módszerrel. Az interferon zömét a fermentlébe szekretálva találtuk a pGIIss-IFN AMI 19 plazmiddal transzormált vonalak esetében, míg a pGIIIFN AMI 19 plazmiddal transzformált vonalak esetében az interferont a sejtek tartalmazták.
HU 220 337 Β
9. példa
Transzformált A. nidulans törzsek PG-I és PG-II termelése
9.1. példa
Az A. nidulans G191 transzformálására használt plazmidok szaporítása és tisztítása
A pGW635 plazmidot az E. coli MH1 törzsében, a pGW1800 plazmidot a JM109, a pGW1900 plazmidot pedig a DH5aF’ törzsben szaporítottuk.
9.2. példa
Protoplasztok készítése és transzformálás
Az A. nidulans uridin-auxotrof mutáns törzsét (G191, pyrG, pabaAA, fwM, uaY9) Ballance és Tumer (27) írták le. A gombát 37 °C hőmérsékleten, az
5.2. példa szerint, az A. nigerrel azonos módon tenyésztettük, kivéve, hogy a tápközeg 2 mg/1 p-amino-benzoesavat is tartalmazott. A protoplasztokat szintén a már leírt módon állítottuk elő; a transzformáláshoz 5 · 106 pro- 20 toplasztot használtunk 200 pl STC-ben, amihez 1 pg pGW635 és 20 pg pGW1800 vagy 25 pg pGW1900 plazmidot adtunk. A transzformánsok kitenyésztését 3 napig, 37 °C-on végeztük.
A kotranszformációs kísérletben körülbelül 50 transzformánst kaptunk 1 pg pGW635 plazmidra vonatkoztatva, amelyek közül minden kísérletből 20 transzformánst tisztítottunk tovább 50 mmol glükózt tartalmazó minimál-táptalajon.
9.3. példa
A transzformált A. nidulans törzsek PG-I és PG-II termelésének vizsgálata Westem-blot technikával
A 9.2. példa szerinti kotranszformánsokat 75 ml, mg/ml p-amino-benzoesavat, 7,5 g/1 ammónium- 35 nitrátot, 1% almapektint és 1% cukorrépaszeletet tartalmazó minimál-tápközegben tenyésztettük, amit 105 konidiospóra/ml inokulummal indítottunk. A rázott (250 fordulat/perc) tenyészeteket 30 °C hőmérsékleten tartottuk.
A 43. és 68. órákban vett mintákat centrifugáltuk, majd a felülúszót 4 °C-on 5 mmol-os, 0,02% nátriumazidot is tartalmazó nátrium-foszfát-pufferrel (pH=6,5) szemben dializáltuk egy éjszakán át. A minták PG-II tar5 talmát Westem-blot technikával, poli- vagy monoklonális antitestek segítségével vizsgáltuk. A kontrollként használt A. nidulans minták nem tartalmaztak a PG-IIre specifikus monoklonális antitesttel keresztreakciót adó anyagot.
Mind a húsz vizsgált transzformáns termelt PG-II-t, bár a termelés foka változó volt. Az elvárt (38 kd) molekulatömegű főtermék mellett számos, alacsonyabb molekulatömegű sav is volt látható, amelyek lebomlási termékek lehettek. A legtöbb enzimet termelő transzfor15 máns az A. nidulans G191/pGW1800-13 jelzésű volt, amelynek poligalakturonáz-aktivitását különböző táptalajokban vizsgálva a 6. táblázatban mutatjuk be.
Mivel a G191/pGW1800-13 transzformáns pektin nélkül is magas szinten termel poligalakturonázt, megvizsgáltuk a többi G191/pGW1800 törzset is. Ennek érdekében a 19 törzset és a G191/pGW635-l transzformánst 15 g/1 kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,4% ammónium-kloridot és 5% glükózt tartalmazó minimál-tápközegben tenyésztettük, és a 46. és 69. órákban vett fermentlémintákat minden előkészítés nélkül megvizsgáltuk Westem-blot technikával, monoklonális antitestet használva. A 19 A. nidulans G191/pGW1800 transzformáns közül 17 termelt PG-II-t, míg a G191/pGW6351 törzs nem. Az a tény, hogy az A. niger N402 törzséhez képest - amelyet pedig PG-termelést indukáló körülmények között tenyésztettünk - igen erős jelet kaptunk, arra utal, hogy az A. nidulans transzformánsai magas szinten termelik a PG-II enzimet. Megvizsgáltuk ezért az A. nidulans G191/pGW1800-13, hat másik G191/pGW1800 transzformáns és a G191/pGW635-l enzimtermelését induktív körülmények között is - a glükózt 1% pektinnel és 1% répaszelettel helyettesítve -, és azt találtuk, hogy még több PG-II-t termeltek, míg a G191/pGW635-l ilyen körülmények között sem produ40 kált poligalakturonázt.
6. táblázat
Az A. nidulans G191/pGW1800-13 transzformáns és a G191 anyatörzs poligalakturonáz-termelése. A tenyészetek 106 spóra/ml inokulummal indultak 30 °C-on; a tápközeg 15 g/1 kálium-dihidrogén-foszfátot és 1 g/1 élesztőkivonatot tartalmazó minimál-tápközeg volt az alább feltüntetett szén- és nitrogénforrásokkal.
Törzs C-forrás N-forrás Idő (óra) PG (U/ml)
G191 3% glükóz 1%NH4C1 40 n. k.
G191/pGW635-l 3% glükóz 1%NH4C1 40 n. k.
G191/pGW1800-13 3% glükóz 1%NH4C1 40 120
G191 1% pektin +1% répaszelet 1% NH4C1 40 n. k.
G191/pGW1800-13 1% pektin +1% répaszelet 1%NH4C1 40 130
A pGW1900 plazmiddal kapott kotranszformánsokat két különböző tápközegben tenyésztettük. Az első alapja a magas foszfáttartalmú (15 g/1 KH2PO4) minimál-tápközeg volt, amiben szénforrásként 1% almapek- 60 tint és 1% cukorrépaszeletet, nitrogénforrásként pedig vagy ammónium-kloridot (4,0 g/1), vagy karbamidot (4,2 g/1) használtunk. A második tápközeg szintén a magas foszfáttartalmú minimál-tápközeg volt, amiben
HU 220 337 Β élesztőkivonatot (1 g/1) és ammónium-kloridot (10 g/1), illetve glükózt (30 g/1) használtunk nitrogén-, illetve szénforrásként. Mindkét tápközeg tartalmazott 2 mg/1 pamino-benzoesavat is. A rázott (250 fordulat/perc) tenyészeteket 42 órán át inkubáltuk 30 °C-on; a mintákat 5 a 20. és 42. órákban vettük Westem-blot technikával, a PG-I-re specifikus poliklonális antitesttel vizsgálva az A. nidulans G191 nem termelt poligalakturonázt, míg a transzformánsok 75%-a jelentős mennyiséget produkált.
A karbamid helyett ammónium-kloridot használva magas foszfáttartalmú komplex táptalajban, számottevően csökkenthető a termelődő poligalakturonáz-I proteolitikus bomlása. A Westem-blot vizsgálat és a fermentléből végzett aktivitásmérés alapján a G191/ pGWl900-6 törzs több mint 1 g/1 enzimet termelt (7. táblázat), ha a PG-I 550 U/mg specifikus aktivitásával [Kester és Visser (1990)] számoltunk.
7. táblázat
Az A. nidulans G191/pGW1900-6 és a G191/pGW635-l transzformánsok poligalakturonáz-termelése. A tenyészetek 106 spóra/ml inokulummal indultak 30 °C-on; a tápközeg 15 g/1 kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó minimáltápközeg volt az alább feltüntetett szén- és nitrogénforrásokkal.
Törzs C-forrás N-forrás Idő (óra) PG (U/ml)
G191/pGW635-l 3% glükóz 0,4%NH4Cl 64 n. k.
G191/pGW635-l 1% pektin+1% répaszelet 0,4%NH4Cl 49 n. k.
G191/pGW635-l 1% pektin +1% répaszelet 0,4% urea 26 n. k.
G191/pGW1900-6 3% glükóz 0,4%NH4Cl 64 5
G191/pGW1900-6 1% pektin+1% répaszelet 0,4%NH4Cl 22 17
1% pektin +1% répaszelet 0,4%NH4Cl 26 125
1% pektin+1% répaszelet 0,4% NH4C1 49 570
G191/pGW1900-6 1% pektin+1% répaszelet 0,4% urea 22 125
1% pektin +1% répaszelet 0,4% urea 26 225
1% pektin+1% répaszelet 0,4% urea 49 140
A pgal és pgall gének glükóztartalmú tápközegekben még akkor sem fejeződnek ki az A. nigerben, ha a transzformánsban a gén többszörös másolatban van jelen. Az A. niger gének kifejeződése az A. nidulans transzformánsokban (például a G191/pGWl 900-6 és -10 vagy a G191/pGW1800-13 és -20 törzsekben) azt bizonyítja, hogy ebben a fajban a gének katabolitrepressziója ki lett kerülve. Ez azért sikerülhetett, mert a két faj katabolit-repressziós rendszere különböző lehet. Ez a jelenség lehetőséget ad arra, hogy egy kiválasztott A. niger poligalakturonáz gént egy idegen gazdaszervezetben, például az A. nidulansban olyan körülmények között fejeztessünk ki, amelyek az eredeti gazdaszervezetben gátolják a kifejeződést, és így gyakorlatilag tiszta enzimeket kapjunk.
10. példa
Az A. nidulans G191/pGW1800-13 transzformáns PGII enzimjének izolálása, tisztítása és jellemzése 10.1. példa
PG-II termelés a G191/pGW1800-13 törzzsel
Az A. nidulans G191/pGW1800-13 törzsét 100 mles tenyészetekben tenyésztettük magas foszfáttartalmú minimál-tápközegben, 1% pektin és 1% répaszelet jelenlétében. Ellenőrző tenyésztést alacsony és magas foszfáttartalmú minimál-tápközegben, 5% vagy 1% glükóz jelenlétében végeztünk; az A. niger N402 és az A. nidulans G191 ez utóbbi tápközegekben nem termelt PG-II-t (9.3. példa).
A tenyésztés 72. órájában vett mintákban, az 5% glükózt és magas foszfátszintet tartalmazó tápközegben az enzimaktivitás 860 U/ml, az alacsony foszfátszintet tartalmazó tápközegben 550 U/ml volt. Az 1% glükózt tartalmazó tápközegekben ennél lényegesen alacsonyabb enzimaktivitásokat mértünk, aminek az az oka, hogy a szénforrás kimerülése után (körülbelül 48 óra) a fehérjék újrafelhasználása fokozódik a tenyészetben. Alacsony foszfátszint és 1% glükóz esetén az enzimaktivitás a tenyésztés során végig alacsony maradt. A szekretált fehérje mennyisége 5% glükóz és magas foszfátszint mellett elérte az 1 g/1 értéket, és ez a fehéije az SDS-gélektroforézis szerint azonos volt az A. niger PGII enzimjével.
10.2. példa
A PG-II izolálása és tisztítása az A. nidulans G191/ pGW1800-13 fermentlevéből
Mintegy 2 1 fermentlevet (pH=4,9) ötszörösére hígítottunk desztillált vízzel, és a kémhatását pH=6,0-ra állítottuk be 2 mol-os nátrium-hidroxid-oldattal. Az enzim koncentrálása céljából az oldatot (a gyors átfolyás érdekében egy Büchner-tölcsérben) 600 ml, 20 mmol-os kálium-foszfát-pufferrel (pH=6,0) ekvilibrált DEAE-Sephadex A-50 oszlopra vittük fel, ahol a teljes enzimmennyiség adszorbeálódott. A leoldást 300 ml, 1 mol-os nátrium-klorid-oldattal végeztük; a visszanyerés csak 65%-os volt. Az enzimet ezután 10 mmol-os bisz-Tris pufferrel (pH=6,0) szemben dializáltuk, majd 60 ml-es, ugyanezzel a pufferrel ekvilibrált DEAE-Sepharose Fást
HU 220 337 Β
Flow oszlopra vittük fel. Az elúciót nátrium-klorid-gradienssel végeztük: az enzim körülbelül 0,15 mol-nál oldódott le, a kitermelés 57% volt.
10.3. példa
A tisztított PG-II jellemzése
A 10.2. példa szerint kapott PG-II-t az 1.1. példa szerint, a Rapidase-ból tisztított PG-II-vel hasonlítottuk össze. SDS-poliakrilamid gélektroforézissel vizsgálva mindkét enzim molekulatömege 38 kd-nek bizonyult, és mindkettő azonos módon reagált a 6.4. példa szerinti mono- és poliklonális antitestekkel. Izoelektromos fokuszálással vizsgálva az A. nidulans enzimjének izoelektromos pontja pl=5,2, de az enzim főtömege mellett csak egy kis sáv volt látható, szemben a Rapidaseenzim számos mikro-heterogenitásával.
A két enzim reakciójának kinetikáját a módosított ferri-cianidos módszerrel, 0,075 mol-os nátrium-acetátpufferben (pH=4,2), 25 °C hőmérsékleten mértük 0,2-1,0 mg/ml poligalakturonát-koncentrációk mellett. A Rapidase®-ból nyert PG-II telítési koncentrációja (Vmax) 2760 U/mg fehérje volt, Michaelis-állandója (KM) 0,8 mg/ml poligalakturonát (USB), a transzformánsból nyert enzimé 3480 U/ml, illetve azonos volt. Végül a transzformánsból nyert enzimet cianogén-bromiddal fragmentáltuk az 1.3. példa szerint, és a kapott mintázat megegyezett a Rapidase-enzim mintázatával.
11. példa
Az A. niger NW756 pgall génjének kifejeződése a transzformált A. niger N95 3 törzsben
Az A. niger N593 transzformálására a pGW1756 plazmidot (3.10. példa) használtuk; a szelekciót biztosító vektor a pGW635 (5.2. példa) volt. Nyolc, véletlenszerűen kiválasztott transzformánst tisztítottunk meg a további vizsgálatok céljára. Ezeket minimál-tápközegben, 4,0 g/1 ammónium-klorid, 1% pektin és 1% szárított és ledarált cukorrépaszelet jelenlétében, az 5.5. példában leírt körülmények között tenyésztettük tovább, majd PG-II termelésüket a fermentléből Westem-blot technikával vizsgáltuk. Mind a nyolc transzformáns több enzimet termelt, mint az anyatörzs; az N402 törzset és közülük kettőt (N593/pGWl 756-6 és -7) újra tenyésztettük a fenti körülmények között, majd a fermentlé enzimaktivitását vizsgáltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a pGW1756 plazmid által hordozott pgall gén funkcióképes és alkalmas A. niger törzsek poligalakturonáz-hipertermelővé transzformálására.
12. példa
Poligalakturonáz-C termelése transzformált A. nidulans törzsekkel
A 9.2. példában leírt transzformációs kísérletekben - ahol az A. nidulans G191 hiánymutánst uridin-prototróffá transzformáltuk - kotranszformáló plazmidként az A. niger N400 pgaC génjét hordozó pGW1910 plazmidot is használtuk. A kapott transzformánsok közül tizet tisztítottunk meg és tenyésztettünk tovább magas foszfáttartalmú minimál-tápközegben, 4,0 g/1 ammónium-klorid, 1% pektin és 1% répaszelet, valamint mg/ml p-amino-benzoesav jelenlétében. A tenyésztés körülményei a szokásosak voltak; a 65. órában vett fermentlémintát minden tisztítás vagy koncentrálás nélkül vizsgáltuk meg Westem-blot technikával a PG-I és PG-II fehérjékre specifikus antitesteket használva. Az enzimaktivitást 50 mmol-os nátrium-acetát-pufferben (pH=4,8), 0,25% poligalakturonsav szubsztráttal mértük.
Mindkét mérés azt mutatta, hogy a transzformánsok és a kontrolltörzs (a pGW635 plazmiddal transzformált A. nidulans G191) fokozott mennyiségű PG-C enzimet termelt.
13. példa
Az A. niger pgaA és pgaD gének kifejeződése transzformált A. nidulans törzsekben
A pgal, pgall és pgaC gének mellett az A. niger poligalakturonáz géncsaládjának (7.2. példa) más tagjait is felhasználtuk az A. nidulans transzformálására. Az ebben a példában leírt kísérletekhez közvetlenül a géneket hordozó lambda-fágokat használtuk fel, és nem készítettünk belőlük szubklónokat vektor plazmidokban.
A fág-DNS-t a 3.5. példában leírt módon preparáltuk ki, és még egyszer extraháltuk fenollal és kloroformmal. Az egyes kotranszformációs kísérletekhez körülbelül 20 pg fág-DNS-t használtunk, amiben egyenlő arányban vett részt a két fág (például a lambda-PGA10 és -A43 vagy a lambda-PG-D8 és -Dll) DNS-e. A kotranszformációt az A. nidulans G191-en a 9.2. példában leirt módon végeztük el; a kontroll a lambdaPGI-7 fággal és a pGW1900 plazmiddal kotranszformált törzs volt. A fág-DNS-sel végzett transzformáció gyakorisága lényegesen kisebb volt, mint a cézium-klorid-gradiensben tisztított plazmid-DNS-sel végzett transzformációké.
A sikeres transzformánsokat a 12. példában leírt módon tenyésztettük tovább, de tenyésztettük egy olyan tápközegben is, amely magas foszfátszintet, szénforrásként 3% glükózt, nitrogénforrásként pedig 0,1% élesztőkivonatot és 1% ammónium-kloridot tartalmazott.
A vizsgált transzformánsok (A. nidulans G191/lambda-A-1 és G191/lambda-D-l) 65 órás fermentleve a répaszelet/pektin tápközeg esetében jelentősen magasabb poligalakturonáz-aktivitást mutatott, mint a kontrolltörzs (G191/pGW635-l). Az A-és D-osztályú lambdafágok által hordozott, a pgall génhez hasonló szekvenciák tehát olyan fehérjéket kódolnak, amelyeknek poligalakturonáz-aktivitása van. A Westem-blot vizsgálat kimutatta, hogy ezeknek a fehérjéknek - a poligalakturonáz-A-nak és poligalakturonáz-D-nek - az elektroforetikus mobilitása a PG-I-éhez hasonló.
Az A. nidulans G191/lambda-A-l glükóztartalmú tápközegben is termel PG-A-t.
14. példa
Hibrid interferon kifejeződése transzformált A. nidulans törzsekben
A kotranszformációs kísérletekben a pGII-IFN AMI 19 vagy a pGIIss-IFN AMI 19 plazmidokból körülbelül 20 pg-ot használtunk, egyébként a 9.2. példa
HU 220 337 Β szerint jártunk el. A megfelelő transzformánsokat megtisztítottuk és a 8.4. példában leírt módon vizsgáltuk tovább, de tenyésztettük azokat a 13. példában leírt glükóztartalmú tápközegben is.
Mintákat minden 20. órában vettünk, a sejteket lecentrifugáltuk, liofilizáltuk és eldörzsöléssel feltártuk, majd a fermentlé és a sejtek extraktuma interferonaktivitását a már leírt módon megmértük. A pGIIss-IFN transzformánsok esetében az aktivitás zöme a fermentlében, a ppGII-IFN transzformánsok esetében a sejtkivonatban volt. Mindkét típusú transzformáns termelt interferont a glükózt tartalmazó tápközegben is.
15. példa
A poligalakturonáz-I és -11 maceráló aktivitása
Az A. niger poligalakturonázok maceráló aktivitásának vizsgálatára uborkaszövetet használtunk. A helybéli zöldségesnél vásárolt uborkákat megtisztítottuk (vagy alkoholos kendővel ledörzsölve, vagy egy órás áztatással 0,5%-os nátrium-hipoklorit-oldatban), szeletekre vágtuk és lágy belsejüket eltávolítottuk. A szeletekből kettőt-kettőt (körülbelül 12 g) tettünk egy-egy 100 mles Erlenmeyer-lombikba, majd 25 ml maceráló puffért (enzimmel vagy anélkül) öntöttünk rájuk. Az emésztést 24 órán át folytattuk enyhe rázás mellett, 30 °C hőmérsékleten, majd a lombikokat megvizsgáltuk. A teljes maceráció követelményei a következők: (i) az uborka héja szemmel láthatóan mentes a rátapadó szövetektől; (ii) a maceráló puffer erősen zavaros; (iii) a maceráló pufferben mikroszkóppal a zavarossággal egyenesen arányos mennyiségű, épnek tűnő szabad sejt látható.
A poligalakturonáz-I és -II enzimeket az 1. példában leírt módon állítottuk elő, és különböző pufferekben vizsgáltuk. Az A maceráló puffer (MBA) 50 mmol-os nátrium-acetát (pH=4,8), a B maceráló puffer (MBB) foszfát-citrát-puffer (pH=4,5) volt, amit Ishii nyomán [Phytopathology, 66, 281 (1976)] készítettünk el 0,1 mol-os citromsav és 0,1 mol-os dinátrium-hidrogén-foszfát törzsoldatokból, majd kétszeresére hígítottunk, és 10 mg/25 ml BSA-t adtunk hozzá.
Az uborkaszövetet 1 pg PG-II az MBA-ban 24 óra alatt teljesen elmacerálta, míg az enzim nélküli pufferben vagy a PG-I jelenlétében a szövet nem macerálódott. Ugyanezt az eredményt kaptuk, ha a vizsgálatot az MBB pufferben, 10 pg enzimmel végeztük. Az eredmények azt igazolták, hogy a 10. példa szerint előállított poligalakturonáz-Il enzimnek maceráló hatása is van.
IRODALOM
1. Rombouts, F. M,, Geraeds, C. C. J. M., Visser, J. and Pilnik, W. Purification of various pectic enzymes on crosslinked polyuronides in T. C. J. Gribnau, J. Visser and R. F. J. Nivard (eds) Affinity chromatography and Related Techniques pp. 255-260,1982, Elsevier, Amsterdam.
2. Rozié, H., Somers, W., Bonte, A., Visser, J., van’t Riet, K. and Rombouts, F. M. (1988) Biotechn. Appl. Biochem. 10, 346-358.
3. Robyt, J. F., Ackerman, R. J. and Keng, J. G. (1973), Anal. Biochem. 45, 517-524.
4. Matsudarai, P. (1987), J. Bioi. Chem. 262, 10035-10038.
5. Amons, R. (1987), Vapor-phase modification of sulfhydryl groups in proteins, FEBS Letters 212, 68-72.
6. Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, I, Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
7. Benton, W. D. and Davis, R. W. (1977), Science 196, 180-182.
8. Caruthers, Μ. H. Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments: a laboratory manual, Verlag Chemie (1982).
9. Frischauf, A. M., Lehrach, H., Poustra, A. and Murray, N. (1983), J. Mól. Bioi. 170, 827-842.
10. Dente, L. and Cortese, R. (1987), Methods in Enzymology, vol. 155 pp. 111-119.
11. BRL, M13 cloning/dideoxy sequencing instruction manual.
12. Holms, D. S. and Quigley, M. (1981), Anal. Biochem. 114, 193.
13. Goosen, T., Bloemheuvel, G., Gysler, Ch., de Bie, D. A., van den Broek, H. W. J. and Swart, K. (1987), Current Genetics 11, 499-503.
14. Boeke, J. D., Lacroute, F. and Fink, G. R. (1984), Mól. Gén. Génét. 197, 345-346.
15. Rombouts, F. M. and Pilnik, W. (1980). Pectic Enzymes. In: A. H. Rose (ed.) Microbial Enzymes and Bioconversion. Economic Microbiology Vol. 5. Academic Press. pp. 227-282.
16. Ohtsuka, E., Matsuki, S., Ikehara, M., Takahashi, Y. and Matsubara, K. (1985), J. Bioi. Chem. 260, 2605-2608.
17. Pharmacia T7 sequencing TM Kit Instruction Manual, pp 1-35.
18. Yelton, Μ. M., Hamer, J. E. and Timberlake, W. E. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474.
19. Kam, J., Brenner, S., Barneff, L. and Cesareni, G. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5172-5176.
20. Slater, R. J. (1984) in: Methods in Molecular Biology vol. 2 Ed. J. M. Walker, The Humana Press Inc.
21. Zissler, J. et al. (1971) in: The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Labs, New York, A. D. Hersley editor.
22. Dente, L., Cesareni, G. and Cortese, R. (1983) Nucl. AcidsRes. 11, 1645-1655.
23. Dente, L., Sollazzo, M., Baldari, C., G. Cesareni and R. Cortese in: DNA Cloning vol. 1. a practical approach ed. D. M. Glover, IRL Press, Oxford 1985.
24. Norrander, J., Kempe, T. and Messing, J. (1983) Gene 26, 101-106.
25. Boel, E., Hansen, Μ. T., Hjort, I., Hoegh, L., Fiil, N. P. (1984), EMBO J. 3, 1581-1585.
26. Mount, S. M. (1982), Nucleic Acids Rés. 10, 459-472.
27. Ballance, D. J. and Tumer, G. (1985), Gene 36, 321-331.
28. Bimbóim, H. C. & Doly, J. (1979), Nucleic Acids Rés. 7, 1513-1523.
HU 220 337 Β
29. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene33,pp. 103-119.
30. Messing, J., Crea, R. and Seeburg, P. H. Nucleic Acids Rés. 9, 309-321 (1981).
31. Renard, C. M. G. C., Voragen, A. G. J., Schols, H. 5 A., Searle-van Leeuwen, M. J. F., Thibault, J. F., Pilnik, W., (1989). Apple protopectin: preliminary study of enzymatic extraction. In: J. P. Roozen, F.
M. Rombouts, A. G. J. Voragen (eds): Food Science: Basic Research fór Technological Progress. 10 PUDOC, Wageningen, The Netherlands.
32. Voragen, A. G. J. (1989): Food enzymes: prospects and limitations. In: J. P. Roozen, F. M. Rombouts, A. G. J. Voragen (eds): Food Science: Basic Research fór Technological Progress. PUDOC, 15 Wageningen, The Netherlands.
33. Beldman, G., Rombouts, F. M., Voragen, A. G. J., Pilnik, W. (1984) Enzyme Microb. Technoi. 6, 503-507.
34. Schmitt, J. J. and Cohen, Β. N. (1983) Quantitative 20 Isolation of restriction fragments from low-melting agarose by Elutip-a affinity chromatography. Analytical Biochemistry 133, 462-464.
35. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pulién, J. K. and Pease, L. R. (1989). Engeneering hybrid genes 25 without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68.
36. J. H. A. A. Uitzetter (1982). Studies on carbon metabolism in wild type and mutants of Aspergillus nidulans. PhD Thesis, Agricultural University Wa- 30 geningen, The Netherlands.
37. Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K. and Weintraub, H. (1980). Nucl. Acids Rés. 8, 1-20.
38. Church, G. M. and Gilbert, W. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1991-1995.
39. von Heijne, G. (1986), Nucleic Acids Research 14, 4683-4690.
40. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Seidman, J. G. and Struhl, K. (eds) (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore.
41. Rambosek, J. and Leach, J. (1987), Recombinant DNA in filamentous fungi: progress and prospects, CRC Critical Reviews in Biotechnology 6, 357-393.
42. Goosen, T., Van Engelenburg, F., Debets, F., Swart, K., Bős, K. and Van den Broek, H. W. J. (1989) Mól. Gén. Génét. 219, 282-288.
43. Shapiro, Μ. B. and Senapathy, P. (1987) Nucleic Acids Rés. 75, 7155-7174.
44. K. S. Poutanen (1990). Communicated at the 199,h ÁCS Meeting, Boston Mass., April 22-27, 1990; Abstract 90 of the Cellulose, Paper and Textilé Division.
Letétbe helyezett mikroorganizmusok
Az alább felsorolt mikroorganizmusokat és fágokat a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg 16, D-3300 Braunschweig, Német Szövetségi Köztársaság, gyűjteményében helyeztük letétbe:
Mikroorganizmusok DSM-No. Időpont
Escherichia coli JM109/pGW1800 5505 1989. 08. 30.
Escherichia coli DH5aF’ /pGW1900 5866 1990. 03. 21.
Escherichia coli DH5aF’/pGW1756 5942 1990. 05. 18.
Escherichia coli DH5aF’ /pGW1910 5943 1990. 05. 18.
Escherichia coli DH5aF’/pGW1911 5944 1990. 05. 18.
Escherichia coli LE 392 5941 1990. 05. 18.
Fágok mind 1990. 05. 18
lambda-PG-A9 5945
lambda-PG-A10 5951
lambda-PG-A43 5964
lambda-PG-B4 5949
lambda-PG-B35 5960
lambda-PG-B36 5961
lambda-PG-Cl 5948
lambda-PG-C16 5954
lambda-PG-C20 5956
lambda-PG-C37 5962
lambda-PG-D8 5947
lambda-PG-Dl 1 5952
lambda-PG-D12 5953
lambda-PG-E6 5946
lambda-PG-E38 5963
lambda-PG-F5 5950
lambda-PG-G17 5955
lambda-PG-G27 5957
lambda-PG-X31 5958
lambda-PG-Y33 5959
HU 220 337 B
SEQIDNo. 1
TÍPUSA: nukleotid a megfelelő polipeptiddel
HOSSZA: 2495 bázispár
SZÁLA: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EREDETE: genomból
FORRASSZERVEZET: Aspergillus niger N400
KÍSÉRLETI FORRÁS: pGW1900 (DSM 5966) plazmid
JELLEMZŐI: az A. niger N400 prepro-poligalakturonáz-I enzimet kódoló pgal gén 1-től 909-ig promoter
901-től 963-ig a jelzőpeptid kódolószakasza 901-től 1002-ig a preproszekvencia kódolószakasza 1003-tól 2127-ig az érett PG-I kódolószakasza 1138-tól 1189-ig intron
1610-től 1671-ig intron
2128-tól 2130-ig stopkodon
2131-től 2495-ig 3’ nem kódolószakasz, a terminátor része
GAATTCGGAA GAATGTCTGC GTTCGTGCGC ACAACGACGT TCCTAAAATT TATCCGATGA TCAACCGAGG AACCAGGGTC GAACCCCTGA AAGGAATCTC GCCGAAAGGA TCAATCATAT TGATTCGCGG ACCCTGTAAA GTGCCCTAAA GGGTCTTTGC CACTCGATAG TGGGATCGGC ACTGGCAGTT TCTAGTCTCG TCAGTGCGGC CATTTCCGAC CGATCCGTAG TGCTGGTGGG TGAGTCCCAG AGCAGTCTAT ATCGATATCA TCACCAAATT CCAAGGACCG TGGGATGACG AGTATGCATT GGCACTGAGA ATTGCCGAGA TCATGCCCCC GTCCTGGAGG TGCATCCATC AAGCATGTTG CGACAGAGTG AAACAGCGTG GATAAGCCGG ATGGGGCAGA TGGGGGAAGA GAGCGAGACA CGGCATCAGC AGTGGAGATG CCGAGAAGTG CCGAGAGCCG CCGATGCTTC GACCTTCAGC CCAAGCGTCA ATCCATGCCT TCTTGGGTCA GGGTTGGCCG GACTGTAAGC CCGTTAGCGT CTGAGATACG CCGGATGACA CGAACCTTGG TGCTTACCAA TGCTGTGATG CATGCAGTGC CGGCGGTATC CCTGGCTGAA GCGCCCATCG CCGTTAGAGA TTGATACCCG GGTGGATCGG AGGGTCCCCT TGGTCTTTCC ACCAATAATG GAGGTATCTC ACTGCTTTGT TCAGGAACAG AAGCTTAGCA TGGACCAGTC TTTCACGTAT AAAACTCTCC AGGACTTCCG TCGTTGAGAT GCTCTATCCA ACAACACCTC ACTCTTCCAC TCCTTGTTCT TTCTTTCTGT TGACCAGACC CCATCCATTC TTTTGGCCGA AACCTGTTCT GTTGACCAGA ACCTATACCA ACAATCACC ATG CAC TCT
Me t H i s Ser 1
120
160
200
240
280
320
360
400
440
480
520
560
600
640
680
720
760
800
840
880
918
TAC CAG CTT CTT GGC CTG GCC GCT GTC GGC TCC CTC
Tyr Gin 5 Leu Leu Gl y Leu Al a 10 Al a Val Gly Ser Leu 15
GTC TCT GCC GCC CCC GCT CCT TCT CGC GTC TCC GAG
Val Ser Al a Al a Pro 20 Al a Pro Ser Arg Val 25 Ser Glu
TTC GCT AAG AAG GCC TCT ACC TGC ACC TTC ACC TCT
Phe Al a Ly s 30 Ly s Al a Ser Thr Cy s 35 Thr Phe Thr Ser
GCC TCT GAG GCC AGC GAG AGC ATC TCC AGC TGC TCC
Al a 40 Ser Glu Alá Ser Glu 45 Ser I le Ser Ser Cy s 50 Ser
954
990
1026
1022
HU 220 337 Β
GAT Asp GTT GTC CTG Leu 55 AGC Ser AGC ATC GAG GTC Val 60 CCC GCT Pro Alá GGC Gly
Val Val Ser lle Glu
GAG ACC CTC GAC CTG TCC GAT GCT GCT GAT GGC TCC
Glu Thr Leu Asp Leu Ser Asp Alá Al a Asp Gly Ser
65 70 75
ACC GTATGTGCTC TCAGCCGTCT TCCATCCTGG CTATCACGCT 1177
Thr
AACACCATCT AG ATC ACC TTC GAG GGC ACC ACT TCC TTC 1216 lle Thr Phe Glu Gly Thr Thr Ser Phe
85
GGA Gly TAC AAG GAA TGG AAG GGC CCC CTG ATC CGC TTC 1252
Tyr Ly s Glu Trp 90 Lys Gly Pro Leu lle 95 Arg Phe
GGT GGT AAG GAT CTG ACT GTC ACC ATG GCC GAC GGC 1288
Gly Gly Lys 100 Asp Leu Thr Val Thr 105 Me t Alá Asp Gly
GCT GTC ATC GAC GGT GAC GGT TCC CGC TGG TGG GAC 1 324
Al a 110 Va 1 lle Asp Gly Asp 115 Gly Ser Arg Trp Trp 120 Asp
AGC AAG GGT ACC AAC GGT GGC AAG ACC AAG CCC AAG 1360
Ser Ly s Gly Thr 125 Asn Gly Gly Ly s Thr 130 Ly s Pro Ly s
TTC ATG TAC ATC CAC GAT GTT GAG GAC TCG ACC TTC 1396
Phe Me t 135 Tyr I le Hi s Asp Val 140 Glu Asp Ser Thr Phe 145
AAG GGC ATC AAC ATC AAG AAC ACT CCC GTC CAG GCC 1432
Ly s Gly lle Asn lle 150 Lys Asn Thr Pro Val 155 Gin Alá
ATC AGT GTC CAG GCT ACC AAC GTC CAC CTG AAC GAC 1468
lle Ser Val 160 Gin Al a Thr Asn Va 1 165 Hi s Leu As n Asp
TTC ACC ATC GAC AAC TCC GAC GGT GAT GAC AAC GGT 1504
Phe 170 Thr lle Asp Asn Ser 175 Asp Gly Asp Asp Asn 180 Gly
GGC CAC AAC ACC GAC GGT TTC GAC ATC AGC GAG TCT 1540
Gly Hi s Asn Thr 185 As p Gly Phe As p lle 190 Ser Glu Ser
ACC GGT GTC TAC ATC AGC GGT GCT ACC GTC AAG AAC 1576
Thr Gly 195 Val Tyr lle Ser Gly 200 Al a Thr Val Ly s Asn 205
CAG Gin GAC As p GAC Asp TGC Cys ATT lle 210 GCC Al a ATC lle AAC As n TCT Ser GGC Gly 215 GAG Glu 1609
HU 220 337 Β
GCACGATATC CCTATTCCAC TATCATTCCT TCCATTCATA 1649
TCGCTAACAA TCAAACCCAC AG AGC ATC TCT TTC ACC 16 86
Ser Ile Ser Phe Thr
220
GGC Gly GGT Gly ACC Thr TGC Cys 225 TCC Ser GGT GGC CAC GGT CTC TCC ATC 1722
Gly Gly His Gly 230 Leu Ser Ile
GGC TCT GTC GGT GGC CGT GAT GAC AAC ACC GTC AAG 1758
Gly Ser Val Gly Gly Arg Asp Asp Asn Thr Val Lys
235 240 245
AAC GTG ACC ATC TCC GAC TCC ACT GTC AGC AAC TCC 1794
Asn Val Thr Ile Ser As p Ser Thr Va 1 Ser Asn Ser
250 255
GCC AAC GGT GTC CGC ATC AAG ACC ATC TAC AAG GAG 1830
Al a Asn Gly Val Arg Ile Lys Thr Ile Tyr Ly s Glu
260 265
ACC GGT GAT GTC AGC GAG ATC ACC TAC TCT AAC ATC 1866
Thr Gly As p Val Ser Glu Ile Thr Tyr Ser Asn Ile
270 275 280
CAG CTC TCC GGA ATC ACC GAC TAC GGT ATC GTC ATC 1902
Gin Leu Ser Gly I 1 e Thr As p Tyr Gly Ile Va 1 I le
285 290
GAG CAG GAC TAC GAG AAC GGC TCT CCC ACC GGC ACC 1938
Glu Gin Asp Tyr Glu Asn Gly Ser Pro Thr Gly Thr
295 300 305
CCC TCC ACC GGT ATC CCC ATC ACT GAT GTC ACC GTT 1974
Pro Ser Thr Gly Ile Pro Ile Thr Asp Val Thr Val
310 315
GAC GGT GTC ACC GGT ACT CTC GAG GAT GAC GCC ACC 2010
Asp Gly Val Thr Gly Thr Leu Glu As p Asp Al a Thr
320 325
CAG GTC TAC ATT CTC TGC GGT GAC GGC TCT TGC TCT 2046
Gin Val Tyr I le Leu Cys Gly Asp Gly Ser Cy s Ser
330 335 340
GAC TGG ACC TGG TCC GGT GTT GAC CTC TCT GGT GGC 2082
Asp Trp Thr Trp Ser Gly Val Asp Leu Ser Gly Gly
345 350
AAG ACC AGC GAT AAA TGC GAG AAC GTT CCT TCC GGT 2118
Lys Thr Ser Asp Lys Cy s Glu Asn Val Pro Ser Gly
355 360 365
GCT TCT TGC TAA ATCGTTCCTC CGGATGCGAG GCAACGTCTG 2160 Alá Ser Cys
368
TAGGACGTCT GGTTGTATAT ATCGATCCAC ACTTGACATG 2200
TACTAGTTAG GTGGTTTTAC TGCCATAGTG TTAGTGAATA 2240
HU 220 337 Β
ATAGGAGCTT TGCTCAATAT GTGAATTTGT AGCAGAAGTA 2280 AATGAGTAGA CTGATAGAGG TAATGATGAA AGATAGAATT 2320 TAATACCAGG TGATGAAGTT AATAACGGGG TGAATTAGGG 2360 CGCGTAGGCT TAGGTATATA AGTTGTCATC CCTCACACTC 2400 GAAATCTCTT CCTCTTTCTT ATATCTTCCA ACCTCTGAAC 2440 CACCAGTTGC CTCCACAGAC TAACAAGATT CTTCTATATC 2480 GATGCTTGAT CTCAA 2495
SEQIDNo.2
TÍPUSA: nukleotid a megfelelő polipeptiddel HOSSZA: 3031 bázispár SZÁLA: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris EREDETE: genomból
FORRASSZERVEZET: Aspergillus niger N400 KÍSÉRLETI FORRÁS: pGW1800 (DSM 5505) plazmid JELLEMZŐI: az A. niger N400 prepro-poligalakturonáz-II enzimet kódoló pgall gén
1-től 1356-ig promoter
1357-től 1419-ig a jelzőpeptid kódolószakasza 1357-től 1437-ig a preproszekvencia kódolószakasza 1438-tól 2494-ig az érett PG-I kódolószakasza 1987-tól 2038-ig intron
2495-tól 2497-ig stopkodon
2498-től 3031-ig 3’ nem kódolószakasz, a terminátor része
TCTAGAAGCA CTTCCCGTGG TGGAGAACAT AACACGCTGG 40 TTAATCTGCT TGACGAACGC GTTGTCTCCA GGTCAGAGCA 80 TGACTCCCTC TCAATATAGC TGGCTTCTAC AACCTTGAAA 120 ATAGGGGTAA TGGAGCGAAT CCGGCTAGAA GAGGGTAATG 160 AACGGGACAA TATGGTTCAC CTGCCATGAT GGAATAGTGT 200 GCGCACTGGT GGCTTCCGAT GCACCAGACT CAGACATAAA 240 CCGTTTTGCG CCAGCACTAC TTTGTCCTCC TGCCCCGAGG 280 AATGAATCCA ATAGGAGGAA TGTCGATATT CGCGCTCGAT 320 AGCATCACTC GGATATCGAG AATACCGGGC TGAGGTTGTT 360 GCAGGTGGAA AGATTTGCTC AATCTGTATC GAAAAAACGT 400 AACTTGATGA ATGACCTTTC AACAACTAAC CGCCCCTATC 440 CACTGCTGTG ACCAGTATAG TCCACCGGAT TCGCTCACCG 480 TTAGCCAGTG GCTTCCTCCT TTTTCGTCAT CTTTTCCTCT 520 TCTTGACTGG CCCCACTCCA GGTTGCTTGT TGCCGGCAAG 560 CTTTCGACCC TGATTAGCGA GCTTTGCGCA CTATTCCTGA 600 TTTAGCTGTC GAAGGAACGG ATGGACGCTG CGCTAGTTTC 640 ATCTCGAATC TCTGATATTA ACATTGGCTA CAGACTAGCC 680 GATTACGCTC CGGAATCTGG CACACAGGGA GTTTATGGAC 720 CGTTCATTGG TGGAACTAGC AAAGCACCAT AATTGCCGCG 760 GACCCTGCAT TTCAGGCTGC AGCCTTACTA GGATTAGTAT 800 AGCTGTCTTC TCGTACTCGT ACACTGCAGT ACCGGCCTGG 840 AATCTCGGGA TCAACGATGG CATCCGCTTC CTCCAGGACT 880 TACGGCTGCT TGTGAAGGCC AATTATAGTG TTGCTTGTTT 920 ACGTGCCAAT TCAGCGGTAC ATACAAACGC TTCTCTATCT 960 TGCCCTTTTT GACAATAGGT TTACCCTCGG GAGCGGAGCT 1000 TTGCCTTCTT TCCACCGACA TGCGCATCCG TTCCATCACC 1040 CGCGGAACCC GTCGGCTGAT CAGCCACGCA CGGCTGGTAT 1080 AAATTAATCG GCCACTCATG TCGAACTGAG GTTCACGGGA 1120 AAACGCAATA TTTGAGACAA CACCTCAATA TGAAACGAGG 1160 ATCCAGGGTC CTACATTTCC TCCAGGGGCT GTCGGCAGTT 1200 ATGAACTTTT CGACCGGAAA AGATTCGCAA TAGTCGTGAG 1240 TATAAGAACC TCGTACCTGC TCACACTGAT GTCTACTTGC 1280 TCATCATTCC ACACTCATTC AAAATCTTAC CAACAACACT 1320
HU 220 337 B
CCTTCTGTCA TTCTTTTCTA TTGTTAACAA TTAATC ATG CAC 1362
Me t His
TCG TTT GCT TCT CTT CTC GCC TAC GGC CTG Leu GTC Val GCC Al a 1398
Ser Phe Alá 5 Ser Leu Leu Al a Tyr 0 Gly
GGC GCC ACC TTC GCT TCT GCC TCT CCT ATC GAA GCT 1434
Gly Al a Thr Phe Al a Ser Al a Ser Pro I le Glu Al a
15 20 25
CGA GAC AGC TGC ACG TTC ACC ACC GCT GCC GCT GCT 1470
Arg As p Ser Cy s Thr Phe Thr Thr Al a Al a Al a Al a
30 35
AAA GCG GGC AAG GCG AAA TGC TCT ACT ATC ACC CTT 1506
Ly s Al a Gly Ly s Al a Ly s Cy s Ser Thr I le Thr Leu
40 45 50
AAC AAC ATC GAA GTT CCA GCT GGA ACC ACC CTC GAC 1542
Asn Asn I le Glu Va 1 Pro Al a Gly Thr Thr Leu Asp
55 60
CTG ACC GGT CTC ACC AGC GGT ACC AAG GTC ATC TTC 1578
Leu Thr Gly Leu Thr Ser Gly Thr Ly s Val I le Phe
65 70
GAG GGC ACC ACG ACC TTC CAG TAC GAA GAA TGG GCA 1614
G1 u Gly Thr Thr Thr Phe Gin Tyr Glu Glu Trp Al a
75 80 85
GGC CCC TTG ATC TCC ATG AGT GGC GAA CAT ATC ACC 1650
Gly Pro Leu 11 e Ser Me t Ser Gly Glu Hi s I le Thr
90 95
GTC ACT GGT GCC TCC GGC CAC CTC ATC AAT TGC GAT 1686
Val Thr Gly Al a Ser Gly Hi s Leu I le Asn Cy s As p
100 105 110
GGT GCG CGC TGG TGG GAT GGC AAG GGA ACC AGC GGA 1722
Gly Al a Arg Trp Trp Asp Gly Ly s Gly Thr Ser Gly
115 120
AAG AAG AAG CCC AAG TTC TTT TAC GCC CAT GGC CTT 1758
Ly s Ly s Ly s Pr o Ly s Phe Phe Tyr Al a Hi s Gly Leu
125 130
GAC TCC TCG TCT ATT ACT GGA TTA AAC ATC AAA AAC 1794
Asp Ser Ser Ser I le Thr Gly Leu Asn I le Ly s Asn
135 140 145
ACC CCC CTT ATG GCG TTT AGT GTC CAG GCG AAT GAC 1830
Thr Pro Leu Me t Al a Phe Ser Va 1 Gin Alá As n As p
150 155
ATT ACG TTT ACC GAT GTT ACC ATC AAT AAT GCG GAT 1866
I le Thr Phe Thr As p Val Thr I le Asn Asn Al a As p
160 165 170
HU 220 337 Β
GGC GAC ACC CAG GGT GGA CAC AAC ACT GAT Asp 180 GCG Al a TTC Phe 1902
Gly As p Thr Gin Gly 175 Gly Hi s Asn Thr
GAT GTT GGC AAC TCG GTC GGG GTG AAT ATC ATT AAG 1938
Asp Val Gly 185 Asn Ser Val Gly Val 190 Asn Ile Ile Lys
CCT TGG GTC CAT AAC CAG GAT GAC TGT CTT GCG GTT 1974
Pro 195 Trp Val Hi s Asn Gin 200 Asp Asp Cys Leu Al a 205 Val
AAC TCT GGC GAG GTAAGCAGCT CTGCATATAT GCTTGATTCG 2016 Asn Ser Gly Glu
210
TAATTATATT GATATTCTAT AG AAC ATC TGG TTC ACC GGC 2056 Asn Ile Trp Phe Thr Gly
215
GGC Gly ACC Thr TGC ATT GGC GGC CAC Gly Gly His GGT CTC TCC ATC GGC 2092
Cys Ile 220 Gly Leu 225 Ser Ile Gly
TCT GTC GGC GAC CGC TCC AAC AAC GTC GTC AAG AAC 2128
Ser Val Gly Asp Arg Ser Asn As n Val Val Ly s Asn
230 235 240
GTC ACC ATC GAA CAC TCC ACC GTG AGC AAT TCC GAA 2164
Val Thr Ile Glu Hi s Ser Thr Val Ser Asn Ser G1 u
245 250
AAC GCC GTC CGA ATT AAG ACC ATC TCT GGC GCC ACT 2200
Asn Al a Val Arg Ile Lys Thr Ile Ser Gly Al a Thr
255 260
GGC TCC GTG TCC GAG ATT ACG TAC TCC AAC ATC GTC 2236
Gly Ser Val Ser Glu Ile Thr Tyr Ser Asn Ile Val
265 270 275
ATG TCT GGC ATC TCC GAT TAC GGC GTG GTC ATT CAG 2272
Me t Ser Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Val Val Ile Gin
280 285
CAG GAT TAC GAA GAC GGC AAG CCT ACG GGT AAG CCG 2308
Gin Asp Tyr Glu Asp Gly Lys Pro Thr Gly Lys Pro
290 295 300
ACG AAC GGT GTC ACT ATT CAG GAT GTT AAG CTG GAG 2344
Thr Asn Gly Val Thr Ile Gin As p Val Lys Leu Glu
305 310
AGC GTG ACT GGT AGC GTG GAT AGT GGG GCT ACT GAG 2380
Ser Val Thr Gly Ser Val As p Ser Gly Alá Thr Glu
315 320
ATC TAT CTT CTT TGC GGG TCT GGT AGC TGC TCG GAC 2416
Ile Tyr Leu Leu Cy s Gly Ser Gly Ser Cys Ser As p
325 330 335
HU 220 337 Β
TGG ACC TGG GAC GAT GTG AAA GTT ACC GGG GGG AAG 2452
Trp Thr Trp Asp Asp Val Lys Val Thr Gly Gly Lys
340 345
AAG TCC ACC GCT TGC AAG AAC TTC CCT TCG GTG GCC 2488
Lys Ser Thr Alá Cys Lys Asn Phe Pro Ser Val Alá
350 355 360
TCT TGT TAG GCTGCTAGGT TGGTGAGTTG TAGCCCTAGC 2527
Ser Cys
362
TGAAATTCGT CTGCTTCGTC TGCTTCGTCT GCTTCGTCTG 2567
CTTCGTCTGC TTCTTCTGCT TCGTCTGCTT TGTCTGCTTT 2607
GTCTGCTTCG TCCACTTCGT CCACTTCGAC TGGTTAGATG 2647
GGCCTTGTAA TAGTTTTTAG AGAGAACAGA ATATGTACAG 2687
TAAGCCTTAG AGGTGGTACC GAGTTGTATA TTTATTTAAA 2727
ATGTTACCTA TCGCGTGTCT TTATATTTAT AGCCTTTTAC 2767
ATATATACGG AGCTACAGTG GATTATCTTA CAGCCCACAC 2807
TCATCGTGCT GGGAACTACG TGAATGAATG CTCGGTTAGA 2847
AGGCCTTGCT CACTGCCACA ACCAACCAGG AACCTTGGCA 2887
GGTACATGCT TGGGCATTTT TGTCTGGCCC TATCTCTTTC 2927
CAGATGGTGG TCTGGATGAG TCACGGCACG AGTAGATTGA 2967
CCGCTACTCC AACCCGCGCA TAAAGCATAC GCCAGAAGTG 3007
CAAGGGATAC AAGACAGCCA GCTG 3031
SEQIDNo. 3
TÍPUSA: nukleotid a megfelelő polipeptiddel
HOSSZA: 3047 bázispár
SZÁLA: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EREDETE: genomból
FORRÁSSZERVEZET: Aspergillus niger NW756
KÍSÉRLETI FORRÁS: pGW1756 (DSM 5942) plazmid
JELLEMZŐI: az A. niger NW756 prepro-poligalakturonáz-II enzimet kódoló pgall gén 1-től 889-ig promoter
890-től 952-ig a jelzőpeptid kódolószakasza 890-től 970-ig a preproszekvencia kódolószakasza lehet 971-től 2027-ig az érett PG-I kódolószakasza lehet 1520-tól 1571-ig intron
2028-tól 2030-ig stopkodon
2031-től 3047-ig 3’ nem kódolószakasz, a terminátor része
CCGGATTTGC TCACCGTTGG CCAATGGCTT CCTCCTTTCC 40 TGTCTTCTCC TTCCTCTCCT TGACTGGCCC CACTCCAGGT 80 TGCTTATTGC CGGCAAGCTT TCAACCCTGA TTAGCGAGCT 120 TTGCACACTA TTCCCGATGT AGCTGTCGAA GGAACGGATG 160 GACGCTGCAC TAGTTTCATT TCGAATCTCT GATATTAATA 200 CTAACTACAG AGTGACTAGC CGATCACGCT CCGGATCTGG 240 CACAGAGTGA TTTTTTGAAT CATTCATTGG TGGAATTTGC 280 AAGGCACCAT AAATGCCGCA GACCCTGCAT ATCGAGCTAC 320 AGCCTTACTG GGATTAGTAT AGCTGCCATC TCGTACTCGT 360 ACACTGCAGA ACCGGCTTGG ATCCCAAGGC CTACGATGAC 400 ACCCGTTTCC TCCAGGACTG ATGGCTGTTT GTGAAGGCGA 440 ATTATAGTAC TGCTTGTCAA TGTCTTGAGT CAGCGGTATA 480 TATGAATCTG TCTTTGTCTT TCCACCTTGA CAATAATGTT 520 ACGCTCAAGA GGGCATTTTG CGTTCTTTTC ATCGACATGC 560 GAACCTGTTC GGTCACCCGC GGACCCCGTC GGCTGATCAG 600 CCACCACGGC TCATATATAT TAGTTGCCCA CCATGTCGAA 640 CTTAAGTTCA TTAAAAAAAA GGTAACATTT GAGACAATAT 680 CTTAATGTGA AACGTGAACC CTGGACTAGC ATCTCTCCAG 720
HU 220 337 Β
AGGCTGTCGG CAGTTATGAC TTTCCGATCA GAAGAGATGC 760
GCTGAAATTG TGACTATAAG AACCTCAAGC CTGCCGATGC 800
TGAGGTGAGT TTGCTCATCA TCCTACACTC ATTTGGCATC 840
AGACCGATTA CACTCTTTTT GTCCTTTTTT TCTATCGCTA 880
TCATTGACC ATG CAC TCC TTT GCT TCT CTT CTG GCC 916
Me t His Ser Phe Alá Ser Leu Leu Alá
5
TAC GGC CTA GCC GCC AGC GCC ACC CTC GCT TCT GCC
Tyr 10 Gly Leu Alá Al a Ser 15 Alá Thr Leu Al a Ser 20 Al a
TCC CCC ATC GAA GCC CGG GGA AGC TGC ACC TTC AAA
Ser Pro I le Glu 25 Al a Arg Gly Ser Cy s 30 Thr Phe Ly s
ACG GCT GCT GCT GCC AAA GCG GGC AAG GCA GGG TGC
Thr Al a 35 Alá Al a Al a Ly s Al a 40 Gly Ly s Al a Gly Cy s 45
TCT ACC ATC ACC CTT GAC AAC ATC GAA GTC CCC GCT
Ser Thr I le Thr Leu 50 Asp Asn I le Glu Val 55 Pro Al a
GGA ACC ACC CTC GAC CTG ACC GGT CTC ACC AGC GGT
Gly Thr Thr 60 Leu Asp Leu Thr Gly 65 Leu Thr Ser G1 y
ACG AAG GTC ATC TTC GAG GGC ACC ACG ACC TTC GAT
Thr 70 Ly s Val 11 e Phe Glu 75 Gly Thr Thr Thr Phe 80 Asp
TAT GAA GAA TGG GCA GGC CCC TTG ATC TCC ATG AGT
Tyr Glu Glu Trp 85 Al a Gly Pro Leu I le 90 Ser Me t Ser
GGC AAA GAT ATC ACC GTC ACT GGT GCC TCA GGC CAT
Gly Ly s 95 Asp 11 e Thr Va 1 Thr 100 Gly Al a Ser Gly Hi s 105
CTC ATC AAC TGC GAC GGT GCG CGG TGG TGG GAC GGC
Leu 11 e Asn Cy s As p 110 Gly Al a Arg Trp Trp 115 As p Gly
AAG GGG ACC AGC GGA AAG AAG AAG CCC AAG TTC TTC
Ly s Gly Thr 120 Ser Gly Ly s Ly s Ly s 125 Pro Ly s Phe Phe
TAC GCT CAT GGC CTT GAC TCC TCG TCC ATT ACT GGA
Tyr 130 Al a Hi s Gly Leu Asp 135 Ser Ser Ser 11 e Thr 140 Gly
TTG AAT ATC AAG AAC ACT CCC CTT ATG GCG TTT AGT
Leu Asn I le Ly s 145 Asn Thr Pro Leu Me t 150 Alá Phe Ser
GTT CAG GCG GAT GAC ATC ACT CTG ACT GAC ATT ACC
Va 1 Gin 155 Al a Asp As p I le Thr 160 Leu Thr Asp I le Thr 165
952
988
1024
1060
1096
1132
1168
1204
1240
1276
1312
1348
1384
HU 220 337 B
ATC I le AAC AAC GCG GAC GGT GAT ACC CTG GGT GGA CAC 1420
Asn Asn Alá As p 170 Gly Asp Thr Leu Gly 175 Gly Hi s
AAC ACT GAT GCG TTT GAT GTT GGT AAC TCT GTC GGT 1456
Asn Thr Asp Alá 180 Phe As p Val Gly 185 Asn Ser Va 1 Gly
GTG AAT ATC ATC AAA CCG TGG GTC CAT AAC CAG GAT 1492
Val 190 Asn Ile Ile Ly s Pro 195 Trp Val Hi s Asn Gin 200 Asp
GAC Asp TGT Cys CTT GCG Leu Alá 205 ATC Ile AAC Asn TCT Ser GGC Gly GAG Glu 210 GTAAGCAGCT 1529
TTGAACATAG ATTTGATTTG CATGTATGTT GATATTCTAT AG 1571
AAC ATC TGG TTT ACC AGC GGC ACC TGC ATT GGC GGC 1607
Asn I le Trp Phe Thr 215 Ser Gly Thr Cys Ile 220 Gly Gly
CAC GGT CTC TCC ATC GGT TCT GTC GGC GGC CGC TCC 1643
His Gly Leu Ser 225 Ile Gly Ser Val 230 Gly Gly Arg Ser
AAC AAC GTT GTC AAG AAC GTC ACT ATC GAA CAC TCC 1679
Asn 235 Asn Val Val Ly s Asn 240 Val Thr Ile Glu Hi s 245 Ser
ACC GTG AGC AAT TCC GAG AAC GCC GTC CGG ATT AAG 1715
Thr Val Ser Asn 250 Ser Glu Asn Al a Val 255 Arg Ile Lys
ACC GTC TCT GGT GCC ACT GGT TCC GTG TCT GAG ATC 1751
Thr Val 260 Ser Gly Al a Thr Gly 265 Ser Val Ser Glu Ile 270
ACA TAC TCC AAC ATT GTC ATG TCC GGC ATC TCC GAT 1787
Thr Tyr Ser Asn Ile 275 Val Me t Ser Gly Ile 280 Ser Asp
TAC GGC GTC GTT ATC CAG CAG GAT TAC GAG GAT GGC 1823
Tyr Gly Val Val 285 Ile Gin Gin As p 290 Tyr Glu Asp Gly
AAG CCT ACG GGT AAG CCC ACG AAC GGT GTC ACT ATT 1859
Ly s 295 Pro Thr Gly Ly s Pro 300 Thr Asn Gly Val Thr 305 Ile
ACG GAT GTC AAG CTG GAG AGC GTG ACT GGT ACT GTG 1895
Thr Asp Val Lys 310 Leu Glu Ser Va 1 Thr 315 Gly Thr Va 1
GAT AGT AAG GCT ACT GAT ATC TAT CTC CTT TGC GGA 1931
Asp Ser 320 Lys Alá Thr Asp Ile 325 Tyr Leu Leu Cy s Gly 330
HU 220 337 B
TCT GGT AGC TGC TCG GAC TGG ACT TGG GAC GAT GTG 1967
Ser Gly Ser Cys Ser Asp Trp Thr Trp Asp Asp Val
335 340
AAG GTC ACT GGA GGA AAG AAG TCT ACT GCT TGC AAA 200 3
Lys Val Thr Gly Gly Lys Lys Ser Thr Alá Cys Lys
345 350
AAC TAC CCT TCG GTG GCT TCT TGC TAG GTTAGTAGGT 2040
Asn Tyr Pro Ser Val Alá Ser Cys 355 360 362
TGTTCGGTTG TAGCACTTGC TAACATGCAT TTGCCTTGAG 2080
GGGTCAAATG GATTTGTGAA ATTATCGGTG TGAAAGAAGA 2120
GATGGTGTCC AGTAAGATTC AGTGGTGGCA GCGTGTATAG 2160
CTCTATACAA TGTTATTTAT CGCATAACTC TATATATCAA 2200
ATACTCGATT AAGAGAACCT GCCTTCAGCC ACAAATAACC 2240
AAGTTCCTCG GCAGGTATCA GATTCCGGGA ACCCCTACCT 2280
AGCCTTACTC CGTTGCAGAT AGTTCTGCTG GTAAATCAGG 2320
ATGGTATGCT GAATTACGAT GCCAGCAAAT TCACCGCTAC 2360
TCCAACCCGC GCATAAAACA TACGCCAGAA GTGCAAGGGA 2400
TAAAGACAGC CAGCTGTGTC TTCGCGCAAG TAACTCTGCA 2440
TAATCCAGTT TCTGACATAG TATAGTCATC TCTTCTACAC 2480
CTTGGCAAAC TCCCTCTCCA TAAACTCCCT CACAGTAATA 2520
AGCGTCTCCC TCCCCTTCCC GCCCTTGGCC TTAAACGCCG 2560
CCTTCTTCAA CGCCGCAGCC GTTTGAATCT CCGTAGGCCC 2600
ATTACCAAAG TACTCCCCAT CCCTAAACTG CGAATAAATA 2640
AAAACATCCC GCTCCTGCTC ACGCCAATAC TCCCCTTTCG 2680
TATTCATGTC GTTCGGGTCC GCTAGAACCT CATACCGGGC 2720
TTTCTTGCCA GTCACTATAC CCATCACCGT CAGCATCTAC 2760
TCATCACTCA TCACGTAAAA GATAATGATA AGTAAAACCT 2800
TACCAGAAAC AAACGTATTC ACCACCTCCG CCGATGAAAC 2840
AATATCACTC GACCCCTGAA TCAGCCGTCT ATTCCACCGC 2880
AACGGGTTAA CAAAAACCCC ATGAACCAGA TCCCCAAAGT 2920
CATCCTTCAT ACTGATCCAG GGGAAATCTT CTTTCCCGCC 2960
CCAAAATGGC GTCTTGTATG TTAGATAACC CTCAGAGTCA 3000
GGGAATGTGG GCCATCCGCC GAATAAGTCG GCGTAGTCCG 3040
GCTCGAG 3047
SEQIDNo. 4
TÍPUSA: nukleotid a megfelelő polipeptiddel
HOSSZA: 2304 bázispár
SZÁLA: kettős
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EREDETE: genomból
FORRÁSSZERVEZET: Aspergillus nigerN400
KÍSÉRLETI FORRÁS: pGW1910 (DSM 5943) plazmid
JELLEMZŐI: az A. niger N400 prepro-poligalakturonáz-C enzimet kódoló pgaC gén 1-től 662-ig promoter
663-tól 710-ig a jelzőpeptid kódolószakasza 663-tól 782-ig a preproszekvencia kódolószakasza lehet 783-tól 1995-ig az érett PG-I kódolószakasza lehet 927-től 1001-ig intron
1428-tól 1483-ig intron
1614-től 1666-ig intron
1996-tól 1998-ig stopkodon
1999-től 2304-ig 3’ nem kódolószakasz, a terminátor része
CCATGGCTGA AACTTTGCCC CTGACCTAGT CCATTTCATT 40
TTATATAATG CTGATGAGAT ATGGTTCTTG CACAACTATG 80
CTTTTCCTCG GTCGGTGCGT AATGTATAGT TCGTGGGTGG 120
HU 220 337 B
TAAGGAAATT CACCGACAGC AACTCCCAGC ATAACATGGA 160
GAAGAACCGA TGAATGAGCA GCGACAAACA TGGTACCACA 200
ATTCTTGAAT AAGCATTTAG ACTCCGGCTT GGTTTTTTCC 240
GTTGCATTGG CGCTGGTGTT GTTCCTGCGC ACGGTGCAAC 280
CGTTATCTCC ACCAATGATT ACCTGCAGAA AGCCCATGGC 320
TGCAACCACC CAGCCGACTT GAGTCCACCT AACAGCATAC 360
TCAGCATACT CGATGCTGGG AATTACTTCA GGTATGGTCG 400
GCTGAATATG CAGTCGATTT CCGGCGCCAG GAACAGTCCG 440
GCCCCCTCAC CACGGACATA GACCCGCCAC CAAAACGTCG 480
ATAGCGGCCT CGCTTCGTCA ACGACCATTT TGCCCACCCC 520
TGACACCCAG GAAAGACGTC TTCCAATAAC AATATAAAAG 560
GGCGAGTCTT GTCCTCTCAC TTTCCGTCTT TCGAGTATGC 600
CTTGCCAGTT CCCAACTTGA CTTGAGACCT CCCATTTCGG 640
TCATTTGTCA CCCGCTATAA GA ATG GTC CGT CAG CTT 677
Met Val Arg Gin Leu
5
ATC Ile CTG ATC AGC AGT CTG CTG GCA Al a GCT Al a GTT Val 15 GCT Al a GTG Va 1 713
Leu Ile Ser Ser 10 Leu Leu
CGC GCG CCT GCC GAT CCG GCT CAT CCC ATG GTT ACG 749
Arg Al a Pro Al a Asp Pro Al a Hi s Pro Me t Va 1 Thr
20 25
GAA GCG CCT GAC GTC AAT TTG GTT GAA AAG AGG GCG 785
Glu Al a Pro Asp Val Asn Leu Val Glu Ly s Arg Alá
30 35 40
ACT ACT TGC ACC TTC TCG GGC TCC GAA GGT GCA TCC 821
Thr Thr Cy s Thr Phe Ser Gly Ser Glu Gly Al a Ser
45 50
AAG GCC AGC AAG TCG AAA ACC TCT TGC TCC ACA ATC 857
Ly s Al a Ser Ly s Ser Ly s Thr Ser Cy s Ser Thr Ile
55 60 65
TAC CTG TCC GAC GTG GCC GTC CCA TCT GGC ACA ACC 893
Tyr Leu Ser Asp Va 1 Al a Val Pro Ser Gly Thr Thr
70 75
CTT GAT CTC TCT GAC CTG AAT GAT GGA ACC CAC 926
Leu As p Leu Se r Asp Leu Asn As p Gly Thr Hi s
80 85
GTACGTTCCC CGGGTGATTC ATGTCTTATT CTCACACCCA 966
ATCGCGTCAA TAGTACTGGC TGACAGATGT ACTAG GTG ATC TTC 1010 Val Ile Phe
90
CAG GGA GAA ACC ACT TTT GGA TAC GAG GAA TGG GAA 1046
Gin Gly Glu Thr Thr Phe Gly Tyr Glu Glu Trp Glu
95 100
GGG CCT CTT GTG CGT GTT TCT GGA ACT GAT ATC ACG 1082
Gly Pro Leu Val Arg Val Ser Gly Thr As p Ile Thr
105 110 115
HU 220 337 Β
GTC GAG GGG GAG AGC GAC GCG GTG CTC Leu AAT GGC GAT Asp 1118
Val Glu Gly Glu Ser 120 Asp Al a Val Asn 125 Gly
GGC AGC CGC TGG TGG GAT GGA GAG GGT GGC AAT GGT 1154
Gly Ser Arg Trp Trp Asp Gly Glu Gly Gly Asn Gly
130 135
GGT AAA ACA AAG CCC AAG TTC TTC TAT GCC CAT GAC 1190
Gly Ly s Thr Ly s Pro Lys Phe Phe Tyr Al a Hí s Asp
140 145 150
TTG ACC TCT TCC ACC ATC AAG AGC ATC TAC ATC GAG 1226
Leu Thr Ser Ser Thr Ile Lys Ser Ile Tyr Ile Glu
155 160
AAC TCT CCT GTG CAG GTG TTC AGC ATC GAT GGC TCC 1262
Asn Ser Pro Val Gin Val Phe Ser Ile Asp Gly Ser
165 170 175
ACT GAT CTT ACC ATG ACT GAT ATC ACG GTG GAT AAC 1298
Thr Asp Leu Thr Me t Thr Asp Ile Thr Val Asp Asn
180 185
ACG GAT GGT GAC ACG GAC GAC CTC GCC GCC AAT ACG 1334
Thr Asp Gly Asp Thr Asp As p Leu Al a Al a Asn Thr
190 195
GAT GGC TTC GAC ATC GGG GAA AGC ACC TAT ATC ACG 1370
Asp Gly Phe As p I 1 e Gly Glu Ser Thr Tyr Ile Thr
200 205 210
ATC ACA GGT GCC GAA ATC TAC AAC CAA GAT GAC TGC 1406
Ile Thr Gly Al a Glu Ile Tyr Asn Gin As p Asp Cy s
215 220
GTT GCC ATC AAT TCT GGA GAG GTATGCGTCC CCTGGCACTG 1447
Val Al a Ile Asn Ser Gly Glu
225 230
ATTGAGAGGA GAGGCGCCTT GCTGACGAT CTGGTAG AAC 1486
Asn
ATT TAT TTC AGT GCC Al a AGT GTG TGT TCT GGT Gly GGT Gly CAC Hi s 1522
Ile Tyr Phe Ser 235 Ser Val Cy s Ser 240
GGC CTG TCT ATT GGC TCT GTT GGT GGT CGG GAT GAT 1558
Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly Arg As p As p
245 250 255
AAC ACT GTC AAG AAC GTG ACG TTT TAT GAT GTC AAT 1594
Asn Thr Val Lys Asn Val Thr Phe Tyr Asp Val Asn
260 265
GTT CTC AAG TCC CAG CAA GGTAAGGGAA AGCATTTGAA 1632
Val Leu Lys Ser Gin Gin
270
HU 220 337 Β
CCATCCGTTT GCCGTCCTCT AACGTATGCT TTA GCA ATC CGT 1674
Alá 11e Arg
275
ATC AAG ACC ATC TAC Tyr GGC Gly GAC ACT GGC TCC Ser GTC Val AGC Ser 1710
lle Lys Thr lle 280 Asp Thr Gly 285
GAA GTC ACT TAC CAT GAG ATT GCC TTT TCG GAC GCT 1746
Glu Val Thr Tyr Hi s Glu lle Al a Phe Ser As p Alá
290 295 300
ACT GAT TAC GGC ATT GTC ATT GAG CAG AAC TAT GAT 1 782
Thr Asp Tyr Gly lle Val lle Glu Gin Asn Tyr Asp
305 310
GAC ACC TCC AAG ACC CCT ACT ACC GGG GTA CCG ATC 1818
As p Thr Ser Lys Thr Pro Thr Thr Gly Val Pro lle
315 320
ACG GAT TTT GTG CTC GAG AAC ATC GTT GGA ACG TGT 1854
Thr As p Phe Va 1 Leu Gl u As n lle Val Gly Thr Cys
325 330 335
GAA GAT GAT GAT TGT ACC GAA GTA TAC ATT GCC TGC 1890
Glu As p Asp Asp Cy s Thr Glu Va 1 Tyr lle Al a Cy s
340 345
GGT GAT GGC AGC TGC TCG GAT TGG ACT TGG ACT GGC 1926
Gly As p Gly Ser Cy s Ser As p Trp Thr Trp Thr Gly
350 355 360
GTG AGC GTG ACT GGC GGC AGT GTC AGT GAC GAC TGC 1962
Val Ser Val Thr Gly Gly Ser Va 1 Ser Asp Asp Cys
365 370
CTT AAT GTT CCC TCC GGG ATT AGC TGC GAT TTG TAG 1998
Leu Asn Val Pro Ser Gly lle Ser Cys As p Leu
375 380 383
GCCGTTGTGA TTGGGGGAGA TGTTCCCGGG TACTCTGGTC 2038 GTTCGTTTAG CCAGCCCTTT CTGTTGAGTG GCCTGTTCTT 2078 CTATACTGTC GATTGTGTGT GAGATTACTA CCTTGCCCGA 2118 GGAAAGAGCA GTGCATCCTA TCTTTTATTC TTTGCCGGTC 2158 GGGGTTGGCC TACTAGTACA TTGTACCCGA AGAGTCAACG 2198 GTGAAAGTAA AGGGCTTACA GAATTAGTCC AGGAGCAAAG 2238 ACAACTTTTA TCAGAGCGCA TCGGTCACGT CATGTTGAAA 2278 GTATTGATCA ATGAAGATAA CCTTGG 2304

Claims (28)

1. Rekombináns DNS-molekulák, azzal jellemez- 55 ve, hogy olyan DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek
a) a pGW1800 (DSM 5505) vagy pGW1900 (DSM
5866) plazmid Aspergillus nigerből származó DNS inszertjét hordozzák, vagy 60
b) képesek hibridizálódni az a) inszertben elhelyezkedő teljes PG-II-t vagy PG-I-t kódoló szakasszal és egy galakturonáz vagy poligalakturonáz-aktivitással rendelkező polipeptid struktúrgénjéból, és adott esetben egy promoterből és/vagy jellemző- vagy vezetőpeptid kódoló tartományából és/vagy egy PG-t kódoló tartományból és/vagy egy transzkripciós terminátorból állnak, vagy
HU 220 337 Β
c) az a) vagy b) DNS-szekvenciák egy funkcionális származékát képviselik, vagy
d) egy teljes PG-t vagy annak egy jelző-, vagy vezetőpeptidjét kódolják, és az a), b) vagy c) DNS-szekvenciák tekintetében a genetikai kód vonatkozásában degeneráltak.
2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidoknak az Aspergillus nigerből származó DNS inszertjét tartalmazza.
3. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNSmolekula, azzal jellemezve, hogy a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidok DNS inszertjében elhelyezkedő, a teljes PG-II-t vagy PG-I-t kódoló szakasszal hibridizálódni képes DNS-szekvenciát tartalmaz, és egy galakturonáz vagy poligalakturonáz-aktivitással rendelkező polipeptidet és/vagy egy promotert és/vagy egy pepiidet kódol, és/vagy promoter és/vagy transzkripciós terminátor aktivitással rendelkezik.
4. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy vagy a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidok Aspergillus niger eredetű DNS inszertjének egy funkcionális származékát, vagy a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidok DNS inszertjében elhelyezkedő, a teljes PG-II-t vagy PG-I-t kódoló szakasszal hibridizálódni képes DNS-szekvenciát, amely egy galakturonáz vagy poligalakturonáz-aktivitással rendelkező polipeptidet és/vagy egy, jelző- vagy vezetőpeptidet kódol, képvisel és/vagy promoter és/vagy transzkripciós terminátor aktivitással rendelkezik.
5. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a lambda-PG-A9, -A 10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 és -Y33 pGW1910, pGW1800, pGW1900 vagy pGW1756 vektor inszertjét vagy funkcionális fragmentumát tartalmazza.
6. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNSmolekula, azzal jellemezve, hölgy a pGW1800 vagy pGW1900 plazmidok Aspergillus niger eredetű inszertjének funkcionális DNS-ffagmentumát vagy egy, az említett DNS-inszertek teljes PG-II-t vagy PG-I-t kódoló szakaszával hibridizálódni képes, és egy szerkezeti gént és/vagy egy vezető- vagy jelzőpeptidet kódol és/vagy egy promoter és/vagy egy transzkripciós terminátor aktivitású szekvenciát tartalmaz.
7. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a lambda-PG-A9, -A 10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 és -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 vagy pGW1756 vektor inszertjéből származó, promoteraktivitású DNS-ffagmentumot tartalmaz.
8. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNSmolekula, azzal jellemezve, hogy a lambda-PG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -X31 és -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 vagy pGW1756 vektor inszertjéből származó, egy vezetőpeptidet kódoló DNS-ffagmentumot tartalmaz.
9. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a lambda-PG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 és -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 vagy pGW1756 vektor inszertjéből származó, egy jelzőpeptidet kódoló DNS-ffagmentumot tartalmaz.
10. A 6, igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a lambda-PG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 és -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 vagy pGW1756 vektor inszertjéből származó, transzkripciós terminátor aktivitású DNS-ffagmentumot tartalmaz.
11. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a lambda-PG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -Cl6, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 és -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 vagy pGW1756 vektor inszertjéből származó, egy galakturonáz- vagy poligalakturonáz szerkezeti gént vagy egy galakturonázvagy poligalakturonáz-aktivitású ffagmentumát kódoló DNS-ffagmentumot tartalmaz.
12. Az 1. igénypont szerint rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az egy expressziós kazetta.
13. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az egy hibrid vektor.
14. A 13. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a pGW1800, pGW1900, pGW1910, pGW1756, lambda-PG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 és -Y33 vektorok egyike.
15. DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a pGW1800 (DSM 5505) vagy pGW1900 (DSM 5866) plazmidból izolált PG gén vagy ennek funkcionális fragmentuma.
16. A 15. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a pGW1800, pGW1900, pGW1910, pGW1756, lambda-PG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 vagy -Y33 hibrid vektor inszertje vagy a PG gén promoterszakasza vagy egy szignálpeptid, vezetőpeptid, prepro-PG, a PG gént kódoló szakasza vagy egy galakturonáz- vagy poligalakturonáz-aktivitású PG-ffagmentum vagy a PG gén transzkripciós terminátorszakasza.
17. Eljárás egy 1. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula vagy egy 15. igénypont szerinti DNSmolekula előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) DNS-t izolálunk megfelelő gombasejt genomból, majd kiválasztjuk a kívánt DNS-molekulát, például egy minta-DNS segítségével vagy egy megfelelő expressziós rendszer alkalmazásával, és a keresett polipeptid alapján szkrínelést végzünk, vagy
b) mRNS-t izolálunk megfelelő gombasejtekből, majd kiválasztjuk a kívánt mRNS-molekulát, például egy minta-DNS-sel való hibridizálás segítségével vagy megfelelő expressziós rendszerben való kifejezéssel, és a keresett polipeptid kifejezése alapján szkrínelést
HU 220 337 Β végzünk, a kiválasztott mRNS-sel komplementer egyszálú, majd ebből kettős szálú cDNS-másolatot készítve, vagy
c) cDNS-könyvtárból izoláljuk a cDNS-t és kiválasztjuk a kívánt cDNS-molekulát, például minta-DNS alkalmazásával vagy egy alkalmas expressziós rendszer felhasználásával, és a kívánt polipeptid kifejezése alapján szkrínelést végzünk, és/vagy
d) az a), b) vagy c) pont szerint előállított kettős szálú DNS-t megfelelő vektorba inkorporáljuk,
e) megfelelő gazdasejteket transzformálunk a kapott hibrid vektorral,
f) kiválasztjuk a transzformált gazdasejteket, amelyek a keresett DNS-t tartalmazzák, a nem transzformáltak közül, vagy szaporítjuk a transzformált gazdasejteket, és szükség esetén
g) izoláljuk a kívánt DNS-t és/vagy a DNS-t mutánssá vagy funkcionális fragmentummá alakítjuk.
18. Gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy azt az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulával transzformáltuk.
19. Eljárás a 18. igénypont szerinti transzformált gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megfelelő gazdaszervezetet a transzformációt elősegítő körülmények között egy 1. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekulával kezelünk, adott esetben egy szelekciós marker génnel együtt, majd adott esetben a transzformánsokat szelektáljuk.
20. Eljárás polipeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulába foglalt struktúrgént, amely molekula egy expressziós kazetta, egy megfelelő transzformált gazdaszervezetben ismert módon kifejezünk, és adott esetben a polipeptidet szokásos eljárásokkal izoláljuk.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként az Aspergillus niger egy törzsét alkalmazzuk.
22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként egy Aspergillus nidulans törzset alkalmazunk.
23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan strukturgént fejezünk ki, amely a BDBB hibrid interferont kódolja.
24. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan strukturgént fejezünk ki, amely egy galakturonáz- vagy poligalakturonáz-aktivitású polipeptidet kódol, és egy, az 1. igénypont szerinti DNS-szekvenciából származik.
25. Eljárás egy homogén poligalakturonáz előállítására, azzal jellemezve, hogy azt pGWl 800-val (DSM 5505) vagy pGW1900-val (DSM 5866) transzformált Aspergillus nigerrel előállított nyers enzimkeverékből izoláljuk és tisztítjuk.
26. Homogén galakturonáz vagy poligalakturonáz vagy ezek galakturonáz- vagy poligalakturonáz-aktivitású származéka és biológiailag elfogadható sói, azzal jellemezve, hogy ezeket az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia kódolja.
27. Enzimkészítmény, azzal jellemezve, hogy a 26. igénypont szerinti polipeptidet vagy ennek keverékét adott esetben előre meghatározott arányban egy vagy több, a PG-től eltérő aktivitású enzimmel együtt tartalmazza.
28. Eljárás növényi eredetű anyagok feldolgozására, azzal jellemezve, hogy azok kezelésére egy 26. igénypont szerinti polipeptidet vagy egy 27. igénypont szerinti enzimkészítményt alkalmazunk.
HU726/90A 1989-09-02 1990-08-31 Rekombináns DNS-molekulák, eljárás előállításukra és alkalmazásuk HU220337B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898919884A GB8919884D0 (en) 1989-09-02 1989-09-02 Fungal expression system
GB909013616A GB9013616D0 (en) 1989-09-02 1990-06-19 Fungal expression system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT54735A HUT54735A (en) 1991-03-28
HU220337B true HU220337B (hu) 2001-12-28

Family

ID=26295856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU726/90A HU220337B (hu) 1989-09-02 1990-08-31 Rekombináns DNS-molekulák, eljárás előállításukra és alkalmazásuk

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0421919A3 (hu)
JP (1) JP3576549B2 (hu)
AU (1) AU640405B2 (hu)
CA (1) CA2024487C (hu)
FI (1) FI105206B (hu)
HU (1) HU220337B (hu)
IE (1) IE903180A1 (hu)
IL (1) IL95553A (hu)
NO (1) NO316388B1 (hu)
NZ (1) NZ235115A (hu)
PT (1) PT95171B (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5863783A (en) * 1991-03-27 1999-01-26 Gist-Brocades, N.V. Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
WO1993012237A1 (en) * 1991-12-09 1993-06-24 Unilever N.V. Process for producing/secreting a protein by a transformed mould using expression/secretion regulating regions derived from an aspergillus endoxylanase ii gene
EP0675950A1 (en) * 1992-12-23 1995-10-11 Novo Nordisk A/S An enzyme with polygalacturonase activity
US5624834A (en) * 1992-12-24 1997-04-29 Gist-Brocades, B.V. Cloning and expression of the exo-polygalacturonase gene from aspergillus
US5674728A (en) * 1993-11-03 1997-10-07 Novartis Corporation Aspergillus niger vacuolar aspartyl protease
AU2724799A (en) * 1998-02-10 1999-08-30 Dsm N.V. Novel endo-xylogalacturonase
AU6203099A (en) 1998-09-18 2000-04-10 Dsm N.V. Aspergillus tubigensis polygalacturonase
ES2303506T3 (es) * 1999-03-22 2008-08-16 Novozymes A/S Metodo de tratamiento enzimatico.
US8765442B2 (en) 2008-12-19 2014-07-01 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for production of an enzyme product
WO2023048199A1 (ja) * 2021-09-22 2023-03-30 花王株式会社 糖化酵素の製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8626879D0 (en) * 1986-11-11 1986-12-10 Ici Plc Dna
GB8702475D0 (en) * 1987-02-04 1987-03-11 Ciba Geigy Ag Expression system
DE3908813A1 (de) * 1989-03-17 1990-09-20 Roehm Gmbh Verfahren zur expression eines aus aspergillus niger stammenden gens in einem aspergillus

Also Published As

Publication number Publication date
FI105206B (fi) 2000-06-30
NO316388B1 (no) 2004-01-19
IL95553A0 (en) 1991-06-30
CA2024487C (en) 2008-04-29
CA2024487A1 (en) 1991-03-03
EP0421919A2 (en) 1991-04-10
NO903812L (no) 1991-03-04
NO903812D0 (no) 1990-08-31
AU640405B2 (en) 1993-08-26
HUT54735A (en) 1991-03-28
PT95171A (pt) 1991-06-25
PT95171B (pt) 1997-09-30
EP0421919A3 (en) 1992-04-15
NZ235115A (en) 1991-09-25
FI904299A0 (fi) 1990-08-31
JP3576549B2 (ja) 2004-10-13
AU6205490A (en) 1991-03-07
IL95553A (en) 2005-12-18
IE903180A1 (en) 1991-03-13
JPH03224489A (ja) 1991-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7517668B1 (en) Process for the production of protein products in aspergillus
US5863759A (en) Process for the production of protein products in aspergillus
DK175814B1 (da) Transformation af Trichoderma
EP2408910B1 (en) Chrysosporium lucknowense protein production system
US5874558A (en) Nucleic acid encoding a recombinant humicola sp. lipase
AU598490B2 (en) Human mutant tPA with modified glycosylation sites
Pařenicová et al. Characterization of a novel endopolygalacturonase from Aspergillus niger with unique kinetic properties
EP1975237B1 (en) Beta-fructofuranosidase variants and uses thereof
HU220337B (hu) Rekombináns DNS-molekulák, eljárás előállításukra és alkalmazásuk
HU214005B (hu) Eljárás tarnszformált gazdasejtek és polipeptidek előállítására új gombakifejező rendszerrel
EP0506190B1 (en) Cloning and expression of genes encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
CA1338859C (en) Expression system
Kanai et al. Recombinant thermostable cycloinulo-oligosaccharide fructanotransferase produced by Saccharomyces cerevisiae
US5447862A (en) Pectin lyase genes of aspergillus niger
CA2032035C (en) Fungal expression system
US11371032B2 (en) Beta glucosidase with high glucose tolerance, high thermal stability and broad PH activity spectrum
KR0179653B1 (ko) 진균 발현 시스템
AU644101B2 (en) Polygalacturonase gene from erwinia carotovora and its molecular cloning
CA2149641A1 (en) Methods for converting a, ab and b blood types to o blood type

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG, CH