PT95171B - Processo para a preparacao de uma molecula de dna recombinante codificadora de uma cassette de expressao de poligalacturonase - Google Patents

Description

(J invento está relacionado com com o campo da engenha ria genética e proporciona novas moléculas de DNA compreendendo sequências de DNA codificadoras de proteínas t. cun actividade de pol.i.galacturonase e/ou o promotor, sequências sinal e/ou sequên.....

cias terminadoras da transcrição que lhes estejam naturalmente ligadas. As novas moléculas de DNA são úteis para a construção de cassetes de expressão para a produção de poligalacturonases ou para a expressão de genes estranhos em fungos filamentosos.

Εί1ΰΐ;!>1Π'θΰ.1ο......dg.......Invento

Apesar de nas técnicas de engenharia genética serem jã conhecidos numerosos sistemas de expressão de polipeptideos para hospedeiros procarióticos e eucariõticos, existe uma necessidade continua de novos sistemas que tenham vantagens relativamente a s i. s t e ι η α s a n t e r ί o res.

São hospedeiros largamente usados a procariota

Eseher l.r;hl.a......íSSÚLl ^e as leveduras eucarióticas» e. g.. S a c ch a r o ni y ces ccrevisiae, para os quais foram desenvolvidos um grande numero de d i. f e i - e n t es v e c t o r e s d e ex pr e s s α o h i b r i d os, a maioria p 1 a s m í d e o s..

As desvantagens dos hospedeiros E„.........coli são eles nao poderem glicosilar polipeptideos e a expressão intracelular de peptídeos pstranhos poder conduzir a acumulação dentro da célula hospedeira e inibição dc crescimento. As leveduras glicosilam, no entanto,

t. L somo ...............reli., não secretam os polipeptideos, excepto os peq ϋ Ί'.; ,s., para o meio nutritivo, mas sim para o espaço periplas.....

mótico. Os hospedeiros eucariõticos superiores tais como células tumoris do mamífero são capazes de glicosilar e secretam para o meio nutritivo, no entanto, a sua cultura é lenta e dispendiosa e exi.ste γ· perigo de ãcidos nucleicos oncogénicos poderem ser isolados Juntamente corn o peptlcleci pretendido..

Ao procurar.....se outros hospedeiros também foram investi.....

gados fungos filamentosos, tais como Neurospora..................crassa, àseprgillus......nidulans e Aspergillus............niger.. A sua aplicação em técnicas de engenharia genética tem si cl o lenta, principalmente devido à inexistênci.a cie um sistema cie transformação adequado, Ao contrario de Saccharomyces......cerevisiae., os fungos filamentosos nao contêm plasmídeos que possam ser usado para a introdução de genes estranhos e selecção fenotipica, Ê, no entanto, possível trans.....

formar fungos filamentosos com plasmídeos estranhos contendo um gene para uma marca selectiva.. A maior parte dos vectores até agora descritos para os fungos filamentosos nao se replicam autonomamente como o fazem os das leveduras, mas antes sao integrados no cromossoma cio fungo. Mo entanto, a trans Formação integrativa torna os tranformantes mi.tóticamente muito estáveis, rnesmo sob condiçoes nao selectivas., Foi descrita a integração > I. de mais de uma centena de copias.

primeiro vector descrito para fungos filamentosos

r-ontínha o gene qa 2 de	Meuroseora............crassa	como 111.:/1-,1	selectiva
[Case, ii. E, , Schweizer,	i. , Kushner, S, R,	e G:i 1es, N	, H„ (1.979 )
f‘; tu , Natl., Acad, 8::.1.,	USA 76, 5259.....6263;	Case, Ι'Ί, E„	(1982) em
«Geί ί e t ic Εn g 1, n eer in g o f	M ::i, c r o or gan i sms for	Chemicals	(Hollander,
A, , Delvloss. D, , Kaplan,	8., , Konisky, J, ,	Savage, D.	, e Holfe,
2,8,, eds), pp, 87.....100,	Plen um J..
Em Aspergillus	.......nidulans, que tem	um ciclo sexuado e é

portanto adequado às manipulações genéticas clássicas, foram descritos sistemas de selecção positivos e negativos (Ballanoe et al. BBRC 11,2., 284, 1983; Tilhurn et al, , Gene 28, 205, 1983; Yel.ton et al, PNAS 81 1.470, 1984; Yeltnn e Timberlake J, Cel l.

Biochem. Suppl. 9C„ 173, 1985; Johnatone et al.. EMBO J. 4, 1307,

1983; Tilburn et al,. Gene 26, 205, 1983; Wernars et al.. , Curr. Genet. 9, 361, 1935; Kelly, J. M„ et al.. , EMBO J. 4, 475, 1985)..

Comparado com tt.........crassa ou A............nidulans, A..........niger é d> .· longe o organismo mais importante uma vez que é usado largamente na produção industrial de enzimas, e„ g.. , para usar na industria alimentar. Sabe.....se que A..........niger secreta uma variedade de enzimas |· ι idr o 1 x t icas, e.g., g 1 uc o am x 1 ase. ctami 1 ase, pe c t x nase, ce 1. u 1 ase,

b.....g 1 u canase, β.....g a 1 a c t o s x d as e, n a r x n g i nase, p e n t osanase, pr o t ease ácida e linhase, a gl.ucoamil.ase e o complexo de pecbinases sendo os mais importantes..

A...........niger nao tem nenhum ciclo sexuado conhecido.. Assim as mutações não podem ser introduzidas via recombinação meiútica.

Nii entanto, através dos processos clássicos de mutação e selec......

ção, foram conseguidos grandes melhoramentos de estirpes relati.....

v a men te â secreção de enzimas hidrolx.tx.cas.

Dos genes das enzimas de A.. nlger apenas os da glucoa milase (Boel et al.. , EMBO J.. 3, 1531., 1984) e da álcool o aldeído- desidrogenase (WO 86/06097) juntamente com as suas sequências de promotor· e sinal foram caracterizados e e usados em exper iências de transformação corn A...........i; i dul.ans e A,.........niger..

Como marcas selectivas para A,..........niger têm sido usados o gene heterõlogo ainds (Kelly e Hynes, EMBO J. 4, 475, 1985) e o gene ar gB (Buxton et al. , Gene 37, 207, 1.965; EP 1.84 438; WO

86/06097), arnbos obtidos a partir de A...........nidulans.

A...........nlger· é o microorganismo mais importante para a produç3o industrial. de enzimas que degradam pectina, e.. g.. , ρ o 1.ig a I a c' · uι o n ases, p e c t i. n a · 1. i ases o u p e c!:.. 1. n a.....e s t e r a s e s.. As pecbinas são poligalacturonetí::>s de alta peso molecular (20000.....

40000 D) consistindo em polímeros do ãcido D.....galacturônico ligados por ligações as~1, 4.....glicosxdicas. Alguns dos grupos de ácido urónico sao esterif içados coro metanol o qual pode ser removido por pectina estearase. As pectina® ocorrem ria natureza corno constituintes das células de plantas superiores, onde elas estão ligadas a moléculas de celulose essencialmente encontradas na parede celular primária e na lamela média.. Entre as fontes mais ricas de pectina encontra.....se a casca do limão e da laranja., a qual. contém cerca de 30% deste polissacárido,, As enzimas pécbicas degradam o substrato polímero de carboidratos por

I·) i d r ci 1. x s e d a 1 i. g a ç ã o as ~ 1, 4 - g 1.1. c o s í d ± c a (e n d o e ex o ρ o 1 x g a I a c t u ronases) ou por transeliminação (pectina.....liases) conduzindo α as 4,5 poli.- ou oligogalacturoneto insaturado. □ nome sistemático d e e n d ο ρ o 1 i g a 1. a c t u r o nase é ( ρ o 1 i.....(1, 4.....α.....D.....g a 1 a c t u r o n e t o ) ) g 1 x c a η o hidrolase ( EC 3. 2. 1.15) e de exo.....poligalacturonase é (poli.....(I, 4-~«

D.....galacturonetoJ ).....galacturono.....hidrolase (EC 3.. 2.. 1.. 67).. Uma outra enzima galacturonase degradadora de pectina i rn ρ o r t a n t e é r a m η o g a 1. a c t u r o nase q u e h i d r o 1 x z a 1. i g ações e n t r e as D g a 1 a c 1 u r o n a b o e L. r a m η o s e..

Enquanto as pectinas p e c. t i nas a 11 a m e n te es t e r x f x c a d a s zam pectinas pouco esterxficadas.

.....es tearases e ρo1xga1acturonases p e c 11 nas a 1t a me n te este r i f 1. c a d as..

liases são específicas para a s ρo1iga1acturonases hidrο 1 i.....

A acção combinada de pectina.....

pode t a m b é m d e s ρ o 1 i m e r i x a r

As aplicaçSes de poligalacturonase e suas misturas de enzimas no processamento de frutas e vegetais (Tabela 1) desen.....

volveram-se a partir das utilizações originais das enzimas pectinas para o tratamento de frutos macios para assegurar elevados rendimentos de sumo e pigmentos quando do espremer dos frutos e na clarificação de sumos.. As preparações técnicas d enzimas utilizada© nestes processos contêm pectina.....estearases, po ! igalacturonases e pectinas.....liases ern quantidades variáveis juntamente com outras enzimas tais corno arabinases, galactanases, xilanases, |3.....1, 4.....glucanases, glicosidases e proteases,.

Preparações de peetinases fúngicas contendo predominen temente endopoligalacturonase e sem pectina.....estearase sao usadas com êxito como enzimas de maceração para a produção de nectares de polpa os quais têm uma consistência mais suave e teores mais elevados de sólidos, pigmentos e nutrientes solúveis do que os produtos por um processo térmico mecânico..

Ta hei a......1 (da referência 32):: Utilização da galacturonases e suas misturas na indústria de frutos e vegetais.

'.eximas

I³ o 1 i g a 1 a c: t u r o n ase

Maceração, estabilização de sumos de cibrinos/redueão da viscosidade

P e c t i. n e s t e r ase T Ρ o 1.i. g a 1 a c t u e / o u P e c: b i η α I. i ase .ctu..... Clarificação de sumos, rona extracção de sumo/óleo.

Oleo da pele de citrinos.

lavagem da polpa de citrinos

P e c t :i. n e s t e rase / Ρ o 1 i g a 1 a c t u ~ t :. n a.....Ί . 1 a s e -1 (II e m i.....) Ί £

Ce Lu la sos

I i cí u e f · a c ç a o, s u m o s r cs n a s e /1³ e c i ι ri p i d o s /1 u r v o s

Aumento da extracção de P r o d u to s naturais Valorização de b i.. o m a s s a / a 1 i m e ι r b o

Δ p: - e s e n ç a d e ρ e c b i n a e s b e a r a s e μ o cl e í á r ί I m e n b e b r a n s formar a actividade de maceração de uma poligalacturonase pura em actividade de desintegração celular devido ã actividade de •' Oj η i ί iiíi'. ;· izacao generalizada da combinação de pectina esteara.....

se/ μ: 11 í i. g a 1 a o 111r o n a s e..

Através da utilização de enzimas péoticas e celulol.it Το as as paredes celulares da polpa de frutos podem ser degradadas até uma fase de quase completa liquef acção.. E essencial a presen.....

ra de enrlo..... e exo.....β.....1, 4glucanases (celulases) assim como de ei i z i mas péo t i.cas (ref.. 31. )..

Poligalacturonase e suas misturas de enzimas podem também ser úteis na liquefacção e e sacarifacçao de biomassa, per exemplo para a produção de polissacaridos fermentáveis a partir cie células vegetais (ref.. 33) ou para a modificação de pectinas (p a r a u rn a rev i s a o ver r e f32).. P o 1 i g a 1 a c t u r on ases e m o o m b i n a ç ã o com xilanases sao também úteis poe exemplo na indústria de pasta de papel (ref.. 44)..

Em Λ,.........n.iger as proteínas do complexo pecbico nao sao expressas constitutivamente. Em condiçoes de indução usando pectina ou seus produtos de degradação. A...........niger expr essa as enzimas atrás referidas, quan d o outras fontes de carbono, tais como glucose ou su crase, são limit antes do crescimento.. Nas culturas de superfície as enzimas péctieas tendem a permanecer associadas a parede celular externa..

Em l,o Rexová.....Benková e Markovic (ref.. 29) eomo Rombouts e Pi.lnik (ref.. 15) descrevem urna série de poligalaeturonases obtidas a partir de Aspergillus nigcr e outros fungos, assim como a partir de bactérias e de plantas, as quais foram descritas como purificadas,. No entanto, como nao foram fornecidos quaisquer dados estruturais mantém.....se a necessidade de poligalacturonase®

Isoladas com elevada actividade específica. Vantajosamente elas deverão estar suficientemente puras para permitir a determinação das suas sequências de aminoácidos.

Daqui em diante as poligalacturonases sao também designadas PG..

Qb.isitívo......ds......invento

Gs objectivos do presente invento sao PGs isoladas purificadas derivadas de hospedeiros naturais ou transformados.

presente invento baseia.....se na purificação e determi.....

nação parcial da estrutura de PGs isoladas, e., g. PGI, II, II IA, IHB, IV, empar ti cu lar PGI ou PGII, o que permite a síntese de sondas de DNA codif icadoras de partes importantes da proteína..

Um objectivo do presente invento é o despiste e isolamento por meio de sondas de DNA, sequências de DNA codificadoras de PGII ou PGI, eventualmente juntamente com pre e post.....sequen.....

cias, de uma biblioteca de genes de A...........niger. Um outro objectivo é identificar outros genes PG por hibridaçâo de partes do gene PUfí (d esignedo pga.11) ou do gene PGI (designado pgal) com uma biblioteca de genes de uma estirpe de fungos, e. g.. de A.. niger..

Outros objectivos são moléculas de DNA recombinante codificadoras de cassetes de expressão do gene da pol:igalacturu.....

nase, facultativamente com sequências intrâo e/ou sequências reguladoras de um gene PG, e.g., sequências de promotor, sinal e/ou de terminador da transcrição. Outras moléculas de DNA recombinante do invento são, por exemplo, vectores híbridos ϊ-empreendendo DNA derivado de um gene PG do invento..

Outros objectivos sao hospedeiros, especialraente fungos fi'lamentosos, e. g.. hospedeiros Aspergillus, transformados com os referidos vectores, métodos para a preparação das moléculas de RNA recombinante e os hospedeiros transformados e utilização das mt d ι'τ;ulas de DNA recombinante para a preparação das novas casse s tes de expressão ou vectores híbridos..

Um objectivo do presente invento ê também a superprodução de PGs, por exemplo em espécies de Asperglllus e a produção de PGs isoladas que não estejam contaminadas com outras PGs., cu dw misturas de PGs artificiais predeterminadas..

Um outro objectivo diz respeito ã produção de qualquer proteína heteróloga cujo gene estrutural, pode ser expressa sob o c,:'·.;-ij: dos presentes DNAs recombinantes de PG..

Os vários temas do invento tornar.....se.....ão mais evidentes a partir da descrição detalhada do invento que se segue..

Desíjrií,:ãci......detalhada......do......invento á§......moléculas......de......DNA_...rgíi::;ombinan.te presente invento diz respeito a uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecoionada en tre

a) a inserção de DNA de Asperglllus niger de pGWISOO ou pGW'1.900,

h) uma sequência de DNA que híbrida com a região codificadora de

PílH ou PGI maduro constituída por uma inserção de DNA de a) e que compreende um gene estrutural para um polipeptideo com actividade poligalacturonase, e facultativamente um promotor, uma região codificadora de urn peptideo sinal ou 11 der e/ou um seu t e i- rn i n a d o v d a tra n s c r i ç a o,

c) um derivado de uma sequência de DNA definida em a), b) ou c).

Na is partieularmente, o invento diz respeito a uma mulécuia de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA seleccionada de entre

a) a inserção de DNA de Aspergillus nlger de pGWlGOO,

b) uma sequência de DNA que hibri.de com a região codificadora do PíiíT maduro constituída pela inserç:ao de DNA de a) e que inclui.

um gene estrutural para um poli, pépti de o com actividade de poliga.....

lacturonase e facultativamente um promotor, uma região codifica.....

do;-a de um peptideo sinal ou líder e/ou um seu terminador de transcrição,

c) um derivado de uma sequência de DNA definido em a) ou b), ou

d) uma sequência de DNA que codifica uma PG madura ou um seu peptideo sinal ou peptideo líder e que é degenerada no contexto do código genético relativamente a uma sequência de DNA de a), b) ou o), ou uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA seleccionada de entre

a) a inserção de DNA de Aspergillus niger de pGWl900,

b) uma sequência de DNA que hi bride corn a região codificadora do PGT maduro constituída pela inserção de DNA de a) e que inclui um

gene estrutural para um polipeptídeo oom actividade de poligalac.....

Luronaso e facultativamente um promotor, uma região codificadora de um peptideo sinal ou líder e/ou um seu terminador de transei' i......

COO., j o) um derivado de uma sequência de DNA definido em a) ou fo), ou

d) uma sequência de DNA que codifica uma PG madura ou uin seu peptideo sinal ou peptideo .líder e que é degenerada no contexto do oodi.go genético relativamente a uma sequência de DNA de a), b) ou i )..

Os plasmídeos pGWISOO e pGWISOO estão contidos nas est ir pes do E,.........coli JNlOO/pGWlBOO e DHbciíl··’/pGWl.900, respectiva-mente, depositado na Deutsche Gamm Lung fur líikroorganismcn und Zeli.kul tur en ( DSM )..

Os polipeptideos com actividade de poligalacturonase s a o ', a m la é m a g u :i r e f^: e r 1. d o s c o m ο ρ o .1. i g a 1 a c t u r cs n a s e s (P G s )E s t e termo também inclui fragmentos ou mutantes de poligalacturonases naturais que retêm acti.vi.dade enzimática. Os termos po.li.galactu.....

í ona se ou PG aqui. usados também incluem outras galacturonases tendo como substratoum oligo ou polissaoárido compreendendo galacturonato, e. g.. oligogalacturonase que cliva um oligalacturonato ou ramnogalacturonase que corta um copolimero de ramnose e galacturonato, ou seus fragmentos ou mutantes retendo actividade enzimática. Um «peptideo líder» destina.....se a ser a sequência de > um prepro.....PG que que ê cortada durante a formação de uma PG madura.. Um «peptideo sinal» é cortado num primeiro passo pela « p e p t i. d ase s i n a I.» η o r e t í c u 1 o e n d ο ρ 1 asma t i c o..

Ima. molécula do DNA recombinante do presente in vento compreende, por exemplo, a inser ção de DNA de Así -o. j i Ei. us............niger de pGwiaoo ou pfiwmoo..

A inserção de 4, 1 Kb de comprimento de A.. niaer do pHWl.800 (ver Fig.. 2)estende.....se desde o sitio de restrição Xbal (posição 1 do mapa) ate ao sítio de restrição EcoRI (posição 4 100 do mapa).. Esta inserçaocempreende o promotor e a região do terminação da transcrição do gene pgal I de PGIIassim como a r-egiãu codificadora de prepro.....PGII» incluindo in troes.. A sequên.....

cia de DNA do fragmento da inserção de A.,.........niger compreendendo pga.II começando no sítio Xba£ aproximadamente na posição 1 do mapa e terminando no sitio PvuII aproximadamente na posição 3050 do mapa mostrado na Eig.. 2 foi determinada e está descrito na sequência apresentada sob o Número de Identificação de Sequência (SEQ ÍD NO.. ) 2..

A região do promotor de pgall prolonga.....se atê à posição

1357 desta sequência de DNA com o Número de Identificação de Sequência (SEQ I'D NO.. ) 2.. A região codificadora do peptideo licier de prepro.....PGXT estende-se desde a posição 1357 atê ã posição

1437.. 0 peptideo sinal ê codificado pelos nucleotideos 1357 a

1.413.. A região codificadora da PGII madura estende.....se desde posição 1438 até à posição 2494.. Segue.....se a região do ter min a dor da tr anscrição que começa na posição 2499,.

A inserção de 8, 6 Kpb de comprimento de A...........niger N400 do pGW’1900 (ver Eig.. 3) prolonga.....se desde o sitio na posição 1 do mapaaté ao sitio Barn HI na posição do rnapa á volta de 8800 i ndicado na Figura 3.. A sequência de DNA estendendo -se desde a posição 8280 do mapa até cerca de 3880 está apresentada na sequência sob a indicação SEQ ID N0.. 1..

A região do promotor da inserção de 8,G kpb estende.....se ,u..e â posição 91.0 da sequêcia de DNA corn a SEP TD Mo.. 1.. A região codificadora do peptideo líder de de 31 aminoácidos de comprimento de prepro.....PGI estende.....se desde a posição 910 até à posição

1.002» 0 peptideo sinal é codificado pelos nucleotideos 910 a 963.. A região codificadora da PGI rnadura começa na pos:ição 1003 e prolonga se até 2197.. A região do terminador da transcrição começa na posição 2181.,

As sequências de DMA codificadoras de PGI e de PG!LI der ivadas das inserçSes de A...........niggt N400 de pGW1900 ou de pGWI.BOO h i. Ij r 1. d a m e i s ι c o n d i. ç o e s «Ι'ι o m õ.!.. o gas» o o m a r e g i a o c n c :l i. í^; i.. c a d o r a d o gene PGI ou PGII, respectivamente., ou de um seu fragmento deriva de de A.. n i.ger M400„ As sequências de DMA que são pelo menos parcialmente homologas da região codificadora de PGI ou PGII de A„ niger e que codificam uma proteína com actividade PG sao membros da familia de genes PG.. As sequências de DNA que sao apenas parcialmente homologas hibridam com sequências derivadas de PGI ou PGII de A..........n i.ger N400 nas chamadas con dições «heterõlo gas» que sao menos restrícti.vas do que as con dições «homólogas».

Um membro da família PG que híbrida apenas em condições «heterõ.....

Iogas» pode ser um outro gene PG de A., niger NÍ00 diferente de PGI ou PGII ou gene PG!., PGII ou um gene PG diferente ile uma estirpe de fungo produtora de PG e diferente de A»niger N400. Tal estirpe fúngica pode derivar, por exemplo, de Aspergilius spec. , e.. g. A,...........Japonlcus, à*..........oryzae, A..........nidulans ou um estirpe de

Α_;λ.........niger di.ferente de N400, Trchoderma spec.. Botrytl.s spec..

Sclerotin ia......spec.. Fusa;' i um spec.. ou outros fungos hi.topatogén i......

r c:. assim como leveduras, por exemplo K1 u y v e r o in y c e s spec.. , produtora de PG tais como K..........frágil is.. Um exemplo preferido de urna destas estirpes ê A.,.........n i.ger MW756» Assi.m, a familia de genes

PG do invento compreende os genes codificadores de PGI, PGII, PGI HA, PG.I.I1B, PGIV e outras PGs, de preferência derivadas de

Aspergi,iius spec. , mais preferencialmente derivadas de A.................niger, ιη.!is pref erencialmente da estirpe M400 ou MW756, mas também de outras estirpes fúngicas produtoras de PG.. Os membros da fam..i..lia de gtc.·;:, PG sao designados «genes PG»..

Os produtos proteicos dos membros ela f-ami lia de genes

PG inclui enzimas («galacturonases») que podem cortar oligo..... ou ρ o 1 1. s s a c a r i < :l o s c o m p r ee n d e n d o g a 1 a c t u r ο ι ί a t o, e.. g, o 1 i g o g a 1 a c t u r o.....

n a er a m η o g a 1. a c t u ι o n ase o u e m p a r t ;:i. c u 1 a r ρ o 1 i g a 1 a c I.. u r o n ase..

Um processo de hibridação convencional esta descrito pnr e. g. ,3enton e Davis (ref.. ?).. As condiçSes de hibridação hemoIogas e heterõlogas estão deinidas mais detalhadamente a wegu ir..

termo «derivado» quando usado em relação a novas sequências de DMA do invento destina.....se a incluir· derivados maiores incluindo sequências delirnitantes, fragmentos das referi, das sequências de DMA e mu t antes, especialmente mu tantos artificiais..

Us derivados maiores das novas sequências de DNA sao os que podem ser retiradas do genoma de A..........niger.. e compreendendo as sequências de DMA que hibridam com a região codificadora de PGII ou PGI maduro constituído pela inserção de DNA de Asperglilus Ώ.Ρ3θο do pGW'1800 ou pGWlGOO, a qual codifica um polipeptídeo com actividade de poligalacturonase e que pode conber um promotor, sequência sinal e/ou sequências terminadoras da transcrição iguais ou diferentes das encontradas na inserirão de DMA de

Asperglilus......ni.ger de pGWl.800 ou pGWlQOO. Tais derivados podem ser encontrados na biblioteca genómica de A................niger M400 ou IMW756 obtida pnr fragmentação dos ácidos nucleicos, tratamento dos fr agmentos oom uma enzima de restrição adequada, e.. g„ , EcoRI, BamlH ou HindiII, ligação num vector adequada, e.. g.. , o fago ambda ou o plasmídeo pBR322, olonagem, o.. g„ em E„ coli. e novamen.....

te remoção com uma enzima de restrição adequada.

Um exemplo preferido para um derivado de sequências de DNA que hibridem oom a região codificadora do gene PGI ou PGTI de

A..niger em condiçSes «heterólogas» é uma inserção ou seu frag.....

monto de um vector seleccionado do grupo constituído por lambdaPG Λ9, AIO, Λ43, 134, B36, 836, Cl, C Hi, C20, .....C37,

.....D8, -Dll, D1..2, E6, E38, E5, G17, G27, X31 e Y33, pGWÍ756 o pGW 191.0. Este último compreende o gene estrutural pgaC codifi cador do PGC de A..................niger N400 derivado de lambdaPG.....C20- pGW1.756 (Figura 6) compreende o gene PGIl derivado de A, nlger NW75B · |u apresenta um padrão de restrição e uma sequência do DMA (ver SEQ )’D NO.. 3) distinto do gene PGIl de A.. nlger í-1-100.. As o-d.. ir ρ:··>

NW756 o NW400 não estas::) portanto estreitamento relacionadas o devem per tonoer a espécies diferentes de fungos filamentosos..

Assirn, o gene estrutural PGI ou PGIl de A.........niger M400 pods?

h (..bridar especificamente em condiçSes heterólogas com genes PG do outras espécies.

plasmídeo pGWl.756 é composto por um fragmentei do vector pEMBL.,18 de cerca de 4000 pb de comprimento e per um fragmento de DMA de A. .niger NW75B de aproximadamente 6500 pb de coraprimentc. D gene codificador de PGIl, pgall, esta situaido dentro de um fragmento de restrição Hindi de aproximadamente 3300 pb do comprimento.. pGW1758 estã depositado na D SM.

A região do promotor de p.ga.II de A..........niger- NW766 situa.....

-se antes do núcleotidoo 889 na sequência de DMA com SEQ TD Nd. 3 apresentado na listagem de sequências.. A região codificadora do peptiden lider de prepro.....PGIl presumivelmente estende.....se desde a posição 890 até 970 enquanto o peptideo sinal é codificado pol.os nucleotídeos 890 a 952,. A região codificadora do proteína madura !6 começa no nucleotídeo 971, termina no oodao de paragem na posição 2028 e contem presumivelmente um intrão. Λ região codificadora e seguida da região terminadora da transcrição que começa na posição 2031..

1 a s m i d e o p G W1.910 (F1 g u r a 7 ) c o n s 1. s b e η u m a i n © e : q ã o com aproximadamente 7800 pb de comprimento derivada de lambdaPG.....020 e do vector pllC9. Dentro da inserção de A...........nlger N400 situa se o gene da pol.igalacturonase pgaC., A sequência de DNA de quase todo o gene pgaC estã apresentada na sequência dada sob SbU ) D ND.. 4..

promotor de pgaC de A.. nl.ger N400 prol.onga '-se presu m Lvelmente a parti r do núcleotideo 663 atê ao 782 e inc.lui a sequência de DNA desde 663 até 710 que codifica o peptideo sinal.

A PD madur a é codificada po La sequência que vai desde o nucleoti.....

dec 783 até 1.995 e inclui vãrios in troes.. A região termin a dor a da transcrição começa após o codao de paragem na posição 1999..

Ds derivados de sequências de DNA hiforidantes abrangi.....

das peio presente invento compreendem a mesma sequência de promotor, sinal e/ou termin a dor da transcrição como em pGWl.800 ou como em pGW1900, ou uma outra sequência de promotor,sinal e/ou terminador da transcrição que possam derivar de um outro gene da íumi!.. la de genes da pol igalacturonase.. Ainda, qualquer- oi.d-ra sequência de promotor, sinal e/ou sequência terminadora da transcrição pode ser ligada às sequências de DNA hibridante dependendo do hospedeiro em que seja expressa a PG pretendida,.

Pode ser empregue uma larga variedade de pr orno tor es, sequências sinal, e terminadores da transcrição. Os promotores pedem normalmente ser obtidos a partir de regiões não codificado · .. - 5 de genes procarioticos, eucarioticos ou virais, enquanto

ι μ.;r os !.:?! uri i·;adores da transcrição podem sor obtidos a par tir das regiões nao codificadoras 3’ .. As sequências sinal podem sor obtidas a partir da região codificadora 6’ de preproboinas que sao introduzidas na via secretora da célula,. Sao apresentados ã

Γ r o n t o e x om p · os d e p r o mo t o res..

Uma seque ncia sinal, no contexto do presente invento é u m a s oq u o n c i a d e UNA codificadora de um peptideo sinal ou da um peptIdeo líder de uma prepro.....PG do invento..

Sequências delimitantes dentro do significado do invento sao também fragmentos de DNA que nao derivem de sequên.....

cias deli mi tantos de um gene PG no genoma.. Tais sequências dei 1.aiitantes, por exemplo, têm funçSes reguladoras, e.. g.. função ile promotor·., ou codificam um polipeptídeo, e„ g.. um gene esbrutu rui, ou sao adaptadores que colocam o gene estrutural e as sequências reguladoras na grelha de lel.tura nu distancia oorrec.....

ta, ou sequências derivadas de um vector, e.. g„ um fago ou um , d as-iii! d; ·ο, usado na construção de um plasmideo de expressão,. I ais sequênc las delimit antes podem dar origem a cassetes de expressão ou genes de fusão..

Ω termo ffragrnento» quando usado em relaçao com o nova DNA prebende incluir bambem fragmentos dos derivados maiores, partioularmente os que retêm funções de promotor, sequência sinal, estruturais ou de berminador da transcrição. Eles podem estender.....se entre dois sítios de restrição..

São preferidos os fragmentos de DNA que contêm uma região de promotor, codificadores de um 1ider ou pepbídeo sinal de uma prepro.....PG ou codificadores de um polipeptídeo com actl.vl.....

dade de poli.galacturonase ou contendo uma região termlnadora da transcrição. Assim, uma sequência de DNA do invento é também uma

que contenha qualquer combinação dos referidos fragmentos, e.. g.. os que contem um promotor e/ou uma região codificadora de um líder cu peptideo sinal e/ou uma PG e/ou um terminador' da trans.....

s tyr· e similares,,

Um fragmento compreendendo um região de promete; de PG si.bua se na sequência de DNA antes de um gene estruturai de

p. : r......PG atê cerca de 2000, de preferência atê aproximadamei ι te

500 a 1.400 nucleotídeos a montante. Ã região do promotor liga.....se a PP. A polimerase assim oomo proteínas reguladoras..

Um fragmento compreendendo uma região de prumoto; ds gene pgal de PGI estende.....se por exemplo desde a posição 1 até a posição 900 da sequência com a SEQ ID M0.. 1„ Um fragmento cumpre.....

en de rido uma região de promotor do gene pgal 1 de Pfill de A.................n iger

Ρ4Ό0 estende.....se, por exemplo, desde a posição 1356 da sequenoia ' í an a 3Í. 0 ID P0.. 2.. Pa inserção de A..niger Pt!760 de pGW!756 um f; a g men t o com pr een d e n d o u m a r o gia o de pr ·οιηο Ζ o r de pg a 11 es t en de.....

se, por exemplo, desde a posição 1 até 689 da sequência com SEP

ID N0.. 8. Pa inserção de A..........niger de pGWISlO, um fragmento compre.....

endendo uma região de promotor de pgaC estende.....se desde a posição;

.;',o 662 da soquei;c i.a oom SP0 ID N0.. 4..

Um fragmento compreendendo a sequência de DNA codifica.....

dor a do peptideo líder de uma prepro PG estende se por exemplo entre o extremo do promotor e o começo da sequência codi Picadora ds proteína madura.. Uma região codificadora de um peptideo sinal é mais curta do que a para o corresponden te peptideo iider., Ela oomeea também no extremo do promotor e estende.....se até uma região codif icadora de um sitio de clivagem por uma peptidase sinal.. Na prepro PGIl de A...........niger N400, o peptideo líder compreende 27 aminoácidos. Um fragmento de DNA codificador do peptideo líder estendese por exemplo desde o codão ATG na posição 1.357 até ai i sítio de clivagem Xhol na posição 1429 da sequência de DMA corn

SEP (D MO.. 2.. Em prepro.....P9I o peptideo líder tem 31 aminoácidos.

!Jin fragmento de DMA codifieador deste peptideo líder estende.....se por exemplo entre as posiçoes 910 e 1002 da sequência de DMA com a di22 XD MO.. 1.. 0 peptideo líder da prepro.....PGXI t.-.lc? A.,.........nlger NW75B tem presumivelmente 27 aminoácidos e portanto o fragmento de DMA codificador do peptideo líder é o fragmento de DMA de 81 pb de comprimento que se estende entre a posição 889 e 071 na sequência de DNA com SEQ XD MO.. 3.. 0 fragmento de DMA codif ieador rl· j pro ..·.....

vei peptideo líder de 40 aminoácidos do produ to de jagaC de .7nlger Mi00 estende.....se desde a posição BG3 atê 782 da sequência asm SEQ TD N0.. 4..

As regiões codificadoras dos respeetivos peptideos sinal estão., por exemplo, situadas nos seguintes fragmentos de DNA:: Posiçoes de bases 911 a 963 em SEQ ID MO.. 1, 1358 a 1419 em SEQ XD M0„ 2, 890 a 952 em SEQ ID N0.. 3 e 663 a 71.0 em SEQ XD NO.. 4.

Um fragmento compreendendo toda a região codifieadora da PGI madura estende.....se, por exemplo, desde a posi,çao 1003 atê á posição 2127 da sequência com SEQ ID N0„ 1.. Um fragmento compreen dendo toda a região codificadora da de PGXI madura de A. nl.ger estende.....se, por exemplo, desde a posição 1430 até 2407 da sequência corn SEQ XD N0.. 2.. PGXI madura de A...........nlger NW75B é codificada, por exemplo, pelo fragmento de DNA que se estende desde a posição 793 até 2027 da sequência com SEQ ID NO.. 3 e o produto maduro do gene pgaO é codificado, por exemplo, pelo fragmento de DNA situado entre as bases NS782 e 1996 da sequência SEQ XD N0.. 4.. No entanto, também fragmentos mais pequenos podem codificar polipep.....

tídeos com actividade P0..

Os genes estruturais de PGXI ou PGT assim como de nutras PGs podem conter introes como acontece com muitos genes de

X' fungos. Mo entanto, estão também dentro do âmbito deste invento genes estruturais sern introes de PGs, e. g. corno sejam os que nao contém in troes corno sequência de DMA genómico ou também o© que podem ser obtios a partir de cDNA..

Um fragmento compreendendo uma região terminadora da transcrição estende.....se, por exemplo, desde um codão de paragem, e„ g.. EA A., TAG ou TGA, no final da região codificadora de PG, até dproximadarnente 300 a 2000, de preferência até cerca de 500 a 1000 pares de bases na direcção de jusante..

Tal fragmento, por exemplo, estende.....se desde a posi.yao de bases 2131 até 2495 da sequência cem SEO ID MO.1, desde 2499 ate 3031 na sequência com SEQ ID MU„ 2, desde 2031 até 304? na sequência com SEQ ID MO., 3 e desde 1999 até 2304 na sequência t ern 3EU í D M0„ 4..

No entanto, os fragmentos aqui, ja referidos podem ser prolongados pelas sequências deT i. rnil·. antes 5⁷ naturais ou ρ o ciem r; encurtados no extremo 5⁷ ou 3⁷ e no entanto podem manter a actividade de promotor ou de terrninador da transcrição ou os p: ilipeptideos codificados podem manter o peptideo sinal ou a a t Ti. v ,i„ da d e d e g a 1. a c t u r o n a s e.. T a i. s f r a g rn e n t o s t a rn b em e s t a o i ri c I. u i.....

dos dentro do âmbito do invento..

Os fragmentos aqui referidos podem conter ou podem estar delimitados por adaptadores que proporcionara uma ligacai! r ; si êxi.to a outras moléculas de DMA e/ou colocam fragmentos de DMA tendo funções reguladoras ou codificadores de um polipeptle g.. promotor e gene estrutural, na fase cie leitura eu d i stância correcta..

Os adaptadores correctos para os fragmentos acima têm uma sequência de DMA que se adapta ao sítio de restrição do DNA a que se preteri de ligar o fragmento.. Eles podem conter um sitio de : · e str· 1 ç ã o p r e d e t e r rn i n a d o..

Os rnutantes de uma sequência de DNA do invento sao e.. g.. mutantes naturais.. 0 invento compreende também rnutantes naturais ou sintéticos da região codificadora dos peptideos sinal ou 11 der com um perfil de hidrofohicidade semelhante ou Idêntico, e. g. em que os codcíes para os aminoácidos polares histidina (!!*'’t iros 1 /,fj · . . , _S+) foram trocados por codcíes para outros na (Y e argi.m.na i. R uminoaeidos tendo cargas semelhantes e os aminoácidos hidrofóbi.....

c os a 1 a f ΐ i na (A ), 1 e u c i n a (I....) e t r e o n i n a ( T), sã o s u b s t i t u i d o s pelos codões para outros aminoácidos hidrofóbicos. Por exemplo, o codão para a lisina carregada positivamente pode ser substituido po: um codão para arginina e vice versa, o codão para urna tirosi na carregada negativamente por um codão para glutamato ou asparta to e/ou o codão para a alanina h:idro f obi.ca nao ρ, i. .·, r a j: qualquer dos codões para treonina, prolina, vai.ina, isoleucina, leuoi.na, metionina ou fenilalanina e similares..

Urna molécula de DNA recombinante do invento também compreende sequências de DNA que sao degeneradas dentro do signif icado do código genético pelo facto de urn nume:-o ilimitado de nucleotideos poderem ser substituídos por outros nucleotideos sern alteração da sequência de aminoácidos que eles codificam.. Tais sequên crias degeneradas podem ser úteis devido aos seus diferentes si ti. os de estriçao ou devido â utilização de codões p; - e f e r i. d a n u m h o s ρ e ti e i r o p a r t i c u 1 ar.

Urna molécula de DNA recombinante do presente inven to de preferência compreende a inserção de DNA de Asperglllus......niger de um vector híbrido seleccionado do grupo de vectores hUn-itl···· constituido por pGWI.800, pGUI900, pGUI7hU, pGWÍ.,910, larnbdaPG A9,

larnbdaPG.....Al 0,	larnbdaPG.....A 43,	larnbdaPG-· · B4,	larnbdaPG.....B3b,
larnbdaPG B36,	larnbdaPG.....Cl,	larnbdaPG.....C1.6,	larnbdaPG.....C20,
larnbdaPG.....G37,	larnbdaPG-·08,	larnbdaPG --1111.,	larnbdaPG.....D 1.2,
ί arnbdaPG.....1GB,	I.arnbdaPG.....F5,	larnbdaPG.....G17,	I.arnbdaPG G27,
I.arnbdaPG.....X31. e	1.arnbdaPG.....Y33 ou	um seu fragmento	í : 11 rn - e e n d e n d a f. ι rn a

região de promotor do um gene PG, ou uma região codificadora de um peptideo sinal, peptideo lider, prepro.....PG, PG ou um fragmento de uma PG oom actividade de poliga lact uronase ou uma região Lerminadora da transcrição de um gene PG.. As próprias inserções Lambem estão cobertas pelo presente invento.

() invento tarnbern diz respeito a moléculas de DNA recombinante que sejam cassetes de expressão compreendendo uma região de promotor, urna fragmento de DNA codificador de urn pepideo lider ou sinal, urn gene estrutural e/ou urna região Ler rninadora da transcrição do invento, de preferência derivado de urn vector seleccionado do grupo de vectores re feri dos atrás..

Γ) termo «cassete de expressão» significa urna sequência de DNA capaz de expressar urn polipeptídeo e compreende um prorno.....

tor, caso se pretenda uma sequência sinal, ainda um gene estrutu.....

ral, caso se pretenda um terminador da transcrição e facultativa mente urn potenciador da transcrição, sitio de ligaçao ao ribossnrna e/ou ainda outras sequências reguladoras.

Numa cassete de expressão do invento do invento, so fragmentos funcionais derivados do gene PG podem ser combinados cum fragmentos funcionais derivados de outros genes.

Pode ser empregue uma grande variedade de sequências de pr ornotor, dependendo da natureza da célula hospedeira.. Promotores que sejam fortes e ao mesmo tempo bern regulados sao os rnais úteis.. Sequências para a iniciação da tradução sao por exemplo sequências Shine.....Dalgarno.. As sequências necessárias para a iniciação e terminação da transcrição e para estabilização do mPNA estão normalmente disponíveis em regiões não codificadoras

0' e 3’ , respectivamente, de cDNAs virais cu eucarióticos, e.. g.

der ivados do hospedeiro de expressão.

Sao exemplos de promotores lambda P. , lambdaP...,

L P, hac, trp e lae de [1.........coió, TPP1....., AD! II.....ADITH....., Pl-l(13..... ou Pl 105..... de levedu.....

ra, ou promotores glicolxtioos tais como o promotor dos genes da e η o !.. a s e, g'!., 1 c era 1 d e i d o.....3.....f o s f a b o.....d es i d r ogenase, 8 í o. · f n g !.. i c: --/,1.

- c x nase ( P GK ), h e x o c x nase, p xr u v a t o.....des c. a r b o x x 1 ase, f o s f o f^: r u tu c i.

nase, glucose.....6.....fosfato -Isomerase, 3.....f osf og 1 icer ato mutase, ρ i r u v a t o.....c i nase, t r x o s e f o s f a t o.....x s o m er ase, f o s f o g 1 u c os e - i s o m e r ase e glucocinase, ou promotores derivados de vírus eucarióticos, e.. g„ promotores derivados de SV40, virus do sarcoma de Pous, adenovir us 2, virus do papiloma bovino, papo v a vírus, cxtornegalo.....

virus ou promotores derivados de células de mamifero, e. g.. do gene da actina, cola génio, miosi.ua, ou |3.....g “Lo bina. Os promotores eucarióticos podem ser combinados com sequências potenciadoras tais como as sequências activadoras a montante de levedura (UA8) ou ρo ten ci ador es v ir a is ou oe1u1arescomo sejam as ρotencia dores TE de citomegalovírus, o potenciador de SV40, o potenciador do gene da imunoglobulina ou outros..

Os potenciadores são equências de DMA estimuladoras da transcrição, e„ g„ derivadas de virus tais como o virus simio, virus pnlinma, virus do papiloma bovino ou virus do sarcoma de Mo ! oney, ou de origem genómica. Uma sequência potenciador a pode também ser derivada de DNA ribossomal extracromossómico de Physarumpolycepbalum (PCT/EP 8000278)ou pode ser o sitio de activaçâo a montante do gene da fosfatase ácida Pl ΙΠ5 (EP App1... NP

1.1.1. 820. 6)ou ο PI--I05, trp, o híbrido PH05.....GAPDH (EP App!... NP 86

1.1 „1 820. 6) ou promo tores similares.

As sequências sinal podern ser, por exemplo, uma pré.....se.....

quênoia ou líder de secreção dirigindo a secreção do polipeptideo ou i in i'! a: os. Uma sequência sinal é, por exernplo, urn peptxden si.nal. ou líder de prepro.....PGI, prepro.....PGII ou prepro.....PGU. Sao conhecidas da literatura outras sequências sinal, e.. g.. as campi.....

ladas em von Heijne, G, , Nucleic Acida Res.. 14, 4683 (1986)..

Neste contexto os genes estruturais sao, para além dos codi Picadores de PGI ou PGII, tambérn os codificadores de outras PGs ou seus derivados, em particular seus fragmentos tendo actividade PG ou outros genes de Aspergillus e genes estruturais derivados de virus, células procariòbicas ou eucariébicas e que podem ser derivados de DNA gen ouriço ou de o DNA preparado pela via de mRNA ou pode ser obtido por sintese química, codificadores de uma larga variedade de polipeptideos úteis, incluindo po Llpepti.·dons glicosilados, em particular de eucariotas superiores, osppc i.altnente de mamíferos, tais como os de origem animal ou espoeiaImente humana, tais como enzimas que podem ser usadas, por exernplo, na produção de nutrientes e para a real isação de rea o.....

ções enzimáticas ern química ou polipeptideos, que sao úteis e importantes no tratamento de doenças humanas e de animaisou para a sua prevenção, por ex ern pio, hormonas, polipeptideos irnunornodu

I a d o r e s, p r o p r i e d a d e s a n t i.....v i r a i. se an t i.....t u rn o r a i s, a n t' i. tr o r p o s, antigénios virais, vacinas, vectores de coagulação, materiais a 1 i rn e n t a r e s e s i rn i 1 ares..

Sao exemplos de tais genes estruturais e„g„ , os que eodií icarn hormonas tais corno secretina, tirnosina, relaxina, ca I í . i í,! m i n, i, hormona luteinixante, hormona paratiroide, adr eno.....

d »-tiootropina, hormona estimuladora de melanõcitos, (5-l.ipotropi.....

na, urogastrona ou insulina, factores de crescimento, tais corno factor de crescimento epidérmico, factores de crescimento t :i - F' o i nsu 11 n a (IGF ), e.. g.. Ϊ G F I e ΐ G F.....11, f a c t o r d e c r e s o i rn e n t o

rieuronal ou factor de crescimento transformante (TGF), como seja TGF(5, hormonas de crescimento, tais como hormonas de crescimento humana ou bovina, interleuquinas, como sejam interleuquina '1. ou

.....2, Factor inifoidor da migração de macrófagos humano (MG ), interforces, tais como í.nterf erao α humano, por exemplo interfe.....

rau-ísA, osB, os D ou osF, interferão β, interferão gama ou um interferao híbrido, por exemplo um interferão híbrido os A.....os D ou osB.....csD» especialmente o interferão híbrido BDBB, inibidores de proteína ses tais como anti tripsina osl, SI....PI e similares, antigénio s do /o - us da hepatite, tais como antigénio de superfície ou do nucleóide do virus da hepatite 13 ou antigénio do virus da hepati.....

te A ou antigénio da hepatite nao A..... não B, activadores do plasminogénio, tais como acti.vador do plasminogénio de tecido ou u r o c i. 11 ase, f a c 1, o r d e n e c r o s e t u m o r a 1, s o m a t o s t a t i n a, r e n .i n a, Λ en rior fina, imunoglobulinas, tais como as cade ias leve e/ou pesada da imunoglobulina D, E ou G, ou imunoglobulinas híbridas humano -ratinho, Factores de ligação a imunoglobulina, tais como fuetor de ligação a imunoglobulina E, calcitonina, peptídeo liumano relacionado com calcitonina, factores de coagulação do sangue, tais como factor IX ou VXIIc, eritropoietina, eglina C,

Hi: udina, dessulfato.....irudina, como seja variante HV1 ou IIV2 da dossulfuto.....hirudina ou PA, superôxido disinutase humana, timidinaci.nase virai, [â Tactamase, glucose.....isomerase.. São preferidos os genes que codificam um interferao ct humano ou um interferão hi.br ido, par'ticularmente o interferão hi.br ido BDBB, acti.vador' do p ! a ·. · m i n u g é η. i ο h u m a η o d e t e c i. ri o (t.....P A ), a n t i g é n i o d e s u p e r ί í c i. e d o virus da hepatite B (HBVsAg), factor de crescimento tipi. i.nsuli......

s.H e ϊ I, eg ί ina G e dessulfato.....hirudina, e.. g„ variante I IV 1.. Nos vectores híbridos do presente invento, o presente promotor e/ou sequência sinale operacionalmente ligado ã região codificadora do polipeptideo de modo a assegurar' uma expressão ef i caz do po l. i.pep.....

de o..

-X invento também diz respeito a moléculas de DNA ι - e c o m b i n a n b e q u e sã o v e c t o res r e c o m b i n a n tes, em α 11 e r n a b i v a designados vectores híbridos,, os quais compreendem uma sequência de DNA se Leecionada de entre

a) a inserção de DNA de Asperglllus nlger de pG 141.8 00 ou pGW1900,

b) uma sequência de DNA que hibrida eom a região codificadora da PGH ou PG í madura constituída por uma inserção de DNA de a),

c) um derivado de uma sequência de DNA definida em a) ou b) ou

d) uma sequência de DNA de a), b) ou c) que codif icaurna PG madura ou um (aeptideo sinal ou um seu peptídeo lidei·' e que é degenerado dentro do significado do código genético.

Elas são úteis para clonagem e7ou expressão em hospe.....

d©iros, tais como bactérias, fungos ou células animais.

Tais vectores híbridos podem ser derivados de qualquer vector úbil. para engenharia genética, como sejam os derivados de virus, fagos, cosmídeos, plasmideos ou DNA cromossómico, como sejam derivados de SV40, virus Herpes, virus Papiloma. Retro.....

virus. Báculo virus, fago lambda, e. g. NM989 ou EI4BL..4 ou fago Ν Ι.3, e.. g.. DNA do fago M13mp8 (ref.. 15)linearizado por digestão com Bani I II, plasmideos bacterianos, e. g. pBR322, pIJCIS ou plasmideos de 'Levedura, e„ g.. plasmídeo '2j.i de levedura ou também DNA creornos.....

sómico, derivado e. g. de fungos filamentosos tais como

Asperglllus......spec.. ., e- d- A„............niger, por- exemplo os proporcionados por EP 184 438 ou um virus, fago ou plasmídeo defectivo na presença de um virus, fago ou plasmídeo auxiliar, e. g. vector Μ13(+)l<S na presença de e.. g,. fago auxi 1 iar Μ1.41<07..

Os vectores híbridos do invento proporcionam replicação e facultativamente expressão de um DNA pretendido num hospedeiro adequado, quer como um elemento extracromossóraico quer por integração no cromossoma do hospedeiro.. Existem disponíveis vãrios sistemas vectores possíveis para integração e expressa do DNA cl.onado do invento.. Em principio, sao adequados todos os vectores que se replicam e/ou expressam um gene de um polipepti.....

deu pretendido inserido numa cassete de expressão no hospedeiro escolhido.. 0 vector é seleccionado dependendo das célul.as hospe.....

doiras destinadas â transformação. Em geral, tais células hospe.....

deiras podem ser microorganismos procariòticos ou eucariótcos tais como bactérias, fungos tais como leveduras ou fungos fila.....

mentosos, ou células derivadas de eu cari, o tas superiores tais como vertebrados, por exemplo células de mamífero.. As células hospe.....

doiras adequadas serão discutidas detalhadamente abaix. Em princípio, os vectores híbridos do invento compreendem o DNA como aqu.i definido anteriormente, uma origem de replicaçãoou uma sequência de replicação autónoma, sequências de marcas dominan.....

tes, facul. ta tivamen te sequências de controle da expressão essen.....

c ; ais para a transcrição e tradução do DNA pretendido e, facul t-a.....

tivamente, si.tios de restrição adicionais..

Uma origem de replicação ou uma sequência de replicação autónoma (um elemento de DNA que confere capacidades de replicacão autónoma a elementos extracromossóraicos) é proporcionada quer pela construção do vector de forma a incluir uma origem exógena como seja a derivada do virus si mi. o (SV409 ou de outra fonte virai quer pelos mecanismos cromossómicos da célula hospedeira.,

Um vector híbrido do invento pode conter marcas selecti.vas dependendo do hospedeiro que se pretende transformar, «seleccionar e clonar. Pode ser usado qualquer gene de marca que facilite a selecçao dos transf orrnantes devido ã expressão fenotipioa da marca. São particularmente adequadas as marcas que expressam resistênccla a antibióticos, e. g.. contra tetraciclina ou ampicilina, ou, no caso de mútantes fúngicos auxotróficos, genes que complementem as lescíes do hospedeiro.. Qs genes corres.....

pendentes conferem, por exemplo, resistência ao antibiótico ciclo.....heximlda ou proporcionam prototrofia num rnutante de levedu.....

ra auxotrófico, por exemplo o gene ura3„ leu2, 1 ilsl ou t;· p 1... Ê também possivel empregar como marcas genes estruturais que estejam associados a um segmento de replicação autónoma desde que o hospedeiro a ser transformado seja auxotrófico para o produto pela marca.

Sao de importância particular os genes de marcas que complementam lesões do hospedeiro A..........niaer, tais como o gene argB codificador da ornitina.....carbamoil.....transferase, e. g„ derivado de

A..........n iger ou de A...........nidulans (EP 184 438) ou fragmentos de DNA de

A..........nidulans homólogos do gene pyr4 de N..........crassa (ref. 27).

As realizações preferidas do presente inventa são vectores híbridos compreendendo uma cassete de expressão do invento, g„ como seja os compreendendo o gene estrutural e7ou o promotor e/ou a sequência de DNA codificadora de um peptídeo lide; ou sinal e/ou o terrninador da transcrição d crivado de um gene PQ do Invento..

São exemplos de vectores híbridos compreendendo uma cassete de expressão do invento pGWISOO, pGW1.900, pGWl.91.0, p G ΐ 1 s s X F N A Μ119, p G W1756, 1a m b d a P G A10, 1 a rn b d a P G A 4 3, la m la d a PG.....D 8 e !. a m L:j d a P G.....D11..

objectivo do Invento nao é apenas uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma inserção derivada de um gene PG aqui definida anteriormente, como também urna molécula de DNA

compreendendo um gene PGou um seu fragmento funcional, e.. g„ como seja um que contenha um promotor, região codificadora de um peptideo sinal, peptideo lider ou uma proteina com actividade PG ou a própria região terminadora da transcrição que pode ser isolada a partir de uma estirpe fúngica produtora de PG, por exemplo, de AspergilfLus......sperc..., e.. g.. h,..........japonicus, h._:,.........oryxae, A,....

n. L,du,lans, A,.........niger, Trichorterma......spec^., Botyris......spere.., Sclerotinia spec. „ Fusarlum............spec. ou outros fungos fi. topa togén icos assim ! omo derivados de levedura, por exemplo derivados de Kluvver omycesspec.. produtor de PG tais corno l<. frágil is.. São preferidas as moléculas de DMA isoladas a partir de A„ niger.

As moleecuIas de DMA do presente invento e seus deriva dos, incluindo fragmentos, podem ser usados para o despiste de bi h I iotecas de genes de DMA ou rnRMA relativamente a DM As ou rnRNAs semelhantes..

P: di. osso......pa: a......a......preparação......das......moléçu 1a.s......de......DMA......recombinante

Um outro objectivo do invento é urn processo para a preparação de uma molécula de DMA recombinante aqui. definida anteriormente compreendendo a cultura de um hospedeiro transfor.....

mado com tal molécula de DMA recombinante ou sua preparação por sintese in vitro..

A cultura dos hospedeiros é efectuada num meio nutri.ti. vo convencional que pode ser suplementado ou desprovido de compostos químicos que permitem a selecção negativa ou positiva dos trans forman tes, i... e.. tais hospedei.ros con tendo _.i molécula de DNA pretendida juntamente com uma marca de selecção, de entre us não transformantes, i. e.. os hospedeiros que nao possuem a molécu.....

la de DNA pretendida..

Podem ser usados quaisquer hospedeihtís ' transformáveis normalrnente utilizados, e. g„ bactérias tais como Saccharomyces ccrevi.slao, l< .1. u y v e r- o rn y c e s lacti.s ou em pa;-1 i..c.u'! a; fungos filarnen tesos, tais como Aspar glllus., 9- .........Ulílifans., A, rmyzae, A.,„.

ca; honarlus, A., awamorl e especialmente .A, niger.. Um hospedeiro preferido é A... nlger A η 8, um mu tan te sem o gene pyrA, como descrito abaixo ou A...........niger N593. A transformação dos hospedeiros é efectuada por métodos convencionais.

Uma sequência de DNA incluida numa molécula de DNA recombinante do invento pode ser obtida a partir do genoma de um fungo que expresse poligal.acturonase ou pode ser preparada por exemplo através da cultura de um hospedeiro que estS transformado com uma molécula de DNA recombinante do invento e, quando neces.....

sàrio, isolamento da sequência de DNA pretendida a partir dele ou através da sintese quimica através da condensação de núcleo ti......

docis..

Em particular, tais DNAs podem ser preparados ραίο) isolamento de DNA genómico a partir de células de fungos adequadas e selecção do DNA pretendido, e.. g.. , usando uma sonda de DNA ou usando um sistema de expressão adequado e despiste qua n t o ã e χ p r e s s ã o d o p o 1 i p e p t í d e o p r e t e n d i d o o u

b) isolamento de mRNA a partir de células de fungos adequadas, selecção do mRNA pretendido, e. g.. por hibridação com uma sonda de DNA ou por expressão num sistema de expressão adequado e despiste quants::) à expressão do polipeptideo pretendido, preparação de cDNA de cadeia simples complementar daquele mRNA, em seguida cDNA de cadeia dupla a partir dele ou

o) iso la mento de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA e selecçao do cDNA pretendido, e.. g.. usando uma sonda de DNA ou usando um sistema de expressão adequado e despiste da expressão do i.> ο I i p e ρ t i d e o p r e t e n d i d o e / o u

d) incorporação do DNA de cadeia dupla do passo a), b) ou c,) num v e c t o r a d e c; u a d o,

e) transiormação de células hospedeiras adequadas com o vector 1 i i brido obtido,

F) selecçao das células hospedeiras transformadas que contém o DNA pretendido de entre as células hospedeiras nao transformadas e, quando necessário,

g) isolamento do DNA pretendido e/ou conversão do DNA num mutante eu seu fragmento..

DNA genomico pode ser isolado e despistado quanto ao DNA pretendido (passo a).. ODNA genomico é isolado a partir estirpes de fungos expressando proteínas com actividade PO.. Orna biblioteca de DNA genomico é preparada a partir dele por digestão com endonucleases de restrição adequadas e incorporação em vectores adequados seguindo processos estabelecidos. A biblioteca do DNA genomico é despistada com uma sonda de DNA como aqui desci-i to ou expresso num sistema de expressão adequado e os polipeptideos expressos despistados de forma convencional.. Ê dada a seguir uma descrição do isolamento de uma molécula de DNA do invento a partir de uma biblioteca genómica.

RNA mensageiro poliadenilado (passo b) é isolado a partir de células adequadas, por métodos conhecidos.. Os métodos de isolamento envolvem, por exemplo, homogeneização na presença

de detergentes e de um inibidor de ribonucleases, e.. g.. heparina, i sotioaeianato de guanidina ou mercaptoetanol, extracção do rnRIMA com misturas adequadas de clorofórmio.....fenol, facultativamente na presença de soluções salinas e tamponantes, detergentes e/ou agentes quelantes de oatioes e precipitação do iiiRiMA, presente na fase aquosa salina corn etanol, i sopro parιοί ou similares.. 0 rnRIMA isolado pode ser ainda purificado por centrifugação nurn gradiente de cloreto de césio seguido da precipitação com etanol e/ou por rné todos cromatograficos, e.. g„ cromatograf ia de afinidade, por . · x i η p 11) o r o in a t o g r a f i. a e rn o 1 i g o ( d T ) c e 1 u 1 o s e o u e rn o 1 i. g o (ÍJ ) s c í a r o s e.. De preferência, tal rnRNA total purificado é fraccionado de acordo com o tamanho por centrifugação em gradientes, e. g.. num gradiente '•iio.ii d·· suor ose, ou cromatograf ia em colunas adequadas de Fracci.nnamento por tamanho, e.. g.. em géis de agarose.

rnRIMA pretendido é seleccionado por despiste do rnRIMA directamente com urna sonda de DMA ou por tradução ern células adequadas ou ern sistemas aceiulares e despiste dos polipeptideos obtidos. A seleccção do rnRIMA pretendido é de preferência conse.....

guido usando uma sonda de hibridação de DNA, evitando assirn o ;···.· adicional de tradução.. Sondas de DMA adequadas são DIMAs de sequência de nucleotídeos conhecida consistindo em pelo menos 1.7 núcleo tideos, pior exernplo DIMAs sintéticos, cDIMAs derivados de rn R NA c o d i f i. c a d od o s p o 1 i. p e p t i d e o s p r e t e n d i d o s o u r a g rn e n t a s de DNA genómica compreendendo e.. g.. sequências de DNA adjacentes que são isoladas a partir de urna fonte natural ou a partir de um rn: i : r o o r g a n i s rn o rn a n i p u 1 a d o o r e n g e n In a r i a g e n é t i. o a..

As sondas de DMA sintético são sintetizadas de acordo corn métodos conhecidos conforme detalhado abaixo, de preferência pela condensacão passo a passo usando o método de fase sólida losfotriéster, fosfitotriéster ou fosforami.de to, e.. g.. a condensação de unidades de acoplamento de di.nucleotideos pelo método fnsfobriéster.. Estes métodos sao adaptados a sintese de misturas dos oligonucleotideos pretendidos usando misturas de dois, três ou quatro nucleotideos d A, dC, dG e/ou dl' na -forma protegida ou as cairrespondentes unidades de acoplamento de dinucleotideos no passo de condensação adequado como descrito por Y„ íke et a!.... í, N u::: . L e i r; A c i d s R e s e a r c h 11., 477, 1983)..

Para a hibridação, as sondas de DMA sao marcadas, e.. g. mareadas radioactivamente pela reacção conhecida que usa cinase.. a hibridação do mRNA fraccionudo por tamanho com as sondas de DMA otmtendo uma marca é efectuada de acordo com processos conheci.....

dos, i.e. em soluçSes salinas e tampão adequadas contendo adibi.....

vos, e.. g. quelantes de cálcio, compostos reguladores da viscosi......

dado, proteínas, DNA nao homologo e similares, a temperaturas que favoreçam hibridação sel.ecti.va, e„ g.. entre 0°C e 80°C, por exmplo enbre 25° C o 50°C ou â volta de 20° abaixo de temperatura de I : .ao do DNA hi. hr i do de cadeia dupla..

mRNA fraccionadc pode ser traduzido em células.. e. g. uocitos de ra ou. em sistemas acelulares, e„ g.. em lisa dos de reticulócitos ou extraotos de germen de trigo.. Gs polipepbideos obtidos sao despistados quanto â acti.vidade enzima tica ou qua ntn à reacção com anticorpos induzidos contra o polipeptídeo nativo, ··.. q. num imunoensaio, por exemplo radioimunoensaio, imunoensa i o com enzimas ou imunoensaio com marcas fluorescentes.. Tais imune.....

• ••ai...- e a preparação de anticorpos policlonais e monoclonals sao bem conhecidos e são aplicados de forma adequada.

A preparação de um DNA complementar de cadeia simples (cDNA) a parti r de um mRNA molde seleccionado é hem conhecida, tal como é a preparação de um DNA de cadeia dupla a partir de um DNA de cadeia simples.. 0 mRNA rnol.de é incubado com uma mistura de b r i - f o s f a t o s d e d e s o x i n u c1 e o t £ d e o, f a c u 1 b a t i v a m e n t e t r i f o s f a t o s d e d esoxi. núcleotideos marcados r adi. oac tivamente (de modo a poder.....se de tec tar' o resultado da reacção), uma sequência iniciadora como seja um residuo oligo.....dl que hibrlde com a cauda poli (A) do mRNA e uma enzima como seja uma transcriptase reversa e„ g.. do virus da mieloblastose aviária (AIW).. Após degradação do mRNA molde e, g..

hidrólise mm fosfatase alcaliria, o cDNA é incubado oom uma m i stura de trifosfatos de desoxi.nucleotideos e uma enzima adequa da para dar um DNA de cadeia dupla.. São enzimas adequadas por exemplo uma transcriptase reversa, o fragmento Klenow da DNA-po!. imerase I de E, coli ou DNA polimerase de 14.. Geralmente, uma estrutura em ansa formada espontaneamente pelo oDNA de cadeia simples aetua como i.niciador para a sintese da segunda cadeia.. Esta estrutura em ansa é removida por digestão com nuclease SI.. Somo a I, ter na t iva, o extremo 3' do DNA de cadeia simples o primei r o pr olongado com caudas homopolimóricas de descrcinucleotído: ?·.·.·. antes da hidrólise do mRNA molde e da sintese subsequente da segunda cadeia de cDNA..

Como alternativa, o cDNA de cadeia dupla e isolado a partir de uma biblioteca de cDNA e despistado relativamente ao cDNA pretendido (passo c).. A biblioteca de cDNA e construída por’ isolamento de mRNA a partir de células adequadas e preparação rio cDNA de ca dei. a simples e de cadeia dupla a partir dele como descrito atrás.. Este cDNA é digerido com eridonucleases de restri.....

çf: arlequadas e incorporado nu fago lambda, lambdacharon 4A ou E .·ml.·ι<.; gtll. segui ndo processos estabeleci dos.. A biblioteca dr· cDNA transfcrida para membranas de nitrocelulose é despistada usando uma sonda de DNA como descrito atrás ou expressa num si stema do expressão adequadoe os polipep ti. deos obtidos dccj. i sta dos quanto ã reacção com um anticorpo especitico para os compos f; :i s p r e t e n d. i. d o s..

É conhecida urna variedade de métodos para a incorpora.....

cão do cDMA de cadeia dupla ou DMA genómico num vector adequado ( p ass n d ).. Ρ o r e x e m p 1. o, seg m © n t o s d e h o m ο ρ o 1 í m e r o s c o rn ρ 1 e rn e n t a r e s podem ser adicionados ao DMA de cadeia dupla e o DNA vector por

Ln cu ha çao na presença dos correspondentes trifosfaLos de de s oxi......

núcleotideos e uma enzima corno seja a desoxinucl.eotidil.....transfe.....

rase terminal... 0 vector e DMA de cadeia dupla sao então ligados por emparelhamen to de bases en tre as caudas homopol.iméri.cas complementares e finalmente ligadas por enzimas especificas de ligação tais como ligases. Outras possibilidades sâo a adição de

J adaptadores sintéticos aos extremos do DNA de cadeia dupla ou a incorporação do DMA de cadeia dupla no vector por ligaçao de extremos cerses ou coesivos.. Os vectores adequados ser ão desci- i tos mais detalhadamente abaixo..

A transformação de células hospedeiras adequadas com o vector híbrido obtido (passo e) e a selecção e multiplicação das c.é lulas hospedeiras transforrnadas (passo f) são bem conhecidas.. Mais abaixo sâo dados exemplos de Lais métodos.. Os ver;tores híbridos e células hospedeiras podem ser par ticularmen te adequa dos â produção de DNA ou ã produção dos polipeptideos pretendidos.

isolamento do DMA pretendido, seus mutantes e frag.....

mentos de acxordo com o invento ê conseguido por métodos conheci......

11e.. g.. extracção com fenol. e/ou clorof órmi.o.. Faoultativamente, o DMA podo ser ainda manipulado e.. g.. por tratamento com agentes mutagériicos para se obter rnubantes ou por digestão com enzimas de • - . trição para se obter fragmentos, modificar um ou ambos os extremos para facilitar a incorporação no vector,remover sequên elas iivbervinlentes e similares..

Λ sequência de nut: h:όt i.deos de um DNA ‘ de ·. icoi-1'0 com o

Invento pode ser determinada por métodos conhecidos per se, por exemplo pelo método de Maxarn Gilbert usa rido DNA marcada nos extremos ou pelo método de terminação de cadeias dídesoxi de ‘t. :: ,OÍ ; ..

As sequências do gene PG do presente invento podem sor também prep^iradas por urna síntese in vitro He acordo com métodos convencinnais. A síntese in vitro é especialmente ap! icavei a preparaçao ele fragmentos mais pequenos de uma cassete de expres y sao de PG, e.g. das sequências de DNA codificadoras de um promo tnr ou de um peptideo sinal, por exemplo do gene PGI, PGH ou pgaG, de um gene PG con tido numa molécula de DNA aqui jã descri, ta, espenialmente nos clones lambda ou um seu mu ban te. Métodos adequados â síntese de DNA forarn apresentados resumidamente ps; ff. A., Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983).. As técnicas de síntese cenhecirias permitem a preparação de polinueleotideos até 120 toses ·'; comprimento, com bom rendimento, pureza elevada ·· num t·::.. ··., relativamente curto. Os nucl.eoti.deos adequada men te protegi.....

i.·. sao ligados uns aos outros pelo método fos fodi.éster (!<„!

Ag.arv-ial et al. , Angew. Chemie 84 489, 1972), pelo método tusfo triéster mais eficaz (C„ B„ Reese, Tetrahedron 34., 3143, 1972), pelo método fosfitotriéster (R. I Letsinger et al . , J. Am. Citem..

Soí:;.. 3655, 1976) ou pelo método f osforami.deto (S. I...... Beaucage e

Μ. H.. Garruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981). A simplificação da sintese dos oligonuclcotideos e polinueleotideos é possível pelo método de fase sólida, em que as cadeias nucLeetiriicas são ligadas a um polímero adequado. H. Rink et al. (Nu cl.. A ci. d s Research 12, 6369, 1984) usa trinucleotídeos em vez de núcleof : doi ;s individuai.se liga.....os pelo método fosfotriéster na sintese ; ·:.; fase sólida. Pode ser assim preparado um pollnuc.leotideo tempo curto e corn bons rendimentos,. 0 DNA de cadeia dupla é pi r e ρ a r a d o e η z i m ã t i c ame n t e a p a r t i ι d e oi. g o n u c .1 e o t j.. cl η j s

,eponxveis sintéticos de ambas as cadeias, os quais são mantidos juntos no arranjo correcto por emparelhamosto de bases e depoi.s são ligados quimicamente pela enzima DMA.....ligase..

Lima outra possibilidade consiste na incubação de o Ii gonucleoti.de os simples sobreponiveis das duas tra delas do DNA na presença dos quatro trifos fatos de desoxi núcleos.ido com uma

DNA.....polimerase, por exemplo DNApolimerase 1, o fragmento Klenow da polimerase I ou DNA.....poli.merase de T4 ou com branscriptase r eversa de AMV (vírus da mi.eloblastose aviaria).. Ds dois ol igonu cl .potideos são portanto mantidas juntos num arranjo correcto por emparelhamento de bases e sao suplementados com os nucleotídeos necessários pela enzima para dar um DNA de cadeia dupla completo (‘TA., Narang et al... , Anal... Bi.oohem.. 121, 358, 1982)..

No que se segue descreve.....se mais detal.hadamente a preparação de uma molécula de DNA recombinante do presente Invento a partir de uma biblioteca genomioa e as condições ti. hibridação homóloga, e heteróloga para a identificação de me miar os da família de genes PG..

Uma biblioteca genomioa pode ser' preparada e.. g.. p; t;

t:ligestão parcial do DNA genómico de uma estirpe de A...........nlger., e.. g.

Ml.'58 cu N400, com e„ g.. G.au3AI ou Mbol e clonagem d tas fragmentos de alto peso molecular num vector adequado, e. g„ o plasmídeo pUN'1 21 de E...........c.o 1 i. ou um vector' lambda, e.. g„ EM BE 4..

Outras estirpes de fungos produtoras das PGs preten til das, por exemplo, Aspergillus......spec,,.., θ- 9- à,..........japtanlçus,

A..........M; T.T..T, A_;.........nidulans, »...............TricMxternia......speç.,_, Botrytis............-TT'·-, ,

Sclerotln ia......spec.. ., Eusarlum......spec.. ou outros fungos fitopatogén 1.....

cíjs assi.m como leveduras, por exemplo |< 1.uyveromyces......spec.. produ.....

tora de PG como seja K..............frágil is podem sei-vir como fonte de uma biblioteca genómica e outros vectores adequados, o., g.. os aqui m: 111; i o n a d o s abras, r r agmen tos..

podein ser usados como recipiente© para

De forma a realizar um despiste bem sucedido da bíbii.o.....

beca de sequências de DMA codificadoras de PG é necessário uma .t .nda de DNA que hibri.de.. Esta pode ser uma sonda de DNA sin bé Li.....

cíj se a sequência de aminoãci.dos ou parte dela da PG pretendida for t j nheí. i du, ou um outro gene PG ou parte dele, que hi.br ide com um gene PG pretendido.. Lima vez que an bes do invento nao er a conhecido uma sequência de PG nem um gene PG ou parte dele, foi. necessário resolver primeiro os problemas de purificação de PGs, determinação da estrutura da sequência M.....terminal de uma PG e preparaçao de sondas de DNA útei.s..

Para a purificação das presentes PGs pode ser usada qualquer fonte que as contenha.. Por exemplo, as fontes brutas como sejam misturas de enzimas obtidas a partir de Aspergillus

P n::i ger„ como seja Paj.aida.se , uma mistura adquirida de enzimas pectinoli. bicas, pode servir como fonte.

c t.j m e r c i a I m e n t e

A pur i. f i.caçao segue métodos de purificação convencio nais, como seja remoção do sal, repreeipitação na forma de umasai c r o rn a t o g r a f g 1. α ti e a f :i, n i. d a d e c o m o cromatografia de permuta iónica,

e.. o., rluma coluna de DEAE.....Sephadex ou Sepharose, cromatografia de per meação em gel, e.. g, numa coluna de Sephaeryl, electrof orese, gel de SDS.....poliacrilamida, focagem isoelêctrica e diferente, cromatograf ia, e.. g.. seja num algi.nato interligado.

e.. g..

com similares e qualquer combinação deles..

No presente invento, PGI, PGII, PG1IIA, PGIIIB e PGIV R foram isolados numa forma pura a partir de Papidase .. As referi.....

das PGs sao endopoligalacturonases (E.. C.. 3.. 2.. 1,.. 15) com as seguintes propriedade© fisicoquímicas: PGI tem uma Mr de 55K» um ponto isoeléctrica (IEP) entre 3,2 e 3,5 e um pH óptimo para a •actividade enzimática de 4, 9,. Os valeres para PGTI sao um Mr de 38 K, um IEP entre 4,8 e 5,9, um pEI óptimo de 4,8” PGIIIA tem um Mr de 57 K, um IEP de 3, 3 e urn pH óptimo de 4, 3, PGIIIB tem também 57 K e um IEP de 3, 3, no entanto, o pH óptimo é 4, 5.. Finalmenie, PGIV tem uma Mr de 59K, um IEP de 3, 7 e um ρ! I óptimo iie 4, 8.. Os valores de !ir dados foram determinados por electrof o rese em gel. de SDS.....poli acrilamida, os valores de ϊ! E’ por isoelee ··

i. s o í^:: o e a g e m e m c a m a d a f i. n a..

A sequenciação !··!.....terminal de PGI revelou a seguinte sequência::

a La ' s er.....tr e.....tf ~ tr e^ - f e n.....tr e - ser.....a 1 a^

A sequenciação M.....terminal de um fragmento BrCN de 81

KDa de PGI revelou a sequência .4.

ai a ser t r e X t r e í · e n t r e ser ··· g I. u, i í ·. a sequência N.....terminal de PGI, e sequenciação de um fragmen · io BrCN de 5, 5 KDa. revelou a sequência a'i a.....a s p g L i.....a I. a v a '1.....:i 1 e.....a s p.....g 1 i.....a s p - g 1 i.....ser..

A sequenciação N.....terminal de PGT.I revelou a sequência i 3 5 .. .. .. '10 . 12 asp ser X ’ tre íen tre tre a ia ala ala ai. a lis ala de um fragmento BrCN de 17 KDa a sequência i Ί a.....f en.....ser' -va 1.....gI.n.....a 1 a.....asn.....asp.....iI.e.....tre.....f en..

.8 ,4 _Λ .. .

X e X nas sequências na altura nao torarn identificados.

Com base na sequência de aminoácidos do fragmento BrCN de 5, 5 KDa de PG í sintetizou.....se a seguinte mistura de oligonu.....

c Leotxdeos met ala asp gli. ala vai RR 6298 '? (d) ATC GCT GA!^ CGI Gíff GTT ile asp gli. asp gli AIR,... GAR„, GGf GAR, GG

I.

Com base na sequência de aminoácidos do fragmento BrCM de 17 KDa de pGLI sintetizaram.....se misturas dos dais oligonuoleo ti íleos í ii.it = se seguem ! 1RR'1 95 HR6196

5‘ (d)

5“ (d)

met	a.La	fen	ser	vai	gin	a Lu
A íG	GCÍ	TTR !	TC f	Gli	car,.	GCÍ
ATG	GCT	TIR...	AGI	GTf	CAÍ?,,	PCI

	asn	asp	ile
HRS1..95	ααρί	gari	AT	3U
PPG.!. 96	AAR1	gari	Ai	3
	Mas ΐ·.	iequê nelas	dos
T ou C,	R? é A	ou G	e R3	é T,

As misturas foram marcadas r adi.oactivamen be e usadas no despiste de uma biblioteca genómica de As per gli. l.us......n iger N400 r e La ti vamente aos genes PG I e PGÍf, respectivamente..

Ds genes identificados cu fragmentos de genes foram enbáo sequenciados de ,10..00 com métodos converici.onai.s.. As s PGT e PG 1.I de A.,...............n iger N400 sequênc i..as d o gene estrio respectiva representados pelas sequências com SEQ ID NQ.. 1 e 2, ϋϋ-ηί.ί', descritas na sequência apresentada..

Para fins de despiste as sondas de DNA foram marcadas r a d inactivawente por métodos conhecidos na área, e.. g. usando qo 22

Γ'Ρ Ajp p cinase de T4 ou «'“P dATP e DNA polimerase I de

I C;O .11, dependendo do tipo de sonda usado.. Os mieroorganismos hospedeiros portadores de ácidos nucleicos do presente invento i:nmo uma inserção, foram identificados por hibridação com a sonda dc DNA marcado em filtros com duplicados da biblioteca de genes..

Os clones apresentando uma resposta de hibridação com uma ou mais sondas de DNA foram isolados e amplificados..

As condições de hibridação usadas foram as convencio.....

nais o podem ser mais ou menos restrletivas..

As con dições restrietivas são tais que apenas · -g: c ir de DNA com um elevado grau de homologia podem ί, d:; ida:

(<~. o n d i q Õ e s d e h i b r' 1. d a ç ã o « h o m 6 1 o g a » ).. E m c o n d i ç õ e s h e t e r o 1 o g a s o u menos restrietivas, também as sequências de DNA relacionadas com um grau de homologia mais podem hibridar.. A restrição da hibrida-çu. e influenciada, por exemplo, pela tempera tura de hi.br Ldaçao e lavagem, concentração de sl. ou f ormamida, teor OlC do DNA, duração do tempo de hibridação e comprimento da sonda de DNA.. Nos í rompi.o., aqui apresentados sao dados exemplos ilustrati vos mas não limi. tantes das condiçSes de hibridação «homólogas» e «hetero.....

iogas»..

Oom a utilização de uma ou mais sondas de DNA derivadas dc gene pf ; f _(r.j POTf, parti.cularmente as que compreendem pelo menns parte das suas regiões codificadoras, os clones bi.bridantes dc; i. vades de uma biblioteca genómica, e.g., de A......................η i. q; ; ..

ρ; ο ί; : onr Efl men te de Α.,.........nlger Ν400 ou de Α..........ιίi.ger NW756, podem se; identificados e divididos em diferentes citasses com base no .(•η grau de homologia <:> com base nos fragmentos de restrição bihridantes observados,. Sao exemplos de clones preferidos deriva.....

dos da b i. Η I i o tec a c:le A,.........niger M400, lamb d a Pd.....A 9, .....AJO, A 43, H-l,

B35, B8B, .....Cl, .....C HI, C20, G37, .....DS, D! E, - D12, EB, .....E38,

EB, B17, C27, .....X31. e Y33„ a sua preparação estã descrita mais dotaLhadamente nos Exemplos que se seguem.. Um Exemp lo para um o fone preferido derivado de A., n l.ger NW758 é o plasmideo pRW17BB..

Estes clones assim como os plasmideo© ρ GUI800, p GUI.803, pGWlQOO, pGW'1902 e pGU1910 podem ser usados para preparar outras moléculas de DNA recombinante do invento, em parti.cular as que contem fragmentos das sequências do gene PG nelas inseridos. As referidas outras moléculas de DNA recombinante foram preparadas de modo convencional usando enzimas de restrição, adaptadores, p;· no ossos de ELgacão, amplificação e isolamento convencionais. De preferencia, sao preparados vectores de expressão que possam ser ·:·::'. or (·· pro..... ou eucari. óticos ou vectores vai......vem par·.; propagação c ia células procariòti.cas e <·«ucarióticas. Sao bem conheci, ri os exemplos de construção de tais vectores vai......vem.. Bs vectores de expressão podem conter genes homólogos ou heterólugos. São aqui apresentados exemplos de tais genes..

As inserções das moléculas de DNA recombi.nan te do

Invento ou seus fragmentos podem ser obtidos de modo con venci, o na!., e.. g.. após clivagem do DNA recombinan te :r-m enzimas de restrição adequadas e isolamento dos fragmentos de DNA pretendi......

dos após electroforese em gel de agarose.

Bs mutantes das moléculas de DNA do invento, par ti. cu lar mente das sequências dos genes PG, contendo novos sítios de restrição podem também ser preparados, por exemplo por mutagénese di ΐ-.....ίgida in vitro, de acordo com métodos convencionais Lver o ;; fi go de revisão de l^vl.. J„ Zollere l^vl Smith, Methods Enzymol,, 100,

408 (1.983), D„ Botstein e D.. Shortle, Science 229, 1193 (1.885) ou '1. Morris et al. , Mucl. Acids Res.. 11, 5103 (1983) J.

D invento diz também respeito á utilização de moléculas de DMA recombinante do invento para a preparação de vectores hi'brides para a expressão de um gene estrutural..

Hrispedeir cs......fran-.ífor mndos

Ainda, o invento diz respeito a células hospedeiras transformadas para amplificação de moléculas de DMA recombinante do invento ou particularmente para a expressão de uma cassete de ex pressa o con tendo uma molécula de DMA recombinante do invento..

Sao exemplos de hospedeiros adequadas, particularmente par a a amp i i fi cação das moléculas dc? DMA recombinante cio i nvento, os mi cr oor gani sinos que nao possuem ou tem poucas enzimas de restrição ou modificação, tais como bactérias, em particu Lar

est icrc cie Esc;líerichia_...cc:)li,	por exemplo	ΓΕ.........coli X1778,	’..·.· coii
Y1090, E.. coli. W81. 10, F.. coli	HB101/L.M1035,	E,.........coli JA221,
Ε.. cíd 1 DH5e ou., de preferência E.. coli	DHbíd ' ,'M 108,	MH1 cu

11111-01 ou E..................coli estirpe K1.2, Bacillus............subtilis, Bac,ll.l.us

z.feaccrtheríncjEhilus, Pseudomonas, Haeriic^iíllus, St ra^to?£ocijs e nutras e leveduras, por exemplo SíJCí.rlíarcíiçiycíes............ÇgfgyͧÍâê corno seja S,.........cerevísiae GRF18. Outras células hospedeiras adequadas são células de organismos superiores, em continuas estabelecidas de c:éi u! as humanas p a r L1 a u 1 a ; - ! i n b a ou animais, c. g..

f i.-brob Las tos de pulmão humano embrionário 1..132, células cio mcinema maligno humano de Bowes, células HeLa, células de rim de

macjr.o verde africano COS.....7 ou células de ovário de hamster chinês (CHO) transformadas com o virus SV40.

Sao exemplos de hospedeiros adequados para a expressão de uma cassete de expressão do invento, as células referidas atrás e em particular fungos filamentosos, por exemplo 14όir.il 1 i..urn, Gephalosporium ou de preferência Aspergillus spec,. ,

to g- A...........ícarbrinarius, Α;λ._........... i' i i d ι! 1 a n s o u A,. o r y z a e..	awamori ou de	preferência	Êe.........nlger, A;,.:
São	hospedeiros	transformados	o; e feridos.	1' . col i. MH1
tr ans formada c	:om pGW1800	ou pGW1803, E	.. col. i .111109	trai is f or macia
ϊ ompGPIGPO ou	PGW1803, Γ..	coli DI!5«E’	transf or mar Ja	com pGDISOO,

1902, 1756 ou 1910, pGÍI.....IFN AM1.19 ou pGIIss.....IFN AM119 ou pGTIss.....

I EN AM 1.19, Aspergillus n iger An 8 ou IM593 ou Aspergillus n i dulans transformado com pGII.....IFN AI4119 ou pGIIss.....IFN AM119 e faculfcati.....

va mente com o plasnri.deo da marca selectiva pCG59D7..

invento também diz respeito a um método para a p r e p a r a ç ã o d e t; - a n s f o r m a n t e s c a r a c t e f- i. z a d ο ρ e 1. o t r a l :· a m e n t o d e ar n a célula hospedeira adequada em condiçoes de transformação com uma ur . Ρ ·ι u L.; de DNA recombinante do presente invento, especialmente um vector hi.brido do invento, facultativamente juntamente com um para uma marca el.ectiva e f acultati.vamente seleoção dos brans f ormantes..

A transformação dos microorganismos é efectuada de acordo com métodos convencionais corno descrito na literatura, por exemplo para S„.........cerevlslae (A.. Hinnen et al... , Proc.. Natl... Aoa.

Gci. LIGA, 75, 1.929, 1978), para EL.........subtllis (Anagnostopuulos et al. , .1'.. Baoteriol.. 81, 741, 1981), al... , J,. Moí... Biol.. 53, 159, 1.970)..

e para E...........coli (M.. Mandei et

Assim, o processo de transformação de células E„...............col.i

O-j.

inclui, por exemplo, pre tratamento das células com da de modo a permitir a internalização de DNA e incubação com o vector hibri.....

rio., A seleção subsequente das células transf orrnadas pode seίο enseguida, por exmplo, por transferência das células para um meio de crescimento selectivo que permita a separação das células trans foi-ninadas de entre as células parentais dependendo da natureza t:1a sequência da marca dc DNA vector.. De preferência, usa se um meio de crescimento que não permita crescimento das células que não contenham o vector.. A transformação de levedura compreende, por exemplo, passes de remoção enzimatica da parede celular de levedura por meio de glucosidases, tratamento dos esferuplastos obtidos com o vector na presença de polietileno 9-1glicol e ides Ca..... e regeneração da parede celular por embebição dos esferoplastos em agar.. De preferência, o agar de regeneração é preparado de modo a permitir a regeneração e selecção d,,-o células transformadas como descrito atras simultâneas..

A transformação das células derivadas de eucariotas superiores, tais como linhas celulares de mamíferos, é de prefe.....

: ência conseguido por transfecção. A transfecção é efectuada oqundo técnicas convencionais, como sejam precipitação com fosfato de cálcio» microinjecção, fusão de protoplastos, electro poracão, e.. intr odução de DNA através de um curto pui.se eléc.....

t; ii o que transitòriarnen te aumenta a permeabilidade da membrana celular ou na presença de compostos auxiliares tais corno dietil.....

a m i η c e t i 1 d e x t r a η o, d im e t il s u 1 f' ò x i d o, g 11. c e r o 1 o u p o 1 i e 111 e η o g I i.....

col e sim i. lares.. Após o processo de transf ecção, as células transfectadas foram identificadas e seleccionadas e.. g. por cultura num meio selectivo escolhido dependendo da natureza da marca selectiva, por exemplo meios de cultura convencionais tais como mido de Eagle modificação de Dulbecco (DMEM), meio mínimo essencial, RPMI 1640 e similares» contendo e.. g„ o correspondente ant ibi o t ico..

As células hospedeiras transformadas sao cultivadas por métodos confiecidos num meio líquido con tendo fontes assimiláveis de carbono, e.. g„ açúcares tais como glucose ou lactose, azoto, o.. g„ aminoácidos, peptideos, proteínas ou seus produtos de ;sti tr ut i tais como peptonas, sais de amónio ou similares e sais inorgânicos, e„ g„ sulfatos, fosfatos e/ou carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. 0 meio contem ainda, por exemplo, substâncias promotoras do crescimento, tais oomo micronubrientes, por exemplo ferro, zinco, manganês e similares..

meio é de preferência escolhido de modo a exercer uma pressão selectiva e evitar o crescimento de células que nao tenham s Ldo transformadas ou que tenham perdido o vector hibrido.

Assim, por exemplo, adiciona.....se um antibótico ao meio se o vector híbrido possuir como marca um gene de resistência a antibiótico..

por exemplo, se usar uma célula hospedeira que é auxutrófica num aminoácido essencial enquan to o vector hibrido com tem um gene c i..di fica dor de uma enzima que complementa o defeito do hospedeiro, um meio mínimo deficiente no referido aminoácido é usado para oultivar as cé l.u Las transformadas..

As células derivadas de eucariotas superiores tais como células de mamíferos sao cultivadas em condições de cultura de tecidos usando meios comerciais, por exemplo meio de Eagle m o d i ; i c a c ã o ti e D u 1 L:j e c e o (D14 E i'1), m e i o m i n 1. m o esse n c 1. a 1, Ε Ε' 14 ί 16 ' 0 e s i rn i 1 a res c o n f o r rn e re f e r i d o atrás, f a c u 11 a 11 v a m e n t e su ρ. 1 e rn e ri t a do com substâncias promotoras do crescimento e/ou soros de mamíferos. São bem conhecidas as técnicas de cultura de células em condl.çóes de cultura de tecidos e incluem cultura de suspen soes fiomogéneas, e.. g„ num reactor com fluxo de ar ou num reactor cntn agitação continua ou em culturas celulares imobilizadas, e„ g.. em fibras ocas, microcàpsulas em microsferas de agarose, esferas de vidro poroso, cassetes de cerâmica ou outr ns mi cr o veículos..

A cultura é efectuada por processos que sao bem conhe.....

eidos,. As condições de cultura, tais como temperatura, pH do meio e tempo de frmentaçao, sao escolhidos de modo a obterse um ί ί'.!.· Ie ma:·; imo do pollpeptideo ou dr:a-i.vudo do invento.. Assim uma estirpe de 11..........col. i ou de levedura é de preferência cultivada em condições aeróbias por cultura submersa com agitaçao a uma temperatura de aproximadamente 20°C a 40°C, de preferência a ; a : de 30° C, e um vai.or de pl l do 4 a 8, de preferência de o?cimadamen te pH 7, durante cerca de 4 a 30 horas, preferen c i almen i.e até se atingir rendimentos máximos do polipept c.deo ou > derivado do invento..

Para permitir a selecção das células transformadas de as nao transformadas, as moléculas de DNA tio invento sao portadoras de uma marca selectiva ou, alternativamente as célula::? sao co transformadas com um segundo vector contendo tal marca.. Ial corno noutros sistemas tal marca selectiva é um gene estrutural e?<pressavel, cujo polipepeti.deo expresso (uma enzima) proporciona resistência contra compostos tóxicos para o organismo recipiente ou rom/dola o sistema enzimático de um mutante sem o pollpeptideo essencial,. Tais genes de marcas adequados ã selecção de células de fungos filamentosos transformados, por exemplo, os genes oonhec idos ga -2., pyr U, pyr 4, trpC, umdf ou argS..

domo descrito em EP 278..355 um gene de mar;.;, designado ç- ·: A., foi. isolado a partir de uma biblioteca genómica de A, niger, o qual esta relacionado e tem uma função semelhante a pyr 3 de A...........nidulans e pyr 4 de N................crassa., nomeadarnenlo produtora da en z :i rn a n r o t :i d i n a.....5 ’.....f o s f a t o.....de s c a r b o x i !. ase.. E s t a enz i m a e a t a 1 is; i a desoarboxilação de orotldina.....5 ‘ fosfato em ácido ur i d i .1 i; o ( u r i d i. n a.....'1 ’.....f o s i a L o) e t a rn h é m d o á e L d o f 1 u o r o - o r ó t:i. c o e m f 1 u o r o.....

tóxica.. Um clone de la...............coli. contendo o gene pyr A . :·:

identificado por hibri daçao corno fragmento H :i.ndl 11 de 1,1 kb do

pDJB2 (ref,, 25) contendo parte do gene pyri.. No entanto, pode ser usado o DNA de qualquer outro gene pyr codificador de orofcidina

5' -fosfato descarboxilase,, A partir de um clone positivo desfg.....

nado Ε, co 11B75183/pCG 5 9D7, foi isolado o plasmídeo pCG59D7,, compreendendo o gene pyrA, e usado para ootransformação de um mutante A...........niger pyrA .. Tal mutante pyrA é defectiva no gene da or ohldina.....5’.....fosfato.....descarboxilase e portanto é incapaz de produzir a correspondente enzima.. Tal mutante foi. preparado por tratamento dos conidiõsporos de A,...............ni.gerN756 em condições de mutagonização por radiação UV e as colónias sobreviventes na presença de ácido fluoro.....oróti.co e uridiria foram seleoo lona das..

As colónias sobreviventes na presença de ácichi fluoro.....orótico e ausência de uridina foram eliminadas, Ds restantes mutantes que requerem uridina, de acordo com a sua capacidade para serem transformados, pertencem a dois grupos de complementaçac pyr A e representados pelos mutantes An8 e An 1.0, respectivamente. Ltes foram tratados na forma de protoplastos em condições de transformação com o plasmídeo pCG59D7 contendo pyrA.. Sá se encontrou colónias An8 transformadas e contendo o gene pyr A ^: c. forme e vi silenciado pela capacidade de hi brida ca u do seu DNA diger ido com DNA de pUN 121..

invento diz respeito a um método para a preparação de polipeptideos, caracterizado pelor um gene estrutural homólngsj ou heterólogo, por exemplo um do presente invento, inserido numa ι..·;:·-:. de expressão do invento ser cxpresssii) num hospedeiro transformado adequadsiii de acordo corn métodos convencionais. Quando necessário, o polipeptideo é isolado de forma convencional-.,. Dependendo da construção da cassete cie expressão, os produtos são produz ::idos ou, se estiver presente uma sequên cii. a sinal.., suo produzidos e secretados. Geralmente, a cassete de expressão está ί user i ds num vector híbrido, inas pode também ficar integrado no genoma do hospedeiro após transf ormação..

Um hospedei.ro adequado é por exemplo um fungo, e.. g.. um fungo filamentoso, particularmente urna estirpe de Asperglilus, se um promotor derivado de um gene PG do invento ou um outro pronw tor derivado de fungos filamentosos for usado para a expressão de um gene estrutural homólogo ou heterólogo. No entanto, se lo;-em usados outros promotores, por exemplo os derivados de prosar Lobas ou eucarLotas superiores, são adequados outros hospedeiros, pnr exemplo bactérias tais corno F„coli ou células de eucar intas si iperiores, respec t i vamen te..

Us promotores dos genes PG de A„.........niger são induziveis na eél.u.La de A...........niger, i„ e„ , a expressão do gene estruturai ·, s' es Ligado, e„ g„ o gene estrutura.!, codificador de um gene PG ou estranho, é induzida pel.a adição ao meio de pectina ou produtos de degradação da pectina.. Mo entanto na presença de glucose suficiente o promotor não é induzivel se se usar corno hospedeiro uma estirpe de A.. niger, e.. g.. An'1 ou N593. Isto significa que que o a genes sob o controle de um promotor PG de A., ri Lger são «repri midos por oatabol.it os» ern A..........niger.. No entanto, se se usar uma cu'.: r_; estirpe de Aspergillus, de preferência A...........oryzae ou rnais

P< eLerenoLal.menbe A................rrLdulans, urn gene sub o con trol.e de um promotor PG de A...........n Lger ê expresso constitutivamente, i... e.. tarnbèrn na ausência de pectina e/ou na presença de glucose.. Pode pois ser vantajoso expressar genes sob o controle de um promotor- PG de A., n.fger num hospedeiro Asperglilus que nao seja A„ niger., de ir;- e f e r ê η o i a A oryzae o u rn a 1. s p r e f e r e n«:: i. a I.rn e n t e A.. nldulans, po: que, por' exemplo, pode ser adicionada glucose ern vez de per tina ao meio nutritivo como energia e fonte de carbono durante a expressão de um gene pretendido..

Se se usar um promotor nao derivado do um gene PO do presente invento para a construção de uma cassete de expressão do invento, e.. g„ compreendendo um gene estrutural codificador ds PG, outros hospedeiros podem ser usados como hospedeiros de expres são.. Os hospede ir es adequados dependem do promo tor usado e são

a., g.. bactérias tais corno E,.........coli,, ou leveduras, tais como

S,.........cerevisiae ou Kli..iyveromyces............lactis.. Hospede:iros e promotorps adequadas para a preparação de polipeptideos de acordo oom o invento são tarnbêrn os adequados à transf ormação aqui descrita..

É agora possível expressar num alto nível um ou ma is PGs pretend idos, para o que podem ser aplicados várxos métodos.. Uma única PG purificada pode ser preparada sujeitando uma mistura de enzimas pectinoliticas contendo uma PG, a métodos de purifica.....

ção convencionais. Um outro método para a produção de uma única PG, de preferência PGI, PGII ou o produto do gene pgaC., é caracterizado po/ um hospedeiro adequado que nao é capaz de expr essar qualquer PG ou que expressa PGs numa pequena quantidade ou quo não expressa PG nas condiçoes de indução usadas para o gene PG introduz ido, ser trans formado com um vector' híbrido compreendendo um gene estrutural codificador de uma PG, e.. g.. PGI, PGII ou o produto do gene pgaC ou um fragmento de uma PG com actividade PG e o referido gene estrutural é expresso., Se se usar um hospedeiro •p·· não é capaz de expressar qualquer PG, a respectiva PG pode ser obtida na forma pura, o que significa nao contaminada por outra PG.. E também possível produzir misturas predeterminadas do pGs, facultativamente juntamente com outras enzimas, expressando num hospedeiro transformado nao sõ um único mas também mais do que um dos genes PGs pretendidos, facultativamente Juntamente com genes codif i ca ores de outras enzimas.. Também se pode obter misturas predeterminadas expressando um ou mais genes PG preteri.....

didos e/ou outra enzimas, e„ g„ codificadores de pectfna.....esteara s e s, p e o t i n a 1 i ases, c e I u. I ases, en d o g 1 u c an ases ι n ,i, s t u s,

-'V

hemicelulases, xilanases, arabinases, galactariases, ct..... e β.....glico.....

sLdases e similares, numa estirpe hospedeira, facultativamente com um certo fundo na produção de enzimas..

Âs misturas predeterminadas de enzimas podem também ser obtidas por disrupçao de genes PG particulares no hospedeiro por fdisrupçao de genes», o gue é uma tecnologia bem conhecida na ursa, usando os genes PG do invento..

Um hospedeiro que nao ê capaz de expressar qualquer PG é um microorganismo nao tendo gene correspondeu te e.. g.. uma estirpe PG de Aspergillus, um outro fungo PG que não seja Aspergi 11 us ou qualquer célula PG eu cario tica ou procarió ti. ca, ou uma estirpe de Aspergillus, e„ g„ A,.........gryxae ou X.........nidulans, cuja expressão de genes PG endógenos foi supri.mi.da num meio de cresci......

menti.! condicionado adequado, e„ g.. sao «rep ri mi d os por oatuboli.....

tos» e/ou não induzidos, enquanto que o rpomotor exógeno PG operacionalmente ligado ao gene estrutural PG pretendido, e.. g..

promotor derivado de A, n iger., 6 activo nestas condiçoes ou quando o gene PG é fundido com um outro promotor..

Outros promotores e estirpes adequadas à preparação de PGs sao os mesmos aqui, apresentados na descrição das cassetes de e:<pr essão..

Si.......PolluU.Qijdeps......e......comprjsiçoes

Os PGs isolados purificados a partir de uma mistura de enzimas pectinoliticas, de preferencia derivada de uma mistura de pnzilílas pectinoliticas de Aspergillus niger, em particular de p

Papidase ' e PGs codificadas por uma sequência de ONA de acordo com o presente invento e seus derivados com actividade PG, em particular se produzido num hospedeiro adequado transformado com

um vector de expressão híbrido codificador de tal PG nu urn sei..: derivado com actividade PGe seus sais fci.siologi.ca men te aceitáveis sã'..) também temas do presente invento. Em particular sao preferi dos PG!., PGI1, PGI1IA, PGITIB e PG!V de Aspergillus......niger na forma purificada. 0 invento diz respeito aos referidos polipeptl.....

deos sempre que p:o idu.r idos por um método de acordo com o presente ί n ven bo„ □ invento diz também respeito a outras composições enzimatinas compreendendo um mais de tais genes PG isoladas e/ou j um seu derivado com actividade PG e/ou seus sais biologicamente a t e :i. t ã v e i s f a c u 1.1 a t i v a m e n t e n u m a c 1:3 rn b i n a ç ã ο ρ r e d e t e r m i n a d a c o m uma ou mais enzimas adequadas tendo outra actividade além de PG..

Enzimas tendo outra actividade além de PG adequada â preparação das referidas composições enzimáticas podem efectuar a degradação e modificação de polimeros da parede celular de plantas. Tai.s enzimas sao e„ g.. pectina.....este ar ases, pectina.....liasec, celulases, endoglucanases mistas, hemicelulases xilanases, arabi.nases, galactanases, a e D gli.cosidases e similares..

presente i.nven to diz respeito ainda ã preparação das efei idas composiçoes enzimáticas segundo métodos convenci onai.s..

A utilização das referidas PGs isoladas e/ou seus derivados com actividade PG e/ou das referidas composições enzimát i.cas no processamento de material vegetal é também um ob i e! . t: i v o d o p r e s o n t e i η v e n b o..

As PGs isoladas do invento e/ou seus derivados oom actividade PG ou composições enzimáticas compreendendo tal PG ou derivado sao úteis e. g.. para a clarificação de sumos de vegetais ou de frutos, para aumentar o rendimento de sumo na produção de

X sumo de vegetais ou de frutose e o rendimento da prensagem de sementes ou frutos contendo óleo, para a estabilização de sumos rie vegetais ou de frutos, para a redução da viscosidade do sumo de vegetais ou de frutos, para a liquefação de biomassa, para maceração, para o aumento da extracção de produtos naturais i.ohío sejam pigmentos naturais, aromas e sabores, para a valorização de biomassa, alimentos ou comida, para aumentar a recuperação de fibras de celulose no fabrico de papel e similares.

As realizações mais preferidas do invento sao a seguir d e s c r i t a s η o s E x e m ρ 1 o s..

Eleve......Desç;rioãg......das......EÍSEias figura 1 uma

Eigura......ΞΕ,

Mapas de restrição parcial dos fragmentos EcoRI dos fagos lambda D e larnbdaE obtidos a partir de biblioteca genómica de A..........niger' por' hibridação com as sondas de DNA combinadas HE61.95 e HR61.96 codif icadoras de parte do gene ΡΟΤΓ.. Os números indicam as distâncias aproximadas em kpb aos s i t ί. o s E c o RI d a d i r e i. t a..

Mapa de restrição parcial de pGWlSOO. 0 plasmideo contem DMA do vector pEMBEIS e a inserção Xbal EcoRI de 4, I. Kpb obtida a partir do fago larnbdaE que compreende o gene PO TI A..........n iger M400..

Ap é o gene de resistência à ampi.cil.ina e as se tas radicam o DMA derivado cie A...........niger..

EigiiEã... '.if

Mapa iie restr ica o parci.al de p 091.900.. Ele é composto por pelo vector pUC9 e por um de Ba mH 1 de 8, 6 Kpb do fago PO 1.....lambda?..

fragmen to gura

Estratégia de clonagem dos plasrnideos pGLE.....IFM

Am 19 e pGITss.....TEN AM 1.1'1.

Preparação passn a passo das inserções de DNA,

D NA E e DNA6, para a construção de pGll.....IEN AN 119 e pGIIss.....IEN AM11.9, respectivamente, com o método da r e ao ça o d e c a d e i a s c o rn p α 1 i m erase ( P C R)..

Mapa de restrição parcial de pGW17G8. pGW17G8 é d fragmento Xhol--BglII de 5,5 Kpfo que é portador do gene da poiigalacturonase 11 de A„.........niger NLJ756 inserido no vector pEMBL.,18.. Os sítios de restrição do vector nao estão apresentados.. Os primeiros sitios Xhol e BglFT do fragmento Lambem sao mostrados, mas estes foram destruídos pela inserção nos sítios Sali e BamHE, respectivamente, do vector..

Mapa de restrição parcial cie pGWl.91.0. pGW 191.0 é a fragmento BglII de 7, 8 !<ph do fago lambda larnbdaPG.....020 inserido no sitio BamllL do vector pliCíl. Estâ indicada a localização aproximada do gene de A...........niger N400 codificador de PGC (gçnC),

Gs exemplos que se seguem servem para ilustrar o invento, no entanto, não prebendem restringi lo..

As abreviaturas têm o seguinte significado:

Amp bis Tris

I j gy r a

7::

BSA ampicilina b i s (2.....h i d r o x i e t i 1.) i m i. η o.....t r i s (h i d r o i m e t i 1) m S , a;

albumi.na sérica bovina

D ΙΊ 1, 4- ditiotreitol,

E D T A ã c i d o e t .i 1 e η o d i a m i n a t e t r a c ê t i c o& a 1 d i.....s ó d i c o ΐ P: G · i s ο ρ r ο ρ ι, Ί.....Il.....D.....t i o g a 1 a c t o ρ ir a η o s i d o

!.I..4 j !<.i lu pares de bases

Ρ E G ρ o1, i e t i. 1 e η o g 1 i i; e 1

P 1 H f e η i It i o.....h :i..da 11t o i n a

SDS dodecilsulfato de sódio í e t t e t r ac i c1 1. n a

ΓΓ A a c i!' o t r 1, f1, u o r o a c é b: i ι · o

T Ρ p e p t 1 d e o t r i p t i c o íris tris( hidrox Lmetil)aminometano

X g a 1. 5 b r o m o 4 e 1 o r o 3 i. n d o 1 i 1 β g a I. a c t o s 1 d o

.........meios*.........ppagentes

SM 100 rnM NaCl, 8,1 mM MgSO^, 50 mM Tris HCl pl!7, 5, 0, 01% gelatina

IP 1% tripticese peptona (BBL), 0,5% de extracto de levedura (BBL), 1% Na.(EI, e 0,5 rnM íris.....HCL pH 7,5

LM 1% bripbicase pepbona (BBL), 0,5% de extracto de levedura (BBL...), 10 mM NaCl e 10 mM MgCI,.,

PBS 0, 37g NuH,,,PC_z,, 2, 7g Nu,,J IPC _r 8, 5g NaCl por

1.1,tro I Ε,Π

CSC 0, 15 M NaCl, 0, 015 M citrato tri. sódlco

PSB 10 mM ír is HCl, pH 7, 6, lOOmM NaCl., 10 mM

MgCl_o, 0,05% (ρ/v) de gelatina..

! t	10 mM Tris.....HC1 pl ! 8, 0, 0, 1 rnM EDTA pH8, 0
rneio rni.nirno	1 'litro contem 1, 5g !<H,..,P0^, 0, 5 KC1, 0, 5 g MgSO .. 711,...0, 0,9 rng ZnSí) .. 7TL0, 0,2 rng '1 2 ' 4 2 Mn Cl,..,.. 4H,.,0, 0, 06 mg OoCl,..,.. 6H,,U, 0, 06 mg CuSO^.. 51-1,..,0, 0,29 rng CaClo„ 611,..,0, 0,2 mg FeSO ... 711.,0, fontes de azoto .··· de car borro 4 2 con forme especificado no textoou 6 g de NaNO,.., e 10 g de glucose por litro se estas fontes não ex pilei, tamente mencionadas, a justado a pll 6, 0 com Na UI!
me i..o canipieto	meio rni.nirno corn 6 g NaiMO,, e 10 g de gíucose por litro, rnais 2 g de tri.pticase peptona (BBi...) por litro, 1 g de casarninoãcidos (Difco), 1 g de extracto de levedura (BB!...), 0, 5 g de ©al sõdi.co do acido ri.bonuclei.co do levedura (ICN, Cleveland, UCA), 2 ml de solução de vitaminas, ajustado a pH 6, 0 corn NaOH

solução de
vitaminas TBE	para 100 rnl 10 mg de tiarnina, 100 mg de ri.boflavina, 10 rng ile áoido patoténico, 2 mg de biotina, 10 rng de áoido p.....aminobenzóicu, 100 mg de ni.coti.rrarnida, 50 mg de piri.doxi.na.....! IC1 1 litro contem 4 ml de solução 0, 5 M EDI A pH 8, 0, 10, 8 g de Tris e 5, 5 g de H,..,B0,., I..J

.· Ί fenol. tratado corno descrito por Maniatis et al.. (p438ref.. 6 ) ν' ' tampão de amostra 10% (v/v) glicerol, 100 mM EDTA pH 7,0 e 0,01% de azul de brornofenol

RNAse A RNAse A tratada como descrito por Maniatis et......al.... ( p451ref. 6) ι

llllae·......<1......seguintes......estirpesp

A..	iiir··; N400	tipo selvagem
A.,,..	n ãa ;· M402	irpp A
A..	a i Nkl756	est:irpr al. tamen te
Λ ί 'Ί ,.	niger i‘1756	e s t i r p e a 11 a rn e ri t e
A.	ni. ger An8	D S M 3 9 1 7, rn u t a n t e

estirpe altamente produtor a dedo complexo p e o ti n a s e A.n i, g e r M 7 5 6

á..........niqer MÍ593

F..........t gja NM539

E..........coli Í.E392 csp A, plr A rnotB, supE, I isdM¹ ., hsdR , supE, (P2oox3)

F , hsdR 51.4 (rk , mk' ), supE44„ supF58„ 1 acYl ou (laclZY)B, ρ..; 11<2, galT22„ melei, tr pR55, lambda

1...... .	col i DH5aE7	E'J , endAl, hsdRl 7, (ι-γ , πγ1), supE44, thi.....1, rec AI., gyrA., relAl., SOsííiLacZ M1..5, ./\ í lecZ Y A a r y.F ) Ll '1 6 9, a rn b d a
E„	a H JM1.09	endAl., rec Al, gyrA9fí„ thi, hsdRl? (rk , mk' ) relAl, supE44, lambda , (lac.....proAB), [1 ' , traD36, proAB, laclqZ Ml 5 ) ]

E_;í.........coli JM 11.0 rpsl...., tre, leu, thl, f,.,.Y. gall, ara, tgnA, bsx, dâíit Ίτη, supE44, (lac.....pro ΛΒ), [F⁵ , traD36, pi-oAR., laclqZ M1..5J

Eí-íts.m......usa.los......29.......seguintes......vector es

Este plasmideo foi descrito por Goosen et al. (ref. 13).

Γ·:·..ίι <......!'·'!......[Gop

Os vector es M13mpl8 e M1.3mpl9 (Norrander et............ãJL_, rei.24) são derivados do hactriófago Ml3 de DNA de cadeia simples e destinam.....se a facilitar a sequenciaçâo de DNAao permitir a cliinagem de fragmentos de DNA num sítio poliadaptador versátil e a clonagem do mesmo fragmento de restrição em ambas as orienta.....

oões. As sequências clonadas nestes vectores podem ser facilmente usadas como moldes para reaeções de sequenciação ou produção de sondas ι h · oa.de i.a simples usando o.ligodesox i cribonuoleotidos iniciadores convencionais e o fragmento Klenowda DNA.....ρο I imo; u·. .o !

de E„.........col.i,, 0 DNA vector é portador do promotor do operão lac de

L·...........icoíi e a informação genética dos primeiros 14b aminoácidos du !' galaotosidase.. As sequências do poliadaptador contendo múlti plos sítios de restrição sao inseridas na sequência lacZ. Π poliadaptador mantém a gralha de leitura lacZ e o vector dá compLamentação alêlica de uma estirpe hospedeira LacZa, dando placas azuis em placas contendo IPTG e X.....g.-ti... Os fagos ocomb i.....

n antes contendo inserções que destroem a grelha de leitura ou de nutro modo interferm com a expressão do peptideo lacZa sao revelados por placas incolores..

rPtllf en

EMBL4- é um vector de substituição de lambda com uma « pacidade de clonagem de 9.....23 !<pl:;> (Frischauf et al...... ref.. 9) Ele contem uma região de clonagem múltipla entre os braços de lambda e a ; of'i.ão nao essencial.. Isto permite que seja possível realizar várias digestões com enzimas de restrição de medo a que a religa.....

lf. da parte não essencial aos braços do vector seja reduzida á medida que é inserido DMA estranho com interesse.. 0 vector também u t i 1. i z a o f e η ó t i ρ o Spi p ara p r ο ρ o r c i. ο 1i a r u m a se .1 e c ç ã o d i r e r: t a >..! t. recombinantes (Zi.ssl.er et......al.. ., ref.. 21).,

EDMBL..18......e......EEMBL13

Estes plasmideos foram descritos por Dente et al.. , (reis.. 10, 22, 23)..

EalHiEllí......1.1 IsolâKlênbS......Ê......fÍâcâfHerlzaçáía......de......Eíollgalat^turrinase

Exemplo1,..1.1 Purificação......das......ρ o 1.1g a 1 a c !:: u r on ase s.......í,..........'( Τ, Γ J ( Be.......IV

A actividade enzimática foi determi. n a da nas fracções com enzima obtidas como descrito atrás (Rozie et ai.., , ref.. 2) usando um teste de ferricianeto (Roby et al.. ref.. 3)..

As poligalacturonases I, II, IIΙΑ, IIIB e IV foram R ficadas a partir de Rapidase \ uma mistura conter clui de enzimas pecti.no.iificas obtida a partir de Asperglllus niger (Gist.....broi;ades, Séclin, França).. 50 g do po de enzima bruto

U of.....M9 !<2B 078) foi dissolvido em 190 ml de tampão acetato .'·· sedio 20 rnM pl ! 3, 8, centrifugado tlurante 10 min.. a 25 ooo g para r emover produtos só ido::;. e retirados os sais numa coluna de Sephadex G.....50 (5x90 cm) equilibrada no mesmo tampão.

U primeiro passo no processo de purificação é um passo de cromatograf ia de afinidade usando alginato interligado que fo.i. preparado como descrito por em Rombous et al... (ref. 1). 0 alginato interligado que tem um volume de leito e 5,2 ml/g, foi também equilibrado com tampão acetato de sódio pH 3,6 (dimensões da χ,:;·;.. 2,5x30 cm), A enzima sem sal foi aplicada nesta coluna e • L -pc ic lavada por aplicação de tampão acetato de sódio 100 mM pH

4,2 e pll 5,8, respectivamente (400 ml de cada).. Enquanto PUI. e PGII adsorvem a matrix de a1gina to, PGs IIIA, I1.II3 e IV nao u fazem..

:emp.'ί ......1,,,1,...1.::,, Pfir j.f.içaçao......dç......PGI.......e......PGII.

As proteínas PCI e PGII adsorvidas à coluna de alginato interligado foram eluidas por um gradiente linear de cloreto de sódio (0.....1 M) num tampão acetato de sódio a pH 5,6 que e uma l igeira modificação do processo usado anteriormente (Rombous et a.1...... ref.. 1.).. PGT r.oeliti com PGTT por volta de 0,5 M NaCl..

A fracç:ão com enzimas contendo PGI e PGT I foi. dialisada c: outra tampão acetato de sódio pll 5, 7 e aplicada numa co I ude

7: DEAE Cephadex A 50 (2,5x30 cm) equ.ili.br a da com o mesmo tampão.

As enzimas foram eluidas usando um gradiente linear de NaCl (0 0, 6 !'i), PGI elui â volta de 0,3 M NaCl, PGII ã volta de 0,2 M, .7 f; accoes contendo as enzimas PGI o PGII foram colhidas separa.....

damente, di alisadas contra tampão 20 mM bi.s Tris HG I pll 5, 8 e cromatografada numa coluna de DEAE.....Sepharose Fast FIow equilibre}.....

da com o mesmo tampão.. Guando da aplicação de um gradiente de NaCl., PGII eluiu à volta de cloreto de sódio 120 snM, PGI à volta de 250 ml^vL. As fracções de enzima activa con tendo PGI e PGII foram concentradas após a diálise contra tampão acetato de sódio 20 mM pl I 5, 7 para um volume final. de 25 ml numa coluna pequena de DEAE.....Gepharose East Elow (1,6 χ 1.0 cm) e aluindo com cloreto de •ed 1 M neste tampão.. A purificação final de cada uma das duas enzimas PGI e PGH foi conseguida por cromatografia de permeação em gel em Sephacryi 8200 (1,6x90 cm) em acetato de sódio 0, 1M pH

4.. 2

Ρ8 Γ Γ mostra urna única banda por electroú.r ese em gel Je

SDS.....poliacrilamida e bem um peso molécula: aparente de 38 KDa.. Â actividade especifica é 2780 U/rng de proteína determinado em tampão acetato de sã adio 0, 075 M pH 4, 2.. Quando da isoelectrofocagem a enzima mostra micro.....heterogeneidade.. Par a alem de um componente principal proriunciado a aproximadamente p!l 5, 2, observou.....se um grande número de bandas mentires na gama de pH en tre 4, G e 5,9..

Ρί.ίΓ também mostra uma única banda quando da dentro fo.....

rese em gel de SDS poliaori.lami.da.. Esta enzima tem uma massa molecular· aparente de 55 KDa.. A actividade especifica e de 550Ll/my de proteína determinado em tampão acetato de sódio 0, 075 H pl! 4, Quando da isoelectrofocagem, a enzima também apresenta Kiii.ro- heberogenddade.. Foram observadas varias bandas na gama de i ·! 1 de 3, 2.....3, 5..

: dd_;......1,,.1,,2.::. Purifsed;......<la......Eí/LIIA.........1111118.............Γ1 efluente da coluna de al..g:inato interligado (Exemplo 1.. 1J contendo as PGs não ligadas foi., ajustado a pl I 5,7 com hidróxido de sódio 1 M e foi aplicadonuma coluna de

DEAE Sephadex A 50 (2,5 x 30 cm), equilibrada em tampão acet-ato de sodio 0, 02 M pl I 5, ?.. As enzimas foram eluidas da coluna de

DEAE.....Sephadex com um gradiente linear de cloreto de sódio (01 M)„

PGI7 elui com cloreto de sódio 0,38 M, PGIl IA e PGIIIB coeluern com 0, 5 ΙΊ..

Retirou.....se o sal a 5ml de cada uma das duas fracções de enzimas numa coluna de Sephacryl S.....200 (1,8 x 90 cm) em tampão acetal:::) de sódio 0, 1 M pH 4, 2.. As fracções activas foram reunidas , cli.iui.das cinco vezes com água destilada e aplicadas numa coluna ΜΟΝΠ Q (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) equi.li.brada em tampão 0, 02 i^vi bis.....Tris/HCl plí 5, 8.. Quando da aplicação de 20 ml de urn gradiente linear de cloreto de sódio (0,1 0., 4 M), PGTV eiui com cloreto de sõdio 0.,32 M, enquanto que PGsIITA e ΙΓΤΒ coelueai cloreto de sódio 0, 411.

Ambas as fracções de enzimas foram separademente : eorom a t ogra fadas numa coluna MONO Q nas condiçSes descritas atrás. As fi acções contendo actividade PG foram reunidas, dia.li.sa.....

das contra tampão 0, 025 M piperazina/HCl pH 0, 0 e aplicadas numa coluna MONO P (Pharmacia Fine Clnemicais, Uppsala, Suécia) equil i brada no mesmo tampao.. A coluna foi eluida oorn 1.0f (v/v) do tampão poli 74 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) pH 3,0 num fluxo de 0, 75 ml/min..

A purificação final foi conseguida por cr urna t ogra F ia de - meação em gel numa coluna iSK G 3000 SW (0,75 x 30 cm) (L

Bromna, Suécia) equilibrada em tampão fosfato de sódio 0,05 M pll S, '' num fluxo de 0, 5 ml/min.,

A coluna foi caJ.ibrada com o© seguintes padrões pmfei • · ' albumina do soro bovina (GS kDa) albumina do ovo (45 kDa) e quimoLripsinogénio A (25 kDa)..

Determinou.....se uma massa molecular aparente de 53 kPa ,rr; PGÍV por cromatografia de permeaçao em gel... 14107 mostra uma única banda quando da electroforese em gel de SDS.....poliacrilamida e tem uma massa molecular aparente de 59 kDa determinada por eleotroforese num gel de 151 de poliacrilamida.. A actividade espoei f ica é de 780 iJ/rng de proteína determinado em tampão acetato de sódio 0, 075 M 4, 2.. Quando da 1soelectrofcoagem a enr im,. mostra uma única banda bem definida a pl i 3, 7..

A cromatograf la de permeaçao em gel das fracções ariLvas con tendo PGTIA e ITIB na coluna de TSK G 3000 SU i- .Piornas mesmas condiçoes descr itas para PGIV, resulta na separaçao das dua© enzimas cem massas moleculares aparentes de 3P e 52 !<Da, respectivamente» Quando da electroforese em gel de

3.P8·· poliacrilamida (gel de 153 depoliaer :i lamida), no entanto, ambas usnexi.mas mostram uma uni·; banda corn urna massa molecular aparente de 57 kDa, PGII IA e IIIB têm uma actividade especifica •G 1.50 e 250 ll/mg de proteina respectivamente, determinado tampa o em tampas acetato de sódio 0, 075 M pll 4, 2, Quando da isoelectro.....

focagem ambas as enzimas mostraram uma única band bem definida a pd 3, 3, í a -m: · Ρ ,.......| . e.....:· Comparaçacr......das......proprl.edades.....das............eο1.1 a I. c. turon i.s,·

e......suas......i e I aooes......imi inológicas

Começando com 50 g de Rapidase (Gist broca des, Sécliri,

Fr ança ) p u r i 1^: i c a / a m s e c χ n c o e n d ο ρ ο 1.1, g a 1 a c t u r o n ases c o m o d e s c r i tu no r·:.·'>.ηpl:: L„ 1... As propriedades destas enzimas purficadas ;e'..3. ; ©sumidas na Tabela II,

Tabela ΓL. Propr iedades físico.....quimi.cas e p!!.....óptima da cinco pu 1i.galncturonases de A,.........niger

ima	Mra	I, Ε, P, b	pH-óptimo (	. ao tiv idade )
PGI	55K	3, 2.....3, 5	4,9
PGII	38Κ	1, 6.....5, 3	4, 3
PRIIIA	57Κ	3, 3	4, 3
PGIIIB	57«	3, 3	4, 5
PGIV	59K	3, 7	4, 8

Notas:: a Valor extrapolado determinado por electrof orese com

SDS b Ρ o n t o 1 s o e 1 é c t r i, o o, d e t e r rn ::i. n a d o p o / isoeie of r ο Γ o o a t ?ι e m em camada fina..

Todas a© enzimas purificadas têm uma massa molecular aparente num gel de SDS-15% poliaerilamida na gama de 55--59l<Da, excepto PGII que parece ser uma proteína muito mais pequena (38 KDa).. A natureza especial de PGII é salientada pelo seu ponto iaeeléotr ίοο relati.vamente alto ao contrario dos pontos isoelêc.....

' ricos 3s1·:!.!:.·, determinados para as outras poligalacturonases.. 0 pH óptimo de todas as poligalacturonases situa.....se ria mesma gama ( 5 3 4, 9)..

Induziram se anticorpos específicos ara, PGI e PG f L purificadas em coelhos brancos machos da Nova Zelândia de acordo com o esquenia de imunização descrita por Uitzetter (ref., 36)..

A reactividade cruzada entre os dois anti.....soror, e as c i n c η ρ ο Ί ί g a 1 a c t u r o n ases f o i. c o n b r o 1 a d o c o m o d e s c r i t o a h a i 5< o.. 9,4-1,0 pg de proteína purificada foi. aplicado num gel de de 389 ! 08 poliaerilamida e após electroforese transf eri.do do gel. para uma membrana de ni.trocelulose usando o método descrito por o p e ri et......ai,... ( re f.. 3 7).. A i η c u b a ç ã o d a n :i t r o c e 1. u 1 o s e c o m ρ;' o t e i. - nas transferidas e os anti serros específicos seguida de color a çao com i. munogl obulinas de cabra marcadas com peroxidase anti .IgG de coelho foi. feito segundo Uitzetter (ref.. 36).. Guando da incubação com o anti soro especifico de PGI observou se um sinal forte para

PGI e par-a as PGs IIIA, IIIB e IV.. PGII dá um sinal 1 igei.r amente mais fr.ico oom este anticorpo.. A incubação da nitrooelulosc oom anti. soro especifico para PGII resultou numa banda de intensidade elevada para PGII mas para as outras poligalacturonases as bandas mos t r ara rn s e f r a c as..

do·'

Determinação............de............seqc;ênc:::i..a............de............aminoácidos

Eiadílílo............Eli.....

fryayentcs......de......brometo......de......ÊÍ âQfi^énio......da......elsàialj^t^ran„asg.

.1.1

Aproximadamente 100,i.j.g de PGII foram dissolvidos em 150 ji L de ãcido for mio o a 70% e adicionado brometo de cianogénio adli.de num excesso molar de cem vezes r el a ti vamente a metionina (da qual ocorre 4 resíduos por molécula de enzima).. A mistura cie reacção foi. agitada continuamente durante 24 horasa temperatura ambiente num frasco cie racção fechado.. Apds 24 horas adicionou se agua e a preparaçao foi seca gaseando com azeito.. Este passo foi., repeticlo par a remover o ãcido f drm.i.co..

Λ μη o electrofcrese em géis de SDS.....151 pnf faradd amida aproximadamente 10 bandas individuais foram coradas por Cocrnass i.e

Brilliant Bl.ue.. Elas representam fragmentes completa ou imeornple.....

tamente clivados. Para além da proteína Intacta que tem um peso molecular de 38 KDa , foram observadas as seguintes bandas:: 33,

30, 27, 19, 17, 10, 7, 5, G e 6 KDa.. Ao retirar.....se amostras corn intervalos regulares durante o período de reacção cie 24 heras e analisando estas por electrofcrese em gel de SDS poliacrilamida, a ordem pela qual aparecem produtos de reacção par ciais e f ina i s assim como a sua posição uns em relaçao aos outros foi. determina da.. 0 fragmento de 17 kDa é um fragmento interno enquanto que o fragmente de de 5kDa estã situada no extremo C ou no extreme 11. íis fragmentos das 24 lacras cie tratamento foram então transferidos para ! mmobi I on.....P, o qual é uma membrana de polivinilideno- u±i fluo

·.>·’.·; (Millipore), de acordo com o processo descrito por Matsudai ra et......ah. , (ref.. 4).. Foram usados três fragmentos para sequencia.....

ί cl £>£.·.? íjõ.íE>OE>cl x.L< um fragmento interno de 17 kDa e dois fragmentos mais pequenos (5 e 8 kDa)..

As sequência© de aminoácidos foram determinadas com um sequenciador de proteína Applied Biosystems modelo 470 A, ligado

i.i um analisador Applied Biosystems 120 A PTH. Ds fragmentos de membrana contendo 0,5.....1 nmole de um peptídeo particular foram lavados, aplicadas num sequenciador de fase gasosa e sujeito a a n â L ise d e se q u ê n c i a s d e a c o r d o c o m o p r o g r a rn a d es cr i t ο ρ o r A m ο 11 s (ref.. b)..

Para o fragmento de D !<Da obteve.....se a seguinte sequên Posição:: 1 5

Ami noa nido:: asp ..... ser .....X ..... tre .....fen ..... tre ..... tre ..... ala ..... ala .....

Posição: 10 12 13

Aminoácido: ala ala li© (ala) (ala)

Ma posição 3 (X) nao se detectou qualquer od.rslo·. Ir:·! vez que o programa de sequenciação usado apenas detecta resíduos de cisteina se a proteína for' S piridiletilada antes, é pr ova vel que a posição 3 possa ser uma cisteina (Amons, ref.. 5).. Mas posiçoes 12 e 1.3 foramencontrados vesti.gi.os de ala conf or me indicado pelos parêntesis. Enquanto que o vestígio na posição 12 t J. a r ame η H e r e s u !.. t a d e u ma r e a c ç a o ,i.. m c o m ρ I. e t a η o p a s s o a n t e r i. o r o sinal baixo de ala na posição 13 representa o aminoácido ala na ο.·!/·:·,, i 3 do pepti doo..

A sequência para o fragmento de 1.7 kD a é posição: 1 5 aminoácido: ala ..... fen ..... ser ..... vai ·-· gin ..... ala .....

posi ção:: aminoácido:

asp

1.0 ile ..... tre (ile) ..... fen (tre)

Os vestígios de isoleucina e treonina observados nos dor· últimos passos conforme estã indicado pelos parêntesis clafamento resultam de reacções incompletas nos passos anterio.....

;^r.·

Pr'··,·.......1.. 4......

;- iu i ^rl«íâauên cia......de......aminoácidoí jnase.......I da............parte

100 jig de PGI purificada de acordo com o Exemplo 1.. I.. 1 foi diali.sado três vezes contra 1 1 de agua f i ! ti ad a _: ·.

Millipore e liof ilizado. As sequências de aminoáci dos foi., deter.....

minada como descri to no Exemplo 1.. 3.. Determinou.....se a seguinte sequência de aminoácidos N.....terminal, para a enzima

Posição:: 1 5 P ami í ia.it: ido:: ala ser tre X tre fen tre -- ser ala

Os resíduos de cisteina na proteína, nao foram modifica dos e portanto não detectados.. A cisteina provave.lmen te bambem o corre na posição 4 (χ) da sequência.. A sequência de aminnãe idos d ter mi nai de PGI apresenta homologia com a sequência de aminoáotolos do fragmento de brometo de cianogénio com 5 !<Da de PGTI que foi. isolada a partir de Rapidase (Exemplo 1.. 3) e com a sequência rio· ami. no ácidos M.....terminai de PGTI isolada a partir tíe A.................niger tr .rd orinan te M593/pGW 1800.....27 (Exemplo 8., 3).. Esta homologia estã deserita no esquema que se segue, onde se assumiu que na posição 4 e 3 das sequências de PGI e de PG11, respectivamente, estã r i;;te Ina::

PGI ala ..... ser ..... tre ··· cis ..... tre fen ..... tre ..... ser ..... alu

PGI) asp ..... ser ..... cis ..... tre ..... fen ..... tre ..... tre ..... ala

I ' ! )

espaço aberto entre o residuo serina na posição 2 residuo císteina assumi, d o para a posição 3 na sequência de poligalacturonase 11 esta introduzido de modo a alinhar ambas as sequências..

li resi duo ser ina na posição 8 da sequênc ia de Pí U nao esta presente na posição correspondente na sequência de PG! I (posição 7), mas neste último caso esta presente um aminoácido de um t:.:i|,!o semelhante, i.„ e„ um aminoácido pequeno com hidr oxilo ( tr con.Ina )..

fts sequências de arninoãcidos N.....terminal de PG Γ e PGII mostram assim hornologia, mas nao sao idênticas, fts diferenças sao tais que que estas não podem resul,tar de modificação parcial. do produto de urn único gen, como seja por exemplo clivagem proteolí.....

ti ca parcial,. Concluiu.....se que PGI e PGII são codificadas por :···.· diferentes da mesma família..

ã -en.iid c......J... 5:: Determlxxucão......da............sequência......de......amir soridec......der.............frz;g menj, > . debrcimetr;de cl.anggér.1 jodapql ί q<;lar: .turqnnsoI

Aproximadamente 100 jig de PGI foi dissolvido em 150 j.i 1 de acido fórmico a 70% e adiei, ona do brometo de cia nogénio solide pjru fragmentos da proteina como descrito no Exomp! i; 1„ 3,

Fstác presentes 4 resíduos de metionina por molécula de enzima.

Apòs e |..pr.trof orese em géis de SDS.....15% de poliacrilamida e color a çso corn Coomassie Brilliant Blue, observaram.....se bandas principais tendo um peso molecular de 39, 5, 35, 21, 19, 5 e 5, 5 kDa, fk; fragmentos de 21 e 5, 5 kDa foram sequenciados usando u mesmo equ ipamento e processos corno descrita no Exemplo '1,. 3..

A sequência para o fragmento de 21 kDa é per. d cós > 1

Ami no áci. d o ala ser tre ..... X ..... tre f on !f i.çaa

1.0

Aminnáci.do tre · ser ala ser ..... glu

Na posição 4 (X) da sequência provavelmente a·;'? c cisteína de modo semelhante ao descrito nos Exemplos 1.3 e 1..4.. A sequência do fragmento de 21 kDa é idêntica á sequência de aminoácidos M.....terminal da proteina PGI descrita no Exemplo !.. 4..

D fragmento de 5, 5 kDa tem a seguinte sequência

Posição 1 5

A mi. noác ide::) ala ..... asp ..... gli ..... ala ..... vai. ..... ile

Pnsi.cl çao

1.0

Am.i.noá; ;i.do asp - gli. ..... asp ..... gli. ..... ser

Concluiu-se a partir destes das los ds? sequsências que? o fragmento :1c? 5,5 kDa nao corresponde ao extremo IM da proteina.

Εχοπηο D.· .1-.,.6.1 Determinação cia sequên cl. a tle ami.as >áí·;d tios cie um psapti.deo.......trjjqtiçn

PG11 foi. parcialmente desnaturado por diáli.se · rr,

0, 51 (v/v) de ácido fSrmicci e subsequentemente liofilizadsx A enzima (1. mg) feri ressuspensa em 1. ml. de tampão N.....etilrnorf olino ···· acetato 0, 2 M pH 8, 0 e depois incubado a 37° C com tripsina (s igma) que? iá d. adicionada numa proporção molar de 1::50 relativa a PG1I.. Após 24 h a sligestao foi. parada pela adiças::! sis?

ócidtj acéticu (30% concentração final). 0 pruduto da digestão foi i i ei ; Ei zado.. Amostras do produto da digestão foram dissolvidas ;-m ácido trif luoroacêtico 0, 1% contenda ditiotreitol 2, 5 mM e ι,νόΐν· a 37° 8 durante peio menos 1 h„ Os pephideos trlptinos (amostras de 100 yl contendo 100.....200 jig de proteína) foram dos usando um HPLC Spec tra Physics SP 8000 equipado oom uma coluna NucLeosil C18 (1,8 x 150 mm) (Supelco)

..-.-.-:21 V:lac ( Chrompack ).. Na coluna, a uma

25° C, aplicou - se um fluxo de 2 ml/min e um gradiente linear muda em 50 min de 1.00% do solvente A (0,1% TFA em água) para de solvente A l- 50% do solvente B (0,1.% TFA em acetonitrilo) ν/'.ίΐί-ν; [1 iram detestados por absorção de IJV a 214 nm.. Um doe peptideíjs que foi Libertado mais tarde durante a digestão surge '··-: Síí dos outros picos no cromatograma a aprox.. 21% de ai-etonl.tr ilo.. Este peptideo foi seco com ar ses::;o a 25°C e sequen > Eido.

e uma coluna ile temperatura í.le que

50% íls

A sequen iria de aminoácidos foi determl.natla th·.· aoordo corn o processo descr ito no Exemplo 1.. 4.. A sequência é::

Aminoácidotre ..... ile ..... ser ..... gli ..... ala ..... tre - gil. ..... ser

1.0

1.4

Aminoácido:; vai. ..... ser ..... glu ..... ile ..... tre ..... tir

Exenij-fLo......2 8onstruçãí:i......de............uma......b i..bl.::i..oteca......genornioad: Aspo; ;. i i.I.us nlger i n i. íl i ó s p or o s d e A spe r g i 1.1u s............nlger e s'. i i p e N -10 0 f o r a m inoculados em 200 ml de meio mínimo numa densidade final de fj esporos de 10 esporos/ml e agitado em Erlenmeyer de 1 1 durante h a 28°C a 300 rpm usando um agitador rotativo New Brunswickι.t nu

Π micél.i.o foi colhido por filtração usando urn funil Buchner

Mvracloth, Lavado com soro fisiológico esterilizado frio, conge.....

ledo ern azoto líquido e guardado a .....60° C ou usado directamente, ÍJ método usado para o isolamento de DNA para preparar a biblioteca οιa irl.niί o baseio......se no processo descrito por Yeiton et ai,.

(ref, 1.8 )..

Para a construção da biblioteca, 10 g de micélio foi esmagado em azoto líquido em porçoes de lg num m.ii ; o......desmembr ado;B; o-: 0 micélio triturado foi transferido para um I ; l.enrneyer .1 t -;.í êri 1contendo 200 ml de tampão de extracção (50 mM IDE', ph 8,5, 0, 2í£ SDS) e 200j.il de dietilpirocarbonato.. A mistura foi

--...,::-1.- aquecida até â temperatura ambiente e depois aquecida durante 20 minutos a 68°C com agitação ocasional.. A suspensão foi. ,;a . S-él; até ã temperatura ambiente e centrifugada dur ante 1.5 min a 1.2 000 xg.. Adicionou.....se ao sobrenadante 1./1..6 de volume de o,sc o solução de acetato de potássio 8 M pH 4, 2 e a mistura foi. deixada em gelo durante 1 h.. D precipitado foi removido por centrifugação (20 min.. ; 16 000 xg ς 4°C). Os ácidos nucleicos precipitados a partir do sobrenadante por incubação com 0, 6 volumes de isopropanol ern gelo durante 15 min. 0 ácido nucleico precipitado foi. colhido por centrifugação (10 min.. ;; 6 000 xg

4°h), lavado com etanol a 70» e seco rapidamente, 0 sedimento foi ressuspenso em 1.0 rnl de TE contendo 20 j.í ;;;/;η 1 de ENase A, (.Boehringer, Mannheim) e incubado durante 15 min a 37°C. Π DNA foi tratado com pronase sem nucleases contaminantes (1. mg/ml oincentração final) (Kochlight, Coinbrook) durante 1 h a h?^c'!l para digerir- as nucleases..

8, 5 g de CsCl foi dissolvido ern 9 ml. da solução de DMA obtida, adicionou.....se 0, 2 ml de brometo de etidio a 10 mg/rnl e es fa solução foi. centrifugada num rotor Beckman SW41. durante 60 b a 33 000 rprn ou num rotor Beckman 50 Ti durante 40 h a 45 000 rpm,

A banda de DNA foi colhida e o brometo de eti’d.io removido por múi triplas extracçSes com isopropanol equilibrado oom uma solução saturada de NaCl ern água.. Adicionou - se 5 volumes de TE e a solução de DNA foi sequenciadamente tratada com fenol saturado c o m i E, f e η o 1 / r1. o r o! “ o :- rn i. o / â 1 c o o ! J. s c; a rn i 1. i c: o 2 5 :: 2 4 :: 1 o c Ί o; - o f ô r.....

rnio/áloool isoarnilico 24::1.. 0 DNA foi precipitado pela adição de

0, 1 volume de acetato de sódio 3I^VI pH 5, 2, 2, 5 volurnes de etanole uma incubação durante a noite a .....20°C.. 0 precipitado foi colhido por centrifugação (1 h, 30 000 xg:; 4°C), lavado corn etanol a 70%, seco o dissolvido ern 400 ,ιι I de TE., ttaÍSti.Lí!......2::...2:.1. ilÍOÊS.ta£í......£2ât22iâl......tífí DNA de......A„niger N400 £QIU NríQl£ ' í.id.tíÉ’ O.t Q dos fragmen .tris

Para testar qual a concentração de MboT. que dâ a maior quairt idade de fragmentos de DNA entre 13,6 e 23 Kpb, fracooes de

!. gg de DNA de A...........niqerN40G foram digeridas no tampão adequada rrs :nmondado pelo fornecedor corn quantidades decrescentes de Mbol (0, 5 0,001. U) durante 1. h a 37° C num volume de 10 pl. A reacção foi parada corn pel.a adição de 1 j.il de 0, 25 M EDTA e as amostras foram aplicadas num gel de 0, 6% de agarose ern tampão TBE, conten.....

- Ic 1 jig/ml de brometo de etidio.. Os marcadores de tamanho conve nientes são uma rnistura de DNA de lambda e DNA de lambda digerido corn Bglll, o que dá bandas de 49, 22, 3, 13, 6, 9, 8 e 2, 3 kpb e um fragmento nao visível de 0, 45 kpb. A concentração de Mbol neoessa ria para dar um rendimento elevado do© fragmentos pretendidos de 13, 6 23 kpb é cerca de 0, 02 U/jjtg de DMA.. Assim, 200 j..ig de DNA num volume total, de 2ml. foram digeridos e divididos 20 amostras iguais imediatamente após a adição da enzima.. Após 1 hora a 37°Π os produtos cia digestão íorarn colocados ern gelo.. Após testar uma amostra de 1. jil quanto digestão correcta por migração num gel, adicionou.....se EDTA para uma concentração final de 25 rnM, a enzima foi. inactivada pelo calor a 65° C durante 10 min, a© amostras foram reunidas e o DNA foi precipitado, lavado, seco e dissolvido em 400j.il de ! E..

DNA fragmentado foi separado num gel preparativo de 0,4% de agarose (cavidade central 120 x 1,5 mm). DNA de lambda digerido com BglII foi usado como marcador para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA parcialmente digeri.de quando da electrofarese a 4°C e 40 V (3V/cm).. A região do gel contendo fi- agmentos com o tamanho correcto foi retirada do gel e o DNA ι .· I, ·! · L; i ie ! u h'!o do gel num tubo de d ia li. se estéril em 2 mi. de TBE durante 2.....3 horas a 100 V., A corrente foi. inverti da durante 30 s e o tampao contendo o DNA foi. colhido.. Os fragmentos foram então ·:·,.!-entrados por' precipitação com etanol e dissolvido em 100j.fl de 0'.

^lffir......2,....3..2 Preparação......de......DNA......vector......e......c'Lona<:ijeui......do......fragmenteis......de

DNA......de......alto......peso......mol. e cu lar......de......A,.........nlger......N4Q0......em......f.Mfii 4

A biblioteca ge nó mi., ca de A,...............n iger estirpe Ni 00 foi construída no vector de lambda EMBL..4.. 0 vector que tem uma capasi.dade de clonagem de 9.....23 kpb, í s ri, descrito por Frischauf et......oh. (ref., 9) e Karn et al... (ref.. 19) e í^::t s i adqui.ri.do a Promega

Biotech. Inc» Para evitar duplas inserções derivadas de di.feren.....

tes partes do genoma, usou.....se na clonagem um comprimento mínimo de fragmento de 13, 6 kpb..

j.ig de DNA de lambda Γ li BI. 4 foi. di.geri.do totalmente com 50 unidades cie BamHI no tampão recomendado pelo fornecedor num volume de 100 jcldurante 2 h a 37° C.. A enzima foi inactivada durante 10 min a 65°C. A concentração de NaCl 'foi. aumentada í50 mM e adicionou.....se 50 unidades de Sall e a incubação a continuou durante mais 2 horas.. Após adiçai::) de EDTA para 25 mM e para

37° 0 inactivação da enzima (aquecendo durante 10 min a 65°C) a solução •fui extraída com iguais volumes de fenol (saturado com TE), f e η o 1 / c 1 o r o f õ r rn i o / à 1 c o a 1 i s o a rn ί 1 i c o ( 25 :: 24 1. ) e c 1. o r o f õ r m 1. o / a 1......

>'- - o o I i. s; j a ι ii 11. 1 c o ( 2 4;; 1)P a r a e 1 i. rn 1.. n a r o s ρ eq u e η o s f r a g m e n t o s d e poli, adaptador Bamíll/Sall, o DNA foi. precipitado com 0, 6 volumes isopropanol apos a adição de 0, 1 vol.. de acetato de sódio 3M ρ! 1 ó„ 2.. Após 1.5 minutos em gelo e 15 min de centrifugação a 12 000 xg a 4° C, o precipitado foi. bem lavado c o metanol a 70%, seco e ι ί i ·..·.·.! d ·.· i do em 40 j.il de TE„

Pxeliip ! g......'14.;;.. I.iqueao......e......encapsulaçao......in.......vitro......de......frsagmentos......cie......DNA ροΈρ-ί......de......A...........nlger......1M4Q0

E essencial que os si ti. os cos do vector' preparado de ,ii.;or'do í .om o exemplo 2.. 3 sejam emparelhados antes er reacção de ligação., L! vector em 100 rnM íris d 13! pH 7,5 e 10 mM MgC1.,.foi. aquecido durante 10 rnin a 65°C e depois emparelhado durante 1. b a

42°íl. A partir' de testes de ligaçao encontrou.....se urna proporção de •'s·.:,· piara fragmentos de aproximadamente 1::.!.. (por peso) como ti indo mais recombinantes. A ligaçao decor r eu em 50 rnM Íris 1-1(31 pH 7, 5, 1.0 mM i-íyC!.,,, 10 mM Dl! e I mM AIR, usando 9, 5 pg de vector' e pi; de fragmentos de DNA num volume ΕοΙ..·.ι I de 100 pl... Adicionou.....

.....-se DNA.....ligase (BRL) numa concentração de 0,5 U/pg de DMA e a mistura de ligação foi incubada durante a noite a .14C„ Para testar a ligaçao uma amostra do DNA ligado foi. sujeita a e Isir· s·?.·.·.’ num gel de agarose.. Também, como testemunha 0, 5 pg de vector ft ri ligado sem a adiçao de fragmentos num volume de 5 pl...

A mistura de ligaçao num volume grande foi. concentrada por pr;s i ρ i i..a.ção com etanol e di.ssolvido em 20 j.xl de ΤΓ antes da encapsula cao in vitro. A encapsulação in vitro foi. feita com ss.-íIís Promega Packagene de acordo com as instruções do fabricante usando porções de 10 j.ilpara encapsular 1 pg de DMA.. 1

j.ig do lago lambda de alto peso molecular c!857 Sam 7, fornecido ι ;(-irn os extractos, foi separadamente encapsulado como testemunha.

Apos encapsulação, adicionou.....se 500 j.fl, de tampão da solução de (PSB) e 5 ,ii! de clorof órmi.o.. Os stocks de DNA recombinante podem ser guardados a 4°C.. A biblioteca obtida foi construída a par tir de duas exper iências de ligação separ adas..

^! P-......3 5:: X.Í,1;aI <!.çao......e............aínpl::;,í1.t::ação......da......biblíoteca......genóm is u.............

A, niger......estirpeN400

As células de E...........coli NM539 foram cultivadas em meio L.B mntendo 0,2% de raaltose, 10 mM MgSO^ e 1. mM CaCl_rJ até uma dens.rdade óptica (600 nm) de 1,0.. Amostras de 0,2 ml des la cu l.tura for urn adicionados a 0, 1 ml. de uma diluição de fagos adequada ern PBS.. Apos adsorção dos lagos durante 20 min a 37° 3, adicionou se 3 ml de 0, 6% de agar de topo LB, α mistura foi.

semeada em placas de agar LB e estas foram incubadas durante a noite a 37°C.. 0 número de unidades formadoras de placas (pfu) por ml de suspensão de fagos foi. de 12 x 10' e 4, 2 x 10 pfu/ml para a- dois stocks de fagos preparados de acordo com o exemplo 4..

Asoa subtracçào do fundo que é calculado a partir das ligações

Lestemunhasem fragmentos (17% e 40% respectivamente) o numerai 5 absoluto de recombinantes e de 6 x 10. 0 DNA contido nos recum.....

hinanbes é equivalente a mais de 200 dos genomas de Aspergillus n L;;ier„

Para ampli.fi.car a hiblioteca, usou.....se amostras de 80 jil dos stocks de ambos os fagos para infectar células E..........coli N145 39 que foram semeadas em agarose de topo LB sobre placas de agar L.B e íiepe L. incubadas durante a noite a 37° 11. Os L;çs foram eluidos da agarose por agi. baça o suave das placas com 5 ml de PBS por placa durante 1 h à temperatura ambiente.. 0 PSB foi colhido, centrifugado (10 min a 6000 xg) para remover- as bactérias e adicionou.....se clorofórmio (0,5% concentração final.)., Ambos os η ο

;stocks de fagos, os quais forarn amplificados aproximadamente mesmo grau, forarn então misturados (40 ml de stock), titulados (3 x ICC'' p fu /rnl) e guardados a 4°C.

·ζύ.......3..;:.. Despiste......da......biblipteç:a......gmóniiça......de......A...........niger............reLati mente......u......ácidos......nucl eioos......relaolqnados......corn......ιυo 1 1. ga I ac.turonases

Exemple;8.. 1:: Sintese......de......misturas......de......o 11gon uo 1eot zí Ic· :33......codificado.....

• ^;......do......i : ugrnen ho......de......brometo......de......cianogénl.o......cie......17......kDa......riu......po ! d.;e i. :.....

L^: 'i ;rjnurr* II

Os oligonueleotideos para o desp.Lste da biblioteca genõrniea de Aspergilius......niger preparada de acordo com o Exemplo 2 forarn sintetizados usando o método fosforarnideto (M„ ! L Car u the; s, ref. 8) com urn sintetizador de oligonuclco tideos Applied Biosysterns (modelo 380 B). 0 fragmento de brometo de cianogénio de 1.7 kDa descrito no Exemplo 1.. 2 é urn peptideo situado interna.....

mente.. Portanto, a sequência de aminoácidos determinada no ! xemplo 1. 4 pode ser prolongada até ao extremo M corn urn resíduo rn e t i o n i n a.. 0 o o 1 i g o n u cl e o 11 d e o s s i n t e ti. z a d os sao m i s t u r a s c a 1 η ρ 1 e.....

cas uma vez que se tom de considerar a degenerescência do código genético., Por razoes técnicas é necessário reduzir o número ile nut-leotideos na mistura.. Para excluir os oligonuoleotideos com a comb inação forte forte Tfi e AC na posição 10 e Ll. e limitar o tamanho da rni.stura, duas misturas separadas de oligonucleotideos correspondendo á sequência na cadeia codificadora foram sinteti.....

zadas tendo ern consideração a degenerescência do nédigo genético.. 8 cizci de oligonueleotideos necessário foi ainda reduzido pela introdução de inosina como a loa se inconstante nas quatro ouloc diferentes dos 29meros sintetizados e portanto cada mistura consiste em 1.8 oligonueleotideos diferentes (Ohtsuka et sJ . , r e! 1.8 1. As duas misturas que sao designadas I1R8195 e PRG1.9B

V >

ΐ,

cpr tr sentam DNA codificador da sequência de aminoácidos que se e tern a seguinte composição::

	de	aminoácidos	rnet	ala	fen	ser	vai	gin	ala
í I ’ '· '· ,?')		DG (d) ATG	GCI	1TR Ί	ICI	G ί I	GAR,,	GCI
1IRG196::		b'· (d) ATG	GGT	T1R..|	AGI	G : I	car9	GCI
:-ad cia	de	aminoácidos:asn	asp	Ile
HRS195?		AAR, GAR..,	AT 3’
RRG!99?		AAR.,,	GAR.,	AT 3
			1.

•-m que I é innsina, R..j é T ou D, R,, e A ou G„

Slt-GEllu......·..' ::...2.1. Gin tese......de......uma......mistura......tie......ç ' Lgqnut1 uo!.1,1o;Ç; V c ; ;

í .a d ;::<r a ii1ragment o dobrornetn............ducianogénio'..pi;! b,..bG3 a d·

C:'. 3:' ^! - o G. l.':¹-?'?[

Ll fragmento de brometo de cianugénio com 5, 5 kDa doo; ; i :.ϋ no Exemplo 1.. 5 é um peptrideo situado internamento que foi preparado por clivagem com CNBr. Portanto a sua sequência de ,j min tra eidos pode ser prolongada no extremo N com um residas?! metionina.. 0 número de cl i. gonucleoti.de os necessário foi redu?r:i..do i J ·λ iu Lrotluçao de innsina como base inconstante nas cinco í ?i o- ---- i t. t Ί: · s d i f e r e n tes d (?) s 32.....rn e r o s q u e f (?) r a rn s i n t e t i z a t :l o s.. 1 s t (?) limita a mistura a 24 oli.gnnuclqotideos diferentes.. A mistura, designarei a HR 8298, representa DNA codificador da sequência .::.1.:-4-., se segue e tern a seguinte composição::

cie

G · - q i j ê i i t ? 1. a d e a rn i n (?) á (?) i d (?) s NRG233 rnet al.a asp 5’ (d)ATG GGT GARj

: í1i ala vai	ile	asp
GCI GCI GTI	AIR,,,	GAR..,
em que I e i.no		R1 é

gli	asp gll
GGT	GAR.., GG	3’
T ori	C e R,., é	Ϊ, C ou A

- urip I ο......3... ,.3..::.. IWcaçao......dg......olií^inucleotiíÈãas......5.29......ο

As misturas de olígonucleotideos liofilizadas, H RB 195,

HR8196 e HR6298 foram dissolvidas em agua destilada numa concen.....

tração de 29 juM.. Amostras destas soluções foram diluídas dez vezes para fazer a mistura de reacção. A mistura de reacção é composta por 20 pmoles da mistura de olígonucleotideos HR61.95 juntamente com 20 pmoles de HR61.96 ou por 40 pmoles de HR62S8 32 sòzLnho, 34 pmoles de [gama.....‘.......Pj.....ATP (NEN, 6000 Ci/mrnol) e 30 uiiidades de polinucleotideocinase de 14 (BRL) em 50 jil de tampão cinase, o gual. é 50 mM Tris.....HCl (ph 7,6), 10 rnM MgCl,,,, 5 rnM DTl,

0,1 rnM 50 TA e 0,1 rnM espermidlna (Man ia tis, et al... , ref.. 6, página 102),. A Incubação foi efectuada a 37° C rkirc.l.:· 30 min.. A reacção foi parada pela adição de 4 jil. de 0,5 M EDTA (pH 8,0).. As mistu.

: ; de reacçao forarn usadas sem purificação no despiste da biblioteca genòmi.ca (Exemplo 3,.4) ou como sondas de hibridação em tr ans f er Anciãs Southern (Exernplo 3..6),.

! ocmo! o......3-..4.1.. fíesj::iiste......da......biblisfegliâ.......9.5......./...........niger......M400

Parte da biblioteca genõmi.ca de Aspergillusniger estirpe M400 descrito atrás (Exemplo 2) foi d 11 ui. d o ern SM e fruccoes de 0, 1 ml cada uma contendo cerca de 2000pfu forarn semeadas. Prepararam.....se células hospedeiras por inoculação de 50 rn I dr · rne io LB suplementado corn 0, 2% de rnalbose corn 0, 5 ml de uma cultura crescida durante a noite de E„coll MM539 em meio LB, . ι gitação durante 4 horas a 250 rpm num agitador orbital iiaiienkamp a 37° C, seguido da adição de 0, 5 ml de MgSO^ 1M e 0, 5 rn.l. de 0, 5 M CaCl_n. Amostras de 0, 2 ml destas células foram misturadas com 0,1 ml. da suspensão de fagos e estas misturas forarn incubadas à temperatura ambiente durante meia hora.

Em seguida adicionou.....se 3 ml de 0, 7% agarose em meio LB a 47°C, agitou.....se brevemente com vortex e semeou-se imediatamente em placas de agar l li. As placas foram incubadas durante a noite a

37° C e arrefecidas durante 2 h a 4°C..

A partir de cada placa foram feitas duas réplicas de acordo com o método de hibridação de placas de Ben bon e Davis (ref,?).. 0 primeiro filtro (Schleicher e Schuell BA85) foi colocado rio topo da placa durante 1 min, a segunda réplica durante 2 min e a posição das réplicas foi marcada usando tinta da china.. Após remoção dos filtros eles foram colocados numa p-1 ao contendo 100 ml de uma solução desnaturante (1 fl NaCl, 0,5 0,5 fl NaOH)durante 0,5 m i.n e depois durante 1 min em 100 ml de solução neutralizar)te (0,5 fl Íris.....HCI pl-l 7,5, 1,5 M NaCl).. Os filtros foram transferidos para uma placa contendo 3xSSC, suave.....

mente esfregados com uma mão enluvada para remover os detritos bacterianos e lavados com 3xSSC„ Os fi.ltros foram secos durante '1.0 min ã temperatura ambiente e incubados em papel Whatman Sflfl numa estufa a 80°C durante 2 b..

Os filtros cozidos foram molhados em 3xSSC, lavado© , of, solução durante 1 h a temperatura ambiente e depois trans fer idos para uma ft.rc contendo 250 ml. de mistura de pré.....híbrida.....

cão préviamente aquecida (65°C) que consiste em 2xSSC se for usada a mistura de oligonucleotideos HRB195 e HR61.9B e IxSSC se a mistura de oligonucleotideos usada for HR6298, ainda lOx Denhardt (0, 2% BSA, Β o eh ringer fracção V; 0,2% Ficoll 400, Pharmacia;

0,2 % polivinllpirrolidana.....10, Sigma), 0,1% SDS e 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmão partido e desnaturado.. A pré.....hibridação foi.

pfectuuda durante 5 horas a 85° C num banho mar ia com agitação., Em seguida os fi.ltros foram lavados uma vez durante meia hora em 250 ml de mistura de hibridação pré.....aquecida (65°C), a qual, é iden bi.....

ca ã mistura de pré.....hibridação, excepto no que respeita â omissão

de DNA de esperma de salmão,. Em seguida os filtros foram colot ·;.....

dos numa placa diferente oontendo 150 ml de mistura de hibridação p r e.....a q t i e o 1 d a (65° C) a q u e t i n h a s i d o a d i c i. o n a d o r e c e n t e m e n t e a s n i i s' · u. r a s d e o 1 i. g o n u c 1 e o t1 d e o s c o m b i n a d as e m a r e a d a s N E 61.95 e i 1Ε8Ί 98 (Exemplo 3.. 1) ou a mistura marcada l-lR6298..

No caso de se usar HR6195 e HR6198, a placa é colocada c banho mari.a com agitação a 85°C, o termostato e ajustado a

17°!: e a hibridação é deixada a decorrer durante 14 h„ Ds filtros for am lavados uma vez em 250 ml de mi.stura de hibridação pre.....

aquecida (47°C)durante mela hora a 47°C, seguido de lavagem ã tempei-atura ambiente em duas mudas de 250 ml de 2x33D, c s:la uma durante 45 min., Fez.....se uma lavagem restri.ctiva por transferênciu dos ί Litros para uma placa contendo 250 ml de 6xS3C préaquecido (63°D) contendo 0,05% de pi.rofosfato de sódio e em seguida incubação durante 30 min num banho ma ri. a oom agitação a 63° D.. Em :-egu i..da os filtros foram lavados à temperatura ambiente em duas mudas de 2xS3C durante 30 min cada... Os filtros foram secos ao ar, fixado:, num suporte de papel Whatman 3MM, coberto com peli.cula de chiste v e exposto a filme Kodak XAR5 durante três dias a 603, e-,,;ndo um êoran i.ntensi. fica dor..

Deste modo, obtiveram.....se 6 sinais positivos a partir de .•i·; placas despistadas.. As placas positivas í:-...i; retiradas cem uma p 1 j:i e t a de Ρ α s t e u r e s t ér i. 1 através d e u m ρ o s 1 e i o n a m e n f' cuidadoso das placas ' 1 ιί ta.. Ds pedaços de as marcas de : ccm η o a u t o r r a d i. o g r ama u s a n d o agar contendo as placas positiva adie tonados a 1 ml de SM e adicionado 2,5 pl de clorofórmio.

Deixou.....se os fagos difundirem do agar à temperatura ambiente durante I. h com agitação ocasional com vortex e em seguido incubados durante a noi.be a 4°C.. D agar e os detritos das células baober foram removidos per centrifugação durante 5 min.

adicionou .·,;;· 2, 5 j.i 1 de clorofórmio e os stock guardados a 4^oC..

tíe fagos foram

Os clones positivos foram designados lambiJaC a lambdab e lambdal. Uma vez que os fagos foram semeados numa densidade elevada , as placas positivas foram purificadas duas vezes p.; sementeira a uma densidade baixa e repetindo todo o processo de transferêncLa de réplicas, hibridação e repicagem das d u posi t ivas..

Mo caso de a mistura de oligonucleotideos HR6298 ;

r..i. a placa é colocada no banho ma ria com agi tacão a 65° C, o termostato é ajustado a b2°C e a hibridação é deixada decorre:· durante 14 horas.. Em seguida os filtros foram lavadas uma vez em

2b0 rn! de mistura de hibridação pré.....aquecida (52°C) durante meia hera a 52° 0 seguido de lavagem â temperatura ambiente em duas rnudas de 250 ml de 2xSSC cada uma durante 45 min.. Subsequentemen.....

fe a Lavagem res br i.e tiva foi. efectuada por transferência ec filtros para uma placa contende:! 250 ml de IxSSO, 0,052 (p/v) pirt)fosfato de sódio pré.....aquecido (64°C) e em seguida incubando.....

os durante 0,5 h num banho mar ia com agitação a 64°C.. Em seguida os í i i !.; ί!,··. foram lavados a temperatura ambien te em duas mudas de '.'···;· 41/ durante 30 min cada.. Os filtros foram secos ao ar, fixados num suporte de papel. Whatman 3MM, coberto com película de pl.asti......

c:n e exposto a filme Kodak XAR5 durante três dias a .....601C, usando ι m .: a n s n L. e n s i f 1.. c a d o r..

Deste modo, foram obtidos nove sinais positivos a pa:.....tl:-· de sets placas despistadas. As placas positivas foram retiradas com uma pipeta de Pasteur estéril colocando cuidadosa.....

mente as placas no autorradiograma usando as marcas de tinta ria china. Os pedaços de agar contendo as placas positivos foram ad ic ionados a 1. ml de SM e adicionado 2,5,::0 de rd..orof ormio..

Gs fogos foram deixados a difundir do agar à temperatura ambiente h com agitação ocasional e depois incubado durante a noite a

4°ff G agar e os detritos das células bacterianas foram removidos por centrifugação durante 5 min, adicionou.....se 2,5 jil. de e1orofórmio e os stocks de fagos foram guardados a 4°C„

Os clones positivos foram designadas i piscas positivas foram ainda purificadas por densidade baixa usando o fragmento Bamlll/Et:::oRI p'?)l.BOB (ver Exemplo 3.. 3) como sonda heteróloga que é efectuada a 60°0, enquanto que a lavagem 2xDSC, também a 80“ C„

PG 1.....lambda 1.....3..

sem en t e i; a n u m a de 1, 2 Epb do p a r a h 1 h r i d a o ao e efectuada em

Permeie......íl..PIpoOimento......de......DMA......do......lambda

Para isolar DNA a partir de clones recombinantes, os fagos foram primeiro amplificados.. Com esta final, i.dade células hospedeiras E. collLE332 foram cultivadas até uma densidade óptica (800 ntn) de .1,0 em meio LBsuplementado com 10 mM MgSO^ e 0,2 % de mal.tose. Em seguida 50 jil dos stocks dos fagos purifica dos foram semeados separadamente como descrito no Exemplo 2.. h„ A ia os uma incubação durante a noite a a 37° C os fagos foram eluidos das placas não confluentes espalhando 5 ml. cie SM sobre as placas e incubando durante duas horas com agitação suave,. Ds fagos el.ui.dos foram colhidos e adicionado 0, 1 ml. de clornf ormio..

A mistura foi agitada rapidamente e os detritos celulares removi.....

dos por centrif ugação.. Ds sobren a dantes foram recuperados, adicionou.....se clorofórmio até 0, 3% e o 1isado das placas resultan.....

tes guardados a 4“C..

partida E.S ··. ι d; r;

Para se obter placas quase para o isolamento de DMA das placas c tá ní ! u o i í!. e s c ο ι;: a 111 a t e r i a 1 E e fágicc, ptárçóes de IOj.j.1 tios hospedeir as foram semeados com células ; :oll LE392.. Apôs incubação durante a noi te a 37° C a camada de tupn de agarose foi raspada de três placas quase confluentes.

Latas ramadas foram combinadas, adicionou.....se 20 ml de SM e 0, 4 mL de clorofórmio e a mistura resultante foi agitada a 37°C durante 30 min.. Us detritos celulares e agarose foram removidos por centrifugação, o sobrenadante foi recuperado e o seu volume ajustado a 18· ml com SM,. Adicionou.....se um volume igual do 2M Nu Cl, '^JU7, de PS....G 6000 (CDU, Poole, GB) em SM e as soiuçoes foram misturadas e colocadas em gelo.. Após 75 min os fagos foram sedimentados por centrifugação durante 20 min a 12 000 xg a 4°0.

Π sobr enadan te foi. decan tado e o res tan te fluido re tir ado oom com .•••.ί 3 ki.eenex.. 0 sedimento foi. res Suspenso em 3 ml de SM e subsequentemente extraído com 3 ml de clerofôrm Lo.. A fase aquosa Uri. tratada com RNase A (67 j.ig/ml) e DNase ΐ (33 ;.»g/ml) durante 20 min a 37°G„ Em seguida esta mistura foi. extraída pela adiça!::! ····' 2 ml de fenol, vortex, adição de 1 ml de olor of órmio, vortex novamente e separação das duas fases por centrifugação.. A fase aquosa fo.:i extraida mais duas vezes com 3 ml de fenol/cloro fórmi.o (1::1.) e 8 ml. de clorofórmio, respectivamente. Em seguida o DNA foi. precipitado da fase aquosa pela adição sequencl ada de 0,3 ml de tampão acetato de sódio 3 M (pH 5, 2) e 6 ml ile etanol.. EsLa mistura foi. deixada a 4°C durante 16 h e ·:η .2 o DNA 2a recuperado por centrifugação (1.0 min, 1200 xg, 4°C,!.. 0 sedimento

9i dissolvido em 0,4 ml de tampão TE, adicionou.....se RNase A paru

21X) j.j g / m 1 e incubou.....se a 37°C durante 1 h.. U DNA foi. precipitado,, pela adição de 36 jil. de tampão acetato de sódio 3 M (pll 5,2) e 0,8 ml de etanol a 4°C durante 1 h. 0 DNA foi recuperado pnr centrifugação e subsequentemente dissolvido em 100 jrl. de tampão TE.

Exemplei......11...6..::. Análise......Eíí;ír......rgstricã£í......dos......GlSDÊS......de......P.G.I.......e......PGií.......de.......A_:,.„ nlgerM400emlambda

A partir dos lagos positivos contendo sequências do •; e a e P G ί I s e 1 e c o i o n a r a m se 1 a m la d a D e 1 a ι n la d a E p ara p í ; s t e r ι or análise.. Pr imeir o estabeleceu.....se por análise de restrição ·.·' ^ ambos os lagos contem inserções derivadas da mesma região ds • r: mia de A...........> lo; o em seguida construiu.....se um j. r .. de restr i o no e lambílal ..

pg de DMA fâgico foi digerido com 20 unidades de EcoRI ou BamHI ou com a combinação destas enzimas num vol.ume de L00j.il durante 3 h a 37°C no tampão recomendado pelo fornecedo;(Lll } e na pr esença de 0,8 mg/rnl de rNAse A.. Em seguida adici o nou...... α . 10 jil de tampão acetato 3l^vl (pH 5,2) e a mistura í >, 1 er tr a'o ia com 80 pl de clorofórmio. 0 DMA foi precipitado da fase .··;····.· p_:- La adi.cão de 250 jil de etanol e a mistura colocada em ·; ^! durante 1 h„ 0 DMA foi. colhido por centrifugação, dissolvido ern 25 ji.L. de tampão de amostra lx e aquecido a 65°Cdurante 10 min.. As amostras migrar am num gel de agarose a 0, 72 usando 1. j.ig de DMA de lambda (BPI....) digerido com HindiII como marcador de pesos molecu Lares,, 3 gei foi. fotografado num transiluminador de 97 usando filrne polar òi. de 667.. D DMA foi. trans ferido para membrana 1 rrL troce Lu.l.ose Gcli J.eiclier and Gcfiuel L BA85 de acordo com o e, · Gouthern (1975) como descrito por Man .Lat is et......

sP 332.....336 (ref.. 6)., Ern seguida a membrana foi. incubada e fa bridada com as misturas coml.iinadas de oli.gonuc Lentideos muro a.....

·. HP6195 e HR6196 como descrito no Exemplo 3.. 3.

ds compr i.men tos dos fragmentos foram calculados a partir ria fotograf ia e autorradiogramaíS por compar ação çom bundas d·.· mamas conhecidas.. Os 3·.i man fios dos fragmentos mais pequenos f que 5 !..i fi obtidos após digestão do DMA isolado a par t ir' dos lagos

Lambda D e Ί amhdaE corn EcoEI, Ba ml II e a s omb:nas..uo de? stâs enzimas, b , ;:,i:’iía? estão apresentadfos na Tabela i I 5.. Com o de resolução do sistema de electroforese empregue, nao tern s dg rl ficado comparar fragmentos corn um bamanhu mais?;'.. Conforme . I ί a.· lo pela presença de algumas bandas com uma intensidade i b nas digestões com Ei: o RI, as quai.s estas? i.ndi.s sidas na íabeLa I III, EcoRI nao digeriu completarnente o DMA.. Cs fragmentí-.s que e-stao presen tes na dupla digestas? EcoRI/BamHI, mas nas? nas if simples, têm intensidades comparáveis oa .

i-e?,/:’ BamHI na mesma gema de tamanho.. Portantsj eles devem pr solu tos to t.; I mt ή ts ’ sli.gsar i.tios.. Lis f: agmei i!-os hibridaram com as misturas de oli.gsanueleotideos combinadas HECl.bb o bpripr cão, no caso ds l.amhdaE, um fragments? maior do que 10 I; b na digestão com BamHI., um fragmento EcoRI de 7,4 kph o um fragmento maior do que 10 kph na digestão com EcoRI e um fragrn:-?nί de 2, o kpb assim corno um fragmento maior· do que 1.0 kph na biplu digestas? oom BamHI/EcoRI..

Ns? cas<? sle lambda D os fragmen Lias que hi.br..:. dam com as misturas de sfEígsanucleotideos combinadas HRG1.95 e HRG19G são;: um e maior ds? que 10 kpbna digestão com BamHI, um fragmente < '· ‘ kpb e urn fragments? maior ds? çs 10 kpb na sligestao com . H'i ;? um fragento de 1,2 kpb . issi. m coms? um fragmento ma.i.or rio ;'· 10 I plana dupla digestão com BamHI/EcoRI.. Quando í oram ebse;·.....

•-.is: mais ; ; -r · ν,-·, s ?. ;nas sli.gostoes com EcoRI, o i .

maior é encarado como um produto que surge da clivagem pare lab. A 1111: η- i ι lar pão de fragmentes de tamanho igual. obtidos a partir s;ie iumbdaD e LambsIaE com as misturas de oli.gonucleotideos não foi. • b ,-.···'- ·.

Das diferenças entre os fagos lambdaD ; IambdaE enume . concluiu se gusa os fagos lambdaD < IambdaE nas:: ·...-?

I dên tios is.. Ns? en tanto, a Tabela II I apresenta dois fragmenbs?s

'•c'f três fragmentos BamH.Í e pelo menos quatro fragmento

E:amíSI......r.i.f; que têm o mesmo tamanfio em lambdaD e lambdaf.. Ester.

fi-agmentos devem derivar das inserções destes fagos, uma vez que o vo tor não contem si ti os EcoRI ou. BamHI, excepto os si.tí.os BamHI que foram usados para inserir os fragmentos do DNA de ' -fs 'i if¹'.nlger no vector e os sítios EcoRI delimitando est: a : o·. BamHI e portanto delimitando também a inserção(Erschauf ef uj, , ref.. 9).. Assim concluiu·-se que as inserções do fago lambdaD e

!. i íhÍ c f. d derivaram da mesma região do genoma .é A„ n l.ger.. Em combinação com o facto do fragmento BamHI.....EeoRI hibridante t, s tíe do lambdaD ser' mais mais pequeno do que o o n-respon dente derivado de 1 ambdaE, e.. g.. 1, 2 kpb versus 2,8 Igd.ι e assumiu.....

do que as diferenças obser vadas no padrão cie esteei nao são o resultado de um artefacto de clonagem, deduz-se que o sítio EcoRí do fragnicntn BamHI.....EeoRI de 1,2 kpb de larnbdaDnao deriva do DNA e é um dos sítios EroBEÍ que de Ei mi tam a ince oras

de A, nlger	e é um ι
desi.o fago	Em adição
de	lambdaD |
qie íu Lbri.da	com a mis

Λ i. i ída.

Jequenc <

dada b;

so e; a sequência de IambdaE que hibr i.da com a mistura de d.i çcuuoj co Lideos estã situada den tr o de 1,2 kpb do sí tio BamHI ca fr onteira do fragmento hibridante BamHI EeoRI (Fig. l).

Tibelu.......11 ΐ.:: Tamanho aproximado dos fragmentos (em kpb) mais pequenos do que 5 kpb obtidos após a digestão de DNA isolado a partir dos fagos lambdaD e lambdaE com as enzimas de restrição EcoRI, BamHI e a com b:i.nação destas enzimas, respectivamente. (P ,i signi fica que os fragmentos resultam de clivagem parcial..

EcoRI		BamHI		EcoRI +	BamHI
XD	XE	XD	XE	XD	XE
				4.4	4.4
3.8	3.8
	3.5(P)
3.2 (P)					2.8
2.4	2.4	2.4		2.4
		2.2	2.2	2.2	2.2
		1.6	1.6	1.6	1.6
				1.5	1.5
				1.2
	0.98			0.84	0.84
				0.72	0.72
0.68				0.68
		0.62	0.62	0.62	0.62

Para f.onsi:; uir um mapa de restrição par ci a ! do lambdaE, o DNA do fago lambda foi. di.ger ido com EcoRI, Xbal, HindiII e frni;ss as combinações possíveis destas enzimas.. Isto foi realizado em ds s ' passos.. Primeiro 6 jig de DNA fo: am incubados durante 105 riria a 37° C na presença ou na ausência de 200 U do EcoRI, num '(.dome do 200 jií contendo o tampas::) recomendado pelo fornecedor (BRL.) mais RNAse A (2 mg/ml).. Em seguida as misturas de reacçao furam extraídas com 100 jil de f enol/clorof órrni o (1:: 1) e

a.

seguida cam 100 j.il de clorofórmio, 0 DMA foi precipitado a parti; da fane aquosa pela adição de 0, 1 volume de tampão acetato de sódio 3M e 2 volumes de etanol.. Apôs permanência em gelo durante I D min, ca precipitaos foram colhidos por- cerrbrif ugação, Hs •-edi.mentoc roram secos ao ar e dissolvidos em '100 gl de tampão iii. Em seguida estas soluçoes foram usadas em incubações subse.....

. uc, :- na ausência de enzima de restrição (apenas material ã i ç. ·: iii. com EcoRI) ou na presença de HindlII, Xba I ou na cor i.c.....

nação destas enzimas.. As incubações foram efectuadas durante 2 is a 3?^οΠηαηι volume de 20 j.)l, con tendo '10 jil, da solução de DNA adequada, RNase A (2 rng/rn’1), 10 Ll da enzima de restrição adquada i·? a t a m p 3 < ί r e c o m e n d a d o p e 1 o f o r n e c e d o r (B RI,,).. A i η o u b a ç 3 o f o i parada peia adiçao cie 5 ;il de tampão de amstra 5 vezes concentra do e subsequentemente as amostras foram analisadas como descrito i tr ãs..

Mo autnrradiograma foi detectada uma. única banda h Hm toante, que é ma ior do que 10 kpb, nas digestões com H ind i T !, Xb,2' ou comb inações des tas duas enzimas,. Uma banda com ,-p; ou ima damente o mesmo tamanhoestã presente em todas as outras diço.....

ides, se bem que com uma intensidade mais baixa, o que indica que as enz i.mau. nao cortaram totalmente o DNA.. A segunda e mais E ; temente bibridante banda nos produtos de digestão com EcoRT cirn fragmento de 7,4 kpb. Novamente indicando digestão i η i ·πρ b · ta, esta banda está pr esente nos produtos de digestão com EcoRI e uma segunda enzima, se bem que a uma densidade mai.s 'uai . .. Em adiçao, a dupla di gestão EcoRI/Hind ί11 e a tr ipla digestão com EcoRT/HindlTI/Xbal deu um fragmento bibridante ds z.d !ί H, Na dupla digestão com as enzimas EcoRI e XbaI lo i detestado um fragmento bibridante de 4, 1 Kpb, Este fragmento estã também presente na tripla digestão com as enzimas EcoRI, HindlII e Xbaí, mas numa intensidade muito baixa. No últimr» caso, o

sc t:-ógmentii de 4, 1 kpb é encarado como um pr;.:kto de digestão íal-.

Concluiu.....se que o fragmenta EcoRI de 7,4 Kpb que h í brida com as mistur as de oligcnueleotideos combinadds HRCIHb HEGI SB pode ser clivado com uma das enzimas Xba.í, I-lindiIi. ou BamHI o que a localização dos sítios de cli.vagemn destas enzimas dezem ser · oo mostrado na Figura 1.. Esta figura cia apenas um c.i-z cio restrição parcial, e„ g.. c fragmento EcoEI de 7, 4 kpb deve ainda conter mais do que um sítio cie clivagem para qualqui·; uma dos HindIII, Xbal e BamHI, neste caso estã apresentado o sitio mais per to cia sequência especifica que H íhr ida oom as ,· ·iraras de oXigonucleotideos combinadas HRG.ÍHLa e iIRGI.BC’..

Com o fago lambdaD nao foi efeetuacla qualquer digestão corn Xbal ou HindIII, mas assumiu.....se que os sities de restrição

XC.;! , · CindiII estão situados corno no fago lambdaE,.

Dos nove olones positivos, os qual. são portadores cie sequência;... do gene PGI.....lambei a 4, lambdab, lambclaB e Lambda? foram si- ·οι ionados para posterior analise.. Prime iro estabeleceu..... que os f agns contêm Inseri;;cies der I.vadas da mesma região cio genoma de

A,.........niger o em seguida urn mapa cie restrição parcial cie Lambdab í o.i.

i . · i fo como descrito atras para os fagos D e I contendo sequências do gene PGII. 0 DMA foi digerido com enzimas de restrição (par a ao enzimas ver Tabela IV) conforme recomenclado iael.es fornecedores de enzimas.. Cs fragmentos foram separados num gel de agaruse e i: a ns feridos para nitroce.lu.lose como descrito atr ãs,. Em seguida a membrana foi incubada e hl.bri.dada com o fragmento BamHI/EcoRI cie z Eh, prévlamente sujeito a Inick.....tr anslationX, do gene estru tarai codificador de PGII.. Este fragmento deriva do plasmídeo sBHI8ΠΒ que estã descrito no Exemplo 3.8. C fragmento foi. isolado > V

- de um gel de agarose e 50 ng de f ragrnen bofei sujeito a ”n :Lek truns 1 ati,on» como descr i. to por Maniatis et a 1,...

(pp, 109 112:; ref, 6), Antes da adição á mistura de hibridação o DNA «niek.....translated» foi, desnaturado durante 10 min num banho mar i a fervente,, Os filtros de nitrocelulose foram hibridados com ; sonda radi.oactiva come:! descrito no Exemplo 3, 0 excepto a tempera Lura de pré hibridação e Jibridaçâo ser de 50'O.i. Em seguida as membranas foram lavadas em 0x000 e ..Lavadas duas s· · durante 0,5 h em tampão de hibridação. hm seguida os tilti-os foram sequenci.adumente lavados em 4x920 e 2x000 durante 00 min por aij 2 . Estes tampões contêm ambos 0, 1% ODO e

Q, 10 Na ,2,..,0,,_?xl()i Após a última lavagem as membranas foram rapidamente lavadas em 0,1x000 e foram então deixadas secar e ss ibsequen temen te expos tas a fi.lme de raios X,

A sonda, usada representa uma pequena parte da reg i ao do promotor de EOLí (200 ph) e uma parte grande da sequência codi.fj,.....

cadora. Nas condições de hibridação descritas esta sonda dá sinais fortes com todos os fagos isolados atrás (ver Exemplo 3,4) ocurfendo sequências do gene Pfi t.

Os comprimentos dos fragmentos foram calculados a ri rias fotografias e autorradiogramas por comparação n. mi as i. r- :r conheoi.das do rnaroadcsr,. Na Tabela IV estão apresentados os E ogmentos de h.ibri.daçao e seus tamanhos aproximados.

tamanho aproximado doo fragmentos I litaridantes (kpb) ohtidos apôs digestão do DNA isolado a par-tir de PG Ί. lambdai.....7 eom as enzimas de res tri çao Po O Pt, BamH I., Xhol e eomhinaçoes destas enzimas assi.m come por BamHI/Β;_:;ι1Ι I

Fago

' n z i ii: a d e res t r i ç a o	lambda4	1. a m b d a 5 a m b d a 8	lambda?
: d-1	8, 6		8, 6	>23	8, 8
EenPi	8, 4		6, 4	8, 4	8, 4
fyoRI/BamHI	8, 4		6, 4	8, 4	8, 4
XHoi	•>OQ i.J		>23	>23	> '.J3
Xbyi/PyRí	2, 0		2, 0	2, 0	2, 0
BamHi/Rgyi)	7, 5		7,5	>23	7, 5
Da Tabela IV	A f':.	lar o	que todos	os fagos	sa ;n tem	u.íi:
íi agmento EcoRI de G, 4	kpb e	um	fa gmen i o Xh! 11 /EcnP I	de 2, 0	k pb
. n t;(u a n t o u m a d u. ρ '1. a d 1. g estã a	com	BEoHl/BapHI	também	resuIta	nu nu
fragmento 1· 6, 4 kpb..	Os f	agos	lambda.·':, lambda 5 e	lambda?	tern

também fragmentos idênticos quando digeridos com BamHI (8·, 8 kpb) e RamHI/BgJLTI (7,5 kpb).. D vector não contem sítios RaroMI exr:epto para os sitias usados para inserir os fragmentos de DNA de

AsPerg i 'lius (Frischauf et......ai...... ref., 9).. As i.nserenos destes f;Aísuos foram portanto consideradas como sendo derivadas da mesma regias ii- genoma de A...........niger..

Para construir um mapa de restrição parcial o DNA do : -a i amhdao f í i s também d i geri si o com yyy SmalSstI e Saíl e com Bam! Π em combinação com estas enzi.mas.. Ainda, foi analisada uma digestão com BglT/Xhol. Todas estas incubações foram efect.ua das durante 3 h a 37°C, excepto para 3mal (30°G), num volume sv

29si' contendo 1 pg de DNA fágico.. Os fragmentos hibridantes com a sonda Pí s f a C estão apresen tados na ! a Is ela 7,

Ι abe ia7:: H tamanho aproximado dos fragmentos h ibridan tes (kpb) ob tido após digestão do DNA isolado a par tir de

PG I.....iambdab corn as enzimas de restrição Bgil I, /:·I,

SmuI, GstI, Sai I e com combinações de 8am HI com estas enzimas ou com XhgI.. Está também apr esentada uma dupJ a d i g e s t a o Bg 111 /Xhg I..

• cg ί ι η e η I o d u iragmen to E rc i ma de restrição (kpb) i ·rimpr :men to d. rragmen kc E r ι · i m a í i c r e s t r i e a o ‘ 1. p s ' · zH I B g 1 ί I K ρη f EcoBI sai l

G, B

Et. 7 b, I :/t 7

6, 4

4, 7 u, g B, 9

Bamlil/Bgill

Pamlll/Xligl

Bgl.U/Xho[

Ba mlIf/tpn I

BâmHi/Sstí:

Bamur/Egli

A, 5 4, 2 2, 0

4, k Ji .. kl. a 9, 5

A partir dos fragmentos hibr zidantes fez.....se um mapa de ¹ as tr ição ele PG I lamhdab a par tir do qual se pode concluir gue o gene codificador da poligalaoturonase I está situado no fragmente ed'π 11! de B, 9 kpb

emBEiíl 3·· 7 · A construçãode......ia GUI. 8 00......©......pGUl.830

Os fragmentos de restrição EcoRT.....Xbal relevantes dos foíios I.ambdaD e lambdaE foram inseridos nos vectores pEMBL (D en te « Cia tese, ref.. 10), resultando nos plasmídeo© pGW18Q3 e pGVi.1800, res í > e f i v a;íl e n t e.,

Da F ig.. 1 e Exemplo 3.. 5 pode.....se deduzir que o fago

I.ambdaD deve ter um fragmento EooRI.....Xbal de 2,5 kpb que é idêntico a parte do fragmente:! EcoRI.....Xbal de 4, 1 kpb do fago lambdaE.. 8 çi n!e DMA de lambdaD foram digeridos oom 60 U de Xbal durante 2 horas a 37°G num volume de 200 j.il no tampan recomendado pela BRL.

Rtlase A (1, 5 mg/ml).. Em seguida a concentração de NaGX foi ajus tada a 1.40 m!^vl, adicionou -se tampão de rsacçan concen tr as :!o pa; a o ycas o aumento de volume, adicionou.....se 60 LI de ' oLU · a j.ncubaçao continuou durante 2, 5 h num volume ile 230 jil.. Em rbf; a mistura de reacção foi. extrai da com 1.00 ;; I de . t: :1:,. mio e e DMA foi precipitado da fase aquosa peia adição cie 0, L volumes ile· tampão acetato de sódio 3N (pLI 5,2) e 2 volumes bo etanol.. Após incubação a 4°Cduranto 16 h o DMA foi recuperado par i. ·-ntrifugaçao, o sedimento fo:i seco ao ar e depois dissolvido no mesmo tampão., Os fragmentos ile restrição forem separados em · , b ile agarwse de baixo ponto de fusão (BRL) ern tampão 0,5 x TBE contendo brometo de etídio. Os fragmentos de DNA foram vi.su a lixa dos sob luz MV e isolada uma fatia de gel contendo o fragmento I -.21 Xbal de 2,5 kpb..

DNA ilo fago lambdaE foi incubado com enzimas de ; · · ’x içãc Xbal e EcoRI, essenc ial.men te como descrito atrás.. Após ex fracção com clorofórmio, o DNA f oi precipitado, sedimentado í enfrifugação, dissolvido em tampão de amostra e sujeito a •á·· '.el,.; .·..:· num gel de 0,6% de agarose tampão Ix TBE.. Uma fatia

de gel con tendo o fragmento Xba f.....EcoRI de 4, 1 kpb foi. recuperado e guardado a 20° C„ colocou se urna rolha de la de 0.0.80 :.. r.mrs da nu fundo de urn tubo de microcentrifuga de 0, 5 mi contendo p 1 de tampão TE alto (100 rnM Tris.....HC1, pH 8,0, 10 rnM EDTAj. A fatia do gel íoi descongelada, colocada no tubo de centrífuga e o tubo congelado em azoto liquido.. Fez.....se um pequeno 'ira, no fundo do tu!;: de cen trif uga pequeno e colocou se este num tubo de centrífuga de 1,5 rn..!.. e o tampao e DNA da fatia de golfaram colhidos por centrifugação.. 0s restos da fatia de gel foram ressuspensos em 50 pl de tampão TE altu, esta suspensão foi z congelada novaraente em azoto liquido e o bampãofoi colhido por i fugacão,. Em seguida os eluatos foram com! d nados e . 1. : -rd· com 100 pi de clorofórmio. 0 DNA foi precipitado da fase aquosa, • . d i d r'o por cen tr if ugação e d issol v ido em 40 pl de tampão ! í. .. A

•.nes b: ação de DNA foi. calculada por olectroforese em gel d : ra o·.; seguido de visualização da banda corn luz 0, usando 1 pg d.· DNA dia !ambda (BRI.) d i.geri.do com HindííT o.o riodo .·.

Us vectores pEMBLl.8 e pEMBL. 19 foram preparados por digestão sequenc.iada com XbaI e EcoRI, nas condições recomei idadas peli? íornecedor (BRI.... ) . A extracção do DNA corn fenol.., fenol/cloro formio (1:: 1) e ι lorofArm.io e a precipitação do DNA com etanol foram efectuados como descrito por Maniatis (ref., 6), excepto a emissão de ácool li.soamili.oo da solução de clorofórmio e a tempe.....

rotura usada para a precipitação de DNA ser de 4°C„ y Os fragmentos de DNA foram ligados ao vector adequado num volume de reacção de 2b pi, contendo o tampao recomendado pela BRL mais AIR (1 mM), 1,5 11 de DNA.....ligase de 14 (BRL), 100 sg de DMA vector, o qual foi preparado como descr i to atr as, e o íragmento de restrição impor tante.. pllMBl.18 d iger ido com XI a 1 0 EcoR í foi. usado para a construção de pGUl.800 mais uma quantidade equirnn Lu:- do fragmento Xba I.....EcoRI de 4,1 do lambdat.

A mistura de reacção foi incubada durante 16 h a 16°C e então ·..;. reacção foi parada pel.a adi..ção de 125 j.il de água destila.....

da e congelacao., pEMBL.19 digerido com Xbai e EcoRI foi usado par a construir pGWl.803.. Neste caso, fragmento XE. s í.....EcoR.!. de 2,5 Epb contendo cerca de 15 ng de DNA, r cdcllada, após o que os outros roo adicionados.. A reacção de f'0 °C, em seguida adicionou.....se

Ei. A reacção continuou durante : : ; como descrito atrás..

a fatia de agarose que con tem o de D foi. f undido a 60°G e 4 foram adicionados a 11. .i.i I de agua componentes da mistura de reacção ligação decorreu durante Í4 h a mais 1. unidade de DNA.....li.gase de mais '7 h e depois a reacção lo::r

j.il das misturas de reacção de ligação resultantes foram usadas para transformar E„.........coli como descrito no manual de f,. 1.1) re fgn.çao com o células fos um clrinagem/sequenciação didesoxi em M1.3 da BRL (pp.. 30-33;

• pt· L.Ufd ip! 'EeU' o E, coli Jo 109 foram cu 1 '.. i. vadas até uma

7'i,de 0, '7 e 0, 9, respectivamente, antes de colocar os f rasca :, em gelo.. A primeira estirpe foi. transformada usando a mistura de reacção de ligaçao com o fragmento de lambdaD, a últi.ma estirpe foi transformada usando a mistura de reacção de fragmento de IambdaE.. Apôs o choque térmico as incubadas em gelo duran te dois minutos e depois adicionou -so 1. mi de meio LB e as células foram incubadas a 37°G durante 1 h„ As células foram sedimentadas por centrifugação a baixa velocidade, : e c i..r ou se 1. ml de sobrenadante e as células for am suavemente ; essuspeiisas.. Em seguida as células foram semeadas em piaras de agar U'' contendo 1.00 j.í/ml de a mpi.ci.il. na e nas quais foi. c-sp.; 9 .·. r i . uma solução de 1PTG/X.....gal ( 200j.il 9,..,9, 30 jd de dimeti.lformam ida

4..

contendo 2% de X-gal. e 20 jil de uma solução de IPiG a 24 mg/ml em .: raj. As placas foram incubada© durante a noite 37 ^OG.,

Várias colónias brancas isoladas foram usadas μ·-:-.· culturas crescidas durante a noite em meio Ul

cupleniBi i Lado c<xin 0, 1% do glucose e 75 jig/rnl de ampicilina. Estas culturas foram usadas para isolar plasmideos., uasndo o método de mini p: do Holmes e Quigley ( ref.. 12 ).. Us plasmi.deí is foram rií qe;-idos; com várias enzimas de restrição, do acordo eom ; r eeomendaooes do fornecedor (BRL) e na presença de RNase A (0,5 mg/ml) o os produtos foram analisados num geJ. de ό 9.

plasml0 1·.; e. que deram ori gem a fragmentos Xbal.....EcoRI, BamHI.....Π d R

Hindi I f do tamanho esperado foram seleccionados e as céiul as .' 1. ecsii portadoras deles foram man tidas em q i i cor ο I a .....20 °íl.

Construíram se dois novos plasmideos.. pGWISOO é o

1; agmento XbaI EcoRI de 4, 1. kpb do fago lumbduE inserido no .Ί pEMBI 18.. pGN1803 é o fragmento Xbal EcoRI e· 2,5 kpb

-io la mt ida D inserido no vector pEMBLIS..

do

9ÍE..Í.1 i õ.. O á

Análise......de......pGNlSOO e......pG 14180 3

A relação entre pGWl.800 e pG!41803 foi. confirmada por de i çao.. A sequência especifica que fii.bri.da · .em ;

• 5 _;: o nu c 1. e o t i d e os <1 o m b i n a d os EIR G19 5 e H R β 1.9 G d e s 11. n a.....se a uma região especifica de pGW.1803. A ausência de artefactos de clona.....

gem, ta i.e como deiecçÕes ou ligação de fragmentos de DNA deriva dos de A..........niger, foi. estabelecida por comparação dos fragmentos de restrição obtidos a par tir de DNA do plasmí deo pGWl.800 e de A niger, r s g· e o t I v a m e n t o..

pGWl.800 e pGW1803 foram propagados em Γ,< ..g l i estir pe JM1..09 e DHSísF’ respectivamente e o DNA de plasmídeo foi. recupera do a gar ti r de 250 rn .L de cultur as crescidas durante a noite em air in suplementado corn 0,1% de glucose e 100 j.ig/ml de ampicil.i na t or.o descrito por Nau latis et_ al...,. (pp 90 91:; ref.. 6) e finai mente r essupenso em tampão TE. Lima vez que pGW'1800 foi também usado para transformar A......................niger, ele -f^:oi. purificado por

sei:í imen t ação em gradiente de el orei o de césio.. A 2, 5 rnl.. de snluçãn de DNA em TE adicionou.....se 3,3 g de OsCX e 1 ml de brometo de etidio (10 mg/ml em ãgua).. A centrifugação decorreu num rotor p

Beckman V Ei tíh» 2 a 20° G durante 16 ha 4b 000 rpm.. Das duas bandas fluorescentes visíveis sob luz UV, a banda inferior (-ontendoDNA de plasmídeo circular covalentemente fechado foi. recuperado picando o tubo lateralmente,. A solução de DNA (ap< οχ.. 1. ml) foi extraída 6 vezes com butanoi saturado com ãgua irara remover o brometo de etidio.. Em seguiria o volume foi. ajusta.....

do _;.,. ;a 1.5 ml com ãgua e o DNA precipitado pela adição de GO mi de etanol. 0 DNA foi colhido por centrifugação e em seguiria o iGm; UÍ..O íGsi, lavado uma vez com etanol α 75% e subsequentemente rle foi dissolvido em tampão TE e guardado a .....20° C.. pGWX803 nao foi. isolado a partir de um gradiente de cloreto de césio, mas foi. su jeito a um processo mais rápido.. Adicionou-se RNAse A a 4 ml de solução de DNApara uma concentração de 1.00 jig/ml e esta mistura foi. incubada a 37°C durante 1 h e subspquentemente extraído com u η; v o 1 u rn e i g u a I. d e f e η o 1 / c 1. o r o f õ r m i o ( 1:: 1) e c 1 o r o f o r m i oE m seguida o DNA foi. precipitado a partir da fase aquosa pela adição de 0,4 ml de tampao acetato de sódio 3N pH 5,2 e G ml de etanol. 0 DNA foi colhido por centrifugação, o sedimentei resultante foi Lavado com etanol a 75% e seco ao ar e subsequentemente dissolvi do í sí; tampao ! E,

G DNA de A...........niger foi. isolado segundo urn processo

I i.geir amen te modificado usado para isolar RNA de planta© (Slater, ref.. 21.).. D micélio foi. lavado com soro fisiológico, congelado em azoto líquido e 2, 5 g foi rebentado usando um microdesmembrador (! ír .iun).. U po de micélio foi extraidn s nm tampao de extr acção pi oparado de rresco.. 0 tampão de extracção foi preparado - οχ ar o e g u e 5 m 1 d e ã c i d o t r i.....i s o p r o p i 1 n a f t a 1 e η o.....s u 1 f ó n i o o

(. TNS, 20 mg/rnl.) foi misturado com 5 ml de ácido p.....arnino.....sal i ci. li r o (PAG) (120 mg/rnl) e 2,5 ml de tampão SxRNB tSxRNB c on ’···.·

212,1 g de Tris, 73, 04g de Ma Cl e 99,1 g de EGTA em 1 1, pH 8,9).. Apti - a adição de 7, 5 rnl. de renei. o tampão de extracção foi. equi Librado durante 1.0 min a 55°C.. 0 tampão aquecido foi en tão adir:

nriado ao pó de inicélio e a suspensão misturada durante 2 min. Em seguida adicionou --se 5 ml. de clorofórmio e misturou.....ac óoroL;· 2 min,. As fases foram separadas por centrifugação (1.0 min, LO 000 ; :g) e a fase aquosa foi extraída mais uma vez i Oto 1.0 ml de ! o η i j L / í: 1. o r o f õ r m i o (1:: 1) e de ρ o i s d uas v e z e s c ο ι n c 1 or o f o r rn i. o..

A fase aquosa contem RNA e DMA.. 0 DNA foi g-el-i 3. 2 curn 2 vai., de etanol ã temperatura ambiente e colhido por centri fugaçãn (10 min, 10 000 xg), lavado duas vezes por redissoluçao em agua destilada estéril e sua precipitação novamente c..:, :-1,ob Π RNA foi removido pela adição de RNase A (20 jig/rnl) ã

-. ‘ . 1 . final,.

Ε..;π construir mapas fisicos de pGW'1800 e pfii!1803,

;. ί : - ·. p a r a t- α m se vá r i a s rn i s fc uras d e r e a c ç ã o c α n fc e n d o a p r o x i m a d a rn e n t e 1 j.jg do DMA de plasmideo, RNase A numa cnncerrtração de 1 mg/ml (apenas no caso cie pGW1803), o tampaolmportan te conforme recomeu dado BRLe 10 un i.dados de uma enzima de restrição, sendo escolhidas diferentes enzimas para diferentes misturas de re 3o. Em vários casos foram escolhidas duas enzimas diferentes ou is DMA de plasmideo foi cor Lado com uma certa enzima ou ot.if ,-'-:. do enzimas, segui, d o de precipitação do DMA na presença de .-3..,2- de sódio e etanol e subsequente colheita do DMA po;

ca-nL-ri fuga ção, o material, fo.i então usado como substrato para urna segunda ou terceira enzima de restrição.. As misturas de reaccão foram in ou Lia das a 37^3 durante 1. h, depois a reacçao foi parada pela adição de tampão de amostra 5 vezes concentrado e em seguida •o. p: d'1.os de reacção foram analisados num gel. de '12 de agarose em tampão 'IDE,. A partir do tamanho calculado dos fragmentos especifácos foi deduzida a posição dos sítios das enzimas de ; ·· :·.: 2,:-2: indviduaisrelativamente a ura ponto de referencia, o ·?!.·! ,2- arbitrariamente escolhido no único sitio Xbal. Na í i gur a

--.-2. a presen i.-ado o mapa de restrição de pGWlBOíl. (.1 mapa de eestricao do DNA derivado de A..........niger de pGW1803 (nao apresen.....

Lado) ê

Lado) o idêntico ao mapa de pGWl.800 desde o sitio Xbal na pos.i.....

ção .1 até ao sítio Hindi na posição 2000.. No entanto., pGNI.803 nau contem um sítio BglTI, o gual estã presente na posição 2100 en;

p G W '1.800.. 0 f; - a g m s n t, o H i n c 11.....B g 11 ΐ d e 0,4 K ρ b d ο ρ G W1800 a p r e s e ι ·,

L ou a m e ·. rn a m o b ί. 1 i d a d e ele c t r o f o r é t i. a a d o f r a s m e n t ο I-! i ι ί ο I £.....E c o 2 £ ;:!e p6W1808 que esta situado no fim do DNA da inserção der ivada de

Λ., n ryer.. Concluiu.....se que o DNA derivado de A..........niger do pGWl.803 é idêntico ao DNA derivado de de A...........niger de pG 1418 00 entre o sítio

Xbal na posição 1 o uma localização muito perto do sitio BglII na posição 2400 mas nao o incluindo. Assim, o tamanho deduzido do fragmento EcoRI.....Xbal do fago lambdaD,

2,5 kpb (Exemplo 3..6), apresenta uma ligeira sobres ti maçã o..

Para localizar a sequên eia especí fica que hi.br ida com as misturas de oligonueleotideos combinadas HRB1.95 e HR6196, o DNA _f r pdV· | 308 foi cortado eos fragmentos resultantes separados ;-r nr;: ; iiesí:! ita atras.. Em seguida o DNA foi. transferido para um··, membrana de nitrocelulose e deixado hibridar com as misturas de ο I. i.gonuí E-otol-os combinadas e man ;adas HR61.95 ο i 1R61.96, -o;:·. ..••o!! descri to atras.. Os fragmentos que hibri.daram com as mis tu; as fie oligonueleotideos combinadas HRB1.95 e HR61.96 são um fragmento

Hino 21. de 0,54 Kpb na digestão com HinoII e um fragmente Ncol.....

,-y pç j,p|,. _{nd c}|_Up| _α digestão NcoI/EcoRI. Concluiu se que a sec;uência especifica que hi.brida com as misturas cie oligonucleo '.eco combinadas HR6195 e HR61.96 esta situada entre o si.tio 2 rí na posição 1750 e o sitio Hi.m ££ na posição 2 000 do -c·.,-a d·restrição de pG 141803, cujas coordenadas correspondem â mesma sequência no mapa de restri.çaode pGNl.800..

ί oo

Α ausência de artefactos de clonagem foi estabelecida por comparação dos fragmenteis de restrição de pGWl.800 com frug.....

mentos de restrição obtidos a partir de DNA de A„.........nl.ger N400.. As digestões de pGWISOO foram preparadas como descrito atrãs.. As digestões do DNA cromossómico da estirpe N400 foram fel.tas a 37°8 num volume de reacção de 200 jid consistindo em 2 rg de DNA, 0, 5 mg/ml cie RNase A, um tampao de reacção fornecido pela BRL (REact Ξο f íer 2 par a Xhol, Xbal, EcoRV e BglII, REacb Buffer 4 par a Kpnl e REacb Buffer 3 para EeoRI e Sall) e 80 unidades de cada uma das enzimas de restrição usadas.. A mistura de reacção foi incubada durante 2 h e depois extraida com 100 j.i 1 de elorof órmio., Subsequen temen t o DNA foi precipitado da fase aquosa pela adição de 20j.iL de um tampao acetato de sõdio 3M pH5, 2 e 0,5 ml de etanol segui do de in cu fiação em gelo durante 45 min.. Em segui da o DNA foi. off r· por centrifugação e seco ao ar.. 0 DNA í'c.i dissolvido em tampa:,i de amostra e estas amostras e os produtos de digestão do pGWlSOO e os marcadores de tamanhos de lambda foram aplicados num >.iel de 0, 7% de agarose em tampao TBE.. Após electroforese o padrão ; osu itante foi documentado e o DNA nas faixas com digestões de

DNA cromossómi.co de A,.........n l.ger foi transferido para uma membrana de ; ,i.t; ocelulose como descrito an terior men te.. As membranas foram iricuhddas e cortadas em duas partes que foram hi bridadas cm ••ri d a s dl., f e r e n t o s..

As sondas usadas na hibridação foram os fragmentos EcoRL Bgl.II de 1,45 kpb e 2,05 kpb de pGWl.800 submetidos a «nicktr aolation». 0s fragmentos foram previamente isolados a ,.· .· ti: de fatias de um gel. de agarose com:::: descri to atrãs e 100 nq tios fragmentos foram sujeitos a «nick.....translati.on» em reacções sep.fr.;c.;s como descrito por Maniatis et......ah. (pp 109.....112; r ef.. 6),

Antes da adição ã mistura de hibridação o DNA «nick-translafed» f i desnaturado durante 10 min num banho maria fervente,.

i 1-- filtros de ni.f rocelulose incubado© foram molhado© · ·;;;

3x030 o Lm,· então transferidos para placas separadas r:.:/,’/2

100 ml de tampão de hibridaçâo pré.....aquecido (88°0) o qual eonsis ta em 8xSSC, 10 mM EDTA, 0, 1 mM EDTA, 0, 1 mg/ml de DSNA de esperma de sal mão partido e desnaturado, 0,1% de Να , Ρ,.,Ο,,,χίΟ! 1,0., -1· 2 /

0,05% SDO e 5x Denhurdid' s (0,1.5 BSA, Boehringer fracção V, 0,1% de F icoll. 400, Pharmacia0, 1% polivinilpirrolidona.....1.0, Sigma J.. A mistura de pré hl.hr 1dação esteve durante 2 h a 60 C num 2a π 2© mar ia c rim agi.fação e depois o tampão de hibridaçâo foi substitu i.

do por í... uni. i.ld. ι 2 erro (75 ml) ao qual foi subsequenf emente adieis.....

anda uma ©onda submeti.da a «ni.ck.....translationX.. A hibri.dação decorreu a 88° C durante pelo menos 16 h.. Em seguida as membranas 2-i ar lavarias a 88°C, usando uma séri.e de tampões pré aquecidos que continham todos Q, 1%SDS e 0,1% Na ^P_o0^x'10H_nD, mas c om Lima.

qusn tidade decrescente de SSC„ Pri.meir o, as mpnibrarias foram

Lrodjs ern 4x000 e depois foram lavadas em 4:-:21-0 duas vezes duran te 1.0 min.. Em seguida os -filtros foram lavados sequenciado-monte oom 4xSSC, 2xSSC, 0, 5: :000, 0, 2:-,000 e 0, l.xSSO durante 00 min •o tampão.. Apõs a ultima lavagem as membranas foram rapidamente lavadas em 0, 0x000 e depois for am deixarias secar e subsequen to mente expertas a filme ile raios X.

A membrana despistada com o fragmento EcoRV--Bg.il 1 de

1,45 kpb con tem os seguintes fragmentos de hibridaçâo:: um frag.....

mento do 2, 4 kpb na digestão corn Xhol, um f ragrnen to de 2, 8 kpb e um fragmento com 1, 2 kpb na digestão com Kpnle um fragmento do 1,0 kpb na dupla digestão com BglII/EcoRV. A membrana despistada com c fragmento EcoRV.....BglEI de 2,05 kpb contem os seguintes o agmen fos:: um fragmento grande de aproximarlamen te 1.1 kpb na dupla digestão EcoRI/Sall, fragmentas de 2, 3 kpb e 2,1 kpb na 1,-..-..2 com Xhol, fragmentos de 2,3 kpb e 1,4 kpb na dup.2.. digestão Xhol/Xbal, fragmentos de 1,2 kpb na digestão com Kpnl o um fragmento de 2,0 kpb na dupla digestão com EcoRI/BglII,

Para quatro dos fragmentos hibridarrbes apenas pode ser deduzido a existência e um tamanho mínimo a partir do mapa de restrição de pGW'1800, i. e„ fragmentos que têm homologia com uma r 1 usada mas tendo um extremo fora da sequência que está prespnte em pGWISOO. Estes fragmentos sao, no caso da sonda ií, oRV BgLII de 2,05 kph, o fragmento na digestão EcoRI/GalI, o fragmento de 2,1. kpb na digestão com Xhol e o fragmento com ' kph na digestão com KpnT. e no caso da sonda EcoRT - BglII de

1,45 kpb, o fragmento de 2, Θ kpb na digestão com KpnT.. Estes ί t .o:; são bodos deduzido do mapa de f: a g m e n t o s h i b r i d a n t e s maiores do que o tamanh restrição de pGWISOO..

mínimo que

Us d1.f er en tes do DNA genómica de A...........n iger podem ser i orrpl-acionados oom fragmentos presentes nas digestões de pGWl.800 e todos têm um tamanho calculado que está muito próximo do taman! io deduzido a partir do mapa de restrição de pGWÍGOO..

Roncluiu se que o DNA derivado de A,.........niger do pfiVlSSOOê uma rqorpspntação fiel de parte do genorna de A,.........niger.

! ' OiHÇ o .......E, g :: A......construção......de......pGtit9QD......E......dii......PGM1902......E......SEâ............anais içao fragmento de restrição B.amiiI ele E·, 6 kpb do fago EGl lambda? que hi.hr ida com sequências codificadoras de PGII (ver I abeia IV, Exemplo G, G) foi, inserido no vector pí IGG (Viei.ra, ,1. Messing, J.. , 1982, Gene 19, 259.....288) resultando nos plasmídeos ί Ε; 1900 (ver Figura 3)e pGWl.901 que tem a. inserção na orientação

A L, 5 j.ig de DNA de PGI lambda? em 5 ).sl cie tampão TE, adicionou se 1 j:Ί de espermidina de uma solução stock 10 md, 20 U

d. Et; ml I!.

tampão de reacção recomendado pela 13Rl....

e agua amos tras destilada estéri.,1 fiara um volume final de 30 jcE, A;

digeridas adicionou se um quarto de tampão de aplicação (v/v) (tampão de aplicação = 0,25% de azul de bromofenol; 0,25% xilenod,.· _e i:. ;. ι | 400 Η,.,0) Os fragmentos da reacção for em

1.03 •sopas' 'ados num gel de 0, 8% de agarose em tampão IxTAE con tendo b: orne to de etl.dic (1. jig/ml) (tampão 50x1 AE = 242 g Tris, 57,1 ml ·' ·'!/ u ético e 100 rnl de 0, 5M EDTA pH 3,0).,

Os fragmentos do DMA foram visualizados sob luz UV e i se L;da uma fatia de ge l contende o fragmento Bamfil de 8,8 !:pb..

Os fragmentos de DMA foram isolados electroforeticamente de soe: oom métodos convencionais .. A eluição foi -ó;· tuada a fOU V durante 1 fi.. 0 DMA foi colhido e precipitado com 2 · .1 de • ·' r ι :i 1... Λ ρ 6 s c e n b r i f u g a ç ã tá n u m a c e n t r i f u g a Ε ρ p e n tT cri d u r a n t e 30 min o precipitado foi colhido, numa ãs, :Oo. e dissolvido

-m 1.0 pl de tampão TE.. 0 vector pUOO (1. jig) foi. linear izado usando 1.0 li de Bom! Eí a 37° C durante 1,5 h usando o tampão recomendado pela BR!.... num volume total de recçãn de 20 ,iEL.

' ' q u e n t e m e n t e a d i e i ο η o u se 1. j.i 1. d e s tá 1. u ç ã o CI E Ç λ p r tá x.. 2! J ) e a ;f . ; f incubada durante 30 min a 37°C„ 0 vector linearizado foi. também preparado por electroforese. Ele foi dissolvido em 20 i; !. de TE que corresponde a uma concentração do DMA v a ·ρ; - o x I. m a ti a m ente 50 n g / jj. I...

Na reacção de ligação um jil do vector pLICS (50 ng) 1 fnearlzado e tratado com CIP e 4 j.i.1 cio fragmento B.amHI (apr tixi.

madamenbe 100 ng) foram ligados com 1,2 fi de DMA ligase de T4 nc tampão ligase adequado. 0 volume final da reacção foi de 10 ml. ri.···:·· decorrer a reacção durante 1.4 h a 1.4° C e em seguida a r'·.: foi diluida com TE para 50 ;.T1...

1. i gcf'. tá r es:1'.an t. -· · escrito no manual de ( pp. 30 33 ζ rei.. I.i.) D3de 0, 5 a 0, 7 o choque térmico as minutos e em seguida

j.TT das misturas de reacção de soí usados para transformar E,........coli como d clcngom/sequenciação didesoxi. em Ml.3 da BR!....

·;.έ, E_;................eoliDH5aE'‘ ter cr esci doa té uma ο;·,Εο·. de colocar os frascos em gele,, Apos células foram incubadas em gelo durante dois

104 adi eir-ifiíju.....se 1 ml. cie meio L.B o as células foram inc abadas a duran te 1, h.. As células foram sedimentadas por oentrifugaoáo a t t veionida.de, retirou.....se 1 ml do sobrenadante e as células 'oram suavemente ressuspensas.. Em seguida as células foram

a.'meadas em placas de agar EB contendo 100 çg/ml 1. ampicilina e . quais foi espalfiada uma solução de IPTG/X gal { 200 μΐ U,_;3, ;;1 de dimetilformamida contendo 2% X gal e 20 j.il de uma solução de IPTG a 24 mg/ml em água).. As placas foram incubadas dor ante u no.i,te a 37°ff, Usaram.....se várias colónias brancas isola rias para p;a'par ar culturas que crescer am dur ante a noite em m·. i; '' suplementado com 0,1% de glucose e 75 j.fl/mlde ampicilina. Est is culturas foram usadas para. isolar plasrnideos, usando o método miniprepe de Nol.mes e Ouigley (ref.. 12).. Ds plasrnideos foram digeridos com varias enzimas de restrição, de . ; rd com rrlc 1 ; do urres, dc (BRi,) e na presença de ilílase A (0,5 c/r) e os produtos foram analisados num gel. de agarose.. íls f .fi< · que deram origem a fragmentos BamHT do tamanho espera do foram seleccionados e as células de E, cgli portadoras l-is foram mantidas em glicerol a 20°C.. Os novos plasrnideos pGU'1900 íauostr río na Figura 3) e pGUl.901. portadores da inserção na direc -a. ..f: foram usados para outras experiências..

pGWlUOO foi propagado em E„.........çcli estirpe DH5aE'' e cj DMA de Plasmadeo fui recuperado a partir de 250 ml. de culturas cultivadas durante a .-:,:7¹ em meio LB suplementado com 0,1% de ; 7..:-.·.- e 1.00 j.;g/ml do ampicilina como descrito por Maniatis Et aE. (pp 90-91.; ref. 8)e finalmente ressuspenso ern tampão TE.. Urna vez gue pGUl.UOÔ foi também usado para transformar A.. n..Eger, ele foi também purificado por sedimentação em gradiente dc

ο ίο;'·'.,· ,·-·	césio.. A 2, 5	ml.	de uma solução de DNA ens	TE,
. d 5 ; ; ··;:.?.....St	2.2 o de f.'sí'EI	e L	ml de b; eme to de ofídio (l.O	mg/iii 1
--'ra água).. A	o' - br 1, fugação	f t .»· i.	p efectuada num rotor Beckman	71 i

95,2 o 20'·-C durante 16 hor as a 45 000 rpm.. Das duas bandas í luo

:·-Rscetites visíveis sob luz UV» a banda inferior contendo DNA de ϊ - .1 a s i ι i i r.h.7? o o i r c u 1 a r c o v a 1 o n t e m e ιί b e f e o h a d o f o i r e c u ρ o r a d o p i c a n d o Ί utcralmvnte o tubo. A solução de DNA (cerca de 1 rnl) foi extraido 5 vezes com butanol saturado com água para remover o de elidi, o.. Em seguida o volume foi ajustado a ?! h ml com agua e o DNA foi. precipitado pela adição de 30 ml. de et ano!..., H

DNA ί o1 colhido e em seguida o sedimento lavado uma vez com ehanúl a 75%e subsequentemente foi. dissolvido em tampão TE e guardado a 20° 0..

Em adição, a partir do produto de digestão de pGHl.900 d i ;··:: ido i cm Kpnl um fr agmento de DNA Κρηΐ de 2,7 hpb foi. isolad:::; -l··; : of or et i.e a m ente a par ti.r de uma fatia de gel de agarose e inserido em pEMBLTB (Dente & Cor tese, ref.. 10) resultando nos p-asmideos pfiWl.902 (ver Figura 4) e pGWl.903, respectivamente.

Para construir um mapa físico de pGWl.900 e de pGWl.902 p: eia.ir'aram.....se vári.as misturas de reacção contendo aproximadamente ;;g de DNA de plasmídeo, o tampão adequado recomendado pela BR!.... e 1.0 unidades de uma enzima de restrição ou uma combinação de duas enzimas de restrição diferentes.. Os produtos de reacção foram analisados em géis de 1% de ag a rose em tampão TA! .. A parti..;- dc ί. ·:, a ι i h: ί e a 1 c u 1 a d o d o s f r a g m e n t o s e s p e c i f i c a s f o I. e , t a b ele c i d a a posição dos sítios para enzimas de restrição individuais nas Figuras 3 e A respectivamente..

EoCPeIo......3,10..;:. ílbnnagem......molecular............do......gene............da............pol i. ga iacturonase .(.Pgul.1.).......Gu......u-.........0. LíJor......NH756

DNA genómico de A„.........ni.c}erNW75G foi. analisado pur analise de transferencias Southern usando o gene pgall de

A.. n.! N400 (i... e„ o fragmento BamHI BglIT de 1., 2 kph de pCWlCOO) como sonda.. Relati.vamente ac que foi. descr ito mtp Tvç.í:·

7. 1, foram feitas fluas modificações.. Neste caso escolheram se •r h· de restrição que cortam dentro da fracação estrutural do ar· Ilde A, n:iger N400 e as condiçoes de hibridação foram mais !· •'(•©t.rictivao, i... e, ao con dições «homólogas» descritas no ·:. q-b ?.. 2.. Na digestão oorn Bamlll foi. de te otário agora um único fragmento hihridante de d, 3 kpb.. Nestas condiçlíes de h i t: ida:. ã< · í ui. dote, '.ada urna única sequência, sequênci a esta que hã pa; tanto definida como o gene pgall de A, giger NW756, ijl iservou.....se urn único fragmento Hindi de 3, 3 kpb, o que indica a ausência de um sítio Hindi no gene estrutural... 0 f agmei. Lo hihridante Xho I.....BglII bem 5,5 kpb.. Estes resultados estão em t r· com com os resultados apresentados nc Exemplo 3.,7 e a sequência de DNA de pgall de ...............niger descrita na sequência

,.··..:.: .:,ã em GEQ ID ΝΩ2.. Portanto, concluiu-se que o gene pgall de A,r dor NU756 nao é idêntico ao gene pgall de A.niger N400..

Uma biblioteca genómica de A., nlger NW756 foi., construi.......

d.-; como descrito para a esil rpe N400 no Exemp Lo 2 com pequenas η h fioaeóes.. Usou.....se Sau3AI para cortar o DNA de Asperg i l lus., s.i • · do seu i.sosqu isómero l-lbol.. A biblioteca, da o- Lq·,..·> NH756 te i c :s·· uida no sector lambda EMBL..3, o qual e aparentado cor;; '1’IBL.l frei., d t. DNA de EMBL3, jr; digerido com Bamíi Γ e EcoPI e tratado oorn r, ··.:.·. f >.· i adquirido d Promega.. Pa; Le da hi ‘ n Lio io .

o ' toid o il d semeada e preparadas replicas do· placas r, ·ί. _;eo. ο,·ο. · ΐ)·,·,!ο descrito no Exemplo 3..3.. (Is filtros foram então h i h; idades com um fragmento Baml ll.....fl oPT de 1., 2 kph do pGU 1.303,

i.rraiido as condiçoes homólogas descritas no Exemplo 7, 2.. fls fagoe positivos foram purd.f içados num passo de novo despiste e suhse quentemente o DNA destes fagos foi. purifir;ado como descrito no Exemplo 3,. 4. 0 DNA foi sujeito a analise de restrição, usando as • E.r Bgl! I e Xhdl. Ern seguida, o fragmento Xho I.....Bgl.I1 d· · 5, E ' h, · de ι.,ίΐιΐ dos fagos positivos que con tem este fragmento foi isolado como descrito no Exemplo 3..6.. Este fragmento foi então ligado ao plasmídeo pEMBL.18 digerido com BamHI e Sal.1 e a mistura

107

3· ligação resultante foi usada para transformar Γ...........poli JTIIOU

3.,6),. Os transformantes foram então analisados por b i b i - d a ç a o d e c o 1 ó n i. as em c o n cl i ç ões h e t er ó 1 o gas» c o m o cl ssc r' i t o π ο Exemplo 7.. 3.. 0 DNA de plasmídeo de um clone positivo 3 a. pa..!;-i í irado e subsequentemente usado para construir um mapa f is icc ( !: b 3.. 7 ) ..

mapa de restrição do μGO1.756 está apresentado na Fig.. tí.. pGW1756 é o fragmento Xl io 13 Bglll de 5„ 5 kpb que con 1 em o : pqalí de A., niger NW756 inserido no vector pENBLÍ.8..

J

Epemp ί ti 4A determinação......da......seç{upn.c .i < i......de......D. ucileo tideos......dg:--.............gep.es

3. p;.! i · j. G .a Furonase s-iPGpil^! 4-, 1:: ^!i Sepe da ís o 11.. g a 1 a r: b u r ί j n ase T'1 (.rgsl.L./ ife ...............QÍ.S33

N i GD

Fragmentos de restrição adequados de pGUloOQ e pGW1803 foram isolados após electrofcrese em gel de agarose e ligados aos !^vl 13mpl8RF e l^v!1.3mpl.9RE, usando um excesso de 2.....10 do fragmento relativamente ao vector. A transformação de E„uni, i. JFU..09 foi efectuada como descrito anteriormente enquanto que após ci choque térmico as células foram imedl.atamen i.e semeadas et.mio s, no manual de e lonagem/sequenc i.aeão di.desoxi. em MJG de DEL (p.. 34g ref,. ll).. D isolamento dos moldes de DNA de cadela si mrd.es a parti.r dos fagos recombinantes foi. efectuado como descrito por Au su Fiel et al..,.. (secção 7., 3„ 9; reíi. 40) enquanto as célula;::: Foram colhida© além dos ©obr-enadanteo e estas células foram subsequentemente guardadas em glicerol a .....20° C„

Um dos clones assim obtido., que é o Fragmento Xbal EscRl dw 1-1,4 kpb de pGW1803 inserido nt::! poliadaptsdnr de

FU Foi. subsequentemente manipulado de r-; a gl -,.....se ! J .dados do sequenciaçao a partir dos sítios HindIII, PstI., imHT

Heo ΐ respoctivamen te., Culturas separada;

ides durante a noite em meio YT foram preparadas α par tir de 1:1 çnli

JM1.O9 e a partir do clone importante, neste ui. timo caso usa no. i ;;·' da eultura em ql i corol como inoculo.. Em seguida 200 ml de meio 2xY i foi. inoculado com 0,4 rn.l. da cultura rf· JTTL09 e esta cultura fai subsequentemente incubaria durante 2,5 h num a:tl··:

noite da chino aa interesse foi adicionado e a i.ncuLiação no agitador afta continuou durante 5 h.. 0 DMA forma replica L i oa foi então iç.oíedo a partir destas células como descrito para pCtH.903 an ter for men te.. Este DNA foi. então digerido corn HindIII, PsfC, BamHI e Nool, r espec t i vamen te.. □ DNA digerido corn BamHI Noo ί íentão digerido oom Sall, subsequentomente eatrai.de ae . ι e ·! /rd.oro íãirmio (I.:: 1) e cloru fòrmio e foi então pr ecd. p i tado com afanoE. Ca extremos coesivos nao compatíveis foram então .;··· erro ic • orno i ι .oo.· 5 unidades de DMA.....polimerase de Γ4 (PP! ) no famp'· ;les(. r .i..to por' Maniatis et......al,. (p!17; ref. C) e na presença d:

ra

1, dc ί P. dGTP e d IIP 0,1 mM cada.. As mi sturas de rescoar a d ume de 25 j.ff foram incutia das durante 5 min a 37° C com ad i ei.onou.....se 5 j.CL de 0,5 M ED EA pi! 8,0 e as mi stura;

depois foram ss f is equ en temente extrairias com fenol.. Os pequenos fragmentes d· PNA p; eentes nas quatro preparações de DMA assim obtidas, foram ; i a,r· irias por electro Forese num gel de 0,75 de agaruse rio baixo peds de fusão (BRI.) e isoladas as fatias de gel que con tem os fragmentos grandes.. Estes fragmentos de DNA foram subsequentomen 9 cir cular izados usando DNA Ligase de T4.. As mistur as de r eacção He ligação resultantes foram subsequRntemfinte usadas parai trans·· fornia;· ' ..........coli JM109 como descrito atras..

Urna vez que Bell é sensível ã metilaçao do substrato e ia não pode cor tar o DNA de plasmídeo i .o ! ado a partir de ^!t. od JMj.09 ou líl. coli DHSsF .. Assim, pGLLLBOO e pGWICC3 ! ο· .·;.·· i.o; mente ::i..sol. ridos furam usados par a trans formar ! i.coli

JfíllO (Yunisch.....Perrnn et al.. , ref.. 29) e o DNA de plasmídeo foi euhaequentemente isolado como descrito no Exemplo 3,8, exc-eptua» do a adição de 0,1% de caeaminoácidos a todos os meios usados : a: .. í i/.ss?r Ε,i :o ' i JM110., 0 DNA de plasmídeo isolado a par fia· d · Ε.. : .í i! I JM110 foi então usado para obter subclones que po;mi.

bem d. de sequências a partir do sitio Bell...

íls trif enes resultantes foram sequeneiados com o rd- a arf if: ’ bif da Ph.;: maci a, usando ao condiçoes recomendadas pelo fornecedor.. Nêilguns casos os resultados de sequeneiaçãoassi.n;

obtidos foram usados para programar a sintese de olignnuuLeoti.....

:···:. r r;.-r f f i í.os do acurdo com o método de Caruthers (ref.. Cf, E . t e ·'. o í i ·:; >:! i u o í e o f í d e o o · d a

1111125, o:,· é 5‘ (d)CAAGAACGTCACCATCGAAC3\

HR6439, que é 5’ ( d ) GAATf RCTCACGGTGGAGTGtb c bb:bfnqce e 5' (o!) ΛΓ: E i GCiEH fTTfd ! ΐ f: 1ΠCCGií' ..

f - · h r - a Ί i <j o n u c 1 e o t i e o s f o r a rn i η i i s i : d o r e s d e se q u e n c í. a c: ã o suhsequen temente usados corno os. mo ides ::-00,: i at. ão

1. ,· f a; , f d i. η1 c 1 a d o r 11R G13 9 e s ρ e c-1 : ; o o s o a r a dã duas escadas de alm·opostos quando usado em moldes M! 3 e portanto este iniciaria: •c u. o? para sequen criação de cadeia dupla do pGWÍBOQ .1 ·. e .rd. _:._i: bases, seguindo as instruções da Pinar macia..

A sequência do gene codificador de PGII (pqall) local1.....

rada em pGWlGOO foi obtida a partir de ambas as cadeias de DNA.. A

-..•••quenciaçan na direcção jusante (desde o sítio Xbal na pnsição 1 nn cií; eoça o do si ti. o Pvull nu posição 3029) il ·. i efec tua ri a :i parti; dos sítios ΧΙηβΓ(ί), EcoRT ( cerr ra de 334), HindllI(cerca de

557), Rstlfcerca de 827), Bcll(cerca de 1056), BamHl(cerca de : ' 55 ). || : :jt í..1 (cerca ;:!e· 1.974), Kpnl(ceroa de 1 I53 ). IIJ nt ί..1. ( .s t.a

Je 1311 e 1974), Κρη Τ( cerca de 1565 e cerca de 2706), Ncoífcerrs de 1715) e Bglll(cercu de 2379), respectivamente^ enquanto o

ι ί η iniciado;·· foi HR6425 ra ci. usado para sequeo, lar a regi ao do a.i t.ic· Bgilí, A sequenciaoão na direcção oposta foi efectuada a par t c doe c i tai os PvuII (coroa do 2 028 e cerca de 1442), Kpnlfcerca de 9709 e cerca de 1.565), BglII(cerca de 2379), HincII(cerca d1.974), BamHI(cerca de 1158), Bell (cerca de 1056), Pctl( cerca de 827 '}, 11 i n d I ί I ( c e r c a d e 557) e Ε ο ο R V (i. - e; o a cl e 294 ), res p e e', i vamen.....

enquanto os i niciadores HP6439 e rII26440 foram usados par a ceguei :c i ar nos sítios Hin cl I (cerca de 1374) e ΚρηΓ( cor ca do 1565), r o s ia e o t i v a rn e n t e..

A sequência de PgaTI esta apresentada sob 3EQ ID MO.. 2.

A sequência cie 3031. pb começa corn o primeiro nucleotideo do sitio XbaX na pnsiçãci 1 ern ρ GUI.800 e termina no último nucl.eotl.cleo do ·’' < PvuII indicado na posição cie rnapa aproximada 3050no mapa cie ·.'· d .;· I (..'··.! .·.. pGWl.800.. 0 gene pga. í. I compreende 1.356 u u cl. eo tideos c região do promotor, 11.38 nuol.eoti.deos da parte estruturei Ei nelu indo um l.ntrão putativo de 52 nucleotideos) e 537 núcleo lar d: oc : r egião cio termi.nador da transcrição.

A sequência imediatamente a jusante· da sequência sinal., e o sitio de Eli vagem Xhol codifica uma sequência de aminoácidt .rs que estã de acordo corn a sequência obtida para o fragmento de ‘ ll cia da poligaiucturonase II assumindo que uma clsteina estiara presente na posição 3 (Exemplo 1.. 3)..

A sequên eia de DMA codifica urn peptideo lai. der de 270 am i noacl.dos, sendo arginina o último aminoác ido an tes da sequên.....

c ia da proteína madura.. Este peptideo lider deve ser- removido por i clivagem proteol.it ica.. Os sí tios de clivagem da sinal......peptidase não se encontram .irnediatamente apos os resíduos arginina e em ge: al nao i media tarnen te apos am i.noãcidos cair rega dos (von Hei jne:

. ·-. 39), o peptieo lider foi removido em pelo rnenos dois passos p; - o L: ο 1.11 i. c o s, i... e.. o p e p i i cl e o 1. i d e r v e p n b a u rn a

! 1 pr , ·· sequência,. Neste caso, a sinal~peptidase cliva a p;-e.....sequência cu peptidec sinal enquanto que a restante pro.....sequência é r ainda por unia outra protease..

gene estrutural da poligalacturonase II contem um intrão,, mais provavelmente compreendendo a sequênoia do ·ο: tor .....

desde a posição 1.987 ate â posição 2038, ' sto sequência contem oodnes de terminação nas três grelhas de lr^jítur\.i pus s i /e is.. À presença deste intrão altera a grei lia ·'· fornia consistente com os dados de sequi ê'.. · ·,· (ver Exemplo 1),. A grelha de leitura antes con f ir mada pelas sequências de aminoácidos rio·, Fragmentos h: orno to de cianogénio (Exemplo 1..8), enquanti leitura a sejais ao intrão foi confirmada po P a i;ι i η o á c i. i:!o s d o p e p t i d e o t r ί.ρ t i c o T P 4 (E x e m ρ I o 1.., 5 ),

: laeãu n tes i	da prote lo intrão	ri fu i
riu·,	Fragmentos	rie
• o que	a grelha	de
pela	eequeneia	!e
1... 5),	cuja sequen
lím H a	de nuclecr	ti -
99911··,	0 sitio	de
se à	eequenc: ; ti	de

rir-o o desde êep liei: ra? h'¹ posição 2183 ate à posição •di; intrão, GTA AGC, assemelhe

Tsplieing» 5’ consensus dos fungos GTPuNGT, enquanto que o sitie de 4ep.Liei.ng/> IP 'AC esta Lotaimen te de acordo com o <si fie p Pçd ielugl consensus 8’ dos fungos PyAG (ref.. 41)..

f ·.· · ·ΟΡ P ;......4. 2 :: 9............gene......da............j roli .galao tu: snrs?.......I........(paglj.............rie.....A................rf-··:

N4O0 fragmentos de restrição adequados foram isolack pr f P de pG81900 e atra r o e · - o m o des cr i t o ale pGWI 902 apos e.Lectro forese em gel de no Exemplo 3.. 9,. Estes foram I.i.gados aos vectores ;1P’mp?8Pt e l41.3mp1.9RE de acordo o manual de olonagem/se acenei.aoão di.desoxi. em 141.3 da BRL. (ref.. 11). Células competentes Foram obtidas como descrito no manual de Pharmacia para o sistema d·· clonagem/sequenciação em M í ft. A trans f ormação de !:su;.o£j Ji'lP;^! ff efeetuada cromo descrito por Nesslng et al.. , ref.. 30..

□ isolamento de moldes de DNA de cadela dupla a par 1:.::1.5- de fagos r or;oinbinant6s foi. segundo métodos convenciona is (e„ g„ ref., 11, pp„ 29 34).. Os r fones resultantes foram sequenciados usando o k i t dc? sequenciaçao de T7 da Pharmacia (Hppsnla, Suécia) usando as o i j n d i.. çnes r e c ta rn e n d a d a s ρ e I. o f ta r η e o e d ta r..

pGWISOO foi sequenciado a partir do sitio EcoRI na posição de mapa aprox imada 5750 até aci sitio ClaΪ. na posi ção rio mspa. aproximada 3900 que esta situada per to rio ra ' ’ p. :

volta dei posição 3790.. Foram sintetizados vários oligonucleot::i.....

J dons (304.....307) usando o método de Caruthers (ref.. 8'. Fsi.es oligonucleotideos têm as seguin tes sequências

1 1 r o

304 305

f? 5'

(d) (d)

T A

1 c

c c

A 1

G G

C A

c A

C C

A G

A A

G C

C T

G T

T c

C A

A 0

A G

A

G T

G G

«-VJ 1 .i O* ·. i

'11 men)

309

6'·

(d)

T

c

1

G

Ί

A

G

G

A

r:

G

T

0

T

G

G

'1'

G

> ’.’ί

ti am t j

307

5

( d)

T

G

G

0

A

G

T

A

A

A

A

c

C

A,

A

A

τ

A

A

o

O’·1

fias foram usadas ctamta iniciadores de sequenciaçao espe; ; f 1 ta tas p.ira os moldes importantes..

□ ol. igon usai eo ti rico numero 307 foi usado para rs.s>nria cão He cadeia dupla do pGWlQOO desnaturado oom bases seguindo as

-r . . . . .......ir!

.instruções do fornecedor para o !<:;..t de sequenciaçao de 17 .. Ioda a sequência rio gene pyuf esta apresentada na sequência mostrada em 350 IDNO.. 1.. A sequência laaseia.....se nos dados tle sequenciaçao _2 obtidos com ambas as cadeias.

A sequência pq.q í de 2495 pb começa ; r o primeiro núcleoLírico do sítio EcoRI na posição tle mapa upm : rmaria 6230 em pGGiÇrò e termina 1.2 nueleotideos para lã do último nucleotirÍer;

sita sitio Ciai perto do sitio Hindi II indicado em 3880.. A sequeri.....

pg a. I ta cm pre ende 909 núcleo ta.deos da região do pr omo ter, 1.21.8

ι.: ri.»ib da ρ-r te estruturai, inclui ndo dois^introes put;ati..

uns rie 52 pb (intrao A) e 82 pb (intr3o B) e 888 nurleutídeus da regi-1:1 de terminador da transcrição..

As sequências de aniinaâcidos obtidas a par a a poli.;ja.....

Las tar onase í madura (ver Exemplo 1... i) e para o fragmento de b ζ,- . de eianogênio de 21 kDa (Lxs-ipl··· 1.. 5 estão botaimente de c v. oom uma sequência de aminoácidos que pode der saras d· sequência de nucleotideos e que começa na posição 1003.. A sequên.....

;. La ' de DMA codif ica assim um peptideo lider de 81 aminoácidos,, . ,:d I I .in·; ο ιί ί b I suo aminoãcido antes do começo da proteína madura. Pnr razoes semelhantes âs apresentadas no caso de PGTT ern que o peptideo lider termina com um resíduo de arginina, este ρ·,..;';:· lider de PG I repr es en ta uma prepro.....sequência que é tamÍaém • --.sa, d t L em pelo menos dois passos proteo .Liticos.. A sequência ç: hihr oi : pom a mi. st ura de ol i .gonur leotideos usada como sonda e ;·ζ... riu posição 1.277 da sequência do nucleotideos,. li vau se s, total entre a sequência de ami.noacidos N ber m Lna ! determinada ο··;;.; o fragmento peptidico de brometo de clanogénLo i..·;.- '/

Pba corno descrito no Exemplo 1 e a sequência de aminoãcidos ρ ui a L i v a b , . ·. · d a n a s e q u ê n c i a d e r ί u c 1 e o t i. d e o s..

(1 gene estrutural da poligalacturonase ΐ contem dois 1 ·' ή-.·, 9 intrao A compreende a soqueis: i.; de núcleo bidons desde a posição 11.83 até 11.89.. 0 sitio de «splicing» 5’ G T A T G Ιο st ã de -í:..!'.í com a sequên cia con sen sus do sitio de Isp i :. í b.;;!

d t..'os aspe G I Pu NG'!' (ref.. 41.) enquanto que a sequência em laço GG LAAC e o sitio de «splicing» 8’ TAG também estã de acordo com as sequências con sen sus conhecidas Pu CT Pu AC e Py AG., A presença deste intr ão altera a grelha do leitur a de modo cons i.s.....

tente com os dados da sequência de proteína obtidos com o frag mento de brometo de oLanogénίn oom 5,5 KDa situado mais distai, mente (ver L:.xemplo '!..).. G segundo intrão (!·), compreende α

I Í ·!

requêneia de nucleotideos de 1610 até 1671.. Tantó' à sequência em Laoo .o?·! o sitio de XspIso.inqê 3'^J estão de a cor'tio eorn as sequên ·;·;· constnsus conlrecidas.. 0 sitio de XsplieingX b'^J GCAEGA nao esta de .o:o.i com a sequência consensus ET Pu NG E, mas GCnn . b io de '?'· .p 1 i (- i ι _:gf 5 assim como um A na posição l-G relativamen te ao .etio de «l-j d i.ei.ng)) 5’ foram também encontrados ea:.- .

;,· ;-e- ; (ref s 4 L e 43)..

A presença do intrão B baseia.....se nos seguintes argumen tos::

aj E l e a H. or a gralha do lei tura enquanto nas duas . o r - : · t·. de leitura surgem oodoes de par agem prematuros,, h} Ll intrão em pgaí. I ocorre na mesma posição e a sequência de ami.noaei.i los que precede este intrão Asn ..... Ser Ed i - Glu é idêntica em ambas as proteínas. Uma região de homologia forte foi. !.a.,r · encontrada entre as sequências de aminoácidos deduzidas a sequências de nucleotideos imed i.a bumen to a seguir ao : i ii puta bivo

R e s i duo de a m i η o á c s d o

jut r r 1 (.	Asn ..... I le ··· 1 rp	len	- T: e ..... Gli.	Gii	..... iro	Eis
fí ; í	Ge; lo·· .....	lon	' 1 r e ..... !,| i	Gli..	..... 1 re	Eis

.... .γ í J.	Fie ..... Gli.	..... G1 i.	His	..... Gli.. .....	Leu	- Ser-	Lie ..... Gli..
Ϊ	Ger ..... Li l i.	Gli.	His	..... EU	Leu	Ser	Ile G'. i.

^:m......A, 3Iloimdaigia......entre......ρ ο I.. :i. g a 1 a c t u r o n a s e s......do......A...........niger......Ν.4θθ

As poligalaeturonases PGT e PGII isol adas a partir de

A.niger catalisam a mesma reacção e estão imuncLlogioamen te rolor.iunadas uma com a outra, como descrito no Exemplo 1.,2..

Ds genes ca d i f icadores destas enzimas estão também ·· eitsmen te relacionados urna vez que com o gene pgu Γ i outros ···!;·;· de ; Liga lac turonase fo; um isolados u pui tir de unta bi.blio feira ge nó mi. o a de A...........n iger M400 como descrito no Exemplo 7.. 2. Uma comparação das sequências de aminoácidos putativas para PCI e ^;i I i imas maduras que diferem 2 r esíduos no comprimento rewE; um grande grau de hornologia.. Estes resultados indicam oticamente que os genes codificadores das PGs estão estreitamento ; · ' ac s enados e representam membros de urna família de genes d,.· ci ' ti; a tur onase..

EíidlíiLi 5.1. Gaf; gins tci rnaçao de A, niger usando g ,.1:.. çtfoicr ......marca oeleetiya e um plasmiideo gcírtador <1.j gene d., ; I. ·! G..:u ! αι tu; onase.......I.......nu.......II.......como......pdgsmidog......çotrans.íiirman.te

Exsgplt-......5.. i :: Prç)i,:)_í;igacac)......e............purif icaçag......de......p'i asmiderrs......usados............pa: a ' · .r f · \i. r.......A,, niger

D plasmídeo pGW635 que e uma versão mais curta dc pí119X3 (Goosen ei. cii,,. ref.. 13) e que também contem o gene pyr Ά e o p.J. .asmiden pGWl.300, o qual con terno gene da poli g a la c turonase I íl, ί ; ç opagados em E, col::i. MUT e JM'1.09, c e s ío c,. b i v a m e n b e.. D plasmídeo pGWlPOO foi propagado em E., coli DH5«F’ .. 0 DNA do plasmideo foi. recuperado a partir de 250 ml de culturas crescidas ii.irr.mte a noite corno descrito em Mania tis ct .........d.T, ( |o, i ía i: .:

reír. G) e no Exemplo 3..7..

ExempJ; j............·.' ·...2'a.eparacno............de............pr o topias11s............e.............transfcr rnaçã; i d; <

rm: tan te auxo tróf ico para......a......uridina A., niger estirpe N593

A...........niger estirpe N593 (cspA, pyr A) que é um derivodu esfiape parental N400 foi obtida por selecção positiva con tra o análogo toxica áci.do 5.....fi.uoro.....orótico como em levedura (BoeKe

etrl'....., ref. 1.4) na presença de urldina come descrito por Cnosen . o (ror.. 13)..

.i-i-: rninimo liquido sup!ementado com 0, 52 de e; 1 : rio levedura, 0,2% de casaminoácidos, urldina 10 mM (Janssen Dhemie) e glucose 50 mM foi. Inoculado corn 1.0' con idiúsporus de A. algeeM598 poe ml e incubada durante 20 h a 30°8 num ugi.tudoe oe bifai New Brunswick. 0 mi. cell o foi colhido por filtração, ,:·,.···. ele Mi.raeloth, lavado com meio mínimo isoosmotien '1 !·) e'a seguinte composição:: snrbil.n l. 1,33 M, 10 mM Tris M81 p!' 7,5., mM ! 081 Uma quantidade de tg de micélio foi : essuspenso m 30 mil de 8 ! 8. Os prntoplastrjs foram libertados do micélio dentes d· - 2 h pr ί,.? adição de 150 mg de ilo*,'oe',-m 234 esterilizado pe; filtesean (Nuvo Industries, Denmark) e incubação da mistura a 20' p agitador a 95 rpm.. Ds protoplastos foram separados do .3;·'!· íesi.dual por fi Ί tração usando um funil com uma rrzlh a de ! ã d. -13: ii,. Em seguida adicionou- se 8T8 frio par a um volume ds 40 ml e a mistura foi colocada em gelo durante 1.0 min.. Os probo 1, I. .. í o: am recuperados por centrifugação (10 min, 2500 rprn) e c sedimento ressuspenso em 5 ml de STC.. Os prOtopi.astos foram sodencetados mais uma vez e finalmente ressuspencos em 1 ml do 818 f; lo.

Para a transformação de 5 >; 10' protoplastos ·;; e eessuspensos em 200 jil que foram então incubados junfamente com jig de pD903b e 20 ;:g de pDWISOO ou pGW1.900„ Após a adição de ONA ele plasmideo aos protoplastos adicionou-se 50 pl de Ρ8Ϊ (1.0 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl_?, 252 11186000) e a mistura de

Incubação foi. mantida em gelo duran to 20 min.. Em seguida adiei o.....

nouse mais 2 rnl. de PCT e a mistura foi. incubada duran te mais min a temperatura ambiente.. Finalmente, 811· .....se 4 mi1 de

STC e misturou se.. Amostras de L ml desta solução de transforma ção final í oram misturadas oom 4 ml de agar cie topo MM i.so osmò

1.7 'uuefeito e estabilizado por sacarose 0,95 M„ A mistura de protopLasLos foi. imediatamente colocada em placas dc agar conten.....

; 1! o rn e s rn o meio mínimo iso.....osmótico e estas foram incubadas a

0 ' ’ 9.. E ·: μ e; i ê n c i a s t e s t e rn u n h a a ti e g u a d as i. η o 1 u e m ρ; · o t o μ 1. a -.1,0-.traçados de modo semelhante sem DNA plasmídeo e em meio mini.mo nao estab i. 1:1. zado com uri.di.na 2, 5 mil.

Após 3 dias de crescimento a 30°3 apareceram transfor.....

ma ii te?s bem crescidos que esporulararn (150 transform antes /ug .19910). A1 e m d i s s o s u r g i r as m 'trans f o r rn a n t e s p r e s u rn i v e 1.. rn e n t e . ífior ti .vos. Obt iveram- se cerca de 300 trans formantes r.om pGHISOO e oreoa de 100 corn pGW1900. De cada urn dos trans for mantos corn c3W! 800 c pGW'1.900 vinte colónias foram repicadas ao acaso, os esporos de transforrnant.es individuais foram retirados e semeados ..- -c: , c a rnente em meio minimo com glucose 50 rnM para se obter

i. ci.tini.as isoladas que 'for arn pur i. f içadas mais uma vez e subsequon temente usadas para propagar esporos para posterior anãlise :1c t; ,;> ι·,. í t j; mai t tes,.

3ie.:íÀii Lo......5, 9 - Gelerrcãtu............de............cotransf ocmantes............de............A,...............OÍOíl'35333 ii. Uri......f‘^! · ‘ds iajees......de......ppJLLfilacturonase............por........formaçao............de......halos............em mc 111 -...ci i dt i :ugn tendo pectina

Aproximadamente 200 colónias transfarmadas com pGWlGOO • - apr oximadamen te 100 transf orrnan tes com pGW1.900 obtida-, como descrito nu Exemplo 5.. 2 forarn despistadas relativamente a urn . .smes! c da a et i.v idade de poligalacturonase por um processo ddespiste de colónias sem purificação prévia,. 0 meio usado no .'.--., c^: . '..c é composto por 2% (p/v) de glucose, 0, il de meio mínimo . ··-- peotinu de macã (34,8% de grau de ester i f icuçãõ, 0b i potli r,. 3ischoffszell), sais e elementos de esporos; 6 g/1 de NaM0_o; 0,2 sá ;lc ex tracto de levedura; 0,2.% de peptona, 0,004% de Triton X 100 ç 1,2 ff- agar.. A placa de Petri. foi. inoculada no cfx e

i noufiada durante dois dias a 30° C„ As colónias foram guardadas durante a noite no (rio.. Em seguida a súper fio ie da placa eri i.urada pela adição de uma camada de 5 ml de uma solução de '..'ponelho de rutenl.o a 0,05%, a qual foi incubada durante 5 min stiiii agitação., Π corante nao ligado foi então removido por lavagem eom agua destilada durante mais 5 min.. Nestas condições a produção de po 1.igalacturonase foi, indicada pelo tamanho do halo formado, Aproximadamente 50% dos transforrnantes assim analisadirr ! :an uma actividade de pol. igalacturonase que e superior ao tipo .: ί vagem.

Vinte colónias de transforrnantes de pGWISOO © 7 de transf orrnantes de pGWXSOO foram repicadas com base no tamanho tios halos formados em meio sólido contendo pectina e após um segundo despiste com estas colónias positivas após 4b h de crescimento, K de cada um dos transf orrnantes foram finalmente repicados e pura, i i r ados como descri to no Exemplo 5..2..

'-vi.......11,.4.::. Análise......genómirra.......das......estirpes......de......A,.........n:iger.............>; .e-..,rç mudas....... -cm......po L.g. d ar Luronuse.......11 ran:

-; ί or man tes ob t i,ri os de a co r d om o '· : .-i -mp-i ( u.l

3 osaini como a estirpe selvagem parental N4Q2 foram cultivados

-m meio min imo liquido suplementado com 0,5% de extracto de levedura, 0,2% de casarninoãcidos, glucose 50 mM e NaNO,., (8 g/1.).

Apõe 1.3 h de crescimento a 30°C o DNA foi. extraído e analisado quanto a pr esença do pl.asmideo cotransformante, 0 DNA de A,nlger gd isolai::! o corno aqui descrito an ter i.ormen te..

Fizeram.....se digestões de DNA cromossómi.co (2 j.ig) a 37 C num de reacção de 200 ,r 1. consistindo em 50 mM Tri.s!!{'·!.

pH 8,0, 1.0 mM MgCl._o, 100 mM NaCl e espermidina 4 mMqu© tinha sido ajustado a 1:::11 7, 5 com base Íris antes da sua adição ã mistur a de lio

--.--12. ·.; i i. í i a u ί ι α ι ' 20 U de EcoRI e de Sal E e a mistura de reacção foi. incubada duran te 2 h a 37° C.. Em seguida adicionou sc :b .1 20 !) de ambas as enzimas e a incubação con ti nu ou durante rnais 2 h.. A mistura de reacção (200 .ul) foi subsequen temei rte extraida com 100 .u 1 de cloro fórmi.o.. Π DNA foi subsequen temer; Lo p; eoipitudo a partir da fase aquosa pela adição de 1./1..0 (v/v) .1 um bumpao acetato de sòdi.o 3 M pll 5,2 e 2,5 vol ile etanol... A pos iííciib rão a 4°C durante 1 H e após centrifugação, o sedimento de DNA fui seco ao ar e dissolvido em 20 jil de tampão de amostra., 2

DNA ;,!·· transf orman tes e de A„...............n .iger N402, di gerido porF roRI/Sail, foi. analisado por hibridaçâo de transferências Southern como descrito anteriormente com o fragmento BamHI/BgJIí ; le 1, 2 kpb do pGW'1800 como sonda PGII.,

A frequência de cot runsf ormação encontrada fui. de api-Oximadamente 75%.. Analisou - se 9 transformantes po;· transfprên.....

• : ··· Southern.. A sonda, hi.bridía em M402, com um fragmento genómico grande. Nas transferencias genómicas dos transformantes que contêm stgd·:,· ias de pGW'1300 encontrou se uma inserção EcoRI 2.2:

- ic 4, 1. fpa. Dependendo do número de eópi.as varia a intensuid;e:!e destas bandas.. Nos casos analisados o fragmento genómicn que r epresenta o gene tipo selvagem foi sempre encontrado :nci; and:, integração heteróloga.. A análise da produção de pnligalocturnnaxe η o t r -a n s f 11 r ma n t e d e A.................n i ger d a η u i. e m d · i a n t e d e s i g u a d o

N5‘IS/pGtJloOO 27 e dada como um exemplo debulhado (Exempla 2 2 partir d·· uma serie do diluições de DNA, o número ·· cópias 2 rl.

•t: lado como sendo da ordem de 20.. Para alem do t . p.··' D 21 br 2 dante tipo selvagem e o fragmento de 4,1 kpb, alguns outros .f.-r menores hibrldantes foram encontrados nesta estirpe cs pu 2 · - representam fragmentos do I im i tantes dos casos de 2 Lc rc.. ·>: 1. i i j ι' ί I t j u r e a r r a n,j α s..

120

Exempi ;.= 5.. 5:: Proiiutrao de poligaiacturonase TI per est irpes ^? ·'· I ·· ... u!j:: de A..nigerepor A,niger N102

Vinte dos transformantes de pGWl.800 descritos oe Exemplo 5„ 2 e seis dos transf orrnantes de pGWISOO descritos no Exompl o 5.3 forarn cultivados num meio que consiste num meio mínimo com sais a que se adicionou ureia (4,2 g/1), 1% (ρ/v) de peetina de maça (d. e.. Gl, 2%) e (p/v) de farelo de trigo.. As m J toras for arn cresciddas durante 43 h a 30° C usando urn agitado: o: -1 t a 1 G a 11 e n k a rn p a 250 r ρ ι η o o b t i vera rn se f i 11 r a d o s d a t:: u 11 u r a.. íJ in i.oé Lio Foi removido por filtração através de Mira o Lo th uuandn um funil do Buchner..

Π teor· ern PGI T destas amostras foi examinado ; :

frunsXerencia Western, a qual foi. usada u ti. I. i.zando o método do detecção da fosfatase aloai.ina de acordo corn o manual de i nsl : u çGus da Biorad.. Com base nos sinais das transferências Western, entre os 20 transformantes obtidos ao acaso no Exemplo 5.2, 705 produz: signi í icativarnente rnais poligalucturonasc 1 ΐ do que A. i.ri.gorN402„ Us transf orman tes seleccionados corn base no tamanho d.os baios usando o rnétodo de despiste de placas (ver Exemplo 5..3) t: r.!o . produz ern si.gni.fi cativa mente mais enzima du que

A, η 1 · i e r N402.,

A...........niger estirpe N402 e três dos trans for man tes designados N593/pGW1800.....27, N593/pGW180030 e N593/pGW1800.....87, fórum seleccionados peia rnedi.ção da actividade de po Eiguiac bur o nuGR. As três ultimas estirpes são da série tíe fcransfnrmantes de • 521800 obtidos no Exerriplo 5.. 2..

M593/pGW1800.....30 e N533/pGWl800.....37 contêm ambos I ti p i as cóp Lao de pGWl.800, rnas monos cópias do que N593/pGW'.'!.8OO.....27..

As estirpes forarn cultivadas em rneio com is de pec1:·ina

1.21 (1ί. 31,2%)) a que se adicionou 1% (p/v) de palpa de beterraba i na seca e mo ida, usando as condições descritas atras.. P .s ro açúcares redutores e inibidores da actividade de PP, PGIT b d par ci.almen te purificado apos a f ·?./. a tacão v -ando vigi nato i nteí ligado.. Ί Ml do filtrado da cultura foi diluido cci;;

' ml d· tampão acetato de sódio 20 mM pí ' 4,2 e foi. então a pi brido suma coluna pequena contendo um leito de 2 ml., cie , dg inale :d.. :

Ligado (5,° ml./g) equilibrado neste tampão.. A coluna foi.. .....

ρ-· a/ Lavada com 4 ml. de tampão acetato dc s o silo o dpo;

. d L dr Pd I i íui eluida da coluna usando 4 ml de ' uim Ό · ateia tu cie sódio 20 mM pH 4,2 a que se adicionou Ma Cl 1 Μ.. A so ti vidade Pdno elua tu foi. então determinada como descrito (; tu .. 2) c a paritr do valor obtido calculou so a aetividade PG au li. tir ado da cultura..

Cal.oularam.....se as seguintes o Lis Idades PG μια/a - .

filtra:! v cie cultura obtidos 20 h após inoculação:: 2,2, 5,6, Pr s 10, 3 unidades/ml par a as es ti rpes N402, N593/pGW 1.800 · 30,

L«b03/pGt!1200 37 e MS93/pGW1000.....27, respecti.vamen te.. Par - ou í LlG ados das culturas obtidos após 40 h estes valores são, ro voa c 2,3, 1.3,7, 16, 4 e 30,9 st. d. ./.ii, . c c ^! r. s / d

Parece pois que pGW LtíOO pode ser' suo esc i vamen te ·. ^J

V^:; ·· tr·uí ormar A,.........n iger para produ. d : uma quantidade mui to maior de actividade PG..

L/ddiLí¹ id '/...../d vd.dl· 0.-03......,ί.'.Ο......PO.'...L3d.Lv.5. .íditdÚdLd’.........·.......PPi......GdsJd i.íOb.............·..' di..

sc ' dg A,.,.........niger......e por......A.,.........niger......M402......e......N093

Pesassete dos transformantes de pGW 1.300 desc;- lios no

L •vempit! Li. 2 e seis dos transf ormantes . de pGWl.900 descritos no

Llmiolo Ll. 3 i,i: c;orno A............n .iger M402 e um trans b ·: man te pyr' de

11033 foram eu Uivados num iirdo que consiste em ..r ir mínimo

--ií.s a que se adicionou ureia (4,2 g/l), 1% (p/v) de pectina dera u;3 (d, e, 8.1. 2%) e 1% de polpa de beterraba sacarina. As culbu esc foram cultivadas durante 64 h a 30°C usando urn agitador • a : 1..! ; Gallentamp a 250 rpm e foram condo retiradas amostras dt: í1 ·, c 1 - da cultura após 20 h e 39 h.. 0 teor em PG i destas amostras foi examinado como o teor em PG Γ i no Exemp lo 5..5 po;transf er ene tas Western..

Com base nos sina is em transferenoLas Ε αχ r oc ' ^v i transiormantes testados, 6b% produz signif icah ivames c.o m· . PCI do íjne A,niger M402.. Os trans for man tes ce I eccionadns os o , ·- no tamanho dos halos todos produzem usais Pol de puo

A nigerN402 e :.|-.;.lx. de ; tr; seis tr ans formar; tes .-A· a 1 temen to .i::P.--c ·' medições de actividade indicam que neste neio a ac f iidade após 20 is e maior do que após? 39 h. Ana Usando doze cccii-fjiz. difernetes de A„.........n iger trans formadas ; em PCI observou?e tfsiK : actividade varia entre 2, 8 e 7 11/rnl enquanto a estirpp teotemunhi nao transformada M402 e um transformante

A..........erige;J1593/pGW835 produz 0,5 e 0, 8 U/rnl respectivamente.. Esta ooffç.id. sde e pelo menos o resultado de niveis tipo selvagem de ti. Γ di- PG Ei en quan to que o aumento nos trans forman tes e o ' Ec'... de mais expressão PG.L.

E ·f;is 1 u 6 .g 1 amen t; <, pur i 1 : çacage g^:.s f tf t í ·:/'' ·de s .· 11 ga ; . c .

.79:,,99929.......II........9......1:.1.1..1......99.............trans f9r mante deA, n iger............súper . - ts::

:9......PGII.......M5a3/p3W18QQg27 ' 9291.9 /1...1,::. 69· .'.o 9,:.999 de c : u. !. 11 .U?9;; : E.?-.: .......99„/ΐ99ΐ.9£ί791,1!9229 transfor-mante PGll de A,...............niger W593/pGWl 800.....27

- 'esc;' ito no Exemplo 5.. 4 'foi cultivado en; meio completo em placas de Eof- i durante 3-4 dias a 30°C para produzir' conidios.. Us

corri di ca foram colhidos em 6 ml. de soro fi.sio Logi.oo es ter i.l.

;-{in tendo 0,005% de [ween 80 por placa. A suspensão de esptn-os i cei, agitada num agitador Griffin durante 20 min e, após contagem dos o.-,, adicionou se ! 0 esporos/ml a frascos Erlenmeyer de '1. 1 • ·, i 1 i corados c::) n t n d o 300 ni 1 d e m e i o d e c r e s c i rn e n to e s t e r i 1. i z a d o.

> ate me io o um meio minimo oontendo cloreto de amónio 70 mM como fonte do azoto e 17. (p/v) de pectina de maçã (grau de os Leri. f i.os cao di. 'ff) .17 de polpa de beterraba sacarina fontes d_; ca: boro !J mi.oelio foi. cultivado durante 43 h a 80°C ar . d ,do;- orbital a 200 rpm.. Apos crescimento o m ir 1 io ff ri roniov i do por f i .1. tração atrvés do Miracloth usando um ; Uni.!. i ·· ' haer.. 0 filtrado da cultura feri., ajustado a pi i 4,2 usando tiaíií!.. Adicionou -.r 0,02% de azi.da de sódio em bodos os - .

p. - o- .. ey i tar cresci.men to mi.croh : ο?:

.r.f· ' f ' ' f. 7sbd. 11 caoeo......cie......çof sp\e d: - ...o_;.......ff.......ob.bj da......a.............ffffff 1 ..i f.

d · A..n i ger·transf rir man te Mbo 3 / p G V!1800.....27 d filtrado da cultura (αρ; ox.. 2,5 Ί ) foi. ,;.d irado ·?.:,? colora de algi.nato interligado (2,5 x 25 cm) equi.li.hr ada com tjínpmi acetato de sódio 20 rnMpH 4, 2.. Após aplicação a coluna foi. elui da cunsequtivatnen te com um volume de leito de tampã:? do eqri í iorl.o, um volume de leito de tampão acetato de sódio 20 mM f '! 5.6, um gradiente linear de sal de 1.200 ml. (0 0,5 M Nadl) no ’,-ηϊιραο anterior· e finalmente 275 ml de uma solução de Nadl 1 Mn o

Ímpio., Golherarn se fracções de 6 ml cada e testeiram · qennt a , actividade enzimática como descrito no Exemplo I .. E A . ' centrai, das fracções activas foi reun ida o d iali.sada E- ·· .· r a , entra um tampão bl.s ír is HCl 20 mM pb 6,0.. A solução fi.naf de enzima (475 ml) foi. então aplicada numa coluna de DEAE -E p;,··. e .·. East Elow (Pharmacia) equilibrada com o ir-.r: tampão. Ao.f-, lavagem, apli cou- se um gradiente de Na61 no mesmo tampão e a - t v b iade -r..· poligalacturonase foi. elui.da com cloreto de sod E;

í fo αρ·-ϋ-.< Lniadamente 100 mM. As fracções activas foram analisadas pr.;· , d oo Lr o forese em gel. de CDC.....poIrLacr cl.amidu,. Es tas f; acções esc ' ί;·,¹,. ·.·,;·. elevado teor em PCII leram reunidas (54 ml), dial isadas contra tampao bis Tris HCI 20 rn!'·'! pll 6,0 e ainda pur ificadas r :,. . ; - 11 u n a Mono D (I-³ h a r m a c i a ) o; u i.|. i b r a d a 11 ο ι ne o t a rn a o.. Ases

a |r I ι: a t.	dib t	i enzima	foi	eluida por aplicação de	um g: adien:
•ra Lias	(0 1	M NaCl)..	A en	zima fo i., ar bitr àr iamen te t	•o.Hiida em ia
. ; · · pos	d i f · :	•entes A	e D	cor r espon den do a par te	2.....0, 26 M d

gradiente de cloreto de sódio e com a par te 0,26.....0,64 H d-, gradiente., Aminas as fracções contêm uma única banda de . ·'. electroforese em gel. de 5D5 r 1. ti, j lamida na s·. ;· . ·· ·. c cíe si.s o !,., gemo LoCP.:: Determinacagda.............e .i í de......amifí.tnatrliiris...... : -............capte '^: I -··:;;!;; ι idd Po L i ga J... ⣠is d5 20 a Si 5 LL

200 jrg dde PCI í dos grupos A e 6 combinados,, pur i Γ : ca ie ' ^!e , · r; corn o I :ccmp I o 6..2 ί o i dia Irisado P. ·'·· 'rezes con tr a ! I d- destilada filtrada por Mi 11i.por· e ^! id il: ade A · .· · · ί a de aminoácidos foi., determinado como descrito no Eqern usan alo um sequenoiadnr de preternas de fase gas

A.rp !rs-'d Ll.rosys tems mede Lo 470A.. Determinou.....se a seguia te sequer,

, : ia ale aminoatr	i dos	N.....terminal	para a	enzima::
1 ·'-- Loas :	1
Pi ; ι as cr ido ·.;	asp	- ser- X		í en tr e .....	La· .....	a 1 ci
'leriç-UO :		10			16
Ar,o : io· icirJo ::	ala	a,La ala	Íris	ala - gli	..... lis	..... a 1. a
Ι-’.· ;s.;.r In::			20
4 m ι a- i.i- i do ::	Íris	..... X ..... ser .....	υ!Ό .....	i La·

do., ;· · ' , ii·:: nao foram dwtecfcados.. Eles com grande

Do resíduos cie citeina na proteína nao faram modifica μριαίιί Li’!.idado (.icurfem na posição 3(X) o na posição 18(X)da sequência í ·. : li..--:,(1. >1.t. .ι 1... 3).. Us três últimos real duos de am l.noão idos io: o::.

·- t '. Η:·, apenas em niveis baixos,, A sequência obtida para esta oi.d..iíia para cor responde exactamente à sequência r· ..de:,.'!·' do • e ·;., N de ΡΓ1ΓΓ deduzida a partir da sequência de ae r - ·· -d í:!o gene PRTT (ver Exemplo 4 e Figura 4, formal.a II). A sequência ;.b ; .uc.ieo ti.deos correspondeute também mostra r esíduos de orsteinu na . . -r f·, esperada, nomeadamente nos resi.duos 3 e 1.8.. EsLa •pè ·. : também corresponde a sequência determinada para o í :· ag mérito de brometo de cia nogénio com 5 KDa (ver Exemplo 1... 3 ) o qual corresponde portanto ao extremo IM da proteina..

Exompd.gG.. 1 :: Pr oiar iedades............depoll.gaineta:.ona se IIds..'s....t. ·... .3 · 'dd...i par ...tis.......,d..2 1? · E.E.dd ézltdi.ksN5D d./.E‘b Wl800.8' 7

A enz ima purifl.oada de acordo com o Exemplo 8.. 2 foi . :.g: ,.C. . ,;.i: . ι enzima pr i Í1-..3.. a partir de Papi.duxe cer,;.

des; r l. to no Exemplo 1... 1 Ambas as enzimas tem uma u: .;····· s. meleoula: ipaoTit? de 88 kDa em géis de SDS -poli sor i.J amida o r eagem de modo idêntico oom anticorpos pol r. donae . 1 ndoz idos ··. · a a pd ' ' ssr:j í -e -d.... Um anticorpo monoc Lona i que reage mm ar;

; ρ: topo continuo de PGFle não cum PGÍ, EIIA, IIIB ou EV, também : - oom a enz ima purificada ile acurrlo oom com o Exemp lo ’i '' ^!· e‘. da ;soelectrolocagem PGII produzi do e pur i Eioado de acordo eom i;.om os Exemplos 6.1 e il. 2 rn ostra ama banda bera definida num • é d . j.d idênt ico ao de PG Γ Γ (pl b, 2).. Devido a micro -beto .r.eoeid. de de PGII., í o: am observadas uma série de outras bandas • o de pl mais baixos quando se usa um gra ri i en te '·· pH ds pl i 3 7 ou de pH 3 1.0.. Foram obbidos padrões semelhanes usando

5^! é produzida de acordo oom o Exemplo 6.. 1..

I -s:ia i cLL·.. · 1 ?!·' 3-3.38......9......is¹. ilâllSr^! to......EIê......8383.3013.1.9.8......‘ 3' R¹ - ' · ·1.1.3; 8 ,q?ne dacE.;,l:; E; 3203. se.......!' í qxpiiipiíj 7.,.1::. De te:::;<?;ar;......de......839.3301318.8......: . 1 mi' r.3. ......cor.-......r::......ggne.......1 ·'.......d

33.1 :g. 3 ,.;; 1 .cironase

3mm.....se DNA a par Ei; de A„...............r γ.'.·; :.3:338 usando o a seguir..

E3iíd^rG EcoPI 3: .. -arda:; 3.. 4 .

e a comi ri nação Ds fragmentos de

DNA Eoi cê;· Esse . as - - . 3,. d e s t a s e n. i. mas c o m o : J e s e: i. to :o DNA Em.,· então separ adas . ·?; s · de 0,38 cie ..aja;-os,· e Eoram subsequentemente tr ans ias idos par a se...

: eada;· .:. dr· η ::;.. tr ruisl ese como deser i Lc na Exemplo 3..7.. A .....

na pré·./.‘..amente ;s3.:!.,. ,.·. tempera Eur a al. ta Eoi. pré sis. :3..3 .

ssssnEe 2 h a 333:- tampao de lii.br l.dação pré aquecido, a gel ases-i ate em IX de BGA (Boehr inger ), I. mM l:::.D I A, ί as ta te de sodio 3 Ε: M pl! 7 3' (adicionado a partir de um stock 1. M que e ...-,.:.-:-3 por 88,0 g de NaHPO 2t! 0 e 4 ml de E!,.._tPD, a 853 por litro) e ^:i· *í· ‘3” 3 Έ, : .amo descrito por Hhurclo e Gi. Lber b (ref.. 88) e a aa a-3 : de fresco DNA de esperma de salmão partido e :pn:.--^: - . .·

8s p;,: a uma concentração de 0,1 mg/m.L. Em seguida adoi.onou ·se 3-aguento BsmGí. Bgl.II de 1,2 kpb do pGWlBOO sujeito a 4m..ck .·:.. .3-.nl. que 3.3. pr epar ado como -.--s ii. no Exemplo 3..7, ;

. 3,3 i:3o3í decorreu durante 44 !a a 80°8 eom agitação ssa'.‘s. ,' -mi r-. ma 3,i então lavada duas vezes em tampao de H :i b;- i daeã?: . - :·-;·; a 3 (80°) (-:::· DNA de do aa ; 13 π,.Ι.-,:..

zi---. - temei í Et > a membrana Eoi. lavada :^Λ: . -· . du: ante :;s .

: 80°8 . tampão pr é.....aqueci do que consiste :;i tz?8S8, 0 313? 338 ;

8. 34 Ε8ρ,Ρ,-1Ί,.₇, 1011,..,8,. A membrana foi então seca e exposta a E 33?s t.aJaE 33'3 duran te 8 dias a 60°8..

Nes tas condlcoes não se obser va hi bridação I. E i

-a se 3o-'u. · da ausência de um arrastamento sigrci. í icante de DMA hi.bridan te e, ainda, da ma?! - de 33:3· id r 3-

'· ΊΑ'7 ;stircJa asm -o marcadores de tamanho lambda, Ετη cada unta d . faixas ft iram obsrvadas vár i as bandas hibr i dantes, se bent <; er.

e 'te em a banda seja mais Intensa de que as outras., EsE handa-, intonsas correspondem a um fragmento de 3, 3 kpb na diges efi ee PamHf, um fr agmente maior do que 20 kpb na digestão < .om •P i fragmento de

3, kpb na digestão dupla

ParnPl/EeoPE. As bandas com uma densi.dade mais baixa correspondem

' ragmen tos cont 17, 3,	b, 6,	4	p	O ··'··· y	0	kpb	na í.ligestão com Pami ' í,
s ;;, me n Is; d e 1. b, 1.2,	6, b	E?	4,	6	kpb na	d i ge·. 1. ão com bs ί :
b ;·;,.· -d s.· de 7,6, 6,4,	4, 0,	r-, S.j	7	e	2, 0	kpb	na dupla di.gesta·; r c;i

EemN r/EooRI..

P: dt. !ae..i de terem sido :Ί.ο· ...o· de bd · i · : a . espee j.. ís. cos, o.o h:i,; que O gene PGI. I.de A, rtojrç AEdg .

usado p. .·a defecbar sequências espeoif icas , e ONA obtido a gárdeir de A,.........niger NW75B.. Ds fragmentes que dão si.nais de I ri br i.

d ·. · fortes foram assumidos como portadores do gene PG ί E. Em _; s -p- . L-Uií fragmento que dá hibr idaçao fraca ps surgir . es :. bs de restrição cortar o DNA perto do fim da r-r. · · · .s,.ir.¹ : cia sonda usaria» No en tanto, isto pode nao explicar ' f 'ia rd·· o número de fragmentos grandes hibridan tes observa;;:.'·:

c o o s c .; ·,; t e ο χ e 111 ρ !.. s. A s s ; ι η c o rt o u. i.......s e s ,s s · t i e t e s1 a s: r sequên•ias espeoi. ficas de DNA, as quais têrn homologia com o gene PGI 1, que não sao idênticas a ele.. Estas sequências de DNA is;,··,· assumidas somo sendo diferentes genes PG, o suo estã de .·.·.;:

• ; m o facto das PGs terem ' r rno i nq E a ni.ve L de pe.··.; ('··

Exenplo 1, 1)..

Esffmp I n 7 . P.q I stjlamen to............de genes............r ei aç Lona ti os............r:nmo............;psr............d·;.

· ¹ Ei · ·.· 7 xPddebAb........!..!

ftpr oximadamen te 1 x 1.0' lagos da lai!, d ib_:·· de A.. nigesNlOO foram semeados em 5 piaras usando E.. t o li! .Ε3-Γ-

24

4: ze; sc- 4 la replicas em niLroceiulose de cada t.ffn-i das p Lac .

cl· · -e i. ti; r: Exemplo 3..4, sendo terceiro i i'4 . 4eò. 4 no 'qs da placa durante 5 min.. Π primeira e segundo filtros de rada rtaoa foram tratados usando condicões que sao : · 4a i 4o : : c d r 4a ' Ό Iogas».. LI í 1. I, Lr o se jeito a condições : ·.· 4 a.

tez., que sao aqui referidas como «homólogas».. A pre lii.hr4 .

4 4-.4- e lavagem dos filtros foram efestuadas a 50° 4 cm ., ;m' i eees heterólogas o a 44 4. em condl.çoes homó logas,, ípce 4,estação filtrais a tempera Lura elevada, este..; for am molhados mi 4 -4’ 4 e dopo i.s pró liibri dados duran te duas h em 4,:,,1..4 ··

4:44:444 pré aquecido, o qual. consiste em LOx De: a fia rd 14 s ' :

: s.y . 3..4), 50 mM íris.....ÍIC1 píl 7,5, 20 mM EDTA gH 3,0, dr, ioiaju de 4··;.·. 0,1. mg/ml. de DNA de esperma . . sa í.mau . . L?

:'....sr· 4.··. íil.tros í cr- am en t a tr ansf orri dcs, um · L cada um ir.ra.,. con tendo 50 mi de tampão de hli

Calca· 1, ondulado DMA de oepe; ma de saí mão,, a que íoi ..:.-4:,-4ad Ar ronado o f r agmen to Bamí lí og I ί Γ de pRWI800 coin 1,2 4:4a ,? 4:4 .- L - ra 4 - d. i - in». A 14 4; oieçèo deccr ; eu durante ' h · então os ί i I tr ados foram Lavados, usando ac :..e homólogas ou ir I.e; ; d ogas.. As condições de lavagem homologa ralo ·· • ·:4;4..·- . Lis fi IL; os são lavados duas vezes duran I.e 0,5 h em ' Z 0,1. X 404 e 0, Ilido piro fosfato de sódio e - eihcequen temes Lo r'eses duran te 0, 5 h em 0, 2:-:444., 0, IX _;airofor4ato de sódio. As condl.çoes heterologas são a;

. · 4 4;-:: fór um Lavados duas vezes dur.rute 0,5 ' 4.4 .- .1- e depo is; dur ante 0,5 h em 4xS4C, pi; ofos'4rto de -4:4- e finalmente 2x444, : 4 4 o: S 4 o de sodlo, ÍJs filtros foram ser a l;,,e foslal: XAR5 durante 3 dias a .....I i: 4cu- i pi cadores, 3s fagos que deram sinala -uceperudos como descr l.to no ί - · rmip Ir': 3.,4..

IX , são	404 e 0, 1 IO '.. .
0, 5	hem tampao
0, IX	40S e 0, IX
IX	41'4 e 0, IX
ao a	: · · · rci ·. ·.
8,	usando

dc •

pos : . 71.

fora,;·:

129

Nos filtros sujeitos a eond içiies homologas for a ; 1:fidos 7 sinais positivos, sinais esses que bamboo cotão presen'·- na : b .7 correspondente nos filtros sujeitos a con d iodes E-d .or d I s Estes sinais sao encarados como o resultado dos fogos ; ala recomtd..nan tes portadores do gene PGÍ.E. r--d r- ' orfos .S 5 J · i U ) voo ·.-.... t E.--s eorrespondentes em ambos os f i I trios.. A o d entre estes 20 sinais varia.. A ;,...ia ^: deste rno.s es ia como resultado dos fagos que contem um gene PG dl fer e; í f . PG.

. ; nai,., oE E 1 veram se 30 ; a ; o; ;d i r fie., he teroiogas sinais positivos nos í1.'bree estes sinais esbao ; ; .···;.'.· í ora do

A biblioteca genómica de A,.........niger d400 foi despistada ;,.pí,j ;r Preparar arnse réplicas como de. ·; IL·.· . ·'. .

! : ·' Eo no que respeita á temperutura usada, a h.ibr idacãu foi ; frd.i.mib como dor r r i to atras.. A hibridação e lavagem foi a GGU’: sara um rios dois fitfros obtidos a par tir de uma pí -.a, snqu.anbs • :e · ;·.

i 1 Ιοί oi. h.ibr ida do e lavado a EEff, η_;:η b-brr • ;. .!.f; e . · or am lavas.los usando condições do GGC .d'..; çiGGCJ, a eu H.Ef., As s eus I i ode-. de HGGG foram as seguintes:; os f i ' E; or.

- . : Er/,:der aluas vezes durante 5 minutos em 4:aGSC, gu !. · • f i I ! oe foram lavados ab berro te duas durante 0,5 h em l':,EE-f enquanto edoríres de GGG usadas também continham 0, 1_% SDS e 0,12 pircfa-..· u L · . f : · o· | ; i dua;

vezes d.. ,t 0., 5 h em o:

filtro© incubados a G8°C (cnndiyõps de hi.bradução fhomu Lcgua e foram obtidos cinco sinais positivos fortes ,-'·;/ es tão presentes na pos ição oor r esponden te nos Et incubados a 92°G.. A analise com enzimas de restrição de um beto fugoc dr- acordo eorn ο I remo! o 3„ b indica que este fago >.. I. ... inserção r qual o gene codificador de PGII (pgalI5 .-.-.bu si 1'nf b.'..es o: neo lagos sao portanto cono I. f·· .·/· como tendo E:.-

a 82° 8 (oondb..ão ;

s i ι í a : s 1 ‘ os i '.: v o - ., hibridam aporias f r aoamen te!:o : a 68° C„ A forca do a d: d entre gqal ÍE Eíh adição, ia is filtros incubados

Eib;.....rd· d coo;' ag s ) ·>·.-.. avam presen te:

os quais nao são hibridantes ou til lo s - _; espon den tos incubados - s fe s ¹ 7 1 oa i s v a r i a..

Lagos do pri.mei.ro despiste e 10 Lagos do ·.···:· .·.

-.ο ι - - re.,

Lagos -.-1,, que não contem ogal I, o go·. 1 .rb·!•ar at 1··;-' ,-:1-.:. Estes fagos foram f; o r; ri i. ç d e s u s a d a a na · u a d e t ecoa o L n i. o ia 1 ar r a.:: ; E : t t í ·<-:·. VII o oito ds ^: :

·. s -.;L··. sao os fagos apresentados na ! abe La ; agoo .- idit: tonais (numeros 2, 3, 31, 33, 40, 41, 42) numerados de 1. a 30 foram obtidos no primeiro despiste da b ί E I Lo.....

;·. . ;-.gu ij d ! · que os Lagos oom números mais o Levados Leram (1 , t i. d m S ; so g U !' i d o d e 3 p i. s t e..

P a r a d i s o r i m i n ar e n t r e !agos que contem o gene da , ; i · i Lactar onase L e os que contem outras sequências re-E;-· «-.n ·.....

s s. ι V i! |::> o 1 i g alu c t u: - o n a s e 11, r e ρ 1 i c a s d, ; |a j d: f a g

1-..1.-,-,.1-:- í saram hibridados oom o tragmento Pjiu Pdd de 1, 81.1. pbWl.909 (Exemplo 3..9)., A hibridação foi a 62°C, enquant o -rr lavagem il d bambem a 82°8 usando uma seri.e de tampões '/Es, t arpoes - · -v.r bambem con tem 0, 17 dí la e 0, 1.7 do p i ro los Lato us sedio (4x888, 2x988, IxSSC, 0,5x888, 0,2x888 e 0,1x888; a incuba v - durou meia hora por tampão)., dsando estas . a·:-.¹- os í ag 8, 8, 7, 40, 41 e 42 deram sinais de hibridação Ler tes, compu; E eis som o sina L obtido com o fago Pd I 1 amiudai, ; - Js uLtimo · rio gene ggn.I (E.xe πιρ I o3.. 8 ).. A analise de restrição do LUA -E: Irh. a partir de um destes Lagos bambem indica gue este fago contem uma inserção na qual estã situado o gene pçg E. Estes seis fago·- são portanto considerados enrao contendo n gene jagal.. íte o-.-;.- Lagos analisados (l, 8, 31, 33, 35, 38, 37, 37, 38, 48 j

,'er ,·. ·.·:.·!.·	um sina..!.. portanto	de I d !.·; .; st u.dio, no caso	íle dar em a fgum, e
	i a gos.	não	ε o n t e rn o g e n e pgu í..
	Par	a enoont;	x.:;	quais i u-·: fagos rp;	! í.íl.rl ’
: ε3η · -		DNA ilo	isolado a partir dos	f a - : o s i. n d ,i, o a d o s n a

!'xbel<-i V1.Í corno dx-xxr i to no Exemplo 3..5 e digeridos como :/·.- ;Ja. no Exemplo 3.. G e os fragmentos resultantes foram subsequen temen te . - ' - - g por analise de transferenoas Goxthern.. Para a o d . · das digestões com H.i.nfT e Hl.ntr Γ Γ, a quantidade de agarose doa gei.s foi. aumentaria . · r·' 1% (p/v)„ As ^:.r.s lerei asas douthern foram hihri dadas a GO°C eom o fragmento Ra mlI í /EçcjP 1 de f ' kpb -

dd 1 amen te	sujeito a	«η 1 d.	;.....transia	hiunSg	enqi ;anft
-:gom kiT também	efestuada α	G0° G,	usando	oix	li ·. '- I	Ir -ϊ. í
atrãs., As	enzimas de	r osi :· i	çar: ;p	Í í il· :hií	x. ·..'· .

o,·, i.íIhis para fazer uma c I os-xi í boxe·'· inicia! ¹ lagos - xo xx Í.uièirxçdO de BamHI e pgj : ', e Ihud ! o 'J.G.xu '. estas ri Ido or • s - foram usadas separadamen te., ί i i n; J · e Hint.í gora l.mente -.

- ι.·:ΐ|;-?ΐϋ x ροηοϋ,-. iragmentos de restrição, o . qua i,s, no pr: · --:d.: s so a mi.nimi.xam a hipótese de os fr agmentos hibridantes resultan d- sen lerem DNA deri' of:. do ver; tor E1^VIBL4, alem da >-.e,, a ' -1 Ί. a o i.. ο rada : o η ι P g g ϊ ί.,

l.dLxiigV^; ; ? 3 Lassí/Í Icação de fagos xrho: relacionados com Pkd ' os.: base ia: tamanhe: dos fragmentos de DNA de lambda fd.brt dantes x pfí) . .d '. í d-, por drgestão do DNA Iso l ado a pa; ; ir destes i ages ^: xl.dte o b.d.'...if e itj jj ·/xdlt'' í e alguns con dali usando sonda..

Ir aguento Banilí/EcgR í do pGW1.303 orno

Classes de fagos lambda’¹

...da de A B C' D Ε F o • t -si; ia,: ao

F a g o s. 1. a ni b d a ρ e r b e ι f c entes á s res p e tb i. \' a s ο 1 asses::

9, 10, 43 4, 35, 36 1, 16, 20, 37 8, 11, 12 6, 38 5 1.7, 27

C o rt! p r i. m e n t o d o f ia g ι n e n t o ( !: p ia )

HincH	1.25 2.4	1.75	1.3; 0.4 1.3;0.78 2.3
Hinfl	0.7; 0.3 1.1	1.28	1.8 0.65 0.6
BglII/BamHI 7.2: 0.56 3.1	8.7	1.7 4.1 >23	3.0 (λ-17)
	(λ-10) (λ-4)	(λ-20)	(λ-6)	4.9 (λ-27)
Sall	6.9 n.d.	6.8 (λ-16; λ-20)	1.3; 0.5 n.d.
; ;;ηΊι:κ·ο	com número 16 e 20	também partilham um fragmento Dpi d’ do
, '1 í ·	um fragmento Mincll/Kpnl de 1,	38!<pb,
' ‘Pagos	da classe G hi.hr i.dam	a P e n a s f r .a o ame n t e o o m P G Τ. I	em condi..

.· nâo ;·· esbr i.obi.vas..

d. d i g e s 1â o n a o rea i ia a d a..

Dos resultados apresentados na Tabela VI Γ é claro que par a a maior par te das classes de fagos for am Isolados i.nriepen den!·:α;η fo vários fagos representativos. Dado o faobo de apei. .·· uma selecção de todos os sinais hibridantes ber' sido feita no despicte inicia, o numero dos fagos lambda encontrudos para csdu i ... · (alasse A:: 3:; iá:; 2:; C:: 4; D:: 3:; F.:: 2) indica que f o:· am enctjiibrados genes diferentes numa frequência semelhante. No caso do gene PGT e:^; · número é mais elevado (G de 2G fagos analisados)

s ,ί ; no ί ι;·ο contendo PC Η encontramse na mesma frequência

9'7 de 59 fagos anal.i sados ).. A classe C ' 1 h; Lda mais fracamsula cr.m o.k a as sondas der ivadas do gene PCI ou do gne PG ι 9 !'·':

99o; de em fragmento hibr i.dan be de 3,0 e 1,9 fgh nos fagcs i .ar e numem 17 e 27 respectivamente, vários fragmentes nao hib; 99n' ··

V··· são idênticos em ambos; os fagos e que são der iva des -9 fase: caes 'oram detectadcs na digestão com Bgl f T/Bamkfí v i · um í mg me r: to de 5,6 kpb, um de 5, '1 kpb, um de 1,45 kpb e um de 0,57 kpb.. lambem f or am quase iguais as digestões do n-.k ' os f.igs c; -a 111.99911 e Kinfíã

ô. .ι·Ρ'. ί.' e'b;do:.

neste Exemplo foram d-idas nova

íií'< açôfid corno	de segue
	Número	Nome
	9	lambda	PG.....A8
	10	lambda	PG.....ALO
	43	Iambda	PG.....A43
	4.	lambda	PG Bi
	35	lambda	PG B35
	36	lambda	PG B86
	1	lambda	PG Cl.
	16	lambda	PG.....Cl6
	20	lambda	PG C20
	37	lambda	PG C37
	8	lambda	PGD8
	11	l.amb da	PC.....BI.1
	12	1 amb ι	PG D12
	6	lambda	PG 1 C
	38	lambda	PG.....188
	5	lambda	PC d 5
	17	lambda	PG.....GI.7
	27	lambda	PG.....G27
de beruri nado	31	1. a miada	PG.....X31
d;·'. í-^nn i.ru.i do	33	lambda	PG.....Y88

L ' arííl1.?. 7,3 ^Cfubcli magem do aeng PGG C.l·.'d)‘d.i 3. rons tr a.g.ãod . 11! dd s fago lambda PG.....C20 (íLxeniplo 7..2: fago 20, d. . d foi dd: ; bío com BgIT.I o os fragmentos resultantes .-0.:1 .

doo omi gel. de agarose.. As fatias do g: d gue contem o fragment fdbridante Bgl ΐ ΐ de 7,8 kpb foram recuperadas — o fragment isolado então como descrito (Exemplo flb).. 0 írugmenfο Bgl. ΓI í

^{1 :}o.a‘,. a p!JC9 digerido os BamH Γ e tratado corn 6ΪΡ (f osf . 3.;·ο d· ί .' - f ; a . de vitela).. A mistura de reacção de Ligaçao foi usada res a tr ans formar E,coí.i.JMIQE! (Exemplo 3..6) !Vá' i a · d a s c o ‘ ό n Las Y f - ν ρ i e m e n t si. · - o;, i s r dom i u 1 tan tes f o r a rn t r a ç a d as em a g a;

Ε,ο crescimento durante a noite ao a srs a um filtro de nitrocelu tose,, As eoforsias no arsin a/ r lisadas e o DNA libertado foi. fj.vado por dr ub. ϊ.!·»; ç.i:>; s i t u. a elevada c ο íi ι o des c; I. t ο ρ o r r ϊ. i o i r I s e t a J . (ref.

íl

314 o doados em a; a ; emover

Ei! tror incubador t e; ι; p era t u r a e 1 o· v ada i i !Lre ;eão a

6;;

vam

I

3x336 e foram suavemente raspados com a mão : n b.r · .

os detrritos das céiulas baoherianas,. Os f ia ir o foram então Hibridados com o fragmento Bam! !'L.....EcoPi de 1, 2 f pfi , .331333, usando as condiçoes loetorologas descritas no Exemplo

'.•''Pt Lavagens :rom 2x336).. Escolineu se um clone positivo e o DNA da- ;j'íao;iir!oj ’ i então usado par a analise de restrição p. r; .; o o n · t; o L: · u ι n m a n a f i.. s i c o..

D e s t e m o do i r o n s h; · u i u se um : ι ο ν ο ρ 1 a o rn · s1 e o.. ρ 8 8 1 8'2

E .igar a 7) o o fragmento Bg1 íi de 7,8 kpb do fago ' ο ο P6 ego rersaikj o sitio BamH Γ do vector pUCEL. Este sub· I one ryrienf os b i b; o .1, .·: 3 es do Eo· lambda ! ‘3 620, e.. g„ oo Lrsgmenfoe ama.! de !, 1 e L'ou Γ de !., 6 kpb.. A partir·' da local i sacão ·.'···.'.·

E pris ό ' · no mapa físico de pGWl.910 concluiuse ·. r.r· este ,E· „ Eo οη'νιη o gene 1116 corapLeto (pga6).

33ií£ 'd L:^: dd . f ί odoi Li., t e r t e r a o hi Lapides humanesBDB R . o b r . gi ba r.: e dao, op;.! .or! ^Jí i' ' 'g-aaqgr,o ''. ' · 6pi r: j : ão dsi iarecrursesr lo : ’ bs; in ^{1 1} ''de'fΓ · ΓΕΝAM118 'Ei a a.......Ε.

pl.asrnideo p681.800 foi diger ido com I · oP I e tr atado mm :oni Lmer ase de 14 como se segue.. A reiigaoae deste DNA o

t; nnsί ΐ η mação de Ε...........ία Η i DHDçv ' pe?r ini.t o o isolamento de urn plasm i i- c pNWlROO Ε, o qual é o mesmo que pGWlBOO, · · eop t u-v vC te;

sido ;d., i.minado o a-ifio de clivagern com EcoP.I...

Π plasmídeo pGWISOO.....E foi digerida som Bgll Γ e tr .·· ado com losfatase alca lina bacteriana (BRL) na presença de 50 ml'¹ ‘is HGf ρΗ d, 0 e 50 mM NaC.I. durante 1 h a 65° G„ A c : í α LoaJ. d u · fui inactivada por digestão com pro te ina: c s (BoaNr i n- / M-innheim) e extracção com fenol.. D DNA í cd , -f ; o . ·, _:s · c . . : ··· ç d ',;d. , om etanol., seco a redisse Lvido em agua.. Em seguida · coesivos foram preenchi rios com DNA.....polimerase dc T i ; . . : aba i. XO..

plasmídeo pJDB207 ff AM 119 (EP 205 104) foi. d i.yerd co . HindíGll e CLa.E, Gs extremos coesivos destes fragmento;; ! dv ar es luram preenchidos com DNA polimerase de Ll (Boe! iringe;

v, d ay _na presença ele dGTP, dGTP, dALP e dl IP 0, L mM · ude ., i 57 mM Lr is HCL pH7, 5, 6,7 mM MgCl^ 16, 7 mM í Nt/,) ,..,66/, e 5 mM DT L ic ..ata 69 min a 37°C. A r eacçao foi. parada por . pe.b·:-· 5 · u Cedi > Ε α ,si·» Lχ · 5 min.. Os fragmentos foram separ ados num gel ds 0, 3% vir cigarose de baixo ponto de fusãu (, RioRad .5 e o fragmento de ! 'yd. o qual, s.s.eve. a região codifIoadoru de ΓΕΝ AMI 1.9, fd et.·.·: e o DNA purificado numa coluna ELutip D /d. dd···;· 3.

. 5'·. ¹ i) e precipitado com etanol (Cchmvth T L.ohen, ref.. 34)..

100 ng do fragmento ff AM 119 e o pr eivar ..sio sGW LGⁿO E for am ligados cm 5 jil de 20 mM Tris HCl pH 7, 5,

1.5 mM . ^:'M' . 10 mM DLL e 1 unidade de DNA li.gase de 14 -11.:5 . f. - Mannheim) durante 2 b ã temperatura ambiente,. Esta mistu; u GG para transformar células competentes L .. çol IDHbcEC,

I.; r . í : ir man tes resistentes α ampicllina foram despistados ; digestão com enzimas de restrição do DNA de plasmídeo par a

ç. ;d.. · f D . ;c os pi: G.c.mç do precursor plasmídeo pGLT.....IEN AMI 19,.

:-'ί ·!ιΐρ ! ί 1

Α ofrtençao de , uslds q·!-·; i : ..

dg......;1 d çl......AMUB.

DdllscpTlt!AM:119......usando......PCR.......(fxur.:;-.......4......e......5)

Π método PCR seguido è como descr ito por' R.. !1, Hor tos ei , d. (rei, 95) e esta esquematizado na Figura 5,

rcwiaoo foi.	lineai azado., por	digestão	com Bamlli e
;· : eo i pll-ado com etano..	Aρ o s r :·.··.· u s ρ; n s a o	em acu.i.	100 -
DNA f ei. sujei. Lo a amp.di f i.cação por o: .	: de eadea	as com ρο ί.. .!..:;;!.: -
a. · ( PCR j H-.iUde ris	ο 11, cj o nu:. 1 e o t ::i. rl e os	A e p (Ι·-	ί gura dj rua

d- ' 1 ,-r; ter do durante 25 ir!:,' P .2 . um eriusis Lindo 1 min : 3 4° Li 2 min o 40° C e 3 min a 72° C) segu d io rio der:- minuto-,,

71° C, 100 pM de oada um doo ol i.g; núcleo t o^! o 0., 5 ri --L t - · , Tnq di PI Cetus) foram ;o. · c• ; .;0 . o iro- de ΙΟΟρΙ usando o tampão do ; - o .rccorror dado -d 1 i iii’· . fsfo d·', DNA 1 (djo.; 5 ) pCWI 900 tratado de modo semelliante com o o'. i. geni r d ;·' ·. ds-, A o ç dã o DNA 2,

De medo semelhante pJDB207.....IFN ΛΜ119 linearizado com lA-crNI o.i> 1 to a PCR com os oligoi luclootzdeoa D e F ou o tigonu !-. 1 o11 deos F s 1 O., DNA 3 ou DNA 4, respectivamente..

misturas de reacção for am proc ipi tadas : furã!,, ; . -r · i idas em água, e uma amostra testaria num gel p.rr r '1·,':..; a tração rios f r agmen tos de DNA nus m -.i.-r ,

Hsando ao mesmas condicríes como descrito atras o DNA I c o DNA 4 de am sujeitos a PCR com ns ;d igonui r J eo ti.deos A c- 1 o; : a dar o DNA 5 e o DNA 2 eo DNA 3 com os mesmos niigonuo D-ota era dor o DNA 6 (Figura 5)..

DNA b comer a com um sitio BamHI. e termina nura ide o ^reoRF c .1nc l..ui um.: 'c-O-. Lu do· grelhas de leitura do · o ' · .

: met l.oni.na original ligado ao fragmento do prometo;

do aom α região codificadora do interferão híbrido maduro

PDBB.

fí fragmento BamíH. EcoRI do DNA 5 fo.i.. íigado -κι precur • dc p Lacmideo pGIi ΓΕΝ AMI í.9 construído no cc, ’.. -do : ;m ' b¹: EcoRI criar o plasmídeo pGTI.....IFN AM 119..

De modo semelhante o fragmento BamHI.....Flui RI do DNA 9, gue contem um fusão de grelhas de leitura perfei. fu ria --ç.iei;; ria

-..d - ío PGII ligada ao fragmento do promotor PGIT ·nn a regi Lo codificadora de interferão hlbri.de madur ei BDBB, foi Inserido no ç: · . u. -; ρθ Γ Γ ΓΕΝ AM 119 para gera; c plasmídeo .-'d·.· ÍE AMI 19.

termo ío d d:; do trai n s formaçao dc ·'-···.'- .a 1 ! ·,· rn ger ou ' o te .-'-‘rd coe ELíL/sbl......e......pGHsg 9 N......nu......--9/ Jj- N mu tanto of i co para ;·. i.di.na AN8 ( DGM 89 ί 7,

-^:D, ρ·;] ep 278 355) fo.i. cotrans for mado com o

P-.1Gb9l í7 : pb í. -··.- 11 N ou pG.I. Γ Í F N Ami 19 para dar g , d; G ..

·· : o i.dinu..

dr- espor os de cnnidios de A., n ico: An8 fru am unte d- . i;r a 28° 9 em meio completo até 2rl0 onni.d í oogor os t^; .1 - D! m · n ' ; - - p cru 1. — . ·- m u s a d o s p a r a ί η o c u 1. a; 2 0 m I. -' -· π ι e. i. · ;·· .!( i mo - · b orefr c--m 1 g/rn 1 de argi.ni.na e uri.rírna..

Apos 20 Horas de crescimento a 28° C e 180 : pm, • . d ο ^; Ρ · ί o ·. onlhi.do por filtração rd - do M i. r a:r l.o tir, ' . ¹

-Der com 10 ml de 0,8 M KCL, 50 mM 0..-G:,, o r---u.se c,- s :ml : 0,8 M KGI, 50 mM GaGI,..,, 0,5 mM GaCL,,,

0, b mg/ml

Novozy», 234 (Novo Industries). A mistur, fi-H , com aeitaoeo (₃₀»_C, _B0 vp„,) até sereElibeZZ ZtoZsto., suficientes (detecteidos ao microscópio após 90-120 min). A suspensão de protoplastos foi filtrada através de uma almofada de lâ de vidro num funil para remover os detritos de micélio. Qs protoplastos foram sedimentados apõs centrifugação suave (10 min,

2000 rpm) à temperatura ambiente e lavados duas vezes com .10 rnl de 0, 8M KUl, 50 rnM UaCig. Us protoplastos foram finalmente ressuspensos em 200-500 pl de 0, 8 M KCl, 50 mM CaCl_o para dar uma 8 - ^z concentração de 1 x 10' /rnl..

Para transformação uma amostra de 200 pl da suspensão de protoplastos foi incubada com 5 pg de DMA de pCG59D7 e 50 pg de pGIIss-IFN AM119 ou pGII-IFN AM119, 50 pl de PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaClg, 2.5% PEG 8000). A mistura de incubação foi mantida em gelo durante 20 min, mais 2 ml de PUf foram adicionados e a mistura incubada durante mais 5 min á temperatura ambiente. Adicionou-se 4 ml de 0, 8 M KOI, 50 mM UaLl^ e amostras de 1 ml da solução de transformação final forarn misturadas corn rneio rninirno de agar liquefeito (Meio rninirno + g/1 de arginina + lOg/1 cie Bacto-Agar (Difco), estabilizado corn 0, 8 M KCl. As misturas forarn imediatamente vertidas sobre placas de agar do mesmo meio e incubado a 30°C.

Após 2-3 dias de crescimento a 28**C, surgiram transfor.....

rnantes estáveis como colonias corn urn crescimento vigoroso e esporulantes num crescimento de fundo de muitas centenas de pequenas colónias de transforrnantes presumivelmente abortivos.

1.40 -

Exemj:/lo.....3..„4.1 E^reí^ão.ji:;LiaÊag_.._2^^

SSOfeosle......‘±l...erornt:>tj;^....JBai;í;.

Os; transf ormantes da experiência de cotransformação (Exemplo 8.. 3) foram repicados e analisados quanto a expressão de interferão. A actividade de interferáofoi determinada de acordo com o processo de Armstrong (J.A. Armstrong, Appl. Microbiol. 21. 732 (1971)) usandocélulas humanas 001.... --23 e virus da estomatite vesicular (VSV) como agente infeccioso.

Os esporos; de? conídios dos; transformantes foram pré-eultivados individualmente em 50 ml de cun meio de pré-cultura (Pectin Slcw Set L (IJnipectin, SA, Redon, França) 3 g/1, NI-LCl 4 g/1, KH₂P0_z| 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1, MgSO_z|.. 71-0,0 0,5 g/1,

Ca^S0_Z|.. 2HgO 0,5 g/1, pl-·! 7,0, 0,1% arginina). A pré.....cultura foi incubada durante 72 horas; a 250 rpm e 28^<?C.. 10% dia pré-cultura foi usado para inocular 50 ml. do meio de cultura principal (farinha de soja 20 g/1, pectina Slcw Set 5 g/1, 1% arginina). A cultura foi cultivada durante 72--96 horas a 250 rpm e 28°C.

A vários tempos (todas as; 20 horas) retiraram-se amostras, as; células foram sedimentadas por centrifugação e rebentadas por liofilização e trituração do pó. 0 sobrenadante e os extractos; celulares foram ambos testados quanto á actividade de interferão corno descrito (supra).. 0 grosso da actividade de interferão é encontrada secretada no meio dos transformantes portadores de p(3IIss~IFN AM119 enquanto os transformantes portadores de pOIIss-IFN AM119 esta principalmente no extracto de células.,

141

Exemplo 9:: Produção de pol.:i..galacturonase I e poligalaçturonase.....II por......estirpes transformadas de A., nidulans

Exemple 9.. 1:: Propagação e purificação de plasmídeos usadas_____para transformar......A„______nidulans G191.....E._____coli MHI pGW635 foi. propagado em E,____coli MH1, pGWISOO em JM1O9 e pGW'1900 ern DH5«F’ ..

Exemplo________9„ 2:: Preparação___de______protoplastos________e________transformação________do mutante de A..____nidulans auxotròfico para.....uridiria

A estirpe mutante de A,.________nidulans G191. (pyrG, pabaAl, fwAl, uaY9) foi descrita por Ballanoe e Turner, 1985 (ref.. 27)..

rnicélio foi crescido a 37° C e processado como descrito para A· niger (ver Exemplo 5.. 2) excepto ter-se adicionado 2 rng de p.....aminobenzoato por litro de meio.. Os protoplastos foram preparados seguindo o processo descrito para A^__________niger.. Para a (??

transf ormação 5 x 10' protoplastos foram ressuspensos em 200j.il de STC, que foi então incubado juntarnente com 1 j.i.g de pGW635 e 20 j.ig de pGWISOO ou 2.5 pg de pGW1900„ As placas foram incubadas durante 3 dias a 37° 0..

Aproximadamente 50 transforrnantes /jig de pGW835 foram obtidos na experiência de cotransformação e em cada experiência 20 transforrnantes foram ainda purificados em meio rninimo com glucose 50 mM,. Estas estirpes foram subsequentemente usadas para propagar esporos para posterior analise.. Estas estirpes foram subsequentemente usadas para propagar esporos para posterior análise..

142 Exemplo.....9. .3:. Análise......de...........tr^i^erêrici^...Wç^tern______da^odUSílfi..........de

P<aXÍ53aIaeturon^e____Le._____ILfíL_esy£E§§.__Xr^^^m«iç!âs____d®_______âx„ nidulans

Os cotransforrnantes obtidos de acordo com o Exemplo

5,. 2. usando pGW1800 como plasmideo cotransformarite foram cultivadas submersas em 75 rnl de rneio rninirno usando 2 rng/1 de p-arnincbenzoato, 7,5 g/1 de NH^NOg como fonte de azoto e 1% (ρ/v) de peetina de maçã (d. e.. 61,2%) mais 1% (ρ/v) de polpa de beterraba sacarina corno fonte de carbono começando corn 10 oonidiõsporos por' rnl... Usou-se urn agitador orbital Gallenkamp a 250 rpm e a temperatura de crescimento foi mantida a 30°C.

Retiraram-se amostras após 43 e 88 h de crescimento, centrifugou.....se e o sobrenadante foi dialisado durante a noite a

4° 6 contra tampão fosfato de sódio 5mM pl-l 6, 5 contendo 0, 02% (p/v) de azida de sódio. A análise do teor em PG II destas amostras foi examinado por transferências Western (ver página 69) usando anticorpos monoclonais ou policlonais. As amostras de

A._____nldulans usadas como testemunha não contêm material que dê reacção cruzada oom PGIl conforme testado corn anticorpos monoclonais.

Os vinte transforrnantes analisados produziram todos poligalacturonase II ainda que a quantidade varie entre os diferentes transformantes. Para além de uma banda principal do peso molecular esperado (38 l<Da) foram observadas várias bandas menores de peso molecular mais baixo provávelmente representando produtos de degração. 0 transformante que produz mais enzima é

A.______nidulansG191/pGW180Q-13. A actividade de poligalacturonase deste transformante usando diferentes meios de crescimento foi comparada oom a actividade da estirpe recipiente como se mostra na Tabela VIII.

Actividades de poligalacturonase das filtrados do transforrnante de â^>JlÍáíálâQâ 9Í91/p9W1800~-13 e de 4,______ni&llâQS

9191. As estirpes foram cultivadas por inoculação de 10' espo.....

ros/ml a 30° C ern meio rninimo usando fontes de C e de N corno definido e concentração alta de fosfato (15 g de KH^PO^/litro) mais 0, 1% de extracto de levedura.

Estirpe	Fonte C	p	ente N	L®ÍSE»o_„.ç!e. Fermentação	Activiz vidade de aaliaâz lâEítura™; nase LUZmli
9191	3% glucose	1%	NH4C1	40	n. d„
9191/p9W885~-l	3% glucose	1%	nh4 Cl	40	n.. d.
9191/p9WI800-13	3% D~-gluoose	1%	nh4ci	40	120
9191	1% pectina + + 1% polpa de beterraba sacarina	1%	nh4ci	40	n„ d.,
ei91/p8W1800™13	1% pectina + + 1% polpa de beterraba sacarina	1%	NHZ|C1	40	130

n. d..

nao dectãvel tJrna vez que o transf orrnante G191/pGW1800-13 sintetisa niveis elevados de PGII na ausência de substâncias peeticas, a produção de PGII dos outros transf orrnantes A....................nidulans

G191/pGW'18OO obtidos foi também analisado.. Com esta finalidade 19 transf orrnantes assim como G191/pGW635~-l foram cultivados num meio que consiste em sais de meio mínimo, usando 0, 4% NH^Cl corno fonte de azoto e 5% de glucose corno fonte de carbono, oorn fosfato adicionado numa concentração alta (15 g/l ΚΗ,^ΡΟ^)., Os filtrados das culturas foram obtidos após 48 e 69 horas e foram subsequentemente analisados por transferência Western e sondando com o anticorpo rnonoolonal, sem concentração prévia filtrados de cultura. Pelo menos 17 de 19

A. nidulans G191./pGW1800 sintetizam PGII no meio de glucose, enquanto nao se obteve qualquer sinal com A.__________nidulans facto de se obter sinais claros irnplica um de expressão em comparação oorn A.______________niger N402 e diálise dos t r a n s f o r rn an t e s

G191/pGW635-l„ elevado nivel cultivada em condições indutoras de poiigalacturonase tal corno descrito no Exemplo 5. 5, urna vez. que se obteve apenas sinais fracos de PGII em transferênoias Western dos filtrados das culturasda estirpe não transformada, quando se usa filtrados não concentrados e o anticorpo rnonoolonal. Também se analisou a produção de PGII por A._______niger G191/pGW1800”13 e seis outros transf orrnantes G191/pGW1800 usando o meio corno descrito atas, mas corn 1% de polpa de beterrabae 1% de pectina como fontes de carbono em vez de glucose a 5%. Ao contrário de A.____________nidulans

G191/pGW1800~-13 estes seis transf orrnantes produzem muito mais PGII no meio oorn pectina e polpa de beterraba, enquanto novamente nao se encontrou qualquer sinal corn A.____nidulans G19l/pGW635···-!..

Os cotransformantes obtidos de acordo com o Exemplo

9. 2. usando pGW1900 corno plasmideo eotransf orrnante foram cultiva.....

dos ern dois meios diferentes. 0 primeiro meio consiste consiste em meio mínimo com sais e elevada concentração de fosfatos a que se adicionou NI-I^Cl (4,0 g/1), 1% (p/v) de pectina de maçã (d.e.

61,2%) e 1% (p/v) de polpa de beterraba sacarina, enquanto alguns;

transformantes foram cultivados neste meio com ureia (4,2 g/1) como fonte de azoto em vez de NII^CI,. A diferença relativamente ao meio mínimo com uma baixa concentração de fosfato© anterior (página 28) è que se usou 15 g de ΚΗ,-,ΡΟ^ por litro ern vez de

1, 5 g. 0 segundo meio também consiste num meio m’ nimo com sais e concentração alta de fosfatos a que foram adicionados 0,1% de extracto de levedura, NH.C1 (10 g/1) e 3% (p/v) de glucose foram 4 adicionados como fonte de azoto e de carbono.. A ambos os rneios foi adicionado 2 mg/1 de p-aminibenzoato. As; culturas foram cultivadas; durante 42 h a 30° C usando um agitador orbital Gallenkarnp a 250 rpm e retiradas; amostras; do filtrado da cultura após 20 h e 42 h. Nas; transferências Western de A._______nldulans (3181, cultivados em condiçoes semelhantes; aos; transf ormantes, não foi detectada proteína ou foi detectada apenas; muito pouca dando reacção cruzada corn anticorpos; policlonais; induzidos; contra poligalacturonase I purificada. Mo filtrado de cultura de 75 % dos; transf ormantes; detectou-se PGI em níveis; significativos.,

Usando NH .Cl em vez de ureia e concentrações de fosfato 4 altas; em meios complexos, reduz-se substancialmente a degradação prcteolítica da poligalacturonase T. que é produzido.. Com base nos; resultados de transferências Western e mediçSes de actividade calculou-se que o transformante (3191 p(3W19OO™6 produz cerca de 1 g de enzima por litro corno indicado na Tabela Vlurna vez que a actividade especifica de PG é 550 IJ/rng (Kester e Visser, 1990),,

Tabela.....VI; Actividades de poligalacturonase dos filtrados das cultura de A„ nidulans transformante G191/pGW1900.....6 e da estirpe testemunha G191/p(3W635-l„ As; estirpes; foram cultivadas por β inoculação de 10' esporos/ml a 30°C em meio mínimo usando fontes;

, 146

de M e C cerne KII?PO4/1).	indicado e	í concentração alt	a de	fosfatos ( r	: 15 C

Estirpe	Fonte C
G191/pGW635-l	3% glucose
G191/pGW635-l	1% pectina + + 1% polpa de beterraba sacarina
G191/pGW635-l	1% pectina + + 1% polpa de beterraba sacarina
G691/pGW1900-6	3% glucose
G191/PGW1900-6	1% pectina + + 1% polpa de beterraba sacarina ( o mesmo ) ( o mesmo )
G191/pGW1900-6	1% pectina + + 1% polpa de

beterraba

Fonte N	Tempo de Fermentação	Activi- vidade de poliga- lactura nase (U/ml)
0,4% NH4C1	64	n.d.
0,4% NH4C1	49	n.d.
0,4% ureia	26	n.d.

0,4%	nh4ci	64	5
0,4%	NH.C1 4	22	17

0,4% NH.C1	26	125
0,4% NH4C1	49	570
0,4% ureia	22	125

sacarina ( o mesmo ( o mesmo

0,4% ureia	26	225
0,4% ureia	49	140

n.d. = não detectável da poligalaçturonase I em A.______niger em meio com uma dose de genes m transforrnantes de gene pgal e pgall codificador e II respectivamente não são expressos contendo glucose, mesrno em transforrnantes alta,. A expressão destes genes de A„ niger

A„_____nidulans tal como nas estirpes G191/pGW1900~6 e G191/pGW1900.....

--1.0 e estirpes similares G191/p(3W1800-13 e G191/pGW1800~20, respectivamente, indica no entanto que ern A,, nidulans a repressão por catabolitos destes genes é ultrapassado. Isto indica especificidades diferentes rio sistema de repressão de catabolitos entre estas diferentes espécies de Aspergillus, Isto pode ser explorado para expressar um gene particular de poligalaçturonase de A„ niger ern condiçSes que evitam a expressão de poligalacturoriases do próprio hospedeiro. As enzimas poligalaçturonase© assim obtidas estão praticamente puras..

Εχοπΐ£3ΐο.„..ΐ()ι IsábMger^^.........esiiaâz laoturonase__________II_____________a____________part±r_.......,de_________jA-_____________Ili^lans________________kâDgfeaSâDÍÊ

Êlâl/pGW1800yl3

Exemplo..........lCL.li Produçãc_L___________de_____PGII...........„...usando___________o_____________tranofíarmarite

G19l2pl^l8CXL13

	0 transforrnante	G191/oGW1800~13 de A..	nidulans foi
cultivado	em culturas de	100 ml num rneio com 1%	de polpa	de
beterraba	sacarina e 1%	de pectina composto como	descrito	no
Exemplo 5.	3 excepto ter	sido usado 15 g/1 de KHOPC	L ©rn vez	de

1, 5 g/1- de rnodo semelhante, este transforrnante foi tmbém cultivado em niveis altos e baixos de fosfatos em rneio rninimo usando 5% ou 1% de glucose corno fonte de carbono.. Estes meios não conduzem a qualquer poligalaçturonase II detectãvel em A-__________niger

N402 enquanto a própria estirpe A.,.........nidulans 6191 é incapaz de fazer PGII corno descrita rio Exemplo 9. 3„

IMa© amostras dos filtrados de cultura dotransformante

G191/pGW1800-13 de A. nidulans tiradas após 72 h usando 5% de glucose e alta concentração de fosfatos, cerca de 860 U/ml de actividade PG foram encontrados enquanto usando baixas concentraçSes de fosfatos esta quantidade é de SSO U/ml. 0 reduzidos niveis observados quando se usa 1% de glucose e concentrações altas de fosfatos são essencialmente devidas a um aumento da reciclagem da proteína quando a fonte de carbono fica exausta após 48 h.. Mo caso de 1% de glucose e concentração baixa de fosfatos, o nível da produção permanece baixo ao longo de todo o período de cultura. A quantidade deproteina obtida por litro de filtrado de cultura usando 5% de glucose e concentração alta de fosfatos aproxima-se de urn grama por litro,. A electroforese em gel de SDS-poliacrilamida indica que o filtrado de cultura do transformante contem uma banda de proteína com uma rnassa molecular correspondente á (de PGII de A.______niger.,

ÊÍSÊÍBElfiJLâí, 2.1 I§slajnêQtfi__Ê__________purifica^^ ......a.......joartáx...........do filtaáS......de„„cultura...„do......tran^H^m^^^......de

N.......niclulaas filtrado de cultura (cerca de 2 1) que tem um pH de aproximadamente 4, 9 Foi diluido 5 vezes com H^O e depois levado até pH6,0 usando NaOH 2 N. Para concentrar a enzima, a solução •f^:o± aplicada numa coluna de Sephadex DEAE-ASO pré-equilibrada em tampão fosfato de potássio 20 rnM pl-l 6, 0 que está contido num funil de Buchner para permitir fluxos elevados. Toda a actividade enzimática ficou adsorvida ao material de permuta iónica e foi colhido em 300 ml por eluição com 11*1 NaCl no mesmo tampão (recu peração:: 65%). A solução de enzima foi então dialisada contra tampão 1.0 ml*l Bis TrispH 6, 0 e aplicado numa coluna de Sepharose DEAE Fast F-low (60 ml. de volume de leito) equilibrada no mesmo tampão. A actividade enzimática foi eluída por aplicação de um

149 gradiente 0-0, 5 M MaCl em tampão a aproximadamente 0, 15 M NaCl (recuperação total:: 57%),.

Exemplo 10.. 3:: Propriedades de PGIl purificada a partir do filtrado de......cultura.....do......transformante.....G191/pGW1800-I3.....de.....A._____nidulans

PGIl purificado de acordo com o Exemplo 10., 2 foi comparado com a enzima purificada a partir de Rapidasecomo descrito no Exemplo 1.1 (caso PGIl). Ambas as enzimas têm uma massa molecular aparente semelhante de 38 kDa em géis de SDs-po— liacrilamida e reagem de forma idêntica com anticorpos policlonais e com o anticorpo monoclonal (ver Exemplo 8.4). Quando da focagem isoeléctrica PGIl produzida pelo transformante de A. nidulans e purificada de acordo com o Exemplo 10.2 tem muito menos micro-heterogeneidade do que a enzima produzida por

A.........niger uma vez que para além da banda principal (pl 5,2) apenas se encontra uma banda menor.

As propriedades cinéticas de ambas as enzimas foram comparadas por medição a 25°C em tampão acetato de sódio 0, 075 M pll 4,2 da actividade de poligalacturonase variando a concentração de poligalacturonase entre 0, 2 e 1 rng/ml usando urn teste modificado com ferricianeto,. Para PGIl de A,_______niger derivada de Rapidase a V é de 2780 U/rng de proteina oom um K de 0,8 rng/ml de rnax rn poligalacturonase (USB). Para a PGIl derivada do transformante o valor da V é ligeiramente superior viz. 3480 Ll/rng de proteina rnax —......

enquanto o K é idêntico. Finalmente PGIl purificada a partir do transformante de A..______nidulans foi tratada corn brometo de cianogénio de acorda corn o Exemplo '1.3 (caso PGIl). Isto leva a um padrão idêntico de fragmentos conforme observado para PGIl purificada a partir de Rapidase.

1.50

Exemi^o....!!.::. Expro^ifi..^^......A_a...._j;iiger.....,NW756......em...........estirpes tt^osfooíâsáâs......ífe......â».......JD.Í9®r.....N593 pGW1756 (Exemplo 3.. 1.0) foi usado parta transformar

A.nipjer N593, usando pGW835 corno vector selectivo (ver Exemplo

5,. 2).. Repicaram-se ao acaso oito transformantes que se purifica.....

ram e usaram para posterior análise. Eles foram cultivados em meio mínimo liquido com sais a que se adicionou cloreto de amónio (4,0 g/1), 1% de pectina (d„ e„ 61,2) e 1% de polpa de beterraba sacarina triturada, usando as condições descritas no Exemplo 5. 5» Nas transferências Western vê-se a super-produção de pGII para os filtrados de cultura dos transformantes, usando anticorpos específicos de PGII. Dois dos transformantes super-protectores de PGII (N593/pGW1758-6 e N593/pGW1.756-7) foram seleccionados e estas estirpes e a estirpe testemunha N402 (ver Exemplo 5.5) foram cultivadas nvamente usando as condições descritas atrás.. Os filtrados de cultura foram obtidos âs 44· h após inoculação e a actividade de poligalacturonase nos filtrados brutos foi determinada como descrito (ref. 2.)., enquanto a mistura de reacção ervzimãtica foi tamponada a pH 4, 8 usando acetato de sódio 50 mM.

Os resultados tarnbém mostram que o gene pgall em pGWl.756 está funcional e que este plasmideo pode ser usado para transformar A._____niger de modo a expressar uma lelevada actividade d e ρ o 1 i g a 1 a c t u r o n a s e

Exempln JL2j:. Produção_________de_..^M9ãlâpturonase.„.C_________por......estirpes de...........A,.„ nidulans......transformadas plasmideo pGW1910 portador do gene pgaC de A........niger

N400 (Exemplo 7.3) foi usado corno plasmideo cotransformante numa experiência destinada a transformar A. nidulans G1.91. parei pratotrofia relativamente â uridina, como descrito no Exemplo 9. 2. Dez.

151 do® transformantes resultantes foram purificados e subsequenternente usados para propagar esporos para posterior anãlise.. Estas estirpes e G191/pGW635-l foram cultivadas ern meio rninimo liquido com sais suplementado com 2 mg/ml de p-aminobenzoato, 4, 0 g/1 de

NH^Cl como fonte de azoto, 1% de polpa de beterraba sacarinas 1% de pectina corno fontes de carbono, corn fosfato adicionado numa fi concentração alta (15 g/1 de KH^PO^ )» A inoculação foi a 10' esporos/rnl e a incubação realizada a 30°C num agitador orbital Gallenkamp a 250 rpm.. Os filtrados das culturas foram obtidos âs 65 h após inoculação e os filtrados foram subsequentemente analisados, sem purificação ou concentração prévia,. As transferências Western foram incubadas corn uma mistura dos anticorpos induzidos contra PGI e PGII (Exemplo 1.. 2). As rnediçSes de actividade (ref» 2) foram efectuada® em tampão acetato de sodio 50 mM pH 4,8 contendo 0,2.5 % de ácido poligalacturónico (USB).

Corn base na transf erência Western a maior parte dos transformantes obtidos produziram quantidades elevadas de poligalacturonase C (PGC).. Este resultado foi confirmado pela medição da actividade de PG no sobrenadante dos transformantes e de uma estirpe testemunha (A» nidulans G191 transformada corn pGW635)„

Exêiaela-lâl .........aej:iesS..........E9â!à..„e......._»KJaD..._de„.A^_____ni_s:jer_______em

Além dos genes pgal, pgall e pgaC outros membros da familia de genes da poligalacturonase de A» niger (Exemplo 7..2) foram usados para transformar A._____nidulans» No presente Exemplo foram usados clones no fago lambda em vez de subclones seus num v e c t o r ρ I asm i d e o..

DNA do fago lambda foi preparado a partir de lisado® de placas como descrito no Exemplo 3» 5 e foi então extraído unta

- 152 ·-vez mais corn fenol. e clorofórmio,. Para uma exepri~encia de cotran©formação usou-se 20 j.rg de DNA de larnbda e o DNA foi obtido em quantidades substancialmente iguais a partir de 2 fagos da rnesrna classe (e.g. lambda PG-AXO em combinação com lambda-A43 ou lambda PG.....D8 ern combinação corn lambda PG-D11). A cotransforrnaçao de A._______nidulans G191 foi efectuada como descrito no Exemplo 9. 2, enquanto as; testemunhas incluiarn agora cotransf orrnaçQes corn pGW'J.900 e larnbda PGI-7, separadamente.. Usando DNA do fago lambda preparado como descrito atrás, as; frequências de transformação forarn mais baixas; comparado corn o DNA de plasrnideo purificado por· sedimentação ern gradientes de cloreto de césio..

Os transformantes; importantes forarn purificados e analisados corno descrito para os; transformantes no Exemplo 12. Neste caso os transformantes foram também cultivados num meio contendo 3% de glucose corno fonte de carbono (concentração alta de fosfatos, 0, 1% de extracto de levedura, 1% de cloreto de arnônio)..

Obtiveram-se transformantes de A.__________________nidulans

G191/larnbdaA~l e G191/XarnbdaD-~l usando a classe de fagos PG-A e PG.....D, respectivamente, referidos; atrás.. As actividades de poligalacturonase nos; filtrados de cultura do meio de polpa de beterraba/pectina às 65 h após inoculação forarn significativamente superiores; às; da estirpe testemunha G191/pGW635-l.. As sequências; relacionadas corn pga11 presentes; nos fagos das classes A e D codificam assim proteínas corn actividade de poligalacturonase.

Corn base nas transferências Western concluiu-se que estes produ.....

tos; de genes, poligalacturonase A e poligalacturonase B, respectivamente, migrarn corn a mesma mobilidade electroforética de PGI.

A., nidulans G191/larnfodaA-l produz poligalacturonase A tarnbérn no meio de cultura corn glucose como fonte de carbono.

»1.53

Exernplo 14: A expressão de interferão híbrido ern estirpes........transformadas......de A.._______nidulans

Para urna experiência de cotransformação usou.....se aproxirnadarnente 20 j.ig de DNA de plasmideo pGII-IEN AM'1'19 ou pGIIss 1FN AM119. A co transformação de A.._____nidulans G191 foi efectuada como descrito no Exernplo 9.. 2..

Ds transforrnantes importantes foram purificados e analisados oorn descrito para os transforrnantes no Exernplo 8. 4.. Neste caso os transforrnantes foram tambérn cultivados num meio contendo 3% de glucose corno fonte de carbono (concentração alta de fosfatos, 0, 1% de extracto de levedura, ‘i.% de cloreto de amónio),

A vãrios tempos (todas as 20 horas) retiraram.....se amostras, as células foram sedimentadas por centrifugação e rebentadas por liofilização e trituração do põ seco.. Sobrenadante e extractos celulares foram ambos testados quanto á actividade interferão como descrito (supra).. 0 grosso da actividade de interferão foi secretada para o meio nos transforrnantes portado · res de pfâlIss-IFN AM119 enquanto os transforrnantes portadores de pGII-IFN AM119 retêm a actividade no extracto celular indicand que A..___________nidulans produz IEN a partir de pGII-IFN AM..I..19 ou de pGIIss.....IEN AM11 quando a glucose é usada corno única fonte de carbono..

Exemplo 15; Propriedades de da......poiigalacturonase......1 maceração da poiigalacturonase II e

A separação de células de tecido de pepino foi usada para testar a actividade de maceração das poligalacturonases de A„ niger,, 0 fruto de pepineiro foi adquirido numa mercearia local..

& si superfície foi subsequentemente descontaminada esfregando com urn tecido embebido ern etanol ou por flutuação durante 1 hora ern água de Javel (comprada na mercearia, diluida para 0,5% de hipoclorito de sódio).. 0 pepino foi então cortado e a parte interior mole das fatias foi removida. Duas das fatias resultantes (cerca de 12 g) forarn colocadas num Erlenmeyer contendo 25 rnl de urn tarnpáo de maceração a que se adicionou previamente ou nao poligalacturonase. A incubação subsequente foi de 24 horas com agitação suave unidireccional num banho rnaria terrnostatizado a 30”C. Os frascos foram então observados a olho nu.. A maceração completa preenche os seguintes requesitos:; (i) a pele do pepino está essencíalrnente liberta do tecido aderente, conforme indicado por exame macroscópico(ii) o tampão de maceração tornou-se altamente turvo:; (iii) existe uma correlação positiva entre a separação das células e elevada turbidez do tampão de maceração, conforme indicado pela elevada proporção de células soltas que parecem estar intactas conforme avaliado ao microscópio.

A poligalacturonase II. e a poligalacturonase I preparadas como descrito no Exemplo 1 forarn testadas em diferentes tampões. 0 tarnpáo de maceração A (MBA) é acetato de sódio 50 rnM pl-l 4,8. 0 tarnpáo de maceração Β (MBB) é tampão fosfato citrato, (ishii (1976), Phytopathology 66., pp. 281-289). MBB foi preparado misturando soluções de ácido citrico 0,1 M e Na^HPO^ até o valor do pl-l pretendido, 4, 5, ser obtido, e depois adicionou-se um volume igual de agua destilada e subsequentemente albumina do soro bovina foi adicionada para uma concentração final de 10 rng/25 ml, usando uma solução concentrada de 10 mg/rnl.

tecido de pepino ficou totalmente macerado dentro de 24 horas, usando 1 jig de poligalacturonase II em MBA. Neste tampão o tecido de pepino riáoé macerado na ausência de poligalae— turonase I. A maceração de tecido de pepino em MSB foi testada na ,55

ausência dei poligalaoturonase ou na presença cie 10 jig de poliga— lacturonase I ou poligalaoturonase II, respectivamente» Novamente, a maceração não é observada na ausência de enzima ou na presença de poligalaoturonase I, enquanto a poligalaoturonase Ii macera totalmente o tecido de pepino.. PG5II preparado de acordo com o Exemplo 10 tem também propriedades de maceração..

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y

159

Microorganismos depositados:

Os microorganismos e fagos que se seguem foram depositados na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg 18, D-3300 Braunschweig:

Microorgan ismos::	DSM-N2. :: 5505	Data do Depósito 30 de Agosto, 1989
Escherichia pGWISOO	coli	JM109/
Escherichia pGW1900	coli	DH5«F’ /	5866	21	de Março, 1990
Escherichia pGW17S6	coli	DH5aF, y	5942	18	de Maio, 1990
Escherichia pfâW1910	coli	DH5«F·’ /	5943	18	de Maio, 1990
Escherichia PGW1911	coli	DHSáF’ /	5944	18	de Maio, 1990
Escherichia	coli.	LE 392	5941	18	de Maio, 1990

Fago©: todo© em 18 de Maio,

1990

XPG-A9	5945
XPG-AIO	5951
XPG-A43	5964
XPG-B4	5949
XPG-B35	5960
XPG-B36	5961
XPG-C1	5948
XPG-C16	5954
XPG-C20	5956
XPG-C37	5962
XPG-D8	5947
ÀPG-Dll	5952
XPG-D12	5953
ÀPG-E6	5946
ÀPG-E38	5963
XPG-F5	5950
XPG-G17	5955
ÀPG-G27	5957
XPG-X31	5958
ÀPG-Y33	5959

Listagern..j:te....^gulncias

TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotídeos com polipeptídeo correspondente COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 2495 pares de bases TIPO DE CADEIA: dupla

TOPOLOGIA: linear

TIPO DE MOLÉCULA: genómica

ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Aspergillu© niger N400

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA: Plasmideo pGWl.900 (DSM 5866)

CARACTERÍSTICAS: Gene pgal codificador da prepro-poligalacturonf se I de A„___nigerN400

de	1	a	909:	região do promotor
de	901	a	963:	região codificadora do peptideo sinal PCI
de	901	a	1002:	região codificadora da prepro-sequêncía PGI
de	1.003	a	2127:	região codificadora de PGI madura
de	1138	a	1189:	intrão
de	1610	a	1671:	intrão
de	2138	a	2130:	codão de paragem
de	2131	a	2495:	região não codificadora 3’ , parte da região

do terrninador da transcrição

GAATTCGGAA GAATGTCTGC GTTCGTGCGC ACAACGACGT 40

TCCTAAAATT TATCCGATGA TCAACCGAGG AACCAGGGTC 80

GAACCCCTGA AAGGAATCTC GCCGAAAGGA TCAATCATAT 120

TGATTCGCGG ACCCTGTAAA GTGCCCTAAA GGGTCTTTGC 160

- CACTCGATAG TGGGATCGGC ACTGGCAGTT TCTAGTCTCG 200

TCAGTGCGGC CATTTCCGAC CGATCCGTAG TGCTGGTGGG 240

TGAGTCCCAG AGCAGTCTAT ATCGATATCA TCACCAAATT 280

CCAAGGACCG TGGGATGACG AGTATGCATT GGCACTGAGA 320

ATTGCCGAGA TCATGCCCCC GTCCTGGAGG TGCATCCATC 360

162

AAGCATGTTG	CGACAGAGTG	AAACAGCGTG	GATAAGCCGG '':	400
ATGGGGCAGA	TGGGGGAAGA	GAGCGAGACA	CGGCATCAGC	440
AGTGGAGATG	CCGAGAAGTG	CCGAGAGCCG	CCGATGCTTC	480
GACCTTCAGC	CCAAGCGTCA	ATCCATGCCT	TCTTGGGTCA	520
GGGTTGGCCG	GACTGTAAGC	CCGTTAGCGT	CTGAGATACG	560
CCGGATGACA	CGAACCTTGG	TGCTTACCAA	TGCTGTGATG	600
CATGCAGTGC	CGGCGGTATC	CCTGGCTGAA	GCGCCCATCG	640
CCGTTAGAGA	TTGATACCCG	GGTGGATCGG	AGGGTCCCCT	680
TGGTCTTTCC	ACCAATAATG	GAGGTATCTC	ACTGCTTTGT	720
TCAGGAACAG	AAGCTTAGCA	TGGACCAGTC	TTTCACGTAT	760
AAAACTCTCC	AGGACTTCCG	TCGTTGAGAT	GCTCTATCCA	800
ACAACACCTC	ACTCTTCCAC	TCCTTGTTCT	TTCTTTCTGT	840
TGACCAGACC	CCATCCATTC	TTTTGGCCGA	AACCTGTTCT	880
GTTGACCAGA	ACCTATACCA	ACAATCACC ATG CAC TCT Met His Ser	918

TAC Tyr

CAG Gin 5

CTT Leu

CTT GGC CTG GCC GCT

GTC GGC

TCC Ser

CTC Leu 15

954

Leu

Gly

Leu

Ala 10

Ala

Vai

Gly

GTC

TCT

GCC

GCC

CCC

GCT

CCT

TCT

CGC

GTC

TCC

GAG

990

Vai

Ser

Ala

Ala

Pro 20

Ala

Pro

Ser

Arg

Vai 25

Ser

Glu

TTC

GCT

AAG

AAG

GCC

TCT

ACC

TGC

ACC

TTC

ACC

TCT

1026

Phe

Ala

Lys 30

Lys

Ala

Ser

Thr

Cys 35

Thr

Phe

Thr

Ser

GCC

TCT

GAG

GCC

AGC

GAG

AGC

ATC

TCC

AGC

TGC

TCC

1022

Ala 40

Ser

Glu

Ala

Ser

Glu 45

Ser

Ile

Ser

Ser

Cys 50

Ser

GAT

GTT

GTC

CTG

AGC

AGC

ATC

GAG

GTC

CCC

GCT

GGC

1098

Asp

Vai

Vai

Leu 55

Ser

Ser

Ile

Glu

Vai 60

Pro

Ala

Gly

•L63 GAG ACC CTC GAC CTG TCC GAT GCT GCT GAT GGC TCC 1134

Glu Thr Leu Asp Leu Ser Asp Ala Ala Asp Gly Ser

70 75

ACC GTATGTGCTC TCAGCCGTCT TCCATCCTGG CTATCACGCT 1177 Thr

AACACCATCT AG ATC ACC TTC GAG GGC ACC ACT TCC TTC 1216 Ile Thr Phe Glu Gly Thr Thr Ser Phe

85

GGA TAC Gly Tyr

AAG Lys

GAA TGG AAG GGC CCC CTG ATC CGC TTC

1252

Glu Trp 90

Lys

Gly Pro Leu

Ile 95

Arg

Phe

GGT

GGT

AAG

GAT

CTG

ACT

GTC

ACC

ATG

GCC

GAC

GGC

1288

Gly

Gly

Lys

Asp

Leu

Thr

Vai

Thr

Met

Ala

Asp

Gly

100

105

GCT

GTC

ATC

GAC

GGT

GAC

GGT

TCC

CGC

TGG

TGG

GAC

1324

Ala

Vai

Ile

Asp

Gly

Asp

Gly

Ser

Arg

Trp

Trp

Asp

110

115

120

AGC

AAG

GGT

ACC

AAC

GGT

GGC

AAG

ACC

AAG

CCC

AAG

1360

Ser

Lys

Gly

Thr

Asn

Gly

Gly

Lys

Thr

Lys

Pro

Lys

125

130

TTC

ATG

TAC

ATC

CAC

GAT

GTT

GAG

GAC

TCG

ACC

TTC

1396

Phe

Met

Tyr

Ile

His

Asp

Vai

Glu

Asp

Ser

Thr

Phe

135

140

145

AAG

GGC

ATC

AAC

ATC

AAG

AAC

ACT

CCC

GTC

CAG

GCC

1432

Lys

Gly

Ile

Asn

Ile

Lys

Asn

Thr

Pro

Vai

Gin

Ala

150 155

1.64

ATC Ile

AGT GTC CAG

GCT ACC

AAC GTC CAC CTG

AAC Asn

GAC Asp

1468

Ser

Vai 160

Gin

Ala

Thr

Asn

Vai 165

His

Leu

TTC

ACC

ATC

GAC

AAC

TCC

GAC

GGT

GAT

GAC

AAC

GGT

1504

Phe

Thr

Ile

Asp

Asn

Ser

Asp

Gly

Asp

Asp

Asn

Gly

170

175

180

GGC

CAC

AAC

ACC

GAC

GGT

TTC

GAC

ATC

AGC

GAG

TCT

1540

Gly

His

Asn

Thr

Asp

Gly

Phe

Asp

Ile

Ser

Glu

Ser

185

190

ACC

GGT

GTC

TAC

ATC

AGC

GGT

GCT

ACC

GTC

AAG

AAC

1576

Thr

Gly

Vai

Tyr

Ile

Ser

Gly

Ala

Thr

Vai

Lys

Asn

195

200

205

CAG

GAC

GAC

TGC

ATT

GCC

ATC

AAC

TCT

GGC

GAG

1609

Gin

Asp

Asp

Cys

Ile

Ala

Ile

Asn

Ser

Gly

Glu

210

215

GCACGATATC CCTATTCCAC TATCATTCCT TCCATTCATA 1649

TCGCTAACAA TCAAACCCAC AG AGC ATC TCT TTC ACC 1686

Ser Ile Ser Phe Thr

220

GGC Gly

GGT ACC Gly Thr

TGC TCC

GGT GGC CAC GGT

CTC TCC ATC

1722

Cys 225

Ser

Gly

Gly His Gly 230

Leu

Ser

Ile

GGC

TCT

GTC

GGT

GGC

CGT

GAT

GAC

AAC

ACC

GTC

AAG

1758

Gly

Ser

Vai

Gly

Gly

Arg

Asp

Asp

Asn

Thr

Vai

Lys

235

240

245

AAC GTG ACC ATC TCC

GAC Asp

TCC Ser

ACT GTC AGC AAC

TCC Ser

1794

Asn

Vai

Thr

Ile

Ser 250

Thr

Vai

Ser 255

Asn

GCC

AAC

GGT

GTC

CGC

ATC

AAG

ACC

ATC

TAC

AAG

GAG

1830

Ala

Asn

Gly

Vai

Arg

Ile

Lys

Thr

Ile

Tyr

Lys

Glu

260

265

ACC

GGT

GAT

GTC

AGC

GAG

ATC

ACC

TAC

TCT

AAC

ATC

1866

Thr

Gly

Asp

Vai

Ser

Glu

Ile

Thr

Tyr

Ser

Asn

Ile

270

275

280

CAG

CTC

TCC

GGA

ATC

ACC

GAC

TAC

GGT

ATC

GTC

ATC

1902

Gin

Leu

Ser

Gly

Ile

Thr

Asp

Tyr

Gly

Ile

Vai

Ile

285

290

GAG

CAG

GAC

TAC

GAG

AAC

GGC

TCT

CCC

ACC

GGC

ACC

1938

Glu

Gin

Asp

Tyr

Glu

Asn

Gly

Ser

Pro

Thr

Gly

Thr

295

300

305

CCC

TCC

ACC

GGT

ATC

CCC

ATC

ACT

GAT

GTC

ACC

GTT

1974

Pro

Ser

Thr

Gly

Ile

Pro

Ile

Thr

Asp

Vai

Thr

Vai

310

315

GAC

GGT

GTC

ACC

GGT

ACT

CTC

GAG

GAT

GAC

GCC

ACC

2010

Asp

Gly

Vai

Thr

Gly

Thr

Leu

Glu

Asp

Asp

Ala

Thr

320

325

CAG

GTC

TAC

ATT

CTC

TGC

GGT

GAC

GGC

TCT

TGC

TCT

2046

Gin

Vai

Tyr

Ile

Leu

Cys

Gly

Asp

Gly

Ser

Cys

Ser

330

335

340

GAC

TGG

ACC

TGG

TCC

GGT

GTT

GAC

CTC

TCT

GGT

GGC

2082

Asp

Trp

Thr

Trp

Ser

Gly

Vai

Asp

Leu

Ser

Gly

Gly

345

350

168

AAG ACC AGC GAT AAA TGC GAG AAC GTT CCT TCC GGT 2118

Lys Thr Ser Asp Lys Cys Glu Asn Vai Pro Ser Gly

355 360 365

GCT TCT TGC TAA ATCGTTCCTC CGGATGCGAG GCAACGTCTG 2160 Ala Ser Cys

368

TAGGACGTCT GGTTGTATAT ATCGATCCAC ACTTGACATG 2200 TACTAGTTAG GTGGTTTTAC TGCCATAGTG TTAGTGAATA 2240 ATAGGAGCTT TGCTCAATAT GTGAATTTGT AGCAGAAGTA 2280 AATGAGTAGA CTGATAGAGG TAATGATGAA AGATAGAATT 2320 TAATACCAGG TGATGAAGTT AATAACGGGG TGAATTAGGG 2360 CGCGTAGGCT TAGGTATATA AGTTGTCATC CCTCACACTC 2400 GAAATCTCTT CCTCTTTCTT ATATCTTCCA ACCTCTGAAC 2440 CACCAGTTGC CTCCACAGAC TAACAAGATT CTTCTATATC 2480 GATGCTTGAT CTCAA 2495

167

SEQ.......ID NO.. 2

TIPO DE SEQUÊNCIA:: Nucleotideos com polipeptideo correspondente CUMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 3031 pares de bases TIPC DE CADEIA:: dupla

TOPOLOGIA:: linear

TIPO DE MOLÉCULA: genómica

ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Aspergillus niger N400

FONTE EXPERIMENTAL.. IMEDIATA: Plasmídeo pGWlBOO (DSM 5505)

CARACTERÍS-	TICAS::	Gene pgaL	[ codificador da prepro-poligalacturo
nase II de	A., niger N400
de 1 a	1.356:	região	do promotor
de 1367 a	1.419:	região	codificadora do peptídeo sinal PGI
de 1357 a	1437::	região	codificadora da prepro-sequência PGI.
de 1438 a	2494:	região	codificadora de PGI madura
de 1.987 a	2038::	intrão
de 2495 a	2497:	codao <	de paragem
de 2498 a	3031.::	região	nao codificadora 3’ , parte da região

	dc te»	''ininador da	transcrição
TCTAGAAGCA	CTTCCCGTGG	TGGAGAACAT	AACACGCTGG	40
TTAATCTGCT	TGACGAACGC	GTTGTCTCCA	GGTCAGAGCA	80
TGACTCCCTC	TCAATATAGC	TGGCTTCTAC	AACCTTGAAA	120
ATAGGGGTAA	TGGAGCGAAT	CCGGCTAGAA	GAGGGTAATG	160
AACGGGACAA	TATGGTTCAC	CTGCCATGAT	GGAATAGTGT	200
GCGCACTGGT	GGCTTCCGAT	GCACCAGACT	CAGACATAAA	240
CCGTTTTGCG	CCAGCACTAC	TTTGTCCTCC	TGCCCCGAGG	280
AATGAATCCA	ATAGGAGGAA	TGTCGATATT	CGCGCTCGAT	320
AGCATCACTC	GGATATCGAG	AATACCGGGC	TGAGGTTGTT	360
GCAGGTGGAA	AGATTTGCTC	AATCTGTATC	GAAAAAACGT	400
AACTTGATGA	ATGACCTTTC	AACAACTAAC	CGCCCCTATC	440
CACTGCTGTG	ACCAGTATAG	TCCACCGGAT	TCGCTCACCG	480

168 ·

TTAGCCAGTG

TCTTGACTGG

CTTTCGACCC

TTTAGCTGTC

ATCTCGAATC

GATTACGCTC

CGTTCATTGG

GACCCTGCAT

AGCTGTCTTC

AATCTCGGGA

TACGGCTGCT

ACGTGCCAAT

TGCCCTTTTT

TTGCCTTCTT

CGCGGAACCC

AAATTAATCG

AAACGCAATA

ATCCAGGGTC

ATGAACTTTT

TATAAGAACC

TCATCATTCC

CCTTCTGTCA

GCTTCCTCCT

CCCCACTCCA

TGATTAGCGA

GAAGGAACGG

TCTGATATTA

CGGAATCTGG

TGGAACTAGC

TTCAGGCTGC

TCGTACTCGT

TCAACGATGG

TGTGAAGGCC

TCAGCGGTAC

GACAATAGGT

TCCACCGACA

GTCGGCTGAT

GCCACTCATG

TTTGAGACAA

CTACATTTCC

CGACCGGAAA

TCGTACCTGC

ACACTCATTC

TTCTTTTCTA

TTTTCGTCAT

GGTTGCTTGT

GCTTTGCGCA

ATGGACGCTG

ACATTGGCTA

CACACAGGGA

AAAGCACCAT

AGCCTTACTA

ACACTGCAGT

CATCCGCTTC

AATTATAGTG

ATACAAACGC

TTACCCTCGG

TGCGCATCCG

CAGCCACGCA

TCGAACTGAG

CACCTCAATA

TCCAGGGGCT

AGATTCGCAA

TCACACTGAT

AAAATCTTAC

TTGTTAACAA

520 560 600 640 680 720 760 800 840 880 920 960 1000 1040 1080 1120 1160 1200 1240 1280 1320 CAC 1362 His

CTTTTCCTCT ?

TGCCGGCAAG

CTATTCCTGA

CGCTAGTTTC

CAGACTAGCC

GTTTATGGAC

AATTGCCGCG

GGATTAGTAT

ACCGGCCTGG CTCCAGGACT TTGCTTGTTT TTCTCTATCT GAGCGGAGCT TTCCATCACC CGGCTGGTAT GTTCACGGGA TGAAACGAGG GTCGGCAGTT TAGTCGTGAG GTCTACTTGC CAACAACACT TTAATC ATG Met 1

TCG	TTT	GCT	TCT	CTT	CTC	GCC	TAC	GGC	CTG	GTC	GCC
Ser	Phe	Ala 5	Ser	Leu	Leu	Ala	Tyr 0	Gly	Leu	Vai	Ala
GGC	GCC	ACC	TTC	GCT	TCT	GCC	TCT	CCT	ATC	GAA	GCT
Gly 15	Ala	Thr	Phe	Ala	Ser 20	Ala	Ser	Pro	Ile	Glu 25	Ala

1398

1434

CGA	GAC	AGC	TGC	ACG	TTC	ACC	ACC	GCT	GCC	GCT	GCT
Arg	Asp	Ser	Cys	Thr	Phe	Thr	Thr	Ala	Ala	Ala	Ala
			30					35

1470 ,169 -

AAA GCG Lys Ala

GGC Gly

AAG GCG AAA TGC

TCT ACT ATC ACC CTT

1506

Lys Ala

Lys

Cys 45

Ser Thr

Ile

Thr

Leu 50

40

AAC

AAC

ATC

GAA

GTT

CCA

GCT

GGA

ACC

ACC

CTC

GAC

1542

Asn

Asn

Ile

Glu

Vai

Pro

Ala

Gly

Thr

Thr

Leu

Asp

55

60

CTG

ACC

GGT

CTC

ACC

AGC

GGT

ACC

AAG

GTC

ATC

TTC

1578

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

Ser

Gly

Thr

Lys

Vai

Ile

Phe

65

70

GAG

GGC

ACC

ACG

ACC

TTC

CAG

TAC

GAA

GAA

TGG

GCA

1614

Glu

Gly

Thr

Thr

Thr

Phe

Gin

Tyr

Glu

Glu

Trp

Ala

75

80

85

GGC

CCC

TTG

ATC

TCC

ATG

AGT

GGC

GAA

CAT

ATC

ACC

1650

Gly

Pro

Leu

Ile

Ser

Met

Ser

Gly

Glu

His

Ile

Thr

90

95

GTC

ACT

GGT

GCC

TCC

GGC

CAC

CTC

ATC

AAT

TGC

GAT

1686

Vai

Thr

Gly

Ala

Ser

Gly

His

Leu

ile

Asn

Cys

Asp

100

105

110

GGT

GCG

CGC

TGG

TGG

GAT

GGC

AAG

GGA

ACC

AGC

GGA

1722

Gly

Ala

Arg

Trp

Trp

Asp

Gly

Lys

Gly

Thr

Ser

Gly

115

120

AAG

AAG

AAG

CCC

AAG

TTC

TTT

TAC

GCC

CAT

GGC

CTT

1758

Lys

Lys

Lys

Pro

Lys

Phe

Phe

Tyr

Ala

His

Gly

Leu

125

130

GAC

TCC

TCG

TCT

ATT

ACT

GGA

TTA

AAC

ATC

AAA

AAC

1794

Asp

Ser

Ser

Ser

Ile

Thr

Gly

Leu

Asn

Ile

Lys

Asn

135

140

145

ACC CCC Thr Pro	CTT ATG GCG TTT	AGT GTC Ser Vai	CAG GCG AAT*GAC Gin Ala Asn Asp 155	1830
Leu Met 150	Ala	Phe
ATT ACG	TTT ACC	GAT	GTT	ACC ATC	AAT AAT GCG GAT	1866
Ile Thr 160	Phe Thr	Asp	Vai	Thr Ile 165	Asn Asn Ala Asp 170
GGC GAC	ACC CAG	GGT	GGA	CAC AAC	ACT GAT GCG TTC	1902
Gly Asp	Thr Gin	Gly 175	Gly	His Asn	Thr Asp Ala Phe 180
GAT GTT	GGC AAC	TCG	GTC	GGG GTG	AAT ATC ATT AAG	1938
Asp Vai	Gly Asn 185	Ser	Vai	Gly Vai 190	Asn Ile Ile Lys
CCT TGG	GTC CAT	AAC	CAG	GAT GAC	TGT CTT GCG GTT	1974
Pro Trp 195	Vai His	Asn	Gin 200	Asp Asp	Cys Leu Ala Vai 205
AAC TCT	GGC GAG	GTAAGCAGCT CTGCATATAT GCTTGATTCG	2016

Asn Ser Gly Glu 210

TAATTATATT GATATTCTAT AG AAC ATC TGG TTC ACC GGC 2056 Asn Ile Trp Phe Thr Gly

215

GGC Gly

ACC Thr

TGC Cys

ATT GGC

GGC CAC GGT CTC TCC ATC GGC

2092

Ile 220

Gly

Gly His Gly

Leu 225

Ser

Ile

Gly

TCT

GTC

GGC

GAC

CGC

TCC

AAC

AAC

GTC

GTC

AAG

AAC

2128

Ser

Vai

Gly

Asp

Arg

Ser

Asn

Asn

Vai

Vai

Lys

Asn

230

235

240

GTC Vai

ACC ATC

GAA CAC Glu His 245

TCC ACC GTG AGC AAT

TCC 'GAA

2164

Thr

Ile

Ser

Thr

Vai

Ser

Asn 250

Ser

Glu

AAC

GCC

GTC

CGA

ATT

AAG

ACC

ATC

TCT

GGC

GCC

ACT

2200

Asn

Ala

Vai

Arg

Ile

Lys

Thr

Ile

Ser

Gly

Ala

Thr

255

260

GGC

TCC

GTG

TCC

GAG

ATT

ACG

TAC

TCC

AAC

ATC

GTC

2236

Gly

Ser

Vai

Ser

Glu

Ile

Thr

Tyr

Ser

Asn

Ile

Vai

265

270

275

ATG

TCT

GGC

ATC

TCC

GAT

TAC

GGC

GTG

GTC

ATT

CAG

2272

Met

Ser

Gly

Ile

Ser

Asp

Tyr

Gly

Vai

Vai

Ile

Gin

280

285

CAG

GAT

TAC

GAA

GAC

GGC

AAG

CCT

ACG

GGT

AAG

CCG

2308

Gin

Asp

Tyr

Glu

Asp

Gly

Lys

Pro

Thr

Gly

Lys

Pro

290

295

300

ACG

AAC

GGT

GTC

ACT

ATT

CAG

GAT

GTT

AAG

CTG

GAG

2344

Thr

Asn

Gly

Vai

Thr

Ile

Gin

Asp

Vai

Lys

Leu

Glu

305

310

AGC

GTG

ACT

GGT

AGC

GTG

GAT

AGT

GGG

GCT

ACT

GAG

2380

Ser

Vai

Thr

Gly

Ser

Vai

Asp

Ser

Gly

Ala

Thr

Glu

315

320

ATC

TAT

CTT

CTT

TGC

GGG

TCT

GGT

AGC

TGC

TCG

GAC

2416

ile

Tyr

Leu

Leu

Cys

Gly

Ser

Gly

Ser

Cys

Ser

Asp

325

330

335

TGG

ACC

TGG

GAC

GAT

GTG

AAA

GTT

ACC

GGG

GGG

AAG

2452

Trp

Thr

Trp

Asp

Asp

Vai

Lys

Vai

Thr

Gly

Gly

Lys

340

345

- 172 —

'χ

AAG	TCC	ACC	GCT	TGC	AAG	AAC	TTC	CCT	TCG	GTG	GCC
Lys	Ser	Thr	Ala	Cys	Lys	Asn	Phe	Pro	Ser	Vai	Ala
	350					355					360

TCT TGT TAG GCTGCTAGGT TGGTGAGTTG TAGCCCTAGC 2527 Ser Cys

362

TGAAATTCGT CTGCTTCGTC TGCTTCGTCT GCTTCGTCTG 2567 CTTCGTCTGC TTCTTCTGCT TCGTCTGCTT TGTCTGCTTT 2607 GTCTGCTTCG TCCACTTCGT CCACTTCGAC TGGTTAGATG 2647 GGCCTTGTAA TAGTTTTTAG AGAGAACAGA ATATGTACAG 2687 TAAGCCTTAG AGGTGGTACC GAGTTGTATA TTTATTTAAA 2727 ATGTTACCTA TCGCGTGTCT TTATATTTAT AGCCTTTTAC 2767 ATATATACGG AGCTACAGTG GATTATCTTA CAGCCCACAC 2807 TCATCGTGCT GGGAACTACG TGAATGAATG CTCGGTTAGA 2847 AGGCCTTGCT CACTGCCACA ACCAACCAGG AACCTTGGCA 2887 GGTACATGCT TGGGCATTTT TGTCTGGCCC TATCTCTTTC 2927 CAGATGGTGG TCTGGATGAG TCACGGCACG AGTAGATTGA 2967 CCGCTACTCC AACCCGCGCA TAAAGCATAC GCCAGAAGTG 3007 CAAGGGATAC AAGACAGCCA GCTG 3031 ·· 1.73

SEP.....ID IMO.. 3

TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotideos corn polipeptídeo corresponplente COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 3047 pares de bases TIPO DE CADEIA: dupla

TOPOLOGIA: linear

TIPO DE MOLÉCULA: genõmica

ORGANISMO FONTE ORIGINAL: Aspergillus niger NW756

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA: Plasmídeo pGW1756 (DSM 5942)

CARACTERÍSTICAS: Gene pgall codificador da prepro-poligalacturo

n ase	II de	A„ nigerNW1756
de	1 a	889:	região	do promotor
de	890 a	952:	região	codificadora do	peptideo sinal PGI
de	890 a	970:	região	codificadora da	prepro—sequência P
de	971 a	202.7:	região	codificadora de	PGI madura
de	1520 a	1571:	intrão
de	2028 a	2030:	codão t:	:le paragem
de	2031 a	3047:	região	não co di f ic a dor <	a 3’ , parte da regi

do terrninador da transcrição

CCGGATTTGC	TCACCGTTGG	CCAATGGCTT	CCTCCTTTCC	40
TGTCTTCTCC	TTCCTCTCCT	TGACTGGCCC	CACTCCAGGT	80
TGCTTATTGC	CGGCAAGCTT	TCAACCCTGA	TTAGCGAGCT	120
TTGCACACTA	TTCCCGATGT	AGCTGTCGAA	GGAACGGATG	160
GACGCTGCAC	TAGTTTCATT	TCGAATCTCT	GATATTAATA	200
CTAACTACAG	AGTGACTAGC	CGATCACGCT	CCGGATCTGG	240
CACAGAGTGA	TTTTTTGAAT	CATTCATTGG	TGGAATTTGC	280
AAGGCACCAT	AAATGCCGCA	GACCCTGCAT	ATCGAGCTAC	320
AGCCTTACTG	GGATTAGTAT	AGCTGCCATC	TCGTACTCGT	360
ACACTGCAGA	ACCGGCTTGG	ATCCCAAGGC	CTACGATGAC	400
ACCCGTTTCC	TCCAGGACTG	ATGGCTGTTT	GTGAAGGCGA	440
ATTATAGTAC	TGCTTGTCAA	TGTCTTGAGT	CAGCGGTATA	480

174 TATGAATCTG TCTTTGTCTT TCCACCTTGA CAATAATGTT . · 520 ACGCTCAAGA GGGCATTTTG CGTTCTTTTC ATCGACATGC 560 GAACCTGTTC GGTCACCCGC GGACCCCGTC GGCTGATCAG 600 CCACCACGGC TCATATATAT TAGTTGCCCA CCATGTCGAA 640 CTTAAGTTCA TTAAAAAAAA GGTAACATTT GAGACAATAT 680 CTTAATGTGA AACGTGAACC CTGGACTAGC ATCTCTCCAG 720 AGGCTGTCGG CAGTTATGAC TTTCCGATCA GAAGAGATGC 760 GCTGAAATTG TGACTATAAG AACCTCAAGC CTGCCGATGC 800 TGAGGTGAGT TTGCTCATCA TCCTACACTC ATTTGGCATC 840 AGACCGATTA CACTCTTTTT GTCCTTTTTT TCTATCGCTA 880

TCATTGACC ATG CAC TCC TTT GCT TCT CTT CTG GCC . 916

Met His Ser Phe Ala Ser Leu Leu Ala 1 5

TAC Tyr 10

GGC CTA

GCC GCC

AGC Ser 15

GCC ACC CTC GCT TCT

GCC Ala

952

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

Thr Leu

Ala

Ser 20

TCC

CCC

ATC

GAA

GCC

CGG

GGA

AGC

TGC

ACC

TTC

AAA

988

Ser

Pro

Ile

Glu

Ala

Arg

Gly

Ser

Cys

Thr

Phe

Lys

25

30

ACG

GCT

GCT

GCT

GCC

AAA

GCG

GGC

AAG

GCA

GGG

TGC

1024

Thr

Ala

Ala

Ala

Ala

Lys

Ala

Gly

Lys

Ala

Gly

Cys

35

40

45

TCT

ACC

ATC

ACC

CTT

GAC

AAC

ATC

GAA

GTC

CCC

GCT

1060

Ser

Thr

Ile

Thr

Leu

Asp

Asn

Ile

Glu

Vai

Pro

Ala

50

55

GGA

ACC

ACC

CTC

GAC

CTG

ACC

GGT

CTC

ACC

AGC

GGT

1096

Gly

Thr

Thr

Leu

Asp

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr

Ser

Gly

60

65

ACG

AAG

GTC

ATC

TTC

GAG

GGC

ACC

ACG

ACC

TTC

GAT

1132

Thr

Lys

Vai

Ile

Phe

Glu

Gly

Thr

Thr

Thr

Phe

Asp

70

75

80

TAT Tyr

GAA GAA TGG GCA

GGC CCC TTG ATC TCC

ATG Met

AG'T Ser

1168

Glu Glu

Trp 85

Ala

Gly

Pro

Leu

Ile 90

Ser

GGC

AAA

GAT

ATC

ACC

GTC

ACT

GGT

GCC

TCA

GGC

CAT

1204

Gly

Lys

Asp

Ile

Thr

Vai

Thr

Gly

Ala

Ser

Gly

His

95

100

105

CTC

ATC

AAC

TGC

GAC

GGT

GCG

CGG

TGG

TGG

GAC

GGC

1240

Leu

Ile

Asn

Cys

Asp

Gly

Ala

Arg

Trp

Trp

Asp

Gly

110

115

AAG

GGG

ACC

AGC

GGA

AAG

AAG

AAG

CCC

AAG

TTC

TTC

1276

Lys

Gly

Thr

Ser

Gly

Lys

Lys

Lys

Pro

Lys

Phe

Phe

120

125

TAC

GCT

CAT

GGC

CTT

GAC

TCC

TCG

TCC

ATT

ACT

GGA

1312

Tyr

Ala

His

Gly

Leu

Asp

Ser

Ser

Ser

Ile

Thr

Gly

130

135

140

TTG

AAT

ATC

AAG

AAC

ACT

CCC

CTT

ATG

GCG

TTT

AGT

1348

Leu

Asn

Ile

Lys

Asn

Thr

Pro

Leu

Met

Ala

Phe

Ser

145

150

GTT

CAG

GCG

GAT

GAC

ATC

ACT

CTG

ACT

GAC

ATT

ACC

1384

Vai

Gin

Ala

Asp

Asp

Ile

Thr

Leu

Thr

Asp

Ile

Thr

155

160

165

ATC

AAC

AAC

GCG

GAC

GGT

GAT

ACC

CTG

GGT

GGA

CAC

1420

Ile

Asn

Asn

Ala

Asp

Gly

Asp

Thr

Leu

Gly

Gly

His

170

175

AAC

ACT

GAT

GCG

TTT

GAT

GTT

GGT

AAC

TCT

GTC

GGT

1456

Asn

Thr

Asp

Ala

Phe

Asp

Vai

Gly

Asn

Ser

Vai

Gly

180

185

GTG AAT ATC ATC	AAA CCG	TGG GTC CAT AAC CAG GAT	1492
Vai 190	Asn	Ile	Ile	Lys	Pro 195	Trp Vai	His	Asn Gin Asp 200
GAC	TGT	CTT	GCG	ATC	AAC	TCT	GGC	GAG	GTAAGCAGCT	1529
Asp	Cys	Leu	Ala	Ile	Asn	Ser	Gly	Glu

205 210

TTGAACATAG ATTTGATTTG CATGTATGTT GATATTCTAT AG 1571

AAC ATC TGG

TTT ACC

AGC GGC ACC TGC ATT

GGC GGC

1607

Asn

Ile

Trp

Phe

Thr 215

Ser

Gly

Thr Cys

Ile 220

Gly

Gly

CAC

GGT

CTC

TCC

ATC

GGT

TCT

GTC

GGC

GGC

CGC

TCC

1643

His

Gly

Leu

Ser

Ile

Gly

Ser

Vai

Gly

Gly

Arg

Ser

225

230

AAC

AAC

GTT

GTC

AAG

AAC

GTC

ACT

ATC

GAA

CAC

TCC

167 9

Asn

Asn

Vai

Vai

Lys

Asn

Vai

Thr

Ile

Glu

His

Ser

235

240

245

ACC

GTG

AGC

AAT

TCC

GAG

AAC

GCC

GTC

CGG

ATT

AAG

1715

Thr

Vai

Ser

Asn

Ser

Glu

Asn

Ala

Vai

Arg

Ile

Lys

250

255

ACC

GTC

TCT

GGT

GCC

ACT

GGT

TCC

GTG

TCT

GAG

ATC

1751

Thr

Vai

Ser

Gly

Ala

Thr

Gly

Ser

Vai

Ser

Glu

Ile

260

265

270

ACA

TAC

TCC

AAC

ATT

GTC

ATG

TCC

GGC

ATC

TCC

GAT

1787

Thr

Tyr

Ser

Asn

Ile

Vai

Met

Ser

Gly

Ile

Ser

Asp

275

280

- 177

TAC GGC

GTC Vai 285

GTT Vai

ATC Ile

CAG CAG GAT TAC GAG GAT

GGC Gly

1823

Tyr

Gly

Gin

Gin Asp 290

Tyr

GlU

Asp

AAG

CCT

ACG

GGT

AAG

CCC

ACG

AAC

GGT

GTC

ACT

ATT

1859

Lys

Pro

Thr

Gly

Lys

Pro

Thr

Asn

Gly

Vai

Thr

Ile

295

300

305

ACG

GAT

GTC

AAG

CTG

GAG

AGC

GTG

ACT

GGT

ACT

GTG

1895

Thr

Asp

Vai

Lys

Leu

Glu

Ser

Vai

Thr

Gly

Thr

Vai

310

315

GAT

AGT

AAG

GCT

ACT

GAT

ATC

TAT

CTC

CTT

TGC

GGA

1931

Asp

Ser

Lys

Ala

Thr

Asp

Ile

Tyr

Leu

Leu

Cys

Gly

320

325

330

TCT

GGT

AGC

TGC

TCG

GAC

TGG

ACT

TGG

GAC

GAT

GTG

1967

Ser

Gly

Ser

Cys

Ser

Asp

Trp

Thr

Trp

Asp

Asp

Vai

335

340

AAG

GTC

ACT

GGA

GGA

AAG

AAG

TCT

ACT

GCT

TGC

AAA

2003

Lys

Vai

Thr

Gly

Gly

Lys

Lys

Ser

Thr

Ala

Cys

Lys

345

350

AAC

TAC

CCT

TCG

GTG

GCT

TCT

TGC

TAG

GTTAGTAGGT

2040

Asn

Tyr

Pro

Ser

Vai

Ala

Ser

Cys

355

360

362

TGTTCGGTTG TAGCACTTGC TAACATGCAT TTGCCTTGAG 2080 GGGTCAAATG GATTTGTGAA ATTATCGGTG TGAAAGAAGA 2120 GATGGTGTCC AGTAAGATTC AGTGGTGGCA GCGTGTATAG 2160 CTCTATACAA TGTTATTTAT CGCATAACTC TATATATCAA 2200 ATACTCGATT AAGAGAACCT GCCTTCAGCC ACAAATAACC 2240 AAGTTCCTCG GCAGGTATCA GATTCCGGGA ACCCCTACCT 2280 AGCCTTACTC CGTTGCAGAT AGTTCTGCTG GTAAATCAGG 2320 ATGGTATGCT GAATTACGAT GCCAGCAAAT TCACCGCTAC 2360

TCCAACCCGC	GCATAAAACA	TACGCCAGAA	GTGCAAGGGA	2400
TAAAGACAGC	CAGCTGTGTC	TTCGCGCAAG	TAACTCTGCA	2440
TAATCCAGTT	TCTGACATAG	TATAGTCATC	TCTTCTACAC	2480
CTTGGCAAAC	TCCCTCTCCA	TAAACTCCCT	CACAGTAATA	2520
AGCGTCTCCC	TCCCCTTCCC	GCCCTTGGCC	TTAAACGCCG	2560
CCTTCTTCAA	CGCCGCAGCC	GTTTGAATCT	CCGTAGGCCC	2600
ATTACCAAAG	TACTCCCCAT	CCCTAAACTG	CGAATAAATA	2640
AAAACATCCC	GCTCCTGCTC	ACGCCAATAC	TCCCCTTTCG	2680
TATTCATGTC	GTTCGGGTCC	GCTAGAACCT	CATACCGGGC	2720
TTTCTTGCCA	GTCACTATAC	CCATCACCGT	CAGCATCTAC	2760
TCATCACTCA	TCACGTAAAA	GATAATGATA	AGTAAAACCT	2800
TACCAGAAAC	AAACGTATTC	ACCACCTCCG	CCGATGAAAC	2840
AATATCACTC	GACCCCTGAA	TCAGCCGTCT	ATTCCACCGC	2880
AACGGGTTAA	CAAAAACCCC	ATGAACCAGA	TCCCCAAAGT	2920
CATCCTTCAT	ACTGATCCAG	GGGAAATCTT	CTTTCCCGCC	2960
CCAAAATGGC	GTCTTGTATG	TTAGATAACC	CTCAGAGTCA	3000
GGGAATGTGG	GCCATCCGCC	GAATAAGTCG	GCGTAGTCCG	3040
GCTCGAG				3047

·~ 179 -

SEU 1D NO. 4

TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotideos com polipeptideo correspondente COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 2304 pares de bases TIPO DE CADEIA:: dupla

TOPOLOGIA: linear

TIPO DE MOLÉCULA: genõmiea

ORGANISMO PONTE ORIGINAL: Asperglllus niger N400

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA: Plasmídeo pGWl 191.0 (DSM 5943)

CARACTERÍSTICAS: Gene pgaC codificador da prepro-poligalacturona™ se C de A,,____nlgerN4Q0

de de	1 a 663 a	662: 710:	região região	do promotor
codificadora	do peptídeo sinal PGC
de	663	a	782::	região	codificadora	da prepro-seguência PGC
de	783	a	1985:	região	codi f i o a d o ra	putativa de PGC madura
de	927	a	1001:	in tr ao
de	1428	a	1483:	intrão
de	1614	a	1666:	in trâo
de	1996	a	1998:	codão t	:le paragem
de	1990	a	2304:	região	nao codificadora 3’ , parte da região

do terminador da transcrição

CCATGGCTGA	AACTTTGCCC	CTGACCTAGT	CCATTTCATT	40
TTATATAATG	CTGATGAGAT	ATGGTTCTTG	CACAACTATG	80
CTTTTCCTCG	GTCGGTGCGT	AATGTATAGT	TCGTGGGTGG	120
TAAGGAAATT	CACCGACAGC	AACTCCCAGC	ATAACATGGA	160
GAAGAACCGA	TGAATGAGCA	GCGACAAACA	TGGTACCACA	200
ATTCTTGAAT	AAGCATTTAG	ACTCCGGCTT	GGTTTTTTCC	240
GTTGCATTGG	CGCTGGTGTT	GTTCCTGCGC	ACGGTGCAAC	280
CGTTATCTCC	ACCAATGATT	ACCTGCAGAA	AGCCCATGGC	320
TGCAACCACC	CAGCCGACTT	GAGTCCACCT	AACAGCATAC	360
TCAGCATACT	CGATGCTGGG	AATTACTTCA	GGTATGGTCG	400
GCTGAATATG	CAGTCGATTT	CCGGCGCCAG	GAACAGTCCG	440
GCCCCCTCAC	CACGGACATA	GACCCGCCAC	CAAAACGTCG	480

ATAGCGGCCT CGCTTCGTCA ACGACCATTT TGCCCACCCC ' ' 520

TGACACCCAG GAAAGACGTC TTCCAATAAC AATATAAAAG 560

GGCGAGTCTT GTCCTCTCAC TTTCCGTCTT TCGAGTATGC 600

CTTGCCAGTT CCCAACTTGA CTTGAGACCT CCCATTTCGG 640

TCATTTGTCA CCCGCTATAA GA ATG GTC CGT CAG CTT 677 Met Vai Arg Gin Leu

5

ATC CTG ATC

AGC AGT

CTG Leu

CTG GCA GCT GTT GCT GTG

713

Ile

Leu

Ile

Ser

Ser 10

Leu

Ala Ala

Vai 15

Ala

Vai

CGC

GCG

CCT

GCC

GAT

CCG

GCT

CAT

CCC

ATG

GTT

ACG

749

Arg

Ala

Pro

Ala

Asp

Pro

Ala

His

Pro

Met

Vai

Thr

20

25

GAA

GCG

CCT

GAC

GTC

AAT

TTG

GTT

GAA

AAG

AGG

GCG

785

Glu

Ala

Pro

Asp

Vai

Asn

Leu

Vai

Glu

Lys

Arg

Ala

30

35

40

ACT

ACT

TGC

ACC

TTC

TCG

GGC

TCC

GAA

GGT

GCA

TCC

821

Thr

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Ser

Glu

Gly

Ala

Ser

45

50

AAG

GCC

AGC

AAG

TCG

AAA

ACC

TCT

TGC

TCC

ACA

ATC

857

Lys

Ala

Ser

Lys

Ser

Lys

Thr

Ser

Cys

Ser

Thr

Ile

55

60

65

TAC

CTG

TCC

GAC

GTG

GCC

GTC

CCA

TCT

GGC

ACA

ACC

893

Tyr

Leu

Ser

Asp

Vai

Ala

Vai

Pro

Ser

Gly

Thr

Thr

70

75

CTT

GAT

CTC

TCT

GAC

CTG

AAT

GAT

GGA

ACC

CAC

926

Leu

Asp

Leu

Ser

Asp

Leu

Asn

Asp

Gly

Thr

His

80

85

181 ··

GTACGTTCCC CGGGTGATTC ATGTCTTATT CTCACACCCA 966

ATCGCGTCAA TAGTACTGGC TGACAGATGT ACTAG GTG ATC TTC 1010 Vai Ile Phe

CAG Gin

GGA Gly

GAA ACC ACT TTT

GGA Gly

TAC GAG GAA TGG

GAA Glu

1046

Glu

Thr Thr Phe 95

Tyr

Glu 100

Glu

Trp

GGG

CCT

CTT

GTG

CGT

GTT

TCT

GGA

ACT

GAT

ATC

ACG

1082

Gly

Pro

Leu

Vai

Arg

Vai

Ser

Gly

Thr

Asp

Ile

Thr

105

110

115

GTC

GAG

GGG

GAG

AGC

GAC

GCG

GTG

CTC

AAT

GGC

GAT

1118

Vai

Glu

Gly

Glu

Ser

Asp

Ala

Vai

Leu

Asn

Gly

Asp

120

125

GGC

AGC

CGC

TGG

TGG

GAT

GGA

GAG

GGT

GGC

AAT

GGT

1154

Gly

Ser

Arg

Trp

Trp

Asp

Gly

Glu

Gly

Gly

Asn

Gly

130

135

GGT

AAA

ACA

AAG

CCC

AAG

TTC

TTC

TAT

GCC

CAT

GAC

1190

Gly

Lys

Thr

Lys

Pro

Lys

Phe

Phe

Tyr

Ala

His

Asp

140

145

150

TTG

ACC

TCT

TCC

ACC

ATC

AAG

AGC

ATC

TAC

ATC

GAG

1226

Leu

Thr

Ser

Ser

Thr

Ile

Lys

Ser

Ile

Tyr

Ile

Glu

155

160

AAC

TCT

CCT

GTG

CAG

GTG

TTC

AGC

ATC

GAT

GGC

TCC

1262

Asn

Ser

Pro

Vai

Gin

Vai

Phe

Ser

Ile

Asp

Gly

Ser

165

170

175

182

ACT Thr	GAT CTT	ACC Thr	ATG ACT GAT ATC ACG GTG GAT AAC	1298
Asp	Leu	Met 180	Thr	Asp	Ile	Thr Vai 185	Asp Asn
ACG	GAT	GGT	GAC	ACG	GAC	GAC	CTC	GCC GCC	AAT ACG	1334
Thr	Asp	Gly	Asp	Thr	Asp	Asp	Leu	Ala Ala	Asn Thr
		190					195
GAT	GGC	TTC	GAC	ATC	GGG	GAA	AGC	ACC TAT	ATC ACG	1370
Asp	Gly	Phe	Asp	Ile	Gly	GlU	Ser	Thr Tyr	Ile Thr
200					205				210
ATC	ACA	GGT	GCC	GAA	ATC	TAC	AAC	CAA GAT	GAC TGC	1406
Ile	Thr	Gly	Ala	Glu	Ile	Tyr	Asn	Gin Asp	Asp Cys
			215					220
GTT	GCC	ATC	AAT	TCT	GGA	GAG	GTATGCGTCC CCTGGCACTG	1447
Vai	Ala	Ile	Asn	Ser	Gly	Glu
	225					230

ATTGAGAGGA GAGGCGCCTT GCTGACGAT

CTGGTAG AAC

1486

Asn

ATT	TAT	TTC	AGT	GCC	AGT	GTG
Ile	Tyr	Phe	Ser 235	Ala	Ser	Vai

GGC	CTG	TCT	ATT	GGC	TCT	GTT
Gly	Leu	Ser	Ile	Gly	Ser	Vai
	245					250

AAC	ACT	GTC	AAG	AAC	GTG	ACG
Asn	Thr	Vai	Lys	Asn 260	Vai	Thr

TGT Cys	TCT GGT GGT	CAC His	1522
Ser 240	Gly	Gly
GGT	GGT	CGG	GAT	GAT	1558
Gly	Gly	Arg	Asp	Asp 255
TTT	TAT	GAT	GTC	AAT	1594
Phe	Tyr	Asp 265	Vai	Asn

183 --

GTT CTC AAG TCC CAG CAA GGTAAGGGAA AGCATTTGAA 1632

Vai Leu Lys Ser Gin Gin

270

CCATCCGTTT GCCGTCCTCT AACGTATGCT TTA GCA ATC CGT 1674 Ala Ile Arg

275

ATC Ile

AAG ACC ATC TAC GGC GAC ACT

GGC Gly 285

TCC Ser

GTC Vai

AGC Ser

1710

Lys

Thr

Ile 280

Tyr Gly

Asp

Thr

GAA

GTC

ACT

TAC

CAT

GAG

ATT

GCC

TTT

TCG

GAC

GCT

1746

Glu

Vai

Thr

Tyr

His

Glu

Ile

Ala

Phe

Ser

Asp

Ala

290

295

300

ACT

GAT

TAC

GGC

ATT

GTC

ATT

GAG

CAG

AAC

TAT

GAT

1782

Thr

Asp

Tyr

Gly

Ile

Vai

Ile

Glu

Gin

Asn

Tyr

Asp

305

310

GAC

ACC

TCC

AAG

ACC

CCT

ACT

ACC

GGG

GTA

CCG

ATC

1818

Asp

Thr

Ser

Lys

Thr

Pro

Thr

Thr

Gly

Vai

Pro

Ile

315

320

ACG

GAT

TTT

GTG

CTC

GAG

AAC

ATC

GTT

GGA

ACG

TGT

1854

Thr

Asp

Phe

Vai

Leu

Glu

Asn

Ile

Vai

Gly

Thr

Cys

325

330

335

GAA

GAT

GAT

GAT

TGT

ACC

GAA

GTA

TAC

ATT

GCC

TGC

1890

Glu

Asp

Asp

Asp

Cys

Thr

Glu

Vai

Tyr

Ile

Ala

Cys

340

345

GGT

GAT

GGC

AGC

TGC

TCG

GAT

TGG

ACT

TGG

ACT

GGC

1926

dy

Asp

Gly

Ser

Cys

Ser

Asp

Trp

Thr

Trp

Thr

Gly

350

355

360

- 184

GTG AGC GTG ACT GGC GGC AGT GTC AGT GAC GAC TGC 1962

Vai Ser Vai Thr Gly Gly Ser Vai Ser Asp Asp Cys

365 370

CTT AAT GTT CCC TCC GGG ATT AGC TGC GAT TTG TAG 1998

Leu Asn Vai Pro Ser Gly Ile Ser Cys Asp Leu

375 380 383

GCCGTTGTGA TTGGGGGAGA TGTTCCCGGG TACTCTGGTC 2038

GTTCGTTTAG CCAGCCCTTT CTGTTGAGTG GCCTGTTCTT 2078

CTATACTGTC GATTGTGTGT GAGATTACTA CCTTGCCCGA 2118

GGAAAGAGCA GTGCATCCTA TCTTTTATTC TTTGCCGGTC 2158

GGGGTTGGCC TACTAGTACA TTGTACCCGA AGAGTCAACG 2198

GTGAAAGTAA AGGGCTTACA GAATTAGTCC AGGAGCAAAG 2238

ACAACTTTTA TCAGAGCGCA TCGGTCACGT CATGTTGAAA 2278

GTATTGATCA ATGAAGATAA CCTTGG 2304

Claims (22)

1. lã» Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante caracterizado por se incluir na referida molécula uma sequência de DNA seleccionada de

   a) a inserção de DNA de Aspergillus niger de pGWlGOO ou pfâWlGOO,

   b) uma sequência de DMA que hi.brida com a região codificadora de PGII ou PGI madura constituída por uma inserção de DNA de a) e que compreende um gene estrutural de um polipeptideo com activi-dade de galacturonase ou poligalacturonase e, facultativamente um promotor, uma região codificadora de um peptídeo sinal ou líder e/ou um terminador da transcrição,

   o) um derivado de uma sequência de DNA definida em a) ou b), ou

   d) uma sequência de DNA que codifica uma PG madura ou um seu peptídeo sinal ou um peptídeo líder e que é degenerada dentro cio significado do código genético relativamente â sequência de DNA de a), b) ou c), e por

   a) isolamento de DNA genómico a partir de células fúngicas adequadas e selecção do DNA pretendido, e„ g„ usando uma sonda de DMA ou usando um sistema de expressão adequado e despiste da expressão do polipeptideo pretendido, ou

   b) isolamento de rnRNA a partir de células fúngicas adequadas, selecção do rnRNA pretendido, e„ g„ por hibridaçâo com uma sonda de DNA ou por expressão num sistema de expressão adequado e despiste da expressão do polipeptideo pretendido, preparação de cDNA de cadeia simples complementar daquele mRNA, depois 'cDNA de cadeia dupla a partir dele, ou

   c) isolamento de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA e selecção do cDNA pretendido, e.. g.. usando uma sonda de DNA ou usando um sistema de expressão adequado e despiste da expressão do pollpeptideo pretendido ou/e

   d) incorporação do DNA de cadeia dupla do passo a), b) ou c) num vector adequado,

   e) transformação de células hospedeiras adequadas com o vector h £ b r i d o o b t i d o,

   f) selecção das células hospedeiras transformadas que contenham o DNA pretendido de entre células hospedeiras nao transformadas ou multiplicação da célula hospedeira transf armada e, quando necessário,

   g) isolamento do DMA pretendido e/ou conversão do DNA num seu mutante ou fragmento..
2. 2sL Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante compreendendo a inserção de DNA de Aspergillus niqer de pGWl.800 ou pGWlQOO,
3. 3$,. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante compreen.....

   dendo uma sequência de DNA que hibrida com a região codificadora da Ρ&Π ou PGI madura constituída por uma inserção de DNA de pGWISOO ou pRW1900 e que codifica um pollpeptideo com actividade de galacturonase ou poligalacturonase e/ou peptideo sinal ou

   187 líder e/ou tem actividade de promotor e/ou terminador da transcrição.
4. 4â„ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado per se preparar uma molécula de DNA recombinante compreendendo um derivado da inserção de Aspergillus niger de pGWl.800 ou pGW1900 ou de uma sequência de DNA que hibrida com a região codificadora da PGII ou PGI madura constituída por uma inserção de DNA de pGW1800 ou p(3W19OO e que codifica um polipeptideo com actividade de galacturonase ou poligalacturonase e/ou peptídeo sinal ou líder e/ou tem actividade de promotor e/ou terminador da transcrição.
5. 5S„ Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante cornpreen.....

   dendo uma inserção ou seu fragmento de um vector seleccionado do grupo de vectores constituído por larnbdaPG-A9, -AIO, -A43, -B4,

   -B35, -1336, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E
6. 6, -E38, •~F'5, --G17, G27, -X31 e -Y33, pGW1756, pGW1910, pGW1800, pGW1900 e pGW1756.

   SS» Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante? cornpreen.....

   dendo um derivado da inserção de A., niger de pGW1900 ou pGW1900 ou de uma sequência de DNA que hibrida com a região codificadora da PGII ou PGI madura constituída por uma das referidas inserçQes de DNA e que codifica um gene estrutural e/ou urn peptídeo sinal ou líder e/ou compreende uma sequência com actividade de promotor e/ou terminador da transcrição.
7. 7ã» Processo de acordo corn a reivindicação 4, caracterizado por se preparar uma molécula de DMA recombinante compreendendo urn fragmento de DNA com actividade de promotor derivado de

   188 uma inserção cie um vector seleccionado do grupo (de vectores constituido por larntodaPG-A9, -AIO, -A43, -134, -1335, -1336, -Cl, -C16, -C20, -037, -D8, -Dll, --D12, -E6, -E38, -F5, -317, -327, -X31 e -Ύ33, pGW1756, pGWISlO, pGW1800, pGW.1900 e pGW1756.
8. 8ã.. Proí ;esso de acordo corn a reivindicação 4, caracterizado por se preparar uma molécula de DMA recombinante compreendendo um fragmento de DMA codificador- de um peptideo Iider derivado de uma inserção de um vector seleccionado do grupo de vectores constituído por lambdaPG-A9, -AIO, -A43, -B4, ---1335,

   J .....1336, -Cl, -C16, -~C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -ΙΞ6, -E38, -F5,

   -317, -327, -X31 e -Y33, pGW1756, pGWISlO, pGW1800, pGW1900 e pGWl.756.
9. 9â„ Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante compreendendo um fragmenta de DNA codificador de um peptideo sinal derivado de uma inserção de urn vector seleccionado do grupo de vectores constituído por lambdaPG-A9, -AIO, -A43, --134, -1335, ••1336, Cl, ---(116, -C20, -C37, --D8, -Dll, -D12, .....E6, -E38, -F5,

   .....317, -327, -X31 e -Y33, pGW1756, pGW1910, pGW1900, pGW1900 e

   PGWX756.
10. 10ã. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se preparar urna molécula de DNA recombinante cornpreendendo um fragmento de DNA corn actividade de terminador da transcrição derivado de uma inserção de urn vector seleccionado do grupo de vectores constituído por larnbdaP3-A9, -AIO, -A43, --B4,

    -1335, -1336, -Cl, -C16, -C20, --C37, D8, -Dll, --D12, -E6, -E38,

    -F5, -317, -327, -X31 e -Y33, pGW1756, pGW1910, pGW1800, pGW1900 e pGW'1756..

    llã- Processo de acordo corn a reivindicação 4, caracterizado por se preparar urna molécula de DNA recombinante compreendendo um fragmento de DNA codificador de urn gene estrutural de urna galacturonase ou poiigalacturonase ou urn seu fragmento corn actividade de galacturonase ou poiigalacturonase derivado de uma inserção de? um vector seleccionado do grupo de vectores constituído por larnbdaPG-A9, -AIO, -A43, -B4, -B35, .....B36, -Cl, .....C16,

    .....C20, -837, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -(327, -X31 e

    -Y33, pGW17S8, _PGWX910, pfâWISOO, p(3Wl9OO e pGWl?5&.
11. 12ã.. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante de acordo corn a reivindicação 1 que é uma cassete de expressão,.
12. 13â„ Processo de? acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma molécula de DNA recombinante que é um vector híbrido.
13. 14§.. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se preparar urna molécula de DNA recombinante seleccio— nado do grupo de vectores constituído por pGWISOO, pGW1900, PGW1756, pGW1910, lambdaPG-A9, lambdaPGA-10, lambdaPGA-43, larnbdaPG-B4, lambdaPG-C16, 1 a rn b d a P G - D11, larnbdaPG.....Fb, larnbdaPG-Y33„ la rn b d a P (3 - B 35, larnbdaPG-C20, 1 a rn b d a P G - D12, lambdaPG-GX7, lambdaP(3-B38, 1 am fc> d a P G - C 3 7, lambdaPG-EG, larnbdaPG.....G27, larnbdaPG-Cl, lambdaPG-D8, larnbdaPG—E38, 1 a m b d a P G -X 31 e

    1.5ã„ Processei para a preparação de uma molécula de DNA caracterizado por se incluir na referida molécula urn gene? de urna PG ou de urn seu fragmento funcional., que é isolado a partir de? uma estirpe de fungo filamentoso produtor de? PG, e? por

    a) isolamento cie DNA genómico a partir de células fúngicas adequadas e selecçao do DNA pretendido, e. g. usando urna sonda de DNA ou usando urn sisterna de expressão adequado e despistei da expressão do polipeptídeo pretendido, ou

    b) isolamento de mRNA a partir de células fúngicas adequadas, selecçao do mRNA pretendido, e. g. por hibridação corn uma sonda de DNA ou por expressão num sistema de expressão adequado e despiste da expressão do polipeptídeo pretendido, preparação de cDNA de cadeia simples complementar daquele mRNA, depois cDNA de cadeia dupla a partir dele, ou

    c) isolamento de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA e selecçao do cDNA pretendido, e. g. usando uma sonda de DNA ou usando urn sistema de expressão adequado e despiste da expressão do polipeptídeo pretendido ou/e

    d) incorporação do DNA de cadeia dupla do passo a), b) ou c) num vector a d equ a d o,

    e) transformação de células hospedeiras adequadas com o vector h i fo r i d o ob t i d o,

    f) selecção das células hospedeiras transformadas que contenham o DNA pretendido de entre células hospedeiras não transformadas ou multiplicação da célula hospedeira transformada e, quando necessário,

    g) isolamento do DNA pretendido e/ou conversão do DNA nurn seu rnutante ou fragmento.

    191 -
14. 16S. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado ρου se preparar· uma molécula de DMA que é isolada a partir de àâBSCaillUS SfâêS
15. 17S. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se preparar' uma molécula de DNA que é uma inserção de um vector híbrido seleccionado do grupo de vectores híbridos constituído por pGWlBOO, pGW1900, pGWl?56, pGW1910, lambdaPG-A9, lambdaPGA-10, 1 a m b d a P G ··- B 3 6, larnbdaPG.....C37, larnbdaPG™E6, lambdaPGA-43, 1 a rn ta d a PG - C1, lambdaPG~D8, lambdaPG-E38, í a rn ta d a P G™B 4, lambdaPG—C15, lambdaPG-Dll, larnbclaPG-l^:5, larnbdaPG-B35, 1 a rnb d a P G—C 2 0, „1. a rn ta d a P G—D12, larntadaPG“-G17, seu fragmento larnbdaPG· -627, lambdaPG-X31 e larnbdaPG-Y33 ou urn compreendendo uma região de promotor de urn gene PG ou urna região codificadora de urn peptídeo sinal, peptídeo líder, prepro-PG, PG ou urn fragmento de uma PG corn actividade de galacturonase ou de poligalacturonase ou urna região terminadora da transcrição de urn gene PG.
16. 18si„ Processo parei a preparação de um hospedeiro transformado corn uma molécula de DNA recombinante caracterizado por se incluir urna sequência de DNA seleccionada de

    a) a inserção «de DNA de Aspergillus niger de pGW1800 ou pGW1900,

    b) urna sequência de DNA que hibrida com a região codificadora de PGI1 ou PGX madura constituída por uma inserção de DNA de a) e que compreende urn gene estrutural de um polipeptídeo corn activi.....

    dade de galacturonase ou poligalacturonase e, facultativamente um promotor, uma região codificadora de um peptídeo sinal ou líder e/ou um terrninador da transcrição,

    c) urn derivado de uma sequência de DNA definida em a) ou b), ou seu

    d) uma sequência de DNA que codifica uma PG madura ou um peptideo sinal ou um peptideo lider e que é degenerada dentro dei significado do código genético relativarnente â sequência de DNA de a), b) ou c:), compreendendo tratamento e uma célula hospedeira adequada em condições de transformação com uma molécula de DNA recombinante do presente invento, especialmente um vector híbrido do invento, facultativamente Juntamente com um gene de uma marca selectiva e f acultati. varnen te selecçâo de tr an sforman tes.
17. 19ã. Processo para a preparação de um polipeptideo caracterizado por um gene estrutural inserido numa cassete de expressão compreendendo uma sequência de DNA seleccionada de

    a) a inserção de DNA de Aspergillus niger de pGW'1800 ou pGW1900,

    b) uma sequência de DNA que híbrida com a região codificadora de PGII ou PGI madura constituída por uma inserção de DNA de a) e que compreende urn gene estrutural de um polipeptideo corn activi.·dade de galacturoriase ou poligalacturonase e, facultativamente um promotor, urna região codificadora de urn peptideo sinal ou líder e/ou um terminador da transcrição,

    c) um derivado de uma sequência de DNA definida em a) ou b), ou

    d) uma sequência de DNA que codifica uma PG madura ou um seu peptideo sinal ou um peptideo lider e que é degenerada dentro do significado do código genético relativarnente ã sequência de DNA de a), b) ou c),

    193 ser' expresso num hospedeiro adequado de acordo com métodos convencionais e, facultativamente, o polipeptídeo ser isolada de rn o d o c o n v e n c i o n a 1 „

    202. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se utilizar uma estirpe de Aspergillus niger.

    212.. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se utilizar uma estirpe de Aspergillus..jiidularis..

    222.. Processo de acordo corn a reivindicação 19, caracterizado por o gene estrutural codificar o interferão híbrido BDBB.

    232.. Processo de acordo corn a reivindicação 19, caracterizado por o gene estrutural codificar um polipeptídeo oom actividade de galacturonase ou poligalaçturonase e ser derivado de uma sequência de DMA seleccionada de

    a) a inserção de DMA de Aspergillus niger de pGWl.900 ou pGW1900,

    b) urna sequência de DMA que híbrida corn a região codificadora de PGII ou PGI madura constituída por uma inserção de DNA de a) e que compreende urn gene estrutural de urn polipeptídeo corn actividade de galacturonase ou poligalaçturonase e, faouXtativarnente um promotor, uma região codificadora de urn peptideo sinal ou lider e/ou um terrninador da transcrição,

    c) urn derivado de uma sequência de DMA definida em a) ou b), ou

    d) uma sequência de DMA que codifica urna PG madura ou urn seu peptideo sinal ou urn peptideo lider· e que é degenerada dentro do significado do código genético relativamente â sequência de DMA de a), b) ou c).

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18. 24â„ Processo para a preparação de urna PG simples caracterizado por α referida PG ser purificada a partir de uma fonte bruta de acordo com métodos convencionais.
19. 25§„ Processo de aoordo com a reivindicação 24, caracterizado por a referida PG ser produzida na forma purificada a partir de urna mistura de enzimas bruta obtida a partir de As£3ergillus.....nd^er.
20. 26â. Processo para a preparação de urna galacturonase ou poligalacturonase simples caracterizado por a referida galacturonase ou poligalacturonase simples ser codificada por urna sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1 ou urn seu derivado com actividade de galacturonase ou poligalacturonase e seus sais biologicamente aceitáveis.
21. 27S„ Processo para a preparação de uma composição enzimática caracterizado por· se incluir na referida composição urn polipeptídeo de acordo com a reivindicação 26 ou qualquer mistura sua facultativamente nurna combinação predeterminada corn urna ou mais enzirnas tendo outra actividade diferente de PG.
22. 28sL Processo para o processamento de material vegetal caracterizado por ser usado urn polipeptídeo de aoordo com a reivindicação 26 ou uma composição enzimática de acordo corn a reivindicação 27.