PT87230B - Processo para a producao de proteinas - Google Patents

Description

invento diz respeito a um novo processo para a produção de proteinas, mais especificamente proteases serina do tipo urocinase. 0 referido processo inclui o uso de estirpes de leveduras modificadas por engenharia genética. 0 invento diz ainda respeito a novas proteinas do tipo urocinase, DNAs codificadores de tais proteinas, vectores híbridos contendo tais DNAs, as referidas estirpes de levedura modificadas por engenharia genética e processos para a produção dos referidos DNAs, vectores híbridos e estirpes de levedura.

A urocinase ou o activador do plasminogénio tipo urocinase (daqui em diante referido como u-PA) é uma protease serina que activa o plasminogénio em plasmina por clivagem proteolitica. A plasmina é uma protease forte que é capaz de degradar a rede de fibrina dos coágulos sanguíneos para formar produtos de degradação solúveis.

u-PA foi inicialmente isolado a partir de urina humana e sabe-se também que é secretado por células de rim em cultura e algumas linhas de células tumorais. á inicialmente produzido como uma molécula de cadeia simples (daqui em diante referida como seu-PA) e pode ser convertida proteoliticamente pela acção de plasmina numa forma de duas cadeias (daqui em diante referido como teu-PA) em que as duas cadeias permanecem ligadas uma à outra através de uma ponte dissulfureto. 0 u-PA tem um único sítio de glicosilação em Asn 302.

Uma vez qúe o scu-PA tem apenas uma actividade amidolitica inferior contra substractos sintéticos de baixo peso molecular , foi considerado até recentemente como um verdadeiro precursor proteoliticamente inactivo da enzima activa tcu-PA. Porém, resultados mais recen-4-

tes provaram que o seu scu-PA activa eficazmente o plasminogénio em plasmina e tem uma selectividade consideravelmente superior para a fibrina do que o teu-PA / cf. II,R. Lijnen et al., J. Biol. Chem. 261, 1253 (1986)_7. Foram estudados os mecanismos da surpreendente actividade fibrinolitica e a especificidade do scu-PA para coágulos / Lijnen et al», supra; D, Collen et al,. J, Biol. Chem. 261, 1259(1986)J. Demonstrou-se que o seu scu-PA não é um zimogónio inactivo mas que activa o plasminogénio sem ser préviamente transformado em tcu-PA. Ao contrário do tcu-PA, scu-PA é inibido competitivamente por um componente do plasma ainda desconhecido cuja inibição é revertida por fibrina ou fragmentos de fibrina, i.e. no coágulo. Enquanto circula no sangue em condições in vivo scu-PA não activa portanto o plasminogenio. A sua actividade fibrinolitica mantem-se confinada no seu alvo próprio. Pelo contrário, o tcu-PA é capaz de activar o plasminogenio em qualquer parto do sistema circulatório, conduzindo assim a efeitos laterais indesejáveis tais como hemorregia. Estas propriedades tornam o scu-PA o activador do plasminogenio tipo urocinase preferido.

Com o advento da tecnologia de DNA recombinante é agora possivel produzir proteínas tais como scu-PA à escala industrial. Baseados na estrutura conhecida do DNA genómico do u-PA /~A. Riccio et al.. Nucleic Acids Research 13. 2759 (1985)_7 e cDNA do u-PA /“w.E, Ilolmes et al.. Biotechnology 2, 923 (1985)_7 foram descritos na literatura processos para a produção do scu-PA utilizando tecnologia de DNA recombinante. Assim, a expressão em B.coli foi conseguida por W.E, Ilolmes et al (supra) P. Jacobs et al.. /“DNA 4, 139 (1985)_7j M.E. Winkler et al.. /Biochemistry 22, (1986)_7, M. Nagai et al /“Gene 2Í, 183 (1985)..7

36; ver também Patente Belga Νο.9θΟ 826, Patente Japonesa No. 61 181 377 e Pedido de Patente Europeia No.92 182.

A expressão de seu-PA em células animais está divulgado nos Pedidos de Patentes Europeias No» 92 182 e 154 272. No entanto, todos os processos conhecidos sofrem de grandes desvantagens: provou-se dificil crescer células animais em larga escala o que é um pré-requisito para a produção barata e das proteínas produzidas por estas células. 0 tempo de geração das células animais é consideravelmente superior ao dos microorganismos, requereu do assim um período de fermentação prolongado para se obter uma densidade celular suficientemente grande, A densidade celular, por suavez obtida na cultura de células animais é consideravelmente inferior à deMsidade celular geralmente atingida na cultura em larga escala de microorganismos. Ainda, os melhoramentos de estirpes são difíceis de conseguir quando comparado com microorganismos. Por outro lado, as endotoxinas contaminantes são encontradas frequentemente em preparações de proteínas de E, coli. Estas têm de ser eliminadas por passos de purificação caros e demorados. As proteínas produzidas por E. coli são necessariamente não glicosiladas uma vez que E. coli não possui o sistema enzimático que é responsável pela ligação das cadeias de açúcar aos sitios adequados na molécula de proteína. Portanto scu-PA recombinante, ao contrário do scu-PA natural, não é glicosilado quando produzido por E. coli. Foi descrito que scu-PA produzido por E. coli existe na forma de um polímero amorfo insolúvel, devido a um alinhamento imperfeito das pontes dissulfureto e a um enrolamento incorrecto da proteína. Pelo menos um passo de reenrolamento adicional envolί j vendo grandes quantidades de solvente é portanto necessário de modo a obter-se uma proteína biologicamente activa (M.E. Winkler et ai. supra).

Considerando as desvantagens dos processos conhecidos verifica-se uma necessidade conbinua de métodos melhorados que tornem possível a produção de scu-PA

-tíbio logicamente activo numa escala larga. Constitui um objectivo do presente invento proporcionar tais métodos.

Surpreendentemente encontrou-se que as células de levedura transformadas com um vector híbrido portador da sequência codificadora do u-PA humano ligada à sequência sinal de um gene de levedura produz seu-PA possuidor de uma actividade biolégica equivalente à do scu-PA natural e é especificamente glicosilada por levedura. Deve-se notar que scu-PA de levedura é completamente activo sem ser necessário quaisquer processos de reenrolamento in vitro.

Assim, o invento diz respeito a um método para a produção de activador do plasminogénio tipo-uocinase humano de cadeia simples ou um seu mutante compreendendo cultura em condições nutritivas adequadas de uma estirpe de levedura transformada com um vector híbrido compreendendo uma sequência de controle da expressão de levedura, um segmento de DNA consistindo numa primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal a montante e na mesma grelha de leitura de uma segunda sequência de DNA codificadora do activador do plasminogénio tipo urocinase maduro ou um seu mutante, segmento de DNA que está sob o controle transcricional da referida sequência de controle da expressão e uma sequência de DNA compreendendo sinais de terminação da transcrição de um gene de levedura e isolamento do referido activador do plasminogénio tipo urocinase ou seu mutante.

termo sequência de DNA codificadora do activador do plasminogénio tipo urocinase maduro ! pretende abranger todas as formas alélicas do u-PA que se sabe existirem ou poderem ser isoladas a partir do genoma humano. Estas sequências de DNA não possuem quaisquer pré-e/ou pro-sequências.

Os mutantes de scu-PA são especialmente aqueles mutantes que tornam a proteína resistente a proteases. Tais mutantes de scu-PA são modificados covalentemente em sitios de proteólise por proteases presenbes no sangue como seja trombina ou plasmina, de modo a não serem mais susceptiveis à hidrólise por proteases nestes sitios. Os sitios alvo incluem Lisl35 a Lisl3ó ( a clivagem neste sitio gera a chamada forma de baixo poso molecular do scu-PA ou LXJK. ; ver Fig. 2 dos desenhos juntos), Arg 156 a Fen 157 (susceptivel ao ataque da trombina) e Lis 158 a Ile 159 (clivagem neste sitio pela plasmina gera tcu-PA)’, Os mutantes scu-PA adequados têm substituições, inserções ou delecções de resíduos de aminoácidos específicos de sitios em um ou mais destes sitios alvo. São especialmente preferidos os mutantes em que um resíduo de arainoácidos ou ambos os resíduos de aminoácidos formando os sitios alvo são eliminados ou em que pelo menos um destes resíduos de aminoácidos é substituído por um outro resíduo de aminoácidos de modo a que os mutantes resultantes sejam resistentes ao ataque proteolitico.

Noutros mutantes do scu-PA o único sitio de glicosilação em N que ocorre era Αβη^θ^ (Asn^^ -Ser-Tre) é modificado de modo a que a glicosilação não possa dar-se neste sitio.

Está bem estabelecido que um pré-requisit para a glicosilação ligada era N nas células de mamíferos e a ocorrência da sequência tripeptidica -Asn-L-Tre (ou Ser)-em que Asn é o aceitador e L pode ser qualquer um de 20 aminoácidos codificados geneticamente excepto prolina ou ácido aspártico que impede a glicosilação.

termo proteínas scu-PA sempre que aqui usado anteriormente ou para a frente prebende incluir scu-PA assim como seus mutantes.

invento rolacióna-so espocifi camonto com um método para a produção do proteinas scu-PA tendo a fórmula

Ser

Asn

Glu

Leu

His

Gin

Vai

Pro

Ser

Asn

Cys

Asp

Cys

Leu

Asn

Gly

Gly

Thr

Cys

Vai

Ser

Asn

Lys

Tyr

Phe

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z2

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Lys Asp Lys Pro Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser His Phe Leu Pro

Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu em que X^ e Xg independentemente um do outro representa Lis, um rosiduo de aminoácido que não seja um rosiduo de aminoácido básico ou uma ligação química, Y^ á Arg, um residuo de aminoácido que não soja um residuo de aminoácido básico ou uma ligaçao quimica, Yg á Fon, um residuo de aminoácido acidico ou uma ligação quimica, Y^ á Lis, um residuo de aminoácido que não seja um rosiduo de aminoácido básico ou uma ligação quimica, Z^ á Asn que églicosilado especificamente por levedura ou é um outro rosiduo de aminoáido e Zg e Tre ou um outro rosiduo de aminoácido diferente de Ser.

termo residuo de aminoácido pretende incluir os residuos de todos os aminoácidos codificados geneticamente, tais como residuos de aminoácidos acidicos, por oxemplo os residuos de ácido glutâmico e de ácido aspártico, residuos do aminoácidos básicos, por exemplo os residuos de arginina, lisina e histidina e residuos de aminoácidos neutros, por exemplo os residuos de asparagina, glutamina, glicina, alanina, leucina, isoleucina, sorina, treonina, tirosina ou prolina.

Para ovitar a glicosilaçao no sitio de glicosilaçao om N as sequências do tripeptideos reconhecidos como sinal para a glicosilaçao em N têm do ser alterados. A substituição dos residuos Asn (z) e/ou Tre (Zg) na sequência de tripeptideos acima referida por qualquer outro aminoácido evita a formação de ligações glicosidicas neste sitio. Por conveniência a modificação do sitio de glicosilaçao em N não e feita ao nivel da proteína. Era vez

10disto é vantajoso modificar o gene codificador do scu-PA de modo a que quando da expressão do referido gene modificado num hospedeiro seja produzido scu-PA em que o sitio de glicosilação em N ó alterado de modo a que a glicosilação não possa ter lugar neste sitio. Especialmente a asparagina ó substituída por valina, leucina, isoleucina, alanina ou em particular, glutamina e treonina com valina, metionina ou em particular, alanina.

Numa execução preferida o presente invento está relacionado com um processo para a produção de compostos da fórmula I em que X^ é Lis, Gli ou Ser, representa Lis, Y^ é Arg, Y^ e Fen, Asp ou Glu, Y^ é Lis, Z^ é Asn ou Gin e Z₂ é Tre.

Especialmente o invento relaciona-se com um processo para a produção do scu-PA, / G1Í135 7~ -scu-PA, ΓSer 1352/-scu-PA, /“Asp 1577-scu-PA, /~Ser 135, Asp 157 7-scu-PA e /“Gli 135, Asp 157_7-scu-PA em que Asn^⁰² e glicosilado especificamente por levedura e ainda / Gin 302_7-scu-PA, /“Gli 135, Asp, 157, Gin 3O2_7-scu-PA e /“Ser 135, Asp 157, Gin 3O2_7-scu-PA.

As estirpes de levedura transformadas de acordo com o invento são cultivadas num meio liquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos.

Pode-se usar várias fontes de carbono. São exemplos das referidas fontes de carbono preferidas os açucares tais como glucose, maltose, manitol ou lactose ou um acetato como seja acetato de sódio, que podem ser usados sozinhos ou em misturas adequadas. As fontes de azoto adequadas incluem, por exemplo, aminoácidos, tais como casaaminoácidos, peptideos e proteínas e seus produtos de degradação, tais como triptona, peptona ou extractos

de carne, ainda extracto de levedura, extracto de malte, melaço de milho, assim como sais de amónio, tais como cloreto sulfato ou nitrato de amónio, que podem ser usados sozinhos ou em misturas adequadas. Os sais inorgânicos que podem ser usados incluem, por exemplo, sulfatos, cloretos fosfatos e carbamatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. Era adição, o meio nutritivo pode também conter substâncias promotoras do crescimento. As substâncias que promovem o cres cimento incluem, por exemplo, micronutrientes tais como ferro, zinco, manganês e similares ou aminoácidos individuais

Células de levedura contendo plasmídeos híbridos com um promotor constitutivo (e.g. ADUZ. GAPDH)expre s s am o gene u-PA ligado ao referido promotor sem indução. No entanto, se o gene u-PA estiver sob o controle de um promotor regulado (e.g. PGK ou ΡΠΟ5) a composição do meio de crescimento tem de ser adaptada de modo a obter-se níveis máximos de iriRNA trancrito, i.o. quando se usa o promotor PH05 o meio de crescimento deve conter uma concentração baixa de fosfato inorgânico para a desrepressão deste promotor.

A cultura é efectuada empregando técnicas convencionais. As condições de cultura, tais como temperaturas, pH do meio e tempo de fermentação são seleccionadas de modo a que sejam produzidos niveis máximos de proteínas scu-PA. Uma estirpe de levedura escolhida é de í preferência cultivada em condições aeróbicas em cultura submersa com agitação a uma temperatura entre cerca de 25° e 35°θ, de preferência a cerca de 28 °C, a um valor de pll entre cerca de 4 e 7, por exemplo a aproximadaraente pH5 e durante cerca de 20 a 50 horas de preferência até serem i atingidos niveis máximos de proteínas scu-PA. i

A proteína seu-PA produzida pode acumular dentro das células de levedura ou pode ser secretada para o espaço periplasmático. No caso da proteína seu-PA ter-se acumulado dentro das células, o primeiro passo para a recuperação da proteína scu-PA coniste na libertação da proteína do interior celular. Na maior parte dos processos a parede celular é primeiro removida por digestão enzimática com glucosidases (infra). Subsequentemente os esferoplastos resultantes são tratados com detergentes, tais como Tritoir-^ K-100. Como alternativa, são adequados para o rebentamento de células forças mecânicas tais como forças de shearing (por exemplo prensa X, prensa Francesa) ou agitação com esferas de vidro. A mistura resultante é enriquecida em proteína scu-PA por meios convencionais, tais como remoção da maior parte do material não proteico por tratamento com polietileneimina, precipitação das protainas usando sulfato de amónio, electroforese em gel, diólise, cromatografia, por exemplo cromatografia de permuta iónica, cromatografia de exclusão por tamanho, IIPLC ou IIPLC em fase reversa, f£accionamento por tamanho molecular numa coluna de Sephadex'-'adequada ou similares. A purificação final do produto pré-purificado ó conseguida, por exemplo por meio de cromatografia de afinidade, por exemplo cromatografia de afinidade com anticorpos, especialmente cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais usando anticorpos monoclonais anti-u-PA fixados numa matriz insolúvel por métodos conhecidos e similares. Vantajosamente, uni detergente especialmente um detergente não iónico, como seja Triton X-100^R ou Tween 80^, ó adicionado a todas as soluções tampão usadas nos passos de purificação, de modo a evitar a adosorção de proteína scu-PA às superfícies do vaso e para aumentar a estabilidade. 0 detergente pode ser adicionado para uma concentração final de 0,01-15$.

I — 13—

No caso da proteína scu-PA ser secretada pela célula de levedura para o espaço periplasmático, pode ser usado um protocolo simplificados a proteína é recuperada sem lise celular por remoção enzímática da parede celular e por tratamento com agentes químicos,

e. g. reagentes tiol ou EDTA, que dá origem a danificação da parede celular permitindo que a proteína scu-PA produzida seja libertada. No caso da proteína scu-PA ser secretada para o caldo de cultura ela pode ser recuperada directa mente a partir dele.

Dependendo da estirpe hospedeira usada e dos métodos de purificação aplicados às proteínas scu-PA de acordo com o presente invento podem ser contaminadas com pequenas quantidades das correspondentes formas de duas cadeias originadas por actividade proteolitica libertala pelas células hospedeiras. A separação da fornia de duas cadeias da forma de uma cadeia pretendida (scu-PA) é conseguida por métodos conhecidos tais como cromatografia em benzamidina-Sepharosé^ /cf, II,E, Uinlcler et al«, Biochemistry 25« 40^1 (198ó)_7.

Surpreendentemente, encontrou-se que as proteínas scu-PA de acordo com o presente invento diferem do scu-PA obtido a partir de E, coli por terem a actividade biológica do scu-PA humano natural sem ser necessário qualquer processo de reenrolamento e por serem glicosiladas especificamente por levedura em Asn 3θ2, Devido à glicosilação especifica de levedura, as proteínas scu-PA de acordo com o invento são também distintas do scu-PA isolacLo a partir de células animais em cultura ou transformadas e são portanto novas.

Assim, o invento relaciona-se também com scu-PA e seus mutantes tendo glicosilação especifica de levedura, em particular tendo uma glicosilação

especifica de Sac charomyces cerevisiae.

Os mutantes de seu-PA em que o sitio de glicosilação ó modificado de modo a que não ocorra glicosilação neste sitio são igualmente novos e constituem ainda um objectivo do presente invento.

Deste modo, o invento diz também respeito a compostos da fórmula. I em que é o residuo de um aminoácido codificado genéticamente que não seja Asn, é Tre e X^, X^, Y^ e Y^ têm o significado dado para a fórmula I e compostos da fórmula I em que Z^ é Asn, é o residuo de um aminoácido codificado geneticamente que não seja Tre ou Ser e X^, X^, Y^, Y_o e Y^ têm os significados dados na fórmula I.

Em particular, o invento diz respeito a compostos da fórmula T em que X^ á Lis, Gli ou Ser, X₂ é Lis, Y^ é Arg, Y^ e Fen, Asp ou Glu, Y^ ó Lis, Z^ é Glu e Z^ ó Tre,

Os compostos mais preferidos do presente invento são seu-PA, /”Gli 135T-seu-PA, /~Ser 135 7 -seu-PA, /~Asp 157_7-scu-PA, /“Ser 135, Asp 157 7-seu-PA e / Gli 135, Asp 157 7-scu-PA em que Asn 302 ó glicosilado especificamente por levedura e ainda /Gin 3θ2 /-scu-PA·, /“Gli 135, Asp 157, Glu 3O2_7-scu-PA e /Ser 135, Asp 157, Glu 302^7 -scu-PA.

As estirpes de levedura transformadas de acordo com o invento podem ser preparadas por técnicas de DNA recombinante compreendendo os passos de: j

- preparação de um gene estrutural codificador de scu-PA ou um seu mutante,

- incorporação do gene estrutural obtido num vector adequado

- transformação de um organismo hospedeiro adequado com o vector híbrido produzido

- e selecção dos hospedeiros transformados de entre os hospedeiros não transformados.

As sequências de nucleotideos do cDNA de u-PA e do DITA genómico do u-PA são conhecidas

E. Holmes et al., Biotechnology J.,923 (1985); A, Riccio et al.. Nucleic Acids Research 13. 2759 (1985) 7»Conhecendo as sequências de cDNA e de DNA genómico do u-PA pode ser feito o gene estrutural do u-PA codificando u-PA ou um seu mutante através de métodos conhecidos. Os métodos para fazer estes DNAs incluem isolamento de mRNA a partir de células humanas que produzam scu-PA tais como células de carcinoma humanos ou células de rins embrionário humanas, selecção do mRNA pretendido, e.g. por hibridação com uma sonda de DNA adequada, preparação de DNA de cadeia simples complementar daquele mRNA, em seguida o DNA de cadeia dupla complementar (ds e DNA) a partir dele ou sim isolamento de DNA genómico a partir de células humanas e selecção do DNA pretendido usat. do uma sonda de DNA adequado e, caso se pretenda, mutagenização do cDNA ou do DNA genómico obtido, ou preparação do gene estrutural por síntese química. De preferência, os genes estruturais de acordo com o invento são preparados via mRNA e caso se pretenda mutantes, por mutagenese do cDNA de u-PA inicialmente obtido. Deste modo, o gene estrutural codificador de u-PA mutante pode ser preparado por excisao de uma porção do DNA compreendendo o codão ou os codões dos aminoacidos indesejáveis a partir do gene do u-PA parental maduro

e sua substituição com um segmento de DITA era que os referidos codões foram substituídos por codões codificadores dos residuos de aminoácidos pretendidos ou conseguindo a substituição de desoxirribonucleotideos por meio de mutagénese dirigida /~cf. M. J. Zoller et ai Methods Snzymol 100, 468 (1983)» D» Botstein et ai.. Science 229. 1193 (1985).7.

Os vectores híbridos de acordo com o presente invento compreendem uma sequência de controle da expressão de levedura, um segmento de DITA consistindo numa primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal a montante e na grelha de leitura de uma segunda sequência de DNA codificadora de activador do plasminogénio tipo urocinase maduro ou um seu mutante, segmento de DNA esse que está sob o controle transcricional da referida sequência de controle de expressão e uma sequência de DNA compreendendo sinais de terminação da transcrição de um gene de levedura.

As sequências de controle da expressão de leveduras são derivadas do DNA genómico de levedura, especialmente de Saccharomyces cerevisiae. De preferência, usou-se a sequência de controle da expressão de um gene de levedura altamente expresso para a expressão de scu-PA. Assim podem ser usados o promotor do gene TDP1, ADIU ou do gene ADIHI. do gene da fosfatase ácida (PH05) um promtor de genes da enolase, desidrogenase do gliceraldeido-3-fosfato (GAPDIí). cinase de 3-fosfoglicerato (PGI<) hexocinase, descarboxilase de piruvato, fosfofrutocinase, isomerase da glucose-6-fosfato, mutase do 3-í'osf oglicerato cinase do piruvato, isomerase de triosofosfato, isomerase de fosfoglacose e glucosinase ou um promotor dos genes da feromona de conjugação de levedura codificadores do factor a ou 15 também possivel usar promotores híbridos compreendendo sequências de activação a montante (UAS) de um gene

de levedura e elementos do promotor a jusante incluindo uma caixa TATA funcional de um outro gene de levedura, por exemplo um promotor híbrido incluindo UAS(s) do gene PH05 de levedura e elementos promotores a jusante incluindo uma caixa TATA funcional do gene GAPDH de levedura. Os vectores preferidos do presente invento contêm promotores com controle transcricional. Os promotores deste tipo, e.g., o promotor do gene PHO5 e os promotores híbridos de PHO5-GAPDH. podem ser ligados ou desligados através de variações das condições de crescimento. Por exemplo, o promotor PI 105 pode ser reprimido conforme se desejar, apenas aumentando a concentração de fosfato inorgânico no meio. Um outro promotor preferido de acordo com o invento é o promotor do gene GAPDH,especialmente fragmentos funcionais dele começando nos nucleotideos entre -550 e -180, em particular no nucleotideo -5^0, -2ó3 ou -198 e terminando no nucleotideo -5 do gene GAPDH.

A sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal (sequência sinal ) deriva preferencialmente de genes eucarióticos, por exemplo humanos ou de levedura, codificadores de polipeptideos que são normalmente secretados* São sequências sinal adequadas, por exemplo, a sequência sinal do u-PA obtida a partir de DNA genómico humano, sequências sinal de levedura, tais como as sequências sinal e prepro da invertura de levedura, factor X, feromona peptidase (ΚΕΧΐ), toxina assassina e genes reprimáveis da fosfatase ácida (PII05) e a sequência sinal da glucoamilase derivada de Aspergillus avamori. Como alternativa, as sequências sinal fundidas podem ser construídas por ligação de parte da sequência sinal (se presente) do gene ligado naturalmente ao promotor usado, com parte da sequência sinal do u-PA. São favorecidas aquelas combinações que permitam uma clivagem precisa entre a sequência sinal e a sequência de aminoácidos madura do scu-PA. Sequências adicionais tais como sequências pro ou espaçadoras que

possam ou não ser portadoras de sinais de processamento específicos podem também ser incluídas nas construções para facilitar processamento preciso das moléculas precursoras. Como alternativa podem ser geradas proteínas fundidas contendo sinais de processamento interno que permitam a maturação correcta in vivo ou in vitro. Por exemplo, os sinais de processamento contendo um residuo Lis-Arg, que é reconhecido por uma endopeptidase de levedura localizada nas membranas do Golgi. As sequências sinal preferidas de acordo com o presente invento são as do gene PHO5 de levedura codificadora de um peptideo sinal tendo a fórmula

Met Fen Lis Ser Vai Vai Tir Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala

Asn Ala, do gene da invertase de levedura codificando um peptideo sinal tendo a fórmula

Met Leu Leu Gin Ala Fen Leu Fen Leu Leu Ala Gli Fen Ala Ala

Lis Ile Ser Ala, e do gene do u-PA humano codificador de um peptideo sinal tendo a fórmula

Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cis Vai Leu Vai Vai Ser Asp Ser Lis Gli

Uma sequência de DNA compreendendo sinais de terminação da transcrição de levedura é de preferência a sequência delimitante 3’ de um gene de levedura que contenha sequências adequadas para a terminação da transcrição e poliadenilação. São sequências delimitantes 3’ adequadas, por exemplo, as do gene de levedura naturalmente ligadas à sequência de controle da expressão usada. As sequências delimitantes preferidas são as do gene PIIO5 de levedura.

Os plasmideos híbridos de acordo com o invento contêm além do promotor a sequência sinal, a sequência de DNA codificadora do u-PA ou um seu mutante e sequências delimitantes 3’» sequência(s) de DNA adicional(ais) que desempenhem funções importantes, por exemplo, na propagação das células transformadas com os referidos plasmideos híbridos. A(s) sequência(s) de DNA adicional(ais) podem ser derivada(s) de células procarióticas e/ou eucarióticas e podem incluir sequências de DNA cromossomico e/ou extracromossémico. Por exemplo, as sequências de DNA adicionais podem derivar de (ou consistirem em) DNA de plasmideo, como seja DNA de plasmideo bacteriano ou eucariótico, DNA virai e/ou DNA cromossomico, como seja DNA cromossomico bacteriano, de levedura ou de eucariotas superiores. Os plasmideos híbridos preferidos contêm sequências de DNA adicionais derivadas de plasmideos bacterianos, especialmente o plasmideo pBR322 de Escherichia coli ou plasmideos relacionados com pUC19, bacteriófago X,, plasmideo 2 μ de levedura e/ou DNA cromossémico de levedura.

de acordo com o invento,

Nos plasmideos híbridos preferidos as sequências de DNA adicionais são portadoras de uma origem marca genética selectiva de replicação de levedura e de uma para leveduras.

Os plasmideos hibridos contendo uma origem de replicação de levedura, e.g. um(s)

segmento(s) de replicação autónoma, ó (são) mantido(s) extracromossómicamente dentro da célula de levedura após transforma ção e são replicados autonomamente quando da mitose* Os plasmideos híbridos contendo sequências homólogas do DNA do plas mideo e 2 u de levedura podem ser igualmente usados. Estes plasmideos híbridos recombinam-se com os plasmideos e 2 p. de levedura já presentes dentro da célula ou replicam-se autonomamente se a origem de replicação estiver presente. As sequências de 2 ji são especialmente adequadas para os plasmideos de alta frequência de transformação e dão origem a elevado número de cópias.

Como gene marcador selectivo para levedura, pode ser usado qualquer gene marcador que facilite a selecção de transformantes devido à expressão fenotipica da marca. As marcas dominantes adequadas para levedura são particularmente aquelas que expressem resistência a antibióticos ou, no caso de mutantes de levedura auxotrópicos, genes que complementam lesões do hospedeiro. Os genes correspondentes conferem, por exemplo, resistência ao antibiótico G418 ou higromicina ou proporcionam prototrofia num mutante de levedura auxotrófico, por exemplo o gene URA3, LEU2. IIIS3 ou TRP1.

Com vantagem, as sequências de DNA adicionais que estejam presentes nos plasmideos híbridos de acordo com o invento também incluem uma origem de replicação e uma marca genética selectiva para um hospedeiro bacteriano, especialmente Escherichia coli. Existem caracteristicas úteis i associadas à presença de uma origem de replicação de E.coli e de uma marca de E.coli num plasmideo híbrido de levedura. Em primeiro lugar, pode-se obter grandes quantidades de DNA de plasmideo hibrido por crescimento e amplificação em E.coli e em segundo lugar, a construção do plasmideos híbridos é convenientemente feita em E.coli usando todo o reportório da

I

tecnologia de clonagem baseada em E. coli, Plasmideos de E. coli< tais como e similares, contêm origem de replicação de E. coli e marcas genéticas de E. coli que conferem resistência a antibióticos, por exemplo tetraciclina e ampicilina, e são com vantagem empregues como parte dos vectores híbridos de levedura.

As sequências de DNA adicionais que contêm, por exemplo, origem de replicação e marcas genéticas para levedura e para um hospedeiro bacteriano (ver acima) sãa daqui em diante referidas como DNA vector que juntamente com o promotor de levedura e a região codificadora da proteina scu-PA constituem um plasmideo híbrido de acordo com o invento.

Numa execução preferida, o presente invento relaciona-se com plasmideos híbridos capazes de replicação autónoma numa estirpe hospedeira de levedura e tendo marcas selectivas compreendendo uma sequência de controle da expressão de levedura, um segmento de DNA consistindo numa primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal a montante e na grelha de leitura de uma segunda sequência de DNA codificando o activador do plasminogénio tipo urocinase maduro ou um seu mutante e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de um gene de levedura o referido segmento de DNA sendo colocado juntamonte com sinais de iniciação e terminação da transcrição assim como sinais codificados de iniciação e paragem da tradução no referido vector hibrido sob o controle da referida sequência de controle da expressão de modo a que numa estirpe de levedura transformada ele seja expresso para produzir o referido activador do plasminogénio tipo urocinase ou seus mutantes.

Os vectores híbridos do presente invento são preparados por métodos conhecidos, por exemplo ligando uma sequência de controle da expressão de levedura

um segmento de DNA consistindo na região codofocadora do peptideo sinal e numa sequencia de DNA codificadora do u-PA ou um seu mutante, a sequência delimitante 3’ de um gene de levedura e DNA vector.

Para a preparação de plasmideos híbridos pode ser empregue DNA vector circular conveniontemente mapeado, por exemplo DNA de plasmideo bacteriano ou similar (ver acima), tendo pelo menos um sitio de restrição, de preferência dois ou mais sitios de restrição. Com vantagem, o DNA vector já contem origens de replicação e marcas genéticas para o hospedeiro levedura e/ou bacteriano. 0 DNA vector é clivado usando uma endonuclease de restrição adequada. 0 DNA cortado é ligado a fragmento(s) de DNA contendo a sequência de controle da expressão de levedura, o referido segmento de DNA e a referida sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição. Antes ou após ligação do(s) referido(s) fragmento(s) de DNA (ou também simultaneamente), é igualmente possível introduzir origens de replicação e/ou marcas para levedura ou para um hospedeiro bacteriano. Sm todos os casos, as condições de restrição e ligação são escolhidas de modo a que não haja interferência com as funções essenciais de DNA vector e da sequência de controle da expressão. 0 vector híbrido pode ser construído sequencialmente ou por ligação de dois segmentos de DNA compreendendo todas as sequências de interesse.

Podem ser usadas várias técnicas para ligar segmentos de DNA in vibro.

Extremos cegos (duplexos de DNA totalmente emparelhadas) produzidos por certas endonucleases de restrição podem ser directamente ligados com DNA ligase de Τ4). Geralmente, os segmentos de DNA são ligados através dos seus extremos coesivos de cadeia simples e ligados covalentemente por uma DNA ligqse, e.g. DNA ligase de T4.

Tais extremos coesivos de cadeia simples podem ser formados por clivagem de DNA com uma outra classe de endonucleases que produzem extremos protuberantes (as duas cadeias do duplex de DNA são clivadas em pontos diferentos a uma distância de alguns nucleotideos). As cadeias simples podem também ser formados pela adição de nucleotideos a extremos cegos ou a extremos protuberantes usando transferase terminal (colocação de acudas homopoliméricas) ou simplesmente comendo uma cadeia de um segmento de DNA de extremos cegos com uma exonuclease adequada, como seja exonuclease X. Uma outra abordagem para a produção de extremos protuberantes consiste na ligação ao segmento de DNA de extremos cegos de um DNA adaptador obtido por síntese quimica o qual contem um local de reconhecimento para uma endonuclease formadora de extremos protuberantes e digestão do DNA resultante com a respectiva endonuclease.

Os componentes do voctor híbrido de acordo com o invento, tais como o promotor de levedura o gene estrutural do u-PA ou um seu mutante incluindo uma sequência sinal,terminador da transcrição, o sistema de replicação etc., são ligados uns aos outros numa ordem predeterminada para assegurar um funcionamento correcto. Os componentes são ligados através de sítios de restrição comuns ou por meio de moléculas de adaptadores sintéticos para assegurar a orientação e ordem correctas dos componentes.

As estirpes de levedura transformadas de acordo com o invento são feitas de modo conhecido per se. vig. transformação de uma estirpe de levedura com um vector híbrido compreendendo uma sequência de controle da expressão de levedura, um segmento de DNA consistindo numa primeira sequência de DNA codificadora de um pei?tideo sinal a montante e na grelha de leitura de una segunda sequência de DNA codificadora do actiador do plasminogénio tipo urocinase maduro ou um seu mutante, segmento de DNA esse que

está sob o controle transcricional da referida sequência de controle da expressão e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de um gene de levedura.

Os organismos hospedeiros adequados do tipo levedura incluem espécies dos géneros Kluyveromyces Candida, Pichia, Saccharomyces. Yarrowia, Torulopsis e géneros relacionaados (cf. J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam 1971), especialmente estirpes de Saccharomyces cerevisiae.

A transformação das células hospedeiras de levedura é conseguida por métodos conhecidos. Por exemplo, a transformação pode ser conseguida de acordo com o método descrito por Hinnen et al., /”l³roc, Natl. Acad. Sei. USA 75. 1929 (1978) 7. Este método pode ser dividido em três passos:

(1) Remoção da parede celular de levedura ou partes dela.

(2) Tratamento das células de levedura nuas (esferoplastos) com o DNA transformante na presença de PEG (polietilenoglicol) e iões Ca^{e +} (3) Regeneração da parede celular e selecção das células transformadas numa camada sólida de agar.

Métodos preferidos:

ad (1): a parede celular de levedura é removida enzimaticamente usando várias preparações de glucosidases, tais como sucos intestinais de cobra (e.g, Glusulas^ ou Helicas^) ou misturas de enzimas obtidas a partir de microorganismos (e.g. ZymolyaseS') em soluções osmóticamente estabilizada (e.g. Sorbitol 1 M).

ad (2): Os esferoplastos de levedura agregam na presença de PEG e são induzidas fusões localizadas das membranas citoplasmáticas. A geração de condições tipo-fusão é crucial e muitas células de levedura transformadas tornam-se diplóides ou mesmo triplóides durante o processo de transformação. Os processos que permitem selecção de esferoplaastos fundidos podem ser usados para enriquecimento em transformantes , i.e. as células transformadas podem fácilmente ser detectadas entre produtos de fusão pré-seleccionados.

ad (3): Uma vez que as células do levedura sem parede celular não se dividem a parede celular tem de ser regenerada. Esta regeneração é convenientemente feita por embebição dos esferophstos em agar. Por exemplo, mistura-se agar fundido (50°C) com os esferoplastos. Quando do arrefecimento da solução para temperaturas de crescimento de leveduras (cerca de 30^sC) obtem-se uma camada sólida. Esta camada de agar é para evitar a difusão rápida e perda de macrocélulas essenciais dos esferoplastos e portanto facilitar a regeneração da parede celular. No entanto, a regeneração da parede celular pode ser conseguida (ainda que com uma eficiência baixa) semeando os esferoplastos na superficie de camadas de qgar pré-formadas,

De perferência, o agar de regeneração é preparado de modo a permitir a regeneração e selecção de células transformadas ao mesmo tempo. Uma vez que os genes de levedura codificadores de enzimas das vias de biossintese de aminoácidos são geralmenbe usados como marcas selectivas (supra), a regeneração é de preferência feita em agar de meio minimo para leveduras. Se forem necessárias eficiências de regeneração muito altas, é vantajoso usar o processo de dois passos que se segue:

(1) regeneração da parede celular num meio complexo rico e (2) selecção das células transformadas por transferência da camada celular para placas de agar selectivo.

Se o vector híbrido não possuir qualquer marca genética as células transformadas podem igualmente ser identificadas por meio de métodos alternativos. Tais métodos incluem, por exemplo, hibi-idação in si tu com um fragmento de DNA marcado homólogo de sequências do vector híbrido /e.g. de acordo com Ilinnen et al. supra_/ 1 imunoensaios in situ desde que esteja disponível um anticorpo para o produto do gene introduzido ou outros métodos de despiste que meçam produtos de genes codificados pelo(s) plasmideo(s) transformante(s).

Como alternativa, a levedura pode ser cotransformada com um vector híbrido de acordo com o invento e um segundo vector contendo uma marca genética para levedura. Se os dois vectores diferentes possuírem sequências de DNA em comum (estas podem ser sequências bacterianas) a recombinação dá-se e conduz a uma molécula ! híbrida fundida e susceptivel de selecção.

As estirpes de levedura transformadas contendo os plasmideos híbridos de acordo com o invento podem ser melhoradas na produção de scu-PA ou seus mutantes através de mutação e selecção usando métodos conhecidos. A mutação pode ser efectuada, por exemplo, por irradiação com U.V. ou reagentes químicos adequados, á especialmente preferida a produção de mutantes deficientes em proteases, especialmente mutantes de levedura, de modo a evitar a degradação proteolitica do scu-PA produzido, ou seus mutantes, sentro da célula hospedeira. Os mutantes adequados podem ser seleccionados e isolados por métodos convencionais.

I

As proteínas scu-PA, obtidas de acordo com o presente invento, especialmente as novas proteínas scu-PA, apresentam propriedades farmacológicas importantes. Elas podem ser usadas, em analogia com os activadores do plasminogénio conhecido, em humanos para a prevenção ou tratamento de trombose ou outras condições sempre que

a.

se pretenda produzir actividade fibrirolitica ou proteolitic local via mecanismos de activação do plasminogénio, tais como arteriosclerose, enfarte do miocárdio e cerebral, trombose venosa, tromboembolismo, trombose pés-cirurgica, tromboflebite e vasculopatias diabéticas.

invento relaciona-se também com composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapêuticamente eficaz do ingrediente activo (scu-PA ou um seu mutante) juntamente com veículos farmaceuticamente aceitáveis, sólidos ou liquidos, orgânicos ou inorgânicos que sejam adequados a administração parenteral, como seja intravenosa e que não interactuam de modo prejudicial com os ingredientes activos.

Existem soluções de infusão especialmente adequadas, de preferência soluções ou suspensões aquosas, sendo possível preparar estas antes de usar, por exemplo a partir de preparações liofilizadas que contenham o ingrediente activo sozinho ou juntamente com um veiculo, como seja manitol, lactose, glucose, albumina e similares, A composição farmacêutica pode ser esterilizada e, caso se pretenda, misturada com aditivos, por exemplo preservativos estabilizadores, emulsionantes, solubilizactores, tampões e/ou sais, tais como cloreto de amónio, para regulação da pressão osmótica. A esterilização pode ser conseguida por filtração em condições de esterilidade através de filtros de poro pequeno (0,45 jum de diâmetro ou menos) após o que a preparação pode ser liofilizada caso se pretenda. Podem

ser igualmente adicionados antibióticos para preservação da esterilidade. Por exemplo, a proteina scu-PA de acordo com o invento é formulada numa solução aquosa esterilizada contendo 5$ de glucose e facultativamente estabilizadores e sais.

As composições farmacêuticas de acordo com o presente invento são divididas em formas de dosagem unitárias, por exemplo ampolas, compreendendo 1 a 2000 mg de um veiculo farmaceuticamente aceitável por unidade de dosagem e cerca de 1 a 20 mg, de preferência cerca de 3 a 15 mg do ingrediente activo (scu-PA ou um seu mutante) por unidade de dosagem.

Dependendo do tipo de doença e da idade é estado do paciente, a dose diária a ser administrad para o tratamento de um doente pesando aproximadamente 70 kg é da ordem de 20 a 150 mg, de preferência entre 45 e 100 mg, por 24 lioras.

invento também diz respeito a um método para produção de uma composição farmacêutica caracterizado por uma proteina biologicamente activa do presente invento ser misturada com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

uso das novas proteínas no tratamento profilático e terapêutico do corpo humano constitui também um objectivo do presente invento, invento diz respeito também a novos plasmideos híbridos e estirpes de levedura transformadas com os referidos plasmideos híbridos e processos para a sua produção.

invento está especialmente relacionad com proteínas scu-PA, vectores híbridos, leveduras hospedeiras transformadas e processos para a sua produção como descrito nos Exemplos.

Breve descrição dos desenhos

Na parte experimental que se segue estão descritas várias execuções do presente invento com referência aos desenhos juntos em que:

Fig. 1 é um mapa de endonucleases de restrição do cDNA do u-PA humano.

Fig. 2 ilustra a sequência de nucleotideos e sequência de aminoácidos deduzida do cDNA do u-PA humano. Está sublinhado o primeiro aminoácido da proetina. madura.

Fig,3 ilustra esquematicamente a construção do plasmideo pCSló

Fig. 4 ilustra esquemáticamente a construção do plasmideo pCS16/UPA compreendendo o cDNA de u-PA.

Fig, 5 é um diagrama esquemático da construção do plasmideo pJDB2O7/PHO5-I-UPA (abreviaturas usadas: SS sequência sinal; t terminador da transcrição, p promotor; L adaptador),

Fig, 6 mostra a sequência de DNA da região do promotor de

GAPDH.

Fig. 7 descreve esquematicamente a construção do plasmideo P31GAPDLIT.

Fig. 8 descreve os elementos do promotor do gene GAPDH usado no presente invento.

Fig. 9 mostra esquematicamente a construção do plasmideo pJDB207/GAPDL-I-UPA.

Fig. 10 é um diagrama esquemático descrevendo a construção do plasmideo pJDB207/GAPDL-UPA.

Fig. 11 e Fig. 12 mostra esquematicamente a construção do plasmideo pDP38 via plasmideo pDP33*

Fig, 13 mostra as sequências de DNA dos genes U-PA mutagenizados e as correspondentes sequências de aminoácidos das proteínas scu-PA mutantes de acordo com o invento.

Os Exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente invento mas não devem ser pensados como uma limitação dele.

Parte Experimental

EXEMPLO 1: Construção do plasmideo pCSló/UPA compreendendo a região codificadora do u-PA

A) Construção do plasmideo pCSló (ver Fig. 3)

Um fragmento PstI-Bam III de 1,5 kb do plasmideo pUN121 / B. Nilsson et al. Nucl. Acids Res, 11 8019-8013 (1983) 7 compreendendo o gene cl do fago lambda e parte do gene de resistência à tetraciclina, foi clonado em pUC18 /^-J. Norrander et al.. Gene 26, 101-106 (1983) 11 cortado com Pst I e Bam ΙΣΕ. 0 clone resultante foi digerido com PstI. Os extremos protubrerantes 3’ foram removidos numa reacção com DNA polimerase de T4 / T. Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), p. 395_7 ^e adaptadores Xho I (5 ‘-CCTGrGAGG-3 ’ , Biolabs) foram ligados aos extremos cegos. Após digestão com Xho I, recircularizou-se a molécula por ligação. Usou-se uma amostra da mistura de ligação para trans formar células E. coli ΙΙΏ101 tratadas com Ca . Analisou-se o DNA de colónias transformadas individuais resistentes à ampicilina. Escolheu-se um dos vários clones correctos e referiu-se como pCSló.

ί B) Construção do plasmideo pCSló/UPA (ver Fig. 4)

Preparou-se o cDNA da urocinase a partir de mRNA obtido de células IIep3 humanas /“cf. T. Mania•M tis et al.. P.188-246, supra_7· Um fragmento Sma I-Bam IH de 1,3 kb e um fragmento BamTU-EcoIlI de ll;b do cDNA de u-PA foi clonado nos sitios Sraal e EcoRI de pUN121 /^_B. Nilsson et al.. Nacl. Acids Res. 11, 8019-8030 (1983)_7 para dar o plasmideo pcUK17ó. 0 mapa de endonucleases de restrição da inserção de cDNA do u-PA humano está apresentado na Fig. 1. A sequência de nucleotideos e sequência de aminoácidos deduzida da inserção de u-PA está mostrada na Fig, 2, A inserção de cDNA do u-PA foi subclonada no plasmideo pCS16. 0 cDNA subclonado vai do sitio Sma I na região 5’ não traduzida (Fig. 1) ao sitio Pvu II nas posições de nucleotideos 1439-1444 (Fig. 2) na região 3’ não traduzida.

pS do plasmideo pcUK17á foram digeridos com Pvu II. 0 fragmento Pvu II de 379 pb foi separado de outros fragmentos num gel de 1,5> de agarose em tampão Tris-borato-EDTA pll 8,3· 0 DNA foi electroeluido, purificado por cromatografia de permuta iónica em DE52 (Vhatman) e precipitado com etanol. Fosforilou-se 1,2 pg de adaptadores Xho I de cadeia simples (5’-CCTGGAGG-3’) nos seus extremos 5’, aqueceram-se durante 10 minutos a 75⁹C, auto-emparalharam -se durante arrefecimento até à temperatura ambiente e guardaram-se a -202C. 0,9 ug dos adaptadores XI10I de cadeia dupla e fosforilados foram ligados num excesso molar de 80 vozes aos extremos cegos do fragmento Pvu II de 379 pb do pcUK17ó (ver atrás) em 20 ul de 60 mM Tris-HCl pll 7,5, 10 mM MgCl , 5mMDTT 3,5 mM ATP e 400 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs a 155C durante 16 horas. A mistura foi aquecida durante 10 min. a 85^?C. As moléculas adaptadoras em excesso foram removidas por precipitação com 0,54 volumes de isopropanol na presença de 10 mM EDTA e 3θθ mM de acetato de sédio pll 6,0 durante 30 min. à temperatura ambiente. Digeriu-se o DNA em Xho I e Bam IH. Isolou-se ura fragmento Bam IH-XhoI de 121 pb num gel de 1,5$ de agarose em tampão Tris-borato-EDTA pll 8,3. 6 |ig do plasmideo pcUK176 foram digeridos com Sma I e BaniIH. Isolou-se um fragmento Smal-Bam IH de 1,3 kb compreendendo a maior parte da sequência codificadora do u-PA. Digeriu-se 6 ug do plasmideo pCS16 com Smal e Xho I, Isolou-se o fragmento vector de 2,7 kb. Os fragmentos de DNA foram electro-33- eluidos do gel e precipitados com etanol 0,2 pmoles do fragmento Smal-Bain IH de 1,3 kb, 0,2 pmoles do fragmento Bamin-Xhol de 121 pb (ambos os fragmentos juntos compreendem toda a sequência codificadora do u-PA) e 0,1 pmoles do fragmento vector de 2,7 kb foram ligados em 10 μΐ de 60 iriM MgCL₂, 5 mMDTT, 3,5 niM ATP e 400 e 3 mM Tris-HCl pH 7,5, unidades de DNA ligase de T4 a 15-C, Quantidades de um çlI da mistura de ligação foram adicionadas a 100 μΐ de células E. coli HB 101 tratadas com Ca . A transformação foi efectuada como descrito /^-A. Ilinen et al., Proc. Natl. Acad* Sei. USA 1929 (1978)_7. 12 colónias resistentes à ampicílina foram cultivadas em meio LB contendo 100 mg/1 de ampicilina, 0 DNA foi isolado de acordo com Holmes et al /“Anal. Biochem. 114, 193 (19S1)_7 e analisado por digestão com as enzimas de restrição EcoRI, Pvu II e Xho I. 0 DNA de plasmideo de um clone isolado tendo os fragmentos de res- | trição esperados por designação de pCSló/UPA.

De modo análogo o cDNA da urocinase desde o sitio Sma I (posições de nucleotideos 1-6, Fig. 2) ate ao sitio Pst I nas posições de nucleotideos 1637-1642 (ver Fig. 2) foi subclonado no plasmideo pCS16. Digeriu-se o plasmideo pcUK176 com Pst I. Os extremos coesivos foram convertidos em extremos cegos numa reacção com DNA polimerase de T4 como descrito por Maniatis et al.. (supra, p.395). Isolou-se o fragmento de DNA de 1,2 kb. Adicionaram-se adaptadores Xho I como descrito acima. 0 DNA foi digerido com Bam Hl e Xho I e isolado um fragmento Bam IH-XhoI de 315 pb. Ligaram-se 0,2 pmoles deste fragmento ao fragmento Smal-Bam Hl de 1,3 kb e ao fragmento vector de 2,7 kb (ver acima). A mistura de ligação foi usada para transformar células E. coli HB101 tratadas com Ca⁺⁺. 0 DNA de plasmideo de um clone isolado tendo os fragmentos de restrição esperados foi designado pCS16/UPA-13. Este plasmideo contem a inserção de cDNA do u-PA desde o sitio Smal na região 5’ não traduzida (Fig. 1} ate ao sitio PstI na posição de nucleotideo 1641 (Fig. 2) na região 3’ não traduzida. A única diferença para o plasmideo pCS16/UPA é a região 3’ não traduzida prolongada.

EXEMPLO 2: Construção do plasniideo p31RIT-12 contendo o promotor de PH05 e a sequência sinal da invertase

A) Sintese de oligodesoxirribonucleotideos para a sequência sinal da invertase:

Quatro oligodesoxirribonucleotideos:

1-1, 1-2, 1-3, 1-4 foram sintetizados num sintetizador de DNA (Applied Biosystems modelo 3803). Após desbloqueamento os fragmentos sintéticos foram purificados num gel de 12$ de poliacrilamida contendo ureia 8M. Os oligodesoxirribonucleotideos puros, sem sal, foram obtidos usando Sep. Pak (Waters Associates), Estes fragmentos consttituem um duplex que codifica a sequência sinal da invertase com os codões ruais frequentemente usados por leveduras.

Hindi IIEcoRI Me t Le u LeuGInAlaFe nLe uE¹ e nLe u Leu

1-1 5'AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTICCTTTT 3'

1-2 3'GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5'

AlaGlifènAlaAlaLysIleSerAla

1-3 5'GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3'

1-4 3¹CAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5'

Hgal____

Xhol

B) Subclonagem da sequência sinal da invertas© no plasmideo p3’

a) Preparação do vector

1,5 ps de p31R/SS-TPA4 2 (Pedido de Patente Europeia N2 143 081) foi digerido com 10 V de Eco RI (Boehringer) em 50 p.1 de 10 ml-I Tris.IICl pll 7,5, 6 niM MgClg, 100 mM NaCl, 6 mM mercaptoetanol durante uma hora a 37⁹θ* Após adição de 1 μΐ de 2,5 M NaCl, adicionou-se 10 V de Xho I (Boehringer) e incubou-se a 37^SC durante uma hora. 0 vector de 4,2 kb foi isolado num gel preparativo de 0,8$ de agarose. A fatia de gel foi transferida para um tubo Micro Colloidor (Sartorius Gmbll), coberto cora 200 pl de TB e electroeluido (submetido a electroforese a 9θ mA durante 5θ min). A solução de TE foi colhida e precipitada era 2,5 volumes de etanol absoluto após adição de 0,1 volume de TNE 10X. 0 sedimento de DNA foi lavado com etanol a 80$ frio e seco sob vácuo. Ressuspendeu-se o DNA em 6 ul de TE (4o pmoles/pl).

b) Emparelhamento dos oligodesoxirribonucleotideos (l-l,I-2, ; 1-3, 1-4), fosforilação e ligação com vector

Uma solução contendo 10 pmoles de ί cada um dos quatro desoxirribonucleotideos em 10 ul de 0,5M Tris.IICl pIIS foi incubada a 95 ⁹C durante 5 minutos num banho-maria. 0 banho-maria foi lentamente arrefecido até 3O9C durante um periodo de 5 horas. A esta mistura emparelhada adi-

I cionou-se 0,1 M MgClg, 0,lM NaCl, 30 mM DTT, 4 niM ATP, 2 pl de cada, e 8U (1 pl) de cinase da polinucleotideos (Boehringer). A fosforilação foi efectuada a 37⁹C durante uma hora.

Os oligodesoxirribonucleotideos emparelhados e fosforilados

e 60 pmoles do vector p31R/SS-TPA.Á 2 cortado cora EcoRI-Xhol (1,5 ul) foram ligados com 400 U (1 μΐ) de DNA ligase de T4 (Biolabs) a 14°C durante 17 horas. A reacçao foi parada por incubação a Ó5⁹C durante 10 min. Usou-se 10 μΐ desta mistura de ligação para transformação de células E.coli HB101 Ca⁺⁺ /”M. Dagert e S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979) 7· Repicaram-se 20 colónias amp \ Preparouse DNA pelo processo de isolamento rápido / D.S. Ilolmes e M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)_7» 0 DNA foi digerido com EcoRI e Xhol, marcado radioactivamente no extremo EcoRI e analisado com gel de 6$ de poliacrilamida contendo ureia 8M usando como marcador DNA de pBR322 marcado radioactivamente e cortado com Ilae III. Para todo o DNA obtido a partir dos 20 clones observou-se bandas com o tamanho correcto. Cultivou-se um clone em 100 ml de meio LB contendo 100 yg/ /ml de ampicilina. 0 DNA de plasmideo foi isolado e referido como p31 RIT-12.

EXEMPLO 3: Construção do plasmideo pJDB207/PII05-I-UPA (Fig.5) pJDB207/PIIO5-I-UPA contem o promotor de PIÍ05 , a sequência sinal da invertase, a sequência codificadora da urocinase madura e o terminador da transcrição de ΡΠ05 num arranjo tandem no vector de expressão de levedura pJDB207.

pg do plasmideo pCS16/UPA foram digeridos totalmente com 40 unidades de EcoRI. Após extracção com fenol e precipitação com etanol o DNA digerido com EcoRI foi ainda cortado por TagI a Ó5⁹C. Os fragmentos resultantes foram separados num gel preparativo de 1,2$ de agarose. 0 fragmento Tagl-EcoRI de 462 pb foi isolado por electroeluição do gel e precipitação com etanol.

Um oligodesoxirribonucleotideo adaptador da fórmula (I) 5’ -CTGCAAGGAATGAACTTCATCAAGTTGCAT-3 ’ (II) 3’- TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5’ foi ligado ao sitio 'fag I do fragmento de DNA. 0 adaptador restaura o extremo 5’ da sequência codificadora do u-PA maduro (nucleotideos 130-154, Fig. .2) e estabelece uma fusão na mesma grellia de leitura com a sequência sinal da invertase. A sequência 5*-CTGCA do adaptador preenche o correspondente extremo protuberante 3’ da sequência sinal da invertase eriado por clivagem com liga I.

Os oligodesoxirrinucleotideos I e

II, 300 pmoles de cada, foram fosforilados e emparelhados.

5,25 pg ( 600 pmoles) de DNA adaptador de cadeia dupla fosforilado foi ligado a 1,7 pg (5,6 pmoles) do fragmento Tagl-EcoRI de 462 pb (ver acima) em 175 μΐ de 6o mtl Tris-HCl pH 7,5, 10 mM l-IgClg, Imll ATP, 5mM DTT e 800 unidades de DNA ligase de f4 a 15°C durante 16 horas. A DNA ligase de T4 foi inactivada durante 10 min a 85³C.

excesso de adaptadore foi removido por precipitação na presença de 10 mtl BDTA, acetato de sódio 300 ml-I píl 6,0 e 0,54 volumes de isopropanol.i Digeriu-se o DNA com PstI. Isolou-se um fragmento único de J 312 pb contendo o adaptador ligado a sequências de DNA codi- I ficadores de u-PA até ao nucleotideo 436 (Sitio PstI, ver Fig.2). 0 fragmento de DNA foi purificado por electroeluição e precipitação com etanol.

Digeriu-se o plasmideo pCS16/UPA com Xhol e PstI. Isolou-se e purificou-se um fragmento Pstl-Xhol de 1007 pb. Este fragmento contem a maior parte da sequência codificadora da urocinase.

II

Digeriu-se o plasmideo p31RIT-12 (ver Exemplo 2) com Sall e Xlio I. Um fragmento Sall-Xhol de 882 pb foi isolado do gel por electroeluição e precipitação com etanol, 0 fragmento foi ainda digerido com BamlH e Hgal. Isolou-se um fragmento BamlH-Hgal de 591 pb que contem a região do promotor de PH05 e da sequência sinal da invertase.

plasmideo pJDB2O7/PHO5-TPA 18 (ver Pedido da Patente Europeia N- 143 081) foi digerido com BamHI e Xho I. 0 fragmento vector de 6,8 lb f oi isolado num gel preparativo de 0,6^ de agarose em tampão Tris-acetato pH 8,2. Electroeluiu-se o DNA e precipitou-se com etanol.

Todos os fragmentos de DNA foram ressuspensos em H^O numa concentração de 0,1 pmoles/jil. 0,2 pmoles do fragmento BamTII-Hgal de 591 pb, 0,2 pmoles do fragmento Ilgal-Pstl de 312 pb, 0,2 pmoles do fragmento PstI-Xhol de 1007 pb e 0,1 pmoles do fragmento vector BamíII-Xhol de 6,8 kb foram ligados durante 15 h a 15²0 em 10 p.1 de 50 mM Tris.IICl pll 7,5, 10 mH MgClg, 5mMDTT, 1 mMATP e 400 unidades de DNA ligase de Τ4, Usou-se um μΐ da mistura de ligação para transformar células E. coli HB101 Ca . Repicaram-se 12 colónias amp^ e cultivaram-se em meio LB contendo 100 mg/ml de ampicilina. Preparou-se DNA pelo processo de isolamento rápido /d.S. Ilolmes e t al. , Anal. Biochem. 114, 193 (1981) 7» Nas digestões de restrição do DNA de plasmideo com HindIII e EcoRI observaram-se os fragmentos de restrição esperados. 0 DNA de plasmideo de um clone isolado foi seleccionado e referido como pJDB207/PH05-I-UPA

EXEMPLO 4

Construção do plasmideo nJDB 2 0 7/PIIO5 -UPA

Esta construção compreende o pfomotor de PIIO5« a sequencia sinal de PIIO 5 ligada na mesma grelha de leitura à sequência codificadora da urocinase madura e ao terminador da transcrição de PIIO5 clonado no vector pJDB207 de levedura.

^TJm oligodesoxirribonucleotideo adaptador da fórmula (I) 5'-CCAATGCAAGCAATGAAC TTCATCAAGTTCCAT-3’ (li)3’-GGTTACGTTCGTTACTT&AAGTAGTTCAAGGTAGC-5’ proporciona 8 nucleotideos (5’-CCAATGCA) da sequência sinal de PH05 (desde um sitio Bali interno ató ao sitio de processamento) e estabelece uma fusão na mesma grelha de leitura da sequência codificadora do u-PA maduro (posições de nu| cleotideos 130-154, Fig. 2). 0 adapfedor foi ligado ao sitio

Tag I do fragmento Tag I-EcoRI de 462 pb do pCS516/UPA (ver Exemplo 3). A fosforilação, emparelhamento e ligação foi feita de acordo com o Exemplo 3· Digeriu-se o DNA com Bali e PstI. Isolou-se um fragmento de 315 pb. 0 fragmento | de DNA contem a sequência de DNA do gene u-PA ató ao sitio

PstI na posição 436 (Fig. 2).

Digeriu-se o plasmideo p31 (Pedido de Patente Europeia No. 100 561) com Bal I e Bam

IH. Isolou-se um fragmento Bam III-BalI de 584 pb contendo o promotor de PH05 e a maior parte da sequência sinal de

-4ο-

ΡΙΙ05. Os fragmentos de DNA foram purificados por electroeluição e cromatografia em DE52, precipitados com etanol e ressuspensos em Π_ο0 a uma concentração de 0,1 pmoles/μ 1.

0,2 pmoles do fragmento BamlH-Ball de 584 pb, 0,2 pmoles do fragmento BalI-PstI de 315 pb, 0,2 pmoles do fragmento PstI-Xhol de 1007 pb (ver Exemplo 3) e 0,1 pmoles do fragmento vector BamlU-XlioI de 6,8 kb (ver Exemplo 3) foram ligados e usados para transformar E.coli UB 101. Repicaram-se 6 colónias amp* e cultivaram-se em meio LB contendo 100 mg/1 de ampicilina. Preparou-se o DNA de plasmideo pelo processo rápido de extracção de DNA e analisou-se por digestão dupla com BamlH/Pstl. Um clone isolado com os fragmentos de restrição esperados foi seleccionado e o DNA do plasmideo referido como PJDB2O7/PHO5-UPA»

EXEMPLO 5

Construção do plasmideo pJDB2O7/PHO5-SSUPA i

! Este plasmideo contem o gene da urocinase com a sua prórpia sequência sinal sob o controle do promotor de PII05 no vector de expressão de levedura pJDB207.

pg do plasmideo pCS16/UPA-13 (ver Exemplo 1) foram digeridos totalmente com 100 unidades de Bgl I (porções de nucleotideos 7^-86 Fig. 2). Os 3 fragmentos de DNA resultantes foram separados num gel preparativo de 1$ de agarose em tampão Tris-borato-EDTA pll 8,3. 0 fragmento BgU de 1,7 kb foi electroeluido e precipitado com etanol.

Um oligodesoxirribonucleotideo adaptador da fórmula (i) 5 ’ -AATTCGATTACCAAIGAGAGCCCTGC-3 ’ (II) 3’- GCTAATGGTTAC TC TCGGG-5’ tem um sitio EcoRI ligado a 8 nucleotideos da região não codificadora 5’ de PH05 antes do seu ATG e aos nucleotideos 70-82 (Fig. 2) da sequência codificadora do u-PA incluindo o ATG. 0 adaptador foi ligado aos extremos coesivos Bgll do DNA como descrito no Exemplo 3· Digeriu-se o DNA com EcoRI e PstI.

Isolou-se um fragmento de 380 pb compreendendo a sequência sinal do u-PA e parte da sequência codificadora do u-PA maduro até ao nucleotideo 436 (sitio PstI, Fig. 2).

plasmideo p31R (ver Pedido de Patente Euroepeia No. 100 561) foi digerido com BamlxE e EcoRI e isolados o fragmento BamUT-EcoRI de 53^ pb compreendendo o promotor de PII05. Os fragmentos de DNA foram electroeluidos do gel de agarose, purificados por cromatografia em DE52, precipitados com etanol e ressuspensos em H_n0 numa concentração de 0,1 pmoles/yl.

0,2 pmoles do fragmento BainlU-EcoRI de 53^ pb, 0,2 pmoles do fragmento EcoRI-PstI de 3θ0 pb, 0,2 pmoles do fragmento PstI-Xhol de 1007 pb (ver Exemplo 3) e 0,1 pmoles do fragmento vector PstI-Xhol de 6,8 kb (ver Exemplo 3) foram ligados e usados para transformar células E. coli IIB101 Ca . Cultivaram-se separadamente 12

colónias amp^ em meio LB contendo 100 mg/ml de ampicilina. Preparou-se DNA pelo método rápido e analisou-se por digestão com BamlH e EcoRI. Seleccionou-se o DNA de plasmideo de um clone isolado e referiu-se como pJDB 2 0 7/PIIO5 - SSUPA.

EXEMPLO 6

Construção do plasmideo pJDB2O7R/PnO5-UPA

A sequência codificadora da urocinase madura foi ligada ao promotor de PIIO5« Não foi introdu zida qualquer sequência sinal nesta construção que foi feita com fins comparativos.

Um oligodesoxirribonucleotideo adaptador com a fórmula (l) 5 ' -AATTCAIGAGCAAIGAACTTCATCAAGTTCCAT-3 ’ (II ) 3' - GTACTCGTTACTIGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5 ' contem um AfG e os nucleotideos 130-154 do u-PA (ver Pig. 1) codificadores dos aminoácidos Serl a Ser 9 da urocinase madura. Os oligonucleotideos não fosforilados, emparelhados e ligados ao fragmento Tagl-EcoRI de 46.2 pb do pCS16/UPA (ver Exemplo 3). 0 DNA foi digerido com EcoPI e Pstl. Isolou-se um fragmento EcoHI-PstI de 315 pb compreendendo o ATG e a sequência codificadora do u-PA maduro até ao sitio Pstl na posição 436 (Pig. 2).

Todos os fragmentos de DNA foram electroeluidos, purificados por cromatografia em DE52, precipitados com etanol e ressuspensos em TI^O a uma concentração de 0,1 pmoles/μΐ. 0 fragmento BamlK-EcoRI de 5jh pb, o fragmento EcoRI-PstI de 315 pb, o fragmento PstI-Xhol de 1007 pb, 0,2 pmoles de cada, e 0,1 pmoles do fragmento vector BamlH-XlioI de 6,8 kb (ver Exemplo 3) foram ligados e

4*4· usados para transformar E,coli HB101 Ca como habitualmente. Repicaram-se 8 colónias amp^ e cultivaram-se em meio LB contendo 100 mg/1 de ampicilina. Preparou-se o DNA de plasmideo e analisou-se por digestão com as enzimas de restrição BamlH e EcoRI. 0 DIÍA de plasmideo de um clone isolado com o padrão de restrição esperado foi referido como pJDB207 R/PH05-UPA.

EXEMPLO 7

Clonagem do gene GAPDH de levedura com o seu promotor constituivo

a) Construção de uma biblioteca de genes de levedura

Trinta yg de DITA total de levedura de alto peso molecular / M.V. Olsen et al. J.Mol.Biol. 122, 367 (1979).7 da estirpe selvagem de Saccharomyces cerevisiae S288C foi incubado durante 30 min,, a 37^sO com 2 unidades de metilase de EcoRI (New England Biolabs) em 250 μΐ de tampão de metilação de EcoRI como recomendado pelo fornecedor, 0 DMA foi precipitado com etanol, ressuspenso em 500 μΐ de 25 niM Tris-MCl plí 8,5, 2 mM MgClg (tampão Eco RI*) / II. Mayer, EMES Lett. £0, 3‘H (1979).7 e digerido com Eco RI (Boehringer) até a distribuição de tamanhos dos fragmentos de DNA tor um máximo na gama de 30-50 kb (uma digestão com Xho I de DNA do fago V proporciona os marcadores de 33 kb e 17 kb adequados). 0 DNA de levedura digerido em condições de EcoRI foi fracoionado pelo tamanho num gradiente de sacarose (5-20$á de sacarose em 10 mlí Tris, IIC1 pH 7,5, 1 m2I EDTA) durante 6 horas a 38 000 rpm num rotor SW^O. Colheram-se trinta fracções de 0,’f ml cada a partir do cimo do gradiente. A fracção 16 contem fragmentos de DNA de 30-^0 kb de tamahho. 0 DNA desta fracção (3 pg) foi precipitado com etanol e ligado durante 16 horas a 15-C num volume total de 15 pl para 1 yg de vector cosmxdeo pYcl /~B. Ilohn et al. . em Genetic Engineering”, Vol. 2, pás. 169, New York 198O_7 linearizado com EcoRI k’ A ligação foi efectuada cora 300 U de DNA ligase de T'l (New England Biolabs) usando o sistema tampão descrito pelo fornecedor. 0 DNA foi encapsidado in vitro no bacteriófago X /~B. Ilohn em Methods in Enzymology, Vol. 68, p, 299, New York 1979 7 e os fagos montados foram usados para a transdução de E.coli estirpe HB101 (r^ , m^ , leu , pro , recA). A eficiência da transdução foi de cerca de 5000 colónias resistentes à ampicilina por pg de vector pYcl. Repicaram-se 3000 colónias amp e cultivaram-se individualmente nos poços de placas do microtitulação em meio LB /“10 g de Bacto-fryptone (Difco) 5 g de Bacto Yeast Extract (Difco), 10 g de NaCl 7 contendo 100 pg/ml de ampicilina.

b) Isolamento do gene GAPDII do levedura

A biblioteca de ge^es descrita atrás foi testada com uin oligonucleotideo sintético /preparado usando o método fosfotriéster: K. Itakura et al.,

J.Am. Chem. Soc. £Z, 7327 (1975); J.B.M. de Rooij et al.,

Recl. Trav. Chim. Pays Bas .£8., 537 (1979) 7 com a seguinte estrutura: 5’-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3‘ yg de oligonucleotideo foram fosforilados usando 10 y.1 de (j^-^P-ATP (3000 Ci/mmol, 10 μθχ/μ1 Amersham) com polinucleotideo cinase de T4 (Boeliringor) num volume total de 50 y.1 ⁰⁰¹¹¹⁰ descrito por Maniatis et al /Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Lab. , 1982 página 125 7· A- hibridação de colónias foi efectuada como descrito pelos mesmos autores (página 312). Os clones positivos foram detectados por autorradiografia usando filme de raios X Kodak X-5. 0 isolamento de DNA de plasmideo (ver Pedido de Patente Europeia No. 100 561) deu um clone hibrido que contem um fragmento HindlII de 2100 pb codificador de GAPDA /J.P. Ilolland et al, J.Biol.Chem. 254. 9839 (1979) 7. A prova final da autenticidade do DNA clonado vem da experiência da sequenciação usando os oligonucleotideos mencionados atrás em combinação com o protocolo de sequencia ção didesoxi como descrito por G.F. Ilong /“Bioscienco Reports 1, 243 (1981) 7 para DNA de cadeia dupla. 0 gene GAPDII clonado tem a mesma sequência de pgap 491 publicado por Ilolland et al. , /j, Biol. Chem. 255, 2596 (198ó)_7.

c) Preparação do promotor de GAPDII fragmento TagI de ó4ç pb que inclui as posições -27 a -675 a partir do alG do gene GAPDII (ver Figura 6) foi isolado por digestão do plasmodeo hibrido atrás referido com TagI (Νθτ,_? England Biolabs), separação dos fragmentos de DNA num gel de 1,2^ de agarose mole e extracção do DNA com fenol quente.

A clonqgem do fragmento Tag I foi feita no sitio Cia I do pBR 322: 1 qg de pBR322 foi clivado com três unidades de Cia I (iTew England Biolabs) como descrito pelo fornecedor. 3θθ ng do vector fenolizado e cortado foi ligado a 300 ng de DNA de inserção (fragmento Tag de 64-9 pb) usando 200 U de DNA ligase de T4 num volume total de 20 μΐ. Fez-se transformação de E. coli HB101 seleccionando resistentes à ampicilina, preparou-se DNA de plasmideo e analisou-se por análise de restrição /“Tae I, Dra I 7· A orientação do fragmento Tag I foi estabelecida usando a endonuclease de restrição Dral em combinação com o sitio Bam IH dos plasmideos e seleccionou-se um plasmideo que tinha o sitio Tag I na posição -675 perto do sitio HindIII do pBR322. Este plasmideo designado pBR322/ /GAPDII foi linearizado usando BamBI (New England Biolabs) 0 DNA foi ressuspenso em 10 mM Tris pH 8,0 numa concentração de 0,5 pg/ml. 16 qg de DNA clivado com Sall foi digerido com 2U de exonuclease Bal31 (BRL) em 100 pl de 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl₂, 12 mM CaCl₂ e 1 ml·' EDTA. Após 1,2,33,5 e 6 min., de incubação a 3θ^ρ0 retiraram-se amostras de 2 yig de DNA que foram imediatamente misturadas com 50 ql de fenol e 60 ql de TNE. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, o DNA foi ressuspenso em lOmlí Tris pll 8,0 numa concentração de 100 pg/ml, Para analisar o grau de clivagem exonucleolitica com Bal 31, digeriu-se 0,5 qg de DNA de cada um dos pontos com endonuclease Bam IH e analisou-se num gel de 1,5$ de agarose em tampão Tris-borato pll 8,3 (50 mM Tris.HCl pll

8,3, ácido bórico 50 mM, 2,5 mM EDTA). 1 Dm média foram removidos 100 pb de cada um dos extremos do fragmento por 1

I min. de digestão com Bal 31.

I Fosforilaram-se adaptadores

BgUI (5 ’ -GGAGATCTCC-3 ' ), emparelharam-se e lfeiram-se aos fragmentos de DNA tratados com Bal31. Os adaptadores em excesso foram removidos por precipitação com isopropanol. 0 DNA foi digerido com BgUI e circulatizado directamente numa concentração de 5 yig/ml num volume total de 20 yl. 0 tamanho do fragmento TagI encortado com Bal31 foi determina do por análise de restrição (usando BglII e Hindlll). Seleccionaram-se três clones. Eles contêm fragmentos de DNA que se prolongam cerca de 200 pb, 265 pb e 54-0 pb, respecti vamente a partir do ATG a montante até ao promotor GAPDII. Os três fragmentos contêm a pressuposta caixa TATA a cerca de -140 pb. Estes clones contêm ainda a origem de replicação na parte do DNA derivada do pBB.322 e foram designados pGAPDII-F, pGAPDH-E e pGAPDII-D, respectivamente.

Para prolongar os elementos do promotor de GAPDII a partir do sitio Tag I na posição -27 até uma posição imediatamente adjacente ao ATG do gene GAPDII sintetizaram-se dois oligonucleotideos sintéticos complementares com a seguinte estrutura:

5' CGAATAAACACATAAATAAAG 3’

3’ TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5’

Estes oligonucleotideos proporcio nam a sequência genuína do promotor GAPDII a partir da posição -26 até à posição -5 com a geração de um sitio EcoRI terminal. Duas yg de cada um dos plasmideos pGAPDII-F, pGAPDH-E e pGAPDII-D foram digeridas com 6 unidades de TagI em 50 jil e a mistura resultante foi fenolizada, precipitada com etanol e ressuspensa em 10 μΐ de água. Os oligonucleotideos sintéticos foram emparelhados misturando 2 μΐ de cada uma das cadeias simples em 100 μΐ de uma solução contendo 10 mM Tris.IICl pH 7,5, 10 mM MgCl_o, 50 mM NaCl, aquecimento durante 3 min., a 90^sC e arrefecimento lento da solução até

à temperatura ambiente (dentro de aproximadamente 3 horas). Um pg do plasmideo digerido com TagI foi misturado com um excesso molar de aproximadamente vinte vezes dos oligonucleotideos emparelhados num volume de 20 μΐ e ligados durante cerca de 18 horas usando 800 U de DNA ligase de 'f4. Após inactivação da ligase, a mistura total foi digerida com 3 unidades de BglII (hew England Biolabs). Os fragmentos BglII-EcoRI de cerca de 200 pb, 2Ó5 pb e 540 pb, respectivamente foram separados num gel de 1,5/J de agarose mole, extraidos do gel e precipitados com etanol.

plasmideo p3UCCT-12 (ver Exemplo 2) foi digerido com BamlH e EcoIÍI» 0 fragmento vector de 3fó kb de comprimento foi siolado. Usou-se este fragmento para clonar os fragmentos BglII-EcoRI de 200 pb, 2Ó5 pb e 540 pb do promotor de GAPDII. As condições de ligação, transformação e isolamento dos plasmideos foram corno descrito atrás. Os plasmideos com a inserção correcta foram referidos como p31GAPPL-IT, p31GAPBL-IT e p31GAPDL-IT, respectivamente (fig. 7).

As sequências de DNA dos fragmentos BglII-EcoRI dos plasmideos p31GAPPL-IT, p31GAPEL-IT e p31GAPDL-IT estão apresentadas na Fig. 8. 0 tamanho exacto destes fragmentos é 202 pb, 2Ó7 pb e 544 pb, respectivamente.

EXEMPLO 8

Construção do plasmideo pJDB207/GAPDL-‘X-UPA (Fig, 9)

Este plasmideo contem o promotor GAPDH-D, a sequência sinal da invertase a sequência codificadora da urocinase madura e o terrainador da transcrição de PII05 num arranjo tandem no vector vai-vem (Shuttle) pJDD2O7.

DNA de plasmideo do p31GAPDL-IT foi digerido com Sall e HindIII. Separou-se um fragmento SalI-IIindlII de 0,8 kb num gel preparati_vo de 1^> de agarose. Este fragmento contem o promotor GAPDII-D e parte da sequência sinal da invertase.

plasmideo pJDB207/PII05-I-UPA foi digerido com HindIII e BamHI. 0 fragmento HindIII-BamHI de 1235 pb compreende a restante parte da sequência sinal da invertase e a maior parte da sequência codificadora do u-PA. pJDB207/PII05-I-UPA foi também digerido com Sall e

BamHI. 0 fragmento grande vector de 6,6 kb foi isolado num gel preparativo de 0,6^j de agarose em tampão tris-acetato pll

8,2.

Os fragmentos de DNA foram isolados do gel por electroeluição, purificados por cromatografia em DE52 e precipitados com etanol. 0 fragmento Sall-IlindlII de 0,8 kb, o fragmento HindIII-BamIII de 1239 e o fragmento vector Sall-BamHI de 6,6 kb foram ligados e usados para transformar células J.coli IIBIOI Ca⁺⁺, 0 DNA de plasmideo obtido a partir de 6 transformantes amp^ foi analisado por digestão de restrição com HindIII e Sall. 0 DNA de plasmideo de um clone isolado tendo os fragmentos de restrição esperados foi designado pJDB207/GAPDL-I-UPA.

Numa construção análoga isolou-se ura fragmento SalI-IIindlII de 493 pb do plasmideo p31GAPFL-IT (ver Exemplo 7) e usou-se para a ligação, 0 DNA de plasmideo resultante foi designado pJDB207/GAPFL-I-UPA.

De modo análogo constriu-se pJDB207/GAPEL-I-UPA.

EXEMPLO 9

Construção do plasmideo p<JDB207/GAPDL-UPA (Fig. 10)

Um arranjo tandem compreendendo o promotor GAPDII-D, a sequência sinal de PIIO5. a sequência codificadora da urocinase e o terminador da transcrição de PIIO5. foi clonado no vector vai-vem de levedura pJDB207.

Digeriu-se 20 yg do plasmideo pJDB207/PHO5-UPA com BglII e Sall. Os dois fragmentos resultantes foram separados num gel preparativo de 0,8Çj de agarose em tampão tris-acetato pll 8,2. Isolaram-se os fragmentos BG UI-Sall de 7,6 kb e 1,1 kb. 0 fragmento de l,lkb foi ainda digerido com Dra I. Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, 3,5 pmoles do DNA foram ligados com um excesso de 100 vezes de um oligodesoxirribonucleotideo adaptador fosforilado e emparelhado com a fórmula:

»-AATTCGATTACCAATGTTT-3»

3’GC taatggttacaaa-5 ’

com um sitio EcoRI e 8 nuclootideos da região 5’ não codificadora do PII05 antes do ATG e parte da sequência de reconhecimento de Dral.

Após ligação durante 16 li a 15-C a ligase foi inactivada, os adaptadores em excesso foram removidos por precipitação com isopropanol (0,54 volumes) na presença de acetato de sódio 300mM pll 6,0 o 10 níM EDTA. 0 DNA foi digerido com Bgl II e EcoRI. Isolou-se um fragmento BgUI-EcoRI de 326 pb.

plasmideo p31UAPDL-IT foi digerido com Sall e EcoRI. Isolou-se um fragmento SalI-EcoRI de 0,75 kb.

Os fragmentos de DNA foram isolados do gel de agaroso por electroeluição, purificados por cromatografia em DE52 e precipitados com etanol. 0,2 pmoles do fragmento SalI-EcoRI de 0,75 kb, 0,4 prnolos do fragmento EcoRI-BglII de 326 pb e 0,1 pmoles do fragmento vector SalI-BglII de 7,6 kb foram ligados durante 5,5 horas a 15³C. Usou-se 1^ul da mistura de ligação para transformar células E.coli HB101 Ca⁺*.

R transformantes amp foram cultivados e preparado o DNA de plasmideo. 0 DNA de plasmideo foi analisado por digestão de restrição com EcoRI. 0 DNA de plasmideo de um clone isolado com o padrão de restrição esperado foi designado pJDB207/GAPDL-UPA.

De modo análogo, constriram-se os plasmideos pJDB207/GAPFL-UPA e pJDB2O7/GAPEL-UPA.

EXEMPLO 10

Construção do plasmideo pDP38 (Fig. 11 e Fig.12)

A partir de Saccharomyces cerevisiae estirpe S288C isolou-se o DNA de 2 microns, circular e covalentemente fechado, por digestão da parede celular com 5 yg/ml de Zymolyase 100 000 unidades/pg£ durante 20 min, , a 37^ρθ, seguido de lise das células cem 2<$ de SDS. Adicionou-se então EDTA para 25mM, cloreto de césio para uma densidade final de 1,59 g/ml, brometo de etídio para 1 mg/ml e a mistura total foi transferida para um tubo de ultracentrifuga. 0 DNA de plasmideo foi separado do DNA cromossómico por ultra-centrifugação durante 42 horas a 42 000 rpm a 15²C, 0 DNA do plasmideo de 2 micron foi retirado do gradiente com uma seringa. Removeu-se o brometo de etídio com isopropanol saturado com NaCl e o DNA de plasmideo foi finalmente precipitado com etanol. 0 DNA de plasmideo purificado foi então lihearizado com Pst I e clonado no sitio PstI de pUC19 /~J. Norrander et al, Gene 26. 101 (1983) 7 para dar o plasmideo pDP31. Digeriu-se o plasmideo pJDB207 com as enzimas Kpnl e Ilpal. 0 fragmento de 0,55 kb resultante foi purificado e clonado no fragmento Kpnl-Iípal de4,25 kb do plasmideo pUC7/LEU2 /um plasmideo contendo o gene genómico LEU2 de levedura como um fragmento Xhol-Sall de 2,2 kb /^-A. Andreadis et al cell 31. 319 (1982)_7 clonado no sitio Sall do plasmideo pUC7 / J. Vieira et al., Gene 19. 259 (1982)_7· Isto resulta num plasmideo pDP30 onde a fusão original 2 micron/LEU2 como no plasmideo pJDB207 foi colocada antes do gene LEU2 mais o seu terminador completo. pDP30 foi digerido com Ilpal e Sall e o fragmento de

1,85 kb contendo todo o gene LEU2 foi purificado e clonado no fragmento Ilpal-Sall de 8,7 kb do plasmideo pDP31.

plasmideo resultante, pDP33, foi linearizado com IlindIII na presença de 50 pg/ml de brometo de etídio /~M. Oesterbund et al Gene 20, 121 (1982) 7 ® ligado com o fragmento IlindIII de 1,17 kb contendo o gene URA 3 /~M. Rose et al Gene 29. 113 (1984)_7» A inserção positiva do gene URA 3 foi seleccionada por transformação

8-0 E. coli estirpe pyrf / M. Rose et al. supra_7· Isto dá o plasmideo pDP34. pDP34 foi digerido com a enzima Sph I. 0 fragmento de 8,4 kb resultante foi purificado é auto-ligado para dar o plasmideo pDP38.

EXEMPLO 11*

Construção dos plasmideos pDP38/GAPDL-I-UPA e pDP38/GAPDL-UPA vector pDP3S (ver Exemplo 10) contem os genes LEU2 e URA3, sequências do pBF-322 e parte do DNA 2 micron de levedura. 0 plasmideo pDP38 foi linearizado com BamlH. Os extremos coesivos resultantes foram preenchidos numa reacção com DNA polimeaa.se klenow (Maniatis et al., p. 113, supra). 0 DNA foi ainda digerido totalmente com Sall e isolado o fragmento grande de 8,4 kb.

pg do plasmideo pJDB207/GAPDL-I-UPA foram parcialmente digeridos com IlindIII (1 unidade/ /pg de DNA) na presença de 10 pg/ml de brometo de etídio durante 28 min., a 37²C. A reacção foi parada pela adição de EDTA para uma concentração final de 10 níM. Os extremos coesivos do DNA foram preenchidos numa reacção com DNA

polimeraso Klenow . 0 DNA foi ainda digerido coei Sall. Isolou-se um fragmento Sall- /HindlII 7 extremo cego de 2,2 lcb.

Os fragmentos de DNA purificados foram ligados e usados x^ara transformar células Ξ.coli IIB101 Ca , Cultivaram-se 24 colónias amp . Preparou-se DNA de plasmideo e analisou-se os produtos da digestão com EcoRI e Sall/lIindlII. 0 DNA de plasmideo de um clone isolado com os fragmentos de restrição esperados foi designado pDP38/ /GAPDL-I-UPA.

Numa construção análoga isolou-se um fragmento Sall-/ IlindlII 7/^extremo cego de 2,2 kb a partir de pJDB2O7/GAPDL-TJPA após digestão completa com HindlII reacção com DNA polimerase klenow e digestão com Sall, Este fragmento foi ligado a pDP38 como descrito acima. Um clone isolado foi referido como pDP38/GAPDL-UPA.

De modo análogo os fragmentos Sall-/HindlII 7 /extremo cego de 2,2 kb foram isolados a partir de pJDB2O7/GAPEL-I-UPA, pJDB207/GAPFL-I-UPA, pJDB2O7/GAPBL-UPA e pJDB207/GAPFL-UPA. Os fragmentos purifiçadosforam ligados a pDP38. A mistura de ligação foi usada para transformar Ξ. coli ΙΠ3101.

Os DNAs de plasmideo de cada um dos clones isolados foram designados pDP38/GAPEL-I-UPA, pDP38/ /GAPFL-I-UPA, pDP38/GAP3L-UPA e pDP38/GAPFL-UPA.

-55EXEMPLO 12;

Transformação de S. cerevisiae estirpes ΙΙΓ246 e GRF18

Saccharomyces cerevisiae estirpe HT246( a, leu 2-3, leu 2-112, prb) foi transformada com os plasmideos p JDB20 7/PIIO5- UPA pJDB207/ΡΙΙ05-Ι - UPA pJDB2O7/PHO5-SSTJPA pJDB2O7R/PHO5-UPA pJDB20 7/GAPDL-UPA pJDB2O7/GAPPL-UPA pJDB2O7/GAPDL-I-UPA usando o protocolo de transformação descrito por Ilinen et al /Proc,.Natl. Acad. Sei. USA 2Σ, 1929 (1978)J. As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio minimo para leveduras deficientes em leucina. Colónias individuais de leveduras transformadas foram isoladas e designadas,

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

HT246/pJDB207/PH05-UPA

HT246/pJDB207/PH05-I-UPA

HT246/pJDB207/PH05-SSUPA

HT246/pJDB207R/PH05-UPA

HT246/pJDB2O7/GAPDL-UPA

HT246/pJDB207/GAPFL-UPA

HT246/pJDB2O7/GAPDL-I-UPA

De modo análogo, Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF13 (DSM 3665) foi transformada com os plasmideos acima referidos. As estirpes de levedura trans formadas resultantes foram designadas

Saccharoniyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

GRF18/pJDB20 7/PH05-UPA

GRF18/pJDB2O7/PHO5-I-UPA

GRF18/pJDB207/PH05-SSUPA

GRF18/pJDB2O7R/PHO5-UPA

GRF18 /pJ.D.B207 / GAPDL-UPA

GRF18/pJDB2O7/GAPFL-UPA

GRF18/pJDB20 7/GAPDL-I-UPA.

EXEMPLO 13:

Transformação de Saccharomyces cerevisiae ostii^pe ITT35O

S. cerevisiae estirpe ΠΤ350 foi obtida por cruzamento da estirpe S. cerevisiae HT246 com uma estirpe deficiente para ura-3 como seja S. cerevisiae IIT285 (Xj, Lis3-11« Lis 3-15, leu 2-3, Leu 2-112. ur a3. pep 4-3) que resulta no genétipo que se segue para a estirpe IIT35O ( X, Lis 3-11, Lis 3-15, lou 2-3, leu 2-112, ura 3, P^rb> ΡθΡ 4-3). A estirpe HT350 foi transformada com os pias mideos pDP38/GAPDL-I-UPA, pDP3S/GAPFL-I-UPA, pDP3S/GAPEL-I-UPA, pDP38/GAPDL-UPA, pDP38/GAPEL-UPA e pDP38/GAPEL-UPA, respectivamente, usando o protocolo de transformação de Ilinnen et al. , (supra). Αβ células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para levedura deficientes em uracilo e suplementares com leucina. Colónias individuais de leveduras transformadas foram isoladas e referidas comoí

Saccharomyces cerevisíae

Saccharomyces cerevisíae

Saccharoniyces cerevisíae

Saccharomyces cerevisíae

Saccharomyces cerevisíae

Saccharomyces cerevisiae

HT35O/pDP38/GAPDI-I-UPA

HT350/pDP38/GAPFL-I-UPA

HT350/pDP38/GAPEL-I-UPA

HT350/pDP38/GAPDL-UPA

HT350/pDP38/GAPFL-UPA

HT350/pDP38/GAPF.I-UPA

EXEMPLO 14

Fermentação de estirpes de levedura transformadas

Saccharomyces cerevisiae Hf24 6/pJDB2O7/PHO5-UPA,

Saccharomyces cerevisiae ΙΙΤ24ó/pJDB207/PH05-1 -UPA e

Saccharomyces cerevisíae Hf246/pJDB2O7R/PHO5-I~UPA contem plasmideos com todo o promotor de PIIOp e requerem a desrepressão do promotor para a oxi^ressão de scu-PA. Ce- i lulas dos transformantes de S.cerevisiae ΗΓ246 foram cultiva das individualmente em 10 ml de meio ininimo para leveduras (Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos ao qual se adicionou 2$ de glucose e 20 mg/1 do L-histidína) num frasco Erlenmeyer de 50 ml com hgitação a 3O⁹O durante 24 h até

ζ <

se atingir uma densidade de 5~7 x 10' células/ml. As células de pré-cultura foram então lavadas em 0,9$ NaCl e 20$ das células da pré-cultura foram usadas para inocular 50 g/1 de L-asparagina mas contendo 0,03 S/l ml de um meio minimo de baixo Pi preparado de acordo com a receita do meio Difco Yeast Nitrogen Base (sem aminoácidos) de KII₂P0 em vez de (NII^J^SO^, 20 g/1 de glucose e 1 g/1 de L-histi dina. As culturas foram agitadas a 3θ⁹θ até 48 11 a 180 z revs/min. Obtiveram-se densidades finais de 1 x 10 células/ /ml (1 DO_6qo = 4-5).

Os transformantes de levedura compreendendo os plasmideos com o promotor GAPDII de tamanhos diferentes expressam constitutivamente scu-PA. Os transformantes correspondentes contendo plasmideos derivados de pJDB207 foram cultivados em pré-cultura com meio minimo para levedura (supra). 20$ da pré-cultura lavada foi inoculado em 50 ml do meio de cultura complexo principal consistindo em (g/1): peptona 5, extracto de levedura 10, glucose 20, sucrose 40, (NII^SO^ 3, ΚΙΙ,,ΡΟ^ 2, MgSO^, 0,5, NaOl 0,1, CaCl 0,1, biotina 10 yg/1. Obtiveram-se aproximadamente

Q x 10~ células/ml (=ΒΟ^θθ 40-45) após 48 11 de incubação a 30SC e 200 revs/min.

Transformantes correspondentes compreendendo plasmideos derivados de pDP38 foram cultivados com seleccção de uracilo. As células foram cultivadas durante 24 h a 30^eC o 180 revs/min num meio de pré-cultura consistindo em (g/1): casaminoácidos 4,5, extracto de levedura, 6,5, sucrose 20, glucose 20, (’NI^)_O SO^ 3,6, KII^PO^ 1, MgSO^ 8,2, CaCl^ 0,013 micronutrientes.

10$ das células de pré-cultura lavadas foram usadas para inocular 60 ml de meio de cultura selectivo consistindo em (g/1): Yeast Nitrogen Base (Difco, ί

sem aminoácidos) 5, L-asparagina 7,5, casaminoácidos 8,5 metiletilsulfonato 10, adenina 0,05, L-histidina 0,04, L-leucina 0,1, L-triptofano 1, Ca-pantotenato 0,03, glucose 30.

Obtiveram-se aproximadamente SxlO células/ml (=D0^₀₀ ca.35) após 48 11 de incubação a 3O⁹C e 200 revs/min.

Colheram-se células a partir de 2 ml após 24 h e 48 h, respectivamente, por centrifugação, a 3000 rpm durante 10 min em tubos Palcon 2070, As células foram lavadas uma vez com 0,9$ de NaCl e centrifugada. 0 sedimento de células foi suspenso em tampão de lise / 66 mH fosfato de potássio pll 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem) 7· À suspensão de células adicionou-se 3 g de esferas de vidro (0,5-0,75 mm de diâmetro) e a suspensão foi agitada num Vortex Mixer /“Scientific Instruments Inc. USÁ_7 na velocidade máxima durante 4-5 x 2 min. Por este processo foram rebentadas maisde 9θ$ das células. Os detritos celulares e as esferas de vidro foram sedimentadas por centrifugação durante 5 min., a 3θθθ rpm a 4°C. Imediatamente antes de se testar a actividade biológica os sobrenadantes foram diluidos ató 500 vezes em 0,1 M Tris-HCl pll 7,4, 0,05$ de Tween 80, 0,1$ de albumina do soro bovina.

-6οEXEMPLO 15 ί

Determinação da actividade biológica

A actividade amidolitica do scu-PA pode ser medida directamente usando o substracto sintético cromogénico tripeptidico S-2444 (piro-Glu-Gli-Arg-pNA) kabi (Kabi Vitram, Estocolmo, Suécia). Para a determinação do teor de teu-PA clivado em Lis 198 e/ou Lis 136 o ensaio foi efectuado de acordo com as recomendações do fabricante (sem activação da plasmina). Scu-PA requere a activação da plasmina antes da determinação da sua actividade amidolitica conduzindo à modificação que se segue do ensaio directo: 100 yl de amostras contendo scu-PA (ver Exemplo 14) foram pré-incubados com 0,01 U de plasmina humana (Eoehringer Mannheim, Alemanha) durante 60 min a 37⁹C. Adicionou-se 5 UI de aprotinina (Eoehringer Mamnheim, Alemanha) e incubou-se a mistura durante mais 10 min a temperatura 100 m antes da adição do substracto cromogénico S-2444 (supra).

A quantificação da actividade foi feiba por comparação com o padrão urocinase UTIO (lote 66/46) e expressa em Unidades Internacionais (u.I.). De acordo

Π , com a preparaçao comercial Ukidan (Serono, ITreiburg, Alemanha), urocinase altamente purificada isolada a partir de urina humana tem uma actividade esi^ecifica de 7θ 000-100 000 Ul/mg de proteina.

teor em scu-PA pode também ser medido através da activação do plasminogénio usando o substracto sintético tripeptidico S-2251 (Kabi Vitrum) Estocolmo, Suécia). 0 ensaio foi feito de acordo com a recomendação do fabricante (Kabi Vitrum, supra) com amostras contendo scu-PA como activador do plasminogénio em vez de estreptocinase.

Á. quantidade de antigénio presente nos caldos de fermentação de leveduras foi calculada usando o processo de transferência de pontos (dot-Blot) (Bio-Rad Riclimond, USA). Usou-se para a detecção um anticorpo polidonal de coelho anti urocinase de urina humana. As amostras foram retiradas às 24 h de fermentação e foi’am pré-tratadas como descrito no Exemplo 14. Na Tabela 1 está apresentado um sumário das actividades de activação do plasminogénio (S-2251 como substracto) com diferentes plasmideos em duas estirpes diferentes.

Tabela 1

Plasmideo	hospedeiro	selecção	Actividade com S-2251 UI/2xlO 7 células
pJDB2O7R/PHO5-UPA	HT246	leu	0
pJDB207/PH05-SSUPA	HT246	leu	2j2
pJDB207/PH05-I-UPA	HT246	leu	10
pJDB207/PH05-UPA	HT246	leu	b4
pJDB207/GAPDI.-UPA	HT246	leu	9
pDP38/GAPDL-I-UPA	HT350	leu	3
pDP38/GAPDL-l-UPA	HT350	ura	V
pDP38/GAPFL-I-UPA	HT350	leu	0^4
pDP38/GAPFL-I-UPA	HT350	ura	3/4

Na Tabela 2 está apresentada una comparação das actividades determinadas nos 3 ensaios usados. Estão indicados os titulos volumétricos totais/por ml de caldo de cultura) obtidos após 48 h de fermentação da estirpe HT246 usando o plasmideo pJDB2O7/GAPDL-I-UPA.

Tabela 2

I I

UI/ml de caldo do cultura

Actividade em S-2444 S-2444	Actividade em S-2251	Transferência de pontos (estimativa)
sem plasmina	sem plasmina
25,8	215	1670	ca. 1000

Os resultados indicam que a melhor produção do scu-PA em levedura foi obtida quando a construção de DNA inclui uma sequência sinal de levedura como seja

I a sequência sinal de PH05 ou da invertase. Os resultados indicam ainda que o scu-PA é expresso em diferentes levedu ras hospedeiras, pelo que a tivas (meio minimo de baixo fermentação em condições selecPi ou selecção de uracilo) conduz a uma productividade por 00. Aproximadamente 9θ/ especifica relativamente superxor do produto de expressão é scuI |

I i

-PA conforme indicado nas medições de actividade em S-2444 com ou sem activação da plasmina. A transferência de pontos indica que a quantidade de antigénio presente não excede significativamente a quantidade de actividade biológica medida. Assim, scu-PA recombinante de levedui-a está correctamente enrolado como no scu-PA genuíno.

EXEMPLO 16:

Recuperação de scu-PA a partir de cólulas de levedura, (30 1 de caldo de cultura

Cultivou-se S_. cerevisiae estirpe IIT246/pJDB207/GAPDL-I-UPA do mesmo modo que S, cerevisiae estirpe GRF18/pJDB207/GAPFL-IIIR na produção de Iiirudina (cf. Pedido de Patente Europeia No. 225633)« θ teor em scu-PA dentro das cólulas (após desintegração, ver Exemplo 14) foi determinado pelo ensaio amidolitico indirecto usando o substracto S-2251 (ver Exemplo 15). Após 48 li de incubação as células foram colhidas por centrifugação numa centrífuga Sharples (Appareils Centrifuges, Rueil, França) e suspensas num volume igual de tampão de lise / 200 ιπΜ K_oIIP0^, 0,2^ύ de Tween 80 7· As células foram rebentadas num moinho com esferas de vidro (Dyno-Mill, KDL, Bachofen AG, Basel; 4500 rpm, 18 1/h). Dilui-se a suspensão 5 vezes com 150 ml’ ITaCl 0,05^ Tween 80 e os detritos celulares foram sedimentados na presença de 0,6d> polietileninina a 4°C por centrifugação num separador Nestfalia SB7-47. 0 sobrenadante ligeiramente turvo foi filtrado através de uma Zetapor Cartridge (0,22 ym de poro) e ajustado a pll 6,5 com IN IIC1. Adicionou-se 1 1 do permutador S-Sepharose de fluxo rápido (Pharmacia)

por kg de células de levedura sedimentadas e a suspensão foi agitada durante lha 4?C. As esferas foram então trans feridas para uma coluna de 5 cm de diâmetro e lavadas com fosfato de sódio 50 111M pH 7,0» 150 Mí NaCl, 0,05'/ de Syraperonic. 0 scu-PA foi eluido a ura fluxo de 30 ml/min com o mesmo tampão contendo 250 mM NaCl. As fracções contendo scu-PA /conforme medido nos ensaios amidoliticos directos; cf. Exemplo 15 7 adicionou-se concanavalina A acoplada a Sepharose (Pharmacia) ( 1 ml de gel por 0,2 mg do scu-PA) e agitou-se a suspensão durante 45 min a 490. Após lavagem com lMNaCl, 10 mM fosfato de sódio pH 7,0, 0,05Çj Synperonic as esferas foram transferidas para uma coluna de 4,4 cm de diâmetro e o scu-PA eluido com 0,8 M- motil- ^-D-inanopiranosido, 150 mM NaCl, 20 mM acetato do sódio pil 4,0, 0,05/ Synperonic a um fluxo de 1 1/11. âs fracções contendo scu-PA, adicionou-se Sepharose- Ig anti-urocinase / anticorpo polidonal purificado de coelho (fracção de IgCr) induzido contra urocinase de urina humana 7 ® a suspensão foi agitada durante 45 min a 4-C. As esferas foram então transferidas para uma coluna de 2,2 cm de diâmetro e lavadas com 1M NaCl, fosfato de sódio 10 mH pll 7,0, 0,0“/. Synperonic. 0 scu-PA foi eluido com 0,1 M glicina-IICl pIT 2,4, 0,055 Synperonic a um fluxo de 1 ral/min, As fracções contendo scu-PA foram ajustadas a ρΠ 6 com IN NaOII.

Nesta fase cerca de 25-30/ da actividade total consiste em teu-PA conforme identificado pelo ensaio amidolitico directo (cf. Exemplo 15).

efluente da coluna de anticorpo foi aplicado numa coluna Mono-S (1 ml de volume de leito; Pharmacia) equilibrada com 50 ml-I fosfato de sódio ρΠ 6,0 0,05/ Synperonic. Após lavagem cora o tampão de equilíbrio o scu-PA foi eluido com um gradiente de passas discretos do tampão de equilíbrio e de um tampão B composto por 500 mM NaCl, 50 mM fosfato de sódio p*I 7,0, 0,05/ Synperonic

a uin fluxo de 1 ml/min. Por esta eluição foram observados dois picos de actividade, um pico eluido no primeiro passo a 30$ do tampão B e o outro no segundo passo a 55$ do tampão B. 0 ensaio afftidolitico dirocto rovelou que a fracção eluida a 30$ de B apresenta ainda uma grande quantidade de tcu-PA, enquanto que a fracção eluida a 55$ de B apresenta apenas 1-3$ de tcu-PA.

scu-PA de levedura produzida deste modo migra como uma única banda de aproximadamente 51 kd de peso molecular por elcrtroforese em gel de SDS-poliacrilamida em condições não redutoras. 0 scu-PA obtido tem uma pureza de cerca de 95$ ou mais conforme avaliado pelo ensaio amidolitico directo (cf. Exemplo 15) e por elect ro forese em gel do SDS-poliacrilamida em condições redutoras.

EXEMPLO 17:

Estado de glicosilação do scu-PA de levedura

A glicosilação foi determinada com 125 um ensaio do cobertura com I-concanavalina A após electro forese em gel. A concanavalina A é uma lectina de plantas que reconhece especificamente resíduos manose. 0 scu-PA pu rificado a partir de levedura assim como o u-PA padrão Ukidan^ (Seromo, Freiburg, Alemanha) foram sujeitos a electroforese em gel em géis de 10$. As proteínas foram então fixadas ao gel em 7$ de ácido acético durante 3θ min.

o gel em tampão de lectinas tendo a seguinte composição:

0,15 M NaCl ml-I Tris-HCl pll 7,^

0,5 mH CaCl₂

0,5 iriM MnCl_o £

Continuou-se a lavagem até o pll atingir 7,3. θ gd foi então cuidadosamente coberto com 2 ml de tampão de lectinas contendo 3 mg de hemoglobina, 100 yg de concanavalina A

coberto com a mistura atrás referida suplementada com metiImanosido 0,2M. Após 3 h de incubação numa câmara humidificada, os géis foram extensivamente lavados em tampão de lectinas secos e expostos a filmes de raios -X. Sem

culares são essencialmente idênticos. Na presença do'X- me ti Imano sido, um inibidor competitivo da ligação de lecitj.

na, a urocinase de urina humana desapareço, enquanto que o scu-PA de levedura ainda é visivel. Isto indica que o scu-PA de levedura ó glicosilado e que a sua glicosilação é de um tipo diferente da urocinase de urina humana.

EXEMPLO 18:

Purificação de scu-PA

Uma solução de scu-PA (cf. Exemplo

16) dialisada contra 0,05 M Tris-HCl plí 8,0, 0,05$ Tween 8o, 0,05 M NaCl foi aplicada numa coluna de 3 ml de benzamidina-Sepharoso (Pharmacia, Uppsal, Suécia) e lavada com tampão

-67Tris-HCl pH 8,0 contendo 1 M NaCl. Seu-PA foi totalmente recuperado no efluente e na solução de lavagem enquanto que o subproduto tcu-PA pode ser eluido da coluna com tampão 0,05 M Tris-IICl pll 8,0, contendo L-arginina 1 M. 0 seu-PA obtido tem uma pureza de aproximadamente 0,8$ ou mais.

EXEMPLO 19:

Mutação do sitio de glicosilação em / Asn 302 7 da cadeia

B da urocinase

a) Clonagem de um fragmento PstI-Bam IH do u-PA em M13 mp 18: 0 plasmideo nJDB207/Pn05-I-UPA (ver Exemplo 3) contem a região codificadora completa da urocinase. 0 DNA foi cor tado com PstI e Bam III. 0 fragmento PstI-BaniIII de 886 pb do gene da urocinase contem o sitio da glicosilação (Asn 302) nas posições de nucleotideos 1033-1041. Um outro frag mento de tamanho semelhante foi ainda cortado por Pst E II 0 fragmento Pstl-BamHT de 886 pb foi isolado num gel preparativo de 0,8$ de agarose.

Cortou-se RF-DNA de M13mp 18 com PstI e Bam IH, 0 fragmento de 7,3 kb foi isolado num gel preparativo de 0,8$ de agarose. Os fragmentos de DNA foram electroeluidos do gel de agarose e purificados por cromatografia em DE 52 e precipitação com etanol.

— 68—

Ligaram-se 0,1 pmoles do vector cortado com Pst I-Bam IH de 7,3 kb e 0,2 pmoles do fragmento Pstl-BamlH de 886 pb do u-PA. Usou-se 1 u,l e 3 y.1 da mistura de ligação para transformação de células B. coli +

JM 109 Ca de acordo cora o manual ”M13 cloning and sequencing handbook publicado pela Amersham. Repicaram-se 12 placas incolores e preparou-se DNA de cadeia simples /“j. Messing, Methods in Enzynology 101, 21-78 (1983).?· 0 DNA de ca'eia simples foi usado para preparar DNA de cadeia dupla parcial para emparelhamento e prolongamento do iniciador universal de 1113 com DNA polimerase klenoar. 0 produto de reacção foi extraido com fenol/clorofórmio e o DNA precipitado com etanol. Cortou-se o DNA em PstI e Bam

III. Um fragmento de 886 pb indicou que o fragmento de u-PA foi clonado no vector M13 mp 18. Um clone foi ainda analisado e a inserção correcta confirmada por sequenciação. 0 clone foi referido como M13 mp 18/UPA.

b) Mutação do sitio de glicosilação em Asn 302:

Tre

Inserção de M13mpL83*....AAA CCT

TTT

CTC

TTA

AGA

TGG

CTG ATA...5' (cadeia anticodão) iniciador mutagenico

W·

5'-GGA

AAA

GAG

CAA

TCT

ACC

GAC-3' cadeia codificadora mutagenizada . .TTT GGA

AAA

GAG

CAA

TCT

ACC

GAC TAT.. . 3'

0 2 li iniciador de sequenciação : CTGCCCTCGATGTATAACG

6 7

985

-t>9-

Os iniciadores de mutação e sequenciação foram sintetizados usando o método de fosforamideto /~M, II. Carutliers, em: Cliemical and Bnzymatic Syntliesis of Gene Fragments, (ed. II. G. Gassen e A. Lang) Verlag Chemie, Ueinheim, Federal Republic of Germany) num sintetizador Applied Biosystem Model 380 B.

A mutagénese in viiro num DNA molde de cadeia simples foi efectuada como descrito por Γ.Α. Kunkel /“Proc, Nat, Acad. Sei. USA 82, £88-492 (1985)_/ Produziu-se DNA molde de cadeia simples contendo uracilo através de um ciclo de crescimento em E. coli estirpe RZ 1032 (dut“, ung”).

100 pmoles do iniciador oligonucleo tidico mutagénico N foram fosforilados em 20 /11 de 50 mM Tris-IICl pll 7,5, 10 πΦΙ MgCl_o, 5 mH DTT, 0,5 mM ATP e 20 unidades de cinase de polinucleotideos de t4 (Boehringer). Após 30 min., a 37^SC a reacção foi parada por aquecimento a 7O2C durante 10 min.

0,3 pmoles de DNA molde 1113 mp 18/ /UPA contendo uracilo foi incubado com 10 pmoles do oligodesoxirribonucleotideo iniciador mutagénico W fosforilado e 10 pmoles do iniciador de sequenciação universal de 1113 em 30 μΐ de 10 mM Tris-IICl pll 8,0, 10 mN MgCl_o. A amostra

A* foi aquecida a SO^C e deixada arrefecer até à temperatura ambiente num pequeno banlio-maria.

c) Reacção de extensão-ligação:

Λ amostra emparelhada atrás referida adicionou-se 10 μΐ de uma mistura de enzima-dNTP contendo lniM dNTPs, 10 mM Tris-IICl pH 8,0, 10 mM I-IgCl₂, 20 mH DTT, 1 mM ATP, 400 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs 400 U/μΐ) e 6 unidades de DNA poliinerase klenow (Boeliringer 6 U/μΐ). Fez-se a incubação durante a noite a 15^ρ0.

d) Transformação de células 3. coli D1-HI71:

A mistura de ligação foi diluida para 200 μΐ com TE. Adicionou-se 0,1 yl, 1 jil e 10 yl da mistura de extensão-ligação a células competentes B. coli BMH71 Ca^⁺ (iíunkel, supra). Após 30 min. era gelo as células foram sujeitas a choque térmico durante 3 min a 42-0 e depois mantidas em gelo. Semearam-se as células com agar de topo e células indicadoras D. coli JI-I 101.

Repicaram-se o placas que se usaram para infectar 2. coli JM 109. Os fagos foram isolados a partir do sobrenadante por precipitação com PBG. 0 DITA de cadeia simples foi preparado por extracção com fenol e precipitação com etanol. Os DNAs moldes são ressuspensos em TE.

A mutação do codão ΑΛΤ (Asn 302) para o codão CAA (Gin 302) foi confirmada pa.ua um clone através da determinação da sequência de DNA com o iniciador de sequenciação atrás referido usando o método de determinação de cadeias / F. Sanger et al Proc. Natl. Acad, Sei. USA 74, 5463-67 (1977) J. A mutação resulta numa troca Asn ^>Glu na posição de aminoácidos 302 de u-PA e portanto elimina o único sitio de glicosilação na. urocinase, designa a mutação do sitio de glicosilação na cadeia B do u-PA (Asn 302 Gin 302 ). Não se encontraram quaisquer outras mutações na sequência codificadora do u-PA. 0 clone positivo foi designado como M13mpl8/UPA-W.

IPLO

Mutação de /^Lis 135_7 -^Gli

A clivagem proteolitica do scu-PA na ligação Lisl35-Lisl3ú conduz à formação de urocinase de baixo peso molecular. 0 sitio de clivagem dibásico foi eli minado por mutação in vitro de /“Lis 1-35 _7 para glicina

135 136

I Ii-S I lis inserção de M13mp 3’..

(cadeia anti-codão) iniciador mutagénico

ACG CGT CTA CCT TTT TTC GGG AGG AGA.....

5'- GCA GAT GGA GGT AAG CCC TCC -3'

5' cadeia codifica- 5'.. /.TGC GCA GAT dora mutagenizada

GGA GGT AAG

CCC

TCC TCT.....

3'

523

51< 3 jorocesso pura a mutagánese in vitro está descrito no Exemplo 19· Preparou-se cadeia simples codificadora niutagonizada. A mutação do codão AAA (Lis 135) para o codão GGT (Gli) foi confirmado pox’ sequenciação de DNA usando o iniciador universal de 1-113 (Biolabs). A mutação / Lis 135 7 -7 Gli resulta na eliminação do sitio de clivagem proteolitica no aminoácido 135 na cadeia A da urocinaso. Um clone com o DNA mutagonizado foi designado 1113 mplS/UPA-LG.

EXEMPLO 21:

Mutação de / Lis 135_7-^Ser:

genizado para serina de aminoácido /~Lis 135 7 foi riutamodo análogo ao Exemplo 20.

135 136 [lÍsIús

Inserção de M13mp 3'.....ACG CGT (cadeia anti-codão) iniciador mutagénico LS 5’- GCA cadeia codificado- 5¹'.....TGC GCA ra mutagenizada·

523

CTA CCT TTT TTC GGG AGG AGA5'

GAT GGA AGT AAG CCC TCC -3'

GAT GGA AGT AAG CCC TCC TCT3'

Iser

5U3

**?

- í _j“

A mutação do codão ÀAA (Lis 135) para o codão AGT (Ser) foi confirmada por sequonciação do DNA molde de cadeia simples usando o iniciador universal de M13. Um clone com a mutação correcta foi designado M13 mp 18/UPA-LS.

EXEMPLO 22:

Mutação de / Fen 157 _7 <yA.sp u-PA de cadeia simples fo.i convertido no u-PA de duas cadeias por clivagem proteolitica da ligação Lis 158-1le 159 pela plasmina. A trombina cliva a ligação Arg 156-Fen 157. Para evitar a clivagem proteolitica do scu-PA pela plasmina e trombina / Fen 157^7 foi mutagenizada para Asp.

Inserção de M13mp 3'...GA GAC TCC 18 (cadeia anti-codào) iniciador mutagenico P 5'- G AGG cadeia codificado- 5'...CT CTG AGG ra mutagenizada .

588

156 157 158 159

Arg|Fén|ii_s Ile

GGG GCG AAA TTC TAA TAA CCC CC...5'

CCC CGC GAC AAG ATT ATT G -3'

CCC CGC GAC AAG ATT ATT GGG GG...3'

I Asp I

0

A mutação do codão TTT (fen 157) para o codão GAC (Asp 157) foi confirmada por sequenciação de DNA usando o iniciador universal de 1-113 (Biolabs). A mutação / Fen 157 7 Asp resulta na eliminação dos sitios de clivagem proteolitica da posição de aminoácidos 156 pela trombina o da posição de aminoácidos 158 pela plasmina na urocinase de cadeia simples. Um clono com o DNA mutagenizado foi designado 1118 mp 18/UPA-P.

EXEMPLO 23:

Transferência da mutação / Gin 302 7 do clone 1-113 para a cassete de expressão em levedura

M13 mp 18/UPA-U contem uma inserção de DNA mutagcnizada codificadora de urna sequência de aminoácidos com uma única alteração (Glu 302) que elimina o sitio de glicosilação na cadeia 3 da urocinase. 0 fragmento de DNA com a mutação foi transferido para o plasmideo de expressão em levedura pJDB2O7/PnO5“I~UPA.

plasmideo pJD3207/l-UPA foi cortado com Sal I e Bam IH. 0 fragmento vector de 6,6 kb foi isolado. Ele contem a parte 3’ do gene do u-PA desde o sitio Bam ^TH na posição de nuclootideos 1323 (Fig. 1) ate à posição 1441 (sitio Pvu II com adaptadores Xho I adicionados) e os sinias de terminação da transcrição de PII05.

Digeriu-se nJDB207/PII05 com Sall e PstI. 0 fragmento SalI-PstI de 1,2 kb foi isolado e electroeluido do gel. 0 fragmento de DNA contem a sequência Sall-Bam IH do pBR322, o promotor PTI05. a sequência sinal

da invertase e a sequência codificadora do u-PA no sitio PstI.

Preparou-se RF-DNA de M13mpl8/UPA~W (ver Exemplo 19) pelo processo rápido de isolamento de DNA / D. S. Ilolmes et al. . Analyt. Brochem. 114 (1981) 193-197-7» Digeriu-se 5 yg de DNA com Bam IH e Pst I. Após adição de 2 pg de RNase (Serva) e incubação 5 min a 37⁹C, isolou-se o fragmento Pst I-Dam III de 886 pb num gel preparativo de 0,8$ de agarose. 0 fragmento do DNA foi electroeluido e precipitado com etanol. 0 fragmento contem a mutação ΑΛΤ - CAA nas posições de nucleotideos 1033-1035 (Asn 3θ2 - Gin) na cadeia B da urocinase. Ligaram-se o fragmento Sal Ι-Pst I de 1,2 k e o fragmento Pst I-Bam IH de 886 pb, 0,2 pmoles de cada e 0,1 pmoles do fragmento vector SaU-Bam TH de 6,0 kb. Transformaram-se células competentes E. coli UB 101 Ca''

Cultivaram-se 12 transformantes resistentes à ampicilina. 0 DNA de plasmideo foi isolado e analisado por cortes de restrição cora Eco RI e HindIII. A mutação (u) no sitio de glicosilação destrói o sitio Eco RI nas posições de nucleotideo 1032-1037» A presença do mutação for confirmada por sequenciação de DNA. 0 DNA de um plasmideo com a mutação foi designando pJDB 207/ /PH05-I-UPA-W.

De modo analogo usaram-se os fragmentos Pstl-BamlH de M13 mpl8/UPA-P, M13 mp 18/UPA-LG e M13 mp 18/UPA-LS para a construção de pJDB207/PII05“I-U’PA-P, pJDB207/PH05-T-UPA-LG e pJDDB2O7/PHO5-I-UPA-LS. respecti. vamente.

plasmideo pJDB 2O7/PHO5-I-UPA-LG (ver Exemplo 23) foi cortado com Sall e Bali. 0 fragmento Sall-Ball de 1,3 kb contem a sequência SalI-BamIII pBR322, o promotor PH05. a sequência sinal da invertase e a sequência codificadora do u-PA até ao sitio Bali portador da mutação Gli 135.

plasmideo pJDB207/PII05-I-UPA-P (ver Exemplo 23) foi digerido com Bali e BamlH. 0 fragmento BalI-BamlH de o,7 kb é um fragmento interno da sequência codificadora do u-PA portadora da mutação Aspl57.

fragmento Sal-BaII de 1,3 kb, o fragmento Ball-Bam IH de o,7 kb e o fragmento vector Sall-BamlII de 6,6 kb (Exemplo 23) foram ligados. Transforniaram-se células competentes E. coli ΠΒ1Ο1. 0 DNA de plasmideos dos transformantes foi isolado e analisado por digestão com enzimas de restrição e sequenciação do DNA. Seleccionou-se um único clone com a sequência de nucleotideos esi^erada codificador das mutações Gli 135 e Asp 157 e designou-se pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LGP.

De modo análogo constxtí.u-se pJDB2O7/ /PII05-I-UPA-LSP usando o fragmento Sall-Bali de pJDB2O7/PHO5 -I-UPA-LS.

EXEMPLO 25:

Construção do plasmideo pJDD2O7/PHO5-I-UPA- (GPU) codifica dor de /Gli 135, Asp 157, Gin 302_7-u-PA

A combinação de três mutações nas sequências de aminoácidos resulta em / Gli 135, Asp molécula de urocinase tem do u-PA nas posições 157, Gin 302 7-u-PA.

135, 157 e 302

Esta nova os locais de clivagem protoolitίση na posição 135 (Lis Gli) e 157 (Fen ^>Asp) assim como o sitio de glicosilação na posição 3θ2 (Asn - Gin) eliminado por mutação.

plasmideo p.íΡΒ207/ΡΠ05-I-UPA-LGPV codifica a urocinase mutante e foi construído do seguinte modo:

Digeriu-se o plasmideo p.iDD207/PH05

-I-UPA-LGP com Sall e Xho I, Isolou-se o fragmento Sall

-Xho I de 2,2 kb, electroeluiu-se do gel de agarose, purificou-se por cromatografia em DE52 e precipitou-se em etanol. Este fragmento de DNA contem três sítios MstI no promotor ΡΠ05 e a sequência do u-PA 3 pg do fragmento Sall-Xho I de 2,2 kb foram x>arcialmente digeridos com 3 unidades de Mst I durante 1 li a 37⁹C. Separaram-se os produtos de reacção num gel preparativo de 0,8/> de agarose e iso

o fragmento Sall-MstI de 1,7 kb e electroeluiu-se do gel. 0 fragmento de DNA contem a sequência SalI-BamlH do pDR322 o promotor de PII05. a sequência sinal da invertase e a sequência codificadora do u-PA até ao sitio PstI na posição de nucleotideos 935.

( »

de RF-DNA de M13 mp 18/UPA-U (ver Exemplo 19) foram digeridos com BamIII e MstI. Após adição de 2 yig de RNase (Serva) e incubação 5 min a 37⁵O o fragmento Mstl-BamlH de 387 pb foi isolado num gel preparativo de 0,8$ de agarose. 0 fragmento de DNA foi electroeluido e precipitado em etanol, 0 fragmento contem a mutação ΑΛΤ - CAA nas posições de nncleotideos 1033-1035 (Asn 302 - Gin) na cadeia B da urocinase.

Ligaram-se os fragmentos Sall-Mstl de 1,7 Rb, MstI-DamIII de 387 e o fragmento vector SalI-BamIII de 6,6 kb (Exemplo 23). Transformaram-se células competentes de E. coli HB101 com uma amostra da mistura de ligação. 0 DNA de plasmideo dos transformantes amp ^v foi isolado e analisado por digestão de restrição com HindIII e EcoRI e por soquenciação de DNA, Um clone isolado com a sequência de nucleotideos esperada da inserção do u-PA codificando as mutações Gli 135, Asp 157 o Gin 3θ2 foi seleccionado e designado nJDB207/PH05-I-UPA-LGPI,^r,

De modo análogo construiu-se pJDB207 /PII05-I-UPA-LSPU usando o fragmento SaII-MstI d» pJDD207/ /PH05-I-UPA-LSP

EXEMPLO 26.»

Transformarão de S,. cerevisiae estirpes ΠΤ246 e GRF18 e cultura das estirpes transformadas

Saccharomyces cerovisiae estirpes TIT246 e GRF18 foram trans formadas com os plasmideos pJDB2O7/PHO5-I-UPA-W pJDB207/PH05-I-UPA-P pJDB207/PH05-I-UPA-LG pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LS pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LGP pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LSP pJDB207/PH05-I-UPA-LGPW pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LSPW usando o protocolo de transformação descrito por Hinnen et al. , /Proc.Natl. Acad. Sei. USA Zl, 3.929 (197S)_7. As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio minimo para levedura deficientes em leucina. As colónias de leveduras transformadas foram isoladas e re feridas como

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-W

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-P

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB2Q7/PHO5-I-UPA-LG

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LS

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-LGP

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LSP

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA~LGPW

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-LSPW

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-W

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5-I-UPA-P

Saccharomyces cerevisiae GRFI8/pJDB207/PH05-I-UPA-LG

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LS

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LGP

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LSP

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LGPW

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LSPW.

As estirpes foram cultivadas cie modo análogo ao descrito no Exemplo 14. As proteínas mutan tes scu-PA foram isoladas de modo análogo ao descrito nos Exemplos 16 ou 18.

EXEMPLO 27:

Primeira composição farmacêutica para administração parenteral

Preparou-se uma solução para administração parenteral dissolvendo 3 mg de scu-PA purificado 25 mg de rianitol e 45 mg do cloreto de sódio em 5 ml de água esterilizada e misturando a solução resultante com um volume adequado de solução de glucose a 5$. Esterilinou-so a solução por filtração através de um filtro de 0,22 μη.

EXEMPLO 28:

Segunda composição farmacêutica para administração parenteral (dispersão para injecção)

169,3 mg do lecitina de soja, (fosfatido de soja NC 95, fabricante: Nattermann, Cologne, Alemanha; 9⁰-96$ de pureza; composição em ácidos gordos, ácido linoleico 61-71$, ácido linolénico 4-7$, ácido oleico 6-13$ ácido palmintico 10-15$·, ácido esteárico 1,5-3,5$) e 92,7 mg do glicolato de sódio puro foram dissolvidos em 752, de água esterilizada.

A solução foi ajustada a pll 7,4 com

UI NaOII. Adicionou-se 10 mg de s?u-?A liofilizado.

Agitou-s a mistura até se obter uma solução limpida*

3s t erili zou-se a solução por filtração através de um filtro de 0,22 μη:

o encheram-se ampo las .

As composições farmacêuticas conten do mutantes seu-PA como ingrediente activo foram preparadas de modo análogo ao descrito nos Exemplos 27 o 28,

Depósito de microorganisnios

As estirpes de mioroorçaaismós que se seguem foram deposita das no Deutsche Sammlung von Nikroorganisraen (DSM) *

Grisebachstrasse 8, D-34OO Gõttingen,

Mascheroder Vog lb, D-33--O 3ra.unsch.weig (são dadas as datas de dep_ositos e números do acosso):

Saccharomyces 4084;

Escherichia corovisiae ΙΓΡ 246:

coli

HflOl/pCSló do Abril do 1987;DS’I

DSM 4.294; Escherichia

DSM 4290;

Escherichia coli coli .•E3101/pcUi:i7ó: 23 do Outubro de 1987;

HD10l/p31A/3S-TPA f: 23 de Outubro de

1987; DSli 4295;

Escherichia coli

DSM 4414

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES:

   13. - Método para a produção de activador do plasminogénio tipo urocinase de cadeia simples humano ou um seu mutante caracterizado por se efectuar a cultura, em condições nutritivas adequadas, de uma estirpe de levedura transformada com um vector híbrido compreendendo uma sequência de controlo da expressão de levedura, um segmento de DNA consistindo numa primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal a montante e na mesma grelha de leitura de uma segunda sequência de DNA codificadora do activador do plasminogénio tipo urocinase maduro ou um seu mutante, segmento de DNA este que está sob o controlo transcricional da referida sequência de controlo de expressão e uma sequência de DNA compreendendo sinais de terminação da transcrição de um gene de levedura e isolamento do referido activador do plasminogénio tipo urocinase ou seus mutantes.

   23. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um mutante do activador do plasminogénio tipo urocinase de cadeia simples humano resistente a proteases.
2. 3^S. _ Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um mutante do activador do plasminogénio tipo urocinase de cadeia simples humano em que o sitio de glicosilação é modificado de modo a não poder haver glicosilação neste sitio.

   i

   - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir uma proteína da fórmula I

   Ser Asn Glu Leu His Gin Vai Pro Ser Asn Cis Asp Cis Leu Asn Gli Gli Tre Ci s Vai Ser Asn Ll s Tir Fen Ser Asn Ile His Trp Cis Asn Cis Pro Lis Lis Fen Gli Gli Gin His Cis Glu Ile Asp Lis Ser Lis Tre Cis Tir Glu Gli Asn Gli His fen Tir Arg Gli Lis Ala Ser Tre Asp Tre Met Gli Arg Pro Cis Leu Pro Trp Asn Ser Ala Tre Vai Leu Gin Gin Tre Tir His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gin Leu Gli Leu Gli Lis His Asn Tir Cis Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp Cis Tir Vai Gin Vai Gli Leu Lis Pro Leu Vai Gin Glu Cis Met Vai His Asp Cis Ala Asp Gli Xi *2 Pro Ser Ser Pro Pro Glu

   Glu Leu Lis Fen Gin Cis Gli Gin Lis Tre Leu Arg Pro Yi Y₂ Y₃ Ile Ile Gli Gli Glu Fen Tre Tre Ile Glu Asn Gin Pro Trp Fen Ala Ala Ile Tir Arg Arg His Arg Gli Gli Ser Vai Tre Tir Vai Cis Gli Gli Ser Leu Ile Ser Pro Cis Trp Vai Ile Ser Ala Tre His Cis Fen Ile Asp Tir Pro Lis Lis Glu Asp Tir Ile Vai Tir Leu Gli Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Tre Gin Gli Glu Met

   Lis Fen Glu Vai Glu Asn Leu Ile Leu His Lis Asp Tir Ser Ala Asp Tre Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lis Ile Arg Ser Lis Glu Gli Arg Cis Ala Gin Pro Ser Arg Τχ-θ Ile Gin Τχ-θ

   Ile Cis Leu Pro Ser Met Tir Asn Asp Pro Gin Fen Gli Tre Ser Cis Glu Ile Tre Gli Fen Gli Lis Glu Zi Ser Z₂ Asp T r Leu Tir Pro Ghi Gin Leu Lis Met Tre Vai Vai Lis Leu Ile Ser His Arg Glu Cis Gin Gin Pro His Tir Tir Gli Ser Glu Vai Tre Tre Lis Met Leu Cis Ala Ala Asp Pro Gin Trp li s Tre Asp Ser Cis Gin Gli Asp Ser Gli Gli Pro Leu Vai Cis Ser Leu Gin Gli Arg

   Met Ire Leu Tre Gli Ile Vai Ser Trp Gli Arg Gli Cis Ala Leu Lis Asp Lis Pro Gli Vai Tir ΤΓ® Arg Vai Ser His Fen Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Tre Lis Glu Glu Asn Gli Leu Ala Leu em que X^ e independentemente um do outro representara Lis, um residuo de eminoácido que não seja um residuo de aminoácido básico ou uma ligação quimica, Yj & Arg, um residuo de aminoácido que não seja um residuo de aminoácido básico ou uma ligação quimica, Yg é Fen, um residuo de aminoácido acídico ou uma ligação quimica, Y^ é Lis, um residuo de aminoácido que não seja um residuo de aminoácido básico ou uma ligação quimica, e Asn que é glicosilada especificamente pela levedura ou é um outro residuo de aminoácido e Zg á Tre ou um outro residuo de aminoácido diferente de Ser.
3. 5-. - Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se produzir uma proteína da fórmula I, em que X^ é Lis, Gli ou Ser, X% representa Lis, Y^ é Arg, Yg é Fen, Asp ou Glu, Y^ é Lis, é Asn que é glicosilada especificamente por levedura ou Gin e Z_o é Tre.
4. 6a. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um activador do plasminogénio tendo a sequência de arainoácidos do activador do plasminogénio tipo urocinase de cadeia simples humano natural em que Asn 302 é glicosilado especificamente por levedura.

   I

   I i
5. 7⁵. - Método de acordo com a rei- | i vindicação 1, caracterizado por se produzir um activador | do plasminogénio seleccionado do grupo constituído por!

   scu-Pa, /“Glil35_7-scu-Pa, /“Serl357-scu-Pa, /^Aspl^./-seu-Pa, /Serl35, Aspl57_7-scu-PA e /G1Í135, Aspl57 7“ ** 30?—

   -scu-PA em que Asir é especificamente glicosilado por levedura, /Gln302_7-scu-PA, /“Gli 135,Aspl57, Gln302_7-scu-

   -PA e /“Ser135, Aspl57, Gln3O2_7-scu-PA.
6. 8 ^a. ~ Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a estirpe de levedura ser uma estirpe de Sacharomyces cerevisiae,
7. 9^a. - Método para a produção de um vector híbrido de levedura compreendendo uma sequência de controlo da expressão em levedura, um segmento de DNA consistindo numa primeira sequência de DNA codificadora de peptideo sinal a montante e ra grelha de leitura de uma segunda sequência de DNA codificadora de activador da plasminogénio tipo urocinase maduro ou um seu mutante, segmento de DNA este que está sob o controlo transcricional da referida sequência de controlo da expressão e uma terceira sequência de DNA compreendendo sinais de terminação da transcrição de um gene de levedura caracterizado por se efectuar a introdução num DNA vector numa ordem predeterminada referida sequência de controlo da expressão em levedura e das referidas primeira e segunda e terceira sequências de DNA.
8. 10&* _ Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se produzir um vector híbrido de levedura compreendendo um promotor de levedura PH05 ou GAPDH.
9. 11^a. - Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se produzir um vector híbrido de levedura compreendendo uma sequência sinal derivada do gene PII05 de levedura, do gene da invertase de levedura ou do gene da urocinase humana.

   3612^, - Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se produzir um vector híbrido de levedura compreendendo os sinais de terminação da transcrição do gene PII05 de levedura.

   135, _ Método para a produção de um hospedeiro levedura transformado contendo um vector híbrido compreendendo uma sequência de controlo da expressão de levedura, um segmento de DNA consistindo numa primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal a montante e na grelha de leitura de uma segunda sequência de DNA codificadora do activador do plasminogénio tipo urocinase maduro ou um seu mutante, segmento de DNA este que está sob o controlo transcricional da referida sequência de controlo da expressão numa sequência de DNA compreendendo sinais de terminação da transcrição de um gene de levedura, caracterizado por se efectuar a transformação de um hospedeiro levedura com o referido vector híbrido.