JPS60256385A - 酵母においてヘテロローガスポリペプチドを効率よく発現するための方法、ベクターおよび形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヘテロローガスポリペプチドをコードつけて
いるヌクレオチドの高レベルの発現を誘導する方法を提
供するものである。かかる方法は、翻訳解読フレーム内
において、酵母ＹＧ１００遺伝子の転写および翻訳活性
化配列および生理活性を有するポリペプチドをコードつ
けているヌクレオチド配列を含んでいるＤＮＡで形質転
換された酵母細胞を培養することからなる。高レベルの
発現別 は、定常増殖期またはその付近でこの形質転換酵母細胞
を培養することにより達成される。あるいは、好気性培
養の後、この形質転換された酵母細胞をまず嫌慨性条件
に付し、次いで好気性条件に付してもよい。無酸素状態
から回復させ、適当な温度にて、定常増殖期またはその
付近で培養することにより、酵母ＹＧ１００Ｇ１００転
写活性化溝され、その結果、生成物が効率良く発現され
る。

本発明はさらに、前記方法を用いるのに必要な組換えＤ
ＮＡ発現ベクターおよび形質転換体を提供するものであ
る。

酵母における組換えＤＮＡ技術の開発及び利用法は、一
般にベクター類および高レベルでの遺伝子発現法が不足
していることより制約されて来た。

ＰＧＫ〔ドブソンら、ヌクレイツク・アシツズ・リサー
チ（Ｄｏｂｓｏｎｅｔ　ａ＋＋、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ″）　Ｒ８５ｏ、６１９、。８゜６゜５　（１
９８゜）　）ＪＥ。

２〔カサダバンら、メソツズ・イン・エンザイモロジー
（Ｃａ５ａｄａｂａｎ　ｅｔ　ａｌ□Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）１００（Ｂｌ：　２９３
　（１９８３）　）、ＨＩ　Ｓ　Ｃ）−ナヒューラ、ジ
ー：／　（Ｄｏｎａｈｕｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｇｅｎｅ）１８：４７（１９８２）、シルバーマンら、
モレキュラ・アンド・セリュラ・バイオロジー（Ｓｉｌ
ｖｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ　ｋ　Ｃｅ１ｌｕ
１．Ｂｉｏ　）　２　：１２１２（１９８２））および
ＡＤＨ（ラッセルら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル中ケミスト　リ　−　（Ｒｕｓｓｅｌ　ｃｃａｌ　、
Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ）２５８：２６７４（１９
８３〕〕プロモーターシステムは公知であるが、酵母に
おいてヘテロローガスなポリペプチドを発現させるのに
利用し得るその他のＤＮＡ配列および方法はほとんどな
い。本発明は、効率よく遺伝子を発現させる方法を提供
することによりこの問題を緩和するのに貢献し、従って
、技術分野におけるめざましい進歩を意味するものであ
る。

本明細書において開示される本発明に関して、次に挙け
る語を以下の様に定義する。

組換えＤＮＡ発現ベクター：自律的複製またはゲノム組
込みが可能なあらゆる作用物質であって。

ｌもしくはそれ以上の転写および翻訳活性化配列カ挿入
されたＤＮＡ分子からなる。プラスミドが挙げられるが
これに限定されない。

転写活性化配列：ＤＮＡをｍ　Ｔ（Ｎ　Ａ転写物に転写
するためのＤＮＡ配列。

翻訳活性化配列：ｍＲＮＡ転写物をペプチドまたはポリ
ペプチドに翻訳するためのＤＮＡ配列翻訳開始シグナル
：翻訳開始コドンをコードつけているＤＮＡ）リプレッ
ト 翻訳停止シグナル：翻訳停止コドンをコードつけている
ＤＮＡトリプレット 形質転換：受容宿主細胞にＤＮＡを導入し、遺伝子型を
変えること。

形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。

制限フラグメント：１またはそれ以上の制限酵素の作用
により生じた線状ＤＮＡ０ レプリコンまたは複製開始点二組換えＤＮＡクローニン
グおよび発現ベクターの複製をコントロール（制御〕す
るＤＮＡ配列。

機能性ポリペプチド：回収可能な生理活性へテロローガ
スポリペプチドまたは前駆体、ヘテロローガスポリペプ
チドとホモローガスポリペプチドの一部または全体から
なる回収可能な生理活性ポリペプチド、またはへテロロ
ーガスポリペプチドと、特異的に開裂し得る生理不活性
なポリペプチドからなる回収可能な生理的に不活性な融
合ポリペプチド。

融合遺伝子産物：ホモローガスなポリペプチドの一部ま
たは全体を含んでいる回収可能なヘテロローガスポリペ
プチド。

発明の詳細 な説明は、自律的復製またはゲノム組込みが可能な、選
択可能なりＮＡであって、翻訳解読フレーム内に酵母Ｙ
Ｇ１００遺伝子の転写および翻訳活性化配列および機能
性へテロローガスポリペプチトヲコードしているヌクレ
オチド自己列を、含んでいるＤＮＡで形質転換した酵母
細胞を、（１１増殖および遺伝子発現に適した条件下で
、定常増殖期またはそのイ」近で培養するか、または、
該形質転換細胞を、 （２）好気性増殖に適した条件下で培養し、に （３）その好気ツタ殖させた細胞を嫌気性増殖に適した
条件下で培養し、そして （４）その嫌気的に増殖させた細胞を好気性増殖および
遺伝子発現に適した条件下で培養する（たたし、所望に
より工程＋２１．　＋３１または（４）のいずれかにお
ける培養を、定常増殖期またはその付近で行なうこと、
および好気性増殖の条件に戻した時に誘導が起こるのに
十分な時間、嫌気性増殖条件に維持することを条件とす
る） 工程からなる、酵母ＹＧ１００遺伝子の転写および翻訳
制御下にあるヌクレオチド配列の高レベルの発現を誘導
する方法を提供するものである。

本発明は、さらに前記方法を実施するのに用いられる組
換えＤＮＡ発現ベクターおよび形質転換体を提供するも
のである。

本発明は、プラスミドｐｌＴ１２０の〜１．３ｋｂ、）
　Ｂｇ１１］−ＢａｍＨＩ７ラグメントをＢａｍＨＩ−
消化プラスミドｐＭｃ１５８７　に結紮することにより
酵母ｙｃｉＯＯ遺伝子の転写および翻訳活性化配列を含
んでおり、これは、ノーザン・ジージョナル・リサーチ
・ラボラトリ−（Ｎｏｒｃｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ
Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｅｏｒｉｄ
ａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）　ニ寄託されて永久保存培養
菌株となっているＥ、Ｃｏ１１Ｋ１２　ＪＡ２２１／ｐ
ＩＴ１２０より得られる。該株は、このプラスミドの好
ましい供給源および保存株として、寄託番号ＮＲＲＬＢ
−１５６０３号で入手できる。このプラスミドｐＭｃ１
５８７出発物質は、ｐＢＲ３２２レプリコン、アンピシ
リン耐性遺伝子、酵母２ミクロンＤＮＡからの配列、Ｌ
ＥＵ２遺伝子、およびＬａｃＺ遺伝子の第８番目のアミ
ノ酸に関する暗号情報内にＢａｍＨＩサイトを含んでい
る改良されたラックオペロンを含んでいる。

該プラスミドは、ノーザン・ジージョナル・リサー　チ
ーラホラトＩＪ　−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎ
ａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｅｏ
ｒｉａ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）に寄託され、永久保存
培養菌株となっているＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２ＪＡ２２１
／ＰＭＣ１５８７より得られる。該株は。

このプラスミドの好ましい供給源および保存株として寄
託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５４４２号で入手できる。

プラスミ）−ｐＩＴ　１２０　（Ｄ〜１．３　Ｋｂ　Ｂ
ａｌ■−ＢａｍＨＩフラグメントは、前記の転写および
翻訳活性化配列およびＹＧ　１００遺伝子の暗号配列の
一部を含む。この〜１，３ＫｂフラグメントのＢａｍＨ
Ｉサイトでの翻訳解読フレームは、プラスミドＰＭＣ１
５８７における先端切断β−ガラクトシダーゼ遺伝子の
ＢａｍＨＩ　サイトにおけるものと同じである。従ッテ
、前記Ｌ７）〜１．３　Ｋｂ　Ｅｇｌ　Ｉ　Ｉ　−Ｂａ
ｍＨＩ７ラグメントをｐＭｃ１５８７のＢａｍＨＩザイ
トに（適切な配向て）結紮すると、ｙｃｉ　ｏ　ｏ　−
ＬａｃＺ　融合遺伝子生成物をコードつけるプラスミド
が得られる。得られたプラスミド（本明細書中ではこの
プラスミドをｐｌＴ　２１０　と呼ぶ〕は〜１７．５ｋ
ｂであって、本発明の目的のために用いられる。プラス
ミドｐＩＴ２１０の制限サイト地図を添付の第１図に示
す。

本発明の方法をさらに例示する他のプラスミドも組立て
ることができる。例えば、プラスミドｐＩＴ１２０の〜
Ｑ、２１　ｋｂ　Ｘｂａｌ　−ＴａｑＩ　＃ヨヒ〜７ｋ
ｂ　ＸｂａＩ　−Ｂ　ａｍＨＩ　７ラグメント、プラス
ミドｐＮＭ５８７．４−４　のｗ　□、２５　ｋｂ　ｌ
−１ｐｈ　Ｉ　−Ｂ　ａｒｒｆ（Ｉフラグメントおよび
以下のリンカ−配列：、・μＴ丁ＣんλＣんＶｕＴんυ
函ＧＡＧＡＴＡＡＡＣＡ丁ｒｃＴＡＴｆｃＧＴＧＴＡＧ
［［１’Ｉ’Ｃ’ＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧ’ＩＴＣＡＴＡ
Ａ■ＧＴｒＣ″ＴＴＴＧＴ１７ｒＴＴＡＡＧ丁ｒ〔図中
、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃは
デオキシシトシル、およびＴはチミジルを意味する〕 を結紮すると、中間体プラスミドｐＩＴ２２１０か得ら
れる。プラスミドｐＮＭ５８７．４−４出発物質は、ノ
ーザン・ジージョナル・リサーチ・ラボラド　リ　−（
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｃｈ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｐｅｏｒｉａ　、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）に寄託され、
永久保存培養菌株となっているＥ、ｃｏＪｉ　Ｋ１２　
ＪＡ２２１／ＰＮＭ５８７．４−４　より得られる。該
株は、寄託番号ＮＲＲＬＢ−１５８１２で、このプラス
ミドの供給源および保存株として利用可能である。プラ
スミドｐＩＴ２２１０の〜１．６　ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ
−Ｂｇｌ　ＩＩ　７−ｙグメントは、ヒトプロインシュ
リンをコードうけているヌクレオチド配列と融合した酵
母ｙＧ１００ｉｆｔ伝子転写および翻訳活性化配列を含
有している。

前記フラグメントをＢａｍＨＩ−消化プラスミドＹＥｐ
２４と結紮すると、例示した二機能性プラスミドｐＩＴ
３２１０が得られる。プラスミドＹＥＰ２４はｐＲＢ５
とも称されるが、制約なしに寄託され、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（、Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
ＲＯＣｋｖｉｌｌｅ。

Ｆｍｒｙｌａｎｄ　２０８５２　）　７））ら寄託番号
ＡＴＣＣ３７０５１号で誰でも入手可能である。例示プ
ラスミドｐｌＴ３２１０は〜９．３ｋｂ　であり、ヒト
プロインシュリンの暗号配列と融合した酵母ＹＧ１００
　転写および翻訳活性化配列の他に、プラスミドｐＢＲ
３２２の複製起源およびアンピシリン耐性遺伝子、酵母
由来のＵＲＡ３遺伝子、および酵母２ミクロンプラスミ
ド由来の複製配列を含んでいる。該プラスミドはヒトプ
ロインシュリンをコードづけており。

本発明をさらに例証するのに有用である。プラスミドｐ
ｌＴ３２１０の制限サイト地図を添付の第１図に示す。

例示したｐＩＴ２１０およびｐＩＴ３２１０　プラスミ
ドは１両方とも通常法の変法に従って、酵母細胞の形質
転換に用いられる。（１）まず、通常の好気性条件下で
、およそ指数増殖中期まで形質転換された酵母細胞を培
養し、（２）この好気的に増殖させた細胞を約１２時間
定常増殖期またはその付近まで嫌気性培養条件に付し、
（３］この嫌気的に増殖した細胞を通常の好気性培養条
件に付すことにより、ＹＧｌｏｏ　転写および翻訳活性
化配列を最も良（誘導することができる。嫌気性状態（
無酸素状態）から回復させることにより、ＹＧｌｏｏ　
転写および翻訳活性化配列か大いに誘導され、これによ
り効率よ（遺伝子が発現する。プラスミドｐＩＴ２１０
およびｐＩＴ３２１’０の場合、かかる誘導により、各
々β−ガラクトシダーゼおよびヒトプロインシュリンが
効率よく発現する。

さらに、酵母ＹＧ１００　転写活性化配列は、後期増殖
期にＹＧ１００配列含有細胞を増殖させることにより誘
導することもできる。さらに詳しくは、定常プラスミド
ｐＩＴ２１０により形質転換された細胞を定常期で培養
すると、強く誘導されてβ−ガラクトシダーゼが効率よ
く発現する。

例えば、添付の第２図に示す如く、サツカロミセス−セ
レビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）／ＰＩＴ２１０細胞が、通常の最少培地（ア
ミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素ベース、２％グル
コース＋栄養要求体要求！ｍ）において、最大細胞濃度
８×１０７個／　ｍｌに達すると、β−ガラクトシダー
ゼのレベルは著しく増加する。プラスミドｐＩＴ３２１
Ｏにより形質転換された酵母細胞を同様に後期増殖期で
培養した場合、ヒトプロインシュリンを効率よく発現さ
せることができる。形質転換された細胞を、前記の両方
の培養条件に付すこと。

即ち、無酸素状態から回復させ、定常増殖期またはその
付近で増殖させることにより、最も効率よく最大の誘導
が起こることは、当業者は容易に理解されるであろう。

個々の一連の誘導条件１例えば、無酸素状態からの回復
は、後期増殖期における培養によってもたらされる先の
誘導により、その効率が低下したり阻害されることはな
い。その上、高い細胞濃度で誘導された細胞も、約３７
℃の培養温度でさらに刺激された場合、さらに活性を増
加させる。例えば、３７℃の一定温度で約１６時間、定
常増殖３ＶＪ−Ｌテ増殖させたサツカロミセスセレビシ
ェ／ｐＩＴ２１０細胞は、１０．１７０　単位のβ−ガ
ラクトシダーゼを蓄積する。このレベルは、２３℃また
は３０℃で細胞により蓄積されるレベルより約３または
４倍高い。温度の増加によるＹＧ１００転写および翻訳
活性化配列の誘導の程度は、添付の第４図から明らかな
プロく、さらに著しい。例えば、２３℃から３７℃に温
度を変化させると、約６０分後に前の発現レベルより少
なくとも２０倍高いβ−ガラクトシダーゼの発現レベル
にＭｆ　る。

この誘導レベルの計算値は、対照（形質転換されていな
い）酵母細胞における可変かつ有限署の非特異的加水分
解活性を計算に入れた場合もつとも高くなり、５０倍に
もなる。この様に、例えは、前記の無酸素状態からの回
復、後期増殖期における培養、および培養温度の増加等
の誘導条件を組み合わせることにより、誘導が著しく向
上し、ヘテロローガスな遺伝子が最も効率よく発現され
る。

従って、この様な組み合わせは、本発明の目的にかなっ
たものである。

本発明の方法は、決して、自律的復製ベクターの使用に
限定されるものではない。例示のプラスミドｐｌＴ２１
０およびｐＩＴ３２１０における複製憤　は自律的であ
って、酵母２ミクロンプラスミドの複製配列により制御
されているが、酵母細胞ゲノムに組込まれるベクターも
組立てることができる口かかる組込みベクターの１例と
して、例示のβ−ガラクトシダーゼ暗号化プラスミミド
ＩＴ２１００が挙げられる。かかるベクターは、種々の
公知の組込みベクター（プラスミドＹｌｐｌ、ＹＩｐ５
、およびＹＩＰ２５〜３３が挙げられるが、これに限定
されるものではない〕の１つに酵ｆＵＹＧ１００転写お
よび翻訳活性化配列をクローンすることにより組立てら
れる〔ポットスタインら、ジーン（Ｂｏｃｓｔｅｉｎｅ
ｔａｌ、、Ｇｅｎｅ）８：１７（１９７９））。さらに
、ベクターを挿入しようとしている宿主細胞由来のゲノ
ムＤＮＡを取り込ますことにより、殆ど全てのベクター
を組込まずことができる。従って。

酵母ゲノムＤＮＡ含有ベクターで形質転換された酵母細
胞は、ホモローガスな組換えを受け、その結果、そのゲ
ノム配列を伴なったヘテロローガスＤＮＡが組込まれる
ことになる。従って、本発明に於いては、ＹＧｌｏｏ　
転写および翻訳活性化配列をクローンするのに、多くの
自律複製および組込みベクターを用いることができる。

例示の組み込みプラスミドｐｌＴ２１００の詳細な組立
て方法は後記の実施例５に示す。

本発明は、非常に広範囲に利用可能であって。

機能性ポリペプチドをコードつけている実質的にありと
あらゆるヌクレオチドを、前に例示したβ−ガラクトシ
ダーゼおよびヒトプロインシュリン暗号配列と置き換え
ることができる。かがる暗号配列には、ウシ成長ホルモ
ン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒトプレ
成長ホルモン（ｐｒｅ−ｈ（Ｊ（入ブタ成長ホルモン（
ｐＧＨ）、浦乳動物成長ホ出因子％。ヒトインシュリン
Ｂ鎖、ヒトプレプロインシュリン、ヒトおよびヒトＪ２
を外のインターフェロン、ウロキナーゼ、組織プラスミ
ノーゲン活性化因子、インターロイキンｆ１インターロ
イキン■、研究または商業的価値のある全てのホルモン
、酵素および生理活性を有するポリペプチドをコードし
ている西己列が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。

本発明の方法およびベクターは、あらゆる種類のサツ力
ロミセスレビシエ（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＣｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ　）　宿主菌に使用することができ、そ
の用途は、具体的に例示した酵１１ＢＤＢＹ　７４６株
およびＤＢＹ６８９．［に限定されるものではない。該
株は両方ともイースト・ジェネティック・ストック−セ
ンター（Ｙｅａｓｔ　Ｇｃｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃ
ｅｎｔｅｒ。

Ｂｃｒｋｌｙ、Ｃａｌ　１ｆｏｌｎｊａ　９４７２０　
）　、Ｊ：す、僅かの料金で入手し得る。さらに、酵母
ＤＢＹ７４５株は。

アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　１’ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＣｏＨｅ
ｃｔｉｏｎ　。

ＲｏｃｋｖｉＨｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２　）
からも入手し得る。これらの株のかわりに用い得る他の
酵母株としては、酵母株Ｘ４００３−！５Ｂ、ＤＢＹ７
４７．５ｒ−ＩＹ−１％５Ｔ−ＩＹ−２、Ｓ　ＨＹ　−
３、オ、Ｊ：　ヒＳ　ＨＹ　−４が挙げられるが、これ
に限定されるものではない。

これらの株は公知であって、イースト・ジェネテイツク
・ストック・センター（Ｙｅａｓｔ　ＧｅｎｅｔｉｃＳ
ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　）より入手し得る。本発明の
態様は全て有用であるが、数種のベクターおよび形質転
換体が特に好ましい。好ましい態様としては、プラスミ
ドｐｌＴ２１０並びに形質転換体サツヵロミセスセレビ
シよりｎｙ６８９／ＰＩＴ２１０　およびサッカ０　ミ
セスセレビシよりＢＹ７４５／ＰＩＴ２１０が誉げられ
る。

本発明の方法およびそれに関連する発現ベクターは１発
酵により、ヘテロローガスポリペプチドを生産するのに
用いられる。ヘテロローガスタンパク質生成物は、技術
上分類の一連の方法により発酵ブロスより単離され、精
製される。以下の実施例により、本発明をさらに詳しく
説明する。適当と思われる箇所に、本発明を実施し１本
発明を使用するための説明や実際の手順を記載した。

実施例１ プラスミドｐＩＴ２１０およびイー・コリ（Ｅ−ｃｏｌ
ｉ）Ｋ１２　ＪＡ２２１／ＰＩＴ２１０の調製Ａ、プラ
スミドｐ　ＩＴｌ　２０の単離Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２
　ＪＡ２２１／ＰＩＴ１２０菌（ＮＲＲＬＢ−１５６０
３）を５０μｇ／ｍｌ　の抗生物質０　アンピシリンを
含むＴＹブロス（１％トリプトン、０．５外　酵母エキ
ス、１％塩化ナトリウム、ｐＨ７，４）中で、通常の微
生物学的方法に従って培養する。

１８時間インキュベートした後、約０．５　ｔｙｌの培
養物を１．５　ｍｌのエッペンドルフ試験管に移し、約
１５秒間遠心分離する。特に記載しない限り、操作は全
て周囲温度で行なう。得られた上清をファインチップア
スピレータ−を用いて注意深く除去し、細胞ヘレットを
、２μｇ／ｍｌリゾチーム、５ＱｍＭグルコース、　Ｉ
　Ｑ　ｍＭ　ＣＤＴＡ　（ジアミン四酢酸シクロ、ヘキ
サン）および２５　ｍＭ　トリスＨＣ６（ｐＨ８）を含
む新たに調製したリゾチーム溶液的ｌｏｏμ４に懸濁さ
せる。０℃にて３０分間イロンキュベートした後、約２
００μｅのアルカリ゛３ｓＤｓ　（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）溶液（０，２Ｎ　Ｎａ０１４−１％５ＤＳ）　を
添加する。試験管を静かに旋回させ、次いで１５分間０
℃に保つ。次に、約１５μｅの３Ｍ酢酸ナトリウム（最
少量の水に３モルの酢酸ナトリウムをとかし、氷酢酸で
ｐＨを４．８に調整し１体積を１ａに調節して調製した
もの）を添加し、試験管の内容物を反転させることによ
り静か　、。

に混合する。

試験管を６０分間θ℃に保ち、次いで５分間遠・し分離
して、殆ど透明な上ｉｆ得る。約０．３　ｍｌの上滑を
別の遠む分離用試験管に移し、これに１Ｍｌの冷エタノ
ールを添加する。試験管を３０分間−２０℃に保持した
後、得られた沈殿を遠心分離により集め、上清をアスピ
レーシヨンにより除去する。得られたベレン）ｒ、１０
０μｅのｏ、ｉＭ６酸ナトナトリウム１０５Ｍトリス−
ＨＣ１ｐＨ８）＋Ｃとかし、次いで２容のｎエタノール
を添加することにより、常法どおりに再沈殿させる。得
られた沈殿を遠・し分離により集め、所望のプラスミド
ｐｌＴ１２０ＤＮＡを得る。プラスミドｐｌＴ１２０を
２０μｅのＴＥ緩衝液（１０１ｎＭ）リス−ＨＣ（７，
ｐＨ８゜ｌ　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ　）にとかし、後で使用
するために、０℃にて保存する。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＪＡ２２１／ＰＩＴ１２０のか
わりにＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＪＡ２２１／ｐＭｃ１５
８７（ＮＲＲＬＥ−１５４４２）　を用いる以外は、実
質的に実施例ＩＡに従って、所望の単離を行なう。所望
のｊラスミ）−ｐＭｃ１５８７ｆ２０ｔｉｇ　（７，）
ＴＥ緩衝液にとかし、後で使用するために０℃にて貯蔵
する。

Ｃ，プラスミドｐＩＴ１２０の−１，３ｋｂ　ＢｇｌＱ
　−−Ｂａｍｌｌｌフラグメントの組立て 約５　ｔｔ（ｌ　Ｃ５ｔｔｇ）のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
　トリｘ−Ｈ（Ｊ、ｐＨ８、ｌ　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ　）
中プラスミドｐＩＴ１２０（実施例ＩＡで単離したもの
）、５μｅ　ＤＴＴ（１００ｍＭジチオトレイトール）
、５μ＃　（１０００り／ゴ）ＢＳＡ（牛血清アルブミ
ン〕。

２５μｅの水、２．５ｐｅＣ５単位）ＢｇｌＵ制限酵素
、２．５μｇ（５単位）ＢａｍＨＩ　制限酵素、オヨ＊ び５μｌ　ＩＯＸ反応ミックス　を３７℃にて約１時間
インキュベートする。７０℃にて５分間インキュベート
することにより反応を終わらせる。次いて該混合物を氷
上で冷却し、フェノールおよびりｏ　ａ　ホ／Ｌ／ム／
イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、次いでエ
タノール沈殿させる。所望の〜１．３　ｋｂ　ＢｇｇＵ
−ＢａｍＨｌ　＄７限フラグメントを常法どおり分離し
、アガロースゲル電気泳動によ’１単４する〔マニアナ
イスら、モレキュラクロ−ニング（Ｍａｎｉａｔｉｓ　
ｅｔ　ａｌ。Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　）（１９８２）　ｇ照〕。

所望の〜１，３ｋｂフラグメントを約２０μｅのＴＥ緩
衝液にとかし、０℃にて保存する。

＊ＢｇｅＵ　制限酵素用反応ミックス（ＩＯＸ）は％以
下の組成で調製する： ６００　ｍＭ　ＮＮａＣ ｅ１００＝　トリｘ　−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）１００
　ｍＭ　ＭｇＣｅｚ Ｄ、プラスミドｐＭＣ，１５８７のＢａｒｎ）ＩＩ消化
約５μｇ（５μｇ）のＴＥ緩衝液中プラスミドＰＭＣ１
５８７（実施例ＩＢで単離したもの）、５μ４のＤＴＴ
（１００ｍＭジチオトレイトール〕、５μｅ（１０００
Ｗ／ｒｔｔｌ）のＢＳＡ（牛血清アルブミン〕％２５μ
ｅの水、５μｌＣ５単位）のＲａ　ｍＨＩ制限酵素、＊ および５μｅのｌＯＸ反応ミックスを３７℃にて４　約
１時間インキュベートする。７０℃にて５分間インキュ
ベートすることにより、反応を停止させる。冷却後、得
られた消化物をフェノールおよびクロロホルム／インア
ミルアルコール（２４：１）で抽出し、次いでエタノー
ルで沈殿させる。所望の〜１．５　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　
７ラグメントを約２０μｌのＴＥ緩衝液に溶かし、０℃
にて保存する。

＊ＢａｍＨＩ制限酵素用の反応ミックス（ＩＯＸ）は、
以下の組成で調製する。

５００ｍＭ　ＮａＣｅ １００ｍＭ　トリフ、　−ＨＣｌ　、　ｐＩ４’７．５
１００　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｅ　２ 約１μｅ（１８ｇ）のＰＭＣＩ　５８７　Ｂａｍ　ＨＩ
消化物を、プラスミドＰＩＴ１２０の〜１，３ｋｂ　Ｂ
ｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ　７　ラグメ、／ト１μｅ（１８
ｇ）−水３７１１ｅ。

ＡＴＰ　５１１（１（ｌ　ＱｍＭ）、結紮ミックス＊５
μｅ、およびＴ４　ＤＮＡ　リガーゼ　ＩＪ’／　（〜
１０５ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂ、Ｕｎｉ
ｔｓ　）　ト混合する。コ１７）混合物を１６℃にて約
１６時間インキュベートし、次いで７０℃にて５分間イ
ンキュベートすることにより反応を終わらせる。氷上で
冷却した後。

と実質的に同様にして、５ｏμｇＡｔｔｌの抗生物質ア
ンピシリンを含有しているＴＹプレート上のＥ、ｃｏｌ
ｉ　Ｋ１２　ＪＡ２２１を形質転換するのに用いる。Ｅ
、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＪＡ２２１株は、ノーザン・ジー
ジョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｅｏ＋ｉｉａ　ｌ１ｌｉｏｏｉりに寄託され、
水入保存培養菌株となっており、寄託番号ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５２１１で誰でも入手可能である。所望の形質転換
体０本明細書中では％Ｅ、ｃｏＪｉ　Ｋ１２　ＪＡ２２
１／ｐＩＴ２１０と呼ぶ〕は、標準的微生物学的技術を
用いて常法に従って同定し、特性化して培養しく実施例
７　Ｅ　ｇ照）、次いで実施例ＩＡの方法と実質的に同
様にしてプラスミドｐＩＴ２１０を単離するのに用いる
。プラスミドｐＩＴ２１０　の制限サイトおよび機能地
図を添付の＠１図に示す。

＊結紮ミックスは以下の組成で調製する８５００ｍＭ　
ｌ−リｘ−ＨＣＬ　ｐＨ７，８２ＱＱｍＭ　ジチオトレ
イト−ル １００ｍＭ　ＮａＣｅ２ 実施例２ 酵母細胞の所望の形質転換を、ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ
）　らの方法（プロシーディンゲス・オブ・ナショナル
アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７５：１９２９（１９
７８））を少し変更するが実質的には同様にして、酵母
プロトプラストを用いて行なう。滅菌状態にし、培地体
積を１００ｚ？にして、サツカロミセス懐セレビシより
ＢＹ７４５（ＡＴＣＣ４４７７３゜イースト・ジェネテ
ィック・ストック・センター（Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｂａｒｋｅｌｅｙ
。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　９４７２０）より入手可能）を
、ますＹ　Ｐ　Ｄ　（１％バクト・酵母エキス、２係バ
クト・ペプトン、２％グルコース）中で、八６００が約
１．０になるまで培養し、次いで１５ｍ１の１．２Ｍソ
ルビトールで洗浄する。新たに加えた１５ｍ１の１，２
Ｍ７　ルｌニー　ト−ルに懸濁させた後、約１００μ４
の２．５り／ゴチモラーゼ６．Ｏ，０ＯＯ（チモラーゼ
を５ｍＭＫＰｉ　、　（ＰＨ’　７．６）　オヨヒ１．
２Ｍ：＃＋ｚヒｌ−−ルに懸濁させることにより調製し
たもの〕を添加する。懸濁液を室温にてインキュベート
し、その２０μ６ｆｌＯ％　５ｐＳ１８０μ６　に懸濁
させて、位相差顕微鏡で観察することにより、プロトプ
ラスト化ノ程度をモニターする。プロトプラストは、Ｓ
ＤＳ溶液中で位相差により黒く見える。

プロトプラスト化が約９０％完了したら、プロトプラス
トを１５ｍ１の１．２Ｍソルビトールで２回洗浄し、で
きるだけ小さな重力で集め、１．２Ｍンルビトール、１
０ｍＭ塩化カルシウムおよびｌ　ＱｍＭトリス−ＨＣｅ
（ｐＨ７，５）ｆ含有する６００μｅのＹＰＤに静かに
再懸濁させる。

約２０μｌのプラスミドＰＩＴ２１０　ＤＮＡを、プロ
トプラスト懸濁液０．２　ｍｌに加えることにより。

η 形質転換を行なう。得られた混合物を室温にてＩＯ分間
インキユベートシ、次いで１ｍｌの２０％ＰＥＧ３３５
０　（ポリエチレングリコール）、ＩＱｍＭ塩化カルシ
ウムおよび１０　ｍＭ　トリス・ＨＣｌ（Ｐ）１７．５
）を添加した後、再び６０分間インキュベートする。種
々の拍参漬の形質転換されたプ＊ ロトプラストを、所望の栄養源　を含有する３％再生用
寒天培地２５　ｍｌ中にプレートする。ブレーティング
する前に、寒天を４５〜５０℃の水浴中で保存し、固化
した後、平板を３０℃にて４８〜７２時間インキュベー
トする。得られたコロニを常法どおりに培養して所望の
サツカロミセス・セレビシェ／ＰＩＴ２１０形質転換体
を得る。

＊再生用寒天は、以下の組成で調製する二アミノ酸を含
まない０，６７％酵母窒素源（ディフコより入手） ３％寒天 １．２Ｍ　ソルビトール 通常の必須栄養源（プラスミドのマーカーを除＜〕；ド
ロップ・アウト・ソリッドが特に好まし・：１ い０ 実施例３ セレビシェ／ＰＩＴ２１０のインキュベーションサツカ
ロミセス・セレビシェ／ｐＩＴ２ｉ（ｌＪ］ｆｊｌをガ
スパック１００嫌気性システム（Ｇａ５ｐａｋｌ　Ｑ　
ＯＡｎａｅｒｏｂｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍ　）　中でインキ
ュベートすることにより嫌気性条件に付す（ＢＢＬＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｃｋｅｙ
ｓｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄセーブおよびエバンス
、ジャーナル・オブ・クリニカルマイクロバイオロジー
（５ｅｉｐ　ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ。

Ｊ、ＣＩ　０Ｍ１ｃｒｏｂｉｏＪ、　）１１　：　２２
６　（１９８０）参照）。他の嫌気性培養システムも使
用でき、酸素を注入しないで通常の大規模の酵母発酵に
より嫌気性条件を達成し得ることは、当業者には容易に
理解されるであろう。

マグネチック・スターシーおよび温度計を備えた２５０
肩ｌビーカーに入れた約２０ｍ１の指数的に増殖してい
る細胞を嫌気性チェンバーに入れる。

密封した後、チェンバーを磁気攪拌板上に置き。

激しく攪拌しながら細胞を約１２時間インキュベートす
る。ガスパックシステムが正しく機能していることを、
まずチェンバーの壁面に凝縮物が見られること、および
触媒付近のふたの温度が上昇することによりモニターす
る。嫌気生活が達成されたことは、シチレンブルー指示
薬の色が消失することによりモニターする。

約１２時間嫌気性培養条件に付した後、培養チェンバー
を開けて、通常の大気中の酸素レベルを回復させる。次
いで細胞を少なくともさらに３０分間好気性条件下で通
常どおりに培養する。その結果、ＹＧ遺伝子の転写およ
び翻訳活性化配列が強く誘導され、その結果、高レベル
のβ−ガラクトシダーゼ活性が発現される。

実施例４ 約５Ｘ１０”　の誘導されたサツカロミセス・セレビシ
ェ／ＰＩＴ２１０細胞５：９，０００Ｘｇにて１分間遠
心分離することにより集める。細胞を２ｒｎｌの氷冷し
たブレーキング（ｂｒｅａｋｉｎｇ　）　緩衝液（１０
、□ｍＭ　）す７．−ＨＣｅ（ｐＨ７，５）、１ｍＭジ
チオトレイトール、および１ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオリド〕中に懸濁させ、これに０．５ｇの洗浄
したガラスピーズ（４５０〜５００μ、ガラスピーズ１
ｇにっき１ｏ清ｔのＩＮＨ（Ｊおよび３０ｙｌの水で洗
浄し、１４０’Ｃにて４時間焼成したもの〕を添加する
。次いで、冷却した混合物を通常のソニケーターを用い
て３０秒間最晶出力で超音波処理する。得られた細胞の
残骸を１分間遠心分離することにより常法どおり除去し
、クーマシーブルー結合法を用いて蛋白質濃度を測定す
る〔ブラッドフォード、アナリティヵル・バイオケミス
トリー（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　、Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ　、）７２：２４８（１９７６）＄照〕。ミラー（
Ｍｉｌｌｅｒ）の方法〔エクスペリメンツ・イン・モレ
キュラ・ジエネティクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉ
ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　
）参照〕に従って。

β−ガラクトシダーゼ活性を計算する。誘導されｔ）　
ｆ：ｉｊ　−ｈ−ｙ　ｌ　）　′ｌ”−！ｆ８＠（Ｄ”
８’ｆＪｉ’２＊　３１ＤｉＣ，Ｈす。

実施例５ ＪＡ２２１／ＰＩＴ２１００％およびサツカロミセスＴ
Ｅ緩衝液中プラスミドＰＩＴ２１ｏ約５ｔｔ（ｌｃ５ｐ
ｇ）、ＤＴＴ（ＩＱＱｍＭ　ジチオトレイトール）５Ａ
ｌｌ、ＢＳＡＣ牛血清アルブミン）　５　ｕｇ　（１０
００ｍｆ／／ｌｌ　）、水２５　ｐｇ％ＳｍａＩ制限酵
素！Ｍｌ（５単位〕、およびＩＯＸ反応ミックス＊５μ
Ｃを３７℃にて約１時間インキユベートスる。７０℃に
て５分間インキュベートすることにより反応を終わらせ
る。氷上でｉ却した後、５ＭＮａ（Ｊ約Ｌ５ｔｔｌ！、
および５ａｌ（制限酵素２．５１１ｅ（５単位〕を加え
、次いで３７℃にて１時間インキュベートする。反応を
停止させ、氷上で冷却し、フェノールおよびりＯｏ　；
ｆ、　／Ｌ／ム／イソアミルアルコール（２４：　１）
で抽出し、ついでエタノール沈殿させる。所望の〜６．
９　ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉ制限フラグメント
をアガロースゲル電気泳動により通常どおり分間「・単
離する〔マニアナイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ　）（１９８２）８照）。所望の〜５．９ｋｂフラグ
メントｆ　ＩＪ　２　ＱμｅのＴＥ緩衝液にとがし、０
℃にて保存する。

＊ＳｍａＩ制限酵素用反応ミックス（１０Ｘ）は以下の
組成で調製する： ２ＱＱｍＭ　ＫＣｌ １００ｍＭ　）　リ°ス−Ｉ−１ｃｃ　ｐＨｓ、。

１００　ｎ’ｌ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ（１２Ｂ、ブラフ、　
ミ）−ＹＩｐ　２６　（７）Ｓｍａｌ−８ａｉｌ消化Ｙ
ＩＰ２６は、酵母ＵＲＡ３およびＬＥＵならびに原核性
アンピンリン耐性遺伝子を含む酵母イー・コリニ重ベク
ターである。ＹＩＰ２６は、酵母における自律的複製に
必要な情報を持っていないので、ベクターが酵母染色体
ＤＮＡに組み込まれた場合にのみ安定に、酵母にロイシ
ンまたはウラシルプロトトロフィーか転移する。ＹＩｐ
２６はＳｒｒ＋ａＩおよび５ａｅｌ制限酵素に対する１
つの認識部位を有しているのて、ＰＴＴ２１０からのＤ
ＮＡをサブクローニングするのに都合かよい。

プラスミドＰＩＴ１２０のかわりにプラスミドＹＩＰ２
６（ＡＴＣＣ３７０５７）を用いる以外は実施例５Ａと
実質的に同様にして、所望の消化を行なう。所望の消化
物を常法により抽出し、エタノール沈殿させ、約２０μ
４のＴＥ緩衝液に溶かして、後で使用するために０℃に
て保存する。

プラスミドｐＩＴ２１０のかわりに実施例５Ａおよび５
Ｂのフラグメントを用いる以外は実質的に実施例ＩＥと
同様にして、所望の結紮および組立を行なう。所望の形
質転換体をアンピシリン耐性に関して選択し、常法によ
り同定し、特性化し、培養しく実施例７Ｅ参照）、次い
で実施例１Ａの方法と実質的に同様にして、プラスミド
ｐｌＴ２１００を単離するのに用いる。

Ｄ、サツカロミセス・セレビシェ／ＰＩＴ２１００の組
立て ＢａｍＨＩ制限酵素および反応ミックスのかわり＊ にＮｃｏｌ制限酵素および反応ミックス　を用いる以外
は実施例ＩＤと実質的に同様にして、プラスミドｐｌＴ
２１００約ｌＯμｇを消化する。プラスミドを線状にす
ることにより、このＤＮＡが酵母染色体に組込まれ、線
状物の両末端がこのプラスミドをホモローガスな配列に
向かわせる効率が増加する。プラスミドＰＩＴ２１００
のＮｃｏＩサイトはＵＲＡ３遺伝子中にあるので、該プ
ラスミドは圧倒的にｕｒａ　３座で組込まれる。

サツカロミセス・セレビシよりＢＹ７４５（ＡＴＣＣ４
４７７３）を、実施例２と実質的に同様にして、線状化
したプラスミドＰＩＴ２１００ＤＮＡを用いて形質転換
させる。ロイシンプロトトロフ（野性体〕を選択する。

細胞を選択せずに約３０世代増殖すせ、ロイシンプロト
トロフィーを保持している細胞のパーセンテージを調べ
ることにより、形質転換体をロイシンプロトトロフィー
の安定性に関して調べる。組み込まれたＬＥＵ　２遺伝
子の、）　コピーは３０世代に渡って９０％ＰＪ、上安
定であり。

一方、２μＤＮＡまたは酵母ゲノム由来のＡＲ８配列を
含んでいる自律複製プラスミドの安定性は、この条件下
では５０％以下である。

＊ＮＣ０Ｉ制限酵素用反応ミックス（ＩＯＸ）は。

以下の組成で調製する： １５００　ｍＭ　Ｎａ（Ｊ ｌｏｏｍＭ　、）リス・ＨＣＪ（ｐＨ７，５）１００　
ｒｒ＋　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２実施例６ サツカロミセス・セレビシェ／ｐｌＴ２１０のかわりに
サツカロミセス・セレビシェ／ＰＩＴ２１００を用いる
以外は実質的に実施例３および４と同様にして、所望の
インキュベーション、誘導および測定を行なう。

実施例７ Ａ、プラスミドｐｌＴ１２０の〜２０９ｂｐ（塩基対〕
Ｘｂａ　Ｉ　−Ｔａｑ　Ｉ　フラグメントの単離的５０
０μｇのプラスミドｐｌＴ１２０を、総容積２ｍｌの０
．１　Ｍ　）リス−ＨＣ（！（ｐＨ７，５）、５ＱｍＭ
Ｎａ（Ｊ、５　ｍＭ　ＭｇＣ１１２、１００ｆｉｇ／ｙ
ｎｌ　牛血清アルブミン、および５００単位のＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａｌ制限酵素中で、消化が完了するまで反
応させる。次いで、３６５　ｂｐ（十各鎖に５方向に４
ｂの延長部あり〕のＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩ−７ラグメン
トをアクリルアミド・ゲルから単離し、標準的方法を用
いて精製する〔シュライフおよびウエンシンク、プラク
ティカル・メソツズ・イン・モレキュラ・バイオロジー
（５ｃｈｌｅｉｆ　ａｎｄ　Ｗｅｎｓｉｎ１７゜Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
、　）　（１ｇ　Ｂ　１　）参照〕。

次いでこのフラグメント約２０μｇをｏ、ｏＩＭトリス
−ＨＣｆｆ（ｐＨ８，４）、０．１Ｍ　ＮａＣ／、０．
００６ＭＭｇＣｇ２．０．００６Ｍ　２−メルカプトエ
タノール。

および１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン２００μａ中
、Ｔａｑｌ　制限酵素２単位と６５℃にてパラフィンオ
イルの存在下で反応させる。５時間の間、１時間ごとに
４０μｅずつ採取し、フェノール中でクエンチする。こ
れらをプールして標準法を用いて精製しくシュライフお
よびウエンシンク（Ｓｃｈｌｅｉｆ　ａｎｄ　Ｗｅｎｓ
ｉｎｋ　）（１９８１）参照）％アクリルアミド上で電
気泳動に付す。部分的ＴａｑＩ消化の産物は、所望の２
０９ｂｐ（＋４ｂおよび２ｂ５　方向に延長したもの）
のＸｂａＩ　−ＴａｑＩフラグメント、１６７ｂｐ　（
＋４ｂおよび２ｂ５方向に延長したもの〕のＸｂａＩ−
ＴａｑＩフラグメント、３６５ｂｐ（十各鎖にっき５方
向に４ｂ延長したもの〕の完全なＸｂａ　Ｉ　−Ｅｃｏ
ＲＩ　フラグメント、１３７　ｂＰ（＋２ｂおよび４ｂ
５　方向に延長したもの）のＥｃｏＲｌ−Ｔａ９Ｉフラ
グメント、１７９ｂｐ（＋４ｂおよび２ｂ５方向に延長
したもの）のＥＣＯＲＩ　−Ｔａｑ　Ｉ　７７グメント
、および４１　ｂＰ（十各鎖につき５方向に２ｂ延長し
たもの）のＴａｑＩ　−ＴａｑＩフラグメントとなるは
ずである。所望の〜２０９ｂＰフラグメントを通常どお
りアクリルアミドゲルから単離し、精製する。

Ｂ．リンカー配列の組立て ＣＧＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＧＡＧＴＩ’ＧＴＡＧＴ口’
ＣＧη７ｒＣＣＣＡＡＴｒＣＴｒＡＣ１１１１１１１１
１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１
１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１
１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１
１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１
１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１
１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１
ＣＡＴ１’ＴＡＴＴＧＴＣＴＡ貫ＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡ
ＴＴＧＧＴＴＧ’ＩＣ＝ＡＡ、Ｃ〔図中、Ａはデオキシ
アデニル、Ｇはデオキシグアニル％Ｃはデオキシシトシ
ル、およびＴはチミジルを意味する〕 イタクラらのサイエンス（　Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａ
ｌ。

’　５（ｉｅｎｃｅ）１９８：１０５６（１９７７）お
よびクレアらのプロシーデイングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（　Ｃｒｅａ　ｅｔ
　ａｌ．，Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　
ＵＳＡ）７５　：　５７６５（１９７８）に記載の方法
と実質的に同様にして、完全に保護したトリデオキシヌ
クレオチド形成ブロックを用いて、修飾ホスホトリエス
テル法により通常どおり合成する。次いでこのリンカー
を５０μｌのＴＥ緩衝液に溶かし、後で使用するために
Ｏ℃にて保存する。

プラスミドｐＮＭ５８７．４−４（ＮＲＲＬＢ−１５８
１２）約１　０　０　μｇを３７℃にて、５ｍＭＫＣ（
７中（７）　Ｈ　ｐ　ｈ　１制限酵素１００単位、ｌＯ
ｍＭトリス−ＨＣＪ（ｐＨ７．４）、　１　０　ｒｒ＋
　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ　（１　２、ｌｍＭジチオトレイトー
ル、および２００μｇ／ｔｎｌ牛血清アルブミンを含む
総体積１　ｍｌ中で反応させる。消化が完了したら、５
　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ　ｅ３　Ｑ　Ａ　ｌ　）ｆ：添加シ、
次イテＢａｍＨｌ制限酵素１００単位を添加する。第２
次消化が完了するまで３７℃にてインキュベートを続け
る。標準的方法を用いて、所望の２５３ｂｐ（＋５万向
に４ｂの延長部および３万向に１ｂの延長部）のＨｐｈ
Ｉ−ＥａｍＨＩフラグメントを標準的方法を用いてアク
リルアミドゲルから精製する。このフラグメントは％Ｎ
末端の６つのアミノ酸コドンを含まない｛トプロインシ
ュリン遺伝子を含んでいる。

プラスミドＰＩＴ１２０約１０μｇを３７℃にＴ、１　
５　０　ｍＭ　ＮａＣＪ中各２０単位（７）　Ｘｂａ　
Ｉ　オヨｉＪＢａｍＨＩ　制限酵素，５ｍＭ　トリス−
ＨＣ（７（ｐＨ７．９）．６ｍＭＭｇＣｌ２，　おＪ：
び１　０　０　μｅ／ｒｔｌ牛血清アルブ５ミンを含む
総体積１　０．０μｎ中で反応させる◎消化が完了した
ら、標準的方法でＤＮＡをフェノールおよびクロロホル
ムを使って精製し、次いでエタノールで沈殿させる。

Ｅ１結紮および形質転換 実施例７Ａ，ＢおよひＣの精製したフラグメント各々約
ｌμｇ、および実施例７ＤのＤＮＡ約１μｇを総体積３
０μ４の５０ｍＭ｝リスーＨ（Ｊ（ｐＩ４　７．８　）
　．１　０ｍＭ　Ｈｇ（Ｊ２．　２　０　ｍＭジチオト
レイトール、ｌ　ｍＭ　ＡＴ　Ｐ　おヨヒ５　０　ｆｉ
　ｇ／ｔｎｌ牛血清アルブミンと混合する。約１００単
位のＴ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼを添加し、次いで４℃にて
約１６時間インキユベートする。この結紮混合物を使っ
てイー・コ’Ｊ　Ｋ１２　ＪＡ２２１を形質転換し、形
質転換体をアンピシリンプレート上で選択する。

所望のＤＮＡフラグメントを含有するクローンを、プロ
ーブとして実施例７Ａ．ＢおよびＣで得られたニック翻
訳ｉｔ製フラグメントヲ用いてコロニーハイブリット形
成させ、そして少量のＤＮＡを単離した後構造分析する
ことにより同定する。所望の組換え体では、実施例７Ａ
，ＢおよびＣで得られたフラグメントがこの順序でプラ
スミドｐｌＴ１２０のＸｂａＩおよびＢａｍ　Ｈ　Ｉ　
サイトに結紮されている。得られたイー・コリＫ１２　
ＪＡ２２１／ＰＩＴ２２１０形質転換体は，好ましいプ
ラスミドｐｌＴ２２１０源である。

実施例８ Ａ、プラスミドＰＩＴ２２１０の〜１６００ｂｐフラプ
ラスミドｐｌＴ２２１０約２０μｇを、３７℃にて、５
　Ｑ　ｍＭ　Ｎａ　Ｃｌ中容々２０単位のＢａｍＨＩお
よびＢｇｅＵ制限酵素、ｌＱｍＭ）リス−ＨＣ／（ＰＨ
７，５）　、　６　ｍＭ　ＭｇＣ１１２、およびＩ　Ｉ
ｔ　ｇ　１　ｍｌ牛血清アルブミンを含有する総体積２
００μｌ中で反応させる。消化が完了したら、標準的方
法を用いてＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで精
ＭＬ、、エタノールで沈殿させる。所望の・〜１６００
ｂｐのフラグメントを通常どおりアクリルアミドゲルか
ら単離し、精製する。

Ｂ、プ５　スミ）−ＹＥｐ　２４　ｔ７）　ＢａｍＨＩ
消化プラスミドｐＭｃ１５８７のかわりにプラスミドＹ
ＥＰ２４　を用いる以外は実質的に実施例ＩＤと同様に
して、所望の消化を行なう。得られたＢａｍＨＩ消化物
を常法に従って抽出し、エタノールで沈殿させ、ＴＥ緩
衝液に溶かし、それ以上の精製゛）、より。わ。。、。

実質的に実施例７Ｅと同様にして、各々約１μｇのプラ
スミドｐｌＴ２２１０の〜１６００ｂｐのフラグメント
とプラスミドＹＥＰ２４のｇａｍＨＩ消化物を結紮する
。結紮したこのＤＮＡを用い、実質的に実施例ＩＥと同
様にして、イー・コ１ＪＫ１２ＪＡ２２１を形質転換す
る。所望のクローンを前記の如く、コロニーハイブリッ
ド形成およびＤＮＡ　構造分析により同定する（実施例
７Ｅ）。得られたイー・フリに１２　ＪＡ２２１／ｐＩ
Ｔ３２１０形質転換体は、奸才しいプラスミドｐＩＴ３
２１０源である。ＹＥｐ２４　はｐＢＲ３２２の複製開
始点およびアンピシリン耐性遺伝子、酵母由来のＵ　Ｒ
Ａ　３　遺伝子、および酵母２ミクロンプラスミド由来
の複製配列を含有しているので、プラスミドｐｌＴ３２
１０は大腸菌および酵母中で複製し、そして選択可能で
ある。また、前記の方法により、プラスミドｐＩＴ３２
１０の異性体も生成する。この様な異性体が生成するの
は、ｐＩＴ２２１０の〜１６００ｂｐ　Ｂａｍ　ＨＩ　
−Ｂｇ　ｌ　［［フラグメントか、Ｂ　ａ　ｍＨＩ消化
プラスミドＹＥｐ２４　に、２方向のうぢのいずれの方
向でも結紮され得るためである。異性体プラスミドを常
法に従って単離し、制限酵素分析により同定する。プラ
スミドｐＩＴ３２１０の制限サイト地図を第１図に示す
。

実施例９ 組立て プラスミドｐＩＴ２１．０のかわりにプラスミドｐｌＴ
３２１０を用いる以外は実質的に実施例２と同様にして
、所望の組立てを行なう。得られたコロニーを常法に従
って培養し、所望のサツカロミセス・セレビシェ／　ｐ
ＩＴ３２１０　形９１転ｍ体ヲ得る。

実施例１Ｏ サツカロミセス・セレビシェ／ＰＩＴ２１０のかわりに
サツカロミセス・セレビシェ／ＰＩＴ３２１０を用いる
以外は実質的に実施例３と同様にしてインキュベートす
る。その結果ＹＧ１００　遺伝子の転写および翻訳活性
化配列の誘導が起こり、ヒト・メチオニル・プロインシ
ュリンが効率よく発現される。所望のプロインシュリン
生成物を常法に従ってプレパラティブＨＰＬＣにより単
離し、ラジオイムノアッセイおよびその他の試験法によ
り同定する。

【図面の簡単な説明】

第１図ニブラスミドｐＩＴ２１０およびｐＩＴ３２１０
の制限サイト地図。 第２図：ＹＧ１００転写および翻訳活性化配列誘導に対
する細胞濃度の影響を示すグラフ。 第４図：ＹＧ１００転写および翻訳活性化配列の誘導に
対する温度の影響を示すグラフ。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー 代理人　弁理士　青　山　葆（外１名）ＦＩＧ、１ ｐｌＴ２１０ ｐｌＴ３２１０ ＦＩＧ、２ ０１２３４５６７Ｂ セル＃ズ／ｍ１ｘ１０−７ ＦＩＧ、３ 無誠索状態η・う解放後の牲過晴間（分）ＦＩＧ、４ 温度変化後Ｉｆ）時間（分） 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１１酵母ＹＧ１００遺伝子の転写および翻訳活性化配
   列と機能性へテロローガスポリペプチドをコードしてい
   るヌクレオチド配列を翻訳解読フレーム内に含んでいる
   自律的複製またはゲノム組込みが可能な、選択可能なり
   ＮＡで形質転換した酵母細胞を、 （ａｌ増殖および遺伝子発現に適した条件下で、定常増
   殖期またはその付近で培養するか、または該形質転換酵
   母細胞を。 （ｂｌ好気性増殖に適した条件下で培養し、（ｃｌその
   好気的に増殖させた細胞を嫌気性増殖に適した条件下で
   培養し、そして ｉｄｌその嫌気的に増殖させた細胞を好気性増殖および
   遺伝子発現に適した条件下で培養する工程からなること
   を特徴とする、酵母において、酵母ＹＧ１００遺伝子の
   転写および翻訳コントロール下にあるヌクレオチド配列
   の高レベルの発現を誘導する方法 （ただし、所望により工程［ｂｌ、［Ｃ１または［ｄｌ
   のいずれかにおける培養を、定常増殖期またはその付近
   で行なうこと、および、好気性増殖の条件に戻した時に
   誘導が起こるのに十分な時間、嫌気性増殖条件に維持す
   ることを条件とする）。 （２）　形質転換細胞を、工程ｔｂｌにおいて指数増殖
   中期まで培養し、工程（Ｃ１において、定常増殖期また
   はその付近まで、嫌気性増殖に適した状態を約１２時間
   持続させる前記第（１１項の方法。 （３）形質転換細胞を、工程（ｂｌにおいて定常増殖期
   またはその付近で培養することからなる前記第ｉｌ＋項
   の方法。 （４）嫌気的に増殖した細胞を、工程＋ｄ＋において定
   常増殖期またはその付近で培養することからなる前記第
   （１）項、第（２）項または第（３）項のいずれかに記
   載の方法。 （５）機能性ポリペプチドをコードづけているヌクレオ
   チド配列が、哺乳動物のホルモンまたは哺乳動物のプレ
   ホルモンをコードつけている前記第（１）項の方法。 （６）　ヌクレオチド配列が、ヒト成長ホルモンまたは
   ヒトプレ成長ホルモンをコードつけていルｆｆＪ記第（
   ５）項の方法。 （７）ヌクレオチド配列がウシ成長ホルモンまたはウシ
   プレ成長ホルモンをコードつけている前記第（３）項の
   方法。 ［８１ヌクレオチド配列がヒトプロインシュリンまたは
   ヒトプレプロインシュリンをコードつけている前記第（
   ５）項の方法〇 ［９］　機能性ポリペプチドをコードつけているヌクレ
   オチド配列が、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活
   性化因子、インターロイキン■、インターロイキン■、
   成長ホルモン放出因子、またはβ−ガラクトシダーゼを
   コードつけている前記第１）（□）項ヵ１．第（４）項
   いずれヵ１０．（。ｌｏアカ法（１０９機能性ポリペプ
   チドをコードつけているヌクレオチド配列が、ヒトイン
   シュリンＡｉまたはヒトインシュリンＢ鎖をコードつけ
   ている前記第（１１項〜第（４）項いずれか１つに記載
   の方法。 （１１〕選択可能なりＮＡがプラスミドに含まれている
   前記第（１）項から第（工０）項いずれか１つに記載−
   の方法。 （１２）選択可能なりＮＡがゲノム組込みが可能である
   前記第（１）項から第（１１９項いずれか１つに記載の
   方法口 （１３〕　ブラフ、　ミ）−がＰＩＴ２１０またはＰＩ
   Ｔ３２１゜である前記第（１１９項の方法。 （１滲プラスミドがＰＩＴ２１００である前記第（１１
   ）項または第（１２）項の方法、 （１５）形質転換酵母細胞がサツカロミセスである前記
   第［１］項から第（１４〕項いずれか１つに記載の方法
   。 （１６つ形質転換酵母細胞がサツカロミセス・セレビシ
   ェである前記第（１）項の方法。 （１７〕形質転換酵母細胞がサツカロミセス・セレビシ
   よりＢＹ６８９／ＰＩＴ２１ｏまタハＰ　ＩＴ３２１０
   である前記第（１６）項の方法。 （１８）好気性および嫌気性増殖のための培養温度が約
   ３７℃である前記第（１）項から第（１７）項いずれか
   １つに記載の方法。 （１９）自律Ｍ製およびゲノム組込み可能な選択可能な
   りＮＡで形質転換された酵母細胞であって、該ＤＮＡは
   、翻訳解読フレーム内において、［ａｌ　酵母ＹＧ　ｌ
   　００遺伝子の転写および翻訳活性化配列、および、 ｆｂｌ　機能ｆｉ！ヘテロローガスポリペプチドをコー
   ドつけているヌクレオチド配列 を含んでいることを特徴とする酵母細胞。 （２ｆＪ）サツカロミセス属、好ましくはセレビシェ種
   である前記第（１９〕項の酵母細胞。 （２１〕　プラスミドｐＩＴ２１０　またはプラスミド
   ｐＩＴ３２１０で形質転換されたサツカロミセス・セレ
   ビシよりＢＹ　６８９である前記第（２０）項または第
   （２１９項の酵母細胞。 （２２）プラスミドｐＩＴ３２１０で形質転換されたサ
   ツカロミセス・セレビシよりＢＹ　７４６である前記第
   （２０９項または第（２１〕項の酵母細胞。 （２３）酵母ＹＧ１００遺伝子の転写および翻訳コン下 トロールズこあるヌクレオチド配列を酵母中で効率よく
   発現し得る、自律複製およびゲノム組込みが可能な選択
   可能なりＮＡであって、翻訳解読フレーム内に、 ［ａｌ　酵母ＹＧ１００遺伝子の転写および翻訳活性化
   配列、および （ｂｌ　機能性へテロローガスポリペプチドをコードつ
   けているヌクレオチド配列を含んでいるＤＮＡ。 （２４）プラスミドｐＩＴ２１０．ｐＩＴ２１００また
   はｐＩＴ３２１０である前記第（２３）項のＤＮＡ０