JP2983997B2 - 脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター - Google Patents
脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーターInfo
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- JP2983997B2 JP2983997B2 JP63501756A JP50175688A JP2983997B2 JP 2983997 B2 JP2983997 B2 JP 2983997B2 JP 63501756 A JP63501756 A JP 63501756A JP 50175688 A JP50175688 A JP 50175688A JP 2983997 B2 JP2983997 B2 JP 2983997B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は有用な血栓崩壊剤である修飾したハイブリッ
ド組織プラスミノーゲンアクチベーターに関する。
ド組織プラスミノーゲンアクチベーターに関する。
発明の背景 プラスミノーゲンアクチベーター、組織プラスミノー
ゲンアクチベーター（ｔ−PA）およびウロキナーゼ（ｕ
−PA）は主として２つの部分、プラスミノーゲンからプ
ラスミン（血餅のフィブリンネットワークを分解するセ
リンプロテアーゼ）への変換に関与する触媒部分および
フィブリン結合のごとき生理学的特異性を担う調節領域
を含有する非触媒部分よりなる。バン・ゾネベルトら
（Van Zonneveld et al.）、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、83、4670−4674（1986）
はｔ−PAのいくつかの構造ドメインの機能を説明してい
る。
ゲンアクチベーター（ｔ−PA）およびウロキナーゼ（ｕ
−PA）は主として２つの部分、プラスミノーゲンからプ
ラスミン（血餅のフィブリンネットワークを分解するセ
リンプロテアーゼ）への変換に関与する触媒部分および
フィブリン結合のごとき生理学的特異性を担う調節領域
を含有する非触媒部分よりなる。バン・ゾネベルトら
（Van Zonneveld et al.）、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、83、4670−4674（1986）
はｔ−PAのいくつかの構造ドメインの機能を説明してい
る。
ｔ−PAの非触媒部分は少なくとも３つのドメイン構
造：各82アミノ酸の２つのクリングル;45アミノ酸の表
皮細胞成長因子（EGF）領域および45アミノ酸のフィブ
ロネクチン（フィンガー）ドメインを含有する。ウロキ
ナーゼは82アミノ酸の単一クリングルを含み、フィブロ
ネクチン領域を含まない同様の非触媒ドメイン構造を有
する。
造：各82アミノ酸の２つのクリングル;45アミノ酸の表
皮細胞成長因子（EGF）領域および45アミノ酸のフィブ
ロネクチン（フィンガー）ドメインを含有する。ウロキ
ナーゼは82アミノ酸の単一クリングルを含み、フィブロ
ネクチン領域を含まない同様の非触媒ドメイン構造を有
する。
ｔ−PAおよびｕ−PAのEGFドメインはヒト表皮細胞成
長因子配列に相同のかなりの領域を占める。ベハールら
（Vehar et al.）は、バイオ／テクノロジー（Bio/Te
chnology）、1051−1057、1984年12月、ここに参照のた
めに挙げる第７図においてこれらの相同領域を描いてい
る。例えば、ジスルフィド結合に関与する６つのシステ
イン残基のうち５つの相当的位置は保存される。同様
に、ｔ−PAおよびｕ−PAのEGFドメイン内のいくつかの
アミノ酸およびアミノ配列はEGFにおける同一位置に対
応する；例えば、アミノ酸52、56−62、67−69、73−7
6、79、81および84−87。
長因子配列に相同のかなりの領域を占める。ベハールら
（Vehar et al.）は、バイオ／テクノロジー（Bio/Te
chnology）、1051−1057、1984年12月、ここに参照のた
めに挙げる第７図においてこれらの相同領域を描いてい
る。例えば、ジスルフィド結合に関与する６つのシステ
イン残基のうち５つの相当的位置は保存される。同様
に、ｔ−PAおよびｕ−PAのEGFドメイン内のいくつかの
アミノ酸およびアミノ配列はEGFにおける同一位置に対
応する；例えば、アミノ酸52、56−62、67−69、73−7
6、79、81および84−87。
血餅フィブリンに対するその高い結合特異性のため、
ｔ−PAは理想的な血栓崩壊剤とされる（コレン（Colle
n）、サーキュレーション（Circulation）、72、1820
（1985））。しかしながら、ｔ−PAは肝臓によって循環
から非常に迅速に除去され（t1/2＝約１〜３分）、それ
により血栓性血管偶発症の治療におけるその効果が減少
される［エメイスら（Emeis et al.）、スロンボウシ
ス・アンド・ヘモスタシス（Thrombosis and Haemost
asis）、54（３）、661−664（1985）］。フックスら
（Fuchs et al.）は、ブラッド（Blood）、65
（３）、539−544（1985）、同様にウロキナーゼ（ｕ−
PA）が肝臓によって循環から除去され、これらのプラス
ミノーゲンアクチベーターがプロテイナーゼ活性部位に
依存しないプロセスによって除去されることを示した。
肝細胞は迅速なｔ−PA除去を担う細胞型であることが示
された。リジケンら（Rijken et al.）は、バイオケ
ミカル・ジャーナル（Biochem.J.）、238、643−644（1
986）、ｔ−PAのＬ鎖（Ｃ末端部分）がＨ鎖よりも循環
から除去されるのがかなり遅いことを見い出し、Ｈ鎖が
肝臓によって認識されるポリペプチド配列を含有するこ
とを立証している。ｔ−PAおよびウロキナーゼの肝臓膜
への結合は速く、アシアロ−フェトゥイン（asialo−fe
tuin）（末端ガラクトース）、マンナンまたはフィブリ
ノーゲンによって抑制されず、これは炭水化物が血液か
らその除去を媒介しないことを示唆する。
ｔ−PAは理想的な血栓崩壊剤とされる（コレン（Colle
n）、サーキュレーション（Circulation）、72、1820
（1985））。しかしながら、ｔ−PAは肝臓によって循環
から非常に迅速に除去され（t1/2＝約１〜３分）、それ
により血栓性血管偶発症の治療におけるその効果が減少
される［エメイスら（Emeis et al.）、スロンボウシ
ス・アンド・ヘモスタシス（Thrombosis and Haemost
asis）、54（３）、661−664（1985）］。フックスら
（Fuchs et al.）は、ブラッド（Blood）、65
（３）、539−544（1985）、同様にウロキナーゼ（ｕ−
PA）が肝臓によって循環から除去され、これらのプラス
ミノーゲンアクチベーターがプロテイナーゼ活性部位に
依存しないプロセスによって除去されることを示した。
肝細胞は迅速なｔ−PA除去を担う細胞型であることが示
された。リジケンら（Rijken et al.）は、バイオケ
ミカル・ジャーナル（Biochem.J.）、238、643−644（1
986）、ｔ−PAのＬ鎖（Ｃ末端部分）がＨ鎖よりも循環
から除去されるのがかなり遅いことを見い出し、Ｈ鎖が
肝臓によって認識されるポリペプチド配列を含有するこ
とを立証している。ｔ−PAおよびウロキナーゼの肝臓膜
への結合は速く、アシアロ−フェトゥイン（asialo−fe
tuin）（末端ガラクトース）、マンナンまたはフィブリ
ノーゲンによって抑制されず、これは炭水化物が血液か
らその除去を媒介しないことを示唆する。
発明の説明 今回、単独でまたはこれらのポリペプチドのいくつか
の未解明領域と共働して、肝臓膜への結合を担うのがｔ
−PAおよびウロキナーゼのEGFドメインであることが判
明し、これにより循環からのそれらの迅速な除去が説明
される。この発明の結果、Ｎ−末端部分；すなわち、ｔ
−PA、ｕ−PAおよび欧州特許出願0213794−Ａ号に開示
されているごときハイブリッドプラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｈ−PA）のEGFおよびフィブロネクチンドメ
インの修飾によって、肝臓膜に対する親和性が顕著に減
少したプラスミノーゲンアクチベーターが開発された。
かくして、本発明はEGF領域が除去されている、フィブ
ロネクチンおよびEGF領域が除去されている、および脱
−EGF u−PA、脱−EGF t−PA、または脱−EGF h−PAに
対して１またはそれ以上のフィブロネクチン領域が加え
られている新規プラスミノーゲンアクチベーターを提供
するものである。これらのポリペプチドはｔ−PAおよび
ｕ−PA遺伝子のcDNAクローンを用いる遺伝子工学によっ
て調製される。
の未解明領域と共働して、肝臓膜への結合を担うのがｔ
−PAおよびウロキナーゼのEGFドメインであることが判
明し、これにより循環からのそれらの迅速な除去が説明
される。この発明の結果、Ｎ−末端部分；すなわち、ｔ
−PA、ｕ−PAおよび欧州特許出願0213794−Ａ号に開示
されているごときハイブリッドプラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｈ−PA）のEGFおよびフィブロネクチンドメ
インの修飾によって、肝臓膜に対する親和性が顕著に減
少したプラスミノーゲンアクチベーターが開発された。
かくして、本発明はEGF領域が除去されている、フィブ
ロネクチンおよびEGF領域が除去されている、および脱
−EGF u−PA、脱−EGF t−PA、または脱−EGF h−PAに
対して１またはそれ以上のフィブロネクチン領域が加え
られている新規プラスミノーゲンアクチベーターを提供
するものである。これらのポリペプチドはｔ−PAおよび
ｕ−PA遺伝子のcDNAクローンを用いる遺伝子工学によっ
て調製される。
さらに、所望のプラスミノーゲンアクチベーターにつ
いてコード付けするDNAから全EGFドメインを除去する必
要がないことが判明した。アミノ酸55−62に対応するポ
リヌクレオチドの欠失は得られるポリペプチドを効果的
に変化させ、肝臓膜による認識（結合、代謝）を回避す
る。プラスミノーゲンアクチベーターについてコード付
けするDNAのEGFドメインの他の修飾は、EGF同種アミノ
酸55−62を産生するヌクレオチドの欠失;EGFドメインの
第３次構造を崩壊するために、メチオニン、セリン、ア
ラニン等を生じるコドンで置き換えることによるごとき
１またはそれ以上のシステイン部位の修飾；または、a.
a.60（グリシン）のごとき中性アミノ酸についてのヌク
レオチドのアスバラギン酸、リジン、アルギニン等の荷
電アミノ酸を生じるコドンでの置き換えを包含する。こ
のようにして修飾したDNAから産生したプラスミノーゲ
ンアクチベーターは肝臓を通過し、機能的に活性な形態
で血流に戻される。プラスミノーゲンアクチベーター遺
伝子のバクテリオファージM13のごとき一本鎖DNAベクタ
ー中へのクローニングの後、オリゴヌクレオチドの定方
向（もしくは部位特異的）突然変異により、これらのす
べての修飾を容易に行うことができる（ゾラーら（Zoll
er et al.）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Met
hods in Enzymology）、100、468−500、1983）。
いてコード付けするDNAから全EGFドメインを除去する必
要がないことが判明した。アミノ酸55−62に対応するポ
リヌクレオチドの欠失は得られるポリペプチドを効果的
に変化させ、肝臓膜による認識（結合、代謝）を回避す
る。プラスミノーゲンアクチベーターについてコード付
けするDNAのEGFドメインの他の修飾は、EGF同種アミノ
酸55−62を産生するヌクレオチドの欠失;EGFドメインの
第３次構造を崩壊するために、メチオニン、セリン、ア
ラニン等を生じるコドンで置き換えることによるごとき
１またはそれ以上のシステイン部位の修飾；または、a.
a.60（グリシン）のごとき中性アミノ酸についてのヌク
レオチドのアスバラギン酸、リジン、アルギニン等の荷
電アミノ酸を生じるコドンでの置き換えを包含する。こ
のようにして修飾したDNAから産生したプラスミノーゲ
ンアクチベーターは肝臓を通過し、機能的に活性な形態
で血流に戻される。プラスミノーゲンアクチベーター遺
伝子のバクテリオファージM13のごとき一本鎖DNAベクタ
ー中へのクローニングの後、オリゴヌクレオチドの定方
向（もしくは部位特異的）突然変異により、これらのす
べての修飾を容易に行うことができる（ゾラーら（Zoll
er et al.）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Met
hods in Enzymology）、100、468−500、1983）。
本発明により得られる修飾プラスミノーゲンアクチベ
ーターは脱−EGF相同プラスミノーゲンアクチベーター
と記載されるのが最も適当である。本出願人らは、「EG
F−相同」なる表現は、産生物のEGF領域は肝臓膜による
結合および血液循環からの除去に関与するので、その領
域の関連する機能特性が存在しなくなるように１または
それ以上のアミノ酸の欠失、付加、または置換によって
かかる領域が修飾されていることを意味させるつもりで
ある。
ーターは脱−EGF相同プラスミノーゲンアクチベーター
と記載されるのが最も適当である。本出願人らは、「EG
F−相同」なる表現は、産生物のEGF領域は肝臓膜による
結合および血液循環からの除去に関与するので、その領
域の関連する機能特性が存在しなくなるように１または
それ以上のアミノ酸の欠失、付加、または置換によって
かかる領域が修飾されていることを意味させるつもりで
ある。
図面の説明 第１および1a図は、Δ2-89t−PAについてコード付け
する遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。
する遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。
第２および2a図は、ΔEGF t−PAについてコード付け
する遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。
する遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。
第３および3a図は、ΔEGF u−PAについてコード付け
する遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。
する遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。
第４および4a図は、（ａ）マップ、および（ｂ）第５
図で用いるｔ−PAのアミノ酸１−44についてコード付け
するフィンガードメインインサートの132塩基対DNA配列
を示す。
図で用いるｔ−PAのアミノ酸１−44についてコード付け
するフィンガードメインインサートの132塩基対DNA配列
を示す。
第５図は、ΔEGF−ビ−（a.a.1-44）ｔ−PAについて
コード付けする遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を
示す。
コード付けする遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を
示す。
第６図は、Δ55-62−91−（UKaa50-131−Ser−Glu−G
ly−Asn−Ser−Asp）−92−ｔ−PAの産生で用いる方法
のフロー図を示す。
ly−Asn−Ser−Asp）−92−ｔ−PAの産生で用いる方法
のフロー図を示す。
第７図は、Δ55-62−ｔ−PAの産生で用いる方法のフ
ロー図を示す。
ロー図を示す。
第８−10a図は、p5′HybF−５およびそのプラスミド
の産生で用いるｔ−PAのK2に見い出されるアミノ酸192
−258をコード付けするために合成・調製するオリゴヌ
クレオチドを調製するフロー図を示す。
の産生で用いるｔ−PAのK2に見い出されるアミノ酸192
−258をコード付けするために合成・調製するオリゴヌ
クレオチドを調製するフロー図を示す。
第11図は、Δ55-62−91−［Ala186−K2］−92−ｔ−P
Aの産生で用いる方法のフロー図である。第11図におい
て、ＥはEcoO109を表す。
Aの産生で用いる方法のフロー図である。第11図におい
て、ＥはEcoO109を表す。
方法および材料 ａ）酵素反応：制限およびDNA修飾酵素はニューイング
ランド・バイオラブズ・インコーポレイティド（New E
ngland Biolabs Inc.）、ベバリー（Beverly）、マサ
チューセッツ州またはインターナショナル・バイオテク
ノロジーズ・インコーポレイテッド（International B
iotechnologies Inc.）、ニューハーベン（New Have
n）、コネチカット州から入手した。典型的な制限酵素
反応は100−200ngのDNAおよび400ユニットのT4DNAリガ
ーゼ（ニューイングランド・バイオラブズ）を含有する
計50μ容量において行った。平滑末端の結びには、４
ユニットのT4 DNAリガーゼ（ニューイングランド・バ
イオラブズ）を前記反応混合物に包含させる。（グッド
マン・エイチ・エムおよびマクドナルド・アール・ジェ
イ（Goodman,H.M.and MacDonald,R.J.）、メソッズ・
イン・エンザイモロジー（Method.Enzymol.）、68、7
5、1979）。用いる緩衝溶液はストック10X溶液;0.5Mト
リス・HCl（pH7.6）,0.1M MgCl2および0.1M DTT（ジ
チオスレイトール）として調製する。
ランド・バイオラブズ・インコーポレイティド（New E
ngland Biolabs Inc.）、ベバリー（Beverly）、マサ
チューセッツ州またはインターナショナル・バイオテク
ノロジーズ・インコーポレイテッド（International B
iotechnologies Inc.）、ニューハーベン（New Have
n）、コネチカット州から入手した。典型的な制限酵素
反応は100−200ngのDNAおよび400ユニットのT4DNAリガ
ーゼ（ニューイングランド・バイオラブズ）を含有する
計50μ容量において行った。平滑末端の結びには、４
ユニットのT4 DNAリガーゼ（ニューイングランド・バ
イオラブズ）を前記反応混合物に包含させる。（グッド
マン・エイチ・エムおよびマクドナルド・アール・ジェ
イ（Goodman,H.M.and MacDonald,R.J.）、メソッズ・
イン・エンザイモロジー（Method.Enzymol.）、68、7
5、1979）。用いる緩衝溶液はストック10X溶液;0.5Mト
リス・HCl（pH7.6）,0.1M MgCl2および0.1M DTT（ジ
チオスレイトール）として調製する。
ｂ）オリゴヌクレオチドの合成：本出願にいうすべての
オリゴヌクレオチドはジーン・マシーン（Gene Machin
e）モデル380A（アプライド・バイオシステムズ・イン
コーポレイティド（Applied Biosystems Inc.）、フ
ォスター・シティ（Foster City）、カリフォルニア
州）を用いてリン酸トリエステル法（クレアら（Crea
et al.）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）（USA）、75、5765、1978）によって合成した。結
ぶ反応におけるそれらの使用前に、200−500ngのDNA、1
0ユニットのT4DNAキナーゼ、0.5mM ATPおよびキナーゼ
緩衝液（0.05Mトリス・HCl、pH7.6、10mM MgCl2、5mM
DTT）を含有する50μ容量中で５′末端においてオ
リゴマーをリン酸化し、37℃にて1/2時間インキュベー
トした。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる
ために、マキサム・エイ・エムおよびギルバート・ダブ
リュー（Maxam,A.M.and Gilbert,W）、メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Method Enzymol.）、65、499（1
980）の方法に準じて100μCiガンマ32P−ATP（5000Ci/
ミリモル、アメルスハム（Amersham）、アーリントン・
ハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）でオリゴ
マーを放射能標識した。
オリゴヌクレオチドはジーン・マシーン（Gene Machin
e）モデル380A（アプライド・バイオシステムズ・イン
コーポレイティド（Applied Biosystems Inc.）、フ
ォスター・シティ（Foster City）、カリフォルニア
州）を用いてリン酸トリエステル法（クレアら（Crea
et al.）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）（USA）、75、5765、1978）によって合成した。結
ぶ反応におけるそれらの使用前に、200−500ngのDNA、1
0ユニットのT4DNAキナーゼ、0.5mM ATPおよびキナーゼ
緩衝液（0.05Mトリス・HCl、pH7.6、10mM MgCl2、5mM
DTT）を含有する50μ容量中で５′末端においてオ
リゴマーをリン酸化し、37℃にて1/2時間インキュベー
トした。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる
ために、マキサム・エイ・エムおよびギルバート・ダブ
リュー（Maxam,A.M.and Gilbert,W）、メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Method Enzymol.）、65、499（1
980）の方法に準じて100μCiガンマ32P−ATP（5000Ci/
ミリモル、アメルスハム（Amersham）、アーリントン・
ハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）でオリゴ
マーを放射能標識した。
ｃ）DNAフラグメントの単離:DNAフラグメントをまず0.5
−1.5％アガロースゲルを通す電気泳動によって分離し
た。電気泳動はトリス−ホウ酸塩−EDTA（TBE）緩衝液
（0.089Mトリス、0.089Mホウ酸、2mM EDTA、pH8.0）
中、約100ボルトにて２−４時間行う。0.5μg/ml臭化エ
チリジウム溶液でゲルを染色することによってUV光下で
DNAバンドを可視化した（シャープら（Sharp et a
l.）、バイオケミストリー（Biochem.）、12、3055、19
73）。DNAバンドを含有するアガロースをカミソリで切
断する。該DNAをゲルから電気溶出する（マニアティス
ら（Maniatis et al.）、モレキュラー・クローニン
グ、ア・ラボラトリー・マニアル（Molecular Clonin
g,A Laboratory Manual）、164頁、1982）。Elutip−
ｄ カラム（シュライヘル・アンド・シュエル（Schlei
cher and Schuell）、ケーネ（Keene）、ニューハン
プシャー州）にそれを通すことによってDNAをさらに精
製する。該DNAをエタノールで沈澱させる。エッペンド
ルブ（Eppendorf）マイクロフューゲ（microfuge）での
15分間の遠心の後、ペレットを70％エタノールで１回洗
浄し、真空下で乾燥し、脱イオン水50μに溶解する。
−1.5％アガロースゲルを通す電気泳動によって分離し
た。電気泳動はトリス−ホウ酸塩−EDTA（TBE）緩衝液
（0.089Mトリス、0.089Mホウ酸、2mM EDTA、pH8.0）
中、約100ボルトにて２−４時間行う。0.5μg/ml臭化エ
チリジウム溶液でゲルを染色することによってUV光下で
DNAバンドを可視化した（シャープら（Sharp et a
l.）、バイオケミストリー（Biochem.）、12、3055、19
73）。DNAバンドを含有するアガロースをカミソリで切
断する。該DNAをゲルから電気溶出する（マニアティス
ら（Maniatis et al.）、モレキュラー・クローニン
グ、ア・ラボラトリー・マニアル（Molecular Clonin
g,A Laboratory Manual）、164頁、1982）。Elutip−
ｄ カラム（シュライヘル・アンド・シュエル（Schlei
cher and Schuell）、ケーネ（Keene）、ニューハン
プシャー州）にそれを通すことによってDNAをさらに精
製する。該DNAをエタノールで沈澱させる。エッペンド
ルブ（Eppendorf）マイクロフューゲ（microfuge）での
15分間の遠心の後、ペレットを70％エタノールで１回洗
浄し、真空下で乾燥し、脱イオン水50μに溶解する。
ｄ）ミニプラスミドDNAの調製：適量の抗生物質を含有
するLB（ルリア・ベルタニ（Luria Bertani））培地約
2mlを単一の細菌コロニーで接種し、激しく振盪しなが
ら37℃にて一晩インキュベートする。マニアティスら
（Maniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）、366
頁に記載されている沸騰法によって、約1.5mlの培地を
用いてプラスミドDNAを単離する。後で使用するため、
培養物の残りを15％グリセロール中、−20℃で貯蔵す
る。10μｇのRNAse/mlを含有するH2O 40μに該DNAを
溶解する。１回の制限酵素分析には約８μで十分であ
る。
するLB（ルリア・ベルタニ（Luria Bertani））培地約
2mlを単一の細菌コロニーで接種し、激しく振盪しなが
ら37℃にて一晩インキュベートする。マニアティスら
（Maniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）、366
頁に記載されている沸騰法によって、約1.5mlの培地を
用いてプラスミドDNAを単離する。後で使用するため、
培養物の残りを15％グリセロール中、−20℃で貯蔵す
る。10μｇのRNAse/mlを含有するH2O 40μに該DNAを
溶解する。１回の制限酵素分析には約８μで十分であ
る。
ｅ）プラスミドDNAの大規模調製：典型的には、LB培地
１リットルを単一の細菌コロニーで接種する。クロラム
フェニコールでのプラスミドDNAの増幅の後、細菌細胞
を収穫し、沸騰法（ホームズ・デイ・エスおよびキグレ
イ・エム（Holmes,D.S.and Quigley,M.）、アナリティ
カル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）、114、19
3、1981）に準じて溶解する。塩化セシウムグラジエン
ト遠心またはマニアティスら（Maniatis et al.）、
ロク・シト（loc.cit.）、93−96頁に記載されているご
ときセファロース4Bカラム（ファルマシア、ウプサラ
（Uppsala）、スウェーデン）上のカラムクロマトグラ
フィーいずれかによってプラスミドDNAをさらに精製す
る。通常、１リットルの培養物あたり約400μｇのDNAの
回収が達成される。
１リットルを単一の細菌コロニーで接種する。クロラム
フェニコールでのプラスミドDNAの増幅の後、細菌細胞
を収穫し、沸騰法（ホームズ・デイ・エスおよびキグレ
イ・エム（Holmes,D.S.and Quigley,M.）、アナリティ
カル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）、114、19
3、1981）に準じて溶解する。塩化セシウムグラジエン
ト遠心またはマニアティスら（Maniatis et al.）、
ロク・シト（loc.cit.）、93−96頁に記載されているご
ときセファロース4Bカラム（ファルマシア、ウプサラ
（Uppsala）、スウェーデン）上のカラムクロマトグラ
フィーいずれかによってプラスミドDNAをさらに精製す
る。通常、１リットルの培養物あたり約400μｇのDNAの
回収が達成される。
ｆ）ベクター：オリゴ−dG−テールのpBR322プラスミド
DNA（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコー
ポレイティド（Bethesda Research Laboratories,In
c.）、ガイセルスブルグ（Gaithersburg）、メリーラン
ド州）を用いてｔ−PAおよびｕ−PAについてのcDNAをク
ローン化する。pBR322の詳細な分子構造はマニアティス
ら（Maniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）５
頁および488頁に記載されている。組換体pBR322での形
質転換に用いるイー・コリ（E.coli）株はHB101もしく
は294いずれかであった（マニアティスら（Maniatis e
t al.）、ロク・シト（loc.cit.）、504頁）。Δ55-62
プラスミノーゲンアクチベーターのうちいくつかの産生
に用いるプラスミドpBS M13-はストラタジーン（Strat
agene）、サンジエゴ、カリフォルニア州から入手し
た。
DNA（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコー
ポレイティド（Bethesda Research Laboratories,In
c.）、ガイセルスブルグ（Gaithersburg）、メリーラン
ド州）を用いてｔ−PAおよびｕ−PAについてのcDNAをク
ローン化する。pBR322の詳細な分子構造はマニアティス
ら（Maniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）５
頁および488頁に記載されている。組換体pBR322での形
質転換に用いるイー・コリ（E.coli）株はHB101もしく
は294いずれかであった（マニアティスら（Maniatis e
t al.）、ロク・シト（loc.cit.）、504頁）。Δ55-62
プラスミノーゲンアクチベーターのうちいくつかの産生
に用いるプラスミドpBS M13-はストラタジーン（Strat
agene）、サンジエゴ、カリフォルニア州から入手し
た。
ｔ−PAおよびｕ−PA遺伝子からのDNAフラグメントの
すべての継代クローニングはpUCプラスミド−lacZおよ
びアンピシリナーゼ遺伝子を含有するpBR322由来の一連
のベクターにおいて行った。これらのプラスミドはlacZ
領域に多重クローニング部位も含有し、これによりDNA
配列の継代クローニングにおいて大きな柔軟性を提供す
る（ビエリア・ジェイおよびメシング・ジェイ（Vieri
a,J.and Messing,J.）、ジーン（Gene）、19、259、19
82）。利用できる11の部位のうちいずれかにおけるクロ
ーニングは、Ｘ−gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル β−Ｄ−ガラクトシド）を含有するインジ
ケータープレート上の青色ベクターコロニーのバックグ
ランド中の白色組換体コロニーの外観によってモニター
することができる（ルザー（Ruther）、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネテックス（Mol.Gen.Geneti
cs）、178、475、1980）。換体pUCプラスミドでの形質
転換で用いるイー・コリ（E.coli）株はJM103であっ
た。pUCプラスミドおよびイー・コリ（E.coli）JM103は
ファルマシア・インコーポレイティド（Pharmacia In
c.）、ピスカッタウェイ（Piscataway）、ニュージャー
ジー州から入手した。
すべての継代クローニングはpUCプラスミド−lacZおよ
びアンピシリナーゼ遺伝子を含有するpBR322由来の一連
のベクターにおいて行った。これらのプラスミドはlacZ
領域に多重クローニング部位も含有し、これによりDNA
配列の継代クローニングにおいて大きな柔軟性を提供す
る（ビエリア・ジェイおよびメシング・ジェイ（Vieri
a,J.and Messing,J.）、ジーン（Gene）、19、259、19
82）。利用できる11の部位のうちいずれかにおけるクロ
ーニングは、Ｘ−gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル β−Ｄ−ガラクトシド）を含有するインジ
ケータープレート上の青色ベクターコロニーのバックグ
ランド中の白色組換体コロニーの外観によってモニター
することができる（ルザー（Ruther）、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネテックス（Mol.Gen.Geneti
cs）、178、475、1980）。換体pUCプラスミドでの形質
転換で用いるイー・コリ（E.coli）株はJM103であっ
た。pUCプラスミドおよびイー・コリ（E.coli）JM103は
ファルマシア・インコーポレイティド（Pharmacia In
c.）、ピスカッタウェイ（Piscataway）、ニュージャー
ジー州から入手した。
ｇ）宿主／ベクター系 1.微生物系 本明細書中に記載する実験は微生物イー・コリ（E.co
li）−12株JM103（ファルマシア（Pharmacia））および
イー・コリ（E.coli）Ｋ−12株294（ATCC No.33625）
であった。このプロセスで用いることができる他の微生
物は他の有用なイー・コリ（E.coli）株およびバチラス
・スブチリス（Bacillus subtilis）のごときバチラス
属を包含する。すべてのこれらの微生物は異種遺伝子配
列を複製しおよび発現できるプラスミドを利用する。
li）−12株JM103（ファルマシア（Pharmacia））および
イー・コリ（E.coli）Ｋ−12株294（ATCC No.33625）
であった。このプロセスで用いることができる他の微生
物は他の有用なイー・コリ（E.coli）株およびバチラス
・スブチリス（Bacillus subtilis）のごときバチラス
属を包含する。すべてのこれらの微生物は異種遺伝子配
列を複製しおよび発現できるプラスミドを利用する。
酵母における発現系では、イー・コリ（E.coli）およ
び／または酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae））における選択および複製が可
能であるプラスミドを用いる。酵母における選択につい
ては、プラスミドは形質転換したtrp−酵母株（RH218）
をトリプトファンに対しての原栄養素株とするTRP1遺伝
子を含有する。酵母発現ベクターは酵母およぴイー・コ
リ（E.coli）間を行き来できる。該プラスミドは以下の
要素：（１）複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子
を含有するpBR322由来のDNAセグメント、（２）酵母TRP
1遺伝子、（３）プラスミドを酵母中にて高安定で複製
させるのを可能とする酵母２μDNA、（４）アルコール
デヒドロゲナーゼ、α因子、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェート−デヒドロゲナーゼ等のごとき酵母遺伝子
からのプロモーター領域、（５）発現系において適当な
停止およびmRNAのポリアデニレーションで用いることが
できる翻訳開始および翻訳停止配列を有する。
び／または酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae））における選択および複製が可
能であるプラスミドを用いる。酵母における選択につい
ては、プラスミドは形質転換したtrp−酵母株（RH218）
をトリプトファンに対しての原栄養素株とするTRP1遺伝
子を含有する。酵母発現ベクターは酵母およぴイー・コ
リ（E.coli）間を行き来できる。該プラスミドは以下の
要素：（１）複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子
を含有するpBR322由来のDNAセグメント、（２）酵母TRP
1遺伝子、（３）プラスミドを酵母中にて高安定で複製
させるのを可能とする酵母２μDNA、（４）アルコール
デヒドロゲナーゼ、α因子、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェート−デヒドロゲナーゼ等のごとき酵母遺伝子
からのプロモーター領域、（５）発現系において適当な
停止およびmRNAのポリアデニレーションで用いることが
できる翻訳開始および翻訳停止配列を有する。
2.哺乳動物細胞の培養系 異種蛋白の産生のための和合ベクターの複製および発
現が可能な哺乳動物細胞系を本発明で用いることができ
る。例えば、それらは:Cos−７、WI38、3T3、CHO、ヒー
ラ細胞、およびC127細胞である。用いるベクターは
（１）ウイルス（SV40、アデノ、ポリオーマ、BPV）ま
たは細胞染色体DNA由来の複製開始点、（２）プロモー
ター、（３）リボソーム結合部位のごとき翻訳開始シグ
ナル、および（４）RNAプロセッシングシグナル（RNAス
プライシング、ポリアデニレーションおよび転写ターミ
ネーター配列）である。ここに示す発現ベクターの特別
の例はBPVウイルス複製開始点、マウスメタロチオネイ
ンプロモーターおよびSV40 RNAプロセッシングシグナ
ルを用いる。該べクターはまた哺乳動物細胞培養物とイ
ー・コリ（E.coli）間を行き来できる。それはイー・コ
リ（E.coli）アンピシリン耐性について選択可能なマー
カーならびにイー・コリ（E.coli）DNA複製開始点を提
供するpBR322配列の誘導体を含有する。これらの配列は
プラスミドpML−2dに由来する。
現が可能な哺乳動物細胞系を本発明で用いることができ
る。例えば、それらは:Cos−７、WI38、3T3、CHO、ヒー
ラ細胞、およびC127細胞である。用いるベクターは
（１）ウイルス（SV40、アデノ、ポリオーマ、BPV）ま
たは細胞染色体DNA由来の複製開始点、（２）プロモー
ター、（３）リボソーム結合部位のごとき翻訳開始シグ
ナル、および（４）RNAプロセッシングシグナル（RNAス
プライシング、ポリアデニレーションおよび転写ターミ
ネーター配列）である。ここに示す発現ベクターの特別
の例はBPVウイルス複製開始点、マウスメタロチオネイ
ンプロモーターおよびSV40 RNAプロセッシングシグナ
ルを用いる。該べクターはまた哺乳動物細胞培養物とイ
ー・コリ（E.coli）間を行き来できる。それはイー・コ
リ（E.coli）アンピシリン耐性について選択可能なマー
カーならびにイー・コリ（E.coli）DNA複製開始点を提
供するpBR322配列の誘導体を含有する。これらの配列は
プラスミドpML−2dに由来する。
BamH I粘着末端を含有する編集されたハイブリッドプ
ラスミノーゲンアクチベーター遺伝子をまずマウスメタ
ロチオネイン転写プロモーター要素およびSV40初期領域
転写プロセッシングシグナル間のプラスミド341−３
（ロー・エム・エフら（Law MF et al.）、エム・デ
イ・セル・バイオル（Md.Cell Biol.）Ｆ、３、2110、
1983）のBgl II部位に挿入する。プラスミド142−６（A
TCC No.37134）をBamH Iで消化した後得られた完全なB
PVゲノムをユニークBamH I部位に結ぶ。プラスミド341
−３は細菌細胞内でのプラスミドの複製を可能とするpM
L2、pBR322誘導体も含有する。ここで組み立てた発現プ
ラスミドは染色体外エピソームとしてマウスC127細胞に
おいてもっぱら複製することができる。トランスフェク
トされた細胞は形質転換された表現型について選択でき
る。さらに、より高発現レベルのために特異的なエンハ
ンサー要素を加えることによる、または（ネオマイシン
耐性のごとき）薬剤耐性を遺伝子に挿入することによる
ごとき発現ベクターのさらなる修飾も可能である。
ラスミノーゲンアクチベーター遺伝子をまずマウスメタ
ロチオネイン転写プロモーター要素およびSV40初期領域
転写プロセッシングシグナル間のプラスミド341−３
（ロー・エム・エフら（Law MF et al.）、エム・デ
イ・セル・バイオル（Md.Cell Biol.）Ｆ、３、2110、
1983）のBgl II部位に挿入する。プラスミド142−６（A
TCC No.37134）をBamH Iで消化した後得られた完全なB
PVゲノムをユニークBamH I部位に結ぶ。プラスミド341
−３は細菌細胞内でのプラスミドの複製を可能とするpM
L2、pBR322誘導体も含有する。ここで組み立てた発現プ
ラスミドは染色体外エピソームとしてマウスC127細胞に
おいてもっぱら複製することができる。トランスフェク
トされた細胞は形質転換された表現型について選択でき
る。さらに、より高発現レベルのために特異的なエンハ
ンサー要素を加えることによる、または（ネオマイシン
耐性のごとき）薬剤耐性を遺伝子に挿入することによる
ごとき発現ベクターのさらなる修飾も可能である。
ΔEGFプラスミノーゲンアクチベーター 本明細書中で特に例示する表皮細胞成長因子ドメイン
を欠くプラスミノーゲンアクチベーターの調製のための
出発点はプラスミドptPBM1、pUKBMおよびpUKKNd16に基
づく。
を欠くプラスミノーゲンアクチベーターの調製のための
出発点はプラスミドptPBM1、pUKBMおよびpUKKNd16に基
づく。
ｔ−PAについてのメッセンジャーRNA ｔ−PAを産生するために内皮細胞成長因子（ECGF）お
よびヘパリンによって刺激された正常なヒト線維芽細胞
（WI−38細胞）からイソチオシアナート法（マニアティ
スら（Maniatis et al.）、モレキュラー・クローニ
ング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clo
ning,A Laboratory Manual））によって全RNAを単離
した。同一の刺激した細胞はウロキナーゼを産生する。
オリゴ−デオキシチミジン（dT）−セルロースカラム上
のクロマトグラフィー（アビブら（Aviv et al.）、
プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アタデミー・
オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、69、
1408、1972）によって全RNAからメッセンジャーRNA（mR
NA）を得た。15−30％スクロース密度勾配における遠心
によってmRNAの分画をさらに行い、個々のmRNA画分を以
下に記載するごとき32P−プローブでハイブリダイズし
た。ｔ−PAメッセージ（約20−24S）を含有する画分を
相補性DNA（cDNA）の調製に使用するためにプールし
た。
よびヘパリンによって刺激された正常なヒト線維芽細胞
（WI−38細胞）からイソチオシアナート法（マニアティ
スら（Maniatis et al.）、モレキュラー・クローニ
ング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clo
ning,A Laboratory Manual））によって全RNAを単離
した。同一の刺激した細胞はウロキナーゼを産生する。
オリゴ−デオキシチミジン（dT）−セルロースカラム上
のクロマトグラフィー（アビブら（Aviv et al.）、
プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アタデミー・
オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、69、
1408、1972）によって全RNAからメッセンジャーRNA（mR
NA）を得た。15−30％スクロース密度勾配における遠心
によってmRNAの分画をさらに行い、個々のmRNA画分を以
下に記載するごとき32P−プローブでハイブリダイズし
た。ｔ−PAメッセージ（約20−24S）を含有する画分を
相補性DNA（cDNA）の調製に使用するためにプールし
た。
ｔ−PA用の相補性DNA 前節に記載のプールしたmRNA（５μｇ）を用いて二本
鎖cDNAを得、末端ヌクレオチドトランスフェラーゼを用
いて該cDNAをポリデオキシシチジレート（ポリdC）でホ
モポリマーテールした。産生物をPst1消化のポリデオキ
シシグアニレート（ポリdG）テールしたpBR322と共にア
ニールした。アニールしたDNAを用いてコンピテントイ
ー・コリ（E.coli）294細胞を形質転換し、これを培養
して約105細菌クローンを産生した（マニアティスら（M
aniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）229
頁）。
鎖cDNAを得、末端ヌクレオチドトランスフェラーゼを用
いて該cDNAをポリデオキシシチジレート（ポリdC）でホ
モポリマーテールした。産生物をPst1消化のポリデオキ
シシグアニレート（ポリdG）テールしたpBR322と共にア
ニールした。アニールしたDNAを用いてコンピテントイ
ー・コリ（E.coli）294細胞を形質転換し、これを培養
して約105細菌クローンを産生した（マニアティスら（M
aniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）229
頁）。
ｔ−PAクローンのスクリーニングおよび同定 32P−ATPで放射能標識した後、以下の３つのオリゴヌ
クレオチドを用いて組換体クローンのライブラリーをス
クリーニングした。これらのオリゴマーはｔ−PA分子の
アミノ酸配列、34−39（17mer）、253−258（18mer）お
よび523−527（15mer）（ペニカ・デイら（Pennica et
al.）、ネイチャー（Nature）、301、214、1968）、1
7mer:5′−CCACTGTTG−CACCAGCA−３′;18mer:5′−CAC
ATCACAGT−ACTCCCA−３′;15mer:5′CGGTCGCATGTTG−TC
−３′）に対応する。約20のコロニーはプールしたプロ
ーブに対し中程度ないし強い相同性を呈した。これらの
コロニーの再画線培養および再ハイブリダイゼーション
は陽性シグナルを有する16のクローンを与えた。これら
のクローンから調製したプラスミドDNAをニトロセルロ
ースペーパー上にブロットし、個々のプローブでハイブ
リダイズした。２つのクローン（42および62a）は中央
（18mer）および３′末満（15mer）プローブ双方にハイ
ブリダイズした。プラスミドDNAのPst1での酵素消化
は、クローンNO.42が、1.1、0.6および0.4kbの３つのフ
ラグメントの形態で２キロベース（kb）より大きい最大
のインサートを含有することを示した。このクローン
は、５′−および３′−非翻訳領域を包含し、2600bpを
含有するｔ−PA遺伝子についての全長配列を含有する。
クレオチドを用いて組換体クローンのライブラリーをス
クリーニングした。これらのオリゴマーはｔ−PA分子の
アミノ酸配列、34−39（17mer）、253−258（18mer）お
よび523−527（15mer）（ペニカ・デイら（Pennica et
al.）、ネイチャー（Nature）、301、214、1968）、1
7mer:5′−CCACTGTTG−CACCAGCA−３′;18mer:5′−CAC
ATCACAGT−ACTCCCA−３′;15mer:5′CGGTCGCATGTTG−TC
−３′）に対応する。約20のコロニーはプールしたプロ
ーブに対し中程度ないし強い相同性を呈した。これらの
コロニーの再画線培養および再ハイブリダイゼーション
は陽性シグナルを有する16のクローンを与えた。これら
のクローンから調製したプラスミドDNAをニトロセルロ
ースペーパー上にブロットし、個々のプローブでハイブ
リダイズした。２つのクローン（42および62a）は中央
（18mer）および３′末満（15mer）プローブ双方にハイ
ブリダイズした。プラスミドDNAのPst1での酵素消化
は、クローンNO.42が、1.1、0.6および0.4kbの３つのフ
ラグメントの形態で２キロベース（kb）より大きい最大
のインサートを含有することを示した。このクローン
は、５′−および３′−非翻訳領域を包含し、2600bpを
含有するｔ−PA遺伝子についての全長配列を含有する。
ptPBM−１ 37℃にて約10μｇのpWP42プラスミドDNAを９ユニット
のXho IIで２時間消化した。反応混合物を調製1.2％ア
ガロースゲルに付し、アガロースゲル中の電気泳動によ
って1618bp DNAフラグメントを単離した。粘着末端を
イー・コリ（E.coli）ポリメラーゼ１（クレノーフラグ
メント）およびdNTP（４つのデオキシヌクレオチドトリ
ホスフェート−dATP,dGTP,dCTPおよびdTTP）で満たした
後、かく修飾したDNA1μｇをリン酸化したSal Iリンカ
ー300ngで一晩結んだ。フェノール／クロロホルム抽出
およびエタノール沈澱の後、該DNAを50UのSal1で４時間
消化し、反応混合物を調製１％アガロースゲルに適用し
て所望のDNAフラグメントを単離した。
のXho IIで２時間消化した。反応混合物を調製1.2％ア
ガロースゲルに付し、アガロースゲル中の電気泳動によ
って1618bp DNAフラグメントを単離した。粘着末端を
イー・コリ（E.coli）ポリメラーゼ１（クレノーフラグ
メント）およびdNTP（４つのデオキシヌクレオチドトリ
ホスフェート−dATP,dGTP,dCTPおよびdTTP）で満たした
後、かく修飾したDNA1μｇをリン酸化したSal Iリンカ
ー300ngで一晩結んだ。フェノール／クロロホルム抽出
およびエタノール沈澱の後、該DNAを50UのSal1で４時間
消化し、反応混合物を調製１％アガロースゲルに適用し
て所望のDNAフラグメントを単離した。
Sal1末端を有する該DNAをSal1切断のpUC13に結び、こ
れを用いてイー・コリ（E.coli）JM103細胞を形質転換
し、該細胞をアンピシリンおよびＸ−galプレート上で
画線培養した。８つのアンピシリン耐性の白色コロニー
を選択し、増殖させてミニプラスミド調製物を調製し
た。２つのクローン（ptPS34BおよびptPS39）が所要のD
NAフラグメントを含有することが判明した。BamH Iおよ
びNar1で完全に消化したptPS39プラスミドDNA10μｇを
調製アガロースゲルに付してｔ−PAのＣ末端についてコ
ード付けする1288bpフラグメントを得た。
れを用いてイー・コリ（E.coli）JM103細胞を形質転換
し、該細胞をアンピシリンおよびＸ−galプレート上で
画線培養した。８つのアンピシリン耐性の白色コロニー
を選択し、増殖させてミニプラスミド調製物を調製し
た。２つのクローン（ptPS34BおよびptPS39）が所要のD
NAフラグメントを含有することが判明した。BamH Iおよ
びNar1で完全に消化したptPS39プラスミドDNA10μｇを
調製アガロースゲルに付してｔ−PAのＣ末端についてコ
ード付けする1288bpフラグメントを得た。
37℃にて、pWP42を４ユニットのHga1で８時間消化す
ることによりｔ−PA遺伝子の５′末端を得た。１％アガ
ロースゲル中の電気泳動によって515bpフラグメントを
単離した。このDNAフラグメントの粘着末端をDNAポリメ
ラーゼ１（クレノーフラグメント）およびdNTPで満た
し、産生物をSma1切断のpUC13に結んだ。イー・コリ
（E.coli）JM103細胞を形質転換した後、約75のアンピ
シリン耐性の白色コロニーを得た。これらのコロニーの
うち24を増殖させてミニプラスミド調製物を調製した。
ミニプラスミド調製物をNar1で消化し、17のクローンが
いずれかの向きの所要のインサートを有することが判明
した沸騰法を用いて１のクローン（ptPHga4）をアンピ
シリンを含有するLB培地1.0リットル中で増殖させて大
量のプラスミドDNAを得た。該プラスミドDNA、ptPHga4
をBamH IおよびNar1で消化し、1.2％アガロースゲル上
の電気泳動に付してｔ−PAのＮ末端についてコード付け
する434bpDNAフラグメントを単離した。
ることによりｔ−PA遺伝子の５′末端を得た。１％アガ
ロースゲル中の電気泳動によって515bpフラグメントを
単離した。このDNAフラグメントの粘着末端をDNAポリメ
ラーゼ１（クレノーフラグメント）およびdNTPで満た
し、産生物をSma1切断のpUC13に結んだ。イー・コリ
（E.coli）JM103細胞を形質転換した後、約75のアンピ
シリン耐性の白色コロニーを得た。これらのコロニーの
うち24を増殖させてミニプラスミド調製物を調製した。
ミニプラスミド調製物をNar1で消化し、17のクローンが
いずれかの向きの所要のインサートを有することが判明
した沸騰法を用いて１のクローン（ptPHga4）をアンピ
シリンを含有するLB培地1.0リットル中で増殖させて大
量のプラスミドDNAを得た。該プラスミドDNA、ptPHga4
をBamH IおよびNar1で消化し、1.2％アガロースゲル上
の電気泳動に付してｔ−PAのＮ末端についてコード付け
する434bpDNAフラグメントを単離した。
1288bpDNA（300ng）および434bp（100ng）を一晩結ん
で1722bpDNAフラグメントを得た。BamH I切断のpUC13で
結んだ後、このDNAを用いてイー・コリ（E.coli）JM103
細胞を形質転換した。1000以上のアンピシリン耐性コロ
ニーが得られた。沸騰法によって12のコロニーからプラ
スミドDNAを調製した。BamH I、Nar1およびXho IIの各
々で切断することによって該プラスミドを同定した。得
られたプラスミドはすべて所望の1722bpDNAフラグメン
トを含有することが判明した。大規模なプラスミドDNA
調製用に、１のプラスミド（ptPBM1）を用いた。BamH I
で切断すると、このプラスミドは完全なｔ−PA分子につ
いてコード付けする1722bpDNAを生じた。
で1722bpDNAフラグメントを得た。BamH I切断のpUC13で
結んだ後、このDNAを用いてイー・コリ（E.coli）JM103
細胞を形質転換した。1000以上のアンピシリン耐性コロ
ニーが得られた。沸騰法によって12のコロニーからプラ
スミドDNAを調製した。BamH I、Nar1およびXho IIの各
々で切断することによって該プラスミドを同定した。得
られたプラスミドはすべて所望の1722bpDNAフラグメン
トを含有することが判明した。大規模なプラスミドDNA
調製用に、１のプラスミド（ptPBM1）を用いた。BamH I
で切断すると、このプラスミドは完全なｔ−PA分子につ
いてコード付けする1722bpDNAを生じた。
ｕ−PAクローンのスクリーニングおよび同定 グルンステインら（Grunstein et al.）、プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、72、3961（19
75）の方法によって、ｔ−PA遺伝子がそれから得られた
105組換体細菌コロニーのライブラリーを、前掲、放射
能標識した18merプローブでスクリーニングした。ジー
ン・マシーン（Gene Machine）（アプライド・バイオ
システムズ（Applied Biosystems））を用いる標準的
なリン酸トリエステル法によって合成したプローブは、
ウロキナーゼ遺伝子の中央部分（a.a.173−179）に対応
するオリゴマー配列−５′−GTA GAT GGC CGC AAA
CCA−３′−を示す。約13のクローンが中程度ないし
強いハイブリダイゼーション信号を示した。これらのク
ローンをテトラサイクリンを含有するLB培地2ml中で増
殖させ、ミニプラスミド調製物を調製した。RNASe10μg
/mlを含有するH2O 40μに該ミニプラスミド調製物を
溶解した。かく産生したDNA約８μを１ユニットのPst
1で消化し、産生物を１％アガロースゲル上の電気泳動
によって分離した。１のクローン（pUK53）はサイズ長
1.2、0.4および0.1kbの３つのインサートの形態で1.7kb
の最大インサートを含有することが判明した。ウロキナ
ーゼの完全な３′末端ヌクレオチド配列がPst1切断の1.
2kbDNAフラグメント中に存在していた。マキサムおよび
ギルバート（Maxam and Gilbert）法、メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）、によるヌ
クレオチド配列決定法により、該遺伝子の５′末端配列
はウロキナーゼ蛋白のシグナルペプチドコーティング領
域の最初の10のアミノ酸に対応する約30ヌクレオチドを
喪失していることが判明した。従って、喪失ヌクレオチ
ドに対応する二重鎖DNA配列を合成し、存在する遺伝子
に結んだ。
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、72、3961（19
75）の方法によって、ｔ−PA遺伝子がそれから得られた
105組換体細菌コロニーのライブラリーを、前掲、放射
能標識した18merプローブでスクリーニングした。ジー
ン・マシーン（Gene Machine）（アプライド・バイオ
システムズ（Applied Biosystems））を用いる標準的
なリン酸トリエステル法によって合成したプローブは、
ウロキナーゼ遺伝子の中央部分（a.a.173−179）に対応
するオリゴマー配列−５′−GTA GAT GGC CGC AAA
CCA−３′−を示す。約13のクローンが中程度ないし
強いハイブリダイゼーション信号を示した。これらのク
ローンをテトラサイクリンを含有するLB培地2ml中で増
殖させ、ミニプラスミド調製物を調製した。RNASe10μg
/mlを含有するH2O 40μに該ミニプラスミド調製物を
溶解した。かく産生したDNA約８μを１ユニットのPst
1で消化し、産生物を１％アガロースゲル上の電気泳動
によって分離した。１のクローン（pUK53）はサイズ長
1.2、0.4および0.1kbの３つのインサートの形態で1.7kb
の最大インサートを含有することが判明した。ウロキナ
ーゼの完全な３′末端ヌクレオチド配列がPst1切断の1.
2kbDNAフラグメント中に存在していた。マキサムおよび
ギルバート（Maxam and Gilbert）法、メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）、によるヌ
クレオチド配列決定法により、該遺伝子の５′末端配列
はウロキナーゼ蛋白のシグナルペプチドコーティング領
域の最初の10のアミノ酸に対応する約30ヌクレオチドを
喪失していることが判明した。従って、喪失ヌクレオチ
ドに対応する二重鎖DNA配列を合成し、存在する遺伝子
に結んだ。
pUKBM−１ ウロキナーゼプラスミド（pUK53）DNAをNco1およびMs
t IIで切断し、産生物を１％アガロースゲル上の電気泳
動によって分離した。1198bpのDNAフラグメントを電気
溶出によって単離した。dNTPおよびイー・コリ（E.col
i）DNAポリメラーゼ（クレノーフラグメント）で満たす
ことによって、Nco1切断に対応するDNAフラグメントの
５′突出末端を平滑末端とした。次いで、該DNAをSma1
切断のpUC13に結び、修飾したプラスミドを用いてコン
ピテントイー・コリ（E.coli）JM103細胞を形質転換し
た。該DNAをpUC13のSma1部位に結んで、該インサートの
Nco1部位が再生された。該細胞をアンピシリンおよびＸ
−galプレート上で画線培養し、白色コロニーからミニ
プラスミド調製物を産生した。該ミニプラスミドDNA調
製物のNco1およびSal1での消化は約1200bpのDNAフラグ
メントを与えた。陽性クローン（pUKNM−３′）からの
大規模なプラスミドDNA調製を行い、Nco1およびSal1で
消化して大量の約1200bpDNAフラグメントを得、これを
調製アガロースゲル電気泳動によって分離した。
t IIで切断し、産生物を１％アガロースゲル上の電気泳
動によって分離した。1198bpのDNAフラグメントを電気
溶出によって単離した。dNTPおよびイー・コリ（E.col
i）DNAポリメラーゼ（クレノーフラグメント）で満たす
ことによって、Nco1切断に対応するDNAフラグメントの
５′突出末端を平滑末端とした。次いで、該DNAをSma1
切断のpUC13に結び、修飾したプラスミドを用いてコン
ピテントイー・コリ（E.coli）JM103細胞を形質転換し
た。該DNAをpUC13のSma1部位に結んで、該インサートの
Nco1部位が再生された。該細胞をアンピシリンおよびＸ
−galプレート上で画線培養し、白色コロニーからミニ
プラスミド調製物を産生した。該ミニプラスミドDNA調
製物のNco1およびSal1での消化は約1200bpのDNAフラグ
メントを与えた。陽性クローン（pUKNM−３′）からの
大規模なプラスミドDNA調製を行い、Nco1およびSal1で
消化して大量の約1200bpDNAフラグメントを得、これを
調製アガロースゲル電気泳動によって分離した。
ウロキナーゼ蛋白の５′シグナルペプチドコーディン
グ領域の最初の10のアミノ酸に対応する約30のヌクレオ
チドを供するために、pUK53プラスミドDNAをまずPst1で
消化し、400bpDNAフラグメントを単離した。このDNAを
次いでScrF1で処理してDNAの242bpフラグメントを単離
した。該DNAの突出末端をdNTPおよびイー・コリ（E.col
i）DNAポリメラーゼ１（クレノーフラグメント）で満た
した。
グ領域の最初の10のアミノ酸に対応する約30のヌクレオ
チドを供するために、pUK53プラスミドDNAをまずPst1で
消化し、400bpDNAフラグメントを単離した。このDNAを
次いでScrF1で処理してDNAの242bpフラグメントを単離
した。該DNAの突出末端をdNTPおよびイー・コリ（E.col
i）DNAポリメラーゼ１（クレノーフラグメント）で満た
した。
適当な翻訳リーディングフレームを保持し、かつSal1
切断のpUC13における継代クローニングのためのDNAの両
末端上にSal1配列を供しつつ、38および42塩基対長の２
つの相補オリゴヌクレオチド配列をジーン・マシーン
（Gene Machine）で合成して喪失アミノ酸（−９ない
し−20）を供した。リガーゼ緩衝液（50mMトリス・HC
l、pH7.6、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール）
中、等モル量で２つのオリゴマーを混合し、５分間で80
℃まで加熱し、約１時間で室温まで冷却した。400ユニ
ットのT4 DNAリガーゼを用い、リガーゼ緩衝液中、４
℃にて、かく形成した２つの相補ヌクレオチド配列の二
重鎖（約１μｇ）を16時間で242bpDNAフラグメント約30
0ngに結んだ。結んだ混合物を1.2％アガロースゲル上の
電気泳動によって分離し、約320bpDNAフラグメントを電
気溶出によって単離した。このフラグメント（約20ng）
をSal1切断のpUC13 100ngに結び、該ベクターを用いて
コンピテントイー・コリ（E.coli）JM103細胞を形質転
換した。該細胞をアンピシリンＸ−galプレート上で画
線培養した。12の白色コロニーを選択し、増殖させてミ
ニプラスミド調製物を調製した。該ミニプラスミド調製
物をSal1で切断した。320bpDNAインサートを含有すると
考えられる１のクローンをプラスミドDNAの大規模調製
のために増殖させた。該DNAをSal1およびNco1で切断し
て、調製アガロースゲル電気泳動により、260bpDNAフラ
グメントを得た。
切断のpUC13における継代クローニングのためのDNAの両
末端上にSal1配列を供しつつ、38および42塩基対長の２
つの相補オリゴヌクレオチド配列をジーン・マシーン
（Gene Machine）で合成して喪失アミノ酸（−９ない
し−20）を供した。リガーゼ緩衝液（50mMトリス・HC
l、pH7.6、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール）
中、等モル量で２つのオリゴマーを混合し、５分間で80
℃まで加熱し、約１時間で室温まで冷却した。400ユニ
ットのT4 DNAリガーゼを用い、リガーゼ緩衝液中、４
℃にて、かく形成した２つの相補ヌクレオチド配列の二
重鎖（約１μｇ）を16時間で242bpDNAフラグメント約30
0ngに結んだ。結んだ混合物を1.2％アガロースゲル上の
電気泳動によって分離し、約320bpDNAフラグメントを電
気溶出によって単離した。このフラグメント（約20ng）
をSal1切断のpUC13 100ngに結び、該ベクターを用いて
コンピテントイー・コリ（E.coli）JM103細胞を形質転
換した。該細胞をアンピシリンＸ−galプレート上で画
線培養した。12の白色コロニーを選択し、増殖させてミ
ニプラスミド調製物を調製した。該ミニプラスミド調製
物をSal1で切断した。320bpDNAインサートを含有すると
考えられる１のクローンをプラスミドDNAの大規模調製
のために増殖させた。該DNAをSal1およびNco1で切断し
て、調製アガロースゲル電気泳動により、260bpDNAフラ
グメントを得た。
遺伝子の333bp位置に共通のNco1制限部位を含有する2
60bpDNAおよび1200bpDNAフラグメントを結ぶために等モ
ル量で混合した。結んだ産生物をSal1で切断し、調製１
％アガロースゲル電気泳動によって反応混合物を分離し
た。電気溶出によってて1460bpDNAフラグメントを単離
した。このDNAをSal1切断のpUC13に結び、該プラスミド
を用いてコンピテントイー・コリ（E.coli）JM103細胞
を形質転換し、これをアンピシリンおよびＸ−galプレ
ート上で画線培養した。12の白色コロニーを選択し、増
殖させて沸騰法によりミニプラスミド調製物を調製し
た。該ミニプラスミド調製物をSal1で切断し、１のクロ
ーン（pUKBM−１）が所望の1460bpDNAインサートを含有
することが判明した。pUKBM−１を大容量で増殖させて
プラスミドDNAを得た。合成リンカーを含有する５′末
端からのオリゴヌクレオチド配列をマキサム・ギルバー
ト（Maxam−Gilbert）法により配列決定してその真性を
確認した。
60bpDNAおよび1200bpDNAフラグメントを結ぶために等モ
ル量で混合した。結んだ産生物をSal1で切断し、調製１
％アガロースゲル電気泳動によって反応混合物を分離し
た。電気溶出によってて1460bpDNAフラグメントを単離
した。このDNAをSal1切断のpUC13に結び、該プラスミド
を用いてコンピテントイー・コリ（E.coli）JM103細胞
を形質転換し、これをアンピシリンおよびＸ−galプレ
ート上で画線培養した。12の白色コロニーを選択し、増
殖させて沸騰法によりミニプラスミド調製物を調製し
た。該ミニプラスミド調製物をSal1で切断し、１のクロ
ーン（pUKBM−１）が所望の1460bpDNAインサートを含有
することが判明した。pUKBM−１を大容量で増殖させて
プラスミドDNAを得た。合成リンカーを含有する５′末
端からのオリゴヌクレオチド配列をマキサム・ギルバー
ト（Maxam−Gilbert）法により配列決定してその真性を
確認した。
それにより、pUKBM−１プラスミド中のDNAインサート
が翻訳開始コドンATG（met、リーダー配列中の−20aa）
ならびに停止コドンAGAを含有するが証明された。この
完全な遺伝子はシグナルペプチドの20のアミノ酸（−１
ないし−20）および成熟ウロキナーゼ蛋白の411のアミ
ノ酸についてコード付けする。
が翻訳開始コドンATG（met、リーダー配列中の−20aa）
ならびに停止コドンAGAを含有するが証明された。この
完全な遺伝子はシグナルペプチドの20のアミノ酸（−１
ないし−20）および成熟ウロキナーゼ蛋白の411のアミ
ノ酸についてコード付けする。
pUKKNd16 ウロキナーゼ配列におけるbp204にて切断するSca1でp
UK53プラスミドDNA約10μｇを完全に消化した。フェノ
ール抽出およびエタノール沈澱の後、DNAペレットを緩
衝溶液（10mM CaCl2、12mM MgCl2、0.2M NaCl、20mM
トリス・HCl（pH8.0）、1mM EDTA）50μに溶解し
た。エンドヌクレアーゼBal 31の１μ（２ユニット）
を反応混合物に加え、該混合物を30℃にて15秒間インキ
ュベートした（レゲルスキィ・アール・ジェイ、ジェイ
・エル・ホドネットおよびエイチ・ビイ・グレイ・ジュ
ニアー（Legerski,R.J.,J.L.Hodnett,and H.B.Gray,J
r.）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic A
cid Res.）、５、145、1978）。0.4M EDTA ５μの
添加により反応を停止した。この反応時間はDNAフラグ
メントの各末端から約80bp除去するのに十分であること
が判明した。フェノール抽出およびエタノール沈澱の
後、標準的な反応条件下でDNAをオリゴヌクレオチドリ
ンカー（10bp）に結んだ。配列がTGGAATTCCAであるオリ
ゴマーリンカー（EocR1/Nde1リンカー）を消化し、配列
TATG（a.a.51に対応）を含有するDNA末端に結んでNde1
部位（CATATG）を得る。加えて、pUC13ベクター中に引
き続いてクローニングを供するために制限部位、EcoR
1、をリンカーに組み入れた。フェノール抽出およびエ
タノール沈澱の後、該DNAをEcoR1で消化し、１％調製ア
ガロースゲル上の電気泳動によって分離した。340bpに
対応するDNAバンドを切断し、溶出し、エタノール沈澱
させた。このDNA約40ngをEcoR1切断のpUC13ベクターDNA
約0.4μｇで結び、これを用いてコンピテントイー・コ
リ（E.coli）JM103細胞を形質転換した（マニアティス
ら（Maniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）、2
50頁）。10のプレートから約1000の組換体コロニーを得
た。該細菌コロニーをニトロセルロースペーパー上でレ
プリカ画線培養し、放射活性なオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーションよ
ってスクリーニングした（グルンステインら（Grunstei
n et al.）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S
ci.）USA、72、3961、1975）。用いたオリゴヌクレオチ
ドプローブは18bp長（TTCCATATGAGGGGAATG）であり、Ec
oR1/Nde1リンカーからの最初の５のヌクレオチドおよび
a.a.51ないし54に対応するウロキナーゼ配列からの次の
13塩基対を含有するものである。12のクローンはＸ線フ
ィルム上で、中程度ないし強い信号を示した。これらの
12のクローンから調製したミニプラスミドDNAをNde1で
消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離
した。１のクローン、pUKKNd16、は新しく生成したNde1
部位を含有することが判明した。
UK53プラスミドDNA約10μｇを完全に消化した。フェノ
ール抽出およびエタノール沈澱の後、DNAペレットを緩
衝溶液（10mM CaCl2、12mM MgCl2、0.2M NaCl、20mM
トリス・HCl（pH8.0）、1mM EDTA）50μに溶解し
た。エンドヌクレアーゼBal 31の１μ（２ユニット）
を反応混合物に加え、該混合物を30℃にて15秒間インキ
ュベートした（レゲルスキィ・アール・ジェイ、ジェイ
・エル・ホドネットおよびエイチ・ビイ・グレイ・ジュ
ニアー（Legerski,R.J.,J.L.Hodnett,and H.B.Gray,J
r.）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic A
cid Res.）、５、145、1978）。0.4M EDTA ５μの
添加により反応を停止した。この反応時間はDNAフラグ
メントの各末端から約80bp除去するのに十分であること
が判明した。フェノール抽出およびエタノール沈澱の
後、標準的な反応条件下でDNAをオリゴヌクレオチドリ
ンカー（10bp）に結んだ。配列がTGGAATTCCAであるオリ
ゴマーリンカー（EocR1/Nde1リンカー）を消化し、配列
TATG（a.a.51に対応）を含有するDNA末端に結んでNde1
部位（CATATG）を得る。加えて、pUC13ベクター中に引
き続いてクローニングを供するために制限部位、EcoR
1、をリンカーに組み入れた。フェノール抽出およびエ
タノール沈澱の後、該DNAをEcoR1で消化し、１％調製ア
ガロースゲル上の電気泳動によって分離した。340bpに
対応するDNAバンドを切断し、溶出し、エタノール沈澱
させた。このDNA約40ngをEcoR1切断のpUC13ベクターDNA
約0.4μｇで結び、これを用いてコンピテントイー・コ
リ（E.coli）JM103細胞を形質転換した（マニアティス
ら（Maniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）、2
50頁）。10のプレートから約1000の組換体コロニーを得
た。該細菌コロニーをニトロセルロースペーパー上でレ
プリカ画線培養し、放射活性なオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーションよ
ってスクリーニングした（グルンステインら（Grunstei
n et al.）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S
ci.）USA、72、3961、1975）。用いたオリゴヌクレオチ
ドプローブは18bp長（TTCCATATGAGGGGAATG）であり、Ec
oR1/Nde1リンカーからの最初の５のヌクレオチドおよび
a.a.51ないし54に対応するウロキナーゼ配列からの次の
13塩基対を含有するものである。12のクローンはＸ線フ
ィルム上で、中程度ないし強い信号を示した。これらの
12のクローンから調製したミニプラスミドDNAをNde1で
消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離
した。１のクローン、pUKKNd16、は新しく生成したNde1
部位を含有することが判明した。
p5′HybF−５ 反応混合物50μ中のptPBM−１プラスミドDNA約10μ
ｇをNar Iで消化して２つのDNAフラグメント−600bpお
よび3800bpを得た。より小さいNar Iフラグメント（600
bp）は単離されるべき400bpの目的DNAを含有していた。
反応混合物をBAL31緩衝液で100μ容量まで希釈して最
終濃度10mM CaCl2、12mM MgCl2、0.2M NaCl、20mMト
リス−Cl、pH8.0、1mM EDTAとした。30℃にて反応試験
管をBAL31 １μ（2u）と共に10秒間インキュベート
した。このインキュベーション時間は600bpDNAセグメン
トの各末端から50bp除去するのに十分であることが判明
した。この結果、1.2％アガロースゲル電気泳動に付す
と、DNAサイズが600bpから500bpに減少した。反応は0.4
M EDTA 5μの添加によって停止した。フェノール抽
出およびエタノール沈澱の後、イー・コリ（E.coli）ポ
リメラーゼ１（クレノー）およびdNTP（dATP、dCTP、dG
TP、dTTP）でDNAを平滑末端とした（マニアティスら（M
aniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）109
頁）。該DNAを1.2％アガロース中で電気泳動に付し、50
0bpDNAセグメントを単離した。15℃にて、このDNA約100
ngをFsp I/EcoR Iオリゴヌクレオチドリンカー１μｇで
一晩結んだ。名称が示唆するように、該リンカー、gca
gaa ttc tgc、は配列TGC（a.a.92）で終了するDNA
に結ぶとFsp I部位（TGC gca）を生じるように設計され
たものであった。加えて、EcoR I配列を該リンカーに組
み入れて引き続いてのEcoR I/pUC13ベクター中でのクロ
ーニングに便利な部位を供した。フェノール抽出および
エタノール沈澱の後、該DNAをEcoR Iで十分に消化し400
bpDNAフラグメントを1.2％アガロースゲルから単離し
た。このDNAおよびEcoR I切断のpUC 13の等モル量を結
び、産生物を用いてイー・コリ（E.coli）JM103を形質
転換した。数千の組換体コロニーが得られた。10のプレ
ートにおける約1000のコロニーをニトロセルロースペー
パー上で複製し、放射能標識したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした（グルンステインら（Grun
stein et al.）、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）USA、72、3961、1975）。用いたプローブは18
ヌクレオチド長であり、DNA/リンカー結合にて生じたヌ
クレオチド配列を表わすよう設計したものであった。こ
れによりDNA/リンカー結合にて異なるヌクレオチドを有
するすべての望まないクローンの除去がほとんど保証さ
れた。ほぼ100のクローンはＸ線フィルムに暴露する
と、中程度ないし強いハイブリダイゼーション信号を与
えた。12のクローンをピックアップし、増殖させてミニ
プラスミド調製物を得た。該プラスミド含有溶液約８μ
を１ユニットのFsp Iで消化した。12のクローンのう
ち９つは新しく生成したFsp I部位を有していた。ベク
ター中のインサートの向きに依存して、Fsp I消化は500
bp（クローンNo.2、３、５、９）または150bp（クロー
ンNo.1、７、８、11、12）いずれかを示すであろう。最
終的な確認は、マキサム−ギルバート（Maxam−Gilber
t）法（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods E
nzymol.）、65、1499、1980）によるヌクレオチド配列
決定法により行い、完全なシグナル配列およびｔ−PA遺
伝子のa.a.1−92に対応するアミノ酸についてコード付
けするDNAを含有するptPFsp−２なる名称のクローン２
におけるFsp I認識配列TGCGCAと共に、bp465（a.a.92）
位におけるFsp I部位（TGCGCA）の存在が示された。
ｇをNar Iで消化して２つのDNAフラグメント−600bpお
よび3800bpを得た。より小さいNar Iフラグメント（600
bp）は単離されるべき400bpの目的DNAを含有していた。
反応混合物をBAL31緩衝液で100μ容量まで希釈して最
終濃度10mM CaCl2、12mM MgCl2、0.2M NaCl、20mMト
リス−Cl、pH8.0、1mM EDTAとした。30℃にて反応試験
管をBAL31 １μ（2u）と共に10秒間インキュベート
した。このインキュベーション時間は600bpDNAセグメン
トの各末端から50bp除去するのに十分であることが判明
した。この結果、1.2％アガロースゲル電気泳動に付す
と、DNAサイズが600bpから500bpに減少した。反応は0.4
M EDTA 5μの添加によって停止した。フェノール抽
出およびエタノール沈澱の後、イー・コリ（E.coli）ポ
リメラーゼ１（クレノー）およびdNTP（dATP、dCTP、dG
TP、dTTP）でDNAを平滑末端とした（マニアティスら（M
aniatis et al.）、ロク・シト（loc.cit.）109
頁）。該DNAを1.2％アガロース中で電気泳動に付し、50
0bpDNAセグメントを単離した。15℃にて、このDNA約100
ngをFsp I/EcoR Iオリゴヌクレオチドリンカー１μｇで
一晩結んだ。名称が示唆するように、該リンカー、gca
gaa ttc tgc、は配列TGC（a.a.92）で終了するDNA
に結ぶとFsp I部位（TGC gca）を生じるように設計され
たものであった。加えて、EcoR I配列を該リンカーに組
み入れて引き続いてのEcoR I/pUC13ベクター中でのクロ
ーニングに便利な部位を供した。フェノール抽出および
エタノール沈澱の後、該DNAをEcoR Iで十分に消化し400
bpDNAフラグメントを1.2％アガロースゲルから単離し
た。このDNAおよびEcoR I切断のpUC 13の等モル量を結
び、産生物を用いてイー・コリ（E.coli）JM103を形質
転換した。数千の組換体コロニーが得られた。10のプレ
ートにおける約1000のコロニーをニトロセルロースペー
パー上で複製し、放射能標識したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした（グルンステインら（Grun
stein et al.）、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）USA、72、3961、1975）。用いたプローブは18
ヌクレオチド長であり、DNA/リンカー結合にて生じたヌ
クレオチド配列を表わすよう設計したものであった。こ
れによりDNA/リンカー結合にて異なるヌクレオチドを有
するすべての望まないクローンの除去がほとんど保証さ
れた。ほぼ100のクローンはＸ線フィルムに暴露する
と、中程度ないし強いハイブリダイゼーション信号を与
えた。12のクローンをピックアップし、増殖させてミニ
プラスミド調製物を得た。該プラスミド含有溶液約８μ
を１ユニットのFsp Iで消化した。12のクローンのう
ち９つは新しく生成したFsp I部位を有していた。ベク
ター中のインサートの向きに依存して、Fsp I消化は500
bp（クローンNo.2、３、５、９）または150bp（クロー
ンNo.1、７、８、11、12）いずれかを示すであろう。最
終的な確認は、マキサム−ギルバート（Maxam−Gilber
t）法（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods E
nzymol.）、65、1499、1980）によるヌクレオチド配列
決定法により行い、完全なシグナル配列およびｔ−PA遺
伝子のa.a.1−92に対応するアミノ酸についてコード付
けするDNAを含有するptPFsp−２なる名称のクローン２
におけるFsp I認識配列TGCGCAと共に、bp465（a.a.92）
位におけるFsp I部位（TGCGCA）の存在が示された。
ジーン・マシーン（Gene Machine）で８つの重複す
るオリゴヌクレオチドを調製することによって、第８図
に描いたごとく組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ｔ−PA）の第２クリングル（K2）に見い出されるアミ
ノ酸191ないし258に対応するDNA配列を化学的に合成し
た。オリゴマーＩないしVIIIの全ヌクレオチド配列を第
９図に描く。オリゴマーＶないしVIIIは相補的である。
二重鎖融合のために各フラグメントに10ヌクレオチド重
複を供する。オリゴマーIIないしVIIはポリヌクレオチ
ドキナーゼおよびATPでリン酸化した。オリゴＩおよびV
IIIの５′末端は自己結びを回避するためにリン酸化し
なかった。すべての８つのオリゴを等量（各オリゴマー
１μｇ）で混合し、相補鎖間の二重鎖形成のために10分
間で65℃まで加熱し、次いで15℃にてT4 DNAリガーゼ
で一晩結んだ。フェノール抽出およびエタノール沈澱に
続き、アガロースゲル上の電気泳動に付すことにより22
8bpDNA産生物を位置決めしたが、それは５′および３′
両末端にEcoR I制限部位が付着し、各々５′および３′
末端に向かってユニークKpn IおよびAat II制限部位を
含有し、後者の制限部位はｔ−PAのa.a.191ないし258に
対応するDNQフラグメントを決定する。該228bpDNA産生
物を電気溶出し、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
し、EcoR I切断のpUC13に挿入した。12のクローンから
ミニプラスミド調製物を調製し、EcoR Iで切断して所望
の228bpインサート９を含有するクローンを同定した。
１のクローンを選択し、pK2＊−５と名付けた。該クロ
ーンのヌクレオチド配列決定により、目的配列を含有す
るDNAは正しいリーディングフレーム中にあることが示
された。このDNA配列は、組換えおよび転写間のルーピ
ングアウトを回避するための所望のアミノ酸についての
別のコドン配列を含有する。
るオリゴヌクレオチドを調製することによって、第８図
に描いたごとく組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ｔ−PA）の第２クリングル（K2）に見い出されるアミ
ノ酸191ないし258に対応するDNA配列を化学的に合成し
た。オリゴマーＩないしVIIIの全ヌクレオチド配列を第
９図に描く。オリゴマーＶないしVIIIは相補的である。
二重鎖融合のために各フラグメントに10ヌクレオチド重
複を供する。オリゴマーIIないしVIIはポリヌクレオチ
ドキナーゼおよびATPでリン酸化した。オリゴＩおよびV
IIIの５′末端は自己結びを回避するためにリン酸化し
なかった。すべての８つのオリゴを等量（各オリゴマー
１μｇ）で混合し、相補鎖間の二重鎖形成のために10分
間で65℃まで加熱し、次いで15℃にてT4 DNAリガーゼ
で一晩結んだ。フェノール抽出およびエタノール沈澱に
続き、アガロースゲル上の電気泳動に付すことにより22
8bpDNA産生物を位置決めしたが、それは５′および３′
両末端にEcoR I制限部位が付着し、各々５′および３′
末端に向かってユニークKpn IおよびAat II制限部位を
含有し、後者の制限部位はｔ−PAのa.a.191ないし258に
対応するDNQフラグメントを決定する。該228bpDNA産生
物を電気溶出し、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
し、EcoR I切断のpUC13に挿入した。12のクローンから
ミニプラスミド調製物を調製し、EcoR Iで切断して所望
の228bpインサート９を含有するクローンを同定した。
１のクローンを選択し、pK2＊−５と名付けた。該クロ
ーンのヌクレオチド配列決定により、目的配列を含有す
るDNAは正しいリーディングフレーム中にあることが示
された。このDNA配列は、組換えおよび転写間のルーピ
ングアウトを回避するための所望のアミノ酸についての
別のコドン配列を含有する。
ptPFsp−２約10μｇをFsp−１で消化して完全なシグ
ナルペプチド（a.a.−35ないし−１）およびa.a.92位に
ユニークFsp−１制限部位を有するｔ−PAの最初の92ア
ミノ酸についてコード付けする550bpDNAフラグメントを
得た。このDNA約１μｇを、T4 DNAリガーゼで、ジーン
・マシーン（Gene Machine）で産生した第10図に描い
た二重鎖オリゴマー２μｇに結んで186位のAlaの存在以
外はｔ−PAの第２クリングルのa.a.181−191に対応する
アミノ酸配列−Tyr−Phe−Gly−Asn−Gly−Ala−Ala−T
yr−Arg−Gly−Thr−の産生用に供し、および３′末端
にKpn−１部位（GGTACC）を供した。フェノール抽出お
よびエタノール沈澱の後、産生物をKpn−１で切断して6
10bpDNA画分を得、これをKpn−１切断のpK2＊−５に挿
入してK2クリングルのＮ末端部分（a.a.181−191）につ
いてのコドンがｔ−PAのアミノ酸92を提供するコドンに
結合した組換体クローンを得た。この組換体クローンを
ptPK2＊Kpn−９と名付けた。それは完全なシグナル配
列、ｔ−PAのK2のa.a.1−91、続いてのa.a.180−258を
コード付けするヌクレオチド配列を含有する。Aat11お
よびEcoR Iで消化したこのプラスミドから所望の630bpD
NAフラグメントを得た。
ナルペプチド（a.a.−35ないし−１）およびa.a.92位に
ユニークFsp−１制限部位を有するｔ−PAの最初の92ア
ミノ酸についてコード付けする550bpDNAフラグメントを
得た。このDNA約１μｇを、T4 DNAリガーゼで、ジーン
・マシーン（Gene Machine）で産生した第10図に描い
た二重鎖オリゴマー２μｇに結んで186位のAlaの存在以
外はｔ−PAの第２クリングルのa.a.181−191に対応する
アミノ酸配列−Tyr−Phe−Gly−Asn−Gly−Ala−Ala−T
yr−Arg−Gly−Thr−の産生用に供し、および３′末端
にKpn−１部位（GGTACC）を供した。フェノール抽出お
よびエタノール沈澱の後、産生物をKpn−１で切断して6
10bpDNA画分を得、これをKpn−１切断のpK2＊−５に挿
入してK2クリングルのＮ末端部分（a.a.181−191）につ
いてのコドンがｔ−PAのアミノ酸92を提供するコドンに
結合した組換体クローンを得た。この組換体クローンを
ptPK2＊Kpn−９と名付けた。それは完全なシグナル配
列、ｔ−PAのK2のa.a.1−91、続いてのa.a.180−258を
コード付けするヌクレオチド配列を含有する。Aat11お
よびEcoR Iで消化したこのプラスミドから所望の630bpD
NAフラグメントを得た。
a.a.95ないし205t−PAについてコード付けする情報を
含有する330bpDNAフラグメント（bp471−801）をEcoR I
およびAva11切断のptPBM−１から単離した。この330bpD
NAフラグメントを、K2＊のアミノ酸259ないし261につい
てコード付けするジーン・マシーン（Gene Machine）
で調製の二重鎖オリゴマー、ｔ−PAのK1のSer−Glu−Gl
y−Asn−Ser−Asp−およびアミノ酸92ないし95について
コード付けするヘプタペプチドリンカーに結んだ。産生
物をEcoR IおよびAat11で切断し、366bpDNAフラグメン
トを単離し、これを前節の630bpDNA配列に結んで996bpD
NAフラグメントを得た。このDNA配列を増幅のためのEco
R I切断のpUC13に挿入し、１の組換体クローンが所望の
産生物を含有するものとして同定された。このクローン
をp5′HybF−５と名付けた。
含有する330bpDNAフラグメント（bp471−801）をEcoR I
およびAva11切断のptPBM−１から単離した。この330bpD
NAフラグメントを、K2＊のアミノ酸259ないし261につい
てコード付けするジーン・マシーン（Gene Machine）
で調製の二重鎖オリゴマー、ｔ−PAのK1のSer−Glu−Gl
y−Asn−Ser−Asp−およびアミノ酸92ないし95について
コード付けするヘプタペプチドリンカーに結んだ。産生
物をEcoR IおよびAat11で切断し、366bpDNAフラグメン
トを単離し、これを前節の630bpDNA配列に結んで996bpD
NAフラグメントを得た。このDNA配列を増幅のためのEco
R I切断のpUC13に挿入し、１の組換体クローンが所望の
産生物を含有するものとして同定された。このクローン
をp5′HybF−５と名付けた。
実施例１ Δ2-89t−PA ptPBM−１約10μｇをBgl IIで消化し、調製アガロー
スゲル電気泳動によって2.8kbDNAフラグメントを単離し
た。このDNAのフラグメントはpUCベクターに対応し、ｔ
−PAの完全なシグナルペプチド領域（−35ないし−１ア
ミノ酸）を含有する。
スゲル電気泳動によって2.8kbDNAフラグメントを単離し
た。このDNAのフラグメントはpUCベクターに対応し、ｔ
−PAの完全なシグナルペプチド領域（−35ないし−１ア
ミノ酸）を含有する。
ｔ−PAクリングル１の中および前に示した喪失アミノ
酸について供する化学的に合成した20および19塩基の２
つの相補オリゴヌクレオチド配列： をBgl II切断の2.8kbDNAに結んだ。このオリゴヌクレオ
チドリンカー配列は、Bgl IIおよびAva II切断のｔ−PA
遺伝子に連結させると、各々５′−および３′−末端に
てBgl IIおよびAva II制限部位を生じるように設計され
たものであった。ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼ
で20塩基オリゴマーをリン酸化した。次いで、２つのオ
リゴマーを、リガーゼ緩衝液（50mMトリス−HCl、pH7.
6、10mM MgCl2、10mM DTT）中で等モル量で混合し、8
0℃まで５分間加熱し、約１時間で室温まで冷却した。B
gl II切断の2.8kbDNA約４μｇを二重鎖リンカー約１μ
ｇに加え、15℃にて混合物をT4 DNAリガーゼと共に約1
6時間インキュベートした。フェノール抽出およびエタ
ノール沈澱の後、産生物をEcoR Iで十分に消化し、リー
ダー配列およびリンカーを含有する130bpDNAフラグメン
トを単離した。
酸について供する化学的に合成した20および19塩基の２
つの相補オリゴヌクレオチド配列： をBgl II切断の2.8kbDNAに結んだ。このオリゴヌクレオ
チドリンカー配列は、Bgl IIおよびAva II切断のｔ−PA
遺伝子に連結させると、各々５′−および３′−末端に
てBgl IIおよびAva II制限部位を生じるように設計され
たものであった。ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼ
で20塩基オリゴマーをリン酸化した。次いで、２つのオ
リゴマーを、リガーゼ緩衝液（50mMトリス−HCl、pH7.
6、10mM MgCl2、10mM DTT）中で等モル量で混合し、8
0℃まで５分間加熱し、約１時間で室温まで冷却した。B
gl II切断の2.8kbDNA約４μｇを二重鎖リンカー約１μ
ｇに加え、15℃にて混合物をT4 DNAリガーゼと共に約1
6時間インキュベートした。フェノール抽出およびエタ
ノール沈澱の後、産生物をEcoR Iで十分に消化し、リー
ダー配列およびリンカーを含有する130bpDNAフラグメン
トを単離した。
ptPBM−１約10μｇをAva IIで消化して、調製１％ア
ガロースゲル電気泳動により、747bpDNAフラグメント
（471ないし1218位）を単離した。該747bpDNAフラグメ
ントを次いでEcoR Iで消化して330bpDNAフラグメント
（471ないし801位）を得た。
ガロースゲル電気泳動により、747bpDNAフラグメント
（471ないし1218位）を単離した。該747bpDNAフラグメ
ントを次いでEcoR Iで消化して330bpDNAフラグメント
（471ないし801位）を得た。
前節で調製した130bpDNAフラグメントおよび330bpDNA
フラグメント各１μｇを混合し、15℃にてリガーゼ緩衝
液中でT4 DNAリガーゼと共に約16時間インキュベート
した。フェノールでの抽出に続き、エタノールを加えて
産生物を沈澱させ、次いでこれをEcoR Iで消化して460b
pDNAフラグメントを得た。このDNAをEcoR I切断のpUC13
に結び、該産生物を用いてコンピテントイー・コリ（E.
coli）JM103細胞を形質転換し、これをアンピシリンお
よびＸ−galプレート上で画線培養した。12の組換体
（白色）コロニーを選択し、ミニプラスミド調製用の培
地1ml中で増殖させた。Ava II、Nar1またはEcoR Iおよ
びBgl IIでの消化によって該組換体プラスミド中のイン
サートの存在をチェックした。９つのクローンは、第１
図に示す向きの所要のインサートを含有することが判明
した。マキサム−ギルバート（Maxam−Gilbert）法（メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymo
l.）、65、1499（1980）による１のクローンの配列決定
（p5′−Δ2-89−tP−４）により、望まれないDNA配列
（187−463位）の正しい欠失が確認された。
フラグメント各１μｇを混合し、15℃にてリガーゼ緩衝
液中でT4 DNAリガーゼと共に約16時間インキュベート
した。フェノールでの抽出に続き、エタノールを加えて
産生物を沈澱させ、次いでこれをEcoR Iで消化して460b
pDNAフラグメントを得た。このDNAをEcoR I切断のpUC13
に結び、該産生物を用いてコンピテントイー・コリ（E.
coli）JM103細胞を形質転換し、これをアンピシリンお
よびＸ−galプレート上で画線培養した。12の組換体
（白色）コロニーを選択し、ミニプラスミド調製用の培
地1ml中で増殖させた。Ava II、Nar1またはEcoR Iおよ
びBgl IIでの消化によって該組換体プラスミド中のイン
サートの存在をチェックした。９つのクローンは、第１
図に示す向きの所要のインサートを含有することが判明
した。マキサム−ギルバート（Maxam−Gilbert）法（メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymo
l.）、65、1499（1980）による１のクローンの配列決定
（p5′−Δ2-89−tP−４）により、望まれないDNA配列
（187−463位）の正しい欠失が確認された。
517位で始まるｔ−PA遺伝子のその部分についてコー
ド付けし、同時に517位にて共通のNar1制限部位を生じ
る、前節で産生したDNA配列に付け加えるために、ptPBM
−１およびp5′−Δ2-89−tP−４各約５μｇをNar1およ
びBamH Iで消化して各々1300bpおよび200bpのDNAフラグ
メントを得た。15℃にてこれらの２つのDNAフラグメン
トを一晩結び、次いでBamH Iで消化してΔ2-89−ｔ−PA
についてコード付けする全配列を含有する1500bpDNAフ
ラグメントを単離し、次いでこれをp341−３のBgl II部
位に挿入した。得られたプラスミドのBamH I部位におい
て8kbBPVゲノムDNAを挿入して完全なBVP−依存性発現ベ
クター（ｐΔ2-89tP−AMT−BPV−40）を得た。通常の培
養、回収、単離および精製技術により、アミノ酸２ない
し89のフィブロネクチンおよび表皮細胞発育因子領域の
欠けたプラスミノーゲンアクチベーターｔ−PAを得る。
このプラスミノーゲンアクチベーターは成熟ｔ−PAにお
いて現れるバン・ゾネベルトら（Van Zonneveld et
al.）、ロク・シト（loc.cit.）によってDNA標識LK1−
２から産生されるものと、少なくとも位置１におけるSe
rにより、および成熟蛋白の正しいプロセッシングにお
いて役立つものの存在により異なる（Arg-1−Ser+1）。
ド付けし、同時に517位にて共通のNar1制限部位を生じ
る、前節で産生したDNA配列に付け加えるために、ptPBM
−１およびp5′−Δ2-89−tP−４各約５μｇをNar1およ
びBamH Iで消化して各々1300bpおよび200bpのDNAフラグ
メントを得た。15℃にてこれらの２つのDNAフラグメン
トを一晩結び、次いでBamH Iで消化してΔ2-89−ｔ−PA
についてコード付けする全配列を含有する1500bpDNAフ
ラグメントを単離し、次いでこれをp341−３のBgl II部
位に挿入した。得られたプラスミドのBamH I部位におい
て8kbBPVゲノムDNAを挿入して完全なBVP−依存性発現ベ
クター（ｐΔ2-89tP−AMT−BPV−40）を得た。通常の培
養、回収、単離および精製技術により、アミノ酸２ない
し89のフィブロネクチンおよび表皮細胞発育因子領域の
欠けたプラスミノーゲンアクチベーターｔ−PAを得る。
このプラスミノーゲンアクチベーターは成熟ｔ−PAにお
いて現れるバン・ゾネベルトら（Van Zonneveld et
al.）、ロク・シト（loc.cit.）によってDNA標識LK1−
２から産生されるものと、少なくとも位置１におけるSe
rにより、および成熟蛋白の正しいプロセッシングにお
いて役立つものの存在により異なる（Arg-1−Ser+1）。
実施例２ ΔEGF t−PA ptPBM−１約５μｇをSty1で消化して約3.0kbおよび1.
35kbの２つのDNAフラグメントを得た。ｔ−PA遺伝子の
５′末端（bp72ないし350）を含有するより大きいフラ
グメントを電気溶出によって単離した。このDNAフラグ
メントをBal 31で５秒間消化して３′末端からｔ−PAの
アミノ酸番号51に対応する約bp342（...TGC）位までの
約８つのbpを除去した。Bal 31での消化から得た混合物
を合成により調製した（Fsp1−EcoR1）リンカー、正し
くbp342....TGC配列に連結すると新しいFsp1制限部
位（...TGCgca...）を生じる５′−gcagaattctgc−３′
に結んだ。EcoR Iでのリンカー付着のBal 31消化産生物
の完全な消化により、約300bpのDNAフラグメントの混合
物を得、これを単離し、EcoR I切断のpUC13に挿入し、
次いでこれを用いてイー・コリ（E.coli）JM103細胞を
形質転換した。ｔ−PAのアミノ酸48ないし51に対応する
12のヌクレオチドおよびリンカーに対応する９つのヌク
レオチドであるDNAとリンカーとの結合部で生成するヌ
クレオチド配列に相補させるために合成した放射能標識
の21merプローブでのインサイチュ・ハイブリダイゼー
ションによってこれらの形質転換細胞をスクリーニング
した。Ｘ線フィルム上で強いハイブリダイゼーション信
号を示す６つのクローンを培養してミニプラスミド調製
物を得た。該DNAをFsp1で消化し、1.2％アガロースゲル
電気泳動に付した。ベクター中のインサートの向きに応
じ、150bpおよび450bpDNAフラグメントの存在によって
証明されるごとく、３つのクローンはFsp1制限部位の存
在を示した。マキサム・ギルバート（Maxam Gilbert）
法によるヌクレオチド配列決定法により、Fsp1部位がｔ
−PAのアミノ酸51に対応する所望の位置にある１のクロ
ーンpl−51 tPFsp1が同定された。Fsp1およびEcoR1で
このプラスミドを消化して、最初の51のアミノ酸に対応
する300bpDNAフラグメントおよびｔ−PAの完全なリーダ
ー配列を得た。
35kbの２つのDNAフラグメントを得た。ｔ−PA遺伝子の
５′末端（bp72ないし350）を含有するより大きいフラ
グメントを電気溶出によって単離した。このDNAフラグ
メントをBal 31で５秒間消化して３′末端からｔ−PAの
アミノ酸番号51に対応する約bp342（...TGC）位までの
約８つのbpを除去した。Bal 31での消化から得た混合物
を合成により調製した（Fsp1−EcoR1）リンカー、正し
くbp342....TGC配列に連結すると新しいFsp1制限部
位（...TGCgca...）を生じる５′−gcagaattctgc−３′
に結んだ。EcoR Iでのリンカー付着のBal 31消化産生物
の完全な消化により、約300bpのDNAフラグメントの混合
物を得、これを単離し、EcoR I切断のpUC13に挿入し、
次いでこれを用いてイー・コリ（E.coli）JM103細胞を
形質転換した。ｔ−PAのアミノ酸48ないし51に対応する
12のヌクレオチドおよびリンカーに対応する９つのヌク
レオチドであるDNAとリンカーとの結合部で生成するヌ
クレオチド配列に相補させるために合成した放射能標識
の21merプローブでのインサイチュ・ハイブリダイゼー
ションによってこれらの形質転換細胞をスクリーニング
した。Ｘ線フィルム上で強いハイブリダイゼーション信
号を示す６つのクローンを培養してミニプラスミド調製
物を得た。該DNAをFsp1で消化し、1.2％アガロースゲル
電気泳動に付した。ベクター中のインサートの向きに応
じ、150bpおよび450bpDNAフラグメントの存在によって
証明されるごとく、３つのクローンはFsp1制限部位の存
在を示した。マキサム・ギルバート（Maxam Gilbert）
法によるヌクレオチド配列決定法により、Fsp1部位がｔ
−PAのアミノ酸51に対応する所望の位置にある１のクロ
ーンpl−51 tPFsp1が同定された。Fsp1およびEcoR1で
このプラスミドを消化して、最初の51のアミノ酸に対応
する300bpDNAフラグメントおよびｔ−PAの完全なリーダ
ー配列を得た。
ptPBM−１約10μｇをAva IIで消化し、747bpDNAフラ
グメントを調製１％アガロースゲル電気泳動によって単
離した。粘着末端をイー・コリ（E.coli）DNAポリメラ
ーゼ１（クレノーフラグメント）およびdNTPで満たし、
該DNAをEcoR1で消化して約330bpのDNAフラグメントを得
た。前節で産生した300bpDNAフラグメントおよび330bpD
NAフラグメント各約0.5μｇを４℃にて一晩でT4DNAリガ
ーゼおよびT4RNAリガーゼで平滑末端とした。産生物混
合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、Ec
oR1で切断して630bpDNAフラグメントを得た。該630bpDN
AフラグメントをEcoR1切断のpUC13に挿入し、該プラス
ミドを有してコンピテントイー・コリ（E.coli）JM103
細胞を形質転換した。18の組換体クローンを選択し、ミ
ニプラスミドDNA調製用に増殖させた。プラスミドDNAの
EcoR1、Nar1またはEcoR1およびBgl IIでの消化によって
所望のクローン、p5′ΔEGF−tP−11を同定した。マキ
サム・ギルバート（Maxam Gilbert）法による選択クロ
ーンのDNA配列決定によって、EGFドメインの欠失ならび
に正しいリーディングフレームの回復が確認された。
グメントを調製１％アガロースゲル電気泳動によって単
離した。粘着末端をイー・コリ（E.coli）DNAポリメラ
ーゼ１（クレノーフラグメント）およびdNTPで満たし、
該DNAをEcoR1で消化して約330bpのDNAフラグメントを得
た。前節で産生した300bpDNAフラグメントおよび330bpD
NAフラグメント各約0.5μｇを４℃にて一晩でT4DNAリガ
ーゼおよびT4RNAリガーゼで平滑末端とした。産生物混
合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、Ec
oR1で切断して630bpDNAフラグメントを得た。該630bpDN
AフラグメントをEcoR1切断のpUC13に挿入し、該プラス
ミドを有してコンピテントイー・コリ（E.coli）JM103
細胞を形質転換した。18の組換体クローンを選択し、ミ
ニプラスミドDNA調製用に増殖させた。プラスミドDNAの
EcoR1、Nar1またはEcoR1およびBgl IIでの消化によって
所望のクローン、p5′ΔEGF−tP−11を同定した。マキ
サム・ギルバート（Maxam Gilbert）法による選択クロ
ーンのDNA配列決定によって、EGFドメインの欠失ならび
に正しいリーディングフレームの回復が確認された。
プラスミド、p5′ΔEGF−tP−11およびptPBM−１、を
Nar1およびBamH Iで消化して、各々、335bpおよび1300b
pのDNAフラグメントを単離した。該２つのDNAフラグメ
ントの等モル量を結び、次いでBamH Iで消化して約1635
bpのDNAフラグメントを単離し、これをpUC13中で増幅し
て組換体クローンｐΔEGF−tP−pUC−22を得た。このDN
AはΔEGF−組織プラスミノーゲンアクチベーターについ
てのコーディング配列を含有する。このDNA配列のp341
−３、BPV−依存性発現ベクター、のBgl II部位への挿
入、続いての通常の培養、回収、単離および精製により
アミノ酸51−91に対応する表皮細胞成長因子を欠くｔ−
PAを得る。
Nar1およびBamH Iで消化して、各々、335bpおよび1300b
pのDNAフラグメントを単離した。該２つのDNAフラグメ
ントの等モル量を結び、次いでBamH Iで消化して約1635
bpのDNAフラグメントを単離し、これをpUC13中で増幅し
て組換体クローンｐΔEGF−tP−pUC−22を得た。このDN
AはΔEGF−組織プラスミノーゲンアクチベーターについ
てのコーディング配列を含有する。このDNA配列のp341
−３、BPV−依存性発現ベクター、のBgl II部位への挿
入、続いての通常の培養、回収、単離および精製により
アミノ酸51−91に対応する表皮細胞成長因子を欠くｔ−
PAを得る。
実施例３ ΔEGF−ウロキナーゼ pUKBM−１約20μｇをAcc1およびNco1で消化して263bp
DNAフラグメントを得、これをHinf1で切断した。位置70
ないし125bpに対応する55bpDNAフラグメントを電気泳動
によって反応産生物から単離した。
DNAフラグメントを得、これをHinf1で切断した。位置70
ないし125bpに対応する55bpDNAフラグメントを電気泳動
によって反応産生物から単離した。
pUKKNd16約10μｇをNde1で消化し、550bpDNAフラグメ
ントを単離した。
ントを単離した。
22および23塩基長の２つの相補オリゴマーを合成し、
等量混合して、各々、３′および５′末端においてNde1
およびHinf1制限部位が両側についた二重鎖オリゴマー
を得、喪失アミノ酸についてのヌクレオチド塩基および
遺伝子における正しいリーディングフレームを得た。該
二重鎖オリゴマーはヌクレオチド配列： で表される。この二重鎖オリゴマー約１μｇを４℃にて
T4 DNAリガーゼで550bpDNAフラグメントに16時間にわ
たって結んだ。フェノール抽出およびエタノール沈澱の
後、産生物をEcoR1で消化し、360bpDNAフラグメントを
単離した。
等量混合して、各々、３′および５′末端においてNde1
およびHinf1制限部位が両側についた二重鎖オリゴマー
を得、喪失アミノ酸についてのヌクレオチド塩基および
遺伝子における正しいリーディングフレームを得た。該
二重鎖オリゴマーはヌクレオチド配列： で表される。この二重鎖オリゴマー約１μｇを４℃にて
T4 DNAリガーゼで550bpDNAフラグメントに16時間にわ
たって結んだ。フェノール抽出およびエタノール沈澱の
後、産生物をEcoR1で消化し、360bpDNAフラグメントを
単離した。
55bpDNAフラグメントおよび360bpDNAフラグメントの
ほぼ等モル量を一晩結び、産生物をAcc1およびEcoR1で
消化して415bpDNAフラグメントを得、これをEcoR−1Acc
1切断のpUC13プラスミドに挿入した。増幅により組換体
クローンp5′Δ1-46UK−１を得、これをSal1および次い
でNco1で消化すると125bpDNAフラグメントが得られ、こ
れをpUKBM−１をSal1、続いてNco1で消化することによ
って得た1200bpDNAフラグメントに結んだ。該結んだDNA
フラグメントをSal1で消化して、ウロキナーゼの表皮細
胞成長因子領域についてコード付けするヌクレオチド13
7−274を欠く1325bpDNA配列を単離した。このDNAフラグ
メントをpUC13中で増幅して組換体クローンｐΔEGF UK
−１を得た。このDNAのBPV−依存性発現ベクターのBgl
II部位への挿入、続いての通常の培養、回収、単離およ
び精製により、アミノ酸１ないし46に対応する表皮細胞
成長因子を欠くウロキナーゼを得る。
ほぼ等モル量を一晩結び、産生物をAcc1およびEcoR1で
消化して415bpDNAフラグメントを得、これをEcoR−1Acc
1切断のpUC13プラスミドに挿入した。増幅により組換体
クローンp5′Δ1-46UK−１を得、これをSal1および次い
でNco1で消化すると125bpDNAフラグメントが得られ、こ
れをpUKBM−１をSal1、続いてNco1で消化することによ
って得た1200bpDNAフラグメントに結んだ。該結んだDNA
フラグメントをSal1で消化して、ウロキナーゼの表皮細
胞成長因子領域についてコード付けするヌクレオチド13
7−274を欠く1325bpDNA配列を単離した。このDNAフラグ
メントをpUC13中で増幅して組換体クローンｐΔEGF UK
−１を得た。このDNAのBPV−依存性発現ベクターのBgl
II部位への挿入、続いての通常の培養、回収、単離およ
び精製により、アミノ酸１ないし46に対応する表皮細胞
成長因子を欠くウロキナーゼを得る。
実施例４ ビ（アミノ酸１−44）、ΔEGF t−PA 実施例２で得たp5′−ΔEGF−tP−11約10μｇをBgl I
Iで消化してシグナルペプチドおよび（ｔ−PAのフィン
ガードメインのＮ末端部位に対応する）tPAの最初のア
ミノ酸の結合にてDNAを正確に切断した。調製1.0％アガ
ロースゲル上の電気泳動によって3.0kbDNAフラグメント
を単離した。細菌アルカリ性ホスファターゼで産生物を
脱リン酸化した。
Iで消化してシグナルペプチドおよび（ｔ−PAのフィン
ガードメインのＮ末端部位に対応する）tPAの最初のア
ミノ酸の結合にてDNAを正確に切断した。調製1.0％アガ
ロースゲル上の電気泳動によって3.0kbDNAフラグメント
を単離した。細菌アルカリ性ホスファターゼで産生物を
脱リン酸化した。
（トリプレットコドン配列の異なる組の組み込みによる
ルーピング・アウトを防いで、同一のアミノ酸配列につ
いてコード付けするが２つのフィンガーDNA配列間にか
なりの異種構造を生じるように設計した）８つのオリゴ
マーをポリヌクレオチドキナーゼおよびATPで個々にリ
ン酸化し、15℃にてT4DNAリガーゼで一晩結び、フェノ
ール抽出およびエタノール沈澱によって回収し、Bgl II
で完全に消化する第４（ａ）図に示す手順の標準法によ
って化学的に合成した（第４（ｂ）図に示され、ｔ−PA
の全フィブロネクチンドメインを表す）132bpDNAフラグ
メントを該3.4kbDNAフラグメントに結んだ。
ルーピング・アウトを防いで、同一のアミノ酸配列につ
いてコード付けするが２つのフィンガーDNA配列間にか
なりの異種構造を生じるように設計した）８つのオリゴ
マーをポリヌクレオチドキナーゼおよびATPで個々にリ
ン酸化し、15℃にてT4DNAリガーゼで一晩結び、フェノ
ール抽出およびエタノール沈澱によって回収し、Bgl II
で完全に消化する第４（ａ）図に示す手順の標準法によ
って化学的に合成した（第４（ｂ）図に示され、ｔ−PA
の全フィブロネクチンドメインを表す）132bpDNAフラグ
メントを該3.4kbDNAフラグメントに結んだ。
3.4kbおよび132bpDNAフラグメントを等モル量結んだ
産生物を用いてイー・コリ（E.coli）JM103細胞を形質
転換し、これを培養した。12の白色コロニーからミニプ
ラスミドDNAの調製を行った。該ミニプラスミドDNAのBg
l IIでの消化、続いての1.5％アガロースゲル上での電
気泳動及びマキサム・ギルバート（Maxam Gilbert）配
列決定法により、正しいインサートサイズおよび配列を
有する１のクローン、p5′ＦΔEGF−tP−１を同定し
た。このプラスミドDNAのBamH IおよびNar1での消化に
より、約450bpのDNAフラグメントが得られた。
産生物を用いてイー・コリ（E.coli）JM103細胞を形質
転換し、これを培養した。12の白色コロニーからミニプ
ラスミドDNAの調製を行った。該ミニプラスミドDNAのBg
l IIでの消化、続いての1.5％アガロースゲル上での電
気泳動及びマキサム・ギルバート（Maxam Gilbert）配
列決定法により、正しいインサートサイズおよび配列を
有する１のクローン、p5′ＦΔEGF−tP−１を同定し
た。このプラスミドDNAのBamH IおよびNar1での消化に
より、約450bpのDNAフラグメントが得られた。
ptPBM−１約10μｇをNar1およびBamH Iで消化し、1.3
kbDNAフラグメントを単離した。
kbDNAフラグメントを単離した。
該1.3kb材料および450bpDNAフラグメントの約等モル
量を結び、BamH Iで切断して1.75kbDNAフラグメントを
得、これをBamH I消化のpUC13/イー・コリ（E.coli）JM
103系中で増幅した。該産生物DNAはビ（アミノ酸１−4
4）、シグナル配列を持つΔEGF−ｔ−PA完全体について
コード付けした。
量を結び、BamH Iで切断して1.75kbDNAフラグメントを
得、これをBamH I消化のpUC13/イー・コリ（E.coli）JM
103系中で増幅した。該産生物DNAはビ（アミノ酸１−4
4）、シグナル配列を持つΔEGF−ｔ−PA完全体について
コード付けした。
かく調製したDNAをBPV−依存性発現ベクターのBgl II
部位に挿入した。通常の培養、回収、単離および精製技
術により、２つの連続する（ビ−（アミノ酸１−44）フ
ィブロネクチンドメインを有するがEGFドメインを有し
ない表記産生物を得る。
部位に挿入した。通常の培養、回収、単離および精製技
術により、２つの連続する（ビ−（アミノ酸１−44）フ
ィブロネクチンドメインを有するがEGFドメインを有し
ない表記産生物を得る。
出発物質として欧州特許出願0213794−Ａ号に開示さ
れているポリクリングルプラスミノーゲンアクチベータ
ーを用いる正確に同一の手順が、ΔEGFポリクリングル
プラスミノーゲンアクチベーターの産生に適用できる。
出発材料としてp438からのHybA DNA/イー・コリ（E.co
li）MM294（ATCC 67175）を用い、本明細書中で開示し
た方法によるEGFドメインの欠失により、ΔEGF−（UKaa
1-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp）1-91−ｔ−PA
を得る。同様に、p504からのHybB DNA/イー・コリ（E.
coli）MM294（ATCC 67174）を用いて、ΔEGF−91−（U
Kaa50-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−SAsp）−92−ｔ
−PAを、およびp113からのHybC DNA/イー・コリ（E.co
li）MM294（ATCC 67176）を用いてΔEGF−261−（Ser
−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp−UKaa50-131）−262−ｔ−
PAを得る。
れているポリクリングルプラスミノーゲンアクチベータ
ーを用いる正確に同一の手順が、ΔEGFポリクリングル
プラスミノーゲンアクチベーターの産生に適用できる。
出発材料としてp438からのHybA DNA/イー・コリ（E.co
li）MM294（ATCC 67175）を用い、本明細書中で開示し
た方法によるEGFドメインの欠失により、ΔEGF−（UKaa
1-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp）1-91−ｔ−PA
を得る。同様に、p504からのHybB DNA/イー・コリ（E.
coli）MM294（ATCC 67174）を用いて、ΔEGF−91−（U
Kaa50-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−SAsp）−92−ｔ
−PAを、およびp113からのHybC DNA/イー・コリ（E.co
li）MM294（ATCC 67176）を用いてΔEGF−261−（Ser
−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp−UKaa50-131）−262−ｔ−
PAを得る。
同様に、以下の実施例により説明する組換え法によっ
て、アミノ酸55−62がEGFドメインから除去されたプラ
スミノーゲンアクチベーターが調製される。
て、アミノ酸55−62がEGFドメインから除去されたプラ
スミノーゲンアクチベーターが調製される。
実施例５ Δ55-62−91−（UKaa50-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser
−Asp）−92 ｔ−PA この組立てにおいて、８アミノ酸配列、HybB−PAのa.
a.55−62についてコード付けするDNA配列を部位定方向
化「ループ・アウト」突然変異によって欠失した。これ
を達成するために、ブルースクリプト（Bluescript）プ
ラスミドpBSM13-（ストラタジーン（Stratagene）、サ
ンディエゴ、カリフォルニア州）、ヘルパー相R408が存
在するか否かに依存して一本鎖または二本鎖形いずれか
で得られるM13修飾ベクター（ラッセルら（Russel et
al.）、ジーン（Gene）、45、333、1986;ヤニッシュ
−ペロンら（Yanisch−Perron et al.）、ジーン（Ge
ne）、33、109、1985）から該コーディング配列を含有
する組換体プラスミドを一本鎖（ssDNA）形で得た。
−Asp）−92 ｔ−PA この組立てにおいて、８アミノ酸配列、HybB−PAのa.
a.55−62についてコード付けするDNA配列を部位定方向
化「ループ・アウト」突然変異によって欠失した。これ
を達成するために、ブルースクリプト（Bluescript）プ
ラスミドpBSM13-（ストラタジーン（Stratagene）、サ
ンディエゴ、カリフォルニア州）、ヘルパー相R408が存
在するか否かに依存して一本鎖または二本鎖形いずれか
で得られるM13修飾ベクター（ラッセルら（Russel et
al.）、ジーン（Gene）、45、333、1986;ヤニッシュ
−ペロンら（Yanisch−Perron et al.）、ジーン（Ge
ne）、33、109、1985）から該コーディング配列を含有
する組換体プラスミドを一本鎖（ssDNA）形で得た。
BamH1配列を両側に持つHybB−PA遺伝子をpBSM13-のBa
mH1部位に挿入し、次いでこれを用いてイー・コリ（E.c
oli）JM103細胞を形質転換した。インサートを含有する
白色コロニーをピックアップし、増殖させてプラスミド
DNAを単離し、BamH1での消化によって分析した。１のク
ローン、pBS−42はT7プロモーターと同一の向きのハイ
ブリッドＢ遺伝子を含有し、これはssDNAが（＋）鎖で
あることを示す。このクローンを600マノメーターで約
0.3の光学密度まで増殖させ、続いて溶菌ファージとし
て細胞を殺しおよび培地中にssDNAベクターを放出する
ヘルパーファージでそれを感染させることによってこの
プラスミドのssDNA形を得た。次いで該細胞をエッペン
ドルフ（Eppendorf）微小遠心機によって全速力で５分
間遠心して沈降させ、［バルダリ・シイおよびセサレニ
・ジイ（Baldari C.andCesareni G.）1985）ジーン
（Gene）、35、27−32］に記載のごとくに、ssDNAを上
澄液から単離した。
mH1部位に挿入し、次いでこれを用いてイー・コリ（E.c
oli）JM103細胞を形質転換した。インサートを含有する
白色コロニーをピックアップし、増殖させてプラスミド
DNAを単離し、BamH1での消化によって分析した。１のク
ローン、pBS−42はT7プロモーターと同一の向きのハイ
ブリッドＢ遺伝子を含有し、これはssDNAが（＋）鎖で
あることを示す。このクローンを600マノメーターで約
0.3の光学密度まで増殖させ、続いて溶菌ファージとし
て細胞を殺しおよび培地中にssDNAベクターを放出する
ヘルパーファージでそれを感染させることによってこの
プラスミドのssDNA形を得た。次いで該細胞をエッペン
ドルフ（Eppendorf）微小遠心機によって全速力で５分
間遠心して沈降させ、［バルダリ・シイおよびセサレニ
・ジイ（Baldari C.andCesareni G.）1985）ジーン
（Gene）、35、27−32］に記載のごとくに、ssDNAを上
澄液から単離した。
a.a.55−62に対応するDNA配列をループ・アウトする
ために（第６図）、以下の（−）鎖または非コーディン
グ鎖（配列３′−TTT...を有する下側の鎖）の36bpオリ
ゴマーを合成した。
ために（第６図）、以下の（−）鎖または非コーディン
グ鎖（配列３′−TTT...を有する下側の鎖）の36bpオリ
ゴマーを合成した。
このオリゴマー配列は所望の欠失のいずれ側にも18bp
のスパンであってssDNA pBS−42と一緒のアニーリング
を容易とする。該オリゴマー約100ngをATPおよびポリヌ
クレオチドキナーゼでリン酸化し、65℃で10分間加熱
し、次いで30分間で徐々に室温まで冷却することによっ
て、結合用緩衝液（25μ）中、鋳型ssDNA約１μｇま
でアニール化した。以下の：合計容量40μ中、10×結
合用緩衝液４μ、2.5mM dNTP（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇおよ
びＴ、等量で）２μ、10mM ATP4μ、遺伝子32蛋白
４μ、クレノーPol I 2μ、T4DNAリガーゼ１μを
添加し、15℃にて、合成反応（伸長）を６時間行った。
合成反応混合物10μを用いてJM109細胞を形質転換
し、これをアンピシリンを含有するLB−寒天プレート上
で画線培養した。
のスパンであってssDNA pBS−42と一緒のアニーリング
を容易とする。該オリゴマー約100ngをATPおよびポリヌ
クレオチドキナーゼでリン酸化し、65℃で10分間加熱
し、次いで30分間で徐々に室温まで冷却することによっ
て、結合用緩衝液（25μ）中、鋳型ssDNA約１μｇま
でアニール化した。以下の：合計容量40μ中、10×結
合用緩衝液４μ、2.5mM dNTP（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇおよ
びＴ、等量で）２μ、10mM ATP4μ、遺伝子32蛋白
４μ、クレノーPol I 2μ、T4DNAリガーゼ１μを
添加し、15℃にて、合成反応（伸長）を６時間行った。
合成反応混合物10μを用いてJM109細胞を形質転換
し、これをアンピシリンを含有するLB−寒天プレート上
で画線培養した。
ニトロセルローグ濾紙上、ハイブリダイゼーションの
厳格な条件下で、32P−放射能標識したオリゴプローブ
（ループ・アウト反応で用いたに同じ）で複製したコロ
ニーのインサイチュ・ハイブリダイゼーションによって
所望のクローンのスクリーニングを行った。濾紙を低塩
（0.2×SSC）中、55℃にて３回洗浄し、Ｘ線フィルムに
暴露した。最高のハイブリダイゼーション信号を呈する
コロニーをピックアップし、増殖させてミニプラスミド
DNAを調製した。HybBのアミノ酸55の位置における、プ
ラスミドDNAのSty1での消化によって最初のスクリーニ
ングを行った。Sty1部位の喪失は、所望の欠失配列を有
するクローンを選択するための基本的基準として採用し
た。２つのクローンｐΔ55-62HybB−１および−２をマ
キサム・ギルバート（Mawam Gilbert）法によるDNA配
列決定法に付し、所望の欠失を有することが判明した。
厳格な条件下で、32P−放射能標識したオリゴプローブ
（ループ・アウト反応で用いたに同じ）で複製したコロ
ニーのインサイチュ・ハイブリダイゼーションによって
所望のクローンのスクリーニングを行った。濾紙を低塩
（0.2×SSC）中、55℃にて３回洗浄し、Ｘ線フィルムに
暴露した。最高のハイブリダイゼーション信号を呈する
コロニーをピックアップし、増殖させてミニプラスミド
DNAを調製した。HybBのアミノ酸55の位置における、プ
ラスミドDNAのSty1での消化によって最初のスクリーニ
ングを行った。Sty1部位の喪失は、所望の欠失配列を有
するクローンを選択するための基本的基準として採用し
た。２つのクローンｐΔ55-62HybB−１および−２をマ
キサム・ギルバート（Mawam Gilbert）法によるDNA配
列決定法に付し、所望の欠失を有することが判明した。
実施例１の方法により、ｐΔ55-62 HybB−１のBamH1
での消化によって得られた2kbDNAをBPV依存性哺乳動物
発現系に挿入した。通常の培養、回収、単離および精製
技術により表記プラスミノーゲンアクチベーターを得
る。
での消化によって得られた2kbDNAをBPV依存性哺乳動物
発現系に挿入した。通常の培養、回収、単離および精製
技術により表記プラスミノーゲンアクチベーターを得
る。
実施例６ Δ55-62t−PA ｔ−PAから欠失されるべき配列はHybB−PAおよびｔ−
PA双方のEGFのドメインに位置するので、正確に同一の
試薬および手法を用いてΔ55-62t−PAを組み立てた。い
ずれの末端においてもBamH1配列に接したｔ−PA遺伝子
をまずクローン化してpBSN13-ベクターに入れてpBSt−P
Aを得、これを用いてssDNAを得た。a.a.55−62に対応す
るオリゴヌクレオチド配列をループ・アウトするため
に、実施例５に記載したのと同一のオリゴを用いてDNA
の第２（−）鎖をプライマー伸長させ、優れたクローン
をスクリーニングした（第７図）。DNA配列決定法によ
り、１のクローン、ｐΔ55-62t−PAは所望の欠失を有す
ることが判明した。
PA双方のEGFのドメインに位置するので、正確に同一の
試薬および手法を用いてΔ55-62t−PAを組み立てた。い
ずれの末端においてもBamH1配列に接したｔ−PA遺伝子
をまずクローン化してpBSN13-ベクターに入れてpBSt−P
Aを得、これを用いてssDNAを得た。a.a.55−62に対応す
るオリゴヌクレオチド配列をループ・アウトするため
に、実施例５に記載したのと同一のオリゴを用いてDNA
の第２（−）鎖をプライマー伸長させ、優れたクローン
をスクリーニングした（第７図）。DNA配列決定法によ
り、１のクローン、ｐΔ55-62t−PAは所望の欠失を有す
ることが判明した。
実施例１の方法により、ｐΔ55-62t−PAのBamH1での
消化によって得たDNAをBPV依存性哺乳動物発現系に挿入
した。通常の培養、回収、単離および精製技術により表
記プラスミノーゲンアクチベーターを得る。
消化によって得たDNAをBPV依存性哺乳動物発現系に挿入
した。通常の培養、回収、単離および精製技術により表
記プラスミノーゲンアクチベーターを得る。
実施例７ Δ55-62−91−［Ala186−K2］−92−ｔ−PA p5′HybF−５はATCC 67570に見い出されるHybF遺伝
子のbp72−801DNAセグメントを含有する部分的クローン
である。この遺伝子において、合成クリングル（Ｋ−２
＊）配列をｔ−PA遺伝子のbp462/463（a.a.91/92）位に
挿入した。８のアミノ酸（a.a.55−62）の欠失はbp352
−375に対応する。
子のbp72−801DNAセグメントを含有する部分的クローン
である。この遺伝子において、合成クリングル（Ｋ−２
＊）配列をｔ−PA遺伝子のbp462/463（a.a.91/92）位に
挿入した。８のアミノ酸（a.a.55−62）の欠失はbp352
−375に対応する。
p5′HybF−５ DNA約10μｇをBamH1およびEcoO 109
で消化してＫ−２＊が挿入されたハイブリッドF bp380
−801に対応する675bp DNAフラグメントを単離した。ｐ
Δ55-62t−PA−７約20μｇをまずBamH1で消化して1.7kb
および2.6kbDNAフラグメントを得た。約1.7kbDNAフラグ
メントをさらにEcoO 109で消化して280bpDNAフラグメ
ントを単離した。２つのDNAフラグメント、675bpおよび
280bp、を等モル量で結んだ。フェノール抽出およびメ
タノール沈澱に続き、反応混合物をNar1およびBamH1で
消化して660bpDNAフラグメントを単離した。ptPBM−１
約10μｇをNar1およびBamH1で切断して1300bpDNAフラグ
メントを単離した。２つのフラグメント、660bpおよび1
300bp、を結び、BamH1で切断し1960bp配列を単離した。
このDNAをBamH1切断のpUC13に挿入し、次いでこれを用
いてイー・コリ（E.coli）JM109細胞を形質転換した。
１の組換体クローン、ｐΔ55-62HybF−15、は表記化合
物に対応する完全な遺伝子を含有することが判明した。
で消化してＫ−２＊が挿入されたハイブリッドF bp380
−801に対応する675bp DNAフラグメントを単離した。ｐ
Δ55-62t−PA−７約20μｇをまずBamH1で消化して1.7kb
および2.6kbDNAフラグメントを得た。約1.7kbDNAフラグ
メントをさらにEcoO 109で消化して280bpDNAフラグメ
ントを単離した。２つのDNAフラグメント、675bpおよび
280bp、を等モル量で結んだ。フェノール抽出およびメ
タノール沈澱に続き、反応混合物をNar1およびBamH1で
消化して660bpDNAフラグメントを単離した。ptPBM−１
約10μｇをNar1およびBamH1で切断して1300bpDNAフラグ
メントを単離した。２つのフラグメント、660bpおよび1
300bp、を結び、BamH1で切断し1960bp配列を単離した。
このDNAをBamH1切断のpUC13に挿入し、次いでこれを用
いてイー・コリ（E.coli）JM109細胞を形質転換した。
１の組換体クローン、ｐΔ55-62HybF−15、は表記化合
物に対応する完全な遺伝子を含有することが判明した。
実施例１の方法により、ｐΔ55-62HybF−15をBamH1で
消化することによって得た遺伝材料をBPV依存性哺乳動
物発現系に挿入した。通常の培養、回収、単離および精
製により小さなプラスミノーゲンアクチベーターを得
た。
消化することによって得た遺伝材料をBPV依存性哺乳動
物発現系に挿入した。通常の培養、回収、単離および精
製により小さなプラスミノーゲンアクチベーターを得
た。
ｔ−PAに比し、本発明のΔEGFおよびEGF修飾プラスミ
ノーゲンアクチベーターは肝臓膜に対する親和性の顕著
な減少を示し、その結果、それらは循環に戻され、ここ
にそれらは30分過剰の半減期を示し、それにより閉塞動
脈の再疎通用血栓溶解性物質の一定の供給を確実とす
る。
ノーゲンアクチベーターは肝臓膜に対する親和性の顕著
な減少を示し、その結果、それらは循環に戻され、ここ
にそれらは30分過剰の半減期を示し、それにより閉塞動
脈の再疎通用血栓溶解性物質の一定の供給を確実とす
る。
本発明のΔEGFおよびEGF修飾プラスミノーゲンアクチ
ベーターは、ｔ−PA自体と同様にしておよびそれと同様
のデリバリビヒクルを通じて血管の偶発症の治療に用い
る。かくして、本発明のプラスミノーゲンアクチベータ
ーは、ポリペプチドをｔ−PAに適用される当該分野で公
知の適当な医薬上許容されるビヒクルに溶解または懸濁
させることによって医薬組成物に処方できる。血管内注
射または注入によるそれを必要とする哺乳動物への投与
はすでにｔ−PAそれ自体に関して確立された技術により
行うことができる。約６ないし12時間での約440IU/kg/
時間の静脈内一次投与量がｔ−PAを用いる場合の慣行で
ある。
ベーターは、ｔ−PA自体と同様にしておよびそれと同様
のデリバリビヒクルを通じて血管の偶発症の治療に用い
る。かくして、本発明のプラスミノーゲンアクチベータ
ーは、ポリペプチドをｔ−PAに適用される当該分野で公
知の適当な医薬上許容されるビヒクルに溶解または懸濁
させることによって医薬組成物に処方できる。血管内注
射または注入によるそれを必要とする哺乳動物への投与
はすでにｔ−PAそれ自体に関して確立された技術により
行うことができる。約６ないし12時間での約440IU/kg/
時間の静脈内一次投与量がｔ−PAを用いる場合の慣行で
ある。
実施例１、２および３で産生したプラスミドは1987年
１月21日にメリーランド州20852、ロックビル（Rockvil
le）、パークローン・ドライブ（Parklawn Drive）123
01、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）に寄託し、
以下に示す受託番号が与えられた。
１月21日にメリーランド州20852、ロックビル（Rockvil
le）、パークローン・ドライブ（Parklawn Drive）123
01、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）に寄託し、
以下に示す受託番号が与えられた。
1.イー・コリ（E.coli）HB−101におけるｐΔ２−89tP
−AMT−BPV−40−ATCC 67299 2.イー・コリ（E.coli）JM−103におけるｐΔEGFtP−pU
C−22−ATCC 67300 3.イー・コリ（E.coli）JM−103におけるｐΔEGFUK−１
−ATCC 67301 実施例５、６および７で産生されたプラスミドは1987
年12月18日に同コレクション（Collection）に寄託し、
以下の受託番号が与えられた。
−AMT−BPV−40−ATCC 67299 2.イー・コリ（E.coli）JM−103におけるｐΔEGFtP−pU
C−22−ATCC 67300 3.イー・コリ（E.coli）JM−103におけるｐΔEGFUK−１
−ATCC 67301 実施例５、６および７で産生されたプラスミドは1987
年12月18日に同コレクション（Collection）に寄託し、
以下の受託番号が与えられた。
5.イー・コリ（E.coli）MM294におけるｐΔ55-62−91
（UKaa50-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp）−92−
ｔ−PA−BPV−14−ATCC 67588 6.イー・コリ（E.coli）MM294におけるｐΔ55-62−ｔ−
PA−BPV12−ATCC 67589 7.イー・コリ（E.coli）MM294におけるｐΔ55-62−91−
［Ala186−K2］−92−ｔ−PA−BPV−６−ATCC 67590
（UKaa50-131−Ser−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp）−92−
ｔ−PA−BPV−14−ATCC 67588 6.イー・コリ（E.coli）MM294におけるｐΔ55-62−ｔ−
PA−BPV12−ATCC 67589 7.イー・コリ（E.coli）MM294におけるｐΔ55-62−91−
［Ala186−K2］−92−ｔ−PA−BPV−６−ATCC 67590
フロントページの続き (72)発明者 リー，ショウグァング・リン アメリカ合衆国ペンシルベニア州19085、 ビラノーバ、サウス・スプリング・ミ ル・ロード 155番 (72)発明者 ハング，ポール・ピイ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19010、 ブリン・モール、ランブルウッド・ドラ イブ 506番 (56)参考文献 欧州公開207589（ＥＰ，Ａ１) ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，189（１) （1985）ｐ．145−149 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (1)
- 【請求項１】Δ2-89−組織プラスミノーゲンアクチベー
ター（ここで、「Δ2-89」は後に記載したｔ−PAのアミ
ノ酸２〜89を欠失させることを意味する）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US879587A | 1987-01-30 | 1987-01-30 | |
| US008795 | 1993-01-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01501996A JPH01501996A (ja) | 1989-07-13 |
| JP2983997B2 true JP2983997B2 (ja) | 1999-11-29 |
Family
ID=21733720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63501756A Expired - Lifetime JP2983997B2 (ja) | 1987-01-30 | 1988-01-29 | 脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター |
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| Country | Link |
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| EP (1) | EP0299053A1 (ja) |
| JP (1) | JP2983997B2 (ja) |
| KR (1) | KR890700660A (ja) |
| AU (1) | AU1295088A (ja) |
| GB (1) | GB2200640B (ja) |
| IE (1) | IE880255L (ja) |
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| GB8901422D0 (en) * | 1989-01-23 | 1989-03-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | New tissue plasminogen activator |
| NZ268470A (en) | 1993-06-01 | 1997-09-22 | Chiron Corp | Production of a peptide containing the egf-like domain of human urokinase-type plasminogen activation (hupa) |
| US6248715B1 (en) * | 1993-06-01 | 2001-06-19 | Chiron Corporation | Method of treating a urokinase-type plasminogen activator-mediated disorder |
| US6846823B2 (en) | 2003-04-04 | 2005-01-25 | Dynogen Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating lower urinary tract disorders |
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|---|---|---|---|---|
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| ATE151111T1 (de) * | 1984-10-01 | 1997-04-15 | Genzyme Corp | Rekombinante dns-verfahren und dadurch hergestellte produkte |
| GB8508717D0 (en) * | 1985-04-03 | 1985-05-09 | Beecham Group Plc | Composition |
| PT82326B (pt) * | 1985-04-04 | 1988-10-14 | Beecham Group Plc | Processo para a preparacao de activador de plasminogenio de tipo tissular fibrinoliticamente activo |
| US4916071A (en) * | 1985-08-14 | 1990-04-10 | American Home Products Corporation | Poly-kringle plasminogen activator |
| US5106741A (en) * | 1985-12-20 | 1992-04-21 | The Upjohn Company | Tissue plasminogen activator (TPA) analogs |
| WO1987003906A1 (en) * | 1985-12-20 | 1987-07-02 | The Upjohn Company | Tissue plasminogen activator (tpa) analogs |
| US5002887A (en) * | 1986-01-31 | 1991-03-26 | Genetics Institute, Inc. | Truncated thrombolytic proteins |
| US5071972A (en) * | 1986-01-31 | 1991-12-10 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences encoding novel thrombolytic proteins |
| AU7090687A (en) * | 1986-04-02 | 1987-10-08 | Beecham Group Plc | Modified tissue-type plasminogen activators |
| GB8608020D0 (en) * | 1986-04-02 | 1986-05-08 | Beecham Group Plc | Compounds |
| PT84588B (en) * | 1986-04-02 | 1989-05-09 | Beecham Group Plc | Process for preparing a fibrinolytic enzyme |
| PT84589B (en) * | 1986-04-02 | 1989-05-09 | Beecham Group Plc | Process for preparing a fibrinolytic enzyme |
| DE3643158A1 (de) * | 1986-04-21 | 1987-11-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gewebs-plasminogen-aktivator(tpa) - derivat und seine herstellung |
-
1988
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- 1988-01-29 AU AU12950/88A patent/AU1295088A/en not_active Abandoned
- 1988-01-29 EP EP88901706A patent/EP0299053A1/en not_active Withdrawn
- 1988-01-29 JP JP63501756A patent/JP2983997B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-29 WO PCT/US1988/000209 patent/WO1988005822A1/en not_active Application Discontinuation
- 1988-01-29 GB GB8801948A patent/GB2200640B/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-01-29 IE IE880255A patent/IE880255L/xx unknown
- 1988-09-28 KR KR1019880701184A patent/KR890700660A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１８９（１）（１９８５）ｐ．１４５−１４９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1295088A (en) | 1988-08-24 |
| KR890700660A (ko) | 1989-04-26 |
| US5376547A (en) | 1994-12-27 |
| IE880255L (en) | 1988-07-30 |
| GB2200640A (en) | 1988-08-10 |
| JPH01501996A (ja) | 1989-07-13 |
| WO1988005822A1 (en) | 1988-08-11 |
| GB8801948D0 (en) | 1988-02-24 |
| GB2200640B (en) | 1991-07-10 |
| EP0299053A1 (en) | 1989-01-18 |
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