JP2831709B2 - 血栓溶解剤およびその製造方法 - Google Patents
血栓溶解剤およびその製造方法Info
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- JP2831709B2 JP2831709B2 JP1201889A JP20188989A JP2831709B2 JP 2831709 B2 JP2831709 B2 JP 2831709B2 JP 1201889 A JP1201889 A JP 1201889A JP 20188989 A JP20188989 A JP 20188989A JP 2831709 B2 JP2831709 B2 JP 2831709B2
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- Japan
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- tpa
- dna
- plasminogen activator
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- tissue plasminogen
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規プラスミノーゲン活性化因子誘導体、該
誘導体を産出する細胞、該誘導体をコードするDNA配列
および該誘導体の製造法に係わる。本発明による新規プ
ラスミノーゲン活性化因子誘導体は、プラスミノーゲン
をフィブリン溶解活性を有するプラスミンに変換する作
用を有し、種々の血栓症の治療薬として用いることがで
きる。
誘導体を産出する細胞、該誘導体をコードするDNA配列
および該誘導体の製造法に係わる。本発明による新規プ
ラスミノーゲン活性化因子誘導体は、プラスミノーゲン
をフィブリン溶解活性を有するプラスミンに変換する作
用を有し、種々の血栓症の治療薬として用いることがで
きる。
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、TPAと
略記する）は、ヒト・メラノーマ細胞（Bowes melanom
a）の分泌するTPAについてよく研究され、527のアミノ
酸残基から成る糖蛋白質である［Pennica,D.ら（1983
年）「ネイチャー（Nature）」,301巻,214頁］。TPA
は、フィブリン溶解能を有しないプラスミノーゲンを該
活性を有するプラスミンに変換する酵素で血栓溶解作用
を有している。
略記する）は、ヒト・メラノーマ細胞（Bowes melanom
a）の分泌するTPAについてよく研究され、527のアミノ
酸残基から成る糖蛋白質である［Pennica,D.ら（1983
年）「ネイチャー（Nature）」,301巻,214頁］。TPA
は、フィブリン溶解能を有しないプラスミノーゲンを該
活性を有するプラスミンに変換する酵素で血栓溶解作用
を有している。
TPAは現在、血栓症の治療に用いられている［Grossba
rd,E.B.（1987年）「ファーマシューティカル・リサー
チ（Pharmaceutical Research）」,4巻,375頁］。しか
し、TPAの最大の欠点はその血中からの急速なクリアラ
ンスである。血流中に投与されたTPAは、主に肝臓で代
謝されると推定され［Fuchs,H.E.ら（1985年）「ブラッ
ド（Blood）」,65巻,539頁」、その血中半減期は僅かに
２分である［Collen,D.ら（1985年）サーキュレーショ
ン（Circulation）」,72巻,384頁］。従って、血栓症の
治療には大量のTPAの投与が必要である。TPAのような蛋
白の大量投与による血栓症治療は、極めて高価な治療に
なるばかりでなく、抗原抗体反応による副作用という懸
念されるべき問題を含んでいる。
rd,E.B.（1987年）「ファーマシューティカル・リサー
チ（Pharmaceutical Research）」,4巻,375頁］。しか
し、TPAの最大の欠点はその血中からの急速なクリアラ
ンスである。血流中に投与されたTPAは、主に肝臓で代
謝されると推定され［Fuchs,H.E.ら（1985年）「ブラッ
ド（Blood）」,65巻,539頁」、その血中半減期は僅かに
２分である［Collen,D.ら（1985年）サーキュレーショ
ン（Circulation）」,72巻,384頁］。従って、血栓症の
治療には大量のTPAの投与が必要である。TPAのような蛋
白の大量投与による血栓症治療は、極めて高価な治療に
なるばかりでなく、抗原抗体反応による副作用という懸
念されるべき問題を含んでいる。
従って、TPA分子の化学的修飾（WO84/01786）（特開
昭63−06938）［Berger,H.ら（1988年）「ブラッド（Bl
ood）」,71巻,1641頁］、酵素的修飾（特開昭62−28258
2）（EPO 253 582A1）、あるいは遺伝子工学的改変（特
開昭61−243024,特開昭62−130690,特開昭62−272976,
特開昭62−269688,特開昭62−282582,特開昭64−63379
号）等により血中持続性の改良された、即ち血中半減期
の長いTPAの誘導体作製の試みが行われている。
昭63−06938）［Berger,H.ら（1988年）「ブラッド（Bl
ood）」,71巻,1641頁］、酵素的修飾（特開昭62−28258
2）（EPO 253 582A1）、あるいは遺伝子工学的改変（特
開昭61−243024,特開昭62−130690,特開昭62−272976,
特開昭62−269688,特開昭62−282582,特開昭64−63379
号）等により血中持続性の改良された、即ち血中半減期
の長いTPAの誘導体作製の試みが行われている。
上記のように、化学修飾、酵素修飾、遺伝子工学的手
法等によって、多くの血中持続性の向上したTPA誘導体
が発明されている。しかしこれらのTPA誘導体は、血中
持続性が大幅に向上した反面、TPAの特徴的な性質であ
るフィブリン溶解能の極端な低下が認められ、優れた治
療効果を示すには至っていない。また改変により、酵素
活性が著しく低下している例もある。
法等によって、多くの血中持続性の向上したTPA誘導体
が発明されている。しかしこれらのTPA誘導体は、血中
持続性が大幅に向上した反面、TPAの特徴的な性質であ
るフィブリン溶解能の極端な低下が認められ、優れた治
療効果を示すには至っていない。また改変により、酵素
活性が著しく低下している例もある。
血中持続性が向上し、かつフィブリン溶解能も強く、
したがって血栓治療が小量の投与によって可能となり、
これに伴って副作用も軽減される改良型TPAの開発の意
義は極めて大きい。
したがって血栓治療が小量の投与によって可能となり、
これに伴って副作用も軽減される改良型TPAの開発の意
義は極めて大きい。
本発明は、血中半減期が長く、かつフィブリン溶解能
の強い新規プラスミノーゲン活性化因子を提供しようと
するものである。
の強い新規プラスミノーゲン活性化因子を提供しようと
するものである。
また本発明は、該プラスミノーゲン活性化因子を産生
する動物培養細胞の作製法、および該動物培養細胞を利
用した該プラスミノーゲン活性化因子の製造方法を提供
しようとするものである。
する動物培養細胞の作製法、および該動物培養細胞を利
用した該プラスミノーゲン活性化因子の製造方法を提供
しようとするものである。
TPAはＮ末端からフィンガー領域、成長因子領域、ク
リングル１、クリングル２およびセリンプロテアーゼ活
性を有する領域の５つの領域から成る［Pennica,D.ら
（1983年）「ネイチャー（Nature）」,301巻,214頁］。
リングル１、クリングル２およびセリンプロテアーゼ活
性を有する領域の５つの領域から成る［Pennica,D.ら
（1983年）「ネイチャー（Nature）」,301巻,214頁］。
TPAの成長因子領域を欠失したTPA誘導体の作製と性質
については、いくつかの記述がある（特開昭62−19862
3,特開昭62−269688,特開昭64−63379）［Larsen,R.G.
ら（1988年）［ジャーナル．オブ．バイオロジカル．ケ
ミストリー（Journal of Biological Chemistry）」263
頁,1023頁］［Browne,J.M.ら（1988年）「ジャーナル．
オブ．バイオロジカル．ケミストリー（Journal of Bio
logical Chemistry）」263巻,1599頁］。成長因子領域
を欠くTPAは、血中持続性が向上したもののフィブリン
親和性が著しく低下しており、そのインビトロ血栓溶解
能は天然型TPAよりも顕著に低下していた。
については、いくつかの記述がある（特開昭62−19862
3,特開昭62−269688,特開昭64−63379）［Larsen,R.G.
ら（1988年）［ジャーナル．オブ．バイオロジカル．ケ
ミストリー（Journal of Biological Chemistry）」263
頁,1023頁］［Browne,J.M.ら（1988年）「ジャーナル．
オブ．バイオロジカル．ケミストリー（Journal of Bio
logical Chemistry）」263巻,1599頁］。成長因子領域
を欠くTPAは、血中持続性が向上したもののフィブリン
親和性が著しく低下しており、そのインビトロ血栓溶解
能は天然型TPAよりも顕著に低下していた。
本発明者らは、成長因子領域を欠くTPAのインビトロ
フィブリン溶解能の低下は、欠失によって新たに生じた
不自然なフィンガー領域とクリングル１領域の連結部に
あると考え、遺伝子工学的手法を用いて改良に努めた。
その結果、驚くべき事に、連結部分のアミノ酸置換体の
中に従来の成長因子領域欠失TPA誘導体と同等の血中持
続性を保持しつつも、インビトロ血栓溶解能が著しく改
善されたものがあることを発見した。
フィブリン溶解能の低下は、欠失によって新たに生じた
不自然なフィンガー領域とクリングル１領域の連結部に
あると考え、遺伝子工学的手法を用いて改良に努めた。
その結果、驚くべき事に、連結部分のアミノ酸置換体の
中に従来の成長因子領域欠失TPA誘導体と同等の血中持
続性を保持しつつも、インビトロ血栓溶解能が著しく改
善されたものがあることを発見した。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、成長因子
領域の欠失したTPA誘導体のさらなる改良であり、遺伝
子工学的手法により達成されるものである。したがって
改良型TPAの作成にはTPAのアミノ酸配列をコードするDN
A配列が不可欠である。そのようなDNA配列の取得は、TP
AcDNAあるいは染色体DNAのクローニング、あるいはTPAc
DNA,染色体DNAやTPAアミノ酸配列をもとにDNAを化学合
成することによって達成できるだろう。TPAcDNAは、ペ
ニカ等［Pennica,D.ら（1983年）ネイチャー（Nature）
301巻,214頁］が単離している。TPAのアミノ酸配列およ
びcDNAに対する番号付けは、彼等が提案しているものに
従った。TPA染色体DNAはニイ等［Ny,T.ら（1984年）プ
ロシーディング．オブ．ザ．アカデミー．オブ．サイエ
ンス．ユーエスエイ（Proceeding of the Academy of S
cience USA）81巻、5355頁］とブラウンら［Brown,M.J.
ら（1985年）ジーン（Gene）33巻,279頁］とデーゲンら
［Degen,S.J.F.ら（1986年）ザ．ジャーナル．オブ．バ
イオロジカル．ケミストリー（The Journal of Biologi
cal Chemistry）」261巻,6972頁］がそれぞれ単離して
いる。TPA染色体遺伝子のエクソンに対する番号付け
は、ニイらに従うことにする。本発明者らは、染色体DN
A利用発現ベクターpSVePA−１（特開昭62−14783）によ
って形質転換されたCHO−K1細胞よりmRNAを抽出し、cDN
Aの合成およびクローニングを行なった。実施例にある
ように新たに取得したTPAcDNAおよびpSVePA−１に含ま
れる染色体DNAを利用してTPA誘導体作成の基本となる発
現ベクターpSVeCPA−１を作成した。
領域の欠失したTPA誘導体のさらなる改良であり、遺伝
子工学的手法により達成されるものである。したがって
改良型TPAの作成にはTPAのアミノ酸配列をコードするDN
A配列が不可欠である。そのようなDNA配列の取得は、TP
AcDNAあるいは染色体DNAのクローニング、あるいはTPAc
DNA,染色体DNAやTPAアミノ酸配列をもとにDNAを化学合
成することによって達成できるだろう。TPAcDNAは、ペ
ニカ等［Pennica,D.ら（1983年）ネイチャー（Nature）
301巻,214頁］が単離している。TPAのアミノ酸配列およ
びcDNAに対する番号付けは、彼等が提案しているものに
従った。TPA染色体DNAはニイ等［Ny,T.ら（1984年）プ
ロシーディング．オブ．ザ．アカデミー．オブ．サイエ
ンス．ユーエスエイ（Proceeding of the Academy of S
cience USA）81巻、5355頁］とブラウンら［Brown,M.J.
ら（1985年）ジーン（Gene）33巻,279頁］とデーゲンら
［Degen,S.J.F.ら（1986年）ザ．ジャーナル．オブ．バ
イオロジカル．ケミストリー（The Journal of Biologi
cal Chemistry）」261巻,6972頁］がそれぞれ単離して
いる。TPA染色体遺伝子のエクソンに対する番号付け
は、ニイらに従うことにする。本発明者らは、染色体DN
A利用発現ベクターpSVePA−１（特開昭62−14783）によ
って形質転換されたCHO−K1細胞よりmRNAを抽出し、cDN
Aの合成およびクローニングを行なった。実施例にある
ように新たに取得したTPAcDNAおよびpSVePA−１に含ま
れる染色体DNAを利用してTPA誘導体作成の基本となる発
現ベクターpSVeCPA−１を作成した。
従来の技術で作成され、血中持続性およびフィブリン
溶解能が評価されている成長因子領域の欠失したTPA誘
導体に関しては、ラーセンら［Larsen,R.G.ら（1988
年）ザ．ジャーナル．オブ．バイオロジカル．ケミスト
リー（The Journal of Biological Chemistry）」263
巻,1023頁］もしくはブローネら［Browne,J.M.ら（1988
年）ジャーナル．オブ．バイオロジカル．ケミストリー
（Journal of Biological Chemistry）」263巻、1599
頁］の報告がある。成長因子領域の欠失したこれらTPA
誘導体は、いずれもアミノ酸51番目から87番目までを欠
失したものである。この誘導体は本発明の対照であり、
50番目のセリンを他のアミノ酸に置換するためのもとに
なるものである。この誘導体は彼等の行なった方法で、
作成することができる。彼等は、合成DNAプライマーを
利用したループアウト法を採用しているが、それ以外に
カセット式変異導入法も有効である。即ち51番目から87
番目までのアミノ酸をコードするcDNA配列bp340−bp450
を欠失し、かつアミノ酸セリンのコドンを形成するbp33
7−bp339に変異を持つDNA配列を化学的に合成すること
によっても作成することができる。合成するDNA配列
は、cDNAの全てであっても一部であっても良い。一部の
み合成した場合は、適当な制限エンドヌクレアーゼとT4
DNAリガーゼを組み合わせれば、本来のcDNA配列の一部
分を合成DNAと置き換えることが可能である。使用する
制限エンドヌクレアーゼは、数多く考えられるが、本発
明を達成するためにはBg1 IIとNar Iの組み合わせが好
適であろう。我々は変異および欠失を含むDNAとして以
下の配列を計画した。
溶解能が評価されている成長因子領域の欠失したTPA誘
導体に関しては、ラーセンら［Larsen,R.G.ら（1988
年）ザ．ジャーナル．オブ．バイオロジカル．ケミスト
リー（The Journal of Biological Chemistry）」263
巻,1023頁］もしくはブローネら［Browne,J.M.ら（1988
年）ジャーナル．オブ．バイオロジカル．ケミストリー
（Journal of Biological Chemistry）」263巻、1599
頁］の報告がある。成長因子領域の欠失したこれらTPA
誘導体は、いずれもアミノ酸51番目から87番目までを欠
失したものである。この誘導体は本発明の対照であり、
50番目のセリンを他のアミノ酸に置換するためのもとに
なるものである。この誘導体は彼等の行なった方法で、
作成することができる。彼等は、合成DNAプライマーを
利用したループアウト法を採用しているが、それ以外に
カセット式変異導入法も有効である。即ち51番目から87
番目までのアミノ酸をコードするcDNA配列bp340−bp450
を欠失し、かつアミノ酸セリンのコドンを形成するbp33
7−bp339に変異を持つDNA配列を化学的に合成すること
によっても作成することができる。合成するDNA配列
は、cDNAの全てであっても一部であっても良い。一部の
み合成した場合は、適当な制限エンドヌクレアーゼとT4
DNAリガーゼを組み合わせれば、本来のcDNA配列の一部
分を合成DNAと置き換えることが可能である。使用する
制限エンドヌクレアーゼは、数多く考えられるが、本発
明を達成するためにはBg1 IIとNar Iの組み合わせが好
適であろう。我々は変異および欠失を含むDNAとして以
下の配列を計画した。
配列中１から６に相当する部分には、50番目のセリン
に対するアミノ酸置換に応じて塩基を選択すれば良い。
表１に１から６の塩基配列の例を上げる。
に対するアミノ酸置換に応じて塩基を選択すれば良い。
表１に１から６の塩基配列の例を上げる。
上記DNA配列は、cDNA配列bp190付近からbp323付近迄
を含むBgl IIとDra IIIで切断、単離して得た約130bpの
断片とbp457付近からbp519付近迄を含むHae IIIとNar I
で切断、単離して得た約60bpの断片とをT4DNAリガーゼ
を利用して連結することによって得ることができる。連
結した断片を前述のTPA発現ベクターpSVeCPA−１の欠
失、変異以外は相同な部分、即ちBgl IIとNar Iでの切
断で生ずる約330bpの断片と置き変えることによって目
的のTPA誘導体発現ベクターが作成できる。実施例２に5
1番目から87番目までのアミノ酸を欠失したTPA誘導体の
作成方法に関して詳細に記した。発現ベクターpSVeCPA
−１は、TPA遺伝子の上流にSV40ウイルスの初期プロモ
ーターがTPA遺伝子が発現可能な形で存在しており、動
物細胞に導入された際、TPAあるいはTPA誘導体が生産さ
れうるように設計されている。もちろんプロモーターと
してはSV40以外にTPA遺伝子を発現可能なものならいか
なるものでも利用することができる。
を含むBgl IIとDra IIIで切断、単離して得た約130bpの
断片とbp457付近からbp519付近迄を含むHae IIIとNar I
で切断、単離して得た約60bpの断片とをT4DNAリガーゼ
を利用して連結することによって得ることができる。連
結した断片を前述のTPA発現ベクターpSVeCPA−１の欠
失、変異以外は相同な部分、即ちBgl IIとNar Iでの切
断で生ずる約330bpの断片と置き変えることによって目
的のTPA誘導体発現ベクターが作成できる。実施例２に5
1番目から87番目までのアミノ酸を欠失したTPA誘導体の
作成方法に関して詳細に記した。発現ベクターpSVeCPA
−１は、TPA遺伝子の上流にSV40ウイルスの初期プロモ
ーターがTPA遺伝子が発現可能な形で存在しており、動
物細胞に導入された際、TPAあるいはTPA誘導体が生産さ
れうるように設計されている。もちろんプロモーターと
してはSV40以外にTPA遺伝子を発現可能なものならいか
なるものでも利用することができる。
51番目から87番目までのアミノ酸を欠失し、さらに50
番目のセリンがアスパラギンに置換されたTPA誘導体
は、TPA染色体DNAを利用すればより容易に作成すること
ができる。ニイらの報告によればTPAの成長因子領域
は、染色体DNA上の第５エクソンに存在している。第５
エクソン及び第５エクソンに隣接するイントロンを含み
他のエクソンは含まない連続したDNA断片の除去された
染色体DNA配列は、動物細胞内で発現した際、第４エク
ソンの３′末端と第６エクソン５′末端がスプライシン
グの結果連結されアミノ酸をコードするフレームも適切
であるので50番目のセリンから87番目のアスパラギン酸
までのアミノ酸配列を欠失したTPA誘導体を提供するこ
とができる、このときスプライシングの結果新たに生ず
る第４と第６のエクソンの連結部にアスパラギンをコー
ドするDNA配列が生ずる結果、49番目のリジンと88番目
のスレオニンの間にアスパラギンが挿入されたTPA誘導
体を作成することができる。
番目のセリンがアスパラギンに置換されたTPA誘導体
は、TPA染色体DNAを利用すればより容易に作成すること
ができる。ニイらの報告によればTPAの成長因子領域
は、染色体DNA上の第５エクソンに存在している。第５
エクソン及び第５エクソンに隣接するイントロンを含み
他のエクソンは含まない連続したDNA断片の除去された
染色体DNA配列は、動物細胞内で発現した際、第４エク
ソンの３′末端と第６エクソン５′末端がスプライシン
グの結果連結されアミノ酸をコードするフレームも適切
であるので50番目のセリンから87番目のアスパラギン酸
までのアミノ酸配列を欠失したTPA誘導体を提供するこ
とができる、このときスプライシングの結果新たに生ず
る第４と第６のエクソンの連結部にアスパラギンをコー
ドするDNA配列が生ずる結果、49番目のリジンと88番目
のスレオニンの間にアスパラギンが挿入されたTPA誘導
体を作成することができる。
TPA染色体DNAとしては、前述のpSVePA−１が利用でき
る。第５エクソンの除去には、種々の制限エンドヌクレ
アーゼが利用できるが、もっとも好適なのはNco Iであ
ろう。Nco Iを利用した上記TPA誘導体発現ベクターの作
成方法については実施例３に詳細に記した。
る。第５エクソンの除去には、種々の制限エンドヌクレ
アーゼが利用できるが、もっとも好適なのはNco Iであ
ろう。Nco Iを利用した上記TPA誘導体発現ベクターの作
成方法については実施例３に詳細に記した。
発現ベクターの動物培養細胞への導入とTPA誘導体生産
細胞の作成 動物細胞へのDNAの導入法として、トランスフェクシ
ョン効率に差はあるが、リン酸カルシウム法［Wigler,
M.ら（1977年）セル（Cell）,11巻,233頁］，マイクロ
インジェクション法［Anderson,W.F.ら（1989年）プロ
シーディング．オブ．ザ．ナショナル．アカデミー．オ
ブ．サイエンス．ユーエスエー（同上）、77巻、5399
頁］、リポゾーム法、DEAE−デキストラン法或いは細胞
融合法［Schoffner,W.ら（1980年）プロシーディング．
オブ．ザ．ナショナル．アカデミー．オブ．サイエン
ス．ユーエスエー（同上）,77巻,2163頁］電気導入法
［達家雅明ら、（1987年）細胞工学、６巻,494頁］など
が利用できる。TPA誘導体発現ベクターを細胞に導入
後、適当な選択マーカー遺伝子によって獲得した形質に
より形質転換株を得ることができる。動物細胞での選択
マーカー遺伝子としては、Ecogpt［Mulligaan,R.C.ら
（1980年）サイエンス（Science）,209巻,1422頁］,neo
［Southern,P.J.ら（1982年）ジャーナル．オブ．モレ
キュラー．アンド．アプライド．ジェネティックス（Jo
urnal of Molecular and Applied Genetics）１巻,327
頁］,dhfr［Wigler,M.ら（1980年）プロシーディング．
オブ．ザ．ナショナル．アカデミー．オブ．サイエン
ス．ユーエスエー（同上）,77巻,327頁〕等の遺伝子が
用いられる。TPA誘導体発現ベクターは、これら選択マ
ーカー遺伝子を同一プラスミド内に含んでいてもあるい
は別のプラスミドであっても形質転換株の取得は可能で
ある。得られた形質転換株がTPA誘導体を生産するか否
かは、それぞれの形質転換細胞の培養液に含まれるプラ
スミノーゲン活性化活性を測定することによって決定で
きる。
細胞の作成 動物細胞へのDNAの導入法として、トランスフェクシ
ョン効率に差はあるが、リン酸カルシウム法［Wigler,
M.ら（1977年）セル（Cell）,11巻,233頁］，マイクロ
インジェクション法［Anderson,W.F.ら（1989年）プロ
シーディング．オブ．ザ．ナショナル．アカデミー．オ
ブ．サイエンス．ユーエスエー（同上）、77巻、5399
頁］、リポゾーム法、DEAE−デキストラン法或いは細胞
融合法［Schoffner,W.ら（1980年）プロシーディング．
オブ．ザ．ナショナル．アカデミー．オブ．サイエン
ス．ユーエスエー（同上）,77巻,2163頁］電気導入法
［達家雅明ら、（1987年）細胞工学、６巻,494頁］など
が利用できる。TPA誘導体発現ベクターを細胞に導入
後、適当な選択マーカー遺伝子によって獲得した形質に
より形質転換株を得ることができる。動物細胞での選択
マーカー遺伝子としては、Ecogpt［Mulligaan,R.C.ら
（1980年）サイエンス（Science）,209巻,1422頁］,neo
［Southern,P.J.ら（1982年）ジャーナル．オブ．モレ
キュラー．アンド．アプライド．ジェネティックス（Jo
urnal of Molecular and Applied Genetics）１巻,327
頁］,dhfr［Wigler,M.ら（1980年）プロシーディング．
オブ．ザ．ナショナル．アカデミー．オブ．サイエン
ス．ユーエスエー（同上）,77巻,327頁〕等の遺伝子が
用いられる。TPA誘導体発現ベクターは、これら選択マ
ーカー遺伝子を同一プラスミド内に含んでいてもあるい
は別のプラスミドであっても形質転換株の取得は可能で
ある。得られた形質転換株がTPA誘導体を生産するか否
かは、それぞれの形質転換細胞の培養液に含まれるプラ
スミノーゲン活性化活性を測定することによって決定で
きる。
TPA誘導体の精製 TPA誘導体生産株の培養は、宿主となる動物細胞株に
応じた培養法により行なうことができる。培養上清から
のTPA誘導体の回収精製は、CPG、キレーティング セフ
ァロース、Con−Ａセファロース、イオン交換体、オク
チルセファロース、セファデックスゲルでのクロマトグ
ラフィー、抗体カラムクロマトグラフィーや電気泳動等
を用いて行なうことができる。プラスミノーゲン活性化
活性は、プラスミノーゲン含有フィブリン平板を用いる
方法［Mackie,M.ら（1981年）ブリティッシュ．ジャー
ナル．オブ．ヘマトロジー（British Journal of Hemat
orogy）47巻,77頁］やプラスミンの合成基質S2251の分
解を測定する方法［Allen,R.A.とPepper,D.S.（1981
年）トロンボシス．アンド．ヘモスタシス（Thrombosis
and Haemostasis）45巻,43頁］CLT法［Gaffney,P.T.と
Curtis,A.D.（1985年）トロンボシス．アンド．ヘモス
タシス（同上）53巻,134頁］ELISA法［Holvoest,T.ら
（1985年）トロンボシス アンド ヘモスタシス（同
上）54巻,684頁］によって測定できる。
応じた培養法により行なうことができる。培養上清から
のTPA誘導体の回収精製は、CPG、キレーティング セフ
ァロース、Con−Ａセファロース、イオン交換体、オク
チルセファロース、セファデックスゲルでのクロマトグ
ラフィー、抗体カラムクロマトグラフィーや電気泳動等
を用いて行なうことができる。プラスミノーゲン活性化
活性は、プラスミノーゲン含有フィブリン平板を用いる
方法［Mackie,M.ら（1981年）ブリティッシュ．ジャー
ナル．オブ．ヘマトロジー（British Journal of Hemat
orogy）47巻,77頁］やプラスミンの合成基質S2251の分
解を測定する方法［Allen,R.A.とPepper,D.S.（1981
年）トロンボシス．アンド．ヘモスタシス（Thrombosis
and Haemostasis）45巻,43頁］CLT法［Gaffney,P.T.と
Curtis,A.D.（1985年）トロンボシス．アンド．ヘモス
タシス（同上）53巻,134頁］ELISA法［Holvoest,T.ら
（1985年）トロンボシス アンド ヘモスタシス（同
上）54巻,684頁］によって測定できる。
血栓溶解能の評価 本発明が提示するTPA誘導体は、血栓の溶解にかかわ
る種々の性質すなわち比改性、フィブリン親和性、活性
のフィブリン依存性、プロテアーゼ抵抗性、血中持続
性、プラスミノーゲン活性化活性、インビトロ血栓溶解
能あるいは阻害剤感受性等のいずれかにおいて改善され
た性質を持つ。フィブリン親和性は、フィブリンクロッ
トへの取込みを指標とする方法に従って測定することが
できる［Collen,D.ら（1988年）ブラッド（Blood）71
巻,216頁］。インビトロ血栓溶解能は、125I−フィブリ
ンからの放射能の遊離を指標する方法に従って測定する
ことができる［Larsen,G.R.ら（1988年）ザ．ジャーナ
ル．オブ．バイオロジカル．ケミストリー（同上）263
巻,1023頁］。活性のフィブリン依存性あるいはプラス
ミノーゲン活性化活性は、プラスミンの合成基質S2251
を利用するコレンら［Collen,Dら（1982年）ザ．ジャー
ナル．オブ．バイオロジカル．ケミストリー（同上）25
7巻,2912頁］の方法にて測定することがきる。血中持続
性に関してはベーベら［Beebe,D.P.ら（1986年）トロン
ボシス リサーチ（同上）43巻,663頁］あるいはマット
ソンら［Mattson,Ch.ら（1983年）トロンボシス リサ
ーチ（同上）30巻,91頁］が報告しており、それらに記
載の方法で血中半減期が測定できる。
る種々の性質すなわち比改性、フィブリン親和性、活性
のフィブリン依存性、プロテアーゼ抵抗性、血中持続
性、プラスミノーゲン活性化活性、インビトロ血栓溶解
能あるいは阻害剤感受性等のいずれかにおいて改善され
た性質を持つ。フィブリン親和性は、フィブリンクロッ
トへの取込みを指標とする方法に従って測定することが
できる［Collen,D.ら（1988年）ブラッド（Blood）71
巻,216頁］。インビトロ血栓溶解能は、125I−フィブリ
ンからの放射能の遊離を指標する方法に従って測定する
ことができる［Larsen,G.R.ら（1988年）ザ．ジャーナ
ル．オブ．バイオロジカル．ケミストリー（同上）263
巻,1023頁］。活性のフィブリン依存性あるいはプラス
ミノーゲン活性化活性は、プラスミンの合成基質S2251
を利用するコレンら［Collen,Dら（1982年）ザ．ジャー
ナル．オブ．バイオロジカル．ケミストリー（同上）25
7巻,2912頁］の方法にて測定することがきる。血中持続
性に関してはベーベら［Beebe,D.P.ら（1986年）トロン
ボシス リサーチ（同上）43巻,663頁］あるいはマット
ソンら［Mattson,Ch.ら（1983年）トロンボシス リサ
ーチ（同上）30巻,91頁］が報告しており、それらに記
載の方法で血中半減期が測定できる。
血中持続性以外に、生体内における血栓溶解能に影響
する因子は、フィブリン親和性、フィブリンによる活性
化、プラスミノーゲン活性化活性、プロテアーゼ抵抗
性、阻害剤感受性など様々である。本発明が提供する新
規TPA誘導体は、天然型TPAに比べてはるかに改善された
血中持続性を持ち、且つ既に知られている成長因子領域
の欠失誘導体よりも天然型TPAに近いインビトロ血栓溶
解能を保持している点で、心筋梗塞等の血栓症の治療に
用いることができ、現在試みられている治療方法を改善
することができる。
する因子は、フィブリン親和性、フィブリンによる活性
化、プラスミノーゲン活性化活性、プロテアーゼ抵抗
性、阻害剤感受性など様々である。本発明が提供する新
規TPA誘導体は、天然型TPAに比べてはるかに改善された
血中持続性を持ち、且つ既に知られている成長因子領域
の欠失誘導体よりも天然型TPAに近いインビトロ血栓溶
解能を保持している点で、心筋梗塞等の血栓症の治療に
用いることができ、現在試みられている治療方法を改善
することができる。
以下に実施例を示すが、本発明に係わる諸実験は、内
閣総理大臣の定める「組換えDNA実験指針」に従って行
なった。また実施例中のファージ、プラスミド、DNA、
種々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげ
る雑誌、成書を参考とした。
閣総理大臣の定める「組換えDNA実験指針」に従って行
なった。また実施例中のファージ、プラスミド、DNA、
種々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげ
る雑誌、成書を参考とした。
1. 蛋白質 核酸 酵素、26巻、４号（1981年）臨時増
刊 遺伝子操作（共立出版） 2. 遺伝子操作実験法、高木康敬 編著（1980年）講談
社 3. 遺伝子操作マニュアル、高木康敬 編著（1982年）
講談社 4. Molecular Cloning a laboratory manual,T.Maniat
isら編（1982年）Cold Spring HarborLaboratory 5. Mathods in Enzymology,65巻、L.Grossmamら編（19
80年）Academic Press 6. Methods in Enzymology,65巻、R.Wu編（1979年）Ac
ademic Press 実施例１ TPA発現ベクターpSVeCPA−１の作成 TPA発現ベクターpSVeCPA−１は以下に記述するステッ
プを経て作成した。
刊 遺伝子操作（共立出版） 2. 遺伝子操作実験法、高木康敬 編著（1980年）講談
社 3. 遺伝子操作マニュアル、高木康敬 編著（1982年）
講談社 4. Molecular Cloning a laboratory manual,T.Maniat
isら編（1982年）Cold Spring HarborLaboratory 5. Mathods in Enzymology,65巻、L.Grossmamら編（19
80年）Academic Press 6. Methods in Enzymology,65巻、R.Wu編（1979年）Ac
ademic Press 実施例１ TPA発現ベクターpSVeCPA−１の作成 TPA発現ベクターpSVeCPA−１は以下に記述するステッ
プを経て作成した。
a.TPAのcDNAクローンpCH79は以下の様にして作成した。
まず、染色体DNA利用TPA発現ベクターpSVePA−１（特
開昭62−14783）を導入したCHO−K1細胞から、既知のグ
アニジン−ホットフェノール法に準じ、トータルRNAを
抽出した。次に、オリゴdTセルロースクロマトグラフィ
ーにより、ポリA+mRNAを調製し、ショ糖濃度勾配遠心法
によって分子量分画してTPAのmRNAを含む画分を得た。
市販のcDNA合成キット（アマシャム社製）にこの画分を
供してcDNAを合成し、市販のλgt10利用cDNAクローニン
グキット（アマシャム社製）を用いて、cDNAライブラリ
ーを作成した。このライブラリーに対して、pSVePA−１
を制限酵素Xba Iで切断、単離した第10,11及び12エクソ
ンを含む約2.5Kbの断片をプローブとして用い、通常の
方法でプラークハイブリダイゼイションを行なって陽性
ファージを選択した。得られた陽性ファージDNAを調製
し、制限酵素Hind III（宝酒造株製）で消化後アガロー
スゲル電気泳動を行なって、クローニングに用いたと同
じXba I2.5Kb断片をプローブとしてサザンハイブリダイ
ゼイション法により解析した。その結果、CH79と名づけ
たクローンには、Hind IIIで約2.2Kbに切断されるプロ
ーブ陽性の断片が含まれていることが分かった。このHi
nd III約2.2Kb断片をアガロースゲル電気泳動法にて単
離後、同じくHind IIIで消化したpUC19〔宝酒造（株）
製〕とT4DNAリガーゼを用いて連結後、E.coli DH1に導
入してpCH79を作成した。このcDNAクローンpCH79のcDNA
部分の塩基配列をM13法を利用した市販のキット〔宝酒
造（株）製〕にて決定した。５′末端に存在する発現ベ
クター由来のHind III認識部位より約150bp下流にBgl I
Iの認識部位が存在し、塩基配列はその下流約1500bpの
終始コドンTGAまでbp585のＣがＴ及びbp1725のＡがＣで
あった以外は、ペニカら［Pennica,Dら（1983年）ネイ
チャー（Nature）301巻,214頁］が報告した塩基配列と
一致しており、さらに、TGAコドンから約410塩基下流に
は発現ベクターに由来するHind III部位が存在してい
た。
開昭62−14783）を導入したCHO−K1細胞から、既知のグ
アニジン−ホットフェノール法に準じ、トータルRNAを
抽出した。次に、オリゴdTセルロースクロマトグラフィ
ーにより、ポリA+mRNAを調製し、ショ糖濃度勾配遠心法
によって分子量分画してTPAのmRNAを含む画分を得た。
市販のcDNA合成キット（アマシャム社製）にこの画分を
供してcDNAを合成し、市販のλgt10利用cDNAクローニン
グキット（アマシャム社製）を用いて、cDNAライブラリ
ーを作成した。このライブラリーに対して、pSVePA−１
を制限酵素Xba Iで切断、単離した第10,11及び12エクソ
ンを含む約2.5Kbの断片をプローブとして用い、通常の
方法でプラークハイブリダイゼイションを行なって陽性
ファージを選択した。得られた陽性ファージDNAを調製
し、制限酵素Hind III（宝酒造株製）で消化後アガロー
スゲル電気泳動を行なって、クローニングに用いたと同
じXba I2.5Kb断片をプローブとしてサザンハイブリダイ
ゼイション法により解析した。その結果、CH79と名づけ
たクローンには、Hind IIIで約2.2Kbに切断されるプロ
ーブ陽性の断片が含まれていることが分かった。このHi
nd III約2.2Kb断片をアガロースゲル電気泳動法にて単
離後、同じくHind IIIで消化したpUC19〔宝酒造（株）
製〕とT4DNAリガーゼを用いて連結後、E.coli DH1に導
入してpCH79を作成した。このcDNAクローンpCH79のcDNA
部分の塩基配列をM13法を利用した市販のキット〔宝酒
造（株）製〕にて決定した。５′末端に存在する発現ベ
クター由来のHind III認識部位より約150bp下流にBgl I
Iの認識部位が存在し、塩基配列はその下流約1500bpの
終始コドンTGAまでbp585のＣがＴ及びbp1725のＡがＣで
あった以外は、ペニカら［Pennica,Dら（1983年）ネイ
チャー（Nature）301巻,214頁］が報告した塩基配列と
一致しており、さらに、TGAコドンから約410塩基下流に
は発現ベクターに由来するHind III部位が存在してい
た。
b.TPA発現ベクターpSVeCPA−１の作成 pSVeCPA−１は、第１図に示した手順により作成し
た。pSVeSal I（特開昭62−14783）を制限酵素Nco Iで
切断後、大腸菌内での複製起点およびアンピシリン耐性
を付与する約4.7Kb断片を単離し、さらにT4DNAリガーゼ
を用いて環状化後E.coli DH1に導入してpSVeSal I−Hin
d IIIを作成した。従って、このベクターはHind III認
識部位をはさんでSV40の複製起点を含む初期プロモータ
ー領域とSV40のポリアデニル化シグナルを含む配列がそ
れぞれ存在している、次に、pSVeSal I−Hind IIIをHin
d IIIにて切断後、pSVePA−１をHind III及びBgl IIで
切断、単離して得たTPA染色体DNAの全第２エクソンと第
３エクソンの一部を含む約1.9Kbと、pCH79をHind III及
びBgl IIで切断したTPAcDNAを含む約2Kb断片とをT4DNA
リガーゼにて連結後、E.coli DH1に導入してpSVeCPA−
１を作成した。このTPA発現ベクターpSVeCPA−１は、第
２エクソンから第３エクソンのBgl II認識部位までが染
色体DNA由来であり、それ以降がcDNAより成り、天然型
のTPAを発現する遺伝子をコードしている。
た。pSVeSal I（特開昭62−14783）を制限酵素Nco Iで
切断後、大腸菌内での複製起点およびアンピシリン耐性
を付与する約4.7Kb断片を単離し、さらにT4DNAリガーゼ
を用いて環状化後E.coli DH1に導入してpSVeSal I−Hin
d IIIを作成した。従って、このベクターはHind III認
識部位をはさんでSV40の複製起点を含む初期プロモータ
ー領域とSV40のポリアデニル化シグナルを含む配列がそ
れぞれ存在している、次に、pSVeSal I−Hind IIIをHin
d IIIにて切断後、pSVePA−１をHind III及びBgl IIで
切断、単離して得たTPA染色体DNAの全第２エクソンと第
３エクソンの一部を含む約1.9Kbと、pCH79をHind III及
びBgl IIで切断したTPAcDNAを含む約2Kb断片とをT4DNA
リガーゼにて連結後、E.coli DH1に導入してpSVeCPA−
１を作成した。このTPA発現ベクターpSVeCPA−１は、第
２エクソンから第３エクソンのBgl II認識部位までが染
色体DNA由来であり、それ以降がcDNAより成り、天然型
のTPAを発現する遺伝子をコードしている。
実施例２ DGFS発現ベクターの作成 天然型のTPAの51番目から87番目までのアミノ酸を欠
失したTPA誘導体をDGFSと名づけ、その発現ベクターpSV
eDH−１を第２図に示した手順により作成した。pSVeCPA
−１をBgl II及びNar Iで消化し約0.33Kbの断片を得、
さらにこれをDra III及びHae IIIで消化して得られるBg
l II−Dra III約130bp,Hae III−Nar I約60bp断片を単
離した。
失したTPA誘導体をDGFSと名づけ、その発現ベクターpSV
eDH−１を第２図に示した手順により作成した。pSVeCPA
−１をBgl II及びNar Iで消化し約0.33Kbの断片を得、
さらにこれをDra III及びHae IIIで消化して得られるBg
l II−Dra III約130bp,Hae III−Nar I約60bp断片を単
離した。
DNA合成機（381A DNAシンセサイザー、アプライド
バイオシステムズ）にて、以下の配列を合成した。
バイオシステムズ）にて、以下の配列を合成した。
それぞれの１本鎖DNAを合成、常法に従ってアニール
し、２本鎖DNAとした後、これとpSVeCPA−１のBgl II−
Nar I約8.1Kb断片とBgl II−Dra III130bp断片とHae II
I−Nar I60bp断片とをT4DNAリガーゼで連結後、E.coliD
H1に導入してDGFS発現ベクターpSVeDH−１を作成した。
し、２本鎖DNAとした後、これとpSVeCPA−１のBgl II−
Nar I約8.1Kb断片とBgl II−Dra III130bp断片とHae II
I−Nar I60bp断片とをT4DNAリガーゼで連結後、E.coliD
H1に導入してDGFS発現ベクターpSVeDH−１を作成した。
実施例３ DGFN発現ベクターpGCPAD5の作成 天然型TPAの51番目から87番目までのアミノ酸が欠失
し、さらに50番目のアミノ酸がセリンからアスパラギン
に置換されたTPA誘導体をDGFNと名づけ、その発現ベク
ターpGCPAD5を第３図に示した手順で作成した。まず、p
SVePA−１をHind III及びNar Iで消化、単離してTPA染
色体DNAの第２エクソンから第７エクソンの一部までを
含む約6.1Kbの断片を得た。この断片を同じくHind III
及びNar Iで消化したpUC19に挿入してpPAHN6.1を作成し
た。さらにこのプラスミドをNco Iで消化、単離して第
５エクソンを含む約0.3Kbの断片を除いた大断片約8.6Kb
を得、さらにT4DNAリガーゼで連結、E.coli DH1に導入
してpPAHN6.1−D5を作成した。pPAHN6.1−D5をBgl II及
びNar Iで消化しTPA染色体DNAを含む約3.6Kbの断片を単
離した。次に、pSVeCPA−１をBgl II及びNar Iで切断、
単離した約8.1Kb断片と上記約3.6Kb断片とをT4DNAリガ
ーゼを用いて環状化後、E.coli DH1に導入してpGCPAD5
を作成した。
し、さらに50番目のアミノ酸がセリンからアスパラギン
に置換されたTPA誘導体をDGFNと名づけ、その発現ベク
ターpGCPAD5を第３図に示した手順で作成した。まず、p
SVePA−１をHind III及びNar Iで消化、単離してTPA染
色体DNAの第２エクソンから第７エクソンの一部までを
含む約6.1Kbの断片を得た。この断片を同じくHind III
及びNar Iで消化したpUC19に挿入してpPAHN6.1を作成し
た。さらにこのプラスミドをNco Iで消化、単離して第
５エクソンを含む約0.3Kbの断片を除いた大断片約8.6Kb
を得、さらにT4DNAリガーゼで連結、E.coli DH1に導入
してpPAHN6.1−D5を作成した。pPAHN6.1−D5をBgl II及
びNar Iで消化しTPA染色体DNAを含む約3.6Kbの断片を単
離した。次に、pSVeCPA−１をBgl II及びNar Iで切断、
単離した約8.1Kb断片と上記約3.6Kb断片とをT4DNAリガ
ーゼを用いて環状化後、E.coli DH1に導入してpGCPAD5
を作成した。
実施例４ マーカーベクターpSV2neo−dhfrの作成 pSV2neo−dhfrは以下の手順で作成した。pSV2dhfr
（アメリカン タイプカルチャー コレクション rDNA
Vectors 37146）を制限酵素Pvu IIで切断し、ここにBa
mH Iリンカーｄ（pCGGATCCG）〔宝酒造（株）製〕をT4D
NAリガーゼで連結後、E.coli DH1に導入してpSV2Bdhfr
を作成した。pSV2BdhfrをBamH Iで消化して得られるdhf
r遺伝子を含む約2Kbの断片を単離後、この断片とpSV2ne
o（アメリカン タイプカルチャー コレクションrDNA
Vectors 37149）をBamH Iで切断したDNAとをT4DNAリガ
ーゼを用いて環状化後、E.coliDH1に導入し、neoとdhfr
遺伝子が同発現方向に挿入されたpSV2neo−dhfrを作成
した。
（アメリカン タイプカルチャー コレクション rDNA
Vectors 37146）を制限酵素Pvu IIで切断し、ここにBa
mH Iリンカーｄ（pCGGATCCG）〔宝酒造（株）製〕をT4D
NAリガーゼで連結後、E.coli DH1に導入してpSV2Bdhfr
を作成した。pSV2BdhfrをBamH Iで消化して得られるdhf
r遺伝子を含む約2Kbの断片を単離後、この断片とpSV2ne
o（アメリカン タイプカルチャー コレクションrDNA
Vectors 37149）をBamH Iで切断したDNAとをT4DNAリガ
ーゼを用いて環状化後、E.coliDH1に導入し、neoとdhfr
遺伝子が同発現方向に挿入されたpSV2neo−dhfrを作成
した。
実施例５ TPA発現ベクターの動物培養細胞への導入とTPAの生産 TPAの生産 TPA発現ベクターpGCPAD5およびpSVeDH−１をそれぞれ
使用し、CHO−K1（ATCC,CCL−61）を宿主として、チェ
ンら〔Chen,C.and Okayama,H.ら（1987年）モレキュラ
ー アンド セルラー バイオロジー（Molecular and
Cellular Biology）７巻,2745頁〕の方法に準じて形質
転換を行なった。即ち、プラスミド〔TPA発現ベクター:
pSV2neo−dhfr＝300:1（重量比）〕ーリン酸カルシウム
共沈殿物を予め５％牛胎児血清（FCS）を含むMD培地（M
CDB302:ダルベッコ変法MEM＝1:1、シグマ）で生育させ
た細胞（５×105細胞/10ml培地／直径10cm培養皿）に加
え、15時間後に培地を洗浄して更新した。さらに48時間
後、培地を５％FCS、800μg/ml G418硫酸塩（ギブ
コ）、7mM ε−アミノカプロン酸、50μＭフォイパン
（小野薬品工業）を含むMD培地に変え、さらに約２週間
培養を続けG418耐性株を分離した。G418耐性株を12穴マ
ルチディッシュ（リンブロー社製）の底面全体に生育さ
せ、上記培地で24時間培養し、培地中に含まれるDGFNあ
るいはDGFSの含量を実施例７にあるような蛋白定量され
た標品を標準としてその活性をプラスミノーゲン含有フ
ィブリン平板を用いて測定した［Mackie,Mら（1981年）
ブリティッシュ ジャーナル オブ ヘマトロジー（Br
itish Journal of Hematology）,47巻,77頁］。
使用し、CHO−K1（ATCC,CCL−61）を宿主として、チェ
ンら〔Chen,C.and Okayama,H.ら（1987年）モレキュラ
ー アンド セルラー バイオロジー（Molecular and
Cellular Biology）７巻,2745頁〕の方法に準じて形質
転換を行なった。即ち、プラスミド〔TPA発現ベクター:
pSV2neo−dhfr＝300:1（重量比）〕ーリン酸カルシウム
共沈殿物を予め５％牛胎児血清（FCS）を含むMD培地（M
CDB302:ダルベッコ変法MEM＝1:1、シグマ）で生育させ
た細胞（５×105細胞/10ml培地／直径10cm培養皿）に加
え、15時間後に培地を洗浄して更新した。さらに48時間
後、培地を５％FCS、800μg/ml G418硫酸塩（ギブ
コ）、7mM ε−アミノカプロン酸、50μＭフォイパン
（小野薬品工業）を含むMD培地に変え、さらに約２週間
培養を続けG418耐性株を分離した。G418耐性株を12穴マ
ルチディッシュ（リンブロー社製）の底面全体に生育さ
せ、上記培地で24時間培養し、培地中に含まれるDGFNあ
るいはDGFSの含量を実施例７にあるような蛋白定量され
た標品を標準としてその活性をプラスミノーゲン含有フ
ィブリン平板を用いて測定した［Mackie,Mら（1981年）
ブリティッシュ ジャーナル オブ ヘマトロジー（Br
itish Journal of Hematology）,47巻,77頁］。
実施例６ 形質転換株のメソトレキセート（Mtx）による選択及び
培養 実施例５で得たpGCPAD5あるいはpSVeDH−１の形質転
換株をそれぞれ直径10cmの培養皿に103から105個の細胞
を植え50nMから200nMのMtxを含むMD培地で約１ヵ月培養
を続け、Mtxに対して耐性を示す株を分離した。これら
の耐性株が24時間あたり生産するDGFNあるいはDGFSの量
を実施例５に示したようにフィブリン平板法にて測定し
た。表−２には実施例５および６で得られたDGFNあるい
はDGFSの生産株名及びその力価を示した。Mtxで選択し
た細胞からは親株よりも高いTPA生産性を示す株が得ら
れた。また、これらの細胞はMD無血清培地（MD培地、7m
M ε−アミノカプロン酸、50μＭフォイパン 1mg/ml
牛血清アルブミン５μg/mlインシュリン）においてもTP
Aを生産した。
培養 実施例５で得たpGCPAD5あるいはpSVeDH−１の形質転
換株をそれぞれ直径10cmの培養皿に103から105個の細胞
を植え50nMから200nMのMtxを含むMD培地で約１ヵ月培養
を続け、Mtxに対して耐性を示す株を分離した。これら
の耐性株が24時間あたり生産するDGFNあるいはDGFSの量
を実施例５に示したようにフィブリン平板法にて測定し
た。表−２には実施例５および６で得られたDGFNあるい
はDGFSの生産株名及びその力価を示した。Mtxで選択し
た細胞からは親株よりも高いTPA生産性を示す株が得ら
れた。また、これらの細胞はMD無血清培地（MD培地、7m
M ε−アミノカプロン酸、50μＭフォイパン 1mg/ml
牛血清アルブミン５μg/mlインシュリン）においてもTP
Aを生産した。
実施例７ TPA誘導体DGFSおよびDGFNの回収、精製 以下にTPA誘導体DGFSおよびDGFNの回収、精製の工程
を示す。工程途中のTPA抗原の検出には、市販のELISAキ
ット（IMUBIND TPA ELISA KIT,アメリカンダイアグノス
ティカ社製）を用いた。10N27−１あるいは10DH1−18−
２を実施例６で示したMD無血清培地にて培養し、得たDG
FSあるいはDGFNを含む培養液を、1MNaCl,50μＭフォイ
パンを含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて平衡化したC
PG−10（エレクトロヌクレオニクス社製）カラムにチャ
ージし、平衡化に用いたと同じ緩衝液にて洗浄した。CP
G−10カラムを通過した培養液および洗浄液中にDGFSあ
るいはDGFNは、ほとんど検出されなかった。CPG−10カ
ラムよりDGFSあるいはDGFNを1M NaCl,0.5 M KSCN,1M
ε−アミノカプロン酸および50μＭフォイバンを含む20
mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて溶出した。溶出後をその
まま1M NaCl,0.01％Tween80および50μＭフォイパンを
含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて平衡化したConA−S
epharose（ファルマシア社製）カラムにチャージした。
平衡化に用いたと同じ緩衝液にて洗浄後、2M KSCN,0.4
M α−メチルマンノシド、0.01％Tween80および50μＭ
フォイパンを含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて溶出
した。ELISAを利用してConA Sepharoseの通過培養液、
洗浄液および溶出液中に含まれるTPA抗原を検出したと
ころ、DGFNあるいはDGFSはほとんどConA Sepharoseに
吸着し、溶出回収されていることが分かった。
を示す。工程途中のTPA抗原の検出には、市販のELISAキ
ット（IMUBIND TPA ELISA KIT,アメリカンダイアグノス
ティカ社製）を用いた。10N27−１あるいは10DH1−18−
２を実施例６で示したMD無血清培地にて培養し、得たDG
FSあるいはDGFNを含む培養液を、1MNaCl,50μＭフォイ
パンを含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて平衡化したC
PG−10（エレクトロヌクレオニクス社製）カラムにチャ
ージし、平衡化に用いたと同じ緩衝液にて洗浄した。CP
G−10カラムを通過した培養液および洗浄液中にDGFSあ
るいはDGFNは、ほとんど検出されなかった。CPG−10カ
ラムよりDGFSあるいはDGFNを1M NaCl,0.5 M KSCN,1M
ε−アミノカプロン酸および50μＭフォイバンを含む20
mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて溶出した。溶出後をその
まま1M NaCl,0.01％Tween80および50μＭフォイパンを
含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて平衡化したConA−S
epharose（ファルマシア社製）カラムにチャージした。
平衡化に用いたと同じ緩衝液にて洗浄後、2M KSCN,0.4
M α−メチルマンノシド、0.01％Tween80および50μＭ
フォイパンを含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて溶出
した。ELISAを利用してConA Sepharoseの通過培養液、
洗浄液および溶出液中に含まれるTPA抗原を検出したと
ころ、DGFNあるいはDGFSはほとんどConA Sepharoseに
吸着し、溶出回収されていることが分かった。
溶出液を0.15M NaCl,0.01％Tween80および50μＭフ
ォイパンを含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）に対して透
析後、同緩衝液にて平衡化した抗体カラム（PAM−２−S
epharose,アメリカンダイアグノスティカ社製）にチャ
ージした。0.3M KSCN,0.15 M NaCl,0.01％Tween80を含
む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて洗浄後、3M KSCN,0.
15 M NaCl,0.01％Tween80を含むリン酸緩衝液（pH7.5）
にて溶出した。溶出液中に含まれるDGFNあるいはDGFSを
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて精製度
を分析した。その電気泳動図を第４図に示した。DGFNあ
るいはDGFSと思われる単一のバンドが検出された。それ
ぞれのTPA誘導体は、CHO細胞の生産するリコンビナント
TPAに比べて、アミノ酸欠失を反映して分子量が少し低
下していた。同溶出液中に含まれる蛋白量をウシ血清ア
ルブミンを標準としてローリー法にて測定した。その結
果DGFNは10N27−１の培養液約2Lより1.3mg,DGFSは10DH1
−18−２の培養液約2Lより4.1mgが回収、精製されてい
ることが分かった。
ォイパンを含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）に対して透
析後、同緩衝液にて平衡化した抗体カラム（PAM−２−S
epharose,アメリカンダイアグノスティカ社製）にチャ
ージした。0.3M KSCN,0.15 M NaCl,0.01％Tween80を含
む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて洗浄後、3M KSCN,0.
15 M NaCl,0.01％Tween80を含むリン酸緩衝液（pH7.5）
にて溶出した。溶出液中に含まれるDGFNあるいはDGFSを
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて精製度
を分析した。その電気泳動図を第４図に示した。DGFNあ
るいはDGFSと思われる単一のバンドが検出された。それ
ぞれのTPA誘導体は、CHO細胞の生産するリコンビナント
TPAに比べて、アミノ酸欠失を反映して分子量が少し低
下していた。同溶出液中に含まれる蛋白量をウシ血清ア
ルブミンを標準としてローリー法にて測定した。その結
果DGFNは10N27−１の培養液約2Lより1.3mg,DGFSは10DH1
−18−２の培養液約2Lより4.1mgが回収、精製されてい
ることが分かった。
実施例８ インビトロ血清溶解能測定 DGFNおよびDGFSのインビトロ血清溶解能を125I−フィ
ブリンからの放射能の遊離を測定するラーセンら（同
上）の方法に従って測定した。4.55μg/mlヒト リジン
タイププラスミノーゲン、0.1M NaCl,0.001％Tween80を
含む50mMリン酸緩衝液（pH7.2）に5mg/mlとなるように
ヒトブィブリンノーゲンを溶解後、ヒトトロンビンを1.
0NIH unit/mlとなるように添加し、適当な容器内で37℃
で１時間放置して凝固させた。作成したフィブンクロッ
トと当量の酵素液を重層し、37℃で４時間反応させた。
反応後各容器内の可溶性画分を抜取り、ガンマカウンタ
ーにて試料中に含まれる放射能を測定した。その結果を
第５図に示す。DGFNはDGFSよりも強力なインビトロ血栓
溶解能をもっていることが判った。
ブリンからの放射能の遊離を測定するラーセンら（同
上）の方法に従って測定した。4.55μg/mlヒト リジン
タイププラスミノーゲン、0.1M NaCl,0.001％Tween80を
含む50mMリン酸緩衝液（pH7.2）に5mg/mlとなるように
ヒトブィブリンノーゲンを溶解後、ヒトトロンビンを1.
0NIH unit/mlとなるように添加し、適当な容器内で37℃
で１時間放置して凝固させた。作成したフィブンクロッ
トと当量の酵素液を重層し、37℃で４時間反応させた。
反応後各容器内の可溶性画分を抜取り、ガンマカウンタ
ーにて試料中に含まれる放射能を測定した。その結果を
第５図に示す。DGFNはDGFSよりも強力なインビトロ血栓
溶解能をもっていることが判った。
実施例９ DGFS,DGFNの血中半減期測定 精製したDGFNおよびDGFSの300μｇをウサギに耳介静
脈よりそれぞれ単回投与し、その血中半減期を測定した
結果、DGFN,DGFSいずれも誘導体も同程度の血中持続性
を示し、その半減期は、第６図に示すように、約15分と
測定された。
脈よりそれぞれ単回投与し、その血中半減期を測定した
結果、DGFN,DGFSいずれも誘導体も同程度の血中持続性
を示し、その半減期は、第６図に示すように、約15分と
測定された。
第１図はベクターpSVeCPA−１の作製法を示す模式図、
第２図はベクターpSVeDH−１の作製法を示す模式図、第
３図はベクターpGCPAD5の作成法を示す模式図、第４図
は、DGFNおよびDGFSのSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動像、第５図はDGFN及びDGFSのインビトロ血栓溶解能
の測定結果を示す模式図、第６図はウサギに投与したDG
FNおよびDGFSの血中減衰曲線を示す。第1,2,3および４
図中、SVe,polyA,ORl.,Ecogpt,TPAcDNA,TPAgDNA,Amp.,A
TG及びTGAは、それぞれSV40のDNA複製起点を含む初期プ
ロモーター領域、SV40のポリ（Ａ）付加シグナルを含む
領域、プラスミドの複数起点、Ecogpt遺伝子、TPAのcDN
A遺伝子、TPAの染色体遺伝子、アンピシリン耐性遺伝
子、TPA遺伝子の翻訳開始コドン、TPA遺伝子の翻訳終止
コドンを示す。第５および６図中CHOrTPAは、CHO細胞で
生産したリコンビナントTPAを示す。 第1,2および３図中、円上の黒塗りの部分及び数字は、T
PA染色体遺伝子のエクソンおよびエクソン番号を表わ
す。
第２図はベクターpSVeDH−１の作製法を示す模式図、第
３図はベクターpGCPAD5の作成法を示す模式図、第４図
は、DGFNおよびDGFSのSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動像、第５図はDGFN及びDGFSのインビトロ血栓溶解能
の測定結果を示す模式図、第６図はウサギに投与したDG
FNおよびDGFSの血中減衰曲線を示す。第1,2,3および４
図中、SVe,polyA,ORl.,Ecogpt,TPAcDNA,TPAgDNA,Amp.,A
TG及びTGAは、それぞれSV40のDNA複製起点を含む初期プ
ロモーター領域、SV40のポリ（Ａ）付加シグナルを含む
領域、プラスミドの複数起点、Ecogpt遺伝子、TPAのcDN
A遺伝子、TPAの染色体遺伝子、アンピシリン耐性遺伝
子、TPA遺伝子の翻訳開始コドン、TPA遺伝子の翻訳終止
コドンを示す。第５および６図中CHOrTPAは、CHO細胞で
生産したリコンビナントTPAを示す。 第1,2および３図中、円上の黒塗りの部分及び数字は、T
PA染色体遺伝子のエクソンおよびエクソン番号を表わ
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/58 C07K 14/745 C12N 5/00 C12P 21/00 A61K 38/49 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (12)
- 【請求項１】天然型ヒト組織プラスミノーゲン活性化因
子のアミノ酸配列において、51番目から87番目までのア
ミノ酸を欠失し、かつ50番目のセリンがアスパラギンに
置換された、フィブリン溶解活性を有する組織プラスミ
ノーゲン活性化因子誘導体。 - 【請求項２】形質転換された動物培養細胞で産生され、
グリコシル化された請求項１に記載の組織プラスミノー
ゲン活性化因子誘導体。 - 【請求項３】動物培養細胞がCHO−K1である請求項２記
載の組織プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 - 【請求項４】天然型の組織プラスミノーゲン活性化因子
と同等なフィブリン溶解活性を有し、かつ血中持続性が
改善された請求項１ないし３のいずれかに記載の組織プ
ラスミノーゲン活性化因子誘導体。 - 【請求項５】請求項１に記載の組織プラスミノーゲン活
性化因子誘導体をコードするDNA配列。 - 【請求項６】DNA配列がcDNAである請求項５記載のDNA配
列。 - 【請求項７】DNA配列がcDNAと染色体DNAのハイブリッド
DNAである請求項５記載のDNA配列。 - 【請求項８】第２エクソンから第６エクソンのNar I認
識部位までを有し、かつ第５エクソンを欠失する染色体
DNAの下流にcDNAを接続した請求項７記載のハイブリッ
ドDNA。 - 【請求項９】請求項５ないし８のいずれかに記載のDNA
配列を含む発現ベクターで形質転換された動物培養細
胞。 - 【請求項１０】細胞がCHO−K1である請求項９記載の動
物培養細胞。 - 【請求項１１】請求項１記載の組織プラスミノーゲン活
性化因子誘導体をコードするDNA配列を有する発現ベク
ターで形質転換された動物培養細胞を培養してプラスミ
ノーゲン活性化因子誘導体を生成せしめ、これを採取す
ることを特徴とするプラスミノーゲン活性化因子誘導体
の製造方法。 - 【請求項１２】動物培養細胞としてCHO−K1を使用する
請求項11記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1201889A JP2831709B2 (ja) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | 血栓溶解剤およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1201889A JP2831709B2 (ja) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | 血栓溶解剤およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0365183A JPH0365183A (ja) | 1991-03-20 |
| JP2831709B2 true JP2831709B2 (ja) | 1998-12-02 |
Family
ID=16448514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1201889A Expired - Fee Related JP2831709B2 (ja) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | 血栓溶解剤およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2831709B2 (ja) |
-
1989
- 1989-08-03 JP JP1201889A patent/JP2831709B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0365183A (ja) | 1991-03-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |