JPH03285685A - 新規プラスミノーゲン活性化因子誘導体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血栓症の治療に有用である組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子の新規誘導体、該誘導体をコードする
ＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター、該ベ
クターを導入された形質転換体。

および該誘導体の製造方法に関する。

（従来の技術） ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（以下。

ＴＰＡと略す）は、ヒトのメラノーマ細胞（ＢｏｗｓＭ
ｅｌａｎｏｍａ）の分泌するＴＰＡについて特によく研
究されており２５２７個のアミノ酸残基からなる糖タン
パクであることが知られている（Ｐｅｎｎｉｃａ、　　
Ｄら。

Ｎａｔｕｒｅ、　　３０１　２１４（ｂ９８３））。

ＴＰＡは、血液中に存在するプラスミ／−ゲンに作用し
てプラスミンに変える酵素であり、プラスミンは血栓の
原因となるフィブリンを溶解する作用を有する。ＴＰＡ
はこのフィブリンに対して強い親和性を有し、かつその
活性はフィブリン依存性７− であるため、血栓に特異的に作用すると考えられている
。そのため、　　ＴＰＡは種々の血栓症の治療薬として
有用である（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ，　　Ｅ．　Ｂ．、　
　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
　Ｌ，　　３７５（ｂ９８７））。しかし、血栓症の治
療のためにＴＰＡを血液中に投与するとしても。

その効果は長時間持続せず，　　ＴＰＡは血液中から急
速に消失してしまうという問題がある。ＴＰＡは主に肝
臓で代謝されると推定されており（　Ｆｕｃｈｓ，　Ｈ
．　Ｅ。

ら＋’　Ｂｌｏｏｄ，　６４　　５３９（ｂ９８５））
　、　　その血中半減期は僅かに２分である（ｃｏｌｌ
ｅｎ，　　Ｄ．ら、　　Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｎ。

７２、　　：Ｈｔ４（ｂ９８５））。そのため、　　Ｔ
ＰＡの血中有効濃度を一定に保つには，大量のＴＰＡを
投与する必要がある。しかも、　　ＴＰＡは水への溶解
性が小さいため高濃度で使用することができず，所定量
の丁ＰＡを投与するためには長時間を要する。このよう
に、血栓症を効果的に治療するためにはＴＰＡを長時間
にわたり大量に投与する必要があり，−刻を争う血栓症
の治療には適さない。さらに、　　ＴＰＡは天然に微量
にしか存在しないタンパクであるため高価で，大量に使
用すると治療が極めて高価となり，患者への負担が大き
い。

このような問題を解決し，　　ＴＰＡをより少量でかつ
短時間に投与し得るようにするために，化学修飾。

酵素修飾，遺伝子工学的手法などにより血中持続性を改
善されたＴＰＡ誘導体が報告されている（Ｂｒｏｗｎｅ
，　　Ｍ．　　Ｊ．　　ら、、Ｊ．　　Ｂｉｏｌ．　　
Ｃｈｅｍ．、　　２６３．　　１５９９（ｂ９８ｇ）　
；Ｄｏｄｄ，　　１．ら、　　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　
　ａｎｄ　　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ。

３　　５２３（ｂ９８８）；およびＫａｙａｎ，　　Ｎ
．　Ｋ．ら、　　Ｊ．　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ．、　　２６３　　３９７１（ｂ９８８））。

しかし、これらの報告によるＴＰＡ誘導体では，血中持
続性が大幅に同上した反面，　　ＴＰＡの特徴的な性質
であるフィブリン親和性の極端な低下が認められている
（Ｌａｒｓｅｎ。

Ｇ．　　Ｒ．ら、　　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、、凝
あ　１０２３（ｂ９８ｇ＞）。

さらに、修飾・改変によりフィブリン溶解能が著しく低
下したＴＰＡ誘導体の例もある（■ａｎｓｅｎ　Ｌ．ら
。

Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、　　２６３　　１５７
１３（ｂ９８８））。

このように、優れた治療効果を示すＴＰＡ誘導体はまだ
得られていない。そのため、血中持続性か向上し，かつ
ＴＰＡ本来の特性をできるだけ保持し。

出血などの副作用を増大させることなく少量の段− ０− 与での血栓治療が可能であるようなＴＰＡ誘導体の開発
が待たれている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その
目的とするところは、血中半減期が長く。

かつフィブリン溶解能の高い新規ＴＰＡ誘導体を提供す
ることにある。本発明の他の目的は、上記優れた性質を
有するＴＰＡ誘導体をコードするＤＮＡ配列。

該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター、該発現ベクターが
導入された形質転換体、ならびに該形質転換体を培養し
てＴＰＡ誘導体を生産することによるＴＰＡ誘導体の製
造方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） ＴＰＡは、フィンガー領域、成長因子領域、クリングル
１領域、クリングル２領域およびセリンプロテアーゼ活
性を有する領域の５つの領域からなり。

これらの領域はＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から上記
順序で並んでいる（Ｐｅｎｎｉｃａ、　　Ｄ、　　ら、
　　Ｎａｔｕｒｅ。

３０１　２１４、前出）。これまでに作成され、血中持
続性およびフィブリン溶解能が評価されたＴＰＡ誘導１
１ 体はいずれも、フィンガー領域を単独で欠く、または他
の領域も含めた広い領域のアミノ酸配列が欠失した欠失
体である（Ｈａｎｓｅｎ　Ｌら、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６３．１５７１３前出；　Ｌａｒｓｅｎ
、　　Ｇ、　Ｒ，ら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６３．１０２３．前出；
およびＣｏ１１ｅｎ。

Ｄ、ら、　　Ｂｌｏｏｄ、　　７１．　２１９（ｂ９８
８））。このようなフィンガー領域を欠＜　ＴＰＡ誘導
体は、血中持続性は向上するがイソロイシン、ビトロで
の血栓溶解能が著しく低下する。従って、フィンガー領
域は、プラスミノーゲン活性化能またはフィブリン溶解
能を担っていると考えられる。

発明者らは、フィンガー領域のこのような特性を損なう
ことなしに血中持続性が向上したＴＰＡ誘導体を作製す
るために、遺伝子工学的手法を用いてフィンガー領域の
アミノ酸置換体を数多（作成し。

評価した。その結果、血中持続性が改善された多くの誘
導体が得られた。しかし、これらフィンガー領域のアミ
ノ酸が置換されたＴＰＡは、一般に、血栓溶解能が天然
型ＴＰＡに比べて低い場合が多いことがわかった。その
ため１発明者らは、さらに検討＝１２− を加え、フィンガー領域の所定の位置が置換されたＴＰ
Ａ誘導体の中に、天然型ＴＰＡと同等な血栓溶解能を有
し、かっ血中持続性が遥かに改善されたＴＰＡ誘導体が
あることを見い出し１本発明を完成するに至った。

本発明のＴＰＡ誘導体は、　　ＴＰＡのアミノ酸配列の
Ｎ末端から３７番目のアスパラギン、３８番目のセリン
。

３９番目のグリシン、４０番目のアルギニン、４１１目
のアラニン、および４２番目のグルタミンのうちの。

少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸、好ましくは
疎水性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。

好適な実施態様においては、上記疎水性アミノ酸はフェ
ニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン。

ロイシンまたはセリンである。

好適な実施態様においては１本発明のＴＰＡ誘導体は、
　　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目のアス
パラギンをセリンに、３８番目のセリンをバリンに。

３９番目のグリシンをバリンに、４０番目のアルギニン
をグルタミン酸に、４１番目のアラニンをセリンに、そ
して４２番目のグルタミンをセリンに置換するアミノ酸
置換のうちの少なくとも１種の置換を含むアミノ酸配列
を有する。

好適な実施態様においては２本発明のＴＰＡ誘導体は、
　　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目のアス
パラギンをロイシンに、３８番目のセリンをバリンに、
３９番目のグリシンをバリンに、４０番目のアルギニン
をイソロシンに、４１１目のアラニンをバリンに、そし
て４２番目のグルタミンをロイシンに置換するアミノ酸
置換のうちの少なくとも１種の置換を含むアミノ酸配列
を有する。

好適な実施態様においては２本発明のＴＰＡ誘導体は、
　　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目のアス
パラギンをセリンに、３８番目のセリンをバリンに。

３９番目のグリシンをバリンに、　　４０番目のアルギ
ニンをイソロシンに、４１番目のアラニンをセリンに。

そして４２番目のグルタミンをセリンに置換するアミノ
酸置換のうちの少なくとも１種の置換を含むアミノ酸配
列を有する。

好適な実施態様においては９本発明のＴＰＡ誘導体＝１
３− １４− は、　　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目の
アスパラギンをセリンに、３８番目のセリンをバリンに
。

３９番目のグリシンをバリンに、４０番目のアルギニン
をイソロシンに、４１番目のアラニンをバリンに。

そして４２番目のグルタミンをセリンに置換するアミノ
酸置換のうちの少なくとも１種の置換を含むアミノ酸配
列を有する。

好適な実施態様においては２本発明のＴＰＡ誘導体は、
　　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目のアス
パラギンをセリンに、３８番目のセリンをバリンに。

３９番目のグリシンをバリンに、４０番目のアルギニン
をイソロシンに、　　４１番目のアラニンをバリンに。

そして４２番目のグルタミンをロイシンに置換するアミ
ノ酸置換のうちの少なくとも１種の置換を含むアミノ酸
配列を有する。

好適な実施態様においては２本発明のＴＰＡ誘導体は、
　　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目のアス
パラギンをフェニルアラニンに、３８番目のセリンをロ
イシンに、３９番目のグリシンをフェニルアラニンに、
４０番目のアルギニンをバリンに、４１番目５− のアラニンをロイシンに、そして４２番目のグルタミン
をフェニルアラニンに置換するアミノ酸置換のうちの少
なくとも１種の置換を含むアミノ酸配列を有する。

好適な実施態様においては１本発明のＴＰＡ誘導体は、
　　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目のアス
パラギンをバリンに、３８番目のセリンをフェニルアラ
ニンに、３９番目のグリシンをロイシンに、４０番目の
アルギニンをフェニルアラニンに、４１番目のアラニン
をイソロイシン、ロジンに、そして４２番目のグルタミ
ンをバリンに置換するアミノ酸置換のうちの少なくとも
１種の置換を含むアミノ酸配列を有する。

好適な実施態様においては２本発明のＴＰＡ誘導体は、
　　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目のアス
パラギンをセリンに、３８番目のセリンをバリンに。

３９番目のグリシンをバリンに、４０番目のアルギニン
をグルタミン酸に、４１番目のアラニンをフェニルアラ
ニンに、そして４２番目のグルタミンをセリンに置換す
るアミノ酸置換のうちの少なくともｌ１６ 種の置換を含むアミノ酸配列を有する。

好適な実施態様においては２本発明のＴＰＡ誘導体は、
　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のセリン
がバリンに、２９番目のアスパラギンがセリンに。

３０番目のアルギニンがグルタミン酸に、３１番目のバ
リンがセリンに、３２番目のグルタミン酸がリジンに、
そして３３番目のチロシンがアスパラギンにそれぞれ置
換されたアミノ酸配列を有する。

本発明のＴＰＡ誘導体は、　ＴＰＡのアミノ酸配列Ｎ末
端から７番目のアルギニンがリジンに、８番目のアスパ
ラギン酸がリジンに、そして９番目のグルタミン酸がリ
ジンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する。

本発明のＴＰＡ誘導体は、　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ
末端から１０番目のリジンがグルタミン酸に、１１番目
のスレオニンがバリンに、１２番目のグルタミンがセリ
ンに、１３番目のメチオニンがセリンに、そして１４番
目のイソロイシンがセリンにそれぞれ置換されたアミノ
酸配列を有する。

本発明のＴＰＡ誘導体は、　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ
末端から１５番目のチロシンがフェニルアラニンに。

１６番目のグルタミンがセリンに、１７番目のグルタミ
ンがセリンに、１８番目のヒスチジンがグルタミン酸に
、そして１９番目のグルタミンがセリンにそれぞれ置換
されたアミノ酸配列を有する。

本発明のＤＮＡ配列は、上記ＴＰＡ誘導体をコードする
。

本発明のＤＮＡ配列は、　　ｃＤＮＡおよび／または染
色体ＤＮＡ由来である。

本発明の発現ベクターは、上記ＤＮＡ配列を有する。

本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを動物培養細
胞に導入して得られる。

本発明のＴＰＡ誘導体の製造方法は、　（ａ）上記ＴＰ
Ａ誘導体をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクター
を構築する工程；　（ｂ）該発現ベクターを動物培養細
胞に導入して形質転換体を得る工程；（ｃ）該形質転換
体を培養してＴＰＡ誘導体を生産させる工程；および（
ｄ）生産されたＴＰＡ誘導体を単離する工程を包含する
。

以下に９本発明をＴＰＡ誘導体の製造工程順に説明７− する。

（ｂ）ＴＰＡをコードするＤＮＡ配列の調製遺伝子工学
的手法を用いてＴＰＡのフィンガー領域を修飾し、血中
持続性の向上したＴＰＡ誘導体を作成するには、天然型
あるいはそれに由来するＴＰＡのアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ配列が必要である。

そのようなりＮＡ配列は、　　ＴＰＡをコードするｃＤ
ＮＡまたは染色体ＤＮＡ　（以下、染色体ＤＮＡをｇＤ
ＮＡとする）をクローニングすることにより；あるいは
ＴＰＡをコードするｃＤＮＡ、　ｇＤＮＡ、　ＴＰＡの
アミノ酸配列などをもとにＤＮＡを化学合成することに
より得られる。

ＴＰＡをコードするｃＤＮＡは、　　Ｐｅｎｎ１ｃａ、
　　Ｄ、らＮａｔｕｒｅ。

３０１、２１４（ｂ９８３）　（前出）によりすでに単
離されており　ＴＰＡをコードするｇＤＮＡは、　　Ｎ
ｙ、Ｔ、ら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　ＬＬ
　５３５５（ｂ９８４））　；Ｂｒｏｗｎ、　Ｍ、　Ｊ
、ら（Ｇｅｎｅ、　３３．２７９（ｂ９８５））　；お
よびＤｅｇｅｎ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｆ、ら（Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、、　　２６１．６９７２（ｂ９８６）
）によりそれぞれ単離されている。本明細書においては
、　ＴＰＡのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列に対する
番号付けはＰｅｎｎ１ｃａ、　Ｄ、ら（前出）に従い。

ＴＰＡをコードするｇＤＮＡ配列のエクソンに対する番
号付けはＮ７＋　Ｔ、ら（前出）に従って行う。

この他、遺伝子操作によって得られた種々のＴＰＡ発現
ベクターが知られており９例えば、特開昭６２−１４７
８３号公報に開示されているＴＰＡ発現ベクターｐＳＶ
ｅＰＡ−１を利用して、　ＤＮＡ配列が得られうる。上
記ｐＳＶｅＰＡ−１を用いた本発明のＴＰＡ誘導体発現
ベクターの作成例を次に示す。

まず上記発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１を含む宿主７例
えば、このベクターにより形質転換されたＣＨＯ−Ｋｌ
細胞（特開昭６２−１４７８３号公報、前出）からｍＲ
ＮＡを抽出し、これを用いてｃＤＮＡを合成してｃＤＮ
Ａライフラリ−を作成し、クローニングを行う。クロー
ニングは１例えば、上記発現ベクターを適当な制限酵素
で切断して得られるＤＮＡの断片（ＴＰＡをコードする
）をプローブとして用いた。プラークハイフリダイゼー
ションにより行うことができる。このようにして、この
プローブとハイブリダイズする陽性クローンＣＨ７９が
選択される。このクローンＣ１７９中のＤＮＡを抽出し
、サザンハイプリダイゼーショ９− ２０− ンにより解析すると、上記プローブとハイブリクイズし
、　ＨｉｎｄｌＩＩで約２．２ｋｂに切断されるＤＮＡ
断片が含まれていることが分かる。この約２．２ｋｂの
ＨｉｎｄＩＩ［切断ＤＮＡ断片を、プラスミドベクター
ｐＵｃ１９に挿入することにより、　　ｃＤＮＡクロー
ンｐＣＨ７９が得られる。

このｐＣＨ７９のｃＤＮＡ部分の塩基配列をＭ１３法に
より決定すると、このｃＤＮＡ部分の５゛末端はプラス
ミドベクターｐＵｃ１９由来のＨｉｎｄ■認識部位に連
結されており、そこから約１５０ｂｐ下流には１■の認
識部位が存在し、その下流約１５００ｂｐには終止フド
ンＴＧＡが存在する。さらに、このＴＧＡコドンから約
４１０ｂｐ下流には、プラスミドベクターｐＵｃ１９由
来のＨｉｎｄ　ＩＩＩ認識部位が存在する。このｃＤＮ
Ａ部分の塩基配列は、５８５番目のＣがＴに、そして１
７２５７２５番目Ｃであることを除いては、　Ｐｅｎｎ
１ｃａ、　　Ｄ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０ユ２１４
、　（前出）に記載のＴＰＡの塩基配列と一致する。

このようにして得られるＴＰＡをコードするｃＤＮＡ配
列を用いて、　ＴＰＡ誘導体調製の基本となるＴＰＡ発
現ベクターが構築され得る。

（ＩＩ）発現ベクターの構築 天然型ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１およびＴ
ＰＡ銹導体発現ベクターの構築を１次に示す。

（ＩＩ−Ａ）天然型ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ
−１の構築プラスミドベクターｐｓＶｓａｌ　Ｔ　（特
開昭６２−１４７８３号公報、前出）、上記ベクターｐ
ｓＶｅＰＡ−１に含まれるｇＤＮＡおよび上記ＴＰＡの
ｃＤＮＡを使用して、　　ＴＰＡ発現ベクターｐＳ’／
ｅＣＰＡ−１が構築され得る。つまり、　ＴＰＡ発現ベ
クターｐｓＶｅｃＰＡ−１は、下記の■〜■の３つのＤ
ＮＡ断片を連結することにより構築される。この発現ベ
クターの構築の概略を第１図に示す。

■ｐｓＶｅｓａｌ　ＩのＨｉｎｄ■−Ｈ４ｎｄｕ断片ニ
ブラスミドベクターｐｓＶｅｓａｌ　Ｉ　（特開昭６２
−１４７８３号公報、前出）を制限酵素Ｎｃｏ　Ｉで切
断し、大きい方のＤＮＡ断片（瞼Ｉ−匹Ｉ断片、約４．
７ｋｂ）を単離し、　Ｔ４　ＤＮＡリカーセにより環状
化して得られるプラスミドベクターｐｓＶｅｓａｌ　Ｉ
　−Ｈｉｎｄｍを、　Ｈｉｎｄｍにて切断して得られる
大きい方のＤＮＡ断片（約４．７ｋｂ）。

■ｐＳＶｅＰＡ−１の）Ｉｉｎｄｍ　−ＬＩｌ、Ｌ　Ｕ
断片：上記ｇＤＮＡ利用ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅＰ
Ａ−１をＨｊｎｄ　Ｉ［Ｉおよび１■で切断して得られ
る小さい方のＤＮＡ断片（約１．９ｋｂ）。

２１− ２ ■ｐｃｔ＋７９の飢ＩＴ−Ｈｉｎｄｍ断片：上記ｃＤＮ
ＡクローンｐＣＨ７９を１■およびＨｉｎｄＩＩＩで切
断して得られる。

ＴＰＡ　ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（約２　ｋｂ）。

このようにして構築されたＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅ
ＣＰＡ−１は、　ＴＰＡ遺伝子の上流にＳＶ４０ウィル
スの初期プロモーターがＴＰＡ遺伝子が発現可能な位置
および方向で存在しており、動物細胞に導入された場合
ＴＰＡを生産し得るように設計されている。ブロモター
としては、　　ＳＶ４０以外にもＴＰＡ遺伝子を発現し
得るプロモーターのいずれが利用され得る。

（ＴＩ−Ｂ）フィンガー領域が修飾されたＴＰＡ誘導体
発現ベクターの構築 ＴＰＡのフィンガー領域内のい（つかのアミノ酸が置換
されたアミノ酸置換体（ＴＰＡ誘導体）を調製するには
、　　（ｂ）ＴＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列に対して合成りＮＡブライマーを利用して変異を導
入する；（２）合成りＮＡを直接利用してカセット式に
変異を導入する；などの方法がある。ＴＰＡのｃＤＮＡ
に対して（２）の方法を採用する場合１合成するＤＮＡ
配列は、　ｃＤＮＡ全部であっても一部（変異が導入さ
れる部分）のみであってもよい。一部のみを合成する場
合には、適当な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）お
よびＴ４　ＤＮＡリガーゼを使用することにより２本来
のｃＤＮＡ配列の一部分を合成りＮＡと置き換えること
ができる。例えば２次に示すようなアミノ酸置換が導入
された１２種類のＴＰＡ銹導体ＰＮＩ、　ＰＮ２、　Ｐ
Ｎ３．　ＤＳＬ、　ＳＤＩ、　Ｓｎ２．　Ｓｎ３．　Ｓ
ｎ２．　Ｓｎ５．　Ｓｎ６．　ＳＤＩおよびＳｎ８を生
産するためには、該アミノ酸置換部分をコードするＤＮ
Ａ配列を合成し、これを天然型ＴＰＡのｃＤＮＡ配列の
相当する部分と置き換えた発現ベクターを構築すればよ
い。

ＰＮＩ：ＴＰＡのアミノ酸配列Ｎ末端から７番目のアル
ギニンがリジンに、８番目のアスパラギン酸がリジンに
、そして９番目のグルタミン酸がリジンにそれぞれ置換
さ九たＴＰＡ誘導体； ＰＮ２：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から１０番目の
リジンがグルタミン酸に、１１番目のスレオニンがバリ
ンに、１２番目のグルタミンがセリンに、１３番目のメ
チオニンがセリンに、そして１４番目のイソロイシン、
ロイシンがセリンにそれぞれ置換されたＴＰＡ誘導誘導
− ３− 体； ＰＮ３：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から１５番目の
チロシンがフェニールアラニンに、１６番目のグルタミ
ンがセリンに、１７番目のグルタミンがセリンに、１８
番目のヒスチジンがグルタミン酸に、そして１９番目の
グルタミンがセリンにそれぞれ置換されたＴＰＡ誘導体
； ＤＳＬ：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目の
セリンがバリンに、２９番目のアスパラギンがセリンに
、　　３０番目のアルギニンがグルタミン酸に、３１番
目のバリンがセリンに、３２番目のグルタミン酸がリジ
ンに、そして３３番目のチロシンがアスパラギンにそれ
ぞれ置換されたＴＰＡ誘導体；ＳＤＩ：ＴＰＡのアミノ
酸配列のＮ末端から、３７番目アスパラギンがセリンに
、３８番目のセリンがバリンに、３９番目のグリシンが
バリンに、４０番目のアルギニンがグルタミン酸に、４
１番目のアラニンがセリンに、そして４２番目のグルタ
ミンがセリンにそれぞれ置換されたＴＰＡ誘導体： Ｓｎ２：　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目
のアスパラギンがロイシンに、　　３８番目のセリンが
バリンに、３９番目のグリシンがバリンに、４０番目の
アルギニンがイソロイシンに、４１番目のアラニンがバ
リンに、および４２番目のグルタミンがロイシンに置換
されたＴＰＡ誘導体； Ｓｎ３：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目の
アスパラギンがセリンに、３８番目のセリンがバリンに
、３９番目のグリシンがバリンに、４０番目のアルギニ
ンがイソロイシンに、４１番目のアラニンがセリンに、
そして４２番目のグルタミンがセリンに置換されたＴＰ
Ａ誘導体； Ｓｎ２：　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目
のアスパラギンがセリンに、３８番目のセリンがバリン
に、３９番目のグリシンがバリンに、４０番目のアルギ
ニンがイソロイシンに、、Ｈｌ目のアラニンがバリンに
、そして４２番目のグルタミンがセリンに置換されたＴ
ＰＡ誘導体； Ｓｎ５：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目の
アスハラキンカセリンに、　　３８番目のセリンがバリ
ンに、３９番目のグリシンがバリンに、　　４０番目の
ア２５− ２６− ルギニンがイソロイシン、ロイシンに、４１目のアラニ
ンがバリンに、そして４２番目のグルタミンがロイシン
に置換されたＴＰＡ誘導体；Ｓｎ２：ＴＰＡのアミノ酸
配列のＮ末端から３７番目のアスパラギンがフェニルア
ラニンに、　　３８番目のセリンがロイシンに、３９番
目のグリシンがフェニルアラニンに、４０番目のアルギ
ニンがバリンに、４１番目のアラニンがロイシンに、お
よび４２番目のグルタミンがフェニルアラニンに置換さ
れたＴＰＡ誘導体； Ｓｎ７：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目の
アスパラギンがバリンに、３８番目のセリンがフェニル
アラニンに、３９番目のグリシンがロイシンに。

４０番目のアルギニンがフェニルアラニンに、４１番目
のアラニンがイソロイシンに、および４２番目のグルタ
ミンがバリンに置換されたＴＰＡ誘導体；Ｓｎ２：　Ｔ
ＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３７番目のアスパラギ
ンがセリンに、３８番目のセリンがバリンに、３９番目
のグリシンがバリンに、　　４０番目のアルギニンがグ
ルタミン酸に、　　４１番目のアラニンがフェニルアラ
ニンに、および４２番目のグルタミンがセリンに置換さ
れたＴＰＡ誘導体。

上記ＴＰＡ誘導体のうちＰＮＩ、　ＰＮ２およびＰＮ３
を生産するための発現ベクターｐｓＶｅＰＮ１．　Ｉ）
ＳＶｅＰＮ２およびｐＳＶｅＰＮ３は、それぞれ以下の
■〜■の３つのＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用
いて連結することにより構築され得る。この発現ベクタ
ーの構築の概略を。

ｐｓＶｅＰＮｌを例にして第２図に示す。

■合成りＮＡ断片：各ベクターについて２種類ずつの２
次に示すようなりＮＡ配列を有する１本鎖の合成りＮＡ
断片。この各ベクターについて２種類ずつの１本鎖ＤＮ
Ａは、互いに相補的であり２発現ベクターの構築に先立
って常法によりアニールされ、２本鎖ＤＮＡとして使用
される。

（以下余白） ２７− ２８− ＰＮＩ用合成りＮＡ配列： ５　ＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡｑＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧ
ＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡ、ＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＴＡＣ
ＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＡＴＧ　３５°ＡＣＴＧ
ＡＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＴＴ
ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴ
ＡＡ　３“ ＰＮＺ用合成りＮＡ配列： ５　ＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡ
ＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣ
ＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＡＴＧ　３゜５　’　Ａ　
ＣＴＧＡＴＧＴＴＧ　ＣＴＧ　Ｇ　ＴＡ　ＧＧ　ＡＧＧ
Ａ　ＧＧ　ＡＧＡ　ＣＣＴＣＴＴＣＡＴ　ＣＴＣＴＧ　
ＣＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡ　３′ ＰＮＳ用合成りＮＡ配列： ５　ＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡ
ＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＣＴ
ＣＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧ　３５°ＡＧＧＡＣ
ＴＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＴＴＴ
ＴＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡ
Ａ　３゜ ■ｐｓＶｅｃＰＡ−１のＮｌａｍ−ＮａｒＩ断片：上記
（ＩＩＩ−Ａ）項で得られたＴＰＡ発現ベクターｐｓＶ
ｅｃＰＡ−１を１ｊｌｌＴおよびＮａｒ　Ｉで消化して
得られる小さい方のＤＮＡ断片（約０．３３ｋｂ）を、
　　ＴＰＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列の２５０番
目付近を切断するＮ１ａｌｌｌで消化して得られるＤＮ
Ａ断片（約２６５ｂｐ）。

■ｐｓＶｅｃＰＡ−１のＢ２４　ＩＴ　−Ｎａｒ　Ｉ断
片：上記（ＩＩ−Ａ）項で得られるＴＰＡ発現ベクター
ｐｓＶｅｃＰＡ−１を、しば■およびＮａｒ　Ｉで消化
して得られる大きい方のＤＮＡ断片（約８．　Ｉｋｂ）
。

このようにして■〜■のＤＮＡ断片を連結して構築され
た３種のＴＰＡ誘導体発現ベクター、　ｐｓＶｅＰＮｌ
。

ｐＳ’／ｅＰＮ２およびｐＳＶｅＰＮ３は、それぞれＥ
、　ｃｏｌｔ　Ｄ旧株（ＡＴＣＣ３３８４９）に導入さ
れて形質転換体が得られた。

上記ＴＰＡ誘導体のうち、　　ＤＳＬを生産するための
発現ベクターｐｓＶｅＤｓ１は、以下の■〜■の４つの
ＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結するこ
とにより構築され得る。この発現ベクターの構築の概略
を、第３図に示す。

０合成りＮＡ断片二次に示すようなりＮＡ配列を有する
１本鎖の合成りＮＡ断片２種類。この２種類の１本鎖Ｄ
ＮＡは、互いに相補的であり１発現ベクターの構築に先
立って常法によりアニールされ、２本鎖ＤＮＡとして使
用される。

２９− ０ Ｉ）３１用合成１）ＮＡ配列： ５’ＴＣＴＴＧＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣ３’５’Ｔ
ＣＡＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡ　３■ｐｓ
ＶｅｃＰＡ−１の頴ＩＴ　−Ｄｄｅ　ｒ断片：上記（Ｉ
Ｉ−Ａ）項で得られたＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣＰ
Ａ−１を阻■およびＮａｒ　Ｉで消化して得られる小さ
い方のＤＮＡ断片（約０．３３ｋｂ）を、　　ＴＰＡを
コードするｃＤＮＡの塩基配列の２７０番目付近を切断
するＤｄｅＩで消化して得られるＤＮＡ断片（約８０ｂ
ｐ）。

■ｐＳ’／ｅＣＰＡ−１のニＩ　−Ｎａｒ　Ｉ断片：０
項の１■Ｎａｒ　Ｉ断片（０，３３ｋｂ）を、　　ＴＰ
ＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列の２９０番目付近を
切断する石工で消化して得られるＤＮＡ断片（約２３０
ｂｐ）。

■ｐＳＶｅＣＰＡ−１の１１Ｉ　−Ｎａｒ　Ｉ断片：上
記（ＩＦ−Ａ）項で得られるＴＰＡ発現ベクターｐＳＶ
ｅＣＰＡ−１を、Ｉｎおよび励工■で消化して得られる
大きい方のＤＮＡ断片（約８．１ｋｂ）。

このようにして■〜■のＤＮＡ断片を連結して構築され
たＴＰＡ誘導体発現ベクター、　ｐｓＶｅＤｓｌは、Ｅ
Ｃｏｌｉ　Ｄ旧株　（ＡＴＣＣ３３８４９）に導入され
て形質転換１− 体が得られた。

上記発現ベクターにより生産され得るＴＰＡ誘導体ＰＮ
Ｉ　　ＰＮ２　　ＰＮ３およびＤＳＬのＮ末端付近の配
列を天然型ＴＰＡと比較して第６図に示す。

上記ＴＰＡ誘導体のうち、　　ＳＤＩ、　ＳＣ２，ＳＣ
３，ＳＣ２゜Ｓｎ２　　ＳＣ６，ＳＣ７およびＳｎ２を
生産するための発現ベクターｐｓＶｅｓＤ１．　ｐＳＶ
ｅＳＤ２．　　ｐｓＶｅｓＤ３．　　ｐｓＶｅｓＤ４．
　　ｐｓ’／ｅＳＤ５．　　ｐＳＶｅＳＤ６．　　ｐＳ
ＶｅＳＤ７．　　およびｐｓＶｅｓＤ８は、それぞれ以
下の■〜０の４つのＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーセ
を用いて連結することにより構築され得る。

この発現ベクターの構築の概略を、　　ｐＳＶｅＳＤ８
を例にして第４図に示す。

０合成りＮＡ断片：各ベクターについて２種類ずつの２
次に示すようなりＮＡ配列を有する１本鎖の合成りＮＡ
断片。この各ベクターについて２種類ずつの１本鎖ＤＮ
Ａは、互いに相補的であり１発現ベクターの構築に先立
って常法によりアニールされ、２本鎖ＤＮＡとして使用
される。

（以下余白） ３２− ＳＤＩ用合成りＮＡ配列： ５’ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴ　３゜５°ＡＴＴＧＣＴＧＧ
ＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣ
ＡＣＴＣＡ　３゜ＳＤ２用合成りＮＡ配列： ５°ＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３゜５°ＡＣＴＧＣＴＧＧ
ＴＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣ
ＡＣＴＣＡ　３゜ＳＤ３用合成りＮＡ配列： ５’　ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＣＡ
ＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３’５°ＡＣＴＧＣＴＧ
ＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣ
ＣＡＣＴＣＡ　３”ＳＤｄ用合成りＮＡ配列： ５°ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３゜５°ＡＣＴＧＣＴＧＧ
ＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣ
ＡＣＴＣＡ　３ＳＤ５用合成りＮＡ配列： ５”　ＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＡ
ＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３゜５’　ＡＣＴＧＣＴ
ＧＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＧ
ＣＣＡＣＴＣＡ　３”ＳＤＳ用合成りＮＡ配列： ５’　ＧＴＧＧＣＡＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＧ
ＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３５°ＡＣＴＧＣＴＧＧ
ＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＣ
ＡＣＴＣＡ　３ＳＤ７用合成りＮＡ配列： ５’　　ＧＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡ
ＧＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　　３’５°　ＡＣＴＧ
ＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＴＣ：ＣＴＧＴＴＣＡＴＴＧＴ
ＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡ　　３゜ＳＤ８用合成りＮＡ配列
： ５　　ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡ
ＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴ　３５”　ＡＴＴＧＣＴＧ
ＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＣ
ＣＡＣＴＣＡ　３゜■ｐｓＶｅｃＰＡ−１のＢＨＩ　Ｉ
Ｉ　−Ｓｇ２．　Ｉ断片：上記（ＩＩ−Ａ）項で得られ
たＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣＰＡ−１を虱■および
Ｎａｒ　Ｉで消化して得られる小さい方のＤＮＡ断片（
約０．３３ｋｂ）を、　　ＴＰＡをコードするｃＤＮＡ
の塩基配列の２９０番目付近を切断する事■で消化して
得られるＤＮＡ断片（約１００ｂｐ）。

＠１ｐｓＶｅｃＰＡ−１のＤｒａＩＩＩ　−Ｎａｒ　Ｉ
断片：０項の１■ＮａｒＩ断片（０，３３ｋｂ）を、　
　ＴＰＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列の３２０番目
付近を切断するＤｒａＴＩＩで消化して得られるＤＮＡ
断片（約２００ｂｐ）。

ＱｐＳＶｅＣＰＡ−１のＢＢｑ　ＩＩ　−Ｎａｒ　Ｉ断
片：上記（ＩＩ−Ａ）項で得られるＴＰＡ発現ベクター
ｐｓＶｅｃＰＡ−１を、ＩＩＩおよびυ、ｒｌで消化し
て得られる大きい方のＤＮＡ断片（約８．１ｋｂ）。

３ ４− このようにして■〜０のＤＮＡ断片を連結して構築され
た８種ノＴＰＡ誘導体発現ベクター　、　ｐｓＶｅｓＤ
］、。

ｐｓＶｅｓＤ２．　ｐｓＶｅｓＤ３．　ｐｓＶｅｓＤ４
．　ｐＳＶｅＳＤ５．　ｐｓＶｅｓＤ６ｐｓＶｅｓＤ？
およびｐｓＶｅｓＤ８は、それぞれＥ、　ｃａｌｆ　Ｄ
ＨＩ株　（ＡＴＣＣ３３８４９）に導入されて形質転換
体が得られた。これらは工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。それぞれの受託番号を以下に示す
： ベクター：　　　名称　　　（受託番号）ｐｓＶｅｓＤ
２：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩ　ＳＤ２］０　（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１１２４４）ｐＳＶｅＳＤ３：　Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ　ＤＨＩ　５Ｄ３２９　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１２４５
）ｐｓＶｅｓＤ４：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩ　５Ｄ４
５９　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０８２）ｐｓＶｅｓＤ５：
　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩ　５Ｄ５７９　（ＦＥＲＭ　
Ｐ−１１２４７）ｐＳＶｅＳＤ６：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　
ＤＨＩ　５Ｄ６７　　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１２４３）ｐ
ＳＶｅＳＤ７：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩ　５Ｄ７１６
　（ＦＥＢＭ　Ｐ−１１２４８）ｐｓＶｅｓＤ８：　Ｅ
、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩ　５Ｄ８１３　（ＦＥＢＭ　Ｐ−
１１２４９）（ＩＩＩ）ニニ左二汰伍王 発現ベクターを動物細胞に導入して得られる形質転換体
を選択するための選択マーカー遺伝子としては、　　Ｅ
ｃｏｇｐｔ　（Ｍｕｌｌｊｇａａｎ、　　Ｒ，Ｃ，ら、
　　５ｃｉｅｎｃｅ。

５ 幻１　１４２２（ｂ９８０））、　　ｎｅｏ　（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ、　　Ｐ、Ｊ、ら。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　　Ｌ３２７（ｂ
９８２））　、　　ｄｈｆｒ　（Ｗｉｇｌｅｒ、　　Ｍ
、ら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　　７７、　３２７
（ｂ９８０））などの遺伝子が用いられる。これらのマ
ーカー遺伝子は、　　ＴＰＡｍ導体発現ベクターに含ま
れていても、該ベクター以外のプラスミドに含まれてい
てもよい。後者の場合は１選択マーカー遺伝子を有する
プラスミドベクターを構築し、　　ＴＰＡ発現ベクター
と適当な割合で混合して使用することにより、形質転換
体のスクリーニングがなされ得る。例えば、　　ｎｅｏ
およびｄｈｆｒ遺伝子を有するマーカーベクターｐｓＶ
２ｎｅｏ−ｄｈｆｒが好適に使用され、該ベクターは次
のように構築される。ｄｈｆｒ遺伝子を有するｒＤＮＡ
ベクターｐＳＶ２ｄｈｆｒ（アメリカン　タイプカルチ
ャー　コレクション、　　ｒＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　
３７１４６）をハｔｕＨで切断したハ胆ＩＩ−ＰｖｕＨ
断片と、　　ＢａｍＨＩリンカ−ｄ　（ｐＣＧＧＡＴＣ
ＣＧ）とをＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結しテベクターｐ
ｓＶ２Ｂｄｈｆｒを構築する。このベクターをＢａｍＨ
Ｉ切断したＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片と、　　ｒＤＮ
ＡベクターｐＳＶ２ｎｅｏ　（アメ＝３６− リカン　タイプカルチャー　コレクション、　　ｒＤＮ
ＡＶｅｃｔｏｒｓ　３７１４９）をＢａｍＨＩで切断し
て得たＢａｍＨＩＢａｍＨＩ断片とをＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼで連結することにより、環状のマーカーベクターｐ
ｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆ　ｒが構築される。

（ＴＶ）　　　　　　　の≦　　　およびＴＰＡ　　　
　の」 宿主細胞としては動物培養細胞が用いられ、　　ＣＨ（
ｂ−Ｋ１．　（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）株が好適に用い
られる。このような動物培養細胞を用いることにより、
　　ＴＰＡ誘導体はグリコジル化されて生産される。

動物細胞への発現ベクターＤＮＡの導入法としては。

トランスフェクション効率に差はあるが、リン酸カルシ
ウム法（Ｗｉｇｌｅｒ、　　Ｍ、ら、　　Ｃｅ１ｌ、　
　１１．、　２３３（ｂ９７７））　、？イクロイソロ
イシン、ジェクション法（Ａｎｄｅｒｓｏｎ。

Ｗ、　　Ｆ、ら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａ
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、、　　′ｉ：！Ｊ５
３９９（＋９８９））　、　　リポゾーム法、　　ＤＥ
ＡＥ−デキストラン１法また：Ｊ細胞融合法（５ｃｂｏ
ｆｆｎｅ、ｒ、　　Ｗ、ら、　　Ｐｒｏｅ、　　Ｎ（＋
　１　、　　ハｃａｄ、　　Ｓｅｉ、　　ＵＳＡ、、　
　７７、　２１６３（ｂ９８０））、　　電気導入試（
達家雅明ら、細胞工学、　６．　４９４（ｂ９８７））
などが利用され得る。このような方法によりＴＰＡ誘導
体発現ベクターを宿主細胞に導入した後、上記（ＩＩＩ
）項に述べたようなマーカー遺伝子によって獲得した形
質により形質転換体が選択され得る。

得られた形質転換体がＴＰＡ誘導体を生産するか否かは
、それぞれの形質転換体細胞の培養液中のプラスミノー
ゲン活性化活性（プラスミノーゲンを活性化させる活性
の度合）を測定することにより調べることができる。プ
ラスミノーゲン活性化活性は、プラスミノーゲン含有フ
ィブリン平板を用いる方法（Ｍａｃｋｉｅ、　Ｍ、ら、
　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＨｅｍａｔｏ
ｒｏｇｙ、　　４７．　７７（ｂ９８１））　＋　　プ
ラスミンの合成基質Ｓ−２２５１の分解を測定する方法
［Ａ１１ｅｎ、　　Ｒ，Ａ、およびＰｅｐｐｅｒ、　Ｄ
、　Ｓ、　、　　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　　４ｉ、４３（ｂ９８１）］　
、　ＣＬＴ法［Ｇａｆｆｎｅｙ、　　Ｐ、Ｔ、およびＣ
ａｒｔｉｓ、　Ａ、　Ｄ、　、　　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ
ｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ。

５３、　１３４（ｂ９８５）］、　　ＥＬＩＳＡ法　［
Ｈｏ１ｙｏｅｓｔ、　　Ｔ、ら。

Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉ
ｓ、　５３．６８４（ｂ９８５）］などにより測定され
得る。

（Ｖ）ＴＰＡ　　　　の　　および ７ −３８＝ ＴＰＡ誘導体生産株の培養は、宿主となる動物細胞株に
適した培養法により行われる。培養物からのＴＰＡ誘導
体の回収および精製は、　　ＣＰＧ−１０，キレ−ティ
ング　セファロース、　　Ｃｏｎ−Ａセファロース、イ
オン交換体、オクチルセファロース、セファデックスゲ
ルなどの各種担体を用いたカラムクロマトグラフィー、
抗体カラムクロマトグラフィー　電気泳動などを適宜組
み合わせて行うことが可能である。本発明においては、
各ＴＰＡ誘導体生産株の培養液２〜６Ｌから、それぞれ
約１〜３ｍｇのＴＰＡ誘導体精製物が得られた。

このようにして得られたＴＰＡ誘導体精製物のプラスミ
ノーゲン活性化活性は、上述の方法により測定され得、
フィブリン親和性はフィブリンクロットへの取り込みを
指標とするＣｏ１１ｅｎ、　Ｄ　　ら。

Ｂｌｏｏｄ、７１２１６（ｂ９８８）の方法により、イ
ソロイシン、ビトロでの血栓溶解能は１２５Ｉ−フィブ
リンからの放射能の遊離を指標とするＬａｒｓｅｎ、　
　Ｇ、　Ｒ，らの方法、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　　２６３．　１０２３（＋９８８＞、　
　あるいは、　　Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｄ３９ らの方法、　　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、、５
２．３０８（ｂ９８４）に従って測定され得る。活性の
フィブリン依存性またはプラスミノーゲン活性化活性は
、プラスミンの合成基質Ｓ−２２５１を利用するＣｏ１
１ｅｎ、　　Ｄ、ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　
２５７．２９１２（ｂ９８２）、（前出）の方法あるい
は。

Ｔａｋａｄａ、　Ａ、らの方法、　　Ｈａｅｍｏｓｔａ
ｓｊｓ、　　１８．　１１７（ｂ９８８）に従って測定
され得る。そして、血中持続性は。

Ｂｅｅｂｅ、　　Ｄ、Ｐ、ら（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　４　６６３（ｂ９８６））　、
またはＭａｔｔｓｏｎ、　　Ｃｈ、ら（Ｔｈｒｏｍｂｏ
ｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　３０．　９１　（ｂ９
８３））に記載の方法により血中半減期として測定され
得る。

血栓の溶解にかかわる種々の性質としては、比活性、フ
ィブリン親和性、活性のフィブリン依存性、プロテアー
ゼ抵抗性、血中持続性、プラスミノーゲン活性化活性、
イソロイシン、ビトロ血栓分解能、阻害剤に対する感受
性などが挙げられる。本発明のＴＰＡ誘導体の血栓溶解
性は天然のＴＰＡとほぼ同等であり、かつ天然のＴＰＡ
よりもはるかに優れた血中持続性を示す。このような性
質は、後述の実施例により明らかにされる。

４０− （実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

本発明に係わる諸実験は、内閣総理大臣の定める［組換
えＤＮＡ実験指針］に従って行った。実施例中のファー
ジ、プラスミド、　　ＤＮＡ、　　種々の酵素、大腸菌
などを扱う詳しい諸操作は、以下の雑誌、成帯を参考と
した。

１、蛋白質核酸酵素、　　２６（４）、　　（ｂ９８１
，）、　　臨時増刊「遺伝子操作」　（共立出版） ２、遺伝子操作実験法、高木康敬編著（ｂ９８０）。

講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（ｂ９８２）
、講談社 ４、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ　ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｍｕａｌ。

Ｔ、　　ＭａｎｉａｔｉｓらＢ（ｂ９８２）、　　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ５、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、　　Ｌ、Ｇｒｏｓｓｍａｍら編。

６５（ｂ９８０）　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ６
、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
　　Ｒ，Ｗｕ編、　６５　（ｂ９７９）。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ 実ｍ 天然型ＴＰＡをコードするＤＩＪＡ配列を、以下のよう
にしてｃＤＮＡから調製した。

まず、グアニジンーホッＩ−フェノール法に準じ。

染色体ＤＮＡ　（ｇＤＮＡ）利用ＴＰＡ発現ベクターｐ
ＳＶｅＰＡ１（特開昭６２−１４７８３号公報、前出）
が導入されたＣＨＯ−ＫＬ細胞から全ＲＮＡを抽出した
。この全ＲＮＡ抽出物をオリゴｄＴセルロースクロマト
グラフィーに供し。

得られたポリＡ＋ｍＲＮＡ画分をショ糖密度勾配遠心法
により分子量分画し、　　ＴＰＡのｍＲＮＡを含む両分
を得た。

このｍＲＮＡ画分を市販のｃＤＮＡ合成キット（アマジ
ャム社）に供してｃＤＮＡを合成し、これを用いてｃＤ
ＮＡライブラリーを作成した。このｃＤＮＡライブラリ
ーの作成には、市販のλｇｔｌｏ利用ｃＤＮＡクローン
ニングキット（アマジャム社）を用いた。次いで、この
ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーショ
ンを常法により行った。それには、ブロー７として、上
記発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１を制限酵素ｘｂａｌで
切断して得られ、第１０．　１１および１２エクソン１ 〜４２− を含む約２．５ｋｂのＤＩＩＡ断片を用い、該ＤＮＡ断
片とハイブリダイズした陽性ファージクローンを選択し
た。

得られたいくつかの陽性ファージクローンからそれぞれ
ＤＮＡを単離し、制限酵素ＢｉｎｄＩＩＩ　（宝酒造（
株）製）で消化した後、アガロースゲル電気泳動を行っ
た。その後、上記プラークハイブリダイゼーションに用
いたのと同じＸｂａＩ切断２．５ｋｂ　ＤＮＡ断片をプ
ローブとして用いたサザンハイプリダイゼーションを行
うことにより、陽性ファージクローンを解析した。その
結果、　　ＣＨ７９と命名したクローンには、上記プロ
ーブとハイブリダイズし、　　Ｈｉｎｄｍで約２．２ｋ
ｂに切断されるＤＮＡ断片が含まれていることが分かっ
た。この約２．２ｋｂの旧ユｄｌ］Ｔ切断ＤＮＡ断片を
アガロース電気泳動法にて単離した後、同じく１１ｉｎ
ｄｍで消化したプラスミドベクターｐＵＣ１９（宝酒造
（株）製）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸
菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｄ旧株に導入してｃＤＮＡクロ
ーンｐＣ１１７９を得た。このｐＣＨ７９のｃＤＮＡ部
分の塩基配列を。

Ｍ２Ｓ法を利用した市販のキット（宝酒造（株）製）に
より決定した。その結果、このｃＤＮＡ部分の５°末端
４３− はプラスミドベクターｐＵｃ１９由来のＨｉ　ｎ　ｄ　
ｍ認識部位に連結されており、そこから約１５０ｂｐ下
流には石佳■の認識部位が存在し、その下流的１５００
ｂｐには終止コドンＴＧＡが存在することがわかった。

さらに。

このＴＧＡコドンから約４１０ｂｐ下流には、プラスミ
ドベクターｐＵｃ１９由来の旧ｎｄｍ認識部位が存在し
ていた。このｃＤＮＡ部分の塩基配列は、５８４番目の
ＣがＴに、そして１７２５番目のＡがＣであったことを
除いては、　　Ｐｅｎｎ１ｃａら（Ｎａｔｕｒｅ、　３
０１．２１４；前出）が報告したＴＰＡの塩基配列と一
致していた。

（ｎ）　　現ベクターの ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１およびＴＰＡ誘
導体発現ベクターを以下のようにして構築した。

（Ｉ［−Ａ）　ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１
の構築ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１を、下記
の０〜０項で得られる３つのＤＮＡ断片を連結すること
により構築した。この発現ベクターの構築の概略を第１
図に示す。

■ｐｓＶｅｓａｌ　Ｉ由来のＨｉｎｄｕ　−Ｈｉｎｄｕ
断片プラスミドベクターｐｓＶｅｓａｌ　Ｉ　（特開昭
６２−１４７８３４４− 号公報、前出）を制限酵素Ｎｅｏ　Ｉで切断し、約４．
７ｋｂの大きい方のＤＮＡ断片（Ｎｅｏ　Ｉ　−Ｎｅｏ
　Ｉ断片）を単離した。このＤＮＡ断片は、　　ＳＶ４
０由来の大腸菌内での複製起点（ＯＲ＋、）を含む初期
プロモーター領域（ＳＶｅ）　；ポリアデニル化シグナ
ルを含む配列（ＰｏｌｙＡ）　；アンピシリン耐性遺伝
子（ＡＭＰ、）　；および２箇所のＨｉｎｄＩＩＩ認識
部位を有する。このＮｃｏＩ−進遼Ｉ断片をＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼにより環状化して得られたプラスミドベクタ
ーをｐｓＶｅｓａｌ　Ｉ　−ＨｉｎｄＩＩＩと命名し。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｄ１株に導入して増幅させた。次に、
Ｌｃｏｌｔ　ＤＨＩ株から常法によりプラスミドベクタ
ーｐｓＶｅｓａｌ　Ｉ　−Ｈｉｎｄｍを単離し、　　Ｂ
ｉｎｄｍにて切断して約４．７ｋｂの大きい方のＤＮＡ
断片（旧ユｄＩＩＩ−坦工ｄｍ断片）を得た。

■ｐｓＶｅＰＡ−１のＨｉｎｄｍ　−１］Ｉ断片」１記
のｇＤＮＡ利用ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＰＡ−１を
旧１ｄｌＩＴおよび１ｌｌＩで切断し、約１．９ｋｂの
小さいＤＮＡ断片く旧ｎｄ　ｍ　−ＬＬＬ　ＩＩ断片）
を得た。この旧旦ｄｍ旺↓■断片は、　　ＴＰＡをコー
ドするｇＤＮＡの第２エクソン全部および第３エクソン
の一部を含む。

■ｐＣＨ７９の１１１−　ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片上記（Ｉ
）項で得られたＴＰＡのｃＤＮＡクローンｐＣＨ７９を
１■およびＨｉｎｄｍで切断し、　　ＴＰＡ　ｃＤＮＡ
を含む約２ｋｂのＤＮＡ断片（ＢＢＩ　ＩＩ　−Ｈｉｎ
ｄｍ断片）を得た。

上記■〜■のＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い
て連結することによりＴＰＡ発現ベクターを構築し、こ
れをｐｓＶｅｃＰＡ−１と命名した。このｐＳＶｅＣＰ
Ａ−１を、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＨＩ株に導入して、以下のＴＰＡ誘導体発
現ベクターの構築に用いた。このＴＰＡ発現ベクターｐ
ｓＶｅｃＰＡ−１は天然型ＴＰＡをコードする遺伝子を
有しており。

ｇＤＮＡ由来部分（第１図中の番号２で示される第２エ
クソンから９番号３で示される第３エクソンの１■認識
部位まで）と、　　ｃＤＮＡ由来部分とを含む。

（ＩＩ　−Ｂ）　ＴＰＡ誘導体発現ベクターの構築天然
型ＴＰＡのアミノ酸配列中に２表１から３に示すような
アミノ酸置換が導入された１２種類のＴＰＡ誘導体を、
それぞれＰＮＩ、　ＰＮ２．　ＰＮ３．　ＤＳＬ、　Ｓ
ＤＩ、　Ｓｎ２゜Ｓｎ２．　　Ｓｎ４．　　Ｓｎ５．　
　Ｓｎ６．　　Ｓｎ２およびＳＣ２と命名した。

（以下余白） ＝４５− ４６ −Ｌ＋’？− これらのＴＰＡ誘導体を得るための発現ベクターｐｓＶ
ｅＰＮ１．　ｐｓＶｅＰＮ２．　ｐｓＶｅＰＮ３．　ｐ
ｓＶｅＤｓｌ、　ｐｓＶｅｓＤ１ｐｓＶｅｓＤ２．　ｐ
ｓＶｅｓＤ３．　ｐｓＶｅｓＤ４、ｐＳＶｅＳＤ５．　
ｐＳＶｅＳＤ６゜ｐｓＶｅｓＤ？およびｐｓＶｅｓＤ８
を２次の方法により構築した。

上記発現ベクターのうち、　　ｐｓＶｅＰＮｌ、　ｐｓ
ｌ／ｅＰＮ２およびｐｓＶｅＰＮ３は、以下の■〜■項
で得られる３つのＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを
用いて連結することにより構築した。

■合成りＮＡ断片 各ＴＰＡ誘導体発現ベクターの構築に使用する１本鎖Ｄ
ＮＡを、各ベクターについて２種類ずつｒ　　ＤＮＡ合
成機（３８ＬＡ　ＤＮＡシンセサイザー　アプライド　
バイオシステムズ）を用いて合成した。この合成りＮＡ
の配列を次に示す。この２種類の１本鎖ＤＮＡは互いに
相補的であり１発現ベクターの構築に先立って常法によ
りアニールし、２本鎖ＤＮＡとして使用した。

（以下余白） ＝５０＝ ＰＮ１用合成りＮＡ配列； ５°ＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧ
ＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＴＡＣＣ
ＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＡＴＧ　３５　’　Ａ　Ｃ
ＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＧ　ＴＡＴＡ　ＴＣＡ　ＴＣＴ
ＧＣＧ　ＴＴＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＴＧ　ＣＡＧ
ＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡ　３ ＰＮＺ用合成りＮＡ配列： ５°ＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡ
ＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣ
ＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＡＴＧ　３’５’　Ａ　Ｃ
ＴＧ　ＡＴＧＴＴＧＣＴＧＧ　ＴＡＧＧ　ＡＧＧ　ＡＧ
ＧＡＧＡ　ＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧ　ＣＡＧＡＴ
ＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡ　３ ＰＮ３用合成りＮＡ配列： ５”ＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡ
ＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＣＴ
ＣＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧ　３゜５’　Ａ　Ｇ
ＧＡ　ＣＴＣＡ　ＧＡＧＧＡ　ＧＡＡＴＡ　ＴＣＡ　Ｔ
ＣＴＧＣＧ　ＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧ　ＣＡＧＡ
ＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡ　３ ■ｐｓＶｅｃＰＡ−１のＮＩａＩＩＴ　−Ｎａｒ　Ｉ断
片上記（ＴＩ−Ａ）項で得られたＴＰＡ発現ベクターｐ
ＳｖｅＣＰＡ−１を職ユ■およびＮａｒ　Ｉで消化し、
小さい方のＤＮＡ断片（ｈ±■−匡■断片；約０．３３
ｋｂ）を得た。

この１■−塗工断片を、　　ＴＰＡをコードするｃＤＮ
Ａの５１− 塩基配列の２５０番目付近を切断する旧ａｌｌｌで消化
して、約２６５ｂｐのＮＩａＩＩＴ　−Ｎａｒ　Ｉ断片
を得た。

■ｐＳＶｅＣＰＡ−１の１１Ｉ　−Ｎａｒ　Ｉ断片上記
（ｎ−Ａ）項で得られたＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣ
ＰＡ−１を１■およびυ工Ｉで消化し、大きい方のＤＮ
Ａ断片（ｌｌｌ−匡Ｉ断片；約８．１ｋｂ）を得た。

このようにして得られた■〜■のＤＮＡ断片を連結して
、３種の発現ベクター（ｐｓＶｅＰＮＬ、　ｐｓＶｅＴ
’Ｎ２およびｐｓＶｅＰＮ３）を構築した。構築された
ＴＰＡ誘導体発現ベクターをそれぞれＥ、　ｃｏｌｔ　
ＤＨ１株（ＡＴＣＣ３３３４９）に導入し、形質転換体
を得た。

上記発現ベクターのうち、　　ｐｓＶｅＤｓｌ（ＤＳＬ
を発現する）は、以下の０〜０項で得られる４つのＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することによ
り構築した。

０合成りＮＡ断片 各ＴＰＡ誘導体発現ベクターの構築に使用する１本鎖Ｄ
ＮＡを、各ベクターについて２種類ずつ、　　ＤＮＡ合
成機（３８ＬＡ　ＤＮＡシンセサイザー、アブライドバ
イオシステムズ）を用いて合成した。この合成りＮＡの
５２− 配列を次に示す。この２種類の１本鎖ＤＮＡは互いに相
補的であり２発現ベクターの構築に先立って常法により
アニールし、２本鎖Ｉ）Ｎ　Ａとして使用した。

ＤＳＩ用合成りＮＡ配列： ５°ＴＣＴＴＧＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣ３゜５°Ｔ
ＣＡＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡ　３’■ｐ
ｓＶｅｃＰＪ’ｒｌの風Ｕ　−Ｄｄｅ　Ｉ断片上記（Ｔ
Ｊ−Ａ）項で得られたＴＰＡ発現ベクターｐＳｖｅＣＰ
Ａ−１をＩｎおよびＮａｒ　Ｉで消化し、小さい方のＤ
ＮＡ断片（頴■−用■断片；約０．３３ｋｂ）を得た。

このＢＢｑｌＩ−Ｎａ工■断片を、　　ＴＰＡをコード
するｃＤＮＡの塩基配列の２７０番目付近を切断するＤ
ｄｅＩで消化して、約８０ｂｐの１１１−ＤｄｅＩ断片
を得た。

■ｐｓＶｅｃＰＡ−１のＳｇ４　Ｉ　−Ｍａｒ　Ｉ断片
上記（Ｉｆ−Ｂ）０項で得られた約０．３３ｋｂの工Ｔ
ＩＮａｒ　Ｉ断片を、　　ＴＰＡをコードするｃＤＮＡ
の塩基配列の２９０番目付近を切断する鏡■で消化して
、約２３０ｂｐのジ上Ｉ−レエＩ断片を得た。

■ｐｓＶｅｃＰＡ−１のｍＴＩ−Ｎａｒ■断片上記（Ｉ
Ｔ−Ａ）項で得られたＴＰＡ発現ベクターｐＳｖｅＣＰ
Ａ−１をＩｎおよびＮａｒ　Ｉで消化し、大きい方のＤ
ＮＡ断片（ＬＬＬ　ＩＩ−用■断片：約８．１ｋｂ）を
得た。

このようにして得られた■〜■のＤＮＡ断片を連結して
１発現ベクター（ｐｓＶｅＤｓｌ）を構築した。構築さ
れたＴＰＡ誘導体発現ベクターをＥ、　ｃｏｕＤＨＩ株
（ＡＴＣｏ　３３８４９）に導入し、形質転換体を得た
。

上記発現ベクターのうち、　　ＳＤＩ、　ＳＣ２，ＳＣ
２，ＳＣ４゜ＳＣ５，Ｓｎ２．　ＳＣ７およびＳｎ２は
、以下の０〜０項の４つのＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結することにより構築した。

０合成りＮＡ断片 各ＴＰＡ誘導体発現ベクターの構築に使用する１本鎖Ｄ
ＮＡを、各ベクターについて２種類ずつ、　　ＤＮＡ合
成機（３８１Ａ　ＤＮＡシンセサイザー　アプライド　
バイオシステムズ）を用いて合成した。この合成りＮＡ
の配列を次に示す。この２種類の１本鎖ＤＮＡは互いに
相補的であり２発現ベクターの構築に先立って常法によ
りアニールし、２本鎖ＤＮＡとして使用した。

一５３＝ ５４− ＳＤＩ用合成りＮＡ断片： ５°ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴ　３５　ＡＴＴＧＣＴＧＧＴ
ＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＡ
ＣＴＣＡ　３ＳＤ２用合成りＮＡ配列： ５’　ＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣ
ＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３５°ＡＣＴＧＣＴＧＧ
ＴＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣ
ＡＣＴＣＡ　３’ＳＤ３用合成りＮＡ配列： ５°ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３５　　ＡＣＴＧＣＴＧＧ
ＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣ
ＡＣＴＣＡ　３゜ＳＤ４用合成りＮＡ配列： ５’　ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＡ
ＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３５　　ＡＣＴＧＣＴＧ
ＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣ
ＣＡＣＴＣＡ　３’ＳＤＳ用合成りＮＡ配列： ５°ＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３５　　ＡＣＴＧＣＴＧＧ
ＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣ
ＡＣＴＣＡ　３ＳＤ６用合成りＮＡ配列： ５°ＧＴＧＧＣＡＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＧＡ
ＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３’５　　ＡＣＴＧＣＴＧ
ＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣ
ＣＡＣＴＣＡ　３ＳＤＶ用合成りＮＡ配列： ５“ＧＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡ
ＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴ　３゜５’　ＡＣＴＧＣＴＧ
ＧＴＧＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＧＣ
ＣＡＣＴＣＡ　３’ＳＤＢ用合成りＮＡ配列： ５°ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴ　３５　　　ＡＴＴＧＣＴＧ
ＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＣ
ＣＡＣＴＣＡ　　３■ｐｓＶｅｃＰＡ−１のＩＩＩ　−
石１断片上記（ＩＩ−Ａ）項て得られたＴＰＡ発現ベク
ターｐｓＶｅＣＰＡ−１をＩｎおよびＮａｒ　Ｉて消化
し、小さい方のＤＮＡ断片（ＢＢｑ　ＩＩ−用Ｉ断片；
約０．３３ｋｂ）を得た。

このＢＢｑＩＩ−Ｎａ工Ｉ断片を、　　ＴＰＡをコード
するｃＤＮＡの塩基配列の２９０番目付近を切断する事
Ｉで消化して、約１００ｂｐのＢＢＩ　ＩＩ−Ｓｇｚ　
Ｉ断片を得た。

＠＋ｐｓＶｅｃＰＡ−１のＤｒａｍ　−Ｎａｒ　Ｉ断片
上記（ＩＩ−Ｂ）■項で得られた約０．３３ｋｂの１■
−Ｎａｒ　Ｉ断片を、　　ＴＰＡをコードするｃＤＮＡ
の塩基配列の３２０番目付近を切断するＤｒａ　ｍで消
化して、約２００ｂｐの因１■−助工■断片を得た。

ＱｐＳＶｅＣＰＡ−１のＢＢｑ　ＩＩ　−Ｎａｒ　Ｉ断
片上記（ｎ−Ａ）項で得られたＴＰＡ発現ベクターｐｓ
Ｖ５− ５６− ｅＣＰＡ−１を耽↓■およびレエＩて消化し、大きい方
のＤＮＡ断片（ＬＬＬ　ＩＩ　−Ｎａｒ　Ｉ断片；約８
．　Ｉｋｂ）を得た。

このようにして得られた■〜０のＤＮＡ断片を連結して
、８種の発現ベクター（ｐｓＶｅｓＤｌ、　ｐｓＶｅｓ
Ｄ２゜ｐｓＶｅｓＤ３．　ｐｓＶｅｓＤ４．　ｐｓＶｅ
ｓＤ５．　ｐＳＶｅＳＤ６．　ｐｓＶｅｓＤ７およびｐ
ＳＶｅＳＤ８）を構築した。構築されたＴＰＡ誘導体発
現ベクターをそれぞれＥ、　ｃｏｌｉ　Ｄ旧株（ＡＴＣ
Ｃ３３８４９）に導入し、形質転換体旦、岨ｉ１　ＤＨ
Ｉ　ＳＤＩ、　Ｅ、並Ｉｉ　ＤＨＩ　５Ｄ２１０．　Ｅ
、ニＤＨＩＳＤ３２９．　Ｅ、匹旦ＤＨＩＳＤ４５９．
　Ｅ、刈旦ＤＩ（Ｉ　５Ｄ５７９．Ｅ、姐且ＤＨＩ　５
Ｄ６７、Ｅ。

（ｍ）？−カーベクター５Ｖ２ｎｅｏ−ｄｈｆ　ｒの選
択マーカー遺伝子としてｎｅｏおよびｄｈｆｒ遺伝子を
有するマーカーベクターを２次のようにして構築した。

まず、　　ｄｈｆｒ遺伝子を有するｒＤＮＡベクターｐ
ｓＶ２ｄｈｆｒ（アメリカン　タイプカルチャー　コレ
クション、　　ｒＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　３７１４６
）を制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩで切断し、ハ世ＩＩ−Ｐｖｕ
ｌｌ断片を単離した。このハｒｕｎ　−Ｐ剋■断片と２
石ＨＩリンカーｄｃｐｃＧＧＡＴｃｃｃ）　　（宝酒造
（株）製）とをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し。

ベクターｐｓＶ２Ｂｄｈｆｒを構築し、　　Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　ＤＨＩ株に導入して増幅させた。このｐｓＶ２Ｂ
ｄｈｆｒを単離してＢａｍＨＩで消化し、　　ｄｈｆｒ
遺伝子を含む約２ｋｂのＢａｍＨＩＢａｍＨＩ断片をア
ガロースゲル電気泳動法により分離した。このし、ｍＨ
Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片と、　　ｒＤＮＡベクターｐｓＶ
２ｎｅｏ　（アメリカン　タイプカルチャー　コレクシ
ョン、　　ｒＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　３７１４９）を
ＢａｍＨＩで切断して得たＢａｍＨＩ　−ＢａｍＨＩ断
片とをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。このよ
うにして構築した環状のマーカーベクターを、　Ｅ、　
ｃｏｌｉ　ＤＬ株に導入した。

５７− ８ このマーカーベクターをｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒと命
名した。

このｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒは、　　ｎｅｏおよびｄ
ｈｆｒ遺伝子が同じ発現方向に挿入されている。

（ｒＶ）　　　培　　胞のン　　　およびＴＰＡ　　　
　の■ 宿主細胞として動物培養細胞ＣＨＯ−Ｋｌ　（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ６１）を選択し、　　Ｃｈｅｎ、　Ｃ，ら（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、　Ｌ２７４５（ｂ９８７＞）の方法に準じ。

上記（ＩＩ−Ｂ）項で得られた各ＴＰＡ誘導体発現ベク
ターを用いて形質転換を行った。各ＴＰＡ誘導体発現ベ
クターは、上記（ｍ）項で得られたマーカーベクターｐ
ＳＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆ　ｒと、　　（ＴＰＡ誘導体発現
ベクター：ｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒ＝　３００　：　
１　　（重量比）〕の割合で混合して用いた。このベク
ター混合物のリン酸カルシウム共沈殿物を、予め５％ウ
シ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＭＤ培地（ＭＣＤＢ３０２
　：ダルベッコ変法ＭＥＭ＝　１　：１、シグマ社）で
生育させたＣＨＯ−Ｋｌ細胞（５Ｘ１０５個細胞／ｌ０
ｍ１培地／直径１０ｃ＋ｎ培養皿）に加え。

１５時間培養した後に新しい培地に変えた。さらに４８
時間培養した後、培地を５％ＦＣ３，８００ｕ　ｇ／　
ｍ１９− Ｇ４１８硫酸塩（ギブコ社）、７ｍＭε−アミノカプロ
ン酸、５０ＭＭフォイバン（小野薬品工業）を含有する
ＭＤ培地に変えた。さらに約２週間培養を続けてＧ４１
８耐性株を分離した。０４１８耐性株を１２穴マルチデ
イツシー（リンブロー社製）に移して底面全体に生育さ
せ、上記ＭＤ培地で２４時間培養した。この培養液中に
含まれるＴＰＡ誘導体の含量を、プラスミノーゲン含有
フィブリン平板を用い、その活性を測定することによっ
て定量した（Ｍａｃｋｉｅ、　　Ｍ、ら。

Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏ
ｌｏｇｙ、　　４７．　７７（ｂ９８１））。

定量には、後述の（Ｖ）項に記述したように精製し、タ
ンパク定量されたＴＰＡ誘導体標品を用いた。

各形質転換体について、培養培地あたりのＴＰＡ誘導体
の生産量が０．５μｇ／ｍ１以上のものを選択した。

このように選択された形質転換体細胞は、　　ＭＤ無血
清培地（ＭＤ培地、　　７ｍＭε−アミノカプロン酸、
　　５０ＭＭフォイハン、　　１ｍｇ／ｍｌウシ血清ア
ルブミン、および５μｇ／ｍｌイソロイシン、シュリン
）においてもＴＰＡ誘導体を生産した。

（Ｖ）ＴＰＡ　　　　の口　および　１６０− 上記形質転換体により生産された各ＴＰＡ誘導体の回収
および精製を、以下のようにして行った。この工程にお
けるＴＰＡ抗原の検出には、市販のＥＬＩＳＡキット　
（ＩＭＵＢＩＮＤ　ＴＰＡ　ＥＬＩＳＡ　ＫＩＴ、　　
アメリカンダイアグツステイカ社製）を用いた。

（ＴＶ）項で上述したようなＭＤ無血清培地で形質転換
体を培養して得られる。　　ＴＰＡ誘導体を含む培養液
を、　　ＩＭＮａＣｌ、　　５０ＭＭフォイパンを含む
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したＣＰ
Ｇ−１０（エレクトロヌクレオニクス社製）カラムに通
し、平衡化に用いたのと同じ緩衝液で洗浄した。ＣＰＧ
−１０カラムを通過した培養液および洗浄液中のＴＰＡ
抗原を測定すると、各ＴＰＡ誘導体はほとんど検出され
ていないことがわかった。次いで、溶離液としてＩＭＮ
ａＣｌ、　　０．５ＭＫＳＣＮ、　　ＩＭε−アミノカ
プロン酸および５０ＭＭフォイバンを含有する２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）を用い、　　ＣＰＧ−１０
カラムからＴＰＡ誘導体を溶出した。この溶出液を、　
　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，０，０Ｌ％Ｔｗｅｅｎ８０および
５０ＭＭフォイバンを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，５）にて平衡化したＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　（ファルマシア社製）カラムにチャージした。平
衡化に用いたのと同じ緩衝液で洗浄した後、２ＭＫＳＣ
Ｎ、　０．４Ｍ　ａ−メチルマンノシド、　　０．０１
％Ｔｗｅｅｎ８０および５０ＭＭフォイパンを含有する
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）により溶出した。

このＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒ。

ｓｅカラムの通過液、洗浄液および溶出液中に含まれる
ＴＰＡ抗原をＥＬＴＳＡ分析したところ、各ＴＰＡ誘導
体はほとんどＣｏｎＡ−３ｅｐｈａ　ｒｏｓ　ｅカラム
に吸着し、溶出により溶出液中に回収されていることが
わかった。

次に、　　ＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出液
を、　　０．１５ＭＮａＣ１，０，０１％Ｔｗｅｅｎ８
０および５０ＭＭフォイバンを含有する２０ｍＭ！Ｊン
酸緩衝アンｐＨ７，５）に対して透析した後、同緩衝液
にて平衡化した抗体カラム（ＰＡＭ−２−３ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ、　　アメリカンダイアグツステイカ社製）にチ
ャージした。　０．３Ｍ　ＫＳＣＮ、　０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣ１および０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて洗浄した後、　　
３Ｍ　ＫＳＣＮ、０．１５Ｍ　ＮａＣ！および０．０１
％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）にて溶出を行った。この溶出液中に含まれる
タンパク量を、ウシ血清アルブミンを標準６１ ６２ としてローリ−法により測定した。その結果、各ＴＰＡ
誘導体生産株の培養液２〜６Ｌから、約１〜３ｍｇのＴ
ＰＡ誘導体がそれぞれ得られていることがわかった。

実施例１で得られたＴＰＡ誘導体（、ＰＮＩ、　ＰＮ２
．　ＰＮ３゜ＤＳＬ、　Ｓｎ２および５Ｄ８）のプラズ
マクロット溶解能を。

次に示すコレンらの方法にしたがって測定した［Ｃｏ１
１ｅｎ　　Ｄ　　ら、　　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏ
ｓｔ、　　５２．　３０８　　（ｂ９８４）］。

まず、５人のボランティア−より、クエン酸（チトシー
ト　ミドリ十字■製）を用いてプラズマを調製し、これ
らを混合して次に示す測定に用いた。このプラズマ１．
ｍｌに　１２５　Ｉラベル　フィブリノーゲン（ｂ，０
ＭＢｑ／ｍｌ）　１０μｌ、　　ｔｏｏユニット／ｍｌ
のヒトαトロンビン２５μｌ、　　および０．５Ｍ　　
ＣａＣｌ２５０　μｌを添加し、混合物を速やかにシリ
コンチューブ（内径４　ｍｍ、　　外径８　ｍｍ）に入
れ、３７℃で１時間にわたり凝固させた。生じたクロッ
トの入ったシリコンチューブを１ｃｍの間隔で切断後、
チューブから６３− クロットを取り出して、　　０．８５％食塩水にてよく
洗浄した。

このようにして作製したプラズマクロットを２゜５ｍｌ
のプラズマ中にうかべた後、　　ＴＰＡあるいはＴＰＡ
誘導体を添加し９反応を開始した。反応開始後、１時間
ごとに５０μｍのプラズマをサンプリングし、プラズマ
クロットから遊離されてプラズマ中に存在する１２５■
の放射能をγカウンターにて測定した。

測定は５時間まで行った。プラズマクロットが１００％
溶解したときの放射能を１００％として、各時間での溶
解率を求めた。結果を第６図および第７図に示す。コン
トロールとしては７　天然型ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶ
ｅＰＡ−１によって形質転換されたＣＨＯ−Ｋｌ細胞よ
り得られたりコンビナンドＴＰＡ　（特開昭６２−１４
７８３号公報）を用いた。Ｓｎ２は、　　ＣＨＯリコン
ビナントＴＰＡと同等な溶解能を示したが、その他の誘
導体については、溶解能がやや低かった。第６図におい
て・印はＰＮＩ、　　目印はＰ　Ｎ２．　　閣印はＰＮ
３．○印はＤＳＬ。

Δ印はＣＨＯ−１細胞より得たりコンビナンドＴＰＡ、
　　およびム印はＴＰＡあるいはＴＰＡ誘導体を添加し
ない状６４ 態で起こる自然溶解の結果をそれぞれ示す。第７図にお
いて、○印はＳｎ２．　　ｅ印はＳｎ２．Δ印はＣＨＯ
１細胞より得たりコンビナンドＴＰＡ、　　およびム印
はＴＰＡあるいはＴＰＡ誘導体を添加しない状態で起こ
る自然溶解の結果をそれぞれ示す。

精製した各ＴＰＡ誘導体、またはＣＨＯ−Ｋｌ細胞から
得た天然型組換えＴＰＡ　（特開昭６２−１４７８３号
公報、前出）の約３００μｇを、ウサギに耳介静脈から
単回投与し。

その血中半減期を測定した。測定は、　　ＥＬＩＳＡを
用いた血液中のＴＰＡ抗原量の定量により行い、投与後
３０分間にわたり、第８図または第９図に示す時間に行
った。ＴＰＡ誘導体ＰＮＩ、　ＰＮ２．　ＰＮ３．　Ｄ
ＳＬおよびＳＤＩについての測定結果を、天然型ＴＰＡ
の効果とともに第８図に示す。　第８図において、○は
ＤＳＬ、　　△はＳＤＩ、　　口はＰＮＩ、・はＰＮ２
．ムはＰＮ３．そして閣は天然型組換えＴＰＡの結果を
示す。ＴＰＡ誘導体ＳＤ４およびＳｎ２についての測定
結果を、天然型組換えＴＰＡの結果とともに第９図に示
す。第９図において７ロ印はＳｎ２．　ム印はＳｎ２．
　　そして・印は天然型組換えＴＰＡの結果を示す。こ
の結果から明らかであるように。

いずれのＴＰＡ誘導体も、　　ＣＨＯ−４１細胞から得
た天然型組換えＴＰＡよりも改善された血中持続性を示
した。

特に、　　ＴＰＡのＮ末端から３７番目〜４２番目のア
ミノ酸が置換されているＴＰＡ誘導体（Ｓｎ２および５
Ｄ８）は、天然型組換えＴＰＡよりもはるかに優れた血
中持続性を示した。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、新規ＴＰＡ誘導体。

該誘導体をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有す
る発現ベクター　該ベクターが導入された形質転換体、
および該ＴＰＡ誘導体の製造方法か提供される。

本発明の新規ＴＰＡ誘導体は、天然型ＴＰＡに比べては
るかに改善された血中持続性を有し、かつ天然型ＴＰＡ
と同等な血栓溶解能を保持するため、心筋梗塞などの血
栓症の治療に有効に使用される。本発明のＴＰＡ誘導体
を使用することにより、現在試みられているＴＰＡによ
る治療の効果が改善され得る。

４、図面の、　なセ日 ６５− ６ 第１図は２本発明の発現ベクターの構築に使用されるＴ
ＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣＰＡ−１の構築を示す概略
図である。

第２図は２本発明の発現ベクターのひとっであるｐｓＶ
ｅＰＮｌの構築を示す概略図である。

第３図は２本発明の発現ベクターのひとっであるｐｓＶ
ｅＤｓｌの構築を示す概略図である。

第４図は２本発明の発現ベクターのひとっであるｐｓＶ
ｅｓＤ８の構築を示す概略図である。

第５図は、　　ＴＰＡのＮ末端付近に存在するフィンガ
ー領域のアミノ酸配列、およびＴＰＡ誘導体ＰＮＩ、　
ＰＮ２、　ＰＮ３およびＰＳｌの、該フィンガー領域に
おけるアミノ酸配列を示す模式図である。

第６図は２本発明のＴＰＡ誘導体であるＰＮＩ、　ＰＮ
２゜ＰＮ３およびＤＳＬのイソロイシン、ビトロ血栓溶
解能の評価結果を示すグラフである。

第７図は２本発明のＴＰＡ誘導体であるＳＣ４およびＳ
Ｃ２のイソロイシン、ビトロ血栓溶解能の評価結果を示
すグラフである。

第８図は２本発明のＴＰＡ誘導体ＰＮＩ、　ＰＮ２．　
ＰＮ３゜ＤＳＬおよびＳＤＩのウサギ血中における安定
性を示すグラフである。

第９図は２本発明のＴＰＡｔＭ導体ＳＤ４およびＳＣ２
のウサギ血中における安定性を示すグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から３７番目のアスパラギン、３８番目のセリ
   ン、３９番目のグリシン、４０番目のアルギニン、４１
   番目のアラニン、および４２番目のグルタミンのうちの
   、少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され
   たアミノ酸配列を有する、組織型プラスミノーゲン活性
   化因子誘導体。 ２、前記他のアミノ酸が疎水性アミノ酸である請求項１
   に記載の誘導体。 ３、前記疎水性アミノ酸がフェニルアラニン、バリン、
   イソロイシン、ロイシンまたはセリンである、請求項２
   に記載の誘導体。 ４、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から３７番目のアスパラギンをセリンに、３８
   番目のセリンをバリンに、３９番目のグリシンをバリン
   に、４０番目のアルギニンをグルタミン酸に、４１番目
   のアラニンをセリンに、そして４２番目のグルタミンを
   セリンに置換するアミノ酸置換のうちの少なくとも１種
   の置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の
   誘導体。 ５、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から３７番目のアスパラギンをロイシンに、３
   ８番目のセリンをバリンに、３９番目のグリシンをバリ
   ンに、４０番目のアルギニンをイソロシンに、４１番目
   のアラニンをバリンに、そして４２番目のグルタミンを
   ロイシンに置換するアミノ酸置換のうちの少なくとも１
   種の置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載
   の誘導体。 ６、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から３７番目のアスパラギンをセリンに、３８
   番目のセリンをバリンに、３９番目のグリシンをバリン
   に、４０番目のアルギニンをイソロシンに、４１番目の
   アラニンをセリンに、そして４２番目のグルタミンをセ
   リンに置換するアミノ酸置換のうちの少なくとも１種の
   置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の誘
   導体。 ７、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から３７番目のアスパラギンをセリンに、３８
   番目のセリンをバリンに、３９番目のグリシンをバリン
   に、４０番目のアルギニンをイソロシンに、４１番目の
   アラニンをバリンに、そして４２番目のグルタミンをセ
   リンに置換するアミノ酸置換のうちの少なくとも１種の
   置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の誘
   導体。 ８、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から３７番目のアスパラギンをセリンに、３８
   番目のセリンをバリンに、３９番目のグリシンをバリン
   に、４０番目のアルギニンをイソロシンに、４１番目の
   アラニンをバリンに、そして４２番目のグルタミンをロ
   イシンに置換するアミノ酸置換のうちの少なくとも１種
   の置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の
   誘導体。 ９、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から３７番目のアスパラギンをフェニルアラニ
   ンに、３８番目のセリンをロイシンに、３９番目のグリ
   シンをフェニルアラニンに、４０番目のアルギニンをバ
   リンに、４１番目のアラニンをロイシンに、そして４２
   番目のグルタミンをフェニルアラニンに置換するアミノ
   酸置換のうちの少なくとも１種の置換を含むアミノ酸配
   列を有する、請求項２に記載の誘導体。 １０、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配
   列のＮ末端から３７番目のアスパラギンをバリンに、３
   ８番目のセリンをフェニルアラニンに、３９番目のグリ
   シンをロイシンに、４０番目のアルギニンをフェニルア
   ラニンに、４１番目のアラニンをイソロシンに、そして
   ４２番目のグルタミンをバリンに置換するアミノ酸置換
   のうちの少なくとも１種の置換を含むアミノ酸配列を有
   する、請求項２に記載の誘導体。 １１、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配
   列のＮ末端から３７番目のアスパラギンをセリンに、３
   ８番目のセリンをバリンに、３９番目のグリシンをバリ
   ンに、４０番目のアルギニンをグルタミン酸に、４１番
   目のアラニンをフェニルアラニンに、そして４２番目の
   グルタミンをセリンに置換するアミノ酸置換のうちの少
   なくとも１種の置換を含むアミノ酸配列を有する、請求
   項２に記載の誘導体。 １２、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配
   列のＮ末端から２８番目のセリンがバリンに、２９番目
   のアスパラギンがセリンに、３０番目のアルギニンがグ
   ルタミン酸に、３１番目のバリンがセリンに、３２番目
   のグルタミン酸がリジンに、そして３３番目のチロシン
   がアスパラギンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有
   する、組織型プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 １３、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配
   列Ｎ末端から７番目のアルギニンがリジンに、８番目の
   アスパラギン酸がリジンに、そして９番目のグルタミン
   酸がリジンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する
   、組織型プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 １４、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配
   列のＮ末端から１０番目のリジンがグルタミン酸に、１
   １番目のスレオニンがバリンに、１２番目のグルタミン
   がセリンに、１３番目のメチオニンがセリンに、そして
   １４番目のイソロイシンがセリンにそれぞれ置換された
   アミノ酸配列を有する、組織型プラスミノーゲン活性化
   因子誘導体。 １５、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配
   列のＮ末端から１５番目のチロシンがフェニルアラニン
   に、１６番目のグルタミンがセリンに、１７番目のグル
   タミンがセリンに、１８番目のヒスチジンがグルタミン
   酸に、そして１９番目のグルタミンがセリンにそれぞれ
   置換されたアミノ酸配列を有する、組織型プラスミノー
   ゲン活性化因子誘導体。 １６、請求項１から１５のいずれかに記載の組織型プラ
   スミノーゲン活性化因子誘導体をコードするＤＮＡ配列
   。 １７、ｃＤＮＡ由来である、請求項１６に記載のＤＮＡ
   配列。 １８、染色体ＤＮＡ由来である、請求項１６に記載のＤ
   ＮＡ配列。 １９、ｃＤＮＡ由来部分と染色体ＤＮＡ由来部分とを有
   する、請求項１６に記載のＤＮＡ配列。 ２０、請求項１６に記載のＤＮＡ配列を有する発現ベク
   ター。 ２１、請求項２０に記載の発現ベクターを動物培養細胞
   に導入して得られる形質転換体。 ２２、前記動物培養細胞がＣＨＯ細胞由来である、請求
   項２１に記載の形質転換体。 ２３、請求項２１に記載の形質転換体を培養して得られ
   る、グリコシル化された組織型プラスミノーゲン活性化
   因子誘導体。 ２４、（ａ）請求項１６に記載のＤＮＡ配列を有する発
   現ベクターを構築する工程； （ｂ）該発現ベクターを動物培養細胞に導入して形質転
   換体を得る工程； （ｃ）該形質転換体を培養して組織型プラスミノーゲン
   活性化因子誘導体を生産させる工程；および （ｄ）生産された組織型プラスミノーゲン活性化因子誘
   導体を単離する工程； を包含する、組織型プラスミノーゲン活性化因子誘導体
   の製造方法。