JP2787483B2 - クリングル１領域に変異を有する新規血栓溶解剤とその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規プラスミノーゲン活性化因子、該因子
を産する細胞、該因子をコードするDNA配列及び該因子
の製造方法にかかわる。本発明による新規プラスミノー
ゲン活性化因子は、プラスミノーゲンをフィブリン溶解
活性を有するプラスミノーゲンに変換する作用を有し、
種々の血栓症の治療薬として用いることができる。

〔従来の技術〕

ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、TPAと
略記する）は、ヒト・メラノーマ細胞（Bowes Melanom
a）の分泌するTPAについてよく研究され、527のアミノ
酸残基からなる糖蛋白質である〔Pennica,D.ら（1983
年）ネイチャー（Nature）301巻、214頁〕。

TPAは、フィブリン溶解能を有しないプラスミノーゲ
ンを該活性を有するプラスミンに変換する酵素で血栓溶
解作用を有している。TPAは現在、血栓症の治療に用い
られている。〔Grossbard,E.B.（1987年）ファーマシュ
ーティカル・リサーチ（Pharmaceulical Research）,4
巻、375頁〕。しかし、TPAの最大の欠点はその血中から
の急速なクリアランスにある。血流中に投与されたTPA
は、主に肝臓で代謝されると推定され〔Fuchs,H.E.ら
（1985年）ブラッド（Blood）,65巻、539頁〕、その血
中半減期は僅かに２分である。〔Collen,D.ら（1985
年）サーキュレーション（Circulation）72巻、384
頁〕。従って、血栓症の治療には大量のTPAの投与が必
要である。TPAのような蛋白の大量投与による血栓症治
療は、極めて高価な治療になるばかりでなく、抗原抗体
反応による副作用という懸念されるべき問題を含でい
る。従って、TPA分子の化学的修飾（WO 84/01786）
（特開昭63−06983）〔Berger,H.ら（1983年）ブラッド
（Blood）71巻、1641頁〕、酵素的修飾（特開昭62−282
582）（EP 0 253 582 A1）、あるいは遺伝子工学的改
変（特開昭61−243024、特開昭62−130690、特開昭62−
272976、特開昭62−269688、特開昭62−282582、特開昭
64−63379）等により血中持続性の改良された、すなわ
ち血中半減期の長いTPA誘導体の作成の試みが行なわれ
ている。しかし、現在までに開発された新規TPAでは、
血中半減期の延長は得られているものの、フィブリンに
対する親和性が低下してまっており、その結果として、
血栓に対する溶解特性に関して、従来のTPAを凌ぐもの
にはなっていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

TPAはフィブリンに対する強い親和性とその活性のフ
ィブリン依存性のため血栓特異的に作用すると考えられ
ている。しかしながらその血中半減期が著しく短いため
血栓治療には大量投与が必要でありその結果出血傾向等
の副作用が問題になってきた。化学修飾、酵素修飾、遺
伝子工学的手法等によって、多くの血中持続性の向上し
たTPA誘導対が発明されている。しかし血中持続性が大
幅に向上した反面、TPAの特徴的な性質であるフィブリ
ン親和性の極端な低下が認められ、優れた治療効果を示
すには至っていない。また改変によりTPAとしての酵素
活性が著しく低下している例もある。TPAの特徴的な性
質であるフィブリン親和性や、フィブリンによる活性化
能が向上し、かつTPA本来の特性をできるだけ保持したT
PA誘導体は、より少量の投与での血栓治療が期待でき、
その開発の意義は極めて大きい。

本発明は、TPAの特徴的な性質であるフィブリン親和
性やフィブリンによる活性化能を強化することにより、
フィブリン溶解能の強力な、グリコシル化された新規TP
A誘導体の発見に基ずく。本発明は、該TPA誘導体、該TP
A誘導体を産生する動物培養細胞の作製法及び該動物培
養細胞を利用した該TPA誘導体の製造方法を提供するも
のである。

〔課題を解決するための手段〕

TPAはＮ末端からフィンガー領域、成長因子領域、ク
リングル1,クリングル２及びセリンプロテアーゼ活性を
有する領域の５つの領域からなる〔Pennica,Dら（1983
年）ネイチャー（Nature）301巻、214頁〕。TPAのクリ
ングル２領域は、TPAのフィブリン親和性やフィブリン
による活性化に関与していると言われているが、クリン
グル１領域は、その欠失誘導体の研究からもその機能が
不明であり、その解析が待たれていた。本発明者らは、
クリングル１領域にクリングル２領域の持つフィブリン
親和性やフィブリンによる活性化などの機能を付与する
ことにより、TPAの特徴的な性質であるフィブリン親和
性やフィブリンによる活性化能を更に強化し、フィブリ
ン溶解能の優れた新規TPA誘導体を作製した。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、TPA誘導
体の作製に関するものであり、遺伝子工学的手法を持っ
て達成されるものである。したがって改良型TPAの作成
にはTPAのアミノ酸配列をコードするDNA配列が不可欠で
ある。そのようなDNA配列の取得は、TPAcDNAあるいは染
色体DNAのクローニング、あるいはTPAcDNA、染色体DNA
やTPAアミノ酸配列をもとにDNAを化学合成することによ
って達成できる。TPAcDNAは、ペニカ等〔Pennica,D.ら
（1983年）ネイチャー（Nature）301巻、214頁〕が単離
している。TPAのアミノ酸配列およびcDNAに対する番号
付けは、彼等が提案しているものに従った。TPA染色体D
NAはニイ等〔Ny,T.ら（1984年）プロシーディング オ
ブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
ユーエスエイ（Proceeding of the Nathional Academy
of Science USA）81巻、5355頁〕とブラウンら〔Brown,
M.J.ら（1985年）ジーン（Gene）33巻、279頁〕とデー
ゲンら〔Degen,S.J.F.ら（1986年）ザ ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（The Journal of B
iolodical Chemistry）261巻、6972頁〕がそれぞれ単離
している。TPA染色体遺伝子のエクソンに対する番号付
けは、ニイらに従うことにする。本発明者らは、染色体
DNA利用発現ベクターpSVePA−１（特開昭62−14783）に
よって形質転換されたCHO−K1細胞よりmRNAを抽出し、c
DNAの合成およびクローニングを行なった。実施例１に
あるように新たに取得したTPAcDNAおよびpSVePA−１に
含まれる染色体DNAを利用してTPA誘導体作成の基本とな
る発現ベクターpSVeCPA−１が作成できた。発現ベクタ
ーpSVeCPA−１は、TPA遺伝子の上流にSV40ウイルスの初
期プロモーターがTPA遺伝子が発現可能な形で存在して
おり、動物細胞に導入された際、TPAあるいはTPA誘導体
が生産しうるように設計されている。もちろんプロモー
ターとしてはSV40以外にTPA遺伝子を発現可能なものな
らなんでも利用可能であろう。発現ベクターpSVeCPA−
１を利用した上記TPA誘導体発現ベクターの作成方法に
ついては実施例２に詳細に記した。

（発現ベクターの動物培養細胞への導入とTPA誘導体生
産細胞の作成） 動物細胞へのDNAの導入法として、トランスフェクシ
ョン効率に差はあるが、リン酸カルシウム法「Wigler,
M.ら（1977年）セル（Cell）11巻、233頁」，マイクロ
インジェクション法〔Anderson,W.F.ら（1989年）プロ
シーディング オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンス ユーエスエー（同上）77巻、5399
頁〕、リポゾーム法、DEAE−デキストラン法或いは細胞
融合法〔Schoffner,W.ら（1980年）プロシーディング
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
ユーエスエー（同上）77巻、2163頁〕、電気導入法
〔達家雅明ら、（1987年）細胞工学、６巻、494頁〕な
どが利用できる。TPA誘導体発現ベクターを細胞に導入
後、適当な選択マーカー遺伝子によって獲得した形質に
より形質転換株を得ることができる。動物細胞での選択
マーカー遺伝子としては、Ecogpt〔Mulligaan,R.C.ら
（1980年）サイエンス（Science）,209巻、1422頁〕,ne
o〔Southern,P.J.ら（1982年）ジャーナル オブ モレ
キュラー アンド アプライド ジェネティクス（Jour
nal Molecular and Applied Genetics）１巻、327頁〕,
dhfr〔Wigler,M.ら（1980年）プロシーディング オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ユ
ーエスエー（同上）77巻,327頁〕等の遺伝子が用いられ
る。TPA誘導体発現ベクターは、これら選択マーカー遺
伝子を同一プラスミド内に含んでいてもあるいは別のプ
ラミスドであっても形質転換株の取得は可能である。得
られた形質転換株がTPA誘導体を生産するか否かは、そ
れぞれの形質転換細胞の培養液に含まれるプラスミノー
ゲン活性化活性を測定することによって決定できる。

（TPA誘導体の精製） TPA誘導体生産株の培養は、宿主となる動物細胞株に
応じた培養法にて行なうことができる。培養上清からの
TPA誘導体の回収精製は、CPG、キレーティング セルフ
ァロース、Con−Ａセファロース、イオン交換体、オク
チル セファロース、セファディックスゲルでのクルマ
トグラフィー、抗体カラムクロマトグラフィーや電気泳
動等を用いて行なうことができる。プラスミノーゲン活
性化能は、プラスミノーゲン含有フィブリン平板を用い
る方法〔Mackie,M.ら（1981年）ブリティッシュ ジャ
ーナル オブ ヘマトロジー（British Journal of Hem
atorogy）47巻、77頁〕やプラスミンの合成基質Ｓ−225
1の分解を測定する方法〔Allen,R.A.とPepper,D.S.（19
81年）トロンボシス アンド ヘモスタシス（Thrombos
is and Haemosutasis）45巻、43頁〕CLT法〔Gaffney,P.
T.とCurtis,A.D.（1985年）トロンボシス アンド ヘ
モスタシス（同上）53巻、134頁〕ELISA法〔Holvoest,
T.ら（1985年）トロンボシス アンド ヘモスタシス
（同上）54巻、684頁〕によって測定できる。

（血栓溶解能の評価） 本発明が提示するTPA誘導体は、血栓の溶解にかかわ
る性質、すなわちフィブリン親和性、酵素活性のフィブ
リン依存性、血中持続性、プラスミノーゲン活性化能、
インビドロ血栓分解能の性質の幾つかにおいて改善され
た性質を持つ。フィブリン親和性は、フィブリンクロッ
トへの取込みを指標とする方法に従って測定することが
できる。〔Collen,D.ら（1988年）ブラッド（Blood）71
巻、216頁〕。インビドロ血栓溶解能は、¹²⁵I−フィブ
リンからの放射能の遊離を指標する方法等によって測定
することができる。〔Larsen,G.R.ら（1988年）ザ ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（同
上）263巻、1023頁〕。酵素活性のフィブリン依存性あ
るいはプラスミノーゲン活性化活性は、プラスミンの合
成基質Ｓ−2251を利用するコレンら〔Collen,D.ら（198
2年）ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミス
トリー（同上）257巻、2912頁〕の方法にて測定するこ
とができる。血中持続性に関しては、ベーベら〔Beebe,
D.P.ら（1986年）トロンボシス リサーチ（同上）43
巻、663頁〕あるいはマットソンら〔Mattson,Ch.ら（19
83年）トロンボシス リサーチ（同上）30巻、91頁〕が
報告しており、それらに記載の方法で血中半減期が測定
できる。

〔発明の効果〕

生体内における血栓溶解能に影響する因子は、ブィブ
リン親和性、フィブリンによる活性化、プラスミノーゲ
ン活性化能、プロテアーゼ抵抗性、阻害剤感受性、血中
持続性など様々である。本発明が提供する新規TPA誘導
体は、天然型TPAに比べて改善されたフィブリン親和
性、プラスミノーゲン活性化能を持ち、天然型TPAを上
回るインビトロ血栓溶解能を保持している点で、心筋梗
塞等の血栓症の治療に用いることができ、現在試みられ
ている治療方法を改善することができる。

〔実施例〕 以下に実施例を示すが、本発明に係わる諸実験は、内
閣総理大臣の定める「組換えDNA実験指針」に従って行
なった。また実施例中のファージ、プラスミド、DNA、
種々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげ
る雑誌、成書を参考とした。

1.蛋白質 核酸 酵素、26巻、４号、（1981年）臨時増
刊 遺伝子操作（共立出版） 2.遺伝子操作実験法、高木康敬 編著（1980年）講談社 3.遺伝子操作マニュアル、高木康敬 編著（1982年）講
談社 4.Molecular Cloning a laboratory manual,T.maniati
sら編（1982年）Cold Spring Harbor Laboratory 5.Methods in Enzymology,65巻、L.Grossmamら編（1980
年）Academic Press 6.Methods in Enzymology,68巻、R.Wu編（1979年）Acad
emic Press 実施例１ TPA発現ベクターpSVeCPA−１の作成 TPA発現ベクターpSVeCPA−１は以下に記述するステッ
プを経て作成した。

（１）TPAのcDNAクローンpCH79の作成 まず、染色体DNA利用TPA発現ベクターpSVeCPA−１
（特開昭62−14783）を導入したCHO−K1細胞から、既知
のグアニジン−ホットフェノール法に準じ、トータルRN
Aを抽出した。次に、オリゴdTセルロースクロマトグラ
フィーにより、ポリA⁺mRNAを調製し、ショ糖濃度勾配遠
心法によって分子量分画してTPAのmRNAを含む画分を得
た。市販のcDNA合成キット（アマシャム社製）にこの画
分を供してcDNAを合成し、市販のλgt10利用cDNAクロー
ニングキット（アマシャク社製）を用いて、cDNAライブ
ラリーを作成した。このライブラリーに対して、pSVeCP
A−１を制限酵素Xbalで切断、単離した第10,11及び12エ
クソンを含む約2.5kbの断片をプローブとして用い、通
常の方法でプラークハイブリダイゼイションを行なって
陽性ファージを選択した。得られた陽性ファージDNAを
調製し、制限酵素Hind III（宝酒造（株）製）で消化後
アガロースゲル電気泳動を行なって、クローニングに用
いたと同じXbal12.5kb断片をプローブとしてサザンハイ
ブリダイゼイション法により解析した。その結果、CH79
と名ずけたクローンには、Hind IIIで約2.2kbに切断さ
れるプローブ陽性の断片が含まれていることが分かっ
た。このHind III約2.2kb断片をアガロースゲル電気泳
動法にて単離後、同じくHind IIIで消化したpUC19〔宝
酒造（株）製〕とT4DNAリガーゼを用いて連結後、E.col
i DH1に導入してpCH79を作成した。このpCH79のcDNA部
分の塩基配列をM13法を利用した市販のキット〔宝酒造
（株）製〕に決定した。５′末端に存在する発現ベクタ
ー由来のHind III認識部位より約150bp下流にBgl IIの
認識部位が存在し、塩基配列はその下流約1500bpの終止
コドンTGAまでbp584のＣがＴ及びbp1725のＡがＣであっ
た以外は、ペニカら〔Pennica,Dら（1983年）ネイチャ
ー（Nature）301巻、214頁〕が報告した塩基配列と一致
しており、さらに、TGAコドンから約410塩基下流には発
現ベクターに由来するHind III部位が存在していた。

（２）TPA発現ベクターpSVeCPAP−１の作成 pSVeCPA−１は、第１図に示した手順により作成し
た。pSVeSall（特開昭62−14783）を制限酵素Ncol（宝
酒造（株）製）で切断後、大腸菌内での複製起点および
アンピシリン耐性を付与する約4.7kb断片を単離し、さ
らにT4DNAリガーゼ（宝酒造（株）製）を用いて環状化
後、E.coli DH1に導入してpSVeSall−Hind IIIを作成し
た。従って、このベクターはHind III認識部位をはさん
でSV40の複製起点を含む初期プロモーター領域とSV40の
ポリアデニル化シグナルを含む配列がそれぞれ存在して
いる。次に、pSVeSall−Hind IIIをHind IIIにて切断
後、pSVeCPA−１をHind III及びBgl II（宝酒造（株）
製）で切断、単離して得たTPA染色体DNAの全第２エクソ
ンと第３エクソンの一部を含む約1.9kb断片と、pCH79を
Hind III及びBgl IIで切断したTPAcDNAを含む約2kb断片
とをT4DNAリガーゼにて連結後,E.Ccli DH1に導入してpS
VeCPA−１を作成した。このTPA発現デクターpSVeCPA−
１は、第２エクソンから第３エクソンのBgI II認識部位
までが染色体DNA由来であり、それ以降がcDNAより成
り、天然型のTPAを発現する遺伝子をコードしている。

実施例２ TPA誘導体発現ベクターpSCKM−２及びpSCKM−４の作成 （１）変異導入ベクターM13−NSの作製 クリングル１領域にアミノ酸置換を導入するための第
一ステップとして、まず変異導入ベクターの作製を行な
った。発現ベクターpSVeCPA−１を制限酵素Narl（ニュ
ーイングランド バイオラボ社製造）とSmal（宝酒造
（株）製）で切断し、アガロース電気泳動によって、約
1.1kbの断片を分離した。また、M13mp11（宝酒造
（株））を制限酵素NarlとSmalで切断した。これらの約
1.1kbの断片とM13mp11を、T4DNAリガーゼにて連結後、
E.coliDH1に導入してM13−NSを作製した。この変異導入
ベクターM13−NSは、TPAのクリングル１領域にあるアミ
ノ酸110番目のグリシンから、プロテアーゼ領域にある
アミノ酸508番目のプロリンに相当するcDNAをコードし
ている。

（２）部位特異的アミノ酸置換反応 クリングル１領域にアミノ酸置換を導入するため、ま
ず変異導入ベクターM13−NSより一本鎖のDNAを調製し
た。そして次に、部位特異的アミノ酸置換反応に用いる
合成DNAプロープとして、 （ａ） ５′−TTCTGGGCCAACGCCATGCTGTTCCAGGGGGTGCAC
TCGGC−３′ 及び （ｂ） ５′−TGCTGCAGAACTCCCAGCTGTACCTCCTCGCCTTAA
AGACG−３′ の配列を持つものを作製した、この合成DNAプローブ
を用いることにより、（ａ）アミノ酸115番目のアスパ
ラギンと119番目のセリンを、それぞれプロリンとメチ
オニンに、及び（ｂ）アミノ酸161番目のグリシン、162
番目のリジン、及び165番目のセリンを、それぞれアル
ギニン、アルギニン、及びトリプトファンに置換するこ
とができる。この合成DNAプローブのＮ末端を、T4ポリ
ヌクレオチド キナーゼ（宝酒造（株）製）を用いてリ
ン酸化した。

調製したM13−NSの１本鎖DNAと変異用合成DNAプロー
ブより、市販のインビトロ変異システム キット（アマ
シャム社製）を用いて部位特異的変異反応を行ない、E.
coli TG1に導入してM13−NSM2、及びM13−NSM4を作製し
た。このM13−NSM2、及びM13−NSM4より１本鎖DNAを調
製し、M13を利用した市販のキット（同上）を用いて変
異の確認を行なったところ、（ａ）アミノ酸115番目の
アスパラギンと119番目のセリンに対応するDNA配列−AA
CTGGAACAGCAGC−が、それぞれプロリン及びメチオニン
に対応する−CCCTGGAACAGCATG−に、そして（ｂ）アミ
ノ酸161番目のグリシン、162番目のリジン、及び165番
目のセリンに対応するDNA配列−GGGAAGTACAGCTCA−が、
それぞれアルギニン、アルギニン、及びトリプトファン
に対応する−AGGAGGTACAGCTGG−に変異していることが
確認できた。

（３）TPA誘導体発現ベクターpSCKM−２、及びpSCKM−
４の作製 TPA誘導体発現ベクターpSCKM−２、及びpSCKM−４の
作製は、以下の手順に従って行なった。まず、M13−NSM
2及びM13−NSM4を制限酵素NarlとSmalで切断し、アガロ
ース電気泳動によって、約1.1kbの断片を分離した。次
に、pSVeCPA−１を制限酵素NarlとSmalで切断し、アガ
ロース電気泳動によって、約7kbの断片を分離した。そ
して、これらの両断片をT4DNAリガーゼによって連結
後、、E.coilに導入してpSCKM−２、及びpSCKM−４を作
製した。

実施例３ マーカーベクターpSV2neo−dhfrの作成 pSV2neo−dhfrは以下の手順で作成した。pSV2dhfr
（アメリカン タイプカルチャーコレクション rDNA V
ectcrs 37146）を制限酵素Pvu II（宝酒造（株）製）で
切断し、そこにBamHl リンカーｄ（pCGGATCCG）（宝酒
造（株）製）をT4DNAリガーゼで連結後E.coliDH1に導入
してpSV2−dhfrを作成した。pSV2BdhfrをBamH1で消化し
て得られるdhfr遺伝子を含む約2kbの断片をアガロース
電気泳動法により調製し、pSV2neo（アメリカン タイ
プカルチャー コレクション rDNA Vectors 37149）を
BamH1（宝酒造（株）製）で切断したcDNAとをT4DNAリガ
ーゼを用いて環状化後、E.coliDH1に導入し、neoとdhfr
遺伝子が同発現方向に挿入されたpSV2neo−dhfrを作成
した。

実施例４ TPA発現ベクターの動物培養細胞への導入とTPAの生産 TPA発現ベクターpSCKM−２及びpSCKM−４をCHO−K1
（ATCC,CCL−61）を宿主として、チェンら〔Chen,C.and
Okayama,H.ら（1987年）モレキュラー アンド セル
ラー バイオロジー（Molecular and Cellular Biolog
y）７巻、2745頁〕の方法に準じて型質転換を行なっ
た。即ち、プラスミド〔TPA発現ベクターpSCKM−２又は
pSCKM−4:pSV2neo−dhfr＝10:1（重量比）〕−リン酸カ
ルシウム共沈澱物を予め５％牛胎児血清（FCS）含むMD
培地（MCDB302:ダルベッコ変法MEM＝1:1、シグマ）で生
育させた細胞（２×10⁵細胞/10ml培地／直径10cm培養
皿）に加え、15時間後に培地を洗浄して更新した。さら
に48時間、培地を800μg/mlG418硫酸塩（ギブコ）、7mM
ε−アミノカプロン酸、50μＭフォイパン（小野薬品
工業）を含むMD培地に変え、さらに約２週間培養を続け
G418耐性株を分離した。G418耐性株を24穴マルチディッ
シュ（コーニング社製）の底面全体に生育させ、上記培
地で24時間培養し、これらの発現ベクターによって生産
される変異型TPA、それぞれKM−2,KM−４の活性をプラ
スミノーゲン含有フィブリン平板を用いて測定した。
〔Mackie,Mら（1981年）ブリティッシュ ジャーナル
オブ ヘマトロジー（British Journal of Hematolog
y）47巻、77頁〕。

実施例５ 形質転換株のメソトレキセート（Mtx）による選択及び
培養 実施例４で得たpSCKM−２又はpSCKM−４の形質転換株
を直径10cmの培養皿に１×10³から１×10⁵個の細胞を植
え100nMから1000nMのMtxを含むMD培地で約２週間培養を
続け、Mtxに対して耐性を示す株を分離した。これらの
耐性株が24時間あたり生産するKM−２の量を実施例４に
示した様にフィブリン平板法にて測定した。表−１には
実施例４および５で得られたKM−２又はKM−４の生産株
名及びその力価を示した。Mtxで選択した細胞からは親
株よりも高いTPA生産性を示す株が得られた。また、こ
れらの細胞はMD無血清培地（MD培地、7mM ε−アミノ
カプロン酸、50μＭフォイパン 1mg/ml牛血清アルブミ
ン ５μg/mlインシュリン）においてもTPAを生産し
た。

実施例６ KM−２およびKM−４の回収、精製 以下にTPA誘導体KM−２及びKM−４の回収、精製の工
程を示す。工程途中のTPA抗原の検出には、市販のERISA
キット（IMUBIND TPA ERISA KIT,アメリカンダイグノス
ティカ社製）を用いた。KM−2601株またはKM−4801を実
施例５で示したMD無血清培地にて培養し、KM−２または
KM−４を含む培養液を、1M NaC−,50μＭフォイパンを
含む20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて平衡化したCPG−10
（エレクトロヌクレオニクス社製）カラムにチャージ
し、平衡化に用いたと同じ緩衝液にて洗浄した。CPG−1
0カラムを通過した培養液および洗浄液中にKM−２又はK
M−４はほとんど検出されなかった。CPG−10カラムより
KM−２及びKM−４を1M NaCl,0.5M KSCN,1Mε−アミノカ
プロン酸および50μＭフォイパンを含む20mMリン酸緩衝
液（pH7.5）にて溶出した。溶出液をそのまま1MNaCl,0.
01％Tween80および50μＭフォイパンを含む20mMリン酸
緩衝液（pH7.5）にて平衡化したConA−Sepharose（ファ
ルマシア社製）カラムにチャージした。平衡化に用いた
と同じ緩衝液にて洗浄後、2M KSCN,0.4M α−メチルマ
ンノシド,0.01％Tween80および50μＭフォイパンを含む
20mMリン酸緩衝液（pH7.5）にて溶出した。ERISAを利用
してConA Sepharoseの通過培養液、洗浄液および溶出液
中に含まれるTPA抗原を検出したところ、KM−２及びKM
−４はほとんどConA Sepharoseに吸着し、溶出回収され
ていることが分かった。

同溶出液に含まれるTPA蛋白質をERISA法にて測定した
ところ、KM−２及びKM−４はKM−2601株、KM−4801株の
培養液約5.6L、約6.0Lより、それぞれ12.3mg及び4.1mg
が回収、精製されていることが分かった。

実施例７ インビトロでのフィブリン親和性 KM−２及びKM−４のインビトロでのフィブリン親和性
を、コレンら（同上）の方法によって測定した。50mM T
ris HCl（pH7.4）,0.038M NaCl,0.1％Tween80,1mg/mlBS
A,0.1μg/mlTPAとし、ヒト フィブリノーゲンを0.01mg
/ml〜4mg/mlとなる様に変化させ、ヒト−トロンビンを2
0NlHunits/mlとなる様に添加して室温で10分間置いた。
そして、15,000rpm,3分間遠心分離して、上清を分離し
た。その活性をＳ−2251を用いた方法で測定し、結果を
第２図にまとめた。KM−４は天然型TPAと同程度のフィ
ブリン親和性を示したが、KM−２は天然型TPAよりも遥
かに強力なインビトロでのフィブリン親和性をもってい
ることが分かった。

実施例８ インビトロでのプラスミノーゲン活性化能測定 KM−２及びKM−４のインビトロでのプラスミノーゲン
活性化能は、プラスミンの合成基質Ｓ−2251を利用する
コレンら（同上）の方法にて測定した。0.1M Tris HCl
（pH7.5）,0.1％Tween80,0.3mM Ｓ−2251,0.1mgヒトフ
ィブリノゲン（ブロモシアンで分解したもの）,1ng/ml
TPAとし、グルタミン酸タイプのプラスミノーゲンを0.0
4μg/ml〜25μg/mlとなるようにして、25℃,3時間置い
た後、405nmでの吸光度を測定した。その結果を第３図
にまとめた。KM−２及びKM4は天然型TPAよりも強力なイ
ンビトロでのプラスミノーゲン活性化能をもっているこ
とが分かった。

実施例９ インビトロでの血栓溶解能測定 KM−２及びKM−４のインビトロでの血栓溶解能をラー
センら（同上）の方法を一部改変して測定した。50μg/
mlヒト グルタミン酸タイプ プラスミノーゲン、0.1M
NaCl,0.01％Tween80を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.2）
に5mg/mlとなるようにヒトフィブリノーゲンを溶解後、
ヒト トロンビンを1.0N1H unit/mlとなるように添加
し、96穴マルチディッシュに100μｌずつ分注して37℃,
1hr放置して凝固させた。作成したフィブリンクロット
に100μ１の酵素液を重層し、37℃で3hr反応させた。反
応後、各ウェルの405nmでの吸光度を測定し、その結果
を第４図にまとめた。KM−２及びKM−４は天然型TPAよ
りも強力なインビトロ血栓溶解能をもっていることが分
った。

実施例10 KM−２およびKM−４の血中での半減期測定 血中持続性に関してはベーベら（同上）あるいはマッ
トソンら（同上）の方法で血中での半減期を測定した。
精製したKM−２又はKM−４ 300μｇをウサギに耳介静
脈より単独回投与し、経時的に採血してその血中TPA濃
度をELISA法にて測定した。その結果、ウサギでの血中
半減期は、KM−２が約４分、KM−４が約2.5分と測定さ
れた。（第５図）

【図面の簡単な説明】

第１図はTPA発現ベクターpSVeCPA−１の構築を示す図、 第２図は、天然型TPA及びKM−２およびKM−４のフィブ
リン親和性を示すグラフ、 第３図は天然型TPA及びKM−２およびKM−４のプラスミ
ノーゲン活性化能の比較を示すグラフ、 第４図は、天然型TPA及びKM−２およびKM−４のin vitr
oでのフィブリンクロット溶解能を示すグラフ、 第５図は、天然型TPA及びKM−２およびKM−４のウサギ
での血中持続性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−253380（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−282582（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/58 C12N 9/64 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＹＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミノ酸115番目のアスパラギンと119番目
   のセリンが、それぞれプロリンとメチオニンに置換され
   た組織プラスミノーゲン活性化因子誘導体。
2. 【請求項２】アミノ酸161番目のグリシン、162番目のリ
   ジン、および165番目のセリンが、それぞれアルギニ
   ン、アルギニン、及びトリプトファンに置換された組織
   プラスミノーゲン活性化因子誘導体。
3. 【請求項３】形質転換された動物培養細胞で産生される
   請求項１または２に記載のプラスミノーゲン活性化因子
   誘導体。
4. 【請求項４】動物培養細胞がCHO−K1である請求項３記
   載のプラスミノーゲン活性化因子誘導体。
5. 【請求項５】請求項１または２で示されるプラスミノー
   ゲン活性化因子誘導体をコードするDNA配列。
6. 【請求項６】DNA配列が、cDNAの一部分と染色体DNAの一
   部からなる請求項５記載のDNA配列。
7. 【請求項７】第２エクソンから第３エクソンのBgI II認
   識部位までが染色体DNA、該BgI II認識部位から下流がc
   DNAからなる請求項６記載のDNA配列。
8. 【請求項８】請求項１または２のプラスミノーゲン活性
   化因子誘導体をコードする請求項５〜７のいずれかに記
   載のDNA配列を含む発現ベクターによって形質転換され
   た動物培養細胞。
9. 【請求項９】動物培養細胞がCHO−K1である請求項８記
   載の動物培養細胞。
10. 【請求項１０】請求項５〜７のいずれかに記載のDNA配
    列を含む発現ベクターによって形質転換された動物培養
    細胞を培養してプラスミノーゲン活性化因子誘導体を生
    成せしめ、これを採取するプラスミノーゲン活性化因子
    誘導体の製造方法。
11. 【請求項１１】動物培養細胞がCHO−K1である請求項10
    記載のプラスミノーゲン活性化因子誘導体の製造方法。