JP2518832B2 - 変形された組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ− - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般にフィブリン溶解因子に関し、さらに
詳しくは、変形された組織プラスミノーゲンアクチベー
ター（活性化因子）に関する。

〔従来の技術〕

血液凝固は、究極的にフィブリンの網状構造すなわち
凝塊を生ずる種々の血液成分の複雑な相互作用から成る
プロセスである。フィブリンの網状構造の分解は、酵素
前駆体プラスミノーゲンのプラスミン、すなわち、フィ
ブリン網状構造を直接分解する作用をするセリンプロテ
アーゼ、への活性化によって達成することができる。プ
ラスミノーゲンのプラスミンへの転化は、組織プラスミ
ノゲンアクチベーター（ｔ−PA）、すなわち、フィブリ
ン特異的セリンプロテアーゼによって触媒することがで
きる。

ｔ−PAはプラスミノーゲンの生理学的脈管活性化因子
であると信じられ、そして通常単一のポリペプチド鎖
（分子量72,000）として循環する。ウロキナーゼ型プラ
スミノーゲンアクチベーター（ｕ−PA）は、セリンプロ
テアーゼとして特徴づけられるプラスミノーゲンアクチ
ベーターの部類の他の構成員である。ｕ−PAはｔ−PAと
機能的にかつ免疫学的に区別することができる。

フィブリンの存在下に、ｔ−PAはこの分子の中央領域
中の一ケ所の部位での裂開によって活性化される。ｔ−
PAの重鎖（分子量40,000および37,000の２つの型）はｔ
−PA分子のアミノ末端に由来し、これに対して軽鎖（分
子量33,000）はカルボキシ末端に由来する。

潜在的前駆体ｔ−PAタンパク質の二次元のモデルが確
立された〔Ny等、PNAS 81:5355−5359、1984〕。この
モデルから、重鎖は「クリングル（kringle）」として
知られる２つの三重ジスルフイド構造を含有することが
決定された。これらのクリングル構造は、また、プロト
ロンビン、プラスミノーゲンおよびウロキナーゼ中にも
存在し、そしてフィブリンへの結合のために重要である
と信じられる〔Nyら、同上〕。ｔ−PAの第２クリングル
（K₂）は第１クリングル（K₁）よりもフィブリンに対し
て高い親和性をもつと信じられる〔Ichinose,Takioおよ
びFujkawa、個人的通信〕。

ｔ−PAの重鎖は、また、フィブロネクチンのフィンガ
ー領域（finger domain）と相同である「フィンガー」
領域を含有する。フィブリノネクチンはフィブリンの結
合を包含する種々の生物学的活動に関係づけられてきて
おり、そしてこのような生物学的活動はフィブリノネク
チンがもつ９つのフィンガー領域のうち４つまたは５つ
に関係づけられた。ｔ−PAの重鎖は、また、生長因子様
領域を含有する。

ｔ−PAの軽鎖はセリンプロテアーゼ活性のための活性
部位を含有し、この活性部位は他のセリプロテアーゼの
活性部位と高度に相同である。

天然ｔ−PAはプレ区域（pre−region）およびそれよ
り下流のプロ区域（pro−region）をさらに含み、これ
らの区域をまともて「プレ−プロ（pre−pro）」区域と
呼ぶ。プレ配列は、血管の内皮細胞によるｔ−PAの分泌
にとって重要であるシグナルペプチドを含有する〔Ny
ら、同上〕。プレ配列は、細胞外分泌における必須の過
程である、小胞体のルーメン中へのｔ−PAの分泌の原因
となると信じられる。プロ配列は、小胞体からゴルジ装
置へ移送された後、ｔ−PA分子から切離されると信じら
れる。

ｔ−PAの生物学的活性はフィブリンの存在で実質的に
増大される〔Sherry、ニュー・イングランド・ジャーナ
ル・オブ・メディシン（New Eng.J.Med.）313:1014−10
17、1985〕。特異性に劣るプラスミノゲンアクチベータ
ーであるストレプトキナーゼおよびウロキーゼと異な
り、ｔ−PAは凝塊の部位を除外して比較的わずかのプロ
テアーゼ活性をもつ。プラスミノゲンおよびｔ−PAはフ
ィブリンの凝塊に最初に結合し、その結果プラスミノゲ
ンのプラスミンへの酸素的分解は立体的に促進されると
理論づけられる。

動物およびヒトにおけるフィブリン溶解のためのｔ−
PAの使用は、天然分子のいくつかの欠点が際立ってい
る。生体内でのｔ−PAの半減期はヒトにおいて３分程度
に短いことが示された〔ニルソン（Nilsson）ら、スカ
ンジナビアン・ジャーナル・オブ・ヘモトロジー（Scan
d.J.Haemotol.）33、49−53、1984〕。注射されたｔ−P
Aは肝臓によって急速に浄化され、そして注射された物
質の大部分は30分以内に低分子量の形態に代謝される。
この短い半減期は、高い投与量および延長された注入を
必要とすることによって、血栓溶解剤としてのｔ−PAの
有効性を制限することがある。FuchsらBlood 65:539−
544、1985〕は、注入されたｔ−PAがタンパク質加水分
解部位とは独立のプロセスにおいて肝臓によって開裂さ
れ、そして注入されたｔ−PAは体の中に蓄積されないで
あろうことを結論した。さらに、冠動脈の血栓を溶解す
るために十分なｔ−PAの投与量は、正常の生理学的レベ
ルよりも非常に多く、そしてフィブノゲンの全身的分解
を導びく〔Sherry、同上〕。

従って、臨床的応用のため、天然ｔ−PAに比較して、
増大したフィブリン結合能力、増加した生物学的半減期
または増加した溶解度を有するフィブリン溶解剤を使用
することは有利であろう。このような溶解剤はフィブリ
ン溶解において活性な役割を演ずるこのできない構造的
および機能的特徴をもないことが好ましい。例えば、表
皮生長因子（EGF）領域を含有しないフィブリン溶解分
子を生成することが望ましいであろう。なぜなら、EGF
領域はフィブリン溶解活性に不必要であることが発見さ
れたからである。生長因子領域のすべてまたは一部分の
欠失は、その領域の疎水性のため、その分子の溶解度を
増加することもある。溶解度の増加は、より少ない（注
射可能な）量のｔ−PAの使用を可能とし、そして患者へ
のより速い投与を可能とする。活性化部位はｔ−PAの生
理学的クリアランスに参加しないので、余分なドメイン
の除去は、また、得られる変形されたｔ−PA分子の生体
内の半減期を、それを不活性化しないで、増加すること
ができる。また、特異的活性を増加し、これによってよ
り少ない投与量を用いることができる。さらに、ｔ−PA
のフィブリン結合の増大は追加のクリングル構造および
／またはフィンガー領域の付加によって達成することが
できる。さらに、より小さい分子は組換え細胞によって
いっそう容易に分泌されることができる。

天然ｔ−PAは複合モザイクポリペプチドであり、そし
てｔ−PA遺伝子は前述の構造的および機能的領域をコー
ドする多数のエクソンを含むという事実〔Nyら、同上〕
に照らして、ｔ−PAの特異的フィブリン溶解活性を最適
に発現するDNA配列を構成することが望ましいであろ
う。タンパク質の最適化は、ｔ−PAの所望の構造的およ
び機能的性質をコードするヌクレオチド配列のみをクロ
ーニングし、同時に所望の生物学的活性に寄与しない配
列を排除することによって達成できるであろう。所望の
構造の多数のコピーを、最適化されたタンパク質の中に
組込むこともできる。

明らかなように、ｔ−PAの臨床的効能と投与の容易さ
および最小の望ましくな副作用とを兼ね備えた、フィブ
リン溶解剤がこの分野において要求されている。本発明
は、比較的大量に生産することができる変形された形態
のｔ−PAを提供することによって、この要求を満足させ
る組換えDNA技術を使用することによって、変変された
（modified）ｔ−PAの絶えず一定した均質な入手源が提
供される。心臓の発作および搏動の罹病において存在す
る凝塊（clot）を溶解するために、そしてフィブリンの
マトリックスを溶解しあるいはその形成を抑制すること
の必要性が治療上望ましい他の場合において、変形され
たｔ−PAを利用できる。

〔発明の開示〕

簡単に述べると、本発明は、フィブリン結合領域をコ
ードする第１区域と、第１区域より下流に位置する第２
区域とから本質的に成るヌクレオチド配列を含有し、第
２区域が組織プラスミノゲンアクチベーターのセリンプ
ロテアーゼ活性のための触媒領域をコードする、DNA構
成体を開示する。この配列は、ｔ−PAと実質的に同一の
生物学的活性を有するタンパク質の遺伝情報を指定す
る。第１区域および第２区域は、ｔ−PAのゲノムのクロ
ーンまたはcDNAのクローンに由来することができ、ある
いは普通のDNA合成技術によって構成できる。

好ましくは、フィブリン結合領域をコードする第１区
域は、１または２以上のクリングル構造をコードする。
とくに、第１区域はｔ−PAのK₁およびK₂クリングル構
造、二重K₂構造または単一のK₂構造をコードするか、あ
るいは他のタンパク質からのクリングル構造を代わりに
使用できる。フィブリン結合領域をコードする第１区域
は、１または２以上のフィンガー領域をさらにコードす
ることができる。

第２区域は、本質的にｔ−PAのセリンプロテアーゼ領
域である触媒領域をコードする。とくに好ましい第２区
域は、第１図に従い、アミノ酸番号276から延びかつア
ミノ酸番号527を通して続くｔ−PAの軽鎖をコードす
る。

さらに、本発明は、ｔ−PAと実質的同一の生物学的活
性を有するタンパク質の発現を命じる（direct）ことの
できる発現ベクターを開示する。これらのベクターは作
用可能にヌクレオチド配列に結合しているプロモーター
を含み、このヌクレオチド配列はフィブリン結合領域を
コードする第１区域と、第１区域より下流に位置する第
２区域とから本質的に成り、第２区域はｔ−PAのセリン
プロテアーゼ活性のための触媒領域をコードする。この
配列はｔ−PAと実質的に同一の生物学的活性を有するタ
ンパク質の遺伝情報を指定する。

本発明の第３の面は、ｔ−PAと実質的に同一の生物学
的活性をもつタンパク質を生産するようにトランスフェ
クションあるいは形質転換された細胞を開示する。これ
らの細胞は、フィブリン結合領域をコードする第１区域
と、第１区域より下流に位置する第２区域とから本質的
に成るヌクレオチドに作用可能に結合した、プロモータ
ーを含んでなるDNA構成体を含有し、第２区域はｔ−PA
のセリンプロテアーゼ活性のための触媒領域をコードす
る。この配列はｔ−PAと実質的に同一の生物学的活性を
有するタンパク質の遺伝情報を指定する。

細胞は哺乳動物の細胞または微生物であることができ
る。好ましい微生物はバクテリア、とくに大腸菌（E.co
li）、および真核生物の微生物、とくに酵母菌サッカラ
ミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）
および糸状菌類、例えば、アスペルギルス（Aspergillu
s）を包含する。

本発明は、さらに、ｔ−PAと実質的に同一の生物学的
活性を有するタンパク質を生産する方法を提供する。こ
の方法は宿主細胞の中にDNA構成体をそう入する工程を
含んでなり、このDNA構成体はフィブリン結合領域をコ
ードする第１区域と第１区域より下流に位置する第２の
区域とから本質的に成るヌクレオチド配列に作用的に結
合したプロモーターを含有し、第２区域はｔ−PAのセリ
ンプロテアーゼ活性のための触媒領域をコードする。こ
の配列はｔ−PAと実質的に同一の生物学的活性を有する
タンパク質の遺伝情報を指定する。第２工程は宿主細胞
を適当な培地中で生長させることを包含し、次の工程は
宿主細胞が生産したDNA構成体によってコードされたタ
ンパク質生産物を単離することを包含する。宿主細胞は
哺乳動物の細胞または微生物であることができる。好ま
しい微生物はバクテリア、とくに大腸菌（E.coli）、お
よび真核動物の微生物、とくに酵母菌サッカラミセス・
セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）および糸状
菌類、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）を包含
する。

さらに本発明の他の面は、アミノ末端フィブリン結合
領域とカルボキシ末端プロテアーゼ領域とから本質的に
成る、ｔ−PAと実質的に同一の生物学的活性をもつタン
パク質を開示する。

本発明の他の面は、以下の詳細な説明および添付図を
参照すると明らかとなるであろう。

〔発明を実施するための最良の方法〕

本発明を説明する前に、ここで使用する幾つかの用語
の定義を記載することは、本発明の理解の助けになるで
あろう。

相補的DNAすなわちcDNA:mRNA鋳型中に存在する配列から
合成されたDNAの分子または配列。

DNA構成体（construct）：自然に存在する遺伝子から部
分的な形態で単離することができ、あるいは自然にはそ
うでなければ存在しない方法で結合および並置されたDN
Aのセグメントを含有するように変更された、一本鎖ま
たは二本鎖のDNA分子、またはこのような分子のクロー
ン。

プラスミドまたはベクター：宿主細胞中にそう入された
とき、その複製を提供する遺伝子情報を含有するDNA構
成体。複製は自律的であるか、あるいは宿主ゲノム中へ
の組込みであることができる。プラスミドは、一般に、
宿主細胞中で発現すべき少なくとも１つの遺伝子配列、
ならびにこのような遺伝子の発現を促進する機能をコー
ドする配列、例えば、プロモーターおよび転写の開始部
位およびターミネーターを含有する。それは線状または
閉じた環状の分子であることができる。

プレ−プロ区域（pre−pro region）：ある種のタンパ
ク質の前駆体のアミノ末端に存在し、そして一般に分泌
の間に、少なくとも一部分、タンパク質から裂開される
アミノ酸配列。プレ−プロ区域は、一部分、タンパク質
を細胞の分泌通路の中に向ける配列を含む。

領域（domain）：タンパク質分子の特定の生物学的活性
のために必要な構成要素を含有する、タンパク質分子の
特定のアミノ酸の三次元的自己集成列。

フィブリン結合領域：タンパク質をフィブリンへ結合す
るために必要なそのタンパク質の部分。天然ｔ−PAにお
いて、クリングル構造およびフィンガー領域はフィブリ
ン結合に寄与する。本発明によれば、EGF領域はｔ−PA
または変形されたｔ−PAのフィブリン結合に有意に寄与
しないことが発見された。

生物学的活性：ある分子が生物学的関係において（すな
わち、生物体、細胞、または生体外の複製物中におい
て）なす機能または機能の組。タンパク質の生物学的活
性は、触媒活動とエフェクター活動とに分けることがで
きる。フィブリン溶解因子の触媒活性は、前駆体の特異
的裂開（specificcleavage）による他のタンパク質の活
性化をしばしば含む。対照的に、エフェクター活性は生
物学的に活性な分子を他の分子、例えば、フィブリン、
または細胞に特異的に結合することを含む。エフェクタ
ー活性は、しばしば、生理学的条件下での触媒活性を増
強し、あるいはそれに必須である。触媒活性およびエフ
ェクター活性は、ある場合において、タンパク質の同一
領域に存在する。天然のｔ−PAについて、生物学的活性
は、フィブリン、プロ酵素または酵素前駆体の存在下
に、プラスミンに転化することによって特徴づけられ、
そしてプラスミンはフィブリンマトリックスを分解す
る。フィブリンはプラスミノゲンの活性化においてコフ
ァクターとして作用するので、天然のｔ−PAはフィブリ
ンの不存下ではほとんど活性をもたない。ここで使用す
るとき、「ｔ−PAと実質的に同一の生物学的活性」とい
う用語は、フィブリン、プロ酵素または酵素前駆体の存
在下に、プラスミノゲンをプラミンに転化することを包
含する。

前述のように、ｔ−PAはフィブリン凝塊の分解（degr
adation）において主要な役割を演ずることが知られて
いる。天然ｔ−PAはｔ−PAのフィブリン溶解活性に不必
要であることがわかった区域をその分子内に有するモザ
イクタンパク質であるので、フィブリン結合活性および
セリンプロテアーゼ活性が保持されているが、EGF領域
のすべてまたは一部分および他の非フィブリン溶解領域
がこのような変形ｔ−PAから排除された、変変ｔ−PAを
提供することが望ましい。さらに、増強されたフィブリ
ン結合活性または増延長され生体内半減期を有する変更
ｔ−PAを生産することが望ましいであろう。

本発明によれば、出発物質としてcDNAクローンまたは
ゲノムのクローンを使用して、組換え技術を用いること
によって、これらの新規なタンパク質を生産することが
好ましい。適当なDNA配列は、また、標準的手順に従っ
て合成できる。cDNAクローンを使用することが好まし
い。なぜなら、変形ｔ−PAを生産するための出発物質と
して、天然ｔ−PAをコードする完全長のcDNAを使用する
ことによって、イントロンが除去され、こうして天然ｔ
−PAのすべてのエクソンが存在しかつ互いに関して正し
く配向されているからである。完全長のcDNAは、また、
ｔ−PAのcDNAを５′末端から「チューイングバック（ch
ewing back）」し、こうして宿主細胞の中に究極的にそ
う入できる多数のcDNA断片を得ることによって、変形分
子を容易に発生させるという利点を提供する。あるい
は、cDNAはオリゴヌクレオチド指令（directed）突然変
異誘発を経る配列の欠失またはそう入のための鋳型とし
て使用できる。

ｔ−PAのcDNAの利用は、追加のクリングル構造および
フィンガー領域のそう入によって、天然のｔ−PAのフィ
ブリン結合領域の便利な増強を可能とする。この方法
は、天然ｔ−PAまたは他のタンパク質中に見出される機
能的領域の最適な組合せを選択して、フィブリン結合お
よびセリンプロテアーゼ活性に関して増強された生物活
性をもつフィブリン溶解剤を得る手段を提供する。

したがって、本発明は、ｔ−PAと実質的に同一の生物
学的活性を有する新規なタンパク質を生産する方法を提
供する。ここに記載する新規なタンパク質は、天然のｔ
−PAよりも５倍〜10倍大きい生体内半減期を有すること
が示された。これらの新規なタンパク質は、トランスフ
ェクションした哺乳動物細胞、および形質転換された菌
類およびバクテリア中において発現される。

成熟ヒトｔ−PAをコードする配列を含有するcDNAクロ
ーンは、すでに同定されている。ｔ−PAのcDNA配列はプ
ラスミドpDR1296中にそう入され、そしてこのプラスミ
ドは大腸菌（E.coli）JM83中に導入された。この形質転
換体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（American Type Culture Collection,Bethesda,MD）
に受託され、そして受託No.53347を受けた。

菌株pDR1296/JM83をｔ−PAのcDNA源として使用した。
プラスミドpDR1296を単離し、そしてｔ−PAのcDNAを制
限エンドヌクレアーゼ消化によって切り取った。ｔ−PA
制限断片を次いでBal 31とともにインキュベーション
し、そして酵素の反応時間を調節して、大きさの不均一
性を示す一連のｔ−PAヌクレオチド配列を生産した。こ
の大きさの不均一性は、ｔ−PAのcDNAの５′末端の漸進
的短縮から生ずる。

Bal 31消化した断片をゲル電気泳動によって分離し、
そして所望の大きさの範囲の断片を選択した。断片を常
用の技術に従いゲルから溶離した。

第２のアプローチにおいて、pDR1296からのcDNA配列
の部分をオリゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発のた
めの鋳型として使用した。この方法により、天然ｔ−PA
の特定の領域をコードする配列を正確に欠失または変更
した。

第３のアプローチにおいて、変形ｔ−PA配列の５′コ
ード区域を、合成オリゴヌクレチオドから構成し、そし
てcDNAの３′区域に連結した。

次いで、変形ｔ−PA断片を適当なプレ−プロ配列に連
結した。ｔ−PAのプレ−プロ配列は、cDNAまたはゲノム
のライブラリーから単離することができ、あるいは合成
したオリゴヌクレオチドから構成することができる。オ
リゴヌクレオチドは好ましくは機械合成し、精製し、そ
してアニーリングして二本鎖断片を構成する。得られた
二本鎖断を、必要に応じて、結合してプレ−プロ配列を
生成する。このプレ−プロ配列は、第１図に描かれてい
るように、105bp配列からなる。次いで、合成したプレ
−プロ配列を変形ｔ−PA断片の５′末端に接合した。選
択した宿主細胞のタイプに依存して他のプレ−プロ配列
を使用できる。ある場合において、宿主種に対して内因
性のプレ−プロ配列を使用することが望ましいであろ
う。

プレ−プロ−ｔ−PA断片を適当な発現ベクター中にそ
う入し、次いでこれを適当な宿主細胞中にそう入する。
そう入の方法は選択した特定の宿主細胞に依存するであ
ろう。異種DNAで哺乳動物の細胞をトランスフェクショ
ンする方法およびバクテリアおよび菌類を形質転換する
方法は、この分野においてよく知られている。適当な発
現ベクターは、宿主細胞中の異種遺伝子の転写を命令で
きるプロモータを含むであろう。

ある場合において、発現ベクターは、さらに、複製起
点ならびに、選択した宿主細胞に依存して、発現のレベ
ルを調節しそて／または増強する配列を含むことが好ま
しい。適当な発現ベクターはプラスミド、RNAおよびDNA
ウイルスまたは細胞のDNA配列から誘導することがで
き、あるいは各々の要素を含有することができる。

本発明の実施において使用するために好ましい原核細
胞は大腸菌（Escherichia coli）の菌株であるが、バシ
ルス（Bacillus）および他の属も有用である。これらの
宿主を形質転換しそしてそれらの中でクローン化された
異種DNA配列を発現する技術はこの分野においてよく知
られている〔例えば、Maniatisら、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー、1982参照〕。バクテリア宿主中の異
質DNAの発現に使用されるベクターは、一般に、選択可
能な遺伝標識、例えば、抗生物質耐性のための遺伝子、
および宿主細胞中で機能するプロモーターを含有するで
あろう。適当なプロモーターは、次のものを包含する:t
rp〔NicholsおよびYanofsky,Meth.in Enzymology 101:
155、1983〕、lac〔Casadabanら、J.Bact.,143:971−98
0、1980〕、TAC〔Russel）ら、Gene 20:231−243、198
3〕、およびファージプロモーター系。バクテリアの形
質転換に有用なプラスミドは、次のものを包含する。:p
BR322〔Bolivarら、Gene）２、95−113、1977〕、pUCプ
ラスミド〔Messing,Meth.in Enzynology,101.20−77、1
983、およびVieiraおよびMessing,Gene,19:259−268、1
982〕、pCQV2〔Queen,J.Mol.Appl.Genet.,２:1−10、19
83〕、およびそれらの誘導体。

真核生物の微生物、例えば、酵母菌Saccharomyces ce
revisiae、または線状菌類、例えば、アスペルギルス
（Aspergillus）もまた、宿主細胞として使用できる。
アスペルギルス（Aspergillus）のとくに好ましい種
は、A.ニドランス（A.nidulans）、A.ニガー（A.nige
r）、A.オリゼー（A.oryzae）、およびA.テレウス（A.t
erreus）を包含する。酵母菌を形質転換するための技術
はBeggsによって記載された〔Nature,275:104−108、19
78〕。酵母菌中で使用するための発現ベクターは、次の
ものを包含する:YRp7〔Serenlら、Proc.Natl.Acad.Sc
i）USA,76:1035−1039、1979〕、YEp13〔Broachら、Gen
e,８:121−133、1979〕、pJDB248 pJDB219〔Beggs、同
上〕、およびそれらの誘導体。このようなベクターは、
一般に、選択可能な遺伝標識、例えば、栄養遺伝標識TR
Pを含み、これによりtrpl突然変異を有する宿主での選
択が可能となる。酵母菌の発現ベクター中の使用に好ま
しいプロモーターは、次のものを包含する：酵母菌解糖
系遺伝子のためのプロモーター〔Hitzemanら、J.Biol.C
him.,255:12073−12080、1980;AlberおよびKawasaki,J.
Mol.Appl.Genet.,１:419−434、1982〕、またはアルコ
ールデヒドロゲナーゼ遺伝子〔Youngら、Genetic Engin
eering of Microorganisms for Chemicals、Hollaender
ら編、335ページ、プレナム（Plenum）、ニューヨー
ク、1982;およびAmmerer,Meth.in Enzymology,101:192
−201、1983〕。酵素菌形質転換体中で生産された変形
ｔ−PAタンパク質の精製を促進しかつ適切なジスルフィ
ド結合の形成を得るために、ｔ−PAプレ−プロ配列の代
りに分泌されるタンパク質をコードする酵母菌遺伝子か
らのシグナル配列を使用することができる。とくに好ま
しいシグナル配列は、MF1遺伝子のプレ−プロ区域であ
る〔KurjanおよびHerskowitz,Cell,30:933−943、198
2〕。アスペルギルス（Aspergillus）の種は既知の方
法、例えば、Yeltonらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81:1740−1747、1984〕に従って形質転換することが
できる。

より高等な真核動物の細胞は、本発明の実施において
宿主細胞として機能することができる。培養した哺乳動
物の細胞、例えば、BHA,CHO、およびJ55 8Lの細胞系が
好ましい。tk−BHK細胞はとくに好ましい。哺乳動物の
細胞中に使用するための発現ベクターは、哺乳動物中に
導入された異質遺伝子の転写を指令できるプロモーター
を含むであろう。とくに好ましいプロモーターはSV40
〔Subramaniら、Mol.Cell.Biol.,１:854−64、1981〕お
よびMT−１プロモーター〔Palmiterら、Science,222:80
9−814、1983〕を包含する。また、発現ベクター中に転
写ターミネーターが含有され、このターミネーターは発
現すべきDNA配列のためのそう入部位より下流に位置す
る。好ましいターミネイターはヒト生長ホルモン（hG
H）遺伝子ターミネーターである〔DeNoteら、Nuc.Acids
Res.,９:3719−3730、1981〕。

培養した哺乳動物の細胞中の突然変異体ｔ−PAの発現
のため、クローン化ｔ−PAを含有する発現ベクターは、
適当なトランスフェクション技術、例えば、リン酸カル
シウム媒介トランスフェクション〔Wiglerら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA 77:3567−3570、1978によって改変さ
れた、GrahamおよびVan der Eb,Virology 52:456−46
7、1973〕の方法によって細胞の中に導入される。DNA−
リン酸カルシウム沈殿物を形成し、そしてこの沈殿物を
クロロキン（100μｍ）を含有する媒質の存在下に細胞
に適用する。細胞を沈殿物とともに４時間インキュベー
ションし、次いで２分間15％のグリセロールショックを
与える。ある比率の細胞はDNAを取り込み、そしてそれ
を細胞内に数日間維持する。小比率の細胞は宿主のゲノ
ムの中にDNAを組込むか、あるいは非染色体核構造体中
にDNAを維持する。これらのトランスフェクタント（tra
nsfectant）は選択可能な表現型（選択可能な遺伝標
識）を与える遺伝子との同時トランスフェクション（co
transfection）によって同定される。好ましい選択可能
な遺伝標識はDHFR遺伝子であり、この遺伝子はヌクレオ
チド合成の阻害剤であるメトトレキセイト（MTX）に対
する耐性を細胞に付与する。宿主細胞がDNAを吸収した
後、薬物選択を適用して、適当な方法で選択可能な遺伝
標識を発現している細胞の個体群を選択する。

MTXを培地に添加し、好ましくは培地中のMTXの濃度を
順次に増加し、次いで薬物耐性の細胞系を希釈によって
クローニングすることを反復することにより、発現レベ
ルを増加する１つの手段として、同時増幅（coamplific
ation）を達成することができる。増幅能力の変動は、
同時トランスフェクションしたDNA配列の初期のゲノム
配置（すなわち、染色体外対染色体）ならびに種々の量
のDNAの転位が起こりうる、増幅自体の機構の両者に関
係する。これは、頻繁かつ安定な同時増幅を行うことが
できることが前に示されたクローンのそれ以上の増幅に
おいて認められる。この理由のため、各増幅工程後に希
釈によってクローン化することが必要である。次いで、
DHFR遺伝標識を発現する細胞を選択し、そしてｔ−PAの
生産についてスクリーニングする。スクリーニングは、
酵結合免疫収着アッセイ（ELISA）または生物学的活性
のアッセイによって実施できる。

さらに、ある条件下に、ｔ−PAの生産は培養中の哺乳
動物の細胞に悪影響を及ぼすことが発見された。これは
一部分プラスミン（非特異的プロテアーゼ）のためであ
ると信じられ、このプラスミンはｔ−PAを生産するよう
にトランスフェクションされた細胞を血清の一成分であ
るプラスミノゲンを含有する培地中で培養するとき発生
する。トランスフェクションされた細胞によって生産さ
れるｔ−PAはプラスミノゲンを活性化してプラスミンに
し、このプラスミンは細胞膜を攻撃し、そして細胞の剥
離に寄与する。他のタンパク質加水分解活性も関与する
と信じられる。培地中にプロテアーゼ阻害剤を含める
と、プラスミノゲンの活性化がブロッキングされ、そし
てｔ−PAの生産を促進する。とくに好ましいプロテアー
ゼ阻害剤はアプロチニンであり、これは培地中にほぼ10
0単位/ml〜50,000単位/mlの濃度で、好ましくはプラス
ミノゲン不含血清を含有する培地中に100単位の濃度
で、あるいは正常の胎児子牛血清を用いる場合、ほぼ10
00単位/ml〜50,000単位/ml、好ましく1000単位/mlの濃
度で含められる。

そのように生産されたｔ−PAは、培地をを取り出し、
そしてそれを分画することによって培養細胞から回収さ
れる。好ましい分別法は、抗ｔ−PA抗体、フィブリン−
セライト（celite）カラムまたはリジン−セファロース
カラムを用いるアフイニティークロマトグラフィーであ
る。また、他の普通の精製法、例えば、イオン交換クロ
マトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィーまたは
ゲル濾過を用いることができる。

要約すると、本発明は、変形ｔ−PAタンパク質を提供
し、そして安定にトランスフェクションされたあるいは
形質転換された宿主細胞を使用することによって、天然
ｔ−PAと実施的に同一の生物学的活性を有する変形ｔ−
PAタンパク質を生産する方法を提供する。次いで、こう
して発現されたタンパク質生産物を細胞または細胞増殖
培地から精製し、そして生物学的活性についてアッセイ
する。このアッセイは、プラスミノゲンのプラスミンへ
の転化、フィブリン結合親和性または血漿半減期特性を
監視できる。免疫学的アッセイもまた使用できる。

以下の実施例を要約すると、実施例１はボウウェス
（Bowes）黒色腫の細胞系からのmRNAからつくったｔ−P
AのcDNAクローンを開示する。このcDNAを使用してプラ
スミドpDR1296を構成し、そしてこのプラスミドを使用
してE.coli菌株JM83を形質転換した。次いで、pDR1296
のｔ−PA配列を、オリゴヌクレオチドから構成した合成
プレ−プロ配列に連結した。MT−１プロモーターおよび
ヒト生長ホルモンのターミネーターを加え、そして第２
図に示すベクターZme99を構成した。

実施例２は、正常肝臓組織から誘導されたDNAライブ
ラリーから得られた、ヒトゲノムｔ−PAのクローニング
および配列決定を開示する。

実施例３は、全長のpDR1296t−PAクローンを使用し
て、ランダム５′末端欠失を有するｔ−PA配列の調製を
開示する。TACプロモーターおよびｔ−PAプレ−プロ配
列を、不規則に欠失したｔ−PAのcDNA配列に結合した。
pDR817構成体は、完全長のｔ−PAクローンを用いて得ら
れたものよりも10〜30倍大きいｔ−PAフィブリン溶解活
性の生成を指令した。培養した哺乳動物中の端を切った
（truncated）配列の発現も開示した。

実施例４および５は、ｔ−PAのフィンガー領域および
生長因子領域のためのコード配列をループアウト（loop
ing out）する方法を記載する。

実施例６および７は、フィンガー領域、生長因子領域
およびクリングル１構造のためのコード配列をループア
ウトして、変形ｔ−PAを生産する方法を開示する。

実施例８は、合成オリゴヌクレオチドを使用する突然
変異体ｔ−PA配列の構成を開示する。

実施例９は、欠失突然変異誘発によって構成される、
生長因子領域コード配列を欠失した突然変異体配列を開
示する。

実施例10は、バクテリア発現ベクターpDR816（実施例
３に記載する）を使用して、形質転換されたE.coli JM1
05中で変異体ｔ−PAを発現する方法を記載する。

実施例11は、子供ハムスター腎（BHK）細胞を変異体
ｔ−PA配列を含んでなる発現ベクターでトランスフェク
ションすることによって、哺乳動物中で変異体ｔ−PAを
発現する方法を教示する。

実施例12は、変異体ｔ−PAヌクレオチド配列を含んで
なるベクターで形質転換された、S.cerevisiae細胞中で
突然変異体ｔ−PAを発現することを記載する。

次の実施例により、本発明をさらに説明する。

〔実施例〕

実施例１ 完全長ｔ−PAクローンの構成 ヒトｔ−PAcDNAクローンの配列は報告されている〔Pe
nnicaら、Nature,301:214−221、1983〕。この配列は、
32−35アミノ酸のプレプロペプチドおよび引続く527−5
30アミノ酸の成熟タンパク質をコードする。

変異体ｔ−PAのためのコード配列を含んでなるcDNAク
ローンは、（Bowes）黒色腫細胞系からのmRNAを出発物
質として使用して構成された〔RijkenおよびCollen,J.B
iol.Chem.,256:7035−7041、1981〕。次いで、このcDNA
を使用してプラスミドpDR1296を構成した。pDR1296で形
質転換したエシェリシャ・コリ（Esherichiacoli）菌株
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）に受託No.53347
で受託された。

プレ−プロ配列はcDNAクローンpDR1296中に存在しな
いので、それは合成オリゴヌクレオチドから構成し、引
続いてcDNAに連結した。合成ｔ−PAプレ−プロ配列にお
いて、BamH IおよびNco Iの裂開部位はプレ−プロ配列
の第１コドン（ATG）に対して５′のすぐ近くに導入
し、そしてBgl II（Sau3A,Xho II）部位はプレ−プロ配
列の３′末端に維持された。天然プレ−プロ配列は中央
付近に便利な制限部位を欠く。しかし、配列GGAGCA（ア
ミノ酸−20および−19Gly−Alaの遺伝情報を指定する）
をGGCGCCに変更して、アミノ酸配列を変化させないで、
Nar I部位を得ることができる。

プレ−プロ配列を構成するために、アプライド・バイ
オシステム（Applied Biosystem）380−Ａ型DNA合成装
置を使用して、次のオリゴヌクレオチドを合成した： 精製後、オリゴマーZC131およびZC132をアニーリング
して12塩基対のオーバラップを生成した（切片１）。オ
リゴマーZC133およびZC134を同様にアニーリングした
（切片２）。

オリゴマーをPol I緩衝液〔ベセスダ・リサーチ・ラ
ブス（Bethesda Research Labs）〕中で混合し、65℃に
５分間加熱し、そして室温にゆっくり４時間冷却してア
ニーリングした。10単位のDNAポリメラーゼを加え、そ
して反応を室温において２時間進行させた。この混合物
を８％のポリアクリルアミド−尿素の配列決定ゲル上で
1,000ボルトで2.5時間電気泳動させて、反応生成物を大
きさで分別した。正しい大きさの断片（ポリメラーゼの
反応が完結したもの）をゲルから切断し、そして抽出し
た。

アニーリング後、切片１をBamH IおよびNar Iで切断
し、BamH I＋Nar I−切断pUC8中にクローン化した〔Vie
iraおよびMessing,Gene,19:259−268、1982;およびMess
ing）,Meth.in Enzymology,101:20−77、1983〕。切片
２を再アニーリングし、そしてNar IおよびBgl IIで切
断し、そしてBam II＋Nar（Sau3A,Xho I−切断pUC8）中
にクローン化した。コロニーを適当な標識オリゴヌクレ
オチドでスクリーニングした。コロニーとのハイブリダ
イゼーションによって陽性と同定されたプラスミドを配
列決定して、正しい配列がクローン化されたこと確かめ
た。

次いで、切片Ｉを適当なpUCクローンのBamH I＋Nar I
二重消化物から精製した。２つの断片をNar I部位で連
結し、そしてBamH I−切断pUC8中にクローン化した。

次いで、pDR1296のｔ−PA配列を、次の方法で、合成
プレ−プロ配列に連結した（第２図）。プラスミドpIC1
9R〔Marshら、Gene,32:481−486、1984〕をSma Iおよび
Hind IIIで消化した。次いで、地図位置270（Pvu II）
から位置5171（Hind III）までのSV40のori区域を直線
化されたpIC19Rに結合してプラスミドZem67を生成し
た。このプラスミドをBgl IIで次に裂開し、そしてヒト
生長ホルモンの遺伝子からのターミネーター区域〔De N
otoら、Nuc.Acids Re₅.,９:3719−3730、1981〕をBgl I
I−BamH I断片としてそう入して、プラスミドZem86を生
成した。合成ｔ−PAプレ−プロ配列をSau3Aで消化してp
UC8ベクターから取り出した。この断片をBgl II消化し
たZem86中にそう入して、プラスミド88を生成した。プ
ラスミドpDR1296をBgl IIおよびBam IIで消化し、ｔ−P
AcDNA断片を単離し、そしてBgl II−切断Zem88中にそう
入した。得られたプラスミドをZem94と表示した。

次いで、MI−１プロモーター、完全ｔ−PAコード配
列、およびhGHターミネーターを含んでなるベクターZem
99を、次の方法で組立てた（第２図）。MT−１プロモー
ターを包むKpn I−BamH I断片をMThGH111〔Polmiter
ら、Science,222:809−814、1983〕から単離し、そして
pUC18中にそう入してZem93を構成した。プラスミドMThG
H112〔Palmiterら、同上〕をBgl IIで消化し、そして再
連結してhGHコード配列を排除した。次いで、MT−１プ
ロモーターおよびhGHターミネーターをEcoR I断片とし
て単離し、そしてpUC13中にそう入してZem4を構成し
た。次いで、Zem93をBamH Iおよびsal Iで消化して直線
化した。Zem4をBgl IIおよびSal Iで消化し、そしてhGH
ターミネーターを精製した。ｔ−PAプロ−プロ配列を、
BamH I−Xho断片としてpUC8ベクターから取り出した。
次いで３つのDNA断片を連結し、そしてZem97の構造を有
するプラスミド（第２図）を選択した。Zem97をBgl II
で切断し、そしてZem94からのXho II t−PA断片をそう
入した。得られたベクターはZem99である。

実施例２ ヒトゲノムｔ−PAクローンのクローニングおよび配列決
定 ゲノムｔ−PAクローンを、正常の肝組織から誘導され
たDNAライブラリーから得た。このライブラリーは胎児
ヒト肝臓DNA断片をハグテリオファージ・ラムダ中にそ
う入することによって構成した〔Lawnら、Cell,15:1157
−1174、1978〕。

このライブラリーを使用してE.コリ（E.coli）菌株LE
392（ATCC 33572）を感染させた〔Maniatisら、Molecul
ar cloning:A Laboratory Manual），コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー、1982、504ページ〕。
0.2％のマルトース、10mMのMgSO₄、および50μg/mlのチ
ミジンを含有するＬブイヨン中で細胞を一夜培養して、
10mMのMgSO₄中で２倍に濃縮した。750μのこの濃縮物
を、１μのファージライブラリー（200,000ファージ
／μ）と一緒に、25cm×22cmの平板を使用するNZYア
ミン軟質寒天の上層中のＬブイヨン寒天上で平板培養し
た。37℃で一夜のインキュベーション後、ほぼ10⁵/平板
のコロニーが得られた。コロニーをニトロセルロースに
移し、そしてリフト（lift）を0.1MのNaOH、1.5MのNaCl
で処理し、空気乾燥し、そして80℃で２時間ベーキング
した。SET緩衝液（SETは１につき175.2gのNaCl、72.7
gのトリス、14.8gのEDTAを含有する、HClでpH8.0）中で
65℃において、プレハイブリダイゼーションおよびハイ
ブリダイゼーション（全長の、ニック翻訳したｔ−PAcD
NAプローブ）を実施した。フィルターを２×SSC、0.1％
のSDS中で洗浄し、乾燥し、そしてオートラジオグラフ
にかけた。13の予備的陽性のものが同定された。プラー
ク精製の２つのラウンド（上のようにスクリーニングし
た）は、13の群から９つの陽性物を同定した。９つの陽
性のゲノムのクローンをE.コリ（E.coli）LE392上で平
板培養し、一夜増殖させ、そしてリゼイトを調製した。
ファージをCsCl勾配で精製し、そして表１に示すオリゴ
ヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによってマッ
ピングを実施した。

フローブZC94、ZC96およびZC98はシグナルペプチドの
コード区域にハイブリダイズするであろう。残りのプロ
ーブは成熟ペプチドコード区域へハイブリダイズする。
９つの陽性単離物は３つの明確なクラスに入ることがわ
かり、これらは一緒になって全ｔ−PAコード区域にわた
る。インサートの大きをEcoR Iの消化によって決定し
た。

各クラスについて、最大のインサートをもつクローン
をEcoR I,Bgl II、およびEcoR I＋Bgl IIで消化し、そ
して代表的オリゴヌクレオチドプローブを使用してサザ
ンブロット〔Southern,J.Mol.Biol.98:503−517、197
5〕でプロービングした。クローン番号９は成熟ｔ−PA
のための全コード配列を含有したが、プレ−プロ区域を
含有しないことがわかった。クローン番号９からのイン
サートのEcoR I断片およびBgl II−EcoR I断片を、配列
決定およびそれ以上の分析のために、M13およびpUC13の
中にそう入した。断片はジデオキシ法によって配列決定
した〔Sangerら、J.Mol.Biol.,143:161−1983、およびS
angerら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 74:5463、197
7〕。

実施例３ ランダム５′末端の欠失を有するｔ−PA配列の調製 A.5′コード配列の欠失 10μｇのpDR1296を５単位のBgl IIまたは５単位のNar
Iで完全に消化した。得られた直線化DNAを0.7％のアガ
ロースゲル上で電気泳動させた。DNA断片をTE緩衝液（1
0mMのトリス、pH7.4、5mMのEDTA）で溶離した。DNA断片
を46μのH₂Oおよび12μの５×Bal31緩衝液（3MのNa
Cl、62.5mMのCaCl₂、100mMのトリス−HCl、pH8.0、50mM
のEDTA、pH8.0）＋２μのBal31（0.5単位／、ベセ
スダ、リサーチ・ラボラトリーズから入手した）中に再
懸濁させた。反応混合物を30℃でインキュベーション
し、そして10μのアリコートを１分間隔で６分間にわ
たり取出した。消化した試料を一緒にし、フェノール−
CHCl₃で抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。断片
の末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）およびdNT
Pでフィルインした。このフィルイン（fll−in）反応
後、試料をXba lで消化し、そして0.7％のアガロースゲ
ル上で分離した。1700bpより小さい断片を切出し、そし
てTE緩衝液で抽出した。引続くマッピングは55の末端が
切られた配列を同定した。

B.pDR817発現ベクターの調製 第３図を参照して、28bpのtrpAターミネーター（Ｐ−
Ｌバイオケミカルスから入手した）を、Sat Iで切断し
かつT4DNA断片によりフィルインしたpUC18中にそう入し
て、プラスミドpDR813を形成した。28bpのターミネータ
ー断片を同様にpIC19RのフィルインされたCla I部位に
そう入して、プラスミドpDR812を構成した。TACプロモ
ーターおよびlacオペレーター（lacO）を含有するプラ
スミドpDR540〔Russelら、Gene,20:231−243、1982〕
を、Hin IIIで切断し、クレノー断片で充填し、そしてB
amH Iで消化した。得られる92bpの断片は、TACプロモー
ターおよびlacOを含み、BamH I＋Sama I cut pDR813中
に結合してpDR814を形成した。次いで、プラスミドpDR8
14をEcoR IおよびHind IIIで消化し、そしてtrpAターミ
ネーター、TACプロモーターおよびlacOを含むこの断片
を単離し、Hind IIIで完全に消化しかつEcoR Iで部分的
に消化したpDR812中に連結した。得られたプラスミドを
pDR815と表示した。

プラスミドZem99（実施例１参照）をDam IIIおよびXb
a Iで消化し、そしてｔ−PAcDNAを含むこの断片（プレ
−プロ配列を含む）を単離した。プラスミドpDR815をBa
mH IおよびXba Iで切断し、そしてｔ−PA断片を結合し
てプラスミドpDR816を構成した。

10μｇのpDR816を５単位のBgl IIで完全に消化し、そ
してDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）を使用して末
端をフィルインした。次いでこのDNAを５単位のXba Iで
完全に消化し、フェノール−CHCl₃で抽出し、エタノー
ルで沈殿し、そして0.7％のアガロースヂルで電気泳動
させた。3050bpの断片（pIC19R、TACプロモーターおよ
びｔ−PAプレ−プロ配列を含む）をゲルから溶離した。

この3050bpの断片および不規則に欠失したｔ−PAcDNA
配列を、16℃で一夜連結した。結合混合物を使用して、
コンピテントE.コリ（E.coli）JM83細胞を形質転換し
た。形質転換した細胞をアンピシリン平板上で平板培養
し、そして耐性コロニーを選択し、そして新しいアンピ
シリン含有平板に移し、これらの操作を３回実施した。
平板を37℃で一夜インキュベーションし、そしてコロニ
ーをニトロセルロースフィルターに移した。フィルター
でアンピシリン平板上に配置し、37℃で４時間インキュ
ベーションし、次いでCHCl₃蒸気で10分間処理した。フ
ィルターを10分間空気乾燥し、フィブリン平板上に直線
配置し、そして37℃で一夜インキュベーションした。フ
ィルターを平板から持上げ、そしてフィブリンの溶解を
起こすことができるコロニーをさらに分析するため採取
した。フィルターの反復実験の組をコロニーの免疫ブロ
ットアッセイのために同様に処理した。ｔ−PA様ポリペ
プチドを生産できるコロニーを同定した。

pDR817と表示する１つのプラスミドを詳しく特性づけ
た。このプラスミドをBamH IおよびXba Iで消化し、そ
して1270bpのｔ−PA断片をゲル精製し、そしてM13mp18
（複製形）中にサブクローニングした。インサートDNA
配列をジデオキシ法によって決定した。結果は、pDR817
がヌクレオチド192−524〔番号はPennica,同上、に基づ
く〕を欠いていることを示した。こうして、それは第4A
図に示すようなアミノ末端をもつ416アミノ酸から成る
成熟タンパク質をコードする。天然ｔ−PAのアミノ酸２
−112は欠失された。

E.コリ（E.coli）菌株JM105をpDR816およびpDR817で
形質転換した。非形質転換細胞および形質転換体を、0.
4％のグルコースおよび0.2％のカザアミノ酸を補充した
M9培地中で１夜増殖させた。10mlのアリコートを各培地
から取り、そして細胞を収得した。誘導物質IPTG（イソ
プロピルチオガラクトシド）を、培養物の残部に1mMの
最終濃度に加えた。120分および240分間誘導後、10mlの
アリコートを取り、そして細胞を収穫した。細胞の沈殿
物を水で１回洗浄し、そして100mMのトリス、pH8.0、中
の20％のスクロースの450μ中に再懸濁させた。50mM
のEDTA中の5mg/mlのリソチームの50μの添加によっ
て、細胞を溶解した。混合物を室温で10分間インキュベ
ーションし、500μの細胞溶解緩衝液（0.3％のトリト
ンＸ−100、150ミリモルのトリス、pH8.0、0.2モルのED
TA）を加え、そしてこの混合物を氷上に30分間置いた。
リゼイトをベックマン（Beckman）SW50ローター中で35,
000rpmで１時間遠心した。上澄みを取出し、そしてフィ
ブリン溶解法によってアッセイした。結果（第２表）が
示すように、pDR817構成体は全長のｔ−PAクローンを使
用して得られたものよりも10〜30倍高いｔ−PA活性の生
成を指令した。

形質転換した細胞および形質転換しない対照のアリコ
ートを、ウェスターンブロットアッセイによりタンパク
質の生産ついて分析した。DNA配列の分析によると、pDR
817t−PAポリペプチドはpDR816により生産されたポリペ
プチドよりもほぼ100アミノ酸だけ短いことが示された
（第4A図）。pDR817で形質転換したE.coli JM105は、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Americ
an Type Culture Collection）に受託No.53446で受託さ
れた。

C.哺乳類の細胞におけるｔ−PA欠失変異体の発現 発現ベクターは以下の方法で構成した。プラスミドZe
m86（実施例１に記載）をHind IIIを用いて分解して、
両端をDNAポリメラーゼＩ（Klenowフラグメント）を用
いてフィルインした。次に、線形化したDNAをEcoR Iを
用いて分解し、SV40複製開始点配列を有する約450個の
塩基対断片をゲル精製し、Sma I＋EcoR Iで分解したpUC
13に連結した。生成するベクターをpDR3001と命名し
た。プラスミドpDR3001をSal IとEcoR Iで分解し、SV40
複製開始点とポリリンカー配列とを有する約450個の塩
基対を精製した。Zem86をEcoR Iで部分的に分解し、Xho
Iで完全に分解して、SV40複製開始点配列を除去した。
次に、pDR3001からのSV40断片を、線形化したZem86に連
結した。生成するプラスミドをpDR3002と命名した（第
５図）。

哺乳類の細胞の発現ベクターを次に構成した。プラス
ミドpDR3002をBamH IはXba Iで分解した。実施例3Bに記
載のバクテリアのベクターをBamH IとXba Iとで分解
し、ｔ−PA配列をゲル精製し、線形化したpDR3002に連
結した。生成するベクター（表３）SV10プロモーター変
異ｔ−PA配列−hGHターミネーターの発現単位を含む。
ベクターpDR3004（第５図）はpDR817からの変異ｔ−PA
配列を有する。pDR3004からの一次翻訳生成物は、第4A
図に示される配列を有することが予想される。pDR3004
で形質転換したE.コリ（E.coli）LM1035は、受託番号が
53445でAmerican Type Culture Collectionに寄託され
た。

第３表に記載のベクターは、標準的処理法に従って培
養した哺乳類の細胞をトランスフェクションするのに使
用される。対数的に増殖するTK^-子ハムスター腎臓（BH
K）細胞を用いてマウスの野性型DHFR遺伝子（pSV2−DHF
R,Subramani等、Mol.Cell.Biol.,１:854〜864頁、1981
年に開示）をコードする発現ベクターと変異ｔ−PAタン
パク質をコードする発現ベクターとの混合物（比率、1:
1）を同時トランスフェクションした。トランスフェク
ションから24時間後に、細胞に（リジン−セファロース
カラム上を通過させることによってプラスミノーゲンを
除いた）10％の胎児ウシ血清、アプロチニン（100単位/
ml）、ペニシリンおよび250mMのMTXを含むDulbeccoの改
質Eagle培地（DME）を加えた。細胞に、この選択培地を
引き続く10〜14日間に亙り数回補給した。フィブリン・
プレート法によって薬剤耐性コロニーのｔ−PA活性をス
クリーニングした。1pg/細胞／日より高い水準で活性タ
ンパク質を産生する細胞系を更に増幅し、希釈によって
クローン化し、そしてタンパク質と単離と特徴付けのた
めにスケールアップした。

上記の欠失変異株の３種類を選択して、更に特徴づけ
を行った。これらは変異株3016,3004および3008に対応
し、３種類の異なる領域に欠失を有している（第３表参
照）。これら３種類の試験した端が切除されて分子総て
を検出することができるモノクローナル抗体を端が切除
されたtPAの検出のための一次抗体として用いた。端が
切除されたtPA類の検出の標準的なELISA試験法を以下に
示す。

端が切除されたtPAのELISA法 １μg/mlの緩衝液Ａ中モノクローン抗体100μをプレ
ートし（緩衝液Ａ＝100mMのNa₂CO₃、pH9.6）； ４℃で一晩インキュベートし； 緩衝液Ｂで３回洗浄し（緩衝液Ｂ＝10mMのリン酸ナトリ
ウム、pH7.2、150mMのNaCl、0.5％のTween20）； 緩衝液Ｃで37℃で２時間ブロックし（緩衝液Ｃ＝緩衝液
Ｂ＋１％BSA）； 試料を緩衝液Ｃに加え、37℃でインキュベートし； 緩衝液Ｂで３回洗浄し； 4.5μg/mlのポリクローン・ウサギ抗−tPAを100μ加
え； 37℃で１時間インキュベートし； 緩衝液Ｂで３回洗浄し； HRP結合ヤギ抗−ウサギを加え； 室温で１時間インキュベートし； 緩衝液Ｂで４回洗浄し；そして、 発色させる。

変異タンパク質3004および3008を、リジン−セファロ
ースカラム上で精製した。細胞培地を負荷緩衝液（50mM
のリン酸ナトリウム、pH7.3、0.1MのNaCl、0.005％のTw
een80、0.003MのNaN₃）に対して一晩透析した。透析し
た溶液を0.5ml/分でリジン−セファロースカラムに加え
た。カラムを負荷緩衝液で洗浄した後、結合した物質を
0.4Mのアルギニンを含む負荷緩衝液で溶出し。溶出液分
画をELISAおよびフィブリン溶解法によって分析した。

フィブリン溶解法はBinder等の方法（J.Biol.Chem.,2
54、1998頁、1979年）に基づいている。10mlのウシ・フ
ィブリノーゲン溶液（0.036Mの酢酸ナトリウム、pH8.
4、0.036Mのバルビタール・ナトリウム、0.145MのNaC
l、10^-4MのCaCl₂、0.02％NaN₃中3.0mg/ml）を、1.5％の
同じ緩衝液中低融点アガロースの溶液10mlに40℃で加え
た。この溶液に10μのウシ・トロンビン（500単位/m
l）を加えた。混合物をGelbondアガロース支持シート
（Marine Colloids）に加えて、放冷した。ウェルをア
ガロース中で切断して、ウェルに試験試料10μ、及び
0.1％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝食塩水10μ
を添加した。結果を、精製したtPAを用いて調製した
標準曲線と比較した。ウェルの周りの透明なハロの出現
は、生物的に活性なプラスミノーゲン・アクティベータ
の存在を示している。

実施例4. フィンガー領域および生長因子 領域コード配列のループ・アウト ｔ−PAのフィンガー領域及び生長因子領域をコードす
る配列を、Zoller等のManual for Advanced Techniques
in Molecular Cloning Course,Cold Spring Harbor La
bortory、1983年に記載の方法と本質的に同様にして、
部位特異的変異誘発によってcDNAから欠失させた。オリ
ゴヌクレオチドはApplied Biosystems 380−Ａ DNA合
成装置上で合成し、変性ゲル上で電気泳動によって精製
した。

ゲノム配列およびcDNAt−PA配列を比較することによ
って正確な欠失をデザインした。フィンガー領域および
生長因子領域をコードするエクソンに対応するcDNAの配
列を欠失させた。

ｔ−PAの配列を変異誘発させるための鋳型を調製する
ため、約１μｇのZem99をBamH IおよびEcoR I各１単位
で分解した。DNAフラグメントを１％アガロースゲル上
で分離して、約730個の塩基対のBamH I−EcoR Iフラグ
メントをNA−45DEAE膜（Schleicher ＆ Schuell）上に
製造業者によって指示された方法で電気溶出した。DNA
をフェノール−CHCl₃で抽出して、EtOHで沈殿させた。
精製したフラグメントを、次に、T4DNAリガーゼの存在
で24時間12℃でBamH I＋EcoR Iで分解したM13mpB（複製
型）と共にインキュベートすることによって連結した。
組換ファージを、コンピテントE.コリ（E.coli）JM101
中にトランスフェクションした。ファージDNAをプラク
から精製し、ジデオキシ法によって配列決定して、正し
いcDNA配列の存在を確かめた。単鎖M13鋳型DNAを調製し
て、変異誘発プライマーとしてオリゴヌクレオチドZC49
0（５′TAC CAA GTG ACC AGG GCC 3′）を用いて部位特
異的変異誘発を行った。第二のプライマーとしてユニバ
ーサルM13プライマーを用いた。20ピコモルのホスホリ
ル化した変異誘発性プライマーおよび20ピコモルの第二
のプライマーと10μの20mMトリス（pH7.5）、10mMのM
gCl₂、50mMのNaClおよび1mMのDTT中で１ピコモルの単鎖
鋳型と混合し、65℃で10分間インキュベートした後、室
温で５分間インキュベートし、氷上に置いた。20mMのト
リス（pH7.5）、10mMのMgCl₂、2mMのATP、1mMのdNTP類
を含む10mMのDTT、2.5単位のKlenowポリメラーゼおよび
3.5単位のDNAリガーゼ10μをアニーリングしたDNAに
加えて、混合物を15℃で３時間インキュベートした。次
いで、DNAをコンピテントE.コリ（E.coli）JM101にトラ
ンスフェクションして、細胞をYT寒天上に置いて、37℃
で培養した。プラークをニトロセルロースに移して、6x
SSC、10xDenhardt溶液中でTm−４℃で変異誘発プライマ
ーをプレ・ハイブリダイゼーションし、同じ溶液中でTm
−４℃で³²Pを標識した変異誘発性プライマーにハイブ
リダイズせしめた。Tm−４℃で３回洗浄した後、フィル
ターを一晩Ｘ線フィルムに暴露した。変異プラークを同
定するのに必要ならば、温度を５℃高くして、更に洗浄
工程を行った。変異したインサートをジデオキシ法によ
って配列させ、所望なループ・アウトを有するクローン
を選択した。ｔ−PAをコードする配列の残りに連結する
ときには、この配列は第4B図に示したアミノ末端を有す
るタンパクをコードする。

実施例５ フィンガー配列および生長因子配列の欠失 フィンガー配列および生長因子配列を欠失させる第二
のストラテジーは、出発物質としてｔ−PAコード配列を
有するプラスミドpDR1496を用いる。pDR1496で形質転換
したS.セレビシエー（S.cerivisine）株E8−11Cを受託
番号20728はAmerican Type Culture Collectionに寄託
された。ｔ−PA配列の変異誘発の鋳型を調製するため、
１μｇのpDR1496をSph IおよびXba I各５単位で37℃で
２時間分解した。DNAを0.7％アガロース・ゲル上で電気
泳動して約2100の塩基対の断片を精製した。この断片
を、Sph I＋Xba Iで分解したM13tg130（複製型、Amersh
am社製、Kieny等、Gene26、91頁、1983年）に連結してM
13tgBOWを形成せしめた。組換ファージをE.コリ（E.col
i）JM103中にトランスフェクションして単鎖鋳型DNAを
調製した。オリゴヌクレオチド指令欠失変異誘発は,20m
Mのトリス（pH7.5）、10mMのMgCl₂、50mMのNaCl、1mMの
DTT中で20ピコモルのリン酸化変異誘発プライマー（配
列:5′CGT GGC CCT GGT ATC TTG GTA AC3′）と１ピコ
モルの鋳型DNAとを用いて65℃にて10分間行った。次
に、この混合物を室温で５分間インキュベートした後、
氷上に置いた。20mMのトリス（pH7.5）、10mMのMgCl₂、
2mMのATP、1mMのdNTP類を含む10mMのDTT、2.5単位のKle
nowフラグメントおよび3.5単位のT₄DNAリガーゼを含む1
0μを加え、そしてアニールしたDNA混合物を15℃で３
時間インキュベートした。DNAをE.コリ（E.coli）JM103
中にトランスフェクションして細胞をYT寒天上に置いて
37℃で培養した。プラークを実施例４に記載の方法でス
クリーニングした。フィンガー配列および生長因子配列
の所望の欠失を有する変異配列を、クローン＃2600と命
名した。コードされたタンパクの配列を第６図に示す。

実施例６ フィンガー配列、生長因子配列およびクリングル１をコ
ードする配列のループ・アウト フィンガー配列、生長因子配列およびクリングル１配
列をコードする配列を、実施例４に記載の欠失方法に類
似の方法で、クローン化されたcDNAから除去した。この
ループ・アウトは成熟ｔ−PAのアミノ酸４のコドンとア
ミノ酸176のコドンを正確に連結し、フィンガー領域、
生長因子領域およびクリングル１領域をコードするエク
ソンに対応するDNA配列の欠失を生じさせた（第4C
図）。

Zem99からのプレ−プロおよび成熟配列の５′末端を
有する約730個の塩基対のBamH I−EcoR I t−PA断片を
調製し、そしてM13mp19（複製型）中にクローン化し
た。単鎖鋳型DNAを調製し、そしてオリゴヌクレオチドZ
C722（５′ACT GTT TCC CAC TTG GTA 3′）およびM13ユ
ニバーサル・プライマーを用いて変異誘発を行った。変
異プラークをスクリーニングして、配列し、所望の変異
を有するクローンを同定した。

実施例７ フィンガー配列、生長因子配列およびクリング１配列を
コードする配列の欠失 フィンガー配列、生長因子配列およびクリングル１配
列は、実施例５に記載の単鎖M13tg130W鋳型を用いて第
二の変異誘発において除去した。変異誘発は実施例５に
記載のように、配列５′GCA GTC ACT GTT TCC TTG GTA
AC3′を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
行った。変異プラークを上記と同様にスクリーニングし
た。正確な欠失を有するクローンを＃2700と命名した。
コードされたタンパクの配列を第７図に示す。

実施例８ 合成オリゴヌクレオチドを含有する変異ｔ−PA配列の構
成 フィンガー領域、生長因子領域およびクリングル１領
域の欠失を有する成熟ｔ−PAをコードするDNA配列の
５′部分を合成オリゴヌクレオチドから構成した。次
に、生成するフラグメントを３′cDNAおよびプレ−プロ
配列に連結した。下記のオリゴヌクレオチドを用いた。

４個のオリゴヌクレオチドをT4キナーゼを用いて別々
にリン酸化した。オリゴヌクレオチドZC635およびZC637
を、44個の塩基対をオーバーラップさせて実施例１に記
載の条件下でアニールせめた。オリゴヌクレオチドZC63
8およびZC639を、同様に49個の塩基対をオーバーラップ
させてアニールせしめた。

変異ｔ−PA配列を含む哺乳類の細胞の発現ベクターを
構成するため、Zem99をBgl IIを用いて完全に分解し、E
coR Iを用いて部分的に分解して、ｔ−PA遺伝子の600個
の塩基対を有する５′部分を除去した。ベクター、ｔ−
PAプレ−プロおよび３′ｔ−PA配列を有するフラグメン
トをゲル精製し、３部ライゲーションで連結させて、対
になったオリゴヌクレオチドとした。暗号化されたタン
パクのアミノ末端配列を第4C図に示す。

実施例10 バクテリアにおける変異ｔ−PAの発現 形質転換されたバクテリア細胞で発現させるために、
複製型のDNAをBgl IIで完全に分解し且つEcoR Iで部分
的に分解することによって、上記の変異ｔ−PA配列をそ
れぞれのM13ベクターから取り出す。変異ｔ−PA配列
は、標準的な方法で精製する。

（実施例３に記載の）バクテリア発現ベクターpDR816
をBgl IIおよびXba Iで分解して、pIC19R、TACプロモー
ター、ｔ−PAプレ−プロおよびtrpAターミネーター配列
を有する断片を精製する。３′ｔ−PAをコードする配列
は、pDR816のEcoR I＋Xba I分解物から精製する。

３種の断片を三元連結で連結させて、完全な変異ｔ−
PA配列を有するバクテリア性発現ベクターを構成する。

同様に、実施例８に記載のリン酸化されそしてアニー
リングしたオリゴヌクレオチドを、Bgl IIで完全に分解
し且つEcoR Iで部分的に分解して成熟ｔ−PA配列の５′
部分の約600塩基対を除去したpDR816に挿入する。

生成するベクターを、E.コリ（E.coli）JM105を形質
転換するのに使用する。形質転換された細胞を、0.4％
グルコースおよび0.2％カザミノ酸を添加したM9培地中
で培養する。細胞を収得して、細胞溶解させ、細胞破片
を遠心分離によって除去した。上澄液をフィブリン溶解
分析法によってｔ−PAについて分析し、ウェスタン・ブ
ロット分析法によってタンパク生産を測定した。

実施例11 哺乳類の細胞における変異ｔ−PAの発現 上記実施例4,5,6,7および９に記載した変異体配列
を、SV40またはMT−１プロモーターおよびDHFR選択マー
カーを含有する哺乳類細胞の発現ベクターに挿入した。
生成する発現ベクターをTK−BHK細胞中にコトランスフ
ェクションし、そして薬剤選択を適用し、そしてトラン
スフェクトされた細胞系を選択し、タンパク生産および
特徴づけを行うためにスケールアップした。変異配列を
Bgl II−Apa I断片としてのクローン＃2600および＃270
0から取り出し、そしてZem99（実施例１）中に挿入し
た。生成するベクターを、pSV2−DHFR DNAを用いて実
施例3Cに記載したのと同様に、TK−BHK細胞中にコトラ
ンスフェクションした。

プラスミドpUC18−820をEcoR IおよびRamH Iで分解
し、変異ｔ−PA配列（620個の塩基対）をpDR3002に挿入
した。p820と命名された生成するベクターを、上記と同
様にしてTK−BHK細胞中にトランスフェクションした。

変異タンパク＃2600を、セファロースｅ（Pharmacia
製）上に固定したモノクローン抗体の2.6x20cmカラムで
精製した。トランスフェクションしたBHK細胞からの培
養液を、このカラムに200ml/時の流速で４℃で加えた。
カラムを0.5MのNaClおよび20IU/mlのアプロチニンを含
む0.1Mトリス−HCl緩衝液（pH7.5）で平衡にした。カラ
ムを1000mlの上記緩衝液で洗浄し、ｔ−PAを5MのKSCNを
含む同じ緩衝液で溶出した。ｔ−PA分画を限外濾過によ
って5mlの容積まで濃縮して、1.5MのKSCNおよび0.5MのN
aClを含む50mMのトリス−HCl緩衝液（pH7.5）で平衡に
したセファクリルＳ−200（Pharmacia製）のカラム（2.
6x90cm）に加えた。カラムを同じ緩衝液を用いて25ml/
時の流速で展開した。ｔ−PA分画を限外濾過によって濃
縮し、1Mの重炭酸アンモニウムで平衡にしたセファデッ
クスＧ−25（PD10、Pharmacia製）のカラム上でゲル濾
過を行った。生成する精製されたタンパクをマンニトー
ルの存在で凍結乾燥した。

変異ｔ−PA2700を含む培養液を1MのNaClおよび2.0KIU
/mlのアポロチニンを含む50mMのトリス−HCl緩衝液（pH
7.5）で平衡にした亜鉛キレート化セファロース（Pharm
acia製）のカラム（5x20cm）に400ml/時の流速で４℃で
加えた。カラムを2000mlの同じ緩衝液で洗浄した。ｔ−
PAを、同じ緩衝液においてイミダゾールの濃度を０〜50
mMの範囲で徐々に増加させることによって溶出させた。
ｔ−PA分画を1MのNaClを含む10mMのリン酸ナトリウム緩
衝液（pH7.5）で平衡にしたセファロース4B（Pharmacia
製）と結合させたコンカナバリンＡのカラム（2.6x20c
m）に直接30ml/時の流速で加えた。カラムを同じ緩衝液
で洗浄した。ｔ−PAを1MのNaCl、20KIU/mlのアプロチニ
ンおよび2MのKSCNを含む10mMのリン酸ナトリウム上でα
−メチルアマノシドの濃度を０〜0.4Mの範囲で徐々に増
加させることによって溶出させた。ｔ−PA分画を限外濾
過によって約5mlにまで濃縮して、1.5MのKSCNおよび1M
のNaClを含む50mMのトリス−HCl（pH7.5）で平衡化した
セフアクリルＳ−200のカラム（2.6x90cm）に加えた。
カラムを同じ緩衝液を用いて25ml/時の流速で展開し、
ｔ−PA分画を纏めて、濃縮し、脱塩し、上記と同様にし
て凍結乾燥した。

2600および2700変異ｔ−PA分子の血漿クリアランス
を、ラットで試験した。雄のSpraque Dawleyラット（体
重230g〜270g）に0.4mg/kg体重の¹²⁵Iを標識した変異ｔ
−PAまたはトランスフェクションされたBHK細胞から精
製した標準の組換ｔ−PAを注射した。注射は大腿静脈か
ら行った。血液試料（0.5ml）を頚静脈から採取し、ア
フィニティー精製ポリクローン・ウサギ抗体を用いてサ
ンドイッチELISAによってｔ−PAタンパクを測定した。
第４表に示される結果は、変異タンパクが標準のｔ−PA
のほぼ５倍の血漿半減基を有することを示している。

変質タンパク3008および2600を精製して、生体内での
半減期について試験した。変異タンパク3008,2600又は
標準のｔ−PA（対照物）を産生する細胞を含むコンフル
エントに達しない75cm²フラスコを、100U/mlのペニシリ
ン、100μg/mlストレプトマイシンおよび100μg/mlアプ
ロチニンを含みメチオニンを含まない10mlのDulbeccoの
MEMで洗浄した。細胞を1mciの³⁵S−メチオニン（New En
gland Nuclear社製）を含む同じ培地10mlで37℃で20時
間培養した。上澄液を2000rpmで10分間遠心分離し、−2
0℃で保管した。非放射性ｔ−PAが、100U/mlのペニシリ
ン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび100μg/mlの
アプロチニンを含むDulbecco培地中に保持された1200cm
²トレーに細胞層から得られた。約400mlの培養液を集め
た。纏めた細胞培養液にNaClおよびTween80をそれぞれ1
Mおよび0.2％の濃度で加えた。pHを7.5に調整した。0.4
5μ上で濾過した後、変異体をモノクローン抗体上でイ
ムノソーベント・クロマトグラフィを用いて精製した。

精製したｔ−PA変異体は、主として単一鎖の形である
ことが分かった。比活性をフィブリン・プレート法によ
って測定した。第５表にその結果を示す。

第５表 タンパク 比活性（IU/mgタンパク） 標準ｔ−PA 400,000 3008 590,000 2600 380,000 変異タンパク3008および2600の生体内半減期を測定し
た。雌のWisterラットを麻酔して、頚静脈および頚動脈
中にカテーテルを配置して、それぞれ静脈内投与を行
い、試料を採取した。試験溶液を投入する10分前にヘパ
リン（1mg/kg体重）を静脈内投与した。0.25〜0.5mlの
試験溶液を投与する前および2,3,4,6および８分後に、
約250μの血液試料を採取した。血漿中の放射能を液
体シンチレーションによって測定し、半減期を１コンパ
ートメントモデルを用いて線形回帰によって計算した。
半減期（３〜５回の実験の平均）は下記のようになっ
た。元のｔ−PA、2.3分;3008、12分；および2600、17
分。

実施例12 酵母での変異ｔ−PAの発現 酵母で発現させるため、変異ｔ−PA配列を、実施例10
に記載されているバクテリア性ベクターからBgl II−Xb
a Iフラグメントとして切り出した。

プラスミドpDR1496はS.セレビシエー（S.cerevisia
e）TPIプロモーター（Alber,Kawasaki,J.Mol.Appl.Gene
t.１、419〜434頁、1982年）、S.セレビシエー（S.cere
cisiae）MF1シグナル配列（Kurjan,Herskowitz,Cell,3
0、933〜943頁、1982年および米国特許第4,546,082号明
細書）、ｔ−PAコード配列およびS.セレビシエー（S.ce
recisiae）TPIターミネーター（Alber,Kawasaki、同
上）を含有する酵母発現ベクターである。pDR1496で形
質転換されたS.セレビシエー（S.cerecisiae）株E8−11
cを、受託番号20728でAmerican Type Culture Collecti
onに寄託した。プラスミドを標準的な方法によって形質
転換体から単離する。ｔ−PA配列をBgl IIおよびXba I
で部分的に分解することによって、pDR1496から切り出
した。12.2kbベクター断片を精製してBgl II−Xba I変
異ｔ−PA配列に連結した。

発現ベクターを使用して、S.セレビシエー（S.cerevi
siae）株E8−11cを形質転換する。細胞を２％グルコー
スおよび0.1Mリン酸水素カリウム（pH5.5）を加えた1eu
培地中で30゜で培養する。細胞を、対数増殖期に取り出
し、そして遠心分離によって集め、破砕して、ライセー
トのｔ−PA活性を測定する。

上記の説明から、本発明の特定の態様を説明のために
記載したのであり、発明の精神および範囲から離反する
こと無く各種変更を行うことが可能であることが理解さ
れるであろう。したがって、本発明は特許請求の範囲に
よって制限されることを除いては制限されない。

【図面の簡単な説明】

第１−１図〜第１−４図は、cDNAから構成されたプレ−
プロコード配列および合成オリゴヌクレオチド、ならび
にコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す。行よ
り上の数字はヌクレオチドの位置を示し、そして行より
下の数字はアミノ酸の位置を示す。 第２図は、ベクターZem99の構成を示す。 第３図は、ｔ−PA発現ベクターpDR817の構成を示す。 第４図は、ここで説明するいくつかの変形ｔ−PA分子の
アミノ末端の比較を示す。 第５図は、プラスミドpDR3002およびpDR3002から誘導さ
れたｔ−PAベクターの構成を示す。 第６−１図及び第６−４図は、フィンガー領域および生
長因子領域を欠失する変異体ｔ−PAタンパク質のアミノ
酸配列、およびこのタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を示す。 第７−１図〜第７−５図は、フィンガー領域、生長因子
領域およびクリングル１領域を欠く変異体ｔ−PAタンパ
ク質のアミノ酸配列、ならびにこのタンパク質をコード
するヌクレオチド配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:865） 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (72)発明者 アイリーン アール．マルビヒル アメリカ合衆国，ワシントン 98103, シアトル，フランシス アベニュ ノー ス 4016 (56)参考文献 特開 昭63−501841（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−243024（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−48378（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−198623（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ301（20）Ｐ．214−221 （1983) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．81．Ｐ．5355−5359（1984)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列： において、87位のAspから113位のCysまでの間のいずれ
   かのアミノ酸から527位のProまでのアミノ酸配列を有
   し、場合によってはさらに該アミノ酸配列のＮ−末端に
   １〜数個のアミノ酸を有する短縮型組織プラスミノーゲ
   ンアクチベーター。
2. 【請求項２】次のアミノ酸配列： において、87位のAspから113位のCysまでの間のいずれ
   かのアミノ酸から527位のProまでのアミノ酸配列を有
   し、場合によってはさらに該アミノ酸配列のＮ−末端に
   １〜数個のアミノ酸を有する短縮型組織プラスミノーゲ
   ンアクチベーターの製造方法において、該組織プラスミ
   ノーゲンアクチベーターをコードするDNAを含んで成る
   発現ベクターにより形質転換された動物細胞又は細菌を
   培養し、得られた培養物から前記組織プラスミノーゲン
   アクチベーターを採取することを特徴とする方法。