JPH0494684A - 新規プラスミノーゲン活性化因子誘導体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血栓症の治療に有用である組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子の新規誘導体、該誘導体をコードする
ＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター　該ベ
クターを導入された形質転換体。

および該誘導体の製造方法に関する。

（従来の技術） ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（以下。

丁ＰＡと略す）は、ヒトのメラノーマ細胞（ＢｏｗｓＭ
ｅｌａｎｏ＋ａａ）の分泌するＴＰＡについて特によく
研究されており、５２７個のアミノ酸残基からなる糖タ
ンノくりであることが知られている（Ｐｅｎｎｉｃａ、
　Ｄ、ら。

Ｎａｔｕｒｅ、　　３０１．　２１４（１９８３））。

ＴＰＡは、血液中に存在するプラスミノーゲンに作用し
てプラスミンに変える酵素であり、プラスミンは血栓の
原因となるフィブリンを溶解する作用を有する。ＴＰＡ
はこのフィブリンに対して強い親和性を有し、かつその
活性はフィブリン依存性であるため、血栓に特異的に作
用すると考えられている。上記ＴＰＡの作用は、ストレ
プトキナーゼ。

ウロキナーゼなどの血栓溶解剤の作用よりも大きい。そ
のため、　ＴＰＡは種々の血栓症の治療薬として有用で
ある（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ、　Ｅ、　Ｂ、、　Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕ−ｔｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４．３
７５（１９８？））。

現在１日本においては、臨床実験が行われているが、　
　丁ＰＡの授与による副作用９例えば、出血、血栓によ
る血管の再閉塞などの問題については、いまだはっきり
とした評価がなされていないのが現状である。さらに、
血栓症の治療のためにＴＰＡを血液中に投与した場合に
、その効果は長時間持続せず、　ＴＰＡは血液中から急
速に消失してしまうという問題がある。ＴＰＡは主に肝
臓で代謝されると推定されており（Ｆｕｃｈｓ、　Ｈ，
Ｅ、ら、　　Ｂｌｏｏｄ、　　６５．　５３９（１９８
５））、その血中半減期は僅かに２分である（　Ｃｏｌ
　１ｅｎ、　Ｄ、ら、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｏｎ、　′Ｌ
２Ｊ３８４（１９８５））　ｏ　そのため、　ＴＰＡの
血中有効濃度を一定に保つには、大量のＴＰＡを投与す
る必要がある。しかも、　ＴＰＡは水への溶解性が小さ
いため高濃度で使用することができず、所定量のＴＰＡ
を投与するためには長時間を要する。このように、血栓
症を効果的に治療するためにはＴＰＡを長時間にわたり
大量に投与する必要があり、−刻を争う血栓症の治療に
は適さない。さらに、　ＴＰＡは天然に微量にしか存在
しないタンパクであるため高価で、大量に使用すると治
療が極めて高価となり、患者への負担が大きい。

このような問題を解決し、　ＴＰＡをより少量でかつ短
時間に投与し得るようにするために、化学修飾。

酵素修飾、遺伝子工学的手法などにより血中持続性を改
善されたＴＰＡ誘導体が報告されている（Ｂｒｏｖｎｅ
、　　Ｍ、　　Ｊ、　　ら、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　
　Ｃｈｅｗ、、　　２６３．　１５９９（１９８Ｂ”）
：Ｄｏｄｄ、　　Ｔ、ら、　　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　
ａｎｄ　ＨａｅＩｌｏｓｔａｓｉｓ。

５９、　５２３（１９８８）；およびＫａｙａｎ、　　
Ｎ、　Ｋ、ら、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　　２６３．　３９７１（１９８８））。

しかし、これらの報告によるＴＰＡ誘導体では、血中持
続性が大幅に向上した反面、　ＴＰＡの特徴的な性質で
あるフィブリン親和性の極端な低下が認められている（
Ｌａｒｓｅｎ。

Ｇ、　　Ｒ，ら、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ
、、　　２６３．　１０２３（１９８８））。

さらに、修飾・改変によりフィブリン溶解能が著しく低
下したＴＰＡ誘導体の例もある（Ｈａｎｓｅｎ　Ｌ、ら
。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６３．　１５７１
３（１９８８））。

このように、優れた治療効果を示すＴＰＡ誘導体はまだ
得られていない。そのため、血中持続性が向上し、かつ
ＴＰＡが有する血栓溶解能がさらに改善され、出血など
の副作用を増大させることなく少量の投与での血栓治療
が可能であるようなＴＰＡ誘導体の開発が待たれている
。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その
目的とするところは、血中半減期が長く。

かつフィブリン溶解能の高い新規ＴＰＡ銹導体を提供す
ることにある。本発明の他の目的は、上記後れた性質を
有するＴＰＡ誘導体をコードするＤＮＡ配列。

該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター、該発現ベクターが
導入された形質転換体、ならびに該形質転換体を培養し
てＴＰＡ誘導体を生産することによるＴＰＡ誘導体の製
造方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） ＴＰＡは、フィンガー領域、成長因子領域、クリングル
１領域、クリングル２領域およびセリンプロテアーゼ活
性を有する領域の５つの領域からなり。

これらの領域はＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から上記
順序で並んでいる（Ｐｅｎｎｉｃａ、　Ｄ、　　ら、　
Ｎａｔｕｒｅ。

３０１、２１４．前出）。

上記ＴＰＡの各領域のうち、クリングル２領域は。

ＴＰＡのフィブリン親和性やフィブリンによる活性化に
関与すると言われている。クリングル１領域については
、その欠失誘導体を作成して検討しても。

該領域の機能についてはいまだ充分に解明されていない
。発明者らは、上記クリングル２領域が有するフィブリ
ン親和性およびフィブリンによる活性化という性質を増
強することを目的として、クリングル１領域の修飾を試
みた。つまり、クリングル１領域のアミノ酸配列をクリ
ングル２領域に似せた配列とするため、遺伝子工学の手
法を用いてアミノ酸置換体を数多く作成した。このよう
なアミノ酸置換体を評価したところ、著しく　ＴＰＡ酵
素活性が高められた誘導体が存在することを見い出し１
本発明を完成するに至った。

本発明のＴＰＡ誘導体は、　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ
末端から１１２番目のグルタミン酸をセリンに、１１５
番目のアスパラギンをプロリンに、１２０番目のアラニ
ンをイソロイシンに、１２２番目のアラニンをイソロイ
シンに、１２３番目のグルタミンをグリシンに、１２５
番目のプロリンをバリンに、１４９番目のアルギニンを
グリシンに、１６１番目のグリシンをアルギニンに、１
６２番目のリジンをアルギニンに、そして１６５番目の
セリンをトリプトファンに置換するアミノ酸置換のうち
の少なくとも１個のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を
有し、そのことにより上記目的が達成される。

好適な実施態様によれば９本発明は２組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子のアミノ酸配列のＮ末端から１１２番
目のグルタミン酸がセリンに、１６１番目のグリシンが
アルギニンに、１６２番目のリジンがアルギニンに、そ
して、１６５番目のセリンがトリプトファンにそれぞれ
置換されたアミノ酸配列を有する９組織型プラスミノー
ゲン活性化因子誘導体を包含する。

好適な実施態様によれば２本発明は１組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子のアミノ酸配列のＮ末端から１１５番
目のアスパラギンがプロリンに、１６１番目のグリシン
がアルギニンに、１６２番目のリジンがアルギニンに、
そして、１６５番目のセリンがトリプトファンにそれぞ
れ置換されたアミノ酸配列を有スル、組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子誘導体を包含する。

好適な実施態様によれば１本発明は２組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子のアミノ酸配列のＮ末ｉカラ１４９番
目のアルギニンがグリシニンに、　　１６１番目のグリ
シンがアルギニンに、１６２番目のリジンがアルギニン
に、そして、１６５番目のセリンがトリブトファンにそ
れぞれ置換されたアミノ酸配列を有する２組織型プラス
ミノーゲン活性化因子誘導体を包含する。

好適な実施態様によれば１本発明は９組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子のアミノ酸配列のＮ末端から１１５番
目のアスパラギンがプロリンに、１２０番目のアラニン
がイソロイシンに、　　１２２番目のアラニンがイソロ
イシンに、１２３番目のグルタミンがグリシンに、１２
５番目のプロリンがバリンに、１６１番目のグリシンが
アルギニンに、１６２番目のリジンがアルギニンに、そ
して、１６５番目のセリンがトリプトファンにそれぞれ
置換されたアミノ酸配列を有する２組織型プラスミノー
ゲン活性化因子誘導体を包含する。

好適な実施態様によれば９本発明は２組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子のアミノ酸配列のＮ末端から１２０番
目のアラニンがイソロイシンに、１２２番目のアラニン
がイソロイシンに、１２３番目のグルタミンがグリシン
に、１２５番目のプロリンがバリンに、１６番目のグリ
シンがアルギニンに、　　ｘ６ｚ番目のリジンがアルギ
ニンに、そして、１６５番目のセリンがトリプトファン
にそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する９組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子誘導体を包含する。

発明のＤＮＡ配列は、上記ＴＰＡ誘導体をコードする。

本発明の発現ベクターは、上記ＤＮＡ配列を有する。

本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを動物培養細
胞に導入して得られる。

本発明のＴＰＡ誘導体の製造方法は、　（ａ）上記ＴＰ
Ａ誘導体をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクター
を構築する工程；　（ｂ）該発現ベクターを動物培養細
胞に導入して形質転換体を得る工程；（ｃ）該形質転換
体を培養してＴＰＡ誘導体を生産させる工程；および（
ｄ）生産されたＴＰＡ誘導体を単離する工程を包含する
。

以下に２本発明をＴＰＡ誘導体の製造工程順に説明する
。

（Ｉ　）　ＴＰＡをコードするＤＮＡ配列の調製遺伝子
工学的手法を用いてＴＰＡのクリングル領域を修飾し、
血栓溶解能が高く、血中持続性の向上したＴＰＡ誘導体
を作成するには、天然型あるいはそれに由来するＴＰＡ
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が必要である。

そのようなりＮＡ配列は、　ＴＰＡをコードするｃＤＮ
Ａまたは染色体ＤＮＡ　（以下、染色体ＤＮＡをｇＤＮ
Ａとする）をクローニングすることにより；あるいはＴ
ＰＡをコードするｃＤＮＡ、　ｇＤＮＡ、　ＴＰＡのア
ミノ酸配列などをもとにＤＮＡを化学合成することによ
り得られる。　ＴＰＡをコードするｃＤＮＡは、Ｐｅｎ
ｎ１ｃａ、　Ｄ、らＮａｔｕｒｅ、　　３０ユ、　２１
４（１９８３）　（前出）によりすでに単離されており
、　ＴＰＡをコードするｇＤＮＡは、　　Ｎ７．Ｔ、ら
（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
　ＵＳＡ、、　　ｉＬ　５３５５（１９８４））　；　
　　Ｂｒｏｗｎ、　Ｍ、Ｊ、ら（Ｇｅｎｅ、　３Ｌ２７
９（１９Ｊ１５））　　；およびＤｅｇｅｎ、　　Ｓ、
　Ｊ、　Ｆ、ら（Ｊ、Ｂｆｏｌ。

Ｃｈａｔ、　　２６１　６９７２（１９８６））により
それぞれ単離されている。本明細書においては、　ＴＰ
Ａのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列に対する番号付け
はＰｅｎｎ１ｃａ。

Ｄ、ら（前出）に従い、　ＴＰＡをコードするｇＤＮＡ
配列のエクソンに対する番号付けはＮ７．　Ｔ、ら（前
出）に従って行う。

この他、遺伝子操作によって得られた種々のＴＰＡ発現
ベクターが知られており１例えば、特開昭６２−１４７
８３号公報に開示されているＴＰＡ発現ベクターｐｓＶ
ｅＰＡ−１を利用して、　ＤＮＡ配列が得られうる。上
記ｐｓＶｅＰＡ−１を用いた本発明のＴＰＡ誘導体発現
ベクターの作成例を次に示す。

まず上記発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１を含む宿主０例
えば、このベクターにより形質転換されたＣＨＯ−Ｋｌ
細胞（特開昭６２−１４７８３号公報、前出）からｍＲ
ＮＡを抽出し、これを用いてｃＤＮＡを合成してｃＤＮ
Ａライブラリーを作成し、クローニングを行う。クロー
ニングは１例えば、上記発現ベクターを適当な制限酵素
で切断して得られるＤＮＡの断片（ＴＰＡをコードする
）をプローブとして用いた。プラークハイブリダイゼー
ションにより行うことができる。このようにして、この
プローブとハイブリダイズする陽性クローンＣＨ７９が
選択される。このクローンＣ■７９中のＤＮＡを抽出し
、サザンハイプリダイゼーションにより解析すると、上
記プローブとハイブリダイズし＋　Ｈｌｎｄｍで約２．
２ｋｂに切断されるＤＮＡ断片が含まれていることが分
かる。この約２．２ｋｂのＨｉｎｄｍ切断ＤＮＡ断片を
、プラスミドベクターｐＵｃ１９に挿入することにより
、　　ｃＤＮＡクローンｐＣＨ７９が得られる。

このｐＣＨ７９のｃＤＮＡ部分の塩基配列をＭ１３法に
より決定すると、このｃＤＮＡ部分の５゛末端はプラス
ミドベクターｐＵｃ１９由来のＨｉｎｄｍ認識部位に連
結されており、そこから約１５０ｂｐ下流には１１．■
の認識部位が存在し、その下流約１５００ｂｐには終止
コドンＴＧＡが存在する。さらに、このＴＧＡコドンか
ら約４１０　ｂ　Ｉ）下流には、プラスミドベクターｐ
Ｕｃ１９由来のＨｉｎｄｍ認識部位が存在する。このｃ
ＤＮＡ部分の塩基配列は、５８４番目のＣがＴに、そし
て１７２５７２５番目Ｃであることを除いては、　Ｐｅ
ｎｎ１ｃａ、　Ｄ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０ユ。

２１４、　（前出）に記載のＴＰＡの塩基配列と一致す
る。

このようにして得られるＴＰＡをコードするｃＤＮＡ配
列を用いて、　ＴＰＡ誘導体調製の基本となるＴＰＡ発
現ベクターが構築され得る。

（ＩＩ）発現ベクターの構築 ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１およびＴＰＡ誘
導体発現ベクターの構築を２次に示す。

（ＩＩ　−Ａ）　ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−
１の構築プラスミドベクターｐｓＶｓａｌ　Ｉ　（特開
昭６２−１４７８３号公報、前出）、上記ベクターｐｓ
ＶｅＰＡ−１に含まれるｇＤＮＡおよび上記ＴＰＡのｃ
ＤＮＡを使用して、　ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰ
Ａ−１が構築され得る。つまり、　ＴＰＡ発現ベクター
ｐｓＶｅｃＰＡ（は、下記の■〜■の３つのＤＮＡ断片
を連結することにより構築される。この発現ベクターの
構築の概略を第１図に示す。

■ｐｓＶｅｓａｌ　ＩのＩ’１ｉｎｄＩＩＩ　−Ｈｉｎ
ｄ■断片ニブラスミドベクターｐｓＶｅｓａｌ　Ｉ　（
特開昭６２−１４７８３号公報、前出）を制限酵素Ｎｅ
ｏ　Ｉで切断し、大きい方のＤＮＡ断片（諺Ｉ−諺Ｉ断
片、約４．７ｋｂ＞を単離し、　Ｔ４　ＤＮＡワガーゼ
により環状化して得られるプラスミドベクターｐｓＶｅ
ｓａｌ　Ｉ−旧ｎｄｍを、　Ｂｉｎｄｍにて切断して得
られる大きい方のＤＮＡ断片（約４．７ｋｂ）。

■ｐｓＶｅＰＡ−１の−ｄＩＩ［−４ｇｊＩＩ断片：上
記ｇＤＮＡ利用ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１を
ＨｉｎｄｍおよびＢ７ｄＴｌ　”Ｃ’切断して得られる
小さい方のＤＮＡ断片（約１．９ｋｂ）。

■ｐＣＨ７９の凪ＩＩ　−Ｈｉｎｄｍ断片：上記ｃＤＮ
ＡクローンｐｃＨ７９を１■およびＨｉｎｄｍで切断し
て得られる。

ＴＰＡ　ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（約２ｋｂ）。

このようにして構築されたＴＰＡ発現ベクターｐＳｖｅ
ＣＰＡ−１ハ、　ＴＰＡ遺伝子の上流にＳＶ４０ウィル
スの初期プロモーターがＴＰＡ遺伝子が発現可能な位置
および方向で存在しており、動物細胞に導入された場合
ＴＰＡを生産し得るように設計されている。プロモータ
ーとしては、　ＳＶ４０以外にもＴＰＡ遺伝子を発現し
得るプロモーターのいずれもが利用され得る。

（ＩＩ　−Ｂ）　ＴＰＡ誘導体発現ベクターの構築ＴＰ
Ａのクリングル領域内のいくつかのアミノ酸が置換され
たアミノ酸置換体（ＴＰＡ誘導体）を調製するには１例
えば、　ＴＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
に対して合成りＮＡブライマーを利用して変異を導入す
る方法（部位特異的変異法）が利用され得る。

例えば、この部位特異的変異法により次に示すアミノ酸
置換が導入された６種類のＴＰＡ誘導体ＫＭ４　。

ＫＭ４１．１Ｍ４２．　ＫＭ４３．　ＫＭ４４．　　お
よびＫＭ４５が生産され得る。

ＫＭ４：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から１６１番目
のグリシンがアルギニンに、１６２番目のリジンがアル
ギニンに、そして１６５番目のセリンがトリプトファン
に、それぞれ置換されたＴＰＡ誘導体。

ＫＭ４１　：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から１１２
番目のグルタミン酸がセリンに、１６１番目のグリシン
がアルギニンに、１６２番目のリジンがアルギニンに、
そして１６５番目のセリンがトリプトファンに、それぞ
れ置換されたＴＰＡ誘導体。

１Ｍ４２：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から１１５番
目のアスパラギンがプロリンに、　　１６１番目のグリ
シンがアルギニンに、１６２番目のリジンがアルギニン
に。

そして１６５番目のセリンがトリプトファンに、それぞ
れ置換されたＴＰＡ誘導体。

ＫＭ４３　：　ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から１４
９番目のアルギニンがグリシンに、１６１番目のグリシ
ンがアルギニンに、１６２番目のリジンがアルギニンに
、そして１６５番目のセリンがトリプトファンに、それ
ぞれ置換されたＴＰＡ誘導体。

ＫＭ４４　：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から１１５
番目のアスパラギンがプロリンに、１２０番目のアラニ
ンがイソロイシンに、１２２番目のアラニンがイソロイ
シンに、１２３番目のグルタミンがグリシンに、　　１
２５番目のプロリンがバリンに、１６１番目のグリシン
がア／ｌ／　＃　ニアに、１６２番目のリジンがアルギ
ニンに、そして１６５番目のセリンがトリプトファンに
、それぞれ置換されたＴＰＡ誘導体。

ＫＭ４５：ＴＰＡのアミノ酸配列のＮ末端がら１２０番
目のアラニンがイソロイシンに、１２２番目のアラニン
がイソロイシンに、１２３番目のグルタミンがグリシン
に、１２５番目のプロリンがバリンに、１６１番目のグ
リシンがアルギニンに、１６２番目のリジンがアルギニ
ンに、そして１６５番目のセリンがトリプトファンに、
それぞれ置換されたＴＰＡ銹導体。

これらのＴＰＡ誘導体のアミノ酸置換をまとめて表１に
示す。

（以下余白） 上記ＴＰＡ誘導体を調製するには９例えば、　ｐｓＶｅ
ＣＰＡ−１などのＴＰＡ発現ベクターからＴＰＡのアミ
ノ酸配列の一部（置換したいアミノ酸の部位を含む）を
コードするＤＮＡ断片を切り出し、これをＭ２Ｓ、　ｐ
Ｕｃ１１９などの大腸菌宿主用の１本鎖ファージもしく
はプラスミドに組みこむ。例えば、上記ｐｓＶｅ　ＣＰ
Ａ−１をＮａｒ　ＩおよびＳｍａｌで分解して得られる
小さい方の断片を、同じ＜　ＮａｒｌとＳｍａ　Ｉとで
分解したＭ１３ｍｐＨ（宝酒造（株）製）に組み込み９
組み換えファージベクターＭ１３ＮＳが得られる。次に
、上記切り出したＤＮＡ断片と相同なりＮＡ配列の一部
（但し、変異を導入すべき部分を含み、この箇所は所望
の塩基に置換されている）を、プライマーとして別途合
成する。

例えば、ＫＭ４を発現し得る発現ベクターｐｓｃＫＭ４
を得るためには９次のＤＮＡ断片（１）が合成される。

５　　ＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡ
ＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＴＡＡＡＧＡＣＧ　３°（１） このブライマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てリン酸化し９次いで、上記組み換え一本鎖ファージも
しくはプラスミドにアニールさせ、常法によりＤＮＡ鎖
を延長させる。これには、市販のインビトロ変５％シス
テムキットが用いられ得る。得られた変異部分を含むプ
ラスミド（Ｍ２Ｓ−Ｎ３Ｍ４）は。

適当な宿主１例えばＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株に導入
して増幅される。次にこのＭ２Ｓ−Ｎ３Ｍ４をＮａｒｌ
およびＳｍａｌで分解して、小さい方の断片（約１．２
ｋｂ、変異を含むＴＰＡのＤＮＡの一部に相当する）を
単離し、これを上記ｐＳＶｅＣＰＡ−１のＮａｒｌ−Ｓ
ｍａ＋断片（大きい方の断片；約７ｋｂ）と連結するこ
とにより、　ＫＭ４Ｌを発現しうる発現ベクター（ｐＳ
ＣＫＭ４）が得られる。

ＴＰＡ誘導体ＫＭ４１．　ＫＭ４２．　ＫＭ４３．　Ｋ
Ｍ４４およびＫＭ４５をそれぞれ発現し得る発現ベクタ
ー（ｐｓｃＫＭ４１．　ｐＳＣＫＭ４２．　ｐＳＣＫＭ
４３．　ｐＳＣＫＭ４４およびｐｓｃＫＭ４５）は、上
記Ｍ１３−ＮＳＭ４を利用して構築される。上記各発現
ベクターを構築するために、まず、下記のＤＮＡ断片（
ｎ）〜（ＶＩ）が合成される。

ｐｓｃＫＭ４１を構築するためのＤＮＡ断片５°ＧＴＴ
ＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＧＣＣＡＣＴＣ３°（ｎ）ｐ
Ｓ（ＪＭ４２を構築するためのＤＮＡ断片５°ＧＣＴＧ
ＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＴＣＧ　３°＜ｍ＞ｐ
ＳＣＫＭ４３を構築するためのＤＮＡ断片５°ＧＣＴＴ
ＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＧＴＴＴ　３’　（Ｔ
Ｖ）ｐｓｃＫＭ４４を構築するためのＤＮＡ断片５　Ｃ
ＣＣＧＣＴＧＴＡＧＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＣＡＡＧＡ
ＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧＣＡＣＴＣ
Ｇ　３°（Ｖ） ｐｓｃＫＭ４５を構築するためのＤＮＡ断片５　’　Ｃ
ＣＣＧ　ＣＴＧＴＡＧＡ　ＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＣＡＡ
　ＧＡＴＧＣＴＧ　ＣＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ
ＡＣＴＣＧ　３°（ＶＩ） 次に１例えば、上記ＤＮＡ断片（ＩＩ）をＭ２Ｓ−ＮＳ
Ｍ４とアニールさせ、上記と同様の方法によりＤＮＡ鎖
を延長することによりＭ！３−Ｎ５Ｍ４１が得られる。

このＭ２Ｓ−Ｎ３Ｍ４１は、適当な宿主９例えばＥ、ｃ
ｏｌｉ　ＴＧＩに導入することにより増幅され得る。次
に、このＭ２Ｓ−Ｎ３Ｍ４１を上記と同様にＮａｒ　Ｉ
およびＳｍａｌで分解し、小さい方の断片を単離し、同
じ＜　ｐｓＶｅｃＰＡ−１を■ゴおよびＳ＋＋＋ａｌで
分解して得た大きい方の断片（約７ｋｂ）を連結するこ
とにより、　ＫＭ４１を発現し得る発現ベクターｐｓｃ
ＫＭ４１が得られる。上記ＤＩＪＡ断片（ＩＩ）の代わ
りにＤＮＡ断片（ｍ）から（Ｖｌ）をそれぞれ用いて。

同様に操作を行うことにより１発現ベクターｐＳＣＫＭ
４２．　　ｐＳＣＫＭ４３．　ｐＳＣＫＭ４４及びｐＳ
ＣＫＭ４５がそれぞれ構築される。

（ＩＩＩ）ヱニＪ２ヨ［区玉 発現ベクターを動物細胞に導入して得られる形質転換体
を選択するための選択マーカー遺伝子トしては、　　Ｅ
ｃｏｇｐｔ　（Ｍｕｌｌｉｇａａｎ、　　Ｒ，Ｃ，ら、
　　５ｃｉｅｎｃｅ。

２０９　１４２２（１９８０））　、　　ｎｅｏ　（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ、　　Ｐ、Ｊ、ら。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１゜３２７（１
９８２））　、　　ｄｈｆｒ　（Ｗｉｇｌｅｒ、　　Ｍ
、ら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　１ｊ、　　３２７
（１９８０））などの遺伝子が用いられる。これらのマ
ーカー遺伝子は、　ＴＰＡＩ導体発現ベクターに含まれ
ていても、該ベクター以外のプラスミドに含まれていて
もよい。後者の場合は２選択マーカー遺伝子を有するプ
ラスミドベクターを構築し、　ＴＰＡ発現ベクターと適
当な割合で混合して使用することにより、形質転換体の
スクリーニングがなされ得る。例えば、　ｎｅｏおよび
ｄｈｆｒ遺伝子を有するマーカーベクターｐｓＶ２ｎｅ
ｏ−ｄｈｆｒが好適に使用され、該ベクターは次のよう
に構築される。ｄｈｆｒ遺伝子を有するｒＤＮＡベクタ
ーｐｓＶ２ｄｈｆｒ（アメリカン　タイプカルチャー　
コレクション、　　ｒＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　３７１
４６）をＰｖｕ　ＩＩで切断したニＩＩ−ＰｖｕＩｒ断
片と、　ＢａｍＨＩリンカ−ｄ　（ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ
）とをＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結してベクターｐｓＶ
２Ｂｄｈｆｒを構築する。このベクターをＢａｍＨＩ切
断した≧ＨＩ−ＢａｍＨＩ断片と、　　ｒＤＮＡベクタ
ーｐｓＶ２ｎｅｏ　（アメリカン　タイプカルチャー　
コレクション、　　ｒＤＮＡＶｅｃｔｏｒｓ　３７１４
９）をＢａｗＨＩで切断して得たＢａｍＨＩ　−Ｂａｍ
ＨＩ断片とを７４　ＤＮＡリガーゼで連結することによ
り、環状のマーカーベクターｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆ　
ｒが構築される。

（ＩＶ）　　　　　　　の形　転　およびＴＰＡ　　　
　の■ 宿主細胞としては動物培養細胞が用いられ、　ＣＨＯ−
Ｋｌ　（ＡＴＣＣＣＣＬ〜６１）株が好適に用いられる
。このような動物培養細胞を用いることにより、　ＴＰ
Ａ誘導体はグリコジル化されて生産される。

動物細胞への発現ベクターＤＮＡの導入法としては。

トランスフェクション効率に差はあるが、リン酸カルシ
ウム法（Ｗｉ　ｇｌｅｒ、　Ｍ、ら、　　Ｃｅ１ｌ、　
ｕ、２３３（１９７７））　、マイクロインジェクショ
ン法（Ａｎｄｅｒｓｏｎ。

Ｗ、　　Ｆ、ら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａ
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、、　　７７゜５３９
９（１９８９））　、　　リポゾーム法、　　ＤＥＡＥ
−デキストラン法または細胞融合法（Ｓｃｈｏｆｆｎｅ
ｒ、　’ｌ／、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、、　７７、２１６３（１９８
０＞）　、電気導入法（達家雅明ら、細胞工学、且、　
　４９４（１９８７））などが利用され得る。このよう
な方法によりＴＰＡ誘導体発現ベクターを宿主細胞に導
入した後、上記（ＩＩＩ）項に述べたようなマーカー遺
伝子によって獲得した形質により形質転換体が選択され
得る。

得られた形質転換体がＴＰＡ誘導体を生産するか否かは
、それぞれの形質転換体細胞の培養液中のプラスミノー
ゲン活性化活性（プラスミノーゲンを活性化させる活性
の度合）を測定することにより調べることができる。プ
ラスミノーゲン活性化活性は、プラスミノーゲン含有フ
ィブリン平板を用いる方法（Ｍａｃｋｉｅ、　Ｍ、ら、
　Ｂｒ１ｔｒｓｈ　ＪｏｕｒｎａＩ　ｏｆＨｅｍａｔｏ
ｒｏｇｙ、　Ｌ！Ｊ７７（１９８１））　、　　プラス
ミンの合成基質Ｓ−２２５１の分解を測定する方法［Ａ
ＩＩｅｎ、　Ｒ，Ａ、およびＰｅｐｐｅｒ、　Ｄ、　Ｓ
、　、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓ
ｔａｓｉｓ、　！ｉ、４３（１９８１）］　、　ＣＬＴ
法［Ｇａｆｆｎｅｙ、　　Ｐ、Ｔ、およびＣａｒｔｉｓ
、　Ａ、　Ｄ、　、　　Ｔｈｒｏａ＋ｂｏｓｉｓ　ａｎ
ｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ。

５３、　１３４（１９８５）］　、　　ＥＬＩＳＡ法［
ｆｌｏｌｖｏｅｓｔ、　　Ｔ、ら。

Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉ
ｓ、　４６８４（１９８５）］などにより測定され得る
。

（以下余白） （Ｖ）ＴＰＡ　　　　の口　および ＴＰＡ誘導体生産株の培養は、宿主となる動物細胞株に
適した培養法により行われる。培養物力）らのＴＰＡ誘
導体の回収および精製は、　ＣＰＧ−１０，キレ−ティ
ング　セファロース、　　Ｃｏｎ−Ａセファロース、イ
オン交ｍ体、　　オクチルセファロース、フェニルセフ
ァロースセフアゾ・ノクスゲルなどの各種担体を用イタ
カラムクロマトグラフィー、抗体カラムクロマトグラフ
ィー、電気泳動などを適宜組み合わせて行うことが可能
である。

このようにして得られたＴＰＡ誘導体精製物の活性のフ
ィブリン依頼性およびプラスミノーゲン活性化活性は、
プラスミンの合成基質Ｓ−２２５１を利用するＣｏ１１
ｅｎ、　　Ｄ、ら、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ、　　
２５ユ、　２９１２（１９８２）、（前出）の方法、あ
るいはタカダの方法［Ｔａｋａｄａ。

Ａ８ら、　　）ｌａｅｎ＋ｏｓｔａｓｉｓ、１８，１１
７（１９８８））　ｌこ従ってｉｔＪ定され得る。上記
方法により、各誘導体１こつ０て。

プラスミノーゲンをプラスミンに変換する速度力；測定
され、その価からＫｍ値あるｌ、Ｘ４よ’Ｊｍａｗ力く
算出される。各誘導体の性能はに＋ｍ値あるＬ）ｉｔ　
Ｖｍａｘとして評価される。

血栓の溶解にかかわる種々の性質としては、比活性、フ
ィブリン親和性、活性のフィブリン依存性、プロテアー
ゼ抵抗性、血中持続性、プラスミノーゲン活性化活性、
インビトロ血栓分解能、阻害剤に対する感受性などが挙
げられる。本発明のＴＰＡ誘導体は天然のＴＰＡよりも
はるかに優れたプラスミノーゲン活性化能を有する。こ
のような性質は、後述の実施例により明らかにされる。

（実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

本発明に係わる諸実験は、内閣総理大臣の定める１組換
えＤＮＡ実験指針」に従って行った。実施例中のファー
ジ、プラスミド、　ＤＮＡ、　種々の酵素、大腸菌など
を扱う詳しい諸操作は、以下の雑誌、成書を参考とした
。

１、蛋白質核酸酵素、■（４）、　　（１９８１）、臨
時増刊「遺伝子操作」　（共立出版） ２、遺伝子操作実験法、高木康敬編著（１９８０）。

講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（工９８２）
、講談社 ４、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｔ、　　ｍａｎｔａｔｔｓら編（１９８２）、　　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ５、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｏｏｌｏｇ
ｙ、　　Ｌ、Ｇｒｏｓｓｍａ＋ｎら編。

６５（１９８０）、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ６
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｍｏｌｏｇｙ、
　Ｒ，Ｗｕｍ、　６５（１９７９）、　Ａｃａｄｅ＋＋
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ天然型ＴＰＡをコードするＤＮＡ配列
を、以下のようにしてｃＤＮＡから調製した。

まス、グアニジンーホットフェノール法に準じ。

染色体ＤＮＡ　（ｇＤＮＡ）利用ＴＰＡ発現ベクターｐ
Ｓｌ／ｅＰＡ−１（特開昭６２−１４７８３号公報、前
出）が導入されたＣ）１０−Ｋｌ細胞から全ＲＮＡを抽
出した。この全ＲＮＡ抽出物をオリゴｄＴセルロースク
ロマトグラフィーに供し。

得られたポリＡ＋ｍＲＮＡ画分をショ糖密度勾配遠心法
により分子量分画し、　ＴＰＡの■ＲＮＡを含む画分を
得た。

このｍＲＮＡ画分を市販のｃＤＮＡ合成キット（アマジ
ャム社）に供してｃＤＮＡを合成し、これを用いてｃＤ
ＮＡライブラリーを作成した。このｃＤＮＡライブラリ
ー１７）作成には、市販のλｇｔｌｏ利用ｃ　ＤＮＡク
ローンニングキソト（アマジャム社）を用いた。次いで
、このｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼ
ーションを常法により行った。それには、プローブとし
て、上記発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１を制限酵素■ａ
Ｉで切断して得られ、第１０．　１１および１２エクソ
ンを含む約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を用い、該ＤＮＡ断
片とハイブリダイズした陽性ファージクローンを選択し
た。

得られたいくつかの陽性ファージクローンがらそれぞれ
ＤＮＡを単離し、制限酵素Ｈｉｎｄｍ　（宝酒造（株）
製）で消化した後、アガロースゲル電気泳動を行った。

その後、上記プラークハイブリダイゼーションに用いた
のと同じＸｂａＩ切断２．５ｋｂ　ＤＮＡ断片をプロー
ブとして用いたサザンハイプリダイゼーションを行うこ
とにより、陽性ファージクローンを解析した。その結果
、　ＣＨ７９と命名したクローンには、上記プローブと
ハイブリダイズしｌ　Ｈｉｎｄｍで約２．２ｋｂに切断
されるＤＮＡ断片が含まれていることが分かった。この
約２゜２ｋｂのＩＨｎｄＩＩｒ切断ＤＮＡ断片をアガロ
ース電気泳動法にて単離した後、同じくＨｉｎｄｍで消
化したプラスミドベクターｐＵｃ１９　（宝酒造（株）
製）とＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いて連結し、大腸菌（
Ｌ姐且）　ＤＨＩ株に導入してｃＤＮＡクローンｐＣＨ
７９を得た。このｐＣＨ７９のｃＤＮＡ部分の塩基配列
を。

Ｈ１３法を利用した市販のキット（宝酒造（株）製）に
より決定した。その結果、このｅＤＮＡ部分の５゛末端
はプラスミドベクターｐＵｃ１９由来のＨＬｎ　ｄ　ｍ
　認ｍ部位に連結されており、そこから約１５０ｂｐ下
流には凪■の認識部位が存在し、その下流的１５００ｂ
ｐには終止コドンＴＧＡが存在することがわかった。さ
らに。

このＴＧＡコドンから約４１０ｂｐ下流には、プラスミ
ドベクターｐＵｃ１９由来の）Ｉ　ｔ　ｎ　ｄ　ｍ　ｊ
２　ｍ部位が存在していた。このｃＤＮＡ部分の塩基配
列は、５８４番目のＣがＴに、そして１７２５７２５番
目Ｃであったことを除いては、　Ｐｅｎｎ１ｃａら（Ｎ
ａｔｕｒｅ、　３０１．２１４；前出）が報告したＴＰ
Ａの塩基配列と一致していた。

（ｎ）発　ベクターの ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１およびＴＰＡ誘
導体発現ベクターを以下のようにして構築した。

（Ｉｆ　−Ａ）　ＴＰＡ発現へ’；１９−　ｐｓＶｅｃ
ＰＡ−１の構築ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１
を、下記の０〜０項で得られる３つのＤＮＡ断片を連結
することにより構築した。この発現ベクターの構築の概
略を第１図に示す。

■ｐｓＶｅｓａｌ　Ｉ由来の旧ｎｄｍ−Ｈｉｎｄｍ断片
プラスミドベクターｐｓＶｅｓａｌ　Ｉ　（特開昭６２
−１４７８３号公報、前出）を制限酵素Ｎｃｏｌで切断
し、約４．７ｋｂの大きい方のＤＮＡ断片（Ｎｅｏ　Ｉ
　−Ｎｃｏ　Ｉ断片）を単離した。このＤＮＡ断片は、
　ＳＶ４０由来の大腸菌内での複製起点（ＯＲ１，）を
含む初期プロモーター領域（ＳＶｅ）　；ポリアデニル
化シグナルを含む配列（ＰｏｌｙＡ）　；アンピシリン
耐性遺伝子（ＡＭＰ、）　；および２箇所のＨ４ｎｄＩ
［Ｉ認識部位を有する。このＮｅｏ　Ｉ　−Ｎｅｏ　Ｉ
断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより環状化して得られた
プラスミドベクターをｐｓＶｅｓａｌ、Ｉ　−Ｈｉｎｄ
ｍと命名し。

Ｅ、　ｃｏ■ＤＨ１株に導入して増幅させた。次に、Ｌ
ｃｏｌｉＤ旧株から常法によりプラスミドベクターｐＳ
’／ｅｓａｌ　Ｉ　−ＨｉｎｄＩＩを単離し、　Ｈｊｎ
ｄｍにて切断して約４．７ｋｂの大きい方のＤＮＡ断片
（Ｌ工ｄｍ−上玉ｄｍ断片）を得た。

■ｐｓＶｅＰＡ−１のＨ４ｎｄＩ［Ｉ　−Ｂ）１４　Ｉ
Ｉ断片上記のｇＤＮＡ利用ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅ
ＰＡ−１を■ｄＩＩＩおよびＢＢＩＵで切断し、約１．
９ｋｂの小さいＤＮＡ断片（ＨｉｎｄＩＩ［−ＬＬＬ　
ＩＩ断片）を得た。この旧ｎｄｎｌ　−１■断片は、　
　ＴＰＡをコードするｇＤＮＡの第２エクソン全部およ
び第３エクソンの一部を含む。

■ｐＣＨ７９の１■−畠ｄｍ断片 上記（Ｉ）項で得られたＴＰＡのｃＤＮＡクローンｐＣ
Ｈ７９を１■およびＨｉｎｄｍで切断し、　ＴＰＡ　ｃ
ＤＮＡを含む約２ｋｂのＤＮＡ断片（１１Ｉ−■迎■断
片）を得た。

上記■〜■のＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い
て連結することによりＴＰＡ発現ベクターを構築し、こ
れをｐｓＶｅｃＰＡ−１と命名した。コ（１）　ｐｓＶ
ｅｃＰＡ−１を、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＨＩ株に導入して、以下のＴＰＡ誘導体発
現ベクターの構築に用いた。このＴＰＡ発現ベク９−　
ｐｓＶｅｃＰＡ−１は天然型ＴＰＡを発現する遺伝子を
コードしており、　ｇＤＮＡ由来部分（第１図中の番号
２で示される第２エクソンから１番号３で示される第３
エクソンの１■認織部位まで）と、　ｃＤＮＡ由来部分
とを含む。

（ｎ　−Ｂ）　ＴＰＡＸ導体発現ベクターの構築本発明
のＴＰＡ誘導体ＫＭ４．　ＫＭ４１．　ＫＭ４２．　Ｋ
Ｍ４３．　ＫＭ４４およびＫＭ４５を発現し得る発現ベ
クターｐＳＣＫＭ４ｐｓｃＫＭ４１．　ｐＳＣＫＭ４２
゜ｐｓｆＪＭ４３．　ｐＳＣＫＭ４４およびｐＳＣＫＭ
４５の構築を次のように行った。

■変異導入ベクターＭ１３ＮＳの調整 ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１を、制限酵素Ｎ
ａｒｌ　にニーイングランドバイオラブ１社製）とＳｍ
ａｌ　（宝酒造株式会社製）とで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動によって約１．２ｋｂの断片を単離した。こ
の断片は、天然のＴＰＡのアミノ酸配列中１１０番目の
グリシンから５０８番目のプロリンに相当するｃＤＮＡ
配列をコードしている。この約１．２ｋｂ断片を、同じ
く凡ａｒｌとＳｍａｌとで切断したＭ１３＋ｎｐＨ（宝
酒造株式会社製）に、　Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（宝酒造
株式会社製）を用いて連結し、　Ｍ２Ｓ−ＮＳを得た。

これを旦、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）
に導入して形質転換体を得た。

■部位特異的アミノ酸置換 上記０項で得たＭ２Ｓ−ＮＳを有する形質転換体を培養
して、培養上清より一本鎖ＤＮＡを得た。次に、ＫＭ４
を発現し得る発現ベクターｐＳＣＫＭ４を得るために。

下記のＤＮＡ断片（１）をＤＮＡ合成機（３８１Ａ　Ｄ
ＮＡシンセサイザー　アブライドバイオシステムズ）を
用いて合成した。

５°ＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣ
ＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＴＡＡＡＧＡＣＧ　３°　（Ｉ） このＤＮＡ断片（Ｉ）をＴ４ポリスクレオチドキナーゼ
（宝酒造（株）製）を用いてリン酸化し１次いで。

上記−本鎖ＤＮＡ　Ｍ２Ｓ−ＮＳにアニールさせ、　Ｄ
ＮＡ鎖を延長させた。これには、市販のインビトロ変異
システムキット（アマジャム社製）を用いた。このよう
な部位特異的反応によって得られた。変異部分を含むプ
ラスミド（Ｍ２Ｓ−ＮＳＭ４）をＥ、ｃｏｉｌ　ＴＧＩ
　（アマジャム社製）に導入して増幅させた。天然のＴ
ＰＡの１６１から１６５番目のアミノ酸配列（グリシン
、リジン、チロシン、セリン、セリン）に対応するもと
の発現ベクターのＤＮＡ配列、　　−ＧＧＧＡＡＧＴＡ
ＣＡＧＣＴＣＡ−は。

−ＡＧＧＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧ−に変換された。こ
のＤＮＡ配列は。

アルギニン、アルギニン、チロシン、セリン、トリプト
ファンのアミノ酸配列に対応する。上記ＤＮＡ配列の変
異の導入は、市販のシークエンスキット（宝酒造（株）
）により確認した。

つぎに、　ＫＭ４１．　ＫＭ４２．にＭ４３．　ＫＭ４
４およびＫＭ４５をそれぞれ発現し得る発現ベクター、
　ｐｓｃＫＭ４１．　ｐｓｃＫＭ４２．　ｐＳＣＫＭ４
３．’　ｐＳＣＫＭ４４およびｐＳＣＫＭ４５を構築す
るために１次のＤＩＪＡ断片（ＩＩ）〜（ＶＩ）を、　
　ＤＮＡ合成機（３８１Ａ　ＤＮＡシンセサイザー、ア
プライドバイオシステムズ）を用いて合成した。

ｐＳ（ＪＭ４１を構築するためのＤＮＡ断片５’ＧＴＴ
ＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＧＣＣＡＣＴＣ３°（ＩＩ）
ｐＳＣＫＭ４２を構築するためのＤＩＪＡ断片５°ＧＣ
ＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＴＣＧ　３’　（
Ｉ［Ｉ）ｐＳＣＫＭ４３を構築するためのＤＮＡ断片５
’ＧＣＴＴＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＧＴＴＴ　
３°（ｒＶ）ｐＳＣＫＭ４４を構築するためのＤＮＡ断
片５°ＣＣＣＧＣＴＧＴＡＧＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＣ
ＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧＣ
ＡＣＴＣＧ　　３°　（Ｖ）ｐｓｃＫＭ４５を構築する
ためのＤＮＡ断片５°ＣＣＣＧＣＴＧＴＡＧＡＣＣＴＴ
ＣＣＣＧＡＴＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＧ
ＴＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＧ　３’　（ＶＴ）上記ＤＮＡ
断片（ＩＩ）を、　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造（株））を用いてリン酸化した。これを上記Ｍｌ　
３−Ｎ５Ｍ４とアニールさせ、常法によりＤＮＡ鎖を延
長させ、　Ｍ２Ｓ−ＮＳＭ４１を得た。この部位特異的
変異反応は、市販のインビトロ変異システムキット（ア
マジャム社製）を用いて行った。このＭ２Ｓ−ＮＳＭ４
１をＥ、ｃｏｌｉ　ＴＧＩ　（アマジャム社製）に導入
して増幅させた。変異の導入は９Ｍ１３法を利用した市
販のシークエンスキット（宝酒造（株））を用いて確認
した。

上記と同様の方法により、ＤＮＡ断片（ｍ）　、　（ｒ
Ｖ）　。

（Ｖ）および（■）をそれぞれ用いて、変異導入ベクタ
ーＭ１３−ＮＳＭ４１．　Ｍ２Ｓ−ＮＳＭ４２　　Ｍ２
Ｓ−ＮＳＭ４４およびＭ２Ｓ−ＮＳＭ４５をそれぞれ調
製した。

■ＴＰＡ誘導体発現ベクターの調製 上記■項で得られたＭＬ３−ＮＳＭ４をＮａｒ　ｌとＳ
ｍａｌとで分解し、小さい方の断片（約１．２ｋｂ）を
単離した。

次に、　　ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１をＮ
ａｒｌ及びＳｍａ　１で分解して大きい方の断片（約７
ｋｂ）を単離した。

これらの断片を連結し、　　ＩＭ４を発現しうる発現ベ
クターｐＳＣＫＭ４を得た。同様にＭｌ　３−Ｎ５Ｍ４
の代わりにＭｌ３−ＮＳＭ４１．　Ｍｌ３−ＮＳＭ４２
．　Ｍｌ３−ＮＳＭ４３．　Ｍｌ３−ＮＳＭ４４および
Ｍｌ３−ＮＳＭ４５を用いて２発現ベクターｐＳ（ＪＭ
４１．　ｐｓＣＫＭ４２．　ｐＳＣＫＭ４３．　ｐＳＣ
ＫＭ４４およびｐＳＣＫＭ４５を得た。

これらの発現ベクターは、ＴＰＡ誘導体ＫＭ４１．　Ｉ
Ｍ４２゜ＩＭ４３．　ＩＭ４４及びＩＭ４６を発現し得
る。

（ＩＩＩ）マーカーベクター５Ｖ２ｎｅｏ−ｄｈｆ　ｒ
の　築選択マーカー遺伝子としてｎｅｏおよびｄｈｆｒ
遺伝子を有するマーカーベクターを２次のようにして構
築した。

まず、　　ｄｈｆｒ遺伝子を有するｒＤＮＡベクターｐ
ｓＶ２ｄｈｆｒ（アメリカン　タイプカルチャー　コレ
クション、　　ｒＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　３７１４６
）を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、む！■−む１■断片
を単離した。このＰｖｕ　ＩＩ　−Ｐ剋Ｊ断片と、誼Ｈ
Ｉリンカ−ｄ　（ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ）　　（宝酒造（
株）製）とをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し。

ベクターｐｓＩ／２Ｂｄｈｆｒを構築し、　Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　ＤＨＩ株に導入して増幅させた。このｐＳＶ２Ｂ
ｄｈｆｒを単離してＢａｍＨＩで消化し、　ｄｈｆｒ遺
伝子を含む約２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をア
ガロースゲル電気泳動法により分離した。このＢａｍＨ
Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片と、　　ｒＤＮＡベクターｐｓ１
７２ｎｅｏ　（アメリカン　タイプカルチャー　コレク
ション、　ｒＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　３７１４９）を
ＢａｍＨＩで切断して得た阻ｍＨＩ　−ＢａｍＨＩ断片
とをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。このよう
にして構築した環状のマーカーベクターを、　Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　ＤＨＩ株に導入した。

コノマーカーベクターをｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆ　ｒと
命名した。

このｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒは、　ｎｅｏおよびｄｈ
ｆｒ遺伝子が同じ発現方向に挿入されている。

（ＴＶ）　　　　　　　の≦　　　およびＴＰＡ　　　
　の２度 宿主細胞として動物培養細胞ＣＨＯ−Ｋｌ　（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−６１）を選択し、　Ｃｈｅｎ、　Ｃ，ら（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、　１．　２７４５（１９８７））の方法に準じ。

上記（ＩＩ−Ｂ）項で得られた各ＴＰＡ誘導体発現ベク
ターを用いて形質転換を行った。各ｒｐＡＸ導体発現ベ
クターは、上ｆｆａ（ＩＩＩ）項で得られたマーカーベ
クターｐＳＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒと、　　（ＴＰＡ誘導
体発現ベクター：ｐｓｌ／２ｎｅｏ−ｄｈｆｒ＝　３０
０　：　１　（重量比）〕の割合で混合して用いた。こ
のベクター混合物のリン酸カルシウム共沈殿物を、予め
５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＭＤ培地（ＭＣＤＢ
３０２　：ダルベッコ変法ＭＥＭ＝　１　：１、シグマ
社）で生育させたＣＨＯ−Ｋｌ細胞（５Ｘ１０５個細胞
／１０ｍ１培地／直径１０ｃ＋ａ培養皿）に加え。

１５時間培養した後に新しい培地に変えた。さらに４８
時間培養した後、培地を５％ＦＣＳ、　８００　μｇ／
　ｍ１Ｇ４１８硫酸塩（ギブコ社）、７ｄε−アミノカ
プロン酸、５０μＭフォイパン（小野薬品工業）を含有
するＭＤ培地に変えた。さらに約２週間培養を続けて６
４１８耐性株を分離した。０４１８耐性株を１２穴マル
チデイツシユ（リンブロー社製）に移して底面全体に生
育させ、上記ＭＤ培地で２４時間培養した。この培養液
中に含まれるＴＰＡ誘導体の含量を、プラスミノーゲン
含有フィブリン平板を用い、その活性を測定することに
よって定量した（Ｍａｃｋｉｅ、　Ｍ、ら。

Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏ
ｌｏｇｙ、　４ｊ、　　？？（１９８１））。

定量には、後述の（Ｖｌ）項に記述したように精製し、
タンパク定量されたＴＰＡ誘導体標品を用いた。

各形質転換体について、培養培地あたりのＴＰＡ誘導体
の生産Ｉが０．５μｇ／ａ＋１以上のものを選択した。

このように選択された形質転換体細胞は、　ＭＤ無血清
培地（ＭＤ培地、　７ｍＭε−アミノカプロン酸、５０
μＭフォイバン、　　１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン
、および５μｇ／ｍｌインシュリン）においてもＴＰＡ
誘導体を生産した。

（Ｖ）ＴＰＡ　　　　の口　および　ｊ上記形質転換体
により生産された各ＴＰＡ誘導体の回収および精製を、
以下のようにして行った。この工程におけるＴＰＡ抗原
の検出には、市販のＥＬＩＳＡキット　（ＩＭＵＢＩＮ
Ｄ　ＴＰＡ　ＥＬＩＳＡにＩＴ、　　アメリカンダイア
グツステイカ社製）を用いた。

（ＴＶ）項で上述したようなＭＤ無血清培地で形質転換
体を培養して得られる。　ＴＰＡ誘導体を含む培養液を
、　　ＩＭ　ＮａＣ１，５０μＭフォイバンを含む２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したＣＰＧ−
１０（エレクトロヌクレオニクス社製）カラムに通し、
平衡化に用いたのと同じ緩衝液で洗浄した。ＣＰＧ−１
０カラムを通過した培養液および洗浄液中のＴＰＡ抗原
を測定すると、各ＴＰＡＩ導体はほとんど検出されてい
ないことがわかった。次いで、溶離液として１ＭＮａＣ
１，０，５Ｍ　ＫＳＣＮ、　　１Ｍε−アミノカプロン
酸および５０ＭＭフォイバンを含有する２００１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）を用い、　　ＣＰＧ−１０カラ
ムからＴＰＡ誘導体を溶出した。この溶出液を、　　Ｉ
Ｍ　ＮａＣ１，０，０１％Ｔｖｅｅｎ８０および５０Ｍ
Ｍフォイバンを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，５）にて平衡化したＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　
（ファルマシア社製）カラムにチャージした。平衡化に
用いたのと同じ緩衝液で洗浄した後、２ＭＫＳＣＮ、　
０．４Ｍ　ａ−メチルマンノシド、　　０．０１％Ｔｖ
ｅｅｎｌｌＯおよび５０ＭＭフォイバンを含有する２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に誹り溶出した。この
ＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒ。

ｓｅカラムの通過液、洗浄液および溶出液中に含まれる
ＴＰＡ抗原をＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析したところ、各ＴＰＡ
誘導体はほとんどＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
に吸着し、溶出により溶出液中に回収されていることが
わかった。

次に、　　ＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出液
を、　　０．１５ＭＮａＣ１，０，０１％Ｔｖｅｅｎ８
０および５０ＭＭフォイバンを含有する２０ｍＭ’Ｊン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析した後、同緩衝液
にて平衡化した抗体カラム［ＥＳＰ−２（バイオスコツ
ト社製）を固定化したセファロース４Ｂカラムコにチャ
ージした。　０．３Ｍ　ＫＳＣＮ、　Ｏ。

１５Ｍ　ＮａＣ１および０．０１％Ｔｖｅｅｎ８０を含
有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて洗浄し
た後、　３Ｍ　ＫＳＣＮ。

０．１５Ｍ　ＮａＣ１および０，０１％Ｔｗｅｅｎ８０
を含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）１７．５）にて
溶出を行った。この溶出液中に含まれるタンパク量を、
ウシ血清ア１．プミンを標準としてローリ−法により測
定した。その結果、各ＴＰＡ誘導体生産株の培養液２〜
６Ｌから。

約１〜３ｍｇのＴＰＡ誘導体（ＩＭ４．　Ｉｉ：Ｍ４１
．　ＩＭ４２．　ＩＭ４３゜ＩＭ４４およびＩＭ４５）
がそれぞれ得られていることがわかった。

実施例１で得られた各ＴＰＡ誘導体のプラスミノーゲン
活性化能を、天然型ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＰＡ−
１によって形質転換されたＣＨＯ−Ｋｌ細胞により得ら
れた組み換えＴＰＡ　（特開昭６２−１ｔ７８３号公報
）のプラスミノーゲン活性化能と比較した。測定方法は
、プラスミンの合成基質　Ｓ−２２５１を利用するタカ
ダらの方法［Ｔａｋａｄａ、　Ａ、ら、　　Ｈａｅｍｏ
ｓｔａｓｉｓ、　１８．１１７（１９８８）］　　に従
い、下記のように行った。但し、　　ＴＰＡはプラスミ
ンにて２本鎖とした後に反応に用い、プラスミノーゲン
としては、ヒト　リジンタイププラスミノーゲン（アメ
リカンダイアグツステイカ社製）を用いた。

２Ｏｎ＋Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，５）中に、　　０．
ｌＮａＣ１，０゜０５％Ｔｗｅｅｎ８０．　ＯＪｍＭ　
Ｓ−２２５１，０，１＋ｕｇ／ｍｌブロムシアン分解ヒ
トフィブリノーゲンを含有する複数個の反応液中に、リ
ジンタイププラスミノーゲンを１１〜８８ｎＭの範囲で
それぞれ添加した。これに実施例１で得られたＴＰＡ誘
導体を０．１５ｎＭとなるように添加して反応を開始さ
せた。反応は２５℃で行い、　４０５ｎＭの吸光度を経
時的に測定した。測定データよりプラスミン生成速度を
求めた。このプラスミン生成速度を用いてＬ　１ｎｅｖ
ｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを行い、に■及びＫｃａ
ｔを算出した。その結果を表２に示す。表表２から２本
発的のＴＰＡ誘導体は、いずれも、　ＣＨＯ−Ｋｌ細胞
より得られた天然型の組み替え体ＴＰＡよりもプラスミ
ノーゲン活性化能の高いことがわかる。

（以下余白） （発明の効果） 本発明によれば、このように、新規ＴＰＡ誘導誘導体厚
誘導体−ドするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有する発現
ベクター、該ベクターが導入された形質転換体、および
該ＴＰＡ誘導体の製造方法が提供される。

本発明の新規ＴＰＡ誘導体は、天然型ＴＰＡに比べては
るかに高いプラスミノーゲン活性化能を有するため天然
型ＴＰＡよりも血栓溶解能が窩＜、心筋梗塞などの血栓
症の治療に有効に使用される。血中持続性も高い。本発
明のＴＰＡ誘導体を使用することにより、現在試みられ
ているＴＰＡによる治療の効果が改善され得る。

４、図−の９ｍな脱Ｂ 第１図は１本発明の発現ベクターの構築に使用されるＴ
ＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１の構築を示す概略
図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から１１２番目のグルタミン酸がセリンに、１
   ６１番目のグリシンがアルギニンに、１６２番目のリジ
   ンがアルギニンに、そして、１６５番目のセリンがトリ
   プトファンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する
   、組織型プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 ２、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から１１５番目のアスパラギンがプロリンに、
   １６１番目のグリシンがアルギニンに、１６２番目のリ
   ジンがアルギニンに、そして、１６５番目のセリンがト
   リプトファンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有す
   る、組織型プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 ３、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から１４９番目のアルギニンがグリシニンに、
   １６１番目のグリシンがアルギニンに、１６２番目のリ
   ジンがアルギニンに、そして、１６５番目のセリンがト
   リプトファンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有す
   る、組織型プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 ４、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から１１５番目のアスパラギンがプロリンに、
   １２０番目のアラニンがイソロイシンに、１２２番目の
   アラニンがイソロイシンに、１２３番目のグルタミンが
   グリシンに、１２５番目のプロリンがバリンに、１６１
   番目のグリシンがアルギニンに、１６２番目のリジンが
   アルギニンに、そして、１６５番目のセリンがトリプト
   ファンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する、組
   織型プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 ５、組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列
   のＮ末端から１２０番目のアラニンがイソロイシンに、
   １２２番目のアラニンがイソロイシンに、１２３番目の
   グルタミンがグリシンに、１２５番目のプロリンがバリ
   ンに、１６１番目のグリシンがアルギニンに、１６２番
   目のリジンがアルギニンに、そして、１６５番目のセリ
   ンがトリプトファンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列
   を有する、組織型プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 ６、請求項１から５に記載の組織型プラスミノーゲン活
   性化因子誘導体のいずれかをコードするＤＮＡ配列。 ７、請求項６に記載のＤＮＡ配列を有する発現ベクター
   。 ８、請求項７に記載の発現ベクターを動物培養細胞に導
   入して得られる形質転換体。 ９、前記動物培養細胞がＣＨＯである、請求項８に記載
   の形質転換体。 １０、請求項８に記載の形質転換体を培養して得られる
   、グリコシル化された組織型プラスミノーゲン活性化因
   子誘導体。 １１、（ａ）請求項６に記載のＤＮＡ配列を有する発現
   ベクターを構築する工程； （ｂ）該発現ベクターを動物培養細胞に導入して形質転
   換体を得る工程； （ｃ）該形質転換体を培養して組織型プラスミノーゲン
   活性化因子誘導体を生産させる工程；および （ｄ）生産された組織型プラスミノーゲン活性化因子誘
   導体を単離する工程； を包含する、組織型プラスミノーゲン活性化因子誘導体
   の製造方法。