JPH07507448A - 向上した治療特性を有する組織プラスミノーゲン活性化因子グリコシル化変異体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 向上した治療特性を有する組織プラスミノーゲン活性化因子グリコジル化変異体 本発明は、十分にそのフィブリン結合親和性を保持しながら、野生型ヒト１−Ｐ Ａと比較して増強した循環半減期を有する組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ −ＰＡ）変異体に関する。ある種の変異体は、ｉｎ　ｖｉｖｏフィブリン溶解カ の向上をさらに示している。本発明はまた、これらの変異体を調製するための方 法と手段、およびこれらを含んだ医薬組成物に関するものである。

■、背景と関連技術の説明 組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、ドメインを多く持つセリンプ ロテアーゼであり、その生理学的役割はプラスミノーゲンをプラスミンに変換し 、それによりフィブリン溶解過程を開始または促進することである。

初めてｔ−ＰＡに臨床的関心が持ち上がった理由は、フィブリンの非存在下に比 べて、ライブ１ルの存在下でその活性が相対的に高かったからであった。野生型 のｔ−ＰＡはフィブリン非存在下では酵素活性が弱いが、フィブリンが存在する とプラスミノーゲンを活性化する能力が著しく高められる。刺激がなければ、プ ラスミノーゲン活性化に対するメラノーマや組み換えヒトｔ−ＰＡ（Ａｃｔｉｖ ａｓｅ”　ｔ−ＰＡ）の触媒効率（触媒速度定数（Ｋ、、、）／ミカエリス定数 （Ｋ、））は、約１ｎＭ−Ｉｓｅｃ−’であり、一方、フィブリンやライブ１ル 分解物の存在下では、この効率（偽速度定数）は数百倍に増加する。ｔ−ＰＡの この並外れた生化学的特性は、全身的なプラスミノーゲン活性化を誘導する非フ ィブｌル特異的血栓溶解促進物質（ストレプトキナーゼやウロキナーゼなど）と は異なっΔは、急性心筋梗塞および肺塞栓の処置の際に血栓溶解剤として治療的 に用いられ、どちらの状況も通常、フィブリン含有血栓による血管の閉塞から生 じている。

ｔ−ＰＡは、その著しいフィブリン特異性に加えて、さらに幾つかの際立った特 徴を示している。

（ａ）　ｔ−ＰＡは、分子の一本鎖型がかなりの酵素活性を持っているという点 で、はとんどのセリンプロテアーゼと異なっている。数種の小さな基質に対して 、およびフィブリン非存在下におけるプラスミノーゲンに対して、二本鎖１−Ｐ Ａは一本鎖よりも大きな活性を持っている。しかし、フィブリンの存在下では乱 立、５１９１−５２０１　（１９９１）］。はとんどの他のセリンプロテアーゼ はチモーゲンとして存在しており、完全な酵素活性を持つようにするための二本 鎖型へのタンパク分解を必要とする。

（ｂ）　ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるｔ−ＰＡの働きは、セ ルピン、すなわちＩ’Ａｌ−１によって阻害される［ボーガム、Ｄ、Ｅ、ら。

Ｊ、ＣＩ　ｔｎ、、Ｉｎｖｅｓｔ、　８４．５８６−５９１　（１９８９）；ラ イマン。

Ｂ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５９．３６４４−３６４７　（１９８４ ）］。

（ｃ）　ｔ−ＰＡは、ｕＭの範囲のに、値でｉｎ　ｖｉｔｒｏでフィブリンと結 合する。

（ｄ）　ｔ−ＰＡは、肝臓において一種もしくは数種のレセプターを介した急ｈ ｒｏｎ、Ｒｅｓ、　５３．２８７−３０３　（１９８９）：　モートン、Ｐ、Ａ 。

ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４．７２２８−７２３５　（１９８９）］ 。

実質的に純粋な形態のｔ−ＰＡは、最初は天然の供給源から生産され、コレンｖ ｉｖｏにおける活性試験がなされた（リーケンら、Ｊ、ｌ３ｉｏ１．Ｃｈｅｍ。

・２１４　［１９８３］　）は、ｔ−ＰＡのＤＮＡ配列を決定し、このＤＮＡ配 列からアミノ酸配列を推測した（１９８８年８月２３日発行の米国特許番号４， ７６６．０７５参照）。

ヒトの野生型ｔ−１’Ａは、１１７．１８４．２１８、および４４８番目のアミ ノ酸位置がＮ結合型グリコジル化部位である可能性がある。Ｃ１（０細胞におけ る発現により産生された組み換えヒトＬ−ＰＡ　（Ａｃ　Ｌ　１ｖａｓｅ”　ｔ −ＰＡ）は、１１７番目の位置の高マンノース型のオリゴ糖、およびＡｓｎ−１ ８４とＡｓｎ−４４８の位置の慢合オリゴ糖からなる炭水化物を約７重態％含む ことが報告されている［ベーハー、　Ｇ、　Ａ、　ら、″組み換えＤＮＡ技術に よって産生されたヒト組織プラスミノーゲン活性因子の特性研究°定量的生物学 に関するコールドスプリングハーバーノンボジウム　１９８６：Ｌｉ　：５５１ −５６２］。２１８番目の位置は、天然のｔ−ＰＡでグリコジル化されていると いう発見はなされなかった。１１７番目と４４８番目の位置は常にグリコジル化 されているように思われるが、一方１８４番目の位置はその分子の約５０％にお いてグリコジル化されていると考えられる。１８４番目の位置でグリコジル化さ れているｔ−ｐへ分子はＩ型ｔ−ＰＡと呼ばれ、１８４番目の位置でグリコジル 化されていない分子は■型ｔ−ＰＡと呼ばれている。Ｃｌｌ０細胞由来ヒトｔ− ＰＡは炭水化物構造の最も包括的な分析がスペルマンら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、　２旦４　（２４）１４１００−１４１１１　（１９８９）　によって行わ れ、彼らは少な（とも１７個の異なったＡ　ｓ　ｎ結合型炭水化物構造がそのタ ンパク質に検出できることを示した。

これらは、１１７番目の位置における高マンノース構造から、１８４番目と４４ ８番目の位置における２本、３本、４本の触角様Ｎ−アセチルラクトサミン型に まで及んだ。■型および■型のｔ−ＰＡは、同じ細胞株から単離すると、Ａｓｎ ＝１１７およびＡｓｎ−４４８の位置に同一の態様でＮ−グリコジル化されると ｔ−ＰＡの配列分析によって、その分子が５つのドメインを持っていることが同 定された。各ドメインは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミノーゲン、プ ロトロンビン、フィブロネクチン、および上皮成長因子（ＥＧＦ）のような他の タンパク質における相同な構造および機能領域に関連して定義されてきた。これ らのドメインはｔ−１’Ａのアミノ酸配列のＮ末から始まって、１番目のアミノ 酸から約４４番目のアミノ酸までがフィンガー（Ｆ）　ドメイン、約４５番目の アミノ酸から約９１番目のアミノ酸までが成長因子（Ｇ）　ドメイン（ＥＧＦと の相同性に基づいている）、約９２番目のアミノ酸から約１７３番目のアミノ酸 までがクリングル−１（Ｋｌ）　ドメイン、約１８０番目のアミノ酸から約２６ １番目のアミノ酸までがクリングル−２（Ｋ２）　ドメイン、そして約２６４番 目のアミノ酸から５２７番目のカルボキシル末端までがセリンプロテアーゼ（Ｓ ）　ドメインと名付けられている。これらのドメインは、本来、互いに隣り合っ た位置にあり、短い“リンカ−”領域によって結合している。３つの付加的な残 基（Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ）が時々アミノ末端に発見されることがあるが 、これらのリンカ−領域のために、成熟ポリペプチドの全アミノ酸数は５２７に なっている。この追加的なトリペプチドは、一般的に、不完全な前駆体プロセシ ングの結果であると考えられており、それが機能性を付与することは知られてい ない。天然のｔ−ＰＡは、２７５番目の位置と２７６番目の位置の間（セリンプ ロテアーゼドメイン中に位置する）で切断され、２本鎖型の分子を生じる。

各ドメインは、ｔ−ＰＡ分子の全体にわたる生物学的に意義ある特性に対して異 なった方法で寄与している。ドメインを欠失させる研究によって、フィンガー、 成長因子もしくはクリングル−２ドメインが欠失すると、結果としてｔ−ＰＡ変 異体のフィブリンに対する結合親和性が低下することが示されている［ファンＢ ＯＪ、旦、３５２５−３０　（１９８６）］が、しかし、置換変異体から得られ たより最近の結果は、クリングル−２ドメインは初期に予測されていたほどフィ ブリンとの結合に関与していないということを示している［ベネット、Ｗ。

Ｆ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６６　５１９１−５２０１　（１９９１ ）］。

ドメインを欠失させる研究は、フィンガーおよび成長因子ドメインが肝臓で除去 されることを示した［コレンら、Ｂｌｏｏｄ　ヱ１，２１６−２１９　（１９８ ８）：カリアンら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３．３９７１−３９７８　（ １９８８）；ツーら、Ｔｈｒｏｍｂ、ｅｓ、旦０．３３−４１　（１９８８）； 　レフイノら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　２，３０　（１９８８）；　ツーセ ンら。

Ｂｌｏｏｄ　７３　１８４２−１８５０　（１９８９）；　ブラウンら、Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２６旦、１５９９−１６０２　（１９８８）］、］クリン グルー２ドメイはリジンへの結合に関与している。セリンプロテアーゼドメイン はｔ−ＰＡの酵素活性に関与しており、その部位の変異がフィブリン結合性とフ ィブリン特異性（恐らく、フィブリンと直接的に相互作用する）の両方に影響を 与えることが示されている特定の領域、およびフィブリン特異性のみが変化を受 ける（恐ら（、フィブリンと間接的に相互作用する）池の領域を含んでいる（ベ ネットら、１９９１．前掲）。部位特異的変化から生じる変異体を用いた研究は 、クリアランスにおいてｔ−ＰＡのグリコジル化が関与していることを示してい る〔ローら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｌｌ’　５．９５３−９５８　（１９８ ７）；　ローら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６，７３４　（１９８８）］ 。

野生型ヒトｔ−ＰＡの血漿からのクリアランスが相対的に速いことは、一方では 血栓溶解後に緊急介入を必要としている患者にとっては利点であるが、血中ｔ− ＰＡの治療的レベルを維持するため連続的な静脈投与を必要とする。急性肺塞栓 の成人患者の血栓溶解治療のためのＡｃｔｉｖａｓｅ”　（アクチバーゼ）１− ＰＡの推奨されている全投与量はｉｏＱｍｇであり、それは２時間をかけた連続 的な静脈注入として投与される。より長い血漿半減期（クリアランスがより遅い ）をもったｔ−ＰＡ誘導体はポーラス注入として投与でき、野生型ｔ−ＰＡの連 続注入で得られるよりも高い血漿濃度を得ることができ、そしてそのために治療 的有効量を減少させる結果になるだろう。よりゆっくりと除去されるｔ−ＰＡ変 異体は、深在静脈血栓症のような状態の処置、梗塞患者の次に続（再潅流の処置 、肺塞栓の処置もしくは末梢動脈血栓症（末梢血管疾患）の処置において特に有 利となるだろう。

ポーラスの形で投与できるｔ−ＰＡ変異体の必要性の高まりは、早期の梗塞に関 係する冠状動脈の開通を促進し、心筋の救助を改善するという目的をもった野生 型ヒトｔ−ＰΔ（特に、１本鎖）のポーラス投与に対する最近の関心が背景と１ ５７０−１５７４　（１９９１）］。最近の臨床的研究の結果は、野生型ヒトｔ −ＰＡのポーラス静脈投与が血栓溶解治療の開始を速めるのみならず、比較的高 いｔ−ＰＡ濃度が素早く達成されるために血栓溶解が亢進することを示している クリアランスの減少したｔ−ＰＡ変異体は、分子から個々のアミノ酸、ドメイン の一部、もしくは完全なドメインを欠失させることによって調製されてきた。

次に挙げている出版物は、成長因子および／またはフィンガードメインの一部も しくは全部を欠失させることによって、また任意に池の変異を加えて、野生型ｔ −ＰＡのクリアランス速度を減少させようとした試みを描いているニブラウンら 。

１９８８、前ｔｌ；　ヨハネセンら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓ　ｔａｓ、６ ３゜５４−５９　（１９９０）；　コレンら、１９８８．前掲；　カリアンら、 １９８８゜−１４０（１９９０）；　米国特許番号　４，９３５．２３７　（１ ９９０年６月１９日発行）；ＥＰ−Ａ　２４１．２０８　（１９８７年１０月１ ４日公開）；ＥＰ−Ａ　２４０，３３４　（１９８７年１０月７日公開）。２個 のクリングル−２ドメインをもち、報告によれば血漿クリアランスの減少したｔ −ＰＡ変異体が、コレンら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｉｌａｅｍｏｓ　ｔ、　６５．１７ ４−１８０　（１９９１）によって開示された。

様々なアミノ酸置換ｔ−ＰＡ変異体は、クリアランス速度を減少させる能力およ び／またはｔ−ＰＡの半減期を増加させる能力によって評価されてきた。６３番 目から７２番目（特に、６７番目と６８番目の位置において）および４２番目か ら４９番目までのアミノ酸領域の置換によって、野生型ヒトｔ−ＰＡの血漿半減 期が増加することが報告されている［１９８９年１２月２８日公開のＷＯ１８９ ／１２６８１およびアヘーンら、Ｊ、ｌ３ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、　２６５，５５４ ０　（１９９０）］。天然の成熟したｔ−ＰＡの２７５番目のアルギニンをグル タミン酸に置換すると、クリアランス速度が野生型ヒトｔ−ＰＡの約２倍遅くな ることが記載されている［ホックキスら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓ　ｔ、、 ５旦・４９１　（１９８７）］。

クリアランス速度を減少させるためのまたは／およびｔ−ＰＡの半減期を延ばす ための池の取り組みは、ｔ−ＰＡ分子を第二の分子と複合体化することであった 。例えば、ｔ−ＰＡ−ポリエチレングリコール−共役体は、ＥＰ−Ａ　３０４゜ ３１１　（１９８９年２月２２日公開）で報告されたように、ｔ−ＰＡのクリア ランス速度を減少させることが報告されている。ｔ−ＰＡに対するモノクローナ ル抗体は、ｔ−ＰＡの活性を減少させることなくｉｎ　ｖｉｖｏでのｔ−ＰＡの 機能的半減期を増加させることが報告されている（１９８９年１２月２日公開の ＥＰ−Ａ　３３９．５０５参照）。

ｔ−ＰＡのクリアランスにおける炭水化物の関与もまた研究されている。野生型 ヒトｔ−ＰＡとは異なる炭水化物プロフィルをもったｔ−ＰＡ変異体が作成され 、試験されてきた。

この取り組みの例として、６０．６４．６５．６６．６７．７８．７９．８０． ８１．８２．１０３．１０５．１０７および２５０番目の位置の１つまたはそれ 以上が、これらの残基のいくつかの位置、もしくはその近（にグリコジル化部位 をもつ分子を作り出すために適当なアミノ酸で置換された（１９８９年１１月３ ０日公開のＷｏ、８９／１１５３１参照）。例えば、これらのｔ−ＰＡ変異体の うち、７１０３Ｎ過剰−グリコシル化ｔ−ＰＡ変異体は、クリアランスが天然の ｔ−ＰＡより約５倍遅かった。

他の研究は、野生型ｔ−Ｐへのグリコジル化部位を非グリコジル化部位に変換す ることに焦点をあてた。クリングル−２およびプロテアーゼドメインからなるｔ −ＰＡの非グリコジル化部位体は、野生型ｔ−ＰＡよりも血漿クリアランスがか ら選択的にオリゴ糖残基を除去し、これらの残基を除去することによって、ｔ− ＰＡのクリアランス速度が減少することを示した。これらの研究およびローら［ （１９８７）、前掲；　（１９８８）、前掲］はまた１１７番目の位置のグリコ ジル化を防ぐため、ｔ　’−Ｐ　Ａ変異体Ｎ１１７Ｑ（その変異体では、野生型 ヒトｔ−ＰＡの１１７番目のアスパラギンがグルタミンに置換している）を生み 出した。

この変異体は、この位置の高マンノースオリゴ糖を酵素的に除去して得られる変 異体と類似しており、野生型ヒトｔ−ｐΔよりも約２倍遅いクリアランス速度を 示した。１９８７年９月２３日公開のＥＰ−Ａ　２３８．３０４および１９８７ 年７月１日公開のＥＰ−Ａ　２２７，４６２も参照されたい。

さらなるヒトｔ−ＰＡグリコジル化変異体のクリアランス速度が減少したことが 、次の出版物に記載され、報告された：アヘーンら、前掲（Ｑ４２Ｎ、Ｈ４４Ｅ 、Ｎ１１７Ｑ　ｔ−ＰＡ）；：Ｉレフら、（１９９８）、前掲［ｄｅｌ　（Ｃ６ −１８６）Ｎ１１７Ｑ　ｔ−ＰＡ、およびｄｅｌ　（Ｃ６−１８６）Ｎ１１７Ｑ 、Ｎ１８４Ｑ　ｔ−ＰＡ］　；ヘイジウッドら、Ｐｒｏｔ、Ｅｎｑｉｎｅｅｒ、 　２＋６１１　（１９８９）（Ｎ１１７Ｑ、Ｎ１８４Ｑ　ｔ−ＰＡ）。

我々は、１０３−１０５番目のアミノ酸の位置での余分のグリコジル化の付加に よって野生型ヒトｔ−ＰＡの循環半減期が延長することはまたフィブリン結合親 和性および／または血漿証血溶解活性における喪失を伴うことを見いだした。

例えば、野生型ヒトｔ−ＰＡの１０３番目のアミノ酸の位置でスレオニンをアス パラギンに置換するとクリアランス速度が約５倍減少したが、しかしｔ−ＰＡの フィブリン結合親和性および活性が著しく減少したという点でｔ−ＰＡ機能にお ける喪失がもたらされた。その結果、このグリコノル化変異体の血漿濃度がその より低いクリアランス速度のためにＡｃｔ　１ｖａｓｅ”　ｔ−ＰＡの等しい用 量に対して約４−５倍大きいにもかかわらず、その活性が減少しているせいで効 率もしくはｉｎ　ｖｉｖｏのフィブリン溶解力は殆ど向上されない。

本発明は、池の状況のなかにあって、初期の機能が野生型ｔ−ＰＡの薬物動態特 性を向上すること（血漿クリアランスを減らし、循環半減期を延ばす）である変 更から生じるｔ−ＰＡのブイプリン結合性の喪失が、より遅いクリアランス速度 の達成や循環半減期の延長を損なうことなしに、追加的な変更によりて回復する ことを示す、特定の研究の成功に基づいている。さらに、本発明は、そのような ｔ−ＰＡ変異体のｉｎ　ｖｉｖｏ凝面溶解（フィブリン溶解）力が、ｔ−ＰＡの グリコ／ル化パターンの変化がｔ−ＰＡのプロテアーゼドメインにおける追加的 な特定の変更を伴う場合は特に、野生型ヒトｔ−ＰＡのそれより著しく向上する ことを示す実験的証拠に基づいている。その結果が野生型ｔ−ＰＡに関して改良 されたフィブリン溶解力をもった分子であり、その分子はまた、野生型ｔ−ｐＡ よりも速く血漿凝血を溶解することができ、その上、向上したフィブリン特異性 をもつだろう。

発明の概要 我々は、驚くべきことに、野生型ヒトｔ−ｐΔの１０３から１０５番目のアミノ 酸の位置に余分のグリコジル化部位をもつ、ゆっくりとクリアランスを受けるｔ −ＰＡ変異体について観察されるフィブリン結合性の喪失は、１１７番目のアミ ノ酸の位置の機能的炭水化物を除去することによって回復できることを見いだし た。これらの変更が組み合わされた場合には、ｔ−ＰＡ変異体のフィブリン結合 親和性を損なわずに循環半減期を延ばすことが可能になる。野生型ｔ−ＰＡのｉ ｎ　ｖｉｖｏフィブリン溶解力（単位用量あたりの凝血溶解）はまた、フィブリ ン特異性を向上する追加的な変更が分子に導入される場合は特に改良され得る。

それゆえ、本発明は、１０３−１０５番目のいかなる位置でもグリコジル化され 、野生型ヒトｔ−ＰＡのアミノ酸配列の１１７番目の位置の機能的な炭水化物構 造を欠いており、モしてａ）野生型ヒトｔ−ＰＡのフィブリン結合親和性を実質 的に保持しながら延長した循環半減期を示すか、もしくはｂ）野生型ヒトｔ−Ｐ へと比べてｉｎ　ｖｉｖｏフィブリン溶解力が向上しているｔ−ｐへ変異体に関 する。

好ましい具体例において、そのようなｔ−ＰＡ変異体は野生型ヒトｔ−ＰＡと比 べて少なくとも同様のフィブリン結合性を示す。

他の好ましい具体例において、そのようなｔ−ＰＡ変異体は野生型ヒトｔ−ＰＡ と比べてｉｎ　ｖｉｖｏフィブリン溶解力が増加している。

天然ｔ−ＰＡ分子の１１７番目のアミノ酸残基の炭水化物を別にすれば、本発明 のｔ−ＰＡ変異体は、野生型ヒトｔ−ｐへでグリコジル化されている位置で機能 的な炭水化物構造を保持することが好ましい。

余分のグリコジル化部位は野生型ヒトｔ−ＰＡの１０３もしくは１０５番目の位 置であることが好ましい。

ひとつの好ましい具体例において、余分のグリコジル化はＮ結合型であり、得ら れる変異体は、Ａｓｎ−Ｘ−５ｅｒもしくはＡｓ　ｎ−Ｘ−Ｔｈ　ｒ　トリペプ チド配列の部分として１０３−１０５番目のいかなるアミノ酸の位置にもアスパ ラギンを含んでおり、そのトリペプチド配列においてＸはグリコジル化を防ぐプ ロリンを除けばどのアミノ酸でもよい。

他の好ましい具体例において、Ｎ結合型の余分のグリコジル化部位は野生型ヒト ｔ−ＰＡの１０３もしくは１０５番目のアミノ酸の位置である。

さらに好ましい具体例において、１１７番目のアミノ酸位置の機能的な炭水化物 構造の除去は、グリコジル化シグナルであるＡ−ｓ　ｎ−Ｘ−５ｅ　ｔ／Ｔｈ　 ｒ　（Ｘは上記のように定義される）の根底にあるＤＮＡの部位特異的変異によ って行われる。得られるＬ−ＰＡ’＆異体では、野生型ｔ−ＰＡアミノ酸の１１ ７番目の位置のアスパラギンを、池のアミノ酸、これはグルタミンであるのが好 ましいが、に置き換える。

さらになお好ましい具体例において、本発明の変異体は野生型ヒトｔ−ＰＡに比 べてフィブリン特異性が向上している。

例えば、フィブリン特異性は、野生型ヒトＬ−ＰＡアミノ酸配列の２９６−３０ ２番目および２７４−２７７番目のアミノ酸領域内に追加的な変更を導入するこ とによって向上させることができる。その変更は、２９６−２９９番目の位置の アミノ酸の各々の、アラニンへの置換であるか、もしくは野生型ｔ−ＰＡの２７ ４−２７７番目の位置に存在するアミノ酸（フェニルアラニン、アルギニン、イ ソロイシン、リジン）の、それぞれロイシン、ヒスチジン、セリンおよびスレオ ニンへの置換であることが好ましい。

他の具体例において、本発明は、上述した変異体をコードしているＤＮＡ配列、 形質転換した宿主細胞においてそのようなりＮＡ配列を発現できる複製可能な発 現ベクター、形質転換宿主細胞およびｔ−ＰＡ変異体をコードしているＤＮＡを 発現するための宿主細胞の培養からなる過程に関する。

さらに池の具体例において、本発明は、製薬的に許容し得る担体の混合物中のｔ −１’Ａ変異体の治療的有効量を含有する、血管の状態や疾患を処置するための 組成物に関する。

さらに池の具体例において、本発明は、哺乳類へｔ−ｐへ変異体の有効量を投与 することを特徴とする、哺乳類における血管の疾をもしくは状態を処置するため の方法を提供する。

さらなる局面において、本発明は、１１７番目のアミノ酸の位置の機能的な炭水 化物構造を追加的に除去することにより、野生型ヒトｔ−ＰＡ配列の１０３−１ ０５番目のいかなる位置での余分のグリコジル化の付加によってもたらされるフ ィブリン結合親和性の喪失を実質的に回復するための方法に関する。

図面の簡単な説明 図１および２は、得られるＬ−ＰＡ変異体のフィブリン結合性に対する本発明の 変異の効果を表している。野生型ヒトｒ−ＰＡの１０３番目の位置のアミノ酸で の余分のグリコノル化のためのフィブリン結合性の喪失は、野生型ヒトｔ−ＦＡ 分子の１１７番目の位置の炭水化物構造を除去することによって回復することが できた。

図３．４．５は、ウサギの動−静脈シヤント狸栓溶解モデルにおいて行った、ｉ ｎ　ｖｉｖｏＭ血溶解アッセイの結果を表している。

“ｔ−ＰＡ”、′ヒトＬ−ＰＡ”、および１ヒト組織プラスミノーゲン活性化因 子”という用語は、典型的には５つのドメイン（フィンガー、成長因子、クリン グル−１、クリングル−２、およびプロテアーゼドメイン）をもっているが、そ れにもかかわらず、もしそれがまだ血栓溶解剤として機能するならばさらに少な いドメインをもつているかもしれないし、またそのドメインのいくつかが反復し ているかもしれない構造を有しているフィブリン溶解活性をもつヒトの外因性（ 組織型）プラスミノーゲン活性化因子を指している。最小単位として、ｔ−ｐＡ は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換できるプロテアーゼドメイン、および 少なくとも部分的にはフィブリン結合性を担っていると考えられているＮ末端領 域からなる。このように、これらの用語は、そのポリペプチドのアミノ酸配列の 一部としてのこれらの機能ドメインからなるポリペプチドをも含んでいる。生物 学的に活性なｔ−ＰＡの形態は、その分子の２つの機能ドメイン、およびそうで なければｔ−ＰＡ供給源固有のｔ−ＰＡのいかなる池の部分をも含んでいる形態 で、組み換え細胞培養系によって生産することができる。各個体のｔ−ＰＡアミ ノ酸配列における１つもしくはそれ以上のアミノ酸の違いによって示されるよう に、天然のアレル変異が存在し、その変異は個体の間で生じうることが理解でき るであろう。

“野生型ｔ−ＰＡ”天然のｔ−ＰＡ”野生型ヒトｔ−ＰＡ”および“天然のヒト ｔ−ＰＡ”という用語は、天然の配列のヒトｔ−ＰＡ、すなわち、１９８８年８ 月２３日発行の米国特許番号４．７６６．０７５中に報告されているｃＤＮＡ配 列によってコードされているものを指している。ｔ−ＰＡ分子中のアミノ酸の部 位の数字または位置は、米国特許番号４．７６６．０７５に従って番号を付けて いる。ｔ−ＰＡはどのような天然の供給源からとられたものでもよい。さらに、 ｔ−ＰＡは、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）またはヒト胎児 腎臓２９３細胞などの、いかなる組み換え発現系から得てもよい。

“フィブリン結合性”および“フィブリン結合親和性”という用語は、リーケン ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５ヱ、２９２０−２９２５　（１９８２）に 記載されている方法もしくは実施例２に開示しているその変法のような標準的な フィブリン結合アッセイにおいて、ｔ−ＰＡ分子がフィブリン凝血に結合する能 力を指している。

“（ｔ−ＰＡの）生物学的活性”、“生物学的に活性のある”、“活性″および “活性のある”という用語は、血漿の凝血の存在下もしくはフィブリン存在下で のＳ−２２５１アツセイ、Ｓ−２２８８アツセイ、血漿凝血溶解アッセイ、また は他の適当なアッセイで測定されるような、ｔ−ＰＡ分子がプラスミノーゲンを プラスミンに変換する能力を指している。そのアッセイは、フィブリン、フィブ リノーゲン、血漿および／または血漿の凝血などの、活性を調節する可能性のあ る因子の存在下もしくは非存在下で行ってもよい。

“フィブリン溶解活性”、“血栓溶解活性”および“凝血溶解活性”という表現 は相互交換して用いられ、カールソン、　Ｒ，Ｈ，ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ 見−１６８，４２８−４３５（１９８８）による精製凝血溶解アッセイおよびベ ネソト、Ｗ、Ｆ、ら、１９９１．前掲により表されたその変法のような当業者に 既知のいかなるｉｎ　ｖｉｔｒｏ凝血溶解アッセイを用いても、また凝血が精製 フィブリン由来であろうが血漿由来であろうが、ｔ−ＰＡ分子がその凝血を溶解 できる能力を指している。

”特異的なフィブリン溶解活性”、″特異的な血栓溶解活性”および“特異的な 凝血溶解活性”という表現は単位定常状態血漿レベルによる凝血溶解を指してお り、その単位定常状態血漿レベルは上記の当業者に既知のいかなるｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ凝血溶解アッセイによっても決定できる。

“ｉｎ　ｖｉｖｏフィブリン溶解力”、“ｉｎ　ｖｉｖｏ血栓溶解力”および“ ｉｎ　ｖｉｖｏ凝血溶解力”という表現は相互交換して用いられ、ｔ−ＰＡの単 位投与量あたりの製血溶解を措している。ｉｎ　ｖｉｖｏフィブリン溶解カ”は 、ハムスター肺塞栓モデル（コレン、Ｄ、ら、１９９１．前掲）、および“ウサ ギ頚静脈血栓症モデル［コレン、Ｄ、ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７１ ．３６８　（１９８３）１などの、凝血溶解アッセイの許容できるいかなる動物 モデルにおいても測定される。後者のモデルの特に好ましい方法を、以下の実施 例にて説明している。

（野生型ヒトｔ−ＰＡと比べて）“実質的にフィブリン結合性（親和性）を保持 している”という表現および本明細書中で用いているその文法的変型は、変異ｔ −ＰＡ分子のフィブリン結合親和性（見かけのに、値）が、同様のアッセイで測 定される野生型ヒトｔ−ＰＡに対するフィブリン結合親和性（Ｋｄ値）の約２倍 以内であることを意味している。“実質的に向上したフィブリン結合性”という 表現は、追加の変異や変異の組を含有することによってもたらされるｔ−ＰＡ変 異体におけるフィブリン結合親和性（見かけのに４値）の約４倍以上の増加を指 している。野生型ｔ−ＰＡと比較して“向上したｉｎ　ｖｉｖｏフィブリン溶解 力”という用語は、野生型ｔ−ｐへの場合の約３分の１もしくはそれよりも少な い投与量のｔ−ｐΔ変異体を投与することにより、匹敵するｉｎ　ｖｉｖｏ凝血 溶解が達成されることを指している。

“クリアランス速度”および“クリアランス”という用語は、ｔ−ＰＡ分子が血 流から除去される速度を指している。クリアランス（速度）は天然のｔ−ＰＡに 関して測定され、そしてそのクリアランス（速度）の減少によってそのｔ−ｐＡ 変異体が天然のｔ−ＰＡより遅（除去されることが示され、クリアランス（速度 ）の増加によってｔ−ＰＡ変異体が天然のｔ−ＰＡより速く除去されることが示 される。

“フィブリン特異性”という表現は、野生型ヒトｒｔ−ＰＡに比べて、５−２２ ５１アツセイでフィブリノーゲン依存性比活性に対するフィブリン依存性比活性 の比が高い変異体の活性を指しており、比は少なくとも１．５であることが好ま しい。

“血漿凝血特異性”という表現は、野生型ヒトｒｔ−ＰＡに比べてＳ−２２５１ アツセイで血漿依存性比活性に対する凝血依存性比活性の比が高い変異体の活性 を指しており、比は少なくとも１．５であることが好ましい。

“チモーゲン“、”チモーゲンの”および“チモーゲン活性”という用語は、１ ９９０年４月２２日公開のＷＯ９０１０２７９８中の定義に従って本明細書では 用いられている。この定義によれば、酵素活性全体の欠如は必要条件ではない。

“野生型ヒトｔ−ＰＡの１１７番目のアミノ酸位置で機能的な炭水化物構造を欠 いた”という表現は、１１７番目のアミノ酸残基で炭水化物が完全に除去されて いることを意味しており、そこではグリコジル化シグナルが、以下に記載してい る部位特異的突然変異誘発によって破壊されているか、もしくは例えばＡｓｎ１ １７に結合する無傷のＮ−アセチルグルコサミン残基を遊離させることのできる エンドグリコシダーゼの処理などによる実質的な除去によって破壊されている。

“アミノ酸”および“アミノ酸群”という用語は、天然に存在するすべてのし一 α−アミノ酸を指している。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、およびヘ モンステインを含んでいることを意味する。アミノ酸は、−文字、三文字のいず れかによって確定される Ａｓｐ　Ｄ　アスパラギン酸　１１ｅ　Ｉ　イソロイシンＴｈｒ　Ｔ　スレオニ ン　Ｌｅｕ　Ｌ　ロイシンＳｅｒ　Ｓ　セリン　Ｔｙｒ　Ｙ　チロシンＧｌｕ　 Ｅ　グルタミン酸　Ｐｈｅ　Ｆ　フェニルアラニンＰｒｏ　Ｐ　プロリン　Ｈｊ ｓ＋１　ヒスチジンｃｒｙ　Ｇ　グリシン　Ｌｙｓ　Ｋ　リジンＡｌａ　Ａ　ア ラニン　Ａｒｇ　ＲアルギニンＣｙｓ　Ｃシスティン　ＴｒｐＷ　トリプトファ ンＶａｌ　Ｖ　バリン　Ｇｉｎ　Ｑ　グルタミンＭｅｔＭ　メチオニン　Ａｓｎ 　Ｎ　アスパラギンこれらのアミノ酸は、化学的組成とその側鎖の特性に従って 分類することができる。それらは、２つのグループ、すなわち電荷のあるものと 電荷のないものに大きく分類される。これらのグループはそれぞれ、さらに正確 にアミノ酸を分類するサブグループに分けられる： “変更”、“アミノ酸配列の変更”、“変異体”および“アミノ酸配列の変異体 ”という用語は、天然のｔ−ＰＡと比べてアミノ酸配列にいくつかの違いがある ｔ−ＰＡ分子を指している。通常、その変異体は、その構造内に保持している天 然ｔ−ＰＡのドメインと少なくとも８０％の相同性を有しており、そのようなド メインと少な（とも約９０％の相同性を有するものが好ましい。本発明の範囲内 に包含されるｔ−ＰＡのグリコジル化変異体はまた、ｔ−ＰＡのグリコジル化パ ターンに特定の変化を生じさせるものに加え、置換、欠失、および／または挿入 も含むことができる。

置換ｔ−ＰＡ変異体とは、天然のｔ−ＰＡ配列において少な（とも１つのアミノ 酸残基が除去され、同じ位置のその場所に異なったアミノ酸が挿入されているも のである。その置換が単一であれば、そこでは分子内のただ１つのアミノ酸だけ が置換されており、またその置換が多数であれば、２つもしくはそれ以上のアミ ノ酸が同一の分子内で置換されている。

ｔ−ＰＡ分子の活性の実質的な変化は、電荷および／または構造が天然アミノ酸 と有意に異なった側鎖をもったアミノ酸に置換することによって得ることができ る。この型の置換は、その置換領域内でポリペプチド骨格の構造および／または 分子の電荷や疎水性に影響を与えることが期待できるだろう。

ｔ−ＰＡ分子活性の中位の変化は、天然の分子と電荷および／または構造が類似 している側鎖をもつアミノ酸に置換することによって期待できるだろう。この型 の置換は保存的置換と呼ばれるが、その置換領域内でポリペプチド骨格の構造ま たは分子の電荷や疎水性を実質的に変化させることは期待できないだろう。

挿入ｔ−ＰＡ−異体とは、天然ｔ−ＰＡ−子の特定の位置のアミノ酸にすぐ隣接 して１つもしくはそれ以上のアミノ酸が挿入されているものである。アミノ酸に すぐ隣接するとは、そのアミノ酸のα−カルボキシルもしくはα−アミノ官能基 のどちらかに結合していることを意味している。その挿入は１つもしくはそれ以 上のアミノ酸でよい。通常、その挿入は１つもしくは２つの保存的アミノ酸から 構成される。挿入部位に隣接するアミノ酸と電荷および／または構造が類似する アミノ酸は、保存的であると定義される。また、本発明は、挿入部位に隣接する アミノ酸と実質的に異なる電荷もしくは構造をもったアミノ酸の挿入も包含する 。

欠失変異体とは、天然Ｌ−ＰＡ−子中の１つもしくはそれ以上のアミノ酸が除去 されているものである。通常、欠失変異体は、ｔ−ＰＡ分子の特定の領域で１つ もしくは２つのアミノ酸が欠失している。

本明細書を通じてｔ−ＰＡのアミノ酸配列変異体を表すために用いている表記法 を以下に説明する。ｔ−ＰＡのポリペプチド鎖中の特定のアミノ酸の位置は番号 によって同定される。その番号は、１９８８年８月２３日発行の米国特許番号４ ．７６６．０７５で示されているように、成熟した野生型のヒトｔ−ＰＡポリペ プチドのアミノ酸配列中のアミノ酸の位置を指している。本明細書では、実際の 残基番号はその分子内の欠失や挿入のためにそのように番号付けされないが、ｔ −ｐΔ変異体の同様に位置決定される残基は、これらの番号によって示されてい る。これは、例えば部位特異的欠失または挿入変異体に関して起こる。そのアミ ノ酸は一文字記号を用いて同定する。置換したアミノ酸は、そのアミノ酸のポリ ペプチド鎖中の位置を示す番号の左側に野生型アミノ酸を示し、そしてその番号 の右側に置換されたアミノ酸を示すことによって命名される。

例えば、野生型ヒトｔ−ＰＡ分子の１０３番目のアミノ酸の位置でアミノ酸のス レオニン（Ｔ）をアスパラギン（Ｎ）に置換すると、Ｔ１０３ＮＬ−ＰＡという 名前のＬ−ＰＡ変異体が生じる。同様に、野生型ヒトｔ−ＰＡ分子の１１７番目 のアミノ酸の位置のアスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）で追加的に置換する ことによって得られるｔ−ＰＡ変異体は、Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑｔ−ＰＡと命 名される。

欠失変異体は、包括的な欠失の両端のアミノ酸残基及び位置を示し、そして示さ れたアミノ酸の左側にギリシャ文字のデルタ“Δ“を付けることによって確定す る。例えば、２９６−２９９のアミノ酸の欠失を含んだｔ−ＰＡ変異体は、Δに ２９６−Ｒ２９７−Ｒ２９８−Ｒ２９９ｔ−ＰＡと示される（ここにに、Ｈおよ びＲはそれぞれアミノ酸のリジン、ヒスチジンおよびアルギニンである）。

ただ１つのアミノ酸、例えばに２９６の欠失は、Δに２９６と示される。挿入ｔ −ＰＡ−異体は、挿入するアミノ酸の回りに角型括弧“［］”を用いることによ り命名され、その挿入の位置は挿入の両側のアミノ酸の位置を示すことによつて 表す。例えば、９４番目の位置のグルタミン酸と９５番目の位置のアスパラギン 酸の間にアミノ酸のアラニン（Ａ）を挿入すると、Ｒ９４［Ａ］　Ｄ９５と示さ れる。読みやすくするために、単一の分子内に存在する多数の変異を分けるのに コンマ“、”を用い、複数のｔ−ｐΔ変異体分子を同時に列挙する場合に、個々 のｔ−ＰＡ変異体分子を分けるためにセミコロン″：２を用いている。

“ＤＮＡ配列のコード”、“ＤＮＡのコード“および′核酸のコード”という用 語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの配列または順 序を指している。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド鎖 に沿うアミノ酸の順序を決定する。ＤＮＡ配列は、このようにアミノ酸配列をコ ードしている。

“複製可能な発現ベクター”および“発現ベクター”という用語は、通常は二本 鎖で、その中に外来のＤＮＡ断片が挿入されていてもよいＤＮＡ断片を指してい る。外来ＤＮＡは異種ＤＮＡとして定義され、それは宿主細胞中に天然には見い だされないＤＮＡである。このようなベクターは、適当な宿主細胞に外来または 異種のＤＮＡを輸送するために用いられる。いったん宿主細胞中に導入されると 、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製でき、ベクターおよびその挿 入された（外来）ＤＮＡのいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクター は外来ＤＮＡをポリペプチド鎖に翻訳することを可能にする必須要素を含んでい る。外来ＤＮＡにコードされる多くのポリペプチド分子は、このように素早く合 成することができる。

核酸は、他の核酸配列と機能的な関係のある位置で配置されれば、“作動可能に 結合されている′。例えば、プレ配列や分泌リーダーのためのＤＮＡは、もしそ のポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリ ペプチドをコードするＤＮＡと作動可能に結合されている；プロモーターやエン ハンサ−は、もしその配列の転写に影響を与えるなら、コードしている配列と作 動可能に結合している】またはりポゾーム結合部位は、もし翻訳を促進するよう に位置しているなら、コードしている配列と作動可能に結合している。一般に、 ”作動可能に結合”とは、結合されるＤＮＡ配列が隣接していることを意味し、 分泌リーダーの場合は、隣接しており解読相内にあることを意味している。しか し、エンハンサ−は隣接している必要はない。結合は都合のよい制限部位での連 結（ライゲーション）によって行われる。もしそのような部位が存在しなければ 、合成オリゴヌクレオチドのアダプターかりンカーを通常のプラクティスに従っ て用いる。

本発明に関連して、“細胞”、“細胞株”および“細胞培養”という表現は、相 互交換して用いられており、そのような呼び名はすべて、後世代の細胞を含んで いる。

゛形質転換した（宿主）細胞”、“形質転換体”および゛形質転換した“という 用語は、ＤＮＡを細胞に導入することを指している。その細胞は“宿主細胞”と 呼ばれる。細胞に導入するＤＮＡは通常、挿入されるＤＮＡ断片を含んだベクタ ーの形をしている。細胞に導入するＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種由来であっ ても宿主細胞とは異なった種由来であってもよく、またはある外来ＤＮＡとある 同種のＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であってももよい。形質転換体およ び形質転換した細胞という言葉は、転換の数にかかわらず、最初に形質転換を受 けた細胞およびそれから誘導される培養細胞を含んでいる。あらゆる後世代の細 胞は、必然的もしくは偶然の変異のためにＤＮＡの内容において正確には同一で ない可能性があることもまた理解できる。最初に形質転換した細胞においてスク リーニングされるものと同じ機能や生物学的性質をもっている変異した後世代の 細胞も含まれる。

“プラスミド“は、英字の表示を後続する小文字のｐによって名付けられる。

本発明において用いた出発プラスミドは市販されているか、制限のない基礎にも とづいて公的にも利用可能であり、あるいは開示されている手順を用いてそのよ うに利用可能なプラスミドから組み立てることができる。さらに、他の同等なプ ラスミドも当業界にて既知であり、通常の熟練者にとっては明らかであろう。

ポリペプチドのグリコジル化は、典型的にはＮ−結合型かもしくは〇−−合型で ある。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物端の結合を指してい る。Ｘがプロリン以外のアミノ酸であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパ ラギン−Ｘ−スレオニンのトリペプチド配列は、炭水化物端がアスパラギン側鎖 に酵素的に結合するための認識配列である。〇−結結合型グリコモ化化、ヒドロ キシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンにＮ−アセチルガラクト サミン、ガラクトースまたはキンロースといった糖の１つが結合することを指す が、５−ヒドロキシプロリンや５−ヒドロキシリジンも〇−結結合型グリコモ化 化関与する場合がある。

哺乳類によって産生されるタンパク質のグリコジル化パターンは、血漿タンパク 質・構造、機能および遺伝的調節（Ｔｈｅ　Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： 　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃ。

−ヨーク、１９８４．特に２７１−３１５ページに詳細に記載されている。本章 では、配糖体として結合したオリゴ糖と同様に、複合、高マンノース、およびハ イブリッド構造と呼ばれている少な（とも３つのグループへの細分を含めて、ア スパラギン結合型オリゴ糖が議論されている。

酵母によって産生されるタンパク質のグリコジル化パターンは、タナ−およびレ ーレ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、［３ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、９０６　（１）、９１５ −９４４　（１９８７）に詳細に記載されている。

哺乳類細胞および酵母から産生されるタンパク質の典型的なＮ−結合型グリコジ ル化パターンが、１９８９年１１月３０日公開のＷｏ　８９／１１５３１の図１ で比較されている。

１３０ｗｅｓメラノーマ細胞から精製した天然ｔ−ＰＡ（メラノーマｔ−ＰＡ。

ｍｔ−ＰＡ）の炭水化物構造に関する予備的な研究は、Ａｓｎ１８４およびＡｓ ｎ４４８の位置の複合型オリゴ糖とともに、Ａｓｎ１１７の位置に高マンノース すべて炭水化物で置換されており、それに対して■型ｔ−ＰＡは１８４番目の位 置に結合した炭水化物をもっておらず、したがってこの位置は天然のｔ−ＰＡ分 子の約５０％においてグリコジル化されているだけである。１つの詳細な報告［ パレクら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８．７６４４−７６６２　（１９８９ ）］は、これらの割り当てを確証しており、さらにオリゴ糖の３０％が硫酸化さ れていることを見いだした。

トランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から精製 される組み換え野生型ｔ−ＰＡ　（ｒ　ｔ−ＰＡもしくはＡｃｔｉｖａｓｅｌＩ ｔ−をもつことが見いだされた：Ａｓｎ１１７の位置に高マンノースオリゴ糖、 Ａｓｎ１８４およびＡｓｎ４４８の位置に複合オリゴ糖が存在し、Ａｓｎ１８４ の部位はその分子の５０％においてグリコジル化されているだけであった。

本発明の変異体は、野生型ヒ）ｔ−ＰＡの１０３．１０４および１０５番目のい ずれかのアミノ酸の位置において、Ｎ−結合型もしくは〇−−合型を介してグリ コジル化される可能性のあるアミノ酸配列を少な（とも１つ含んでいなければな らない。

Ｎ−結合型のグリコジル化を企図するなら、変異体中のグリコジル化部位は、式 ：アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここに、ア クセプターとしてのアスパラギンおよびＸは、グリコジル化を阻害することが知 られているプロリンを除（２０種の遺伝的にコードされたアミノ酸のどれでもり 、１９７３．１−１５ページを参照されたい。本発明におけるアミノ酸配列変異 体は、（表面のループをより太き（、そしてより露出するようにするために１０ ３番目の位置の後にアスパラギン−Ｘ−セリン／スレオニンを加えるなどして） グリコジル化をもたらす目的で適切な部位（複数の場合もある）に適当なアミノ 酸（複数の場合もある）を挿入することによって、またはグリコジル化をもたら す目的で適当なアミノ酸で適当な部位のアミノ酸（複数の場合もある）を置換す ることによって改変されている。

〇−−合型のグリコノル化を採用するなら、０−グリコシド結合は、動物細胞に おいて、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースと数種の ヒドロキシアミノ酸のうちの１つとの間で生じ、最も一般的にはセリンかスレオ ニンであるが、分子内の適当な領域に位置している５−ヒドロキシプロリンもし くは５−ヒドロキシリジン残基の場合もある。

ひとつの好ましい具体例において、Ｎ−結合型のグリコジル化部位を野生型ヒト ｔ−ＰＡの１０３−１０５番目のアミノ酸の位置に加える。〇−結結合型グリコ ン化化は、これらの領域中の１つまたはそれ以上のアミノ酸を、セリン、スレオ ニンまたは５−ヒドロキシリジン残基に置換するか、またはそれを付加する。

そのようなｔ−ＰＡ変異体は、Ｗｏ　８９／１１５３１．前掲に開示されている 。

本発明のｔ−ＰＡ変異体は、さらに、１１７番目のアミノ酸残基で機能的な炭水 化物構造を欠いているという点で特徴的である。好ましい具体例では、天然のｔ −ＰＡ分子ではグリコジル化されている他のすべてのアミノ酸位置で機能的な炭 水化物構造が保持されている。そのような１１７番目の位置での機能的な炭水化 物構造の選択的除去は、野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１１７−１１９番目 の位置にあるＡｓｎ−８ｅｒ−３ｅｒグリコリル化シグナル内の、少なくとも１ つの残基をアミノ酸置換することによって行うことが好ましい。特に好ましい変 異体は、１１７番目のアミノ酸の位置にあるアスパラギン（Ｎ）が、他のアミノ 酸と置換しており、好ましい置換分はグルタミン（Ｑ）である（例として、ＥＰ 　２３８．３０４．前掲およびＷｏ　８９１０４３６８を参照されたい）。

本発明の好ましい変異体は、天然のヒトｔ−ＰＡの１０７番目の位置のアラニン をセリンに置換すると共に、１０３番目の位置のスレオニンもしくは１０５番目 の位置のセリンがアスパラギンに置換しており、１１７番目の位置のアスパラギ ン（Ｎ）が池のアミノ酸、好ましい置換分のグルタミン（Ｑ）に置換している。

本発明中のプラスミノーゲン活性化因子は、天然ｔ−ＰＡのグリコジル化パター ンにおける前述の変更に加えて、その分子のある種の特性を向上するために、天 然のｔ−ＰＡ配列の他の領域中の残基を置換、欠失もしくは挿入することも随意 に含むことができる。そのような変更は当業界にて周知である。プラスミノーゲ ン活性化因子およびその第二世代の誘導体の一般的概観は、ハリス、Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、↓：　４４９−４５８　（１９８７）およびり −ネン、　Ｈ，Ｒ，およびコレン、Ｄ、、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓ　ｔ、６ ６　（１）８８−１１０　（１９９１）に見いだすことができる。ｔ−ＰＡ変異 体の池の概観としては、バネコークら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、２：１２３ −１３２　（１９８８）、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉ ｎａｌ　Ｃｂｃト、１９９０前掲がある。

例えば、クリアランス速度および／または半減期をさらに向上するための方法は 、本発明のｔ−ＰＡ変異体からフィンガーおよび／または成長因子ドメインの一 部もしくは全部を除去することである。およびもしくはさらに、本発明の１−Ｐ Ａ変異体は、２７５番目および２７６番目のアミノ酸の位置でまたはその周辺で タンパク分解切断に抵抗性を示すものがあり、および／またはｔ−ＰＡのクリン グル２ドメインの推定リジン結合部位内にアミノ酸変更を有している。

より遅い血漿クリアランスに加え、野生型ｔ−ＰＡよりもフィブリン特異性が良 好なｔ−ＰＡ変異体を提供することが特に望ましいと考えられた。そのようなｔ −ＰＡ変異体は、変更を行っていないｔ−ＰＡよりもフィブリン凝血部位でより 優先的に働くだろうし、それゆえ循環プラスミノーゲンの活性化に付随する副作 用が減少され、例えば出血性の合併症の重症度を低減し、頻度を減少させること が期待できる。

本発明のｔ−ＰＡ変異体のフィブリン特異性は、当業者に既知の追加的な変更に よって向上することができる。

フィブリン特異性を向上させるために、本発明のｔ−ＰＡ変異体は、例えばセリ ンプロテアーゼドメインの２９６−３０２番目のアミノ酸位置で、好ましくは２ ９６−２９９番目のアミノ酸の位置でさらに変異を加えることができる。好まし い変異体においては、野生型ｔ−ＰＡの２９６−２９９番目の位置のリジン（Ｋ ）、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、アルギニン（Ｒ）の各アミノ酸をア ラニンに置換する。さらに好ましい変異体においては、２９８および２９９番目 の位置のアルギニンを両方ともグルタミン酸に置換する。池の好ましい変異体に おいては、野生型ｔ−ＰＡの２９６．２９７および３０１番目のアミノ酸の位置 のリジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびプロリン（Ｐ）をさらにグルタミン （Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）およびセリン（Ｓ）にそれぞれ置換する。さらに好 ましい具体例においては、本発明のｔ−ＰＡ変異体のフィブリン特異性は、野生 型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の２７４．２７５．２７６および２７７番目のアミ ノ酸の位置のフェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（＋） およびリジン（Ｋ）を、ロイシン（Ｌ）、ヒスチジン（１−１）、セリン（Ｓ） およびスレオニン（Ｔ）のアミノ酸にそれぞれ置換することによって向上させる 。

後者の変更は、結果としてプラスミン切断部位を喪失させるので、その変異体は 実質上−木端型である。

さらに、本発明の分子は、チモーゲン特性を含む追加的な望ましい特性を与える ために、ある種の位置で置換を行ってもよいし、または欠失を含んでもよい。

ヒトｔ−ＰＡ中のこれらの位置は、例えば４１６−４１８番目の位置のリジン、 ヒスチジン、グルタミン酸をそれぞれアラニンに置換すること、および４２６． ４２７．４２９および４３０番目の位置のグルタミン酸、アルギニン、リジンお よびグルタミン酸をそれぞれアラニンに置換することを包含しており、これらは 、例えば１９９０年３月２２日公開のＷｏ　９０１０２７９８に記載されている 。

適当な多重の変異体の例は次の通りである：Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｚ　ｔ−ＰＡ ；５１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓ、Ｎ１１７Ｚ　ｔ−ＰＡ；Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｚ。

Ｋｌ−（ＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ　ｔ−ｒ’Ａ；５１０５Ｎ、Ａ１０７ Ｓ、Ｎ１１７Ｚ、ＫＩＩＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ　ｔ−ＰＡ：Ｔ１０３ Ｎ、Ｎ１１７Ｚ、Ｒ２９８Ｅ、Ｒ２９９Ｅ　ｔ−ｐＡ；５１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓ 、Ｎｉ１７Ｚ、Ｒ２９８Ｅ、Ｒ２９９Ｅ　ｔ−ＰＡ；Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｚ、 に２９６Ｑ、Ｈ２９７Ｎ、Ｐ３０１Ｓ　ｔ−ＰＡ；５１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓ、Ｎ １１７Ｚ。

Ｋ２９６Ｑ、Ｈ２９７Ｎ、Ｐ３０１Ｓ　ｔ−ＰＡ；Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｚ、Ｆ ＲＩＫ　（２７４−２７７）　ＬＩｉｓＴ　ｔ−ＰＡ；５１０５．Ａ１０７Ｓ、 Ｎｉ１７Ｚ、ＦＲＩＫ　（２７４−２７７）ＬＨ３Ｔ　Ｌ−ＰＡｏ、ニー、−で １！、Ｚはアスパラギン（Ｎ）を除く２０種の天然に存在するアミノ酸のどれで もよいことを示している。特に好ましいものは、１１７番目の位置のアスパラギ ン（Ｎ）がグルタミン（Ｑ）に置換しているｔ−ＰＡ変異体である。

天然のｔ−ＰＡ分子への余分のグリコジル化の付加および１１７番目のアミノ酸 残基での機能的な炭水化物構造の除去は、当業者に知られているいずれの方法に よっても成し遂げることができる。

タンパク質へのグリコシドの化学的および酵素的な結合は、例えばＣＲＣＣｒ１ ｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｐｐ、２５９−３０６　（１９８１）中にてアル フィンおよびリストンによって記載されているように、さまざまな活性基を用い て行うことができる。化学的な結合技術の利点は、その技術が比較的単純であり 、天然の〇−およびＮ−結合型グリコシル化にめられる複雑な酵素的機構を必要 としないということである。用いる結合方法によって、糖は、（ａ）アルギニン およびヒスチジン、（ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸におけるような遊 離のカルボキシル基、（Ｃ）システィンにおけるような遊離のスルフヒドリル基 、（ｄ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンにおけるような遊離の水 酸基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのような芳香族 残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合できる。これらの方法は、ＷＯ ８７１０５３３０（１９８７年９月１１日公開）中に記載されている。

天然ヒトｔ−ＰＡの１１７番目のアミノ酸の炭水化物構造は、例えばエンドグリ コンダーゼＨ（Ｅｎｄｏ−ＩＩ）のようなエンドグリコシダーゼを用いることに よって実質的に除去することができる。Ｅｎｄｏ−Ｈは、高マンノースおよびハ イブリッドオリゴ糖の（部分的な）除去が可能なだけである。したがって、Ｅｎ ｄｏ−Ｈは、適当な条件下、１８４および４４８番目のアミノ酸残基の位置の複 合構造に機能的な影響を与えずに、天然ヒトＬ−ＰＡの１１７番目のアミノ酸残 基（Ａｓｎ）の高マンノース炭水化物構造を（実質的に）除去することができる 。

！３．６１９１　（１９８４）の方法によって行われる。

本発明のｔ−ＰＡ変異体は、野生型ｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ配列を突然変異 し、適当な宿主細胞において変異ＤＮＡ配列を発現することによって構築するの が好ましい。

所望の配列変異を得るために天然の分子内の適当なアミノ酸（群）を変化または 挿入するという変更は、例えば部位特異的突然変異誘発や、以下に説明するよう な、関連タンパク質をコードするＤＮＡ中に適当な配列を結合するなど当業者に 既知の方法によって行われる。

例えば、サンプルーフら［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ −プレス、ニューヨーク（１９８９）］で記載されているような部位特異的突然 変異誘発を行うためには、当業者に知られているいかなる手法を用いてもよいが 、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発が本発明のＬ−ＰＡ変異体を調製する ための好ましい方法である。当業界で周知のこの方法［アデルマンら、ＤＮＡ。

７・１８３　（１９８３）、サンプルーフら、前掲〕は、置換変異体を作成する のに特に適しており、それはまた欠失および挿入変異体を簡便に調製するために 用いてもよい。

オリゴヌクレオチドは、フレアら（１’ｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃｌ。

ｔＪｓＡ、７５　：　５７６５　［１９８７］　）に記載されているような当業 界にて周知の手法を用いて容易に合成される。

１つ以上のアミノ酸が置換している変異体は、数種の方法のうちの１つによって 作成することができる。アミノ酸同士がポリペプチド鎖中の近（に位置している ならば、目的のアミノ酸置換のすべてをコードする１つのオリゴヌクレオチドを 用いて同時に変異を起こすのがよい。しかし、アミノ酸同士が互いに少し離れて 位置している（例えば１０アミノ酸以上離れている）ならば、目的の変異のすべ てをフードする１本のオリゴヌクレオチドを作成することはより困難である。

その代わり、２つの二汁択−的方法のうち１つを採用してもよい。第一の方法で は、置換されるべき各アミノ酸に対して別個のオリゴヌクレオチドを作成すると いうものである。それらのオリゴヌクレオチドを同時に１本鎖の鋳型ＤＮＡにア ニーリングすると、その鋳型から合成される第二のＤＮＡ鎖は、目的のアミノ酸 置換のすべてをコードするだろう。他の方法は、目的の変異体を作成するために ２つもしくはそれ以上の突然変異誘発を行う。

例えば本発明に従って新しいグリコジル化部位を導入するなどの、野生型ｔ−Ｐ Ａもしくは変異分子をコードするＤＮＡ配列に変異を作成するための当業者に既 知の池の方法は、出発ｔ−ＰＡ分子をコードするＤＮＡ配列を制限酵素消化によ って適当な位置で切断し、適当に切断したＤＮＡを回収し、グリコジル化のため の目的のアミノ酸配列および平滑末端をもワたポリリンカーのようなフランキン グ領域（もしくは、ポリリンカーの代わりに、Ｌ−ＰＡをコードしているＤＮＡ を切断するのにも用いられる制限酵素で合成オリゴヌクレオチドを切断し、それ によって付着末端を作り出す）をコードしているオリゴヌクレオチドを合成し、 そして残りのｔ−ＰＡをコードしている構造遺伝子中にその合成りＮＡを結合す ることからなっている。

例えば１９８７年７月２８日発行の米国特許番号４，６８３，１９５およびＣｕ ｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ 、オースベルら２編、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔ ｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−１ｎＬｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第２巻、第１５章。

１９９１中に記載されているＰＣＲ突然変異誘発もまた、本発明のｔ−ｐへ変異 体を作成するのに適している。

本発明のｔ−ＰＡ変異体をコードするｃＤＮΔは、さらなるクローニングや発現 のために複製可能なベクターに挿入する。

適したベクターは、標準的な組み換えＤＮＡの手順を用いて調製される。単離し たプラスミドおよびＤＮＡ断片は切断し、必要に合わせて調整し、目的のベクタ ーを作り出すために特定の順序で一緒に連結する。

連結の後、挿入された外来遺伝子をもつベクターを、適した宿主細胞中に形賀転 換する。形質転換した細胞は、一般的にはテトラサイクリン（Ｌｅｔ）やアンピ シリン（ａｍｐ）などの抗生物質上での生育によって選択するが、これはベクタ ー上にＬｅｔおよび／またはａｍｐ耐性遺伝子が存在することでこの抗生物質に 対する耐性が付与されることによっている。連結混合物を真核生物の宿主細胞に 形質転換したなら、形質転換細胞はＤＨＦＲ／ＭＴＸシステムによって選択する ことかできる。形質転換細胞は培養中で生育し、次いでプラスミドＤＮＡ　（プ ラスミドとは、関心のある外来遺伝子とつながれているベクターを指している） を単離する。次に、プラスミドＤＮＡは制限マツピングおよび／またはＤＮＡ配 列決定によって分析する。ＤＮＡの配列決定は一般的にメンングら、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、９：３０９（１９８１）の方法またはマキサムら。

Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＶ、６５：４９９（１９８０）の方法 のどちらかによって行う。

原核生物は、本発明の最初のクローニング工程に用いる宿主細胞として好ましい 。それらは、大量のＤＮＡを迅速に生産するために、また部位特異的突然変異誘 発に用いる１本鎖ＤＮＡの鋳型を生産するために、また多（の変異体を同時に選 択するために、そして生成した変異体のＤＮＡ配列決定をするために、特に有± １　Ｂがある：しかし、ｌｌＢ１０１、ＪＭｌｏｌ、ＳＶ５２２、ＳＶ５３８、 ＳＶ５３９などの多くの他のＥ、ｃｏｌｉの株および原核細胞の多（の他の種と 属もまた用いてもよい。当然ながら、これらは制限的なものではな（、例示を意 図するものである。

宿主細胞と適合する種由来のレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクタ ーをその宿主とともに用いる。ベクターは通常、複製起点、形質転換細胞にて表 現型の選択を可能にするマーカー遺伝子、１つまたはそれ以上のプロモーター、 および外来ＤＮＡの挿入のための幾つかの制限酵素部位を含むポリリンカー領域 をもっている。Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換に用いられるプラスミドは一般的には、 ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９、ｐＵｃ１１８、ｐＵｃ１１９およびブ ルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｍ１３などであり、それらはすべて、 サンプルーフら、前掲の１．１２−１．２０セクシヨンに記載されている。しか し、多くの他の適したベクターもまた利用可能である。これらのベクターは、ア ンピシリンおよび／またはテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を含んでお り、この耐性のために、これらのベクターで形質転換された細胞がこれらの抗生 物質存在下でも生育できるようになる。

原核細胞のベクターで最も一般的に用いられるプロモーターは、β−ラクタマ７ ９］）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（ゴーデルら。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、８：４０５７　［１９８０］　；ＥＰＯＡｐ ｐｌ、Ｐｕｂｌ、Ｎｏ、３６．７７６）、およびアルカリホスファターゼシステ ムなどである。これらが最も一般に使用されているが、池の微生物プロモーター も利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されており、 当業者がそれらをプラスミドベクターに機能的に連結するのを可能にしている（ シーベンリストら、Ｃｅｌ　１．２０：２６９　［１９８０］参照）。

本発明のｔ−ＰＡ変異体の発現のために、真核細胞微生物（酵母）などの真核細 胞宿主および多細胞生物（哺乳類細胞培養）を使用する。

ら、前掲）：に、ｗａｌｔｉｉ　（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ、ｄｒｏｓｏｐ ｈ０７０；スリークリスナら、Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２８： ２の多くの池の属、種および株が本発明に一般に利用可能であり有用である。

酵母ベクターに適するプロモーター活性のある配列は、３−ホスホグリセリン酸 キナーゼ（ヒッツェマンら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、λ５５　：　２０７３ 　［１９８０１）もしくはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒド ロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ 、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピ ルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラ ーゼおプラスミドを構築するには、これらの遺伝子と関係する終結配列もまた、 ｍＲＮＡのポリアデニル化と終結をもたらすように発現する目的の、発現ベクタ ー内の配列の３°側に連結する。生育条件によって転写が制御されるという追加 的な利点をもつ他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロー ムＣ１酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前述のグリセル アルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、およびマルトースとガラクトースの利用に 関係する酵素に対するプロモーター領域である。酵母と適合するプロモーター、 複製起点および終結配列を含むあらゆるプラスミドベクターが適している。

多細胞生物由来の細胞培養は、本発明を実施するための宿主として利用すること ができる。無を推動物およびを推動物の細胞培養の両方が許容されるが、を推動 物の細胞培養、特に哺乳類の培養が好ましい。適した細胞株の例は、ＳＶ４０に よって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ系列（ＣＯ３−７，ＡＴＣＣＣＲＬＣＣＬ 　１０）：チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ）１０）細胞（ローラブおよび７０ ）、アフリカミトリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７ ）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　２）；イヌ腎臓細胞（Ｍ ＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ　３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ　３Ａ 、ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８．ＡＴＣＣＣＣＬ　７５ ）：ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ　Ｇ２．Ｉ−ＩＢ　８０６５）；７ウス乳癌細胞（Ｍ ＭＴ　０６０５６２．ＡＴＣＣＣＣＬ　５１）；ラット肝癌細胞（Ｈターは通常 、複製起点、発現される遺伝子の前に位置するプロモーター、リボゾーム結合部 位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結部位を（もし必 要であるなら）含んでいる。

哺乳類の発現ベクターで用いられるプロモーターは、しばしばウィルス由来であ る。これらのウィルスプロモーターは一般的にはポリオーマウィルス、アデノウ ィルス２および最も頻繁にはシミアンウィルス（Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕａ）４ ０　（ＳＶ４０）である。ＳＶ４０ウィルスは、初期プロモーターおよび後期プ ロモーターと呼ばれる２つのプロモーターを含んでいる。これらのプロモーター は両方とも、ウィルスの複製起点も含んでいる１つのＤＮＡ断片としてウィルス から容易に得られるので、特に有用である（フィアースら、Ｎａｔｕｒｅ、２７ ３：１１３　［１９７８］）、より小さいかもしくはより大きい５ｖ４０のＤＮ Ａ断片もまた、ウィルスの復製起点中に位置するｌｌｔｎｄｌ部位から且（±１ 部位までをまたぐ約２５０−ｂｐ配列を含んでいるならば、使用することができ る。

または、外来遺伝子と自然に関連するプロモーター（同種のプロモーター）は、 もしそれが形質転換のために選択した宿主細胞系列と適合するなら、使用しても よい。

複製起点は、ＳＶ４０や他のウィルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ。

ＢＰＶ）のような外来の供給源から得て、クローニングベクター内に挿入しても よい。または、復製起点は、宿主細胞の染色体複製機構によって供給されてもよ い。もし外来遺伝子を含んでいるベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれるな ら、後者の方法で十分となる場合が多い。

形質転換した細胞培養から満足のいく量のヒトｔ−ＰＡが産生される。しかし、 二次的なりＮＡコード化配列を使用すると、生産レベルを上昇させることができ る。二次的なコード化配列は、一般にジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）酵 素を含んでいる。野生型のＤＨＦＲは普通、化学的なメトトレキセート（ＭＴＸ ）によって阻害される。細胞におけるＤＨＦＲ発現レベルは、培養している宿主 細胞に添加するＭＴＸの量によって変動する。二次的な配列として特に有用なも のにしているＤＨＦＲのさらなる特徴は、形質転換した細胞を同定するための選 択マーカーとしてＤＨＦＲが利用できることである。

ＤＩＩＦＨの２つの型、つまり野生型ＤＨＦＲおよびＭＴＸ耐性Ｄ　ＨＦ　Ｒは 、二次的な配列として利用可能である。特定の宿主細胞で用いられるＤＨＦＲの 型は、宿主細胞がＤＨＦＲ欠損であるかどうか（宿主細胞が、内因性に非常に低 いレベルのＤ　ＨＦ　Ｒを産生ずるか、もしくは機能的なり　ＨＦ　Ｒを全く産 生じないかということ）に依存している。ウーラブおよびチャシン（Ｐｒｏｃ、 　Ｎａ　ｔ　１．　八Ｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、（ＵＳＡ）ヱ７　：　４２１６　［１ ９８０］　）によりて記載されているＣＨＯ細胞株のようなり　ＨＦ　Ｒ欠損細 胞株を、野生型ＤｔｌＦＲをコードする配列で形質転換する。形質転換の後では 、これらのＤＨＦＲ欠損細胞系列は機能的なりＨＦＲを発現し、栄養源であるヒ ポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培養培地中で生育することができ る。形質転換していない細胞は、この培地では生存できないだろう。

ＭＴＸ耐性の型のＤＨＦＲは、ＭＴＸ感受性の通常量の機能的ＤＨＦＲを内生的 に産生ずるこれらの宿主細胞中で、形質転換した宿主細胞を選択するための手段 として使用することができる。Ｃｌｌ０−Ｋｌ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＬ　６１ ）はこれらの特徴を備えており、したがってこの目的にとって有用な細胞株であ る。

細胞培養の培地にＭＴＸを添加すると、ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲをコードしているＤ ＮＡによって形質転換された細胞だけが生育することができるだろう。形質転換 していない細胞は、この培地では生存できない。

本発明の変異体を作るために用いられる哺乳類の宿主細胞は、種々の培地で培養 することができる。Ｉｌａｍ’ｓ　ＦＩＯ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）　、最少必須培地 （［ＭＥＭ］　、Ｓｉｇｍａ）　、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）　、ダル ベツコ改変イーグル培地（［ＤＭＥＭ］　、Ｓ　ｉ　ｇｍａ）などの市販されて いる培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、ハムおよびウェルス （Ｍｅ　ｔ　ｈ、Ｅｎ　ｚ、　。

５８　：　４４　［１９７９］　）、バーンズおよびサトウ（Ａｎａ　１．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、。

↓旦ｌ・２５５　［１９８０］　）　、米国特許番号　４，７６７．７０４；４ ．６５７．８６６；４，９２７，７６２；又は４，５６０．６５５；ＷＯ９０１ ０３４３０；Ｗｏ　８７１００１９５；米国特許　Ｒｅ、３０．９８５；に記載 されている培地はどれでも、宿主細胞の培養培地として使用することができる。

これらの培地のどれでも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子 （インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリ ウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳな ど）、ヌクレオノド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイ シンなど）、微量元素（通常、最終濃度がマイクロモル濃度の範囲で存在する無 機化合物と定義される）、およびグルコースまたは等価のエネルギー源を添加し てもよい。池のいかなる必要な添加物も、当業者に既知であるような適当な濃度 で含有させればよい。

細胞から普通に分泌される多く真核生物タンパク質は、アミノ酸配列の一部とし て内因性のシグナル配列を含んでいる。この配列は、小胞体およびゴルジ体を経 由してタンパク質を細胞から輸送することを目的としている。シグナル配列は、 一般にタンパク質のアミノ末端に位置しており、長さは約１３から約３６アミノ 酸にわたっている。実際の配列はタンパク質によって異なっているけれども、既 知の真核生物のシグナル配列のすべては、シグナル配列の中心付近に少な（とも １つの正の電荷をもつ残基と１０−１５アミノ酸の高い疎水性領域（通常はアミ ノ酸のロイノン、イソロイシン、アラニン、バリンおよびフェニルアラニンに富 んでいる）を含んでいる。シグナル配列は、小胞体中にタンパク質が転位するあ いだに小胞体に位置する／グナルペブチダーゼによって分解されるので、普通は タンパク質の分泌型には存在しない。シグナル配列がなお結合しているタンパク 質は、「プレタンパク質」またはタンパク質の未成熟型としばしば呼ばれる。

しかし、分泌タンパク質のすべてが、切断されるアミノ末端シグナル配列を有し ているという訳ではない。オボアルブミンなどのいくつかのタンパク質のシグナ ル配列はタンパク質の中央領域に位置している。この配列は、転位のあいだに切 断されないのが普通である。

細胞質中に通常見いだされるタンパク質は、シグナル配列をタンパク質へ結合す ることにより分泌が可能になる。これは、タンパク質をコードしているＤＮＡの ５°末に／グナル配列をコードしているＤＮＡを連結し、それから適当な宿主に おいてこの融合タンパク質を発現させることによって、容易に成し遂げられる。

シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列をもっているタンパク質をコ ードするいかなる遺伝子からも制限断片として得ることができる。このように、 原核生物、酵母および真核生物のシグナル配列は、本発明を実施するために利用 する宿主細胞の型に応じて、本発明にて用いることができる。遺伝子のシグナル 配列の部分をコードするＤＮＡは、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて切断 し、次いで分泌されるべきタンパク質すなわちｔ−ＰＡをコードするＤＮＡに結 合する。

機能的なシグナル配列の選択に当たっては、シグナル配列の切断およびタンパク 質の分泌が起こるように、そのシグナル配列が宿主細胞のシグナルペプチダーゼ によって認識されることが必要である。例えば、ヒト成長ホルモン、プロインス リンおよびプロアルブミンなどのいくつかの真核生物遺伝子のシグナル配列部分 をコードするＤＮＡおよびアミノ酸配列が知られており（ストライヤー、Ｂｌｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ニー ｘ−ヨーク［１９８８］　、ｐ、７６９参照）、それらは適当な真核生物の宿主 細胞にてシグナル配列として使用できる。酵母のシグナル配列は、例えば酸ホス ファターゼ（アリマら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１１：１６５７［１９ ８３］）。

アルファーファクター、アルカリホスファターゼおよびインベルターゼのように 、酵母宿主細胞からの直接的な分泌に用いることができる。他の遺伝子と同様に 、例えばＬａｍＢまたはＯｍｐＦ（ワンら、Ｇｅｎｅ　旦８　：１９３　［１９ ８８］）、Ｍａ　ＩＥ、ＰｈｏＡ、またはβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子 由来の原核生物シグナル配列は、原核細胞由来のタンパク質をから培養培地中に 分泌させるために使用できる。

関心のあるタンパク質にシグナル配列を与え、それが分泌できるようにするため の池の技術は、シグナル配列をコードするＤＮＡを化学的に合成することである 。この方法においては、選択されたシグナル配列をコードするオリゴヌクレオチ ドの両方の鎖を化学的に合成し、それから２本鎖を形成するために互いにアニー リングする。次いで、２本鎖のオリゴヌクレオチドを、タンパク質をコードする ＤＮＡの５゛末端に連結する。

次にシグナル配列が結合されたタンパク質をコードするＤＮＡを含む構築物を、 適当な発現ベクターに連結すればよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞に形 質転換し、関心のあるタンパク質を発現させ、分泌させる。

哺乳類の宿主細胞および堅固な細胞膜の障壁をもっていない他の宿主細胞は、も ともとグラハムおよびファンデル編ｆ■ｉ　ｒｏ　ｌｏｇｙ、５２　：　５４６ 　［１９７８］）によって記載され、サンプルーフら、前掲の１６．３２−１６ ．３７節に記載されているように改変されたリン酸カルシウム法を用いて通常は 形質転換ｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、ヱユ：　２１ ６３　［１９８０１）、エレクトロポＬ／−ンＢン法（ノイマンら、ＥＭＢＯＪ 、、１：８４１　［１９８２］）および核内への直接マイクロインジエクシ５ン 法（カペチ、Ｃｅ１ｌ、２２　：　４７９　［１９８０１）などのＤＮＡを細胞 内に導入する他の方法も使用してもよい。

酵母宿主細胞は、ヒネン（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、 　Ｕ、　Ｓ。

Ａ、、７５　：１９２９　［１９７８］　）によって記載されている、ポリエチ レングリコール法を用いて一般的には形質転換する。

原核生物の宿主細胞または堅固な細胞萱をもった池の宿主細胞は、サンプルーフ ら、前掲の１．８２節に記載されている塩化カルシウム法を用いて形質転換する のが好ましい。または、これらの細胞の形π転換にはエレクトロボレーレジン法 を用いてもよい。

ｔ−ＰＡ変異体は、分泌シグナルなしで直接発現したときに宿主細胞の溶解液か ら回収してもよいが、分泌タンパク質として培養培地から回収するのが好ましい 。その変異体をヒト起源の細胞以外の組み換え細胞で発現させた場合には、その 変異体はヒト起源のタンパク質を完全に含まない。しかし、タンパク質に関して 実質的に均質な調製物を得るには、組み換え細胞タンパク質から変異体を精製す る必要がある。最初の段階として、培養培地または細胞溶解液を遠心分離して粒 状の細胞破壊物の破片を除去する。

それから、変異体は、例えば免疫アフィニティもしくはイオン交換カラムでの分 取；エタノール沈殿、逆相ＴＩＰＬＣ；シリカもしくはＤＥＡＥのような陽イオ ン交換体上でのクロマトグラフィー；硫酸アンモニウム沈殿；またはゲル電気泳 動によって、混入している可溶性タンパク質がら精製する。フェニルメチルスル ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのｔ−ＰＡ活性を妨害しないプロテアーゼイ ンヒビターもまた、精製のあいだにタンパク質の分解を阻害するために用いても よく、抗生物質もまた外来の混入物の生育を抑えるために添加してもよい。当業 者であれば、天然ｔ−ＰＡに適する精製方法は、組み換え細胞培養での発現の際 にｔ−ＰＡもしくはその変異体の性質が変化することを考慮した変更が必要な場 合のあることは認識されよう。

好ましい具体例では、ｔ−ＰＡ変異体を分泌させ、集めた細胞培養液を透析濾過 し、そしてリジンアフィニティークロマトグラフィーによってｔ−ＰＡ変異体を 精製する。または、細胞培養の上演は、ＰＢＳで前もって平衡化しである抗ｔ− ＰＡヤギポリクローナルへ６抗体を結合したガラスピーズカラムに通してもよく 、続いて緩衝液でそのカラムを平衡化し、モしてｔ−ＰＡ変異体を溶出する。

本発明の化合物は、製薬的に有用な組成物を調製するための既知の方法にしたが って製剤化することができ、それによってｔ−ＰＡ産物は製薬的に許容し得る６ 版、１９８０．Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、中に記載されている。

これらの組成物は、患者への効果的投与に遇する製薬的に許容し得る組成物を調 製するための適量の担体とともに、例えば約０．５ｍｇ／ｍ＋から約５ｍｇ／ｍ １のオーダーに及ぶｔ−ＰＡの有効量を一般的に含む。ｔ−ＰＡ変異体は、心血 管疾患や病気に侵されている患者に非経口的にまたは効果的な形態で確実に血中 に運んでくれるような他の方法によって投与することができる。

本発明を実施するために用いられるｔ−ＰＡ変異体の臨床的投与にとって特に適 した組成物は、無菌の水溶液や凍結乾燥したタンパク質のような無菌の水和性粉 末を含んでいる。通常、適当量の製薬的に許容し得る塩もまた、製剤を等張にす るために、その製剤に使用される。リン酸と組み合わされているアルギニン塩基 などの緩衝液もまた、普通５．５から７．５の間の適切なｐＨを維持するのに適 当な濃度で一般的に含ませる。さらにもしくはまたは、グリセリンのような化合 物を貯蔵寿命の維持を助けるために製剤中に含めてもよい。

本発明の医薬組成物の投与量および望ましい薬物濃度は、特定の変異体と目的と する特定の用途に応じて変化してもよい。適当な投与量の決定は、特に野生型組 み換えヒトｔ−ＰＡの投与に関する広範な経験という観点で、医師の技術の範囲 内にゆだねられる。本発明のｔ−ＰＡ変異体では血漿半減期が延長しているため 、特にポーラス投与に適している。投与の好ましい様式によれば、本発明のｔ− ＰＡ変異体は、実質的にｔ−ＰＡクリアランス機構を飽和する最初静脈内ポーラ ス投与量で没与し、続いて、任意にさらなるポーラスおよび／または連続静脈内 投与を行う。野生型ｔ−ＰＡに匹敵する生物学的活性をもつ変異体の投与量の合 計は、約１００ｍｇであることが好ましい。さらに活性の高い変異体であれば、 より低濃度でも同様の効果を示す。フィブリン特異性が向上した変異体は、出血 性合併症の危険を有意に増加させることがなく、高投与量で投与することができ る。

一般的な規則として、投与量と投与速度は、他の心血管血栓溶解剤の臨床研究で 現在使用されている場合と等しいがもしくはより高く、例えば、心筋梗塞、肺塞 栓などに苦しむヒトの患者では、１．５から１２時間にわたる静脈内もしくは動 脈内投与量は約１−２ｍｇ／ｋｇ体重である。

例えば、深在静脈血栓症や末梢血管疾患の処置では、約１　ｏ５から約０．　２ ｍｇ／ｋｇのオーダーでの“ポーラス”投与を行い、次いで極カ一定の血中レベ ルを保つために投与する約０１から約０．２ｍｇ／ｋｇのオーダーの以後の投与 を行うことが一般的には好ましく、その血中レベルは約３μｇ／ｍｌのオーダー であることが好ましい。

適当な投与剤型の一例として、５０ｍｇのｔ−ＰＡ、アルギニン、リン酸および ポリソルベート８０を含むバイアルを５０ｍ１の注射用滅菌水で再構成し、適当 量の０９％塩化ナトリウム注射液を混和する。

本発明のｔ−ＰＡ変異体はまた、フィブリン沈着や癒着の形成および再形成を予 防するのに有効である。この用途のひとつの具体例は１９８９年１月４日公開の ＥＰＯ２９７，８６０に記載されている。一般にこの型の処置は、フィブリンも しくは癒着形成の可能性のある部位へある組成物を局所投与することがらなり、 その組成物は、約３日から２週間の期間をかけてその部位で持続的に放出するよ うな難溶性形態のｔ−ＰＡ変異体の治療的有効量を含んでいる。一般的に、ｔ− ＰＡ変異体は、手術、感染、外傷もしくは炎症後のフィブリン沈着や癒着の形成 を予防するに十分な用量で投与する。通常、この用量は、ゲルの０．０２ｍｇ／ ｇからゲルの２５ｍｇ／ｇであり、好ましいのはゲルの０．２０ｍｇ／ｇからゲ ルの約２．５ｍｇ／ｇであり、最も好ましいのは、ゲルの０．２５ｍｇ／ｇから ゲルの約１．０ｍｇ／ｇである。癒着の形成および／またはフィブリン沈着を予 防するために用いる個々のｔ−ＰΔ変異体は、癒着形成の可能性のある部位に酵 素を位置決めするための半固形で粘液性の製薬的に活性のない担体中で一般的に 製剤化される。その担体は、修飾された飽和および不飽和脂肪酸グリセリドの混 合物からなる長鎖炭化水素もしくは植物油および木蝋を含んでいる。例示すれば 、ワセリンや半合成グリセリドのような半固形ビヒクル、グリセリンのような多 水酸性溶媒、長鎖炭化水素、生体侵食性のポリマーもしくはリポソームが挙げら れる。

次の実施例は、本発明を実施するために現在考えられる最良の方法を単に例示す るに過ぎず、本発明を制限するものであると解釈するべきではない。

本発明の新しいｔ−ＰＡ変異体は、ｔ−ＰＡ発現ベクターであるｐＲＫ７−ｔ− ＰＡ’ｔ’構築した（例えば、１９９０年３月２２日公開（７）ＷＯ９０１０２ ７９８および１９９２年２月２０日公開のＷｏ　９２１０２６１２参照）。変異 型もしくは野生型ｔ−ＰＡを含んでいるこのベクターを、ヒト胎児腎臓細胞（２ ９３Ｃ）でのトランスフヱクンコンおよび発現に用いた。

ｔ−ＰＡｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発は、アマルシャムコーボレーシ町ン から購入したキット（カタログ番号　ＲＰＮ１２５３）を用いてティラーら。

Ｎｕｃ　１．Ａｃ　ｉｄｓ、Ｒｅｓ、、１３　：８７５６　（１９８５）の方法 で行った。

目的の変異体を作成するために、目的のアミノ酸配列置換をコードする配列のオ リゴヌクレオチドを合成し、それをプライマーとして用いた。これらのオリゴヌ クレオチドを標準的な方法［ヴイエラら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、、１４３：３　（ １９８７）］で調製しておいた一本鎖ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡとアニーリングした。

ｔ−ＰＡ変異体のいくつかはクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）突然変異誘発［クンケル 、Ｔ、Ａ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２，４８８− ４９２　（１９８５）およびクンケル、　Ｔ、　Ａ、ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、、 １４３　：　３　（１９８７）］を用いて作成した。

デオキシリポアデノンン（ｄＡＴＰ）　、デオキシリポグアノシン（ｄＧＴＰ） およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の３つのデオキシリボヌクレオチドの 混合物を、キットの製造元がキット中に提供しているｄＣＴＰ　（ａＳ）と呼ば れる修飾チオーデオキシリポントンンと一緒にし、それを、オリゴヌクレオチド をアニーリングしている一本鎖ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡに加える。

ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物に添加すると変異した塩基以外はｐＲＫ７−１ −ＰＡと同一のＤＮＡ鎖が生じる。さらに、この新しいＤＮＡ鎖は、ｄＣＴＰの 代わりに、制限エンドヌクレアーゼ消化からそのＤＮＡ鎖を守る働きのあるｄＣ ＴＰ　（ａｓ）を含有している。２本鎖のへテロ二重分子の鋳型鎖に適当な制限 酵素でニック（切れ目）を入れた後、その鋳型鎖を突然変異誘発性のオリゴマー を含んだ領域を越えてＥｘａｍヌクレアーゼで消化した。それから、一部分だけ １本鎖である分子を残してお（ためにその反応を止めた。それから、４種類すべ てのデオキシリボヌクレオチド３リン酸、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存在下 にＤＮＡポリメラーゼを用いて完全な２木端ＤＮＡホモ二重分子を形成した。

ｐＲＫ７−１−ＰＡ分子を作成するためにプライマーとして用いたオリゴヌクレ オチドを次の表１に示す： 表１ 変異（単−座）°ゝ　オリゴヌクレオチド配列（５°から３゛解読）Ｔ１０３Ｎ 　ＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＴＧＣＣＣＣＴＧＴ＾ＧＣＴ（配列番号１） Ｓ　ｌ０５Ｎ、　Ａ　ｌ０７Ｓ　ＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧＴＡＴＴＣＣＡ ＣＧＴＧＣＣＣＣＴ（配列番号２） Ｎ　１１７Ｑ　ＣＧＣＧＣＴＧＣｍＧＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ＾（配列番号３） ａ）単一座変異体とは、鋳型として野生型ｔ−ＰＡを用いた単一のオリゴヌクレ オチドで突然変異を起こすことにより作成したｔ−ＰＡ変異体を示す用語である 。

８１０５Ｎ、Ａ１０７Ｓｔ−ＰＡ変異体およびＫＩＩＲＲ（２９６−２９９）へ ＡＡＡｔ−ＰＡ変異体は１つ以上のアミノ酸置換を含んでいるので多重変異体で あるが、それらはただ１つのオリゴヌクレオチドを用いてそれぞれ作成された。

これが可能なのは、置換アミノ酸がポリペプチド鎖中で互いに非常に近い場所に 位置しているからである。

さらなる多重変異体を調製するために、上記の手順のなかで細かい変更を行った 。下記の変異体のための鋳型ＤＮＡは、野生型ｔ−ＰＡ　（ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡ ）ではなかった。その代わりに、使用した鋳型は、少な（とも単一の変異を含む ＤＮＡ、すなわち上記の表１中で変異体の構築で調製したＤＮＡであった。鋳型 として使用したＤＮＡ、および作成したそれぞれの二重座変異体に追加的な変異 を生じさせるために使用したオリゴヌクレオチドを以下の表２に列挙する。各オ リゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は上記の表１に記載している。星印は、本発明を 例示する変異体を示している。

変異体（三重座）　ｂ１級型　第１ノゴヌクレオチドＴ１０３Ｎ、　Ｎ１１７Ｑ 　Ｔ１０３Ｎ　Ｎ１１７ＱＳ１０５Ｎ、＾１０７ｓ、　Ｎｌ　１７Ｑ　５１０５ Ｎ、＾１０７Ｓ　Ｎ１１７ＱＴ１０３Ｎ、　ＫＢＲＲ（２９６−２９９）＾＾＾ ＾　Ｋ１１ＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ　Ｔｌ（１３ＮＳ１０５Ｎ、　Ａｌ （１７ｓ、にＨＲＲ（２９Ｇ−２９’ｌ）ＡＡＡＡ　に１１１１Ｒ（２９６−２ ９９）ＡＡＡＡ　５１０５Ｎ、＾１０７r Ｎ１１７Ｑ、　Ｋ１１ＲＲ（２９６−２９９）＾＾＾八　Ｋ１１ＲＲ（２９６− ２９９）＾＾＾＾　Ｎ１１７Ｑｂ）二重座変異体は、突然変異誘発のための鋳型 としてｔ−ＰＡの単一座変異体をコードするＤＮＡを用いて作成した。

次の多重（“三重座”）変異体は、鋳型として鋳型の段１こ示す多重変異体を用 いて、基本的に前出の手順に従って作成した。各第１ノゴヌクレオチドの配り１ ：ヨ上記の表１に記載している。星印は、本発明を例示する変異体を示して（す る。

表３ 変異体（三重座）−）線型　第１ノゴヌクレオチドＴ１．０３Ｎ、　Ｎ１１７Ｑ 、　Ｋ１１ＲＲ（２９６−２９９）＾＾＾＾　Ｎ１１７Ｑ、　Ｋ胴（２９６−２ ９９）へ＾へ＾　７１０３ＮＳ１０５Ｎ、＾１０７５．　Ｎｌ　１７Ｑ、　ＫＩ ＩＩＩＲ（２９６−２９９）八＾ＡＡ　３１０５Ｎ、＾１０７Ｓ、　Ｎ１１７Ｑ 、　ＫＩhＲＲＮ１１７Ｑ Ｃ）三重座変異体は、突然変異誘発のための鋳型としてｔ−ＰＡの二重座変異体 をコードするＤＮＡを用いて作成した。

■　細菌の形質転換およびＤＮＡの調製上述のプロトコールを用いて作成したｔ −ＰＡ変異体構築物を、コンピテント細胞の調製と形質転換のための標準的なＣ ａＣ１，法（１，７６−１，８４節転換した。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＭ２９４　ｔｏ ｎＡ　（Ｔ１ファージ耐性）は、１１ユＡ遺伝子へのＴｎｌＯ）ランスボゾンの 挿入と、その後の正確性を欠いた切除によって調製した。次に、トランスポゾン 挿入突然変異［クレツクナーら、去工恵ｏ１．Ｂｉｏ１．．１１６：１２５−１ ５９　（１９７７）］を用いて、Ｅ、ｃ。

１ｉ宿主ＭＭ２９４　（ＡＴＣＣ３１，４４６）にこの遺伝子を挿入した。

ＤＮＡは、マニアナイスら、前掲の標準的なミニブレウプの手順を用いて細菌の 形質転換体の個々のコロニーから抽出した。さらに、プラスミドはセファクリル ＣＬ６Ｂスピンカラムを通して精製し、それから塩基配列決定によって、および 制限エンドヌクレアーゼ消化とアガロース電気泳動によって分析した。

または、塩基配列は１本鎖レベルで決定し、２本鎖のプラスミドは、製造元の説 明書に従ってキアーゲンブラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ　ｐｌａｓｍｉｄｋｉ ｔ）により細菌の形質転換体から精製した。

■　ヒト胎児腎臓２９３細胞の形質転換ヒト胎児腎臓２９３細胞は、６穴−ウェ ルプレートで７０％全面成長するまで増殖した。ｔ−ｐΔ変異体をコードしてい るプラスミド２．５μｇを１５０μｌの１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、０．１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ　ＣａＣ１、に溶解した。１５０μｌの５０ｍＭ　Ｈ ＥＰＥＳｉｌｌｉ液（ｐＨ７，３５）　、２８０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　 ＮａＰＯ４をこれに加え（ポルテックスをしなから滴加）、２５°Ｃで１０分か けて、沈殿を形成させた。それから、懸濁した沈殿を６穴−ウェルプレートの個 々のウェル内の細胞に加え、インキュベーター内に一晩入れておいた。それから 、培地を吸引除去し、２０％のグリセリンを含有したＰＢＳ　（リン酸緩衝食塩 水）１ｍｌを加えた。次いで、３ｍｌの無血清培地を加え、細胞を５日間インキ ュベートした。それから培地を収集し、アッセイを行った。

例えば、２９３細胞において本発明のｔ−ＰＡＲ異体を大量に生産して精製する ためのトランスフエクノコンは、ＷＯ９０／’０２７９８．前掲に記載されてい るように行うことができる。

■、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＩＯ）細胞における発現および精製チャ イニーズハムスター卵巣（ＣＩＩＯ）細胞において本発明のｔ−ＰＡ変異体をト ランスフェクションおよび発現するために、応用範囲の広い親ベクターであるｐ ｓＶ１６Ｂ５　（形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ株　ＡＴＣＣ番号６８．１５１） を用いた。ｐｓＶ１６８５の構築は、１９９２年２月１１日発行の米国特許番号 ５．０８７，５７２に記載されている。

グラハムおよびファンデルニブ、前掲の一般的な手順を用いて、目的のｔ−ｐＡ 変異体をコードしているｃＤＮＡ配列がポリリンカ一部位に挿入されているｐＳ Ｖ１６８５に基づ（発現ベクターおよびｄｈｆｒ選択ベクターＰＦＤ１１［シモ ンセンおよびレビンソン、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　Ｌ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳ Ａ旦旦乱立４９５−２４９９　（１９８３）］を、非選択培地で生育させておい た（ウーラブおよびチャシン、前掲に記載されているような）ＣＩＩＯ−ｄｈｆ 　ｒに同時トランスフェクションした。トランスフェクションの後、ａ）グリシ ン、ヒボキサンチンおよびチミジンを欠いているか、またはｂ）これらの成分を 欠いていると同時に１０から３００ｎＭの範囲の濃度のメトトレキサートを添加 しであるかどちらかの選択培地に細胞をさらした。好ましくは（メトトレキサー トでの）選択が最も厳密なプレートから、各トランスフェクションについて約５ ０個のコロニーが単離された。組み換えｔ−Ｉ’Ａ変異体の発現を分析するため に、クローンを６穴プレートに広げて撒いた。全面成長ウェルを無血清生産培地 （インスリンとトランスフェリンを１：１で含んでいるＤＭＥＭ／Ｆ１２からを 変更したもの）に５−６０間さらし、ポリクローナルに基づ＜ＥＬＩＳＡアッセ イを用いて、細胞培養液中のｔ−ｐΔを定量した。凸トランスフエクンジンに対 して最も生産性の高いクローンを生産比率増加のために拡大した。細胞を警濁状 態で生育するように遍心させ、ｔ−ＰＡ変異体を無血清培地を用いて撹拌培養で 生産した。収穫した細胞培養液を透析濾過し、ｔ−ＰＡ変異体をリジンアフィニ テークロマトグラフィーを用いて精製した。

実施例２ １、ｔ−ＰＡの定量 天然−配列ｔ−ＰＡに標準化したＥＬＩＳＡによって、タンパク賀濃度をルー存 在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ−３Ｏ８）によつてタンパ ク質の純度および均一性を分析した。一般に、１０から２０％のグラジェントゲ ルを使用し、モリセイ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１ユニ３０７　（１９ ８１）のクーマシーブルーもしくは銀染色技術のどちらかで、タンパク質を視覚 化した。上記のようにして調製したＬ−ＰＡ変異体は、この方法で純粋であり均 一であることが分かった。

２、クリアランスおよび結合研究のためのｔ−ＰＡ変異体の標識ハンターおよび グリーンウッドに記載されている方法［Ｎａｔｕｒｅ　１９４゜４９５−４９６ 　（１９６２）］の変法を用いて、チロシル−プロリル−アルギニルクロロメチ ルケトン（ＹＰＲｃｋ）のクロラミン−Ｔ＃１！ｋＷ放射ヨード化により、活性 部位標識剤を調製した。一般的な反応では、５０μＩの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐ Ｈ７，５を、キャップ付き反応容器中の４０μｌのＮａ””Ｉ　（４ｍＣｉ　； 　１．８ｎｍｏ　Ｉ）に加えた。この容器に８．３μｌのＹＰＲｃｋ　（１２ｍ ＭＨＣＩ中にｌ、８ｎｍｏｌ含有）を加えた。１２．５μｌのクロラミン−Ｔ（ ０，ＩＭ　ＮａＰ’、ｐＨ７，５中に１ｍｇ／ｍｌ含有）を加えテヨード化反応 を開始した。２５μｍのメタ重亜硫酸ナトリウム（０，ＬＭ　ＮａＰ’、ｐＨ７ ，５中に１ｍｇ／ｍｌ含有）で２４°Ｃで６０秒処理した後、ヨード化反応を消 失させた。それから、反応物に２ｍｌのＰＢＳを加えて希釈し、希釈した標識試 薬２０μＩを一時的にトランスフェクションした２９３細胞の培養上清１ｍｌに 加えた。この混合物を１時間インキュベートし、ＰＤ−１０カラム（ファルマン ア）でのゲル濾過によってタンパク質結合型＋２６！から遊離の１１８１を分離 した。

タンパク質結合型１■Ｉを１０％トリクロロ酢酸との沈殿により測定した。これ らの標識条件は、ヨウ素：ＹＰＲｃｋ　：　ｔ−ＰＡのモル比が１：１：１であ ることに対して最適化した。■Ｉ標識ｔ−ＰＡ変異体の比放射活性は約１μＣ１ １１８＋／ｇｇｔ−ＰＡであった。

３、クリアランス速度の評価 マウスにおける血漿クリアランス ヒト胎児腎臓２９３細抱由来タンパク質を放射標識し、それをマウスに注射し、 そしてマウスの血中の放射能を経時的に測定することにより、ｔ−ＰＡ変異体の クリアランス速度を評価した。各実験は４匹のマウスを用いた。マウスは２つの グループに分け、グループ内の２匹のマウスは事前に定めた時点で採血した。２ つのグループから得たデータを合わせ、グラフ上に時間対血中ｃｐｍをプロット した。各マウスの血漿消失曲線下面積（Ａ　ＣＵ）を１から４０分までの連続し た台形を用いて計算した。

以下の表４では、Ｎはクリアランス速度を決定するために行った実験の数を示し ている。

平均上標準偏差はｍ！／分／ｋｇ（体重）で表現されるクリアランス速度を表し ており、これは上記の血漿消失曲線下面積によって計算した。

％Ｃ１■　はパーセントで示した変動率の値である。

Ｎｏｒｍ、は、野生型（２９３細胞由来）ｔ−ＰＡのクリアランスと比較したｔ −ｐΔ変異体のクリアランスの比を表す正規化因子である。

星印は、本発明を例示する変異体を示している。

マウスにおける血漿クリアランス ｔ−Ｐ＾変異体　暉　平均±標準偏差　（気Ｖ、　Ｎｏｒｍ。

野生型ｔ−ｐ＾　１２　３４．３±４．９　１４．３　１゜００ＴＩ０３Ｎ　５ 　１４．４±１．５　１０．１　０．４２３１０５Ｎ、＾１０７Ｓ　３　２０． ０±２．６　１２．９　０．５８Ｎ１１７Ｑ　４　２０．２±３．７　１８．６ 　０．５９ＫＨＲＲ３３５，Ｏｔ５．２　１５．１　１．０２Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１ １７Ｑ　３　１０．５±２．３　２１．８　０．３１Ｓ１０５Ｎ、＾ｌ０７Ｓ、 Ｎ１１７Ｑ　３　１２．１±２．２　１８．３　０．３５７Ｉ０３Ｎ、ＫＩＩＲ Ｒ４１４，４±１．６　１０．８　０．４２Ｓ１０５Ｎ、＾ｌ０７Ｓ、ＫＩＩＲ Ｒ’　２　１９．２±０．８　４．２　０．５６Ｎｌ１７Ｑ、ＫＩＩＲＲ５２０ ，３±３．９　１９．４　０．５９ＴＩ０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ、ＫＨＲＲ２９，７ 土０．７　７．３　０．２８ＳＩ０５Ｎ、＾１０７ｓ、Ｎ１１７Ｑ、にＩＩＲＲ １１０，Ｏｎ、ａ、　ｎ、ａ、　０．３０ＫＩＩＲＲ−ＫＨＲＲ（２９６−２９ ９）＾＾＾＾（−Ｐ＾ウサギにおける血漿クリアランス 本明細書の５節に記載している血栓溶解の動静脈シャント（ＡＶＳ）モデルの実 験プロトコールを用いて、ウサギにおけるｔ−ＰＡおよびｔ−ＰＡ変異体の薬動 学的分析を行った。流量スイッチのついた２０Ｇテフロンカテーテル（Ｖｉｇｇ ｏ）を、各２．５から３．５ｋｇ体重の麻酔をかけた雄のニューシーラント白ウ サギの内側耳動脈に差し込んだ。注入キャップ付き２２Ｇカテーテルを反対の耳 の辺縁静脈に差し込んだ。カテーテルはヘパリンを含んだ生理食塩水を流し、固 定した。

Ａｃｔｉｖａｓｅ”　ｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ変異体はポーラスとして与えるか 、もしくは静脈カテーテルを通して注入した。静脈内注入は１５％のローディン グポーラスで開始し、次に残り８５％の投与量を１２０分間かけて注入した。様 々な投与量のＡｃｔ　１ｖａｓｅ”　ｔ−ＰＡもしくはｔ−ＰＡ変異体をＡＶＳ プロトコールで試験した：６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇおよび５４０μｇ ／ｋｇ。

変異体Ｔ１０３Ｎ、ＫｆｌＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡは、４種類の投与量 で試験した一２０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇおよび５４０ μｇ／ｋ　ｇｏ血液サンプルは、注入プロトコールの間、３０分、６０分および ９０分の時点で採集した。サンプルは、ポーラス注入による投与１２，１０．２ ０．３０．４５．６０．９０および１２０分の時点で採集した。血液サンプルか ら抗凝血性血漿を調製し、血漿中のＬ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ変異体濃度をポリク ローナルＥＬＩＳＡによって測定した。５匹の動物のクリアランス速度の値を多 数の投与量の各々で評価した。

本発明のｔ−ＦＡＩ異体の血漿クリアランスをＡｃｔｉｖａｓｅ”　ｔ−ＰＡお よび既知のｔ−ＰＡ変異体と比較して次の表５に示す。星印は、本発明を例示す る変異体を示している。

表５ ウサギにお１する血漿クリアランス（−１／分／Ｋｇ）ｔ−ｐ＾サンプル　注入 °１　ポーラスゝ）Ａｃｔｉｖａｓｅ”ｔ−ＰＡ　２０７±３．９　２３．９± ６．４にＨＲＲ（２９６−２９９）＾＾＾＾　２０．　Ｏｆ３．　Ｏｎ、　ｄ。

Ｔ１０３Ｎ　ｎ、ｄ、　２．７土０．４ＴＩ０３Ｎ、　Ｋ１１ＲＲ（２９６−２ ９９）＾＾＾＾　ｎ、　ｄ、　３．３ｔＯ，２Ｎ１１７Ｑ、　Ｋ１１ＲＲ（２９ ６−２９９）＾＾＾＾　ｎ、　ｄ、　２２．７±１．２Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ 、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）＾＾＾＾　ｎ、ｄ、　２．１±０．４ａ）クリア ランスの減少と関係する変異を欠いたｔ−ＰＡ変異体［すなわち野生型およびＫ ＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ］に対しては、タンパク質を一定速度で静脈 内注入した後に血漿クリアランスを評価した。注入の終了時にポリクローナルＥ ＬＩＳＡによってｔ−ＰＡ変異体の定常状態血漿濃度を測定した。

クリアランスは次の関係式によって計算した：クリアランスフ注入速度／定常状 態血漿濃度。Ａｃｔｉｖａｓｅ”およびＫＨＲＲ［２９６−２９９］　ＡＡＡＡ のそれぞれに対して反復した分析によって平均クリアランス速度（±標準偏差） を測定した。

ｂ）静脈内注射によるタンパク質のポーラス投与後に、クリアランスが遅い性質 をもつｔ−ＰＡ変異体くおよびＡｃｔｉｖａｓｅ”　ｔ−ＰＡ）をウサギにおい て評価した。注射後の様々な時間のｔ−ＰＡの血漿濃度をポリクローナルＥＬＩ ＳＡを用いて測定した。クリアランス速度は、クリアランス速度＝投与量／血漿 消失曲線下面積という関係式を用いて計算した。平均クリアランス速度（士標準 偏差）をＡｃｔｉｖａｓｅ″　、Ｔ１０３Ｎ、Ｔ１０３Ｎ、ＫＨＲＲ（２９６− ２９９）ＡＡＡＡ：Ｎ１１７Ｑ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ、および Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡのそれぞれに対 して反復分析（ｎ＝５．１５，１６．１５およびｎ＝１０）を行って測定した。

４　フィブリン結合性 ＣＨＯ細胞から精製したｔ−ＰＡ変異体を１””−ＹＰＲｃｋで放射標識し、次 の手順を用いて可溶性プラスミンにより２本鎖型に変換した。０．　５％ウシ血 清アルブミンと０．Ｏ１％Ｔｗｅｅｎ８０が入ったリン酸緩衝溶液中の３１１１ −ＹＰＲｃｋ標識ｔ−ＰＡ（または変異体）のうち０．１５μＣｉを含んでいる 一部の溶液（１，５ｍ１）を、ヒトプラスミン（リン酸緩衝溶液５μｌ中、０， ０９力ゼイン単位）と緩やかにｌ！盪しなから２５’Ｃで２時間インキュベート した。

残りのプラスミンは、リン酸緩衝溶液１５μｍ中に含まれる０、９ＴＩユニツト を加えることにより、アプロチニンで阻害した。

フィブリン結合性は、リーケンら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７：２９２ ０−２９２５　（１，９８２）に記載されている方法の変法を用いて評価した。

０゜１２ａｇ／ｍｌから８ｍｇ／ｍｌにわたるリジン−セファロース処置ヒトフ ィブリノーゲンの希釈液をリン酸緩衝溶液で調製した。一部のフィブリノーゲン （５０１ｚｌ）およびＩ”’−ＹＰＲｃｋ欅識ｔ−ＰＡまたは変異体（１００μ ｌ）を１２ｍ１のポリエチレンチューブ中で合わせ、手短かに混和した。ヒトト ロンビン（１単位／ｍｌの溶液から５０μＩ）を添加するとフィブリン凝血が形 成され、６０秒間以内で肉眼で見えた。室温で６０分間放置した後、その凝血を ４℃で５分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上演の一部（５０μｌ）を放 射活性を計数するための個々のチューブに移した。総放射活性を計数するために 、（凝血と残りの液を含んでいる）もとのポリエチレンチューブもまた計数した 。総放射活性（５０μｌの部分溶液および凝血を含んでいるチューブの合計）と 上清５０μｉ中の量の４倍と計算される非結合型の放射活性の差が、結合型ｔ− ＰＡの量であった。

Ｃｌｌ０由来の精製した、プラスミン処置のほどこされた材料で行ったフィブリ ン結合アッセイの結果を図１および図２に示す。２木端ｔ−ＰＡ　（およびｔ− ｐＡ変異体）に対する数字で表記しであるフィブリン結合性のデータは次の表６ 中に示す。星印は、本発明を例示する変異体を示している。

フィブリン結合アッセイ°） ｔ−ＰＡサンプル　【フィブリン１５０（ｐｇ／ｓｌ）”　ａＨ冴慮ｄ９見ど） Ａｃｔ　１ｖａｓｅ’　ｔ−ＰＡ　７２　０．２１Ｋｌ！ＲＲ（２９６−２９９ ）＾＾＾＾　８７　０．２６τ１０３Ｎ　８３０　２．５ Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ　６３　０．１９ＴＩ０３Ｎ、　ＫＨＲＲ（２９６−２ ９９）＾＾＾＾　６２０　１．８Ｔ１０３Ｎ、　Ｎ１１７Ｑ、　Ｋ１１ＲＲ（２ ９６−２９９）＾＾＾＾　１２０　０．３５５１０５Ｎ、　Ａ１０７Ｓ　２１０ 　０．６３Ｓ１０５Ｎ、　Ａ１０７Ｓ、　Ｎ１１７Ｑ　９７　０．２９３１０５ Ｎ、　Ａ１０５Ｓ、　Ｎ１１７Ｑ、　Ｋ１１ＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ　 ８５　０．２５ａ）ｔ−ＰＡのＹＰＲｃｋ標識サンプルはプラスミンで処置した 。本結合アッセイは２本鎖型のｔ−ＰＡのフィブリン親和性を測定している。

ｂ）　［フィブリン］５０は、フィブリンに結合したサンプルタンパク質の５０ ％を観察するのに必要なフィブリンの濃度を表している。

ｃ）ａｐｐＫｎは、フィブリン凝血に結合しているｔ−ＰＡの見かけの親和定数 を示しており、これはｔ−ＰＡの５０％に結合するのに必要なフィブリンのマイ クロモル濃度によって決定される。この計算で用いたフィブリン単量体の分子量 は３４０キロダルトンであった。

上記のデータおよび図１から明らかなように、野生型ヒトｔ−ＰＡ分子の１０３ 番目の位置に（余分な）グリコジル化部位を付加するＴ１０３Ｎ変異は、フィブ リン結合性を有意に喪失させる。Ｔ１０３Ｎｔ−ＰＡが、野生型ヒトｔ−ＰＡと 比べて約３から５倍減少したクリアランスを示したにせよ、その治療的価値は、 フィブリン結合性の喪失のために有意に向上したとは言えない。

前述のデータで立証され、図２に示されているように、Ｔ１０３Ｎｔ−ＰＡのフ ィブリン結合性は、野生型ヒトｔ−ＰＡ分子の１１７番目の位置のグリコジル化 を除去する第二の変異を加えることによって、実質上向上する。さらに、Ｔ１０ ３Ｎ、Ｎ１１７Ｑｔ−ＰＡ変異体は、野生型ヒトｔ−ＰＡ　（またはＡｃｔｉｖ ａｓｅ’　ｔ−ＰＡ）と比べて低いクリアランスを保持している。

野生型ヒトｔ−ＰＡ分子の２９６−２９９番目の位置にさらに変異を加えると、 これはフィブリン特異性に著しい向上をもたらすことが知られているが［ＫＨＲ Ｒ（２９６−２９９）ＡＡＡＡＩ　、フィブリン結合性の有意な喪失を全く伴わ ない有意なりリアランス速廣の減少とフィブリン特異性の増加のために、野生型 ヒトｔ−ＰＡと比べて優れた三重変異体が生じる。

５．１ｎ　ｖｉｖｏ凝血溶解アッセイ（ウサギ動静脈シャント血栓溶解モデル） 新鮮な７０％ウサギ全血（０，１５Ｍ　ＮａＣ＋で希釈されている）もしくはＥ ＤＴＡで収集したウサギの血小板に富む血漿（０，８Ｘ１０＠血小板／ｍ１）の どちらかの０．２ｍｌを０．５ｍｌシリンジの注射筒に入れることにより、ｅｘ −ｖｉｖｏで凝血（血餅）を形成させた。ヒトトロンビンおよびＣａＣＩｍを血 小板に富む血漿に加えた（最終濃度はそれぞれ０．　２μｇ／ｍｌおよび１５ｍ Ｍ）。シリンジに移す前に全血および血小板に富む血漿の一部に１＋ｔｓ−ヒト フィブリノーゲンを加えた。凝血を形成するための軸として働（ための、ある長 さの綿糸をシリンジの注射筒に通した。凝血を３７６Ｃで１時間インキュベート した後、プランツヤ−を取り外し、シリンジ（１本は全血で、もう１本は血小板 に富む血漿）をシリコンゴムの管につないだ。２．５ｋｇから３．０ｋｇのニュ ーシーラント白ウサギの頚動脈および頚静脈に事前に埋め込んでおいたカテーテ ルにこの管をつないだ。血液は、凝血を越えて動脈循環がら流れてきて、静脈側 がら戻っていった。シャントを通過する流速は約２０ｍ１／分であった。ＡＣｔ ｉｖａｓｅ”　ｔ−ＰＡを注入に９０分以上かけて静脈カテーテルから投与した （そのうち１５％がローディング投与量）。Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ、ＫＨＲＲ （２９６−２９９）ＡＡＡＡを静脈内ポーラスとして投与した。ヘパリン（３０ ０Ｕ／ｋｇ）も１０分前と４５分後にこの経路でポーラス投与した。血栓溶解を 、実験の時間経過の１２０分過まで外部ガンマ線検出器で測定した。Ａｃｔｉｖ ａｓｅ”ｔ−ＰＡの標準曲線に関して、変異体の用量作用曲線の片対数プロット から相対強度を測定した。実験日の最後に、凝血回路を取り外し、カテーテルに 生理的食塩水を流し、ヘパリン（５０Ｑ単位／カテーテル）を入れて閉じた。５ 日間もの間に一日あたり１回に１０匹の動物を使用した。結果は、図３−６に示 す。

ｉｎ　ｖｉｖｏのデータは、全血の凝血および血小板に富む凝血の両方の凝血溶 解が三重変異体Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡ ｔ−ＰＡによって、Ａｃｔｉｖａｓｅ”　ｔ−ＰＡに比べて有意に速く生じてい ることを示している（図３および４）。さらに、このデータはＴ１０３Ｎ、Ｎ１ １７Ｑ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡｔ−ｐＡのｉｎ　ｖｉｖｏの有効 性が全血凝血および血小板に富む凝血においてＡｃｔｉｖａｓｅ’　ｔ−ＰＡよ りもそれぞれ６．０倍および９．５倍高いことを示している（図５および６）。

これらの数字で表記されたデータは、図５および６に記載する実験時点に対応す る平行な線状曲線に基づいて決定した。

ベクターｐｓＶＩＢ５で形質転換したＥ、ｃｏｌｉ２９４細胞は、１９８９年１ ０月２５日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１　パークレ ーン、ドライブ、ロックビル、　ＭＤ、米国（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ 受託番号６８．１５１と指定された。特許手続きを目的とする微生物の寄託の国 際的承認に関するブタペスト条約の条項、およびその条約（ブタペスト条約）下 の規定に基づいて寄託を行った。これは、寄託日から３０年間生存可能な培養の 維持を保証している。その微生物はブタペスト条約の条文の下で、およびジェネ ンテク、インコーポレイテッドとＡＴＣＣの間の協定の条件下で、ＡＴＣＣによ り入手可能となるだろうし、その協定は、直接関係のある米国特許の発行を受け た国民にとっても、またはいかなる米国もしくは外国の特許出願を行う国民にと っても開かれた状態にあり、どちらが先に来ようとも、その後世代の培養が永久 かつ無制限に入手可能であることを保証しており、米国特許委員および３５　Ｕ ＳＣ９１２２に従い特許に対して資格を与えられている登録商標および特許に準 じた委員規則（８８６０Ｇ　６３８の具体的な参照と３７　ＣＦＲ９１，１４を 含んでいる）によって決定された国民にとつてその後世代の培養が入手可能であ ることを保証している。

本出願の指定代理人は、もしその寄託した培養が適切な条件下で培養していると きに死ぬかもしくは失われるかもしくは破壊された場合には、通知１こより速や かに同一の培養の生存可能な試料と交換するということに同意した。寄託した株 の入手可能性は、特許法に従っているいかなる政府当局にも与えられている権利 に違反して本発明を行うための許可として構成されるべきではない。

上記の明細書は、当業者が本発明を実施することが十分可能であるように考慮さ れている。本明細書中の材料の寄託の項は、本明細書中に含まれている記載が本 発明の最適な方法を含めて、本発明のいかなる局面の実行も可能にするためには 不十分であるということの許可を構成している訳ではなく、また本発明が表して いる特定の例示に対する請求の範囲を限定するように構成されている訳でもない 。

前出の記載は、特に好ましい具体例を示しているが、本発明はそれほど限定的で はないことが理解されるだろう。技術的に通常に熟練した人にとっては、本発明 の全体的な概念から逸脱することなしに、示された具体例に様々な変更を加える ということもあるだろう。そのような変更はすべて本発明の範囲内で意図された ものである。

配列表 （１）　一般的情報 （ｉ）　特許出願人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（ｉｆ）　発明の名 称；向上した治療特性を有する組織プラスミノーゲン活性化因子グリコジル化変 異体 （ｉｆｆ）　配列の数＝４ （ｉｖ）　連絡先： （Ａ）　名宛人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）　通り：ポイント ・サン・ブルーノ・ブールバード４６０番（Ｃ）　市：サウス・サン・フランシ スコ（Ｄ）　州、カリフォルニア （Ｅ）　国：アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ：９４０８０ （Ｖ）　コンピューター解読書式 （Ａ）　媒体型：５．２５インチ、３６０Ｋｂフロツピーデイスク（Ｂ）　コン ピューター＋ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）　オペレーティング・システム：　ＰＣ−Ｄ Ｏ３／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）　ソフトウェア：　Ｐａｔｉｎ　（ンエネンテク）（ ｖｉ）　本出願のデータ： （Ａ）　出願番号・ （Ｂ）　出願日： （Ｃ）　分類： （ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ：（Ａ）　出願番号： （Ｂ）　出願日 （ｖｉｉｉ）　弁理士／代理人情報 （Ａ）　氏名ニドレジャー、ジンジャ−・アール（Ｂ）　登録番号＋３３．０５ ５ （Ｃ）　参照／整理番号・７５７ （ｉｘ）　電話連絡先情報： （Ａ）　電話番号＋４１５／２６６−３２１６（Ｂ）　ファックス番号：４１５ ／９５２−９８８１（Ｃ）　テレックス：　９１０／３７１−７１６８（２）　 配列番号１の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ＝２４塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列　配列番号１： ＴＧＴＧＣＴＣＣ＾＾ＴＴＧＣＣＣＣＴＧＴ　ＡＧＣＴ　２４（２）　配列番号 ２の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ・３０塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数・１本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号２： ＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧ　ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴ　３０（２ ）　配列番号３の情報・ （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：２４塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号３・ ＣＧＣＧＣＴＧＣＴＴ　ＴＧＣＣＡＧＴＴＧＧ　ＴＧＣ＾　２４（２）　配列番 号４の情報。

（ｉ）　配列の特徴 （八）　長さ：３６塩基 （Ｂ）　型６核酸 （Ｃ）　！ｊｌの数：１本鎖 （Ｄ）　トボロノー、直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号４： ＣＣＧＣＴＣＴＣＣＧ　ＧＧＣＧＡＣＧＣＣＧ　ＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣ＾＾＾Ｇ ＡＴ　３６フイブリン　（μｇ／ｍ１） 時間（分） 時間（分） 電−ＰＡの１２１ｊ！（μＱ／ｋＧ１１１−ＰＡの投与＊（μ９／に９） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　９／６ ４　Ｚ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　パオニ、ニコラス・エフアメリカ合衆国カリフォルニア９４５ ５６、モラガ、シュエイ・ドライブ５１番 Ｉ

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０３−１０５番目のいかなる位置にお いてもグリコシル化されており、１１７番目の位置で機能的な炭水化物構造を欠 いているヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）変異体であって、野 生型ヒトｔ−ＰＡと比べて、ａ）延長した循環半減期および実質的に保持されて いるフィブリン結合性、またはｂ）向上したｉｎ　ｖｉｖｏフィブリン溶解力を 示す該変異体。
2. ２．野生型ヒトｔ−ＰＡと比べて循環半減期が延長しかつフィブリン結合性が実 質的に保持されている請求項１に記載の変異体。
3. ３．野生型ヒトｔ−ＰＡの１０３から１０５番目のいかなる位置においてもグリ コシル化されているヒトｔ−ＰＡ変異体に比べてフィブリン結合性が向上してお り、かつ１１７番目の位置で機能的な炭水化物構造を有する請求項２に記載の変 異体。
4. ４．野生型ヒトｔ−ＰＡに比べてｉｎ　ｖｉｖｏフィブリン溶解力が向上してい る請求項１に記載の変異体。
5. ５．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０３番目の位置でグリコシル化されて いる請求項１に記載の変異体。
6. ６．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０５番目の位置でグリコシル化されて いる請求項１に記載の変異体。
7. ７．１０３から１０７番目の位置のグリコシル化がＮ−結合型である請求項１に 記載の変異体。
8. ８．１０３から１０５番目の位置のグリコシル化がＯ−結合型である請求項１に 記載の変異体。
9. ９．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０３番目の位置に、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅ ｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここに、Ｘはプロリン以外のどのアミノ酸でもよ い）のトリペプチド配列の一部としてアスパラギンを有する請求項７に記載の変 異体。
10. １０．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０３番目の位置にアスパラギン、１ ０４番目の位置にトリプトファンおよび１０５番目の位置にセリンを有する請求 項９に記載の変異体。
11. １１．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０５番目の位置に、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓ ｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここに、Ｘはプロリン以外のどのアミノ酸でも よい）のトリペプチド配列の一部としてアスパラギンを有する請求項７に記載の 変異体。
12. １２．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０５番目の位置にアスパラギン、１ ０６番目の位置にスレオニンおよび１０７番目の位置にセリンを有する請求項１ １に記載の変異体。
13. １３．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１１７番目の位置にアスパラギン以外 のアミノ酸を有する請求項１に記載の変異体。
14. １４．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１１７番目の位置がグルタミンに置換 している請求項１３に記載の変異体。
15. １５．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０３番目の位置が、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓ ｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここに、Ｘはプロリン以外のどのアミノ酸でも よい）のトリペプチド配列の一部としてアスパラギンにさらに置換している請求 項１３に記載の変異体。
16. １６．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０５番目の位置が、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓ ｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここに、Ｘはプロリン以外のどのアミノ酸でも よい）のトリペプチド配列の一部としてアスパラギンにさらに置換している請求 項１３に記載の変異体。
17. １７．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０７番目の位置がさらにセリンに置 換している請求項１６に記載の変異体。
18. １８．野生型ヒトｔ−ＰＡに比べてフィブリン特異性が向上している請求項１に 記載の変異体。
19. １９．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の２９６から３０２番目または２７４か ら２７７番目のアミノ酸領域内で、２９９番目の位置のアルギニンをアスパラギ ン酸に置換する以外の変更によってフィブリン特異性を向上させる請求項１８に 記載変異体。
20. ２０．該変更が野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配剤の２９６から３００番目の領域 内である請求項１９に記載の変異体。
21. ２１．該変更が野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の２９６、２９７、２９８およ び２９９番目の位置の一カ所またはそれ以上の箇所である請求項２０に記載の変 異体。
22. ２２．該変更が野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の２９６、２９７、２９８およ び２９９番目の位置のリジン、ヒスチジン、アルギニン、アルギニンの各アミノ 酸からアラニンヘの置換である請求項２１に記載の変異体。
23. ２３．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０３番目の位置にＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅ ｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのトリペプチド配列の一部としてアスパラギンを有 し、１１７番目の位置にアスパラギン以外のアミノ酸を有する請求項１９に記載 の変異体。
24. ２４．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０３番目の位置にアスパラギン、１ ０４番目の位置にトリプトファン、１０５番目の位置にセリンおよび１１７番目 の位置にグルタミンを有する請求項２３に記載の変異体。
25. ２５．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０５番目の位置にＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅ ｒおよびＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのトリペプチド配列の一部としてアスパラギンを有 し、１１７番目の位置にアスパラギン以外のアミノ酸を有する請求項１９に記載 の変異体。
26. ２６．野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列の１０５番目の位置にアスパラギン、１ ０６番目の位置にスレオニン、１０７番目の位置にセリンおよび１１７番目の位 置にグルタミンを有する請求項２５に記載の変異体。
27. ２７．次の変異を含むヒトｔ−ＰＡ変異体からなる群より選択される請求項１に 記載の変異体：Ｔ１０３Ｎ，Ｎ１１７Ｚ：Ｓ１０５Ｎ，Ａ１０７Ｓ，Ｎ１１７Ｚ ；Ｔ１０３Ｎ，Ｎ１１７Ｚ，Ｋ２９６Ａ，Ｈ２９７Ａ，Ｒ２９８Ａ，Ｒ２９９Ａ ；Ｓ１０５Ｎ，Ａ１０７Ｓ，Ｎ１１７Ｚ，Ｋ２９６Ａ，Ｈ２９７Ａ，Ｒ２９８Ａ ，Ｒ２９９Ａ：Ｔ１０３Ｎ，Ｎ１１７Ｚ，Ｒ２９８Ｅ，Ｒ２９９Ｅ；Ｓ１０５Ｎ ，Ａ１０７Ｓ，Ｎ１１７Ｚ，Ｒ２９８Ｅ，Ｒ２９９Ｅ；Ｔ１０３Ｎ，Ｎ１１７Ｚ ，Ｋ２９６Ｑ，Ｈ２９７Ｎ，Ｐ３０１Ｓ；Ｓ１０５Ｎ，Ａ１０７Ｓ，Ｎ１１７Ｚ ，Ｋ２９６Ｑ，Ｈ２９７Ｎ，Ｐ３０１Ｓ；Ｔ１０３Ｎ，Ｎ１１７Ｚ，Ｆ２７４Ｌ ，Ｒ２７５Ｈ，１２７６Ｓ，Ｋ２７７Ｔ；Ｓ１０５，Ａ１０７Ｓ，Ｎ１１７Ｚ， Ｆ２７４Ｌ，Ｒ２７５Ｈ，２７６Ｓ，Ｋ２７７Ｔ。（ここに、Ｚはアスパラギン （Ｎ）以外のどのアミノ酸でもよい）。
28. ２８．請求項１に記載の変異体をコードするＤＮＡ配列。
29. ２９．請求項２８に記載のＤＮＡ配列を含み、適当な宿主細胞にてそれを発現で きる複製可能な発現ベクター。
30. ３０．請求項２９に記載のベクターによって形質転換されている宿主細胞。
31. ３１．請求項３０に記載の宿主細胞を培養することを特徴とする、ｔ−ＰＡ変異 体をコードするＤＮＡを発現するための方法。
32. ３２．宿主細胞の培養から変異体を回収する工程をさらに含む請求項３１に記載 の方法。
33. ３３．製薬的に許容し得る担体と混合した治療的有効量の請求項１に記載の変異 体を含有する血管の病気や疾患のための組成物。
34. ３４．有効量の請求項３３に記載の組成物を哺乳類に投与することからなる哺乳 類における血管の肩気や疾患を処置するための方法。
35. ３５．製薬的に許容し得る担体と混合した治療的有効量の請求項１に記載の変異 体を含有するフィブリン沈着または癒着形成や再形成を予防するための組成物。
36. ３６．有効量の請求項３５に記載の組成物をフィブリンまたは癒着の形成の可能 性のある哺乳類上の部位に投与することからなり、フィブリン沈着または癒着の 形成や再形成を予防するために哺乳類を処置する方法。
37. ３７．１１７番目の位置のアミノ酸における機能的な炭水化物構造を除去するこ とを特徴とする、１０３−１０５番目のアミノ酸のグリコシル化の結果として減 少した野生型ヒトｔ−ＰＡのフィブリン結合親和性を実質的に回復させる方法。