JPH02504102A - 血管障害治療のための改良法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血管障害治療のための改良法 本発明は、一般的に言うと、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ） タンパク質の改良方法、および特に、ｔ−ＰＡの薬動力学的性質の改良方法に関 する。

２、関連技術の説明 ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子ｔ−ＰＡは、インビボで血餅を溶解するそ の能力の強さおよびその高い特異性のゆえに、血管障害の治療において非常に有 望であることが示された極めて重要かつ新規な生物学的薬物である。従って、ｔ −ＦＡは、血管障害の治療および特に心臓障害の治療用に、最近の歴史の中で最 も著名な新規薬物の１つであるとして医学界によって歓迎された。これらの理由 およびその他の理由によって、ｔ−ＦＡは、重篤な血管障害の臨床的な処置に革 命をもたらすことが予想される。

ヒトｔ−ＦＡタンパク質ならびにそれをコードしている基本の遺伝子配列は、最 近の数年間の移しい数の科学的発表の対象であった。

例えば、ｔ−ＰＡタンパク質の構造ならびにその天然供給源からの単離は、リツ ケンら［Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８１）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、、　２５６：　７０３５］が開示している。さらに、天然および組換えの 両供給源からの天然ｔ−ＰＡの単離を詳しく記載した特許および種々の特許出願 が公開されている（例えば、ＵＫ特許Ｎｏ、　２．１１９．８０４　；欧州特許 出願公開λｏ、　０４１７６６　；および欧州特許出願公開λｏ、０９３６ｔ９ を参照）。このような開示に基づき、現在では、天然ｔ−Ｐ　Ａ　（天然から単 離されたものであるか、またはその組換えによるものであるかを問わない）が、 通常、種々の他のタンパク質において同定された相同または類似の構造を参考に して定義された５つのドメインを含んでいることが明らかになっている。これら のドメインは、フィンガー（Ｆ）、成長因子（Ｇ）、クリングル１（Ｋｌ）、ク リングル２（Ｋ２）およびプロテアーゼ（Ｐ）領域と呼ばれており、タンパク質 骨格構造のＮ−末端からＣ−末端に至るまで隣接して位置している。

血餅を溶解する薬学物質であるとして天然のヒトｔ−ｐＡで確認された顕著な利 点にもかかわらず、ある種の欠点が種々の状況下で使用する際に付随する。例え ば、天然のｔ−ＰＡは、治療学的有効量で患者に投与したときに極めて短い血漿 半減期（通常は約６分あるいはその近辺）を有している。さらに、別の重要な薬 動力学的指標である浄化（クリアランス）速度について言うと、通常、天然のｔ −ＰＡは極めて高い浄化速度約７〜８．５Ｍ（１／分／ｋｇを示す。短い半減期 および高い浄化速度は、ある種の状況下、例えば心筋梗塞または肺塞栓などの生 命を脅かす疾患の迅速な積極的治療が行われる場合に望ましい。この危険度の高 い状況下では、制御されない出血に対するかなりのまたは知り得ない可能性を含 んで患者が治療されることもある。そのような出血か発生したときには、薬物の 投与が停止され、原因となっているｔ−ＰＡの量が高い浄化速度によって急速に 消耗される。

しかし、他の状況においては、例えば再潅流に続く心筋梗塞の治療においては、 望ましい治療処方は積極性の少ないものであり、持続期間の長い（４〜１２時間 ）ものである。長い半減期型のｔ−ＰＡは、生命が脅かされる状況にない患者の より望ましい効率的かつ好都合な治療薬であると認めることができる。さらに、 より長い半減期のｔ−ＰＡはポーラス投与用の薬物として望ましいであろう（例 えば、注入法を利用できないのが普通である救急車の専門家にとっては、より長 い半減期および／またはより遅い浄化速度を有するｔ−ＦＡ様の薬物を用いる方 がより望ましいであろう）。

従って、最近では、改善された薬動力学パラメーターを有し、なおインビボにお いて高い血餅溶解活性を保持しているｔ−Ｐ　Ａ変異体を製造するための改良法 およびそれに関連する態様を見つけることが必要とされている。これらは、心臓 血管障害の治療に、および血管の血栓塞栓による閉塞から生じるその他多数の医 学的症状の治療において医学上重要かつ新規な別法を提供するであろう。

発明の要約 当分野における上記のおよびその他の不都合な点を認めた上で一般的に記述する と、本発明の目的は、血管障害を有する患者において障害を治療するための、特 に冠状動脈の再血栓症の防止において、改善された方法を提供することである。

具体的な本発明の目的は、現在利用されている血餅溶解薬物に比べて一層長い半 減期および／または一層減少した浄化速度を有する血餅溶解薬物を必要としてい る患者の治療に特に適合する方法を提供することである。

さらに具体的な本発明の目的は、天然のｔ−ＰＡに比べてさらに長い半減期およ び／またはさらに減少した浄化速度を有する血餅溶解薬物を使用する余地のある 症状、例えば深静脈血栓症または末梢動脈血栓症（末梢血管障害）などの症状の 治療のための方法を提供することである。

従うて、全般的かつ総合的な意味において、本発明は本発明者らの認識を具体化 するものであり、天然のｔ−ＰＡに比べて一層長い半減期および／または一層減 少した浄化速度を示すがなおインビボで高い血餅溶解活性を保持しているヒ）　 ｔ−Ｆ　Ａタンパク質の変異体が製造されるものである。本明細書で用いる「変 異ヒトｔ−Ｆ　Ａクンバク質」なる用語は、天然のｔ−ＰＡの基本的な構造的特 徴を含むタンパク質構造を意味し、例えば天然のｔ−ＰＡに見い出されるアミノ 酸配列またはそのようなアミノ酸配列の生物学的な機能的等個物に大体において 一致しているが、それでもなお該構造が１またはそれ以上の方法により天然ｔ− ＰＡに比べて統計学的に増加した半減期および／または浄化速度を有する変異タ ンパク質を生じるように変えられた構造を指す。本明細書で用いる「天然のｔ− ＰＡＪなる用語は、例えばＥＰＯ出願公開Ｎｏ、　０４１．７６６およびＮｏ、 　０９３６１９に記載されているような天然または組換え供給源から得られたい ずれのｔ−Ｐ　Ａをも含むものとする。

即ち、本発明を一般的に記述すると、本発明は「半減期を長くした」または「浄 化速度を減少させたＪｔ−ＰＡ薬物を必要としている患者の血管障害を治療する ための改良法に関する。一般的に言うとこの方法は、比較的長い血漿半減期、例 えば天然のｔ−ＦＡによって示されるものより少なくとも約２倍長い半減期を示 すか、または減少した浄化速度、例えば天然のｔ−ＰＡタンパク質によって示さ れる浄化速度に比べ約１／２またはそれ以下を示す変異ｔ−ＦＡタンパク質を製 造することを包含している。この変異ｔ、−ＰＡタンパク質が患者に治療学的利 益を与えるに適した量で種々の薬学的に許容しうる担体または賦形剤と都合の良 い剤形で製剤化され、続いて特定の状況に従ってこれを必要としている患者に適 切な童を投与する。

「半減期」または「血漿半減期」が、血漿中の薬物濃度が１／２まで減少する時 間を意味し、通常は選ばれた用量の投与の後に測定されることは当業者の理解す るところであろう。従って、半減期は血漿中の薬物濃度の半分が排除される時間 を測定するものである。

対照的に、「浄化速度」なる用語は、特定の体液（通常は血漿）中の薬物の濃度 で割られた薬物排除の割合を意味する。本明細書で用いる「血漿」は血漿または 血清のいずれかを意味する。ある薬物の浄化は臨床的に用いられるほとんどの薬 物濃度にわたって一定であるのが普通であり、通常は一次の速度動力学に合致す るので、浄化の概念は臨床的な薬動力学において極めて有用である。浄化速度は 、ＡＵＧ（血漿濃度時間曲線の下側の領域として定義される）で割りた用量とし てさらに具体的に定義されることもある。従って、「増加した」、「高められた 」または「より長くなった」半減期は統計学的に一層長くなった半減期を意味す る。さらに、「減少した」または「遅くなった」浄化速度は統計学的に減少した 速度を意味する。

天然のｔ−ＰＡの薬動力学は２相的または多相的のようであるので、通常、それ らの薬動力学は２−（または多−）指数方程式に適合する。

従って、本明細書に示す半減期の数が「名目上の」半減期であって、天然ｔ−Ｐ Ａの支配的な半減期がｔｌ／２ａについては約２．２分であり、モしてｔ］、、 ／２ｂについては約３０分であることを示していることを認識すべきである。し かし、Ｃ０−１００であるときには、通常、１１／２ａ、成分は約９５％であり 、ｔｌ／２ｂ成分は約５％である。従って、α相が支配的であり、名目上の半減 期を示している。

驚くべきことに、天然ｔ−ＰＡのインビボでの高い血餅溶解活性を有効に保持し ている変異ｔ−ＰＡタンパク質の製造の鍵となるのは、通常は天然ｔ−ＰＡに伴 われているフィンガー領域の全部もしくは一部、または成長因子領域の全部もし くは一部、またはクリングル１領域の全部もしくは一部の除去であることを発見 した。本明細書で用いる「フィンガー領域」なる用語は、通常、システィン残基 ６と３６、および３４と４３の間の推定のジスルフィド結合の存在によって「フ ィンガ一様の」構造を示す天然ｔ−ｐＡタンパク質のアミノ末端領域を指す。別 の方法によれば、このフィンガー領域は、それぞれのフィンガーをコードしてい るエクソン領域として基本の遺伝子構造によって定義することもできる（例えば 、フィブロネクチンとのタイプ１の相同性によって特徴付けられるように、およ び独立のエクソン領域として）。従って、ある種の好ましい態様では、フィンガ ー領域は天然のｔ−ＰＡのアミノ酸およそ１　（Ｓ　Ｅ　Ｒ）からおよそ４４（ ＨＴＳ）に対応するアミノ酸を含んでいる。

で延びるものとして様々に定義されている（ＥＧＦとの相同性に基づいて）。ク リングル１（Ｋｌ）はアミノ酸９２近辺から１７３近辺まで延びるものとして定 義されており、クリングル２（Ｋ２）はアミノ酸１８０近辺からアミノ酸２６１ 近辺まで延びるものとして定義されている。いわゆるセリンプロテアーゼドメイ ン（Ｐ）は、通常、アミノ酸２６４近辺から分子のＣ−末端まで延びるものとし て定義されている。通常、これらのドメインは互いに隣接して位置しているか、 または短い「リンカ−」領域によって分離しており、そして推定の成熟型におけ る１〜５２７アミノ酸の全アミノ酸配列を占めている。

それぞれのドメインはある種の特異的な活性を付与するものとして様々に記載さ れている。即ち、フィンガー領域は、フィブリンへの高い結合親和性にとって必 須であるか、または少なくとも主な重要性を有している配列を含有していると様 々に記載されている（この活性は、フィブリンに富む血栓の存在場所でヒト組織 プラスミノーゲン活性化因子が血餅溶解に対して示す高い特異性にとって重要で あると考えられている）。同様に、成長因子様の領域は、少なくともウロキナー ゼに関しては細胞表面の結合活性に関与している。

また、クリングル２領域は、ｔ−Ｐ　Ａの活性を刺激するフィブリンの能力と、 およびフィブリン結合と強く関係している。セリンプロテアーゼドメインは、プ ラスミノーゲンを活性化する活性に関する分子の作業ドメインであるとして意見 が一致しているようである。

従って、本発明は、除去されるフィンガー、成長因子またはクリングル１ドメイ ンの量または部分が関係する方法で、ｔ−ＰＡの血漿半減期を増加させる方法を 意図するものである。即ち、ｔ−ＦＡ変異体中に示されるドメインの機能的変化 の程度が大きくなるにつれて、この変異体によって示される半減期の増加が大き くなる。しかし、全体のフィンガー、成長因子またはクリングル１領域を実質的 に除去したときであっても、インビボでの血餅溶解活性がわずかに減少する結果 にしかならないことがわかった。従って、インビボでの血餅溶解活性を保持して いる本発明の変異ｔ−ｐＡタンパク質を用いて、即ち、１またはそれ以上の機能 的なフィンガー、成長因子、クリングル１、クリングル２および／またはプロテ アーゼドメインを含み、少なくとも一部のフィンガー、成長因子またはクリング ル１領域が除去されているか、または変えられている変異体を用いて医薬調製物 を容易に製造することができる。

ある好ましい態様では、製造され、そして臨床的に使用されるｔ−ＰＡ変異体は 全フィンガードメインが実質的に除去されており、具体的には天然ｔ−ｐＡのア ミノ酸１から４４に対応するアミノ酸が除去されていることを特徴とする［本明 細書においては「デス（１−４４）ｔ−ＰＡＪ　と呼ぶコ。

本発明の他の好ましい態様では、実質的に完全な成長因子領域であるアミノ酸４ ４〜８４が削除されているか、または実質的に完全なりリンゲル１領域であるア ミノ酸９２〜１７９が削除されている。

本発明に従って製造されるｔ−ＰＡ変異体は、通常、天然のｔ−ＰＡよりも少な くとも２倍長い血漿半減期を示し、ある態様では、天然ｔ−Ｐ　Ａによって示さ れる血漿半減期の約５〜約２０倍の半減期を示す。ヒトでの天然ｔ−ＰＡの血漿 半減期が約６分であるときには、通常、本発明の好ましい変異ｔ−ＰＡ３１４製 物は少なくとも１２〜２０分の半減期を示し、デス（１−４４）ｔ−ＦＡの場合 は１時間に達するかあるいはそれ以上の半減期を示す。

ウサギ、サルおよびヒトでの天然ｔ−ＰＡの「名目上の」半減期がそれぞれ約２ ．３．５および６分であることは理解されよう。通常、この比は比較的一定であ る。従って、例えばウサギで観察された半減期は、ヒトでは若干高い半減期に対 応するであろう。

他の態様では、変異ｔ−ＦＡ構造の改善された薬動力学は薬物の浄化速度の減少 として定義される。そのような態様では、変異ｔ−ＰＡタンパク質は、天然ｔ− ＰＡの浄化速度の１／２〜１１５またはそれ以下の浄化速度、好ましくは天然ｔ −ＦＡの浄化速度の約１／】５〜約１／２５の浄化速度を示すように提供される 。最も受は入れられている試験系においては、並びにヒトにおいては、天然のｔ −ＰＡは通常７〜８．５ＭＱ／分／ｋｆのオーダーの浄化速度を示すであろう。

しかし、本発明を実施する際に用いるｔ−Ｐ　Ａ変異体は、通常、約２１１２／ 分／に９より小さい浄化速度を示し、好ましいデス（１，−４４，）ｔ−ＦＡ変 異体は約０．！Ｍ！／分／ｋｙより小さい浄化速度を示すであろう。

変異ｔ−ＰＡタンパク質調製物の不都合な作用および未知の毒性の可能性を避け るため、必須ではないが、製造された変異タンパク質は合成誘導体、例えばアル キル、アルキルアミンもしくはメチル化されたベンジルアミンまたはその他のブ ロック基がタンパク質構造に含まれている誘導体などを含んでいないことが好ま しい。

しかし、他の修飾により改良型のｔ−ＰＡが得られることが既に見い出されてお り、そのような修飾型のｔ−ＰＡも本発明の方法で用いることができる。例えば 、ヒトｔ−ｐＡのアミノ酸２７０〜約２７９の領域に、より具体的には位置２７ ５．２７６および２７７にある種のアミノ酸置換を有する新規なｔ−ＰＡ突然変 異体が、Ｕ、Ｓ、出願Ｎ　０．０７１０７１．５０６（１９８７年７月９日出願 ）、並びにその親出願Ｎ　ｏ、　０６７８４６゜６９７（１９１１１６年４月１ 日出願）およびＮ　Ｏ，０６／７２５．４６８（１９８５年４月２２日出願）（ １９８６年１０月２９日に公開された欧州特許出願公開Ｎ　ｏ、　１９９．５７ ４に対応）に記載されている（これら出願のすべては祭考のために挙げた）。位 置２７７にリジンまたは位置２７５にアルギニン以外のアミノ酸を有するｔ−Ｆ 　Ａの突然変異体であると好便に特徴付けられるこれらの突然変異体は、本明細 書においてはプロテアーゼ耐性の１本鎖ｔ−ＰＡ変異体と呼ばれるが、これらは 、１本鎖または２本鎖の両形態で存在することができる天然のｔ−ＰＡとは異な り、位置２７５および／または２７７のプロテアーゼ切断に対して耐性であり、 従ってインビボでの代謝によって２本鎖形に変換されない。このような耐性の「 １本鎖」変異体も本発明の方法によって同様に改善され、本発明の範囲内に含ま れる。本発明のこのような酵素的に耐性なもの（アミノ酸位置２７５および／ま たは２７７で）の例には、フィンガー、成長因子またはクリングル１領域（少な くともその一部）の欠失と組み合わせた同様の変異体、例えばデス１−４４　Ｇ ］ｕ２７５ｔ−ＰＡおよびデス１−４４　Ｇ１ｕ２７５１　ｓｏ２７７ｔ−ＰＡ が含まれる。

変異ｔ−ＰＡタンパク質は、例えば天然ｔ−ＰＡの酵素による切断とそれに続← 選択したアミノ酸の酵素による付加によって、または全合成法によっても得るこ とができるが、好ましい態様では、ｔ−ｐＡ変異体は組換えＤＮＡ法と細胞培養 法を実施することによって得られる。組換えベクターを始め、このようなベクタ ーを用いることによって適切なｔ−ＰＡ変異体を生成させ、培養し、発現させる 組換え法は当分針で広く知られており、本明細書中に詳しく記載されている。

通常、適切な変異ｔ−Ｆ　Ａタンパク質を製造するための好ましい組換え法は、 変異体をコードしている組換えベクター、例えばアミノ酸４５〜５２７に対応す るアミノ酸をコードしているベクターを調製することを包含し、デス（１−４４ ）ｔ−ＰＡの場合は天然ｔ−ＦＡのアミノ酸１−４４を削除し、モしてデス成長 因子およびデスクリンゲルＩｔ−ＰＡの場合は適切なアミノ酸を同様に削除する 。組換えＤＮＡ法を用いて変異ｔ−ＦＡタンパク質を調製することによって、保 持されるフィンガー、成長因子またはクリングル１領域の大きさおよび配列が特 異性高く制御された変異体が得られることは理解されよう。さらに、大量の変異 タンパク質を製造し、常法によってさらに精製して薬学的に許容しうる調製物を 得ることができる。遺伝子操作を行った微生物または細胞培養系によって産生さ れる生成物は、これまで可能であった方法よりもなお一層効率の高い方法でヒト 組織プラスミノーゲン活性化因子を得る機会を与え、これまで十分に行えなかっ た市場風聞を可能にする。さらに、宿主細胞に依存して本ヒト組織プラスミノー ゲン活性化因子は、天然の物質と比較して一層高いか、または低い程度で付随の グリフシル化を含んでいることもある。いずれにしても、このｔ−ＦＡは汚染タ ンパク質およびその他の外来物質、例えばウィルスに基づく物質（通常、非組換 えの細胞環境において、あるいはプールした血清由来の調製物においてそれが伴 う）などの汚染物質を含んでいない。

本発明の化合物を既知の方法に従って製剤化して薬学的に有用な組成物を得るこ とができ、それにより、本発明の改良型ヒ）　ｔ−Ｐ　Ａ産物を薬学的に許容し うる担持担体と混合する。適当な担持担体およびそれらの製剤（他のヒトタンパ ク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は記載されている［例えば、Ｒｅｍｉ ｎｇｔｏｎｓ　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　１６版、１９ ８０年、Ｍａｒｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、０ｓｌｏら編；参考のため に挙げた〕。通常、そのような組成物は、宿主に効果的に投与するのに適した薬 学的に許容しうる組成物を調製するために、有効量の変異ｔ−ＰＡ（例えば、約 ０．５〜約５Ｍ９／ｊ１１りを適当量の担体とともに含有しているであろう。こ のｔ−ＦＡ組成物を非経口によって、またはそれを有効な形および量で血流に放 出させる他の方法で投与することができる。

本発明を実施する際に用いる変異ｔ−ＰＡ産物の臨床的投与に特に適した組成物 には、例えば滅菌水溶液または凍結乾燥タンパク質などの滅菌水和性粉末が含ま れる。通常、製剤中に適切な量の薬学的に許容しうる塩をさらに含んでいるのが 望ましいく通常は製剤を等張にするのに十分なＩＩ）。また、ｐＨ調節剤、例え ばアルギニン塩基、およびリン酸も十分な量で含有させて、適切なｐＨ（通常は ５，５〜７．５）を維持するのが普通である。さらに、水性製剤の貯蔵寿命ある いは安定性を改善するために、グリセロールなどの物質をさらに含ませるのが望 ましいこともある。このようにして、変異ｔ−ＰＡ製剤を非経口投与、特に静脈 内投与に適した形にする。

本発明の医薬組成物の用量および望ましい薬物濃度は、意図している具体的な使 用に依存して変わるであろう。例えば、深静脈血栓または末梢血管障害の治療に おいては、通常、約０．０５〜約０．３π９／に？のオーダーの「ポーラス」用 量が好ましく、それに続く投与を約０．１〜約０．２ｘ９／に９のオーダーで行 ってほぼ一定の血液レベル（好ましくは約３μ２ｇ／ｍｃのオーダーで）を維持 するのが好ましい。

しかし、注入法を利用することができないのが普通である救急医療機関に関連し て使用するためには、対象の疾病が通常は危機的な性質のものであるため（例え ば、塞栓、梗塞）、通常、若干高い初期用ｊｌ（例えば、０．３ｏ／に９のオー ダーの静脈内ポーラス）を与えるのが望ましいであろう。

例えば、本発明のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を、心臓血管系の障害 または症状に苦しんでいる対象に非経口投与してもよい。用量あるいは投与速度 は、他の心臓血管の血栓溶解剤の臨床的研究において現在用いられているものと 同様であってよいく例えば、心筋梗塞、肺塞栓などに苦しんでいる患者において は１，５〜１２時間にわたって静脈内または動脈内用量として約１〜２　ｚ９／ 　ｋｙ体重）。

適当な剤形の例を１つ挙げると、５０業９のヒト組織型プラスミノーゲン活性化 因子、アルギニン、リン酸およびポリソルベート８０を含有するバイアルを５０ １の注射用滅菌水で復元し、適切量の０゜９％塩化ナトリウム注射液と混合する 。

本発明のヒ）４４１１織型プラスミノーゲン活性化因子の延長された半減期は迅 速なｉ、ｖ、注射に適している。これにより、複雑な投与法の必要性がなくなり 、限定された医療装置の状況下において、例えば準医療従事者が配置されている 救急車においてｔ−ＰＡを使用する機会が増加する。また、ヒト組織型プラスミ ノーゲン活性化因子の延長された半減期はより低い、より安全な初期用量をも可 能にし、４５分またはそれ以上にわたって血栓溶解に有効な血漿レベルを維持す ることができる。さらに、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のより長い半 減期は、成功裏の迅速な血栓溶解に続く再閉塞を避けるために必要となることも ある低用量の長期治療に、または末梢血管閉塞の場合に必要となることもある長 期の血栓溶解に有用であろう。

第１Ａ〜ＩＣ図は、推定のプレ配列領域（アミノ酸−３５〜−１）並びに５°お よび３°境界配列を含む、完全長のヒトｔ−Ｆ　Ａ　（アミノ酸１〜５２７）の 核酸配列および対応のアミノ酸配列を示すものである。

第２図は、デス（１−４４）ｔ−ＰＡ変異体をコードしている突然変異プラスミ ドを得るのに採用した工程を図式的に示すものである。

第３図は、還元剤の存在下および非存在下で、天然のｔ−ＰＡの移動度をデス（ １−４４，）変異ｔ−ＰＡＯものと比較したポリアクリルアミドゲルを示すもの である。

第４図は、プラスミン特異的な基質Ｓ−２２５１を用いて、インビトロでデス（ １−４４）ｔ−ＰＡおよび天然ｔ−ＰＡのフィブリン刺激を比較するものである 。

第５図は、天然ｔ−Ｆ　Ａのフィブリン結合活性（無傷のフィブリン、口；およ びプラスミン分解したフィブリン、−）をデス（１−４，４）ｔ−ＦＡのもの（ 無傷のフィブリン、Ｏ；およびプラスミン分解、・）と比較するものである。

第６図は、デス（１−４４）ｔ−ＰＡ（Ｎ４４）のインビボでの血栓溶解活性を 天然ｔ−ＰＡ（ＲＩ　Ｋ）のものとウサギで比較するものである（それぞれｎ＝ ＝１３．　５＋＋ｓ、Ｉ）、）。

第７図は、天然ｔ−ＰＡおよびデス（１−４４）ｔ−ＰＡ変異体をそれぞれ０． ３および０．０６４　ｚｆ／ｋｇの用量で、１０％ポーラスとして投与し、続い て残りを９０分間にわたって注入することによって投与したときの天然ｔ−ＰＡ の溶解速度（０）をデス（１−４４）ｔ−ＰＡ変異体のもの（・）と比較するも のである。

第８図は、０．３＋ｇ／ｋｐの天然体または０．０６４大９７に９のＮ４４変異 体を１０％ｘｇ／ｋｇポーラスとして投与し、残りを９０分間にわたって注入し たときに得られる血漿濃度の経時変化を比較するものである。

第９図は、非放射活性のｒｔ−ＰＡを担体として用い、Ｎ４４の薬動力学を天然 ｔ−Ｐ　Ａ　（ｒｔ−Ｐ　Ａ）のものと比較するものである。

第１０図は、Ｎ４４を担体として用いるＮ４４の薬動力学を示すものである。

第１１図は、プラスミドｐＨ５４がどのように調製され得るがを図式的に示すも のであり、また、その部分的な制限マツピングを示すものである。

第１２図は、プラスミドｐＨ５４がコードしているデス１−４４Ｇ１ｕ２７５　 ｔ−ＰＡ突然変異体の配列を示すものである。

第１３図は、種々のドメイン欠失突然変異体、成長因子欠°失デス４４−８４（ ｒｄ−ＧＦＪ　）、クリングル１欠失デス９２−１．７９　（ｒｄ−に１」）、 クリングル２欠失デス１７４−２６１（ｒｄ−に２Ｊ）、および対照としての天 然ｔ−ＰＡ（ｒｒｔ−ＰＡＪ　）のウサギにおける薬効力学プロフィールを示す ものである。

第１４図は、フィンガー欠失デス１−４４を含む種々のドメイン欠失突然変異体 く第１３図参照）のフィブリン結合特性を、結合％対フィブリン（フィブリノー ゲン）濃度で示すものである。

好ましい態様の詳細な説明 Ｉ−喰Ａ五 ヒトおよびその他の動物において、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ Ａ）はフィブリン血餅の溶解において本質的な役割を演じる［例えば、ベルスト レートおよびコレン（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ　ａｎｃｌ　Ｃｏｂｌｅｎ、　１９ １１１６．　Ｂｌｏｏｄ、　６７：　１４２５）を参照］。ｔ−ＰＡはプラスミ ノーゲンをプラスミンに変換することによってフィブリン溶解を開始させるセリ ンプロテアーゼである。ｔ−ＰＡは、他のタンパク質と配列を同じ（するいくつ かのドメインからなり、それぞれのドメインがこの多機能タンパク質に特定の機 能を付与しているものと仮定されている［例えば、ベニ力ら（Ｐｅｎｎｉｃａ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ２．　Ｎａｔｕｒｅ、　３０１　：　２１４）　：バニャ イら（Ｂａｎｙａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　　１９８３．　ＦＥＢＳ　Ｊｅｔｔ、、 　　１６３：　３７）を参照］。

プロテアーゼドメイン（残基２７６〜５２７）の機能だけが明白に定義されてい る。この発見は、第１に他の既知のセリンプロテアーゼとで観察された配列相同 性に基づいていた。もっと最近になって、ｔ−ＰＡの２本鎖形の限定された還元 によりて、このプロテアーゼ領域を機能的に調べることおよび直接的な単離が可 能になった［リジケンおよびグレネベルド（Ｒｉｊｋｅｎ　ａｎｄ　Ｇｒｏｅｎ ｅｖｅｌｄ、　１９８６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　２６１　：　３０ ９Ｂ）　；　トッドら（Ｄｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ、、　　１９８６．　Ｔｈｒｏｍ ｂｏｓ、Ｅａｅ＋ｃ。

５ｔａｓ、、　　５５　：　　９４）コ。

しかし、フィンガードメイン（例えば、第１Ａ〜ｌｃ図を参照；フィブロネクチ ンのタイプ１フインガー領域と相同である残基１〜４４）、成長因子ドメイン（ 残基４５〜８９；これはウロキナーゼ、因子■、因子ＸおよびプロティンＣの成 長因子領域並びに表皮成長因子に相同である）、および２つのクリングルドメイ ン（残基９２〜１７３および１８０〜２６１；これらはプラスミノーゲン、プロ トロンビン、ウロキナーゼおよび因子廟のクリングル領域と相同である）の正確 な機能は今のところわかっていない。バニャイら（上記）は、ｔ−ＰＡでの限定 されたタンパク質加水分解試験およびフィブロネクチンのフィブリン親和性の原 因であるフィンガードメインとの配列相同性を用いて、アミノ末端のフィンガー ドメインがｔ−ＰＡのフィブリン親和性の原因であることを示唆した。他では、 イチノイズら［Ｉｃｈｉｎｏｉｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｊ、Ｃｌ１ ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　７８：　１０３コは、限定されたタンパク質加水分解お よびプラスミノーゲンのフィブリン親和性の原因であるクリングルドメインとの 配列相同性を用いて、ｔ−ＰＡの第２のクリングルドメインがフィブリンとの相 互作用の原因であることを示唆した。

部位特異的な突然変異誘発は、対応する基本の遺伝子配列の選択的な削除によっ て、特定タンパク質の所望の部分の選択的な削除を可能にする方法である。得ら れた突然変異体を機能的に調べることと組み合わせると、この方法はそれぞれの ドメインの機能または機能群を解明することを可能にする。例えば、バングら［ Ｂａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、　Ｃｌ１ｎ、Ｒｅｓ、、　３３：８７８Ａ］はこの方法を用いる予備 的な研究を行い、フィンガーおよび成長因子ドメインがフィブリンによる活性の 最大の刺激およびフィブリン結合に十分であることを示した。対照的に、ゾンネ ベルドら［ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　ａｔ　ａｌ−＋　１９８６．Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｃｌ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３　：　４６７０］は、一 時的な発現系および未精製の上溝を用いて、第２のクリングルドメイン並びにそ れより程度は少ないがフィンガーおよび成長因子ドメインがフィブリン結合の原 因であることを示した。しかし、カギタニら［Ｋａｇｉｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８５．　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、、　１８９：１４５３は、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞から残基５０〜５２７をコードしている天然ｔ−ＰＡのｃ　Ｄ　Ｎ　 Ａを単離し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）で発現させた後にタンパク質の特徴を調べ た。他の研究者らの結果とは対照的に、彼等は、フィンガードメインと成長因子 ドメインの一部を欠くこの突然変異体がフィブリンと結合しないことを見い出し た。

ベルハイジエンら［Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯ５，３５２ ５（１９８６）］は、】またはそれ以上のドメインを欠く一連のｔ−ＰＡ変異体 を調製した。

彼等は、フィブリンが低濃度であるところでプラスミノーゲンが存在しないとフ ィンガードメインの除去によってフィブリン結合が有意に減少するが、しかし、 フィブリンが高濃度であるところで第２のクリングルドメインが存在すれば有意 な結合を確実なものにするのに十分であるようであることを見い出した。また、 プラスミノーゲンの存在下では、クリングル２ドメインが低濃度のフィブリンの ときに重要になる。さらに、彼等は、クリングル２ドメインだけがフィブリンに よる活性の刺激に関与していると結論した。

従って、種々の構造ドメインの機能的な意義について、特に天然ｔ−ＰＡのＮ− 末Ｄ％ｊフィンガードメインによって演じられる役割については相当な混乱およ び不明確さが存在していた。しかし、本発明に基づき、フィンガー、成長因子ま たはクリングル１ドメインのいくつかの他の可能性ある薬理学的特性の中で、こ れらのドメインがｔ−ＰＡタンパク質中に存在していることは明らかに天然ｔ− ＰＡの短い半減期に直接関係していると明確に開示することができる。特に、フ ィンガー、成長因子またはクリングル１領域が除去されると（例えば、フィンガ ー領域の除去の場合、天然ｔ−ＰＡの最初の４４アミノ酸の除去によって例示さ れるような除去）、天然ｔ−ＰＡおよびその関連の分子内構造についてこれまで 知られていた内容に照らして、驚くべきかつ予想外の薬効力学的性質を示す変異 ｔ−ＰＡタンパク質が得られることを開示することができる。

Ｉ［、ｔ−ＰＡ変異体の製造 上述のように、組換え法が本発明方法で用いるｔ−ＰＡ変異体の製造に好ましい 。特に、組換えＤＮＡ法を用いて、例えば部位指向性の欠失突然変異誘発により 、１個または多数のアミノ酸の置換、削除、付加および取替によって種々に修飾 されたヒ）　ｔ−Ｐ　Ａ欠失突然変異体を製造する。これに包含されるのは、フ ィンガー領域の全部または一部が削除されているが、なお以前に記載（例えば、 ＬＩＫ特許Ｎ　ｏ、　２．１１９．８０４を参照：参考のために挙げた）されて いるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の一般的な特徴であるセリンプロテア ーゼ領域およびクリングル領域（群）を保持しているｔ−ＰＡ欠失変異体の製造 であろうが、他にフィンガー領域の除去または変性によって修飾された変異体の 製造も含まれるであろう。

本方法の実施の際に用いる特異的な欠失に関連して、本明細書で用いる「ヒト組 織プラスミノーゲン活性化因子」、「ヒトｔ−ＰＡＪまたは「天然のｔ−ＰＡＪ は、プロテアーゼ部分を含有する、生物活性形の、微生物または細胞培養系によ って産生されるヒトの外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子を指し、微 生物または細胞培養系によって産生されることを除けばヒト組織に固有の組織プ ラスミノーゲン活性化因子に対応するものであることは当業者には理解されよう 。本発明で得たヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質は、決定された ＤＮＡ遺伝子および演鐸によるアミノ酸配列によって定義される（第１Ａ〜ＩＣ 図参照）。個体が異なれば天然のアレル変異が存在し、生成することはわかるで あろう。これらの変異は、全配列中のアミノ酸の相違によって、即ち該配列中の アミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加によって示すことができる。

さらに、グリコジル化の程度および位置は宿主細胞環境の性質に依存する。

ｔ−ＰＡの生物学的な機能的等個物として特徴付けられるヒト組織プラスミノー ゲン活性化因子の誘導体ということになるこれらすべてのアレル変異および修飾 は本発明の範囲内に含まれ、また、本質的かつ特徴的なヒト組織プラスミノーゲ ン活性化因子の活性が実質的に影響を受けないままである限り、物理的および生 物学的に類似している他の関連のヒト外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化 因子も含まれる。さらに、タンパク質の基本の生物学的機能を変えることなくア ミノ酸配列にある種の変更を加えることもできることが知られている。例えば、 ２つの交換されるアミノ酸のハイドロバシ−・インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔ ｈｉｃ　１ｎｄｅｘ）の関係に基づいてアミノ酸を種々の他のアミノ酸と交換し うろことが知られている。

ｔ−ＦＡと同様、本発明の変異ｔ−ＰＡは、通常、次のように製造される：即ち 、（１）その最初のアミノ酸がメチオニンであるように（構造遺伝子の前にＡＴ Ｇ開始シグナルコドンを挿入することによって供与される）、または（２）メチ オニンが細胞内または細胞外で切断され、その通常の第１アミノ酸を有するよう に、または（３）そのシグナルポリペプチドまたは通常のシグナルポリペプチド 以外のコンジ一ゲートしたタンパク質とともに（このシグナルポリペプチドまた はコンジユゲートは細胞内または細胞外の環境で特異的に切断され得るものであ る）、または（４）無関係かつ余分なあらゆるポリペプチドを切断することを必 要とせずに成熟形で直接発現させることによって製造される。与えられた宿主が シグナルペプチドを効率的に除去することができないか、または除去することが です、発現媒体が組織プラスミノーゲン活性化因子とそのシグナルペプチドを一 緒に発現するように設計されているときには、この後者が特に重要である。

いずれにしても、上記のように種々の形態で製造したヒト変異ｔ−ＰＡを回収し 、種々の血管症状または障害の治療に用いるのに遇巳だレベルまで精製する。

さらに、ｔ−ＦＡは１本鎖（非プロテアーゼ耐性１本鎖）タンパク質および２本 鎖タンパク質の両方を含む形態を有している。この後者は、タンパク質加水分解 によって非耐性１本鎖化合物から誘導される。この２本鎖はプラスミノーゲンが プラスミンに変換される場所で生成すると考えられている。本発明は、変異１本 鎖タンパク質（プロテアーゼ耐性であるか否かを問わない）を投与、または２本 鎖タンパク質（活性であることが示されたタンパク質）を投与することを提供す るものである。２本鎖タンパク質は、非耐性の１本鎖物質が得られた後にインビ トロでのタンパク質加水分解による変換によって製造することができる。いわゆ る「クリングル」領域はセリンプロテアーゼ部分から上流に位置しており、本発 明の組織プラスミノーゲン活性化因子のフィブリンマトリックスへの結合におい て、従ッて、実際の存在する血栓に対する本発明の組織プラスミノーゲン活性化 因子の観察される特異的な活性において重要な機能を演じるものと考えられる。

本発明の組織プラスミノーゲン活性化因子は天然物質に対応する酵素的に活性な 部分を含有して製造され、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子なる用語は、そ のようなタンパク質だけを含有するか、または完全長の分子に違する追加のアミ ノ酸配列とともに含有する産物を意味する。

本発明によって製造される変異ヒ）ｔ−ＦＡの状態を表すのに用いる「実質的に 純粋な形態」は、非組換え細胞によって、即ちその「天然の」環境において製造 されたときにヒトｔ−Ｆ　Ａに通常随伴するタンパク質またはその他の物質を含 まないことを意味する。

ｒＤＨＦＲタンパク質」は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）に関連する活性 の能力があり、従ってヒボキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培地（− ＨＧ　Ｔ培地）で生存する能力がある細胞によって産生されることが必要なタン パク質を指す。通常、ＤＨＦＲタンパク質を欠く細胞はこの培地で増殖すること ができず、ＤＨＦＲタンパク質を含む細胞はうまく増殖する。この理由で、本発 明の組換えベクターにＤＨＦＲ−暗号配列を含ませると、成功裏に形質転換した 宿主を選択する方法が可能になる。

ｒＭＴＸに感受性の細胞」は、ＤＨＦＨの阻害物質であるメトトレキセー）（Ｍ ＴＸ）を含有している培地で増殖することができない細胞を意味する。即ち、ｒ ＭＴＸに感受性の細胞」とは、遺伝子的に変えるか、または別の方法で追加しな ければ、ＭＴＸ濃度が０゜２μ９／ｘＱまたはそれ以上であるときにこの細胞型 に適した周囲および培地条件のもとでは増殖できない細胞である。細菌などのあ る種の細胞は、それらが他ではこの薬物に対して感受性であるＤＨＦＲを含有し ているときであっても、それらが細胞境界の内側にＭＴＸを入れさせないことに よりＭＴＸ感受性を示さない。即ち、ＤＨＰＲを含有する細胞は、通常、それら がＭＴＸに対して浸透性であるか、またはＭＴＸを取り込むことができるときに だけ、メトトレキセートに対して感受性となる。

「野生型ＤＨＦＲＪは、問題にしている特定の生物において普通に見い出される ジヒドロ葉酸還元酵素を意味する。通常、野生型ＤＨＦＲはインビトロで低濃度 のメトトレキセートに対して感受性である。

「発現ベクター」は、それに含まれているＤＮＡ配列を発現させることができる ベクターを包含し、ここで該配列はその発現を可能にする他の配列と機能的に結 合している。必ずしも明快に記述されるものではないが、これらの発現ベクター はエビソームとして、または染色体ＤＮＡの組込み部分として宿主生物中で複製 可能なものでなければならないことも意味する。複製可能であることが欠如して いるとそれらを効率よく操作できないことになることは明らかである。つまり、 「発現ベクター」には機能的な定義が付与され、それに配された特定のＤＮＡ暗 号を発現させうるあらゆるＤＮＡ配列がこの用語に含まれる（それが特定の配列 に適用されるので）。一般的には、組換えＤＮＡ法に利用される発現ベクターは 、「プラスミド」（これは環状の２本鎖のＤＮＡ環を指し、それらのベクター形 では染色体に結合していない）の形態であることが多い。プラスミドが最も普通 に用いられるベクターの形態であるので、本明細書では「プラスミド」と「ベク ター」を交換可能に用いる。しかし、本発明は、等伍な機能を与え、本発明後に 当分野で既知となる、他の形態の発現ベクターをも包含するものである。

「組換え宿主細胞」は、組換えＤＮＡ法を用いて構築されたベクターで形質転換 された細胞を意味する。本明細書中に明記したように、変異ｔ−ＰＡはこの形質 転換によって達成される量で産生され、この量は、形質転換されていない宿主に よって産生されるかもしれない量よりも少ない量ではなく、またもっと普通には 検出可能な量よりも少ない量ではない。そのような細胞によって産生されるｔ、 −ＰＡを「組換えｔ−ＰＡＪと呼ぶことができる。

本明細書で用いるｔ−Ｐ　Ａまたは変異ｔ−ＰＡの「生物学的な機能的等個物」 は、天然配列（または対応する変異配列）、例えば第１Ａ〜ＩＣ図に示されてい るような配列が、同様の生物学的機能を有する配列で置き換えられている天然ま たは変異ｔ−ＰＡを意味する。例えば、カイトら［Ｋｙｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　 　（１９８２）、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　１５７：　１０５］は、ある種 のアミノ酸を類似のバイトロバシー・インデックスまたは値を有する他のアミノ 酸に置換することができ、なお類似の生物学的活性を保持することができること を見い出した。以下に挙げる表に示すように、アミノ酸はその疎水性および荷電 性に基づいてバイトロバシー・インデックスが割り当てられる。アミノ酸の相対 的なノルイドロバシーの性質は得られるタンパク質の二次構造を決定し、続いて タンパク質とその受容体の相互作用を規定するものと考えられている。ｔ−ＰＡ の場合、類似のバイトロバシー値を有するアミノ酸の置換によって、ｔ−ＰＡの 生物学的な機能的等価物を得ることができると考えられる。本明細書で用いるｔ −ＰＡまたは変異ｔ−ＰＡの生物学的な機能的等価物は生物学的活性についてで ある。従って、例えばバイトロバシー・インデックスが＋４．５であるイソロイ シンをバリン（＋４．２）またはロイシン（＋３．８）に代えて置くことができ 、なお同様の生物学的活性を有するタンパク質を得ることができる。これとは全 く対照的に、リジン（−３，９）をアルギニン（−４゜５）などに代えて置くこ とができる。通常、アミノ酸が置換アミノ酸のバイトロバシー・インデックス単 位の約＋／−１の範囲の７％イドロバシー値を有していればアミノ酸をうまく置 換することができると考えられでいる。

アミノ酸　　　　　　　　　　バイトロバシー−フェニルアラニン　　　　　　 　　　　２．８システイン／シスチン　　　　　　　　　２，５グルタミン酸　 　　　　　　　　　　　−３，５グルタミン　　　　　　　　　　　　　−３， ５アスパラギン酸　　　　　　　　　−３，５ａ１部位特異的な欠失突然変異誘 発 上述のように、本発明のＴ　Ｐ　Ａ変異体は特異的な欠失突然変異誘発によって 製造するのが好ましい。本発明を実施する際に有用な欠失突然変異誘発は、目的 の欠失ジャンクション（接合点）ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドのＤＮＡ 配列をフードしている特異的なオリゴヌクレオチド配列を用いて十分な大きさお よび配列錯綜のブライマーとし、欠失ジャンクシ宜ンをまたぐ両側に安定な二重 らせんを形成させることによって最も容易に得られる。通常、長さが少なくとも ２７ヌクレオチドであるブライマーが好ましく、欠失箇所の５“側に約１０ヌク レオチド、そして３゛側に１７ヌクレオチドを有する。

従って、好ましいデス（］−４４）ｔ−ＰＡ変異体の製造用には、次の配列を有 するブライマーを用いるのが好ましい：ｇｌｌｌ ｅｒ ５’　　ＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧ　　３’ｔ −ＰＡ　　　　　ＰＡ４５ プレ配列 しかし、同様のＤ　Ｎ　Ａブライマーを用いることによって、あらゆる度合いの フィンガーの削除を行いうろことは明らかであろう。即ち、例えばフィンガー領 域の増加したカルボキシおよび／またはアミン末端部分をコードしている欠失突 然変異体用には、上記のブライマーを次の配列のブライマーなどに置換する：Ｉ Ｓ ５’　ＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＧＴＧＣＣＴＧＴＣ３’プレ配列　Ｐ Ａ４４ 即ち、全欠失（例えば、デス１−４４）から減少欠失（例えば、デス１−４３、 デス２−４３、デス２−４２など）まで、フィンガー領域の欠失を「歩く」こと によって、天然ｔ−ＰＡに比べて改善薬動力学パラメーターが変化し改良された 変異ｔ−ＰＡが得られる。このような種々の欠失変異体を調製するのに用いるこ とができる具体的な方法、試薬などは、デス（１−４４）ｔ−ＰＡをコードして いるプラスミドであるＣＶＳＶＰＡ−Ｎ４４（Ｄ２２）の開発を示す実施例に関 連して後述するか、または当分野で既知の方法による。

従って、ｔ−ＦＡ遺伝子の適切な欠失変異体は既知のｔ−Ｐ　Ａコード化ベクタ ーからこの一般的な方法によって調製することもでき、次いでこの欠失突然変異 体をさらに用いて適切な宿主を形質転換することができる。

ｂ、宿主細胞の培養およびベクタ一 本明細書に開示したベクターおよび方法は、広範囲のｉ核および真核生物にわた る宿主細胞で用いるのに適している。

一般に、本発明で有用なベクターを構築する際のＤ　Ｎ　Ａ配列のクローニング には原核生物が好ましいのは勿論のことである。例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏ］ｉ ）Ｋ　１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６）が特に有用である。使用する ことができるその他の微生物株には、大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣ ＣＮｏ、３１５３７）などの大腸菌株が含まれる。これらの例示が限定のためで はなく説明のためのものであることは勿論のことである。

原核生物を発現のためにも用いることができる。上記の菌株、並びに大腸菌Ｗ３ １１０（Ｆ−１λ°、原栄養性；ＡＴＣＣＮｏ、２７３３２５）、バシラス・サ ブテラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｕｓ）などのバシラス属、およびサ ルモネラ・チフイムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ） あるいはセラッチア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓａｎｓ） などのその他の腸内細菌科の細菌、および種々のシニードモナス種を用いること ができる。

通常、宿主細胞と適合する種から得たレプリコンおよびコントロール配列を含有 するプラスミドベクターをこれら宿主との関係で用いる。このベクターは、複製 部位、並びに形質転換された細胞において表現型による選択を与えることを可能 にするマーク配列を担持しているのが普通である。例えば、大腸菌は、大腸菌種 から得たプラスミドであるｐＢＲ３２２［例えば、ポリバーら（Ｂｏｌｉｖａｒ 　ｅｔ　ａ＋、。

Ｇｅｎｅ　２　：　９５　（１９７７））を参照］を用いて形質転換するのが普 通である。

ｐＢ　Ｒ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含 有しており、従って、形質転換された細胞を同定するための簡単な手段を与える 。また、このｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファー ジは、その自身のタンパク質を発現させるために微生物が用いることができるプ ロモーターを含有するか、または含有するように修飾されなければならない。

組換えＤＮＡの構築において最も普通に用いられるプロモーターには、Ｂ−ラク ターゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系［チャンら（Ｃｂａ ｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　！１ａｔｕｒｅ、　３７５　：　６１５　（１９７ｇ） ）　：イタクラら（Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９ ８：　１０５６　（１９７７））　；ゲデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｎａｔｕｒｅ　２８１　：　５４４　（１９７９））］およびトリプトファ ン（ｔｒｐ）プロモーター系［ゲデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、λｕ ｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　８　：　４０５７　（１９８０））　；　 Ｅ　Ｐ　Ｏ出願公開Ｎ　ｏ、　００３６７７６、］が含まれる。

これらが最も普通に用いられるが、その他の微生物プロモーターが発見され、利 用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公表されていて当業者 ならこれらをプラスミドベクターに機能的に連結することができる［例えば、シ ーベンリストら（Ｓｉｅｂｔｂｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　２０ 　：　２６９　（１９８０））を参照］。

原核生物に加えて、酵母培養物などの真核微生物を用いてもよい。

真核微生物の中ではサツカロマイセス・セレビジアセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅ）あるいは普通のパン酵母が最もよく用いられる が、多数の他の菌株も普通に用いることができる。サツカロマイセス中での発現 のためには、プラスミドＹ　Ｒ１）７　［例えば、ステインク；ンブら（Ｓｔｉ ｎｃｈｃｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８２　：　３９　（１９ ７９））　；キンゲスマンら（Ｋｉｎｇｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、 　７　：　１４１　（１９７９））　：チェンバーら（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　　１０　：　１５７　（１９８０））ｌがよく用い られる。このプラスミドはｔｒｐｌ遺伝子を既に含有しており、トリプトファン 中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株［例えば、ＡＴＣＣＮｏ。４４０７６ またはＰ　Ｅ　Ｐ　４．−１　（ジヲーンズ：　Ｊｏｎｅｓ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ、　８５　：　１２　（１，９７７））］に対して選択マーカーを与える。酵 母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐｌ欠損が存在すると、次に、トリプトファ ンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための効率的な環境が得られ る。

酵母ベクターにおける適当な促進配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ［ ヒッツェマンら（Ｅｉｔｚｅｌｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｌｌ、。

２５５　：　２０７３　（１９８０））］、またはその他の解糖酵素［ヘスら（ ｌｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、＾ｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、、　７　： 　１４９　（＋９６８））　；ホランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ　ｅｔａｌ、＋　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１７　：　４９００　（１９７Ｂ））］、例えばエ ノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロゲナーゼ、ヘキソ キナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコー ス−６−ホスフェート　イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート　ムターゼ、ピ ルベートキナーゼ、トリオセホスフェート　イソメラーゼ、ホスホグルコースイ ソメラーゼ、およびグルコキナーゼのためのプロモーターが含まれる。また、適 当な発現プラスミドを構築する際には、これらの遺伝子と関連した終止配列を、 発現ベクターの発現させようとする配列の３′に連結して終止およびｍＲＮＡの ポリアデニル化を付与する。増殖条件によってコントロールされる転写の別の利 点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロ ムＣ１酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、および前記のグリセル アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガ ラクトース利用の原因をなす酵素のプロモーター領域である。酵母−適合性のプ ロモーター、複製起源および終止配列を含有するあらゆるプラスミドベクターが 適している。

微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物も宿主として用いることができる 。原則として、を推動物または非を推動物培養物のいずれからであっても、これ らすべての細胞培養物を用いることができる。しかし、を推動物細胞が最も重要 であり、培養物（組織培養）中でのを推動物細胞の増殖は最近の数年間で常法と なった［Ｔｉ５ｓｕｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓ ｓ、　　Ｋｒｕｓｅ　　ａｎｄ　　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ編　（１９７３）コ。

このような有用な宿主セルラインの例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイ ニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルライン、ならびにＷ２Ｂ５、ＢＨＫ、Ｃ Ｏ３−７およびＭＤＣＫセルラインである。

このような細胞の発現ベクターは、通常、複製起源、発現させようとする遺伝子 の前に位置するプロモーターを、あらゆる必要なリポソーム結合部位、ＲＮＡス プライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネータ−配列とともに含 有している（必要なら）。

哺乳動物細胞で用いるためには、ウィルス性物質によって発現ベクター上にフン トロール機能が付与されることが多い。例えば、通常用いられるプロモーターは 、ポリオーマ、アデノウィルス２、および最も多くはシミアン・ウィルス４０（ ＳＶ４．Ｏ）から得られる。

５Ｖ４Ｑウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０のウィルス性複製 起源をも含有するフラグメントとして両方がウィルスから容易に得られるので物 に有用である［フィアーズら（Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　 ２７３：　１１３　（１９７ｇ））］。Ｈ４ｎｄｌ１１部位からウィルス性複製 起源中に位置するＢｇ１１部位まで延びる約２５０ｂｐの配列が含まれているな らば、それより小さいか、または大きい５Ｖ４Ｑフラグメントも用いることがで きる。さらに、目的の遺伝子配列に通常伴われるプロモーターまたはコントロー ル配列も、そのようなコントロール配列が宿主細胞系に適合するならば用いるこ とができるし、また用いるのが望ましいことが多い。

複製起源は、例えば５Ｖ４Ｑまたはその他のウィルス（例えば、ポリオーマ、ア デノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど）供給源から誘導される外来の起源を含むようにベク ターを構築することによって得ることもできるし、また、宿主細胞の染色体の複 製機序によって得ることもできる。ベクターが宿主細胞染色体に組込まれるとき には、後者が十分であることが多い。

変異ｔ−ＰＡおよびＤＨＰＲタンパク質の両方をコードしているＤＮＡ配列を含 有する本発明のベクターによるトランスフェクションのだめの好ましい宿主細胞 を選択する際には、用いられているＤＨＦＲタンパク質の種類に従って宿主を選 択するのが適当である。野生型のＤＨＦＲタンパク質が用いられているときには 、ＤＨＦＲを欠く宿主細胞、従ってヒボキサンチン、グリシンおよびチミジンを 欠ぐ選択培地での成功裏のトランスフェクシヨンのためのマーカーとしてＤＨＦ Ｒ暗号配列を使用することができる宿主細胞を選ぶのが好ましい。この場合の適 当な宿主細胞は、ウルラウブら［Ｕｒｌａｕｂａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７　：　４２１６　（１ ９８０）］の記載のようにして調製し、増殖させた、Ｄ）（ＦＲ活性を欠くチャ イニーズ・ハムス９−ｎ巣ｃｃ　ＨＯ）セルラインである。

一方、ＭＴＸに対して低い結合親和力を有するＤＨＰＲタンパク質をコントロー ル配列として用いるときには、ＤＨＦＲ欠損細胞を用いることは必要ではない。

突然変異ＤＨＰＲはメトトレキセートに対して耐性であるので、宿主細胞自身が メトトレキセード感受性であるならば、ＭＴＸ含有の培地を選択手段として用い ることができる。ＭＴＸを吸収することができる真核細胞のほとんどはメ）・ト レキセート感受性であるようである。そのような有用なセルラインの１つはＣＨ ｏライン、ＣＨＯ−Ｋ］（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣｌ２１）？ある。

満足な量のヒトｔ−ＰＡが細胞培養によって得られるが、第２の暗号配列を用い る工夫がなお一層の産生レベルの増強に有用である。

この第２の暗号配列は、メトトレキセートなどの外部からコントロールされるパ ラメーターによって影響されるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含有し、従 って、メトトレキセート（ＭＴＸ）濃度のコントロールによって発現のコントロ ールが可能である。

Ｃ１用いた方法 強力な細胞膜障壁を持たない細胞を宿主細胞として用いるときには、トランスフ ェクションは、グラハムら［（ｉｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５２　：　５４６　（１９７ｇ）］が記載しティるような リン酸カルシウム沈澱法によって行う。しかし、細胞中にＤＮＡを導入するため の他の方法、例えば核注入法またはプロトプラスト融合法などを用いることもで きる。

原核細胞または相当な細胞壁構造を有する細胞を用いるときには、好マシいトラ ンスフェクション法は、コーエンラ［Ｃｏｈｅｎ、Ｆ、！ｉ、　ｅｔａｌ、、　 Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９　：　２１１０　（１９ ７２）］が記載しているような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である。

目的の暗号配列およびコントロール配列を含有する適当なベクターの構築には通 常のライゲーシヲン（連結）法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラ グメントを、切断し、加工し、必要なプラスミドを得るのに望ましい形態にする 。

切断は、適当な緩衝液中、制限酵素（または酵素群）で処理することによって行 う。通常は、約１μ９のプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０μρの 緩衝液中、約１単位の酵素とともに用いる（特定の制限酵素のための適切な緩衝 液および基質量は製造元によって指定されている）。３７℃で約】時間のインキ 二ベート時間を用いることができる。インキユベートの後、フェノールおよびク ロロホルムによる抽出によってタンパク質を除去し、エタノールによる沈澱によ って水性分画から核酸を回収する。

平滑末端が必要であるときには、調製物を１５°Ｃで１５分間、１０単位のポリ メラーゼ１（フレノウ）で処理し、フェノール−クロロホルム抽出を行い、エタ ノール沈澱させる。

切断したフラグメントの大きさによる分離は、ゲデルら［Ｇｏｅｄｄｅｌ。

Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　８：　４ ０５７　（１９８０）コが記載している６％ポリアクリルアミドゲルを用いて行 った。

連結のために、正しい接続が得られるように適切に末端加工したほぼ等モル量の 所望の成分を、０．５μ９のＤＮＡあたり約１０単位のＴ４　　ＤＮＡリガーゼ で処理する（切断したベクターを構成要素として用いるときには、細菌性アルカ リホスファターゼで前処理することによって切断ベクターの再連結を防止するの が有用である）。

上述のように、本発明のｔ−ＰＡ変異体は、特異的な欠失突然変異によって得る のが好ましい。本発明の実施の際に有用な欠失突然変異は、所望の欠失ジャンク シ５ンのＤＮＡ配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドをコードしている特異 的なオリゴヌクレオチド配列を用いて十分な大きさおよび配列の複雑さを備えた 配列とし、欠失ジャンフシボンをまたぐ両側に安定な二重らせんを形成させるこ とによって最も容易に得られる。

構築したプラスミド中の正しい配列の確認用の分析のために、連結混合物を用い て大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、適切なところで 成功裏の形質転換体をアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性で選択する。形 質転換体からプラスミドを調製し、制限分析し、モして／または配列決定する［ メシングら（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、、　９　：　３０９　（１９８１））の方法によって、またはマクサム ら（Ｍａｘａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ＥｎｚｙＩＩｏｌｏ ｇｙ。

６５　：　４９９　（１９８０））の方法によって］。

約２０〜５００．０００ｎＭ２＃度のメトトレキセート（ＤＨＰＲ活性の競合阻 害物質）の存在下で宿主細胞培養物を増殖させることによって、ＤＨＦＲタンパ ク質暗号配列の増幅を行う。勿論、濃度の有効範囲は、ＤＩ（ＦＲ遺伝子、タン パク質の性質および宿主の特性に太き（依存する。一般的に指定した上限および 下限を確かめることができないのは明らかである。適切な濃度の他の葉酸類似体 またはＤＨＦＲを阻害するその他の化合物も用いることができよう。しかし、Ｍ ＴＸは都合がよく、入手が容易であり、効果的である。

以下に挙げる実施例において、好ましい態様は、本発明の実施および驚くべき有 用性を示すために発明者らによって行われた実験の形で記載されている。これら の方法が、本発明者らによって見い出された本発明の実施をうまく行うための方 法を示すものであり、従って、これらの実験がいかなる意味においても本発明の 利点を達成するための唯一の手段を示すものではないことは当業者の認めるとこ ろであろう。

実施例１　デス（１−４４）ヒトｔ−ＰＡ変異体の調製上で簡単に説明したよう に、天然ｔ−Ｐ　Ａのフィンガー領域に特異的な欠失を導入するための最も好都 合な方法は、基本のｃＤＮＡ遺伝子配列の部位−特異的な欠失突然変異誘発によ る方法である。この方法は、所望の新しい配列をコードしている１本鎖の合成「 ブライマー」配列を用いる。この新しいブライマーを、相補配列を有する１本鎖 の鋳型、通常は配列が削除されようとしている遺伝子をコードしている鋳型にハ イブリダイズさせる。ＤＮＡポリメラーゼを用いることによってこのブライマー を延長した後、ハイブリッド（雑種）分子を適当な宿主中で複製させる。

デス（１−４４）ｔ−ＰＡ突然変異体を調製するため、ｔ−ＰＡのｃＤＮＡ構造 遺伝子および３゛非翻訳化領域の一部をコードしている出発プラスミドを用いて 部位−指向性の欠失突然変異誘発を行った。このプラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６ （ＰＥＴＰＦＲとも呼ばれる）の調製、ならびに適切な宿主においてそれを発現 させるための条件および得られたタンパク質の精製は、ＥＰＯ出願公開Ｎ０１０ ９３．６１９（参考のために挙げた）に詳細に記載されている。この欠失を行う 際の工程図を第２図に示す。用いた基本的な方法はアデルマンら［Ａｄｅｌｍａ ｎ　ｅｔａｌ、、　１９８３．　ＤＮＡ　２：　１８３コ（参考のために挙げた ）が開示している。

プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６を５ｔｕｌおよびＥｃｏＲＩで消化して、アミノ 酸２０３までのｔ−ＰＡプレ配列をフードしている配列を含む８２６塩基対のフ ラグメントを放出させた。このフラグメントを、Ｓ＋ｎａｌ／ＥｃｏＲＩ消化し たＭ１３ｍｐｌＯＲＦ（複製型Ｍ１３ファージベクター）［例えば、メシングら （Ｍｅｓｓｔｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙ ｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ ｔ　ＤＮＡ、　Ｅｄｉｔｏｒ　Ａ、Ｗａ］ｔｏｎ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍ ｓｔｅｒｄａｍ　（ＩＨＩ））を参照］のベクターフラグメントと連結した。従 って、中間プラスミドｐｐ　Ａ−Ｎ　４４１ｎｔＡは、部位指向性の欠失突然変 異誘発によってアミノ酸１−４４のコドンが除去されようとしているｔ−Ｆ　Ａ 遺伝子の一部を含有している複製型のＭ１３ファージであった。

この突然変異誘発を行うために、フレアら［Ｃｒｅａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７ １ＬＰｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５　：　５ ７６５］のホスホトリエステル法などの方法によってオリゴヌクレオチドブライ マーを調製した。デス（１−４４）突然変異体を調製するために用いたブライマ ーは次のようであった： ｇｌ１１ ｅｒ プレ配列 このブライマーの１０個の５゛ヌクレオチドがプレ配列アミノ酸−３〜−１（ｇ ］ｙ−ａｌａ−ａｒｇ）をコードしており、一方、１７個の３′ヌクレオチドが アミノ酸４５〜４９　（ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＰＲＯ−ＶＡＬ−ＬＹＳ）をコードし ていることはわかるであろう。Ｂｇｌ１１部位を保持させるため、セ’）７−４ ５用にｒＴＣＴＪコドンを用いていることに注意が必要である。

約２００ｒｙの合成オリゴヌクレオチドを、約８ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナ ーゼを含む３０μｆｆの５０ｍＭ）リス−）（ＣＩ２（ｐＨ７，５）、１０ｄ　 ＭｇＣム、ｌＱｍＭジチオトレイトール、１＋ａＭＡＴＰ中、３７℃で３０分間 、ホスホリル化した。ペテロ２本鎖を形成させるため、１００ｒ＋９のホスホリ ル化したブライマーを含む約４０μｇの１０１トリス−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，５） 、１０ｍＭ　ＭｇＣｆｆ＊、　　１　ｍｌｌジチオトレイトール中で、約５０ｎ ｇの１本鎖ｐＰ　Ａ−Ｎ　４４１ｎｔＡを９５℃まで加熱しく１０分）、室温ま でゆっくりと冷却しく３０分）、次いで４℃まで冷却した。２！ＩＩＩＡＴＰ、 それぞれ０．２５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ。

ｄＡ、ＴＰＳｄＴＴＰ、５Ｕの大腸菌ポリメラーゼＩの大きい（フレノウ）フラ グメント、および４００ＵのＴ４．ＤＮＡリガーゼを含む１０℃ｇのりガーゼ緩 衝液を加えることによって、ブライマー延長を開始させた。１５℃で１時間の後 、この反応混合物を用いてＪＭＩＯ】細胞を形質転換した。

全ライゲーション混合物を２００ｕｆｆのコンビテン）ＪＭ１０］細胞と混合し 、次いで氷上で３０分間および３７°Ｃで５分間インキニベートすることによっ て形質転換を行った。次に、３．５３！ρの２Ｙ丁トップ（表層）寒天を５５℃ で、２００μｇのファージ飽和細胞、１０ｕＱのＩ　ＰＴＧ（２００＋ｅＭ）お よび５０℃ｇのＸガルと混合し、添加の後、薬物を含まない２ＹＴを入れたベト リ皿にこの細胞をプレートした。

無色のプラークを採取し、１００ｕ１２の２ＹＴ培地を入れた微量滴定器に移し た。この接種した微量滴定液を、８叶の２ＹＴ）ツブ寒天において６００μｇの ＪＭＩＯＩ細胞の菌叢を重ねた直径１５ＣｊＩのＬＢ寒天プレートに刻印し、３ ７℃で一部インキユベートした。生成したプラークを１分間の物理的な接触によ ってニトロセルロースディスクに移した。このニトロセルロースディスクを０． ５Ｍ　ＮａＯＨ−１，５Ｍ　Ｎａ（Ｊ！で３分間処理し、３Ｍ　ＮａＣｌ２−０ ．５に！　）リス−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，５）で１５分間洗浄しく２回）、次いで ２Ｘ　ＳＳＣで１５分間洗浄した。プレハイブリダイゼーシヲン混合物は、１１ ０１ｎトリス（ｐＨ７，５）、５ｄ　ＥＤＴＡ、０．９Ｍ　ＮａＣ（！、ＩＸデ ンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）　０　、５％ＮＰ４０．１１００ｕ　ＡＴＰ、ｌ ｉＭビロリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸ナトリウム、および５０ｕ９／宵（ｌ の大腸１１ｔＲＮＡを含有している。ＩＸＸノンルトは、１ρあたりに２００Ｒ ９のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、２００ｇ９のポリビニルピロリドン、２００ ＋ｙのウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ　；分画■）を含有している。ディスク を真空下、８０℃で９０分間加熱した。次いで、このディスクをペトリ皿中、６ 村のプレハイブリダイゼーシテン液とともに３時間インキ二ベートし、続いて５ Ｘ１０６ｃｐｍのラベルしたブライマーを加えて一部ハイブリダイズさせた。デ ィスクの選択的な洗浄を０．４．Ｘ５ＳＣを用いて４９℃で行い、風乾の後にデ ィスクをＸ−線フィルムに暴露した。ポジティブにハイブリダイズしたクローン をジデオキシ配列決定によってさらに分析した（アデルマンを参照：同上）。ポ ジティブなコロニーから、適切な欠失を含むｐＰ　Ａ−Ｎ　４４１ｎｔＡデルタ と命名した組換えプラスミドを選択した。

Ｍ］３ファージの突然変異遺伝子配列をＤＨＰＲ含有発現ベクター中の適切な発 現関係箇所に置き換えるため、プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ６を別々に消化し、Ｂ 　ｇｉｌｌ／　Ｋ　ｐｎ　Ｔにより、ＤＨＰＲ遺伝子をフードしている大きいフ ラグメントを単離し、そしてＢｓｔＸＩ／Ｋｐｎｌにより、天然ｔ−ＰＡの３“ 末端（アミノ酸４５〜５２７）をコードしている２２４ｏ塩基のフラグメントを 単離した。Ｎ　４．４突然変異を有する４００塩基のフラグメントをＢ　ｇｌ　 ＩＩ／　Ｂ　ｓｔＸ　Ｉによる消化によってｐＰ　Ａ−Ｎ　４４１ｎｔＡデルタ から単離し、ｐＰＡＤＨＦＲ６から誘導した２つのフラグメントとともに連結し た。従って、ＣＶＳＶＰＡ−Ｎ４．４　　Ｄ２２と命名したこの連結生成物は、 アミノ酸１−４４をコードしているコドンが除去されていることを除き、親のプ ラスミドｐＰＡＤＨＦＲ６のフビーであった。

実施例２　　ＣＶＳＶＰＡ−Ｎ４４．（Ｄ２２）ｊ：よるＣＨＯ細胞のトランス フェクシヨン 組ｍエフ５スミ）’ＣＶ　Ｓ　Ｖ　ＰＡ−Ｎ４４　（Ｄ　２２）を、上記のよう にして調製し、ＤＨＦＲ−ＣＨ○細胞中で発現させた。ＣＨＯ細胞を約７５％の 全面成長になるまで増殖させ、予めトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中でＲＮアーゼ処理 しておいた約２μ２のプラスミドＤＮＡ（約１／２の通常のミニスクリーン）を 用いてトランスフェクシｌンした。このＤＮＡを５０ｍＭ　ＣａＰＯ４／ＨＥＰ ＥＳにし、これを用いてグラハムら［Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７ｇ 、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５２：　５４６コの方法により細胞を普通にトランス フェクシヨンした。簡単に説明すると、１、　ＯＯｍｘの培養皿中の単層細胞か ら培地を除去し、１０％ＦＣＳを含む約５１Ｑのハム（Ｈａ＋ｎ）のＦ１２培地 で置換した。カルシウム沈澱させたＤＮＡを細胞上に置き、３７℃で２時間その ままにした。

約２時間後に、古い培地を除去し、１！ｌｉ！のシＮ−／り溶液（ＰＢＳ中の２ ０％グリセロール）を約４５秒間加えることによって、細胞にグリセロールシラ ツクを与えた。次いで、この細胞をＦ１２培地で洗浄してグリセロールを除去し 、新鮮な培地で約４８時間両培養した。この時点で、細胞を約１／１０に分け、 選択培地（ハムのＦ１２、Ｇ−Ｈ−Ｔ−１１０％の徹底的に透析したＰＯ５を含 む）に置き換えた。選択培地にプレートした後、デス（１−４４）ｔ−Ｐ　Ａの 調製に用いるときまで細胞を凍結させた。

実施例３　デス（１−４４）ヒトｔ−ＦＡの調製デス　１−４４　ｔ−ＰＡを上 記のようにしてチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨ○）細胞中で発現させた。

上清を集め、濾過し、アプロチニンの存在下、−２０℃で保存した。公知の方法 （例えば、ＵＫ特許Ｎｏ、　２．１１９．８０４　；　Ｅ　Ｐ　Ｏ出願公開Ｎ　 ｏ、　０４１．７６６、Ｎ　ｏ、　０９３．６１９またはＮｏ、　０．１９９． ５７４を参照；これらのすべては参考のために挙げた）またはモノクローナル抗 体カラムを用いて細胞上清からｔ−ＰＡを精製した。具体的には、形質転換した ＣＨＯ細胞を、回転ビン中、１０％Ｆ　Ｂ　Ｓ、　５００ｍＭ　ＭＴＸ、　２０ ０ｍＭグルタミン、２０ｍＭヘベス、１００ＩＪ／ｉＱベンーストレツプ（ｐｅ ｎ−ｓｔｒｅｐ）を含有するＦ１２培地で全面になるまで増殖させ、次いで培地 を血清不含培地に置換し、５〜６日間日間インベニベートけた。この細胞を分離 し、上清をＺｎキレート化カラム（例えば、ＥＰ○公開Ｎ　ｏ、　０．１９９． ５７４を参照）Ｉこ通し、２カラム容量の１ＭＮａＣ４，５０ｎトリス（ｐＨ８ ，０）で洗浄した。次いで、５０＋ｏＭイミダゾールを含む同一の緩衝液でｔ− ＰＡ変異体を溶離し、活性を有する試験管を集めた。

次に、この物質を２５ｄ）リス、０．５Ｍ　ＮａＣＱ　（ｐＨ８，０）中に透析 し、リジン−セファロースカラムに通した。２カラム容量の０、ＨＮａＣｆ２． ４０ｍＭ　ＮａＰＯ，で洗浄した後、５０ｄＮａＰＯ，，０，２Ｍアルギニン（ ｐＨ７，２〜７．４）で溶離した。リジン−アガロースからデス］、　−４４ｔ −Ｆ　Ａを溶出させるのに必要なアルギニンの濃度は正常配列のｔ−ＦＡを溶出 させるのに必要な濃度と同様であつたが、デス１−４４ｔ−ＦＡが結合するのを 確保するために、極めてゆっくりとカラムに入れる必要があった。

タンパク質濃度をＥＬＩＳＡで測定し、デス１−４４ｔ−ＰＡおよび正常配列ｔ −ＦＡの両方のアミノ酸分析に対して標準化した。タンパク質の純度および均質 性を、基本型のガス／液相シークエンサーによるＮ−末端配列決定によって、お よびレンムリ［Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０゜Ｎａｔｕｒｅ、　２２７　：　６ ８０］の緩衝系によるドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミド ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ−ＳＤＳ）によって分析した。通常は７〜１７％勾配の ゲルを用い、モリッセイ［Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、　　１９８Ｌ　＾ｎａ１．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、、　　１１７　：　：（０７’：ｌの銀−染色法によってタンパク 質を可視化した。同様の方法で天然配列のｔ−ＰＡを発現させ、精製した。

同じ方法を用いてｔ−Ｐ　Ａおよびデス１−４４ｔ−ＰＡ・の両者を均質になる まで精製したが、それぞれのタンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥで予想の分子量を示 した。１本のポリペプチド鎖として合成されるが、非耐性の１本鎖ｔ−ｐＡをＡ ｒｇ２７５−１１ｅ２７６ペプチド結合のところで容易に加水分解して２本鎖形 を得ることができる。第３図は、還元剤の非存在下でｔ−ＰＡおよびデスｌ−４ ４ｔ−ＰＡの見掛けのＭｒがそれぞれ約６０，０００および５５，０００である ことを示している。２本鎖形のタンパク質がジチオトレイトールの添加によって 還元されたときには、ｔ−ＰＡは、約３５，０００ダルトンのバンドと約３０， ０００〜３４，０００ダルトンの拡散したバンドを示し、それぞれが分子のプロ テアーゼ部分（残基２７５〜５２７）、並びにアミノ末端フィンガー、成長因子 およびクリングルドメイン（残基１〜２７５）に対応している。デスｌ　−４４ ｔ−Ｐ　Ａは、Ｍｒ約３５．０００のバ：／）’と約２５，０００〜３０，００ ０の拡散ハントヲ示し、これらはｔ−ＰＡの場合と同一のプロテアーゼ部分、お よびｔ−ＰＡ中の対応のドメインより低分子量のアミノ末端ドメインに対応対す る抗体を用いるウェスタンプロットによって確認した。

両タンパク質試料のアミン末端配列決定によって、それぞれのタンパク質が残基 ２７６−２７８に対応するマイナー配列１−に−Ｇを有していることがわかり、 これらの試料が２本鎖形であることが示された。ｔ−ＰＡ試料中の他のメジャー 配列は５−Ｙ−Ｑであり、これは残基１〜３に対応している。デス１−４４ｔ− ｐＡ中のメジャー配列は５−ｖ−ｐであり、残基４５〜４７に対応しており、フ ィンガードメイン（残基１−４４．）が削除されていること、および突然変異タ ンパク質が発現され、新規なアミノ末端として残基４５で適切にプロセッシング されていることが確認された。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび配列分析の結果により、デス］　−４４１−ＦＡが予想 された分子量および配列を有する均質なタンパク質であることが確認されたが、 タンパク質の１つのドメインの削除が分子の残りの構造および折り畳みに有意の 作用を有していることもある。

分子の２次および３次構造を調べるための直接の試験法は利用できないが、限定 されたタンパク質加水分解が不適切に折り畳まれた分子を同定するのに有効であ ることがわかった。トリプシン処理したｔ−ＰＡおよびデス１−４４ｔ−ＰＡの 分解／ｆターンを比較すると、差異は観察されなかった（第４図）。デスｌ−４ ４ｔ−ＦＡ試料中の７ミノ末端ドメイン（第４図参照）はｔ−ｐＡ中の対応−ド メインより低い分子量を有しているが、デス１−４４　ｔ−Ｐ　Ａのプロテアー ゼドメインおよびアミン末端ドメインのいずれもトリプシンによるタンパク質加 水分解に対して比較的感受性ではなかった。一層高いトリプシンｔ−ＰＡ比、お よびキモトリプシンおよびペプシンのｔ−ＦＡに対するいくつかの比でのタンパ ク質加水分解により、タンパク質加水分解の速度に差がないことが示された。

実施例４　本発明のデス　１−４４　　ＧＬＵ　２７５　ｔ−ＰＡ変異体の組換 え産生のための発現ベクターの調製および利用１、プラスミドの構築 ａ、プラスミドｐＨ，５４ １）プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６ ブラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６（ｐＥＴＰＦＲとも呼ばれる）は、例えば欧州特 許出願公開Ｎｏ、　９３６１９（上記；参考のために挙げた）に記載のようにし て調製したく全体的な詳細については第１図を参照）。

このプラスミド、それ自体およびトランスフェクシ芽ンされたＣＨ○細胞の形態 のものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ町ン（Ａ　Ｔ　ＣＣ）［ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏ ｃｋｖｉｌ］ｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　１ｉｓＡコにそれぞれＡＴＣＣＮｏ、４０４０３およびＣ ＲＬ９６０６のもとて１９８７年１２月１５日に寄託されている。

２）　ブラｘミ）’ｐＣＶＳＶＰＡ−Ｎ４４　　Ｄ２２上記のようにしてプラス ミドｐＣＶＳＶＰＡ−Ｎ４４　　Ｄ２２を調製した。プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ −６（上記）を５ｔｕｌおよびＥｃｏＲｌで消化して、アミノ酸２０３までのｔ −ＰＡブレ配列をコードしている配列を含む８２６塩基対のフラグメントを放出 させた。このフラグメントを、Ｓｍａｌ／ＥｃｏＲＩ消化したＭ１３ｍｐｌＯＲ Ｆ（複製型Ｍ１．３ファージベクター）［例えば、メシングら（Ｍｅｓｓｉｎｇ 、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｌｌａｃｒｏｍ ｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｒ＋ａｎｔ　ＤＮＡ。

Ｅｄｉｔｏｒ　Ａ、Ｙａｌｔｏｎ＋　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ 　（１９８１））を参照］のベクターフラグメントと連結した。従って、中間プ ラスミドｐＰＡ−Ｎ４４ｉｎｔＡは、部位指向性の欠失突然変異誘発によってア ミノ酸１−４４のコドンが除去されようとしているｔ−ＰＡ遺伝子の一部を含有 している複製型のＭ１３ファージであった。

この突然変異誘発を行うために、フレアら［Ｃｒｅａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７ ｇ。

Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　７５　：　５７６ ５］のホスホトリエステル法などの方法によってオリゴヌクレオチドブライマー を調製した。デス（１−４４）突然変異体を調製するために用いたブライマーは 次のようであった： ｇｌｌｌ ｅｔ マ ５’　ＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡ　ＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧ　：（’ｔ −ＰＡ　　ＰＡ４５ プレ配列 このブライマーの１０個の５°ヌクレオチドがプレ配列アミノ酸−３〜−１（ｇ ｌｙ−ａｌａ−ａｒｇ）をコードしており、一方、１７個の３′ヌクレオチドが アミノ酸４５〜４９　（ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＰＩ？０−ＶＡＬ−ＬＹＳ）ヲ：ｌ− Ｆしていることはわかるであろう。Ｂｇｌ１１部位を保持させるため、セリン− ４５用にｒＴＣＴＪニドンを用いていることに注意が必要である。

約２００ｏの合成オリゴヌクレオチドを、約８ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナー ゼを含む３０μｌ！（７）５０ｍｌリス−ＨＣ（！（ｐＨ７，５）、１０ＭＭ　 ＭｇＣ４ｔ、　　１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍ１ｌＡＴＰ中、３７℃で３ ０分間、ホスホリル化した。ヘテロ２本鎖を形成させるため、１００ｎ９のホス ホリル化したブライマーを含む約４０μｇの１０ａＭ）リス−ＨＣ（！（ｐＨ７ ，５）、１０ＩｏＭＭｇ（Ｊｊ、、ｌｌ１１Ｍジチオトレイトール中で、約５０ ｎ９の１本鎖ｐＰ　Ａ　−Ｎ　４４１ｈｔＡを９５℃まで加熱しく１０分）、室 温までゆっくりと冷却しく３０分）、次いで４°Ｃまで冷却した。２＋ｎＭＡＴ Ｐ、それぞれ０．２５ｄのｄＧＴＰＳｄｃＴＰ。

ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、５ｔＪの大腸菌ポリメラーゼＩの大きい（フレノウ）フラ グメント、および４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む１０μρのリガーゼ緩衝 液を加えることによって、ブライマー延長を開始させた。１５℃で１時間の後、 この反応混合物を用いてＪＭＩＯ１細胞を形質転換した。

全ライゲージ１ン混合物を２００μｇのコンピテントＪＭ］、ＯＩ細胞と混合し 、次いで氷上で３０分間および３７℃で５分間インキニベートすることによって 形質転換を行った。次−に、３．５１ｆｆの２ＹＴトツプ（表層）寒天を５５℃ で、２００μＱのファージ飽和細胞、１Ｏμ（ｌのＩ　ＰＴＧ（２００ＩｏＭ） および５０ａ（ｌのＸガルと混合し、添加の後、薬物を含まない２ＹＴを入れた ベトリ皿にこの細胞をプレートした。

無色のプラークを採取し、１００μｇの２ＹＴ培地を入れた微量滴定器に移した 。この接種した微量滴定液を、８１ｇの２ＹＴ）ツブ寒天に６００μＱのＪＭＩ ＯＩ細胞の菌叢を重ねた直径１５ｃｍのＬＢ寒天プレートに刻印し、３７℃で一 部インキニベートした。生成したプラークを１分間の物理的な接触によってニト ロセルロースディスクに移した。このニトロセルロースディスクを０．５Ｍ　Ｎ ａＯＨ，ｌ。

５Ｍ　ＮａＣＱで３分間処理し、３Ｍ　ＮａＣｆｆ−０，５Ｍ　）リス−ＨＯｆ ｆ（ｐＨ７，５）で１５分間洗浄しく２回）、次いで２ｘ　ｓｓｃで１５分間洗 浄した。プレハイブリダイゼーシ璽ン混合物は、１０ＩＩＭトリス（ｐＨ７，５ ）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．９Ｍ　ＮａＣ（！ｖ　ＩＸＸシンルト０．５％ＮＰ ４０，１００μＭ　ＡＴＰ、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸ナトリ ウム、および５０μ９／１（ｌの大腸菌ｔＲＮＡを含有している。ＩＸＸシンル トは、１ｇあたりに２００ｘ９のフィコール、２０○に２のポリビニルピロリド ン、２００π？のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；分画Ｖ）を含有している。ディ スクを真空下、８０℃で９０分間加熱した。次いで、このディスクをベトリ皿中 、６ｘ（ｌのプレハイブリダイゼーシ璽ン液とともに３時間インキニベートし、 続いて５　Ｘ、　１．０　’ｃｐｍのラベルしたブライマーを加えて一部ハイブ リダイズさせた。ディスクの選択的な洗浄を０．４Ｘ　ＳＳＣを用いて４９℃で 行い、風乾の後にディスクをＸ−線フィルムに暴露した。ポジティブにハイブリ ダイズしたクローンをジデオキシ配列決定によってさらに分析した（アデルマン を参照；上記）。ポジティブなコロニーから、適切な欠失を含むｐＰ　Ａ−Ｎ　 ４４１ｎｔＡデルタと命名した組換えプラスミドを選択した。

Ｍｌ、３フアージからの突然変異遺伝子配列をＤＨＦＲ含有発現ベクター中の適 切な発現関係箇所に置き換えるため、プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ６を別々に消化 し、Ｂｇｌｌｌ／Ｋｐｎｌにより、ＤＨＦＲ遺伝子をコードしている大きいフラ グメントを単離し、そしてＢｓｔＸＩ／Ｋｐｎｌにより、天然ｔ−ＰＡの３“末 端（アミノ酸４．５〜５２７）をコードしている２２４ｏ塩基のフラグメントを 単離した。Ｎ４４（デス１−４４）突然変異を有する４００塩基のフラグメント をＢｇｌ１１／ＢｓｔＸＩによる消化によってｐＰ　Ａ−Ｎ　４４１ｎｔＡデル タから単離し、ｐＰＡＤＨＦＲ−６から誘導した２つのフラグメントと一緒にし て連結した。従って、ＣＶＳＶＰＡ−Ｎ４４　　Ｄ２２と命名したこの連結の生 成物は、アミノ酸１−４４をコードしているコドンが除去されていることを除き 、親のプラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６のコピーであった。

３）プラスミドｐＰＡ、ＤＨＦＲ−６２Ｃ９例えば、１９８７年７月９日出願の 米国特許出願Ｎ　ｏ、　０７１０７１．５０６およびその特許（上記を参照）に 記載されているようにしてプラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９を調製した。要 約すると、ヒトｔ−ＰＡＤＮＡをプラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６（ｐｊＴＰＦＲ とも称されている）およびｐＡ２５Ｅ１０から得た。これら２種類のｔ−ＰＡプ ラスミドの調製は欧州特許出願公開Ｎ　ｏ、　０９３６１９（上記）に記載され ている。

プラスミドｐＡ２５Ｅ１０は、ｔ−ＰＡ遺伝子の最後の５０８アミノ酸をコード している配列および７７２塩基対の３゛非翻訳化領域を含有している。このプラ スミドをＳ　ａｅ　ＩおよびＢｇｌｌｌで消化して７４４塩基対のフラグメント を得、これを既述のような常法によって単離した。このフラグメントはｔ−ＰＡ アミノ酸４１１〜５２７のコドンを含有しており、３”非翻訳化領域の一部を含 んでいる。

プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６はｔ−ＰＡの全構造遺伝子と３゛非翻訳化領域の 一部を含有している。このプラスミドを５ａｃＴおよびＢｇｌｌｌで消化して１ ，２３０塩基対のフラグメントを得、これを単離した。このフラグメントは、成 熟形ｔ−ＰＡの最初の４１０アミノ酸のコドンを含有している。

これらのフラグメントを常法により連結し、Ｂｇｌ、Ｉ＋で消化した。

完全な成熟ｔ−ＰＡ配列と３゛非翻訳化領域の一部のコドンを含有している１、 ９７４塩基対のフラグメントを単離した。２本鎖のＭ１３ｍｐ８（メシング；上 記）をＢａｍＨＩで消化し、Ｂｇｌｌ！消化したｔ−ｐＡとアニーリングしてＭ ｌ　３＋ｎｐ８ＰＡＢｇｌｌｌを得た。大腸菌ＪＭＩ０１細胞（ＡＴＣＣＮｏ、 ３３８７６）を、２本鎖複製型のＭ１３ａ＋ｐ８ＰＡＢｇｌｌｌで形質転換した 。１本鎖および２本鎖の（ＲＦ）型のＭｌ　３ｎｐ８　ＰＡ　Ｂｇｌｌｌは、こ の７７−ジで感染サセｔ：大ＦＡｍ　Ｊ　Ｍ　１０１細胞から単離することがで きる。１本鎖型をｔ−ＰＡの部位特異的な突然変異誘発に用いた。

ヒトｔ−Ｐ　Ａの構造遺伝子を部位特異的な突然変異誘発によって修飾し、適切 な種々の位置にアミノ酸置換を有するｔ−ＰＡを発現させた。例えば、フレアら （上記）の固相ホスホトリエステル法によって合成オリゴヌクレオチドを調製し た。このような部位特異的な突然変異誘発のために調製し、そして用いた合成ブ ライマーの１つを以以下に記載する方法を用いて合成ブライマーの突然変異誘発 配列を含有する別種ｔ−ｐ　Ａクローンを得た。通常の使用した方法はアデルマ ン（上記：参考のために挙げた）の方法である。例えば、上記のブライマーを用 いることによって３Ｍ１３ＲＦ２Ｃ９を調製した。

突然変異誘発を行ったｔ−ＰＡ遺伝子由来の精製Ｍ１３　ＲＦ　　ＤＮＡを大腸 菌ＪＭＩＯＩ細胞から調製した。次いで、突然変異誘発したｔ−ＰＡ、ｌ１７） ＤＮＡ配列を含有しているＤＮＡフラグメントを用いて、突然変異誘発ｔ−ＰＡ の発現ベクターを構築した。

５０Ｍ１の合成オリゴヌクレオチドを、８ＴＪのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ を含む１０ｕ０の５０１トリス−ＨＣ１２（ｐＨ７，５）、１０１Ｄ１１ｉ１ｓ ｈＣＱ２、ｌＱｍＭジチオトレイトール、ｌｎＭＡＴＰ中、３７℃で３０分間、 ホスホリル化した。プローブとして用いるため、ＡＴＰを６０ｉＣｉの［７”− Ｐ］−Ａ　Ｔ　Ｐ　（３０００μＣｉ／ｘモル：４００ｎ９の２４、−ｍｅｒあ たり約５０〜６０ｘ１０＠ｃｐＩ１１になる）に換えること以外は上記と同様に して４００ｎｆｌの合成オリゴヌクレオチドをホスホリル化した。ペラＣ２本鎖 を形成させるため、１０ｎ９のホスホリル化したブライマーおよび５０ｎ９のＥ ｅｏＲ１消化したＭ　１３ｍｐ８　Ｐ　ＡＢｇｌｌｌＲ，Ｆの大きいフラグメン トを含む４ｏｐｇの１０ｍＭトリス−ＨＣｏ、（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　Ｍｇ Ｃ１！、、ｌａＭジチオトレイトール中で、Ｉｏｎ９の１本鎖Ｍ１３ｒｒｌｐ８ ＰＡＢｇｌｌｌを９５℃まで加熱しく１０分）、室温までゆっくりと冷却した（ ３０分）。２＋ｅＭＡＴＰ、それぞれ０．２５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣ ＴＰおよびｄＡＴｐ、５ｕの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きいフラグメント 、ならびに４００ｔＪのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む１ｏｐ（ｌのリガーゼ緩衝液 を加えることによって、ブライマー延長を開始させた。１２℃で１時間の後、こ の反応混合物を用いて大腸菌ＪＭＩＯＩ細胞を形質転換した。

１０μＱのライゲーション混合物を２００μＣのコンピテントＪＭｌ○１細胞と 混合し、次いで氷上で３０分間および３７℃で５分間インキコベートすることに よって形質転換を行った。次に、３．５ｇｇの２　Ｙ　Ｔ　トｙブ寒天を５５℃ で、２００ｕＱの飽和ＪＭＩ　Ｏ１細胞、１０μｕ）Ｉ　ＰＴＧ（２０Ｃ）ｎｌ Ｎ）および５０ＩｌａのＸガルと混合し、形質転換細胞の添加の後、薬物を含ま ないＬＢを入れた９ｃｉのベトリ皿にプレートした。

無色のプラークを採取し、１００μｇの２ＹＴ培地を入れた微量滴定置に移した 。この接種した微量滴定液を、８肩ρの２ＹＴトツプ寒天に６００μｇのＪＭＩ ○１細胞の菌叢を重ねた直径１５ＣＲのＬＢ寒天プレートに刻印し、３７℃で一 部インキユベートした。生成したプラークを１分間の物理的な接触によってニト ロセルロースディスクに移した。このニトロセルロースディスクを０．５Ｍ　Ｎ ａＯＨ，、ｌ、５ｋｌＮａ（Ｊ！で３分間処理し、３ＭＮａＣρ−０，５Ｍ）リ ス−ＨＣｊ（ｐＨ７，５）で１５分間洗浄しく２回）、次いで２ｘ　ｓｓｃで１ ５分間洗浄した。プレハイブリダイゼーシヲン混合物は、１ｏＩＩＩＭトリス（ ｐＨ７，５）、５ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、０．９Ｍ　ＮａＣ（２，ＩＸＸシンルト０ ．５％ＮＰ４０，１００ｕＭ　ＡＴＰ、］＋ｎＭビロリン酸ナトリウム、ｌｌ１ １Ｍリン酸ナトリウム、および５０μｙ／　ｘ（ｌの大腸菌ｔＲＮＡを含有して いる。ＩＸＸノンルトは、１ｇあたりに２００πりのフィコール、２００即のポ リビニルピロリドン、２００ｍ９のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；分画Ｖ）を含 有している。ディスクを真空下、８０℃で９０分間加熱した。次いで、このディ スクをベトリ皿中、６！ｇのプレハイブリグイゼーション液とともに３時間イン キュベートし、続いて５、ｘ　１０”ｃｐｍのラベルしたブライマーを加えて一 部ハイブリダイズさせた。ディスクの選択的な洗浄をＱ、４．Ｘ５ＳＣを用いて ４９℃で行い、風乾の後にディスクをＸ−線フィルムに暴露した。ポジティブに ハイブリダイズしたクローンをジデオキシ配列決定によってさらに分析した（ア デルマンを参照；上記）。

ＢｇｌｌｌおよびＢｓｔＥＩＩによるｐＰＡＤＨＦＲ−６の消化によって生成し た大きいフラグメントを単離することによって、フラグメント１と命名したベク ターフラグメントを得た。ＢｇｌｌｌおよびＢｓｔＸＩによるｐＰＡＤＨＦＲ− ６の消化によって得られる４００塩基対のｔ−ＰＡフラグメントを単離すること によってフラグメント２と命名したフラグメントを得た。ＢｓｔＸＴおよびＢｓ ｔＥｌｌにより突然変異を−ＦＡクローン由来のＲＦ　　ＤＮＡ（上記）を消化 することによって、所望の突然変異を含む１．１４１塩基対のｔ−ＦＡフラグメ ント（フラグメント３）を得た。フラグメント１および２を各フラグメント３と 連結した。このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌を形質転換した。それぞれの形質転 換体から、それぞれの真核性発現ベクター、例えばｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９を 得た。

４）ｐｌ、１５４の最終的な構築 プラスミドｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｆ　Ｒを制限酵素Ｂｇｌｌ＋およびＡ、ｐａｌで消化 し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分画した。ｔ−ＰＡのプレプロ暗 号領域、ＳＶ４　Ｑ初期プロモーター、β−ラクタマーゼ、およびＤＨＦＲ遺伝 子を含有する６、Ｏｋｂのフラグメントをゲルがら切り出し、電気溶出させた。

ブ５７．ミ）’ｐｃＶｓＶＰ、Ａ−Ｎ４４　　Ｄ２２をＢｇｌｌｌおよび５ｃａ Ｔで消化し、フラグメントをアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、０．６３ｋ ｂのフラグメント［ｔ−ＰＡの成長因子、クリングル１およびクリングル２（一 部）ドメインの暗号配列を示す］を含有するバンドを切り出し、電気溶出した。

プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９を５ｅａｌおよびＡｐａｌで消化し、クリ ングル２（一部）およびプロテアーゼ（Ｇ１ｕ２７５突然変異を有する）ドメイ ンの暗号配列を含有する０、６３ｋｂのフラグメントをアクリルアミドゲル電気 泳動と電気溶出によって精製した。

このようにして単離し、精製した３種類のフラグメントを、Ｔ４Ｄ　Ｎ　Ａリガ ーゼおよびｒＡＴＰの存在下でインキユベートして、残基１−４４を欠き（フィ ンガードメイン欠失）、Ａｒｇ２７５−Ｇｌｕ突然変異（１本鎖突然変異）を導 入したｔ−Ｐ　Ａ分子をコードしている配列を含有するプラスミドｐＨ５４を得 た（第１１図を参照）。

実施例５　　ｔ−ＰＡの他のドメインの欠失変異体の調製７’５スミｌ’ｐｃＶ ｓＶＰＡ−Ｎ４４　　Ｄ２２の構築については、プラスミドｐＨ５４の調製の記 載に関連して上に詳述した。

同様に、部位指向性の突然変異誘発の実験については、プラスミドｐＰＡＤＨＦ Ｒ−６２Ｃ９の調製に関連して上に詳述した。

以下に示すオリゴヌクレオチドを用いる部位指向性の突然変異誘発によって、デ ス４４．−８４成長因子ドメイン欠失、デス９２−１７９クリングル１ドメイン 欠失およびデス１７４．−２６１クリングル２ドメイン欠失も行った： （三角記号は、削除された配列の部位を示す。）ｔ−Ｐ　Ａの暗号配列の大部分 を含有する突然変異誘発を１．４ｋｂＢｇ１１１／Ａｐａｌフラグメント（１本 鎖ベクターにおいて）において行ったこと以外は、上記デス１−４４構築と同様 の方法で発現プラスミドを調製した（第１１図参照）。また、基本的にデス１− ４４構築と同様の方法で、デス４４−８４およびデス９２−１７９突然変異体を Ｂｇｌｌｌ／　Ｓ　ｃａｌフラグメントで単離し、０．６３　ｋｂ　Ｓ　ｃａｌ ／　Ａ　ｐａｌフラグメント上のｔ−ＰＡのＣ−末端暗号配列およびＧｌｕ２７ ５突然変異と結合させることができ、こうして、上記のｐＨ５４に類似するプラ スミドを作成することができる。上記に従い、これらプラスミドを用いて適当な 細胞をトランスフェクションし、対応するｔ−ＰＡ変異体を得る。

実施例６　デス（１，−４４）ｔ−Ｐ　Ａのインビトロでのプロテアーゼアミド 分解活性の測定 プロテアーゼアミド分解検定におけるデス（１−４４）ｔ−ＦＡの活性を、Ｓ− ２２８８パラニトロアニリド色素生成基質［ヘレナ・ラブズ（ｌｌｅｌｅｎａ　 Ｌａｂｓ）３を用いて、天然ｔ−ＰＡと比較した。Ｓ−２２８８パラニトロアニ リド基質によって、プロテアーゼのアミド分解活性が直接測定される。Ｈ−Ｐダ イオード配列分光光度計（Ｈ−Ｐｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ　５ｐｅｃｔｒｏｐｈ ｏｔｏｏ＋ｅｔｅｒ、　Ｈ’Ｐ　８４５１−　Ａ）を用いて５−２２８８基質に よるｔ−Ｐ　Ａおよびデス１−４４．ｔ−ＰＡの動力学定数を測定した。タンパ ク濃度を０．０５Ｍ　ト’）　ス−ＨＣＱ、０．１２Ｍ　ＮａＣｆｆ、０．０１ ％トゥイーン（Ｔｈｖｅｅｎ）　８０からなる緩衝液（ｐＨ７，４）中で２３ｎ Ｍに一定に維持しながら、２種類の基質濃度（１、０ｘＭおよび０．１ｘＭ）で 基質の加水分解を継続して測定した。ミカエリス−メンテンの微分方程式と非直 線型回帰（ｎｏｎ−１ｉｎｅａｒ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を用いて、反応の経 過曲線からＫｍおよびｖ　ｍａｘを算出した。

デス１−４４　ｔ−ＰＡおよび正常配列のｔ−ＰＡは、小さい合成Ｓ−２２８８ 基質、Ｈ−Ｄ−インロイシル−し−プロリル−し−アルボ−１−フｐ−ニトロア ニリドを用いると、類似の特異活性を示した。第１表に示すように、２つの酵素 のｋｅａｔおよびＫＩｌｌは互いに実験誤差内であり、このことは、分子のプロ テアーゼ部分が正常な機能を有しており、フィンガードメインが低い分子量の基 質の加水分解に影響を及ぼさないことを示すものである。

第１表 Ｓ−２２８８を用いる野生型ｔ−ＰＡおよびデス１−４４　ｔ−ＰＡの動力学定 数 ｋｃａ、ｔ　　　　Ｋｍ　　　　ｋｃａｔ／Ｋｍ（ｓｅａ”）　　（ｘＭ）　　 （ｓｅｅ″１．１−１）野生型ｔ−ＰＡ　　　　　　１７．９　　０．３３　　 　５４．２デス１．−４４　　ｔ−ＰＡ　　　１７．Ｉ　　　　Ｑ、２８　　　 　６１．１ノーゲンの活性化の測定 ｔ−ＰＡおよびブラスミ／−ゲンを予めインキユベートし、次いで、プラスミン 特異的な基質Ｈ−Ｄ−バリルーＨ−ロイシル−Ｈ−リジン−ｐ−ニトロニリド（ Ｓ−２２５１）を添加することによって、インビ）ｃ検定で、ｔ−ＰＡがプラス ミノーゲンを活性化する能力を測定することができる。この反応の刺激物質とし て作用するフィブリン（フィブリノゲン）またはフィブリン（フィブリノゲン） のフラグメントの存在下でこの反応の最大速度を観察する。

２段階検定にプラスミン特異的な基質Ｓ−２２５１を用い、試料がプラスミノー ゲンを活性化する能力を測定した。０．０５Ｍ　トリス−ＨＣｌ２．０．１２Ｍ 　ＮａＣＱ、０．０１％トゥイーン８０の全ｊ１０゜１２ｉＣ（ｐＨ７，４’） 中、３７℃で３０分間、１Ｕのトロンビンを含有する０、０２πｇの２０χ９／ 　ｚ（ｌフィブリノゲン溶液でこの試料をインキユベートすることによってフィ ブリン血餅を作成した。別の方法として、トロンビンを加えずに刺激物質として フィブリノゲンを用いることもできる。次いで、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン溶液 、０．０３ｘＱの２．１巧／ｘρ溶液を添加した。３７℃で１０分の後、０．０ ３７Ｍトリス、０．８６ＮａＣＱ、、０．ＯＯ７％トゥイーン８０（ｐＨ７，４ ）中の０．３５１の２．８６ｘＭ　Ｓ−２２５１を添加した。この混合物を５分 間インキコベートシ、次いで、０．１１１２の５０％氷酢酸の添加によって反応 を停止させた。４０５ｎｍでの吸収を測定した。活性は、基質の存在下、１分間 につきｌｎｆ！当たりの吸光度の変化で示しこの検定は、フィブリン血餅を含ま ない別の試料と共に上述に従って行った。刺激は、フィブリンを含有する試料の 特異活性とフィブリンを含有しない試料の特異活性の比である。

種々の検定（第２表および第４図参照）において、フィブリンの存在下でデス１ −４４　ｔ−ＰＡを用いて得られた最大特異活性は、正常配列のｔ−Ｆ　Ａを用 いて得られた比の５０％よりわずかに大きかった。

ｔ−ＰＡおよびデス１−４４　ｔ−ＰＡの両方の活性は、フィブリンの存在下で 約５０倍に増大した。第２表において、“ｓｔｉｍ”の値は、フィブリノゲンの 存在下で観察される刺激をフィブリノゲンの非存在下での刺激と比較するもので ある。

フィブリン（フィブリノゲン）の存在下でプラスミノーゲンを活性化するデス１ −４４　ｔ−ＰＡの能力をさらに比較するために、フィブリン血餅を溶解するｔ −Ｐ　Ａおよび飽和プラスミノーゲンの能力を測定する検定においてｔ−ＰＡと 比較した。この検定において、デス１−４４１−ＰＡは、正常なｔ−ＰＡによっ て観察される活性の３５％だけを示した。これらの結果は、フィブリンと適切に 相互作用するデス１−４４　　ｔ−ＦＡ能力に欠損が存在することを示唆するも のである。

第３表 ｒ−ＰＡおよびデス１−４４　ｔ−ＰＡの活性ｔ−ＰＡ　　　デス１−４４　　 ｔ−ＰＡ血餅溶解（相対単位）　　１．０　　　０．１８リツケン等（Ｒｉｊｋ ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　　１９８２＋　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　２５ ７：２９２０）の方法の修飾方法を用いてデス１−４４　ｔ−ＦＡのフィブリン への結合を監視した。非特異的な吸着を防止するために、ＩＩｆ／ｘＱのヒト血 清アルブミン（ＪＥＭ　　リサーチ・インコーボレイテッド、ケンシントン、Ｍ Ｄから）の存在下、試料と、ヒトのプラスミノーゲン不含のフィブリノケンとを 混合した。全反応量はＩ！（であり、緩衝液は０．０５Ｍ）リス−ＨＣｆｆ、０ ．１．２Ｍ　ＮａＣｌ２．０゜０１％トウィーン８０からなっていた（ｐＨ７， ４）。１単位のトロンビン［シグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ｃｉｅａｌ　Ｃｏ 、、　　ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯルを加え、この混合物を３７°Ｃで１時間、 血餅化した。１０，００Ｑ　ｒｐｍで５分間遠心分離して血餅を物理的に除去し 、次いで、少量の上清を、活性検定またはＥＬＩＳＡによって残存ｔ−ＰＡ皿に ついて検定した。

結果を第５図に示す。デス（１−４，４）が非常に減少したフィブリン結合能力 を示すことが理解されよう。フィブリンとの結合は解離定数を得ることができな いほど弱いが、この解離は天然のｔ−ＰＡ（“ＲＩＫ”）よりも少なくとも１０ 倍高いものであると評価された。

したがって、フィブリン結合は、ｔ−ＦＡ活性の効力を維持するためには必要で はない。

実施例８　天然のｔ−ＦＡに対するデス（１−４４）　ｔ−ＦＡのインビボでの 血餅溶解活性 ウサギにおいてインビボ試験を行い、デス（１−４４）　ｔ−ｐＡ変異体に対す る天然のｔ−ＦＡ（ＲＩＫと称する）の用量応答を調べた。１−１２５フイブリ ノゲンで標識化した血栓を含む体外シャントを用いてウサギにおいて血栓溶解活 性を測定した。外部ヨウ化ナトリウム結晶によって測定した放射活性の消失によ って溶解を測定した。

野生型ｔ−ｐＡを１０％ポーラスとして投与し、残りの用量を次の９０分間にわ たって注入した。デス（１−４，４）ｔ−ＰＡは、０．０３＋９／に９ポーラス を用いる０、　０６４　Ｒｆｌ１ｋｇ０１回投与と、それに続く９０分間の０． ０３４　ｎ／ｋｇの注入によって試験した。９０分間の注入の最後に全ての溶解 を測定した。

第６図に示すように、インビボ検定において、デス（１−４４）ｔ−ＦＡ変異体 は、天然のｔ−Ｐ　Ａの標準誤差内で驚くほど高い血餅溶解活性を示した。この 発見は、溶解活性がＮ４４変異体の比較的低い溶解活性を反映するインビトロ検 定の結果に鑑みて、特に驚くべきことであった。しかし、このようなインビトロ 試験は、変異体の半減期の増大を考慮に入れていなかった。

第２のタイプの検定において、２つの種を、時間に対する溶解％によって比較し た。結果を、比較可能な溶解率を０．３ｕ／ｋｇの野生型ｒｔ−ＰＡ用量および ０．０６４ｘ９／に９のデス（１−４４）　ｒｔ−ＰＡについてグラフ化し、第 ７図に示す。デス（］−４４）変異体（Ｎ４４）の時間による活性は天然のｔ− ＰＡ（ＲＩ　Ｋ）の活性と非常に類似していることがわかるであろう。

第８図に、前述の研究からの２種類の型のｒｔ−ＰＡの血漿濃度の経時変化を示 す。等価な活性を有する両型のｒｔ−ＰＡを検出するポリクローナルＥＬＩＳＡ によって濃度を測定した。血液試料をＥＤＴＡで集め、ｒｔ−ＰＡの不可逆的抑 制物質であるＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−クロロメチルケトンを添加した： この抑制物質は、血漿プロテアーゼ抑制剤とのｔ−ＰＡコンプレックスのインビ トロ形成を遮断する。これらのコンプレックスは免疫反応性を有意に減少させた 。

Ｎ４４変異体は、非常に低い初期用量および全周１で天然ｔ−ＰＡよりも非常に 高い血漿濃度を生じた。

ウサギにおいて、比較薬動力学研究を行った。ｌ−１２５標識化した被験ｔ−Ｐ Ａ（天然型またはＮ４４変異体のいずれか、５μＣｉ／に９．５〜１０μＣｉ／ μ９の比活性を有する）および担体の野生型ｔ−ｐＡ（１，０ａｔｇ／ｂ）を同 時注射し、連続の血液試料を集め、血漿を調製し、モしてＴＣＡ（）リクロロ酢 酸）沈Ｒ量を各時間で測定した。

肝臓によるｔ−Ｐ　Ａの分解のゆえに比較的遅い時間に現れるあらゆる小さな代 謝産物を除去するためにＴＣＡ沈澱を用いた。ｒｔ−ＦＡの血漿濃度時間曲線は 、二指数方程式Ｃ−Ａ　ｅｘｐ（−ａ　Ｘ　ｔ）＋　Ｂ　ｅｘｐ（−βＸｔ）に 合致する。デス（１−４４）　ｒｔ−ＰＡの曲線は、−指数方程式Ｃ＝　Ａ　ｅ ｘｐ（−ａ　Ｘ　ｔ）に合致する。浄化（ＣＩ）を、式ＣＩ＝用ｊｌ／ＡＵＧ（ 式中、Ａｔ、ｌＣは血漿濃度時間曲線下の面積である）によって算出した。

得られた結果を下記第４表に示し、そして第９図にプロットしたが、この結果か られかるように、ウサギ試験システムにおいて、天然のｔ−ＰＡ紙試料ｒｔ−Ｐ Ａは、浄化速度約８．４　！ｉ２／分／ｋｇｃ標準偏差値約０．９２）および半 減期（ｔｌ／２ａ）約３．１分く標準偏差値約Ｏ９５５）を示した。

第４表 ウサギにおいて用量５ｕＣ／ｋｓの１−１２５　ｒＴ−ＰＡを１ｇ９／＆９のコ ールドｒＴ−ＰＡと同時注射したときの、Ｉｎ　２５　ｒＴ−ＰＡの静脈内ポー ラス投与の薬効力学パラメーター＃　Ａ　　　　＃　Ｃ＃　Ｅ　　　　＃　Ｇ　 　　平　均　標準偏差値ＢＯ３０１４４，３２０３２９２０，０３３２７００５ ，３０６３１３４０，９３Ｂ　３０３５２．６４９　２５０４゜４１５ｔｌ／２ ｂ　　　　　３３．２３６　　２３．９８７　　３１．．７８２　　２６．４６ ７　　２Ｂ、８６８　　４．３６５ｒｓｑ　　　　　　Ｏ，９７３０，９６３０ ，９９７０，９５９０，９７３０，０１７ＡＯ２４７９９０３０Ｇ０５９　　２ ５５９０４　　２９０８５２　　２７５２０１２７７４ｇ、８６８ｔ１／２ａ　 　　　　３．７１６　　２．６４５　　３Ｊ３４　　２．５７５　　３．０６７ 　　０．５５２ｒｓｑ　　　　　　Ｏ，９９９０，９９１０，９８３０，９７１ ０，９ｇ６　　０．０１２ＡＵＭＣ７８９，５１０４５２，９２５６３７，７１ ０５２５，８２ｇ　　６０１．４９３　１４６．５８３（罰／に９） ＣＬ　　　　　　　　　　　　　　フ、０６３　　　　　　９．２２２　　　　 　　８．５６７　　　　　　８．５７７　　　　　　８．３T７　　　　　　０ ．９１６ （籾／分／に９） しかし、下記第５表および第９図に示すように、デス（１−４４）変異体Ｎ４４ を用いると、浄化速度約０．４８１Ｍ分／に９（標準偏差値０．０２）および半 減期約５３．７分（標準偏差値６．５８）が観察された。

第５表 ウサギにおいて用量５μＣ／に９の１−１２５　Ｎ４４を１　ｕ／ｋｔｔのコー ルドｒＴ−ＦＡと同時注射したときの、Ｔ−１２５Ｎ−４４のポーラス投与の薬 効力学パラメーター ＃ｂ　　　　＃ｄ　　　　＃ｆ　　　　：ｈ　　平　均　標準偏差値ＡＯ２３４ １００２４５９００１ｇ３０００　　２０２３００　　２１６３００２８ｇ？０ ．０００］ａＩＩｌｄｂａ０　０．０１４　　　　０．０１５　　０．０１１　 　０．０１２　　０．０１ａ　　　Ｏ，００２ｔｌ／２　　　　５０．２２０　 　４６．３１０　　６０．７４０　　５７．３７０　　５３．６６０　　６．５ ７５ｒａｑｕａｒｅ００．９８４　　　　０．９１．４　　０．９８０　　０． ９４５　　０．９５６　　０．０３３Ａ［ｌＣ１）１．４００　　　１７０．９ ００　　　１５ｇ、６００　　　１．７２．４００　　　１６ｇ、３００　　　 　　６．５５２（ｘ１０一つ ＡＵＭＣ１２６１０，０００１２０５０，０００１３８００，０００１４７４０ ，０００１３３００，０００１２０５，０ＤＤ（ｒｆ２／分／ｋｇ） 標識化Ｎ４４変異体の担体として天然ｔ−Ｆ　Ａを用いる代わりに変異体Ｎ４４ （非放射活性）そのものを１１９／に９の濃度で用いたこと以外は、上記のよう に薬効力学分析を繰り返した。結果を下記第６表および第１ｏ図に示す。結果か られかるように、Ｎ４４担体を用いると半減期約７３．１分（標準偏差値１．２ ２）および浄化速度約０゜４２！ρ／分／に９（標準偏差値０．０３）が観察さ れた。

第６表 ウサギにおいて用ｊ１５μＣ／に９の１−１２５　Ｎ４４を１η／に９のコール ドＮ４４と同時注射したときの、ｌ−１２５Ｎ−４４のポーラス投与の薬効力学 パラメーター Ｈａ　　　　＃ｂ　　　　＃Ｃ平　均　標準偏差値ＡＯ１９７８００１９７００ ０２２１５００２０５４００１３９００，００１ａｍｄｂａＯＯ，０１０，０１ ０，０１０，０１０，００ｔｌ／２　　　　　　Ｎ、６８　　　７３．８１　　 　７３．７６　　　７３．０ｇ　　　　１．２２ｒａＱｕａｒｅｏ　　　　Ｏ， ９８０，９７０，９８０，９８０，０ＩＣＵ　　　　　　　０．４４　　　０． ４３　　　０．３ｇ　　　　０．４２　　　０．０３（ｘＱ／分／に９） ウサギ試験動物において観察された前述の浄化速度および半減期に基づいて、ヒ トにおいて、同様のまたはより大きい半減期ならびに同様のまたはより低い浄化 速度が観察されるであろうことが容易に予想され得る。

ＣＴＴ　ｃｙｃａｃｃＡｃａｃｃｃ　ＣＴＩ−ＧＡＷＡＧＡＡＡＡ　ｅｃＴ　Ｃ ＴＧＣＧＡＧｆＪＡＡＧＧＧＡＩＬＧＧＡＧＣＡＡＧＣＣＣsＧＡ ＴＹＲＳＥＲＧＬＵ　　ＡＲＧ　　ｌｔＵ　　ＬＹＳ　　ＧＬｔｌ　　＾ＬＡ　 　ＨＩＳ　　ＶＡＬ　　ＡＲＧ　　ＬｒＬＩ　　ＴｒＲＰＲn５ｉｌｌ ＴＡＴ　ＴＣＩＪＧＡＧ　ＣＧＧ　ＣＴｃＡＡＣＧＡＧ　ＧＣＴ　ＣＡＴ　ＧＴ ＣＡＧＡ　ＣＴＧ　ＴＡＣＣＣＡ　Ｔ（（ＦＩＧ、　ＩＣ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ｔ−ＦＡおよびデス１−４４　ｔ−ＰＡのフィブリン刺激ｔ−ＰＡ　　　　　　 　　　　　デスｌ−４４ｔ−ＰＡＦＩＧ、４ 結合％ □ ＦＩＧ、　６ 分 −０−ＲＩＫ −・０・−Ｍ４４ 分 一つ−Ｍ４４ 分 ＦＩＧ、　９ 分 ＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、　１２−１ ＦＩＧ、　１２−２ ＦＩＧ、　１２−３ ＦＩＧ、　１３ ｔ−ＰＡ結合％ 国際調査報告 −耐重ｌｌ５−ムーー＋ｍ１１１＋ｅ、　　？ＣＴ、／ＵＳεε１０２ｍ７５１ ｓｌ＃、＋’ａＭｅｅｌ　ｉｌ、、１ｃｍ＋４．ＩＩｓ、　ｐｃτ／ＵＳ　εε １０＝＝：Ｓ

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）天然ｔ−ＰＡによって示される血漿半減期よりも長い半減期を示すか 、または天然ｔ−ＰＡによって示される浄化速度よりも遅い浄化速度を示す変異 ヒトｔ−ＰＡタンパク質を調製し、（ｂ）治療学的に有効な濃度で該ｔ−ＰＡ変 異体を含有する薬学的に許容しうる組成物を調製し、そして （ｃ）該組成物を患者に投与すること、からなる患者の血管障害治療のための改 良方法。
2. ２．変異体が天然かｔ−ＰＡによって示される血漿半減期の約２〜約２５倍の血 漿半減期を示す請求項１記載の方法。
3. ３．変異体が天然ｔ−ＰＡによって示される血漿半減期の約５〜約２０倍の血漿 半減期を示す請求項２記載の方法。
4. ４．変異ｔ−ＰＡが少なくとも１５分の血漿半減期を示す請求項１記載の方法。
5. ５．変異ｔ−ＰＡが約２０〜約７５分の血漿半減期を示す請求項１記載の方法。
6. ６．ｔ−ＰＡ変異体が天然ｔ−ＰＡによって示される浄化速度の約１／２〜約１ ／２５の浄化速度を示す請求項１記載の方法。
7. ７．ｔ−ＰＡ変異体が２ｍｌ／分／ｋｇよりも遅い浄化速度を示す請求項１記載 の方法。
8. ８．ｔ−ＰＡ変異体が少なくともフィンガードメインの一部を欠いている請求項 １記載の方法。
9. ９．ｔ−ＰＡ変異体が成長因子、タリングル１、タリングル２、およびプロテア ーゼドメインを含有している請求項８記載の方法。
10. １０．ｔ−ＰＡ変異体がフィンガー領域を欠くｔ−ＰＡからなる請求項８または ９記載の方法。
11. １１．変異ｔ−ＰＡがアミノ酸１−４４を欠く天然ｔ−ＰＡからなる請求項８記 載の方法。
12. １２．ｔ−ＰＡ変異体が少なくとも成長因子ドメインの一部を欠いている請求項 １記載の方法。
13. １３．ｔ−ＰＡ変異体が少なくともクリングル１ドメインの一部を欠いている請 求項１記載の方法。
14. １４．ｔ−ＰＡ変異体がフィンガー、クリングル１、クリングル２およびプロテ アーゼドメインを含有している請求項１２記載の方法。
15. １５．ｔ−ＰＡ変異体がフィンガー、成長因子、クリングル２およびプロテアー ゼドメインを含有している請求項１３記載の方法。
16. １６．ｔ−ＰＡ変異体がアミノ酸４４−８４を欠く天然ｔ−ＰＡからなる請求項 １４記載の方法。
17. １７．ｔ−ＰＡ変異体がアミノ酸９２−１７９を欠く天然ｔ−ＰＡからなる請求 項１５記載の方法。
18. １８．変異ｔ−ＰＡがアミノ酸２７５の位置にＧｌｕをさらに有する請求項１１ 、１６または１７のいずれかに記載の方法。
19. １９．（ａ）フィンガー、成長因子またはクリングル１ドメインの少なくとも一 部の除去によって修飾されたｔ−ＰＡからなるｔ−ＰＡ変異体を得、 （ｂ）該変異体の薬動力学を天然ｔ−ＰＡのものと比較し、そして（ｃ）天然ｔ −ＰＡに比べて一層長くなった半減期または一層減少した浄化速度を示す変異ｔ −ＰＡを選択すること、からなる天然ｔ−ＰＡに比べて高められた半減期または 減少した浄化速度を示す変異ヒトｔ−ＰＡタンパク質を得る方法。
20. ２０．選択した変異ｔ−ＰＡが天然ｔ−ＰＡによって示される血漿半減期の少な くとも２倍の血漿半減期を示す請求項１９記載の方法。
21. ２１．選択した変異ｔ−ＰＡが天然ｔ−ＰＡによって示される血漿半減期の約５ 〜約２０倍の血漿半減期を示す請求項２０記載の方法。
22. ２２．選択した変異ｔ−ＰＡが少なくとも１５分の血漿半減期を示す請求項１９ 記載の方法。
23. ２３．選択した変異ｔ−ＰＡが約２０〜約７５分の血漿半減期を示す請求項２２ 記載の方法。
24. ２４．ｔ−ＰＡ変異体が天然ｔ−ＰＡによって示される浄化速度の１／２または それ以下の浄化速度を示す請求項１９記載の方法。
25. ２５．ｔ−ＰＡ変異体が天然ｔ−ＰＡによって示される浄化速度の約１／１０〜 約１／２５の浄化速度を示す請求項１９記載の方法。
26. ２６．ｔ−ＰＡ変異体が２ｍｌ／分／ｋｇよりも遅い浄化速度を示す請求項１９ 記載の方法。
27. ２７．ｔ−ＰＡ変異体がフィンガードメインを欠いている請求項１９記載の方法 。
28. ２８．ｔ−ＰＡ変異体が成長因子ドメインを欠いている請求項１９記載の方法。
29. ２９．ｔ−ＰＡ変異体がクリングル１ドメインを欠いている請求項１９記載の方 法。
30. ３０．ｔ−ＰＡ変異体が天然ｔ−ＰＡのアミノ酸１−４４に対応するアミノ酸を 欠いている請求項１９記載の方法。
31. ３１．ｔ−ＰＡ変異体が天然ｔ−ＰＡのアミノ酸４４−８４に対応するアミノ酸 を欠いている請求項１９記載の方法。
32. ３２．ｔ−ＰＡ変異体が天然ｔ−ＰＡのアミノ酸９２−１７９に対応するアミノ 酸を欠いている請求項１９記載の方法。
33. ３３．ｔ−ＰＡ変異体がアミノ酸２７５の位置にＧｌｕをさらに有する請求項３ １、３２または３３のいずれかに記載の方法。
34. ３４．変異ｔ−ＰＡが２本鎖の変異体であるとさらに定義される請求項１または １９記載の方法。
35. ３５．変異ｔ−ＰＡが耐性の１本鎖変異体であるとさらに定義される請求項１ま たは１９記載の方法。
36. ３６．変異体がデス１−４４　Ｇｌｕ２７５　ｔ−ＰＡである請求項１または１ ９記載の方法。
37. ３７．１本鎖の変異体が天然ｔ−ＰＡと比較したときに位置２７５にアルギニン 以外のアミノ酸を含有している請求項３５記載の方法。
38. ３８．（ａ）フィンガー、成長因子またはクリングル１領域の少なくとも一部の 除去によって修飾されたｔ−ＰＡからなるｔ−ＰＡ変異体を得、 （ｂ）治療学的有効量の該変異ｔ−ＰＡタンパク質を選択した希釈剤または担体 とともに製剤化して薬学的に許容しうる調製物を得ること、 からなる天然ｔ−ＰＡに比べて増加した血漿半減期または減少した浄化速度を有 する薬学的ｔ−ＰＡ調製物の製造方法。
39. ３９．変異体がアミノ酸１−４４を欠くｔ−ＰＡからなる請求項３８記載の方法 。
40. ４０．変異体がアミノ酸４４−８４を欠くｔ−ＰＡからなる請求項３８記載の方 法。
41. ４１．変異体がアミノ酸９２−１７９を欠くｔ−ＰＡからなる請求項３８記載の 方法。
42. ４２．変異体がアミノ酸２７５の位置にＧｌｕをさらに有する請求項３９記載の 方法。
43. ４３．ｔ−ＰＡ変異体が、 （ａ）変異体をコードしている組換えベクターを調製し、（ｂ）この組換えプラ スミド適当な宿主中で発現させ、そして（ｃ）発現したｔ−ＰＡ変異体を集める こと、からなる方法によって得られる請求項１、１９または３８のいずれかに記 載の方法。
44. ４４．組換えベクターが細菌性ベクターであり、宿主が細菌性宿主である請求項 ４３記載の方法。
45. ４５．組換えベクターが真核性ベクターであり、宿主が真核性宿主である請求項 ４３記載の方法。
46. ４６．宿主がＣＨＯ細胞である請求項４５記載の方法。
47. ４７．デス１−４４　Ｇｌｕ２７５　ｔ−ＰＡ。