DK175369B1 - Anvendelse af tPA-varianter til fremstilling af et terapeutisk præparat til behandling af vaskulæresygdomme - Google Patents

Description

DK 175369 B1 i mi ·. '_" . · ··. 1"1_;_· - ··

Den foreliggende opfindelse angår generelt fremgangsmåder til forbedring af human vævsplasminogenaktivator*(t-PA)-protein og specielt fremgangsmåder til forbedring af t-PA's faroakokinetiske egenskaber.

Human vævsplasminogenaktivator, t-PA, er et umådeligt betydningsfuldt ^ 5 nyt biologisk farmaceutisk middel, som har vist sig at være meget lovende til behandling af vaskulær sygdom på grund af dens høje specificitet og kraftige evne til at opløse blodpropper in vivo. Følgelig har den medicinske videnskab fremhævet t-PA som ét af de mest virkningsfulde nye midler i nyere tid til behandling af vaskulær syg-10 dom og især hjertesygdom. Af disse og andre grunde vil t-PA sandsynligvis revolutionere klinisk bekæmpelse af alvorlig vaskulær sygdom.

Humant t-PA-protein samt de tilgrundliggende gensekvenser, som koder for det, har i de seneste år været genstand for adskillige videnskabelige publikationer. Fx er t-PA-proteinets struktur samt isolering 15 deraf fra naturlige kilder beskrevet af Rijken et al., (1981), J.

Biol. Chem., 256:7035. Desuden er der offentliggjort et patentskrift og forskellige patentansøgninger, som i detaljer beskriver isolering af naturlig t-PA fra både naturlige og rekombinante kilder (se fx GB- 1 patentskrift 2.119.804; EP-patentansøgning 041766; og EP-patentansøg-20 ning 093619). På basis af disse er det nu klart, at naturlig t-PA, hvad enten den er isoleret naturligt eller er en rekombinant art deraf, typisk omfatter 5 områder, som er defineret med henvisning til homologe eller lignende strukturer, der er identificeret i forskellige andre proteiner. Disse områder er blevet betegnet som finger- (F), 25 vækstfaktor- (G), kringle 1- (Kl), kringle 2- (K2) og protease- (P) λ •områderne og er beliggende grænsende op til hinanden i N-terminal-til C-terminal-retningen af proteinets skeletstruktur.

V

På trods af de store fordele, der er ved naturlig human t-PA som blodprop-opløsende farmaceutisk middel, er der visse ulemper for-30 bundet med dens anvendelse under forskellige omstændigheder. Fx har naturlig t-PA en ekstremt kort plasma-halveringstid, typisk ca. 6 minutter eller deromkring, når den administreres til patienter i terapeutisk virksomme mængder. Udtrykt i clearance-hastighed, en anden vigtig farmakokinetisk indikator, har naturlig t-PA desuden 35 typisk en ekstremt høj clearance-hastighed på ca. 7-8,5 ml/minut/kg.

I DK 175369 B1 I

i 2 I

I Korte halveringstider og høje clearance•hastigheder er under visse I omstændigheder ønskelige, fx når der foretages akut aggressiv terapi I af en livstruende sygdom såsom myocardieinfarkt eller pulmonal em· I boli. I denne høj risiko·situation kan der behandles patienter, som I I 5 har signifikant eller ikke-erkendt potentiel risiko for ukontrolleret I I blødning. Hvis en sådan blødning forekommer, kan lægemiddeladmini· I strationen standses, og de forårsagende t-PA-niveauer opbruges hur- ' I I tigt på grund af høje clearance-hastigheder. H

I Under andre omstændigheder, fx ved behandling af myocardieinfarkt I I 10 efter reperfusion, er det ønskede terapeutiske regimen imidlertid I I mindre aggressivt og har en længere varighed (4-12 timer). En t-PA- I I form med lang halveringstid kan opfattes som en mere ønskelig, effek- I I tiv og hensigtsmæssig behandling for patienter, som ikke er i livs- I I truende situationer. Desuden vil en t-PA med længere halveringstid I I 15 være ønskelig som middel til bolusadministration; fx for ambulance- I I teknikere, hvor infusionskapacitet i almindelighed ikke er tilgænge- I I lig, vil det være særdeles ønskeligt at anvende t-PA-lignende midler I I med længere halveringstider og/eller lavere clearance-hastigheder. I

I Der er følgelig for tiden et behov for at identificere forbedrede I I 20 fremgangsmåder og dermed forbundne udførelsesformer til fremstilling I I af t-PA-varianter med forbedrede farmakokinetiske parametre, hvilke I I varianter bevarer en høj blodprop-lyserende aktivitet in vivo. Dette I I vil give den medicinske videnskab betydningsfulde nye alternativer I I til behandling af cardiovaskulær sygdom og til behandling af flere I I 25 andre medicinske tilstande, som opstår på grund af tromboembolisk I I okklusion af blodkar. * I

Under hensyntagen til disse og andre kendte ulemper er et generelt *' I I formål for den foreliggende opfindelse at tilvejebringe forbedrede I I fremgangsmåder til behandling af vaskulær sygdom, især til forebyg- I I 30 gelse af retrombose af koronar-arterier, hos ramte patienter. I 1

Et særligt formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe I I fremgangsmåder, der specielt er tilpasset til behandling af patlen- I I ter, som har behov for blodprop-opløsende midler, der har en længere I

........ »·ηΓ-φ·,. · ··;_ S

DK 175369 B1 3 halveringstid og/eller formindsket clearance-hastighed i forhold til for tiden tilgængelige blodprop-opløsende midler.

Et mere specifikt formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe fremgangsmåder til behandling af lidelser, hvor der kan an-5 vendes blodprop-opløsende midler med længere halveringstider og/eller formindskede clearance-hastigheder i forhold til naturlig t-PA, fx lidelser såsom dyb venetrombose eller perifer arterietrombose (perifer vaskulær sygdom).

Den foreliggende opfindelse omfatter således i generel forstand en 10 erkendelse, som nærværende opfindere har gjort af, at der kan fremstilles varianter af humant t-PA-protein, hvilke varianter har længere halveringstider og/eller reducerede clearance-hastigheder i forhold til naturlig t-PA og bevarer en høj blodprop-lyserende aktivitet in vivo. I nærværende sammenhæng betegner udtrykket "variant af 15 human t-PA-protein" proteinstrukturer, der omfatter naturlig t-PA's grundlæggende strukturelle træk, fx svarende i det væsentlige til de aminosyresekvenser, der findes i naturlig t-PA, eller til biologisk funktionelle ækvivalenter af sådanne aminosyresekvenser, hvilke strukturer imidlertid er ændret på én eller flere måder, således at 20 der produceres en proteinvariant med en statistisk forlænget halveringstid og/eller clearance-hastighed i forhold til naturlig t-PA. I nærværende sammenhæng skal udtrykket "naturlig t-PA" omfatte t-PA, fx som beskrevet i EP 061766 og 093619, hvad enten den er opnået fra naturlige eller rekombinante kilder. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Den foreliggende opfindelse angår således generelt forbedrede frem 2 gangsmåder til behandling af vaskulær sygdom hos en patient, der har 3 behov for et t-PA-middel med forøget halveringstid eller reduceret 4 clearance-hastighed. Sådanne fremgangsmåder omfatter generelt, at der 5 fremstilles en t-PA-proteinvariant, som har en større plasma-halve- 6 ringstid, fx mindst 2 gange længere end den, som naturlig t-PA har, 7 eller som har en reduceret clearance-hastighed, fx ca. 1/2 eller 8 derunder, end den clearance-hastighed, som naturlige t-PA-proteiner 9 har. t-PA-proteinvarianten formuleres med forskellige farmaceutisk 10 acceptable bærere eller excipienser i mængder, der er tilstrækkelige 11 til at tilvejebringe en terapeutisk værdi for en patient i en hen-

I DK 175369 B1 I

I I

sigtsmæssig dosis, hvorefter der administreres passende mængder til I

I en patient, der har behov derfor i overensstemmelse med de særlige I

omstændigheder. I

I Det vil være klart for fagfolk, at "halveringstid" eller "plasma- I

I 5 halveringstid” betegner den tid, det tager for en lægemiddelkoncen- I

I tration i plasmaet at blive reduceret med halvdelen, typisk målt ' I

I efter administration af en udvalgt dosis. Følgelig måler halverings- I

I tiden tiden for eliminering af halvdelen af lsgemiddelkoncentrationen I

I i plasmaet. Udtrykket "clearance-hastighed" betegner i modsætning I

10 hertil hastigheden for lægemiddel-eliminering divideret med lægemid- I

I delkoncentrationen i den bestemte væske, almindeligvis plasma. Ud- I

trykket "plasma" betegner i nærværende sammenhæng enten plasma eller I

I serum. Clearance-begrebet er særdeles nyttigt inden for klinisk I

farmakokinetik, idet clearance af et givet lægemiddel sædvanligvis er I

I 15 konstant for de fleste klinisk forekommende lægemiddelkoncentrationer I

I og kan typisk tilpasses efter kinetik af første orden. Clearance-has- I

I tighed kan undertiden mere specifikt defineres som den givne dosis I

I divideret med AUC, hvor AUC defineres som arealet under plasmakoncen- I

I trations-tidskurven. En "forøget", "forbedret" eller "længere" halve- I

20 ringstid betyder således en halveringstid, som statistisk set er I

I længere. "Formindsket" eller "reduceret" clearance-hastighed betyder I

I endvidere en clearance-hastighed, som statistisk set er reduceret. I

I I og med at naturlig t-PA's farmakokinetik ser ud til at være tofaset I

I eller flerfaset, er en sådan farmakokinetik typisk indrettet til bi- I

I 25 (eller multi-)eksponentielle ligninger. Det er derfor klart, at de I

tal for halveringstid, der er anført i nærværende sammenhæng, er " I

I "nominelle" halveringstider, hvilket således afspejler, at naturlig I

I t-PA's dominerende halveringstid er ca. 2,2 minutter for tl/2a og ca. " I

I 30 minutter for tl/2b. Hvis Co - 100, er tl/2a-komponenten imidlertid 1

I 30 generelt ca. 95X og tl/2b-komponenten ca. 5Z. a-fasen er således I

I dominerende og afspejler den nominelle halveringstid. I

I Det har overraskende vist sig, at nøglen til fremstilling af t-PA- I

I proteinvarianter, som effektivt bevarer naturlig t-PA's høje blod- I

I prop-lyserende aktivitet in vivo, er fjernelse af det hele eller en I

35 del af fingerområdet eller det hele eller en del af vækstfaktorområ- I

5 DK 175369 B1 dec eller det hele eller en del af kringle l-området, som typisk er associeret med naturlig t-PA. 1 nærværende sammenhæng betegner "fingerområde" generelt det aminoterminale område af naturlig t-PA-pro-tein, som udviser en "finger-lignende" struktur på grund af den for-5 roodede placering af disulfidbindinger mellem cysteinresterne 6 og 36 samt 34 og 43. Fingerområdet kan alternativt defineres som den til-' grundliggende genstruktur for det individuelle finger-kodende exon- område, fx som karakteriseret af Type 1-homologier med fibronektin og som et uafhængigt exon-område. I nogle foretrukne udførelsesformer 10 omfatter fingerområdet således aminosyrer svarende til aminosyrerne ca. 1 (SER) til og med ca. 44 (HIS) af naturlig t-PA.

Vækstfaktorområdet (G) er blevet defineret på forskellig måde som strækkende sig fra ca. aminosyre 45 op til aminosyre 91 (baseret på dets homologi med EGF). Kringle 1 (Kl) er blevet defineret som stræk-15 kende sig fra ca. aminosyre 92 til ca. 173, og kringle 2 (K2) er blevet defineret som strækkende sig fra ca. aminosyre 180 til ca. aminosyre 261. Det såkaldte serinproteaseområde (P) er i almindelighed blevet defineret som strækkende sig fra ca. aminosyre 264 til molekylets C-terminale ende. Disse områder befinder sig grænsende op 20 til hinanden, eller de er adskilt af korte "linker"-områder og tegner sig for den fuldstændige aminosyresekvens på fra 1 til 527 aminosyrer i den formodede færdige form.

Det er på forskellig vis beskrevet, at hvert område bidrager med en bestemt specifik aktivitet; dvs. at fingerområdet på forskellig vis 25 er beskrevet som indeholdende en sekvens, der er essentiel eller i det mindste af stor betydning for høj bindingsaffinitet til fibrin.

(Denne aktivitet formodes at være vigtig for den høje specificitet, ' som human vævsplasminogenaktivator udviser med hensyn til blodprop lyse ved stedet for en fibrinrig trombe.) Det vækstfaktorlignende 30 område er ligeledes blevet forbundet med celleoverfladebindingsaktivitet, i det mindste med hensyn til urokinase. Kringle 2-området er også i høj grad blevet forbundet med fibrinbinding og med fibrins evne til at stimulere t-PA*s aktivitet. Der er tilsyneladende almindelig enighed om, at serinproteaseområdet er det vigtigste område i 35 molekylet, hvad angår plasminogenaktiverende aktivitet.

I DK 175369 B1 I

i 6 I

I Opfindelsen angår derfor en fremgangsmåde til forøgelse af t-PA's I

I plasma-halveringstid på en måde, som har relation til den mængde I

I eller del af finger-, vækstfaktor- eller kringle 1-området, som I

I fjernes. Jo større grad af en sådan områdefunktionel ændring, der I

I S afspejles i t-PA-varianten, desto større er den forøgelse i halve- I

I ringstid, som findes i varianten. Det har imidlertid vist sig, at I

I selv fjernelse af praktisk talt hele finger-, vækstfaktor- eller * I

I kringle 1-området kun medfører en lille reduktion i den blodprop- I

I lyserende aktivitet in vivo. Der kan således let fremstilles farma- I

I 10 ceutiske præparater med t-PA-proteinvarianter ifølge den foreliggende I

I opfindelse, hvilke præparater bevarer blodprop-lyserende aktivitet in I

I vivo, under anvendelse af varianter, der omfatter ét eller flere af I

I de funktionelle finger-, vækstfaktor-, kringle 1-, kringle 2- og/el- I

I ler proteaseområder og stadig har i det mindste en del af finger-, I

I 15 vækstfaktor- eller kringle 1-området fjernet eller ændret. I

I I visse foretrukne udførelsesformer har de således fremstillede og I

I klinisk anvendte t-PA-varianter i det væsentlige hele fingerområdet I

I fjernet, og de er især ejendommelige ved, at der er fjernet amino- I

I syrer, der svarer til aminosyrerne 1 til og med 44 af naturlig t-PA I

I 20 (i det følgende betegnet "des (1-44) t-PA"). I

I 1 andre foretrukne udførelsesformer er aminosyrerne 44-84, i det væ- I

I sentlige hele vækstfaktorområdet, deleteret, eller aminosyrerne 92- I

I 179, i det væsentlige hele kringle 1-området, er deleteret. I

I t-PA-varianter, der er fremstillet ifølge den foreliggende opfindel- I

25 se, har plasma-halveringstider, der i almindelighed er mindst 2 gange I

I større end halveringstiden for naturlig t-PA, og i visse udførelses- I

I former har de halveringstider, der er mellem ca. 5 og ca. 20 gange * I

I større end den halveringstid, som naturlig t-PA har. Da naturlig I

t-PA's plasma-halveringstid i mennesker er ca. 6 minutter, har fore- I

30 trukne t-PA-variantpræparater ifølge den foreliggende opfindelse I

typisk halveringstider på mindst 12-20 minutter, og i tilfælde af des I

(1-44) t-PA op til 1 time eller derover. I

Det er klart, at naturlig t-PA's "nominelle" halveringstid i kaniner, I

aber og mennesker er henholdsvis ca. 2, 3,5 og 6 minutter. Dette I

7 DK 175369 B1 tidsrum er typisk relativt konstant. En halveringstid, der observeres fx i en kanin, vil således svare til en noget større halveringstid i et menneske.

I andre udførelsesformer defineres den forbedrede farmakokinetik af 5 t-PA-variantstrukturer som formindsket clearance‘hastighed af midlet.

' I sådanne udfcrelsesfomer tilvejebringes der t-PA-proteinvarianter, som har clearance-hastigheder på 1/2 til 1/5 eller derunder af naturlig t-PA's clearance-hastighed, fortrinsvis en clearance-hastighed på mellem ca. 1/15 og ca. 1/25 af naturlig t-PA's clearance-hastighed. I 10 de fleste accepterede testsystemer såvel som i mennesker har naturlig t-PA almindeligvis en clearance-hastighed i størrelsesordenen 7-8,5 ml/minut/kg. Imidlertid har t-PA-varianter, der benyttes til udøvelse af den foreliggende opfindelse, typisk en clearance-hastighed på under ca. 2 ml/minut/kg, idet den foretrukne des (1-44) t-PA-variant 15 har en clearance-hastighed på under ca. 0,5 ml/minut/kg.

For at undgå muligheden for uheldige virkninger og ukendte toksiciteter for t-PA-proteinvariantprsparater er det foretrukket, men ikke påkrævet, at den således producerede proteinvariant er fri for syntetiske derivater såsom fx derivater, i hvilke alkyl, alkylamin eller 20 methylerede benzylaminer eller andre blokerende grupper er inkluderet i proteinstrukturen.

Det har imidlertid tidligere vist sig, at andre modifikationer giver forbedret t-PA, og sådanne modificerede t-PA*er kan også anvendes i fremgangsmåder ifølge den foreliggende opfindelse. Fx er der beskre-25 vet en hidtil ukendt t-PA-mutant med visse aminosyresubstitutioner i området af aminosyrerne 270 til ca. 279, mere specifikt positionerne * 275, 276 og 277, af human t-PA, i US 07/071.506, der er indleveret den 9. juli 1987 og i dennes stamansøgninger nr. 06/846.697 indleveret den 1. april 1986 og nr. 06/725.468 indleveret den 22. april 1985 30 (svarende til EP-patentansøgning nr. 199.574 offentliggjort den 29. oktober 1986; der henvises til alle disse ansøgninger). I nærværende sammenhæng henvises der til disse mutanter, der fortrinsvis er karakteriseret som t-PA-mutanter med en anden aminosyre end arginln i position 275 eller lysin i position 277, som protease-resistente 35 t-PA-varianter med én kæde, idet de til forskel fra naturlig t-PA, I DK 175369 B1

som kan eksistere i en form med både én kede og to keder, er resi* I

stente over for protease-spaltning i position 275 og/eller 277, og de

H omdannes derfor ikke metabolisk in vivo til en tokædet form. Sådanne I

H resistente "énkædede" varianter kan ligeledes forbedres ved frem- H 5 gangsmåder ifølge den foreliggende opfindelse og er omfattet heraf.

H Eksempler på sådanne enzymatisk resistente (i aminosyrepositionerne H 275 og/eller 277) mutanter omfatter disse varianter i kombinantion » H med et manglende (i det mindste en del af) finger-, vækstfaktor· H eller kringle 1-område, fx des 1-44 Glu 275 t-PA og des 1-44 Glu275- 10 Iso277 t-PA.

H Selv om det antages, at t-PA-proteinvarianter fx kan fås ved enzyma- H tisk spaltning af naturlig t-PA, efterfulgt af enzymatisk tilføjelse H af udvalgte aminosyrer eller selv på fuldstændig syntetisk måde, fås t-PA-varianter i foretrukne udførelsesformer ved udøvelse af rekombi- H 15 nant DNA-teknologi og celledyrkningsteknikker. Rekombinante udgangs- H vektorer og de rekombinante teknikker til dannelse, dyrkning og eks- H pression af passende t-PA-varianter under anvendelse af sådanne vek- H torer er almindeligt kendte inden for området eller er beskrevet i detaljer i nærværende sammenhæng.

H 20 Foretrukne rekombinanc-teknikker til fremstilling af passende t-PA- H proteinvarianter omfatter i almindelighed, at der fremstilles en H rekombinant vektor, der koder for varianten, fx koder for aminosyrer svarende til arainosyrerne 45 til og med 527, eksklusive aminosyrerne I 1-44 af naturlig t-PA i tilfalde af des (1-44) t-PA, og tilsvarende 25 eksklusive de relevante aminosyrer i tilfælde af des vækstfaktor og des kringle 1 t-PA. Det er klart, at ved anvendelse af rekombinant DNA-teknologi til fremstilling af t-PA-proteinvarianter fremstilles H der varianter, i hvilke størrelsen og sekvensen af det bevarede « finger-, vækstfaktor- eller kringle 1-område kan reguleres med høj 50 specificitet. Desuden kan der produceres store mængder proteinvari- I ant, der yderligere kan oprenses på konventionel måde til dannelse af farmaceutisk acceptable præparater. Det produkt, der fremstilles af I gensplejsede mikroorganismer eller celledyrkningssystemer, giver en mulighed for at producere human vævsplasminogenaktivator på en meget I 35 mere effektiv måde, end det hidtil har været muligt, hvilket muliggør I hidtil vanskelig kommerciel udnyttelse. Afhængigt af værtscellen kan 9 DK 175369 B1 den humane vævsplasminogenaktlvator desuden indeholde associeret glycosylering i større eller mindre grad i sammenligning med nativt materiale. I alle tilfælde vil t-PA være fri for kontaminanter såsom kontaminerende proteiner og andre tilfældigt forekommende stoffer, fx 5 virusbaserede enheder, som normalt er forbundet dermed i et ikke-re-kombinant cellulært miljø eller i præparater afledt af puljet serum.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kan formuleres i overensstemmelse med kendte fremgangsmåder til fremstilling af farmaceutisk anvendelige præparater, ved hvilke det modificerede humane 10 t-PA-produkt ifølge den foreliggende opfindelse kombineres i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer. Egnede bærere og deres formulering sammen med andre humane proteiner, fx humant serumalbumin, er fx beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. udgave, 1980,

Mack Publishing Co., red. af Oslo et al., hvortil der henvises. Så-15 danne præparater indeholder typisk en virksom mængde af t-PA-varian-ten, fx fra ca. 0,5 til ca. 5 mg/ml, sammen med en passende mængde bærer til fremstilling af farmaceutisk acceptable præparater, der er egnede til effektiv administration til værten. t-PA-præparatet kan administreres parenteralt eller ved andre metoder, der sikrer dets 20 afgivelse til blodstrømmen i en virksom form og mængde.

Præparater, der er særligt egnede til klinisk administration af t-PA-variantprodukter, og som kan anvendes ved udøvelse af den foreliggende opfindelse, omfatter fx sterile vandige opløsninger eller sterile hydratiserbare pulvere såsom lyofiliseret protein. Det er generelt 25 ønskeligt, at der i formuleringen også inkluderes en passende mængde af et farmaceutisk acceptabelt salt, sædvanligvis i en mængde, der er tilstrækkelig til at gøre formuleringen isotonisk. Et pH-regulerende 1 middel såsom argininbase og phosphorsyre er typisk også Inkluderet i tilstrækkelige mængder til at opretholde en passende pH, sædvanligvis 30 fra 5,5 til 7,5. Til forbedring af vandige formuleringers opbevaringstid eller stabilitet kan det tillige være ønskeligt et inkludere stoffer såsom glycerol. På denne måde geres t-PA-variantformuleringer egnede til parenteral administration og især intravenøs administration.

I DK 175369 B1

H Doser og ønskede lægemiddelkoncentrationer af farmaceutiske præpara- I

ter ifølge den foreliggende opfindelse kan variere afhxngigt af den I

bestemte anvendelse, der påtænkes. Ved behandling af dyb venetrombose I

eller perifer vaskulxr sygdom foretrxkkes fx typisk •bolus"-doser i 5 størrelsesordenen fra ca. 0,05 til ca. 0,3 mg/kg, idet der gives efterfølgende administrationer i størrelsesordenen fra ca. 0,1 til

ca. 0,2 mg/kg for at opretholde et omtrent konstant blodniveau, for- t I

trinsvis i størrelsesordenen ca. 3 μ$/αΙ. Til anvendelse i forbindel-

se med medicinske nødfaciliteter, hvor infusionskapacitet generelt I

10 ikke er tilgængelig, og på grund af den sxdvanligvis kritiske natur

H af den tilgrundliggende sygdom (fx emboli, infarkt) er det generelt I

H ønskeligt at give noget større doser i begyndelsen såsom en intrave- I

H nøs bolus i størrelsesordenen 0,3 mg/kg. I

Den humane vævstype-plasminogenaktivator ifølge opfindelsen kan fx I

15 administreres parenteralt til patienter, der lider af cardiovaskulxre I

sygdomme eller tilstande. Dosis eller dosishastighed kan svare til det, der for tiden anvendes ved kliniske undersøgelser af andre car- diovaskulære trombolytiske midler, fx ca. 1-2 mg/kg legemsvægt, som H en intravenøs eller intraarteriel dosis i løbet af 1,5-12 timer til H 20 patienter, der lider af myocardieinfarkt, pulmonal emboli, etc.

H Som et eksempel på en egnet doseringsform kan et hxtteglas, der indeholder 50 mg human vxvstype-plasminogenaktivator, arginin, phos- phorsyre og polysorbat 80, rekonstitueres med 50 ml sterilt vand til H injektioner og blandes med et passende volumen 0,9Z natriumchlorid- 25 opløsning.

H Den forøgede halveringstid af den humane vævstype-plasminogenaktiva- tor ifølge opfindelsen kan være hensigtsmæssig til hurtig intravenøs , injektion. Dette vil eliminere behovet for komplicerede administra- tionsprocedurer og kan øge muligheden for at anvende t-PA i miljøer 30 med begrænset medicinsk udstyr såsom i ambulancer med paramedicinsk personale. En forøget halveringstid for human vxvstype-plasminogenak- tivator kan også muliggøre lavere og sikrere initiale doser og kan opretholde trombolytisk virksomme plasmaniveauer i op til 45 minut- I ter eller derover. En længere halveringstid for human vævstype-plas- I 35 minogenaktivator kan også være nyttig til længerevarende terapi med 11 DK 175369 B1 lave doser, hvilket kan være nødvendigt for at undgå reokklusion efter vellykket akut trombolyse eller til længerevarende trombolyse, hvilket kan være nødvendigt i tilfælde af perifer vaskulær okklusion.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret under henvis -5 ning til tegningen, på hvilken fig. 1A-1C viser nukleinsyresekvensen og den tilsvarende aminosyre-sekvens af human t-PA i fuld længde (aminosyrerne 1-527), herunder det formodede præsekvens-område (aminosyrerne -35 til -1) samt 5'- og 3'-flankerende sekvenser; 10 fig. 2 skematisk viser trinnene under fremstillingen af et des (1-44) t-PA-variant-kodende mutantplasmid; fig. 3 -viser en polyacrylamidgel, der sammenligner vandringen af naturlig t-PA med des (1-44) t-PA-varianten, både i nærværelse og i fravær af reduktionsmidler; 15 fig. 4 viser en sammenligning af fibrinstimuleringen mellem des (1-44) t-PA og naturlig t-PA in vitro under anvendelse af det plasrainspecifikke substrat S-2251;

fig. 5 viser en sammenligning af den fibrinbindende aktivitet I

mellem naturlig t-PA (intakt fibrin □ og plasmin-nedbrudt 20 fibrin ) og des (1-44) t-PA (intakt fibrin o og plasmin- nedbrudt ·); fig. 6 viser en sammenligning af den trombolytiske aktivitet in vivo mellem des (1-44) t-PA (N44) og naturlig t-PA (RIK) i kaniner (n - henholdsvis 6 og 5, ± S.D.); 25 fig. 7 viser en sammenligning af lyseringsgraden mellem naturlig t-PA (o) og des (1-44) t-PA-varianten («) i en dosis på henholdsvis 0,3 og 0,064 mg/kg, der er givet som en 10X bolus, efterfulgt af infusion af den resterende mængde i løbet af 90 minutter; 30 fig. 8 viser en sammenligning af det tidsforløb for plasmakoncentrationen, der fremkommer efter administration af 0,3 mg/kg naturlig eller 0,064 mg/kg N44-variant, der er givet som en 10X mg/kg bolus, hvor den resterende mængde infunderes over et 90 minutters tidsforløb; 35 fig. 9 viser en sammenligning af farmakokinetikken mellem N44 og naturlig t-PA (rt-PA) under anvendelse af ikke-radioaktivt rt-PA som bærer; I DK 175369 B1

fig. 10 viser farraakokinetikken af N44 under anvendelse af N44 som I

bærer; I

fig. 11 skematisk viser, hvorledes plasmidet pll54 kan fremstil- I

les, og viser også en delvis restriktionskortlægning

5 deraf; I

fig. 12 viser sekvensen af des 1-44 Clu 275 t-PA-mutanten, som kodes af plasmidet pll54; H fig. 13 viser de farmakokinetiske profiler i kaniner af de for- skellige områdedeletionsmutanter: vækstfaktordeletion, I 10 des 44-84 ("d-GF"); kringle 1-deletion, des 92-179 ("d-Kl"); kringle 2-deletion, des 174-261 ("d-K2"); og nativ t-PA ("rt-PA") som kontrol; og H fig. 14 viser fibrinbindingskarakteristika for de forskellige områdedeletionsmutanter (se fig. 13), herunder fingerdele- 15 tionerne des 1-44, udtrykt som procent bundet i forhold til fibrin(ogen)-koncentration.

I. Introduktion

Hos mennesker og andre dyr spiller vævstype-plasminogenaktivator (t-PA) en væsentlig rolle for opløsning af fibrin-blodpropper (se fx 20 Verstraete og Collen (1986) Blood, 67:1425). t-PA er en serinprotea- se, som initierer fibrinolyse ved at omdanne plasminogen til plasmin.

H t-PA består af flere områder, som har fælles sekvenshomologi med andre proteiner, og det er postuleret, at hvert område giver dette roultifunktionelle protein en specifik funktion (se fx Pennica et al.

25 (1983) Nature, 301:214; Banyai et al. (1983) FEBS Lett., 163:37). Det I er kun funktionen af proteaseområdet (resterne 276-527), der er ble- H vet entydigt defineret. Denne erkendelse blev først baseret på den , iagttagne sekvenshomologi med andre kendte serinproteaser. For nylig I har begrænset reduktion af den tokædede form af t-PA muliggjort di- I 30 rekte isolering og funktionel karakterisering af proteaseomr&det I (Rijken og Groeneveld (1986) J. Biol. Chem., 261:3098; Dodd et al.

I (1986) Thrombos. Haemostas. , 55:94).

I Imidlertid kendes for tiden ikke den eller de præcise funktioner af fingerområdet (se fx fig. 1 A-C; resterne 1-44, der er homologe med 13 DK 175369 B1 type 1-fingeroraråderne i fibronektin), vækstfaktorområdet (resterne 45-89, der er homologe med epidermisvækstfaktor og vækstfaktorområderne i urokinase, faktor IX, faktor X og protein C) og de to kring-leoraråder (resterne 92-173 og 180-261, der er homologe med kringleom-5 raderne i plasminogen, protrombin, urokinase og faktor XII). Banyai et al., supra, anvendte sekvenshomologi med de fingerområder, der er ansvarlige for fibronektins fibrlnaffinitet, og begrænsede proteoly-tiske undersøgelser af t-PA og foreslog, at det aminoterminale fingerområde er ansvarligt for t-PA's fibrinaffinitet. Alternativt har 10 Ichinoise et al. (1986) J. Clin. Invest., 78:103, anvendt sekvenshomologi med de kringleororåder, der er ansvarlige for plasminogens fibrinaffinitet og begrænset proteolyse, og har foreslået, at t-PA's andet kringleområde er ansvarligt for interaktlonen med fibrin.

Stedspecifik mutagenese er en teknik, som muliggør selektiv deletion 15 af ønskede dele af et bestemt protein ved selektiv deletion af de tilsvarende tilgrundliggende gensekvenser. Når sådanne teknikker kombineres med funktionel karakterisering af den resulterende mutant, kan de muliggøre opklaring af hvert områdes funktion eller funktioner. Fx har Bang et al. (1985) Clin. Res., 33:878A, offentliggjort 20 et foreløbigt arbejde under anvendelse af denne fremgangsmåde, som tyder på, at finger- og vækstfaktorområderne er tilstrækkelige til fibrinbinding og maksimal stimulering af aktiviteten med fibrin.

Derimod har van Zonneveld et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4670, under anvendelse af et kortvarigt ("transient") ekspres-25 sionssystem og uoprensede supernatanter påvist, at det andet kringleområde og i mindre grad finger- og vækstfaktorområdeme er ansvarlige for fibrinbinding. Imidlertid har Kagitani et al. (1985) FEBS Lett., 189:145, isoleret et naturligt forekommende t-PA-cDNA, som koder for resterne 50-527 fra Detroit 562-celler, og karakteriseret proteinet 30 efter ekspression i E. coli. I modsætning til andre forskere fandt de, at denne mutant, som manglede fingerområdet og en del af vækstfaktorområdet, faktisk bandt til fibrin.

Verheijen et al., EMBO 5, 3525 (1986) har fremstillet en række t-PA-varianter, som mangler ét eller flere områder. De fandt, at ved lave 35 fibrinkoncentrationer og i fravær af plasminogen formindskedes fibrinbinding signifikant ved fjernelse af fingerområdet; ved høje I DK 175369 B1

I I

fibrinkoncentrationer ser tilstedeværelsen af det andet kringleområde I

imidlertid ud til at være tilstrækkeligt til at sikre signifikant I

binding. I nærværelse af plasminogen er kringle 2«området også vig- I

tigt ved lave fibrinkoncentrationer. De konkluderede også, at kun I

5 kringle 2-området er involveret i stimulering af aktiviteten med I

fibrin. I

H

Der har således været megen forvirring og usikkerhed omkring de I

forskellige strukturelle områders funktionelle betydning og især den I

rolle, som naturlig t-PA's N-terminale fingerooråde spiller. På basis I

10 af den foreliggende opfindelse kan det imidlertid utvetydigt beskri- I

ves, at blandt visse andre mulige farmakologiske bidrag fra finger-, I

vækstfaktor- eller kringle 1-området er det klart, at tilstedeværel- I

sen af disse områder i t-PA-proteiner har direkte sammenhæng med I

H naturlig t-PA's korte halveringstid. Det kan nu specielt beskrives, I

15 at fjernelse af finger-, vækstfaktor- eller kringle 1-området, fx ved

fjernelse af de ferste 44 aminosyrer fra naturlig t-PA i tilfælde af I

fjernelse af fingerområdet, medfører t-PA-proteinvarianter, som har H overraskende og uventede farmakokinetiske egenskaber i lyset af, hvad der tidligere har været kendt med hensyn til naturlig t-PA og de 20 dermed forbundne intramolekylære strukturer.

II. Fremstilling &£ t-PA-varianter

Som nævnt ovenfor foretrækkes rekombinante teknikker til fremstilling af t-PA-varianter, der anvendes i fremgangsmåderne ifølge den fore- liggende opfindelse. Især anvendes rekombinant DNA-teknologi til 25 fremstilling af de humane t-PA-deletionsmutanter, der på forskellig I måde er modificeret ved resulterende substitutioner, deletioner, I tilføjelser og udskiftninger af enkelte eller flere aminosyrer, fx I ved hjælp af steddirigeret deletionsmutagenese. Omfattet heraf er I fremstillingen af t-PA-deletionsvarianter, hvor det hele eller en del 30 af fingerområdet er deleteret, men hvor kringleområdet eller -områ- I derne og serinproteaseområdet er bevaret, hvilket almindeligvis er I karakteristisk for tidligere beskrevne humane vævsplasminogenaktiva- I torer (se fx GB 2.119.804, hvortil der henvises), men ellers er I modificeret ved fjernelse eller ændring af fingerområdet.

15 DK 175369 B1

Det er klart.for fagfolk, at i forbindelse med de specifikke deletioner, der anvendes ved udøvelse af de foreliggende fremgangsmåder, betegner udtrykkene "human vævsplasminogenaktivator", "human t-PA" eller "naturlig t-PA" i nærvarende sammenhæng human eksogen (vævsty-5 pe) plasminogenaktivator, der produceres af mikrobielle systemer eller celledyrkningssysteroer, i bioaktive former omfattende en pro-teasedel og svarende til de vævsplasminogenaktivatorer, der ellers er native for humant væv. Det ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede humane vævsplasminogenaktivator-protein er defineret ved 10 hjælp af det fundne DNA-gen og deduktiv aminosyre-sekventering (se fig. 1 A-C). Det er klart, at naturlige allelvariationer eksisterer og optræder fra person til person. Disse variationer kan påvises ved aminosyreforskelle i den samlede sekvens eller ved deletioner, substitutioner, insertioner, inversioner eller additioner af aminosyrer 15 i denne sekvens. Desuden afhænger placeringen og graden af glycosyle-ring af arten af værtscellens miljø.

Alle sådanne allelvariationer og -modifikationer, der resulterer i derivater af human vævsplasminogenakcivator, som karakteriseres som biologiske funktionelle ækvivalenter af t-PA, er omfattet af den 20 foreliggende opfindelse ligesom andre relaterede humane ydre (vævstype) plasminogenaktivatorer, der er tilsvarende i fysisk og biologisk henseende, når blot den essentielle, karakteristiske humane vævsplas-minogenaktivator-aktivitet forbliver uberørt i sin art. Det er desuden kendt, at der kan foretages visse ændringer i aminosyresekvensen 25 uden at ændre proteinets tilgrundliggende biologiske funktion. Fx er det kendt, at aminosyrer kan udskiftes med forskellige andre aminosyrer på basis af en korrelation af de to udskiftede aminosyrers v hydropatiske indeks.

Som det er tilfældet med t-PA, fremstilles t-PA-varianter ifølge den 30 foreliggende opfindelse typisk (1) med methionin som den første aminosyre (til stede som følge af indsætning af ATG-startsignalkodo-nen foran strukturgenet), eller (2) hvis methionin spaltes intra-eller ekstracellulært, har den sin normale første aminosyre, eller (3) sammen med enten dens signalpolypeptid eller et konjugeret pro-35 tein, der er forskelligt fra det konventionelle signalpolypeptid.

I DK 175369 B1

I I

idet signalpolypeptidet eller konjugatet er specifikt spalteligt i et I

H intra* eller ekscracellulært miljø, eller (4) ved direkte ekspression I

H i færdig form, uden det er nødvendigt at fraspalte eventuelt fremmed, I

H overflødigt polypeptid. Sidstnævnte er særlig vigtigt, når en given I

5 vært ikke (eller ikke effektivt) fjerner et signalpeptid, hvor eks- I

pressionsvektoren er udformet til at udtrykke vævsplasminogenaktiva- I

H toren sammen med dens signalpeptid. I alle tilfælde isoleres den I

således producerede humane t-PA-variant i sine forskellige former og 1

H oprenses i en grad, der gør den egnet til anvendelse ved behandling I

10 af de forskellige vaskulsre lidelser eller sygdomme. I

Desuden har t-PA former, som omfatter både det enkeltkædede (ikke- I

protease-resistent 1-kæde) protein og det tokædede protein. Sidst- I

H nævnte er proteolytisk afledt af den ikke-resistente 1-kæde-forbin- I

H delse. Det er en teori, at 2-kæden forekommer ved stedet for omdan- I

15 nelse af plasminogen til plasmin. Den foreliggende opfindelse angår I

H administration af 1-kæde-proteinvarianten, hvad enten den er protea- I

seresistent eller ej, eller administration af 2-kæde-protein, som I

også har vist sig at være aktivt. 2-kæde-proteinet kan fremstilles I

H ved in vitro proteolytisk omdannelse, efter at det ikke-resistente 1- I

20 kæde-materiale er fremstillet. Et såkaldt "kringle"-område er anbragt I

opstrøms for serinproteasedelen og formodes at have en vigtig funk- I

H tion ved binding af vævsplasminogenaktivatoren til en fibrinmatrix og I

dermed den iagttagne specifikke aktivitet hos den foreliggende vævs- I

plasminogenaktivator mod konkrete, eksisterende tromber. Den fore- I

25 liggende vævsplasminogenaktivator fremstilles med indhold af den I

enzymatisk aktive del svarende til nativt materiale, og udtrykket I

human vævsplasminogenaktivator definerer produkter, der omfatter en I

I sådan del alene eller sammen med yderligere amlnosyresekvenser op til I

molekylet med fuld længde. ^ I

I 30 Udtrykket "i det væsentlige ren form" betyder, når det anvendes til I

I at beskrive tilstanden af den humane t-PA-variant, der er fremstillet I ifølge opfindelsen, at den er fri for protein eller andre materialer, I der normalt er forbundet med human t-PA, når den produceres af lkke-

rekombinante celler, dvs. i dens "native" miljø. I

17 DK 175369 B1

Udtrykket "DHFR-protein* betegner et protein, som har den aktivitet, der er forbundet med dihydrofolatreduktase (DHFR), og som derfor er nødvendig for at blive produceret af celler, som kan overleve på et medium, der mangler hypoxanthin, glycin og thymidin (-HGT-medium).

5 Sædvanligvis er celler, der mangler DHFR-protein, ude af stand til at vokse på dette medium, og celler, der indeholder DHFR-protein, kan godt vokse dér. Inkorporering af DHFR-kodende sekvenser i rekombinan-te vektorer ifølge den foreliggende opfindelse udgør derfor en metode til selektion af vellykket transformerede værter.

10 "Celler, der er følsomme over for MTX" betegner celler, som ikke kan vokse på medier, som indeholder DHFR-inhibitoren methotrexat (MTX).

"Celler, der er følsomme over for MTX" er således celler, som, medmindre, de ændres genetisk eller suppleres på anden vis, ikke kan vokse under omgivelses- og mediebetingelser, der er egnede for celle-15 typen, når MTX-koncentrationen er 0,2 pg/ml eller derover. Nogle celler såsom bakterier udviser ikke MTX-følsomhed på grund af, at de ikke tillader MTX inden for deres cellegrænser, selv om de indeholder DHFR, som ellers ville være følsom over for dette stof. Celler, der indeholder DHFR, vil således generelt kun vare følsomme over for me-20 thotrexat, hvis de er permeable for eller i stand til at optage MTX.

"Vildtype-DHFR" henviser til dihydrofolatreduktase, som det almindeligvis findes i den bestemte organisme, der er tale om. Vildtype-DHFR er generelt følsomt in vitro over for lave methotrexat-koncentratio-ner. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 "Ekspressionsvektor" omfatter vektorer, der er i stand til at udtryk 2 ke DNA-sekvenser, som er indeholdt deri, hvor sådanne sekvenser er 3 operativt forbundet med andre sekvenser, som kan udvirke deres eks 4 pression. Det er underforstået, selv om det ikke altid udtrykkes eks 5 plicit, at disse ekspressionsvektorer skal være replikerbare i værts- 6 organismerne, enten som episomer eller som en integreret del af det 7 kromosomale DNA. Det er klart, at manglende replikerbarhed vil gøre 8 dem effektivt inoperable. I korthed er "ekspressionsvektor· angivet 9 som en funktionel definition, og en hvilken som helst DNA-sekvens, 10 som kan udvirke ekspression af en specificeret DNA-kode, der er an- 11 bragt deri, er omfattet af dette udtryk, som det anvendes med den

I DK 175369 B1 I

I I

specificerede sekvens. Ekspressionsvektorer, der kan anvendes ved I

rekombinante DNA*teknikker, er almindeligvis ofte i form af "plasmi- I

der", hvilket betegner cirkulære dobbeltstrengede DNA-løkker, som i I

deres vektorform ikke er bundet til kromosomet. I nærværende sammen· I

5 hæng anvendes "plasmid” og "vektor" i flæng, da plasmidet er den mest I

almindeligt anvendte form for vektor. Opfindelsen skal imidlertid I

omfatte sådanne andre former for ekspressionsvektorer, som opfylder I

tilsvarende funktioner, og som senere bliver kendte inden for områ- I

H det. I

10 "Rekombinante værtsceller" henviser til celler, som er blevet trans- I

formeret med vektorer, der er konstrueret under anvendelse af rekom- I

binante DNA-teknikker. Som defineret i den foreliggende sammenhæng I

H

H produceres t-PA-variant i de opnåede mængder som følge af denne I

transformation, og ikke i sådanne mindre mængder, eller mere alminde- I

H 15 ligt i sådanne mindre end detekterbare mængder, som kunne produceres I

af en utransformeret vært. t-PA produceret af sådanne celler kan be- I

tegnes som "rekombinant t-PA". I

I nærværende sammenhæng betegner udtrykket "en biologisk funktionel I

ækvivalent" af t-PA eller t-PA-variant naturlig t-PA eller t-PA- I

20 variant, i hvilke den naturlige sekvens (eller tilsvarende variantse- I

kvens), fx som vist i fig. lA-iC, er erstattet med en sekvens, der I

har en tilsvarende biologisk funktion. Fx har Kyte et al. (1982) J. I

Mol. Biol., 157:105, fundet, at visse aminosyrer kan udskiftes med I

andre aminosyrer med et tilsvarende hydropatisk indeks eller score og I

25 stadig bevare en tilsvarende biologisk aktivitet. Som vist i tabellen I

nedenfor tildeles aminosyrer et hydropatisk indeks på basis af deres I

hydrofobicitets- og ladningskarakteristika. Det formodes, at amino- I

I syrens relative hydropatiske karakter er bestemmende for det resul- I

H terende proteins sekundære struktur, hvilket igen definerer protei- I

30 nets interaktion med dets receptor. 1 tilfælde af t-PA antages det, I

H at der kan opnås biologiske funktionelle ækvivalenter af t-PA ved I

I substitution af aminosyrer med lignende hydropatiske værdier. I I

I nærværende sammenhæng er en biologisk funktionel ækvivalent af t-PA I

eller t-PA-variant udtrykt som biologisk aktivitet. Fx isoleucin, som I

35 har et hydropatisk indeks på +4,5, kan således indsættes i stedet for I

I valin (+4,2) eller leucin (+3,8), og der opnås stadig et protein oed I

19 DK 175369 B1 en lignende biologisk aktivitet. I den anden ende af skalaen kan lysin (-3,9) alternativt indsættes i stedet for arginin (-4,5) og så videre. Generelt formodes det, at aminosyrer med held kan substitueres, hvis en sådan aminosyre har en hydropatisk score inden for ca.

5 ±1 hydropatisk indeks-enhed af den udskiftede aminosyre.

Aminosyre Hydropatisk indeks

Isoleucin 4,5

Valin 4,2 10 Leucin 3,8

Phenylalanin 2,8

Cystein/cystin 2,5

Methionin 1,9

Alanin 1,8 15 Glycin -0,4

Threonin -0,7

Tryptophan *0,9

Serin -0,8

Tyrosin -1,3 20 Prolin *1,6

Histidin -3,2

Glutaminsyre -3,5

Glutamin -3,5

Asparaginsyre -3,5 25 Asparagin -3,5

Lysin *3,9

Arginin *4,5 a. Scedspecifik deletionsmutagenese 30 Som nævnt ovenfor produceres t-PA-varianter ifølge opfindelsen fortrinsvis ved specifikke deletionsmutationer. Deletionsmutanter, der er anvendelige ved udøvelse af opfindelsen, dannes lettest ved anvendelse af specifikke oligonukleotidsekvenser, som koder for DNA-se-kvensen af det ønskede deletionsforbindelsessted såvel som et til-35 strækkeligt antal tilgrænsende nukleotider, hvilket giver en primer- I DK 175369 B1 I 20 sekvens med tilstrækkelig størrelse og sekvenskompleksitet til at danne en stabil dobbeltstreng på begge sider af det deletionsforbin- H delsessted, som gennemskæres. En primer på mindst 27 nukleotiders H længde foretrækkes typisk, med ca. 10 nukleotider på 5'-siden af 5 forbindelsesstedet og 17 på 3'-siden.

Til fremstilling af den foretrukne des (1*44) t-PA*variant anvendes H der således fortrinsvis en primer med sekvensen: I Hin I s«r I 5' ACGACCCACATCTCTCCCTCTCAAAACJ' t-PA ?A45 præsekvens 10 Det er imidlertid klart, at der kan opnås en hvilken som helst grad H af fingerdeletion under anvendelse af lignende DNA-primere. Med H hensyn til deletionsmutanter, der koder for stigende carboxy- og/el- H ler aminoterminale dele af fingerområdet, kan der således fx i stedet H for ovenstående primer anvendes en primer med følgende sekvens: I His I δ'-ΑΟΟΑΟΟΟΑΟΑΟΑΟΤΟΑσΤΟΟΟΤσΚ-ν I præsekvens PA44 og så videre. Ved at "gå ned af" fingerdeletionen fra en fuldstændig I deletion (fx des 1-44) til faldende deletioner (fx des 1-43, des 2*43, des 2-42 osv.) tilvejebringes der t-PA-varianter med varierende H 20 forbedrede farmakokinetiske parametre i forhold til naturlig t-PA.

Den bestemte metodologi, de bestemte reagenser, etc., der kan anven- I des til fremstilling af sådanne forskellige deletionsvarianter, er beskrevet nedenfor i forbindelse med eksempler, der viser konstruk- I tionen af CVSVPA-N44 (D22), et plasmid, der koder for des (1-44) I 25 t-PA, eller omfatter teknikker, der er kendte på området.

I Hensigtsmæssige deletionsvarianter af t-PA-genet kan således frem- I stilles på denne generelle måde ud fra kendte t-PA-kodende vektorer, 21 DK 175369 B1 hvilke deletionsmutanter derefter yderligere kan anvendes til transformation af hensigtsmæssige værter.

b. Værtscellekulcurer og vektorer

De i nærværende sammenhæng beskrevne vektorer og den beskrevne frero-5 gangsmåde er egnet til anvendelse 1 værtsceller fra et bredt område af prokaryote og eukaryote organismer.

Prokaryoter foretrækkes naturligvis i almindelighed til kloning af DNA-sekvenser ved konstruktion af de vektorer, der kan anvendes ifelge opfindelsen. Fx er E. coli K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) 10 særligt egnet. Andre mikrobielle stammer, som kan anvendes, omfatter E. coli-stammer såsom E. coli B og E. coli X1776 (ATCC nr. 31537).

Disse eksempler tjener naturligvis kun som illustration og er ikke en begrænsning.

Prokaryoter kan også anvendes til ekspression. De ovenfor nævnte 15 stammer samt E. coli W3110 (F', λ", prototrof, ATCC nr. 273325), bacilli såsom Bacillus subtilis og andre enterobacteriaceae såsom Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens og forskellige Pseudomonas-arter kan ligeledes anvendes.

Generelt anvendes plasmidvektorer, der indeholder replikon- og kon-20 trolsekvenser, som stammer fra arter, der er kompatible med værtscellen, i forbindelse med disse værter. Vektoren bærer almindeligvis et replikationssted samt markørsekvenser, der kan tilvejebringe fænoty-pisk selektion i transformerede celler. Fx transformeres E. coli typisk under anvendelse af pBR322, et plasmid, som stammer fra en E.

25 coli-art (se fx Bolivar et al. (1977) Gene 2:95). pBR322 indeholder-gener for ampicillin- og tetracyclinresistens og tilvejebringer således midler til let identificering af transformerede celler. pBR.322-plasmidet eller andre mikrobielle plasmider eller fager skal også indeholde eller modificeres til at indeholde promotorer, der kan 30 udnyttes af den mikrobielle organisme til ekspression af dens egne proteiner.

I DK 175369 B1

De promotorer, der oftest anvendes ved rekombinant DNA-konstruktion, omfatter B-lactase- (penicillinase) og lactose-promotorsystemerne (Chang et al. (1978) Nature 375:615; Itakura et al. (1977) Science 198:1056; Goeddel et al. (1979) Nature 281:544) og et tryptophan- H 5 (trp)·promotorsystern (Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res., H 8:4057; EP 0036776). Selv om disse er de hyppigst anvendte, er der H opdaget og anvendt andre mikrobielle promotorer, og detaljer angående deres nukleotidsekvenser er offentliggjort, hvilket gør det muligt H for fagfolk at ligere dem funktionelt med plasmidvektorer (se fx I 10 Siebwenlist et al. (1980) Cell 20:269).

H Foruden prokaryoter kan der også anvendes eukaryote mikrober såsom H gærkulturer. Saccharomyces cerevisiae eller almindeligt bagergsr er H den mest almindeligt anvendte blandt de eukaryote mikroorganismer, H selv om en række andre stammer er almindeligt tilgængelige. Til H 15 ekspression i Saccharomyces anvendes almindeligvis fx plasmidet YRp7 H (Stinchcomb et al. (1979) Nature 282:39; Kingsman et al. (1979) Gene 7:141; Tschemper et al. (1980) Gene 10:157). Dette plasmid indeholder H allerede trpl-genet, som udgør en selektionsmarkør for en muteret H gærstamme, der mangler evne til at vokse i tryptophan, fx ATCC nr.

20 44076 eller PEP4-1 (Jones (1977) Genetics 85:12). Tilstedeværelsen af H trpl-læsionen som et træk ved gærværtscellens genom tilvejebringer dermed et effektivt miljø til detektion af transformation på grund af ' H vækst i fravær af tryptophan.

Egnede promotorsekvenser i gærvektorer omfatter promotorerne for 3- 25 phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem.

255:2073) eller andre glycolytiske enzymer (Hess et al. (1968) J.

I Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al. (1978) Biochemistry 17:4900) såsom enolase, glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphatisomera- 30 se, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, trlosephosphatlsomerase, I phosphoglucoseisomerase og glucokinase. Ved konstruktion af hensigts - mæssige ekspressionsplasmider ligeres de terminationssekvenser, der I er forbundet med disse gener, også ind i ekspressionsvektoren 3' i I forhold til den sekvens, der skal udtrykkes, for at tilvejebringe H 35 polyadenylering af oRNA’et og termination. Andre promotorer, der har I den yderligere fordel, at de transkriberes under kontrol af vækstbe- 23 DK 175369 B1 tingelser, er prorootorområdet for alkoholdehydrogenase 2, isocyto* chrom C, syrephosphatase, nedbrydende enzymer forbundet med nitrogen-metabolisme og det ovenfor navnte glyceraldehyd-3-phosphatdehydroge-nase samt enzymer, der er ansvarlige for maltose- og galactoseudnyt-5 telse. En hvilken som helst piasmidvektor, der indeholder gærkompati-bel promotor, replikationsinitieringssted og terminationssekvenser, er egnet.

Foruden mikroorganismer kan der som værter også anvendes kulturer af celler fra flercellede organismer. I princippet kan en hvilken som 10 helst sådan cellekultur anvendes, både fra kulturer af hvirveldyr og hvirvelløse dyr. Der har imidlertid varet størst interesse for celler fra hvirveldyr, og propagation af celler fra hvirveldyr i kultur (vævskultur) er blevet en rutinemæssig procedure inden for de senere år (Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, red. (1973)).

15 Eksempler på sådanne anvendelige værtscellelinjer er VERO* og HeLa-celler, kinesisk hamsterovarie-(CHO)*cellelinjer samt W138-, BHK-, C0S-7- og MDCK-cellelinjer. Ekspressionsvektorer for sådanne celler omfatter almindeligvis (om nødvendigt) et replikationsinitierings-sted, en promotor anbragt foran det gen, der skal udtrykkes, sammen I 20 med eventuelle nødvendige ribosombindingssteder, RNA-splejsnings- I steder, polyadenyleringssted og transkriptionsterminationssekvenser.

I Til anvendelse i pattedyrceller udgøres kontrolfunktionerne på eks- I pressionsvektorerne ofte af viralt materiale. Fx stammer almindeligt I anvendte promotorer fra polyom, Adenovirus 2 og hyppigst Simian Virus I 25 40 (SV40). De tidlige og sene promotorer fra SV40-virus er særligt I egnede, fordi begge let opnås fra viruset i form af et fragment, som I også indeholder SV40*virusreplikationsinitieringsstedet (Fiers et al.

I (1978) Nature 273:113). Hindre eller større SV40-fragmenter kan også I anvendes, forudsat at der er inkluderet den ca. 250 bp lange sekvens, I 30 der strækker sig fra Hindlll*stedet mod Bgll-stedet og er lokaliseret I i virusreplikationsinitieringsstedet. Det er endvidere også muligt og I ofte ønskeligt at anvende de promotor- eller kontrolsekvenser, der I normalt er forbundet med den ønskede gensekvens, forudsat at sådanne I kontrolsekvenser er kompatible med værtscellesystemerne.

I DK 175369 B1 H Ec replikationsinitieringssted kan enten tilvejebringes ved konstruk- H tion af vektoren, således at den omfatter et eksogent initierings- H sted, som kan afledes af en SV40-kilde eller en anden viral (fx H polyom, adeno, VSV, BPV) kilde eller kan tilvejebringes af værtscel- H 5 lens kromosomale replikationsmekanisrne. Hvis vektoren integreres i H værtscellens kromosom, er sidstnævnte ofte tilstrækkeligt.

H Ved selektion af en foretrukken værtscelle til transfektion med H vektorerne ifelge opfindelsen, hvilke vektorer omfatter DNA-sekven- H ser, der koder for både t-PA-variant og DHFR-protein, er det hen- H 10 sigtsmæssigt at selektere værten alt efter den anvendte type DHFR- H protein. Hvis der anvendes vildtype-DHFR-protein, foretrækkes det at H selektere en værtscelle, som mangler DHFR, hvilket muliggør anvende1- se af den DHFR-kodende sekvens som markør for vellykket transfektion H i selektivt medium, som mangler hypoxanthin, glycin og thymidin. En

H 15 hensigtsmæssig værtscelle i dette tilfælde er kinesisk hamsterovarie- I

H (OHO)-cellelinjen, som mangler DHFR-aktivitet, og som fremstilles og

propageres som beskrevet af Urlaub og Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. I

I Sci. (USA) 77:4216.

Hvis der som kontrollerende sekvens anvendes DHFR-protein med lav I

H 20 bindingsaffinitet for MTX, er det på den anden side ikke nødvendigt I

at anvende DHFR-deficiente celler. Da DHFR-mutanten er resistent over I

H for methotrexat, kan MTX-holdige medier anvendes som selektionsmid- I

del, forudsat at værtscellerne selv er methotrexat-følsomme. De I

fleste eukaryote celler, som er i stand til at absorbere MTX, ser ud I

25 til at være methotrexat-følsomme. En sådan anvendelig cellelinje er I

en CH0-linje, CH0-K1 ATCC nr. CCL 61.

Der produceres tilfredsstillende mængder human t-PA af cellekulturer, I

H men forfinelser under anvendelse af en sekundær kodende sekvens I

H tjener til at forøge produktionsniveauerne endnu mere. Den sekundære I

30 kodende sekvens omfatter dihydrofolatreduktsae (DHFR), som påvirkes I

af en eksternt kontrolleret parameter såsom methotrexat, hvilket I

muliggør ekspressionskontrol ved kontrol af methotrexat-(MTX)-koncen- I

trationen. I

25 DK 175369 B1 c. Anvendte metoder

Hvis der som værtsceller anvendes celler uden meget store cellemembranbarrierer, udføres transfektion ved calciumphosphat-præcipitati-onsmetoden som beskrevet af Graham og Van der Eb, Virology (1978) 5 52:546. Der kan imidlertid også anvendes andre metoder til indføring af DNA i celler såsom ved nukleær injektion eller ved protoplast-fusion.

Hvis der anvendes prokaryote celler eller celler, der indeholder betydelige cellevægkonstruktioner, er den foretrukne transfektions-10 metode calciumbehandling under anvendelse af calciumchlorid som beskrevet af Cohen, F.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69:2110.

Ved konstruktion af hensigtsmæssige vektorer indeholdende de ønskede kodende sekvenser og kontrolsekvenser anvendes der standardligerings-15 teknikker. Isolerede plasmider eller DNA-fragmenter skæres, skræddersys ("tailored") og religeres i den ønskede form til dannelse af de ønskede plasmider.

Skæring udføres ved behandling med et restriktionsenzym (eller -enzymer) i en hensigtsmæssig buffer. Der anvendes i almindelighed ca.

20 1 μg plasmid eller DNA-fragmenter med ca. 1 enhed enzym i ca. 20 μΐ bufferoplcsning. (Egnede buffere og substratmængder til bestemte restriktionsenzymer er angivet af forhandleren.) Inkubationstider på ca. 1 time ved 37®C er anvendelige. Efter inkubationerne fjernes proteinet ved ekstraktion med phenol og chloroform, og nukleinsyren 25 isoleres fra den vandige fraktion ved precipitation med ethanol.

Hvis stumpe ender ønskes, behandles præparationen i 15 minutter ved 15®C med 10 enheder polymerase I (Klenow), ekstraheres med phenol-chloroform og præcipiteres med ethanol.

Størrelsesadskillelse af de skårne fragmenter udføres med 6X poly-30 acrylamidgel som beskrevet af Goeddel, D. , et al. Nudele Acids Res.

(1980) 8:4057.

I DK 175369 B1

Til ligering anvendes i det væsentlige ækvimolære mængder af de øn- I

H skede bestanddele, soa er ende'skræddersyet på passende måde til dan' I

H nelse af korrekt matching, og disse behandles aed ca. 10 enheder T4· I

H DNA-ligase pr. 0,5 /ig DNA. (Når skårne vektorer anvendes som bestand- I

5 dele, kan det være nyttigt at forhindre religering af den skårne I

H vektor ved forbehandling med bakteriel alkalisk phosphatase.) I

H Som nævnt ovenfor produceres t-PA-varianter ifølge opfindelsen for- I

trinsvis ved hjælp af specifik deletionsautation. Deletionsmutanter, der kan anvendes ved udøvelse af den foreliggende opfindelse, dannes

H 10 lettest ved anvendelse af specifikke oligonukleotidsekvenser, som I

H koder for DNA-sekvensen af de ønskede deletionsforbindelsessteder

såvel som et tilstrækkeligt antal tilgrænsende nukleotider, hvilket I

giver en sekvens med tilstrækkelig størrelse og sekvenskompleksitet I

H til at udgøre en stabil dobbeltstreng på begge sider af det dele* H 15 tionsforbindelsessted, der gennemskæres.

H Til analyse til bekræftelse af korrekte sekvenser i de konstruerede H plasmider anvendes ligeringsblandingerne til transformation af E.

H coli K 12-stamme 294 (ATCC 31446), og vellykkede transformanter se- H lekteres ved ampicillin- eller tetracyclinresistens, alt efter behov.

H 20 Der fremstilles plasmider fra transformanterne, og disse analyseres H ved restriktion og/eller sekventeres ved fremgangsmåden ifølge Mes· sing et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:309, eller ved fremgangsmåden ifølge Maxam et al. (1980) Methods of Enzymology 65:499.

Amplifikation af DHFR-proteinkodende sekvenser udføres ved dyrkning 25 af værtscellekulturer i nærværelse af ca. 20-500.000 nM-koncentratio- ner af methotrexat, en kompetitiv inhibitor af DHFR-aktivitet. Det H effektive koncentrationsområde er naturligvis meget afhængigt af arten af DHFR-genet, proteinet og værtens karakteristika. Det er klart, at generelt definerede øvre og nedre grænser ikke kan angives.

30 Der kan også anvendes hensigtsmæssige koncentrationer af andre folin- syreanaloger eller andre forbindelser, som inhiberer DHFR, MTX er H imidlertid selv hensigtsmæssig, let tilgængelig og effektiv.

I I nedenstående eksempler er der beskrevet foretrukne udførelsesfomer I i form af eksperimenter, som ansøgerne har udført for at påvise ud- 27 DK 175369 B1 øvelsen og den overraskende anvendelighed af den foreliggende opfindelse. Det er klart for fagfolk, at disse metoder repræsenterer sådanne, som nærværende opfindere har fundet at virke godt ved udøvelse af opfindelsen, og disse eksperimenter udgør på Ingen måde den eneste 5 måde, hvorpå man kan opnå fordelene ved den foreliggende opfindelse.

EKSEMPEL 1

Fremstilling af des (1-44) human t-PA-variant

Som nævnt kort ovenfor er den mest hensigtsmæssige metode til indføring af specifikke deletioner i naturlig t-PA's fingerområde stedspe-10 cifik delecionsmutagenese af de tilgrundliggende cDNA-gensekvenser.

Ved denne metode benyttes der en enkeltstrenget syntetisk "primer"-sekvens, som koder for den ønskede nye sekvens. Den nye primer hybri-diseres til en enkeltstrenget skabelon, som bærer komplementære sekvenser, typisk en skabelon, der koder for det gen, hvorfra sekven-15 ser skal deleteres. Efter at primeren er forlænget ved anvendelse af DNA-polymerase, lades hybridmolekylet replikere i en hensigtsmæssig vært.

Til fremstilling af en des (1-44) t-PA-mutant blev der udført steddirigeret deletionsmutagenese under anvendelse af et udgangsplasmid, 20 som koder for t-PA cDNA-strukturgenet og en del af det 3'-ikke-trans-laterede område. Fremstillingen af dette plasmid, pPADHFR-6 (også betegnet pETPFR) samt betingelser for dets ekspression i egnede værter og oprensning af det resulterende protein er beskrevet i detaljer i EP 093.619, hvortil der henvises. Et skematisk diagram 25 over de trin, der blev udført for at foretage deletionen, er vist i fig. 2. Den anvendte grundlæggende metodologi er beskrevet i Adelman et al. (1983) DNA 2:183, hvortil der henvises.

Plasmidet pPADHFR-6 blev skåret med Stul og EcoRI for at frigøre et 826 basepar langt fragment, der omfattede sekvenser, som kodede for 30 t-PA-præsekvensen til og med aminosyre 203. Dette fragment blev ligeret med vektorfragmentet af Smal/EcoRI-skåret M13mpl0RF, en replikativ form af en M13-fagvektor (se fx Messing et al., Third I DK 175369 B1 I 28 H Cleveland Symposium on Hacromolecules Recombinant DHA, red. A. Wal- H ton, Elsevier, Amsterdam (1981)). Det intermediate plasmid, pPA- N44intA, var således en replikativ form af M13-fagen, som omfattede den del af t-PA-genet, hvorfra kodonerne for aminosyreme 1-44 skulle H 5 fjernes ved sceddirigeret deletionsmutagenese.

H Til udførelse af denne mutagenese blev der fremstillet en oligonukle- H otid·primer ved en metode såsom phosphotriester-metoden ifølge Crea et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765. Den primer, der blev anvendt til fremstilling af en des (1-44)-mutant, var som føl- 10 ger: I Bglll I s*r 5’ ACGACCCACj&CTCTCCCTCTCAAAAC 3' I t-PA PA45 præsekvens

Det kan ses, at de 10 5'-nukleotider af denne primer koder for prase- H kvensens aminosyrer -3 til -1 (gly-ala-arg), mens de 17 3’-nukleoti- 15 der koder for aminosyreme 45 til og med 49 (SER-VAL-PRO-VAL-LYS).

Bemark, at "TCTH-kodonen blev anvendt for serin-45 for at bevare

Bglll-stedet.

Ca. 200 mg af det syntetiske oligonukleotid blev phosphoryleret i 30

I minutter ved 37eC i 30 pi 50 mK Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM HgCl2, 10 mM

I 20 dithiothreitol, 1 mM ATP indeholdende ca. 8 U T4-polynukleotidkinase.

I Til heteroduplex-dannelse blev ca. 50 ng enkeltstrenget pPA-N44intA

I opvarmet til 95°C (10 minutter) og langsomt afkølet til stuetempera-

tur (30 minutter) og derefter til 4*C i ca. 40 pi 10 mM Tris-HCl, pH

I 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol indeholdende 100 ng af den I 25 phosphorylerede primer. Primerforlangelse blev påbegyndt ved tilsat- I ning af 10 pi ligasebuffer indeholdende 2 mM ATP, 0,25 nM af hver af I dGTP, dCTP, dATP, dTTP, 5 U E. coli polymerase I stort (Klenov) I fragment og 400 U T4-DNA-ligase. Efter 1 time ved 15*C blev reak- tionsblandingen anvendt til transformation af JMlOl-eeller.

29 DK 175369 B1

Transformation blev udført ved blanding af hele ligeringsblandingen med 200 μΐ kompetente JK101*celler efterfulgt af inkubation på is i 30 minutter og 5 minutter ved 37“C. Derefter blev 3,5 ml 2YT-topagar ved 55eC blandet med 200 pi af de fag-mættede celler, 10 pi IPTG 5 (200 mM) og 50 μΐ X-gal, og efter tilsætningen blev cellerne udpladet på Petri-skåle indeholdende 2YT uden lægemidler.

Farveløse plaques blev udvalgt og overført til en mikrotiterskål indeholdende 100 μΐ 2YT-medium. De inokulerede mikrotitervæsker blev anbragt på LB-agarplader med en diameter på 15 cm og overlejret med 10 en plæne af 600 μΐ JMlOl-celler i 8 ml 2YT-topagar og inkuberet natten over ved 37eC. De dannede plaques blev overført til en nitrocelluloseskive ved fysisk kontakt i 1 minut. Nitrocelluloseskiven blev behandlet med 0,5 M NaOH, 1,5 H NaCl i 3 minutter og vasket to gange med 3 M NaCl-0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, i 15 minutter og derefter 15 med 2X SSC i 15 minutter. Præhybridiseringsblandingen indeholder 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCl, IX Denhardt 0.5X NP40, 100 μΜ ATP, 1 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natriumphosphat og 50 pg/ml £. coli tRNA. IX Denhardt indeholder pr. liter 200 mg Fi-coll, 200 mg polyvinylpyrrolidon, 200 mg bovint serumalbumin (BSA; 20 fraktion V). Skiven blev bagt ved 80*C i vakuum i 90 minutter. Derefter blev skiven inkuberet i 3 timer med 6 ml præhybridiseringsvæske i en Petri-skål efterfulgt af tilsætning af 5x10^ cpm mærket primer og hybridiseret natten over. Selektiv vask af skiven blev udført med 0,4X SSC ved 49eC, og efter lufttørring blev skiven eksponeret på 25 røntgenfilm. Positivt hybridiserende kloner blev analyseret yderligere ved dideoxy-sekventering, se Adelman, ibid. Blandt de positive kolonier blev der selekteret et rekombinant plasmid med betegnelsen pPA-N44intA delta, som indeholdt den korrekte deletion.

For at erstatte den muterede gensekvens fra M13-fagen i korrekt eks-30 pressionssammenhæng i den DHFR-holdige ekspressionsvektor blev plas-raidet pPADHFR-6 skåret separat med Bgll/Kpnl for at isolere det store fragment, som koder for DHFR-genet, og BstXI/Kpnl for at isolere et 2240 basepar langt fragment, som koder for 3'-enden (aminosyrerne 45-527) af naturlig t-PA. Et 400 basepar langt fragment, som bærer N44-35 mutationen, blev isoleret fra pPA-N44intA delta ved skæring med Bglll/BstXI og ligeret sammen med de to fragmenter fra pPADHFR-6.

I DK 175369 B1 I

I 30 I

I Produktet fra denne ligering, soo blev betegnet CVSVPA-N44 D22, var I

I således en kopi af stamplasmidet pPADHFR-6 bortset fra, at de kodo· I

I ner, der koder for aminosyrerne 1-44, var fjernet. I

I EKSEMPEL 2 I

I 5 Transfektion af CHO-celler med CVSVPA-N44 (D22) I

I Det rekombinante plasmid CVSVPA-N44 (D22) blev udtrykt i DHFR-CHO- I

I celler, der var fremstillet som beskrevet ovenfor. CHO-cellerne blev I

I dyrket til ca. 75X konfluens og transficeret med ca. 2 μg plasmid-DNA I

I (ca. 1/2 normal miniscreen), som i forvejen var udsat for RNase i I

I 10 Tris-EDTA-buffer. DNA'et blev tilsat 50 mM CaPO^/HEPES, og dette I

materiale blev anvendt til transfektion af cellerne, generelt som I

I beskrevet af Graham et al. (1978) Virology 52:546. Kort beskrevet I

I blev mediet fjernet fra enkeltlag-cellerne i en 100 mm dyrkningsskål I

I og udskiftet med ca. 5 ml Ham's F12-medium med 10X FCS. Det calcium- I

I 15 præcipiterede DNA blev anbragt på cellerne og lodes sidde ved 37®C i I

I 2 timer. I

Efter ca. 2 timer blev cellerne udsat for glycerolchok ved fjernelse I

I af det gamle medium og tilsætning af 1 ml chokopløsning (20Z glycerol I

I i PBS) i ca. 45 sekunder. Cellerne blev derpå vasket med F12-medium I

I 20 for at fjerne glycerol og på ny tilsat frisk medium i ca. 48 timer. I

I På dette tidspunkt blev cellerne opdelt ca. 1/10 og anbragt på selek- I

I tivt medium (Ham's F12, G- H- T-, med 10X grundigt dialyseret FCS). I

I Efter udpladning på selektivt medium blev cellerne nedfrosset, Indtil I

I de skulle anvendes til fremstilling af des (1-44) t-PA. I

I 25 EKSEMPEL 3 I

I Fremstilling af des (1-44) human t-PA I

I Des 1-44 t-PA blev udtrykt i kinesisk hamsterovarie-(CHO)-celler som I

I beskrevet ovenfor. Supernatanteme blev opsamlet, filtreret og opbe- I

I varet ved -20®C i nærværelse af aprotinin. t-PA blev oprenset fra I

31 DK 175369 B1 cellesupernatanterne under anvendelse af kendte fremgangsmåder (se fx GB 2.119.804; EP 041.766, 093.619 eller 199.574, hvortil der henvises) eller en raonoklonal antistof*søjle. Især blev transformerede CHO-celler dyrket til konfluens i rysteflasker i F12-medium inde-5 holdende 10X FBS, 500 mM MTX, 200 mM glutamin, 20 oM Hepes, 100 U/ml penicillin-streptomycin, hvorefter mediet blev udskiftet med serumfrit medium, og inkubationen blev fortsat 15-6 dage. Cellerne blev skilt fra, og supernatanten blev ledt hen over en 2n-chelaterende søjle (se fx EP 199.574) og vasket med 2 søjlevolumina 1 M NaCl, 10 50 nM Tris, pH 8,0. t-PA-varianten blev derefter elueret med den samme buffer indeholdende 50 mM imidazol, og reagensglas med aktivitet blev samlet i pujle.

Dette materiale blev derefter dialyseret i 25 mM Tris, 0,5 M NaCl, pH

8,0, og ledt hen over en lysin-sepharose-søjle. Efter vask med 2 15 søjlevolumina 0,8 M NaCl, 40 mM NaPO^, blev det elueret med 50 mM NaPO*,, 0,2 M arginin, pH 7,2-7,4. Selv om den argininkoncentration, der krævedes for at eluere des 1-44 t-PA fra lysin-agarose, svarede til den koncentration, der krævedes for at eluere t-PA med normal sekvens, var det nødvendigt at påføre des 1-44 t-PA på søjlen meget 20 langsomt for at sikre, at det ville binde.

Proteinkoncentrationer blev bestemt ved ELISA og standardiseret til aminosyreanalyse af både des 1-44 t-PA og t-PA med normal sekvens. Proteinrenhed og -homogenitet blev analyseret ved N-terminal sekven-tering på en prototype gas/væskefase-sekvenator og ved polyacrylamid-25 gelelektroforese i nærværelse af natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) med buffersystemet ifølge Laemmli (1970) Nature 227:680. Typisk blev der anvendt 7-17X gradientgeler, og proteiner blev visualiseret ved hjælp af sølvfarvningsteknikken ifølge Morrissey (1981) Anal. Biochem.

117:307. t-PA med naturlig sekvens blev udtrykt og oprenset på lig-30 nende måde.

Både t-PA og des 1-44 t-PA blev oprenset til homogenitet under anvendelse af identiske teknikker, og hvert protein havde den forventede molekylvægt ifølge SDS-PAGE. Selv om det syntetiseres som én polypep-tidkæde, kan ikke-resistent énkædet t-PA let hydrolyseres ved Arg275-35 Ile276-peptidbindingen til dannelse af en tokædet form. Fig. 3 viser,

I DK 175369 B1 I

I 32 1

I at i fravær af reduktionsmidler er den skønnede molekylvægt af t-PA H

I og des 1-44 t-PA henholdsvis ca. 60.000 og 55.000. Når proteinernes H

I tokædede former blev reduceret ved tilsætning af dithiothreitol, I

I udviste t-PA bånd ved ca. 35.000 Dalton og et diffust bånd fra ca. I

I 5 30.000 til 34.000 Dalton, svarende til proteasedelen af molekylet I

I (resterne 275-527) og henholdsvis det aminoterminale finger-, vækst- I

I faktor- og kringleområde (resterne 1-275). Des 1-44 t-PA udviste bånd I

I ved en molekylvægt på ca. 35.000 og et diffust bånd fra ca. 25.000 I

I til 30.000, hvilket svarer til en proteasedel, der er identisk med I

I 10 den i t-PA, og et aminoterminalt område med en lavere molekylvægt end I

I det tilsvarende område i t-PA. Identifikationen af disse bånd blev I

I bekræftet ved et Western Blot under anvendelse af antistoffer mod den I

I aminoterminale halvdel af t-PA. H

I Aminoterminal sekventering af prøver af begge proteiner viste, at I

I 15 hvert protein havde en mindre sekvens I-K-G svarende til resterne I

I 276-278, hvilket tyder på, at prøverne var i den tokædede form. Den I

I anden større sekvens i t-PA-prcven var S-Y-Q svarende til resterne I

I 1-3.1 des 1-44 t-PA var den vigtigste sekvens S-V-P, hvilket svarer I

I til resterne 45-47 og bekræfter, at fingerområdet (resterne 1-44) var I

I 20 deleteret, og at det muterede protein blev udtrykt og processeret

I korrekt med resten 45 som den nye aminoterminal. I

I Selv om resultaterne af SDS-PAGE og sekvensanalyse bekræftede, at des I

I 1-44 t-PA var et homogent protein med den forventede molekylvægt og I

I sekvens, kan deletion af ét område i proteinet have betydelige virk- I

I 25 ninger på strukturen og foldningen af resten af molekylet. Selv om

der ikke findes nogen direkte tests til undersøgelse af molekylets I

I sekundære og tertiære struktur, er det blevet fundet, at begrænset I

I proteolyse er effektiv til identifikation af ukorrekt foldede moleky- I

I ler. Når nedbrydningsmønsteret for trypsinbehandlet t-PA og des 1-44 I

I 30 t-PA blev sammenlignet, blev der ikke iagttaget nogen forskelle I

I (fig. 4). Selv om det aminoterminale område i des 1-44 t-PA-prøver I

I (se fig. 4) har en lavere molekylvægt end det tilsvarende område i I

I t-PA, var hverken proteaseområdet eller det aminoterminale område af I

I des 1-44 t-PA mere udsat for proteolyse med trypsin. Proteolyse ved I

I 35 højere trypsin-t-PA-forhold og flere forhold mellem chymotrypsin og I

I pepsin og t-PA viste heller ingen forskelle i proteolysegraden. I

r . - _ ' ΒΒ^ΒΙΙ^^^ΜΙΙΒΓ^τγ ' ^ ^ »'-'T^ ~ Γ> _i«anfit,g'«· DK 175369 B1 33 EKSEMPEL 4

Fremstilling og anvendelse af en ekspressionsvektor til rekombinanc produktion af des 1-44 Glu 275 t-PA-varianter 1. Plasmidkonstruktioner 5 a. Plasmid pll54 1) Plasmid pPADHFR-6

Plasmidet pPADHFR-6 (også betegnet pETPFR) blev fremstillet som beskrevet i fx EP 093.619 supra, hvortil der henvises, se fig. 1 for perspektivdetaljer. Dette plasmid i sig selv samt i transficeret 10 form i CHO-celler er den 15. december 1987 blevet deponeret hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA og har fået henholdsvis ATCC nr. 40403 og CRL 9606.

2) Plasmid pCVSVPA-N44 D22

Plasmidet pCVSVPA-N44 D22 blev fremstillet som beskrevet ovenfor. For 15 at rekapitulere blev plasmidet pPADHFR-6 (supra) skåret med Stul og EcoRI til frigørelse af et 826 basepar langt fragment, der omfattede sekvenser, som koder for t-PA-prasekvensen til og med aminosyre 203.

Dette fragment blev ligeret med vektorfragmentet af Smal/EcoRI-skåret M13mpl0RF, en replikativ form af Ml3*fagvektoren (se fx Messing et 20 al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, red. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981)). Det intermediate plasmid, pPA-N44intA, var således en replikativ form af M13-fagen, som omfattede den del af t-PA-genet, hvorfra kodonerne for aminosyreme 1-44 skulle fjernes ved steddirigeret deletionsmutagenese. 1

Til udførelse af denne mutagenese blev der fremstillet en oligonukle-otid-primer ved en metode såsom phosphotriester-metoden ifølge Crea et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765. Den primer, der

DK 175369 B1 I

blev anvendt til fremstilling af en des (1-44)-mutant, var som føl- I

ger: I

Bglll I

Ser I

5* AGCACCCAG/ErCTCTCCCTCTCAAAAG I

t-PA PA45 I

præsekvens I

5 Det kan ses, at de 10 5'-nukleotider af denne primer koder for prase- H

kvensens aminosyrer -3 til -1 (gly-ala-arg), mens de 17 3'-nukleoti- I

der koder for aminosyrerne 45 til og med 49 (SER-VAL-PRO-VAL-LYS). I

Bemærk, at "TCT"-kodonen blev anvendt for serin-45 for at bevare H

Bglll-stedet. H

10 Ca. 200 rag af det syntetiske oligonukleotid blev phosphoryleret i 30 I

minutter ved 37eC i 30 μΐ 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM I

dithiothreitol, 1 mM ATP Indeholdende ca. 8 U T4-polynukleotidkinase. I

Til heteroduplex-dannelse blev ca. 50 ng enkeltstrenget pPA-N44intA I

opvarmet til 95eC (10 minutter) og langsomt afkølet til stuetempera-

15 tur (30 minutter) og derefter til 4*C i ca. 40 μΐ 10 mM Tris-HCl, pH I

7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol indeholdende 100 ng af den I

phosphorylerede primer. Primerforlangelse blev påbegyndt ved tilsat- I

ning af 10 μΐ ligasebuffer indeholdende 2 mM ATP, 0,25 mM af hver af I

dGTP, dCTP, dATP, dTTP, 5 U £. coli polymerase I stort (Klenov) I

20 fragment og 400 U T4-DNA-ligase. Efter 1 time ved 15*C blev reakti- I

onsblandingen anvendt til transformation af JMlOl-celler. I

Transformation blev udført ved blanding af hele ligeringsblandingen I

med 200 μΐ kompetente JMlOl-celler efterfulgt af inkubation på is i I

30 minutter og 5 minutter ved 37’C. Derefter blev 3,5 ml 2YT-topagar 9

25 ved 55‘C blandet med 200 μΐ af de fag-mattede celler, 10 /ti IPTC I

(200 mM) og 50 μΐ X-gal, og efter tilsatningen blev cellerne udpladet

på Petri-skåle indeholdende 2YT uden legemidler. I

Farveløse plaques blev udvalgt og overført til en mikrotiterskål I

indeholdende 100 μΐ 2YT-medium. De lnokulerede mikrotitervesker blev I

30 anbragt på LB-agarplader med en diameter på 15 cm og overlejret med I

35 DK 175369 B1 en plæne af 600 μΐ JMlOl-celler i β ni 2YT-topagar og Inkuberet natten over ved 37°C. De dannede plaques blev overført til en nitrocelluloseskive ved fysisk kontakt i 1 minut. Nitrocelluloseskiven blev behandlet med 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl i 3 minutter og vasket to 5 gange med 3 M NaCl-0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, i 15 minutter og derefter med 2X SSC i 15 minutter. Præhybridiseringsblandingen Indeholder 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCl, IX Denhardt 0,5X NP40, 100 μΜ ATP, 1 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natriumphosphat og . 50 μg/πll E. c oli tRNA. IX Denhardt indeholder pr. liter 200 mg Fi-10 coll, 200 mg polyvinylpyrrolidon, 200 mg bovint serumalbumin (BSA; fraktion V). Skiven blev bagt ved 80*C i vakuum i 90 minutter. Derefter blev skiven inkuberet i 3 timer med 6 ml præhybridiseringsvæske i en Petri-skål efterfulgt af tilsætning af 5x10^ cpm mærket primer og hybridiseret natten over. Selektiv vask af skiven blev udført med 15 0,4X SSC ved 49“C, og efter lufttørring blev skiven eksponeret på røntgenfilm. Positivt hybridiserende kloner blev analyseret yderligere ved dideoxy-sekventering, se Adelman, supra. Blandt de positive kolonier blev der selekteret et rekombinant plasmid med betegnelsen pPA-N44intA delta, som indeholdt den korrekte deletion. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

For at erstatte den muterede gensekvens fra M13-fagen i korrekt 2 ekspressionssammenhæng i den DHFR-holdige ekspressionsvektor blev 3 plasmidet pPADHFR-6 skåret separat med Bgll/Kpnl for at isolere det 4 store fragment, som koder for DHFR-genet, og BstXI/Kpnl for at isole 5 re et 2240 basepar langt fragment, som koder for 3'-enden (amino- 6 syrerne 45-527) af naturlig t-PA. Et 400 basepar langt fragment, som 7 bærer N44 (des 1-44)-mutationen, blev isoleret fra pPA-N44intA delta 8 ved skæring med Bglll/BstXI og ligeret sammen med de to fragmenter 9 fra pPADHFR-6. Produktet fra denne ligering, som blev betegnet 10 CVSVPA-N44 D22, var således en kopi af stamplasmidet pPADHFR-6 bort- 11 set fra, at de kodoner, der koder for aminosyreme 1-44, var fjernet.

12 3) Plasmid pPADHFR-6 2C9 13

Plasmidet pPADHFR-6 2C9 blev fremstillet som beskrevet i fx US-pa 14 tentansøgning nr. 07/071.506 indleveret den 9. juli 1987 og dens 15 stamansøgninger, se ovenfor. Kort beskrevet blev humant t-PA-DNA op- 16 nået fra plasmiderne pPADHFR-6 (også betegnet pETPFR) og pA25E10.

I DK 175369 B1 I

I I

I Fremstillingen af disse to t-PA-plasmider er beskrevet i EP 093.619 I

I supra. I

I Plasmidet pA25E10 indeholder sekvenser, som koder for de sidste 508 I

I aminosyrer af t-PA-genet og 772 basepar af det 3'-ikke-translaterede I

I 5 område. Dette plasmid blev skAret med SacI og Bglll til dannelse af I

I et 744 basepar langt fragment, som blev isoleret ved standardmetoder

I som beskrevet tidligere. Dette fragment indeholder kodonerne for t-PA

I aminosyrerne All til og med 527 og omfatter en del af det 3'-ikke·

I translaterede område. I

I 10 Plasmidet pPADHFR-6 indeholder hele strukturgenet for t-PA og en del I

I af det 3ikke -translaterede område. Dette plasmid blev skåret med I

I SacI og Bglll til dannelse af et 1230 basepar langt fragment, som I

I blev isoleret. Dette fragment indeholder kodoner for de første 410 I

I aminosyrer af den færdige form af t-PA. I

I 15 Disse fragmenter blev ligeret sammen under anvendelse af standard- I

I metoder og skåret med Bglll. Der blev isoleret et 1974 basepar langt I

I fragment, der indeholdt kodoner for hele den færdige t-PA-sekvens I

I plus en del af det 3ikke-translaterede område. Dobbeltstrenget I

I M13rap8 (Messing, supra) blev skåret med BamHI og sammenføjet med det I

I 20 Bglll-skårne t-PA til dannelse af Ml3mp8PABglIl. E. coli JM101-celler I

I (ATCC nr. 33876) blev transformeret med den dobbéltstrengede replika- I

I tive form af M13mp8PABglII. De enkeltstrengede og dobbeltstrengede I

I (RF) former af M13mp8PABglII kan isoleres fra E. eoli JMlOl-celler I

I inficeret med denne fag. Den enkeltstrengede form blev anvendt til I

I 25 den stedspecifikke mutagenese af t-PA. I

I Det humane t-PA-strukturgen blev modificeret ved stedspecifik mutage- I

I nese til at udtrykke t-PA med aminosyresubstitution ved de relevante I

I forskellige positioner. Et syntetisk oligonukleotid blev fremstillet I

I fx ved fastfase-phosphotriestermetoden ifølge Crea et al. (supra). I

I 30 Blandt de syntetiske primere, der blev fremstillet og anvendt til en I

I sådan stedspecifik mutagenese, var: I

I Primer 2C9 Glu I

I DNA-sekvens G CCT CAG TTT GAA ATC AAA GGA G I

37 DK 175369 B1

Den i det følgende beskrevne procedure blev anvendt til fremstilling af forskellige t-PA-kloner·, der indeholdt den muterede sekvens af de syntetiske primere. Den generelle metode, der blev anvendt, er beskrevet af Adelman (supra), hvortil der henvises. Px blev 3M134RF2C9 5 fremstillet under anvendelse af ovenstående primer. Oprenset M13 RF DNA fra det muterede t-PA-gen blev fremstillet ud fra E. coli JM101-celler. Derefter blev DNA-fragmenter indeholdende den muterede t-PA-DNA-sekvens anvendt til konstruktion af ekspressionsvektorer for den muterede t-PA.

10 50 ng af et syntetisk oligonukleotid blev phosphoryleret i 30 minut ter ved 37°C i 10 μΐ 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM di-thiothreitol, 1 mM ATP indeholdende 8 U T4-polynukleotidkinase. Til anvendelse som probe blev 400 ng af det syntetiske oligonukleotid phosphoryleret som ovenfor bortset fra, at ATP blev erstattet med 15 60 mCi [7^2-P]-ATP (3000 pCi/mmol), hvilket gav ca. 50-60 x 10® cpm/400 ng 24-mer. Til heteroduplex-dannelse blev 10 ng enkeltstren-get M13mp8PABglII opvarmet til 95*C (10 minutter) og langsomt afkølet til stuetemperatur (30 minutter) i 40 /»1 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2i 1 mM dithiothreitol indeholdende 10 ng af den phosphory-20 lerede primer og 50 ng EcoRI-skåret M13mp8PABglIIRF stort fragment.

Primerforlængelse blev påbegyndt ved tilsætning af 10 μΐ ligasebuffer indeholdende 2 mM ATP, 0,25 mM af hver af dGTP, dTTP, dCTP og dATP, 5 U £. coli DNA-polymerase I stort fragment og 400 U T4-DNA-ligase.

Efter 1 time ved 12eC blev reaktionsblandingen anvendt til transfor-25 mation af E. coli JMlOl-celler.

Transformation blev udført ved blanding af 10 μΐ af ligeringsblandingen med 200 μΐ kompetente JM101-celler efterfulgt af inkubation i 30 minutter på is og 5 minutter ved 37"C. Derfter blev 3,5 ml 2YT-top-agar ved 55°C blandet med 200 μΐ mættede JM101-celler, 10 μΐ IPTG 30 (200 mM) og 50 μΐ X-gal, og efter tilsætning af de transformerede celler blev cellerne udpladet på Petri-skåle indeholdende LB uden lægemidler.

Farveløse plaques blev udvalgt og overført til en mikrotiterskål indeholdende 100 μΐ 2YT-medium. De inokulerede mikrotitervæsker blev

I DK 175369 B1 I

I 38 I

I anbragt på LB-agarplader ned en diameter på 15 cm og overlejret med I

I en pisne af 600 μΐ JMlOl-celler i 8 ml 2YT-topagar og inkuberet nat- I

I ten over ved 37'C. De dannede plaques blev overfort til en nitrocel- I

I luloseskive ved fysisk kontakt i 1 minut. Nitrocelluloseskiven blev I

I 5 behandlet med 0,5 H NaOH, 1,5 H NaCl i 3 minutter og vasket to gange I

I med 3 M NaCl-0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, i 15 minutter og derefter med 2X I

I SSC i 15 minutter. Præhybridiseringsblandingen indeholder 10 mM Tris, I

I pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCl, IX Denhardt 0,5Z NP40, 100 pM ATP, I

I 1 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natriumphosphat og 50 pg/ml E. coli I

I 10 tRNA. IX Denhardt indeholder pr. liter 200 mg Ficoll, 200 mg polyvi- I

nylpyrrolidon, 200 mg bovint serumalbumin (BSA; fraktion V). Skiven I

I blev bagt ved 80eC i vakuum i 90 minutter. Derefter blev skiven I

I inkuberet i 3 timer med 6 ml præhybridiseringsvæske i en Petri-skål I

I efterfulgt af tilsætning af 5x10^ cpm mærket primer og hybridiseret I

I 15 natten over. Selektiv vask af skiven blev udfert med 0,4X SSC ved I

I 49°C, og efter lufttørring blev skiven eksponeret på røntgenfilm. I

I Positivt hybridiserende kloner blev analyseret yderligere ved dide- I

I oxy-sekventering, se Adelman, supra. I

Et vektorfragment, der blev betegnet fragment 1, blev opnået ved I

I 20 isolering af det store fragment, som blev dannet ved skæring af I

I pPADHFR*6 med Bglll og BstEII. Et fragment, der blev betegnet frag- I

I ment 2, blev opnået ved isolering af det 400 basepar lange t-PA- I

I fragment, som blev opnået ved skæring af pPADHFR-6 med Bglll og I

BstXI. Et 1141 basepar langt t-PA-fragment indeholdende de ønskede I

I 25 mutationer (fragment 3) blev opnået ved skæring af RF DNA fra de mu- I

I terede t-PA-kloner (supra) med BstXI og BstEII. Fragmenterne i og 2 I

I blev hver især ligeret med fragment 3. DNA-blandingeme blev anvendt I

I til transformation af £. coli. Fra hver af transformanteme blev der I

I opnået de respektive eukaryote ekspressionsvektorer, fx pPADHFR-6 I

I 30 2C9. I

I 4) Endelig konstruktion af pll54 I

Plasmidet pETPFR blev skåret med restriktionsenzymerne Bglll og Apal, I

I og fragmenterne blev fraktioneret ved agarosegelelektroforese. Det I

I 6,0 kb lange fragment, som indeholdt det t-PA-prækodende område, den I

39 DK 175369 B1 tidlige SV60-promotor, Ø-lactamase- og DHFR-generne, blev skåret ud fra gelen og elektroelueret.

Plasmidet pCVSVPA-N44 D22 blev skåret ned Bglll og Seal, fragmenterne blev fraktioneret ved acrylamid-gelelektroforese, og det bånd, der 5 indeholdt det 0,63 kb lange fragment (der repræsenterede de kodende sekvenser for vækstfaktor-, kringle 1- og kringle 2- [partiel] -områderne af t-PA) blev skåret ud og elektroelueret.

Plasmidet pPADHFR-6 2C9 blev skåret med Seal og Apal, og det 0,63 kb lange fragment, som indeholdt de kodende sekvenser for kringle 2-10 (partiel) og protease- (med Glu 275-mutationen) -områderne, blev oprenset ved acrylamid-gelelektroforese og elektroeluering.

De tre således isolerede og oprensede fragmenter blev inkuberet i nærværelse af T4-DNA-ligase og rATP til dannelse af plasmidet pll54, der indeholder sekvenser, som koder for et t-PA-molekyle, der mangler 15 resterne 1-44 (fingerområdedelétion) og omfatter en Arg 275 -* Glu-mutation (enkeltkæde-mutant), se fig. 11.

EKSEMPEL 5

Fremstilling af t-PA-varianter med andre områdedeletioner

Konstruktionen af plasmidet pCVSVPA-N44 D22 er beskrevet i detaljer 20 ovenfor i forbindelse med fremstillingen af plasmidet pll54.

Steddirigeret mutagenese-eksperimenter er ligeledes beskrevet i detaljer ovenfor i forbindelse med fremstillingen af plasmidet pPADHFR-6 2C9.

Des 44-84 vækstfaktorområde-deletionen, des 92-179 kringle 1-område-25 deletionen og des 174-261 kringle 2-område-deletionen blev også udført ved steddirigeret mutagenese under anvendelse af følgende oligo-nukleotider:

I DK 175369 B1 I

I AO I

I des 46-BA CCACGCCACACTGcSaAATAGATACTCCACCCACCTCCTACC I

I des 92-179 TGTGAAATAGATACTCGACCCAC&GCTACTTTGCCAATCCA- I

I TCCGCCTACCGTGCC I

I des 176*261 TTCTCCACCACCCCTCCCTC?rCCACCTCCCCCCTC I

(Delta-mærkerne angiver stedet for den deleterede sekvens.) I

og disse blev anvendt til fremstilling af ekspressionsplasmider på I

5 analog måde med des l-AA-konstruktionen ovenfor med den undtagelse, I

at mutagenese blev udfort på det i,A kb lange Bglll/Apal-fragment (i I

I en enkeltstrenget vektor), som indeholdt hovedparten af de t-PA- I

H kodende sekvenser (se fig. 11). Ligeledes analogt med des 1-AA-kon- I

struktionen kunne des AA-8A- og des 92-179-mutationerne i princippet I

10 også isoleres på Bglll/Scal-fragmenter og sammenfejes med Glu275- I

mutationerne og de t-PA C-terminale kodende sekvenser på det 0,63 kb I

lange Scal/Apal*fragment, hvilket gav plasmider svarende til ρ115Α I

som beskrevet ovenfor. Disse plasmider anvendtes til transfektion af I

H hensigtsmæssige celler, og de tilsvarende t-PA-varianter blev pro- I

H 15 duceret som beskrevet ovenfor. I

I EKSEMPEL 6 I

Påvisning af in vitro protease-amidolytisk aktivitet af des (1·44) I

I c'pa I

Aktiviteten af des (1-AA) t-PA 1 et protease-amidolytisk assay blev I

20 sammenlignet med aktiviteten af naturlig t-PA under anvendelse af I

I det S-2288-paranitroanilid-kromogene substrat (Helena Labs). S-2288- I

paranitroanilid-substratet giver en direkte måling af protease-amido- I

I lytisk aktivitet. De kinetiske konstanter for t-PA og des 1-AA t-PA I

blev bestemt ved hjælp af S-2288-substratet under anvendelse af et I

I 25 H-P-diodearray-spektrofotometer (HP8A51-A). Hydrolyse af substratet I

I blev målt kontinuerligt ved to substratkoncentrationer (1,0 mM og I

I 0,1 mM), mens proteinkoncentrationeme blev holdt konstante på 23 nM I

I i en buffer bestående af 0,05 M Tris-HCl, 0,12 M NaCl, 0.01X Tween I

I 80, pH 7,A. Under anvendelse af differentialeformen af Mlehaelis- I

41 DK 175369 B1

Menten-ligningen og en ikke-lineær regression blev K,,, og Vmax beregnet ud fra kurverne for reaktionens forløb.

Både des 1-44 t-PA og t-PA med normal sekvens udviste lignende specifik aktivitet under anvendelse af det lille syntetiske S-2288-sub-5 strat, H-D-isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilid. Det fremgår af tabel 1, at kcat og Kq af de to enzymer lå inden for den eksperimentelle fejlmargen i forhold til hinanden, hvilket tydede på, at pro-teasedelen af molekylet har en normal funktion, og at fingerområdet ikke har nogen virkning på hydrolysen af substrater med lille mole-10 kylvægt.

TABEL 1

Kinetiske konstanter for vildtype-t-PA og des 1-44 t-PA med S-2288 ^cat ^m ^cat/Kj!) (sek*^) (mM) (sek'^mM'*)

Vildtype-t-PA 17,9 0,33 54,2

Des 1-44 t-PA 17,1 0,28 61,1 20 EKSEMPEL 7

Påvisning af in vicro plasminogenaktivering aed des (1-44) t~PA

t-PA’s evne til at aktivere plasminogen kan måles ved et in vicro-assay ved przinkubation af t-PA og plasminogen, hvorefter det plas* 25 minspecifikke substrat H-D-valyl-H-leucyl-H-lysin-p-nitroanilid (S-2251) tilsættes. Den maksimale hastighed for denne reaktion observeres i nærværelse af fibrin(ogen) eller fragmenter af fibrin(ogen), som virker som stimulatorer af reaktionen.

Det plasminspecifikke substrat S-2251 blev anvendt i et totrinsassay 30 til måling af prøvens evne til at aktivere plasminogen. Fibrin-koage-

I DK 175369 B1 I

I I

I ler blev fremstillet ved Inkubation af prøven med 0,02 ml af en I

I 20 mg/ml fibrinogenopløsning med 1 U trombin i et samlet volumen på I

I 0,12 ml 0,05 M Tris-HCl, 0,12 M NaCl, 0,01X Tween 80, pH 7,4, i 30 I

I minutter ved 37eC. Alternativt kan trombinet udelades, og fibrinogen I

I 5 anvendes som stimulator. Der tilsattes derefter Glu-plasminogenopløs- I

I ning, 0,03 ml af en 2,1 mg/ml-opløsning. Efter 10 minutter ved 37*C

I tilsattes 0,35 ml 2,86 mM S-2251 i 0,037 M Tris, 0,86 H NaCl, 0,0071 I

I Tween 80, pH 7,4. Denne blanding blev inkuberet i 5 minutter, hvor- I

I efter reaktionen blev standset ved tilsætning af 0,1 ml 50Z iseddike. I

I 10 Absorbansen ved 405 nm blev målt. Aktiviteten blev udtrykt som sn- I

I dringen i absorbans pr. nanogram pr. minut i nærværelse af substrat. I

I Assayet blev kørt som beskrevet sammen med et yderligere sæt prøver, I

I som ikke indeholdt fibrin-koageler. Stimuleringen er forholdet mellem I

I den specifikke aktivitet af den prøve, der indeholdt fibrin, og den I

I 15 specifikke aktivitet af den prøve, der ikke indeholdt fibrin. I

I I forskellige assays (se tabel 2 og fig. 4) var den maksimale sped- I

I fikke aktivitet, der blev opnået med des 1-44 t-PA i nærværelse af I

I fibrin, en smule større end 50X af den mængde, der blev opnået med I

I t-PA med normal sekvens. Aktiviteten af både t-PA og des (1-44) t-PA I

I 20 forøgedes ca. 50 gange i nærværelse af fibrin. I tabel 2 sammenligner

I værdien for "stim” den stimulering, der ses i nærværelse af fibrino- I

I gen, med stimuleringen uden fibrinogen. I

43 TABEL 2 DK 175369 B1

Med fibrinogen +Fgn 5 rel Stim 100X 100 50Z 70,2

Med fibrin-koageler +Fgn 10 rel Stim 100X 100 56X 80.4

For at foretage en yderligere sammenligning af evnen hos des 1-44 15 t-PA til at aktivere plasminogen i nærværelse af fibrin(ogen) blev det sammenlignet med t-PA i et assay, som måler evnen hos t-PA og mættende plasminogen til at lysere en fibrin-koagel. I dette assay udviste des 1-44 t-PA kun 35X af den aktivitet, der blev observeret med normal t-PA (tabel 3). Disse resultater antyder, at der kan være 20 en defekt i des 1-44 t-PA's evne til at samvirke korrekt med fibrin.

TABEL 3

Aktivitet af t-PA og des 1-44 t-PA

t-PA des 1-44 t-PA

25 _

Koagel-lyse (relative enheder) 1,0 0,18

Bindingen af des 1-44 t-PA til fibrin blev overvåget under anvendelse af en modifikation af metoden ifølge Rijken et al. (1982) J. Biol.

30 Chem., 257:2920. Prøver blev blandet med varierende koncentrationer af humant plasminogenfrit fibrinogen i nærværelse af 1 mg/ml humant

I DK 175369 B1 I

I I

I seruroalbumin (fra J E M Research, Inc., Kensington, MD) for at for- I

I hindre uspecifik adsorption. Det samlede reaktionsvolumen var 1 ml, I

I og bufferen bestod af 0,05 M Tris-HCl, 0,12 M NaCl, 0,012 Tween 80, I

I pH 7,4. Én enhed trombin (fra Sigma Chemical Co., St. Louis, M0) I

I 5 blev tilsat, og blandingerne lodes koagulere i 1 time ved 37®C. I

I Koagelerne blev fysisk fjernet ved centrifugering ved 10.000 omdr./- I

I minut i 5 minutter, og en alikvot af supernatanten blev derefter I

I analyseret for resterende t-PA-indhold ved enten et aktivitetsassay I

I eller et ELISA. I

I 10 Resultaterne er vist i fig. 5. Det fremgår heraf, at des (1-44) ud* I

I viste en meget reduceret evne til at binde fibrin. Selv om bindingen I

I til fibrin var så svag, at der ikke kunne opnås en dissociations· I

I konstant, blev det anslået, at dissociationen var mindst 10 gange I

I højere end for naturlig t-PA ("RIK"). Fibrinbinding er således ikke I

I 15 påkrævet for at bevare effektiv t-PA-aktivitet. I

I EKSEMPEL 8 I

I In vivo blodprop-lyserende aktivitet af des (1-44) t-PA i forhold til I

I naturlig t-PA I

I Et in vivo-eksperiment blev udført i kaniner for at påvise dosis- I

I 20 responset af naturlig t-PA (betegnet RIK) i forhold til des 1-44 I

I t-PA-varianten. Trombolytiske aktiviteter blev bestemt i kaniner I

I under anvendelse af en shunt uden for kroppen, hvilken shunt inde- I

I holdt en trombe mærket med I-125-fibrinogen. Lyse blev målt ved I

I radioaktivitetens forsvinden, målt med en ekstern natriumiod-krystal. I

I 25 Vildtype-t-PA blev givet som en 102 bolus, idet resten af dosen blev I

I infunderet i løbet af de følgende 90 minutter. Des (1-44) t-PA blev I

I testet i en enkeltdosis på 0,064 mg/kg under anvendelse af en I

I 0,03 mg/kg bolus efterfulgt af en infusion af 0,034 mg/kg 1 90 minut- I

I ter. Hele lysen blev bestemt efter de 90 minutters infusion. I

I 30 Det fremgår af fig. 6, at i et in vivo-assay udviste des (1-44) t-PA- I

I varianten en overraskende høj blodprop-lyserende aktivitet inden for I

I standardafvigelsen for naturlig t-PA. Dette var særligt overraskende I

1.. ·?__i_-· * · PmVVEK3æ<*™WHF*'. - ' ·'· iTHBWF |Μι:· >a— DK 175369 B1 4 5 i lyset af in vi tro-assayresultaterne, hvor den lyserende aktivitet afspejlede en lavere lytisk aktivitet for N44-varianten. Sådanne in vicro-forsøg tog imidlertid ikke variantens forøgede halveringstid i betragtning.

5 I en anden type assay blev de to arter sammenlignet med hensyn til procent lyse i forhold til tiden. Resultaterne er vist i fig. 7, hvor sammenlignelige lyseringsgrader blev opstillet grafisk for 0,3 mg/kg dosen af vildtype-rt-PA og for 0,064 mg/kg des (1-44) rt-PA. Det fremgår af figuren, at aktiviteten med tiden af des (1-44)-varianten 10 (N44) var nært parallel med aktiviteten af naturlig t-PA (RIK).

I fig. 8 er vist tidsforløbet af plasmakoncentrationen af de to former af rt-PA ud fra den foregående undersøgelse. Koncentrationer blev bestemt ved et polyklonalt ELISA, der detekterer begge former af rt-PA med lige stor aktivitet. Blodprøver blev opsamlet på EDTA, og 15 der tilsattes en irreversibel rt-PA-inhibitor, D-Phe-Pro-Arg-chlor-methylketon; denne inhibitor blokerer in vitro-danneIse af t-PA-kom-plekser med plasmaprotease-inhibitorer. Disse komplekser har en betydeligt nedsat immunreaktivitet. Det fremgår af figuren, at N44-vari-anten frembragte en meget højere plasmakoncentration end naturlig 20 t-PA med en meget lavere initial og samlet dosis.

EKSEMPEL 9

Farmakokinetiske undersøgelser

Sammenlignende farmakokinetiske undersøgelser blev udført i kaniner. I-125-mærket test-t-PA, enten vildtype eller N44-varianten, 5 pCi/kg 25 med en specifik aktivitet på 5-10 pCi/kg, og bærer-vildtype-t-PA, 1,0 mg/kg. blev injiceret sammen, der blev taget serieblodprøver, plasma blev fremstillet, og de TCA-(trichloreddikesyre)-præclpiter-bare tællinger blev bestemt på hvert tidspunkt. TCA-præcipitation blev anvendt for at fjerne eventuelle små metaboliter, som fremkommer 30 på senere tidspunkter på grund af leverens nedbrydning af t-PA.

Plasmakoncentrations-tidskurven for rt-PA blev tilpasset til en bi-

I DK 175369 B1 I

I I

I eksponentiel ligning C-Aexp(-alfaXt)+Bexp(-betaXt). Kurven for des I

I (l-44)-rt-PA blev tilpasset til en monoeksponentiel ligning I

I C-Aexp(-alfaXt). Clearance (Cl) blev beregnet ifølge formlen I

I Cl-DOSIS/AUC, hvor AUC er arealet under plasmakoncentrations-tids· I

I 5 kurven. I

I Det fremgår af de opnåede resultater, der er vist nedenfor i tabel 4 I

I og afbildet i fig. 9, at den naturlige t-PA-prøve, rt*PA, i et kanin- I

I testsystem udviste en clearance-hastighed på ca. 8,4 ml/minut/kg med I

I en standardafvigelse på ca. 0,92, og en halveringstid (tl/2a) på ca. I

I 10 3,1 minutter med en standardafvigelse på ca. 0,55. I

I TABEL 4 I

I Farmakokinetiske parametre for en intravenøs I

I bolusdosis af 1-125 rt-PA i kaniner. I

I Dosis - 5 /iC/kg 1-125 rt-PA injiceret I

I 15 sammen med 1 fflg/kg kold rt-PA I

I //A il C y/K #G Hiddel S.D. I

I BO 30144,320 32920,033 27005,306 31340,936 30352,649 2504,415 I

I 20 tl/2b 33,236 23,987 31,782 26,467 28,868 4,365 I

I rsq 0,973 0,963 0,997 0,959 0,973 0,017 I

I AO 247990 306059 255904 290852 275201 27748,868 I

I tl/2a 3,716 2,645 3,334 2,575 3,067 0,552 I

I rsq 0,999 0,991 0,983 0,971 0,986 0,012 I

I 25 AUCxlO*6 26,609 21,106 23,505 21,128 23,087 2,604 I

I AUMCxlO'6 789,510 452,925 637,710 525,828 601,493 146,583 I

I VDSS ml/kg 209,553 197,899 232,427 213,466 213,336 14,342 I

I CL ml/minAg 7,063 9,222 8,567 8,577 8,357 0,916 I

I 30 Som vist nedenfor i tabel 5 samt i fig. 9 blev der Imidlertid obser- I

I veret en clearance-hastighed på ca. 0,48 ml/minut/kg (S.D. - 0,02) og I

I en halveringstid på ca. 53,7 minutter (S.D. - 6,38) for des (1-44)- I

I varianten, N44. I

TABEL 5 47 DK 175369 B1

Farmakokinetiske parametre for en bolusdosis af

1-125 N44 i kaniner * dosis - 5 μθ/kg 1-125 N44 injiceret sammen med 1 mg/kg 5 kold rt-PA

ilb #d iff ifh Middel S.D.

AO 234100 245900 183000 202300 216300 28870,000 10 lambdaO 0,014 0,015 0,011 0,012 0,013 0,002 tl/2 50,220 46,310 60,740 57,370 53,660 6,575 rsquareO 0,984 0,914 0,980 0,945 0,956 0,033 AUCxlO’6 171,400 170,900 158,600 172,400 168,300 6,552 AUMCxlO'6 12610,000 12050,000 13800,000 14740,000 13300,000 1205,000 15 VDSS ml/kg 34,540 33,200 44,190 39,890 37,960 5,060 CL ral/min/kg 0,470 0,471 0,508 0,467 0,479 0,019

Farmakokinetiske analyser blev gentaget som ovenfor bortset fra, at i stedet for at anvende naturlig t-PA som barer for den markede N44-20 variant blev N44-varianten (ikke-radioaktiv) selv anvendt i en koncentration på 1 mg/kg. Resultaterne er vist nedenfor i tabel 6 samt i fig. 10. Det fremgår heraf, at der under anvendelse af N44-b*reren blev observeret en halveringstid på ca. 73,1 minutter (S.D. - 1,22) med en clearance-hastighed på ca. 0,42 ml/minut/kg (S.D. - 0,03).

I DK 175369 B1 I

I I

I TABEL 6 I

I Farmakokinetiske parametre for en bolusdosis af I

I I-125 N44 1 kaniner · dosis - 5 pC/kg I

I 1-125 N44 injiceret sammen med 1 mg/kg I

I 5 kold N44 .1

I #a //b Hc Middel S.D. I

I AO 197800 197000 221500 205400 13900,00 I

I 10 lambdaO 0,01 0,01 0,01 0,01 0,00 I

I tl/2 71,68 73,81 73,76 73,08 1,22 I

I rsquareO 0,98 0,97 0,98 0,98 0,01 I

I AUCxlO'6 200,10 205,10 233,70 213,00 18,14 I

I AUMCxl0*6 21470,00 22180,00 25870,00 23380,00 2258,00 I

I 15 VDSS ml/kg 47,17 47,72 41,68 45,52 3,34 I

I CL ml/min/kg 0,44 0,43 0,38 0,42 0,03 I

På basis af ovenstående clearance-hastigheder og halveringstider, der I

I blev observeret i kanin-testdyrene, kan det forventes, at der i men- I

I 20 nesker vil opnås en lignende eller større halveringstid samt en lig- I

I nende eller lavere clearance-hastighed. I

Claims (18)

1. Anvendelse af en human t-PA-proteinvariant til fremstilling af et lægemiddel til behandling af vaskulxr sygdom hos én patient, idet den humane t-PA-proteinvariant vælges pé basis af en udvist plasma-halve- 5 ringstid, der er længere end den, der udvises af naturlig t-PA, og/eller clearance-hastigheder, der er mindre end den clearance-hastighed, som udvises af naturligt t*PA-protein.

2. Anvendelse af en t-PA-variant ifelge krav 1, kendetegnet ved, at den længere halveringstid og/eller 10 lavere clearance-hastighed skyldes fjernelse af i det mindste en del af finger- eller kringle 1-området,

3. Anvendelse af en human t-PA-proteinvariant til fremstilling af et lægemiddel til behandling af vaskulær sygdom hos en human patient, herunder vaskulære lidelser, hvor der foretrækkes lægemidler med 15 andre farmakokinetiske egenskaber end lægemidler, der omfatter naturligt t-PA-protein som aktiv bestanddel, idet den humane t-PA-proteinvariant vælges på basis af en udvist plasma-halveringstid, der er længere end den, der udvises af naturlig t-PA, og/eller en clearance-hastighed, der er mindre end den clearance-hastighed, som udvises af 20 naturligt t-PA-protein, idet en sådan længere halveringstid og/eller lavere clearance-hastighed skyldes fjernelse af i det mindste en del af vækstfaktorområdet.

4. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, 25 kendetegnet ved, at varianten har en plasma-halveringstid på mellem ca. 2 og ca. 25 gange den plasma-halveringstid, som naturlig t-PA har, fortrinsvis mellem ca. 5 og ca. 20 gange den plasmahalveringstid, som naturlig t-PA har, idet plasma-halveringstiden især er mindst 15 minutter, specielt mellem ca. 20 og ca. 75 minut-30 ter. 1 Anvendelse af en t-PA-variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1- 3, I DK 175369 B1 I 50 I H kendetegnet ved, at t-PA-varianten udviser en clearance- I I hastighed på mellem ca. 1/2 og ca. 1/25 af den clearance-hastighed, I som naturlig t-PA har, fortrinsvis en clearance-hastighed på under I 2 ml/minut/kg. I

56. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge et hvilket som helst af I kravene 1-5, I kendetegnet ved, at t-PA-varianten mangler i det mindste I H en del af fingerområdet. I

7. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge krav 6, I 10 kendetegnet ved, at t-PA-varianten omfatter et vækstfak- I tor-, kringle 1-, kringle 2- og proteaseområde. I

8. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge krav 6 eller 7, I kendetegnet ved, at t-PA-varianten omfatter t-PA, der I mangler et fingerområde. I H 15 9. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge krav 6, I kendetegnet ved, at t-PA-varianten omfatter naturlig t-PA, I H der mangler aminosyrerne 1-44. I

10. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge et hvilket som helst af I kravene 1-5, I H 20 kendetegnet ved, at t-PA-varianten mangler i det mindste I en del af vakstfaktorområdet. I

11. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge krav 10, I H kendetegnet ved, at t-PA-varianten omfatter et finger-, I kringle 1-, kringle 2- og proteaseområde. I I 25 12. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge krav 11, I H kendetegnet ved, at t-PA-varianten omfatter naturlig t-PA, I I der mangler aminosyrerne 44-84. I

13. Anvendelse af en t-PA-variant Ifølge et hvilket som helst af I kravene 1-5, I DK 175369 B1 kendetegnet ved, at t*PA-varianten mangler i det mindste en del af kringle 1-området.

14. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge krav 13, kendetegnet ved, at t-PA-varianten omfatter et finger-, 5 vækstfaktor-, kringle 2- og proteaseområde.

15. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge krav 14, kendetegnet ved, at t-PA-varianten omfatter naturlig t-PA, der mangler aroinosyrerne 92-179.

16. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge et hvilket som helst af 10 kravene 9, 12 eller 15, kendetegnet ved, at t-PA-varianten desuden har Glu ved aminosyre 275.

17. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-16, 15 kendetegnet ved, at t-PA-varianten yderligere er defineret som en tokædet variant.

18. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-16, kende tegnet ved, at t-PA-varianten yderligere er defineret 20 som en resistent énkædet variant, fortrinsvis omfattende en anden aminosyre end arginin ved position 275, målt i forhold-til naturlig t-PA.

19. Anvendelse af en t-PA-variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-18, 25 kendetegnet ved, at t-PA-varianten fremstilles ved ekspression i en egnet vært af en rekombinant vektor, som koder for varianten, fortrinsvis en bakterievektor i en bakterievært, især en eukaryot vektor i en eukaryot vært, specielt CHO-celler. 1 Fremgangsmåde til tilvejebringelse af en human t-PA-proteinvari-30 ant, der udviser en forøget halveringstid eller en nedsat clearance- hastighed i forhold til naturlig t-PA, I DK 175369 B1 I 52 H kendetegnet ved, at fremgangsmåden omfatter følgende trin: (a) opnåelse af en t-PA-variant, som omfatter t-PA, der er modificeret ved fjernelse af i det mindste en del af finger-, vækstfaktor- eller kringle 1-området; 5 (b) sammenligning af variantens farmakokinetik med farmakoki- netikken af naturlig t-PA; og (c) selektion af en således vundet t-PA-variant, som udviser I en længere halveringstid og/eller formindsket clearance- I hastighed i forhold til naturlig t-PA. I H 10 21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, I H kendetegnet ved, at den selekterede t-PA-variant udviser I en plasma-halveringstid, der er mindst 2 gange den plasma-halverings- tid, soro naturlig t-PA har, fortrinsvis en plasma-halveringstid på mellem ca. 5 og ca. 20 gange den plasma-halveringstid, som naturlig I 15 t-PA har, især en plasma-halveringstid på mindst 15 minutter, sped- I elt en plasma-halveringstid på mellem ca. 20 og ca. 75 minutter, I

22. Fremgangsmåde ifølge krav 20, I kendetegnet ved, at t-PA-varianten har en clearance-has- I tighed på 1/2 eller derunder af den clearance-hastighed, som naturlig I 20 t-PA har, fortrinsvis mellem ca. 1/10 og ca. 1/25 af den clearance- I hastighed, som naturlig t-PA har, især en clearance-hastighed på I under 2 ml/minut/kg. I

23. Des 1-44 Glu 275 t-PA.