DK175958B1 - Vævsplasminoaktivator-(t-PA)-variant med zymogene eller fibrinspecifikke eller plasmakoagel-specifikke egenskaber, fremgangsmåde til fremstilling deraf, DNA-sekvens, som koder for varianten, replicerbar udtrykkelsesvektor for denne og værtsceller tran - Google Patents

Description

• 1 DK 175958 B1 Vævsplasminogen aktivator med zymogene eller fibrinspecifikke egénskaber

Denne opfindelse er rettet mod bestemte vævsplasminbgenaktivator-(t-PA)-5 zymogener, mod fremgangsmåder til fremstilling af sådanne zymogener og mod fremgangsmåder og præparater, der udnytter sådanne zymogener til farmaceutiske anvendelser. Desuden angår opfindelsen varianter med en modificeret struktur, som inkluderer udskiftede aminosyrer inden for protease domænet af t-PA, hvilken modifikation gør Varianten zymogen, dvs. relativt 10 inaktiv i dens én-kæde-form, men aktiv, når den omdannes til dens to-kæde-form i nærvær af fibrin, og/eller mere fibrin- (eller plasmakoagel-) -specifik end vild-type (vt)-t-PA.

Plasminogenaktivatorer er enzymer, som aktiverer zymogenet plasminogen 15 til frembringelse af serinproteinasen plasmin (ved spaltning ved Arg561-0al562), der nedbryder forskellige proteiner, herunder fibrin. Blandt de undersøgte plasminogenaktivatorer er streptokinase, et bakterielt protein, urokinase, et enzym der syntetiseres i nyren og andet steds og oprindeligt blev ekstraheret fra urin, og human vævsplasminogenaktivator (t-PA), et enzym pro-20 duceret af cellerne, der beklæder blodkarvægge.

Virkningsmekanismen for hver af disse plasminogenaktivatorer er forskellig: streptokinase danner en kompleks med plasminogen eller plasmin og frembringer plasminogenaktiverende aktivitet, urokinase spalter plasminogen di-25 rekte, og t-PA, fibrin og plasminogen samvirker alle til opnåelse af maksimal aktivitet.

t-PA er blevet identificeret og beskrevet som et særlig vigtigt og kraftigt nyt biologisk farmaceutisk middel, som har vist ekstra ordinære resultater ved 30 behandlingen af vaskulære sygdomme, såsom myocardial infarkt, til dels på grund af dens høje fibrinspecificitet og stærke evne til at opløse blodkoagler L'_:_______ DK 175958 B1 2 in vivo. Selv om eksistensen af t-PA gav anledning til talrige undersøgelser af forskellige videnskabelige grupper, blev den først identificeret som et i det væsentlige rent isolat fra en naturlig kilde og afprøvet for den krævede plasminogenaktivator-aktivitet in vivo af Collen et al., US patentskrift nr. 4 5 752 603, udstedt den 21. juni, 1988; se også Rijken et al.,. J. Biol. Chem., 256: 7035 (19811.

Senere blev t-PA fuldstændigt identificeret og karakteriseret ved den underliggende DNA-sekvens og afledte aminosyresekvens baseret på heldigt ar-10 bejde under anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi, som resulterede i store mængder af t-PA i et distinkt miljø. Dette arbejde blev rapporteret af Pennica et al., Nature. 301: 214 (1983) og i US patentskrift nr. 4 766 075, udstedt den 23. august 1988.

15 På basis af disse angivelser synes det nu klart, at t-PA-molekylet indeholder 5 domæner, som er blevet defineret med henvisning til homologe eller på anden måde lignende strukturer identificeret i forskellige andre proteiner, såsom trypsin, chymotrypsin, plasminogen, prothrombin, fibronectin og epidermal vækstfaktor (EGF). Disse domæner er blevet betegnet, begyndende fra 20 N-terminus af t-PA’s aminosyresekvens, som 1) fingerregionen (F).som forskellig måde er blevet defineret som inkluderende aminosyreme 1 til omkring 44, 2) vækstfaktorregionen (G) som på forskellig måde er blevet defineret som strækkende sig fra omkring aminosyre 45 til omkring aminosyre 91 (baseret på dens homologi med EGF), 3) kringle 1 (K1) som er blevet defineret 25 som strækkende sig fra omkring aminosyre 92 til omkring aminosyre 173, 4) kringle 2 (K2) som er blevet defineret som strækkende sig fra omkring aminosyre 180 til omkring aminosyre 261, og 5) det såkaldte serihproteasedomæ- | ne (P) som almindeligvis er blevet defineret som strækkende sig fra omkring aminosyre 264 til den C-terminale ende af molekylet. Disse domæner, som 30 almindeligvis er beliggende op til hinanden eller er adskilt af korte "linker"-områder, gør rede for hele aminosyresekvensen på 527 aminosyrer i den 3 DK 175958 B1 formodede modne form af t-PA.

Hvert domæne er blevet beskrevet på forskellig måde som tilførende visse specifikke biologisk væsentlige egenskaber. Fingerdomænet er blevet karak-5 teriserét som indeholdende en sekvens af i det mindste overvejende betydning for høj bindingsaffinitet til fibrin. (Denne aktivitet menes at være vigtig for den høje specificitet, som t-PA udviser med hensyn til koagellyse ved locus for en fibrinrig trombe). Den vækstfaktor-lignende region er ligeledes blevet forbundet med celleoverflade-bindende aktivitet. Kringle 2 regionen er også 10 blevet stærkt forbundet nhed fibrinbinding og med fibrinets evne til at stimulere aktiviteten af t-PA. Serinprotease domænet er ansvarligt for den enzymatiske spaltning af plasminogen til dannelse af plasmin.

Trods de afgørende fordele, som er forbundet med naturlig t-PA som koage-15 lopløsende middel, menes det ikke, at det naturlige protein nødvendigvis repræsenterer det optimale t-PA-middel under alle omstændigheder. Derfor er der blevet foreslået eller udformet forskellige varianter for at forhøje specifikke egenskaber hos t-PA. Visse af disse varianter afhjælper de ulemper, som er forbundet méd anvendelsen af naturlig t-PA i situationer, hvor man ville 20 foretrække et middel med en længere halveringslevetid eller langsommere "clearance", f.eks. ved behandling af dyb-vene-trombose og efter reperfusion af et infarkt-offer, eller hvor der foretrækkes et enkelt-kæde-middel.

F.eks. resulterer fjernelse af en væsentlig portion af eller hele fingerdomænet 25 i et molekyle med væsentligt formindskede fibrinbindende egenskaber, selv om der til gengæld sker et fald i den samlede "clearance" af det resulterende molekyle; se WO 89/00197, offentliggjort den 12. januar 1989.

I EP offentliggørelsesskrift nr. 199574 er beskrevet varianter, som har ami-30 nosyre-udskiftninger ved de proteolytiske spaltningssteder i positionerne 275, 276 og 277. Disse varianter, karakteriseret fortrinsvis som t-PA-varianter med k......... ....

DK 175958 B1 4 en anden aminosyre end arginin i position 275, betegnes som protease-resistente en-kæde^t-PA-varianter, fordi de til forskel fra naturlig t-PA, som kan eksisterer i enten en en-kæde- eller en to-kæde-form, er resistente over for proteasespaltning ved position 275 og derfor ikke omdannes metabolisk 5 in vivo til en to-kæde-form. Denne form menes at have visse fordele biologisk og kommercielt ved, at den er mere stabil, mens fibrinbihdingen og fibrinsti-muleringen forøges i forhold til to-kæde-t-PA. Endvidere er der beskrevet plasminogenaktivatorer, som omfatter et domæne, der er i stand til at samvirke med fibrin og proteasedomænet i urokinase, hvor én udførelsesform er 10 urokinase ændret, så den er mindre modtagelig for dannelse af to-kæde-urokinase; se WO 88/05081, offentliggjort den 14. juli 1988.

Med hensyn til yderligere patentlitteratur angående modifikation af protea-sespaltningsstedet i t-PA, se f.eks. EP patentskrifteme nr. 241209, nr.

15 201153 offentliggjort den 12. nov 1986, nr. 233013 offentliggjort den 19. aug 1987, nr. 292009 offentliggjort den 23. nov 1988, nr. 293936 offentliggjort den 7. dec 1988 og nr. 293934 offentliggjort den 7. dec 1988, samt WO 88/10119.

20 I EP-A-0351246, som anses for at være kendt teknik i henhold til Art. 54(3) i EPC, anvises t-PA analoge, som er modificeret i det område, som i dette skrift kaldes position 414 til position 433. Den nummerering, som anvendes i denne ansøgning, adskiller sig fra hvad der bruges i den foreliggende ansøgning. Aminosyre positionerne i EP-A-0351246 har en værdi som er tre 25 større end de værdier, som anvendes i den foreliggende ansøgning til at identificere en specifik aminosyre.

Glycosyleringsmutanteme ved 117-119, 184-186 og 448-450 udviste højere specifik aktivitet, efterhånden som molprocenten af carbonhydrat blev redu-30 ceret; se EP offentliggørelsesskrift nr. 227462 offentliggjort den 1. juli 1987.

Denne patentansøgning angiver yderligere anvendelse af en prøvning for _ _______ DK 17595a B1 5 fibrin/fibrinnedbrydriingsprodukter og angiver, at man også kan modificere t-PA-molekylet i positionerne 272-280 eller deleterer op til 25 aminosyrer fra C-terminus. Endvidere blev t-PA-mutanteme med Asn119, Ala186 og Asn450, som har N-glycosyleringsstedeme selektivt fjernet ved . DNA-modifikation, 5 men indeholder resterende O-bundet carbonhydrat, at være omkring dobbelt så kraftige som melanoma-t-PA ved in vitro lyseringsprøvning; se EP offentliggørelsesskrift nr. 225286 offentliggjort den 10. juni 1987.

Erstatning af aminosyren i position 449 af t-PA med enhver aminosyre und-10 tagen arginin for at modificere glycosyleringsstedet, såvel som modificering af Arg275 eller deletion af området fra -3 til 91 er også angivet; se WO 87/04722 offentliggjort den 13. august 1987. En aminosyreudskiftning i position 448 af t-PA er angivet som ønskelig for at fjerne glycosylering; se EP offentliggørelsesskrift nr. 297066 offentliggjort den 28. december 1988. Kom-15 binationen af modifikationer i positionerne 448-450 og deletion af de N-. terminale aminosyrer 1-82 er angivet i WO 89/00191 offentliggjort den 12. januar 1989. Desuden er urokinase blevet modificeret i området Asp302-Ser303-Thr304 for at forhindre glycosylering; se EP offentliggørelsesskrift nr.

299706 offentliggjort den 18. januar 1989. Imidlertid synes ændring af glyco-20 syleringsstederne og især det ved aminosyre 117 uvægerligt at resultere i et molekyle med påvirkede opløseiighedsegenskaber, som yderligere kan resulterer i et ændret cirkulerende halveringslevetidsmønster og/eller ændrede fibrinbindingsegenskaber; se EP offentliggørelsesskrift nr. 238304 offentliggjort den 23. september 1987.

25 Når vækstfaktordomænet i t-PA deleteres, er den resulterende variant stadig aktiv og binder til fibrin som rapporteret af A.J. van Zonrieveld et al., Throm-bos. Haemostas., 54 (1)4 (1985). Forskellige deletioner i vækstfaktordomænet er også blevet rapporteret i patentlitteraturen; se EP offentliggø relses-30 skrift nr. 241 209 (des-51-87), EP offentliggørelsesskrift nr. 241 208 (des-51-

87 og des 51-173), PCT 87/04722 (deletion af alle eller en del af de N- I

| k____ DK 175958 B1 6 terminale 1-91), EP offentliggørelsesskrift nr. 231 624 (hele vaekstfaktordo-mænet deleteret) og EP offentliggørelsesskrift nr. 242 836 og japansk patentansøgning Kokai nr. 62-269688 (noget af eller hele vækstfaktordomænet, deleteret).

5

Det er yderligere blevet vist, at t-PA kan modificeres både i det første kringledomæne og i vækstfaktordomænet, hvilket resulterer i forøget cirkulatorisk halveringslevetid, se EP offentliggørelsesskrift nr. 241 208 offentliggjort den 14. oktober 1987. Området mellem aminosyrerne 51 og 87, inklusive, kan 10 deleteres fra t-PA, hvilket resulterer i en variant med langsommere clearance fra plasma; Browne ét al., J. Biol. Chem., 263: 1599-1602 (1988). Ligeledes kan t-PA modificeres uden skadelige biologiske virkninger i området, af aminosyrerne 67-69 af den modne, native t-PA, ved deletion af visse amino-syrerester eller udskiftning af en eller flere aminosyrer med andre aminosy-15 rer; se EP offentliggørelsesskrift nr. 240334 offentliggjort den 7. oktober 1987.

En hybrid af t-PA/urokinasé under anvendelse af det område fra t-PA, som omfatter aminosyrerne 273-527, er også angivet; se EP offentliggørelses-20 skrift nr. 290 118 offentliggjort den 9. november 1988.

Serin-resistente mutanter af human t-PA med ændringer i proteasedomænet, inklusive d296-302 t-PA, R304S t-PA og R304E t-PA, er angivet i Madison et al., Nature, 339: 721-724 (1989); se også den ledsagende artikel af Dagmar 25 Ringe i samme nummer.

W090/10649, som er offentliggjort den 20. september 1990, indeholder en beskrivelse af d296-302tPA, R304E t-PA og R304S t-PA, hvilket anses for kendt teknik ifølge Art. 54(3) i EPC.

30

En almen oversigt over plasminogenaktivatorer og anden-generations- ! ______^ 7 DK 175958 B1 derivater deraf kan findes i Harris, Protein Engineering, i: 449-458 (1987).

Andre oversigterover t-PA-varianter inkluderer Pannekoek et al., Fibrinolysis, 2: 123*132 (1988) og Ross et al. i Annual Reports in Medicinal Chemistry,.

Vol. 23, Chapter 12 (1988).

5

Selv om den ovennævnte litteratur vidner om, at der er nyere og i forskellige henseender bedre t-PA-midler for hånden, er der for tiden ikke beskrevet nogen t-PA-molekyler, som kun bliver aktiveret, når de når stedet, for det koa-gel, der skal opløses. For tiden er t-PA-molekylerne aktivé i nærvær af fibrin 10 og/eller plasmaproteiner eller helblod, hvad enten de er i en-kæde- eller to-kæde-formen. Det ville være ønskeligt at have en zymogen t-PA, som i nærvær af fibrin kræver overklipning af dens en-kæde-form til dens to-kæde-form for at blive fuldt altid. Sådanne variantmolekyler ville sandsynligvis udøve færre bivirkninger, såsom mindre blødning, og have fibrinogenbesparende 15 egenskaber, hvorved de ville give lægevidenskaben vigtige nye alternativer ved behandlingen af cardiovaskulær sygdom og talrige andre medicinske tilstande, som stammer fra tromboembolisk okklusion af blodkar, såvel som ved forhindring af dannelsen af adhæsioner.

20 Det ville også være ønskeligt at tilvejebringe et t-PA-molekyle, som i forhold til vild-type-t-PA har en højere fibrin-stimuleret (eller plasmakoagel-stimuleret) aktivitet end fibrinogen-stimuleret (eller plasma-stimuleret) aktivitet, dvs. er fibrin- (eller plasmakoagel-)$pecifik, således at den kun vil virke på stedet for koaglet og ikke systemisk.

25 I overensstemmelse hermed er det et formål for denne opfindelse at tilvejebringe zymogene og/eller fibrin-specifikke t-PA-molekyler, som udviser forbedrede terapeutiske og farmaceutiske egenskaber.

30 Et andet formål for opfindelsen er at give mulighed for behandling af tilstande, som kun tillader anvendelsen af koagel-opløsende midler, som er aktive L_________ • 8 DK 175958 B1 på stedet for koaglet og er anvendelige i høje niveauer end andre sådanne midler.

Disse formål opnås ved tilvejebringelsen af et vævsplasminogenaktivator-(t-5 PA)-zymogen, som er i stand til at omdannes til den enzymatisk aktive form af t-PA efter spaltning med plasmin. I et andet aspekt tilvejebringer opfindelsen en t-PA-variant med en aminosyreændring i et eller flere steder inden for proteasedomænet af t-PA sammenlignet med den tilsvarende vild-type-t-PA, hvilken ændring gør varianten zymogenisk sammenlignet med den til-10 svarende vild-type-t-PA.

I en særligt foretrukket udførelsesfomn er varianten afledt fra human t-PA, og ændringen er i området omkring aminosyre 305: en aminosyre som ikke er phenylalanin substitueres på aminosyre position 305, eller en aminosyre ind-15 sættes efter en eller begge aminosyre på position 304 og 305, eller en eller flere aminosyre slettes på aminosyre positionerne 297 til 305 inklusive begge positioner; nummereringen af aminosyre positioner er i overensstemmelse med nummereringen i figur 1.

20 I andre udførelsesformer angår opfindelsen en DNA-sekvens, som koder for det ovenfor beskrevne zymogen og ovenfor beskrevne varianter, replicerbare ekspressionsvektorer, som er i stand til at udtrykke DNA-sekvensen i en transformant-værtscelle, og mikroorganismer og cellekulturer transformeret med vektoren.

25 I endnu en anden udførelsesform tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til identifikation af vævs-plasminogenaktivator-(t-PA)-varianter, som har en større differentiel aktivitet mellem en-kæde-formen og to-kæde-formen end den vild-type rekombinant t-PA, som omfatter: 30 (a) substituering af en aminosyre som ikke er phenylalanin på aminosyre po sition 305; eller DK 175958 B1 9 (b) indsættelse af en aminosyre efter en eller begge aminosyre på position 304 og 305; eller (c) sletning af en eller flere aminosyrer på aminosyre positionerne 297 til 305 inklusive begge positioner; 5 af den vilde-type human t-PA.

I andre aspekter leverer opfindelsen en human vævsplasminogenaktivator-(t-PA)-variant, som er i stand til at udøve en eller flere af de følgende biologiske aktiviteter: en større differentiel aktivitet mellem en-kæde formen og to-kæde 10 formen end vild-type rekombinant t-PA, en større fibrinafhængig specifik aktivitet i forhold til fibrinogenafhængig specifik aktivitet i en S2251 prøvning end en vild-type rt-PA, eller en større plasmakoagelafhængig specifik aktivitet i forhold til plasmaafhængig specifik aktivitet i en S2251 prøvning end en vild-type rt-PA, kendetegnet ved, at den indeholder mindst en aminosyresubstitu-15 ering i dens proteasedomæne sammenlignet med den tilsvarende vild-type-t-PA (fra aminosyre 264 til aminosyre 527), hvilken substituering er ansvarlig for den nævnte biologiske aktivitet, forudsat at varianterne d296-302 t-PA, R304E t-PA, R304S t-PA og A473S t-PA er udelukket og at substitueringen ikke alene kan være i områderne 270-280, 448-450 og 502-527, og substitu-20 eringer i områderne 411-416, 416-423 eller 423-430; nummereringen af aminosyre positionerne svarer til den i figur 1.

I et andet aspekt tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til identifikation af vævsplasminogenaktivator varianter med specificeret biologisk aktivitet 25 omfattende: (a) indførelse af en aminosyresubstitution i proteåse domænet af vævsplasminogen aktivator (t-PA) (aminosyre positionerne 264 til 527), hvor substitueringen ikke alene kan være i områderne 270-280, 448-450 og 502-527 af den tilsvarende vild-type t-PA, og 30 (b) screening af den resulterende t-PA-variant for dens evne til at udøve en eller flere af de følgende biologiske aktiviteter (a) en større differentiel aktivi- j i i..........

DK 175958 B1 10 tet mellem en-kæde formen og to-kæde formen end vild-type rekombinant t-PA; (b) en større fibrinafhængig specifik aktivitet i forhold til fibrinogenafhæn-gig specifik aktivitet i en S2251 prøvning end en vild-type rt-PA, eller (c) en større plasmakoagelafhængig specifik aktivitet i forhold til plasmaafhængig 5 specifik aktivitet i en S2251 prøvning en vild-type rt-PA, med det forbehold at screeningen for aktivitet (a) er udelukket hvis substitutionen er i områderne 411-416, 416-423 eller 423-430; nummereringen af aminosyre positionerne svarer til den i figur 1.

10 I yderligere udførelsesformer tilvejebringer opfindelsen DNA-sekvenser og replicerbare vektorer, som koder for de ovenfor beskrevne varianter, og værtsceller transformeret med dem.

I endnu en udførelsesform er opfindelsen rettet mod et præparat til behand-15 ling af en vaskulær tilstand eller sygdom, hvilket præparat indeholder en terapeutisk effektiv mængde af en her omhandlet variant i blanding med et farmaceutisk acceptabelt bærestof.

Det første aspekt af opfindelsen er blandt andet baseret på specifik succes-20 fuld forskning, som påviser, at visse t-PA-molekyler er zymogener i nærvær af en stimulator af t-PA-aktivitét, såsom plasmin-nedbrudte fibrinogenfrag-menter, og således kan have deres fibrinolytiske aktivitet afbrudt, når de forekommer alment i plasmaet, og aktiveret, når de er nær ved plasmin på koagelstedet. Således aktiveres zymogenet efter behov til specifik lokaliseret 25 koagelterapi. De her omhandlede zymogener forventes at være fibrinogen-besparende og er almindeligvis anvendelige i højere doser end deres ikke-zymogene modstykker, hvilket resulterer i hurtigere koagéllyse og lyse af flere koagler.

30 Det andet aspekt af denne opfindelse er at opnå et t-PA-molekyle, som er mere fibrin-(eller plasmakoagel)-specifikt, således at det vil virke mere for- __i DK 175958 B1 11 . trinsvis på stedet for koagelet end umodificeret t-PA.

Fig. 1 afbilder den primære struktur af t-PA, idet den viser beliggenheden af de 5 domæner, disulfidbroeme og aktiveringsstedet, hvor molekylet klippes til 5 et to-kæde-molekyle.

Fig. 2 og 3 er skematiske gengivelser af en egnet fremgangsmåde til fremstilling af pCISt-PA sammen med en beskrivelse af visse af dets fremtrædende restriktionssteder.

1°

Fig. 4 er en skematisk gengivelse af en egnet fremgangsmåde til fremstilling af p7-1 H sammen med en beskrivelse af visse af dets fremtrædende restriktionssteder.

15 Fig. 5 viser fibrinbinding af overvejende en-kæde-F305H (udfyldte.trekanter), to-kæde-F305H (udfyldte cirkler med dobbelte linier), en-kæde-vild-type-t-PA (udfyldte kvadrater), to-kæde-vild-type-t-PA (udfyldte rhomber) og en blanding af en-kæde- og to-kæde-vild-type-t-PA (åbne trekanter) ved. en t-PA-koncentration på 10 ng/ml.

20

Fig. 6-9 viser kurver over kinetikken ved omdannelsen af plasminogen til plasmin i nærvær af plasmin-nedbrudt fibrinogen med overvejende en-kæde-vild-type-t-PA (fig.6), to-kæde-vild-type-t-PA (fig.7), overvejende en-kæde-F305H-t-PA (fig.8) og to-kæde-F305H-t-PA (fig.9). Kvadraterne, linierne og i 25 cirklerne repræsenterer forskellige koncentrationer af plasminogen og t-PA i prøvningspufferen, som er specificeret i slutningen af eksempel 1.1 disse figurer angiver ordinaten absorbansen ved 405 nm og abscissen kvadratet på antallet af minutter, hvorunder absorbansen blev taget.

30 I denne beskrivelse med krav betegner "human vævsplasminogenaktivator", "human t-PA" og "t-PA" human ydre (vævstype) plasminogenaktivator med to L____ _ DK 175958 B1 12 funktionelle områder bestående af et proteasedomæne, som er i stand til at omdanne plasminogen til plasmin, og en N-terminalregion, som antages at være ansvarlig for fibrinbinding. Disse tre betegnelser inkluderer derfor poly-peptider indeholdende disse funktionelle domæner som del af den samlede 5 sekvens. t-PA fremstilles passende f.eks. af rekombinant-cellekultur-systemer, i bioaktive former omfattende proteasedelen og portioner af t-PA, som på anden vis er native for kilden til den pågældende t-PA. Det vil forstås, at der eksistere naturlige allele variationer fra individ til individ påvist ved en eller flere aminosyreforskelle i den samlede sekvens.

10 I deriné beskrivelse med krav henfører betegnelsen "vild-type-t-PA" til den t-PA, som der kodes for af den cDNA, som er. rapporteret i US patentskrift nr.

4.766.075. Den således indkodede t-PA er passende et t-PA-molekyle fra enhver nativ kilde eller ethvert rekombinant ekspressionssystem, herunder 15 293-eller 294-celler, kinesisk-hamster-ovarie-celler osv.

I denne beskrivelse med krav henviser betegnelsen "proteasedomæne" til området i den modne form af vild-type-t-PA fra aminosyre 264 til aminosyre 527, inklusive.

20 I definitionen henfører et "zymogen" specifikt til et t-PA-molekyle, som ved en prøvning af enzymatisk aktivitet udviser en større differentiel aktivitet mellem en-kæde-formen og to-kæde-formen end vild-type-rekombinant-t-PA (rt-PA).

Den differentielle aktivitet , af zymogenet er fortrinsvis mindst ca. 1,5 gange 25 aktiviteten af vild-type-rt-PA. Denne aktivitet kan opnås ved sænkning af akti: viteten af en-kæde-formen i større grad end af to-kaede-formen i forhold til vild-type-rt-PA; hævning af aktiviteten af to-kæde-formen i større grad end af en-kæde-formen i forhold til vild-type-rt-PA; eller enhver kombination af de ovenfor beskrevne hændelser, som giver den beskrevne virkning. Den zy-30 mogeniske karakter af vild-type-t-PA er beskrevet i Loscalzo, J. Clin. Invest., 82: 1391-1397 (1988) og Ranby et al., Thrombosis Research, 27: 175-183 ...............

i (1982).

DK 175958 B1 13

Udtrykket "fibrinspecificitet" henfører til aktiviteten af en mutant, som udviser et højere forhold mellem fibrinafhængig specifik aktivitet, og fibrinafhængig 5 specifik aktivitet ved en S-2251-prøvning (i enten en-kæde- eller to-kæde-formen) end vild-type-rt-PA, og fortrinsvis et forhold på 1,5.

Udtrykket "plasmakoagelspecificitet" henfører til aktiviteten af en mutant, som udviser et højere forhold mellem plasmakoagel-afhængig specifik aktivitet og 10 plasma-afhængig specifik aktivitet ved en S-2251-prøvning (i enten en-kæde-eller to-kæde-fomnen) end vild-type-rt-PA, og fortrinsvis et forhold på mindst 1,5.

I denne beskrivelse med krav angiver "transient ekspressionssystem" en cel-15 lekultur indeholdende celler transficeret med en t-PA-variant-kodende vektor,.

som udtrykker DNA-sekvensen, som koder for varianten, midlertidigt, dvs. på j j en måde, som eventuelt ikke er stabil. Sådanne celler bedømmes til at være j "i stand til transient ekspression". j ! 20 Med henblik på omtale af de her omhandlede varianter henvises til fig. 1, ! i som belyser den primære struktur af t-PA. I fig. 1 er bogstaverne i cirklerne enkelt-bogstavs-aminosyre-koder, dé forbindende linier mellem kæderne angiver disulfidbnoer, de åbne cirkler angiver glycosyleringssteder, og betegnelserne F, GF, K1, K2 og SP angiver henholdsvis finger-, vækstfaktor-, kringle-25 1-, kringle-2- og serinprotease-domæneme.

Med henblik på kort betegnelse af her beskrevne t-PA-varianter bemærkes det, at numrene henfører til aminosyreresten/positionen langs aminosyrese-kvenseme af den formodet modne t-PA (EP offentliggørelsesskrift nr. 93619).

30 Nummereringen er også vist i figur 1. Aminosyreidentifikationen anvender enkelt-bogstavs-koden for aminosyrer, dvs.: i________ DK 175958 B1 14

Asp D asparaginsyre Ile I isoleucin

Thr T threonin Leu L leucin

Ser S serin Tyr Y tyrosin

Glu E glutaminsyre Phe F phenylalanin

Pro P prolin His H histidin

Gly G glycin Lys K lysin

Ala A alanin Arg R arginin

Cys C cystein Trp W tryptophan I Val V valin Gin Q glutamin

Met M methionin_ Asn N asparagin_._

Betegnelsen for en udskiftningsvariant i denne beskrivelse med krav består af et bogstav efterfulgt af et tal efterfulgt af et bogstav. Det første bogstav (til venstre) betegner aminosyren i den modne form af vild-type-t-PA. Tallet hen-5 fører til den aminosyreposition, hvori aminosyreudskiftningen foretages, og det andet bogstav (til højre) betegner den aminosyre, som anvendes til at erstatte vild-type-aminosyren. Betegnelsen for en indsætningsvariant består af bogstavet i efterfulgt af et tal, som betegner positionen af den rest i den modne form af vild-type-t-PA, foran hvilken indsætningen begynder, efterfulgt 10 af et eller flere store bogstaver, som tilsammen angiver den indsætning, som foretages. Betegnelsen for en deletionsvariant består af bogstavet d efterfulgt af tallet for startpositionen af deletionen til tallet for slutpositionen af deletionen, hvor positionerne er baseret på den modne form af vild-type:t-PA. Fler-dobbelte mutationer er adskilt af et komma i notationen med henblik på lette-15 re aflæsning.

Eksempler på nomenklaturen er som følger: en udskiftningsvariant, hvor phenylalaninresten i position 305 af vild-type-t-PA’en er erstattet med en ! histidinrest, betegnes F305H. En udskiftningsvariant med flere indførelser i 20 på hinanden følgende positioner 296-299 af AAAA i stedet for KHRR betegnes K296A, H297A, R298A, R299A. En indsætningsvariant, hvor cystein og valin indsættes efter position 305 i vild-type-t-PA, betegnes i305CV. En deletionsvariant, hvor aminosyrerne i positionerne 300-305 deleteres fra den i i i ______—Λ DK 17595β B1 15 modne form af vild-type-t-PA, betegnes d300-305. Notationen "t-PA" følger efter hver mutant.

En foretrukken klasse af zymogener ifølge opfindelsen er de, som har en ud-5 skiftning, deletion eller indsætning i eller omkring position 305 i vild-type-t-PA. Disse varianter inkluderer dem med en anden aminosyre en phenylala-nin i position 305 i den tilsvarende vild-type-t-PA. Mere fortrinsvis er sådanne varianter dem med en aminosyre i position 305, der har en sidekæde, som kan virke eller virker som hydrogenbindingsdonor, såsom en, der indeholder 10 en hydroxygruppe eller et nitrogenatom. Endnu mere fortrinsvis er sådanne aminosyrer arginin, lysin, tyrosin, asparagin, glutamin og histidin, mest foretrukket histidin. Foretrukne zymogeniske indsætningsvarianter af denne type inkluderer dem med en eller flere, fortrinsvis en, aminosyre indsat efter aminosyren i position 304 eller 305, såsom de ovenfor beskrevne aminosyrer, 15 dvs. dem med en sidekæde, der kan virke eller virker som hydrogenbindingsdonor, såsom en, der indeholder en hydroxygruppe eller et nitrogen-atom, f.eks. arginin, lysin, tyrosin, asparagin, glutamin og histidin, mest foretrukket histidin. Foretrukne zymogeniske deletionsvarianter inkluderer dem med deletioner i området 297-305, inklusive, i vild-type-t-PA, herunder d297 20 t-PA, d298 t-PA osv. og kombinationer, såsom d297-299 t-PA eller d297,d305 t-PA.

Særlige udførelsesformer af de ovenfor angivne zymogenvarianter inkluderer: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q 25 t-PA; i304H t-PA; Ϊ304Τ t-PA; Ϊ304Ν t-PA; Ϊ304Κ t-PA; i304R t-PA; i304Q t-PA; Ϊ304ΗΗ t-PA; i305H t-PA; Ϊ305Τ t-PA; Ϊ305Ν t-PA; i305K t-PA; i305R t-PA; i305Q t-PA; i304H,i305H t-PA; Ϊ305ΗΗ t-PA; d297 t-PA; d298 t-PA; d299 t-PA; d300 t-PA; d301 t-PA; d302 t-PA; d303 t-PA; d304 t-PA; d305 t-PA; d297-298 t-PA; d297-299 t-PA; d297-300 t-PA; d297-301 t-PA; d297-302 t-30 PA; d297-303 t-PA; d297-304 t-PA; d297-305 t-PA; d300-301 t-PA; d300-302 t-PA; d300-303 t-PA; d300-304 t-PA; d300-305 t-PA; d304-305 t-PA; d297, i l________ DK 175958 B1 16 d300t-PA; d,d305 t-PA; d1-44,N184D,F305H t-PÅ; d1-44,F305H t-PA; d1- .

44.I210R, G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d144,121 OR,G211A,K212R,V213K, F305H t-PA; d1-44,V213K,F305H t-PA; d1-44,T252R,F305H t-PA; 5 d1-44,V213K,T252R,F305H t-PA; d1-44,l210K,F305H t-PA; .

d1-44,121 OR,G211 H,K212Q.V213K.F305H t-PA; 1210R.G211 H.K212Q, V213K.F305H t-PA; I210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d1-44,N184D,I210R,G211A,K212R,V213R,T252R,F305H t-PA; N184D, I210R,G211A,K212R,V213R,T252R,F305H t-PA; d92-179,F305H t-PA; d92-10 179,I210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d92-179,N194D, I210R,G211A,K212R,V213R,T252R,F305H t-PA; d92-179,121 OR, G211A,K212R,V213R,T252R,F205H t-PA; Y67N;F305H t-PA; d1-44,.

Y67N.F305H t-PA; og de T252R eller N184S analoge dertil eller kombinationer deraf. (Ændringerne ud over dem i proteasedomænet er beskrevet yder-15 ligere nedenfor).

Af disse er de foretrukne zymogenvarianter F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; Ϊ304Η t-PA; d1-44,F305H t-PA; d92-179,F305H t-PA; d1-44,N184D,F305H t-PA; d1-20 44,121 OR,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d1-44,l210R; G211A,K212R,V213K,F305H t-PA; l210R,G211A,K212R,V213R,F305Ht-PA; d92-179,l210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d92-179,N183D, 210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d1-44,N184D,l210R,G211A, K212R,V213R,T252R,F305 t-PA; og N184D,I210R,G211A,K212R, V213R, 25 T252R.F305H t-PA.

Mere foretrukne varianter af den første klasse af zymogenér er F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305Q t-PA; i304H t-PA; d1-44,F305H t-PA; d92-179.F305H t-PA, og den mest foretrukne F305H t-PA. i 30

En anden foretrukken klasse af zymogener ifølge opfindelsen såvel som en

_________-A

DK 175958 B1 17 klasse af varianter, som alternativt eller desuden kan være fibrin- (eller plasmakoagel-specifikke), er varianter med en eller flere ændringer i små områder af proteasedomænet identificeret som havende ladede aminosyre-sidekæder, hvilke områder og/eller naboområder dertil kan være ansvarlige 5 for t-PA's samvirken med andre stoffer, som eventuelt påvirker dens forskel· lige. aktiviteter.

De områder, der er identificeret til prøvning for aktivitet ved denne fremgangsmåde, er ved aminosyrenumrene 267, 283-287, 296-299, 303-304, 10 322,326-327,331-332,339-342,347-351,353-356,360-362,364-366,369- 371, 378-383, 387-392, 400-405, 408, 410, 416-418, 426-430, 432-434, 440, 445-449, 449-453, 460-462, 471-472, 477, 487-489, 505-506, 513, 519-523 og 523-526 i den tilsvarende vild-type- t-PA. Et eller flere af disse områder, eller underenheder deraf, ændres for at bestemme, om den eller de ønskede 15 biologiske egenskaber vil blive opnået. De ladede rester (Arg, Asp, His, Lys. og Glu) identificeres passende under anvendelse af en teknik kendt som ala-nin-scannings-mutagenese, angivet i Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989), og erstattet med en neutral eller negativt ladet aminosyre for at frembringe samvirken af aminosyreme med det omgivende vandige 20 miljø i eller uden for cellen.

De mutanter, som er fundet at være i denne anden foretrukne klasse af zy-mogener og fibrinspecifikke molekyler, er dem, hvori de erstattede aminosyrer er positionerne 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-25 349+351, 364-366, 408, 410, 416-418, 426-427+429-430, 432-434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 og/eller 477 i den tilsvarende vild-type t-PA, hvor ”+" angiver erstatninger kun i de anførte positioner, og angiver erstatninger i alle de angivne og mellemliggende positioner.

30 Til alanin-scannings-mutagenesen foretrækkes det, at der indføres en aminosyre, som vil neutralisere ladningen af den tilsvarende aminosyre i vild- * ______ _ 18

DK 175958 BT

type t-PA fremfor tilføre en modsat ladning på molekylet. Enhver hydrofob, i det væsentlige uladet eller modsat ladet aminosyre kan anvendes, herunder som foretrukne alanin, glycin, serin, threonin, asparagin, glutamin, valin, leu-cin, isoleucin, phenylalanin eller tyrosin. Blandt disse foretrækkes småamino-5 syrer, såsom alanin, serin og threonin, fremfor større aminosyrer, såsom va-lin, leucin og isoleucin. Ladede aminosyrer, såsom aspåraginsyre eller glu-taminsyre er mindre foretrukne.

Mere fortrinsvis er den aminosyre, der anvendes til erstatning, enten alanin, 10 serin, threonin, asparagin, glutamin, phenylalanin eller tyrosin, og endnu mere foretrukket alanin, serin eller threonin. Alanin er den mest foretrukne aminosyre til dette formål, fordi den eliminerer sidekædén ud over β-carbonatomet og er mindre tilbøjelig til at ændre hovedkædekonformationen af vild-type t-PA-molekylet. Yderligere findes alanin hyppigt i både begravede 15 og blottede positioner (Creighton, T.E., The Proteins (eds. W.H. Freeman &

Co., N.Y.); Chothia, C. (1976) J. Mol. Biol., 150:1).

Foretrukne varianter af denne sidste klasse af zymogener eller fibrin-(eller plasmakoagel)-specifikke varianter er de, der også indeholder modifikationer 20 i proteasedomænet af t-PA med undtagelse af varianterne D365A t-PA, R462L t-PA, 473S t-PA, d296-304 t-PA, d296-302 t-PA, R298E t-PA, R299E t-PA, R304E t-PA, R304S t-PA, d296-299 t-PA og K296E,R298E,R299E t-PA.

25 Mere specifikt foretrækkes de varianter, som har en eller flere udskiftninger i positionerne 267, 283, 287, 296, 297, 298, 299, 303, 304, 331, 332, 339, 342, 347, 348, 349, 351, 364, 365, 366, 408, 410, 416, 417, 418, 426, 427, 429, 430, 432, 434, 440, 445, 449, 453, 460, 462 eller 477 eller flere af disse i den tilsvarende vild-type t-PA. : 30

Mere foretrukket har proteasedomænevarianterne udskiftninger i positioner- _________________—ύ DK 175958 B1 19 ne 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364-366, 408, 410, 416-418, 426-427+429-430, 432+434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 og 477 af den tilsvarende vild-type t-PA, hvor"+" angiver ændringer kun i de anførte positioner, og angiver ændringer i alle de an- · i * ...

5 førte positioner, herunder de mellemliggende.

Endnu mere foretrukket er proteasedomænevarianteme af den sidste klasse af zymogener eller fibrin-(eller plasmakoagel)-specifikke varianter R267A t-PA, D283A.H287A t-PA, K296A,H297A,R298A,R299A t-PA, E303A.R304A t- . i 10 PA, H331A,H332At-PA, R339A.R342A t-PA, E347A,E348A,E349A,K351A t-PA, D364A, D365A.D366A t-PA, E408A t-PA, E410A t-PA, K416A.H417A.E418A t-PA, E426A,R427A,K429A,E430A t-PA, H432A.R434A t-PA, R440A t-PA, H445.R449A t-PA, R449A.D453A t-PA, D460A.R462A t-PA og D477A t-PA.

15

Af disse er den mest foretrukne indførelse en alaninrest i stedet for hver af de I

eksisterende aminosyrerester i positionerne 296-299 af vild-type t-PA, dvs. K296A,H297A,R298A,R299A t-PA.

20 De foretrukne indsætningsvarianter, som kan udvise zymogeriisk eller fi- ! brinspecifik aktivitet, er dem, hvori en eller flere aminosyrer er indsat efter ' aminosyreme i positionerne 296, 297, 298 og/eller 299. Ligeledes foretrukket til dette formål er de proteasedomænevarianter, som har en indsætning bestående af enten tyrosin, asparagin, lysin, arginin eller glutamin.

25 '

Andre varianter med en eller flere aminosyreændringer (deletioner, udskiftninger eller indsætninger, men fortrinsvis udskiftninger) i proteasedomænet (aminosyreme 264-527) af det native t-PA-molekyle, som udviser zymo-geniske egenskaber sammenlignet med vild-type t-PA, kan identificeres un-30 der anvendelse af en eller flere af de nedenfor angivne screeningsprøvninger.

L _______ DK 175958 B1 20 i

Foruden at være ændret fra den native sekvens i et eller flere proteasedo-mænesteder for at udvise zymogeniske og/eller fibrin-(eller plasmakoagel)-specifikke egenskaber, indeholder t-PA-varianteme ifølge opfindelsen eventuelt også udskiftninger, deletioner eller indsætninger af rester i andre områ· 5 der af den native sekvens for at forbedre visse egenskaber hos molekylet, forudsat at de foretagne ændringer ikke forhindrer spaltningen af en-kæde-formen af t-PA til dens to-kæde-form eller på anden måde ændrer en ønskelig biologisk egenskab tilført molekylet ved ændringen eller ændringerne i proteasedomænet som angivet ifølge opfindelsen. De foretrukne ændringer i 10 disse andre domæner er anført ovenfor i listerne over de mest foretrukne zymogenvarianter af den første type.

For eksempel er varianterne ifølge opfindelsen passende uden i det mindste en del fingerdomænet, vækstfaktordomænet og/eller kringle-1-domænet 15 og/eller uden glycosyleringsevne ved glycosyleringsstedet omkring aminosyre 184 og indeholder passende aminosyremodifikationer i det formodede ly-sin-bindingssted i kringle 1 eller 2.

Desuden kan fibrinbindingen af t-PA moduleres, mest foretrukket genoprettes 20 eller forøges ved passende udskiftninger af positivt eller negativt ladede ami-nosyrerester ved de modsatte kanter af den formodede ligantbindingslomme i kringle 2 domænet af t-PA. Varianterne ifølge opfindelsen fremstilles almindeligvis ved stedsdirigeret mutagenese eller ved udskærings/ligerings-teknik beskrevet yderligere nedenfor.

25

Specifikke eksempler på sådanne varianter inkluderer et molekyle uden ami-nosyreme 1-44 (betegnet d1-44) og et molekyle med asparaginsyre i position 184 (betegnet N184D). Varianter uden aminosyrerne 1-44 er beskrevet mere fuldstændigt i det ovennævnte WO 89/00197.

30

Alle de ovennævnte varianter er eventuelt modificeret i forskellige andre om- ____________________________u I-- DK 175958 B1 21 råder af molekylet, hvis sådanne modifikationer stadig opfylder de her angivne kriterier for zymogeniske og/eller fibrin-(eller plasmakoagel)-specifikke egenskaber. Sådanne modifikationer inkluderer f.eks.: 5 1. Kringle 1 modifikationer, f.eks. deletion af omkring 92-179 og/eller 2. Kringle 2 modifikationer, f.eks. deletion af omkring 174-261 eller modifikation i området af aminosyrer fra omkring 205 til omkring 215, især 210-213, og/eller 3. Aminosyreme fra omkring 244 til omkring 255, især 252 eller dens sted, 10 og/eller 4. Aminosyreme fra omkring 233 til omkring 243, især 236-238, og/eller 5. Kendte glycosyleringssteder, såsom aminosyre 184, og/eller 6. Glycosylering i vækstfaktordomænet. Kort fortalt N- eller O-glycosyleres t-PA-molekylet i dets vækstfaktordomæne, fortrinsvis i position 67-69, hvor 15 tyrosinresten i position 67 erstattes med en asparaginrest for at ændre t-PA-molekylets halveringslevetid.

Mange af disse modifikationer kan væsentligt ændre clearance og fibrinbinding i forhold til nativ t-PA. Fagmanden vil være i stand til at bestemme ved 20 passende prøvning, hvilke optimale egenskaber af hver variant, der ønskes i hvert bestemt tilfælde.

Modifikationen til ændring eller indsætning af den eller de passende aminosyrer i de native molekyle for at frembringe de ovennævnte sekvensvariatio-25 ner gennemføres ved anvendelse af ethvert middel, der er kendt inden for faget; som f.eks. stedsdirigeret mutagenese eller ligering af den passende sekvens ind i DNA'en, som koder for det relevante protein, som beskrevet nedenfor.

30 Fremstilling af t-PA-varianter ifølge opfindelsen gennemføres fortrinsvis ved stedsspecifik mutagenese af DNA, som koder for en tidligere fremstillet vari- L -- ----—-—--—--- --- ...........

DK 175958 B1 22

• ' . I

! i ant- eller nonvariant-version af proteinet. Stedsspecifik mutagenese muliggør fremstillingen af t-PA-varianter via anvendelsen af specifikke oligonucleotid-sekvenser, som koder for DNA-sekvensen af den ønskede mutation, såvel j som et tilstrækkeligt antal tilliggende nucleotider til at tilvejebringe en primer-5 sekvens af tilstrækkelig størrelse og sekvenskompleksitet til at danne en stabil duplex påbegge sider.af den gennemskåme samling. Typisk foretrækkes en primer af en længde på ca. 20-25 nucleotider, hvor ca. 5-10 aminosyrere-ster på begge sider af sekvenssamlingen ændres. I almindelighed er teknikken til stedsspecifik mutagenese velkendt inden for faget som eksemplificeret 10 ved publikationer, såsom Adelman et al., DNA, 2:183 (1983).

Som det vil indses, anvender stedsspecifik-mutagenese-teknikken typisk en fagvektor, som eksisterer i både en enkeltstrenget og en dobbeltstrenget form. Typiske vektorer, der er nyttige ved stedsdirigeret mutagenese, inklu-15 derer sådanne vektorer som M13-fagen, f.eks. som angivet af Messing et al.,

Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA,

Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981). Disse fager er kommercielt tilgængelige, og deres anvendelse er almindeligvis velkendt for fagfolk. Alternativt kan der anvendes plasmidvektorer, som indeholder et enkeltstrenget 20 fag-origin for replikation (Veira et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987)), anvendes til opnåelse af enkeltstrenget DNA.

I almindelighed gennemføres stedsdirigeret mutagenese i overensstemmelse med opfindelsen ved først at fremstille en enkeltstrenget vektor, som i dens 1 25 sekvens inkluderer en DNA-sekvens, som koder for den relevante t-PA. En oligonucleotid-primer, som bærer den ønskede muterede sekvens fremstilles, almindeligvis syntetisk, f.eks. ved fremgangsmåden beskrevet af Crea et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 75: 5765 (1978). Primeren sammensmeltes derpå med den enkeltstrengede t-PA-sekvens-holdige vektor og udsættes for 30 DNA-polymeriserende enzymer, såsom E. coli polymerase I Klenow-fragment, for at fuldføre syntesen af den mutationsbærende streng. Således ....................... .................

DK 175958 B1 23 dannes en heteroduplex, hvori den ene streng koder for den oprindelige ikke-muterede sekvens, og den anden streng bærer den ønskede mutation. Denne heteroduplex-vektor anvendes derpå til at transformere passende celler,. såsom JM101-celler, og via hybridisering til en radioaktiv gruppe bestående 5 af den 32P-mærkede mutagenese-primer selekteres kloner, som inkluderer rekombinant-vektorer bærende det muterede sekvensarrangement.

Efter at en sådan klon er selekteret, kan det muterede t-PA-område fjernes og anbringes i en passende vektor til t-PA-produktion, almindeligvis en.eks-10 pressionsvektor af den type, der typisk anvendes til transformation af en passende eukaryotvært. I sammenhæng med opfindelsen foretrækkes kinesisk-hamster-ovarie (CHO)-celler eller 293 (humane nyreceller beskrevet), af Graham et al., J.Gen. Virol., 36: 59 (1977)) til fremstilling af langvarigt stabile t-PA-producenter. Imidlertid er opfindelsen ikke begrænset til CHO-produktion, 15 da det er kendt, at talrige andre celletyper er velegnede til anvendelse, især hvor man kun ønsker forbigående produktion af enzymet til prøvningsformål.

F.eks. er der nedenfor beskrevet et transient system under anvendelse af 293-celler, som tilvejebringér et hensigtsmæssigt system til fremstilling af t-PA-varianter til analytiske formål.

20

En anden fremgangsmåde til fremstilling af mutationer i DNA-sekvensen, som koder for t-PA, involverer spaltning af DNA’en, som koder for t-PA, i den passende position ved nedbrydning med restriktionsenzymer, udvinding af den rent spaltede DNA, syntetisering af et oligonucleotid, som koder for den 25 ønskede aminosyre og flankerende områder, såsom polylinkere med stumpe ender (eller i stedet for anvendelse af polylinkere anvendes nedbrydning af det syntetiske oligonucleotid med restriktionsenzymerne også til spaltning af den t-PA-kodende-DNA, hvorved der skaber kohæsive termini) og ligering af den syntetiske DNA ind i resten af det t-PA-kodende strukturelle gen.

30

Selv om kinesisk-hamster-ovarie-(CHO)-ekspression i sidste ende foretræk- i l_______ DK 175958 B1 24 kes til t-PA-produktion, er de her angivne vektorer og fremgangsmåder egnede til anvendelse i værtsceller over et bredt område af eukaryote organismer.

I 5 I almindelighed foretrækkes selvfølgelig prokaryoter til den indledende klo ning af DNA-sekvenser og konstruktion af vektorerne, der er nyttige ifølge opfindelsen. F.eks. er E. coli K12 stamme 294 (ATCC nr. 31 446) og E. coli stamme W3110 (ATCC nr. 27 325) særlig nyttige. Andre egnede mikroorganismestammer inkluderer E. coli stammer, såsom E. coli B og E.

10 coli X1776 (ATCC nr. 31 537). Disse eksempler er selvfølgelig blot belysende og på ingen måde begrænsende.

Prokaryoter er også nyttige til ekspression. De førnævnte stammer såvel som baciller, såsom Bacillus subtilis, og andre enterobacteriaceae, som f.eks.

15 Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens, og forskellige Pseudomo-nas-arter er eksempler på nyttige værter til ekspression.

I almindelighed anvendes plasmidvektorer indeholdende replicon og styresekvenser, der er afledt fra arter, kompatible med værtscellen, i forbindelse 20 med disse værter. Vektoren bærer almindeligvis et replikationssted såvel som markørsekvenser, der er i stand til at tilvejebringe fænotypisk selektion i transformerede celler. F.eks. transformeres E. coli typisk under anvendelse af pBR322, et plasmid afledt fra en E. coli art (se f.eks. Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 indeholder gener for. ampicillin- og tetracyclinresistens 25 og tilvejebringer således lette midler til identificering af transformerede celler.

Plasmidet pBR322 eller et andet mikrobielt plasmid eller en fag må også indeholde, eller være modificeret til at indeholde, promotorer, der kan anvendes af mikroorganismen til ekspression af dens egne proteiner.

30 De promotorer, som mest almindeligt anvendes ved rekombinant-DNA-konstruktion, inkluderer lactamase-(penicillinase-) og lactose- __________.________j DK 175958 B1 25 promotorsystememe (Chang et al., Nature, 375:615 (1978): Itakura et al.,

Science 198:1056 (1977); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)) og et tryp-tophan-(trp)-promotorsystem (Goeddel et al., Nucl.Acids Res., 8:4057(1980); EP offentliggørelsesskrift nr. 36776), samt alkalisk-phosphatase-systememe.

5 Selv om disse er de mest almindeligt anvendte, er andre mikrobielle promotorer blevet opdaget og anvendt, og detaljer vedrørende deres nucleotidse-kvenser er blevet offentliggjort, hvilket gør det muligt for en fagmand at ligere dem funktionelt med plasmidvektorer (se f.eks. Siebenlist et al., Celle, 20:269 (980)).

10

Foruden prokaryoter er eukaryote mikroorganismer, såsom gærarter, også egnede til anvendelse ifølge opfindelsen. Sacchanomyces cerevisiae eller almindelig bagegær er den mest almindeligt anvendte blandt eukaryote mikroorganismer, selv om et antal andre stammer er almindeligt tilgængelige.

15 F.eks. anvendes plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979);

Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)) almindeligvis til udtrykkelse i Saccharomyces. Dette plasmid indeholder allerede trp1 genet, som tilvejebringer en selektionsmarkør for en mutantstamme af gær, der mangler evnen til at vokse i tryptophan, f.eks. ATCC nr. 44 076 20 eller PEP4/1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). Tilstedeværelsen af trp1 læsionen som en karakteristisk egenskab ved gærværtscelle-genomet tilvejebringer så et effektivt miljø til detektering af transformation ved vækst i fravær af tryptophan.

25 Egnede promotorsekvenser i gærvektorer inkluderer promotorerne for 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) eller andre glycolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland et al., Biochemistry, 17:4900 (1978)), såsom enolase; glyce-raldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, ; 30 phosphofructokinase, glucose-6-phosphat-isomerase, 3- phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosephosphatisomerase, l_______ DK 175958 B1 26 phosphoglucoseisomerase og glucokinase. Ved konstaiktionen af egnede ekspressionsplasmider ligeres afslutningssekvenseme forbundet med disse gener også en i ekspressionsvektoren 3’ for den sekvens, som ønskes udtrykt, for at give polyadenylering af mRNA'en og afslutning. Andre promoto-5 rer, som har den yderligere fordel, at deres transskription ér styret af vækstbetingelser, er promotorområdet for alkoholdehydrogenase 2, isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydende enzymer forbundet med nitrogenmetabolismen og den førnævnte glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase og enzymer, der er ansvarlige for maltose- og galactoseudnyttelse. Foruden mikroor-10 ganismer kan kulturer af celler afledt fra flercellede organismer også anvende som værter. I princippet er enhver sådan cellekultur brugbar, hvad enten den er fra hvirveldyr- eller ikke-hvirveldyr-kultur. Imidlertid har interessen været størst for hvirveldyrceller, og formering af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) er blevet en rutineprocedure i de senere år [Tissue Culture, Academic Press, 15 Kruse and Patterson, editors (1973)]. Eksempler på sådanne nyttige værtscellelinier er VERO og HeLa Celler, CHO-cellelinier, og W138-, BHK-, COS- 7- og MDCK-cellelinier. Ekspressionsvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis (om nødvendigt) et repliceringsorigin, en promotor beliggende foran genet, som skal udtrykket, sammen med alle nødvendige ribosombin-20 dingssteder, RNA-splejsningssteder, polyadenyleringssteder og transskriptionsafslutningssekvenser.

Til anvendelse i pattedyrceller tilvejebringes styringsfunktionerne på ekspres-sionsvektorerne ofte af viralt materiale. F.eks. afledes almindeligt anvendte 25 promotorer fra polyoma, Adenovirus 2 og hyppigst abevirus 40 (SV40). Den tidlige og den sene promotor fra SV40 virus er særlig anvendelige, fordi begge opnås let fra viruset som et fragment, der også indeholdér det virale repliceringsorigin fra SV40 (Fiers et al., Nature, 273:113 (1978)). Mindre eller større SV40-fragmenter anvendes også passende, forudsat at der er inklude- i 30 ret den sekvens på omkring 250 bp, som strækker sig fra Hindlll-stedet hen imod Bgll-stedet beliggende i det virale repliceringsorigin. Endvidere er det ___-__-______— DK 175958 B1 27 også muligt, og ofte ønskeligt, at anvende promotor- eller styresekvenser, som normalt er forbundet med den ønskede gensekvens, forudsat sådanne styresekvenser er kompatible med værtscellesystemerne.

5 Et repliceringsorigin tilvejebringes typisk entén ved konstruktion af vektoren til at inkludere et exogent origin, såsom det der kan afledes fra SV40 eller anden viral (f.eks. polyoma, Adenovirus, VSV..BPV) kilde, eller ved hjælp af værtscellens kromosomale repliceringsmekanisme. Hvis vektoren integreres i værtscellekromosomet, er det sidstnævnte ofte tilstrækkeligt.

10

Tilfredsstillende mængder af human t-PA produceres af cellekulturer, men af raffinementer, såsom anvendelse af en sekundær kodesekvens, tjener til at forhøje produktionsniveauerne endnu mere. Den sekundære kodesekvens omfatter dehydrofolatreductase (DHFR), som påvirkes af en ude fra styret 15 parameter, såsom methotrexat (MTX), og der muliggør styring af ekspressio-, nen ved styring af MTX-koncentrationen.

Ved valget af en foretrukken værtscelle til transfektion med vektorerne ifølge opfindelsen, der omfatter DNA-sekvenser, som koder for både variant t-PA-20 og DHFR-prptein, er det passende at overveje hvilken type DHFR-protein, der anvendes. Hvis der anvendes vild-type-DHFR-protein, foretrækkes det at vælge en værtscelle, som er deficient med hensyn til DHFR, hvilket muliggør anvendelsen af DHFR-kodesekvensen som markør for heldig transfektion i selektivt medium, der mangler hypoxanthin, glycin og thymidin. En passende 25 værtscelle i dette tilfælde er den CHO-cellelinie, deficient med hensyn til DHFR-aktivitet, der fremstilles og formeres som beskrevet af Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216 (1980).

!

Hvis der på den anden side anvendes DHFR-protein med lav bindingsaffinitet 30 for MTX som den styrende sekvens, er det ikke nødvendigt at anvende DHFR-dificiente celler. Eftersom den mutante DHFR er resistent overfor L_____________ 28 DK 175958 Βϊ MTX, kan der anvendes MTX-holdige medier som middel til selektion, forudsat at værtscellerne selv er MTX-følsomme. De fleste eukaryote celler, som er i stand til at absorbere MTX, viser sig at være følsomme for MTX. En sådan nyttig cellelinie er en CHO-linie, CHO-K1 (ATCC nr. CCL 61).

5

Hvis der anvendes pattedyrceller som værtsceller, udføres transfektionen almindeligvis ved calciumphosphat fældningsmetoden som beskrevet af Graham and Van der Eb, Virology, 52:546 (1978). Imidlertid kan der også passende anvendes andre fremgangsmåde til indførelse af DNA i cellerne, 10 såsom kemeinjektion, elektroperforering eller protoplastfusion.

Hvis der anvendes gær som værtsceller, gennemføres transfektionen almindeligvis under anvendelse af polyethylenglycol som angivét af Hinnen, Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:1929-1933 (1978).

15

Hvis der anvendes prokaryote celler eller celler, som indeholder væsentlige cellevægkonstruktioner, er den foretrukne transfektionsmetode calciumbehandling under anvendelse af calcium som beskrevet af Cohen et al;, Proc.

Natl. Acad. Sci. (USA) 69:2110 (1972), eller mere nyligt elektroperforering.

20

Konstruktionen af egnede vektorer indeholdende de ønskede kode- og styresekvenser sker under anvendelse af standardlegeringsteknik. Isolerede plasmider eller DNA-fragmenter spaltes, tilpasses og religeres i den ønskede form til dannelse af de krævede plasmider.

25 i

Spaltningen gennemføres ved behandling med restriktionsenzym (eller - enzymer) i en egnet puffer. I almindelighed anvendes ca. T pg plasmid eller j i DNA-fragmenter med omkring 1 enhed enzym i ca. 20 pi pufferopløsning.

(Passende puffere og substratmængder til bestemte restriktionsenzymer er 30 specificeret af producenten). Inkubationstider på omkring 1 time ved 37°C er brugbare. Efter inkubationen fjernes protein ved ekstraktion med phenol og i i

______________________________-J

DK 175958 B1 29 chloroform, og nukleinsyren udvindes fra den vandige fraktion ved fældning med ethanol.

Hvis der kræves stumpe ender, kan præparationsblandingen behandles i 15 5 minutter ved 15°C med 10 enheder af Klenow-fragmentet af DNA polymerase I, hvorpå der ekstråheres med phenol og chloroform og fældes med ethanol.

Størrelsesseparation af de spaltede fragmenter udføres ved anvendelse af 10 6 % polyacrylamidgel, som beskrevet af Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057(1980).

Til ligering behandles tilnærmelsesvis ækvimolære mængder af de ønskede komponenter, disse er endetilpasset på egnet måde for at give korrekt tilpas-15 ning, med ca. 10 enheder T4-DNA-ligase pr. 0,5 pg DNA. (Når der anvendes spaltede vektorer som komponenter, kan det være nyttigt at forhindre relige-ring af den spaltede vektor ved forbehandling med bakteriel alkalisk phosphatase).

20 Som omtalt pvenfor fremstilles t-PA-varianter fortrinsvis ved hjælp af specifik mutation. Varianter, der er nyttige ved udøvelsen af opfindelsen, dannes mest bekvemt via anvendelsen af specifikke oligonucleotidsekvenser, som koder for DNA-sekvensen af den ønskede mutation, såvel som et tilstrækkeligt antal tilliggende nucleotider til at give en sekvens af tilstrækkelig størrelse 25 og sekvens kompleksitet til at danne en stabil duplex på begge sider af mutationen, som gennemskæres.

Til analyse for at bekræfte korrekte sekvenser i konstruerede plasmider anvendes ligeringsblandingerne typisk til at transformere E. coli K12 stamme 30 294 (ATCC 31 446) eller andre egnede E. coli stammer, og heldige trans- formanter selekteres ved ampicillin- eller tetracyclinresistens, hvor det er i____________ DK 175958 B1 30 passende. Plasmider fra transformanterne præpareres og analyseres ved restriktionskortlægning og/eller DNA-sekvensbestemmelse ved fremgangsmåden beskrevet af Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) eller ! ved fremgangsmåden beskrevet af Maxam et al., Methods of Enzymology, 5 65:499(1980).

Efter indførelse af DNA’en i pattedyrcelleværten og selektion i medium for stabile transformanter, frembringes forstærkning af DHFR-protein-kodende ' sekvenser ved dyrkning af værtscellekulturer i nærvær åf omkring 20.000- 10 500.000 nM koncentrationer af MTX, en kompetitiv inhibitor af DHFR-aktivtet.

Det effektive koncentrationsområde er selvfølgeligt stærkt afhængigt af DHFR-genets og -proteinets art og værtens egenskaber. Det er klart at der ikke kan fastlægges alment definerede øvre og nedre grænser. Egnede koncentrationer af andre folsyreanaloge eller andre forbindelser, som inhiberer 15 DHFR, kunne ogsåanvendes. MTX selv er imidlertid hensigtsmæssigt, let tilgængeligt og effektivt.

For at simplificere eksemplerne vil visse hyppigt forekommende fremgangsmåder blive omtalt ved forkortede henvisninger.

20 "Plasmider" betegnes med et lille p efterfulgt af en alfanummerisk betegnelse. Udgangsplasmideme i denne beskrivelse med krav er kommercielt tilgængelige, er offentligt tilgængelige på uindskrænket basis eller kan konstrueres ud fra sådanne tilgængelige plasmider i overensstemmelse med 25 publicerede procedurer. Desuden kendes andre ækvivalente plasmider inden for faget og vil være indlysende for den almindelige fagmand.

"Nedbrydning" af DNA henfører til katalytisk spaltning med DNA'en med et enzym, som kun virker ved visse lokaliteter i DNA’en. Sådanne enzymer kal-30 des restriktionsenzymer, og steder, for hvilke hvert enzym er specifikt, kaldes et restriktionssted. De forskellige restriktionsenzymer, der anvendes i denne j _______________ ....______ ________________________ DK 175958 B1 31 beskrivelse med krav, er kommercielt tilgængelige, og deres reaktionsbetingelser, cofaktorer og andre krav som fastlagt af enzymleverandøreme blev anvendt. Restriktionsenzymer betegnes almindeligvis ved forkortelser sammensat af et stort bogstav efterfulgt af andre bogstaver repræsenterende· 5 den mikroorganisme, hvorfra hvert restriktionsenzym oprindeligt blev opnået, og derpå et tal, som betegner det bestemte enzym. I almindelighed anvendes ca. 1 pg plasmid eller DNA-fragment med ca. 2 enheder enzym i ca. 20 pi pufferopløsning. Passende puffere og substratmængder for bestemte restriktionsenzymer er specificeret af producenten. Der anvendes almindeligvis in-10 kubationstider på omkring 1 time ved 37°C, men de kan variere i overensstemmelse med leverandørens instruktioner. Efter inkubationen fjernes protein ved ekstraktion med phenol og chloroform, og den nedbrudte nucleinsyre udvindes fra den vandige fraktion ved fældning med ethanol.

Nedbrydning med et restriktionsenzym efterfølges i sjældne tilfælde af hydro-15 lyse med bakteriel alkalisk phosphatase af de 5‘-terminale phosphatgrupper for at forhindre de to restriktionsspaltede ender af et DNA-fragment i at "cir-kularisere" eller danne en lukket løkke, som ville skade indsætning af et andet DNA-fragment i restriktionsstedet. Med mindre andet er anført, efterfølges nedbrydning af plasmider ikke af 5'-tenminaldephosphorylering. Procedu-20 rer og reagenser til dephosphorylering er konventionelle (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning side 133-134).

"Udvinding" eller "isolering" af et givet fragment af DNA fra en restriktionsnedbrydning betyder separation af nedbrydningsblandingen på polyacryla-25 mid- eller agarosegel ved elektroforese, identifikation af det fragment, som har interesse, ved sammenligning af dets mobilitet i forhold til mobiliteten af markør-DNA-fragmenter med kendt molekylvægt, fjernelse af gelsektionen indeholdende det ønskede fragment og separation af gelen fra DNA. Denne prodcedure er alment kendt; se f.eks. R. Lawn et al., 1981, Nucleic Acids 30 Res. 9:6103-6114 og D. Goeddel et al., 1980, Nucleic Acids Res. 8:4057.

I_______ DK 175958 B1 32 "Southem-analyse" er en metode, ved hvilken tilstedeværelsen af DNA-sekvenser i en nedbrydningsblanding eller DNA-holdig sammensætning bekræftes ved hybridisering til et kendt mærket oligonucleotid eller DNA-fragment. Til de heri omhandlede formål skal "Southern-analyse", med min-5 dre andet er anført, betyde separation af hedbrydningsblandinger på 1 % agarose, denaturering og overførsel til nitrocellulose ved fremgangsmåden er beskrevet af E. Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517 og hybridisering er i beskrevet af T. Maniatis et al., 1978, Cell 15:687-701.

10 "Transformation" betyder indførelse af DNA i en organisme, således at DNA'en er replicerbar, enten som et ekstrakromosomalt element eller som kromosomal integrant. Med mindre andet er anført, er den fremgangsmåde, som anvendes i denne beskrivelse med krav til transformation af E. coli, CaCI2-fremgangsmåden beskrevet af Mandel et al., 1970, J. Mol. Biol.

15 53:154.

"Ligering" henfører til en fremgangsmåde til dannelse af phosphodiesterbin-dinger mellem to dobbeltstrengede nucleinsyrefragmenter (T. Maniatis et al.,

Ibid, side 146). Med mindre andet er anført, kan ligering gennemføres under 20 anvendelse af kendte puffere og betingelser med 10 enheder T4-DNA-ligase ("ligase") pr. 0,5 pg tilnærmelsesvis ækvimolære mængder af de DNA-fragmenter, som skal ligeres.

"Præparation" af DNA fra transformanter betyder isolering af plasmid-DNA 25 fra mikroorganismekultur. Med mindre andet er anført, kan alkali/SDS-fremgangsmåden beskrevet af Maniatis et al., ibid, side 90, anvendes.

"Oligonucleotider" er korte enkelt- eller dobbeltstrengede polydeoxynucleoti-der, som syntetiseres kemisk ved kendte fremgangsmåder og derpå renses 30 på poiyacrylamidgeler.

_________ __________________J

DK 175958 B1 33 C. Farmaceutiske præparater

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan sammensættes ifølge kendte frem-, gangsmåder til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, hvorved det 5 omhandlede t-PA-produkt kombineres i blanding med et farmaceutisk acceptabelt bæremedium. Egnede bæremedier og deres sammensætning, inklusive andre humane proteiner, f.eks. humant serumalbumin, er beskrevet f.eks. i Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th éd., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al. Sådanne præparater vil typisk indeholde en effektiv 10 mængde af den omhandlede variant, f.eks. fra ca. 0,5 til ca. 5 mg/ml, sammen med en egnet mængde bæremedium til at fremstille farmaceutisk acceptable præparater, der er egnet til effektiv indgivning til værten. Den omhandlede t-PA-variant kan indgives parenteralt til individer, som lider af cardiovaskulære sygdomme eller tilstande, eller ved andre metoder, som 15 sikrer dens levering til blodstrømmen i en effektiv form.

Præparater, som er særlige velegnede til klinisk indgivning af t-PA- i i variantprodukter ifølge opfindelsen inkluderer f.eks. sterile vandige opløsninger eller sterile hydratiserbare pulvere, såsom lyofiliseret protein. Det er al-20 mindeligvis ønskeligt, at der i sammensætningen yderligere inkluderes en passende mængde af et farmaceutisk acceptabelt salt, almindeligvis i en tilstrækkelig mængde til at gøre sammensætningen isotonisk. En pH-regulator, såsom argininbase, og phosphorsyre inkluderes også typisk i tilstrækkelige mængder til at holde en passende pH-værdi, almindeligvis fra 5,5 til 7,5.

25 Endvidere kan det til forbedring af vandige sammensætningers opbevaringslevetid eller stabilitet også være ønskeligt at inkludere yderligere midler, såsom glycerol. På denne måde gøres t-PA-variant-sammensætninger passende til parenteral indgivning, og især intravenøs indgivning.

30 Doseringer og ønskede lægemiddelkoncentrationer af farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen kan variere afhængigt af den bestemte forudsete l_ _ ____ DK 175958 B1 34 brug. F.eks. vil der ved behandling af dybvenethrombose eller perifer vasku-lær sygdom typisk blive foretrukket "bolus"-doser af størrelsesordenen fra ca.

0,05 til ca. 0,2 mg/kg med efterfølgende indgivninger af størrelsesordenen fra ca. 0,1 til ca. 0,2 mg/kg, der indgives for at holde et passende konstant blod-5 niveau, fortrinsvis af størrelsesordenen ca. 3 pg/ml.

Imidlertid vil det til anvendelse i forbindelse med nødforanstaltninger, hvor infusionsmulighed almindeligvis ikke er til rådighed og på grund af den alment kritiske natur af den bagved liggende sygdom (f.eks. embolisme, in-10 farkt) almindeligvis være ønskeligt at tilvejebringe noget højere begyndelsesdoser, såsom en intravenøs bolus af størrelsesordenen ca. 0,3 mg/kg.

F.eks. indgives den omhandlede t-PA-variant passende parenteralt til individer, som lider af cardiovaskulære sygdomme eller tilstande. Dosering og do- i !

15 sishyppighed kan være parallelt med eller højere end den, som for tiden er i. brug ved kliniske undersøgelser af andre cardiovaskulære thrombolytiske midler, f.eks. omkring 1-2 mg/kg legemsvægt som en intravenøs eller intraar- I

teriel dosis i løbet af 1,5-12 timer hos menneskepatienter, som lider af myocardial infarkt, liingeembolisme osv. Højere doser kan tolereres, fordi de om-20 handlede varianter har lavere bivirkninger end vild-type-t-Ρλ, hvilket fører til j hurtigere og mere fuldstændig koagellyse.

Som et eksempel på en passende doseringsform rekonstitueres en ampul indeholdende 50 mg t-PA, arginin, phosphorsyre og polysorbat 80 med 50 ml 25 sterilt vand til injektion og blandes med et passende volumen 0,9 % natrium- chloridinjektionsopløsning. j

De omhandlede t-PA-varianter er også nyttige til at forhindre fibrinaflejring eller adhæsionsdannelse eller -gendannelse. En udførelsesform af denne 30 anvendelse er beskrevet i den internationale patentansøgning WO 89/00049, offentliggjort den 12. januar 1989. Almindeligvis involverer en sådan behand- _____________________________-j DK 175958 B1 35 ling topisk indgivning af et præparat til et sted for potentiel fibrin- eller adhæsionsdannelse, hvorved præparatet omfatter en terapeutisk effektiv mængde af t-PA-varianten i en tungt opløselig form, som kontinuert frigives på det sted. i et tidsrum fra omkring 3 dage til omkring 2 uger. Typisk indgives t-PA- · 5 varianten i en tilstrækkelig dosering til at forhindre fibrinaflejring eller dannelse af adhæsioner efter kirurgi, infektion, traume eller inflammation. Typisk er denne mængde fra 0,02 mg/g gel til 25 mg/g gel med foretrukne mængder fra 0,20 mg/g til ca. 2,5 mg/g gel, mest foretrukket fra 0,25 mg/g gel til ca. 1,0 j mg/g gel.

10

Det medium, hvori. t-PA-varianten typisk sammensættes til forhindring af adhæsionsdannelse, er en halvfast, slimagtig, farmaceutisk inert bærer til anbringelse af enzymet på stedet for potentiel adhæsionsdannelse. En sådan bærer inkluderer langkædede carbonhydrider eller vegetabilske olier og vok-15 sarter sammensat af blandinger af mættede og umættede fedtsyreglycerider eller blandinger af modificerede mættede og umættede fedtsyreglycerider.

Eksempler inkluderer halvfaste medier, såsom mineralsk vaseline eller halvsyntetiske glycerider, polyhydroxy-opløsningsmidler, såsom glycerol, langkædede carbonhydrider, bionedbrydelige polymere eller liposomer.

20

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen, men opfindelsen skal ikke anses for begrænset dertil.

EKSEMPEL 1 25 A. Fremstilling oa anvendelse af ekspressionsvektor til rekombinant produktion af de omhandlede t-PA-varianter 1. Konstruktion af plasmid p7-1 H \ 30

al Plasmid pCISt-PA

L-- --------— DK 175958 B1 36

Plasmidet pCISt-PA blev fremstillet som følger. Sammenfattende blev vektoren pCIHt-PA indeholdende cytomeganovirus-forhøjeren og -promotoren, cytomeganovirus-splejsedonorstedet og intranet, Ig-variabel-område-splejse-acceptorstedet, cDNA'en, som koder for t-PA (Pennica et al., Nature, 5 301:214 (1983)) og hepatitis-overfladeantigén-polyadenylerings- og trans skriptionsafslutnings-stedet konstrueret først:

Vektoren pF8CIS indeholdende cytomegalovirus-forstærkeren (Boshart et al.,

Cell, 41: 520 (1985)) og promotoren (Thomsen et al., Prac. Natl. Acad. Sci.

10 (U.S.A.) 81: 659 (1984)), cytomegalovirus-splejsedonorstedet og en portion af en intran (Sternberg et al., J: of Virol., 49: (1984)), Ig-variabelt-område-intronen og -splejseacceptorstedet, cDNA'en, som koder for faktor VIII, og SV40-polyadenyleringsstedet blev konstrueret. De tre dele af konstruktionen er beskrevet i detaljer nedenfor.

Ί5 1. Ampicillinrestens-markøren og replikationsoriginet til den endelige vektor blev afledt fra udgangsplasmidet pUC13pML, en variant af plasmidet pML (Lusky et al., Nature, 293: 79 (1981)). pUC13pML blev konstrueret ved overførsel af polylinkeren fra pUC13 (Veira et al., Gene, 19; 259 (1982)) til EcoRI-20 og Hindlll-stedeme i pML. Et andet udgangsplasmid pUC8CMV var kilden til CMV-forstærkeren, -promotoren og splejsedonorsekvensen. pUC8CMV blev konstrueret ved indsætning af nucléotideme1-732 for CMV-forstærkeren, -promotoren og splejsedonorsekvensen i de afstumpede Pstl- og Sphl-steder i pUC8- Veira et al., ovenfor. Syntetiske BamHI-Hindlll-linkere (kommercielt 25 tilgængelige fra New England Biolabs) blev ligeret til den cohæsive BamHI-ende til skabelse af et Hindlll-sted. Efter denne ligering blev der gennemført en Hindlll-HincIl-nedbrydning. Denne nedbrydning gav et fragment på omkring 800 bp, der indeholdt CMV-forstærkeren, -promotoren og -splejsedonorstedet. Efter gelisolering blev dette 800 bp fragment ligeret til et 30 2900 bp stykke af pUC13pML. Det fragment, der blev krævet til konstruktio nen af pF8CIS, blev opnået ved nedbrydning af det ovennævnte mellempro- ______________________j DK 175958 B1 37 duktplasmid med Sall og Hindlll. Dette stykke på 3123 bp indeholdt .resistensmarkøren for ampicillin, replikationsoriginet fra pUC13pML og styrese-kvenseme for CMV, inklusive forstærkeren, promotoren og splejse do norstedet.

5 2. Ig-variabelt-område-intronen og splejse acceptorsekvensen blev konstrueret under anvendelse af en syntetisk oligomer.. Der blev kemisk syntetiseret en 99-mer og en 30-mer med den følgende sekvens for IgG-intronen og splejse acceptorstedet. (Bothwell et al., Cell. 24: 625 (1981)): 10 1 5'-AGTAGCAAGCTTGACGT GGCAGGCTTGA...

31 GATCTGGCCATATACTT GAGTGACAATGA...

60 CAT CCACTTT GCCTTT CT CT CCACAGGT...

88 GT CCACT CCCAG-3' 15 1 3'-CAGGTGAGGGTGCAGCTTGACGTCGCTGGA-5' DNA-polymerase I (Klenow fragment) udfyldte det syntetiske stykke og skabte et dobbeltstrenget fragment (Wartell et al., Gene, 9: 307 (1980)). Dette blev efterfulgt af en dobbelt nedbrydning med Pstl og Hindlll. Denne synteti-20 ske linker blev klonet ind i pUC13 (Veira et al., ovenfor) i Pstl- og Hindlll-stedeme. Klonen indeholdende det syntetiske oligonucleotid, mærket pU-Clg.10, blev nedbrudt med Pstl. Et Clal-sted blev føjet til dette fragment ved anvendelse af en Pstl-Clal-linker. Efter nedbrydning med Hindlll blev et stykke på 118 bp indeholdende en del af Ig-intronen og Ig-variabelt-område-25 splejseacceptoren gelisoleret.

3. Den tredie. del af konstruktionsskemaet erstattede 3’enden af hepatitisoverfladeantigenet med polyadenyleringsstedet og transskriptionsafslutningsstedet fra det tidligere område af SV40. En vektor, pUC.SV40, indehol- 30 dende SV40 sekvenserne blev indsat i pUC8 ved BamHI-stedet beskrevet i Veira et al., ovenfor. pUC.SV40 blev derpå nedbrudt med EcoRI og Hpal. Et

• I

i ------- ! 38 DK 175958 B1 fragment på 143 bp, der kun indeholdt SV40-polyadenyleringsstedet, blev gelisoleret fra denne nedbrydning. To yderligere fragmenter blev gelisoleret efter nedbrydning af pSVE.8d D (EP offentliggørelsesskrift nr. 160 457). 4,8 kb fragmentet frembragt ved EcoRI- og Clal-nedbrydning indeholdet SV40-5 DHFR-transskriptionsenheden, replikationsoriginet fra pML og ampicillinre-sistens-markøren. 7,5 kb fragmentet fremstillet efter nedbrydning med Clal og Hpal indeholder cDNA'en for faktor VIII. En tre-parts-ligering giver pSVE.8c24D. Dette mellemproduktplasmid blev nedbrudt med Clal og Sall til dannelse af et 9611 bp fragment indeholdende cDNA'en for faktor VIII.med 10 SV40-polyadenylerings-og transskriptionsafslutnings-stedeme efterfulgt af SV40-DHFR-transskriptionsenheden.

Den endelige tre-parts-ligering til opnåelse af pF8CIS anvendte: a) 3123 bp Sall-Hindlll-fragmentet indeholdende replikationsoriginet, ampicillinrestens-15 markøren og CMV-forstærkeren, -promotoren og -splejsedonoren; b) 118 bp Hindlll-Clal-fragmentet indeholdende lg-intronen og -splejséacceptoren; og c) et 9611 bp Clal-Sall-fragment indeholdende cDNA'en for faktor VIII, SV40-polyadenyleringsstedet og SV40-DHFR-transskriptionsenheden.

20 Dernæst gik man i gang med fuldførelsen af konstruktionen af plasmidet pCIHt-PA ud fra mellemproduktplasmidet pClat-PA og plasmidet pF8CIS (ovenfor): t-PA-cDNA'en blev først klonet ind i pML til dannelse af et Clal-sted ved ge- i 25 nets 5'ende. For at gøre dette blev et 3238 bp Hind I Il-fragment fra pSVpa-DHFR (også betegnet som pETPFR, ovenfor) indsat i Hindlll-stedet af pML (Lusky et al., ovenfor). Kolonier blev screenet for kloner, dér har cDNA’ens 5'ende op til Clal-stedet. Mellemproduktplasmidet blev kaldt pCalt-PA. En t-PA-cDNA efterfulgt af 3'polyadenyleringsområdeme blev isoleret som et Clal-30 Kpnl-fragment på 2870 bp. Dette fragment blev ligeret til 5146 bp fragmentet af pF8CIS. Dette Clal-Kpn-fragment af CIS-vektoren gav 5'styreområdet, en i ------------i DK 175958 B1 39 SV40-DHFR-transskriptionsenhed, ampicillinresistensgenet og originområdet fra pML. Se fig. 2.

Ekspressionsniveauer af t-PA blev opnået ved transfektion af CHO- eller 5 293-celler med pCIHt-PA i overensstemmelse med fremgangsmåder, som er alment kendte i sig selv og beskrevet ovenfor. Medier fra f.eks. de transfice-rede 293-celler blev prøvet, hvilket viste at pCIHt-PA producerede 420 ng/ml t-PA.

10 Vektoren pCISt-PA indeholdende cytomegalovirus-forstærkeren og -promotoren, cytomegalovirus-splejsedonorstedet og intronen, lg-variabelt-område-splejseacceptorstedet, cDNA'en, som koder for t-PA, og SV40-polyadenyleringssekvensen blev endeligt konstrueret som følger 15 Udgangsvektorerne for denne konstruktionn var pCIHt-PA og pF8CIS (ovenfor). Den sidstnævnte vektor har de samme 5'-styresekvenser som pCIHt-PA, men inkluderer cDNA'en for faktor VIII og SV40 polyadenyleringsstedet.

Sadl blev anvendt til at spalte 3' for t-PA-cDNA'en. Det resulterende 3'-overhæng blev afstumpet med T4-polymerase. pCIHt-PA blev derpå skåret 20 med Clal..Dette sted adskiller den kimæriske intron, idet det spalter mellem CMV-intron-sekvenseme og lg-variabelt-område-intronen. Et 2870 bp fragment blev gelisoleret fra Clal-behandlingen. SV40-poly-adenylerings stedet, DHFR-transskriptionsenheden, det bakterielle replikationsorigin og ampicillinresistensgenet såvel som CMV-forstærkeren og -promotoren og -splej-25 sedonoren blev isoleret fra pF8CIS. Disse elementer blev isoleret i fragmenter som et 2525 bp Sal-BamHI-fragment og et 3113 bp Hpal-Sal-fragment.

En tre-parts-ligering af Kpnl (stump)-Clal-fragmentét med Hpal-Sal-fragmentet og Sal-BamHI-fragmentet giver pCISt-PA, som blev udtrykt i både CHO-og 293-celler som omtalt ovenfor for plasmid pCIHt-PA og gav hen-30 holdsvis 55 og 3000 ng/ml t-PA. Se fig. 3. 1 « DK 175958 B1 40

b) Endelig konstruktion af p7-1 H

Plasmidet pCISt-PA blev nedbrudt med Spel og derpåbehandlet med E. coli DNA-polymerase i, stort fragment (Klenow), og deoxyribonucleo-tidtriphosphater til skabelse af stumpe ender. Det resulterende lineære frag- ‘ 5 ment blev under anvendelse af T4-DNA-ligase ligeret til 0,45 kb Rsal/Ahalll-fragmentet indeholdende tstreng-originet fra den enkeltstrengede DNA-fag f 1, som beskrevet i Zinder et al., Microbiol. Rev., 49: 101 (1985). Lige-ringsprodukter blev isoleret med f1-originet indsat i begge mulige orienteringer ved Spel-stedet i pCISt-PA-fragmentet. Et plasmid indeholdende dette 10 origin i en sådan orientering, at anti-sens-strengen af t-PA-genet blev pakket ind i virioner i nærvær af hjælperfag, blev valgt og betegnet p7-1 H. Se fig. 4.

2. Mutaoenese af ekspressionsplasmid 15 a) Skabelonfremstilling

Plasmidet p7-1H blev indført i E. coli stamme JM101 (ATCC nr. 33876) via CaVI2-formidlet transformation. Disse celler blev derpå inficeret méd hjælperviruset M13K07, og enkeltstrenget p7-1 H-DNA blev fremstillet som beskrevet af Veira et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987). Kort fortalt blev dér til 0,3 ml af 20 en mættet kultur af transformerede celler i 2YT-væske sat 109-101° pfu M13K07, og blandingen blev inkuberet i 15 min ved 37°C. 1,5 ml frisk 2YT-væske indeholdende 50 pg/ml carbenicillin blev tilsat, og kulturen blev forsigtigt rystet i 16 timer ved 37°C. Efter at cellerne var pelleteret, blev fager og pakket plasmid-DNA høstet, og enkeltstrenget DNA blev fremstillet som be-25 skrevet af Anderson, Nucl. Acids. Res., 9: 3015 (1981).

b) Stedsdirigeret in vitro mutagenese

Mutagenese på p7-1 H blev udført under anvendelse af oligodeoxyribonucleo-tidet, 5-CGGAGAGCGGCACCTGTGCGGGG-3', i det væsentlige som be-30 skrevet af Zoller et al., Meth. Enzymol., 100: 468 (1983), undtagen at mutanten, med mutationen phe305 —> his305, blev identificeret ved kolo-

________ ........... -J

DK 175958 B1 41 nihybridisering frem for ved plaquehybridisering. Mutationer blev bekræftet ved DNA-sekvensbestemmelse direkte på den enkeltstrengede plasmid-DNA under anvendelse af dideoxynucleotid-kædeafslutnings metoden (Sanger et al., Natl Acad Sci (U.S.A.) 74: 5463 (1977)).

5 3. Ekspression oa rensning a) Plasmid præparation

Transformerede celler blev dyrket til mætning i 500 ml LB-væske indehol-10 dende 50 pg/ml carbenicillin. Cellerne blev pelleteret ved centrifugering og resuspenderet i 40 ml 50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCI (pH 8,0). Til denne suspension sattes 60 ml 1 % natriumdodecylsulfat, 0,07 M NaOH, og blandingen blev 2 min ved 25°C og derpå i 10 min ved 0°C. Til dette blev sat 52 ml 4 M eddikesyre, 3 M natriumacetat, og blandingen blev 15 inkuberet i 30 min ved 0°C. Den blev derpå centrifugeret ved 11.500. omdr./min i 20 min, supematanten blev blandet med 2 volumener 100 % koldt ethanol, og det resulterende bundfald blev høstet ved centrifugering.

Pellen, indeholdende plasmid-DNA og -RNS, blev tørret og genopløst i 100 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 pg/ml RNase A. Efter at den resulterende 20 opløsning .var klaret ved centrifugering, blev den indstillet til 0,5 mg/ml ethi- diumbromid, og. der blev tilsat én lige så stor vægtmængde CsCI. DNA'en blev derpå centrifugeret i en Beckman VTI65 rotor i 16 timer ved 55.000 omdr./min ved 18°C. DNA-båndet blev høstet ved sidepunktur, ekstraheret med n-butanol for at fjerne ethidiumbromidet, fortyndet med vand og fældet 25 med ethanol. DNA blev genopløst i 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA til en slutkoncentration på 1 mg/ml.

b) Transfektion og ekspression 293-celler blev dyrket til sammenflydning. 10 pg t-PA-plasmid-DNA-mutant 30 blev blandet med 1 pg DNA, som koder for VA RNA-genet (Thimmappaya et al., Cell, 31; 543 (1982)) og opløst i 500 pi 1 mM Tris-HCI, 0,1 mM EDTA, DK 175958 B1 42 0,227 M CaCI2. Dertil blev sat (dråbevis under omhvirvling) 500 μΙ 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCI, 1,5 mM NaP04, og bundfaldet fik lov at dannes i 10 min ved 25°C. Det suspenderede bundfald blev derpå sat til cellerne (i 100 mM plade) og fik lov at sætte sig i 4 timer i inkubatoren. Mediet · 5 blev derpå suget fra, og 2 ml 20 % glycerol i saltopløsning med phosphat buffer (PBS) blev tilsat i 30 s. Celler blev vasket to gange med 5 ml serumfrit ! medium, derpå tilsattes frisk medium, og cellerne blev inkuberet i 5 dage.

Til dannelse af stabile CHO cellelinier, der udtrykker t-PA-varianten kan 1,4 10 kb Bglll/Apal-fragmentet indeholdende hovedmassen af t-PA-kodesekvenserne (Bglll-stedet spænder over kodoneme -1 til 1 af fuld-længde-t-PA-kodende DNA, og Apal-stedet spænder over kodonerne 465-466 i fuld-længde-t-PA-kodende DNA) ligeres til 6,0 kb Bglll/Apal-fragmentet fra vektoren pPaDHFR-6 (beskrevet i EP offentliggørelsesskrift nr. 93619).

15 Det resulterende plasmid indføres derpå i CHO celler og induceres til at overudtrykke t-PA-varianteme ved forstærkning af kodesekvensen ved hjælp af selektion i methotrexatholdige medier.

c) Rensning 20 Rensning af t-PA-produktet blev gennemført ved at sende til konditionerede medium over en søjle (1 ml lagvolumen) med glaskugler af kontrolleret størrelse, hvortil der var blevet koblet et polyklonalt anti-t-PA-gede-A6-antistof (fremstillet ifølge i sig selv kendte standardmetoder). Før mediet blev søjlen ækvilibreret med PBS, og efter påsætningen blev søjlen ækvilibreret med 0,1 25 M Tris-HCI (pH 7,5), 1 M NaCI. t-PA’en blev elueret med 0,1 M eddikesyre, 0,15 M NaCI, 0,02 M arginin, 0,01 % 'Tween 80" (pH 2,0), og fraktionerne blev øjeblikkeligt neutraliseret med Tris-base. Fraktionerne blev indstillet til 0,01 % Tween 80", før de blev hældt sammen. tPA’en blev på en reducerende SDS-gel fundet at være overvejende (80%) enkelt-kæde.

30 DK 175958 B1 43 B. Biologiske prøvninger 1. t-PA-kvantiteringer

Proteinkoncentrationer blev rutinemæssigt bestemt ved en ELISA standardi-5 seret til nativ-sekvens-t-PA (se EP offentliggørelsesskrift nr. 93619, ovenfor). Proteinrenhed og homogenitet blev. analyseret ved polyaacrylamidgel-elektroforese i nærvær af natriumdodecylsulfat (PAGE-SDS) med puffersystemet ifølge Laemmli, Nature, 227: 680 (1970). Typisk anvendtes 7-17 % gradient geler, og proteiner blev visualiseret med sølvfårvningsteknikken iføl-10 ge Morrissey, Anal. Biochem., 117: 307 (1981). t-PA-varianten fremstillet som beskrevet ovenfor blev fundet at være ren og homogen ved denne metode.

2. S-2251 prøvning 15 Resultater for koagellyse og S-2251 prøvninger viser gennemsnit af flere uafhængige iagttagelser (koagellyse, to bestemmelser; S-2251, tre bestemmelser).

t-PA's evne til at aktivere plasminogen kan måles ved en in vitro prøvning 20 ved præinkubering af t-PA og plasminogen og efterfølgende tilsætning af det plasminspecifikke substrat H-D-valyl-H-leucyl-H-lysin-paranitroanilid (S-2251). Maksimum hastigheden af denne reaktion iagttages i nærvær af fi-brin(ogen) eller fragmenter af fibrin(ogen), der virker som stimulatorer for reaktionen. i 25 |

Det plasminspecifikke substrat S-2251 blev anvendt ved én to-trins prøvning til at måle prøvens evne til at aktivere plasminogen. Fibrinogen kunne anvendes som stimulator ved inkubation af prøven med 0,02 ml af en 20 mg/ml fibrinogenopløsning i et totalvolumen på 0,12 ml af 0,05 M Tris-HCI, 0,12 M 30 NaCI, 0,01 % Tween 80", pH 7,4. j i DK 175958 B1 44

Derpå tilsattes Glu-plasminogen-opløsning (kommercielt tilgængelig), 0,03 ml af en 2,0 mg/ml opløsning i 0,05 M Tris, 0,12 M NaCI-puffer, pH 8. Efter 10 ! min ved 37°C tilsattes 0,35 ml 0,86 mM S-2251 i 0,037 M Tris, 0,086 M NåCI, 0,007% "Tween 80", pH 7,4. Denne blanding blev inkuberet i 5 min; derpå 5 blev reaktionen stoppet ved tilsætning af 0,1 ml 50% iseddike. Absorbansen ved 405 nm blev målt. Aktiviteten blev udtrykt som ændringen i absorbans pr. nanogran pr. min i nærvær af substrat.

Resultaterne er, at F305H-varianten med fibrinogen har 78% af vild-typens 10 specifikke aktivitet, hvilket kan skyldes forsinkelsen før A405 forøges.

3. Koagellyse

Vild-type- og F305H-t-PA blev prøvet for deres evne til at lysere fibrin i nærvær af mættende koncentrationer af plasminogen, ifølge den fremgangsmå-15 de, der er beskrevet af Carlsen et al., Anal. Biochem., 168: 428-435 (1988).

In vitro koagellyse-prøvningen måler aktiviteten af t-PA’er ved turbidimetri under anvendelse af en mikrocentrifugalanalysator. En blanding af thrombin og t-PA-prøver centrifugeres i en blanding af fibrinogen og plasminogen for at starte koageldahnelse og efterfølgende koagelopløsning. Den resulterende 20 profil af absorbans overfor tid analyseres for at bestemme prøvningens endepunkt. t-PA-variantemes aktiviteter blev sammenlignet med en standardkurve for rt-PA (EP offentliggørelsesskrift nr. 93619, ovenfor). Den anvendte buffer under hele prøvningen var 0,06 M natriumphosphat, pH 7,4, indeholdende 0,01 vol% "Tween 80" og 0,01 vægt/vol % natriumazid. Humant 25 thrombin var i en koncentration på 33 enheder/ml. Fibrinogen (ved 2,0 mg/ml koagulerbart protein) blev afkølet på våd is for at udfælde fibronectin og derpå tyngdefiltreret. Glu-plasminogen var i en koncentration på 1 mg/ml. Analysatorkamrets temperatur indstilles til 37°C. Påfylderen indstilles til at afgive 20 μΙ rt-PA (ca. 62,5 ng/ml til 1,0 pg/ml) som prøven for standardkurven eller 30 20 μΙ variant-rt-PA i en koncentration, som forårsager lyse inden for stan dardkurvens område. 20 μΙ thrombin blev anvendt som det sekundære rea-

:.............J

DK 175958 B1 45 gens, og 200 μΙ af én fibrinogen/plasminogen-blanding i volumenforholdet 50:1 som det primære reagens. Absorbans/tids-programmet blev anvendt med en 5 min inkubationstid, 340 nm filter og 90-i nterva l-afiæsn i nger.

5 Resultaterne angiver, at F305H-varianten under anvendelse af denne prøvning har omkring 46 % af normal vild-type-t-PA’s koagellyseaktivitet.

4. Fibriribinding

Prøvningsmetoden for fibrinbinding er en modifikation af deri frerrigangsmå-10 de, som er beskrevet af Rijken et al., J. Biol. Chem., 257: 2920 (1982). t-PA-prøven, som skal afprøves, sættes til en opløsning indeholdende 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,12 M NaCI, 0,01 % "Tween 80", 1 mg/ml humant serumalbumin og forskellige koncentrationer af plasminogenfrit fibrin (0, 0,05, 0,1, 0,25 og 0,5 mg/ml). Det endelige volumen af reaktionsblandingen var 1 ml, og t-PA-15 koncentrationen var 10 ng/ml for hver prøve. Prøverne blev inkuberet ved 37°C i 5 min efterfulgt af tilsætning af 1 enh. thrombin. Prøverne blev derpå inkuberet i 1 time ved 37°C. Koagelet blev fjernet ved centrifugering, og mængden af t-PA, som forblev ubundet i supematanten, blev bestemt ved ELISA.

20

Resultaterne (fig. 5) viser, at overvejende enkelt-kæde-F305H-t-PA (udfyldte trekanter) binder til fibrin under de anvendte prøvningsbetingelser næsten lige så godt som en-kæde-vild-type-t-PA (udfyldte kvadrater) og blandingen af en-kæde- og to-kæde-vild-type-t-PA (åbne trekanter). Ligeledes binder to-25 kæde-F305H-t-PA (udfyldte cirkler) fibrin mindst lige så godt som to-kæde-vild-type-t-PA udfyldte rhomber).

5. Zymogenisk kinetik ved S-2251 30 a) Fremstilling af fibrinogen

Humant fibrinogen (Calbiochem) blev gjort plasminogenfrit ved påføring på I_ ___ DK 175958 B1 46 en lysin-"Sepharose"-søjle og opsamling af gennemløbet. Den resulterende fibrinogenpool blev nedbrudt ved behandling med plasmin-"Sepharose" ved stuetemperatur natten over. Den resulterende koagulerbarhed var 7 %. Koncentrationen blev derpå indstillet til 1,51 mg/ml.

5 b) Procedure

Kinetikken for omdannelsen af plasminogen til plasmin med vild-type-t-PA'en og F305H-t-PA'en blev bestemt under anvendelse af det chromogene plasminsubstrat S-2251 i nærvær af fibrinogen. Vild-type- og F305H-t-PA-10 molekylerne blev anvendt både i den overvejende en-kæde-form (opnået ved rensning som tidligere beskrevet) og i den overklippede to-kæde-form (opnået ved inkubation af den overvejende en-kæde-form med plasmin-"Sepharose" i 1 time ved 37e.C).

15 I nærvær af 1,2 μΜ plasmin-nedbrudte fibrinogenfragmenter fremstillet som beskrevet ovenfor blev reaktionerne udført ved plasminogenkoncentrationer fra 0,08 til 0,89 μΜ og t-PA-koncentrationer fra 2,3 til 9,0 nM i 0,12 M NaCI, 0,05 M Tris, 0,01 % ’Tween 80", pH 7,4: Plasminogenet, fibrinogenet og pufferen blev præinkuberet i 3 timer ved stuetemperatur. S-2251 blev tilsat til en 20 slutkoncentration på 0,9 nM, og prøvéme blev opvarmet til 37°C i omkring 5 min. Ved tiden Q tilsattes t-PA-prøverne, og absorbansen af hver prøve blev aflæst i intervaller på 30 sek i 10 min ved 37°C. .

Resultaterne er vist i fig. 6 og 7 (for henholdsvis en-kæde- og to-kæde-vild-25 type-t-PA) og i fig. 8 og 9 (for henholdsvis en-kæde- og to-kæde-F305H-t-PA). I figurerne er ordinaten absorbansen ved 405 nm, og abscissen er kvadratet på antallet af minutter, hvori absorbanserne blev taget. De udfyldte cirkler repræsenterer 0,09 μΜ plasminogen (og 15,7 nM to-kæde-vild*type-t-PA, 10,8 nM to-kæde-F305H-t-PA, 16,1 nM en-kæde-vild-type-t-PA og 17,2 30 nM en-kæde-F305H-t-PA), de udfyldte trekanter repræsenterer 0,11 μΜ plasminogen (og 11,8 nM to-kæde-vild-type-t-PA, 8,1 nM to-kæde-F305H-t- ................._j DK 175958 B1 47 PA, 12,1 nM en-kæde-vild-type-t-PA og 12,9 nM en-kæde-F305H-t-PA), de udfyldte kvadrater repræsenterer 0,16 μΜ plasminogen (og 9,8 nM to-kæde-vild-type-t-PA, 6,7 nM to-kæde-F305H-t-PA, 10,1 nM en-kæde-vild-type-t-PA og 10,8 nM en-kæde-F305H-t-PA), de åbne cirkler repræsenterer 0,22 pM 5 plasminogen (og 7,9 nM to-kæde-vild-type-t-PA, 5,4 nM to-kæde-F305H-t-PA, 8,1 nM en-kæde-vild-type-t-PA og 8,6 nM en-kæde-F305H-t-PA), de åbne trekanter repræsenterer 0,44 pM plasminogen (og 3,9 nM to-kæde-vild-type-t-PA, 2,7 nM to-kæde-vild-F305H-t-PA, 4,0 nM en-kæde-vild-type-t-PA og 4,3 nM en-kæde-F305H-t-PA), og de åbne kvadrater repræsenterer 0,9 10 pM plasminogen (og 3,9 nM to-kæde-vild-type-t-PA, 2,7 nM to-kæde-F305H-t-PA, 4,0 nM en-kæde-vild-type-t-PA og 4,3 nM en-kæde-F305H-t-PA).

Kurverne viser, at kun med den overvejende en-kæde-F305H-t-PA-variant udviser absorbansen en udtalt forsinkelse tidligt i reaktionerne og en stigning 15 i aktivitet derefter. To-kæde-F305H-t-PA-varianten udviser ikke denne forsinkelse, men forekommer snarere at have kinetiske egenskabér magen til enelier to-kæde-vild-type-t-PA. Denne opførsel demonstrerer F305H-variantens zymogeniske natur, som ikke iagttages med vild-type-t-PA.

20 EKSEMPEL II

En strategi kendt som alanin-scannings-mutagenese (ALA-scan), beskrevet i Cunningham and Wells, ovenfor, blev anvendt til skabelse af de t-PA-varianter, som er bedømt i dette eksempel. Denne fremgangsmåde involve-25 rer identifikation af små overfladeområder af t-PA-proteasedomænet, som indeholder ladede aminosyresidekæder. Uden begrænsning til nogen bestemt teori antages det, at enten disse områder indeholdende ladningsklynger eller naboområder eller begge er ansvarlige for t-PA-molekylets samvirken med dets substrat og forskellige andre forbindelser, som kan modulere 30 dets aktivitet. De ladede aminosyrer i hvert område (dvs. Arg, Asp, His, Lys og Glu) blev erstattet (et område pr. mutantmolekyle) med alanin for at be- DK 175958 B1 48 dømme vigtigheden af det bestemte område for den samlede aktivitet af t-PA-molekylet. Resultaterne er anført nedenfor.

1. Konstruktion af pRK7-t-PA

5 Plasmidet pRK7 blev anvendt som vektor til frembringelsen af t-PA-mutanteme. pRK7 er identisk med pRK5 (EP offentliggørelsesskrift nr. 307 247 offentliggjort den 15. marts 1989), undtagen at rækkefølgen af endo-nucleaserestriktions stederne i polylinkerområdet mellem Clal og Hindlll er omvendt. t-PA-cDNA'en (Pennica et al:, Nature, 301: 214 (1983)) blev præ-10 pareret til indsætning i vektoren ved skæring med restriktionsendonuclease hindlll (som skærer 49 basepar 5’ for ATG-startkodonen) og restriktionsendonuclease Ball (som skærer 276 basepar nedenfor TGA-stopkodonen). Denne cDNA blev ligeret ind i pRK7, som i forvejen var skåret med Hindlll og Smal under anvendelse af standardligeringsmetodologi (Maniatis et al., Molecular 15 Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Denne konstruktion blev navngivet pRK7-t-PA.

2. Stedsdiriaeret mutaaenese af pRK7-t-PA

Stedsdirigeret mutagenese af t-PA-cDNA blev gennemført ved fremgangs-20 måden beskrevet af Taylor et al., Nucl. Acids. Res., 13: 8765 (1985) under anvendelse af et kit købt fra Amersham Corporation (catalog number RPN 1253). Til frembringelse af de ønskede mutanter blev oligonucleotider med sekvenser, som koder for de ønskede aminosyreudskiftninger, syntetiseret og anvendt som primere. Disse oligonucleotider blev sammensmeltet med 25 enkeltstrenget pRK7-t-PA, som var blevet præpareret ved standardprocedurer (Viera et al., Meth. Enz., 143: 3 (1987)).

En blanding af tre deoxiribonucleotidtriphosphater, nemlig deoxyriboadeno-sintriphosphat (dATP), deoxyriboguanosintriphosphat (dGTP) og deoxyri-30 bothymidintriphosphat (dTTP), blev kombineret med en modificeret thiodeo-xyribocytosin kaldet dCTP(_S), leveret med kittet af producenten, og sat til

--------------J

• 49 DK 175958 B1 det enkeltstrengedé pRK7-t-PA, hvormed oligonucleotidet blev sammensmel-tet:

Efter tilsætning af DNA-polymerase til denne blanding blev der skabt en 5 streng af DNA, som var identisk med pRK7-t-PA, undtagen hvad angår de muterede baser. Desuden indeholdt denne nye streng af DNA dCTP(aS) i stedet for dCTP, hvilket tjente til at beskytte den mod en vis. restriktionsendb-nuclease. nedbrydning! Efter at skabelonstrengen af den dobbeltstrengede heteroduplex var nick-behandlet med et passende restriktionsenzym, blev 10 skabelonstrengen nedbrudt med Exolll-nuclease forbi det område, som indeholdt den mutagené oligomer. Reaktionen blev derpå stoppet for at efterlade et molekyle, som kun var delvis enkeltstrenget. Et komplet dobbeltstrenget. DNA-homoduplexmolekyle blev derpå dannet med DNA-polymerase i nærvær af alle fire deoxyribonucleotidtriphosphater, ATP og DNA-ligase.

15

De følgende oligonucieotider blev fremstillet til anvendelse som primere til frembringelse af pRK7-t-PA-molekyler under anvendelse af den ovenfor beskrevne ALA-scan-metodologi: 5'-GGCTGTACTGGGCCAGGCCGGA-3’(R267A) 20 5-GGCAGCCTGCCAGGGGGCGGAGGCGATGGCGGCGAAGAG-3’(D283A,H287A) .

5-CCGCTCTCCGGGCGACGCCGCGGCCGCGGCAAAGAT- 3’(K296A,H297A,R298A,R299A) 5’-GCCCCCGCACAGGAACGCCGCTCCGGGCGA-3’(E303A,R304A) 25 · 5’-CTCCTGGAAGCAGGCGGCGGCAGA-3’(H322A) 5’-GTGGTGGGGCGGAAACGCCGCCTGGAACGA-3’(E326A1R327A) 5’-CAAGATCACCGTCAGGGCGGCGGGCGGAAA-3'(H331A,H332A) 5,-CTCGCCAGGGACCACCGCGTATGTTGCGCCCAAGAT-3’(R339A1R342A) δ'-ΤΤΤΤΤCGACTTCAAATGCCTG CGCCGCCGCGCCAGGGAC-30 3’(E347A, E348A, E349A, K351A) 5’-CTTATGGACAATGTATGCTGCGACTGCAAATTTCtG-3’(E353A;E355A, K356A) 5’-AGT GT CAT CATCG AATGCCGCAGCG ACAAT GTA-3’( H360A, K361 A, E362A) i____-_________________ ____— .......

DK 175958 B1 50 5’-GT CATT GT CGTAAGT G GCAGCAGCGAATTCCTT-3’(D364A,D365A;D366A) 5’-CT GCAGCAGCGCAATGGCATTGG CGTAAGTGTC-3’(D369A,D371A) 5-CT CCT GGGCACAGGCGGACGAAGCCGATGCCAGCT GCAG-3’(K378A,D380A,R383A) 5 5’-AAGGCACACAGTGGCGACCACGCT GCT CGCCT GGGCACA-3’(E387A, R392A) 5-ACACT CCGTCCAGGCCGGCAGCT GCAGGGCCGCCGGGGG-3’(D400A, D405A) 5’-GGAGAGCTCACAGGCCGTCCAGTC-3’(E408A) 5’-GTAGCCGGAGAGGGCACACTCCGT-3’(E410A) 10 5’-AGGAGACAAGGCCGCAGCCGCGCCGTAGCC-3’(K416A.H417A.E418A) 5'-TCTGÅCATGAGCCGCCGCCAGCCCCGCGGA- ATAGAA- 3’(E426A, R427A, K429Å, E430A) 5-GGATGGGTACAGT cGGACAGCAGCCT CCTT-3’( H432A.R434A) 5’-TT GTGAT GTGCAGGCGCTGGATGG-3’(R440A) 15 5’-GT CGGTGACT GJTGCGTTAAGTAAAGCTT GTGATGT-3’(H445A, R449A) 5-ACACAG CAT GTTGG CGGT GACT GTT GCGTTAAGTAA-3’{R449A,D453A) 5‘-GGGCCCGCCGCTCGCAGTGGCTCCAGCACA-3’(D460A,R462A) 5’-GCCCTGGCAGGCGGCGGCCAAGTTTGC-3,(H47lA,D472A) 5’—GGGGCCTCCCGAAGCGCCCTGGCA-3’(D477A) 20 5VCACCAAAGT CAT GGCGCCAGCGTTCAGACA—3’(D407A, R489A) 5’-CACACCCGGGACAGCCGCCTGTCCACA-3’(K505A.D506A) 5’-GTAGTTGGTAACGGCTGTGTACAC-3’(K513A) 5-CGGTCGCAT GTTGGCAGCAAT CCAGGCTAGGT AGTT -3’(D519A,R522A,D523A) 25 5'-TCCTGGTCACGGTGCCATGTTGGCACGAATCCA-3’ (D523A.R526A) 3. Bakteriel transformation og DNA-praeparation

De mutant-t-PA-konstruktioner, som blev frembragt under anvendelse af den ovenstående forskrift, blev transformeret ind i E. coli værtsstamme.

30 MM294tonA under anvendelse af standard-CaCb-proceduren (Maniatis et al., ovenfor) til fremstilling og transformation af kompetente celler.

MM294tonA (som er resistent overfor T1-fag) blev fremstillet ved indsætning og efterfølgende upræcis udskæring af et Tn10-transposon i tonA-gehet. Det- ________________________j DK 175958 B1 51 te gen blev derpå under anvendelse af transposonindsætningsmutagenese (Kleckrier et al., J. Mol. Biol., 116: 125-159 (1977)), indsat i E. coli værts-. . stamme MM294 (ATCC nr. 31446).

5 DNA blev ekstraheret fra individuelle kolonier af bakterielle transformanter under anvendelse af standard-miniprep-proceduren beskrevet af Maniatis et al., ovenfor. Plasmideme blev yderligere renset ved passage over en "Sephacryl CL6B" spinsøjle og derpå analyseret ved sekvensbestemmelse og ved restriktionsendonuclease nedbrydning og agarosegel-elektroforese.

10

En af disse transformanter indeholdende plasmidet, som koder for. K296A,H297A,R298A,R299A mutanten og betegnes pTPA33-2, biev deponeret i the American Type Culture Collection den 18. juli 1989 som ATCC. nr.

68059.

15 4. Transfektion af humane embvroniske nvre-293-celler (lille målestok) 293-celler blev dyrket til 70 % sammenflydning i 6-hullers plader. 2,5 pg t-PA-plasmid-DNA-mutant blev opløst i 150 pi 1 mM Tris-HCI, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCI2. Dertil sattes (dråbévis under omhvirvling) 150 μΙ 50 mM HE-20 PES-puffer (ph 7,35), 280 Mm NaCI, 1,5 mM NaP04, og bundfaldet fik åt dannes i 10 minutter ved 25eC. Det suspenderede bundfald blev derpå sat til cellerne i de individuelle huller i en 6-hullers plade og fik lov at sætte sig i 4 timer i inkubatoren.. Mediet blev derpå suget af, og 1 ml 20 % glycerol i PBS blev tilsat i 30 S: Cellerne blev vasket to gange, først med 3 ml og derpå med 25 1 ml serumfrit medium. Derpå tilsattes 3 ml frisk medium, og cellerne blev inkuberet i 5 dage. Mediet blev derpå opsamlet og prøvet.

Når der blev krævet enkelt-kæde-t-PA, var proceduren som beskrevet ovenfor, undtagen at der anvendtes serum befriet for plasminogen under cellernes 30 vækstfase, I____________—- . . - --------1 DK 175958 B1 52 . 5. Transfektion af humane embryoniske nvre-293-celler fstor målestokV Til rensning i stor målestok af K296A,H297A,R298A,R299A varianten, der er . nyttig til produktion i væsentlige mængder, blev den anvendte transfek-tionsprocediire opnået fra Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et 5 al., eds. (Wiley Interscience, 1988) og modificeret lidt som følger En suspension af humane embryoniske nyre-293-celler blev dyrket i et cellekulturmedium og koncentreret ved pelleterihg. Pelleten blev resuspenderet til en koncentration på omkring 108 celler/ml, og cellerne blev vasket som nødvendigt i serumfrie medier. DNA-dextran-opløsningen blev tilsat i en koncéntration på 10 omkring 250 pg DNA pr. 500 ml celler, og denne blanding blev inkuberet under mild. omrøring ved 37°C i. op til 90 minutter. Der blev tilsat DMSO til en slutkoncentration på 10 %, og efter ca. 2 minutter tilsattes frisk medium for at fortynde cellerne til omkring 10® pr. ml. Cellerne blev derpå inkuberet i op til 7 dage, hvorefter supematanten blev opsamlet.

15

Rensning af denne mutant blev gennemført ved passage af supematanten over en søjle af. glaskugler, hvortil der var koblet polyklonalt anti-t-PA-gede-Å6-antistof. Søjlen var blevet prækonditioneret med PBS. Efter at supematanten var sat på, blev søjlen ækvilibreret med en Tris-salt-puffér [0,1 M Tris-20 HCI (pH 7,5) og 1M NaCI]. t-PA-varianten blev derpå elueret med 0,1 M eddikesyre, 0,15 M NaCI, 0,02 M arginin og 0,01 % "Tween 80". Fraktionerne blev øjeblikkeligt neutraliseret med Tris-base og indstillet til 0,01 % "Tween 80".

25 6. Bioloqiske prøvninger A. t-PA kvantitering.

Mængden af t-PA, som var til stede i cellekultursupernatantérne, blev bestemt ved ELISA-proceduren under anvendelse af polyklonale antistoffer 30 fremstillet over for vild-type-t-PA.

. . I

..............................J

DK 175958 B1 53 B. S-2288 prøvning S-2288 prøvningen blev anvendt til at måle mutanterne proteolytiske aktivitet i både en- og to-kæde-formeme. Denne prøvning er en direkte prøvning for t-PA-proteolytisk aktivitet; t-PA spalter bindingen mellem det lille peptid og pa-5 rånitroanilid-chromophoren.

Standardkurve-prøver blev fremstillet ved fortynding af. vild-type-rt-PA med cellekulturmedier. Stahdardkurve-prøveme og rt-PA-mutånt-prøveme blev sat til hullerne i en mikrotiterplade. Hvis prøvningen blev anvendt til at måle 10 aktiviteten af to-kæde-rt-PA blev der inkluderet et inkubationstrin med humant plasmin i proceduren. Humant plasmin (KabiVitoim) blev tilsat til en slutkoncentration på 0,13 caseinenheder/ml. Prøverne blév inkuberet i 90 ml ved stuetemperatur. Til afprøvning åf prøverne i enkelt-kæde-formen blev plasminopløsningen erstattet med PBS, og 90 minutters inkubationen blev 15 udeladt.

Protinin [Sigma, tilnærmelsesvis 14 trypsinhibitorenheder/mg] blev tilsat til én slutkoncentration på 72 pg/ml for at inhibere plasminaktiviteten, og prøverne blev inkuberet véd stuetemperatur i 15 minutter. En 2,16 mM opløsning af S-20 2288 blev. fortyndet til 1,45 nM med 6,1 M Tris, 0,106 mM NaCI, 0,02 % nå- triumazid, pH 8;4 og. 100 pi af denne opløsning blev sat til hvert hul i mikroti-terplåden (endeligt volumen i hvert hul var 200 μΙ). Farveudvikllngen blev kontrolleret ved 405 nm. Hældningen af absorbans/tids-kurven for hver standard og prøve blev bestemt. En standardkurve blev fremstillet ved afsætning 25 af hældningen af absorbans-/tids-kurven som funktion af rt-PA-koncentration for rt-PA-standardeme. Koncentrationen af mutanternes relative aktivitet blev derpå bestemt ud fra standard kurven. Aktivitetskoncentrationen af hver mutant blev delt med koncentrationen af mutanten opnået ved rt-PA-ELISA-prøvningen, og de resulterende specifikke aktiviteter blev udtrykt i forhold til 30 vild-type-t-PA, som blev tildelt en værdi på 1,0. 1 i i DK 175958 B1 54 . Dataene er gennemsnit af to prøvninger og præsenteres som aktivitet i forhold til vild-type-rt-PA i tabel I. Resultaterne viser, at for alle anførte mutanter er to-kæde-formen mere aktiv (mindst 1,5 gange op til næsten 60 gange) end en-kæde-formen i forhold til vild-type-rt-PA, hvilket viser, at hver af disse mu-5 tanter kan betragtes som zymogenisk ved denne prøvning. .

TABEL I

Zvmoaener ved S-2288 prøvningen ·

Aktivitet i forhold til vild-typenl-PA (hvor vild-__.__typen er 1,0;() angiver forsøgsusikkerhed)

MutatiQn IkSe I 93η9β forekel R267A 0,331 (0,03) 0,851(0,13) 2,6 D283A,H287A 0,08 (0,11) 0,6 (0,23) 7,5- R339A.R342A . 0,01 (0,01) 0,52 (0,01)_52_ ^ΘΑ^· 0.01 (0.01) 0.49(0.18) 49 E418A,H417A’ 0,01 (°>1) 0,59 (0,01) 59..

K429a!e43QA : °'01 (°·1) °'33 <°·04> _ H432A.R434A 0,08 (0,01 )| 0,71 (0,08) 8,9 C. S-2251 prøvning 10 Denne prøvning er en indirekte prøvning for t-PA-aktivitet. Ved denne prøvning omdannes plasminogen til plasmin ved virkningen af t-PA, og plasmin spalter S-2251-substratet og frigør paranitroanilid-chromophoren. Produktionen af denne chromophor måles derpå med tiden.

15 1. Fibrinstimuleret S-2251 prøvning

Standard kurve-prøverne blev fremstillet som beskrevet for S-2288 prøvningen. Prøverne bedømt i to-kæde-formen blev inkuberet med plasmin-"Sepharose". Plasmin-"Sepharose" blev fremstillet ved kobling af tilnærmelsesvis 20,8 caseinenheder af humant plasmin (KabiVitaim) til 1 ml cyanbro-

S

DK 175958 B1 55 . mid-aktiveret "Sepharose” (Pharmacia). Plasmin-"Sepharose"-koblingsproduktet (50 μΙ åf en 5 % opslæmning) blev inkuberet under rystning i 90 minutter ved stuetemperatur med . 150 μΙ prøve. Efter inkubationen blev harpiksen fjernet ved centrifugering, og 10 μΙ af prøven blev sat fil hul-5 lerne i en mikrotiterplade.

Til prøver, som blev afprøvet i en-kæde-formen, blev der sat 50 μΙ cellekulturmediér i stedet for harpiks, og inkubatioristrinnet blev udeladt. Humant thrombin (10 μΙ af en 42 enh./ml opløsning) blev sat til hvert hul. Reaktionen i 10 hvert hul blev startet ved tilsætning af en cocktail (130 μΙ) sammensat af .28 μΙ humant Glu-plasminogen (5,3 μΜ); 10 μΙ plaminogenfrit humant fibrinogen (10 μΜ); 30 μΙ 3 mM S-2251 (KabiVitrum); og 62 μΙ PBS. Farveudviklingén blev kontrolleret ved 405 nm, og absorbansen ved referéncebølgelængdén på 492 nm blev trukket fra hver tidsværdi. Hældningen af kurven over absor-15 bans mod kvadratet på tiden blev bestemt for hver standard- og mutantprøve. En standardkurve blev fremstillet ved afsætning af hældningen af kurven i over absorbans mod tid i anden potent som funktion af rt-PA-koncentrationen for rt-PA-standardeme. Bestemmelsen af den relative specifikke aktivitet af mutanterne var som beskrevet for S-2288 prøvningen.

20 2. Fibrinoaenstimuleret S-2251 prøvning

Denne prøvning blev gennemført som beskrevet for den fibrin-stimulerede S- I

2251 prøvning, undtagen at der anvendtes PSB i stedet for thrombinet. . j 25 3. Plasma koaael S-2251 prøvning

Fremstillingen af standarkurve-prøver og omdannelsen af en-kæde-rt-PA til to-kæde-rt-PA under anvendelse af plasmin-'Sepharose" vér som beskrevet for den fibrinstimulerede S-2251 prøvning. Humant thrombin (10 μΙ af en 31 pg/ml opløsning) blev sat til hvert hul i mikrotiterpladen. Standard- og mu-30 tantprøveme (40 μΙ) blev sat til pladen, og reaktionen blev startet véd tilsætning af 100 μΙ af en blanding af 90 μΙ surt citrat/dextrosé/humant plasma og DK 175958 B1 56 10 μΙ 9,1 mM S-2251 (KabiVitmm). Fan^dviklingen blev kontrolleret ved 405 nm, og absorbansen ved referencebølgelængden på 492 nm blev trukket fra hver tidsværdi. Analysen af dataene var som beskrevet for den fibrin-stimulerede S-2251 prøvning.

5 4. Plasma S-2251-prøvning

Denne prøvning blev gennemført som beskrevet for plasma koagel S-2251 prøvningen, undtagen at der anvendtes PBS i stedet for thrombinet.

10 Mutanter blev afprøvet for zymogeniske kvaliteter under anvendelse af de fibrin:afhængige og plasma-koagel-afhængige prøvninger, og resultaterne i forhold til vild-typen er vist i tabellerne henholdsvis II og III. Værdier for mutanter i enkelt-kæde-formen .er gennemsnit af to bestemmelser. Værdier for mutanter i to-kæde-formen er gennemsnit af fire bestemmelser.

15 TABEL II

_Zvmoaener véd den fibrinafhænaiae S-2251 prøvning___

Aktivitet i forhold til vild-type-rt-PA (hvor vild-_typen er 1,0; () angiver forsøasusikkerhed) _Mutation__én-kæde to-kæde__gange ____forskel K296.H297A.R298A.R299A , 1,26(0,02) 2,82(0,32) 2,2 E303A.R304A _ 1,38(0,04) 2,13(0,29) 1.5 H331A.H332A . 1,29(0,04) 2,19(0,68) 1.7 .

R339A.R342A_ 0,38(0,07) 1,04(0,11) 2,7 K416A.H417A.E418A 0,21 (0,04) 0,96(0,09) 4,6 E426A,R427A,K429A,E430A 0,14(0) 0,76(0,07) 5.4 H432A.R434A_ 0,16(0,08) 0,99(0,13) 6.2 D460A.R462A 0,68 (0,04) T,04 (0,08) | ϊϋ DK 175958 B1 51

TABEL III

_Zvmoaener ved den plasmakoagelafhænaiae S-2251 prøvning

Aktivitet i forhold til vild-typé-rt-PA (hvor vild-typeh _._er 1.0; Q angiver forsøgsusikkerhed)_

Mutation . én-kæde to-kæde . gange _· ·___forskel D283A.H287A . 0,53(0,01) 0,82(0,04) 1,6 K296A,H297A;R298A,R299A 0,42(0) 1,29(0,20) 3,1 E303A.R304A_ 0,90(0,03) 1,34(0,10) 1,5 H331A.H332A, 1,09(0,09) 1,61 (0,68) 1,5 R339A.R342A _0,19(0,03) 0,79(0,10) 4,2 E347A,E348A,E349A,K351A 0,38(0,05) 0,97(0,10) 2,6 D364A,D365A,D366A_ 0,88(0,03) 1,46(0,15) 1,7 K416A.H417A.E418A 0,19(0,05) 0,77(0,05) 4,1 E426A,R427A,K429A,E430A 0,11(0,01) 0,66(0,12)__6 H432A.R434A 0,05(0,01) 0,38(0,05) 7,6 H445A.R449A_ . 0,80 (ND)* 1,19(0,11) 1,5 . R449A.D453A_ 0,79(0,01) 1,22(0,13) 1,5 D460A.R462A . 0,21 (0,01) 0,32(0,02) 1,5., D477A 0,11 (0,02) 0,25 (0,08) 2,3 *ND = ikke bestemt

En sammenfatning af tabel l-lll, som viser for hvilke prøvninger hver.mutant 5 udviser specificitet, er'vist i den efterfølgende tabel IV:

TABEL IV

Mutation Zymogen ved S-2288 Fibrin Plasmakoagel ___2251__2251 R267A__X ________

D283A.H287A_ X___X

K296A, H297A.R298A.R299A__X__X,

E303A.R304A___X X

H331A.H332A_____X__X

R339A.R342A___X X__X

E347,E348A,E349A,K351A I X [ X

i • 58 DK 175958 B1

D364A.D365A.D366A__.__X

K416A.H417A.E418A X__X___X

. E426A.R427A.K429A.E430A X X X

. H432A.R434A___X___X X

R440A _ X -__,

H445A.R449A ____X

R449A.D453A __ " .__X

D460A.R462A___;__X X

D447A Γ 1 X ~

De zymogeniské t-PA-varianter anført i tabel IV blev analyseret ved S-2251 fibrinspeclficitetsprøvningen og/eller S-2251 plasmakoagel-specificitetsprøvningen i både én-kæde og to-kæde-formeme. Resultaterne 5 for én-kæde- og to-kæde- t-PA-varianteme er vist i henholdsvis tabel V og VI.

En sammenfatning af dataene i tabellerne V og VI er vist nedenfor i tabel VII.

Det kan ses, at hver af de zymogéniske rt-PA-varianter fra tabel IV også. er fibrin- eller plasmakoagél-specifik i forhold til vild-type-t-PA. Et X angiver et .10 forhold mellem fibrin og fibrinogen eller plasmakoagel og plasma på >1,5 som målt ved S-2251 prøvningen og rapporteret i tabellerne V og VI.

TABEL V

DK 175958 B1

Or FIBRIN- OG PLASMAKOÅGEL-SPECIFICITET AF rt-PA-VARIANTER (EN-KÆDE)

Aktiviteterne er i forhold til vild-type-rt-PA (hvor vild-typen er 1,0) 5 ‘ ·

Mutant Fe · Eb FWFe ' PI PC_PC/PI

R267A

AVE 033 0.92 1.74 0.24 a7 3.00 io . §e_:_ roooi «ion_(o.on (0.091 D283A, H287A · AVE 039 078 102 0.19 003 2.76

15 SD (0.021 (0051_(0.071 (0.01Y

K296A, H297A, . .

R298A,

20 R299A

AVE 029 1.26 4.40 014 042 3.00 SD_;_(0051 (0021 (0,031 (0.001 E303A,

25 R304A

AVE 068 138 2-04 035 090 231 SD_;_ (0091_(0.04)_(0.011 (0.031 H331A.

30 H332A

AVE 1.19 139 1.08 1.12 1.09 0.97 SD _;_(0.061_(0.041 (0131 (0091 R339A, .

35 R342A

AVE 034 038 1.12 002 019 930 SD_(0.001_(0071 (0.031 (01031 E347A, 40 E348A.

E349A,

K351A

AVE · 050 0.87 1.75 0.13 038 2.88 SD _ (0091_(0-15)_(0.041 (0.051 45 D364A, D36SA.

D366A

AVE . 066 1.50 237 028 038 3.14 50 SD_;_ /0.031 (0.041_(0.041 (0.031 K416A, H417A,

E418A

55 AVE 034 031 0.60 0.10 019 1.95 SD _(0.011 (0.041_(0.041 (0.051 DK 175958 B1 • 60 5

Mutant_Fe · Fb_Fb/Fe PI PC_PC/Pl

R267A

AVE 033 0.92 1.74 0.24 . 0.7 . 3.00 io sd (Q.ooi (o.on_(O.on (0.09i D283A,

H287A

AVE 039 0.78 132 0.19 033 2.76 15 SD (0.021 (0.051_(0.071 (0.011 K296A, H297A, . R298A,

20 R299A

AVE 0.29 1.26 4.40 0.14 0.42 3.00 SD_;_(0.051 (0.021_(0.031 (0.001 E303A,

25 R304A

AVE 0.68 .138 .2.04 035 0.90 2.61 SD_ (0.091_(0.041 (0.011 (0.031 H331A,

30 H332A

AVE 1.19 1.29 1.08 1.12 1.09 0.97 SD_ _(0.061_(0.041 ' (ΟΛ31 (0.091 R339A,

35 . R342A

AVE 034 038 1.12 0.02 0.19 930 SD (0.001 (0.071_(0.031 (o:o3i E347A, ...

40 E348A, E349A, .

K351A

. AVE 030 0.87 1.75 0.13 038 238 SD (0.091 (0.151_(0.041 (0.051 45 ' D364A, D365A,

D366A

AVE ' 0.66 130 237 0.28 038 3.14 50 SD _ . (0.031 (0.041_ (0.041 (0.031 K416A, . * Η4Γ7Α,

E418A

55 AVE 034 0.21 0.60 0.10 0.19 1.95 SD___(0.011 (0.041_(0.041' (0.051, DK 175958 B1 61 i 5 Mutant .. Fe_Efe_ Fb/Fe Pi PC PC/EL.

E426A, R427A, K429A,

10 E430A

AVE 0.21 0.14 .0.68 0.07 0.11 1.50 .

SP (0.0 n (0.00)_fp.on ιο.οη_ H432A. ·

15 R434A

AVE 0.16 0.16 1.00 0.08' 0.05 0.60 SP _ιο.οη to.os)_ (0.0 n ιο.οη

R440A

20 AVE 0.62 1.02 1.64 0.48 0.86 1.8) SE_10.08) 10.18)_(0.04) (0.10) H445A,

R449A . I

25 AVE 0.52 1.12 2.15 0.24 0.80 3.33 I ' SE_t, —---:-:---:-- R449A,

P453A

30 AVE 0.58 1.16 2.00 0.28 . 0.79 2.87 SE_ <o.on fP.m _rø.on (o.on___ P460A, .

R462A

35 AVE 0.13 0.68 5.19 0.10 0.2) 2.16 SP _ 10.03) (OM (0.05) (0.01)___ P477A ' AVE 0.08 0.09 1.06 0.03 0.11 4.20 40 SE_:_10.00) 10.01) 10.04) 10.02)_

Fg = Fibrinogen Fb = Fibrin PI = Plasma PC = Plasmakoagel AVE= Gennemsnit SD = Standardafvigelse i [_____

TABEL VI

DK 175958 B1 62 FIBRIN- OG PLASMAKOAGEL-SPECIFICITET AF rt-PA-VARlANTER (TOKÆDE)

Aktiviteterne er i forhold til vild-type rt-PA (hvor vild-typen er 1,0)' 5 .

' Mutant_ Fe Fb Fb/Fg PI PC · PC/P1 ' R267A ' .10 AVE · 0.85 0.97 1114 ,0.70 0.86 . 1.23 sd____(0.211 ro. i5i_ ~ ro.oei ram D283A,

H287A

15 AVE . 0.77 1.00 131 0.68 0.82 1.19 SD_;_;_ (0.121 (0.081 _(0,141 (0.041 ’ K296A, H297A, 20 . R298A, ., R2&A* AVE 031 2.82 9.24 024 1.29 530 SD_ _(0.141_(0.321_(0,151 (0.201 E303A, ‘

25 R304A

AVE 036 2.13 3.79 0.26 134 5.10 SD_; (0331 (0.291 (0.081 (0.101 H331A.

30 H332A

AVE 1.03 2.19 2.12 1.03 1.61 136 SD (0.861 __;_£MQ_tSjigL 'i R339A,

35 R342A

AVE 035 1.04 1.89 0.23 0.79 '3.38 SD_(0.T81 ' . (0.111 (0.051 (0.101 E347A, 40 E348A.

E349A.

K351A

AVE 076 133 1.76 0.44 0.97. 2.20 SD (0.241 (0.121_(0.111 (0.101 45 D364A, D365A,

D366A

AVE 0.73 L77 2.44 036 1.46 5.68 . .

50 SD · (0371 (0.231 _ (Q,121_ JU151 K416A, H417A.

E418A

55 AVE 0.77 . 0.96 1.24 0.42 0.77 1.82 §B_(0.131_(0.091_(0.081 (0.051 .

64 DK 175958 B1 -.--Mutafll-Es-Eb_ - Fb7Fe PI PC PC/P1- 5 E426A, R427A, K429A.

E430A . .

AVE 0.38 0.76 2.01 0.24 0.66 2.80 10 S.D__(0.271 (0.071_ (0.071 (0.Ί21 H432A, · R434A ' , AVE 0.16 0.99 6.40 0.Ί6 0.38 2.31 15 SJ? _ (0051 (0.131 (0,051 (0.051

R440A

AVE 0.51 0.92 1.81 0.51 0.90 . 1.78 SB_{Q.in (0.101_ 10,081 (0.09i 20 H445A,

R449A

AVE 0.62 1.46 2.36 0.29 .1.19 4.06 , SD_ (0.161 fO.101 ' 10,091 *10.111 ' 25 R449A,

D453A

AVE 0.74 J.50 ' 2.04 0.36 1.22 3.36 SB_ fO-Hl_(0.23)_; (0-121 (0.131 30 D460A.

R462A

AVE . 0.18 1.04 5.91 0.12 . 0.32 2.59 SB__mjli_(0.081 (0.021,· <0.021 35 · - .

D477A · · AVE 0.12 0.10 0.89 0.11 0:25 224 SB_ (0.021 _LM23_r (0.031 (0.081

Fg = Fibrinogen Fb = Fibrin PI = Plasma 5 PC = Plasm akoagel AVÉ= Gennemsnit .

SD = Standardafvigelse •65 ' DK 175958 B1

TABEL VII

Mutant Fibrinspecificitet Plasmakoagelspecificitet __én-kæde to-kæde én-kæde to-kæde R267A__X X__ D283.H287A_________X__' K296A,H297A,R298A,R299A x__X x__x

. E303A.R304A _ χ x X X

H331A.H332A_.___X____χ R339A.R342A . X__x__x E347A,E348A.E349A,K351A x__X x__x D364A, D365A, D366A__X__x__x x K416A.H417A.E418A_______χ__x

. E426A, R427A.K429A.E430A ,_ X__X__X

H432A.R434A . X____X

R440A_ X X__X__X

H445A.R449A .__X__X;__X__χ

R449A.D453A__X X X__X

D460A,R462A__X__X . X__X

D477A I , . I I X X

Der var en slående korrelation mellem de varianter af rt-PA, som udviste fibrin-og/eller plasmakoagel-specificitet, og de, som opfyldte de ovenfor specificerede 5 kriterier for zymogenicitet. Desuden b|ev to varianter af rt-PA fundet at udvise fibrinspecificitet, men var ikke zymogeniske i forhold til vild-type-rt-PA. Tabel VIII viser S-2251 prøvningsdataene for de fibrinspecifikke og plasmakoagelspecifikke varianter.

10 TABEL VHI

FIBRIN- OG PLASMAKQAGEL-SPECIFIKKE. IKKE-ZYMOGENISKE VARIANTER AF rt-PA

i 66 DK 175958 B1

FIBRIN- AND PLASMA CLOT- SPECIFIC, NON-ZYMOGENIC VARIANTS OF rt-PA

Mutant Fa/1ch Fb/lch Fb/Fglch Pl/tch PC/1ch PC/PI1ch

E408A

AVE 0.35 0.79 2.28 0.19· 0.47- '2.51 .

SD __(0.01) (0.06)__' , (0-04) (0,01)__ E410A ' AVE 0.81 . 0.90 1.47 0.51 0.74 1.44 SD (0.08) (0.04)___(0.11) (0.05)__.

Mutant Fg/2ch Fb/2ch Fb/Fg2ch Pl/2ch PC/2ch PC/PI2ch

E408A

AVE 0.34 039 2.61 0.24 0.64 2.72 SD (0.18) ' (0.11)____(0.08) (0.04)

E410A

AVE 0.55 0.92 1.67 0.48 0.88 134 SD (0.13) (0.09)__(0.10) (0.08)__ ;

Fg = Fibrinogen Fb = Fibrin PI = Plasma.

5 PC = Plasmakoagel 1ch= én-kæde 2ch= to-kæde AVE= Gennemsnit SD = Standardafvigelse 10

Deponering af materialer

Den følgende kultur er blevet deponeret i the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

Stamme ATCC Dep. nr. Deponeringsdato pTAP33-2 i E. coli MM294tonA 68059 18. juli 1989 15

Denne deponering blev foretaget i henhold til bestemmelserne i Budapest-traktateri vedrørende den internationale anerkendelse af deponering af. mikroorganismer med henblik på patentprocedure og reglerne derunder. Dette sikrer opretholdelse af en levedygtig kultur i 30 år fra deponeringsdatoen! 20 Organismen vil blive gjort tilgængelig af ATCC under Budapest-traktatens betingelser og i henhold til en overenskomst mellem Genentech, Inc. og ATCC, som sikrer permanent og ubegrænset tilgængelighed af kultlirens af- i j 67 DK 175958 B1 kom for offentligheden efter at denne ansøgning er blevet offentlig tilgængelig.

Indehaveren af den foreliggende ansøgning er gået ind på, at hvis den depo-5 nerede kultur skulle dø eller gå tabt eller blive ødelagt, når den dyrkes under egnede betingelser, vil den efter påkrav straks blive erstattet med en levedygtig prøve af den samme kultur. Tilgængelighed af den deponerede stamme må ikke udlægges som en licens til at udøve opfindelsen under krænkelse af de rettigheder, som er givet under en hvilken som helst regerings myn-10 dighed i overensstemmelse med dens patentlove.

i ! !

Claims (62)

1. Vævsplasminogenaktivator-(t-PA)-variant, som ved en.prøvning af enzy-5 matisk aktivitet udviser en større differentiel aktivitet mellem en-kæde formen og to-kæde formen end en vild-type rekombinant t-PA i kraft af at der enten: (a) substitueres en aminosyre, som ikke er phenylalanin, i aminosyre position 305; eller der (b) indsættes en aminosyre efter en eller begge aminosyre positionerne 304 10 og 305; eller der (c) slettes en eller flere aminosyrer i aminosyre positionerne 297 til 305, begge positioner inklusive; i en vild-type human t-PA; nummereringen af aminosyre positionerne svarer til den i figur 1. 15

2. Variant ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den aminosyre som substitueres eller indsættes har en sidekæde, som kan optræde eller optræder som donor til en hydrogenbinding.

3. Variant ifølge krav 2, kendet egnet ved, at aminosyren er histidih, tyrosin, asparagin, lysin, arginin eller glutamin.

4. Variant ifølge krav 3, kendetegnet ved, åt aminosyren er histidin.

5. Variant ifølge krav 1,kendetegnet ved, at sletning sker i position 297, 300, 304 eller 305.

6. Variant ifølge krav 1 valgt fra gruppen bestående af: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; Ϊ304Η t-PA; Ϊ304Τ t-30 PA; i304N t-PA; Ϊ304Κ t-PA; i304R t-PA; i304Q t-PA; Ϊ304ΗΗ t-PA; i305H t-PA; i305T t-PA; Ϊ305Ν t-PA; i305K t-PA; i305R t-PA; i305Q t-PA; i304H,i305H DK 175958 B1 69 t-PA; Ϊ305ΗΗ t-PA; d297 t-PA; d298 t-PA; d299 t-PA; d300 t-PA; d301,t-PA; . d302 t-PA; d303 t-PA; d304 t-PA; d305 t-PA; d297-298 t-PA; d297-299 t-PA; d297-300 t-PA; d297-301 t-PA; d297-302 t-PA; d297-303 t-PA; d297-3041-. PA; d297-305 t-PA; d300-301 t-PA; d300-302 t-PA; d300-303 t-PA; d300-304 5 t-PA; d300-305 t-PA; d304-305 t-PA; d297, d300t-PA; d,d305 t-PA; d1 -44,. N184D.F305H t-PA; d1-44,F305H t-PA;.d1-44,l210R.G211 A.K212R, V213R, F305H t-PA; di44,l210R,G21 1A,K212R,V213K,F305H t-PA; d1-44,V213K, F305H t-PA; d1-44,T252R,F305H t-PA; d1-44, V213K.T252R, F305H t-PA; d1-44,1210K.F305H t-PA; d1-44, l210R,G211H,K212Q,V2i3K, F305H t-PA;

10 I210R.G211H,K212Q,V213K,F305H t-PA; I210R.G211A,K212R,V213R, F305H t?PA; d1-44,Nl84D,l210R,G211A,K212R)V213R,T252R,F305H t-PA; N184D,I210R,G211A,K212R,V213R,T252R,F305H t-PA; d92-179,F305H t-PA; d92-1791l210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d92-179,N194D, 1210R.G211Å.K212R.V213R,T252R,F305H t-PA; d92-179,1210R.G211A,

15 K212R,V213R.T252R.F205H t-PA; Y67N.F305H t-PA; d1-44,Y67N,F305H t-. PA.

7. Variant ifølge krav 1 valgt fra gruppen bestående af: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; I304H t-PA; d1- 20 44.F305H t-PA; d92-179,F305H t-PA; d1-44,N184D,F305H t-PA; d1- 44,121 OR, G211 A,K212R,V213R,F305H t-PA; d1-44,l210R,G211A,K212R, V213K.F305H t-PA; I210R.G211A.K212R.V213R; F305H t-PA; d92-179,I210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d92-179.N183D.210R, G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d1-44,N184D,l210R,G211A,K212R,

25 V213R,T252R,F305 t-PA; og Ν1840.Ι210Ρ,β211Α,Κ212^ν213Ρ,Τ252Ρ, F305H t-PA.

8. Human-vævsplasminogenaktivator-(t-PA)-variant, som er i stand til at udvise en eller flere af de følgende biologiske aktiviteter en større differentiel 30 aktivitet mellem en-kæde. formen og to-kæde formen end en vild-type rekom-binant t-PA, en større fibrinafhængig specifik aktivitet i forhold til fibrinoge- DK 175958 B1 70 • ' t nafhængig specifik aktivitet ved S2251 prøvning end en vild-type rt-PA„ eller eh større plasmakoagelafhængig specifik aktivitet i forhold til plasmaafhængig specifik aktivitet ved S2251 prøvning end en vild-type rt-PA, kendete g n e t ved, at den indeholder mindst en aminosyresubstituering i dens pro-5 teasedomæne sammenlignet med den tilsvarende vild-type-t-PA (fra aminor syre 264 fil aminpsyre 527), hvilken substituering er ansvarlig for den nævnte biologiske aktivitet, forudsat at varianterne d296-302 t-PA, R304E t-PA, R304S t-PA og A473S t-PA er udelukket og at substitueringen ikke alene er i områderne 270-280, 448-450 og 502-527, og substitueringer i områderne 10 411-416, 416-423 eller 423-430; nummereringen af aminosyre positionerne svarer til den i figur 1.

9. Variant ifølge krav 8, hvori substitutionen involverer at en Arg, Asp, His, Glu eller Lys erstattes med en neutral eller negativt ladet amjnosyre. 15

10. Variant ifølge krav 9, hvori den aminosyre, der anvendes som erstatning, er alanin, glycin, serin, threonin, asparagin, glutamin, valin, leucin, isoleucin, phenylalanin eller tyrosin.

11. Variant ifølge krav 9, hvori den aminosyre, der anvendes som erstatning, er alanin, serin, threonin, asparagin, glutamin, valin, leucin, isoleucin, phenylalanin eller tyrosin.

12. Variant ifølge krav 9, hvori den aminosyre, der anvendes som erstatning, 25 er alanin, serin, eller threonin.

13. Variant ifølge krav 12, hvori substitutionen sker i en tilsvarende vild-type-t-PA i position 267, 283, 287, 296, 297, 298, 299, 303, 304, 331, 332, 339, 342, 347, 348, 349, 351, 364, 365, 366, 408, 410, 432, 434, 440, 445, 449, 30 453, 460,462 eller 470 eller kombinationer deraf. ! . 71 DK 175958 B1 . 14. Variant ifølge krav 13, hvori substitutionen sker i positionen eller,positionerne 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364-366, 408, 410, 432+434, 440, 445+449, 449+453i 460+462 eller 477 i en tilsvarende vild-type-t-PA, hvor ”+" betyder at der kun er sket ændringer i de 5 angivne positioner, og betyder ændringer i samtlige de angivne positioner.

15. Variant ifølge krav 14, hvor ændringen er R267A t-PA, D283A.H287A t-PA, K296A,H297A,R298A,R299A t-PA, E303A.R304A t-PA, H331A.H332A t-PA, R339A.R342A t-PA, E347A,E348A,E349A,K351A t-PA, D364A,

10 D365A.D366A t-PA, E408A t-PA, E410A t-PA, K416A,H417A,E418A t-PA, E426Å,R427A,K429A,E430A t-PA, H432A.R434A t-PA,. R440A t-PA, H445.R449A t-PA, R449A.D453A t-PA, D460A.R462A t-PA og D477A t-PA.

16. Variant ifølge krav 14, som har en substitution i en af aminosyre positio-15 neme 296-299, inklusiv 296 og.299.

17. Variant ifølge krav 16, som har en alanin substitution i .en af aminosyre positionerne 296-299, inklusiv 296 og 299. 20 18. Våriant ifølge krav 16, som har en alanin substitution i hver af aminosyre positionerne 296-299, inklusiv 296 og 299.

19. Variant ifølge krav 12, hvori substitutionen er i positionerne 416-418 eller 426-427+429-430 i en tilsvarende vild-type-t-PA, hvor"+” betyder at der kun 25 er sket ændringer i de angivne positioner, og betyder ændringer i samtlige de angivne positioner.

20. Variant ifølge krav 19, hvor ændringen er K416A,H417A,É418A t^PA, E426A,R427A,K429A,E430A t-PA. .30

21. Variant ifølge ethvert af kravene 8-20, som er fri for i det mindste en del i DK 175958 B1 72 af fingerdomænet åf den tilsvarende vild-type t-PA.

22. Variant ifølge ethvert af 8-21, som har substitution, indsætning eller sletning af en aminosyre i position. 117-119, 184-186, eller 448-450 i en den.til- 5 svarende vild-type t-PA.

23. Variant ifølge krav 22, hvor ændringen er fri for en funktionel carbo-hyd ratstruktur i position 184.

24. Variant ifølge et af kravene .8-23, som er glycosyleret i vækstfaktordo- mærief i den tilsvarende vild-type t-PA.

25. Variant ifølge krav 24, som indeholder asparagin i position 67 i den tilsvarende vild-type t-PA. 15

26. Variant ifølge ethvert af kravene 8-25, som er fri for aminosyreme 92-179, inklusiv 92 og 179, i den tilsvarende vild-type t-PA.

27. Vævsplasminogenaktivator-(t-PA)-variant ifølge krav 8, hvor alanin er 20 substitueret i hver af positionerne 296-299.

28. Fremgangsmåde til identifikation af vævsplasminogenaktivator-(t-PA)-varianter.som har en større differentiel aktivitet mellem en-kæde formen og to-kæde formen end en vild-type rekombinant t-PA, og som omfatter 25 (a) substituering af en aminosyre, som ikke er phenylalanin, i aminosyre position 305; eller der (b) indsætning af en aminosyre efter en eller begge aminosyre positionerne 304 og 305; eller der (c) sletning af en eller flere aminosyrer i aminosyre positionerne 297 til 305, 30 inklusive begge positioner; i en vild-type human t-PA; nummereringen af aminosyre positionerne svarer DK 175958 B1 73 til den i figur 1.

29. Fremgangsmåden ifølge krav.28, hvori aminosyren, som er substitueret eller indsat, har en sidekæde, der kan optræde eller som optræder, som do- 5 nor til en hydrogenbinding..

30. Fremgangsmåde ifølge krav 28, hvor aminosyren er histidin.·

31. Fremgangsmåde til identifikation af vævsplasminogen aktivator-(t-PA)-10 varianter med specificeret biologisk aktivitet omfattende: (a) indførelse af en aminosyresubstitution i proteasedomænet af vævsplasminogenaktivator (t-PA) (aminosyre positionerne 264-527), hvor substitutipnen udelukker'substitutioner alene i områderne 270-280, 448-450 og 502-527 i den tilsvarende vild-type t-PA; og . 15 (b) screening af den. resulterende t-PA-variant for dens evne til at udvise en eller flere af de følgende biologiske aktiviteter: (a) en større differentiel aktivitet mellem en-kæde formen og to-kæde formen end vild-type rekombinant t-PA, (b) en større fibrinafhængig specifik aktivitet i forhold til fibrinogenafhæn-gig specifik aktivitet i en S2251 prøvning end en vild-type rt-PA, eller (c) en . 20 større plasmakoagelafhængig specifik aktivitet i forhold til plasmaafhængig specifik aktivitet i en S2251 prøvning en vild-type rt-PA, med det forbehold at screeningen for aktivitet -(a) er udelukket hvis substitutionen er i områderne fra 411 til 416, fra 416 til 423 eller fra 423 til 430; nummerering af aminosyre positionerne svarer til den i figur 1. 25

32. Fremgangsmåden ifølge krav 31, hvori den screenede t-PA variant, er produceret i et transient expressionssystem.

33. Fremgangsmåden ifølge krav 31, hvor substitutionen omfatter at en Arg,

30 Asp, His, Glu eller Lys i en vild-type t-PA erstattes med en neutral eller negativt ladet aminosyre. DK 175958 B1 74

34. Fremgangsmåden ifølge krav 33, hvor erstatningen sker i positionen eller positionerne 267, 283+287, 296-299, 303-304, 322, 331-332, 339+342, 347-349+351, 353+355-356, 360-362, 364-366, 408, 410, 416-418, 426-5 427+429-430, 432-434, 440, 445+449, 449+453, 460+462, 471-472, 477 . eller kombinationer heraf, .af den tilsvarende vild-type t-PA, hvor ’+" betyder at der kun er sket ændringer i de angivne positioner, og betyder ændringer i samtlige de angivne positioner. .

35. Frerrtgangsmåde ifølge krav 34, hvor den aminosyre, der anvendes som erstatning, er alanin, serin, threonin, asparagin, glutamin, valin, leucin, iso-leucin, phenylalanin eller tyrosin.

36. Fremgangsmåde ifølge krav 35, hvor den aminosyre, der anvendes som 15 erstatning, er alanin.

37. Fremgangsmåden ifølge krav 36, hvor erstatningen sker i positionen eller positionerne 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351’ 364-366, 408, 410, 416-418, 426-427+429-430, 432+434, 440, 20 445+449, 449+453, 460+462 eller 477 af den tilsvarende vild-type t-PA, hvor ”+” betyder at der kun er sket ændringer i de angivne positioner, og betyder ændringer i samtlige de angivne positioner.

38. Et DNA-molekyle, som koder for varianten i krav 1. 25

39. Et DNA-molekyle, som koder for varianten i krav 8.

40. Et DNA-molekyle ifølge krav 39, hvor vananten har hver af positionerne 296-299 substitueret med alanin. 30

41. Et DNA-molekyle ifølge krav 39, som koder for R267Å t-PA, DK 175958 B1 75 D283A.H287A t-PA, K296A,H297A,R298A,R299A t-PA, E303A.R304A t-PA, Ή331Α.Η332Α t-PA, R339A.R342A t-PÅ, E347A,E348A,E349A,K351A t-PA, D364A.D365A.D366A t-PA, E408A t-PA, E410A t-PA, K416A.H417A.E418A t-PA,. E426A,R427A,K429A,E430A t-PA, H432A.R434Å t-PA, R440Å t-PA,

5 H445.R449A t-PA, R449A.D453A t-PA, D460A.R462A t-PA og D477A t-PA.

42. En replicerbar ekspressionsvektor, som er i stand til i en-transformant værtscelle at udtrykke DNA-sekvensen ifølge krav 38.

43. En replicerbar ekspressionsvektor ifølge krav 42, hvor den transformante værtscelle ér eukaryotisk.

44. En replicerbar ekspressionsvektor, som er i stand til i en transformant værtscelle at udtrykke DNA-sekvensen ifølge krav 39. 15

45. En replicerbar ekspressionsvektor ifølge krav 44, hvor den transformante • . værtscelle er prokaryotisk.

46. En replicerbar ekspressionsvektor ifølge krav 44, hvor varianten har hver 20 af positionerne 296-299 substitueret med alanin.

47. Vektoren ifølge krav 46, som er pTPA33-2, tilgængelig fra depot nummer ATCC 68.059. 25 48. Værtscelle transformeret med vektoren ifølge krav 42.

49. Eukaryotiske værtsceller, som er transformeret med vektoren ifølge krav 43.

50. Cellerne ifølge krav 49, som er gærceller. , DK 175958 B1 76

51. Cellerne ifølge krav 49, som er pattedyrceller.

52. Værtsceller transformeret med vektoren ifølge krav 44. 5 53. Værtscellerne ifølge krav 52, som er eukaryotiske celler..

54. Værtscellerne ifølge krav 53, som er i stand til transient expression af den DNA sekvens, som koder for varianten.

55. Prokaryotiske værtsceller transformeret med vektoren ifølge krav 45.

56. Værtsceller ifølge krav 52,. hvor variantén har hver af positionerne 296-299 substitueret med alanin. 15 57. E.coli værtsceller transformeret med vektoren ifølge krav 47. . 58. Én sammensætning til behandling af en vaskulær tilstand eller sygdom, som omfatter.en terapeutisk effektiv mængde af varianten ifølge krav 1 i samblanding med en farmaceutisk acceptabel bærer. 20 .

59. En sammensætning til behandling af en vaskulær tilstand eller sygdom, som omfatter en terapeutisk effektiv mængde af varianten ifølge krav 8 i , samblanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.

60. En sammensætning ifølge krav 59, hvor varianten har hver af positioner ne 296-299 substitueret med alanin. i • i

61. En sammensætning til forebyggelse af fibrin aflejringer eller dannelse af sammenvoksning eller omdannelse, som omfatter en terapéutisk effektiv 30 mængde af varianten ifølge krav 1 i samblanding med en farmaceutisk acceptabel bærer. DK 175958 B1 77 • i 62. ; En sammensætning til forebyggelse af fibrin aflejringer eller dannelse af sammenvoksning eller omdannelse, som omfatter en terapeutisk effektiv mængde af varianten ifølge krav 8 i samblanding med en farmaceutisk ac- 5 céptabel bærer.

63. En sammensætning ifølge krav 62, hvor varianten har hver af positionerne 296-299 substitueret med alanin.