KR960015610B1

KR960015610B1 - 신규의 혈전붕괴 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR960015610B1
Application number: KR1019890700320A
Authority: KR
Inventors: 알. 라아센 글렌; 제이. 아언 팀
Original assignee: 제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드; 브루스 엠. 에이센
Priority date: 1987-06-22
Filing date: 1987-07-03
Publication date: 1996-11-18
Also published as: HUT51901A; WO1988010119A1; KR890701123A

Abstract

내용없음

Description

신규의 혈전붕괴 단백질의 제조방법

본 발명은 조직 플라스미노겐 활성화제형(t-PA) 활성을 갖는 물질에 관한 것이다. 보다 상세히 설명하면, 본 발명은 "재조합" 혈전붕괴 단백질, 유전공학 처리된 세포로부터 단백질을 수득하는 방법 및 이 물질의 혈전붕괴제로서의 치료학적 용도에 관한 것이다.

이들 단백질은 천연의 인간 t-PA에 비하여 개선된 섬유소 용해 프로필을 갖는 활성 혈전붕괴제인 것으로 생각된다. 이것은 섬유소에 대한 증가된 친화력, t-PA의 억제제와의 감소된 반응성, 보다 빨라진 혈전 붕괴속도, 증가된 섬유소 용해 활성 및/또는 연장된 생물학적 반감기에 의해 분명해질 수 있다. 또한 본 발명의 단백질은 천연의 인간 t-PA 보다 더 균질한 형태로 보다 편리하게 제조될 수 있으리라고 생각된다. 이들 단백질에 대해 개선된 종합적인 약학역학적 프로필이 계획되었다.

천연 인간 t-PA의 구조는 약 91 아미노산 잔기의 아미노(N-)말단, 두 개의 소위 "크링글(kringle)" 영역 및 카르복시 말단에 세린 프로테아제형 도메인을 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 본 발명자들은 N-말단이 특히, 섬유소 결합 및 생체내 단백질 청소에 있어서 기능적인 역할을 담당하는 수개의 서브-도메인을 함유하는 것을 발견하였다. 최근에, 천연의 N-말단 및 첫번째 크링글 영역이 결손되어 있는 또 다른 형태의 t-PA의 회수가 보고되었다[참고 유럽 특허 공고 제 0 196 920호(1986년 10월 8일 공고). 그 보고에 따르면, 천연 인간 t-PA의 Ala-160에서 시작되는 절단형의 t-PA가 섬유소 용해에서 활성을 갖는다.

이하에 보다 상세히 설명되는 대로, 본 발명은 천연의 인간 t-PA의 크링글 영역을 모두 보유하지만, N-말단 내에 변형을 포함하는 신규한 인간 t-PA의 단백질 유사체를 제공한다. 특정 구현예에서는 변형이 N-말단에서의 결실을 포함하는 한편, 첫번째 크링글 영역이 그대로 남아있고, N-말단 결실이 94 아미노산보다 절대로 크지 않다. 대부분의 구현예는 현저하게 작은 결실(들) 및/또는 아미노산 변환(들)을 포함한다. 천연의 인간 t-PA의 구조중 더 많은 부분을 유지함으로써, 본 발명의 단백질이 천연의 인간 t-PA의 바람직한 생물학적 활성을 더 많이 선택적으로 보유하고, 보다 격렬하게 변형된 t-PA의 유사체보다 낮은 면역성을 갖는 것으로 생각된다. 그러므로, 본 발명의 단백질은 다른 변형된 형태의 t-PA 뿐만 아니라 천연의 인간 t-PA 및 절단된 Ala-160 t-PA 모두에 비하여 개선된 섬유소 용해 및 약학역학적 프로필을 갖는 것으로 생각된다.

천연의 인간 t-PA의 폴리펩티드 중축은 4개의 일치(consensus) Asn-결합 글리코실화 부위도 포함한다. 이들 부위중 두개가 흑색종-유래 포유동물 세포에서 유래된 t-PA에서, 즉 Asn₁₁₇및 Asn₄₄₈에서 전형적으로 글리코실화 되었음이 밝혀져 있다. Asn₁₈₄는 가끔 글리코실화되고 Asn₂₁₈은 전형적으로 글리코실화 되어있지 않다. 흑색종-유래 포유동물 세포, 예를들면 보웨스(Bowes) 세포에서 얻어진 t-PA는 또한 본 명세서에서 "천연의(native)" 또는 "자연의(natural)" 인간 t-PA로 표기된다.

상술한대로, 본 발명은 t-PA형 혈전붕괴활성을 갖는 신규한 인간 t-PA의 단백질 유사체를 포함한다. 본 발명의 단백질은 (i) 천연 t-PA메 존재하는 Asn-결합 글리코실화 부위의 세개 이하에서; (ⅱ) 천연 t-PA의 94 아미노산 성숙 N-말단에 대응하는 단백질의 N-말단내에서; 및/또는 (ⅲ) Arg-275와 Ile-276 사이에 걸쳐있는 단백질 분해 절단부위에서 펩티드 서열의 변형을 갖는다는 점에서 인간 t-PA와는 구조상 다르다. 본 발명의 단백질의 이러한 특성은 하기에 보다 상세히 설명된다. 각종 변형에도 불구하고, 표 1외 한 문자 코드 서열로 나타낸 아미노산의 번호 매기기는 그대로 유지된다.

A. N-말단에서의 변형

본 발명의 한 측면에서는, 단백질이 천연의 인간 t-PA에 비해, Gly-(-3) 또는 Ser-1에서 Thr-91까지 걸쳐 있는 펩티드 영역내에 1-94 아미노산이 결실되어 있는 것을 특징으로 한다. 예를들면, 한 구현예에서는, 천연 t-PA의 Cys-51부터 Asp-87까지가 결실되어 있다. 두개의 다른 특정 구현예에서는, 각각 Cys-6부터 Ser-50까지, 그리고 Cys-6부터 Ile-86까지가 결실되어 있다. 다른 구현에서는, 단백질의 N-말단 영역에 보다 보존적인 변형이 존재한다. 예를들면, 본 발명의 특정 단백질은 다음의 보다 불연속적인 하나 또는 그 이상의 아영역내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 결실 또는 변환을 포함한다:

Gly-(-3)부터 Thr-91까지 걸쳐있는 N-말단내의 상기 변형 및 다른 변형은 하기에 보다 상세히 설명된다.

B. N-결합 글리코실화 부위에서의 변형

본 발명의 단백질 변형체는 또한 N-결합 탄수화물 부위를 포함하지 않거나 또는 천연의 인간 t-PA에 비해 부분적으로만 글리코실화 될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "부분적으로 글리코실화된" 단백질은 전부 글리코실화된 천연의 인간 t-PA 보다 적은 N-결합 탄수화물 부위를 포함하는 단백질을 의미한다. 이러한 글리코실화의 부재 또는 부분적인 글리코실화는 천연 t-PA 분자내에 존재하는 일치 N-결합 글리코실화 인지 부위중 하나 또는 그 이상에서의 아미노산 변환 또는 결실에 의한 것이다. 본 발명자들은 하나 또는 그 이상의 N-결합 글리코실화 부위에서의 이러한 변형을 구체화하는 본 발명의 변형체 단백질이 특정한 경우에는 보다 큰 섬유소 용해 활성과 함께 t-PA형 혈전붕괴 활성을 보유하고, 천연 t-PA 보다 균질한 형태로 보다 쉽게 제조될 수 있으며, 많은 경우에 천연 t-PA 보다 긴 생체내 반감기를 갖는다는 것을 발견하였다.

N-결합 글리코실화 인지 부위는 현재 적절한 세포성 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인지되는 트리펩티드 서열을 함유하는 것으로 믿어진다. 이들 트리펩티드 서열은 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린(식중 X는 통상적으로 모든 아미노산이다)이다. t-PA 펩티드 서열내의 그들의 위치를 표 1에 나타내었다. 세 위치의 글리코실화 인지 부위의 하나 또는 그 이상에서의 각종 아미노산 변환 또는 결실은 변형된 서열에서의 비글리코실화를 유발한다. 예로서, t-PA의 Asn₁₁₇및 Asn₁₈₄모두가 한 구현예에서는 Thr로, 그리고 다른 구현예에서는 Gln으로 치환되어 있다. 적어도 이증 Gln 치환의 경우에, 생성된 당단백질(Gln₁₁₇Gln₁₈₄)은 천연 t-PA의 경우에서와 같이 둘 또는 세개의 이러한 부위를 갖기 보다는 오직 하나의 N-결합 탄수화물 부위(Asn₄₄₈에서)를 포함한다. 이 분야의 통상의 지식을 가진 자는 동일한 Asn₄₄₈모노글리코실화를 갖는 유사 당단백질을 117 및 184 위치에서의 아미노산의 결실 또는 다른 아미노산의 변환에 의해, 및/또는 상술한대로, 각각의 글리코실화 인지 부위내의 다른 위치, 예를 들면 Ser₁₁₉에서 Ser₁₈₆에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 결실 또는 변환시킴으로써, 및/또는 트리펩티드 부위의 "X" 위치중 하나 또는 그 이상에서 변환시킴으로써, 또는 보다 바람직하게는 결실시킴으로써 제조할 수 있음을 이해할 것이다. 다른 구현예에서는 117, 184 및 448 위치의 Asn이 Gln으로 치환된다. 생성된 변형체는 천연 t-pA의 경우에서처럼 둘 또는 세개의 N-결합 탄수화물 부위를 갖기 보다는 이러한 부위를 갖지 않아야 한다. 다른 구현예에서는, 잠재적인 글리코실화 부위가, 현재로서 바람직한 한 구현에서는 117 위치에서, 다른 구현에에서는 184 위치에서, 그리고 또 다른 구현예에서는 448 위치에서 Asn가 예를들면 Gln으로 치환됨으로써 개별적으로 변형되어 있다. 본 발명은 이러한 비글리코실화, 모노글리코실화, 디글리코실화 및 트리글리코실화 t-PA 변형체를 포함한다.

본 발명의 각종 구현예에서 발견할 수 있는, 세개의 일치 N-결합 글리코실화 서열, R¹, R²및 R³중의 하나 또는 그 이상에서의 대표적인 변형을 하기에 나타내었다:

N-결합 글리코실화 부위에서의 대표적인 변형

-,-- 및 ---=펩티드 결합

*=모든 아미노산

U=Asn, Thr 또는 Ser을 제외한 모든 아미노산

V=Asn을 제외한 모든 아미노산 또는 펩티드 결합

W=Ser을 제외한 모든 아미노산 또는 펩티드 결합

X=Gly을 제외한 모든 아미노산 또는 펩티드 결합

Y=Arg을 제외한 모든 아미노산 또는 펩티드 결합

Z=Thr을 제외한 모든 아미노산 또는 펩티드 결합

wt=야생형, 즉 변이발생이전

C. Arg-275/Ile-276 절단 부위에서의 변형

본 발명의 한측면에서는, 변형체가 Arg-275의 결실 또는 Arg을 다른 아미노산, 바람직하게는 Lys 또는 His 이외의 아미노산으로 변환함으로써 Arg-275부터 Ile-276까기에 결쳐있는 단백질 분해 절단 부위가 임의로 변형되어 있다. 본 발명의 여러 구현예에서는 Thr이 현재로서 Arg-275에 대한 특히 바람직한 치환 아미노산이다. 천연 t-PA의 Arg-275에서의 단백질 분해 절단은 이 분야에 공지되어 있는 대로 소위 "2쇄(two-chain)" 분자를 생산한다. 이 절단 부위에서의 변형을 특징으로 하는 본 발명의 단백질은 절단 부위의 변형을 특징으로 하는 본 발명의 단백질은 절단 부위의 변형이 없는 대응 단백질보다 더 균질한 형태로 보다 쉽게 제조될 수 있으며, 아마도 보다 중요하게는 개선된 섬유소 용해 프로필 및 약학역학적 특성을 가질 수 있다.

그러므로 본 발명은 인간 t-PA에 관련된 신규한 혈전 붕괴 단백질의 군을 제공한다. 이들 단백질은 단백질(본 발명의 변형을 실시하기 전)을 코딩하는 DNA가 엄격한 조건하에서 안간 t-PA를 코딩하는 DNA서열에 하이브리드화될 수 있는 한, 다른 변화, 예를들면 대립형질성 변화 또는 부가적인 결실, 아미노산의 변환 또는 삽입도 포함할 수 있는, 본 명세서에 기재된 각종 변형 또는 변형의 조합을 특징으로 하고 여전히 혈전붕괴 활성을 갖는 t-PA 유사체를 포함한다. 이 군은 여러 단백질 종을 포함한다.

한 종에서는, 단백질은 Arg-275가 결실되거나 또는 다른 아미노산, 바람직하게는 리신 또는 히스티딘 이외의 아미노산에 의해 치환되어 있고, 적어도 하나의 일치 Asn-결합 글리코실화 부위가 결실되거나 또는 일치 Asn-결합 글리코실화 서열 이외의 것으로 변형되어 있는, 인간 t-PA의 펩티드 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 펩티드 서열을 특징으로 한다. 이 중의 대표적인 단백질을 하기 표 1에 나타내었다. 본 발명자들은, 본 명세서에서 사용한 "인간 t-PA의 펩티드 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 펩티드 서열을 특징으로 하는"이라는 표현에 의해, 인간 t-PA의 펩티드 서열, 또는 인간 t-PA를 코딩하는 DNA 서열 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 그에 하이브리드화 될 수 있는 DNA 서열에 의해 코딩된 펩티드 서열을 의미한다.

Arg-275 및 적어도 하나의 N-결합 글리코실화 부위에서의 변형을 포함하는 대표적인 단백질

[표 1]

J=Arg 이외의 것, 바람직하게는 Arg, His, 또는 Lys 이외의 것; R¹, R²및 R³은 각각 펩티드 결합, 아미노산, 디펩티드 또는 트리펩티드 이루어진 군에서 선택되고, R¹, R²및 R³중의 적어도 하나는 일치 N-결합 글리코실화 서열이외의 것이다;

"-", "--" 및 "---"=펩티드 결합

두번째 종에서는, 단백질은 Cly-(-3) 또는 Ser-1 부터 Thr-91까지의 N-말단 영역내에서 15 또는그 이상의 아미노산이 결실되어 있고 (a) 하나 또는 그 이상의 Asn-결합 글리코실화 부위가 임의로 결실되거나 또는 아니면 일치 Asn-결합 글리코실화 부위 이외의 것으로 변형되고, 및/또는 (b) Arg-275가 임의로 결실되거나 또는 다른 아미노산, 바람직하게는 리신 또는 히스티딘 이외의 것으로 치환되어 있는 인간 t-PA의 펩티드 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 펩티드 서열을 특징으로 한다. 이 구현예의 대표적인 단백질을 하기에 나타내었다:

N-말단 결실을 갖는 대표적인 단백질

하기 단백질은 식중 R¹, R²및 R³이 wt 트리펩티드 서열을 나타내지만 N-말단(Gly-(-3)에서 Thr-91까지)이 다음의 것으로 치환된, 표 1에 나타낸 펩티드 서열을 갖는다.

"_"는 아미노산 결실의 부위를 나타낸다.

이 종은 상술한대로 15 또는 그 이상의 N-말단 아미노산이 결실되어 있고, 하나 또는 그 이상의 Asn-결합 글리코실화 부위가 결실되거나 아니면 상술한대로 일치 Asn-결합 글리코실화 서열 이외의 것으로 변형된 단백실의 아종을 포함한다. 또한 Gly-(-3) 또는 Ser-1 부터 Thr-91까지에 이르는 영역에서 15 또는 그 이상의 아미노산이 결실되어 있고, Arg-275가 결실되거나 또는 다른 아미노산, 바람직하게는 리신 또는 히스티딘이외의 것으로 치환되어 있는 화합물의 아종도 포함된다. 이 종의 부가적인 구현예는 Gly-(-3) 또는 Ser-1 부터 Thr-91까지의 영역내에서 15 내지 약 94 아미노산이 결실되고, 하나 또는 그 이상의 Asn-결합 글리코실화 부위가 결실 또는 변형되고(예를들면 8페이지의 표를 참조) Arg-275가 결실되거나 또는 다른 아미노산에 의해 치환되어 잇는 것을 특징으로 한다. 이들 아종의 대표적인 단백질을 하기 표 2 및 2.5에 나타내었다.

이 종은 또한 N-말단 결실이 Ser-1 부터 Ser-50까지의 영역내의 15 또는 그 이상의 아미노산의 결실을 함유하는 구현예도 포함한다. 또한 Ser-1부터 Ser-50까지의 영역에서 15 또는 그 이상의 아미노산이 결실되어 있고 전술한대로 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위가 변형되어 있는 단백질의 아종도 포함된다. 또다른 아종은 Ser-1 부터 Ser-50까지의 영역내에 15 또는 그 이상의 아미노산이 결실되어 있고, Arg-275가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환되어 있는 단백질을 포함한다. 부가적으로 Ser-1 부터 Ser-50까지의 영역내에 15 또는 그 이상의 아미노산의 결실을 갖고, (a) 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위 및 (b) Arg-275가 모두 전술한대로 임의로 변형된 아종도 포함된다. 이들 아종의 대표적인 단백질을 표 2 및 2.5 뿐만 아니라 하기 표 3에 나타내었다.

N-말단에서의 1~94 아미노산의 결실, 및 Arg-275 및 적어도 하나의 N-결합 글리코실화 부위의 어느 하나 또는 둘 모두에서의 임의적인 변형 포함하는 대표적인 단백질

(전체적인 서열은 표 1을 참조)

[표 2]

*는 wt N-말단에 비해 적어도 하나의 아미노산이 다른 N-말단을 나타내고 그의 대표적인 예는 표 2.5 및 표 3∼5 및 6-B에 나타나 있으며; "#"는 펩티드 결합 또는 아르기닌 (R)이외의 아미노산을 나타내고; "-"는 펩티드 결합을 나타내고; U는 Asn, Thr 또는 Ser을 제외한 모든 아미노산이고; W는 펩티드 결합 또는 Ser을 제외한 모든 아미노산이고; Z는 펩티드 결합 또는 Thr 또는 Ser을 제외한 모든 아미노산이고; ∧는 모든 아미노산이고; wt는 야생형을 의미한다.

1~94 아미노산의 결실을 함유하는 대표적인 N-말단

N-말단지정

[표 2.5]

본 발명의 특정 단백질은 표 2의 화합물 번호, N-말단의 지정 및 위치 275의 확인을 순서대로 포함하는 3 부분 표시법에 의해 표현할 수 있다. 예를들면, 화합물 번호 2-11/N-6/Arg은 3 글리코실화 부위가 결실되어 있고("2-11", 표 2 참조), C-6에서 K-10까지 및 E-32에서 C-43까지가 결실되어 있고(N-말단 #N-6) Arg-275가 보유되어 있는 단백질을 표시한다.

Ser-1 부터 Ser-50까지의 영역내에 15-∼45 아미노산의 결실, 및 (a) Arg-275 및 (b) 적어도 하나의 N-결합 글리코실화 부위중 하나 또는 모두에서의 변형을 갖는 대표적인 단백질

(전체적인 서열은 표 1을 참조)

대표적인 단백질은 표 2에 정의된 바와 같지만, Gly-(-3) 부터 Thr-91까지의 야생형 (wt)서열이 하기 N-말단으로 치환되어 있다.

N-말단 지정

[표 3]

표 3에 묘사된 변형된 N-말단에 관해서, 15 이상의 아미노산이 S-1 부터 S-50까지의 영역에서 결실될수 있음을 이해해야 한다. 다수의 아미노산이 결실되는 경우에, 이들은 서로 인접해 있거나 또는 하나 또는 그 이상의 아미노산에 의해 떨어져 있을 수 있다.

이러한 N-말단으로 화합물을 표시하는데 있어서, 본 발명자들은 결실의 크기를 "△n"("n"은 결실된 아미노산의 수이다)으로 지시하였다. 예를들면 표 3에 나타낸 바와 같이 15 아미노산이 결실되어 있는 N-말단 #24는 "N-24△15"로 표현될 수 있다. 예를들면 S-1에서 Q-16까지의 16 아미노산이 결실된 경우에는, N-말단은 "N-24△16"으로 표현된다. 결실의 조합이 이루어진 경우에는, 예를들면 S-1, Y-2 및 I-5가 결실된 경우에는, N-말단은 "N-△1,2,5"로 표현될 수 있다. 표 2.5의 아래에 있는 본문에서 나타낸 대로, 특정 화합물은 표 2의 화합물 번호, N-말단 #의 지정(예를들면 표 2.5) 및 위치 275의 상태 확인을 차례로 포함하는 3 부분 코드로 표시된다. 그러므로 화합물 2-26/N-24△15, N-50△15/-는 세개의 모든 글리코실화 부위; R-275; S-1 부터 Y-15까지 및 R-27 부터 A-41까지가 결실되어 있는 단백질을 표시한다.

본 발명은 덧불여 하나 또는 그 이상, 예를들면 1∼45 아미노산이 Cys-51 부터 Thr-91까지의 영역에서 결실되어 있는 단백질 종을 포함한다. 한 아종에서는, Cly-(-3) 또는 Ser-1 부터 Ser-50까지의 영역내에서도 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실되어 있다. 특정 구현예에서, 이 종의 단백질은 Arg-275가 결실되거나 다른 아미노산, 바람직하게는 리신 또는 히스티딘 이외의 것으로 치환되어 있도록 더 변형된다. 다른 구현예에서는, 이 종의 단백질은 Arg-275에서의 변형 대신에 또는 그 변형에 덧붙여, (a) 전술한대로, 하나 또는 그 이상의 N-결합 글리코실화 부위가 소실되고/되거나 (b) 하나 또는 그 이상의 아미노산이 Gly-(-3) 부터 Ser-50까지의 영역에서 결실되도록 변형된다. 이 아종의 대표적인 단백질은 표 2 및 3에 묘사된 것들과 비슷하지만, 하기 표 4에 나타낸 것과 같은 N-말단을 포함한다.

Cys-51 부터 Thr-91까지의 영역에서 1-∼41 아미노산의 결실을 갖는 대표적인 단백질

(전제적인 서열은 표 1을 참조)

대표적인 단백질은 표 2에 정의된 바와 같지만 Gly-(-3) 부터 Thr-91까기의 야생형 (wt)서열이 하기 N-말단으로 치환되어 있다.

N-말단 지정

[표 4]

상기 표 4와 관련하여, 여러 서브클래스의 단백질이 기재되어 있음에 유의해야 한다. 예를들면, Cys-51부터 Asp-87까지에서 1-37 아미노산의 결실(개별적으로, 연속적으로 또는 조합하여)을 함유하는 단백질이 묘사되어 있고, Cys-51 부터 Arg-87까지에서의 1-37 아미노산의 결실 및 Cly-(-3) 부터 Cys-51까지의 영역내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 결실을 함유하는 단백질(참고 N-76)이 묘사되어 있다. N-말단 N-76 부터 N-111까지에서 선택된 N-말단을 함유하는 화합물에 관해서는, 하나 이상의 아미노산이 결실될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들면, 표 4에 나타낸대로 한 아미노산이 결실되어 있는 N-77은 "N-77△1"으로 표현할 수 있다. 예를들면 S-52 부터 F-57까지의 여섯 아미노산이 결실되어 있는 경우에, N-말단은 "N-77△6"으로 표현된다. 특정 화합물은 하기 표 2 및 3에 기재된대로 표시된다. 세 글리코실화 부위 및 Arg-275가 결실되어 있는 예를 다음에 나타내었다:

글리코실화 부위에는 변형이 없지만 각종 결실을 포함하는 대표적인 화합물을 다음에 나타내었다:

상술한 것과 동일한 결실을 갖기만, Asn-117이 Gln으로 치환됨으로써 첫번째 N-결합 글리코실화 부위가 변형되어 있는 대표적인 화합물을 다음에 열거하였다.:

2-1/N-424/Arg

2-1/N-425/Arg

2-1/N-426/Arg

2-1/N-427/Arg

2-1/N-428/Arg

2-1/N-63 2, N-92 3/Arg

2-1/N-63 1, N-92 2/Arg

2-1/N-63 1, N-92 1/Arg

상술한 것과 동일한 결실을 갖지만, Asn들이 Gln들로 치환됨으로써 세개의 모든 글리코실화 부위가 변형되어 있는 대표적인 화합물을 다음에 열거하였다:

2-7/N-424/Arg

2-7/N-425/Arg

2-7/N-426/Arg

2-7/N-427/Arg

2-7/N-428/Arg

2-7/N-63 2, N-92 3/Arg

2-7/N-63 1, N-92 2/Arg

2-7/N-63 1, N-Arg 92 1/Arg

그러므로, 본 발명은 약 20 아미노산 미만의 하나 또는 그 이상의 결실이 Cly-(-3) 부터 Thr-91까지의 영역내에 존재하는 단백질의 아종을 더 포함한다. 이 아종의 단백질은 Arg-275에서 및/또는 하나 또는 그 이상의 Asn-결합 글리코실화 부위에서 변형될 수 있다. 이 아종의 대표적인 단백질은 표 2 내지 4에 묘사된 것과 비슷하지만, 야생형 N-말단 대신에 하기 표 5에 나타낸 것과 같은 N-말단을 포함한다. 이 아종의 부가적인 대표적 화합물은 또 3-부분 코드 표시법에 의해 상기에 열거되어 있다.

또 다른 종에서, 단백질은 Gly-(-3) 또는 Ser-1 부터 Thr-91까지의 영역내의 아미노산 1-94가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 인간 t-PA의 펩티드 서열과 실질적으로 동일한 펩티드 서열을 특징으로 한다. 이 종은 상술한 N-말단내의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환 및 전술한 대로 Arg-275에서의 변형을 특징으로 하는 화합물을 포함한다. 또한 N-말단내의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 상기 치환 및 전술한 대로 하나 또는 그 이상의 일치 Arg-결합 글리코실화 부위에서의 변형을 특징으로 하는 화합물의 아종도 포함된다. 이 구현예의 또 다른 아종은 N-말단내의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환 및 전술한 대로 Arg-275 및 하나 또는 그 이상의 N-결합 글리코실화 부위 모두에서의 변형을 특징으로 한다. 특정 구현예에서는 Arg-275 및/또든 하나 또는 그 이상의 N-결합 글리코실화 부위에서의 변형과 함께 또는 변형 없이 Cly-(-3) 또는 Ser-1 부터 Ser-50까지의 영역내에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환된다. 다른 구현예에서는, 다시금 Arg-275 및/또는 하나 또는 그 이상의 N-결합 글리코실화 부위에서의 변형과 함께 또는 변형없이 Cys-51 부터 Thr-91까지의 영역내에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환되어 있다. 또 다른 측면에서는, 다시금 다른 상기 변형과 함께 또는 변형 없이 하나 또는 그 이상의 하기 영역내에서 1 내지 약 11, 바람직하게는 1 내지 약 6 아미노산이 치환되어 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서는, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 하나 또는 그 이상의 하기 영역내에서 치환되어 있다: R-7 내지 S-20, W-21 내지 Y-33, N-37 내지 Q-42, 및 H-44 내지 S-50. 이 구현예의 부가적인 측면에서는 하나 또는 그 이상의 상기 정의된 영역내에서 1 내지 약 1l, 바람직하게는 1 내지 약 6 아미노산이 변환됨으로써 N-말단이 다시 변형되고, 1 내지 93, 바람직하게는 1 내지 45, 및 보다 바람직하게는 1 내지 약 15 아미노산의 결실에 의해 더 변형되어 있다.

대표적인 아미노산 변환을 하기 표 6-A에 나타내었으며, 대표적인 단백질은 표 6-B에 표시하였다. 표6-A에 나타낸 R-40, A-41 및 Q-42에 대한 치환 아미노산 중에서, R-40에 있어서는 S가 바람직한 치환이고, A-41 및 Q-42에 대해서는 각각 V 및 L이 바람직한 치환이다. 표 6A의 R-40, A-41 및 Q-42에 대해 확인된 변환을 포함하는 본 발명의 단백질은 현재는 바람직하게는 단독이거나 또는 이 구현예의 다른 측면 및 아종에서 처럼 다른 변환(들) 및/또는 N-말단내의 결실, 및/또는 R-275 및/또는 적어도 하나의 글리코실화 부위에서의 변형들과 조합되어 있다. 어느 정도까지는 본 발명의 단백질이 결실보다는 변환에 의해 변형되고, 본 발명의 단백질이 더 많은 천연 t-PA 구조를 유지하고 그의 바람직한 생물학적 활성중 더 많은 것을 선택적으로 유지한다고 생각된다.

Cly-(-3) 부터 Thr-91까지의 영역내에 ∼20 미만의 아미노산의 하나 또는 그 이상의 결실을 갖는 대표적인 단백질

(전체적인 서열은 표 1을 참조)

대표적인 단백질은 표 2에 정의된 바와 같지만, Cly-(-3) 부터 Thr-91까지의 야생형 (wt)서열이 하기 N-말단으로 치환되어 있다.

N-말단 지정

[표 5]

대표적인 아미노산 변환

[표 6-A]

Gly-(-3) 부터 Thr-91까지기의 영역내에 하나 또는 그 이상의 아미노산의 변환을 포함하는 대표적인 단백질

(전체적인 서열은 표 1을 참조)

대표적인 단백질은 표 2에 정의된 바와 같지만, Cly-(-3) 부터 Thr-91까지의 야생형 (wt)서열이 하기 N-말단으로 치환되어 있다

N-말단지정

[표 6-B]

아미노산 변환(들)을 포함하는 본 발명의 단백질은 상술한대로 3 부분 코드로 표시할 수 있다. 물론 하나 이상의 wt 아미노산이 치환될 수 있음을 이해해야 한다. 화합물을 이러한 N-말단으로 표시하는데 있어서, 본 발명자들은 변환의 수를 "Sn"("n"은 예를 들면(거기에 국한되는 것은 아니지만) 표 6-A에 표시한 것 같은 치환 아미노산에 의해 치환된 아미노산의 수이다)으로 나타내었다. 예를들면, N-말단 #N-122s1은 표6-B에 묘사한 것과 같은 N-말단을 표시하고, N-말단 #N-122s4는 S-1이 G로 치환되고 하기 세 wt아미노산이 다른 아미노산들로 치환된 N-말단을 표시한다. 다수의 아미노산 변형을 포함하는 이 구현예의 단백질은 다음과 같이, 특정 치환을 지시하는 일렬의 N-말단 지정으로 표시할 수 있다:

다수의 N-말단 변형, Cln으로 치환된 Asn-117 및 Thr로 치환된 Arg-275를 갖는 대표적인 화합물:

특히 흥미있는 한 아종은 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위 및/또는 Arg-275에서의 상술한 것과 같은 변형과 함께 또는 변형 없이 Cly-(-3) 부터 L-66까지의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 임의로 결실 및/또는 변환되어 있고, Y-67 부터 S-69까기의 하나 또는 그 이상이 치환되어 있음을 특징으로 한다.

본 발명의 한 측면에서는, 단백질은 포유동물의 당단백질의 특징이 되는 적어도 하나의 소위 "복합 탄수화물"당 부위를 포함한다. 하기에 보다 상세히 설명되는 대로 이러한 "복합 탄수화물"당단백질은 목적 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 분자를 포유동물 숙주 세포내에서 형질 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 적절한 포유동물 숙주 세포 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생산 및 정제의 방법은 당 분야에 공지되어 있다.[예를들면, Gething and Sambrook, Nature 293:620~625(1981), 또는 Kaufman et al., Molecular and (Cellular Biology 5(7):1750~1759(1985) 또는 Howley et al., 미합중국 특허 제4,419,446호를 참조].

본 발명의 또 다른 측면은 포유동물 유래 t-PA를 포함하여, 각 탄수화물 부위가 포유동물의 당단백질의 특징인 "복합 탄수화물"변환과는 대조적으로 곤충 세포-생산 당단백질의 특징인 최초 돌리콜-결합 올리고당류의 가공된 형태인 상기에 정의된 t-PA 변형체를 포함한다.

이러한 곤충 세포형 글리코실화는 단순화를 위해 "고 만노스"탄수화물로 표기된다. 이러한 기재에 있어서, 복합 및 고 만노스 탄수화물은 문헌[Kornfeld et al., Ann. Rev. Biochem. 54:631~64(1985)]에 정의된 대로이다. 본 발명에 따른 "고 만노스"변형체는 적어도 하나의 점유된 N-결합 글리코실화 부위를 갖는 상술한 것과 같은 변형 폴리펩티드중축을 특징으로 한다. 이러한 변형체는 변형체를 코딩하는 DNA 서열을 곤충 숙주 세포내에서 형질 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 이 측면을 실시하는데 유용한 형질전환/형질감염, 곤충세포배양, 스크리닝 및 생성물 생산 및 정제를 위한 방법 및 물질 뿐만 아니라 적절한 곤충 숙주 세포는 당 분야에 공지되어 있다. 이렇게 해서 생산한 당단백질은, 본 발명의 이 측면의 변형체가 탄수화물 부위에 말단 시알산 또는 갈락토스 치환체를 갖지 않고 또 포유동물 유래 당단백질의 특징인 다른 단백질 변형을 포함하지 않는다는 점에서 천연의 t-PA 및 지금까지 재조합 공학 기술에 의해 포유동물 세포내에서 생산된 t-PA와는 다르다.

N-결합 탄수화물 부위를 포함하지 않는 본 발명의 단백질은 목적 변형체, 예를들면 표 1의 화합물 1-6 내지 1-11을 코딩하는 DNA 분자를 포유동물, 곤충, 효모 또는 세균 숙주 세포(현재로서는 진핵 숙주 세포가 바람직하다)내에서 형질 발현시킴으로서 생산할 수 있다. 상기에서 지적한대로, 본 발명의 이 측면을 실시하는데 유용한 형질전환/형질감염, 세포배양, 스키리닝 및 생성물 생산 및 정제를 위한 방법 및 물질 뿐만 아니라, 적절한 포유동물 및 곤충 숙주 세포, 및 또 적절한 효모 및 세균 숙주 세포도당 분야에 공지되어 있다.

덧붙여, 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백하게 나타나듯이, 본 발명은 Gly-3 또는 Ser₁부터 Thr₉₁까지의 영역내의 아미노산 결실을 특징으로 하는 것이 아니라, 특히 Arg7 부터 Ser₅₀까지의 영역내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형, 또는 결실 및 변환의 조합을 특징으로 하는 다른 t-PA 변형체도 포함한다. 이들 화합물을 코딩하는 cDNA는 예를 들면 적절한 변이발생 올리고누클레오티드를 이용하는 본 명세서에 기재한 변이발생 공정과 아주 유사한 방법에 의해 쉽게 제조할 수 있다. cDNA는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 R¹, R²및 R³에 대한 코돈의 하나 또는 그 이상, 및/또는 Arg-275에서 임의로 변이될수 있으며, 형질 발현 벡터내에 삽입되고 숙주 세포내에서 발현될 수 있다. 이들 단백질은 본 발명의 다른 화합물의 유리한 약학역학적 특성을 공유하고, 아마도 본 명세서에 기재된 것과 유사한 약학 제제의 투여시에 부당한 항원성을 나타내지 않을 것으로 생각된다.

전술한 바에 의해 명백하듯이, 본 발명의 모든 변형체는 천연의 인간 t-PA에 비해 잠재적인 글리코실화부위를 적게 포함하거나 또는 포함하지 않고 및/또는 Arg-275의 결실 또는 치환을 포함할 수 있는 유사체를 코딩하는 DNA 서열을 이용하는 재조합 기술에 의해 제조된다. 이러한 DNA 서열은 t-PA를 코딩하는 DNA 서열의 공지의 부위 지향성 변이유발에 의해 제조할 수 있다.

t-PA를 코딩하는 DNA 서열은 클로닝되고 특성지적되어 있다[예를들면, D. Pennica et al., Nature(London) 301:214(1983) 및 R. Kaufman et al., Moi Cell. Biol. 5(7):1750(1985) 참조]. 혈전 붕괴 활성을 갖는 t-PA 유사체를 코딩하는 한 클론인 ATCC 39891은 245 위치에 Va1이 아닌 Met 잔기를 포함한다는 점에서 독특하다. 전형적으로, DNA 서열은 프로세스된, 즉 숙주 세포에 의해 인지 및 제거되고, Gly. Ala.Arg.Ser.Tyr.Gln..으로 시작되는 풀 랭쓰 단백질의 아미노산 잔기로 이어지는 리더(leader) 서열을 코딩한다. 배지 및 DNA 서열이 발현되는 숙주 세포에 따라, 이렇게 제조되는 단백실은 Gly.Ala.Arg 아미노 말단으로 시작되거나 또는 처음의 세 아미노산 잔기가 단백질 본해에 의해 제거되도록 더 프로세스될 수 있다. 후자의 경우에, 성숙 단백질은 Ser.Tyr.Gln.Leu..을 함유하는 아미노산 말단을 갖는다. 둘중의 한 아미노말단을 갖는 t-PA 변형체는 혈전 붕괴 활성을 갖고 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따른 변형체는, 아직 혈전 붕괴 활성을 유지하는, 예를들면 대립 형질 변형 또는 다른 아미노산 변환 또는 결실을 갖는 다른 병형체 뿐만 아니라 Met₂₄₅또는 Val₂₄₅를 갖는 단백질도 포함한다.

본 발명은 또한 Asn-218 부터 Thr-220까지에 결쳐있는 폴리펩티드 도메인내에 변형을 더 포함하는 상술한 화합물도 포함한다. 특히, 이 구현예의 화합물은 218 위치에서의 Asn 이외의 아미노산 또는 펩티드 결합 및/또는 219 위치에서의 Pro 이외의 아미노산 또는 펩티드 결합 및/또는 220 위치에서의 Ser 또는 Thr 이외의 아미노산 또는 펩티드 결합을 더 특징으로 한다. 그러므로 이 구현예의 화합물은 흑색종-유래 포유동물 세포에 의해 생산되는 t-PA에서는 전형적으로 글리코실화 되어 있지 않은 일치 N-결합 글리코실화부위가 결손되어 있다.

상술한 대로, 본 발명의 개개의 변형체를 코딩하는 DNA 서열은 인간 t-PA 또는 그의 유사체 또는 변형체를 코딩하는 DNA 서열의 공지의 부위 지향성 변이 유발에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변이 유발 방법은 단일 가닥 DNA를 이용하는 졸러 및 스미쓰[Zoller and Smith, Nucleic Acids Res. 10:6487∼6500(1982); Methods Enzymol. 100:468-500(1983); 및 DNA 3:479∼488(1984)]의 M13계 및 이종이중가닥 DNA를 이용하는 모리나가 등[Morinaga et al., Bio/technology, 636-639(1984년 7월)]의 방법을 포함한다. 이러한 방법에 따라 N-말단에서의 결실을 실시하거나 또는 아스파라긴 잔기를 트레오닌 또는 글루타민으로 전환시키는데 이용되는 몇몇 대표적인 올리고누클레오티드를 표 7에 나타내었다. 물론, 본 발명의 각각의 당단백질을 코딩하는 DNA는 당 분야의 숙련된 자에 의해 적절히 선택된 올리고누클레오티드(들)을 이용하는 부위 지향성 변이 유발을 통해 비슷하게 제조될 수 있음을 이해해야 한다. 포유동물, 효모, 세균 또는 곤충 숙주 세포계에서의 공지방법에 의한 DNA의 형질 발현은 목적 변형체를 생산시킨다. 현재로선 포유동물 형질 발현계 및 그에 의해 얻어지는 변형체가 바람직하다.

본 명세서에 기재된 포유동물 세포 형질 발현 벡터는 당 분야의 숙련된 자에게 주지된 기술에 의해 합성할 수 있다. 세균 레플리콘(replicon), 선택유전자, 인헨서(enhancer)프로모터 같은 벡터의 성분은 천연원으로부터 얻거나 또는 공지 공정에 의해 합성할 수 있다[Kaufman et al., J. Mol. Biol., 159:51~521(1982); Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:689~693(1985) 참조].

형질 전환된 세포주를 포함하는 확립된 세포주가 숙주로서 적절하다. 정상 2배체 세포 일차 조직의 시험관내 배양에 의해 유도된 세포 균주 뿐만 아니라 일차 체외이식조직(조혈 간세포 같은 상대적으로 미분화된 세포를 포함)도 적절하다. 후보 세포는 선택 유전자가 우세하게 작용하는 한 선택 유전자가 유전자형적으로 결핍되어 있을 필요는 없다.

숙주 세포는 바람직하게는 확립된 포유동물 세포주이다. 공지방법에 의해, 벡터 DNA를 염색체 DNA에 안정하게 통합시키고, 그 다음에 통합된 벡터 DNA를 증폭시키기 위해서는, 현재로선 CHO(Chinese hamster Ovary) 세포가 바람직하다. 한편, 벡터 DNA는 소 유두종 비루스 게놈(Lusky et al., Cell. 36:391∼401(1984))의 전부 또는 일부를 함유할 수 있고 C127 생쥐 세포같은 세포주내에 안정한 에피좀 요소로서 보유될 수 있다. 다른 유용한 포유동물 세포주는, 거기에 국한된 것은 아니지만, HeLa, COS-1 원숭이 세포, 생쥐 L-929 세포, 스위스, Balb-c 또는 NIH 생쥐에서 유래된 3T3주, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주 등을 포함한다.

그 다음, 생성물의 발현을 위해 안정한 형질전환체를 표준면역 또는 효소 분석법에 의해 스크리닝한다. 변형 단백질을 코딩하는 DNA의 존재는 서던 블롯팅 같은 표준 방법에 의해 검출할 수 있다. 형질 발현 벡터 DNA를 COS-1 원숭이 세포같은 적절한 숙주 세포내에 도입시킨 후 며칠동안에 변형체를 코딩하는 DNA가 일시적으로 형질 발현되는 것은 배양 배지내의 단백질의 활성 또는 면역학적 분석법에 의해 선택없이 측정한다.

세균 형실 발현의 경우에 있어서, 변형체를 코딩하는 DNA는 당 분야에 공지되어 있는대로 세균 형질 발현을 위한 다른 코돈을 함유하도록 더 변형될 수 있으며, 바람직하게 하는 분리 리더 폴리펩티드를 코딩하는 누클레오티드 서열에 프레임을 이루어 기능적으로 결합되어 있다. 포유동물, 곤충, 효모 또는 세균 숙주 세포내에서 발현된 화합물은 회수되고, 정제되고/되거나 물리화학적, 생화학적 및/또는 임상학적 변수로서 특징지워질 수 있으며, 이들 모두는 공지방법에 의해 행해진다.

이들 화합물은 인간 t-PA를 향한 단일클론성 항체에 결합되어 있는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이러한 항체를 이용하는 면역 친화력 크로마토그래피에 의해 회수 및 또는 정제될 수 있다. 덧붙여, 이들 화합물은 t-PA형 효소 활성을 갖는다. 즉, 본 발명의 화합물은 당 분야에 공지된대로 플라스민 발색성 기질 S-2251을 이용하는 간접 분석법으로 측정했을때 섬유소의 존재하에 플라스미노겐을 효과적으로 활성화하여 섬유소 용해를 일으킨다.

본 발명은 또한, 약학적으로 허용되는 비경구적 담체와 혼합된, 치료학적으로 유효한 양의 상기 변형체를 함유하는 혈전 붕괴 치료용 조성물로 포함한다. 이러한 조성물은 인간 t-PA에 대해 기재된 것과 동일한 방법으로 사용할 수 있으며, 인간 또는 개, 고양이 및 혈전성 심장 혈관 질환의 대상이 되는 것으로 알려진 다른 포유동물 같은 하등동물에 있어서 유용하다. 조성물은 혈전 상태를 치료하고 바람직하게는 예방하는데 모두 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 정확한 투약량 및 투여방법은 약제의 작용을 변화시키는 각종 인자, 예를들면 체중, 성별, 식이요법, 투여시간, 약제의 조합, 반응 민감도 및 특정 경우의 심각성 뿐만 아니라 특정 화합물의 효력 및 약학역학적 프로필에 따라 주치의에 의해 결정될 것이다.

하기에는 본 발명의 구현예를 설명하기 위한 것이다. 이들 예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명은 첨부된 특허청구의 범위에 기재된 것 이외에는 이들 예에만 국한되는 것으로 간주되어서는 않된다.

곤충 세포 형질 발현을 포함하는 각 예에 있어서, 사용된다면 성비루스증 비루스는 오토그라파 캘리포니카(Autographa Californica)의 L-1 변이주이며, 사용된 곤충 세포주는 스포도프테라 프루기페르다(spodoptera frugiperda) IPLB-SF 21 세포주(Vaughn, J. L. et al., In Vitro(1977) 13, 213~217)이다. 세포 및 비루스 조작은 문헌에 상술된 것과 동일하다(Pennock G. D., et al., 상동: Miller, D. W., Safer, P., and Miller, L. K., Genetic Engineering, Vol. 8, pages 277~298, J. K. Setlow and A. Hollaender, eds. Plenum Press, 1986). RF m13 벡터, mp18 및 mp11은 시판품이다(new England Biolabs에서 구입가능). 그러나, 본 발명이 속한 분야의 통상의 지식을 가진자는, 상술한 대로, 관련 cDNA를 함유하는 다른 비루스, 균주, 숙주 세포, 프도모터 및 벡터도 본 발명의 각 구현예를 실시하는데 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 이용된 DNA 조작은 특별히 언급되지 않는한 마니아티스 등의 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Sping Harbor, NY 1982)]에 따른다.

변이유발을 위한 대표적인 올리고누클레오티드

[표 7]

* 괄호안에 지시된 돌연변이를 스크리닝하는데 사용됨(스크리닝 올리고누클레오티드가 지시되어 있지 않은 경우에는, 변이유발 및 스크리닝을 위해 동일한 올리고누클레오티드를 사용한다). 치환 아미노산의 코돈은 밑줄을 쳤고, ▲는 결실 부위를 나타낸다. 당 분야의 숙련된 자가 알게 되듯이, 올리고누클레오티드중의 목적 치환 아미노산의 코돈(돌)을 결실시키거나 또는 코돈을 변환함으로써 목적 부위에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 결실시키거나 다른 아미노산을 삽입(즉, 치환)하는데 사용하기 위해 올리고누클레오티드를 쉽게 제작할 수 있다. 다른 변이유발 올리고누클레오티드는 목적 부위에 걸쳐 있는 대략 20-50 누클레오티드 서열을 기준으로 하여 바꾸고자 하는 원래의 코돈(돌)을 치환하거나 결실시킴으로써 설계할 수 있다.

플라스미드 유도

각종 아미노산을 위한 코돈에서의 cDNA의 변이유발을 졸러 및 스미쓰의 방법에 의해 M13 플라스미드내에서 cDNA의 적절한 제한 단편을 이용하여 행한다. cDNA내의 결실은 M13 벡터 내에서 cDNA의 적절한 제한 단편, 예를들면, Sac I 단편을 이용하는 루프아웃(loopout) 변이유발 또는 플라스미드 pSVPA4 내에서 이종이중가닥 루프-아웃에 의해 행한다.

플라스미드 pSVPA4를 제작하여 포유동물 세포내에서의 t-PA 당단백질의 형질발현을 가능하게 한다. 이 플라스미드는 처음에 플라스미드 pspLT5(Zhu, A. et al,. 1984, J. Virology 51:170~180)로부터 SV40의 큰 T 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 제거하여 만든다. 이것은 전체 Xho1소화 후에 부분적인 Bam-H1 제한 엔도누클레아제 소화를 행함으로써 달성된다. 플라스미드 J205(ATCC No. 39568)을 SalⅠ 및 BamH1도 소화시켜 분리한 점착성 Sall/Bamh1 t-PA 코딩 제한 단편을 상술한 대로 제조한 모(parent) Xho1/BamH1 절단 벡터에 연결시킴으로써 pspLT5 중의 SV40 큰 T 코딩 영역을 인간 t-PA-코딩 서열로 치환한다. 결과적으로, 포유동물 세포내에 도입했을때 t-PA는 SV40 레이트 프로모터(late promoter)의 통제하에 상기 벡터내에서 전사될 것이다. 이 최종 생성물을 pSVPA4로 명명한다.

플라스미드 pLDSG는 CHO 세포같은 포유동물 세포내에서 t-PA를 형질 발현시키기 위한 증폭성 벡터이다. pLDSG는 아데노비루스형 2 메이저 레이트 프로모터(MLP), 원숭이 비루스 40(SV40) 인헨서 및 복제 오리진, SV40 레이트 프로모터(아데노비루스 MLP와 동일한 방향으로 있음), 테트라사이클린 내성을 코딩하는 유전자 및 아데노비루스형 2MLP에 대하여 적절한 방향으로 있는 인간 t-PA(Met-245)를 코딩하는 cDNA용 이용하는 생쥐 DHFR cDNA 전사 단위를 포함한다. pCVSVL2(ATCC No. 39813) 및 t-PA코딩 cDNA로부터 pLDSG를 제조하는 것은 CHO 세포내에서의 pLDSG와의 공동형질전환 및 증폭을 갖는것으로서 상세히 설명되어 있다[Kaufman et al., Mol. and Cell. Bio. 5(7):1750~1759(1985)].

플라스미드 pWGSM은 cDNA 삽입물이 Val-245 인간 t-PA를 코딩하는 점을 제외하고 pLDSG와 동일하다. pWSGM 또는 기능적으로 등가인 플라스미드는 부위 지향성 변이유발을 이용하여 pLDSG로부터 제조할 수 있다. 본 명세서 전반에 걸쳐서, pWGSM 및 pLDSG는 상술한 대로 전자의 벡터가 Va1-245 단백질을 생산하고 후자의 벡터가 Met-245 단백질을 생산함에도 불구하고 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

pIVPA/1(ATCC No. 39891)은 t-PA-코딩 cDNA를 함유하는 바큘로비루스성 전위(baculoviral transplacement)벡터이다. PIVPA/1 및 그의 돌연변이 유도체는 cDNA가 바클로비루스 폴리헤드린 프로모터의 전사 통제하에 있도록 목적 cDNA를 바큘로비루스 게놈에 삽입하는데 사용된다.

이종이중가닥 변이유발

t-PA 형질 발현 플라스미드인 pSVPA4 중의 특정 부위의 이종이중가닥 DNA를 통한 변이유발은 다음의 단계를 포함한다:

암피실린 민감성 pSVPA4 DNA의 제조

1. Pvu I을 이용하여 플라스미드 pSVPA4(15㎍)를 완전히 직선화한다. 이 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 0.1M NaCl이 존재하는 에탄올 2 부피를 이용하여 DNA를 침전시킨다.

2. DNA를 21μl의 물, dNTB 용액(2mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP 함유), 2.5μl의 10X 닉크 번역 완충액(0.5M 트리스-Cl pH 7.5, 0.1M MgSO₄, 10mM DTT, 500㎍/ml) 및 0.5μl(2단위) DNA 폴리머라제 I-큰 단편(New England Biolabs)에 재현탁시킨다. 이 혼합물을 실온에서 30분간 보온한 후, 상술한 대로 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다.

3. 75μl 물을 가하여 침전 DNA를 0.2㎍/μl로 재현탁시킨다.

암피실린 내성 pSVPA4 DNA의 제조

1. 플라스미드 pSVPA4를 t-PA 코딩 서열내에서 2회 절단하여 두 제한 단편, 1.4kbp t-PA 코딩 제한 단편 및 모 벡터를 생산해내는 Sac I 을 이용하여 상기 플라스미드(15㎍)를 소화한다. 제한 소화 후에, 1μl(28 단위)의 송아지 소장 알칼리성 포스파타제(Boehringer Mannheim)를 가하고 37℃에서 5분간 보온한다. 이 혼합물을 0.7% 아가로스 겔에 로딩하여 두 밴드를 분리한다. 모 벡터 제한 단편을 겔에서 절취하고 4℃에서 이산화 실리카에 흡착시켜 추출하고, 50mM 트리스/1mM EDTA로 37℃에서 30분간 용출시킨다. 용출된 DNA를 0.2㎍/μl의 최종농도로 조정한다.

이종이중가닥 어닐링

1. 6μl(1.2㎍)의 암피실린 민감성 pSVPA4 DNA와 6μl(1.2㎍)의 암피실린 내성 pSVPA4 DNA를 혼합한다.

2. 등 부피(12μl)의 0.4M NaOH를 가한다. 실온에서 10분간 보온한다

3. 4.5 부피(108μl)의 0.1M 트리스-Cl pH 7.5/20mM HCl을 천천히 가한다.

4. 50 피코몰(5μl)의 포스포릴화된 변이유발성 올리고누클레오티드를 45μl의 이종이중가닥 혼합물이 가한다.

5. 이 혼합물을 68℃에서 2시간동안 보온한 후 천천히 실온으로 냉각한다.

변이유발

1. 이종이중가닥 혼합물에 7μl를 가하여 각 변이유발 반응을 하기 농도로 조정한다. 2mM MgCl/0.2mM ATP/60μM dATP, dTTP, dGTP, dCTP/4mM DTT/40 단위/ml 이.콜리 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편(B.R.L.), 200 단위/ml T4 DNA 리가제(N.E.B).

2. 반응 혼합물으 페놀/클로로포름으로 추출한 후 에탄올로 침전시킨다. 침전된 DNA를 12μl의 50mM 트리스-Cl/1mM EDTA에 재현탁시킨다. 이중 4μl를 콤피텐트(competent) HB101 세균을 형질 전환하는데 사용한다.

3. 5X SSC, 0.1% SDS, 5X 덴하르트 시약 및 100μg/ml 변성 연어 정자 DNA에 용해시킨 32p-표지화스크리닝 올리고누클레오티드 1×10⁶cpm/ml를 이용하여 암피실린 내성 콜로니를 스크리닝한다.

4. 필터를 올리고누클레오티드 탐침의 계산된 융해 온도인-5°의 온도에서 5X SSC, 0.1% SDS로 세척한다.

5. 양성 하이브리드화된 클론으로부터 DNA를 제조하고 서로 다른 제한 효소를 이용한 소화 및 아가로스겔 전기영동에 의해 최초로 분석한다. DNA를 니트로셀룰로스에 옮기고 필터를 제조하고 변이유발 올리고누클레오티드가 올바른 단편내에 도입된 것을 보장하기 위해 스크리닝 탐침에 하이브리드화 한다.

6. DNA를 이 콜리내에 재형질 전환시키고, 스크리닝 올리고누클레오티드에 대한 하이브리드화에 대하여 암피실린 내성 콜로니를 스크리닝한다.

7. 최종 돌연변이를 DNA 시퀀싱(생거, Sanger)에 의해 확인한다.

돌연변이된 cDNA의 제조: M13법

하기의 도식적 제한 기도는 특징 엔도누클레아제(아래에 표시)에 대해 표시된 절단 부위를 갖는 인간 t-PA를 코딩하는 cDNA(위)를 설명한다:

개시 코돈인 ATG 및 (a), R¹, R²및 R³을 코딩하는 cDNA 영역이 표시되어 있다. 그러므로, N-말단에서의 변이유발은 예를들면 Sac I 단편 또는 BglII/Nar I 단편을 이용하여 행할 수 있다. Arg-275 및/또는 R¹및/또는 R²에서의 변이유발은 예를들면 Sac I 단편 또는 BglII/Sac I 단판을 이용하여 행할 수 있다. R³에서의 변이유발은 EcoR I/Xma 또는 EcoRI/APaI 단편을 이용하여 행할 수 있다. 제한 단편의 선택은 변이유발 및/또는 형질 발현 벡터 제작용의 특정 벡터를 이용하는 편의에 따라 결정할 수 있다.

일반적으로, 돌연변이 시키고자 하는 cDNA 제한 단편을 지시된 엔도누클레아제 효소(들)을 이용하여 예를들면 pWGSM, pIVPA/1 또는 pSVPA4에 존재하는 풀-랭쓰(full-length) cDNA로부터 절취한 후 예를들면 표 7에 나타낸 올리고누클레오티드 또는 목적 변이유발을 위해 설계된 다른 올리고누클레오티드를 이용하여 돌연변이시킬 수 있다.

이렇게 하여 제조할 수 있는 대표적인 돌연변이 된 cDNA 단편을 하기 표 8에 나타내었다.

대표적인 돌연변이된 cDNA 단편

[표 8]

*는 변이유발의 부위를 나타낸다; cDNA 단편 I 내지 Ⅳ는 pWGSM 또는 pSVPA4를 Sac I 으로 소화시키고, Sac I 단편을 M13 벡터내에 삽입하고, 목적 올리고누클레오티드(들)로 변이시키고, 돌연변이된 M13/t-PA DNA를 Sac I 으로 소화시킴으로써 제조한다; 한편으로는, I∼Ⅳ를 돌연변이 M13/t-PA로부터 BglII 및 Sac I 을 이용하여 절취해내고, N-말단, R¹, R²및 Arg-275에 결쳐있는 펩티드 도메인을 코딩하는 BglII/Sac I 단편을 BglII/Sac I -소화 pIVPA에 삽입할 수 있다. cDNA 단편 V는 하기 실시예에 2에 기술한 대로 제조한다.

변이유발 후에, 변이유발을 더 행하거나 또는 행하지 않고 단편을 M13 벡터로부터 절취해내고 M13 벡터로부터 돌연변이 단편을 절취하는데 사용했던 것과 동일한 효소(들)에 의해 미리 절단된 풀-랭쓰 또는 부분 cDNA를 함유하는 형질 발현 벡터내에 다시 연결시킬 수 있다. 이 방법에 의해, 원하는 대로 돌연변이된 플-랭쓰 cDNA를 하나 또는 그 이상의 돌연변이 단편을 제한 단편 카세트로 이용하여 재조립할 수 있다.

하기의 대표적인 화합물(13 페이지의 표 및 표 2.0, 2.5 및 3을 참조)을 코딩하는 cDNA는 하기와 같이 표 8의 돌연변이 단편으로부터 제조할 수 있다:

플라스미드 pIVPA 또는 pSVPA4는 현질 발현 백터로서의 용도이외에도, 돌연변이된 부위의 목적 퍼뮤테이션(permutation)을 갖는 cDNA의 제작에서 "저장소(depot)"로도 이용될 수 있다. 그러므로, "pIVPA/△" 또는 "pSVPA4/△", N-말단 영역을 코딩하는 cDNA 영역내의 목적변형을 포함하는(M13 또는 이종이중가닥 형성을 통해) 돌연변이된 플라스미드는 Nar I(부분) 및 Xma I(Sma I)(전체)에 의해 소화되어 R¹, R²및 R^3-에 걸쳐있는 단백질 도메인을 코딩하는 cDNA 영역이 제거될 수 있다. Arg-275, R¹, R²및 R³-코딩 영역의 어느 조합위치에서든 필요에 따라 (M13 또는 이종이중가닥 형성을 통해) 돌연변이된 두번째 pIVPA 또는 pSVPA4는 Nar I(전체) 및 Xma I(Sma I)(전체)에 의해 소화된 후 Nar I/Xma I(Sma I) 단편이 동정 및 분리되고 Nar I/Xma I(Sma I) 소화 pIVPA/△ 또는 pSVPA4/△에 연결될 수 있다. 이러한 Nar I/Xma I(Sma I) 제한 단편 카세트의 이용은 예를 들면 pIVPA 또는 pSVPA4에서의 목적 돌연변이된 cDNA의 제작을 가능하게 한다. 그후에 돌연변이된 cDNA를 예를들면 BglII/Xma I 제한 단편 카세트로서, 필요에 따라 포유동물 형질 발현을 위한 BglII/Xma I -소화 pWGSM내로 옮길 수 있다.

실시예 1

졸러 및 스미쓰의 올리고누클레오티드 지향성 변이유발법을 이용하여 화합물 2-1/N-21/Arg, 2-1/N-22/Arg 및 2-1/N-23/Arg의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 cDNA 분자를 제조한다. 특히 t-PA 유전자를 함유하는 변이유발 벡터 RF M13/t-PA를 포유동물 t-PA 형질 발현 플라스미드 pSVPA4로부터 제작한다. RF M13/t-PA는 먼저 제한 엔도누클레아제 Sac I을 이용하여 pSVPA4를 완전히 소화시킴으로써 제작한다. t-PA의 폴리펩티드 서열의 큰 부분을 코딩하고 아스파라긴 117, 184 및 218을 포함하는 일치 N-결합 글리코실화 부위를 코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 대략 1,436 염기쌍(bp) Sac I 단편을 조제용 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한다.

상기에서 Sac I 단편으로 얻은 t-PA cDNA의 Sac I 단편을 미리 Sac I으로 소화시킨 직선화된 이중가닥 RF M13 mp18 DNA 벡터에 연결시킨다. 연결 혼합물은 형질 발현 콤피텐트 세균 JM101 세포를 형질전환시키는데 사용한다. 형질 전환 세포로부터 제조한 t-PA-유래 DNA를 함유하는 M13 플라크를 분석적 DNA 제한 분석 및/또는 플라크 하이브리드화에 의해 확인 및 분리한다. t-PA DNA를 함유하는 비루스 플라크를 검출하기 위해 필터 하이브리드화를 이용하는 경우에는, 표 1에 나타낸 t-PA-코딩 누클레오티드의 서열의 Sac I 제한 부위내에서 유래된 방사능 표지화 올리고누클레오티드(∼17 mers, 양성극성)를 탐침으로 사용한다. 모든 올리고누클레오티드는 제작자의 지시에 따라 어플라이드 바이오 시스템스 DNA 신쎄사이저(Applied Biosystems DNA synthesizer)를 이용하여 자동화 합성법에 의해 제조한다.

제한 또는 하이브리드화 분석에 의해 검출된 몇몇 양성 플라크를 공지의 플라크 정제에 의해 더 클로닝한다. 플라크 정제 방법으로 부터 얻은 정제 M13/t-PA 박테리오파지를 사용하여 JM101 세포를 감염시킨다. 이들 감염된 세포는 세포질성 이중가닥 "RF" M13/t-PA 플라스미드 DNA를 생산한다. 감염 세포는 또한 배양 배지내에서 t-PA의 1.4kbp Sac I 단편 및 M13 DNA에 대해 상보적인 단일가닥 DNA를 함유하는 박테리오파지를 생산한다. 단일가닥 DNA를 배양배지에서 분리한 M13/t-PA-함유 파지로부터 정제한다. 이 단일가닥 M13/t-PA DNA는 표 7의 올리고누클레오티드 #3을 이용하는 졸러 및 스미쓰의 방법에 따른 변이유발 반응에서 주형으로 이용된다. 이 변이유발사건은 DNA 서열을 "AAC"에서 "CAG"라 바꿈으로써 그 다음에 얻어진 DNA의 코딩 가닥의 117 위치의 Asn 코돈을 Gln 코돈으로 바꾼다. 변이유발 반응후에, DNA를 세균균주 JM101내에 형질 전환시킨다. 돌연변이된 cDNA를 확인하기 위해, 표 7의 방사능 표지화 올리고누클레오티드 #4를 이용하는 DNA 하이브리드화에 의해 형질 전환체 플라크를 스크리닝한다. 표 7의 모든 대표적인 올리고누클레오티드는 양성 극성이다. 즉, DNA의 비코딩 가닥 보다는 코딩의 영역을 나타낸다. 모든 하이브리드화 양성 플라크를, 그 다음에 돌연변이된 DNA를 함유하는 M13 파지로 JM101 세포를 이차 감염시킴으로써 더 정제한다.

돌연변이된 t-PA cDNA를 함유하는 정제 M13 파지에 의해 감염된 JM101 세포로부터 RF M13/t-PA 플라스미드 DNA를 정제한다. 이렇게해서 얻은 RF M13/t-PA 플라스미드는 t-PA DNA의 Gln₁₁₇돌연변이된 Sac I 제한 단편을 포함한다. 이 돌연변이된 제한 단편은, 졸러 및 스미쓰의 방법에 의해, 그러나 상술한 올리고누클레오티드를 이용하여 다시금 더 돌연변이 시킬 수 있다. N-말단 도메인을 코딩하는 cDNA 영역내에 결실("루프 아웃")을 유발하도록 후술한 올리고누클레오티드를 설계한다.

결실 변이유발 1:

표 7의 올리고누클레오티드 #8은 Cys-6 내지 Ser-50(양 말단 포함)을 코딩하는 cDNA 결실을 유도한다. 이 두번째 변이유발 반응후에 DNA를 JM101 세포내에 형질 전환시킨다. 돌연변이된 cDNA를 확인하기 위해, 상술한대로, 그러나 표 7의 방사능 표지화 올리고누클레오티드 #9를 이용하여 형질 전환체 플라크를 스크리닝한다. 하이브리드화 양성 플라크는, 2회 돌연변이된 t-PA cDNA를 함유하는 M13 파지를 이용하여 그 다음에 JM101 세포를 2차 감염시킴으로써 더 정제할 수 있다. 이 돌연변이된 제한 단편을 포함하는 후술한 대로 제조한 cDNA는, Ile-5가 펩티드 결합에 의해 Cys-51에 공유결합되어 있는 화합물 2-1/N-21/Arg을 코딩한다.

결실 변이유발 2:

표 7의 올리고누클레오티드 #10은 Cys₆내지 Ile₈₆(양 말단 포함)을 코딩하는 cDNA 결실을 유도한다. 이 두번째 변이유발 반응후에 DNA를 JM101 세포내에 형질 전환시킨다. 돌연변이된 cDNA를 확인하기 위해, 상술한대로, 그러나 표 7의 방사능 표지화 올리고누클레오티드 #11을 이용하여 형질 전환체 플라크를 스크리닝한다. 하이브리드화 양성 플라크는, 2회 돌연변이된 t-PA cDNA를 함유하는 M13 파지를 이용하여 그다음에 JM101 세포를 2차 감염시킴으로써 더 정제할 수 있다. 이 돌연변이된 단편을 함유하는 후술한 대로 제조한 cDNA는, Ile₅가 펩티드 결합에 의해 Asp₈₇에 공유결합되어 있는 화합물 2-1/N-22/Arg을 코딩한다.

결실 변이유발 3:

표 7의 올리고누클레오티드 #12는 Cys₅₁내지 Asp₈₇(양 말단 포함)을 코딩하는 cDNA 결실을 발생시키는데 사용할 수 있다. 이 두번째 변이유발 반응후에 DNA를 JM101 세포내에 형질 전환시킨다. 돌연변이된 cDNA를 확인하기 위해, 상술한대로, 그러나 표 7의 방사능 표지화 올리고누클레오티드 #7을 이용하여 형질전환체 플라크를 스크리닝한다. 하이브리드화 양성 플라크는, 2회 돌연변이된 t-PA cDNA를 함유하는 M13 파지를 이용하여 그 다음에 JM101 세포를 2차 감염시킴으로써 더 정제할 수 있다. 이 돌연변이된 제한 단편을 함유하는 후술한 대로 제조한 cDNA는 Ser₅₀이 펩티드 결합에 의해 Thr₈₈에 공유결합되어 있는 화합물 2-1/N-23/Arg을 코딩한다.

이들 돌연변이된 제한 단편 각각은 실시예 #3B에 기술된 것과 비슷한 방법에 의해 Sac I 카세트로서 포유동물 형질 발현 벡터 pSVPA4에 다시 연결시키거나, 또는 곤충 세포 형질 발현 벡터 pIVPA/1(ATCC No.39891)에 삽입하기 위해 변형 RF M13/t-PA DNA로 부터 유도된 BglⅡ/Sac I 카세트로 제조할 수 있다.

B. 고 만노스 Gln₁₁₇결실 변형체의 형질 발현을 위해 사용되는 벡터의 제조

상술한대로 제조한, 변형 및 절단된 t-PA DNA를 함유하는 정제 RF M13/t-PA를 제한 엔도누클레아제 BglⅡ 및 Sac I으로 소화시킬 수 있다. 대략 1.2kbp BalⅡ/Sac I 제한 단편을 공지의 조제용 겔 전기영동에 의해 정제한다. 이렇게해서 얻은 BglⅡ/Sac I 단편은 번역된 단백질의 아미노 및 카르복시 말단을 코딩하는 DNA의 5' 및 3'부위가 결손되어 있는 돌연변이된 카세트를 구성한다.

곤충 형질 발현 벡터 pIVPA/1(ATCC No.39891)은 바큘로비루스 측면 DNA 서열과 함께 폴리헤드린프로모터에 기능적으로 결합되어 있는 야생형 t-PA cDNA 삽입물을 함유한다. pIVPA/1을 BglⅡ 및 Sac I으로 소화시켜 N-말단 및 R¹과 R²에 결쳐 있는 t-PA 코딩 영역을 절취해낸다. 돌연변이된, N-말단이 변형된 t-PA cDNA를 함유하는 BglⅡ/Sac I 카세트를 각각 미리 BglⅡ 및 Sac I으로 소화시킨 후 정제한 pIVPA/1 형질 발현 벡터 DNA에 연결시킬 수 있다. 생성된 플라스미드인 pIVPA/△ FBR; Gln₁₁₇, pIVPA/△ FBR/△ EGF, Gln₁₁₇; pIVPA/△ EGF, Gln₁₁₇은 이제 폴리헤드린 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 화합물 2-1/N-21/Arg, 2-1/N-22/Arg 및 2-1/N-23/Arg을 각각 코딩하는 돌연변이된 cDNA를 함유한다. 각각의 돌연변이된 cDNA 삽입물의 누클레오티드 서열은 기질로서 플라스미드를 이용하여 수퍼코일 시퀀싱에 의해 확인할 수 있다[예를들면, E. Y. Chen et al., 1985, DNA 4(2):165∼170 참조].

B. 돌연변이된 cDNA의 곤충 비루스에로의 도입

돌연변이된 cDNA를 함유하는 각각의 pIVPA 플라스미드를 스포도프테라 세포내에서 야생형 AcNPV와 함께 공동형질 감염시킴으로써 곤충 비루스내에 도입시킬 수 있다. 정제된 오토그라파 캘리포니카 NPV DNA 1㎍ 및 목적 pIVPA DNA l0㎍을 조직 배양 접시상에서 자라고 있는 스포도프테라 세포내에 인산 칼슘 형질 감염법(Potter, K. N. and Miller, L. K., J. Invertebr. Path.(1980), 36, 431~422)에 의해 도입시킨다. 이들 DNA의 세포에로의 공동도입은 pIVPA 플라스미드(돌연변이된 cDNA 함유)와 비루스 DNA사이에 둘사이의 상동성 영역에서 이중 재조합 사건을 유발한다; 즉, 재조합 사건에 의해 생성된 자손 비루스의 폴리헤드린 유전자 영역은 pIVPA 플라스미드에서 유래된 돌연변이된 cDNA 삽입물을 포함한다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 누클레오티드 서열을 함유하는 비루스의 분리

형질 감염 세포의 표면에 걸쳐 배지내에 존재하는 자손 비루스는 수회의 여러 희석시에 세포의 신선한 단일층위에 플라크를 형성한다. 플라크를 분석하고, 다음과 같은 PIB-마이너스 표현형을 기준으로 하여 재조합체를 골란낸다 : 돌연변이된 cDNA를 함유하는 비루스 PIB를 생산하지 않으므로 그의 폴리헤드린 유전자를 상실한 비루스를 골라낸다. PIB 결손으로 나타단 플라크를 선택하여 절취해내고 신선한 세포에서 증폭시킨다. 이들 세포 표면의 상층액을 t-PA형 효소활성에 대해 분석한다. 양성분석 결과는 당단백질이 사실 생산되고 있음을 생산되고 있음을 나타낸다.

플라크를 꺼내는 프로토콜을 통한 또 다른 비루스 정제법은 상술한 단계와 약간 다르며, 하기에 기술되어 있다. 적절히 희석된 상태의, 형질감염에서 유래된 자손 비루스를 세포배양 접시 상에 플라크로 만든다. 세포 단일층 및 비루스 플라크의 니크로셀룰로스 복제를 제조한다. 하기 단계의 결과가 얻어진 후에 플레이트로 부터 얻은 아가로스 오버레이를 비루스원으로 보존한다.

비루스 염색체내에 위치한 유전자를 나타내는 방사능 DNA 단편으로 니트로셀룰로스 필터를 탐침화한다. 외래 유전자를 함유하는 것을 양성으로 평가한다. 하이브리드화 탐침을 제거한다. 외래 DNA에 의한 변환에 의해 제거된 비루스 염색체의 일부를 나타내는 방사능 DNA로 필터를 재탐침화한다. 폴리헤드린 유전자를 함유하는 것을 양성으로 평가한다.

하이브리드화된 탐침을 제거한다. 폴리헤드린 유전자의 상태와는 무관하게 비루스 플라크로 확인되는 방사능 DNA 단편으로 필터를 재탐침화한다. 적절한 단편은 EcoR I I 단편일 수 있다. 이들을 자손 비루스로 기록한다. 외래 유전자 DNA 탐침에 대해 양성이고, 폴리헤드린 유전자 탐침에 대해 음성이고 비루스 DNA 탐침에 대해 양성인 플라크를 선택한다. 이들이 목적 유전자형의 강력한 후보이다.

C. 고 만노스 당단백질의 생산 및 특성지적

감염 세포의 세포의 배지내의 각종 단백질의 존재를 증명하기 위해 항체가 사용되어 왔다. 상술한대로 제조한 재조합 비루스를 사용하여, 10% 소 태아 혈청의 표준 배지 보충대신에 이것을 5% 난황 첨가물(~1% 총 부피)(Scott Biologicals)로 치환한 통상의 TC-100(Gibco) 영양염 용액에서 발육시킨 세포를 감염시킨다. 이전의 실험은 이러한 조건하에서 더 많은 본 그대로의 단백질을 증명하였다. 감염세포에서 유래된 상층액을 천연의 인간 t-PA에 결합된 단일클론성 항체를 보유하는 친화력 컬럼 상에서 분획화한다. 컬럼이 특이적으로 유지하고 있는 단백질을 용출시키고 t-PA 효소 활성에 대해 분석한다. 이것 및 대조 t-PA 제제의 고정된 양의 활성단위를 아크릴아미드 겔 상에서 분리한다. 이 겔을 은-기재시약으로 염색하여 단백질 패턴이 드러나게 한다. 이것은 곤충세포의 감염시에, 비루스가 t-PA형 활성을 갖는 단백질의 세포의 생산을 유도함을 드러낸다.

비루스(m.o.i=1)에 의해 감염된 스포도프테라 프루기페르다 세포를 먼저 48 시간동안 보온함으로써 방사능 표지화 단백질을 더 특성 지적하기 위해 생산한다. 배양판을 메티오닌-결손 배지로 헹군다. 35s-메티오닌이 보충된 메티오닌-결손 배지를 배양판에 가한다. 세포 배양물을 4시간동안 보온한다. 방사능 표지화 당단백질을 함유하는 상층액을, 곤충 세포에서 비슷하게 생산된 야생형(즉, 완전히 글라코실화된 풀-랭쓰)t-PA 및 예를들면 카우프만의 방법(R. kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5(7):1750(1985))에 의해(단, 투니카마이신의 존재하에) 생산된 포유동물 t-PA(비글리코실화됨)에 대해 SDS-PAGE(7.5%)에 의해 분석할 수 있다. 실시예 1에서 생산된 부분 글리코실화 절단 단백질은 완전 글리코실화 유사체 및 비글리코실화 풀-랭쓰 유사체에 비하여 증가된 겔 이동성을 갖는다.

실시예 2

본 발명의 다른 단백질의 제조

A. 다른 cDNA의 제조

원래의 t-PA DNA 서열이 변형된, 공기의 방법으로 제조한 다른 합성 올리고누클레오티드를 사용하여 실시예 1의 변이유발 방법을 이용함으로써 상술한대로, N-말단 영역이 변형되고/되거나 N-결합 글리코실화 부위가 임의로 변형되고/되거나 Arg-275가 적절한 코돈(들)으로 변화된 단백질을 생산할 수 있다[예를들면, 상술한 "돌연변이된 cDNA의 제조 : M13법" 및 경로 (a)∼(h)를 참조].

예를들면, 화합물 D-6, D-1 및 D-3을 코딩하는 cDNA는 M13/t-PA 내의 Sac I 제한 단편을 이용하고, 올리고누클레오티드 #3이 아닌 올리고누클레오티드 #8, 10 및 12를 각각 이용하여 돌연변이시킴으로써 제조할 수 있다. Arg-275는 결실시키거나 또는 각각 Thr, 울리고 14 또는 15를 이용하여 치환할 수 있다. 벡터 제작, 형질 발현은 곤충세포에 관한 실시예 1 또는 포유동물 세포에 관한 하기 실시예 구에서 처럼 실시할 수 있다.

실시예 1에서처림 제조한, M13 변이유발 벡터(RF M13/t-PA)에서 생성된 단일가닥 DNA도 부위 특이적 방식으로 Arg-275 및/또는 글리코실화 부위(들) R¹또는 R²또는 두곳 모두에서 변이를 유발시키는데 주형으로 사용할 수 있다. Asn₂₁₈을 포함하는 일치 트리펩티드를 코딩하는 영역을 비슷하게 돌연변이 시킬 수 있다. 이들 부위에서 단백질을 다중 변형시키기 위해 반복 방법을 사용할 수 있다. 예를들면, 변형된 R¹부위를 포함하는 M13 파지의 확인 및 정제후에, 이 변형부위를 함유하는 단일가닥 DNA를 파지로 부터 정제하여, R²부위내 및/또는 Arg-275에서의 돌연변이의 2회전을 개시하기위한 주형으로 사용할 수 있다. 이 방법은 모든 목적 변형이 얻어질때까지 반복할 수 있다. 그러므로, 화합물 2-2/N-23/Arg, 2-2/N-21/Arg 및 2-2/N-22/Arg을 코딩하는 cDNA는 올리고누클레오티드 #3 대신에 돌연변이 올리고누클레오티드 #5를 그리고 올리고누클레오티드 #4 대신에 스크리닝 올리고누클레오티드 #6을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 화합물 2-6/N-21/Arg, 2-6/N-22/Arg 및 2-6/N-23/Arg을 코딩하는 cDNA는 실시예 1에서 상술한 대로 Sac I 단편을 2회 돌연변이시키고 올리고누클레오티드 #5 및 #6으로 더 돌연변이시키고 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 벡터 제작, 형질 감염 및 형질 발현은 곤충 세포에 관한 실시예 1에서처럼 또는 포유동물에 관해 후술한 것에 따라 실시한다[상기 경로 (a)-(h) 참조].

RF M13/t-PA 돌연변이 벡터는 R³, 즉 단백질의 카르복시 말단에 가장 근접한 t-PA의 N-결합 글리코실화 부위를 코딩하는 DNA 서열을 함유하지 않는다. 그러므로, 이 부위에 DNA 변형을 만들기 위해서, M13/t-PA : R1-Xma I로 명명된 새로운 M13/t-PA 변이유발 RF 벡터를 만든다. 이 벡터는 EcoR I 및 Xma I을 이용하여 M13 벡터 M13 mp11을 완전히 소화시켜 제작한다. R1/Xma I 소화 M13 벡터를 글리코실화 부위 R³을 포함하는 폴리펩티드 영역을 코딩하는 정제 EcoR I/Xma I t-PA 제한 단편(대략 439bp, 이후에는 0.4kbp로 표시)에 연결시킨다. 플라스미드 pWGSM을 EcoR I 및 Xma I으로 소화시킨후 이 0.4kbp 제한 단편을 정제한다. t-PA 유전자를 코딩하는 포유동물 형실 발현 플라스미드 pWGSM은 439bpEcoR I/Xma I 단편내에서 플라스미드 pLDSG[Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5 : 1750∼1759(1985)]와 동일하다.

연결 혼합물은 콤피텐트 세균 JM101 세포를 형질 전환시키는데 사용한다. 여러 플라크를 고르고 표준 DNA 제한 단편 분석에 의해 0.4kbp t-PA EcoR I/Xma I 단편의 존재를 분석한다. 이중가닥 RF M13 DNA를 0.4kbp t-PA 단편을 함유하는 세포로부터 정제한다. 이 DNA를 RF M13/t-PA : R I-Xma I 변이유발 벡터로 명명한다. 실시예 1A에 이미 나타낸대로, 이 벡터는 콤피텐트 JM101 세포내에 형질 전환시키는 경우에, 그로부터 단일가닥 M13/t-PA : R I -Xma I DNA를 정제할 수 있는 M13/t-PA : R I-Xma I 파지를 만드는데 사용할 수 있다. 이 단일가닥 DNA는 N-결합 글리코실화 부위 R³에서 t-PA DNA를 변형시키기 위한 부위 지향성 변이유발 반응에서 주형으로 사용할 수 있다.

변형된 R³코딩 서열은 실시예 1에 기재된 대로 제조한 변형 pIVPA/1(R¹및/또는 R²에서 절단 및/또는 변형됨) 또는 야생형 pIVPA/1 플라스미드 DNA에 존재하는 야생형 R³서열을 치환하는데 이용할 수 있다. 이것은 먼저 R³변형 M13/t-PA : R I/Xma I 변이유발 플라스미드 벡터를 Sac I/Apa I으로 전체 소화시키고, 이렇게 해서 생산된 R³변형 M13/t-PA : RI/Xma I 변이유발 플라스미드 벡터를 분리함으로써 달성할 수 있다. 예를들면 실시예 1에서처럼 변형된 곤충 형질 발현 벡터 pIVPA/1 또는 pIVPA/1 플라스미드 DNA를 비슷하게 Sac I 및 Spa I으로 전체 소화시켜 미변형된 R³부위를 코딩하는 165bp 야생형 t-PA 제한 단편을 절취해낼 수 있다. 165bp 단편이 결손되어 있는 정제된 곤충 형질 발현 벡터를 변형된 R³165bp 단편에 연결시키면 새로운 곤충 형질 발현 벡터가 생산된다. 벡터를 형질 발현시키면, 천연 t-PA에 존재하는 다른 일치 N-결합 글리코실화 부위의 하나 또는 모두 및/또는 Arg-275에서 뿐만 아니라 R³부위에서 변형된 절단 단백질이 생산된다.

변형 cDNA를 포함하는 pIVPA 플라스미드도, R¹, R²및 R³을 코딩하는 영역뿐만 아니라 N-말단 도메인내의 결손 영역에 걸쳐 있는 변형 t-PA cDNA의 BglⅡ/Apa I 단편, 또는 R¹, R²및 R³에 걸쳐있는 Nar I/Xma I 단편을 생산하는데 사용할 수 있다. 이들 단편 중 어느 것이든 실시예 3에 기재된 대로 pSVPA4 또는 pWGSM 같은 포유동물 형질 발현 벡터내에 삽입할 수 있다.

실시예 3

포유동물 세포내에서의 화합물 D-6, D-1 및 D-3의 제조

A. cDNA의 제조

화합물 D-6, D-1 및 D-3의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 cDNA 분자를, 실시예 1의 M13법 또는 이종 이중가닥 변이유발(모리나가 이종이중가닥 변이유발 프로토콜;둘다 상기 참조)에 의해 각각 올리고누클레오티드 #8, 10 및 12를 이용하여, 그리고 주형으로서 t-PA cDNA의 Sac I 단편을 이용하여 제조한다. 스크리닝 올리고누클레오티드 9, 11 및 13을 각각 이용하는 DNA 하이브리드화에 의해 선택한 변이주를 변형된 DNA 서열이 옳은 서열 분석에 의해 확인한다.

B. 변형 t-PA 벡터 제조

먼저 벡터를 Sac I으로 전체 소화시킴으로써 M13 변이유발 벡터 RF M13/t-PA로 부터 실시예 1A(△,Gln₁₁₇) 또는 3A(△)에서 제조한 각 변형 cDNA를 제거한다. 각각의 돌연변이된 cDNA의 대략 1.4kbp 제한 단편을 겔 전기영동에 의해 정제한 후 다음과 같이 pSVPA4에 연결시킨다. 먼저, pSVPA4를 Sac I으로 소화하여 야생형 t-PA 1.4kbp 제한 단편을 제기한다. Sac I 소화 pSVPA4의 남아있는 부분을 돌연변이된 cDNA의 1.4kbp 제한 단편에 연결시킨다. 이 연결 사건에 의해, 삽입된 단편의 두 방향이 생길 수 있다. 각각의 경우에 있어서 적절한 방향은 공지의 분석 제한 효소 분석법에 의해 EcoR I 및 Pvu Ⅱ를 효소로 사용하여 확인할 수 있다. 이 치환은 Sac I 단편을 RF M13/t-PA 변이유발 벡터 및 pSVPA4 포유동물 형질 발현 벡터사이의 카세트 단편으로서 사용할 수 있게 한다. 변형된 M13 Sac I 단편(R¹및/또는 R²에서 절단되고 임의로 변형됨)을, 미리 또는 그 다음에 필요에 따라 R³에서 변형시킨 Sac I-소화 pSVPA4 DNA에 삽입시킬 수 있다. 한편으로, R¹, R²및/또는 R³에서 미리 변형된 DNA는 pIVPA 또는 pSVPA4 같은 벡터로부터 Nar I/Apa I 또는 Nar I/Xma I 단편으로서 절취해낼 수 있다. 이렇게 해서 얻은 단편을 미리 Nar I(부분) 및 Apa I 또는 Xma I(전체)으로 소화시킨 pSVPA4 또는 pWGSM 같은 벡터내에 삽입할 수 있다. 이 방법에 의해 N-말단 결실 및/또는 치환 및/또는 글리코실화 부위 돌연변이 및/또는 Arg-275 변이유발의 어느 조합이든 달성할 수 있다.

C. COS(SV40 형질 전환된 아프리카그린(African Green) 원숭이 신장) 세포의 형질 감염

로파타의 방법[Lopata, M. A. et al., Nucl. Acids Res. 12 : 5707∼5717(1984)]에 의해 COS-1 세포(ATCC CRL 1650)를 실시예 3B에서 제조한 벡터, 즉 변형 pSVPA4로 형질 감염시킨다. 형질 감염 24시간후에, 혈청-함유 배지를 무혈청 배지로 바꾸고, 형질 감염 48 및 72시간 후에, 조정 배지에 대해 발색 기질 S-2251을 이용하여 플라스미노겐 활성의 존재를, 또는 ELISA 분석법에 의해 t-PA 항원의 존재를 분석한다.

D. CV1(아프리카 그린 원숭이 신장)세포에서의 비루스 증식

게팅 및 샘브룩(Gething and Sambrook, Nature, 293 : 620~625, 1981)에 의해 기술된대로 증식시킨 SV40 비루스 원액(Viral stock)으로 CV1 세포(ATCC CCL 70)를 감염시킴으로써 변형된 복합 탄수화물 단백질을 생산할 수 있다. 이것은 먼저 변형 pSVPA4를 제한 엔도누클레아제 BamH1으로 전체 소솨시켜 SV40 비루스 DNA로부터 세균 셔틀 벡터 pXf3을 제거함으로써 행해져 왔다. 헬퍼 비루스 SV40-rINS-pBR322 DNA(후술)와 함께 이 DNA를 CV1 세포에 형질 감염시키기 전에, BamH I으로 직선화한 SV40/t-PA DNA를 묶은 DNA 농도(1㎍/ml)에서 연결에 의해 고리화한다. SV40 벡터 SV40-rINS-pBR322(Horowitz, M.et al., 1982, Eukaryotic Viral Vectors, pp 47~53, Cold Spring Harbor Laboratory를 함유하는 인슐린을 이용하여 이 방법을 반복실시한다. SV40-rINS-pBR322 중의 세균 셔틀 벡터 pBR322를 EcoRI 전체 소화에 의해 제거한다. 직선화된 인슐린/SV40 비루스 DNA를 1㎍/ml의 DNA 농도에서 연결시켜 고리화 한다. 비루스 원액을 생산하기 위해서 등몰량의 고리상 연결 pSVPA4 및 SV40-rINS DNA를 이용하여 CV-1 세포를 형질감염시킬 필요가 있다. SV40-rINS는 "레이트(late)" SV40 단백질을 제공하는데 이용되는 반면에, pSVPA4는 본 발명의 단백질을 코딩하면서 비루스 DNA 생산에 필수적인 "얼리(early)" SV40 단백질을 제공한다. 그 결과 세포를 게팅 및 샘브룩에 의해 기재된 대로 이들 DNA 모두로 세포를 형질 감염시키는 경우에 어느 한 비루스 벡터로부터 유래된 DNA를 함유하는 SV40 비루스가 생산된다. 이어서 증폭 비루스로 CV1 세포를 감염시키면 실시예 3C에 기재된 대로 감염 72시간 후에 분석할 수 있는 t-PA형 활성을 갖는 단백질이 생산된다.

실시예 4

다른 단백질의 제조

본 발명의 여러 단백질을 코딩하는 cDNA를 실시예 1,2 및 3의 방법에 의해 제조했었다. BglⅡ/Xma I제한 단편 카세트를, 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위에서의 변형을 갖거나 또는 갖지 않는 절단 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함하는 pIVPA 또는 pSVPA4 중 어느 하나로부터 절취해낼 수 있다. 절취한 BglⅡ/Xma I 단편을, 포유동물 세포에 도입시키기 위해 그 다음에 BglⅡ/Xma I-절단 pSVPA4 또는 pWGSM에 연결시킬 수 있다. 예를들면, 실시예 3의 방법 또는 카우프만 등의 방법(상기 참조)(CHO 숙주세포)에 의해 또는 하울리 등의 방법(Howley et al., 미합중국 특허 제4,419,446호(1983년))(BPV 형질발현계)에 의해 포유동물 숙주 세포내에서 이러한 cDNA를 형질 발현시키면 대응 포유동물-유래 절단 단백질이 생산된다. 그러므로, 상술한 대로, 화합물 2-1/N-21/Arg(△FBR, Gln₁₁₇) 및 2-1/N-22/Arg(△FBR/EGF, Gln₁₁₇)을 코딩하는 cDNA를 제조하고 pSVPA4에 삽입한다. 화합물 2-1/N-23/Arg(△ EGF, Gln₁₁₇)을 코딩하는 cDNA를 상술한 이종이중가닥법에 의해 변이유발 올리고누클레오티드 #12 및 스크리닝 올리고누클레오티드 #13(표 7)을 이용하여, 그리고(상술한 대로) 위치 117 미리 돌연변이된 pSVPA4를 주형으로 사용하여 제조한다. 비슷하게, 화합물 D-1(△ FBR) 및 D-3(△ EGF/FBR)을 코딩하는 cDNA를 상술한 대로 M13 변이유발에 의해 제조하고, Sac I 단편으로서 Sac I-소화 pSVPA4에 도입시킨다. 화합물 D-6(△ EGF)을 코딩하는 cDNA를, 상술한 대로 이종이중가닥법에 의해, pSVPA4를 주형으로 이용하고, 변이유발 올리고누클레오티드 #12 및 스크리닝 올리고누클레오티드 #13을 이용하여 제조한다.

포유동물내에서의 증폭 및 형질 발현을 위하여 단백질을 코딩하는 cDNA를 제조하기 위해서는, pSVPA4 또는 pIVPA에 함유되어 있는 cDNA를 BglⅡ/Xma I 단편으로서 절취해내고 정제된 BglⅡ/Xma I-소화 pWGSM에 연결시킨다. 각각의 경우에, 생성된 pWGSM 벡터를 카우프만의 방법(상기 참조)에 의해 CHO 세포에 도입시키고 증폭시킨다. 형질 전환되고 증폭된 CHO 세포는 각각 D-6, D-1, D-3, 2-1/N-23/Arg, 2-1/N-21/Arg 및 2-1/N-22/Arg을 생산하는데, 이들을 인간 t-PA 특이적 항체에 의해 배양 배지내에서 검출한다. 화합물은 면역친화력 크로마토그래피에 의해 회수 및 정제될 수 있다.

실시예 5

CHO 세포내에서 목적 단백질을 생산시키기 위해, R¹, R²및/또는 R³이 변형되거나 또는 변형되어 있지 않고 N-말단 및/또는 R-275가 변형되어 있는 단백질을 코딩하는 cDNA를 이용하여 실시예 4를 반복할 수 있다. 돌연변이된 cDNA는 상술한대로 제조할 수 있다. 그러므로, 실시예 2에 기재한대로 pIVPA내에서 화합물 2-7/N-23/Arg, 2-7/N-21/Arg 및 2-7/N-22/Arg을 코딩하는 cDNA를 제조한다. 그 후에, cDNA를 BglⅡ/Xma I 단편으로서 절취해내어 정제된 BglⅡ/Xma I-소화 pWGSM에 연결시키고, 생성된 벡터를 실시예 4에서처럼 CHO 세포내에서 형질 전환 및 증폭시켜 화합물 2-7/N-23/Arg, 2-7/N-21/Arg 및 2-7/N-22/Arg을 생산한다.

Claims

인간 t-PA의 펩티드 서열로부터 Gly-(-3) 내지 Thr-91 영역 내의 하나 이상의 아미노산을 결실시키고, (a) Arg-275을 결실 또는 다른 아미노산으로 치환시키거나, (b) 적어도 하나의 일치 N-결합 글리코실화 부위를 일치 N-결합 글리코실화 부위 이외의 것으로 변형시키거나, 또는 (c) (a) 및 (b)를 모두 수행함을 특징으로 하는, 조직 플라스미노겐 활성화제형 활성을 갖는 혈전 붕괴 단백질의 제조방법.
제1항에 있어서, 15개 이상의 아미노산을 Ser-1 내지 Ser-50의 영역으로부터 결실시키는 방법.
제1항에 있어서, 1 내지 37개의 아미노산을 Cys-51 내지 Asp-87의 영역으로부터 결실시키는 방법.
제1항에 있어서, Gly-(-3) 내지 Thr-91의 영역 내에서 20개 미만의 아미노산의 결실을 1회 이상 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 아미노산 Cys-6 내지 Ile-86을 결실시키는 방법.
제5항에 있어서, 인간 t-PA의 펩티드 서열 내에서 위치 117~119에 걸친 펩티드 서열 Asn-Ser-Ser을 일치 N-결합 글리코실화 부위 이외의 것으로 변형시키는 방법.
제6항에 있어서, Asn-117을 상이한 아미노산으로 치환시키는 방법.
제7항에 있어서, 위치 117∼119의 N-결합 글리코실화 부위를 변형시켜 Asn-117을 Gln으로 치환시키고, 혈전 붕괴 단백질이 하나 이상의 비변형 N-결합 글리코실화 부위에서 글리코실화 되는 방법.
제8항에 있어서, 245 위치의 아미노산이 Met 또는 Val인 방법.
제5항에 있어서, 인간 t-PA에서 글리코실화된 3개의 모든 일치 N-결합 글리코실화 부위를 일치 N-결합 클리코실화 부위 이외의 것으로 변형시키는 방법.
제10항에 있어서, 117,184 및 448 위치에서의 각각의 Asn을 독립적으로 선택된 치환 아미노산으로 치환시키는 방법.
제11항에 있어서, 117∼119, 184∼186 및 448 내지 450에서의 N-결합 글리코실화 부위를 변형시켜 Asn-117, Asn-184 및 Asn-448을 Gln으로 치환시키는 방법.
제12항에 있어서, 펩티드 서열의 위치 245에서의 아미노산이 Met 또는 Val인 방법.
인간 t-PA의 펩티드 서열에서 영역 Gly-(-3) 내지 Thr-91내의 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산으로 치환시키고, (a) Arg-275을 결실 또는 다른 아미노산으로 치환시키거나, (b) 적어도 하나의 일치 N-결합 글리코실화 부위를 일치 N-결합 글리코실화 부위 이외의 것으로 변형시키거나, 또는 (c) (a) 및 (b)를 모두 수행함을 특징으로 하는, 조직 플라스미노겐 활성화제형 활성을 갖는 혈전 붕괴 단백질의 제조방법.
제14항에 있어서, Gly-(-3) 내지 Cys-51의 영역 내에서 아미노산을 치환시키는 방법
제14항에 있어서, Cys-51 내지 Thr-91의 영역 내에서 아미노산을 치환시기는 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 치환된 아미노산의 수가 1 내지 15인 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 치환된 아미노산의 수가 1 내지 5인 방법.
제14항에 있어서, Gly-(-3) 내지 Thr-91의 영역을 1 내지 93개 아미노산의 결실에 의해 더욱 변형시키는 방법.
t-PA 또는 그의 상사체 또는 그의 변형체를 코딩하는 DNA 서열을 통상적인 부위에서 돌연변이 시킴을 특징으로 하는, 제19항 내지 31항 중 어느 한 항에 따라 제조된 단백질을 코딩하는 DNA 분자의 제조방법.
제20항에 따라 수록된 DNA 분자를 포유동물, 효모, 곤충, 진균 및 세균 세포로 구성된 균으로부터 선택된 숙주 세포 내에서 형질 발현시킴을 특징으로 하는 조직 플라스미노겐형 활성을 갖는 혈전 붕괴 단백질의 제조방법.
t-PA 또는 그의 상사체 또는 그의 변형체를 코딩하는 DNA 서열을 통상적인 부위에서 돌연변이 시킴을 특징으로 하는, 제14항 내지 19항 중 어느 한 항에 따라 제조된 단백질을 코딩하는 DNA 분자의 제조방법.
제22항에 따라 수득된 DNA 분자를 포유동물, 효모, 곤충, 진균 및 세균 세포로 구성된 군으로부터 선택된 숙주 세포 내에서 형질 발현시킴을 특징으로 하는 조직 플라스미노겐형 활성을 갖는 혈전 붕괴 단백질의 제조방법.