JP2936201B2 - ヒト第▲ｉｘ▼因子または類似の蛋白質をコードするｄｎａ配列、発現ベクター、形質転換された細胞、第▲ｉｘ▼因子の製造方法および得られた対応する生成物 - Google Patents
ヒト第▲ｉｘ▼因子または類似の蛋白質をコードするｄｎａ配列、発現ベクター、形質転換された細胞、第▲ｉｘ▼因子の製造方法および得られた対応する生成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト第IX因子または類似の蛋白質をコード
する新規なDNA配列に関する。該配列は、宿主細胞、特
に脊椎動物細胞、とりわけ哺乳類細胞における発現に利
用できる、 従来技術 第IX因子は、血液凝固に関与するビタミンＫ−依存性
蛋白質である。該因子は、チモーゲンの形態で合成さ
れ、血中に分泌される前に、３種類の翻訳後修飾を受け
る：即ち、グルタミン酸のカルボキシグルタミン酸への
ビタミンＫ依存性変換、炭化水素鎖の付加およびアスパ
ラギン酸のβ−水酸化である。ヒトにおいては、肝臓が
第IX因子の合成部位である。この蛋白質は、血液凝固サ
イクルに係わり、血友病Ｂ患者の治療に使用される。現
在市販されている唯一の第IX因子源は、ヒト血漿であ
る。
する新規なDNA配列に関する。該配列は、宿主細胞、特
に脊椎動物細胞、とりわけ哺乳類細胞における発現に利
用できる、 従来技術 第IX因子は、血液凝固に関与するビタミンＫ−依存性
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れ、血中に分泌される前に、３種類の翻訳後修飾を受け
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ラギン酸のβ−水酸化である。ヒトにおいては、肝臓が
第IX因子の合成部位である。この蛋白質は、血液凝固サ
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在市販されている唯一の第IX因子源は、ヒト血漿であ
る。
しかしながら、血漿抽出物から得られた第IX因子製剤
は、発熱性である可能性があり、また、病原性因子また
はウィルス、特に肝炎ウィルスまたはAIDSベクター因子
で汚染されている危険性を伴う。
は、発熱性である可能性があり、また、病原性因子また
はウィルス、特に肝炎ウィルスまたはAIDSベクター因子
で汚染されている危険性を伴う。
この理由により、ヒトまたは動物血漿からの抽出作業
を必要とすることなく、極めて純度の高い第IX因子を製
造する方法を開発することが、特に有利である。
を必要とすることなく、極めて純度の高い第IX因子を製
造する方法を開発することが、特に有利である。
従って、過去数年間、組換えDNA技術を用いて、第IX
因子を製造する試みがなされている。
因子を製造する試みがなされている。
特に、先願である欧州特許公開EP0,167,420、EP0,16
2,782およびEP0,251,874において、本出願人は、宿主細
胞に第IX因子生産能を与えるために、宿主細胞を形質転
換させる方法を開示している。
2,782およびEP0,251,874において、本出願人は、宿主細
胞に第IX因子生産能を与えるために、宿主細胞を形質転
換させる方法を開示している。
他のビタミンＫ依存性蛋白質の発現において既に得ら
れていた結果から予測できる知見と合致して、考慮でき
る全ての宿主細胞の内でも、哺乳類の細胞が最も有益な
結果をもたらす。例えば、哺乳類細胞における第VII因
子または蛋白質Ｃの発現は好結果をもたらし、十分に活
性な蛋白質の生産を導いた（バークナー ケイ．（Berk
ner K.）ら、コールド スプリング ハーバー（Cold S
pring Harbor）、クォンティテイティブ バイオロジー
（Qantitative Biology）学会、Vol.LI、1986）。
れていた結果から予測できる知見と合致して、考慮でき
る全ての宿主細胞の内でも、哺乳類の細胞が最も有益な
結果をもたらす。例えば、哺乳類細胞における第VII因
子または蛋白質Ｃの発現は好結果をもたらし、十分に活
性な蛋白質の生産を導いた（バークナー ケイ．（Berk
ner K.）ら、コールド スプリング ハーバー（Cold S
pring Harbor）、クォンティテイティブ バイオロジー
（Qantitative Biology）学会、Vol.LI、1986）。
しかしながら、第IX因子の特異性および、余り高くな
い費用で工業的開発を期待するに十分な収量で生産でき
かつ活性である生成物を得ることの困難は、すぐに明ら
かとなった。
い費用で工業的開発を期待するに十分な収量で生産でき
かつ活性である生成物を得ることの困難は、すぐに明ら
かとなった。
最近の刊行物（リース ディ．ジェイ．ジー．（Rees
D.J.G.）Embo J.,1988,vol.7,2053）には、イヌ腎（MD
CK）細胞から非常に活性な第IX因子の生産が開示されて
いるが、発現レベルは極端に低く、0.2〜0.3μg/106細
胞/24時間である。これらの低い発現レベルにおいて、
第IX因子に活性を付与するのに必要なカルボキシル化反
応は飽和化しないことが観察され、このことは観察され
た非常に大きな比活性を説明する。
D.J.G.）Embo J.,1988,vol.7,2053）には、イヌ腎（MD
CK）細胞から非常に活性な第IX因子の生産が開示されて
いるが、発現レベルは極端に低く、0.2〜0.3μg/106細
胞/24時間である。これらの低い発現レベルにおいて、
第IX因子に活性を付与するのに必要なカルボキシル化反
応は飽和化しないことが観察され、このことは観察され
た非常に大きな比活性を説明する。
また、第IX因子cDNAの一次翻訳生成物の構造は、周知
であり、３種のドメインに分割される:N末端には、一次
翻訳生成物が小胞体膜を通過する時に切り出される28個
のアミノ酸のシグナル配列が存在する。次いで、12個の
グルタミン酸のカルボキシル化を指示する18個のアミノ
酸のプロシークエンス（prosequence）が存在し、次に
成熟第IX因子をコードする配列が存在する。最近の研究
で、２種の要素が第IX因子に生物活性を与えるために必
須であることがわかった。２つの要素とは、一つは、ビ
タミンＫ依存性カルボキシル化であり、もう一つは、第
IX因子が細胞外に分泌される時に切り出されるプロシー
クエンスである。
であり、３種のドメインに分割される:N末端には、一次
翻訳生成物が小胞体膜を通過する時に切り出される28個
のアミノ酸のシグナル配列が存在する。次いで、12個の
グルタミン酸のカルボキシル化を指示する18個のアミノ
酸のプロシークエンス（prosequence）が存在し、次に
成熟第IX因子をコードする配列が存在する。最近の研究
で、２種の要素が第IX因子に生物活性を与えるために必
須であることがわかった。２つの要素とは、一つは、ビ
タミンＫ依存性カルボキシル化であり、もう一つは、第
IX因子が細胞外に分泌される時に切り出されるプロシー
クエンスである。
発明の開示 従って、本発明の目的とするところは、肝臓細胞にお
ける第IX因子の成熟メカニズムについての最近の科学的
データの観点から、遺伝子工学で第IX因子を製造する従
来の試みにおいて生じた問題点を解決することにある。
特に、本発明の目的は、工業的利用に適う程度の発現レ
ベルで、生物学的に活性であるヒト第IX因子または類似
の蛋白質を製造する方法を提供することである。
ける第IX因子の成熟メカニズムについての最近の科学的
データの観点から、遺伝子工学で第IX因子を製造する従
来の試みにおいて生じた問題点を解決することにある。
特に、本発明の目的は、工業的利用に適う程度の発現レ
ベルで、生物学的に活性であるヒト第IX因子または類似
の蛋白質を製造する方法を提供することである。
本発明は、ヒト第IX因子または類似の蛋白質をコード
するDNA配列に関する。該配列は、プロシークエンスを
コードする部分および成熟第IX因子または類似の成熟蛋
白質をコードする部分の少なくとも２つの部分を有す
る。プロシークエンスをコードする部分において、コド
ン（−３）は、バリン、アルギニン、リジン、トレオニ
ンまたはセリンをコードする。
するDNA配列に関する。該配列は、プロシークエンスを
コードする部分および成熟第IX因子または類似の成熟蛋
白質をコードする部分の少なくとも２つの部分を有す
る。プロシークエンスをコードする部分において、コド
ン（−３）は、バリン、アルギニン、リジン、トレオニ
ンまたはセリンをコードする。
以下の記載で、マイナスの番号をつけられたコドン
は、プロシークエンスに相当し、成熟第IX因子のアミノ
酸をコードする第１コドンを＋１とする。
は、プロシークエンスに相当し、成熟第IX因子のアミノ
酸をコードする第１コドンを＋１とする。
特に、コドン（−３）の付近の好ましい構造は、下記
のアミノ酸配列に相当する： （式中、Ｘはバリン、アルギニン、リジン、トレオニン
およびセリンから選ばれるアミノ酸である） 一般的にいえば、本明細書において、“ヒト第IX因子
に類似の蛋白質”とは、類似の構造を有し、インビボで
同タイプの生物学的活性を有する蛋白質を意味する。す
なわち、例えば、第IX因子と同じ一次構造と、必要であ
れば、限定された数のアミノ酸について数個の修飾を持
つ蛋白質、さもなくば第IX因子と同じ翻訳後修飾を必ず
しも持たない蛋白質、或いは必須部分において欠失があ
る同タイプの蛋白質などである。
のアミノ酸配列に相当する： （式中、Ｘはバリン、アルギニン、リジン、トレオニン
およびセリンから選ばれるアミノ酸である） 一般的にいえば、本明細書において、“ヒト第IX因子
に類似の蛋白質”とは、類似の構造を有し、インビボで
同タイプの生物学的活性を有する蛋白質を意味する。す
なわち、例えば、第IX因子と同じ一次構造と、必要であ
れば、限定された数のアミノ酸について数個の修飾を持
つ蛋白質、さもなくば第IX因子と同じ翻訳後修飾を必ず
しも持たない蛋白質、或いは必須部分において欠失があ
る同タイプの蛋白質などである。
特に、本発明の対象は、ヒト第IX因子または上記の類
似蛋白質をコードする新規なDNA配列である。該配列
は、第１図に示す第IX因子cDNAのヌクレオチド配列と比
較する場合、対応するアミノ酸配列において、プロリン
（−３）がプロシークエンス中のバリン、アルギニン、
リジン、トレオニンまたはセリンに変換されるような少
なくとも１個のヌクレオチドの変異を有する。
似蛋白質をコードする新規なDNA配列である。該配列
は、第１図に示す第IX因子cDNAのヌクレオチド配列と比
較する場合、対応するアミノ酸配列において、プロリン
（−３）がプロシークエンス中のバリン、アルギニン、
リジン、トレオニンまたはセリンに変換されるような少
なくとも１個のヌクレオチドの変異を有する。
このDNA配列は、宿主細胞における第IX因子または類
似蛋白質の発現に有用である。上述の理由により、好ま
しい宿主細胞は、脊椎動物細胞、特に哺乳類細胞であ
る。
似蛋白質の発現に有用である。上述の理由により、好ま
しい宿主細胞は、脊椎動物細胞、特に哺乳類細胞であ
る。
事実、第IX因子cDNAの一次翻訳生成物は上記したごと
く、３種のドメインを含有する。また、本発明のDNA配
列は、好ましくは、第IX因子の発現を促進することがで
きるシグナル配列をコードする部分をも含む。しかしな
がら、この部分が第IX因子の天然シグナル配列に相当す
ることは必須ではない。また、この部分は、所望であれ
ば、第VII因子、蛋白質ＣなどのビタミンＫ依存性蛋白
質のシグナル配列と置換されていても良い。
く、３種のドメインを含有する。また、本発明のDNA配
列は、好ましくは、第IX因子の発現を促進することがで
きるシグナル配列をコードする部分をも含む。しかしな
がら、この部分が第IX因子の天然シグナル配列に相当す
ることは必須ではない。また、この部分は、所望であれ
ば、第VII因子、蛋白質ＣなどのビタミンＫ依存性蛋白
質のシグナル配列と置換されていても良い。
さらに詳しくは、本発明の配列は、ポジション（−
３）に、プロリンをコードするCCAコドンの代わりに、
バリンをコードするGTGまたはGTAコドンを有する。
３）に、プロリンをコードするCCAコドンの代わりに、
バリンをコードするGTGまたはGTAコドンを有する。
本発明の第２の対象は、新規な第IX因子類縁物質およ
びこれらの新規な類縁物質をコードする新規なDNA配列
である。後者は、（Ala1）FIX類縁物質（FIXは、天然ま
たは組換え第IX因子或いは上記類似蛋白質を意味する）
である。なお、本明細書において（Ala1）FIXとは、FIX
のアミノ酸配列において、１位のチロシンがアラニンに
置換されてなる蛋白質を意味する。
びこれらの新規な類縁物質をコードする新規なDNA配列
である。後者は、（Ala1）FIX類縁物質（FIXは、天然ま
たは組換え第IX因子或いは上記類似蛋白質を意味する）
である。なお、本明細書において（Ala1）FIXとは、FIX
のアミノ酸配列において、１位のチロシンがアラニンに
置換されてなる蛋白質を意味する。
同様に、本発明は、これらの新規な類縁物質をコード
するDNA配列（５′末端がアラニンをコードする）に関
する。特に、該配列は、第１図に示す第IX因子cDNAのヌ
クレオチド配列と比較する場合、対応するアミノ酸配列
において、チロシン（＋１）がアラニンに変換されるよ
うな少なくとも１個のヌクレトチドの変異を有する。
するDNA配列（５′末端がアラニンをコードする）に関
する。特に、該配列は、第１図に示す第IX因子cDNAのヌ
クレオチド配列と比較する場合、対応するアミノ酸配列
において、チロシン（＋１）がアラニンに変換されるよ
うな少なくとも１個のヌクレトチドの変異を有する。
さらに詳しくは、本発明の配列は、ポジション（＋
１）でチロシンをコードするTATコドンの代わりに、ア
ラニンをコードするコドンGCCまたはGCTを有する。
１）でチロシンをコードするTATコドンの代わりに、ア
ラニンをコードするコドンGCCまたはGCTを有する。
最後に、本発明の第３の対象は、コドン（＋１）がア
ラニンをコードし、コドン（−３）がバリン、アルギニ
ン、リジン、トレオニンまたはセリンをコードする、ヒ
ト第IX因子または類似蛋白質をコードするDNA配列であ
る。
ラニンをコードし、コドン（−３）がバリン、アルギニ
ン、リジン、トレオニンまたはセリンをコードする、ヒ
ト第IX因子または類似蛋白質をコードするDNA配列であ
る。
したがって、このDNA配列は、好ましくは、 （Ｘはバリン、アルギニン、リジン、トレオニンおよび
セリンから選ばれるアミノ酸である。）をコードする配
列を含有する。
セリンから選ばれるアミノ酸である。）をコードする配
列を含有する。
特に、本発明の対象は、第１図に示すヌクレオチド配
列に比べて、対応するプロシークエンスにおいて、プロ
リン（−３）がバリン、アルギニン、リジン、トレオニ
ンまたはセリンに変換され、且つ成熟第IX因子または成
熟した類似蛋白質をコードする配列において、チロシン
（＋１）がアラニンに変換されるような変異を有する、
ヒト第IX因子または類似蛋白質をコードする新規なDNA
配列にある。
列に比べて、対応するプロシークエンスにおいて、プロ
リン（−３）がバリン、アルギニン、リジン、トレオニ
ンまたはセリンに変換され、且つ成熟第IX因子または成
熟した類似蛋白質をコードする配列において、チロシン
（＋１）がアラニンに変換されるような変異を有する、
ヒト第IX因子または類似蛋白質をコードする新規なDNA
配列にある。
第IX因子の遺伝子を担うクローンを製造する方法につ
いては、再度詳しくは述べない。既に述べた特許公開が
参考文献として挙げられ、その内容は、本明細書の一部
をなすものである。
いては、再度詳しくは述べない。既に述べた特許公開が
参考文献として挙げられ、その内容は、本明細書の一部
をなすものである。
また、本発明の対象は、宿主細胞において第IX因子ま
たは類似蛋白質の発現のためのベクターである。該ベク
ターは、少なくとも、本発明のDNA配列および該細胞で
該配列を発現させるための要素を有する。
たは類似蛋白質の発現のためのベクターである。該ベク
ターは、少なくとも、本発明のDNA配列および該細胞で
該配列を発現させるための要素を有する。
有用なベクターについては、ポックスウィルス族のウ
ィルス、特にワクシニアウィルスまたは牛痘ウィルス、
或いはプラスミドベクター、特に組み込みベクターを挙
げることができる。その他の代替可能なベクターについ
ては、前述の特許出願、特に特許出願EP0,162,782、EP
0,251,874などに詳しく記載される。
ィルス、特にワクシニアウィルスまたは牛痘ウィルス、
或いはプラスミドベクター、特に組み込みベクターを挙
げることができる。その他の代替可能なベクターについ
ては、前述の特許出願、特に特許出願EP0,162,782、EP
0,251,874などに詳しく記載される。
使用するベクターに適合する限り、特に、用いるベク
ターがウィスルベクターかプラスミドベクターかに応じ
て、宿主細胞は種々のタイプであってよい。哺乳類細
胞、特にVERO細胞、BHK21細胞等の肝臓細胞が特に好適
に使用される。CHO細胞を感染させるためには、牛痘ウ
ィルス由来のベクターを用いる。
ターがウィスルベクターかプラスミドベクターかに応じ
て、宿主細胞は種々のタイプであってよい。哺乳類細
胞、特にVERO細胞、BHK21細胞等の肝臓細胞が特に好適
に使用される。CHO細胞を感染させるためには、牛痘ウ
ィルス由来のベクターを用いる。
成長のための適当な培地で、上記細胞を培養する。形
質転換または感染の後に、細胞または培地を回収して、
第IX因子蛋白質またはその活性類縁物質を公知の蛋白質
精製方法により単離することができる。
質転換または感染の後に、細胞または培地を回収して、
第IX因子蛋白質またはその活性類縁物質を公知の蛋白質
精製方法により単離することができる。
ほとんどの場合、ビタミンＫを含有する培地上で培養
することが重要である。ビタミンＫの量は、細胞培養物
によって異なり、好ましくは培地を飽和させる量であ
り、例えば５〜50μg/培地1ml、通常10μg/mlのオーダ
ーである。
することが重要である。ビタミンＫの量は、細胞培養物
によって異なり、好ましくは培地を飽和させる量であ
り、例えば５〜50μg/培地1ml、通常10μg/mlのオーダ
ーである。
最後に、本発明は、上記の方法に従って得られる第IX
因子に関する。特に、本発明は、チロシン（＋１）がア
ラニンに変換されているヒト第IX因子類縁物質に関す
る。
因子に関する。特に、本発明は、チロシン（＋１）がア
ラニンに変換されているヒト第IX因子類縁物質に関す
る。
本発明の他の特徴および利点は、第１図および第２図
で説明されるように、下記で明らかにされる。
で説明されるように、下記で明らかにされる。
実施例1:第IX因子cDNAの構築 第IX因子cDNAをBamHIフラグメントの形態でプラスミ
ドpTG381にクローンした。非コーディング５′末端をコ
ザック則（Kozak′s rule）により良く従うようにさせ
るために、pTG381の構築が行われた。pTG381の構築は、
前述の特許公開EP−Ａ−0,251,874に記載されている。B
amHIフラグメントは、ポリリンカーの制限部位が20Bg1I
I、PstI、HindIII、SmaI、BamHIおよびEcoRIである以外
は、ファージM13TG131（キーニー（Kieny）ら、1983、
ジーン（Gene））と同一のファージM13TG127に再クロー
ンされる。第IX因子cDNAの５′末端がSmaI部位に隣接す
る新規な構築物をM13TG1938と称する。
ドpTG381にクローンした。非コーディング５′末端をコ
ザック則（Kozak′s rule）により良く従うようにさせ
るために、pTG381の構築が行われた。pTG381の構築は、
前述の特許公開EP−Ａ−0,251,874に記載されている。B
amHIフラグメントは、ポリリンカーの制限部位が20Bg1I
I、PstI、HindIII、SmaI、BamHIおよびEcoRIである以外
は、ファージM13TG131（キーニー（Kieny）ら、1983、
ジーン（Gene））と同一のファージM13TG127に再クロー
ンされる。第IX因子cDNAの５′末端がSmaI部位に隣接す
る新規な構築物をM13TG1938と称する。
ファージM13TG1938から一本鎖DNAを製造し、公知の位
置特異的突然変異誘発技術（ゾラー（Zoller）およびス
ミス（Smith））に従って、第IX因子cDNA上で変異誘発
を行う。
置特異的突然変異誘発技術（ゾラー（Zoller）およびス
ミス（Smith））に従って、第IX因子cDNA上で変異誘発
を行う。
ａ）プロリン（−３）がバリンに変換されているアミノ
酸配列に相当するcDNAの構築。
酸配列に相当するcDNAの構築。
TG1771と称される合成オリゴヌクレオチド５′−ATAC
TCCTCACCCGATTCAG−３′を使用する。
TCCTCACCCGATTCAG−３′を使用する。
このオリゴヌクレオチドを一本鎖DNAフラグメントと5
0℃で30分間迅速にハイブリダイズさせる。次いで、デ
オキシヌクレオチドトリフォスフェートの存在下に、ハ
イブリダイズさせた混合物をポリメラーゼクレノーフラ
グメントで処理することにより、二本鎖分子を製造す
る。形質転換の後、プローブとして放射性物質で標識し
たオリゴヌクレオチドTG1771を用いて、ハイブリダイゼ
ーションにより、効果的に所望の変異を遂げた分子を同
定する。
0℃で30分間迅速にハイブリダイズさせる。次いで、デ
オキシヌクレオチドトリフォスフェートの存在下に、ハ
イブリダイズさせた混合物をポリメラーゼクレノーフラ
グメントで処理することにより、二本鎖分子を製造す
る。形質転換の後、プローブとして放射性物質で標識し
たオリゴヌクレオチドTG1771を用いて、ハイブリダイゼ
ーションにより、効果的に所望の変異を遂げた分子を同
定する。
所望の変異を確認するために、新規な第IX因子cDNAの
５′末端のDNA配列を調べる。プロリンをコードするCCA
コドンは、バリンをコードするGTGコドンによって置換
されている。
５′末端のDNA配列を調べる。プロリンをコードするCCA
コドンは、バリンをコードするGTGコドンによって置換
されている。
ｂ）チロシン（＋１）がアラニンに変換されているアミ
ノ酸配列に相当するcDNAの構築。
ノ酸配列に相当するcDNAの構築。
TG1770と称される合成オリゴヌクレオチド５′−CTGA
ATTAGCCCTCTTTACCCGATTC−３′を用いる。
ATTAGCCCTCTTTACCCGATTC−３′を用いる。
この場合、チロシンをコードするTATコドンは、アラ
ニンをコードするGCCコドンにより置換されている。条
件は、ａ）に記載のものと同じである。
ニンをコードするGCCコドンにより置換されている。条
件は、ａ）に記載のものと同じである。
ｃ）チロシン（＋１）がアラニンに変換され、且つプロ
リン（−３）がバリンに変換されているアミノ酸配列に
相当するcDNAの構築。
リン（−３）がバリンに変換されているアミノ酸配列に
相当するcDNAの構築。
TG1327と称される合成オリゴヌクレオチド５′−CTGA
ATTAGCCCTCTTACCCGATTC−３′を用いる。
ATTAGCCCTCTTACCCGATTC−３′を用いる。
この場合、プロリン（−３）をコードするCCAコドン
は、バリンをコードするGTAコドンによって置換され、
チロシン（＋１）をコードするTATコドンは、アラニン
をコードするGCTコドンにより置換されている。
は、バリンをコードするGTAコドンによって置換され、
チロシン（＋１）をコードするTATコドンは、アラニン
をコードするGCTコドンにより置換されている。
実施例2:組換えワクシニアウィルスの生産およびBHK21
細胞の感染 上記により得られた新規なcDNAを、制限酵素BamHIでM
13ベクターから切り出す。これらのフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動により単離し、BamHIで消化された
プラスミドベクターpTG186−polyに挿入する。pTG186−
polyは、その構築が前述の欧州特許公開EP0,162,782に
記載され、既に述べたファージM13TG131のポリリンカー
のBg1II−EcoRIフラグメントを更に含有するpTG186の誘
導体である。
細胞の感染 上記により得られた新規なcDNAを、制限酵素BamHIでM
13ベクターから切り出す。これらのフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動により単離し、BamHIで消化された
プラスミドベクターpTG186−polyに挿入する。pTG186−
polyは、その構築が前述の欧州特許公開EP0,162,782に
記載され、既に述べたファージM13TG131のポリリンカー
のBg1II−EcoRIフラグメントを更に含有するpTG186の誘
導体である。
得られた３種のプラスミド： −FIX−3val/＋1ala（オリゴヌクレオチドTG1327）に対
応するpTG3533、 −FIX−3val（オリゴヌクレオチドTG1771）に対応するp
TG3536、 −FIX＋1ala（オリゴヌクレオチドTG1770）に対応するp
TG3537 を、欧州特許公開EP0,162,782に記載された条件下に、
ワクシニアウィルスゲノムにそれぞれ挿入する。
応するpTG3533、 −FIX−3val（オリゴヌクレオチドTG1771）に対応するp
TG3536、 −FIX＋1ala（オリゴヌクレオチドTG1770）に対応するp
TG3537 を、欧州特許公開EP0,162,782に記載された条件下に、
ワクシニアウィルスゲノムにそれぞれ挿入する。
５−ブロモデオキシウリジンを用いて、第IX因子をコ
ードする配列がワクシニアの7.5Kプロモータの支配下に
ある組換えワクシニアウィルスをTK-表現型についてス
クリーニングする。
ードする配列がワクシニアの7.5Kプロモータの支配下に
ある組換えワクシニアウィルスをTK-表現型についてス
クリーニングする。
56℃で30分間加熱することにより不活性化された牛胎
児血清５％を捕われたMEMグラスゴー培地中で、ビタミ
ンK10μg/mlの存在下に、細胞を培養する。感染濃度1pf
uで、組換えウィルスにより該細胞を感染させる。細胞
を培地だけで３回洗浄し、次いで、完全培地と接触させ
る。24時間後、培養上清み中の第IX因子の存在を２種の
方法で試験する： −第IX因子抗原の量をELISA試験（ダイアグノスチカ
スタゴ（Daiagnostica Stago）製）により算出する。
児血清５％を捕われたMEMグラスゴー培地中で、ビタミ
ンK10μg/mlの存在下に、細胞を培養する。感染濃度1pf
uで、組換えウィルスにより該細胞を感染させる。細胞
を培地だけで３回洗浄し、次いで、完全培地と接触させ
る。24時間後、培養上清み中の第IX因子の存在を２種の
方法で試験する： −第IX因子抗原の量をELISA試験（ダイアグノスチカ
スタゴ（Daiagnostica Stago）製）により算出する。
−抽出物（スタゴ（stago）により市販されるキット）
を加え、血友病患者の血漿の凝固時間を測定することに
より、第IX因子の活性を計算する。
を加え、血友病患者の血漿の凝固時間を測定することに
より、第IX因子の活性を計算する。
結果を下記の表に示す。第IX因子抗原の量は、μg/試
料1mlで表わされる。
料1mlで表わされる。
活性は、比活性で表わす。このために、測定された活
性を正常人血漿の混合物を用いて得られた活性と比較す
る。
性を正常人血漿の混合物を用いて得られた活性と比較す
る。
表に示される比較例は、その構築が欧州特許公開EP−
Ａ−0,162,782に開示された第IX因子cDNAの発現のため
の組換えウィルスVVTGCIIである。
Ａ−0,162,782に開示された第IX因子cDNAの発現のため
の組換えウィルスVVTGCIIである。
特に組換えワクシニアウィルスVVYG3533およびVVTG35
37において、比較し得る発現レベルで強い比活性がみら
れる。生産された第IX因子の活性が実質的に100％であ
るので、ウィスルVVTG3537が特に有利である。対照は正
常血漿であり、FIX5μg/mlについて100％活性である。
37において、比較し得る発現レベルで強い比活性がみら
れる。生産された第IX因子の活性が実質的に100％であ
るので、ウィスルVVTG3537が特に有利である。対照は正
常血漿であり、FIX5μg/mlについて100％活性である。
下記の菌株をパリのアンスティテュ パストゥール
（Institut Pasteur）のコレクシォン ナシォナル ド
キュルチュール ド ミクロオルガニスム（Collecti
on Nationale de Cultures de Microorgamismes）に198
8年11月８日に寄託した。
（Institut Pasteur）のコレクシォン ナシォナル ド
キュルチュール ド ミクロオルガニスム（Collecti
on Nationale de Cultures de Microorgamismes）に198
8年11月８日に寄託した。
−E.coli pTG3537（寄託番号Ｉ−810） −E.coli pTG3536（寄託番号Ｉ−811） −E.coli pTG3533（寄託番号Ｉ−812）。
第１図は、ヒト第IX因子のヌクレオチド配列および対応
するアミノ酸配列を示す。 第２図は、第１図に示すcDNAの一次翻訳生成物の種々の
ドメイン構造の大要を示すものである。
するアミノ酸配列を示す。 第２図は、第１図に示すcDNAの一次翻訳生成物の種々の
ドメイン構造の大要を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/02 C12N 15/00 - 15/90 A61K 37/465 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (16)
- 【請求項１】（Ala1）FIX （上記FIXは、成熟したヒト第IX因子又はその類似蛋白
質を示す。） で示される蛋白質をコードするDNA配列。 - 【請求項２】プロシークエンスをコードする部分および
成熟第IX因子または類似の成熟蛋白質をコードする部分
の少なくとも２つの部分を有し、下記に示す第IX因子cD
NAのヌクレオチド配列と比較する場合、対応するアミノ
酸配列において、チロシン（＋１）がアラニンに変換さ
れるような少なくとも１個のヌクレオチドの変異を有す
る配列であることを特徴とするヒト第IX因子または類似
の蛋白質をコードする請求項１記載のDNA配列。 - 【請求項３】チロシンをコードするTATコドンがアラニ
ンをコードするコドンGCCまたはGCTにより置換されてい
る請求項１又は２記載のDNA配列。 - 【請求項４】コドン（＋１）がアラニンをコードし、コ
ドン（−３）がバリン、アルギニン、リジン、トレオニ
ンまたはセリンをコードすることを特徴とする、ヒト第
IX因子または類似の蛋白質をコードするDNA配列。 - 【請求項５】 （Ｘはバリン、アルギニン、リジン、トレオニンおよび
セリンからなる群から選ばれるアミノ酸である。） をコードする配列を有する請求項４に記載のDNA配列。 - 【請求項６】下記に示す第IX因子cDNAのヌクレオチド配
列と比較する場合、対応するプロシークエンスにおい
て、プロリン（−３）がバリン、アルギニン、リジン、
トレオニンまたはセリンに変換され、且つ成熟第IX因子
または類似の成熟蛋白質をコードする配列において、チ
ロシン（＋１）がアラニンに変換されるような変異を有
する配列である請求項４または５に記載のDNA配列 - 【請求項７】第IX因子の天然シグナル配列（−46から−
18）をコードする部分をも有する請求項１乃至６のいず
れかに記載のDNA配列。 - 【請求項８】ベクターが請求項１乃至７のいずれかに記
載のDNA配列の少なくとも１種および宿主細胞において
該配列を発現させるための要素を有することを特徴とす
る、宿主細胞において第IX因子または類似の蛋白質を発
現するベクター。 - 【請求項９】ヒト第IX因子または類似の蛋白質をコード
するDNA配列が挿入されているポックスウイルス属に属
するウイルスゲノムからなる請求項８に記載のベクタ
ー。 - 【請求項１０】ポックスウイルス属に属するウイルス
が、ワクシニアウイルス及び牛痘ウイルスの中から選択
されるいずれかである請求項９記載のベクター。 - 【請求項１１】組み込みプラスミドである請求項９に記
載のベクター。 - 【請求項１２】請求項９または10に記載のベクターで感
染されているか、或いは請求項11記載のベクターで形質
転換された宿主細胞。 - 【請求項１３】VERO、BHKおよびCHO細胞並びにこれらの
サブクラスから選ばれた哺乳類細胞の１種である請求項
12記載の細胞。 - 【請求項１４】請求項12または13に記載の細胞を培養し
て、形成された第IX因子または類似の蛋白質を回収する
ことを特徴とする活性ヒト第IX因子または類似の蛋白質
を製造する方法。 - 【請求項１５】細胞培養をビタミンＫを含有する培地で
行う請求項14記載の方法。 - 【請求項１６】（Ala1）FIX （式中、FIXは天然または組換え第IX因子或いはその類
縁物質を示す）。
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