JPS61502164A

JPS61502164A - 第▲ｉｘ▼因子の製造方法

Info

Publication number: JPS61502164A
Application number: JP60502263A
Authority: JP
Inventors: ド　ラ　サル　アンリ; ドリリエン　ロベール; アルテンブルガー　ウエルナー; トルストシエフ　ポール; ルコツク　ジヤン‐ピエール
Original assignee: トランスジ−ン　ソシエテ　アノニム
Priority date: 1984-05-22
Filing date: 1985-05-21
Publication date: 1986-10-02
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: JPH082307B2; EP0162782B1; CA1262877A; DE3576360D1; EP0162782A1; WO1985005376A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】第１Ｘ因子発現ベクターおよび活性第１ｘ因子生産細胞系本発明は、ヒト第１Ｘ因子または類似分子を産生ずる細胞系の構築に関する。

第１Ｘ因子は、血液凝固過程に関与する蛋白である。第１Ｘ因子は、チモーゲンの形で合成され、翻訳後に炭化水素鎖の付加、アスパラギン酸の水酸化及び１２個のグルタミン酸のγ−カルボキシーグルタミン酸への転換により＠飾される。

後者の修飾は、ビタミンＫに依存している（ベルチナら、１９８１年）。

肝臓が、第１Ｘ因子の合成部位である。

第１Ｘ囚子は、血友病患者の血中では活性が低いがあるいは存在しない。血友病Ｂは、もっと頻度の高い形の血友病、即ち、血友病Ａと同様に、出血時間が非常に長いことが特徴でおる。これは、劣性伴性体質の形で遺伝するくベドナーら、１９８２年）。

第■因子欠損の分子特性は、明らかではない。

第１Ｘ因子を血友病Ｂ患者に与えると、出血時間は正常に回復する。

現在のところ、第１Ｘ囚子の唯一の利用源は、ヒト血漿であるが、場合によっては相応するウシ蛋白を使用することができる。

第■因子製剤は、パイロジ−ニック（発熱を起こす）であることがあり、また、病原因子または肝炎ウィルスのようなウィルスおよびエイズ（Ａ、Ｉ、Ｄ、Ｓ、）のベクター因子で汚染されている危険性がある。

このため、組換えＤＮＡ法による極めて高純度の第１Ｘ因子の製造方法の開発に関心がもたれている。

しかしながら、この方法は、ある種の困難を伴う。

第■因子は、上記第２パラグラフで述べたように、高次に修飾された蛋白でおる。

第■因子の安定性又は活性に対するこれら修飾の重要性は、十分には理解されていない、３修飾されたグルタミン酸が、第１Ｘ因子の活性化に必須でおると考えられる。

このため、本出願人は、第１Ｘ因子を活性形で、即ち、前述の特別な構造を考慮して、発現させることができるベクターを開発した。

該ベクターは、ヒト第１Ｘ因子又は第１Ｘ因子類似蛋白をコードする遺伝子を含むポックスウィルス科、特にオルソポックスウィルス属ウィルス、例えばワクシニアウィルスから成る発現ベクターであり、この遺伝子は、ポックスウィルス遺伝子プロモーター、例えばワクシニア７．５に蛋白をコードする遺伝子プロモーターに依存している。

今後、前記科、特に前記属の代表的種でおるワクシニアウィルスについて主に言及するが、他のオルソポックスウィルス、特に牛痘ウィルスを用いることができる。

発現ベクターがワクシニアウィルスから成ると言う場合には、このウィルスは不完全であることがある、即ち、べぜない程度に削除されてもよいことは、容易に理解されるところである。

一般に、本明細書に記載の「第１Ｘ因子類似蛋白」が同種のインビボ生物活性あるいは見かけの活性を有する蛋白を示すことは理解されよう。それは、特に、ある種のアミノ酸を除いて第■因子と同じ構造を有する蛋白を意味する。

グリコジル化、β−ヒドロキシル化およびＴ−カルボキシル化のような翻訳後修飾は、天然分子のこれらと必ずしも同一ではなく、重要なことは、その分子が天然第■因子のそれに代わり得る凝固活性を有することであり、あるいは完全分子の本来の活性を有する第１Ｘ因子の断片であることである。

ワクシニアウィルス（ＶＶ）による第１Ｘ因子のような外因性蛋白をコードする配列の発現は、必ず二つの段階を含んでいる：１）コード配列を■■プロモーターと一列に並べ、適当な細菌プラスミド中でクローン化されるＶＶＤＮＡの非必須領域に挿入しなければならない。

２）両側に位置するＶＶＤＮＡ配列は、同種組換えがプラスミドとウィルス性ゲノムの間でインビボで起るのを可能ならしめなければならない。二重相互組換えによりプラスミドＤＮＡ挿入片をウィルスゲノムに移入し、その中で繁殖、発現される（パニカリおよびパオレツチ、１９８２：マケットら、１９８２ニスミスら、１９８３：バニカリら、１９８３）。

このため、プロモーター／前記に定義した第■因子をコードする配列全部をワクシニアウィルス遺伝子、例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ＞遺伝子中に挿入し、このことにより、以下に説明するように、同種組換えが起り、選択が可能になる。

このようにして得られるハイブリッドウィルスは、細胞培養物を感染するのに使用することが出来、この培養物から第１Ｘ因子または類似蛋白を、細胞粉末または培地を用いて既知の方法により抽出することができる。

背推動物宿主細胞、特に哺乳動物細胞は、多種多様のものを使用し得るが、使用するベクターにあわせる。

特に、これら細胞は、ヒト肝臓細胞であってもよく、従うてインビボで第１Ｘ因子を生産する器官に由来する。

これら細胞のうち、Ｈｅ’ｐ　Ｇ　２系について述べる。このタイプの細胞系の調製方法は、特に、特許ＷＯ３１，１０３６６３（出願人工ウィスター・インステイチコート・オブ・７ナトミー・アンド・バ・イオロジー）に記載されている。

これら細胞は、第１Ｘ因子を生産しないが、血液凝固過程の蛋白を生産し、その一部は、第１Ｘ因子と同じ化学的性質を有する（第１Ｘ因子、蛋白Ｃ，プロトロンビン）。従って、これら細胞は、本発明を実施するのに好適の宿主である。

さらに、実験、により、この過程において他の細胞培養物、持にＶｅｒｏ細胞またはＢ　ＨＫ　２１細胞のような腎細胞を使用することかできることか確認され −Ｃいる。

ワクシニアウィルスは、ＣＨＯ系での感染サイクルを完了することができない。

従って、ＣＨＯ細胞で十分量の第１Ｘ因子を生産するために″、ワタシニアベクターを使用することはぐきない。

ベクターは、牛痘ウィルス、即ち、ワクシニアウィルス基に属するのがＣＨＯ細胞を感染できるウィルス由来のものを用いる。

形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞を、それらの発育を可能にする適当な培地で培養ブる。培養後、細胞または培地を集め、第１Ｘ因子蛋白を既知の蛋白および抗原精製方法により単離することができる。

本発明は、また、哺乳動物細胞の形質転換法、第■因子または類似蛋白を生産するこれら細胞の培養法並びに少なくともその一部が哺乳動物細胞を培養することにより得られる第１Ｘ因子類似蛋白に関する。

さらに詳しくは、本発明は、また、肝臓によって生産された蛋白の調製法に関するものであり、ワタシニアプロモーターの促進下ぐ前記蛋白をコードする遺伝子をそのゲノム中に挿入したワクシニアウィルスによって感染させた肝細胞系を培養することを特徴とする。

本発明は、また、得られた第■因子の活性に関り、て細胞培養培地におけるビタミンにの重要性を立証することができる。

従って、本発明はさらに詳しくは、前記のように、発現ベクターと表記される組変えウィルスで感染した哺乳動物細胞系を培養し、感染細胞系をビタミンに含有培地で培養することを特徴とする活性第■因子の調製法に関する。

使用するビタミンにの量は、細胞培養物により変えることができるが、培地を飽和させる量、例えば２０−８０μＣｌ／１１１２培地が好ましく、一般には約５０μＱ／戒培地のオーダーである。過剰量のビタミンＫが存在しても、障害は生じないものと考えられ、このビタミンは発育中に消費される。

培地自体は既知である。即ち、使用細胞がＶｅｒｏ細胞のような腎由来細胞でおる場合、使用する培地はドゥルベコ培地で良い、ＢＨＫ２１細胞の場合にはガルスゲロウ最小必須培地（ＭＥＭ）：Ｃｈａｎｇのような肝由来培養物の場合はＭＥＭ培地が使用されよう。これらの培地に、胎仔ウシ血清１０％を加えるのが好ましい。

本発明のその他の特徴および有用性は以下の実施例を参照すればざらに明らかとなろう。

本発明によるベクターウィルスの調製は、特に以下の段階を含んでいる：１）　第１Ｘ因子に相応するＣＤＮＡクローンの生産（第１−３図に図示）：第１図は、第１Ｘ因子ＣＤＮＡに対する第１Ｘ因子およびそのホモローブ用プローブの模式図でおる。

第２図は、得られたＣＤＮ八部弁部分列を示す。

第３図はＭ１３ｔＣ１３１５の調製法を示す。

２）　ｐＢＲ３２２からのミニプラスミドｐＴＧ１Ｈの合成（第４図）。

３）　このミニプラスミド中へのＶＶＴＫ遺伝子保有Ｈｉｎ−Ｊ断片の挿入。

４）　ＴＫ遺伝子への７．５に蛋白プロモーターの挿入（第５図）。

５）　ｐ７．５にの促進下でのＭ１３ｔＣ１３１５により保持された第■因子をコードする遺伝子の挿入（第５図）。

６）　後者のプラスミドの必須要素のワクシニアウィルス中でのクローニング（第６図）。

以下の実施例に得られた種々の成分の性質を説明する。

使用した種々の材料は実施例中に示す。

特に明示しない限り、酵素はメーカー指示の条件下で使用し、用いた方法は当業者には既知のものである。

図に示すアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、冗長にならないように本明細書の本文には記載しないが、本願の必須部分を構成するものである。

ヒ１〜第１Ｘ因子に相応するＣＤＮＡクローンの生産ヒト第１Ｘ因子に相応するＣＤＮＡクローンの生産は、本出願人の名で出願されたフランス特許Ｎα８４１０７１２５にすでに記載されている。

ヒト第ＪＸ因子に相応するＣＤＮＡクローンを得るには、単一合成オリゴヌクレオチドから成るプローブを用いる。

驚くべきことに、この合成オリゴヌクレオチドを用いてヒト肝臓ＣＤＮＡバンクから直接用■因子クローンを得ることができた。従来は、ウシ第１Ｘ囚子のアミノ酸配列が知られているだけである。

ＲＮＡは、トルストシェフら（１９８１）が記載のように、８Ｍ＠酸グアニジン抽出法によりヒト肝臓５ｇから調製する。

このようにして得たＲＮＡは、メーカーの仕様書に従ってポリＵ−セファロース（７１１１７９７社）カラムクロマトグラフィに付し、ポリーＡ含有ＲＮＡ抽出物を得る。

ポリ−へ配列は、オリゴ（ｄＴ）を「プライマー」として用いる逆転写の指標として利用できる。ＣＤＮＡは、１００ｍＭＴｒ　ｉ　５−）（Ｃ９（ｐＨ８，３＞　、　１０ｍＭＭＱＣ９２，５０ｍＭＫＣ９，３０ｍＭメルカプトエタノール、１０μｇ／１１１１２オリゴ（ｄＴ＞　、５０μｇ／或ポリーＡ−ＲＮＡ、夫々０．５ｍＭのｄＡＴＰＸｄＧＴＰ。

ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、およびニワトリ筋芽細胞逆転写酵素（ライフ・サイエンシズ社＞８０単位を含有する試薬１００μＣを用いて合成した。

４２℃で４５分後、反応゛を終結させ、ｃＤＮＡ／ＲＮＡ複合体を１０５℃で３分間加熱して変性ざぜ、素早く水浴に移す。

第二のＤＮＡ鎖の合成の場合には、前記反応混合物を５倍に希釈し、１００ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６，９＞　、１００ｍＭＫＣＱ、２００μＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび３２Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性０．５Ｃｉ　／ｆｌｌ［ｎ０１）で最終濃度に調整する。

次いで大腸菌・ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ断片）（べ一リンガー・マンハイム社＞１０単位を添加し、２５℃で２時間培養する。

二重鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓｃＤＮＡ）をフェノール／クロロホルム（５０：　５０）の等容量で抽出し、１０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＱ　（１）Ｈ８）　、１ｍＭＥＰＴＡで飽和し、エタノールで２度沈澱させる。

ポリ−Ａ−ＲＮＡ５μＱからｄｓｃＤＮＡ約９７０ｎｇが得られる。末端は、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）、３００ｍＭＮａＣＱおよび３　ｍ　Ｍ　Ｚ　ｎ　ＣＱ　２含有反応培地０．１ｍｆ２中で８１ヌクレア一ゼ５単位を用いて消化することによりフリーにする。３７℃で１時間後、ＥＤＴＡおよびＳＤＳを添加し、最終濃度をそれぞれ１０ｍＭおよび０．１％にし、反応混合物を６５ ℃で５分間加熱する。

続イテ、Ｓｌで消化されたｄｓｃＤＮＡを、１００ｍＭＴｒ　ｉ　５−Ｈ（，９（ｐｔ−１７，５＞　、５ｍＭＥＤＴＡ。

１００ｍＭＮａＣＱ含有の前もって用意した５−２０％スクロース勾配に付し、５Ｗ６０Ｔ　ｉローターを用いて３０、ｏｏｏｒｐｍにて１５℃で１６時間遠心分離する。

０．５ｍｌの両分を集める。ＣＤＮＡの大きざを測定するため、各両分の１μＱを中性アガロースゲル電気泳動にかけ、各両分の移動度を適当な分子量マーカーと比較する。

１キロベース（１千塩基）以上のＣＤＮＡを含有する両分を合せ、支持体として大腸菌ｔＲＮＡ５μｑの存在下に一晩、２倍量のエタノールで沈澱させる。沈澱物は、０．１ｘｓｓｃ　（５ｍＭＮａＣ９，０，５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０＞２０ｕＱに再懸濁させる。

Ｉｌ、ｃＤＮＡのクローニングホモポリマー末端要素（約１５のｄＣＭＰ）を、デオキシヌクレオチジルターミナルトランスフエラーゼを用いてＣＤＮＡの３′末端に付加する（デングら、１９８１）。

同様に、ポリーｄＧＭＰホモポリマー末端要素（約１０のｄＧＭ’Ｐ）を、ＰＳｔＩ制限酵素でめらかしめ消化した１Ｒ３２２プラスミドの３′末端に付加する。

ボ！Ｊ−ｃ−ｄＣＭＰ末端を有するｃＤＮＡ６０ｒ＋ｇおよび前パラグラフの条件下に調製したベクター１μｇを、１−ＯｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＱ　（りＨ７，５＞　、１００ｍＭＮａＣＱ中において４２℃で２時間加熱する。組換えプラスミドを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　８７３９を形質転換しくマレ−ら、１９７７）、形質転換体をテトラサイタリン１５μＣ１／ＩＩＩｆ１２を含有する寒天−ＬＢ平板上で選択する。形質転換体３０，０００を得、そのうちの約５０％は１Ｋｂ以上のＣＤ　Ｎ　Ａ挿入片を含んでいる。全ての形質転換体を最小量のＬＢ中に平板から取り、等量のグリセロールを加えた後、得られたバンクを一２０℃で保存する。

肝臓により合成されたウシ蛋白をコードする遺伝子配列の１７５５個のヌクレオチドを分析しくマツクギリプライら、１９８０　：チュングら、１９８１）、優先的に使用されるコドンを立証する。５２個の塩基の配列を選択した。

このオリゴヌクレオチドは次のように構築されるニオ＋）ゴヌ’）Ｉ＃チドＡ　：　ｄ　（ＣＴＣＡＣＡＣ丁ＧＡＴＣＡＣＣＡＴ’ＣＣＡＣＡ丁ＡＣＴ＞　、オリゴヌクレオチドＢ：ｄ　（ＧＣＴ丁ＣＣＡＧＡＡＣＴＣ丁ＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＡ）ｔ３よび相補断片Ｃ：　ｄ　（ＧＧＡＡＧＣＡＧ丁Ａ丁Ｇ丁〉を、コーりら（１９８２）により既に記述されているように、無機固形支持体上でホスホトリエステル法により化学的に合成し・、フリック（１９７８）記載のようにＨＰＬ、　Ｃにより精製する。

・オリゴヌクレオチド８０，５ｎｍｏｌを６０ｍＭＴｒｉｓ−１１０９（ｒ）８７．８＞　、６ｍＭＩＶＢＪＣ９２，６ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭＡＴＰ、６ｐｎｏｔ３”Ｐ−ΔＴ　Ｐ　（３０００ｃｉ／ｍｍｏｌ　）およＵ　Ｔ　４ポリヌクレオチドキナ一ゼ２単位を含有する反応培地１０μＱ中において３７℃で３０分間培養する。５′−リン酸化オリゴマーＢを１０ｍＭＴｒ　１ｓ− ＨＣＱ（ｐＨ７，５）、ＩｍＭＥＤＴＡ中でオリゴヌクレオチドＡおよびＣｏ。

５ｎｍｏｌと混合し、混合物＠１００℃で加熱し、緩徐に冷却して４℃にする。

オリゴヌクレオチドへおよびＢの反応混合物を、６６ｍＭＴｒ　１ｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５＞、１００ｍＭＮａＣＱ、７゜５ｍＭＭｇＣＱ２．２ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍＭスペルミジン、０．２ｍＭＥＤＴＡおよびＴ、ＤＮＡリガーゼ４単位を含有する反応混合物５０μＱ中に冑いて４℃で一晩ライゲートする。

１ｑられた５２量体を２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりライゲーション混合物から精製する。

ＩＶ、ヒト肝臓ＣＤＮＡバンクの分析的１０，０００コロニーをテトラサイクリン１ｏμｑ／−を含有するいくつかの寒天−ＬＢ血で発育させる。翌日、細菌コロニーをニトロセルロースフィルターに移し、フィルターを基本的にはグルンスタインら（１９７９）が記載しているように、コロニーハイブリダイゼーションのため調製する。最初のテトラサイクリン含有面上の残りの細菌を３７℃で数時間発育させる。

ハイブリダイゼーションプローブは、５２量体１１００ｎを３２Ｐ−ＡＴＰ５０ μｃｉとカイネーションすることにより調製する。ハイブリダイゼーションは、６ｘｓｓｃおよび１×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、大腸菌ｔＲＮＡ５０．ＵＯ／ｍＩ２の４．０ｗ２中において４８℃チー晩行う。

翌日、フィルターを４２℃において、６ＸＳＳＣ。

０．１％ＳＤＳの溶液で数回洗浄する。フィルターを乾燥し、次いで一晩オートラジオグラフィにかける。

結果ウシ第１Ｘ因子のアミノ酸配列（カタヤマら、１９７９）を分析して、若干縮重したコドンにより決定されるアミノ酸から成る長い配列を見い出す。

プローブはこのように、４つのコドンによりコードされた４つのアミノ酸（ｔｈｒ、ｖａ　Ｉ、ＣＪ　！　Ｖ）　、２’：）（７）＋トンによりコードされた１２のアミノ酸（ｑｌｕ、ｌ　ｙｓ。

ｐｈｅ、ｇ　Ｉ　ｎ、ｔｙｒ、ａｓｐ、ｃｙｓ）および１つのコドンによりコードされた１つのアミノ酸（ｔｒｐ＞に相応する、ウシ第１Ｘ因子の３６〜５２番目のアミノ酸に相応するように作られたく第１図）。

続いて、ウシプロトロンビンおよびウシフィブリノーゲンの５８５９ｉｉのコドンを分析し、バリンコドンＧＴＧは、３８回中２１回用いられていることが明らかとなった。同様に、ＴＴＣおよびＴＧＴは、アミノ酸ｐｈｅおよびｃｙｓの場合の他のコドンよりそれぞれ２倍の頻度で使用される。

その他の特に顕著な優先的使用は分析からは判明しなかったが、ある種のヌクレオチドは、おる種のコドンの場合第３位、例えばグリシンおよびスレオニンの場合のＧ、でまれに見い出される。

ざらに、Ｇ：Ｔ対は、Ｇ：Ｃ塩基対より安定性に劣るが、少なくと、もコロニーのバイブリプ−ジョン中に５２＠体のバイブリプ−ジョンの安定化に寄与するであろうが、一方、Ａ：Ｃ対は、寄与しないでおろう。

従って、縮重コドンの第３位でＧもしくは八が選択されるアミノ酸（ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｇｌｎ）のいずれについてもＧが選択された；同様に、アミノ酸ｔｙｒおよびａｓｐの場合Ａに比してＴが選択された。

ンの場合第３位におけるヌクレオチドとしてＴまたはＧに限定された：しかしながら、前述のように、Ｇはスレオニンコドンの第３位にまれに見い出されるだけでおる。従って、スレオニンコドンの１つには王を選択し、５２量体内の二次構造による問題を回避するため、グリシンの場合第３位にはＴを選択し、第２のスレオニンコドンの場合第３位にはＡを選択した。

ヒトｃＤＮＡバンクの選択および第１Ｘ因子クローンの同最初の方法は、ウシ肝臓ＣＤＮＡバンクを選択するためこの５２量体を用い、次いでこのウシ第１Ｘ因子ＣＤＮＡクローンをヒト肝臓ＣＤＮＡバンク用プローブの形で用いることＩ５つだ。この方法は、ウシおよびヒト蛋白のＮ末端でのアミノ酸配列にあける既知の相同性を一般化できるという仮説に基づいている（ディ・シピオら、１９７７、参照）。

アミノ酸配列にあけるこの種間の相同性に基いて、ウシ肝臓およびヒト肝臓バンクの平行選択を行った。

使用したハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、５２量体プローブと第■ 因子ＣＤＮＡ間の実際の相同性が明らかでなかったため、厳密なものではなかった。

ウシＣＤＮＡバンクにおける種々のコロニーは、５２量体プローブでの選択により正のシグナルを与えた。ヒト肝臓ＣＤＮＡバンクでは、用いられた条件下でシグナルを与える１つのコロニーが得られた。

この研究は、ヒト第■因子ＣＤＮＡを単離する目的で行われたため、ざらなる分析はウシクローンでは行わず、必らゆる試みはヒトクローンについて行った。

このクローンがヒト第■因子に相応することを確立するため、組換えプラスミドをＰＳ↑工で消化し、切断されたＣＤＮＡ挿入片をＭ１３ｍｌ）８フアージに移入しくメツシングら、１９８２）、ジデオキシヌクレオチドを鎖ターミネータ− として用いて配列させる（サンガーら、１９７７）。得られた配列は、第２図のヌクレオチド１−１８０に相応し、推測されたアミノ酸配列は、該クローンがじト第１Ｘ因子ＣＤＮＡのクローンであることを確証している。

このクローン（ｐＴＧ３９７）のＣＤＮＡ挿入片のより完全な配列は、マキサムの方法およびギルバートの方法（１９８０）またはサンガーの方法を組合せることにより、Ｍ１２ｍｐ９においてサブクローン化された制限セグメントから決定される。得られた配列を第２図に示す。

結果の考察単一オリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、２．１Ｋｂの挿入片を含むヒト第■因子クローンを単離することができた。この２．１Ｋｂ挿八片へ第２のヒト肝臓ｃＤＮＡバンク選択用プローブとして用いる場合、２．６Ｋｂ挿入片を含む、第■因子に特異的な別のクローン（１）ＴＧ３９８）が単離される。

ｐＴＧ３９８の５′末端は第２図のヌクレオチド４８０に位置する。このことは、ｐＴＧ３９８の３′非翻訳末端が不完全でおり、非翻訳３′完全末端は約１．７Ｋｂの長さであることを示唆している。

得られたヌクレオチド配列とクラウチおよびディビーによって示された配列との間には差異が認められる。

この差異は、ヌクレオチド５８１でのトランジション（Ｇ−＋Ａ＞　、それによるアラニンのスレオニンへの転換を含んでいる。第１Ｘ因子連結ペプチドのアミノ酸配列決定により、この位置にスレオニンが存在することが確認される。

これらのデータは、他の血清蛋白と同様に、第■因子が多形性であることを示唆している（クーパー、１９７８＞。

この仮説は既に確認されている（マツフグランＲ，Ａ。

ら、“ブラッド″６４．２６４ａ、１９８４）。

Ｇ：ＴＷ換コドンの使用およびヌクレオチドプローブにおける可能な二次構造の排除を考慮することにより、単一クローンの配列・決定用プローブとして十分に使用し得ることが明らかにされた単一５２量体を得ることができた。選択した５２量体は、４３１５２のヌクレオチドについてクローン化された配列と一致し、一方、２つの誤射はＧ：Ｔ対である。

このことは、先に観察された種間ヌクレオチド配列において一致率が８５％であることを反映している。

第■因子ＣＤＮＡの一般構造第■因子ＣＤＮＡヌクレオチド配列の知識は、対応する蛋白におけるアミノ酸のコードされた配列の推測を可能にする。ｐＴＧ３９７のＣＤＮＡ挿入部は、以下のヒト第１Ｘ因子特性を示す：ａ。第■因子は、４１５個のアミノ酸を含む蛋白である。

第３図において、ヌクレオチド１４０−１３８４はヒト第１Ｘ因子をコードする。

ｂ、ヒト第■因子は、付着シグナル配列および前蛋白配列を有する前駆体の形で合成される。これは、分泌される運命にあるすべての蛋白に共通の特性である。

第■因子の場合３、ヌクレオチド２−７６によってコードされた約２５個のアミノ酸の標準的シグナル配列がある。このアミノ酸の疎水性伸長部は、通常、蛋白が細胞の外側へ分泌される間に除去される。ヌクレオチド７７−１３９は、おそらく分泌後素早く、第１Ｘ因子の成熟形から除去される前蛋白配列をコードする（ヌクレオチド１４０のチロシンで開始する）。この前蛋白配列の末端でしばしば見られるように、リジンーアルギニンニ塩基アミノ酸構造は、前蛋白配列と成熟第ＬＸ因子の第１アミノ酸の接合部に見い出される。

Ｃ０第１Ｘ因子の活性形（ＩＸａ）は、第■因子の不活性またはチモーゲン形から、活性第■囚子（ＩＸａ）による２つのペプチド結合の加水分解により産生される。このペプチド結合は、アミノ酸ａｒｐ−ａｌａ（ヌクレオチド５７２−５７７＞およびｖａｔ−ｖａｌ（ヌクレオチド６７７−６８２＞の間にルＺめられるａ第１Ｘ因子の活性化の間に遊離した３５個のアミノ酸から成る最も長いペプチドは、活性化ペプチドと称されている。このように、第１Ｘａ因子は、２つのペプチド鎖から成ってい：即ち、１４５個のアミ、〕酸から成るｌ（ヌクレオチド１４０−５７４）Ｊ５よび２３５個のアミノ酸から成るＨ鎖（ヌクレオチド６８０−１３８４）である。第１Ｘａ因子のＬおよび１」鎖は、ジスルフィド架橋により維持されている。

Ｈ鎮は、典型的セリンプロテアーゼの触媒活性において重要な他の残基と同様に、セリンプロテアーゼの典型的活性部位（ｍｅｔ−ｐｈｅ−Ｃ￥Ｓ−ａ　ｌ　ａ −ｇＩ　ｙ。

ヌクレオチド１１８１−１１９５）を含んでいる。１は、ビタミンに依存性過程により、γ−カルボキシル化されてＴ−カルボキシグルタミン酸を生じる１２のグルタミン酸単位を含んでいる。

これは、凝固過程においてＭＩＸａ因子がＣａ＋＋′、膜性リン脂質膜および第 ■ａ因子に固着するのに重要である。

ｄ。４つの炭水化物固定部位を有するウシ第１Ｘ因子とは対照的に、ヒト第■Ｘ因子は、炭水化物が付加し得る部位が２カ所ある。これらの部位は、ともに活性化ペプチド、即ちヌクレオチド６０８−６１６および６３Ｂ−６４６に位置し、典型的配列ａ　Ｓ　ｎ　−Ｘ　−ｉ　ｈ　ｒ　、／　Ｓ　ｅ　ｒを含んでいる。

対照的に、ウシ第１Ｘ因子は、４つの付着炭水化物を有してあり、その構造は、最近、ミズオチら（１９８３）により決定された。

１児」こ必要なりローと制匪■尿テｃＤＮＡの調製（第・３図参照）ｐＴＧ３９７を制限酵素ＰＳｊＩで消化した。ｃＤＮＡバンクを１）ＢＲ３２２のＰＳｔＩ部位でＧ／Ｇ末端を介してクローン化し、ざらに、ｐＴＧ３９７の第 ■因子は内部ＰＳｔＩ認識部位を含んでいないので、この処理により、Ｐｓ１４部位でクローン化し得る末端とともに、第■因子に相応する無傷の２．’１ＫｂｃＤＮＡが遊離する。

第■因子ＣＤ　Ｎ　Ａ断片は、あらかじめＰｓｔＩで消化しアルカリホスファターゼで処理したＭ１３ｍｐ８ファージ中に標準法により移入される。組換えファージを用いてＥ。

ｃｏｌｉ株ＪＭ１０３をトランスフェクトする。

組換えファージＭ１３ｔ０３９７Ｂは、以下に記載する様に、第１因子ＣＤＮＡ源として用いられる。

第■因子ＣＤＮＡは、ヌクレオチド７−１０に位置するテトラヌクレオチド配列ＣＧＣＧを認識する酵素ＦｎｕＤ■に対する１つの認識部位を含んでいる。

Ｍｌ　３　ｔ　Ω３９７Ｂ７Ｆｒ：Ｐｓ　ｔ　ＩおよびＦｒ１ＬＪＤ］Ｉで消化することにより、１つの大きな断片と数個の小さな断片が得られ、これ等はＭ１３ｍｐ８におけるＦｎｕＤＩＩに対する１９カ所の認識部位に相応する。最も大きな断片は、ＦｎｕＤＩＩ−ｐｓｔＩ断片に相応する。

この断片は、第１Ｘ因子ＣＤＮＡの５′末端から９つのヌクレオチドとＧ／Ｃ末端を分離する。このＧ／Ｃ末端を５′末端から分離することは、発現ベクター中での第１Ｘ因子ＣＤＮＡの発現および安定性を増大するのに重要と考えられた。

これら９つのヌクレオチドを除去することにより、シグナル配列のＡＴＧを除去する。しかしながら、このＡＴＧが翻訳を開始するＡＴＧであることは確がではない。

ＦｎｕＤＩＩでの消化により除去された第■肉子部分は、シグナル配列の中にあり、従って第■因子活性にとっては重要ではない。

もし翻訳が、Ｆｎｕ［）［での消化の間に除去されるＡＴＧで開始するならば、このシグナル配列は、アミノ酸５個分だけ短くなっている。この５個の付加アミノ酸が、第１Ｘ因子の分泌および／または使用にとって重要であるがどうかを検討するため、ＦｎｕＤＩＩでの消化により除去されたヌクレオチド配列を２つの合成オリゴヌクレオチドを用いて復元する：Ａ＞　５’　ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＣＧ　３’Ｂ）　５’　ＣＧＣＴＧＣＡＴＧ　３’オリゴヌクレオチドＡにおいて下線を引いた配列は、ＦｎｕＤＩＩによる消化によりファージＭ１３ｔｇ３８７Ｂから最初のヌクレオチドＴが取れて分離した配列に相応する。

オリゴヌクレオチドＢはオリゴヌクレオチドＡと相補している。

オリゴヌクレオチドＡとＢをハイブリダイゼーションすると、粘着性ＢａｍＨＩ末端を有する次の二重鎖構造が得られる：５’　ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＣＧ　３’３’　ＧＴＡＣＧＴＣＧＣ５’ オリゴヌクレオチドＡおよびＢを、Ｍ１３ｔに１３９７Ｂから精製した第■因子ＣＤ’Ｎ　ＡのＥｃｏＲＩ−ＦｎｕＤＩＩ消化断片とライゲートする。アルカリホスファターゼで処理し、ＢａｍＨＩでの制限に付したファージＭ１３ｍｐ７０１をざらにライゲーションのために加え、ライゲーシヨンを一晩行う。最終ライゲーション混合物の一部を用い、ＪＭ１０３細胞を形質転換する。白色領域を生じた組換えファージＭ１３ｔｇ３１５のヌクレオチド配列は、その構造が正しいことを確証している。Ｍ１３ｔＣ１３１５をＢａｍＨ工で消化すると第１Ｘ因子ｃＤＮＡ断片をＭ’ＭＩし、その５′配列は次の通りである：オリゴヌクレオチドＡに相応する配列は、上記に点線で示しである。下線を引いた配列は、Ｍ１３ｔｇ３１１での第１Ｘ因子ＣＤＮＡのＢａｍＨニーＢｇｌ　ＩＩ消化断片のシフナル配列にはない５個のアミノ酸をコードする１５個のヌクレオチドに相応する。

ハイブリッドプラスミドの構築第１Ｘ因子をコードする配列をＶＶゲノム中に移入し、次いでそれを発現させるのに必要な種々要素を合わせた大きさは、数Ｋｂのオーダーでおる。従って、構築作業に用いる大腸菌中での複製プラスミドの大きさをできるだけ小ざくすることが、必要な操作を容易にするのに必要と判断された。

ＶＶゲ°ツムのＨｉ　ｎｄＩＩＩ　（Ｈｌｎ−Ｊ）断片は、ＤＮＡの交換および組換えをＶＶゲノム中・に挿入可能にするため既に使用されている（マケットら、１９８２）デミジンキナーゼ（ＴＫ＞の完全遺伝子を含んでいる。ＴＫ遺伝子における挿入部を■Ｖゲノム中に移入すると、単純選択により認識し得るＴＫ欠陥ウィルスが得られることに留意することが重要である。

まず、ＶＶＨｒ　ｎ−Ｊ断片の統合に使用し得る単一１−１ｉｎｄ１１部位を有する小ざなプラスミドを生産することが必要であった。ざらに、不必要な制限配列をプラスミドから除去し、以下の操作を行い得るようにすることが重要であった。

３）構築は、ヌクレオチド１０８つおよび２４９１間セグメントの自然欠失によるプラスミドｐＢＲ３２２由来ベクターであるプラスミドｐＭＬ２（ルスキーおよびボッチャン、１９８１）から開始した（第４図）。

ＰＳｔＩ配列は、まず、ｐｕｃｓのＡｈａｌＩ［−Ａｈａ■断片（ビエイラおよびメツシング、１９８２）をＣＭＬ２の２つのＡｈａＩ１１部位間に挿入することにより除去し、１９の塩基対を除去した。「リンカ−テーリング」法（ラテら、１９８４）を用い、ヌクレアーゼ＄１で処理したＨ　ｉ　ｎｄＩＩＩリンカ− をＮｒｕ工とＥＣＯＲＣＯＲ工部挿間し、ＢａｍＨＩ部位を除去した。これにより、機能的β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を与える）を有し、ざらに大腸菌において活性な複製開始点および単−Ｈｉ　ｎｄＩＩＩ制限部位を含む２０４９塩基対のプラスミドが得られる。

この構築物は、ｐＴＧＩＨと命名された。

４）　ＴＫ遺伝子を有するＶＶＤＮＡのＨｒｎ−Ｊ断片をあらかじめｐＢＲ３２７由来ベクター中でクローン化した（ドリリアンおよびスベーナー、１９８３）。この４．６Ｋｂ断片をｐＴＧＩＨのＨｉ　ｎｄＩ１１部位で再クローン化した。ＴＫ遺伝子がアンピシリン耐性をコードする遺伝子に比べ末梢に位置するクローンを選択した。

この構築物ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫを以下の実験においてキャリアーとして使用した。

５）　続く段階は、挿入第１Ｘ因子をコードする配列の発現を制限するのに使用できるｖｖプロモーターを単離することであった。７，５００ダルトン（７，５Ｋ＞の蛋白をコードする初期遺伝子のプロモーターは既に同じ目的に使用して成功しており（スミスら、１９８３）、従ってその単離を行った。

７．５に遺伝子は、ＷＲ型■■ゲノムの最も小さな５ａｌＩ断片（Ｓａｌ−３断片）の１つに位置している（ベン力タサン、１９８１）。小断片は、優先的にクローン化されるため、５ａｌＩにより切断されたＷＲ型ＶＶＤＮＡをプラスミドＤＢＲ３２２中で直接クローニングすることにより得られるクローンの大部分は、３ａｌ−３断片を有している。この断片を３ａｌＩ消化および再ライゲーションによりベクターバクテリオファージＭ１３ｍｐ７０１に移入しくキーニーら、１９８３）、このことによりファージＭ１３ｔＱＳａ　ｌ　−３を得る。

このクローンにおいて、ＳＣａ■部位は、７．５に遺伝子の開始部ＡＴＧのすぐ隣に存在する。７．５に遺伝リメラーゼのフレノウ断片で完全にした後、リンカ −法によりＢＣＩＩｎリンカ−５’　−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３’を介して融合する。この過程によりＳａＣ工部位が除去位のすぐ下流に単−ＥＣ０ＲＩ部位が位置する。同時に、下流のＳａ　ｌ　Ｉ　（ＡｃｃＩ＞部位が除去され、従って士流部位が唯一の部位となる。

この構築物をＭ１３↑９７゜５にと命名する。

ＶＶＤＮＡのｌ−１ｉｎｄ−Ｊ断片内にＣ１ａ■およびＥＣＯＲ工部位が位置し、これらは約３０の塩基対によりへだてられている（ウェアおよびモス、１９８３）。

Ｍ１３ｔ（７７，５Ｋに存在する７、５にプロモーター断片は、ＡＣＣＩおよびＦＣＯＲＩで切除され、ｐ丁Ｇ１Ｈ−丁にのＣＩａＩ部位およびＥＣｏＲＩ部位間でクローン化されてｐＴＧＩＨ−Ｔ’に−Ｐ７゜５Ｋを生じる：その合成を第 °５図に示す。

この構築により、Ｍ１３ベクターの単一１３　ａｍＨＩ部位が７．５にプロモータ・−配列のすぐ下流に移入される。

この単−ＢａｒｎＨＩ部位は、以下の構築に使用する。

６）　ｐＴＧｌＨ−ＴＫ−Ｐ７．５Ｋを１３　ａｍＨＩで消化しノ、ＢａｍＨＩで消化したＭ１３ｔｇ１１５とライゲートする（第５図〉。

大腸菌の形質転換後、この方法により単離した粗換えプラスミドの１つのｐＴＧ３９３を、これが７．５にプロモーターからの発現のため正しい方向に第■因子ＣＤＮＡを保有するので、選択する。

ワクシニアウィルス内でのクロー・ニング（第６図）７）　スミスらに記載の方法（１９８３）は、ウィルスにより保持された昼遺伝子を不活性化するように、ＶＶＴＫ遺伝子に挿入部を有するプラスミドと野生型ウィルスゲノム間でのインビボ交換に基づいている。

ＴＫ″″ウィルスは、５−ブロモデオキシウリジン（５ＢＵＤＲ）の存在下にＴＫ−陰性細胞系に置くことにより選択できる（マケットら、１９８２）。チミジンキナーゼは、５ＢＵＤＲをリン酸化して５′−モノフォスフアートに変え、これは次いでトリフォスフアートに変換される。この化合物は、ｄ丁ＴＰアナローグであり、そのＤＮＡへの取込みは、ウィルスの正しい発育を阻害する。しかし、ＴＫ−ウィルスは、そのＤＮＡを正常に複製することができ、同様に丁に一細胞系中に見られるウィルスプラークとなる。

ワクシニアウィルスは、感染細胞の核におけるよりもむしろそれらの細胞質において繁殖する。このため、宿主ＤＮＡの複製および転写機構を利用することができず、ピリオンがウィルス遺伝子発現のための成分を有することが必要である。

精製ＶＶＤＮＡは非感染性である。

組換体を生じさせるために、ｖＶでの細胞感染および興味めるクローン化ＤＮＡセグメントでのトランスフェクションを同時に行う必要がある。しかしながら、組換体の発生は、ＤＮＡでのトランスフェクションに適格な細胞の小部分に限られる。このため、間接「合同Ｊ法を用いて非組換え親ウィルスのバックグラウンドを減することが必要であった。これは、非許容温度３９．５℃で繁殖できないワクシニアの熱感受性（ｔｓ＞変異体を生感染ウィルスとして用いることにより、行なった。（ドリリアンおよびスベーナー、１９８３）。細胞を非許容条件下にｔｓ変異体で感染させ、野生型ウィルスのＤＮＡでトランスフェクトすると、ウィルス増殖は、トランスフェクションに適切な細胞中で起こるだけであろう；他の細胞では、それらが感染したという事実にもかかわらず、いかなる結果も得られないであろう。

若し、ｐＴＧ３９３のようなワクシニアＤＮＡ断片含有組換えプラスミドが適当な濃度でトランスフェクション混合物中に野生型ＤＮＡとともに含まれるならば、それを適格細胞中でのワクシニアＤＮＡとの同種組換えに関与させることもできる。

ＶＶ−ＦＩＸ組換体のクローニング１１日令胚から確立され一次ニワトリ胚フィブロプラスト（０−ＥＦ）をウシ新生仔血清（ＮＣ３＞を加えたイーグル基礎培地（ＢＭＥ／ユーロビオ）中で発育、融合させる（直径２ｃｍの皿あたり２Ｘ１０６個）（ドリリアンおよびスペーナー、１９８３）。

細胞を０．０１−０．”ｌｆｕ／細胞の割合で、コペンハーゲン野生型つィルス由来ワタシニアウイルスの熱感受性変異体Ｎ７で感染させる（ドリリアンら、１９８１）。

ウィルス吸収後、細胞をＢＭＥ１５％ＮＣ３中において該ウィルスに許容温度（３３℃）で２時間培養する。細胞は次いで、精製コペンハーゲン野生型（Ｗｔ＞ウィルスＤＮＡ　（３０ｎｃ＋／皿）と異種遺伝子含有キメラプラスミドＤＮＡ　（３０ｎｇ／皿）との混合物で、リン酸カルシウム共沈法を用いてトランスフェクトする。

１時間吸収させた後、細胞をＢＭＥ／２％ＮＣ３の存在下において３９．５℃で２時間培養する。カルシウム沈澱をＰＢＳで３回洗浄し、細胞を５％ＮＣ３添加ＢＭＥ２ｍｆ２を用いて非許容温度（３９，５℃〉で２日間発育させる。

この過程により、野生型（Ｗｔ）または組換えゲノムを有するウィルスを膣冨にすることができる。

第２段階において、ＴＫ″″　（組換体）ウィルスを前記のように、５ＢＵｄＲの存在下で３７℃で選択することができる。これらの条件下において、ｔＫ″′ 粗換体組換ルスは、複製を行うことができるが、Ｗｔウィルスの発育は、ｄ丁ＴＰ７ナローグのそれらＤＮＡへの取込みにより妨げられる。

ウィルスを、第１段階において、１％寒天、Ｌ　Ｍ　Ｔ　Ｋ　−細胞および５％ＮＣ８含有固形培地を用いてクローン化しくドリリアンら、１９８２）、５ＢＵｄＲの存在下にＴＫ−細胞中で再クローン化する。第１Ｘ因子の正しい組換えが ■■のｔＫ遺伝子において起ったことを確認するため、組換えウィルスで感染したＣＥＦ細胞の全ＤＮＡを単離し、種々のエンドヌクレアーゼで消化する。分別後、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼとともに放射活性リンで標識した第■囚子ＣＤＮＡとハイブリッド化する。

以下の実験で使用したウィルスＶＶＲＴＧ２をこのようにして選択する。

単離したウィルスは、続いてＣＥＦ細胞ローンで培養し、以下の実験のため大量のウィルスを得る。

ＨｅＤＧ２系細胞のワタシニアウイルスによる感染ＨＣ４）Ｇ２細胞を、ＭＦＭ　（ＭＥＭ、ギブコ）および５％ウシ胎仔血清（Ｆｅ２）（ギブコ）から成る培地を含みビタミンＫ　（５０μｇ／ｍ１２）を添加した平底ビン中で培養、融合させる。これらの血は約１０７個の細胞を含む。

これら細胞を組換えワタシニアウイルスあるいは野生型ウィルスで感染させる。

実際には、細胞培養培地をとり、ワクシニアウィルス含有抽出物５００ＬｌＱを細胞上に置く（約５ｐｆｕ／細胞に等しい）。皿を室温で１時間撹拌し、次いでＦｅ２　（５％）およびビタミンＫ　（５０μＣｌ／ｆｆｌ！２）を加えたＭＥＭ１０ｍｉ２を加える。皿を９７℃でインキュベーター中に種々の期間（４，８，２２時間）置く。

感染細胞の培養培地の分析野生型ワクシニアウィルスおよび粗換えウィルスで感染した肝細胞から得た上澄みを検討した。この分析は、感染後４．８および２２時間に培地を検討することにより行った。培地を、常法（ミレットリッチら由来）に従い、第■因子をクエン酸バリウムに吸着させることにより分別した二第１Ｘ因子は、カルボキシル酸が分子内に存在する場合、この不溶性塩に吸着させることができる。

実際には、感染細胞上澄みの１容量（組換えまたは正常ワクシニアウィルスで感染した細胞から得た上澄み７回）にクエン酸ナトリウム（最終３０ｍＭ＞を加え、この容量の１／１０１の１Ｍ塩化バリウム溶液を撹拌しながら滴下する。

混合物を１時間撹拌し続ける。

沈澱をｓ、ｏｏｏｑで２０分間遠心分離する。

上澄みを集め、３０−７０％硫酸アンモニウム分画に付す。７０％硫酸アンモニウムで沈澱した画分を、２０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣＱ　（ｐＨ７，５＞２００ｉを加えることにより取り、同じ緩衝液で透析する。その後最終容量を約８００μＱにする。バリウム沈澱物を１０ｍＭＢａｃ９２．１００ｍＭＮａＣＱの０．３容量に再懸濁し、ａ、ｏｏｏｇで１０分間再遠心分離する。このペレット洗浄操作を更に２回繰返す。ペレットを２０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣＱ　（ｐＨ７，５＞の０．３容量に取り、２Ｍ硫酸アンモニウム０．０７５容量を滴下する。混合物を１時間撹拌し、８，０ＯＯＱで１０分間遠心分離する。

上澄み中の蛋白を硫酸アンモニウム（７０％濃度）で１時間にわたり沈澱させる。沈澱した蛋白をａ、０ＯＯＣＩで１０分間遠心分離する。

ペレットを２’ＯｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ、１５０ｍＭＮａＣＱ（ｐＨ７，５＞の２００μＱに溶解し、同緩衝液で透析する。　この一連の操作は、すべてＯ′Ｃで行う。

得られた画分を一２０℃で保存する。

これらは２つの方法で試験する：ａ）第■因子抗原量は、ＥＬＩＳＡ試験（販売元ディアグノステイカースタゴ）で算定する。

ｂ）この因子の活性は、抽出物を加えた血友病血漿の凝固時間を測定することにより計算する。

これらの測定値を正常ヒト血漿混合物を用いて得た値と比較する。

結果は％で表わす。実際には、１００％は、正常ヒト血液１鵬中に存在する因子の量に相応する。

結果は付表に示す。この表には、第■因子濃度をサンプル１１ＴＩＩ２あたりで示す。

野生型ワタシニアウィルスで感染させた肝細胞の上澄みでは、クエン酸バリウムに吸着した両分および非吸着画分におけるのと同様に、第１Ｘ因子抗原量は、１％以下でおり、凝固活性は２％以下でおる。対照的に、組換えウィルスで感染した細胞の上澄みでは、クエン酸バリウムに吸着し得る両分中の第１Ｘ因子量は、感染時間と共に増加する。

ＥＬＩＳＡ試験および活性試験により算定された量は同様である。クエン酸バリウムに吸着しなかった両分では、抗原量は低く（５５％）、活性は野生型ウィルスで検出したバックグラウンドと同等である。

結論として、組換えワクシニアウィルスで感染させたＨｅＤＧ２細胞は、活性第 ■因子を生じる。クエン酸バリウムに吸着しない画分中に第１Ｘ因子抗原が存在しないことは、これらの条件下では、生じた第１Ｘ因子は、実際に完全にγ−カルボキシル化されていることを示している。

佃細胞での発灰実験方法は、既述のものと同様である。

即ち、融合細胞ローンを主発明に記載の条件下で野生型ウィルスまたは組換えウィルス（１〜５ｉ）ｆＬＩ／細胞）で感染させた。細胞感染（即ち、細胞中でのウィルスの増殖）は、１０％ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ　（Ｃｈａｎｇ）、ドウルベコ（Ｖｅｒｏ）およびＭＥＭ−ガルスゴウ（ＢＨＫ２１＞培地中で２２時間行った。ざらに、ビタミンＫ（Ｎｏ、Ｖ３５０１、シグマ社カタログ）を５０μｇ／諧の割合でこれら培地に加える。

感染後、培地を主発明に記載のように分別した。

表Ａは、得られた結果を示す。結果は、ＨｅｐＧ２細胞の場合の％ではなく、単位で示した。１単位は、正常ヒト血漿１鵬中の第■因子量を示す。

表　ＡＶＶＲＴＧ２で感染した数種の細胞結果は、組換えウィルスで感染させた３種の細胞系は、活性第１Ｘ因子を産生できることを示している。

ＨＩＧ２細胞の場合ＨｅＤＧ２細胞を１％合成血清代用ウルトロザーＧ（販売元１ＢＦ−カタログＮ α５０９０２＞を添加したＭＥＭ培。

地に１２１５世代間（４継代培養）培養した。この培地は、ビタミンＫが添加しであるかまたは添加していなかつた。次いで細胞をウィルスで感染させた。得られた結果は、表Ｂにまとめられている。

表　ＢＶＶＲＴＧ２感染ＨｅｐＧ２細胞における第１Ｘ因子合成に対するビタミンにの作用この表Ｂは、ビタミンにの存在下で培養し、感染させた細胞は、γ−カルボキシル化活性第１Ｘ因子を生産することを示している。

対照的に、ビタミンに添加なしで培養し、感染させた細胞のγ−カルボキシル化第■因子産生は、少ない：バリウムに吸着しなかった両分は、かなりの量の第■ 因子抗原を含んでいる。さらに、バリウムに吸着した両分における凝固活性は、抗原量から予測された値より非常に小ざい。

細胞を通常培地で培養した場合、同様の結果が観察される：ビタミンＫを感染の間に除けば、バリウムに吸着しない両分は非常に多量の第１Ｘ因子抗原を含む。

ｖｅｒｏ細胞に対する作用ウシ胎仔血清（１０％）を添加したドウルベコ培地において培養したＶｅｒｏ細胞をＶＶＲＴＧ２または野生型ウィルスで感染させた。ウィルス増殖は、適宜ビタミンＫを添加した同培地で行なった。得られた結果を表Ｃにまとめた。

表　ＣＷＲＴＧ２ウィルス感染ｙｅｒｏ細胞にあける第１Ｘ因子合成に対するビタミンにの作用衣Ｃは、ビタミンＫを培地に添加することが、生じた第１Ｘ因子活性にとって非常に重要であることを示している。

感染時間が長くなるほどこのビタミン添加の重要性は大きくなるように思われる。

これらの結果を総合すると、感染細胞の培養培地にビタミンＫを添加することの重要性が明らかである。

野生型（ＷＴ＞または組換え（Ｏｆｆ）ワタシニアウィルス％−１，−一−−１１−２−一一一一−−−−−−−１−０゜。

感染細胞により生産された第１Ｘ因子の分別種々の動物細胞系を１ｐｆｕ／細胞で組換えまたは野生型ウィルスに感染させた。２４時間後、培養培地を集め、クエン酸バリウムで分別する。第１Ｘ因子を２画分において、ＥＬＩＳＡ試験を用いて測定する。バリウムに吸着した両分だけを活性試験（血友病血漿の凝固回復の測定）により測定する。

結果は第１Ｘ因子単位で表わす。

これらの結果は、初代サル腎細胞が活性第１Ｘ因子の生産に使用できることを示している。

牛痘ウィルスを用いる第１Ｘ因子の発現ＶＶＲ丁Ｇ２単雌の際にずでに記述した実験スキーム（第７図）を用いてベクターを構築する。しかし、実験方法を少し変更する必要がおる。

ＣＨＯ−Ｋｌ　（Ａ丁ＣＣＣＣＬ　６１）細胞をニワトリ肝細胞の代りに使用した。感染には牛痘ウィルス（７９４１〜２株）を用いた。使用培地は、ＣＨＯ細胞に推賞されているものでおる二アルファ２０００培地をＢＭＥの代りに用い、ＮＣ３血清をウシ胎仔血清（Ｆｅ２）に代えた。

構築は、ｐＴＧ３９３構築段階まで同じである。

次に前記のように、牛痘つィルス感染ＣＨＯ細胞への共移入を０丁Ｇ３９３および野生型ワクシニアウィルスＤＮＡ間で行う。ＶＶＲ丁Ｇ２の構築においては、プラスミドＤＮＡ、共移入されたワタシニアＤＮＡおよびウィルスゲノム間の組換えは、確立または含まれておらず、一方牛痘組換え体に使用する方法ではこの３成分が必要であることに注目すべきである。

組換え後に得られたウィルスは非熱感受性でおり、ＣＨＯ細胞を感染することができる。

組換え実験に用いた過程は、牛痘ウィルスゲノム（ＣＨＯ細胞において熱感受性）とワクシニアウィルスＤＮＡ　（非熱感受性）、および、場合によっては第１Ｘ因子ベクタ・−１ｐＴＧ３９３の間での組換体であるウィルス中でのウィルス産生を盛んにすることができる。

生じたウィルスは、次いでクローン化し、前記のようにそれらのＴＫ″″特性について選択する。

次に、第■因子ＣＤＮＡは、事実、ウィルスゲノムにおいて統合されることが確認された。選択されたクローンは、ＣＨＯ細胞での第■因子発現を研究するのに用いた。

この目的のために、ＣＨＯ−ＫＩ綱胞を１　ｐｒｕ／細胞で感染させ、感染はＦｅ２およびビタミンに添加アルファ２０００培地で行う。培養培地をクエン酸バリウムで分別する。

典型的結果は、次の通りで必る：培養物３０戒の場合、抗原６．４Ｕが得られる：・非吸着画分では、抗原０．３Ｕが集められる。

・吸着画分では、抗原０．８６Ｕおよび凝固活性０．６４Ｕ。

ＣＨＯ細胞中に生じた第■因子は活性でおる。

バリウムに吸着した両分では、測定された活性と抗原量から予測された活性との間には２０％の差がある。この差は、有意と思われるが、ＣＨＯ，ｆｉＩＢ胞により生じた第１Ｘ因子が完全に活性であるかどうかを検討するには、他のさらに正確な試験を行う必要がおる。しかしながら、ＣＨＯ細胞中に生じた第１Ｘ囚子は天然ヒト分子の活性に近似の活性を有しているということができる。

以下の菌株は、パスツール研究所国立微生物培養物寄託所（２８ｒｕｅ　ｄｕ　［）ｏｃｔｅｕｒ−Ｒｏｕｘ。

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ＬＥＥＳ　Ｒ，Ｆ、ｅｔ　Ｋ１−１０ＲＡＮＡ　Ｈ，Ｇ−（１９７８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ　１７゜１２５７−１２６７、） ■グリュンシュタイン及びウオーリス（ｉ９７９）　“メソツズ　イン　エンザイモロジー゛６８．３７９〜３８９　（ＧＲＵＮＳ丁ＥＩＮ　Ｍ、ｅｔ　ＷＡＬＬＩＳＪ、（１９７９）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　ＥｎＺｙｍｏｌＯｃｌ：Ｖ　６８，３７９−３８９．）○カタヤマ、エリクソン、エンフィールド、ウオルシュ、ノイラート、ディビー及びチタニ（１９７９）“プロシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンシズ　オブ　ザ　ユナイテッド　スティンオブ　アメリカＴ１７旦、４９９０〜４９９４（ＫＡ丁ＡＹＡＭＡ　Ｋ、、ＥＲＩＣ３ＳＯＮ　Ｌ。

Ｈ，、ＥＮＦＩＬＥＤ　Ｄ、Ｌ、、ＷＡＬＳＨＫ。

Ａ、、ＮＥＵＲ八ＴＨへ　Ｈ，、ＤＡＶＩＥ　Ｅ、Ｗ、ｅｔ　Ｔ’ＩＩＴＡＮＩ　Ｋ、（１９７９）、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、△ｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ｕ、ｓ、Ａ、７６゜４９９０−４９９４．、） ■ディ　シビオ、ヘルモドソン、イエーツ及びディビー（１９７７）”バイオケミストリー″１６．６９８〜７０６（ＤＩ　５ＣＩＰＩＯＲ，Ｇ。。

ＨＥＲＭＯＤＳＯＮ　Ｍ、Ａ。、ＹＡＴＥＳ　Ｓ、Ｇ。

ｅｔ　ＤＡＶＩＥ　Ｅ、Ｗ、（１９７７）。

３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６，６９８−７０６゜〕■メリック及びビエイラ（１９８２）”ジーン″１９．２６９〜２７６（ＭＥＳＳＩＮＧ　Ｊ、ｅｔＶＩＥＩＲＡ　Ｊ、（１９８２＞、Ｇｅｎｅ　１９゜２６９−２７６、） ■サンガー、ニクレン及びコールソン（１９７７）、゛′プロシーディンゲス　オプ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンシズ　オブ　ザ　ユナイテッドスティン　オブ　アメリカ″７４．５４６３−５４６７（ＳＡＮＧＥＲＦ。、ＮＩＣＫＬ、ＥＮ　Ｓ、ｅｔＣＯＵＬＳＯＮ　Ａ、Ｒ８（１９７７）。ＰＯＣ０５４６３−５４６７、） ■マクサム及びギルバート（１９８０＞”メソツズ　イン　エンザイモロジー” 　６５．４９９〜５５５（ＭＡＸＡＩＶＩ　Ａ、Ｍ、’ｅｔ　ＧＩＬＢＥＲＴ　Ｗ。

（１９８０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇＶ　６５，４９９−５５５．）■ディ　シピオ、クラチ及びディビー（１９７８＞　“ジャーナル　オブ　クリニカル　インベステイゲイションズ″６１．１５２８〜１５３８、（ＤＩ　５ＣＩＰＩＯＲ，Ｇ、、ＫＵＲＡＣＨＩ　Ｋ、ｅｔ　ＤＡＶＩＥＥ、Ｗ、（１９７８＞、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓ。

６１．１５２°８−１５３８．） ○クーパー（１９７８＞“ザ　バイオケミカル　ジュネテイクス　オブ　マン″ 、ブロック及びマヨ編、第２７１〜３２４頁、アカデミツク　プレス、ロンドン（ＣＯＯＰＥＲＤ、Ｗ、（１９７８）ｉｎ　Ｔｈｅ３ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆＭａｎ、Ｂｒｏｃｋ　Ｄ’、Ｊ、Ｈ，ｅｔ　ＭＡＹＯＯｌ、ＰＰ、２７’ｌ−３２４，Ｅｄｓ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　［−ｏｎｄｏｎ、）（１９８３）“′ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー”　２５８．６０２０−６０２４（ＭＩＺＵＯＣＨＩ　Ｔ。、ＴＡＮＩＧＵＣＨｆｆｉ　丁。。

ＦＵＪＩＫＡＷＡ　Ｋ。１丁ＩＴ’ＡＮＩ　Ｋ、ｅｔＫＯＢＡＴＡ　Ａ、（１９８３）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。２５８，６０２０−６０２４）■　ドリリエン及びスペーナー（１９８３＞”ピロロジー″１３１．３８５〜３９３（ＤＲＩＬＬＩＥＮ　Ｒ。

ａｎｄ、５ＰＥＨＮＥＲＤ、（１９８３）ＶｉｒｏｌｏＱｙ　１３１．３８５− ３９３．）■キーニー、ラテ及びルコツク（１９８３）、′ジーン″２６．９１〜９９　（ＫＩＥＮＹ　Ｍ、Ｐ、。

ＬＡＴＨＥ　Ｒ，ａｎｄ　ＬＥＣＯＤＱ　Ｊ、Ｐ。

（１９８３）Ｇｅｎｅ　２６，９１−９９．）Ｏラテ、キーニー、スコリー及びルコツク（１９８４＞、”　Ｄ　Ｎ　Ａ　”印刷中（ＬＡＴＨＥ　Ｒ，、ＫＩＥＮＹ　Ｍ。

Ｐ、、５ＫＯＲＹ　Ｓ、ａｎｄ　ＬＥＣＯＣＱ　Ｊ、Ｐ。

（１９８４）、ＤＮＡ、ｉｎ　ｐｒｅｓｓ、）■ルスキー及びボッチャン（１９８１）、゛ネイチャー″２９３．７９〜８１　（［ＪＳＫＹ　Ｍ、。

ＢＯＴＣＨＡＮ　Ｍ、（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ２９３．７９−８１．）Ｏマケット、スミス及びモス（１９８２）、“プロシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブサイエンシズ　オブ　ザ　ユナイテッド　スティンオブ　アメリカ″７９．７４１５〜７４１９（ＭＡＣＫＥＴＴ　Ｍ、、ＳＭＩ丁）−ＩＪ、Ｌ、＆Ｍｏ５ｓ　Ｂ、（１９８２）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

■パニカリ及びパオレツテイ（１９８２）、“プロシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブサイエンシズ　オブ　ザ　ユナイテッド　スティンオブ　アメリカ”７９．４９２７〜４９３１（ＰＡＮＩＣＡＬＩ　Ｄ、＆　ＰＡＯＬＥＴＴＩ　Ｅ。

（１９８２）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、３ｃ　ｉ。

ｔＪｓＡ　７９，４９２７−４９３１．）■パニカリ、ディビス、ワインバーブ及びパオレツテイ（１９８３）、゛プロシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンシズ　オブ　ザユナイテッド　スティソ　オブ　アメリカ゛′旦旦、５３６４〜５３６８（Ｐ、ＡＮＩＣＡＬＩ　Ｄ、。

ＤＡＶｌｌＳ　Ｓ、Ｗ、、ＷＥＩＮＢＥＲＧ　Ｒ，Ｌ、＆Ｐ△ＯＬ　Ｅ丁ＴＩ　Ｅ、（１９８３）、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　８０．５３６４−５３６８．） ■スミス、マケット及びモス（１９８３）、“ネイチャー”３０２．４９０〜４９５　（ＳＭＩＴＨＧ、Ｌ、。

ＭＡＣＫ、ＥＴ’Ｔ　Ｍ、ａｎｄ　Ｍｏ５ｓ　Ｂ。

（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ　３０２，４９０−４９５、） ■ベンカデザン、バルーディ及びモス（１９８１＞、゛セル”１２５．８０５− ・８１３（ＶＥＮＫＡ丁ＥＳＡＮ　Ｓ、、Ｂ、ＡＲＯｔＪＤＹ　Ｂ。

Ｍ、＆　Ｍｏ５ｓ　Ｂ。　（’１９８１）、、Ｇｅ　ｌ　１１２５．８０５−８１３゜〕 ■ビエイラ及びメツシング（１９８２）、パジーンパ］８．２５９−２６８（Ｖ ’ｔＥ１．ＲＡ　Ｊ、＆ＹＥＳＳＩＮＧ　Ｊ、（１９８２）、Ｇｅｎｅ　１Ｂ。

２５９−２６８．） ■ウェア及びモス（１９８３）、“ジャーナル　オブ＆　Ｍｏ５ｓ　Ｂ。　（１９８３）、Ｊ、■１ｒＯ１，４６，５３０−５３７，） ■ドリリエン、スペーブー及びカーノ（１９８２＞、′“ピロロジー゛′上１旦、３′７２〜３８１（ＤＲＩＬＬＩＥＮ　Ｒ１，５ＰＥＨＮＥＲＤ、＆ＫＩＲＮ　Ａ、（１９８２）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１１９．３７２−３８１．） ■ドリリエン、ローレン及びカーノ（１９８１）、パご口１コシ−″」二り、ユ、４８８〜４９９　（ＤＲＩ　ＬＬ　ＩＥＮＲｏ　、ＫＯＥｔ−ＩＲＥＮ　Ｆ、＆　ＫＩＲＮ　Ａ。

■クラヂ及びディビーＮ９８２）、°゛プ「」シ・〜ディンゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイユンシズ　オブ　ザ　ユナイテッド　スティン　ォブアメリカ　７９．６４６１〜６４６４（ＫＵＲＡＣＨＩＫ、ｅｔ　ＤＡＶＩＥ　Ｅ、Ｗ、（１９８２）。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

Ｌ旦、６４６１−６４６４、〕 ■ミレトリッヒ、プローズ及びマジエラス（１９８１）、パメソツズ　イン　エ〕／ザイモロジー“１旦、２２１〜２２８（アカデミツク　プレス　インコーホレイテッド）（ＭＩＬＥＴＲＩＣＨＪ、Ｐ、、ＢＲＯＺＥ　Ｇ、Ｊ。

ａｎｄ　ＭＡＪＥＲｔＪＳ　Ｐ、Ｗ、（１９８１）。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　８０゜２２１−２２８（Ａｃａ ’ｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＩｎｃ。）、〕 ○ヤーエ、ド　ラ　サル、ジャンパー、バランド、コーリ、フィントリ、トルストシェフ及びルコック（１９８３）、゛ヌクレイツク　アシッズ　リサーチ″１ユ、２３２５〜２３３５　（ＪＡＹＥ　Ｍ、、ｄｅＩａ　５ＡＬＬＥ　！−１．．ＳＣＨＡＭＢＥＲＦ、。

ＢＡＬＬＡＮＤＳ　Ａ、、ＫＯＨＬＩ　Ｖ、。

ＦＩＮＤＥＬ・Ｉ　Ａ、、ＴＯＬＳＴＯ３Ｉ（ＥＶ　Ｐ。

ａｎｄ　ＬＥＣＯＣＱ　Ｊ、Ｐ、（１９８３）Ｎｕｃｌ。

Ａｃ　ｉ　ｄｓ　ＲｅＳ、、１ユ、２３２５−２３３５．）■ザザーン（１９７５）、“ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジー旦、５１〜６９（ＳＯＵＴＨＥＲＮ　Ｅ、Ｍ、（１９７５）、Ｊ。

２）　ＰｓｔＩｄｅ　Ｍ１３ｍｐ８Ｍ＋３ｒｇ３９７ＢＩＮ　ＶＩＴＲＯＩＮ　ＶＩＶＯＩＮ　ＶＩＴＲＯＩＮ　ＶＩＶＯ丁５　：ＨＱ −一１１．−１−ｈ−一一一一、１ｍＰＣ丁／ＦＲ８５７００１２４入ＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔ′ｈｒ＋　ＩＮＴＥＲＮＡＴ工０ＮＡＬ　ｓ二人ＲＣａ　ＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第ＩＸ因子または類似蛋白の脊椎動物細胞中での発現ベクターであつて、ヒト第ＩＸ因子または第ＩＸ因子類似蛋白をコードする遺伝子を挿入したポツクスウイルス科ウイルスゲノムから成ることを特徴とする発現ベクター。
（２）ポツクスウイルスがオルトポツクスウイルス属であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。
（３）オルトポツクスウイルスがワクシニアおよび牛痘ウイルスから選択されることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のベクター。
（４）遺伝子がポツクスウイルスプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のベクター。
（５）前記遺伝子がワクシニアプロモーターの促進下にあることを特徴とする請求の範囲第４項に記載のベクター。
（６）前記ワクシニアプロモーターが７．５Ｋ蛋白遺伝子プロモーターであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載のベクター。
（７）前記遺伝子がワクシニアのＴＫ遺伝子中でクローン化されることを特徴とする請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のベクター。
（８）請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のベクターにより感染された脊椎動物細胞。
（９）細胞がＶｅｒｏ、ＢＨＫおよびＣＨＯ細胞系およびこれら細胞系のサブクローンから選はれた細胞であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の細胞。
（１０）請求の範囲第８および９項のいずれかに記載の細胞を培養し、生じた第ＩＸ因子または類似蛋白を回収することを特徴とする第ＩＸ因子または類似蛋白の調製法。
（１１）肝臓により製造される蛋白の調製法であり、ワクシニアプロモーターの促進下に前記蛋白をコードする遺伝子をそのゲノム中に挿入したワクシニアウイルスに感染させた肝細胞系を培養することを特徴とする蛋白の調製法。
（１２）感染細胞培養物をビタミンＫ含有培地で培養することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
（１３）ビタミンＫ添加量が培地を飽和させる程度の量であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の方法。
（１４）請求の範囲第１０乃至１３項のいずれかに記載の方法を実施することにより得られた第ＩＸ因子または類似蛋白。