JPH02131593A - 組換体アビポックスウィルスベクターを用いた単離された蛋白様物質の産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、異質ＤＮＡの動物組織培養液における発現に
関する。より詳しくは、本発明は、異質ＤＮＡがアビポ
ックスウィルス（ａｖｉｐｏｘ　ｖｉｒｕｓ）発現ベク
ターにおいて発現するものであるウィルス性糖蛋白質類
およびビタミンＫ依存血液因ｒに関してコードするＤＮ
Ａの動物組織培養液における発現に関するものである。

（従来の技術） 最近の遺伝子方法の発展により、例えば血液凝固因子ま
たは抗原性ウィルス蛋白質に関する遺伝子等の多数の予
防的、診断的および治療学的に小要な蛋白質に関する遺
伝子を同定しかつ単離することが可能となってきている
。これに関連して、感染細胞または感染細胞培養液から
所望の蛋白質を単離可能にするためあるいは、例えば免
疫化のために発現される蛋白質の生体内における免疫原
性を利用するために、原核性または真核性細胞における
確実でかつ十分な発現システムに対する必要性が増加し
ている。それ故に、真核性ウィルス性ベクターシステム
は、これに関する特別な重要性を得ている。

国際公開Ｗ０８８／０２０２２は、鶏痘ワクチンの処方
における組換鶏痘ウィルス（ｆｏｗｌｐｏｘ　ｖｉｒｕ
ｓ）および家禽類用の他のデリバリーシステムの使用を
開示している。組換体アビポックスウィルスが単離され
た蛋白様物質の生産に関する好適な発現ベクターを産生
ずるかという論点は、検討されていない。

しかしながら、単離された蛋白様物質の凋製法に用いる
種々の従来のウィルス性発現ベクターが提案されている
。公知の真核性ベクターシステムの１つとして、パボバ
ーウィルス（Ｐａｐｏｖａ−Ｖｉｒｕｓ）ＳＶ４０があ
る。５．４ｋｂを有するＳＶ４０は、比較的によく知ら
れた組織を有する比較的に小さなゲノムを有する。この
ウィルスの小さなゲノムは、一方では、好適な制限エン
ドヌクレアーゼを用いた際に正確に操作できるという利
点を有するが、他方では、クローニング能が対応する小
さなウィルス外皮によってまた必須遺伝子の稠密な、特
にオーバーラップ配列によって苛酷に制限されるという
欠点がある。

また、ワクシニアウィルスに基づく真核性ベクターシス
テムの発展も、例えばヨーロッパ公開公報第０２４３０
２９号に記載されている。ワクシニアウィルスは、約１
８５ｋｂｐの二重鎖ＤＮＡの線状ゲノムを有するオルソ
ボックスウィルス族（ｏｒｔｈｏｐｏｘ　ｖｉｒｕｓ）
である。ワクシニアウィルスゲノムの寸法は、制限エン
ドヌクレアーゼにより分裂しついで好適な異質ＤＮＡで
配位結合することにより組換体ゲノムの構造を不能にす
る。この方法が利用可能であるとしても、生体外操作さ
れたウィルスＤＮＡ自身が感染性でないので、組換体ゲ
ノムを有するウィルスの産生は、ヘルパーウィルスの存
在を必要とする。ワタシニアウィルスの転写は、特に真
核性ＲＮＡボリメラーゼ■で置換されることのできない
ワタシニアウィルスコードされたＲＮＡポリメラーゼが
感染の際にウィルス粒子に導入され包み込まれなければ
ならないということを必要とする。従って、ワタシニア
ウィルスは、該ウィルスコードされたＲＮＡポリメラー
セに適応された特別なプロモーターを有する。

このことは、真核性細胞におけるワタシニアウィルスゲ
ノムに挿入された異質遺伝子を発現すべき組換体の横造
においてさらに困難であることを意味する。したがって
、発現ベクターとしてのワクンニアウィルスの使用は、
ワタシニア特異酵素による宿主独立（　ｉｎｄｅｐｅｎ
ｄｅｎｔ）法で行なわれる必要がある。すなわち、一方
では必須ウィルス領域がクローニングによって影響され
ず、また他方では、発現を与えられる遺伝子がワクシニ
アプロモーターの抑制下でなければならない。

このため、まずワクシニアウィルスプロモーターと接合
した所望の異質遺伝子を含有するプラスミドを構成し、
この組換体プラスミドを生体内においてウィルスーＤＮ
ＡとプラスミドーＤＮＡとの相同性組換によりワクシニ
アウィルスゲノムに取り込む２つの段階を含む方法が早
期研究において用いられていた。例えば、ヨーロッパ公
開公報第０２４３０２９号において、上記原理に従って
構成されＨＩＶ　　ｅｎｖ一蛋白質を発現するのに用い
られる組換体ワクシニアウィルスが記載されている。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、ワクシニアウィルスベクターの使用は、
非常に多くの種に関して病原性であるウィルスがヒトに
対しても病原性であるという実際−Ｌの欠点がある。し
たがって、個人を保護するために、また消耗を除《際に
も、高価な安全な処置を行うべきである。これらの安全
な処置は、時間がかかりまた非常に高価である。したが
って、方でワクシニアシステムの利点を有しかつ他方で
より容易に操作され得る真核性細胞における発現に関す
るベクターシステムを用いることが望ましい。

したがって、本発明の目的は、異質ＤＮＡに対するヒト
に関して病原性でない発現システムを提供することであ
る。

（課題を解決するための手段） すなわち、本発明は、以下のごとく特定される。

（１）蛋白様物質に関してコードする異′ｆｉＤＮＡを
発現する組換体アビポックスウィスル発現ベクターを含
有する動物細胞を生長させ、かつ該タンパク様物質を増
殖することからなるタンパク様物質の製造方法。

（２）該発現ベクターが、アビポックスウィルスの天然
ＤＮＡに加えて、異質ＤＮＡの発現を制御する補足的プ
ロモーターを含有する上記第１項に記載の方法。

（３）組換体アビポックスウィルス発現ベクターが、少
なくとも１つのレプリコン（ｏ　ｒ　ｉ　１）、少なく
とも１つの選択マーカー（ｓｍ１）　、少なくとも１つ
のクローニング部位（Ｃ　Ｓ）および少なくとも１つの
プロモーター（ただし、該プロモーターおよび該クロー
ニング部位は、アビポックスウィルスＤＮＡ配列によっ
て側面配置される）を六〇゜する組換体プラスミドでア
ビポックスウィルスを組換えることによって産生される
七記第１項または２項に記載の方法。

（４）クローニンク゛部位（Ｃ　Ｓ）が多屯クローニン
ク部位である上記第３項に記載の方法。

（５）クローニング部位が ａ）ＡＴＧ　　ＡＡＴ　　ＴＣＣ　　ＴＧＣ　　ＡＧＧ
ＴＣＧ　　ＡＣＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＧ　　ＧＡＴＣＣ
Ｃ　　ＣＴＴ　　ＡＡＧ　　ＴＴＡ　　ＡＣＴＴＡＡ　
． ｂ）ＡＴＧ　　ＧＡＡ　　ＴＴＣ　　ＣＴＧ　　ＣＡＧ
ＧＴＣ　　ＧＡＣ　　ＴＣＴ　　ＡＧＡ　　ＧＧＡＴＣ
Ｃ　　ＣＣＴ　　ＴＡＡ　　ＧＴＴ　　ＡＡＣＴＴＡ　
　Ａ：および ｃ）ＡＴＧ　　ＧＧＡ　　ＡＴＴ　　ＣＣＴ　　ＧＣＡ
ＧＧＴ　　ＣＧＡ　　ＣＴＣ　　ＴＡＧ　　ＡＧＧＡＴ
Ｃ　　ＣＣＣ　　ＴＴＡ　　ＡＧＴ　　ＴＡＡＣＴＴ　
　ＡＡ のいずれか１つを白゛する上記第３項または第４項に記
載の方法。

（６）プロモーター（ｐ　ｒ　１）が痘症状ウィルスで
ある−Ｌ記第３〜５項のいずれか１つに記・哉の方法。

（７）プロモーターが分子ｆｆｌｌｌｋＤをａするポリ
ペプチドに関するワクシニアプロモーターｐ１１である
−ト記第６項に記載の方法。

（８）プロモーターが分子１１２５ｋＤを６するポリベ
プチドに関する後朋鶏痘ウィルスプロモーターｐ２５で
ある上記第６項に記載の方法。

（９）異質ＤＮＡがプロモーターにより供給されるＡＴ
Ｇ開始コドンの直ぐ後のまたはＡＴＧコドンの後のプリ
ン残渣の１または２後のクローニング部位に挿入される
上記第３〜８項のいずれか１つに記載に方法。

（１０）アビポックスウィルスの側面配置ＤＮＡ配列が
ウィルスゲノムの非必須領域に相当する上記第３〜９項
のいずれか１つに記載の方法。

（１１）アビポックスウィルスが鶏痘ウィルスである上
記第１〜１０項のいずれか１つに記載の方法。

（１２）プラスミドが一重鎖ＤＮＡの産生を認めるレプ
リコン（ｏ　ｒ　ｉ　２）を補足的に担持する上記第３
〜１０項のいずれか１つに記載の方法。

（１３）プラスミドが第２ａ’択マーカー（　ｓ　ｍ　
２　）をａ白゛する上記第３〜１０項のいずれか１つに
記載の方法。

（１４）第２選択マーカー（ｓｍ２）かキサンチンーグ
アニンポスファリボシルトランスファーゼに関してコー
ドするＤＮＡまたは坑生物質ヒグロマイシンを不活性化
する蛋白質に関してコードするＤＮＡからなる上記第１
３項に記載の方法。

（１５）第２選択マーカー（ｓｍ２）がＥ．コリのΩａ
ｃＺ逍伝子に相当するＤＮＡからなるト記第１３項に記
載の方法。

（１６）蛋白様物質がビタミンＫ依存血液因子である上
記第１〜１５項のいずれか１つに記載の方法。

（１７）挿入された異質ＤＮＡが百日咳、破傷風、マラ
リア、エイズ、ダニ媒介脳炎、Ｂ型肝炎、ヘルペス感染
および家禽疾病マレック病、ＩＬＴ感染性気管支炎また
はコクシジウム病を引き起こし得る病１京体からの蛋白
質またはその誘導体に関するコード配列に完全にまたは
部分的に相当するＩ二記第１〜１５項のいずれか１つに
記載の方法。

（１８）挿入された異質ＤＮＡが血液凝固因子■、■，
ｘｎ，ｘｍまたはまたはＳのいずれか１つ、フォンビル
ブランド因子、蛋白質Ｃ１ブロトロンビン、アンチトロ
ンビン、ブラスミノーゲン、ヒルジン、ＮＧＦ，ＦＧＦ
ＳＴＮＦＸＢ細胞刺激因ｒ、インターロイキングループ
からの蛋白質類、アポリ蛋白質またはウィルス類からの
糖蛋白質の少なくとも１つの蛋白質の生物学的機能を用
する蛋白質に関して部分的または完全にコードする上記
第１〜１５項のいずれか１つに記載の方法。

（１９）蛋白様物質に関してコードする異質ＤＮＡを発
現する組換体アビポックスウィルス発現ベクターをａｈ
する細胞からなる哺乳類細胞培養菌株。

（２０）蛋白様物質に関してコードする異質ＤＮＡを発
現する組換体アビポックスウィルス発現ベクターをａ６
する細胞からなる１次ニワトリ胚線維芽細胞培養菌株。

（作用および発明の効果） 本発明の第１の態様によると、蛋白質物質に関してコー
ドする異質ＤＮＡを発現する組換体アビポックスウィス
ル発現ベクターを含有する動物細胞を生長させ、かつ該
タンパク禄物質を増殖することからなるタンパク様物質
の製造方法を提供するものである。

該発現ベクターは、アビポックスウィルスの天然ＤＮＡ
に加えて、異質ＤＮＡの発現を制御する補足的プロモー
ターを含有してもよい。

組換体アビポックスウィルス発現ベクターは、少なくと
も１つのレプリコン（ｏｒｉ１）、少なくとも１つの選
択マーカー（ｓｍ１）　、少なくとも１つのクローニン
グ部位（ｃｓ）および少なくとも１つのプロモーター（
ただし、該プロモーターおよび該クローニング部位は、
アビポックスウィルスＤＮＡ配列によって側面配置（ｆ
ｌａｎｋｅｄ）される）を含有する組換体プラスミドに
よりアビポックスウィルスを組換えることによって産生
され得る。異質ＤＮＡは、クローニング部位にまたはク
ローニング部位の一つに挿入され得る。

真核性細胞における発現システムを確立するのにアビポ
ックスウィルスを用いることは、ワクシニアウィルスの
ものに比べて相当に何利である。

ワクンニアウィルスの宿主範囲がヒトにまで及ぶが、ア
ビポックスウィルスは、鳥類および鳥類から誘導される
細胞系のみに感染性である。これにより、研究員は、ア
ビポックスウィルス誘導発現システムの使用による疾病
の危険をうけることはない。

本発明に用いられる組換体アビポックスウィルス発現ベ
クターの調製に用いられる組換体プラスミドは、一般に
、レプリコン（ｏｒｉ１）、少なくとも１つの選択マー
カー（ｓｍ１）、クローニング部位（Ｃ　Ｓ）および少
なくとも１つのプロモーター（ｐ　ｒ　１）等のその構
成に必須であるこれらの通常の成分に加えて、プロモー
ターおよびクローニング部位を側面配置するアビポック
スウィルスゲノムからのＤＮＡを含む。完全アビポック
スウィルスゲノムによる生体内合成により、アビポック
スウィルス中へのプロモーター、夕ローニング部位およ
びおそらくクローニング部位に挿入された異質ＤＮＡの
挿入は、この側面配置配列によりもたらされ得る。

一般に、原核性生物におけるプラスミドの複製を可能に
するレプリコンは、ｏｒｉ　１として用いられる。組換
体プラスミドの構成に、組換体プラスミドの形質転換お
よび増幅をダラム陰性微生物、例えばエシエリキアコリ
　（Ｅｓｃｈｃｒ１ｅｈｉａ　　Ｃｏｌｔ）において行
うことが好ましい。したがって、特に好ましいレプリコ
ンは、エシエリキアコリからのＣｏｔ　　Ｅ　　１レプ
リコンである。

本発明に有効なプラスミドの横成における一定の段階、
例えば形質転換された微生物の選択は、好適な選択マー
カーを用いることにより促進される。原核性生物を形質
転換する際に好適な選択マーカーとしては、例えば坑生
物質の不活性化である。当業者は、多くのダラム陰性ま
たはダラム陽性生物における抗性不活性化蛋白質の発現
に関する好適な耐性遺伝子に精通するであろう。

本発明に有効なアビポックスウィルス発現ベクターの構
成に用いることのできるプラスミドは、少なくとも１つ
のクローニング部位（ｃｓ）を含有するが、広範な制限
エンドヌクレアーゼ類を用いて異質遺伝子の挿入を可能
にする多重クローニング部位（ｉｃｅｓ）を含有するこ
とが好ましい。このようなｍｃｓは、ｐＵＧプラスミド
類またはＭ１３ベクター類に用いられる配列と同様に溝
成されるのが好ましい。これらのｍｃｓは、一般に４ま
たは６塩基対の回文構造を認識する複数の通常の制限エ
ンドヌクレアーゼ類に関するクローニング部位を含有す
る。

■およびＢａｍＨＩに関する制限エンドヌクレアーゼ認
識部位を含む配列から成り得る。多くの読み枠において
クローニングをもたらすため、その５′末端におけるク
ローニング部位は、１以上の補足的塩基の挿入による異
なる実施態様において改質することができる。これは、
全３枠における挿入された異質ＤＮＡの発現を可能にす
る。このような配列の例としては、 る。

ａ）ＡＴＧ ＴＣＧ ＣＣＣ ＴＡＡ ＡＴＧ　　ＧＡＡ　　ＴＴＣ ＧＴＣ　　ＧＡＣ　　ＴＣＴ ＴＣＣ　　ＣＣＴ　　ＴＡＡ ＴＴＡ　　Ａ：および ＡＴＧ　　ＧＧＡ　　ＡＴＴ ＧＧＴ　　ＣＧＡ　　ＣＴＣ ＡＴＣ　　ＣＣＣ　　ＴＴＡ ＣＴＴ　　ＡＡ０ 組換体プラスミド含有されるプロモーターｐｒ１は、ク
ローニング部位の上流に挿入される異質道伝子の転写を
規制するように配列される。アビポックスウィスルが真
核性宿主細胞の核内に侵入しないが全ての痘症ウィルス
のごとき細胞形質内で複製され、それゆえにその転写が
アビボックスＡＧＡ ＣＴＧ ＣＣＴ　　　ＧＣＡ ＴＡＧ　　　ＡＧＧ ＡＧＴ　　　ＴＡＡ ＴＣＣ　　　ＴＧＣ　　　ＡＧＧ ＣＴＡ　　　ＧＡＧ　　　ＧＡＴ ＡＡＧ　　　ＴＴＡ　　　ＡＣＴ ＡＣＴ ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＴＴ 例えば次のとおりであ ＣＴＴ Ｃ） ｂ） コードされた酵素に依存するので、痘症ウィルスプロモ
ーターは、アビポックスウィルスで相同的に組換えるの
に実質的に用いられるプラスミドに関するプロモーター
として便利に用いられる。

できる限り効率的に伸入された異質遺伝子の発現を達成
するために、強力プロモーターをプロモーターｐｒｌと
して用いることができる。さらに、このプロモーターは
、可能ならばアビポックスウィルスの感染サイクルの全
ての期間の間、活性であるべきである 好適な実施態様において、使用するプロモーターは、ワ
クシニアウィルス由来である。ワクシニアウィルスプロ
モーターは、痘症ウィルス族のうに最良の特徴を有する
プロモーターである。これらのプロモーターの多くに関
して、最大転写活性の時間は、既に知られている。

好ましいプロモーターは、７５ｋＤポリペプチドに関し
てコードするワタシニアウィルス遺伝子ノフロモーター
である［コヒラン、エム．エイ．パケット、シイー．お
よびモス、ビー．　　（１９８５），「ワクシニアウィ
ルス遺伝子のプロモーター領域の生体外突然変位誘発：
早期直列および後期調節シグナルに対する証拠」ジャー
ナル　オブ　ビロ口シイ第５４巻、第３０〜３７頁（Ｃ
ｏｃｈｒａｎ．　Ｍ．Ａ．，　Ｐｕｃｋｃｔ．　Ｃ．　
ａｎｄ　Ｍｏｓｓ，　Ｂ．（１９８５）　　；　　’Ｉ
ｎ　　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓ１ｓ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｎ　ｏｆ　ｖａｃｃ
１ｎｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｅ；　ｅｖｉｄｅｎｃｅ
　ｆｏｒ　ｔａｎｄｅｍ　ｅａｒｌｙ　ａｎｄ　ｌａｔ
ｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｓｉｇｎａｌ．”　Ｊ．　
　ｖｉｒｏｌ　５４，　３０〜３７）コ。この７．５ｋ
Ｄポリペプチドに関するＲＮＡ合或は、早期転写相のみ
らなず後期転写相に際しても生じる。したがって、ｐ７
．５と呼ばれるプロモーターは、ウィルス複製および発
現の全サイクルにわたって均一に発現される蛋白質に対
する理想的プロモーターである。

ワクシニアウィルスから知られているさらに強力なプロ
モーターは、分子量１１ｋＤを有する蛋白質に関するプ
ロモーター、Ｉ）１１である［ベルトホーレット，シー
．，ドリリエン，アールおよびビイテック，アール．　
　（１９８５年）；「ワタシニアウィルス後期遺伝子の
５′側面配列の１００塩基対は、後期転写を一時的に規
制するのに十分である」プロンーティング　オブ　ナシ
ョナル　アカデミック　サイエンス　ユーエスエイ第８
２巻、第２．０９６　〜２，１００頁（Ｂｃｒｔｈｏｌ
ｅｔ．　Ｃ．，　Ｄｒｉｌｌｉｅｎ１？．　ａｎｄ　Ｗ
ｉｔｔｅｃｋ．　Ｒ．（１９８５）：　”Ｏｎｅ　ｈｕ
ｎｄｒｅｄ　ｂａｓｅｐａｉｒｓ　　ｏｆ　　５’　　
　　ｆ’ｌａｎｋｉｎｇ　　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　　ｏｆ
　　ｖａｅｃｉｎｉａ　　ｖｉｒｕｓ　ｌａｔｅ　ｇｅ
ｎｅ　ａｒｅ　ｓｕｆｆ１ｃｉｅｎｔ　ｔｏ　ｔｅｍｏ
ｒａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｌａｔｅ　ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔｉｏｎ　．　Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ．　　
Ａｃａｄ．　　Ｓｅｔ．　　ＬＩＳＡ　８２，　２０９
６−２１００）コ。しかしながら、特に好ましい実施態
様は、アビボックス特異プロモーターの使用を提供する
。相同性システムからのプロモーターは、実際の機能の
最大の必然性を提供する。

好適に用いられるアビボックスプロモーターは、分子量
２５ｋＤを有するポリペプチドに関する鶏痘プロモータ
ー、すなわちｐ２５プロモーターである。

しかしながら、この好ましい実施他態様に加えて、他の
全ての公知鶏痘プロモーターもまた、本発明に従って用
いることができる。先に記載された全てのプロモーター
は、必要により突然変異誘発によって変化および改良さ
れ得る。同様に、相当痘症ウィルスＲＮＡポリメラーゼ
によって認識された合成プロモーターは、本発明に従っ
てプラスミド内に挿入するのに用いられ得る。

１一述のｐｌｌプロモーターを含むほとんどのワタシニ
アウィルス後期プロモーターは、翻訳開始コドンを含む
機能的に重要な配列モチーフ（Ａ／１’Ａ／Ｔｉ”ＡＡ
Ａ’ｌ”ＧＰｕＰｕ）という特徴を有する［ローセル、
ジエイ．ピー、エール、ジエイ。ヴエイル、およびビー
、モス（１９８６年）ジャーナル　オブ　ビロロジイ第
６０巻：第４３４〜４４９頁およびマジストリス、エル
．およびシュートウメンベルグ、エイチ．ジ．（１９８
８年）ヌクレイック　アシッズ　リサーチ、第１６巻第
３１４１〜３１５６頁［Ｒｏｓｅｌ．Ｊ．Ｐ．　Ｅａｒ
ｌ，Ｊ．Ｗｅｉｒａｎｄ　　１３．　　Ｍｏｓｓ（１９
８Ｂ）Ｊ．　　　Ｖｉｒｏ１．６０：４３６−４４９　
　ａｎｄ　　Ｍａｇｉｓｔｒｉｓ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｓ
ｔｕｎｎｅｎｂｃｒｇ．ｌｌ．Ｇ．　（１９８８）　Ｎ
ｕｅ１．　　Ａｅ１ｄｓ．　　Ｒａｓ．　１６．３１４
１−３１５６）］　．したがって、プロモーターのＡＴ
Ｇの直ぐ下流の興味深い異質遺伝子をクローンすること
は、最善発現に好ましい。読み取り枠の容易なクローニ
ングを促進し、また高いレベルの発現を確実にするため
、一連のプラスミドベクターは、自身のＡＴＧを欠く遺
伝子フラグメントが全３つの読み枠においてクローンさ
るように構成される。このようなプラスミドに用いるク
ローニング部位の例は、既に記載されている。ただ１つ
のＡＴＧコドンが存在し、またＡＴＣの直ぐ後の異質Ｄ
ＮＡまたはＡＴＧコドンの後のプリン（例えばＧ）残基
の１または２後の異ｒｆｉＤＮＡの挿入を可能ならしめ
るクローニング部位を用いることが好ましい。このよう
な配列は、翻訳開始が通常第ＩＡＴＧで生じまた第２Ａ
ＴＧにおける再開始が生じないが充分でなくまた２つの
ＡＴＧの距離が増加するにつれて効率が減少するので、
プロモーターの翻訳開始コドン並びに挿入された遺伝子
のものが存在する国際特許公開８８／０　２　０　２　
２に記載されたものより効率的である傾向がある。

プロモーターおよびｍｃｓまたはその中に挿入された異
質遺伝子を側面配置するＤＮＡ配列は、アビポックスウ
ィルスの機能に必須でないアビポックスウィルスゲノム
のこのような蛋白質と好都合に一致する。該ウィルスの
相当部位は、本発明に従うブロスミドでの組換により破
壊され、したがって、またこの状況において存在し得る
読取り枠をカットする。押入に与える部位の注意深い選
択により、同時にウィルスの複製能力が限定されるのを
妨げられることを注意すべきであるが用いられるウィル
ス菌株の毒性が減少される。

ワクシニアウィルスシステムにおいて、チミジキナーゼ
遺伝子の部分は、既に配列を側面配置するのに」二肖゜
尾に用いられている。該組換体ウィルスは、チミジンキ
ナーゼ機能の損失後、１猛系ウィルスより毒性が少ない
［ビュラー、アール．エム．スミス、ジー．エル．クレ
ーマー、ケイ．　　ナットキングス．エイ．エル．およ
びモス，ビー（１９８５年）：「組換体ウィルス発現ベ
クターの減少された毒性は、チミジンキナーゼ陰性表現
型に関連する」　；ネーチャー、第３１７巻、第８１３
〜８ｌ５頁（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｒ．Ｍ．，　Ｓｍ１ｔｈ．
Ｇ．Ｌ．．　Ｃｒｃｍｅｒ．Ｋ．Ｎｏｔｋｉｎｇｓ．Ａ
．Ｌ．　　ａｎｄ　Ｍｏｓｓ．Ｂ　．（１９８５）：　
　“Ｄｅｃｒｒｅａｓｃｄｖｉｒｕｌｅｎｃｃ　ｏｆ　
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖａｃｃ１ｎｉａ　ｖｉｒｕ
ｓ　ｃｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　　ｉｓ　
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｈｙｍ１ｄｉ
ｎｃ　ｋｉｎａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｐｈｅｎｏｔ
ｙｐｅ　　；　Ｎａｔｕｅｒ　３１７．８１３−８１５
）］。オルソボックスシステムと異なり、組換体ウィル
ス類を選択するすなわちＴＫ一表現型を自゛するウィル
スの選択するウィルス性ＴＫ遺伝子の不活性化は、一次
鳥類ＴＫ一細胞がないので今迄アビボックス細胞に用い
ることができなかった。

好ましい態様において、鶏痘ウィルスは、アビポックス
ウィルスとして用いられる。このウィルスの使用は、そ
の病原性が鳥類細胞に厳密に制限されるという利点があ
る。多くの継代は、例えばＨＰ−１菌株において弱毒性
を導き、また鶏胚線維芽細胞において比較的強く促進さ
れている［マイヤー、アー．およびマリッキー、力一（
１９６８年）；　［アテヌイ　イ　ルンク　フォン　ヴ
ルレンテム　ヒューネルポッケン　ウィルス　イン　ツ
エルクルチューレン　ウント　アイゲンシャフテンデス
　アテンテユイールテン　ウィルム；ンエントラルブラ
ット　フユア　フエーターインアルメディツイン、第Ｂ
欄、第１３巻、第１〜１３頁（Ｍａｙｒ，Ａ．ａｎｄ　
Ｍａｌ１ｃｋｉ　，　Ｋ．（１９６Ｂ）：　　“Ａｔｔ
ｅｎｕｉｅｒｕｎｇ　ｖｏｎ　ｖｉｒｕｌｃｎｔｅｍ　
Ｉｌｊｌｈｎｃｒｐｏｅｋｅｎｖｉｒｕｓ　ｉｎ　Ｚｃ
ｌｌｋｕｌｔｕｒｎｃ　ｕｎｄ　Ｅｉｇｃｎｓｃｈａｆ
ｔｅｎ　ｄｅｓ　ａｔｔｅｎｔｕｉｃｒｔｃｎ　Ｖｉｒ
ｕｓ　　；　Ｚｃｎｔｒａｌｂｌａｔｔ　ｆＬｉｒ　Ｖ
ａｔｃｒ１ｎａｒｍｃｄ１ｚｉｎ，　ｃｏｌｕｍｎ　　
肌　１３：ｌ−１３）コ。

本発明に白゜効な組換体アビボックス発現ベクターの調
製に用いることのできるプラスミドは、上述の成分に加
えて、一重鎖ＤＡＮの産生を認めるトブリコン（ｏｒｉ
２）も担持する。この補足的機能は、プラスミドの構造
のチェックに有効であり、従って、例えばｍｃｓにおけ
る異質ＤＮＡは、公知方法により一市鎖ＤＮＡの産生を
誘導することにより容易にチェックすることができ、該
一重鎖ＤＮＡは、続いてジデオキシ配列法により好適な
プラスミドを用いて検査され得る。

この方法に用いることのできるｏｒｉ２の例としては、
例えばｆｄＳ　ｆｌまたはＭ１３等の線維状ファージの
レプリコンがある。これら３つのバクテリオファージの
うち、Ｍ１３およびその誘導体は、全シリーズの配列ベ
クターがその上に構成されるので、最良であるとわかっ
た。上述のプラスミドは、一重鎖等のｏｒｉ２を用いた
際に産生され、一重鎖のファージのように配列され得る
。

組換体ウィルスの選択は、形質転換された真核性細胞の
存在をテストするために補足的選択マーカーの挿入によ
って促進することができる。選択のための優性選択マー
カー（ｓｍ２）の使用は、特に有効である。このマーカ
ーの発現は、例えばｐ７．５のような強力な連続活性プ
ロモーターのコントロール下において特に好ましい。こ
のような優性選択マーカーの例としては、キサンチング
アニンホスフォリボシルトランスファーゼに関してコー
ドするｇｐｔ遺伝子がある。この酵素は、補乳動物から
のヒポキサンチングアニンホスフォリボシルトランスフ
ァーゼに類似したＥ．コリからの遺伝子産生物である。

補乳動物細胞と同様に、これは、イノシン酸またはグア
ニン酸（ＩＭＦまたはＧＭＰ）中におけるヒポキサンチ
ンまたはグアニンによるホスフォリボシルピ口ホスフエ
ートの縮合を触媒する。さらに、該微生物性酵素はまた
、キサンチンをＸＭＰに転換する性質を打ずる。

反応は、補乳動物細胞からの酵素では、行うことができ
ず、たとえできたとしても極くわずかである［ムリガン
、アール．およびベルグ、ピー．（１９８１年）「キサ
ンチンーグアニンホスフォリボシル１・ランスフγ−ゼ
に関してコードするＥ．コリ遺伝子を発現する動物細胞
に関する選択」プロシーディング　オブ　ナショナル　
アカデミックサイエンス　コーエスエイ　第７８巻、第
２０７２〜２ｏ７６頁（Ｍｕｌｌ１ｇａｎ，Ｒ．ａｎｄ
　Ｂｅｒｇ，Ｐ．（１９８１）　：　”　Ｓｅｌｅｃｔ
ｉｏｎ　ｆｏｒ　ａｎｉｍａｌ　ｃｅｌｌｓ．　ｔｈａ
ｔ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　Ｅ．　ｃｏｉｆ　　ｇｅ
ｎｅ　　ｅｏｄ１ｎｇ　　ｆｏｒ　　ｘａｎｔｈｉｎｃ
−ｇｕａｎｉｎｃ　　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　：　Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ
．　Ａｅａｄ．　Ｓｃｉ．ｔｌｓＡ　　７８．２０７２
−２０７６）コ。したがって、ｇｐｔ遺伝子を担持する
ことのできる組換体ウィルスは、マイコフェノール酸（
Ｉｌｙｅｏｐｈｃｎｏｌ１ｃ　ａｃｉｄ）の存在下、Ｇ
ＭＰの合成のＸＭＰを、従って、ｄＧＴＤおよびＤＮＡ
を与えることによりこのウィルスで成分啼乳細胞を感染
させるが［ファルケナー、エフ．ジーおよびモス、ビー
．（１９８８年）、「エシュリキア　コリ　ｇｐｔ遺伝
子は、ワタシニアウィルス読み取り枠発現ベクターに関
する優性選択を与える」、ジャーナル　オブ　バイロロ
ジイ第６２巻、第１８４９　〜１８５４頁（１９８８年
）　（Ｐａｌｋｎｃｒ，Ｐ．Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｏｓｓ．
Ｂ．（１９８８）．”Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ１ａ　　ｃｏ
ｌｔ　　ｇｐｔｇｅｎｅ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ｄｏｍｉ
ｎａｎｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｖａｅｃｉｎ
ｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｏｐｅｎ−ｒｅａｄｉｎｇイｒａｌ
０　０ＸｐｒＯＳＳｉＯｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ”．Ｊ．　
Ｖ１ｒｏｌ　．６２．１８４９−１８５４（１９８８）
］、ＸＭＰの非感染細胞合成においては、マイコフェノ
ール酸によって禁止される。すなわち、物質としてのキ
サンチンの使用は、類似咄乳類細胞酵素の異なる特異性
のために不可能である。自生型ウィルスは、マイコフェ
ノール酸の存在では生長しない。　選択マーカーとして
のｇｐｔ遺伝子の発現に対する別の方法は、ヒグロマイ
シンＢ　（ｈｙｇｒｏｍｙｃｌｎ　Ｂ）ホスフォトラン
スファーゼに関する遺伝子の使用である。ヒグロマイシ
ンＢは、リポソーム転移を遮断し、かつアミノアシルー
ｔ−ＲＮＡを干渉することによって原核性生物および真
核性生物の両者において蛋白質の合成を禁止するストレ
プトミセート類（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）によ
り合成される抗生物質である。この坑生物質は、Ｅ．コ
リから単離されたホスフォトランスファーゼにより不活
性化することができる［ブロヒリンガー、ケイ，および
デッゲルマン、エイチ．　（１９８４年）：モレキュラ
アンド　セル、バイオロジー　第４巻、第２９２９〜２
９３ｌ頁（Ｂｌｏｃｈｌｉｎｇｃｒ．Ｋ．ａｎｄ　Ｄｉ
ｇｇｅｌｍａｎｎ，１１．（１９８４）：Ｈｏｔ．　ａ
ｎｄ　　Ｃａｌｌ．　Ｂｉｏｌ．４．　ｐ　２９２９−
２９３１）。

組換体ウィルスの同定に関する選択法に変わるさらに別
の方法は、Ｅ．コリ　１ａｃＺ遺伝子の共発現および酵
素ベータ一一ガラクトシダーゼの生体内発現に関するス
クリーニング（「ブルーフγ−ジスクリーニング」）で
ある。ブルーフγ一ジスクリーニングを行なうワクシニ
アウィルス挿入ベクターの例としては、ベクターｐｓｃ
１１［チャクラバティー、エス．．ブレックリング、ケ
イ．およびモス、ビー　「ワタシニアウィルス発現ベク
ター：ベーター−ガラクトシダーゼの共発現は、組換体
ウィルスファージの目視スクリーニングを与える」、モ
レキュラー、セル、バイオロジー第５巻、第３４０３　
〜３４０９（１９８５年）　（Ｃｈａｋｒａｂａｔｉ，
Ｓ．．Ｂｒｃｃｈｌ１ｎｇ．Ｋ．ａｎｄ　Ｍｏｓｓ．　
Ｂ．”Ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｌｒｕｓ　ｃｘｐｒｃｓｓ
１ｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ：ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏ
ｆ　ｂｅｔａ−ｇａｌａｅｔＯｓｉｄａｓｏ　ｐｒｏｖ
ｔａｅｓ　ｖ１ｓｕａｌ　ｓｃｒｃｅｎｔｎｇ　ｏｆ　
ｒｅｃｏａ＋ｂｉｎａｎｔ　ｖｉｒｕｓ　ｐｌａｑｕｅ
ｓ”．Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂ１ｏ１．　５．３４０
３−３４０９　（１９８５）コおよびｐＵＶ１　（ファ
ルクナーエフ、ジー．，チャクラバティー、エスおよび
モス、ビー、ｒｐＵＶ１：新規ワクシニアウィルス挿入
および発現ベクター」、ヌクレイック　アシッド　リサ
ーチ　第１５巻、第７１９２頁（１９８７年）（Ｆａｌ
ｋｎｃｒ．Ｐ．Ｇ．，Ｃｈａｋｒａｂａｔ１．Ｓ．ａｎ
ｄ　Ｍｏｓｓ．Ｂ．”ｐＬＪＶ　ｌｅａｎｅｗ　　ｖａ
ｃｃｉｎ１ａ　　ｖｉｒｕｓ　　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　
　ａｎｄ　　ｃｘｐｒｏｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ’　　
Ｎｕｃｌ．　　　Ａｃｉｄｓ　　　　Ｒｅｓ．　　１５
　　７１９２　　（１９８７）コがある。

所望の蛋白様物質に関してコードするＤＮＡは、前記プ
ラスミドのｍｃｓ内に挿入することができる。完全遺伝
子、すなわち、その翻訳開始コドンおよび翻訳終止コド
ンもまた転移し得る遺伝子を、例えば挿入することがで
きる。しかしながら、全痘症ウィルスの特性は、ｍ　Ｒ
　Ｎ　Ａの予備切り継ぎが起こらないらいしということ
である。これは、おそらく全ウィルス依存プロセスが感
染された細胞の細胞形質のおいて生じ、一方細胞性切り
継ぎ装置が細胞核にあることによるものであろう。した
がって、アビポックスウィルスにより組換に用いられる
プラスミドを再構成する際に、イントロン遊離ＤＮＡを
真核性遺伝子を用いる際に用いるということを注意しな
ければならない。

多くの目的のために、プラスミドを介して組換体に蛋白
質に関する全遺伝子を挿入するのではなく代わりに、例
えば蛋白質の機能的領域に関する解読配列および／また
は抗原決定因子のみを挿入することが好適である。一定
の場合において、ウィルスの複製能は、例えば完全遺伝
子の挿入によって減じられるかあるいは細胞は、非常に
早く損傷される。加えて、蛋白質の部分のみは、多くの
場合一定の目的に必要である。

プラスミドに挿入されたＤＮＡは、天然由来のみならず
合成でもあり得る。天然由来のＤＮＡは、例えば、原核
性生物のゲノムから単離されるゲノムＤＮＡまたは複合
真核性遺伝子のｃＤＮＡのいずれかである。合成ＤＮＡ
は、一般に、合成産生されたオリゴヌクレオチドから調
製され、つづいてプラスミド内に取り込まれる。合成Ｄ
ＮＡは、次の必要性に従って産生の際に改質できまたク
ローニングするのに有いられる制限部位を末端に組み込
むことができるという利点がある。

本発明によって産生じ得る蛋白様物質としては糖蛋白質
類、アセチル化蛋白質類、カルボキシル化蛋白質類およ
び他の翻訳後改質蛋白質類等の蛋白質類および蛋白質ま
たはポリペプチド含打化合物がある。ビタミンＫ依存血
液因子は、翻訳後改質蛋白質の例である。

本発明の好ましい適用は、少な《とも１つ以上の蛋白質
の生物学的機能を有する蛋白様物質の産生である。すな
わち、血液凝固因子■、■、Ｘ■、Ｘ■のうちの１つま
たは８１フォンビルプラント因ｒ１蛋白質Ｃ１プロトロ
ンビン、アンチトロンビン■、プラスミノーゲン、ヒル
ジン、ＮＧＦ，ＦＧＦ，ＴＮＦＳＢ細胞刺激因子類、イ
ンターロイキングルーブからの蛋白質類、アボリ蛋白質
またはウィルス類からの糖蛋白質である。アビボックス
発現システムからのこれらの蛋白質の産生の実質的利点
は、例えば血液凝固因子（血清から通常に回収される）
がＨＩＶ等のヒト病原性ウィルスによりｌη染されない
ということである。さらに、細胞培地からのこれらの因
子の回収は、著しい濃縮化を可能にする。

本発明により打効に産生じ得る翻訳後改質蛋白質の特定
のサブグループは、因子■、ＸＩおよびＸ１蛋白質Ｃお
よびＳおよびプロトロンビンを含む１一述のごときビタ
ミンＫ依存血液因子である。

プロトロンビンは、遺伝子形成およびその生物学的活性
について広く研究されている。正確な翻訳後改質は、粘
性に必須であり、またサル、腎臓およびヒト肝臓等の市
販細胞が痘症ウィルス発現システムにおいて十分にまた
は少なくとも好適にカルボキシル化されたプロトロンビ
ンの合成を認めるようだ。このタイプの改質は、全ての
血液因子にとって最も重要である。加えて、分泌細胞は
、これらが有効になりかつＦＰＶ等のアビポックスウィ
ルスにより感染を認める場合には、本発明に用いる細胞
になりそうである。

本発明に有効でありかつ前記プラスミドを用いて産生さ
れる組換体アビポックスウィルスの産生がプラスミドの
側面配置アビボックス配列をアビポックスウィルスによ
る組換によって生体内において生じることを注目すべき
である。もともと影響されていないウィルス性遺伝子は
、この組換によって破壊され、それゆえに不活性化され
る。

本発明によって産出する他の好ましい蛋白様物質は、蛋
白質類または病原体からのこれらの誘導体である。すな
わち、これらは、例えば免疫化の口的に用いることがで
きる。例えば、百日咳、破傷風、マラリア、ＡＩＤＳ、
ダニ媒介脳炎、Ｂ型肝炎およびヘルペス感染がある。ほ
とんどの場合において、免疫化に用いられる蛋白質は、
中和抗体を導くまたは細胞毒Ｔ細胞を導く当該病原体の
蛋白質である。

本発明に有効な組換体アビポックスウィルスとしては、
天然アビボックス成分に加えて、プロモーターのコント
ロール下における異質遺伝子（またはその部分または所
望の蛋白様物質に関してコードする他のＤＮＡ）がある
。プロモーターは、アビポックスウィルスに自然に生じ
ない補足的プロモーターであってもよい。プロモーター
の特性により、異質遺伝子は、ウィルスの早期転写相、
後朋転写相または全転写期間の際のいずれかに転写され
る。

組換は、好ましくは繰返し継代されたアビボックス（例
えばＨＰ−１菌株）が細胞培養菌株の要求に適する十分
に弱められた菌株を産出するように鶏痘アピボックスウ
ィルスを用いて行なわれる。

得られる転写体は、感染された細胞の細胞質ゾルに翻訳
され、つづいて翻訳後改質、例えばグリコソレート化（
ｇｌｙｃｏｓｏｌａｔｃｄ）またはアセチル化される。

したがって、本発明によるシステムは、痘病ウィルスに
異質なかつ確実な改質された蛋白質になる真核性ＤＮＡ
配列を発現するのに用いることができる。

このシステムにより好適に産生される蛋白様物質は、例
えば既に述べたように血液凝固因子■、■、Ｘ■、Ｘ■
、またはＳの１つ、フォンビルブランド因子、蛋白質Ｃ
１ブロトロンビン、アンチトロンビン■、プラスミノー
ゲン、ヒルジン、ＮＧＦＳＦＧＦ，ＴＮＦＳＢ細胞刺激
因子、インターロイキングループからの蛋白質、アポリ
蛋白質または例えばＴＢＥウィルスのようなウィルス性
蛋白質である。

本発明に有効な組換体アビポックスウィルスは、その適
用により、鳥類において生体内でまたは細胞培養液にお
いて生体外にてのいずれかで保持することができる。長
期間の保存のためには、本発明の従ってウィルスにより
感染された細胞培養液を凍結または細胞親和化すること
を勧める。

本発明のプロセスにおける発現は、目下の技術状況にお
いては、トランスゲン性動物の使用を廃除するものでは
ないが通常組織培養液において生じる。本発明の使用に
好適な動物組織は、咄乳類および家畜類細胞培養液の両
者を含む。

異なる由来または分化の段階の種々の桶乳動物類細胞の
型は、これらがアビポックスウィルスの取り込みおよび
中断性感染サイクルを認めるなら血液因子の発現に用い
てもよい。蛋白質の正確な！ｖｊりたたみ、正確なグリ
コシル化、アセチル化またはビタミンＫ依存カルボキシ
ル化および合成された蛋白質の均等な分泌に関して細胞
内における最適条件に関する要件は、もちろん上釘尾の
発現研究に関する主要な検討事柄である。

咄乳類細胞がアビポックスウィルスを完全に複製しなく
ても、細胞のこの半任意（ｓｅａｌ−ｐａｒｍｉｓｓｉ
ｖｃｎｃｓｓ）および細胞がウィルスによって損傷され
ないという可能性は、十分に利点である。死亡していな
い、すなわち宿主停止（ｈｏｓｔ−ｓｈｕｔ　ｏｆｆ）
になやまされていない感染された細胞は、重要は異質遺
伝子を効率よく合成し得る。補乳動物の半任意のため、
早期アビボックス（例えばＦＰＶ）プロモーターは、発
現の規制に特に好適であり得る。

早期プロモーターは、複製の後期段階またはそれ故に［
後期Ｊ　ＲＮＡ合成が起こられなくても、活性である。

■乳類細胞は、大多数のこれらの細胞が市販されている
ので、発現に特に有効である。これに対して、ウズラま
たはダックから確立された１または２のみの不変生長ア
ビジン細胞系は、ＡＴＣＣまたはＧＩＢＣＯ等の受託機
関から得ることができる。

用いることのできる啼乳類細胞は、原則として、第１巴
代（すなわち「１次」）細胞または永続細胞のいずれか
であり得る。しかしながら、第１世代咄乳類細胞は、実
用において、これらが培養液において非常に制限された
寿命を有するのでアビポックスウィルス発現システムの
市販細胞になりそうもない。永続生長細胞は、最適発現
および、例えば血液囚子蛋白質等の蛋白様化合物の分泌
に関して細胞をテストするために目下のところ必須であ
る。好適な、安定な形質転換された細胞は、ＢＳＣ−１
、ＣＶ−１、ＭＲＣ−５、ＶｅｒｏおよびヒトＨｅｐＧ
２細胞を誘導する。

永続細胞のさらなる利点は、これらが直ちに利用できる
血清遊離培地にて増殖し得ることであるが、それに対し
て１次細胞は、合成培地を将来１次細胞に対して使用し
得るであろうが胎児ウシ血清により供給された成長因子
により依存する。目下のところ、哺乳類１次細胞に対す
る合成培地は、非常に高価であり成長効率は、数人の研
究者により考察されている。

鳥類細胞は、自ずと永続生長師乳類細胞に対比してＦＰ
Ｖ等のアビポックスウィルスを最適に増殖する細胞であ
る。加えて、ニワトリ胚線維芽（Ｃ　Ｅ　Ｆ）細胞は、
１次細胞であり、許可機関は、末端遺伝子性レトロウィ
ルスがニワトリ細胞のゲノムに存在するがワクチン（例
えばＴＢＥ）の産生用にこれを許可している。噛乳動物
の永続化またはＦ生長一形質転換」は、細胞性ゲノムに
対する遺伝的損傷の結果または細胞がＤＮＡウィルス（
ＳＶ−４０またはエプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）
等）により形質転換されたのかいずれかである。

発現ベクターとしてアビポックスウィルスにより感染さ
れたＣＥＦ細胞等の蛋白様物質の産生は、宿主細胞蛋白
質の合成の停止がワクシニアウィルスにて感染された細
胞における（２〜３口）より遅く進行する（５〜７口）
ので産生にｈ゛効な手段である。

ウズラ、ダック胚細胞または「造血」細胞等の補足的鳥
類細胞もまた発現ベクターとして好適であり、懸濁培養
液における生長が達成される場合、これはいずれのクロ
ーンされた血液因子または他の蛋白様細胞の大規模産生
を促進するので、特に好ましい。

好適に用いられる細胞培地は、１次ニワトリ胚線維芽細
胞からなる。

本発明に有効な細胞培養液において、異質ＤＮＡによっ
てコードされた蛋白様分子のべブチドまたはポリペブチ
ド成分は、用いられるプロモーターに依存してウィルス
サイクルにおいて連続的にまたは一定時間内のみにおい
て合成させ得る。このようにして産生された蛋白様物質
は、例えば公知技術等の好適な手段により細胞から増殖
され、通常の蛋白質化学の方法を用いて純化され得る。

それゆえ、蛋白様物質は、一般にアビポックスウィルス
物質がなくまた通常一般に細胞成分がない。

本発明に従って産生される蛋白様物質は、診断剤として
用いることができる。この場合、本発明に従って産出さ
れるペブチドまたはポリベブチドとヒトまたは動物（例
えば踊乳類）患者の血清との抗原抗体反応によって感染
された個体における病原性ウィルスの一定の蛋白質に対
する抗体を決定することが可能である。

（実施例） 本発明をより理解し、本発明がどのように効果を与える
ことができるかを示すため、実施例に基づいて記載する
。

実施例１ 胚ＳＰＦ卵（Ｓ　Ｐ　Ｆ）からの１次鳥類細胞の産生 １２口の培養時間後、ＳＰＦニワトリ卵（口に２，００
０卵程度）をエッグランプによりテストし、アルコール
で殺菌し、ついで無菌箱に開いた。

生存胚をピンセットで除き、スチール製容器に回収し、
ＴＢＥトリブシン化（ｔｒｙｐｓｉｎａｔｉｎｇ）ｍ衝
液で洗浄することにより卵の残りの蛋白質をなくし、約
５００胚を各ビーカに分配するように２ｐビーカに分配
した。ついで、胚を空気プレスで金属ふるいにより圧縮
した。

ニワトリ胚細胞の抽出 約５００ふるいされた胚をＴＢＥ｝リプシン化緩衝液約
７９を含有するトリプシン化器具のガラス容器に配置し
た。主要割合の赤血球および血液成分をさらに同じ緩衝
液１０Ωで洗い出した。このため、トリプシン化器具は
、攪拌機、ポンプ、サーモスタット制御水浴を取り付け
た。サンプルを十分撹拌し、トリブシン溶液（トリブシ
ン４５ｇを１規定ＨＣＩＩに加えてこの溶液を調製）２
００ｍｌ、ＤＮＡアーゼ溶液（４　５　０　Ｕ／ｍ１）
　４　０ｍｌ、ネオマイシンサルフエート溶液（２５ｇ
／！））１４ｍｌおよびポリミキシン溶液、（２．５Ｘ
１０５Ｕ／ｍ１）　７ｍｌを加えた。ｐＨを濾過ＮａＯ
Ｈで７．４に調整し、好適なテストペーパーでチェック
した。

該トリプシリン化法を３７℃で３分間続けた。

トリブシン化の進行は、ガラス管中、規則的間隔でテス
トされた。トリプシン化の終了後、トリブシン化器具の
内容物を２０９デキャンタにポンプ排出し、ＴＢＥトリ
プシン化緩衝液（０．１２５％トリブシンＴＢＥ溶液）
約１２ｆＪで希釈した。

細胞懸濁液をトリプシン化器具の出口における金属性フ
ィルターおよひデキャンタ容器の人口における金網フィ
ルターにより濾過した。デキャンタ容器の内容物をマグ
ネチックスターラーおよびテフロン被覆回転子（ｓｔｉ
ｒｒｉｎｇ　ｆｌｅａ）により十分に混合した。トリプ
シン化器具をＴＢＥトリブシン化緩衝液１０９でフラッ
シュし、該緩衝液をつづいてデキャンタ容器を経て遠心
分離した。一定の割合の細胞懸濁液を直接デキャンタ容
器から連続流遠心機に供給し、８５００ｒｐｍ　（１７
．１００×ｆ）で遠心分離した。細胞懸濁液を１分間に
つき４００ｍｌで遠心機中にポンプ排出した。合計３０
９にするのに約７５分間要した。細胞懸濁液の第２部分
を１１１１のプラスチック製遠心ビーカに導入し、２５
分間１．００Ｏｒｐｍ　（１，６５０Ｘｇ）にて遠心分
離した。連続流遠心機の収容力が非常に小さかったので
２回に分けて遠心した。

細胞懸濁液約２５０ｍｌをデキャンタ容器から除き、１
一澄液および細胞を異質ウィルスについてテストした。

ニワリト胚細胞の純化 １つの調製につき２００ｔｎｌ培地をスチール製容器ま
たは２０の１０９ビンにおいて調製した。その１０ｍｌ
，またはビンの場合２０Ｘ１０ｍｌを、無菌テストした
。１００ｍｌをサンプルとして４℃に保ち、また２５ｍ
ｌを発熱性（ｐｙｒｏｇｃｎｉｅ１　ｔｙ）テスト用に
用いた。また同定テストも、ゲンタマイシン活性を決定
することにより行なった。

連続流または固定角ローターを用いた遠心により得られ
た細胞をＴＢＥ培地２Ｑに再懸濁させ、３０分間室温に
てマグネチックスターラーを白゛するガラス製三角フラ
スコ中で撹拌した。遠心後（１．００Ｏ　ｒｐｍ，２０
℃にて２５分間）、Ｌ澄液をデキャントし、沈降物をＴ
ＢＥ培地２Ωに再１ヒ濁して、さらに同一条件にて遠心
した。上澄液をさらにデキャントして、細胞をＴＢＥ培
地１Ωに再懸濁して、室温にて４５分間撹拌した。

細胞を散在前に無菌金網で濾過し、これらが３７゜Ｃに
て２目培養後に融合するように薄く散在させた。

実施例２ 鶏痘ウィルスゲノムの非必須領域からの鶏痘ウィルス（
ＦＶＰ）ＤＮＡの単離 ＴＫ逍伝子をゲノム鶏痘ＤＮＡの非必須領域として選択
した。ＦＰＶ−ＴＫ遺伝子の単離は、１次ニワトリ胚線
維芽（Ｃ　Ｅ　Ｆ）の感染、遠心によるＦＰＶの純化お
よびウィルス性ＤＮＡの単離およびアガロールゲル上の
ウィルス性制限フラグメントの除去およびＴＫ遺伝子に
関して特異的に放射線活性マークされたオリゴヌクレオ
チドでのハイブリダイゼーションによるＴＫ遺伝子の同
定の段階を含む。

ａ）１次ＣＥＦの感染 １次ＣＥＦをグルタミン、２％胎児ウシ血清および坑生
物質で捕捉されたＤＭＥＭをａ白゛する培地において記
載のごとく産生じた。ＣＥＦの全細胞層（ＩＸ１０８細
胞）を菌株ＨＰ−１（７）１細胞につき未純化菌株溶液
５プラーク形成単位（ｐｆＵ）にて感染された。培地（
実施例１参照）において３７℃にて４〜５日培養後、細
胞を廃棄し、遠心し（１０分間、１０００Ｘｇ）　、ペ
レットを１０ｍＭ｝リスＨＣΩ、ｐＨ９．０に再懸濁し
た。

細胞を均質化し（例えば、２０〜３０きね運動を有する
ドウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー中）、核を８
００Ｘｇにおける５分の遠心により遠心除去し、ウィル
ス含有上澄液をウィルスを分散するために超音波処理し
た。さらにウィルスを純化するために、上澄液を３６％
シヨ糖、１０ｍＭｌ・リスＨＣΩ　ｐＨ９，Ｏの傾斜上
で遠心した［［ベックマン（Ｂｃｃｌｖａｎ）　Ｓ　Ｗ
　２　７　　管；１４，０００ｒｐｍ，８０分間、４℃
］。ウィルスベレッ１・を１〜２ｍ１の１　ｍ　Ｍ　Ｉ
・リスＨＣΩ　ｐＨ９．０に再懸濁し、超音波処理し、
連続シヨ糖傾斜（２４〜４０％シヨ糖、１ｍＭ｝リスＨ
ＣＩ　ＳｐＨ９．０）上で純化した。ウィルス懸濁液１
ｍｌをベツクマンＳＷ２８遠心管に調整された傾斜に適
用し、４℃にて１２，０００で５０分間遠心した。ウィ
ルスバンドは、ピペットで捨て、２容量の１ｍＭ｝リス
ＨＣΩ　ｐＨ９，Ｏで希釈し、ＳＷ２８管中４℃にて６
０分間１３，５００で遠心した。ペレットを１ｍＭトリ
スＨＣｆＩＳｐＨ９．．０に再懸濁し、７０℃にて凍結
させた。

この方法で純化されたウィルスを以下「純化ウィルス」
という。

ｂ）ＦＰＶ−ＤＮＡの単離およびアガロースケル！二の
ウィルス性制限フラグメントの特徴つけ純化ＦＰＶを１
０ｍＭトリスＨＣ１、１０ｍＭＮａ２−ＥＤＴＡ，１０
ｍＭ　　ＮａＣｆｌ　，０．５％　ＳＤＳＳｐＨ８．０
の溶液に再懸濁し、１０　０　ｍ　ｃ　ｙ；　／　ｍｌ
プロテインナーゼＫの存在下、１晩培養した。ＦＰＶ−
ＤＮＡ溶液を注意深くフェノールで１度、クロロホルム
で２度抽出し、エタノールで沈降させた。ペレットを７
０％エタノールで１度洗浄し、１０ｍＭ｝リス、１ｍＭ
Ｎａ２　−ＥＤＴＡの溶液中に再懸濁させた。

純化ＦＰＶからこの方法で単離されたＤＮＡを以下［純
化ＦＰＶ−ＤＮＡＪという。

２ｍＣｇ純化ＦＰＶ−ＤＮＡのアリコートを制限エンド
ヌクレアーゼで分割し、０．６％アガロースゲル−ヒで
分離した。ＦＰＶ　　ＨＰＩ菌株のＤＮＡのフラグメン
トパターンは、公表されている［ミューラー、ハー．力
一．　　ビテック、エル．シャフナー、ダブリュ．シュ
ンペリー、デーメンダ、アー．およびビイラー、エル（
１９８７年）、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ
、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによる分析による５つの
痘症ウィルスの比較、ジャーナル　オブ　ジェネテック
ビロロジイー．第３８巻、第１３５　〜１４７頁（Ｍｊ
ｉｌｌｅｒ，Ｉｌ．Ｋ．．　Ｗ１ｔｔｃｋ．Ｒ．．Ｓｅ
ｈａｆｆｎｃｒ，Ｗ．Ｓｅｈｉｉｉｐｃｒｌｉ．Ｄ．．
Ｍｅｎｎａ　　Ａ．ａｎｄ　　Ｗｙｌｃｒ．Ｒ．（１９
７８），　　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　　ｏｆ　　ｆｉｖ
ｃ　ｐｏｘ　ｖ１ｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｂｙ　ａｎ
ａｌｙｓ１ｓ　ｗ１ｔｈ　ｒｃｓｔｒｉｅｔｉｏｎ　　
ｃｎｄｏｎｕｅｌｃａｓｃｓ　　Ｉｌｉｎｄ　　ｌｌＩ
．Ｂａｍｌｌｌ　　ａｎｄ　　　Ｅｅｏｌシｌ．Ｊ．　
　　ｇｃｎ．　　Ｖｉｒｏ１．３８．１３５−１４７．
）］。

ｃ）ＴＫ遺伝子に対して特異な放射活性マークされたオ
リゴヌクレオチドによるハイブリダイジングによるＴＫ
遺伝子の同定 実施例（ｂ）で分離された制限フラグメントをニトロセ
ルロースフィルター上に転移し（サザンブロッｌ・）、
２８ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５ＣＡＧ　　ＴＴＡ　
　ＴＴＧ　　ＴＧＧ　　ＣＣＧＣＧＣ　ＴＴＡ　ＡＣＧ
　ＧＴＧ　Ａ−１）でハイブリダイゼーションした。２
８ｍｅｒ配列は、鶏痘ＴＫ遺伝子配列の保護部分に山来
する［ボイル、ディー．ビー．　　コウパー　ビー　イ
ー　エイチ．，ギブス，エイ．ジエイ．，セイグマン，
エル．ジエイ。およびボース，ジー、ダブリュ．（１９
８７年）、鶏痘ウィルスチミジンキナーゼ；ヌクレオチ
ド配列および他のチミジンキナーゼとの関係、パイ口ロ
ジー、第１５６巻、第３５５〜３５６頁（Ｂｏｙｌｃ．
Ｄ．Ｂ．．　Ｃｏｕｐａｒ．Ｂ．Ｅ．ｌＩ．，Ｇ１ｂｂ
ｓ．Ａ．Ｊ．，Ｓｃｉｇｍａｎ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ　Ｂｏ
ｔｈ　　．　　Ｇ．Ｗ．（１９８７），Ｆｌｏｗｐｏｘ
　ｖｉｒｕｓｔｈｙｍｉｄｉｎｃ　ｋｉｎａｓａ；ｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｒａｌ
ａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ　ｔｈｙｍｉｄ
ｉｎｃ　ｋｉｎａｓｃｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５６，
３５５−３５６）］　。

２８ｍｅｒは、ガン７−３２Ｐ−ＡＴＰ　［アマーンヤ
ム（Ａａ＋ｃｒｓｈａｍ）２０００Ｃ　ｉ／ｍｍｏ　ｌ
　；　１０ｍＣｉ／ｍｃ１）］で予め放射線マークされ
ていた。すなわち、この目的で、２０ｍｃ　１反応容量
中２０ピロモルのオリゴヌクレオチドを製造者［ボエフ
リンガー　マンハイム　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｃｒ　Ｈａ
旧〕ｈｅｉ１）］の指示に従ってポリヌクレオチドキナ
ーセでマークした。

ハイブリダイゼーションを６ＸＳＳＣ，ＩＯＸデンハル
ド（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液０、２％ＳＤＳ中６８℃に
て一晩行った。

フィルターを３ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中５０゜Ｃに
て３０分間４度洗浄し、つづしてオートラジオグラフし
た。

ＴＫ遺伝子は、この方法で明白に同定でき、各制限フラ
グメントと関連した。適正な制限フラグメントを以下の
実施例３に用いた。

実施例３ 鶏痘ウィルス挿入プラスミドｐＦＰｔｋｇｐｔ−ＦＩお
よびｐＦＰ　ｔ　ｋｇｐ　ｔ−ＦＵの構成 挿入プラスミドｐＦＰｔｋｇｐｔ−ＦＩおよびｐＦＰｔ
ｋｇｐｔ−ＦＵを構成するために、鶏痘ウィルス［菌株
ＨＰＩミュンヘン（Ｍｕｎｃｈｃｎ）］を前述の実施例
２に記載のごとく単離した。

第１図に示されるとおり、鶏痘ウィルスＤＮＡのＥｃｏ
ＲＩ消化物は、ベクターｐ”ｒｚ１９ＲのＥｃｏＲＩ部
位にクローンされた。プラスミドｐＦＰｔ．ｋ５は、オ
リゴヌクレオチドブローブ５′ＣＡＧ　　ＴＴＡ　　Ｔ
ＴＧ　　ＴＧＧ　　ＣＣＧ　　ＣＧＣ　　ＴＴＡ　　Ａ
ＣＧ　　ＧＴＧ　　Ａ−３’　　（実施例２ｃ）を用い
てコロニーフィルターハイプリダイゼーションにより同
定された。プラスミドは、５．５ＫｂＥｃｏＲＩフラグ
メントを含白゛した。

すなわち、これは、Ｃ　１　ａ　ＩＳＢａｍＨ　Ｉおよ
びＳｃａＩで分割され、クレノウ（ｋｌａｎｏｗ）ポリ
メラーセで処置され、ＲｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびホ
スフォターゼで処置されたベクターＰＴＺ　１　９Ｒで
連結された。得られたプラスミドｐ　Ｆ　Ｐ　ｔ　ｋ　
１０．４は、鶏痘ウィルスｔｋ逍伝を含有する２．３ｋ
ｂ　　ＢａｍＨＩ−Ｃ１ａＩ挿入を示した［ボイル、デ
ィー．ビー．およびコーパー、イー．エイチ．　　（１
９８６年）ワクシニアウィルスを用いた鶏痘ウィルスチ
ミジンキナーゼ遺伝子の同定およびクローニング」、シ
ャーナル　オブ　ジエネテック　パイロジイ、第６７巻
、第１５９１〜１６００頁およびボイル、ディー．ビー
．、コーパー　ビー．イーエイチ、ギブス、エイ．ジエ
イ．　　セイグマン、エル．ジエイ．およびボース、ジ
ー．ダブリュ、（１９８７年）「鶏痘ウィルスチミンジ
キナーゼ：ヌクレオチド配列および他のチミジンキサー
ゼとの関係」第１５６巻、第３５５　〜３５Ｂ頁（Ｂｏ
ｙｌｅ，　Ｄ．Ｂ．　ａｎｄ　Ｃｏｕｐａｒ．　Ｅ．ｌ
ｌ．（１９８Ｂ）　．　”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ　ａｎｄｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｏｗｌｐ
ｏｘ　ｖｉｒｕｓ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｃ　ｋ１ｎａｓｃ
　ｇｅｎｅ　ｕｓｉｎｇ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕ
ｓ　．　Ｊ．　　ｇｅｎ．　　Ｖｉｒｏ１．　６７．　
１５９１−１６００　　ａｎｄ　Ｂｏｙｌｅ，　Ｄ．Ｂ
．．　Ｃｏｕｐａｒ．　Ｂ．［．ｌｌ．．Ｇｉｂｂｓ．
Ａ．Ｊ．．Ｓｅｌｇｍａｎ．Ｌ．Ｊ．ａｎｄ　Ｂｏｔｈ
，Ｇｊ／．　　（１９８７）．　　”Ｐｏｗｌｐｏｘ　
ｖｉｒｕｓ　　ｔｈｙｇ＋１ｄｉｎｅ　ｋｌｎａｓｅ：
　ｎｕｅｌｃｏｔｌｄｃ　ｓｃｑｕｃｎｅｃ　ａｎｄ　
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｔｏ　ｏｔｈｃｒ　ｔｈ
ｙｍｉｄｉｎａ　ｋｉｎａｓｃｓ　　．　　Ｖｌｒｏｌ
ｏｇｙ　１５Ｂ，　　３５５−３５６）コ。プラスミド
　ｐＴＫｇｐ　ｔ−ｏＦ　１　ｓ［ファルクナー、エフ
．ジー．およびモス．ビー（１９８８年）ジャーナル　
オブ　バイロロジイ、第６２巻、第１８４９　〜１８５
４頁（Ｆｌａｌｋｎｃｒ．　Ｐ．Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｏｓ
ｓ．　　Ｂ．（１９８８）　　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．　　６
２．　　１８４９−１８５４）　　コ　の囲ａＩ．ｃ１
ａＩおよびクレノウボリメラーセ処置された遺伝子カセ
ット（隣接多重クローニング部位を有するワタシニアウ
ィルスプロモーター［コヒラン、エム．エイ、パケット
、シーおよびモス、ビー（１９８５年）ジャーナル　オ
ブ　ビロロジー第５４巻：第３０〜３７頁（Ｃｏｃｈｒ
ａｎ，　Ｍ　．Ａ．．　Ｐｕｃｋｃｔｔ　Ｃ．　　ａｎ
ｄ　　Ｍｏｓｓ．　　１３．　　Ｊ（１９８５）．　　
Ｖ１ｏ１．　　５４：　　３０−３７）コ　およびワク
シニアウィルスＰｌｌプロモーター［ベルホーレット、
シー．　　ドリリエン　アールおよびヴイテック、アー
ル．　１９８５年プロシーティングオブ　ナショナル　
アカデミック　サイエンスユーエスエイ第８２巻：第２
０９６〜２１００頁（Ｂｅｒｔｈｏｌａｔ　Ｃ．，Ｄｒ
ｉｌｌｉｅｎ．Ｒ　ＡＮＤ　Ｗｉｔｔｅｋ，ｌ？．１９
８５　　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｅａｄ．　Ｓｅｉ．
　　ＬＩＳＡ　８２：２０９６−２１００）］のコント
ロール下Ｅｃｏ−ｇｐｔ遺伝子を含有する）は、プラス
ミドｐＦＰ　ｔ　ｋｇｐ　ｔ−Ｆ　１およびｐＦＰｔｋ
ｇｐｔ−ＦＩＩになるプラスミドｐＦＰｔｋｌ０．４の
独特なクレノウポリメラーゼ処置Ｎｃｏ１部位に挿入さ
れた。

実施例４ ｐＦＰ−ＵＶ２を構成するために、ワクシニアウィルス
挿入ベクターの２。２　ｋ　ｂ　Ｓ　ｓ　ｐ　Ｉフラグ
メント［フγルクナー、エフ．ジー．，チャクラバティ
ー、エス．およびモス、ビー．　［ｐＵＶ１：新規ワタ
シニアウィルス挿入および発現ベクター］ヌクレイック
　アシッド　リサーチ　第１５巻、第７１９２頁（１９
８７年）　（Ｆａｌｋｅｒ．　Ｉご．Ｇ．，　Ｃｈａｋ
ｒａｂａｔｉ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｍｏｓｓ　Ｂ．　”ｐ
ＬＩＶ１：　ａ　ｎｅｗ　ｖａｅｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕ
ｓ　ｔｎｓｅｒｔｔｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ　ｖｅｃｔｏｒ．　”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　　Ｒａｓ
．　１５．　７１９２　（１９８７）］を用いた。この
フラグメントは、ワタシニアウィルスプロモーターｐｌ
ｌおよびｐ７．５および部分的Ｅ．コリ　ΩａｃＺ遺伝
子を含む。フラグメントは、低融点アガロースから記１
製され、プラスミド　ｐＦＰ−ＵＶ２．２ｉになるプラ
スミド　ｐＦＰｔｌ＜１０．４の独特のケルノウポリメ
ラーゼ処置ＮＣＯＩ部位にクローンされる（第１図参照
）。プラスミドｐＵＶ１から調製される（部分的Ωａｃ
ｚ道伝子を含有する）２．３ＣΩａＩフラグメントは、
プラスミドｐＦＰＵＶ２１：：なルｐＦＰ−ｔｒｖ’２
．　　２１の独特なＣΩａＩ部位に挿入される。このプ
ラスミドは、強力なワタシニアウィルスｐｌｌの下流の
読み取り枠の発現を認め、またワクシニアウィルスｐ７
．５プロモーターによって誘導されるＥ．コリ　Ωａｃ
Ｚマーカー逍伝γ・をａ　Ｎする。

鶏痘ｔ　ｋ側面領域は、ウィルス性ｔｋ逍伝了座中の発
現カセットを導く。

実施例５ スウィルケノムからの側面配置ＤＮＡ配列を含釘する挿
入ベクターの産生 神大ベクターの構成に使用されるベクターは、例えばｐ
ＢＲ３２２およびその誘導体およびｐＵＣ７およびその
誘導体等の通常のいずれかのプラスミド、いずれかのコ
スミドまたはいずれかのフ７−ジであり得る。

２つのタイプの挿入ベクターが構成された、すなわち （ａ）痘症プロモーターを有するベクター（タイブＩプ
ロモーター）および、 （ｂ）痘症プロモーターにつづいて　翻訳開始コドン、
制限エンドヌクレアーゼ分割点および停止コドンを有す
るベクター（タイブ■プロモーター）であった。

谷プロモーターブラグメントは、直接またはその末端の
適正な改質後に、好適な制限酵素で線状化されたプラス
ミドに配位結合される。付着端またはブランド末端の配
位結合は、標準法に従ってもたらされる。プロモーター
は、例えばプロモーターの「下流」領域における多面化
（ｍｕｌｔｉ−ｆａｃｅｔｃｄ）ｍｅｓを既に含有して
いるｐＵｃ１９等のプラスミドに取り込まれるのが好ま
しかった。タイプ２プロモーターは、１以」二の停止コ
ドンを含何する合成オリゴヂオキシリボヌクレオチドの
補足的種人により完成された。この方法で産生されたプ
ロモーター含打プラスミドは、微生物中に形質転換され
た後、増幅され、つづいて単離、純化される。

隣接制限エンドヌクレアーゼ分割部位および必要により
翻訳シグナルを何する適切なプロモーターフラグメント
は、制限エンドヌクレアーゼでの分割によりこれらのプ
ラスミドから切り離され、標準法に従って純化される。

プロモーターとアビポックスウィルスゲノムの非必須領
域から新た取り込まれた制限エンドヌクレアーゼ分割部
位とを側面配置するＤＮＡ　（この場合、チミジンキナ
ーゼ遺伝子に関してコードするＤＮＡである）は、実施
例２Ｃに記載のごとく同定およびサブクローンされる。

原核性生物または真核性生物において複製可能ないずれ
の選択性ブススミドも、このサブクローニングに用いる
ことができる。好ましいプラスミドは、補足的一重鎖パ
ッキンに対するリプリコンを有するのでｐＴＺ１９Ｒで
ある。ついで、クローンされたフラグメントは、好適な
制限酵素で分割部位に配位結合させ、先に定義したタイ
ブ１またはタイブ２プロモーターからなるカセットおよ
び所望によりｍｃＳとともに得られる分割部位に配位結
合した。

この方法により異なる２つのタイプのプラスミド、すな
わち、タイプ１およびタイブ２プラスミドが得られた。

実施例６ タイブ２挿入プラスミド内への異質遺伝子の挿入 定性的かつ定量的にアビボックスシステムにおける異質
遺伝子の発現を検定可能ならしめるために、酵素ベータ
ーガラクトシダーゼに関してコードするＥ．コリΩａｃ
Ｚ遺伝子をベクターｐＦＰｔ　ｋ　−　ｇ　ｐ　ｔ　Ｆ
　Ｉにクローンした。この目的のため、製造者指示（ボ
エフリンガー）に従って５ｍｃｇのｐＦＰｔｋ−ｇｐｔ
ＦＩプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＢ　ａ　ｍ　
Ｈ　Ｉで線状化し、ついでリン酸アルカリ塩で処置した
。ｊ７ａｃ遺伝子は、プラスミドｐＭｃ１８７１　　［
シャピラ、エス．ケイ．、ジェイ．チュウ、エフ．ブイ
．リチャウドおよびエム．ジエイ．キャサダバン（１９
８３年）；「ベーターガラクトシダーゼの活性カルボキ
シル末端部分を酵素的にコード化するΩａｃＺ遺伝子配
列に融合されたクローン遺伝子によりコードされたハイ
ブリッド蛋白質の発現に関する新規多機能プラスミドベ
クター」ジエン、第２５巻第７１〜８２頁（Ｓｈａｐｉ
ｒａ．　Ｓ．Ｋ．．　Ｊ．　Ｃｈｏｕ，　Ｐ．Ｖ．　Ｒ
ｉｅｈａｕｄ　ａｎｄＭ．Ｊ．　Ｃａｓａｄａｂａｎ（
１９８３）：　”Ｎｅｗ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｐｌａ
ｓｍｉｄｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｃｏｄｃ
ｄ　ｂｙ　ａ　ｃｌｏｎｃｄ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｅｄ　
ｔｏ　ｌａｃ　Ｚ　ｇｅｎｅ　ｓｃｑｕａｎｅｃｓ　ｅ
ｎｃｏｄｉｎｇ　ａｎ　ｃｎｚｙｍａｔｉｅａｌｌｙ　
ａｃｔｉｖｅ　ｃａｒｂｏｘｙｔａｒｍｉｎａｌ　ｐｏ
ｒｔ１ｏｎ　ｏｆ’　ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄ
ａｓｃ　：Ｇｅｎｅ　２５．　７１−８２）］から誘導
されたものであり、ＢａｍＨＩフラグメンととして単離
され、標準法に従ってｐＦＰ　ｔ　ｋ−ｇｐ　ｔ　Ｆ　
Ｉにクローンされた。ρａｃＺ　　ＢａｍＨＩフラグメ
ントは、独自のＡＴＧ翻訳開示コドンを−６しておらず
発現のためにワタシニアウィルスＰｌｌプロモーターに
よって供給されるＡＴＧコドンを必要とする。ＢａｍＨ
Ｉフラグメント配位結合は、正確な読み取り枠で種人を
誘いだ。

べ一夕−−ガラクトシダーゼ陽性の組換体アビポックス
ウィルスの構成および単離は、実施例７〜８に記載のと
おり行われた。

実施例７ キメラ遺伝子を六Ｇするプラスミドによる鳥類細胞のト
ランスフエクンヨン アビポックスウィルスゲノムからの非必須ＤＮＡにより
側面配置されたキメラ遺伝子をｌ＞ｆｊする本発明によ
るプラスミドを、自生型アビポックスウィルスにより既
に感染された細胞のトラトンスフエクションに用いた。

ついで、キメラ逍１云子を相同性組換によりアビポック
スウィルスケノムに挿入した。一般に、１次ニワトリ胚
線維芽（ＣＥＦ）または他の鳥類細胞の全面細胞単一層
は、１細胞につき０．０１〜０．５０ブラーク形成単位
（ｐ　ｆ　ｕ）アビポックスウィルスで底面積２５ｃｄ
の培養フラスコ中感染された。プラスミドＤＮＡ約５ｍ
ｃｇを単独またはアビポックスウィルスＤＮＡ１ｍｃｇ
とともに各々１ｍｌ０．１％デキストロース、０．１４
Ｍ　　ＮａＣρ、５ｍＭＫＣΩ、２ｍＭ　　Ｎａ２　Ｈ
ＰＯ４　、２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．０５中の１４ｍｃ
ｇコウシ胸腺ＤＮＡまたは他のキャリャーＤＮＡと混合
し、ＣａＣ，１７２を加えて最終濃度１２５ｍＭにまで
下げることによって沈降させた。混合物を注意深く混合
し、室温にて約１５分間培養した。感染５時間後、最終
的に分配されたｕｆＡ液１ｍｌを、培地がＹ・め除かれ
た感染細胞単一層に加えた。３０分後、８％胎児ウシ血
清含（１′培地１０ｍｌまたは他の組織培養培地１０ｍ
ｌを各フラスコに加え、３７℃にて培養しつづけた。感
染４時間後、８％胎児ウシ血清をａ白−する培地を供給
した。９６〜１２０時間培養し続けた。

その後、感染されたウィルスをフラスコから廃棄し、遠
心し、組織培養培地に再懸濁させ、ウィルスを開放する
ために同容量の２．５％トリブシンで消化させた。

実施例８ 組換体アビポックスウィルスの選択および単離および異
質遺伝子産生物の決定 ｌ・ランスフェクションされた細胞から単離されたウィ
ルスは、ほんの数パーセントの組換体を倉自する集団か
ら描成された。選択的および非選択的方法をこれらの組
換体を単離するのに用いた。

選択的方法は、本来のウィルスの成長が禁止されるよう
な条件の基でのＮ■換体の成長能力に基づいている。こ
れは、第１キメラ逍広ｒに加えて微生物ｇｐｔ逍伝了と
接合したワクシニアプロモーターらかなりかつ非必須ア
ビボックス配列により側面配置された第２キメラ遺伝子
を含む挿入プラスミドを用いることによって達成された
。生体内における相同性組換の後、両キメラ遺伝丁一は
、アビポックスウィルスＤＮＡの非必須領域に存在する
。つづいて、ウィルスは、優性選択マーカーとして作用
する微生物性ｇｐｔ遺伝子を発現する。

アビボックス組換体の選択単離に対する条件は、次のと
おりである。すなわち、まずｇｐｔ遺伝子含白゛ウィル
ス集団を低多重度における選択条件下、ウィルスを継代
することによって増幅させた。ＣＥＦ単一層を異なる希
釈度の実施例７で記載されたトリブシン化ウィルス細胞
ａｆＥ−懸Ｅ液（０．　　１および０．０１の感染多重
度で）感染させ、ついで選択条件下（選択培地：ＤＭＥ
Ｍ，２．５％胎児ウシ血清、７　５　０ｎｇ／　ｍｌマ
イコフェノール酸、２５０ｍｃｇ／ｍｌキサンチン、１
５ｍｃｇ／ｎ＋ｌヒボキサンチン）生長させた。増幅法
を３度繰り返した。組換体の最終同定は、次のとおりブ
ラーク検定によって行なわれた。すなわち、トリブシン
化細胞懸濁液からなるウィルス性生原料の異なる培養液
をＣＥＦ単一層の感染に用いた。その後、細胞を選択培
地（ＤＭＥＭ、２．５％胎児ウシ血清、７　５　０ｎｇ
／　ｍｌマイコフェノール酸、２５０ｍＣ　ｇ　／　＋
ｕｌキサンチン、１５ｍｃｇヒポキサンチンおよび１％
低融点アガロースからなる）でコートした。５％ＣＯ２
をｈ゜する湿潤条件中３７゜Ｃで４〜５口後、ブラーク
を０．００５％ナチュラルレッドで着色することのより
決定した。いくつかのブラークを抽き出し、ついでドッ
トブロソトハイブリノダイゼーンヨンによって同定した
。

ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、例えば組換
体ウィルスを含−ａするウィルスブラークを同定する非
選択法として用いられる。決定は、ドットプロットハイ
プリダイゼーンヨンで好適に行なわれた。この方法にお
いて、キメラプラスミドで既に感染された細胞のトラン
スフエクション後に得られたウィルスを、１％アガロー
スゲルコーティングを存する細胞単一層上にシードアウ
トした。９６時間後、ブラークをナチュラルレッドでの
百色することにより決定した。個々のブラークからのウ
ィルスを無菌パスツールピペットを用いて除き、微小力
価プレート中の直径１６ｍｍのくほみにおいてＣＥＦ細
胞単一層を感染するのに用いた。３７℃にて４８時間培
養後、細胞を廃棄し、３サイクルの凍結および解凍によ
り溶解し、ミクロサンプリング装置による濾過によりニ
トロセルロースフィルター上に回収した［シュレイヒャ
ーおよひシュル（Ｓｅｈｌｃｉｅｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃ
ｈｉｊｌ１）コ。ついで、フィルターを１００ｍＭ　　
ＮａＣΩ、５０ｍＭ、トリスＨＣ（１，ｐＨ７．５で洗
浄し、第１の場合０．５Ｍ　　ＮａＯＨ，第２の場合Ｉ
ＭトリスＨＣΩ、ｐＨ７．５および第３の場合２ｘＳＳ
Ｃ　（ＩＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ　　ＮａＣＪ７，ｏ．０
１５Ｍクエン酸ナトリウム）が含浸されたワットマン（
Ｗｈａｔｍａｎ）　３　Ｍ　Ｍペーパ」二に連続して３
度拡げ、ついで８０゜Ｃで２時間ベークし、ついで６５
゜Ｃにて４ＸＳＳＣにおける５×デンハルド（Ｄｃｎｈ
ａｒ（ｌｔ＞溶液［バイオケミカル　バイオフィジカル
ノサーチ　コミニュケーション第２３巻　第６３１〜６
４６頁、１９６６年（Ｂｉｏｃｈｃｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．ｌシｃｓ．ｃｏｕｕｎｕｎ．２３６３１−６４６．　
１９６６］で４時間で培養された０．１ｍｇ　／　ｍｌ
変性サケ精子ＤＮＡで捕捉した。３２Ｐでの「ニソク翻
訳」によりマークされた次のＤＮＡおよびドデンル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１％の最終濃度に加え、１
２時間ハイブリダイセーションをつづけた。ついで、フ
ィルターを６５゜Ｃにて１５分間、２ｘＳＳＣ／０．１
％ＳＤＳで、ついで０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＳＣで
２度洗浄した。ついで、フィルターとオートラシオグラ
フイーし、組換体ウィルス濃化に基づいて同定した。

ビリラリールおよびベルグ（Ｖｌｌｌａｒｒｃａｌ　ａ
ｎｄ　Ｂｅｒｇ）　　［サイエンス　　１９Ｂ、第１８
３　〜１８５頁、１９７７年（Ｓｅｉｃｎｅｃ　１９Ｂ
，　１８３−１８５　、１９７７）］により別の方法が
記載されている。この方法のため、ウィルスプラークの
プリカは、ニトロセルロースフィルターを細胞単一層に
塗布することによって得られる。

ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、前記のごと
きこのセルロースフィルターで行なわれる。

組換体ウィルスを含有するプラークの局地化の後、残り
のウィルスをもともとブラークに積層された寒天から単
離する。

ヘーターガラクトシターゼ発現組換体の場合は、ブルー
ブラークスクリーニングを次のとおりｇｐｔ選択の代わ
りに行う。すなわち、大きいペトリ血（直径１５ｃｍ）
にて生長されたＣＥＦ単一層を低多小度で感染させ（通
常１０−３　　１０−４、およひ１０−５希釈度の未増
幅ウィルス性生原料）、培地中で（ＭＥＭ，２％胎児ウ
シ血清、グルタミン、ペニシリンおよびスリトプトマイ
ンン含白゛）２日間生長させ、１％低融点アガロース含
有同一培地のオーバーレイをもう３口間適用した。組換
体（ブルー）ブラークを、リン酸緩衝食塩水中０．４　
ｍｇ／　ｍｌ　Ｘゲル、０．００５％ナチュラルレッド
および１％アガロースゲルからなるオーハーレイで染色
することによって決定した。

実施例９ 組換体鶏痘Ｖｆｐ−１ａｃＺの構成 第３図に示すように、ウィルス性組換体Ｖ　ｆ　ｐ１ａ
ｃＺを構成するために、Ｅ，　　コリＩａｃＺ道伝ｒ−
ＫＭ３．ＯＫｂ　　Ｐｓｔｌ’７ラグメン１・ヲプラス
ミドｐＴＫｇｐｔ−ｏＦベータ　［ファルクナー、エフ
．ジー、およびモス．ビー　（１９８８年）、ジャーナ
ル　オブ　バイロロジイー、第６２巻、第１８４９　〜
１８４頁（Ｆａｌｋｎｃｒ，　Ｐ．Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｏ
ｓｓ，Ｂ．（１９８８）　Ｊ．　　Ｖｉｒｏｌ．　６２
．１８４９−１８５４）］のＰｓｔＩ消化物からの低融
点アガロースから純化し、１重人プラスミド、ｐＦＰＴ
Ｋｇｐ　ｔ　−Ｆ　Ｉ　Ｉの独特のＰｓｔ１部位に挿入
した。２つの得られた配向異性体をｐＦＩＩ−１ａｃＺ
およびｐＦＩＩ−１ａｃＺ＃７と命名した。

ｐＨＩｒ　−　１　ａ　ｃ　Ｚ＃４において、１ａｃＺ
遺伝子が正確に配向され、ワクシニアウィルスＰｌｌプ
ロモーターの開始コドンの後の枠に神大されたことを証
明するため、一時発現検定［コヒン、エム．マケット、
エム．およびモス、ビー［ＣｏｃｈｒａｎＭ．．　Ｍａ
ｅｋｃｔｔ，Ｍ．ａｎｄ　　Ｍｏｓｓ，Ｂ．，）により
記載、プロシーディング　オブ　ナショナル　アカデミ
ック　サイエンス　ユーエスエイ　第８２巻第１９〜２
３頁（Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ
．　　ＵＳＡ　８２．１９　−　２３）を行なった。ｐ
ＦＩＩ−１　ａ　ｃ　Ｚ＃７で１・リンスフ工クンヨン
された抽出物のみが高いベーターガラ１・ンターゼ活性
を含白゛し、一方ｐＦＩＩ−１ａｃＺにより得られた抽
出物は、活性がなかった。

組換体鶏痘ウィルスを構成するために、１次ニワ１・り
胚線維芽（Ｃ　Ｅ　Ｆ）の全単一層を痘症ウィルス菌株
ＨＰ１［エイ．マイヤー．マンニッヒ（Ａ．Ｍａｙｒ，
Ｍｕｎ１ｃｈ）により提供）の１細胞につき０．０２ｐ
　ｆ　ｕで感染させた。１時間の付着期間の後、培地を
加え、もう３時間培養し続けた。ｐＦＩＩ−１　ａ　ｃ
　Ｚ　＃　４　５　ｍ　ｃ　ｇ　ｓ　ニシン精子キャリ
ャーＤＮＡ１４ｍＣｇおよび鶏痘自生型ウィルスＤＮＡ
ｌｍｃｇからなるＤＮＡリン酸カルシウム沈降物を細胞
上に拡げた。室温における１５分間の培養の後、培地（
ＤＭＥＭ、坑生物質を有する８％ＦＢＳ）９ｏ＋ｌを加
えた。培地を４時間後にかえて、さらに３時間培養しつ
づけた。細胞を増殖させ、ウィルス性生原料を培地５０
０ｍｌ中に細胞を再懸ｌ蜀し、ついで当量の２．５％ト
リブシンを加えることによって調製した。３０分間培養
後、胎児ウシ而清５００ｍｌを加えてトリブシンを中和
した。

ブラーク検定のため、ニワトリ胚線Ｋ｛［ｉ’を６−ウ
エルプレート（ウエル直径３ｃｍ）の１ウエルにってＩ
　Ｘ　１　０５細胞の密度でシードし、前面生長させた
（通常２目間）。ウエルを１０−３　　１０−４および
１０−５希釈度のウィルス性生原料５００ｍｃ１で感染
させ、増幅させ（実施例８に記載のごとく）、１時間吸
着させるため培養した。ｇｐｔ選択性培地（ＤＭＥＭ，
２．５％ＦＢＳ，抗生物質、７５０ｎｇ／ｍｌ　　ＭＰ
Ａ、２５０ｍｃｇ／ｍｌキサンチンおよび１５ｍｃｇ／
ｍｌヒポキサンチン）の２口間の生長の後、細胞を１％
低融点アガロースＡ白−ｇｐｔｉｔ択性培地でオーバー
レイし、さらに２目間生長させた。ついで細胞を０．　
　００５％ナチュラルレッドおよび０．４ａ＋ｇ／ｍｌ
Ｘゲル含６オーバーラップで染色した。５時間の培香後
、ブルーブラークを直ちに可視化したところ、ベーター
ガラクトシターゼ発現ウィルス性組換体を示した。

実施例１０ 鶏痘ウィルス■ｆｐ−ＰＴＨＢの１１ｌＩｘ成第４図に
示すとおり、組換体ウィルスｖｆｐＰＴＨＢを構成する
ために、２．０ｋｂ　　ＥｃｏＲｌフラグメントとして
プロトロンビンｃ　ＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＫ
ｇｐｔ−ＰＴ．ｂをＥｃｏＲＩで分割した。プロトロン
ビン遺伝子を２．０ｋｂフラグメントとして低融点アガ
ロースより純化し、痘症挿入プラスミドｐ　Ｆ　Ｐ　ｔ
　ｌｃ　ｇ　ｐｔ−ｎの独特のＥｃｐＲ１部位にクロー
ンしプラスミドｐＦＩＩ−ＰＴＨＢを得た。この構成に
おいてプロトロンビン遺伝子のコード配列は、ワクンニ
アウィルスＰｌｌプロモーターの翻訳開始コドンの後の
枠内に抑人した。

プラスミドｐＦＩＩ−ＰＴＨＢを用いて、前述の実施例
９におおむね従って痘症ウィルス組換体Ｖｆｐ−ＰＴＨ
Ｂを構成した。

実施例１１ アビポックスウィルス組換体による 感受性鳥類細胞の感染 アビポックスウィルス組換体の同定後、２以上の感受性
プラーク純化を、純粋組換体ウィルスを産生ずるために
行なった。ついで、一次ニワトリ胚線維芽または他の一
次鳥類細胞等の感受性ウィルスを、組換体ウィルスをｆ
Ｔする多量菌株溶液を産生ずるために感染させた。この
菌株溶液の力価を連続希釈およびブラークテストによっ
て決定した。

異質道伝子の発現を決定するため、細胞を１細胞につき
１〜２０ｐｆｕ未純化または純化ウィルスで感染させ、
３７°Ｃにて７２〜９６時間培養した。異質遺伝子産生
物は、その性質により細胞培養培地中または細胞内で決
定することができた。

細胞内に残った産生物は、１以−トの以下の方法で開放
された。すなわち、超音波処理、凍結および解凍サイク
ル、ホモジネーションまたは洗浄剤処置である。

異質蛋白質は、免疫学的、酵素的または電気泳動方法に
より決定され、当業者に公知の通常の技術により増殖さ
れた。

実施例１２ アビポックスウィルス組換体での感受性哺乳類細胞の感
染 アビポックスウィルス組換体の同定後、１以上の連続ブ
ラーク純化を、純粋な組換体を得るために行った。つい
で、ＶｅｒｏまたはＣＶ−１細胞またはヒトＭＲＣ−５
等の感受性細胞を、屯要な異質遺伝子産生物の合成に関
してテストするために感染させた。異質遺伝子産生物の
決定および細胞の増殖は、前述の実施例１１のとおり行
なわれた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、鶏痘ウィルス挿入ベクターｐＦＰｔＩｃ−ｇ
ｐｔＦ１およびｐＦＰｔｋ−ｇｐｔＦＩＩの構成を示し
、 第２図は、鶏３１′７ウィルス挿入ベクターｐＦＰＵＶ
２の構成を示し、 第３図は、組換体鶏痘ウィルスｖ　ｆ　ｐ−１　ａ　ｃ
Ｚの構成を示し、また 第４図は、組換体鶏痘ウィルスｖｆｐ−ＰＴＨＢの構成
を示す。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛋白様物質に関してコードする異質ＤＮＡを発現
   する組換体アビポックスウィスル発現ベクターを含有す
   る動物細胞を生長させ、かつ該タンパク様物質を増殖す
   ることからなるタンパク様物質の製造方法。
2. （２）該発現ベクターが、アビポックスウィルスの天然
   ＤＮＡに加えて、異質ＤＮＡの発現を制御する補足的プ
   ロモーターを含有する請求項１に記載の方法。
3. （３）組換体アビポックスウィルス発現ベクターが、少
   なくとも１つのレプリコン（ｏｒｉ１）、少なくとも１
   つの選択マーカー（ｓｍ１）、少なくとも１つのクロー
   ニング部位（ｃｓ）および少なくとも１つのプロモータ
   ー（ただし、該プロモーターおよび該クローニング部位
   は、アビポックスウィルスＤＮＡ配列によって側面配置
   される）を含有する組換体プラスミドでアビポックスウ
   ィルスを組換えることによって産生される請求項１また
   は２に記載の方法。
4. （４）クローニング部位（ｃｓ）が多重クローニング部
   位である請求項３に記載の方法。
5. （５）クローニング部位が ａ）【遺伝子配列があります】； ｂ）【遺伝子配列があります】：および ｃ）【遺伝子配列があります】 のいずれか１つを有する請求項３または４に記載の方法
   。
6. （６）プロモーター（ｐｒ１）が痘症状ウィルスである
   請求項３、４または５に記載の方法。
7. （７）プロモーターが分子量１１ｋＤを有するポリペプ
   チドに関するワクシニアプロモーターｐ１１である請求
   項６に記載の方法。
8. （８）プロモーターが分子量２５ｋＤを有するポリペプ
   チドに関する後期鶏痘ウィルスプロモーターｐ２５であ
   る請求項６に記載の方法。
9. （９）異質ＤＮＡがプロモーターにより供給されるＡＴ
   Ｇ開始コドンの直ぐ後のまたはＡＴＧコドンの後のプリ
   ン残渣の１または２後のクローニング部位に挿入される
   請求項３〜８のいずれか１つに記載に方法。
10. （１０）アビポックスウィルスの側面配置ＤＮＡ配列が
    ウィルスゲノムの非必須領域に相当する請求項３〜９の
    いずれか１つに記載の方法。
11. （１１）アビポックスウィルスが鶏痘ウィルスである請
    求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
12. （１２）プラスミドが一重鎖ＤＮＡの産生を認めるレプ
    リコン（ｏｒｉ２）を補足的に担持する請求項３〜１０
    のいずれか１つに記載の方法。
13. （１３）プラスミドが第２選択マーカー（ｓｍ２）を含
    有する請求項３〜１０のいずれか１つに記載の方法。
14. （１４）第２選択マーカー（ｓｍ２）がキサンチン−グ
    アニンホスファリボシルトランスファーゼに関してコー
    ドするＤＮＡまたは坑生物質ヒグロマイシンを不活性化
    する蛋白質に関してコードするＤＮＡからなる請求項１
    ３に記載の方法。
15. （１５）第２選択マーカー（ｓｍ２）が￥Ｅ．コリ￥の
    ｌａｃＺ遺伝子に相当するＤＮＡからなる請求項１３に
    記載の方法。
16. （１６）蛋白様物質がビタミンＫ依存血液因子である請
    求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
17. （１７）挿入された異質ＤＮＡが百日咳、破傷風、マラ
    リア、エイズ、ダニ媒介脳炎、Ｂ型肝炎、ヘルペス感染
    および家禽疾病マレック病、ＩＬＴ、感染性気管支炎ま
    たはコクシジウム病を引き起こし得る病原体からの蛋白
    質またはその誘導体に関するコード配列に完全にまたは
    部分的に相当する請求項求項１〜１５のいずれか１つに
    記載の方法。
18. （１８）挿入された異質ＤＮＡが血液凝固因子VIII、I
    X、ＸII、ＸIIIまたはまたはＳのいずれか１つ、フオン
    ビルブランド因子、蛋白質Ｃ、プロトロンビン、アンチ
    トロンビン、プラスミノーゲン、ヒルジン、ＮＧＦ、Ｆ
    ＧＦ、ＴＮＦ、Ｂ細胞刺激因子、インターロイキングル
    ープからの蛋白質類、アポリ蛋白質またはウィルス類か
    らの糖蛋白質の少なくとも１つの蛋白質の生物学的機能
    を用する蛋白質に関して部分的または完全にコードする
    請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
19. （１９）蛋白様物質に関してコードする異質ＤＮＡを発
    現する組換体アビポックスウィルス発現ベクターを含有
    する細胞からなる哺乳類細胞培養菌株。
20. （２０）蛋白様物質に関してコードする異質ＤＮＡを発
    現する組換体アビポックスウィルス発現ベクターを含有
    する細胞からなる１次ニワトリ胚線維芽細胞培養菌株。