JPH06261763A - 修飾真核細胞質ｄｎａウイルス及びその産生方法 - Google Patents

修飾真核細胞質ｄｎａウイルス及びその産生方法

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JPH06261763A
JPH06261763A JP4250826A JP25082692A JPH06261763A JP H06261763 A JPH06261763 A JP H06261763A JP 4250826 A JP4250826 A JP 4250826A JP 25082692 A JP25082692 A JP 25082692A JP H06261763 A JPH06261763 A JP H06261763A
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virus
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ドルナー フリードリッヒ
Friedrich Scheiflinger
シェイフリンガー フリードリッヒ
Falko Gunter Falkner
ファルクナー ファルコ−ギュンター
Fleideler Michael
フライデラー ミカエル
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Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 修飾細胞質ＤＮＡウィルスゲノムを含む修飾
ＤＮＡ分子の直接分子クローニングにより修飾真核細胞
質ＤＮＡウィルスを産生する方法を開示する。 【構成】 本発明の方法は、（Ｉ）修飾細胞質ＤＮＡウ
ィルスゲノムを含む修飾ＤＮＡ分子を産生するために、
細胞外の条件下で、第１細胞質ＤＮＡウィルスゲノムを
含むＤＮＡ分子を修飾し、（II）修飾ＤＮＡ分子を、修
飾ＤＮＡ分子を感染性ビリオンにパッケージする第１宿
主細胞に導入し、及び（III) 修飾ウィルスゲノムを含
むビリオンを宿主細胞から回収する、工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本特許出願は、現在、放棄されて
いる、1991年８月26日に出願した特許出願番号第07／75
0,080 号出願の１部継続出願である。
【０００２】
【技術分野】本発明はポックスウイルスおよびイリドウ
イルス（iridoviruses) のような宿主細胞の細胞質に複
製する真核ＤＮＡウイルスの修飾ゲノムに関する。特
に、本発明は細胞質ＤＮＡウイルス ゲノムを含む精製
ＤＮＡ分子を細胞外条件下で修飾することによって生成
する修飾細胞質ＤＮＡウイルス ゲノムの直接分子クロ
ーニング（direct molecular cloning) に関する。次い
で、修飾ＤＮＡ分子はヘルパー細胞質ＤＮＡウイルスに
感染した細胞における感染性ビリオンに包装する。本発
明の好適例においては、望ましい遺伝子を含む外来性Ｄ
ＮＡフラグメントをゲノム ポックスウイルスＤＮＡ
に、ウイルス ゲノムに独特の制限エンドヌクレアーゼ
切断部位において直接に挿入し、修飾ウイルスＤＮＡを
ビリオンに、ヘルパー ポックスウイルスに感染した細
胞へのトランスフェクションにより包装する。
【０００３】
【背景技術】真核生物の細胞質ＤＮＡウイルスは背椎動
物および昆虫において見出された別種のポックスウイル
スおよびイリドウイルスを含んでいる。組換え体ゲノム
を有するポックスウイルスは挿入遺伝子の変種の形質発
現に用いられている。このポックスウイルスは、例えば
細胞培養において生物活性のポリペプチドを生産するの
に、およびワクチン抗原を動物またはヒト免疫系に与え
るのに用いることができる。外来遺伝子の形質発現につ
いての組換え体イリドウイルス ゲノムの構造は遺伝子
工学に属する文献に記載されていることが明らかでな
い。
【０００４】組換え体ポックスウイルス ゲノムの構造
についての普通の技術はインビボ（細胞内）組換えの１
部である外来遺伝子からなる。細胞内組換えの使用はサ
ムおよびダンベル氏「Ann. Virol. (1nstitut Pasteur)
132E ；135 (1981)によるウイルスＤＮＡのサブゲノム
フラグメント(subgenomic fragments)による「標識釈
放 (marker rescue)」プロセスとして初めに記載されて
いる。これらの著者は温度感受性ワクシニアウイルス突
然変異体を、ウサギ ポックスウイルスのサブゲノムＤ
ＮＡフラグメントによる細胞内組換えによって釈放する
（rescued)ことができる。細胞内組換えに用いられるこ
れらの方法は現在まだ用いられている。
【０００５】非ポックスウイルス（「外来」）遺伝子を
含む組換え体ワクシニアウイルスの構造は Panicali お
よびPaoletti氏「Proc. Nat ′1 Acad. Sci. U.S.A. 」
79 :4927〜4931 (1982) ; Mackett 氏ほか「Proc. Nat
′1 Acad. Sci. U.S.A. 」79: 7415〜7419 (1982) ;
および米国特許第4,769,330 号明細書によりあとで記載
されている。特に、組換え体ポックスウイルスを生産す
る現在の技術は２つの段階を含んでいる。初めに、外来
遺伝子を囲むポックスウイルス ゲノムに対してホモロ
ジー領域を有するＤＮＡフラグメントを作る。あるい
は、また「挿入」プラスミドを外来遺伝子とプラスミド
とのインビトロ（細胞外）組換えによって構成する。こ
のプラスミドは遺伝子挿入が最後に必要とされるポック
スウイルスゲノムの領域に相同する短いウイルスＤＮＡ
配列を含んでいる。外来遺伝子はウイルスＤＮＡ配列に
より横に並んでいる（flanked)、一般に挿入遺伝子の転
写を制御するポックスウイルス プロモーターの下流の
部位におけるプラスミドに挿入している。第２の段階に
おいて、挿入プラスミドは標的ポックスウイルスに感染
した宿主細胞に導入している。次いで、遺伝子をポック
スウイルス ゲノムに、ポックスウイルス ゲノムにお
ける相同ウイルス配列と外来遺伝子を含むプラスミドの
部分との間の細胞内組換えによって挿入している。次い
で、生成する組換え体ゲノムを複製し、感染性ポックス
ウイルスを生成している。
【０００６】それ故、各粒子遺伝子のポックスウイルス
ゲノムへの挿入は、必要とする挿入位置について選択
した遺伝子の横に並んだウイルス配列（gene flanked v
iralsequences) からなる独特なプラスミドが要求され
ている。この取り組み方の困難さは、新しい挿入プラス
ミドが各組換え体ポックスウイルスについて要求される
ことである。各プラスミドは細胞外組換えＤＮＡ方法に
より構成し、細菌細胞において増幅し、次いでポックス
ウイルス感染宿主細胞に加える前に研究室的に分離およ
び厳密に精製する必要がある。この関係での現在の方法
体系における他の問題は組換え体ゲノムの収率が低いこ
とであり、この場合多くの個々のウイルスをスクリーニ
ングして単一の望ましい組換え体を見出すことが必要と
なる。収率の乏しいことは、挿入プラスミドをウイルス
ゲノムに組込むこの種の多くの手段についての要件と
妥協した、個々の細胞内組換え発生の回数の低いことに
よる。結果として、細胞内組換え方法により生じた多大
数のウイルス ゲノムは外来遺伝子の欠乏している親ゲ
ノムである。それ故、任意の他の必要とされる配列に沿
って選択標識遺伝子をポックスウイルス ゲノムに挿入
して多くの個々のウイルス クローンから分離ＤＮＡの
性質を調べる必要なく所望とするまれな組換え体を検出
しやすくすることが、しばしば必要とされている。
【０００７】真核細胞質ＤＮＡウイルスの精製ＤＮＡ
は、核において複製するウイルスＤＮＡにより感染する
方法に用いる感受性宿主細胞に導入した場合に、複製す
ることができない。細胞質ＤＮＡウイルスのＤＮＡの感
染力のこの欠乏は、ウイルス転写を感染細胞において、
内部感染ビリオンを通常与えるウイルス・特異的ＲＮＡ
ポリメラーゼにより始める必要があることから生ずる。
【０００８】不活性化、非感染性ポックスウイルス粒子
の内部のゲノムＤＮＡを生存能力のあるヘルパー ポッ
クスウイルスによる共感染（coinfection)により感染性
ウイルスにパッケージングしたポックスウイルスDNA の
活性化は10年間にわたり知られていた（フェナーおよび
ウッドルーフェ氏「Virology」11 : 185〜201 (1960)参
照) 。1981年に、サムおよびダンベル氏は、最初のポッ
クスウイルスの分離した非感染ゲノムＤＮＡを第２の遺
伝学的に独特のポックスウイルスによって感染した細胞
における感染性ポックスウイルス ビリオンにパッケー
ジングすることができることを報告している（サムおよ
びダンベル氏「Ann. Virol.(InstitutPasteur)」132E :
135 (1981) 。裸のポックスウイルスDNA のこのパッケ
ージングは、先ずビリオンまたは感染細胞から第２の自
然に生ずるオルトポックスウイルス ゲノムにより感染
された細胞に分離した第１の野性型オルトポックスウイ
ルス ゲノムを含む非修飾（unmodified) DNA のトラン
スフェクションによって立証されている。しかしながら
異種パッケージング、すなわち、他の属の生存能力のあ
るビリオン (例えばアビポックス(avipox)による１種の
ポックスウイルス属（例えばオルトポックス）からのＤ
ＮＡのパッケージングは、まだ立証されていない。
【０００９】非ポックスウイルス遺伝子を形質発現する
組換え体ポックスウイルス ゲノムを構成する細胞内組
換えの使用は、サムおよびダンベル氏が裸のポックスウ
イルスＤＮＡを細胞内組換えによるＤＮＡフラグメント
によって釈放するポックスウイルス ビリオンおよび標
識に細胞内パッケージングすることを報告してから間も
なく発表されている（パニカリおよびパオレティ氏、19
82；マケット氏ほか、1982参照) 。しかしながら、次の
10年間における関連する文献には、直接分子クローニン
グ、すなわち、任意の真核細胞質ＤＮＡウイルス、特に
ポックスウイルスの修飾ゲノムの細胞外遺伝子工学によ
る唯一の構造は立証されていない。この文献は上述する
直接クローニングの研究方法から実現可能な任意の利益
の広い観点について示されていない。これに対して、信
頼すべき論文は、直接分子クローニングはポックスウイ
ルスＤＮＡが感染性でないためにポックスウイルスの遺
伝子工学の情況において実際的でないことを報告してい
る（Ｆ．フェナー、Ｐ．ウイテックおよび K.R. ダンベ
ル氏「The Poxviruses」( アカデミック プレス)、198
9) 。同様に、この分野における他の研究はポックスウ
イルスＤＮＡのエンドヌクレオテック（endonucleolyti
c)切断および再結合は度外視されていると共に、組換え
体ポックスウイルス ゲノムを含む分離ＤＮＡの感染性
ウイルスにより釈放するポテッシャルが認識されている
（例えば、マケットおよびスミス氏「J.Gen. Virol」67
: 2067 〜2082 (1986) 参照) 。さらに、最近の再調査
では、組換え体ポックスウイルス ゲノムを構成する可
能な唯一の手段は細胞内組換えを必要とする方法による
論文が提出されていた（マイナーおよびハウバイ氏「TI
BTECH 」８：20〜25 (1990) 、およびモスおよびフレッ
クスナー氏「 Ann. Rrv.Immunol. 」５：305 〜324 (19
87)。
【００１０】
【発明の開示】発明の概要 本発明の目的は、細胞内組換えに基づく普通の技術に関
連した上述する制限を克服する真核細胞質ＤＮＡウイル
ス、特にポックスウイルスの修飾ゲノム（modified gen
omes) を構成する方法を提供することである。本発明の
他の目的は、現存する方法体系より組換え体を実質的に
高収率で生成する細胞質ＤＮＡウイルス ゲノム−構造
技術を提供することである。本発明の他の目的はゲノム
ウイルスの直接修飾により細胞質ＤＮＡウイルスのゲ
ノムを修飾し、修飾したウイルスＤＮＡをビリオンにヘ
ルパー ウイルス機能の助けにより細胞内パッケージン
グする方法を提供することである。
【００１１】本発明の他の目的は、組換え反応段階にお
いて２つの可能な配向のそれぞれに挿入した外来ＤＮＡ
セグメントを有する修飾ゲノム、および外来ＤＮＡセグ
メントの多重挿入を有する修飾ゲノムを生成する細胞質
ＤＮＡウイルスのゲノムを構成する方法を提供すること
である。さらに、本発明の他の目的は、ウイルス ゲノ
ムに唯一の部位において配列−特異的なエンドヌクレア
ーゼで切断することにより生成した２部分のゲノム ウ
イルスＤＮＡを含む修飾細胞質ＤＮＡウイルス ゲノム
における外来遺伝子の直接分子クローニングに適当な修
飾ＤＮＡ分子を提供することである。さらに、本発明の
他の目的は、配列−特異的エンドヌクレアーゼについて
の独自（unique) 切断部位に挿入した外来ＤＮＡからな
る修飾ゲノムを有する細胞質ＤＮＡウイルス、特にポッ
クスウイルスを提供することである。さらに、また本発
明の他の目的は、遺伝子カセット（gene cassettes) を
構成しやすくする、および遺伝子カセットを細胞質ＤＮ
Ａウイルス、特にポックスウイルスに直接分子クローニ
ングを用いて転移しやすくするプラスミドを提供するこ
とである。
【００１２】上述するおよび他の目的の達成において、
本発明の１つの観点により、修飾細胞質ＤＮＡウイルス
ゲノムを含む修飾ＤＮＡ分子の直接分子クローニング
によって修飾真核細胞質ＤＮＡウイルスを生成する方法
を提供することである。本発明の方法は、（Ｉ）第１細
胞質ＤＮＡウイルス ゲノムを含む精製ＤＮＡ分子を細
胞外条件下で修飾して修飾ウイルス ゲノムを含む修飾
ＤＮＡ分子を生成し；（II) 修飾ＤＮＡ分子を感染性ビ
リオンにパッケージングする第１宿主細胞に修飾ＤＮＡ
分子を導入し；および(III) 第１宿主細胞から修飾ウイ
ルス ゲノムからなる感染性ビリオンを回収する各段階
を含んでいる。この方法の１例によれば、ＤＮＡ分子を
細胞外条件下で修飾する段階はＤＮＡ分子を配列−特異
的エンドヌクレアーゼで切断する段階を含んでいる。他
の例においては、ＤＮＡ分子を修飾する段階は第１ＤＮ
Ａ配列を第１ウイルス ゲノムに挿入する段階を含んで
いる。この第１ＤＮＡ配列は第１ゲノムに配列−特異的
エンドヌクレアーゼについての切断部位において挿入す
るのが有利である。細菌制限酵素のような特定の配列−
特異的エンドヌクレアーゼは指定されたヌクレアーゼの
任意のアイソシゾマーを示す名前で記載されている。
【００１３】必要に応じて、この方法によりＤＮＡ分子
を修飾する段階は、またホスファターゼを用いてＤＮＡ
分子を配列ー特異的エンドヌクレアーゼで切断すること
よって生成するＤＮＡフラグメントの未端からリン酸部
分（phosphate moiety)を除去する段階を含んでいる。
この方法のある例においては、第１ウイルス ゲノムを
ワクシニアウイルスゲノムとし、および独自部位を細菌
制限エンドヌクレアーゼ NotI についての切断部位また
は細菌制限エンドヌクレアーゼ SmaI についての切断部
位にする。また第１ゲノムは真核細胞質ＤＮＡウイルス
ゲノムに自然に生じない第２ＤＮＡ配列を含めること
ができ、この場合第２ＤＮＡ配列は独自切断部位からな
る。例えば、第１ゲノムは大腸菌β−ガラクトシダーゼ
遺伝子の配列を含む鶏痘ウイルス ゲノムにすることが
でき、および独自部位はかかる遺伝子に位置する細菌制
限エンドヌクレアーゼ NotI についての切断部位とす
る。
【００１４】この方法の他の形式においては、第１ＤＮ
Ａ配列を第１配列−特異的エンドヌクレアーゼについて
の第１切断部位と第２配列−特異的エンドヌクレアーゼ
についての第２切断部位との間の第１ウイルス ゲノム
に挿入する。必要に応じて、第１および第２切断部位
は、それぞれ第１ウイルス ゲノムにおいて独特であ
る。この本発明の方法の他の例においては、第１ゲノム
に挿入する第１ＤＮＡ配列の少なくとも１部分はプロモ
ーターの転写調節下にする。このプロモーターは第１ウ
イルス ゲノムに挿入する第１ＤＮＡ配列に位置するこ
とができる。あるいは、またプロモーターは第１ゲノム
に挿入する第１ＤＮＡ配列の上流の修飾ウイルス ゲノ
ムに位置する。ある場合には、プロモーターは修飾ウイ
ルス ゲノムにより暗号化したＲＮＡポリメラーゼによ
り利用される。また、このプロモーターは修飾すべき真
核細胞質ＤＮＡのＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始
に適当である。ある方法において、プロモーターは真核
細胞質ＤＮＡウイルスの自然に生ずるプロモーターの修
飾を含んでいる。
【００１５】本発明の方法によりＤＮＡ分子を修飾する
段階は、ＤＮＡ配列を第１ゲノムから欠失する段階を含
めることができる。あるいは、また、この段階は第１ゲ
ノムのＤＮＡ配列を置換する段階を含んでいる。また、
第１ウイルス ゲノムを修飾する方法は第１宿主細胞
を、修飾ウイルスゲノムを感染性ビリオンにパッケージ
ングするように形質発現する第２ゲノムを含む第２真核
細胞質ＤＮＡウイルスで第１宿主細胞に感染する段階を
含んでいる。修飾ＤＮＡ分子を第１宿主細胞に導入する
段階は第１宿主細胞を第２直核細胞質ＤＮＡウイルスで
感染する段階の後、約１時間にわたり行うのが有利であ
る。この方法の１例においては、第１宿主細胞を、第１
宿主細胞における第２ゲノムの形質発現が第２ウイルス
ゲノムからなる感染性ビリオンを生成しないように選
択することである。例えば、この場合、修飾ウイルス
ゲノムを修飾ワクシニア ウイルス ゲノムとし、およ
び第２ゲノムを鶏痘ワクチン ゲノムにし、および選定
第１宿主細胞を哺乳類の細胞にする。
【００１６】ウイルス ゲノムを修飾する方法のある形
式においては、修飾ウイルス ゲノムからなる感染性ウ
イルスの段階が第２宿主細胞を第１宿主細胞により生じ
た感染性ビリオンで感染する段階を含むことである。こ
の事は、第２宿主細胞における第２ゲノムの形質発現が
第２ゲノムからなる感染性ビリオンを生じないような条
件下で行うことである。例えば、修飾ウイルス ゲノム
を修飾ワクシニア ウイルス ゲノムとする場合に、第
２ゲノムは鶏痘ウイルス ゲノムにすることができ、お
よび第２宿主細胞を哺乳類の細胞にする。あるいは、ま
た修飾ウイルスゲノムは第２宿主細胞において感染性ビ
リオンを生ずるのに要する機能宿主域遺伝子を含む。こ
の事は、修飾ウイルス ゲノムをヒト細胞において感染
性ビリオンを生成するのに要する機能宿主域遺伝子を含
む修飾ワクシニア ウイルスゲノムにし、および第２宿
主細胞をヒト細胞にする場合によって例示することがで
きる。
【００１７】この方法の他の例においては、修飾ウイル
ス ゲノムが選択標識遺伝子（selective marker gene)
を含み、第２ゲノムが選択標識遺伝子に欠乏させ、およ
び第２宿主細胞を感染する段階が選択標識遺伝子を発現
するゲノムについて選択する条件下で行うようにする。
第２宿主細胞における選択標識遺伝子の形質発現は、選
択標識遺伝子を発現するゲノムについて選択するのに十
分なレベルで、感染中、存在する細胞障害薬物に対する
第２宿主細胞抵抗を与えるようにするのが有利である。
本発明の他の観点においては、上述する方法により修飾
ウイルス ゲノムの直接分子クローニングにより生じた
修飾真核細胞質ＤＮＡウイルスを提供することである。
また、本発明の他の観点は修飾ウイルス ゲノムからな
る修飾真核細胞質ＤＮＡウイルスに関するもので、この
場合、修飾ウイルス ゲノムは（Ｉ）第１真核細胞質Ｄ
ＮＡウイルスの第１ゲノムを含む。この第１ゲノムは配
列−特異的エンドヌクレアーゼについての切断部位から
なり、およびこの切断部位は第１ゲノムにおいて独自部
位である。さらに、修飾ゲノムは (II) 第１ゲノムにお
ける独自部位に挿入した第１ＤＮＡ配列を含む。
【００１８】本発明のこの観点における例において、第
１ＤＮＡ配列は真核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノムに自
然に生じない。ある好適な場合には、第１ゲノムをワク
シニア ウイルス ゲノムにし、および独自部位を Not
I および SmaI からなる群から選択した細菌制限エンド
ヌクレアーゼについての切断部位にする第１ゲノムは真
核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノムに自然に生じない第２
ＤＮＡ配列を含めることができ、およびこの第２ＤＮＡ
配列は独自切断部位からなる。１例において、第１ゲノ
ムを大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子の第２ＤＮＡ配
列を含む鶏痘ウイルス ゲノムにし、この遺伝子におけ
る独自部位を細菌制限エンドヌクレアーゼ NotI につい
ての切断部位にする。
【００１９】本発明の若干の修飾ウイルスにおいて、独
自部位に挿入する上記第１ＤＮＡ配列の少なくとも１部
分はプロモーターの転写調節下にする。このプロモータ
ーは第１ゲノムに挿入する第１ＤＮＡ配列に位置する。
ある場合には、第１ゲノムはポックスウイルス ゲノム
にし、およびプロモーターはポックスウイルス プロモ
ーターまたはその修飾を自然に生ずるポックスウイルス
プロモーターを含む。本発明の他の観点は、修飾ウイ
ルス ゲノムが（Ｉ）第１真核細胞質ＤＮＡウイルスの
第１ゲノムを含む。修飾ウイルス ゲノムからなる修飾
真核細胞質ＤＮＡウイルスに関するもので、この場合、
修飾ウイルス ゲノムは（Ｉ）第１真核細胞質ＤＮＡウ
イルスの第１ゲノムを含む。この第１ゲノムは第１配列
−特異的エンドヌクレアーゼについての第１切断部位お
よび第２配列−特異的エンドヌクレアーゼについての第
２切断部位からなる。これらの各切断部位は第１ゲノム
において独自部位である。
【００２０】さらに、この修飾ウイルスにおける修飾ゲ
ノムは (II) 第１独自部位と第２独自部位との間の第１
ゲノムに挿入した第１ＤＮＡ配列を含んでいる。この修
飾ウイルスのある例において、第１ＤＮＡ配列は真核細
胞質ＤＮＡウイルスのゲノムにおいて自然に生じない。
ある場合において、第１ゲノムは真核細胞質ＤＮＡウイ
ルスのゲノムに自然に生じない第２ＤＮＡ配列を含み、
およびこの第２ＤＮＡ配列は第１独自部位と第２独自部
位との間に挿入した第１ＤＮＡ配列からなる。１例にお
いて、この修飾ウイルスはワクシニア ウイルス ゲノ
ムである第１ゲノムを含むことができ、および第１独自
部位および第２独自部位のそれぞれをNotI, SmaI, Ap
aIおよび RsrIIからなる群から選択した細菌制限エンド
ヌクレアーゼについての切断部位にする
【００２１】本発明の他の修飾真核細胞質ＤＮＡウイル
スは（Ｉ）第１真核細胞質ＤＮＡウイルスの第１ゲノム
を含む修飾ウイルス ゲノムからなる。この第１ゲノム
は第１ＤＮＡ配列からなり、およびこの第１ＤＮＡ配列
は配列−特異的エンドヌクレアーゼについての切断部
位、すなわち、この修飾ウイルス ゲノムにおける独自
部位からなる。さらに、この修飾ウイルスのこのゲノム
は (II) ウイルス ゲノムにおける独自部位に挿入した
ＤＮＡ配列をブロモーターの転写調節下にするうよに位
置したブロモーターを含む。ある例において、この第１
ＤＮＡ配列はブロモーターと独自挿入部位との間の翻訳
読始めコドンに欠乏している。この第１ＤＮＡ配列は真
核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノムに自然に生じない配列
にすることができる。この修飾ウイルスは、第１ゲノム
をワクシニア ウイルス ゲノムにし、および第１ＤＮ
Ａ配列を細菌制限エンドヌクレアーゼ NotI, SmaI, Ap
aIおよび RsrIIについての切断部位を含む多重クローニ
ング部位からなる。
【００２２】本発明の他の観点は本発明の修飾真核細胞
質ＤＮＡウイルスに関するもので、この場合、修飾ウイ
ルス ゲノムにおける第１配列（興味ある挿入配列）を
タンパク質の生成において生ずる宿主細胞に発現する。
他の観点において、本発明は本発明による修飾ウイルス
の修飾ウイルス ゲノムを含むＤＮＡ分子に関する。特
に、このＤＮＡ分子のある形は真核細胞質ＤＮＡウイル
スの修飾ウイルス ゲノムの１つの末端を含んでおり、
この場合（Ｉ）修飾ウイルス ゲノムの末端は真核細胞
質ＤＮＡウイルスのゲノムに自然に生じないＤＮＡ配列
を含む。このＤＮＡ分子において、(II)修飾ウイルス
ゲノムは配列−特異的エンドヌクレアーゼについての切
断部位、すなわち、この修飾ウイルス ゲノムにおける
独自部位からなり；および (III)ＤＮＡ分子は修飾ウイ
ルス ゲノムにおける独自部位を配列−特異的エンドヌ
クレアーゼで切断することにより生ずる末端に相同する
末端を有する。
【００２３】このＤＮＡ分子のある形態においては、真
核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノムに自然に生じないＤＮ
Ａ配列は、配列−特異的エンドヌクレアーゼについての
切断部位、すなわち、この修飾ウイルス ゲノムにおけ
る独自部位からなる。本発明の他の観点において、本発
明は真核細胞質ＤＮＡウイルスの修飾ウイルス ゲノム
の直接分子クローニングについてのキットに関するもの
で、このキットは（Ｉ）本発明における精製ＤＮＡ分
子； (II) ＤＮＡリガーゼ；および(III)修飾ウイルス
ゲノムを含む修飾ＤＮＡ分子を生ずるＤＮＡセグメン
トの連結反応に適当な緩衝液および試薬の溶液を含んで
いる。１例において、このキットは遺伝子形質発現カセ
ットからなるプラスミドを含んでおり、かかるカセット
はキット中のＤＮＡ分子により暗号化した修飾ウイルス
ゲノムの独自切断部位にカセットを挿入するのに融和
性の配列−特異的エンドヌクレアーゼにより切断につい
ての部位により横に並んで位置する。さらに、キットは
第１宿主細胞、および修飾ウイルス ゲノムを感染性ビ
リオンにパッケージングするのに適当な第２ウイルスを
含んでいる。
【００２４】さらに、他の観点においては、本発明は各
末端に細菌制限エンドヌクレアーゼNotIについての切断
部位を有するＤＮＡセグメントを含むプラスミドに関す
る。このプラスミドにおいて、このＤＮＡセグメンはプ
ラスミドにおいて唯一の配列−特異的エンドヌクレアー
ゼ切断部位を含んでいる。図３に示すようにこのプラス
ミドの１例を PN2で示し、ＳＥＱ．ID. No1 の配列を含
んでいる。このプラスミドにおいて、ＤＮＡフラグメン
トは、さらにポックスウイルス プロモーターの転写調
節下で選択標識遺伝子を含むことができる。例えば、こ
のプラスミドはSEQ.ID.No2 の配列を含む pN2-gpta お
よび SEQ.ID. No3 の配列を含む pN2-gptbを示すプラ
スミドを含んでいる。
【００２５】本発明の他のプラスミドは、さらに制限エ
ンドヌクレアーゼ切断部位を含むＤＮＡ配列に操作的に
（operatively)結合したポックスウイルス プロモータ
ーを含むＤＮＡセグメントを含んでいる。それ故、この
切断部位に挿入したＤＮＡセグメントはこのプロモータ
ーの転写調節下になる。 SEQ.ID.NO.11 の配列を含むpA
I-S2、および SEQ.ID.NO.12 の配列を含む pA2-S2 を示
したプラスミドを例示することができる。さらに、分離
ポックスウイルス プロモーターの調節下で選択標識遺
伝子を含む上記プラスミドの例としては、SEQ.ID.NO.14
の配列を含むプラスミド pN2gpt-S4を示すことができ
る。また、他のプラスミドはポックスウイルスのチミジ
ンキナーゼ遺伝子を含むポックスウイルス ゲノムのセ
グメントを含んでいる。このチミジンキナーゼ遺伝子
は、SEQ.ID. NO.14 の配列を含む pHindJ-2 および SE
Q.ID.NO.5の配列を含むpHindJ-3 を示したプラスミドに
おけるように、活性チミジンキナーゼの形質発現を抑制
するように修飾した。他のプラスミドは翻訳読み始めコ
ドンに操作的に結合したポックスウイルスプロモーター
を含む。この読み始めコドンは、ただちに第２制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位に挿入した読み取り枠を翻訳す
るように適当に配置した第２制限エンドヌクレアーゼ切
断部位に従う。このプラスミドの例としては SEQ. ID.
NO.9の配列を含む pA1-S1 および SEQ. ID. NO.10 の配
列を含む pA2-S1 を示したプラスミド、および SEQ. I
D. NO.13 の配列を含むプラスミド pN2gpt-S3A を包含
している。
【００２６】さらに、このタイプの１種の特定のプラス
ミドはＤＮＡ配列暗号化ヒト プロトロビンを含んでお
り、この場合ＤＮＡ配列は、プラスミド pA1S1-PT を示
し、かつ SEQ. ID. NO5 の配列を含むプラスミドにより
図26に示すようにポックスウイルス プロモーターおよ
び読み始めコドンに操作的に結合する。さらに、他のプ
ラスミドはヒト プラスミノーゲンを暗号化し、かつ翻
訳読み始めコドン含むＤＮＡ配列を含んでおり、この場
合ＤＮＡ配列はポックスウイルスに操作的に結合する。
図27に示すように、この事は、ヒトglu-プラスミノーゲ
ンを暗号化し、かつ SEQ. ID. No.17 の配列を含む pN2
gpt-GPg.および lys−プラスミノーゲンを暗号化し、か
つ SEQ.ID.NO.18 の配列を含む pN2gpt-LPg のような p
N2gpt-S4 から誘導したプラスミドによって例示するこ
とができる。また、上述するように本発明の他のプラス
ミドは、SEQ.ID.NO.19の配列を含むプラスミド pN2gpt-
gp160 により図29に示すように、ポックスウイルス プ
ロモーターに操作的に結合した翻訳読み始めコドンを含
むＤＮＡ配列暗号化ヒト免疫不全ウイルス（HIV ）gp16
0 を含んでいる。最後に、他のプラスミドは図33に示す
ようにＤＮＡ配列暗号化ヒト フォン・ビルブラント因
子を含み、１例としてはSEQ.ID.NO.20の配列を含むプラ
スミド pvWF を示すことができる。
【００２７】本発明における若干のプラスミドはポック
スウイルスのゲノムに独特の配列−特異的エンドヌクレ
アーゼ切断部位を含んでいる。図21では、SEQ.ID.NO.6
の配列を含む pAO、 SEQ.ID.NO.7の配列を含む pA1, お
よび SEQ.ID.NO.8の配列を含む pA2を包含する例を示し
ている。他のプラスミドは、図35に示すように K1L宿主
域遺伝子を欠失するワクシニアウイルスＤＮＡの修飾 E
coRI K フラグメントを含んでいる。２つの例として
は、SEQ.ID.NO.21の配列を含む pEcoK-dhrおよび SEQ.I
D.NO.22 の配列を含むpdhr-gptを示すことができる。
【００２８】本発明の他の目的、要旨および利点は後述
する詳細な記載から明らかになる。しかしながら、本発
明の好適例を示す詳細な記載および特定例は例示してい
るのにすぎず、詳細な記載から当業者は本発明の要旨お
よび範囲内で種々変更を加えることができるものと理解
されるこきが明らかである。
【００２９】図面についての簡単な記載 図１は裸のポックスウイルスＤＮＡの反応性により生じ
たポックスウイルスの修飾ゲノムによる標識遺伝子の形
質発現を示している。パッケージングしたウイルス（vp
Pg＃１−vpPg＃８) によりおよび野性型（ＷＴ）ウイル
ス対照により感染した細胞の培養上澄み液に生成したタ
ンパク質の銀染色ポリアクリルアミドゲルを示してい
る。上部に示している矢印はプラスミノーゲン標識バン
ドを示しており、下部の矢印は主として分泌した35 Kワ
クシニア標識タンパク質のバンドを示している。レーン
１および９は標識タンパク質；レーン２および３は標準
のヒト プラスミノーゲン（10ng) ; レーン３はワクシ
ニア組換え体 vPgD （パッケージングしたＤＮＡの供給
源）；レーン４〜７および11〜14は vpPg # １〜８；お
よびレーン８および15は野性型ワクシニア（WR WT)を示
している。
【００３０】図２は標識遺伝子（大腸菌 (E.coli) gpt
遺伝子) をワクシニア ウイルスプロモーターの制御下
で形質発現する遺伝子カセットからなるポックスウイル
スゲノムの直接分子クローニングを示す線図である。
【００３１】図３はプロモーターおよび読み取り枠の挿
入による遺伝子形質発現カセットの構造についての前駆
体であるプラスミド（pN2-gptaおよび pN2-gptb)構造を
示す線図である。このカセットは独自挿入部位、および
ワクシニア ウイルス プロモーターにより駆動された
選択しうる標識遺伝子 (gpt)を用いるワクシニア ウイ
ルス ベクターへの直接分子転移を示す。ＭＣＳ＝多重
クローニング部位；Ｐ7.5＝ワクシニア7.5 Ｋポリペプ
チド遺伝子についてのプロモーター；Ｐ11＝ワクシニア
11 Ｋポリペプチド遺伝子についてのプロモーター。矢
印はプロモーターから転写の方向を示している。
【００３２】図４は直接分子クローニングにより生成し
たポックスウイルス ゲノムが、gpt-遺伝子プローブを
用い HindIIIエンドヌクレアーゼで消化したプラーク、
精製ウイルスＤＮＡのサザン・ブロット分析により示
す、独自（NotI) 切断部位に挿入した gpt標識遺伝子カ
セットを含有することを示している。レーン１は標識Ｄ
ＮＡ（HindIII はファージλＤＮＡを消化する）；レー
ン２および３は HindIIIで切断した野性型ワクシニア
ウイルス (ＷＲ）ＤＮＡ（それぞれ 500および100 n
g）；レーン４〜９は 2.1.1〜7.1.1 にわたって示した
プラークで感染した細胞のＤＮＡ；レーン10〜12はプラ
ーク10.1.1〜12.1.1 により感染した細胞のＤＮＡを示
している。矢印はキロ塩基対における標識の制限プラグ
メントの大きさを示している。
【００３３】図５は種々の分離物で感染し、かつ gpt−
遺伝子プローブでハイブリッド形成した細胞の NotI 消
化ＤＮＡのサザン・ブロット法を用いて得た修飾ポック
スウイルスＤＮＡの構造を示している。レーン１は標識
ＤＮＡ ( HindIIIはファージλＤＮＡを消化した）；レ
ーン２は NotI (50ng)で切断したワクシニア野性型 (W
T) ＤＮＡ；レーン３〜８は 2.1.1〜7.1.1 を示した組
換え体プラークで感染した細胞のＤＮＡ；およびレーン
９〜11はプラーク10.1.1〜12.1.1で感染した細胞のＤＮ
Ａを示している。
【００３４】図６は指示制限エンドヌクレアーゼで切断
し、かつアガロース ゲルにおいて分離したＤＮＡフラ
グメントの臭化エチジウム染色を用いる野性型（ＷＴ）
ワクシニアおよび修飾クローン（vp７）からのＤＮＡの
比較を示している。レーン１および２はWTおよび vp ７
の NotI 消化物；レーン３および４はWTおよびvp７のHi
ndIII 消化物；レーン５および６はWTおよびvp７のHind
III および NotI 結合消化物；レーン７および８はWTお
よびvp７の PstI 消化物；レーン９および10はWTおよび
vp７の PstI および NotI 結合消化物；レーン11および
12はWTおよびvp７のSalI消化物；およびレーン13は標識
ＤＮＡ（つなぎ、HindIII がファージλDNA 消化し；お
よびファージφX を HaeIII d 切断した) を示してい
る。左側の矢印はワクシニアWTの NotI 消化物のフラグ
メント (キロ塩基対における) の大きさを示しており、
および右側の矢印は標識を示している。レーン１および
２は他のレーンより約10倍少ないＤＮＡを含有してい
る。
【００３５】図７は gpt−遺伝子プローブを用いる図６
に示すゲルのサザン・ブロット分析の結果を示してい
る。矢印は標識の大きさを示している。
【００３６】図８は NotI で消化し、ワクシニア ウイ
ルス プローブにハイブリッド形成した感染細胞からの
ワクシニア ウイルスＤＮＡのサザン・ブロット分析の
結果を示している。レーン１〜４は指示プラークA1〜A4
で感染した細胞のＤＮＡ；レーン５〜８はプラークC1〜
C4；レーン９〜12はプラーク E1 〜E4；レーン13はワク
シニア WT DNA ；レーン14は非感染 CV-1 宿主細胞のＤ
ＮＡ；およびレーン15は標識ＤＮＡ（HindIII はファー
ジλＤＮＡを消化し；およびファージφX はHaeIIIで切
断した) を示している。
【００３７】図９は gpt−遺伝子プローブを用いる図８
に示すゲルにおけると同じ試料のサザン・ブロット分析
の結果を示している。レーン１〜12は図８におけると同
様であり；レーン13は非感染 CV-1 宿主細胞のＤＮＡ；
レーン14はワクシニアWTＤＮＡ；およびレーン15は標識
ＤＮＡ（HindIII はファージλＤＮＡを消化し；および
ファージφX は HaeIIIで切断した) を示している。
【００３８】図10は gpt−遺伝子プローブを用い、Ｐst
I で制限した図８に示すゲルにおけると同じウイルスＤ
ＮＡのサザン・ブロット分析の結果を示している。レー
ン12は図８に示すと同様であり；レーン13は非感染CV-1
宿主細胞のＤＮＡ；レーン14はワクシニア WT DNA ；お
よびレーン15は標識ＤＮＡ（HindIII はファージλＤＮ
Ａを消化しおよびファージφX は HaeIIIで切断した)
を示している。
【００３９】図11は gpt−遺伝子カセットの一本または
二本挿入によるワクシニア ウイルスＤＮＡの修飾 Pst
I 「Ｃ」フラグメントの構造の外形を示す線図である。
Ｐ＝PstIおよびＮ＝NotI切断部位、数値は個々のPstIフ
ラグメントの大きさを示しており；肉太の数字はgpt −
遺伝子プローブによりハイブリッド形成するのを予想し
たフラグメントを示している。矢印はワクシニア ウイ
ルス ブロモーター(300bp)による gpt−遺伝子（800b
p)の転写の方向を示している。
【００４０】図12は制限エンドヌクレアーゼ NotI によ
る消化および１％アガロース ゲルにおける FIGE によ
る分離での組換え体アビポックス (鶏痘(FP)）の分析の
結果を示している。レーン５は標識（ファージλ HindI
IIフラグメントはファージλおよびワクシニアWRで切断
しない）；レーン１および２は NotI で切断しないおよ
び切断した鶏痘ウイルス HP 1.441 DNA ; およびレーン
３および４は NotI で切断しないおよび切断した組換え
体鶏痘ウイルス f-TK2a DNA を示している。
【００４１】図13は直接分子クローニングにより外来遺
伝子を形質発現する鶏痘ウイルスの構造を示している。
ポックスウイルス ブロモーター(P) により制御した大
腸菌gpt遺伝子からなる遺伝子形質発現カセットを NotI
による切断により得た鶏痘ウイルス(f-TK2a)の右およ
び左DNA アーム (DNA arms)(それぞれraおよびla) でつ
なぐ。パッケージングはニワトリ胚繊維芽細胞における
鶏痘ヘルパー ウイルス（菌株 HP2) で行う。
【００４２】図14は細胞外ゲノム工学技術および細胞内
パッケージングによる修飾ポックスウイルスを構成する
プロセスを示している。ワクシニア ウイルス プロモ
ーターにより制御した gpt遺伝子からなる遺伝子カセッ
トを独自部位で切断したワクシニア ウイルスDNA の
「右アーム(ra)」および「左アーム(la)」でエンドヌク
レアーゼ SmaI によりつなぐ。パッケージングはニワト
リ胚繊維芽細胞における鶏痘ヘルパー ウイルス（菌株
HP1.441) により行う。Ｐ１＝7.5kDAポリペプチドにつ
いて暗号化するワクシニア ウイルス遺伝子のプロモー
ター。
【００４３】図15は鶏痘ヘルパー ウイルスによりパッ
ケージングした処理 (engineered)ワクシニア ウイル
ス ゲノムが、サザン・ブロット分析により検定したよ
うに、独自 SmaI 切断部位において予想挿入を含んでい
ることを示している。感染細胞から分離した全ＤＮＡは
HindIIIにより消化し、およびプロット(blat)を gpt−
遺伝子プローブによりハイブリッド形成した。レーン１
〜８は F12.2〜F12.9を示したプラークで感染した細胞
からのＤＮＡ；レーン９〜13はプラーク F13.1〜F13.5
; レーン14および15は非感染細胞およびワクシニア (W
R野性型) ウイルスで感染した細胞のそれぞれから分離
した Hind III-消化DNA ; およびレーン16は標識 (Hind
III−消化ファージλ DNA) を示している。レーン８に
おけるＤＮＡは、ウイルス分離物＃ F12.9が複製しない
ために、ハイブリッド形成しない。
【００４４】図16は一本および二本挿入による独自 Sma
I 部位に挿入した遺伝子カセットを有する修飾ワクシニ
ア ウイルス ゲノム、特に修飾 HindIII「Ａ」フラグ
メントの予想構造の外形を示す線図である。Ｈ＝HindII
I およびＳ＝ SmaI 制限エンドヌクレアーゼ切断部位。
数値HindIII フラグメントの大きさを示しており、肉太
タイプの数字は gpt−遺伝子によりハイブリッド形成す
ることを予想したフラグメントを示している。 gpt−遺
伝子カセットは gpt配列 (約800bp)から内部HindIII 部
位により分離したワクシニア ウイルス プロモーター
(約300bp 大きさ) からなる。矢印は gpt−遺伝子の転
写の方向を示している。
【００４５】図17, 18および19は修飾チミジンキナーゼ
(tk)遺伝子を有するワクシニア ウイルス因子vdTKの構
造を示す線図である。ＷＲ−ＷＴ＝ワクシニア ウイル
ス(VV)の野性型(WT)ウエスタン リザーブ (Western Re
serue)(WR)。図17は望ましくない NotI および SmaI 部
位の欠失を含むワクシニア ウイルス ゲノムの直接分
子修飾だけを用いる方法を示している。図18はワクシニ
ア ウイルスおよび修飾プラスミドによる標識釈放技術
を用いる NotI 部位の欠失についての他の方法の概略を
示している。図19は SmaI 部位を標識釈放により欠失す
る他の方法を示している。
【００４６】図20は多重クローニング部位に取って代え
たチミジンキナーゼ(tk)遺伝子を有するワクシニア ウ
イルス ベクター(vdTK)の構造を示している。矢印はプ
ラスミド pHindJ-I においてクローン化した HindIII J
フラグメントにおけるワクシニア ウイルスtk遺伝子(V
V-tk) の転写の開始および方向を示している。tk遺伝子
は示すように取り替え、最終プラスミド pHindJ-3 を用
いて修飾 HindIII Jフラグメントをワクシニア ウイル
スに挿入している。
【００４７】図21はプロモーターおよび読み取り枠の挿
入により遺伝子形質発現カセット(gene expression cas
settes)を構成するための前駆体であるプラスミド(pA1
およびpA2)の構造の外形を示している。このカセットは
方向 (強制) クローニングを用いるワクシニア ウイル
ス ベクター vdTK に直接分子転移するのに適当であ
る。
【００４８】図22は読み取り枠を合成ポックスウイルス
プロモーター(S1)および翻訳読み始めコドンと結合す
るのに適当な遺伝子形質発現カセットからなるプラスミ
ド（pA1-S1およびpA2-S1）の構造を示している。カセッ
トは強制クローニング（forced cloning) によりワクシ
ニア ウイルス ベクター vdTK に直接分子転移するよ
うに設計している。S1プロモーターは転写方向を示す矢
印によって示されているように、２種のプラスミドにお
いて異なる配向に存在している。
【００４９】図23は強制クローニングによりワクシニア
ウイルス ベクター vdTK に直接分子転移する前に、
翻訳読み始めコドンをすでに有する読み取り枠を合成ポ
ックスウイルス プロモーター(S2)と結合するのに適当
な遺伝子形質発現カセットからなるプラスミド(pA1-S2
およびpA2-S2 )の構造を示している。S2プロモーターは
転写方向を示す矢印によって示されているように、２種
のプラスミドにおいて異なる配向が存在している。
【００５０】図24はプラスミド pN2-gpta および pN2-g
ptb の構造を示している。図25はワクシニア ウイルス
ベクター vdTK における独自部位に直接分子転移する
前に、(S3A) 翻訳読み始めコドンの欠乏しているまたは
(S4) 翻訳読み始めコドンを有する読み取り枠を合成プ
ロモーター(S3AまたはS4のそれぞれ) と結合するのに適
当な遺伝子形質発現カセットからなるプラスミド(pN2gp
t-S3A およびpN2gpt-S4)の構造を示している。略語は図
３におけると同様である。
【００５１】図26はワクシニア ウイルス ベクター v
dTK においてヒト プロトンピンの形質発現についての
遺伝子形質発現カセット プラスミド(pA1S1-PT)の構造
を示している。略語は図３におけると同様である。矢印
は転写方向を示している。
【００５２】図27はワクシニア ウイルス ベクター v
dTK においてヒトglu-プラスミノーゲンの形質発現につ
いての遺伝子形質発現カセット プラスミド(pN2gpt-GP
g)の構造を示している。Ｓ４＝合成ポックスウイルス
プロモーター；他の略語は図３におけると同様である。
【００５３】図28はワクシニア ウイルス ベクター v
dTK においてヒトlys-プラスミノーゲンの形質発現につ
いての遺伝子形質発現カセット プラスミド(pN2gpt-LP
g)の構造を示している。略語は図３におけると同様であ
る。
【００５４】図29はワクシニア ウイルス ベクター v
dTK においてヒト ウイルス抗原 (HIV gpt160 )の形質
発現についての遺伝子形質発現カセット プラスミド
(pN2gpt-gp160)の構造を示している。略語は図３におけ
ると同様である。
【００５５】図30は視覚的に特有の表現型(1acZ 遺伝子
に欠乏するウイルスの正常の「白色」プラークに比べて
「青色」プラーク) を与える標識遺伝子 (大腸菌 1acZ
遺伝子) の同時挿入に基づく直接分子クローニングによ
り得た修飾ワクシニア ウイルスをスクリーニングする
１例を示している。
【００５６】図31はプラスミド pTZS4-1acZaおよび pTZ
S4-1acZbの構造を示している。図32は強い後期(late)ワ
クシニア ウイルス プロモーター(S4)の制御下におい
て方向マスター クローニング部位(directional maste
r cloning sita) を有するワクシニア ウイルス ベク
ター(vS4) の構造を示している。
【００５７】図33はワクシニア ウイルス ベクター v
S4への読み取り枠の直接分子挿入によるフォン・ビルブ
ランド因子の形質発現についての修飾ワクシニア ウイ
ルス(vvWF)の構造を示している。ｖＷＦ＝フォン・ビル
ブランド因子cDNA。矢印はS4プロモーターからの転写方
向を示している。
【００５８】図34は鶏痘ウイルスを完全に複製しない哺
乳類の(CV-1)細胞におけるワクシニア ウイルスＤＮＡ
を鶏痘ヘルパー ウイルスによりパッケージングする場
合のＤＮＡの添加量の効果を示している。５つの培養物
を鶏痘ウイルスで感染し、次いで指示量のワクシニア
ウイルスＤＮＡでトランスフェクションした。初めにカ
ラムはＤＮＡおよび鶏痘ウイルスを添加しない培養物を
示しており、５番目の培養物はＤＮＡを添加しないが、
しかし鶏痘ウイルスで感染させている。
【００５９】図35はあるヒト細胞系における複製を抑制
する宿主域突然変異を有するヘルパー ウイルスとして
用いるのに適当なワクシニア ウイルス(vdhr)の構造を
示している。ｈｒ＝ワクシニア ウイルスの EcoRI K
フラクションに位置した。宿主域遺伝子；他の略語は図
３におけると同様である。
【００６０】図36はプラスミド pS2gpt-P2および pP2gp
160MN の構造を示している。プラスミド内の矢印は個々
の遺伝子の転写方向を示している。
【００６１】図37はウイルス vP2-gp160MN-Aおよび vp2
-gp160MN-Bの構造の外形を線図的に示している。
【００６２】図38は野性型ワクシニア ウイルスのＰst
I-E-フラグメントおよびgp160 遺伝子を含むキメラ ウ
イルスのＰstI −フラグメントの地図を示している。矢
印はgp160 の遺伝子の転写方向を示している。数値はキ
ロ塩基対におけるフラグメントの大きさを示している。
【００６３】図39はプラスミド pse1P-gp-L2の構造を示
している。矢印は個々の遺伝子の転写方向を示してい
る。
【００６４】図40のＡはプラスミド pse1P-gp160MNの構
造を示しており、および図40のＢは野性型 (SEQ.ID.N
O.：73) および修飾 gp160−遺伝子（SEQ.ID.NO.：75)
の翻訳読み始めコドンのまわりの配列を示している。
【００６５】図41はキメラ ワクシニア ウイルス vse
1P・gp160MNAおよび vP2-gp160MNBの構造の外形を線図
的に示している。矢印は gp160−遺伝子の転写方向を示
している。
【００６６】図42は野性型ワクシニア ウイルスの SaI
I-F-フラクションおよびキメラ ワクシニア ウイルス
vse-gp160MNA および vP2-gp160MNB のSaII−フラグメ
ントの地図を示している。矢印は gp160−遺伝子の転写
方向を示している。数値はキロ塩基対におけるフラグメ
ントの大きさを示している。
【００６７】図43のＡはプラスミド pN2-gptaProtSの構
造を示している。ワクシニア P7.5プロモーター (P7.5)
により制御した gpt遺伝子、および合成ポックスウイ
ルスプロモーターにより制御したヒト タンパク質Ｓ遺
伝子(huProtS) からなる二重遺伝子カセット(double ge
ne cassette)を NotI 制限部位により側面に位置する。
図43のＢは野性型タンパク質Ｓ遺伝子（SEQ.ID.NO.：7
7) 、およびキメラ(SEQ.ID.NO.：79) におけるタンパク
質Ｓ遺伝子の翻訳読み始めコドンのまわりの配列を示し
ている。
【００６８】図44はタンパク質Ｓ遺伝子を担持するキメ
ラ ワクシニア ウイルスのサザン・プロット分析の結
果を示している。図44のＡは全細胞ＤＮＡを SacI で消
化し、ワクシニア野性型 SacI フラグメントでハイブリ
ッド形成している。図44のＢは同じ材料を NotI で消化
し、ヒトタンパク質Ｓ配列でプローブしている（probe
d) 。図44のＣは野性型 SacI-I-フラグメントおよび挿
入体の結合後のキメラ SacI-フラグメントの外形を線図
的に示している。
【００６９】図45はブラズマ−誘導タンパク質Ｓ（pdPr
otS ；レーン１および２）および組換え体タンパク質Ｓ
（rProtS) のウエスタン ブロット分析の結果を示して
いる。SK Hep1 の細胞の細胞培養澄み液 (10μl)を24〜
72時間にわたる温置後、評価した。
【００７０】図46はブラスミド pN2gpta-FIXの構造を示
している。ワクシニアＰ7.5 プロモーター (P7.5) によ
り制御した gpt遺伝子および合成ポックスウイルス プ
ロモーター (se1P) により制御したヒト因子IX遺伝子か
らなる二重遺伝子カセットをNotI制限部位により側面に
位置する。
【００７１】図47はヒト因子IXについての遺伝子を担持
するキメラ ウイルスのサザン・ブロット分析の結果を
示している。図47のＡは SfnI で消化し、ヒト因子IX遺
伝子プローブ (プラスミド pブルースクリプト(pBluesc
ript)-FIX でハイブリッド形成した全細胞ＤＮＡを示し
ている。すべて８つの分離物（＃１〜６，９および10)
において、挿入体は“α”配向を有しているが；ｍ＝標
識； VV-WT／ WR ＝ワクシニア野性型、WR−菌株、図47
のＢはキメラ ウイルスゲノム構造を示している。
【００７２】図48はプラズマ・誘導因子 IX (pdFIX；レ
ーン１および２）および Vero 細胞におけるキメラ ワ
クシニア ウイルスにより発現した組換え体因子 IX の
ウエスタン・ブロット分析の結果を示している。細胞培
養上澄み液 (10μl) を72時間の温置後に評価した。＃
１〜６，９および10＝プラーク分離物の数；pdFIX ＝プ
ラズマ・誘導因子 IX 。
【００７３】図49は HIVIIIB env遺伝子の直接分子クロ
ーニングによるキメラ鶏痘ウイルスf-envIIIB の構造を
示している。
【００７４】図50はenv 遺伝子挿入体の配向を示すキメ
ラ鶏痘ウイルス分離の SspI-フラグメントのサザン・ブ
ロット分析の結果を示している。レーン１〜12はウイル
ス分離ｆ−LFa-1 ；レーン13および14は HP1,441および
ｆ−TK2a (陰性対照) ；およびレーン15は pN2gpt-gp16
0 （陽性対照) の SspI 消化物を示している。図51はキ
メラ鶏痘ウイルスにおける２つの可能な配向においての
挿入体の SspI-フラグメントの制限地図を示している。
数値はキロ塩基対における SspI-フラグメントの大きさ
を示している。矢印は gp160転写単位の転写方向と一致
する挿入体の配向を示している。
【００７５】図52はニワトリ胚繊維芽細胞における HIV
エンベロープ糖タンパク質の形質発現を示している（ウ
エスタン ブロット) 。レーン１〜８はウイルス分離物
ｆ−LF2a-h；レーン９および15は Orth ／Donau , オー
ストリア ; レーン10〜13はウイルス分離物ｆ−1F2i-
1；レーン14は標識タンパク質；およびレーン16および1
7は鶏痘ウイルス HP 1.441 およびｆ−TK2a (陰性対照)
を示している。
【００７６】図53は感染ニワトリ胚繊維芽細胞における
キメラ ワクシニア ウイルスにより生じた HIV gp41
の欠失を示している (ウエスタン・ブロット) 。レーン
１〜８はウイルス分離ｆ−LF2a-h；レーン９および15は
gp160標準；レーン10〜13はウイルス分離物ｆ−LF2i-
1；レーン14は標識タンパク質；およびレーン16および1
7は鶏痘ウイルス HP1.441およびｆ−TK2a (陰性対照)
を示している。
【００７７】好適な具体例についての説明 本発明はポックスウイルスで例示するように、生存細胞
の制限の完全に範囲外の真核細胞質ＤＮＡウイルスの修
飾ゲノムの第１構造を示している。この構造は配列−特
異的エンドヌクレアーゼで切断し、次いで外来ＤＮＡで
再結合した分離ウイルス ゲノムＤＮＡを用いて構成し
た。次いで、生成する修飾ＤＮＡを感染性ポックスウイ
ルス ビリオンに、ヘルパー ウイルスとして作用する
他のポックスウイルスで感染した宿主細胞に転写するこ
とによってパッケージングした。
【００７８】本発明は他のＤＮＡウイルスに予め適用し
て種々の遺伝子工学の問題を解消した真核細胞質ＤＮＡ
ウイルスからベクター発生する方法を誘導する。例え
ば、この直接クローニング手段は、細菌ベクターについ
てあまり大きく、または細菌に毒性であり、または細菌
において不安定であるために、細菌系においてクローン
化することのできない、ポックスウイルスのような細胞
質ＤＮＡウイルスにおけるクローニング遺伝子の可能性
を与える。直接分子クローニングは、処理ウイルス ゲ
ノムの構造に正確さを与え、最適条件下でクローニング
の速度を高めることができ、および外来遺伝子の最適形
質発現を与える配列について速やかに処理できる、多く
の配向に多くの挿入体を有する多くの構造を単一連結反
応において生ずることができる。
【００７９】本発明において用いる「真核細胞質ＤＮＡ
ウイルス」はイリドウイルスおよびポックスウイルスを
包含している。イリドウイルスは、アフリカ ブタ熱ウ
イルスおよびある種の両生類および昆虫ウイルスにより
例示されるように、イリドビリダ科のメンバーとして分
類されている任意のウイルスを包含している。「ポック
スウイルス」はコルドポックスウイルス亜科（subfamil
ies Chordopoxviridae) ( 背椎物質ポックスウイルス)
およびエンドモポックスウイルス (Entomopoxuiridae)
亜科（昆虫ポックスウイルス) を含むポックスウイルス
科の任意のメンバーを包含している（例えば、Ｂ．モ
リ, Ｂ．Ｎ．フィエルダス, Ｄ．Ｍ．ニッペ氏ほか「VI
ROLOGY」2080 (ラベン プレス社 (1990) ）参照）。コ
ルドポックスウイルスは、とりわけ、次の属を包含して
おり、特定の例をカッコで示す：オルトポックスウイル
ス (Orthopoxuirus) (ワクシニア) ；アビポックスウイ
ルス（Avipoxvirus) (鶏痘）；カプリポックスウイルス
（Capripoxvirus) (シープポックス) (sheeppox)；レポ
リポックスウイルス（Leporipoxvirus) ( ウサギショー
プ (Shope)）繊維腫（粘液腫）；およびスイポックスウ
イルス（Suipoxuirus)(豚痘) 。エンドモポックスウイ
ルスは３つの属：Ａ．ＢおよびＣを含んでいる。
【００８０】本発明の１つの観点においては、修飾真核
細胞質ＤＮＡウイルスを修飾真核細胞質ＤＮＡウイルス
ゲノムの直接分子クローニングによって生成する方法
を提供する。この方法は、細胞外下で、第１細胞質ＤＮ
Ａウイルス ゲノムを含む精製ＤＮＡ分子を修飾して修
飾細胞質ＤＮＡウイルス ゲノムを含む修飾ＤＮＡ分子
を生成する段階を含んでいる。
【００８１】本発明の方法により修飾するのに適当な精
製ＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡを真核細胞質ＤＮＡウイ
ルスから分離する標準方法により、例えばゲノムＤＮＡ
をウイルス粒子から分離することにより生成する（例え
ば、後述する実施例１を参照）。あるいは、また若干の
またはすべての精製ＤＮＡ分子を分子クローニングまた
は化学合成から作ることができる。
【００８２】本発明の範囲内のウイルス ゲノムを含む
精製ＤＮＡ分子の修飾は上記ゲノムのＤＮＡ配列におい
て任意の遺伝性変化を生成することを含んでいる。この
変化は、例えばＤＮＡ配列を上記ゲノムに挿入し、かか
るゲノムからＤＮＡ配列を欠失すること、またはかかる
ゲノムにおけるＤＮＡ配列を異なるＤＮＡ配列で置換す
ることを含んでいる。挿入、欠失または置換するＤＮＡ
配列は単一ＤＮＡ塩基対またと１個のＤＮＡ塩基対から
なる。
【００８３】本発明のこの観点においては、第１ＤＮＡ
ウイルス ゲノムを含むＤＮＡ分子を修飾する段階はＤ
ＮＡ分子の配列を細胞外的に修飾するのに適当な任意の
技術により行う。例えば、本発明によるＤＮＡ分子の修
飾は紫外線のような物理的突然変異誘発物質により、ま
たは化学的突然変異誘発物質により精製ＤＮＡ分子を修
飾することを包含する。精製ＤＮＡ分子の細胞外突然変
異誘発の多くの方法は遺伝子工学の分野においてよく知
られている。
【００８４】他の例において、ＤＮＡ分子を修飾する段
階はＤＮＡセグメントを共に接合して修飾ウイルス ゲ
ノムを含む修飾ＤＮＡ分子を形成することを含んでい
る。この例の１つの観点においては、修飾するＤＮＡ分
子を形成するのに共に接合する若干のまたはすべてのＤ
ＮＡセグメントは第１ウイルス ゲノムおよびヌクレア
ーゼ、好ましくは配列−特異的エンドヌクレーゼを含む
ＤＮＡ分子を切断することにより生成する。あるいは、
また修飾ＤＮＡ分子を形成するのに共に接合する若干の
またはすべてのＤＮＡセグメントは周知の方法を用いる
化学合成によって作ることができる。
【００８５】ある例において、ＤＮＡセグメントを共に
接合して修飾ＤＮＡ分子を生成する段階は、広く知られ
ている組換えＤＮＡ法により細菌またはバクテリオファ
ージリガーセのようなリガーゼを用いてＤＮＡセグメン
トを共に連結する細胞外段階を含んでいる。必要に応じ
て、また、このＤＮＡ修飾段階は第１ウイルス ゲノム
を含むＤＮＡ分子から切断したＤＮＡセグメントの末端
をホスファターゼ、例えば仔ウシ腸ホスファターゼで処
理することを含んでいる。この酵素はリン酸部分を除去
し、これによりＤＮＡ分子を他のセグメントで切断する
ことにより生じた１つのＤＮＡセグメントの再結合を防
止する。
【００８６】ＤＮＡセグメントを接合する他の手段にお
いては若干のまたはすべてのＤＮＡセグメントを付着端
の細胞外アニーリングにより接合する。かかる付着端
は、修飾ＤＮＡ分子をアニーリングしたＤＮＡセグメン
トの連結を生ずる宿主細胞にトランスフェクションする
のに十分な長さにする。この方法の他の例において、第
１ウイルス ゲノムを含むＤＮＡ分子を修飾する段階
は、第１ウイルスのゲノムＤＮＡ分子の切断から生ずる
少なくとも若干のＤＮＡセグメントを付加ＤＮＡセグメ
ントと共に接合して修飾ＤＮＡ分子を生成する段階を含
めることができる。本発明のこの観点における好適な例
においては、この段階はゲノム ウイルスＤＮＡ分子を
配列−特異的エンドヌクレアーゼで第１ウイルス ゲノ
ムの独自切断部位で開裂し、これによりゲノム ウイル
スＤＮＡの２本のＤＮＡ「アーム（ DNA arms)」を生成
することを含んでいる。次いで、これらの２本のアーム
を興味ある配列を含む外来ＤＮＡとつなぐ。
【００８７】ウイルスＤＮＡアームとつなぐ外来ＤＮＡ
セグメントの配列を記載するのに用いる興味あるＤＮＡ
配列は、第１の例において、真核細胞質ＤＮＡウイルス
ゲノムに自然に生じないＤＮＡ配列を含んでいる。ある
いは、また興味あるＤＮＡ配列は真核細胞質ＤＮＡウイ
ルスのゲノムに自然に生ずる配列およびかかるゲノムに
自然に生じない配列からなる配列を含んでいる。さら
に、興味ある配列は真核細胞質ＤＮＡウイルスに自然に
生ずる配列だけを含めることができ、この場合この配列
は配列が自然に生ずる位置から異なる細胞質ＤＮＡウイ
ルスゲノムにおける位置に挿入する。さらに、興味ある
自然に生ずるウイルス配列を１つのＤＮＡウイルスから
他のＤＮＡウイルスに、または単一ウイルス ゲノムの
１部分からこのゲノムの他の部分に挿入することは、本
発明による細胞質ＤＮＡウイルスゲノムに自然に生じな
い配列がウイルス ゲノムと興味ある挿入ウイルス配列
の接合において必然的に生ずる。
【００８８】ゲノム ウイルスＤＮＡの２本のアームに
つなぐ外来ＤＮＡセグメントはウイルスＤＮＡアームの
末端で連結するのに適合する末端を含んでいる。この適
合性末端は相補的付着端またはブラント末端にすること
ができる。この特定の方法における連結段階では、第１
ウイルス ゲノムおよび独自部位において第１ウイルス
ゲノムに挿入した外来ＤＮＡのＤＮＡ配列を含む修飾
ＤＮＡ分子を生ずる。ＤＮＡ配列を第１ウイルス ゲノ
ムに挿入する方法のこの例としては、特に実施例１およ
び３にそれぞれ記載するように、遺伝子形質発現カセッ
トをワクシニア ウイルス ゲノムに細菌制限エンドヌ
クレーゼ NotI または SmaI についての独自切断部位に
挿入する方法を示すことができる。また、この例におい
ては、遺伝子カセットを組換え体ウイルス ベクターの
ゲノムに実施例２に記載するように組換え体鶏痘ウイル
ス ゲノム内の細菌遺伝子の配列内の独自 NotI 部位に
おいて挿入することができる。
【００８９】本発明における真核細胞質ＤＮＡウイルス
ゲノムにおける独自部位に外来ＤＮＡを挿入すること
は、所望おタンパク質、特にヒトタンパク質を形質発現
する目的に有利である。例えば、実施例５においてはプ
ラスミノーゲン、ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質16
0 (HIV gp160) についての遺伝子をワクシニア ウイル
ス ベクターの独自切断部位に挿入することについて、
およびこれらのタンパク質を生成するための生成修飾ワ
クシニア ウイルスの使用について記載している。外来
タンパク質は精製タンパク質を生成するための細胞培養
において、または宿主を本発明における修飾ウイルスを
含むワクチンで免疫するためのヒトまたは動物宿主にお
いて生成することができる。
【００９０】ある例において、ウイルス ゲノムをＤＮ
Ａ配列を挿入することによって修飾する段階は、修飾ウ
イルス ゲノムを第１ウイルス ゲノムから区別するた
めに標識遺伝子機能を導入または除去することを含める
ことができる。この１例において、第１ウイルス ゲノ
ムに挿入したＤＮＡ配列は選択標識遺伝子を含み、およ
び第１宿主細胞により生じた感染性修飾ポックスウイル
ス ビリオンを回収する段階は、選択標識遺伝子を形質
発現するポックスウイルス ゲノムについて選択する条
件下で、第２宿主細胞をこれらの感染性ビリオンで感染
する段階を含んでいる。本発明のこの観点における好ま
しい例においては、第２宿主細胞における選択標識遺伝
子の形質発現は細胞障害薬物に対する第２宿主細胞抵抗
性を与える。この薬物は第２宿主細胞の感染中に、選択
標識遺伝子を形質発現するポックスウイルス ゲノムに
ついて選択するのに十分なレベルで存在させる。この場
合、薬物は挿入選択標識遺伝子を有する修飾ウイルス
ゲノムについて選定し、かつ選択遺伝子が欠乏する任意
のゲノムに対して選定する。
【００９１】修飾ウイルス ゲノムを第１ウイルス ゲ
ノムと識別するために選択標識遺伝子を含むＤＮＡ配列
の挿入は、第１ウイルスのゲノムＤＮＡ分子が独自切断
部位において切断した場合に、特に有利であり、このた
めに生成ウイルスＤＮＡアームは所望のＤＮＡ配列の挿
入なしで再結合するようである。この手段は、例えば大
腸菌の酵素キサンチン−グアニジン−ホスホリボシル−
転移酵素についての遺伝子を、特にワクシニア ウイル
ス ゲノムまたは鶏痘ウイルス ゲノムに独自NotI部位
において実施例１および２のそれぞれに記載するように
挿入するようにする。標識遺伝子機能を第１ウイルス
ゲノムから除去して修飾ウイルス ゲノムを第１ゲノム
から識別する方法は実施例２に例示している。この方法
は外来ＤＮＡ配列β−ガラクトシダーゼについての大腸
菌（E.coli) IacZ遺伝子暗号に存在する NatI 部位への
鶏痘ウイルス ゲノムに挿入することに関する。実施例
２（アビポックス）に記載するように、ＤＮＡ配列のこ
の部位への挿入は 1acZ 暗号配列を分裂させ、これによ
りβーガラクトシダーゼの生成を抑制する。この酵素の
形質発現は 1acZ 遺伝子を担持するウイルスについて
「青色プラーク」表現型を生ずる。従って、この部位に
おけるＤＮＡ配列の挿入を支える修飾ウイルスゲノム
は、修飾ウイルスを第１ウイルスと識別する白色プラー
ク表現型を示す。本発明の方法の他の例においては、機
能性大腸菌 1acZ (functioning E.coli1acZ) をベクタ
ーに、所望の挿入体を含有する修飾ウイルスについての
標識として作用するのに興味ある他の遺伝子によって転
移する。
【００９２】本発明の方法の他の例において、ＤＮＡ分
子を修飾する段階は配列−特異的エンドヌクレアーゼに
ついての新しい切断部位を第１ウイルス ゲノムに導入
することを含んでいる。この方法の１例においては、実
施例６に記載するように、合成ＤＮＡ「リンカー」から
なる外来ＤＮＡを第１ポックスウイルス ゲノムに存在
する独自部位に挿入することを含んでいる。このリンカ
ーは、外来ＤＮＡを修飾ポックスウイルス ゲノムに挿
入するのに有用な二三の隣接する切断部位からなる「多
重クローニング部位」を含んでいる。多重クローニング
部位における切断部位は第１ウイルス ゲノムに存在さ
せないようにし、それ故、修飾ウイルスゲノムに独特の
ものにするのが有利である。
【００９３】特に、第１ウイルス ゲノムを含むＤＮＡ
分子を修飾する段階は、また、配列−特異的エンドヌク
レアーゼについての第１切断部位と第２切断部位との間
にＤＮＡ配列を挿入することを含めることができる。１
例において、第１ウイルスゲノムは第１ウイルス ゲノ
ムに独自切断部位からなる多重クローニング部位を含ん
でいる。この方法では、第１ウイルス ゲノムを含むＤ
ＮＡ分子を多重クローニング部位における２つの独自部
位において切断することによって、互いに連結するのに
適合しない付着端を有する２個のウイルスＤＮＡアーム
を生ずる。多重クローニング部位における２つの独自切
断部位間の介在ＤＮＡセグメントは、切断ウイルスＤＮ
Ａアームから、例えば実施例５においてヒト プロトロ
ンビン遺伝子を修飾ポックスウイルス ベクターに挿入
するために記載しているように、上記アームのエタノー
ル沈降によって除去する。
【００９４】ＤＮＡセグメントを２つの独自切断部位間
のウイルス ゲノムに挿入することは、ベクターアーム
のそれぞれと連結するのに適合する付着端を有するＤＮ
Ａ挿入体の「強制」クローニングに有利である。換言す
ると、２つの部位におけるウイルスＤＮＡの切断を含む
この方法は、ウイルスＤＮＡを一つの部位において切断
することにより生じたアームに匹敵するウイルＤＮＡア
ームの連結から生ずるウイルス ゲノムの収量を高める
のに有利である。なぜならば、この方法のアームは連結
するのに適合する末端を有していないためである。ま
た、この強制クローニング方法は、１つのウイルＤＮＡ
アームだけが挿入ＤＮＡの各末端に連結するのに適合す
るために、修飾ウイルス ゲノム内に挿入したＤＮＡの
配向を指示する。
【００９５】本発明の強制クローニング方法は、例えば
実施例５に記載するように、ヒトプロトロピン遺伝子か
らなる遺伝子形質発現カセットをワクシニア ウイルス
ベクターの多重クローニング部位に挿入することによっ
て示すことができる。好ましい例において、第１ウイル
ス ゲノムにおける２つの独自切断部位間における挿入
ＤＮＡセグメントは第１ウイルス ゲノムの複製に必要
としなく、それ故、この配列を除去することも、他のＤ
ＮＡセグメントで置き換えることもなく、生成修飾ゲノ
ムの複製を防止することができる。あるいは、また介在
ＤＮＡセグメントは、第１ウイルス ゲノムに挿入する
付加ＤＮＡ配列に結合したウイルス複製について必要と
する介在配列の部分を含むＤＮＡセグメントで置き換え
るこができる。
【００９６】本発明の他の観点において、第１ウイルス
ゲノムを修飾する段階は配列−特異的エンドヌクレア
ーゼについて望ましくない切断部位を除去することを含
んでいる。このタイプの修飾は、必要に応じて、同じヌ
クレアーゼについての余分の切断部位を除去するために
繰り返し行うことができ、これにより最後に、特定のヌ
クレアーゼについての独自切断部位を有する修飾ウイル
ス ゲノムを生成する。切断部位をウイルス ゲノムか
ら除去するのに、特に適当な方法は当業技術において知
られている。この方法は多くの一般部位−特異的突然変
異誘発を含んでいる。エンドヌクレアーゼ切断部位をウ
イルス ゲノムから除去する特別の１方法は適当なエン
ドヌクレアーゼによる切断に抵抗する突然変異体ゲノム
ＤＮＡ分子について選択するゲノム ウイルスＤＮＡの
細胞外処理を含んでいる。
【００９７】切断部位をウイルス ゲノムから除去する
他の方法は、切断ウイルスＤＮＡ分子を、ＤＮＡセグメ
ント、例えば切断ウイルスＤＮＡと連結するのに適合す
るが、しかしウイルスＤＮＡを切断するヌクレアーゼに
ついての認識配列（recognition sequence) の部分が欠
乏している末端を含むＤＮＡセグメントで連結すること
からなる。この方法においては、ウイルスＤＮＡを切断
する配列−特異的エンドヌクレアーゼについての切断部
位は、付着端に包囲した配列を越えて付着端に隣接する
配列に延びるヌクレアーゼ認識配列を含んでいる。合成
挿入体は一つの部位で切断したウイルスＤＮＡアームに
よる連結に適合する付着端を含んでいる。しかしなが
ら、合成挿入体の１つの付着端に隣接する配列は、ウイ
ルスＤＮＡを切断する酵素による切断に必要とする認識
配列から異なる。それ故、合成ＤＮＡセグメントのこの
末端のウイルス アームによる連結は、ウイルスＤＮＡ
を切断するヌクレアーゼについての機能切断部位を再構
成しない。切断部位をウイルス ゲノムから除去するこ
の方法は、実施例４に例示するように、多重クローニン
グ部位を含む合成ＤＮＡセグメントをウイルス ゲノム
の独自切断部位に挿入することを含んでいる。
【００９８】修飾の結果としてウイルス ゲノムの不活
性化を防止するために、本発明の方法によるウイルス
ゲノムの修飾は、生成修飾ウイルスの増殖に用いられた
条件下で、細胞培養におけるウイルス増殖に必要とされ
ないウイルス ゲノムの領域に形成する必要がある。細
胞培養における増殖に必要としない、さもないければ本
発明の方法による修飾に適当である配列を含むＤＮＡウ
イルス ゲノム領域は、遺伝子の間（すなわち、遺伝子
間領域）の配列、および修飾ウイルス ゲノムの増殖に
必要としない遺伝子の配列を含んでいる。
【００９９】本発明における真核細胞質ＤＮＡウイルス
の選定ゲノムを修飾するのに適当な重要でない部位は、
所望とする修飾を行い、かつこの修飾が所望とする感染
条件下で上記ゲノムの複製に妨げられるか否かを調べる
ことによって確認することができる。特に、ウイルス
ゲノムにおける独自部位を含むかかるウイルス ゲノム
における制限酵素部位は、例えばゲノムＤＮＡの消化に
より、および当業技術において広く知られている手順を
用いる生成フラグメントの分析により確認する。ゲノム
は、短い合成ＤＮＡセグメントの試験的挿入により、本
発明の直接クローニング方法によって選定標的切断部位
に分裂することができる。選定標的部位における試験的
挿入体からなるウイルス回収は、標的部位が上記ゲノム
の重要でない領域にあることを直接に指示する。あるい
は、また有用な切断部位が特定のゲノム標的位置に存在
しない場合には、かかる部位は標識釈放技術に基づく直
接分子クローニングまたは普通のゲノム構造を用いて導
入することができる。この場合、標的位置における挿入
切断部位からなるウイルスの回収がよいことは、標的位
置が本発明における修飾に適当である重要でない領域に
あることを直接に示している。
【０１００】本発明をポックスウイルスにより行うのに
適当である重要でないゲノム領域は、例えばゴエベル氏
ほか「Virology」 179；247 〜266 (1990)の表１に記載
されている。
【０１０１】本発明の他の例においては、第１ウイルス
ゲノムに挿入する少なくとも１部分のＤＮＡ配列をプ
ロモーターの転写調節する。ある例において、このプロ
モーターを第１ウイルス ゲノムに挿入するＤＮＡ配列
に位置し、これによりプロモーターから下流の挿入ＤＮ
Ａ配列の部分の転写を制御する。この手段は、例えば実
施例１〜５に記載しているように、読み取り枠に機能的
に結合したプロモーターを含む遺伝子カセットのポック
スウイルス ゲノムに挿入することができる。他の好適
な例において、第１ウイルス ゲノムに挿入するＤＮＡ
配列のプロモーター制御転写を挿入ＤＮＡ配列の上流の
修飾ウイルス ゲノムに位置する。この手段は実施例６
に記載するように、ヒト フォン・ビルブランド因子タ
ンパク質を暗号化する cＤＮＡをワクシニア ウイルス
ベクターにおける上流のプロモーターに機能的に結合
する多重クローニング部位に挿入することができる。
【０１０２】ある例においては、挿入ＤＮＡ配列を制御
するプロモーターは修飾ウイルスゲノムにより暗号化し
たＲＮＡポリメラーゼによって確認する。あるいは、ま
たこのプロモーターは他のゲノム、例えば他のウイルス
または細胞ゲノムにより暗号化したＲＮＡポリメラーゼ
によってのみ確認するようにする。例えば、このＲＮＡ
ポリメラーゼは他の細胞質ＤＮＡウイルス ゲノムによ
りまたは修飾宿主細胞のゲノムにより暗号化するバクテ
リオファージＴ７ポリメラーゼにすることができる。Ｔ
７ポリメラーゼおよびプロモーターは、例えば挿入ＤＮ
Ａ配列の形質発現を高めるために組換え体ポックスウイ
ルスに用いられている（例えば、T.R.フエルト氏ほか
「J. Mol. Biol. 」 205；333 〜348 (1989)。 T7 RNA
ポリメラーゼを分離ゲノムに与えることは、分離ゲノム
が存在する場合を除いて、修飾ポックスウイルス ゲノ
ムに挿入したＤＮＡ配列の形質発現を防止するのに用い
る。
【０１０３】更に他の態様においては、挿入体を調節す
るプロモーターが、細胞質ＤＮＡウイルスＲＮＡポリメ
ラーゼによって転写を開始するのに適している。幾つか
の態様においては、このプロモーターは、自然発生した
ウイルス性プロモーターのＤＮＡ配列の修飾からなる。
こうした態様の一つを例示すると、特に、実施例５及び
６に記載された「Ｓ３Ａ」及び「Ｓ４」プロモーターの
ような、「合成」ワクシニアウイルスプロモーターを使
用する。
【０１０４】更に、本発明の真核細胞質ＤＮＡウイルス
のゲノム構成法は、修飾ウイルスのゲノムを含む修飾Ｄ
ＮＡ分子を第一の宿主細胞中へと導入する工程を有し、
第一の宿主細胞がこの修飾ＤＮＡ分子を感染性修飾細胞
質ＤＮＡウイルスビリオン中にパッケージングする。こ
の修飾ＤＮＡ分子は、第一の宿主細胞をＤＮＡ分子でト
ランスフェクションするのに適した方法によって、例え
ば、他のＤＮＡを類似の宿主細胞にトランスフェクショ
ンするために本技術分野で知られた方法によって、第一
の宿主細胞中へと導入する。例えば、好適例では、グラ
ハム及ヴァンデルEb (Graham and van der Eb)の「ウイ
ルス学：Virology」52：456 −467 (1973)に記載された
リン酸カルシウム沈降技術を用いて、修飾ＤＮＡを第一
の宿主細胞中へと導入する。
【０１０５】好適な態様においては、修飾真核細胞質Ｄ
ＮＡウイルスを生産するこの方法は、更に、第一の宿主
細胞を、第二の細胞質ＤＮＡウイルスのゲノムを含む第
二の細胞質ＤＮＡウイルスに感染させる工程を有し、第
二の細胞質ＤＮＡウイルスのゲノムが形質発現して、修
飾ＤＮＡ分子を感染性修飾細胞質ＤＮＡウイルスのビリ
オン中へとパッケージングする。第一の宿主細胞に第二
のウイルスを感染させることを含む方法においては、こ
の第一の宿主細胞中への組み換え体ＤＮＡ分子の導入
は、第一の宿主細胞に第二のウイルスを感染させた後約
１時間で遂行するのが有利である。
【０１０６】この方法の他の態様においては、第一の宿
主細胞中で必要なパッケージング機能は、第一の宿主細
胞の形質転換及び必要なヘルパーウイルス機能の形質発
現に適したプラスミドや他の発現ベクターのような、第
二のウイルスの完全なゲノム以外の遺伝要素によっても
たらされる。ヘルパー機能をもたらすために非ウイルス
性遺伝要素を用いることにより、感染性ヘルパーウイル
スを生産しない遺伝的に安定なヘルパー細胞を生産する
ことが可能になる。修飾ＤＮＡ分子のパッケージング用
の第一の宿主細胞としてこうしたヘルパー細胞を使用す
ることにより、この修飾ＤＮＡのみを含むビリオンを生
産できるので、有利である。
【０１０７】第一の宿主細胞に第二のウイルスを感染さ
せることを含む方法においては、第一の宿主細胞中の第
二のウイルスのゲノムの形質発現が、修飾ウイルス ゲ
ノムを有する感染性ビリオン中へと修飾ＤＮＡ分子をパ
ッケージングするように、第二のウイルスを選ぶ。本発
明に従い、真核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノムを含む修
飾ＤＮＡを、近接関連したウイルスの感染した細胞中へ
とトランスフェクションさせることによって細胞内パッ
ケージングすることが可能である。例えば、第一のポッ
クスウイルス属のＤＮＡを、これと同じ又は異なる属か
らの、同じポックスウイルスサブファミリーの第二のポ
ックスウイルスが感染した宿主細胞によってパッケージ
ングする。
【０１０８】特定の態様では、第一の宿主細胞における
第二のウイルス ゲノムの形質発現が、第二のウイルス
ゲノムを含む感染性ビリオンに加え、修飾ウイルス
ゲノムを含む感染性ビリオンを生産する。こうした状況
は、例えば、ある属からの第一のポックスウイルスＤＮ
Ａを、これと同じ属の第二のポックスウイルスによって
相同パッケージングした場合に起こる。ここで、トラン
スフェクションされたＤＮＡは理論的には直接に、即
ち、トランスフェクションされたゲノムの転写なしにパ
ッケージングされ得るけれども、このトランスフェクシ
ョンされたＤＮＡ分子の相同パッケージングには、おそ
らく、トランスフェクションされたＤＮＡ及びヘルパー
ウイルスのＤＮＡの双方の転写と複製とが含まれる。こ
の状況は、特に、実施例１及び２におけるポックスウイ
ルスＤＮＡの相同パッケージングによって示される。
【０１０９】しかし、他の態様においては、第一の宿主
細胞中の第二のウイルス ゲノムの形質発現は、この第
二のウイルス ゲノムを含む感染性ビリオンを生産しな
い。異種パッケージングを含む場合には、例えば、受動
性パッケージング単独では、トランスフェクションされ
たＤＮＡから生存ウイルス粒子を生産しない。この場合
には、トランスフェクションされたＤＮＡを鋳型として
認識し、これによって、トランスフェクションされたＤ
ＮＡの転写を開始し、結局は複製を開始するように働く
ＲＮＡポリメラーゼをもたらす第二の（ヘルパー）ウイ
ルスを選ぶことが有利である。この場合の例としては、
実施例３で述べるように、アビポックスウイルスがこの
アビポックス ウイルス ゲノムを含む感染性ビリオン
を生産できない哺乳類の第一の宿主細胞において、オル
トポックス ウイルス（ワクシニア）ベクターの修飾ゲ
ノムをアビポックス（鶏痘）ヘルパーウイルスによって
再活性化する。
【０１１０】修飾ＤＮＡ分子をパッケージングするのに
異種ウイルスを使用することにより、例えば鶏痘ウイル
ス又はエクトロメリア（ectromeria) （マウスポック
ス）ウイルスをワクシニア ウイルス構成体用のヘルパ
ーとして使用することにより、ヘルパーウイルスのゲノ
ムとトランスフェクションされたゲノムとの間での組み
換えの発生を最小限にできるで有利である。この組み換
えは、近接関連したウイルスの相同配列が一つの細胞の
中に存在しているときに生ずる。フェンナー及びコンベ
ン（Fenner and Comben) (1958) ；フェンナー（Fenne
r) (1959)を参照。
【０１１１】ＤＮＡパッケージングのためにヘルパーウ
イルスを使用する方法の特定の態様においては、修飾ウ
イルス ゲノムを含む感染性ビリオンを回収する工程
が、第一の宿主細胞によって生産された感染性ビリオン
を第二の宿主細胞に感染させる工程を含む。好ましく
は、この第二の宿主細胞における第二のウイルス ゲノ
ムの形質発現が、第二のウイルス ゲノムを含む感染性
ビリオンを生産しないような条件の下に、第二の宿主細
胞に感染させる。言い換えると、修飾ウイルスの複製を
選択し、ヘルパーウイルスの複製を選択しないような条
件の下に、第二の宿主細胞に感染させる。こうした方法
を例示するものとして、修飾ゲノムが修飾ワクシニアウ
イルスのゲノムであり、第二のゲノムが鶏痘ウイルスの
ゲノムであり、第二の宿主細胞が哺乳類細胞である方法
がある。この方法では、実施例３に示すように、鶏痘ウ
イルスが感染性ビリオンを生産しない哺乳類宿主細胞の
培養物中で精製したプラークが修飾ウイルスになる。
【０１１２】修飾ウイルスが選択される条件の下に第二
の宿主細胞に感染させる他の態様では、修飾ウイルスの
ゲノムが、第二の宿主細胞中で感染性ビリオンを生産す
るのに必要な機能性宿主域遺伝子を含む。第二のウイル
スのゲノムは、この機能性宿主域遺伝子を欠いている。
この態様を例示すると、実施例８に示すように、修飾ウ
イルスのゲノムが修飾ワクシニア ウイルスのゲノムで
あり、修飾ワクシニアウイルスのゲノムが、第二の宿主
細胞として使用されるヒト（MRC ５）細胞中に感染性ワ
クシニア ウイルスを生産するのに必要な機能性宿主域
遺伝子を有する方法がある。
【０１１３】第二の宿主細胞において修飾ウイルスを選
択することを含む更に他の態様では、修飾ウイルスのゲ
ノムが、第二のウイルス ゲノムが欠いている選択的マ
ーカー遺伝子を含んでおり、第二の宿主細胞の感染工程
を、この選択的マーカー遺伝子を形質発現するウイルス
ゲノムを選択する条件下に実施する。例えば、第二の
宿主細胞における選択的マーカー遺伝子の形質発現は、
細胞障害薬品に対する耐性をこの細胞に与えうる。この
薬品は、第二の宿主細胞に感染させる間、選択的マーカ
ー遺伝子を形質発現するウイルス ゲノムを選択するの
に充分なレベルで与えられる。このアプローチを例示す
ると、実施例１においてはワクシニアウイルスのゲノム
中へと、実施例２においては鶏痘ウイルスのゲノム中へ
と、大腸菌（E. coli gpt)遺伝子用の遺伝子を挿入する
方法があり、いずれの場合においても、選択的マーカー
遺伝子を欠いた相同ヘルパーウイルスを使用している。
【０１１４】第二の宿主細胞中で修飾ウイルスを選択す
ることを含む更に他の態様においては、この修飾ウイル
スのゲノムが、第二のウイルスのゲノム中に存在する選
択的マーカー遺伝子の欠失を含む。ここでは、第二の宿
主細胞の感染工程を、選択的マーカー遺伝子を形質発現
するウイルス ゲノムに対して不利に選択するような条
件下に、実施する。例えば、第二の宿主細胞（即ち、チ
ミジンキナーゼ陰性の宿主細胞）におけるポックス ウ
イルス チミジンキナーゼ (tk) 遺伝子の形質発現によ
り、第二の（ヘルパー）ウイルスが、代謝阻害剤の５−
ブロモーデオキシウリジンに対して感受性になる。実施
例４で述べるところでは、第二の宿主細胞の感染の間、
これらの阻害剤を、ｔｋ遺伝子が欠失して多重クローニ
ング部位によって置換されているワクシニアウイルス
ベクター（vdTK) を選択するために使用する。
【０１１５】本発明の他の態様は、修飾ウイルスのゲノ
ムを含む真核細胞質ＤＮＡウイルスに関するものであ
る。本発明の範囲内にある細胞質ＤＮＡウイルスの修飾
ゲノムは、例えば通常の核酸ハイブリッド形成方法やＤ
ＮＡ配列決定法によって互いに識別可能な特徴的部分Ｄ
ＮＡ配列を含む。
【０１１６】特定の態様においては、例えば、修飾ウイ
ルスのゲノムが、第一の真核細胞質ＤＮＡウイルスの第
一のゲノムを含む。この第一のゲノムは、配列特異的エ
ンドヌクレアーゼのための、第一のゲノムにおいて独自
部位である切断部位を有する。この態様においては、第
一のウイルスのゲノムを含む修飾ゲノムの配列は、自然
発生した真核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノムに対して相
同である。更に、この第一のウイルスの配列は、上記し
た興味の対象であるＤＮＡ配列によって中断される。
【０１１７】修飾ウイルス ゲノムの本例で必要とされ
るように、第一のウイルスのゲノムの独自の切断部位中
にこの配列が挿入されるか否かを決定するには、この挿
入体の直近に並ぶ配列を、配列特異的エンドヌクレアー
ゼの切断部位の配列と比較する。
【０１１８】第一のウイルスのゲノム中の独自切断部位
中へとＤＮＡ配列を挿入する本態様の一形態では、第一
のウイルスのゲノム中のこの挿入された配列に、配列特
異的エンドヌクレアーゼ用の二つの同等な無傷の切断部
位が並ぶ。そしてこれらの二つの部位のみが、修飾ゲノ
ム全体においてこのヌクレアーゼに対する部位である。
これらの二つの部位は、それぞれ、第一のウイルス ゲ
ノムからの切断部位と挿入されたＤＮＡ配列との結合部
分を含む。
【０１１９】更に詳しくは、配列特異的エンドヌクレア
ーゼ用の切断部位を含む二本鎖ＤＮＡの各鎖は、モノフ
ォスフェート連鎖によって分けられる左側切断部位配列
（ＳL ) と右側切断部位配列（ＳR ) とからなる完全切
断部位配列（ＳL ＳR ）を含むものと考えることがで
き、このモノフォスフェート連鎖は、適当なヌクレアー
ゼを用いた切断によって分離される。この態様の特定形
態においては、独自の制限部位へとＤＮＡ配列を挿入す
ることにより，この挿入体の横に並ぶ二つの完全な部位
が再生産される。
【０１２０】しかし、この態様の他の形態においては、
独自の切断部位へとＤＮＡ配列を挿入しても、この挿入
されたＤＮＡ配列の各末端にもとの切断部位が再生産さ
れない。例えば、実施例６に記載した、切断部位の除去
方法を参照すること。従って、この挿入ＤＮＡは、完全
切断部位（ＳL ＳR ）によって一方の末端（例えば、左
側の末端）で横に並ぶことができ、一方、右側の末端
は、第一のウイルスのゲノム中のＳR 配列に直接に連鎖
するＳL とは異なった配列で終結する。更に一般的に
は、この発明のいかなる修飾ウイルスのゲノムにおいて
も、第一のウイルスのゲノム中の独自部位中へと挿入さ
れたＤＮＡ配列は、切断部位の二つのマッチング部分
（ＳL 及びＳR ) の横に並ぶであろうが、これは挿入Ｄ
ＮＡの外側の修飾ウイルスのゲノムにおいては起こらな
い。
【０１２１】他の態様においては、修飾ウイルスのゲノ
ムが、第一のウイルスのゲノム中の二つの独自部位の間
に挿入されるＤＮＡ配列を含む。この場合には、第一の
ウイルス ゲノムが真核細胞質ＤＮＡウイルスの自然発
生ゲノムである場合には、少なくとも、二つの異なった
原切断部位の認識可能なＳL 及びＳR 部分によって外来
性ＤＮＡ配列から分離されたウイルス配列により、挿入
体が包囲されるであろう。
【０１２２】他の態様においては、修飾ウイルスのゲノ
ムが、真核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノム中に自然発生
しないＤＮＡ配列の中に局在する独自切断部位を含む。
この場合には、この外来性ＤＮＡを、天然のウイルスＤ
ＮＡ配列から、切断部位の認識可能なＳL 及びＳR 部分
によって分離しない。この態様の特定の形態では、第一
の外来性ＤＮＡ配列を、第一の配列中の独自切断部位中
又は第一の配列中の二つの独自切断部位の間に挿入され
た第二の外来性ＤＮＡ配列によって、中断する。これら
の態様においては、この第二の外来性ＤＮＡを、第一の
外来性ＤＮＡ配列から、配列特異的エンドヌクレアーゼ
切断部位の認識可能なＳL 及びＳR 部分によって分離す
る。この場合には、この第二の外来性ＤＮＡ配列を囲む
すべての配列が、本発明による第一のウイルスのゲノム
を含む。
【０１２３】本発明の修飾真核細胞質ＤＮＡウイルスの
好適な態様には、修飾ウイルスのゲノムが、（Ｉ）配列
特異的エンドヌクレアーゼのための切断部位を有する第
一の真核細胞質ＤＮＡウイルスの第一のゲノムを含む態
様が、第一の主要な態様として含まれている。この部位
は、第一のウイルス ゲノムにおける独自部位である。
この態様の修飾ウイルスのゲノムは、更に、興味の対象
である第一のＤＮＡ配列を有する。このＤＮＡ配列は、
第一の細胞質ＤＮＡウイルスのゲノム中の独自部位中へ
と挿入される。
【０１２４】修飾真核細胞質ＤＮＡウイルスのこの第一
の態様のうちの一変形例においては、この独自部位を有
する第一のウイルス ゲノムが、自然発生ウイルスのゲ
ノムである。ここでこの変形例を例示すると、実施例１
及び３で記載したような、細菌制限エンドヌクレアーゼ
NotI 及び SmaI 用の独自切断部位を持つ自然発生ワク
シニアウイルスのゲノムを含む修飾ポックスウイルスの
ゲノムがある。この態様において、この独自部位中に挿
入される、興味の対象である第一のＤＮＡ配列の例は、
ワクシニアウイルスのゲノムの NotI 部位( 実施例１）
中に、又は SmaI 部位 (実施例３）中に挿入された自然
発生ワクシニアウイルスプロモーターによってドライブ
された大腸菌 gpt(E. coli gpt) 遺伝子である。
【０１２５】修飾ウイルスのこの第一の態様の第二の形
態においては、独自部位を含む第一のウイルスのゲノム
が、更に、ウイルスのゲノム中で自然発生したものでな
い第二のＤＮＡ配列を含む。更にこの第二のＤＮＡ配列
は、第一のＤＮＡ配列を挿入するための独自部位を有す
る。ここでこの変形例を例示すると、実施例２に記載し
たように、修飾鶏痘ウイルスのゲノムが、大腸菌（Esch
erichia Coli) β−ガラクトシダーゼ遺伝子を暗号化す
るＤＮＡ配列を含んでいる。この細菌遺伝子は、修飾鶏
痘ウイルス ゲノム中で独自である細菌制限エンドヌク
レアーゼ NotI用の切断部位を含んでおり、従って、外
来性ＤＮＡ配列の挿入には特に好都合である。
【０１２６】修飾ウイルスのこの第一の態様の他の変形
例においては、独自部位中へと挿入される第一のＤＮＡ
配列の少なくとも一部が、プロモーターの転写調節の下
にある。幾つかの場合には、このプロモーターが、第一
のウイルスのゲノム中に挿入されに第一のＤＮＡ配列内
に局在する。これは、例えば、特に実施例１及び２に記
載したように、挿入ＤＮＡが、プロモーターと機能連鎖
遺伝子とを含む遺伝子カセットを有している場合にあて
はまる。
【０１２７】この発明の修飾細胞質ＤＮＡウイルスの第
二の態様においては、修飾ウイルスのゲノムが、（Ｉ）
配列特異的エンドヌクレアーゼ用の第一及び第二の切断
部位を有する第一のウイルス ゲノムを含み、ここでこ
れらの部位の各々が、第一のウイルスのゲノム中で独自
である。この態様の好適な一変形例においては、第一の
ウイルスのゲノムが、幾つかの独自切断部位を含む多重
クローニング部位を有する。
【０１２８】この第二の態様においては、修飾ウイルス
のゲノムが、更に、（II) 真核細胞質ＤＮＡウイルスの
ゲノム中で自然発生したものではない第一のＤＮＡ配列
を含んでおり、この第一のＤＮＡ配列が、第一及び第二
の独自切断部位の間にある第一のウイルスのゲノム中へ
と挿入される。
【０１２９】この発明の修飾細胞質ＤＮＡウイルスの第
三の態様においては、修飾ウイルスのゲノムが、（Ｉ）
真核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノム中で自然発生したも
のではない第一のＤＮＡ配列を有する第一のウイルスの
ゲノムを含む。この第一のＤＮＡ配列は、修飾ウイルス
のゲノム中の独自部位である、配列特異的エンドヌクレ
アーゼ用の切断部位を含む。この態様の修飾ウイルス
ゲノムは更に、(II)独自部位中へと挿入されたＤＮＡ配
列がプロモーターの転写調節下にあるように局在するプ
ロモーターを有している。この第一のＤＮＡ配列は、プ
ロモーターと、ＤＮＡ配列の挿入用の独自部位との間
に、翻訳読み始めコドンを有していない。この態様を例
示すると、実施例６に記載したワクシニアウイルスベク
ター（vS4)があり、これは「合成」ポックスウイルスプ
ロモーターを有し、このプロモーターが、読み取り枠の
挿入用に設計された多重クローニング部位中へと挿入さ
れたＤＮＡ配列の転写を調節するように、プロモーター
が局在する。
【０１３０】ＤＮＡ分子に関する本発明の他の態様に
は、この発明の修飾真核細胞質ＤＮＡウイルスの修飾ウ
イルス ゲノムが含まれる。好適な態様においては、こ
のＤＮＡ分子を、本発明の修飾真核細胞質ＤＮＡウイル
スのビリオンから、あるいは本発明の修飾ウイルスが感
染した細胞からゲノムＤＮＡ分子を抽出することによっ
て、調製する。修飾ウイルスのゲノムＤＮＡをビリオン
から抽出するのに適した方法は、本技術分野において知
られている。更に、真核細胞質ＤＮＡウイルスのＤＮＡ
を調製するのに適した方法は、実施例１において明細書
中に記載している。
【０１３１】本発明の更に他の態様は、本発明の真核細
胞質ＤＮＡウイルスのゲノムＤＮＡアームに関するもの
である。これらのゲノムＤＮＡアームは、外来性ＤＮＡ
を有するウイルス ゲノムの直接分子クローニングに有
用である。更に詳しくは、本発明のこの態様は、二つの
ＤＮＡ分子、即ち真核細胞質ＤＮＡウイルスの修飾ウイ
ルス ゲノムの左側及び右側ゲノムアームに関するもの
である。本発明の直接分子クローニング法を実施するの
に際しては、上記したように、これらのアームのうちの
一方又は双方が、細胞質ＤＮＡウイルス中で自然発生す
るＤＮＡ配列からのみなっていてよい。しかし、本発明
の本態様の新規なＤＮＡ分子は、ウイルス ゲノムの修
飾アームであり、言い換えると、真核細胞質ＤＮＡウイ
ルスの修飾ウイルス ゲノムの一方の末端を含むＤＮＡ
分子である。この修飾ウイルスゲノムのこの末端は、細
胞質ＤＮＡウイルス中で自然発生する配列のみからなる
ゲノムアームからこのＤＮＡ分子を区別する、興味の対
象であるＤＮＡ配列を有している。更には、この新規な
アームが由来するところのこの修飾ウイルス ゲノム
は、配列特異的エンドヌクレアーゼ用の独自切断部位を
含んでいる。更に、このＤＮＡ分子の有する末端は、配
列特異的エンドヌクレアーゼによって修飾ウイルス ゲ
ノム中の独自部位を切断する製品に相同である。
【０１３２】好適な態様においては、このＤＮＡ分子
は、配列特異的エンドヌクレアーゼ用の独自部位で修飾
ウイルスのゲノムＤＮＡを切断することによって生産さ
れたゲノムアームを含む。または、このＤＮＡ分子は、
修飾ウイルス ゲノム中の独自部位を切断することで生
産される末端と相同な末端を生ずるように、他のＤＮＡ
分子を修飾することによって、生産することができる。
例えば、本発明のこの態様に基づくＤＮＡ分子は、自然
発生したゲノムウイルスＤＮＡのアームから生産するこ
とができる。この必要なＤＮＡ分子は、こうした自然発
生ウイルスアームから、例えば、第一のウイルス ゲノ
ム中に存在しない切断部位に由来する付着端を含む合成
「アダプター」ＤＮＡセグメントに連結させることによ
って、製造できる。この場合には、第一のウイルス ゲ
ノムの末端と連結アダプターとは、共に、修飾ウイルス
ゲノムの一方の末端を含む。従って、この特定のＤＮ
Ａ分子は、修飾ウイルス ゲノムＤＮＡの切断によって
生産されたものではないが、修飾ウイルス ゲノム中の
独自部位の切断によって生産される末端に対して相同な
末端を含んでいる。
【０１３３】本発明の修飾ウイルスＤＮＡアームの他の
態様においては、真核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノム中
で自然発生しないＤＮＡ配列が、修飾ウイルス ゲノム
中で独自である、配列特異的エンドヌクレアーゼ用の切
断部位を含む。この切断部位は、更に、左側ゲノムアー
ム用の左側切断部位配列（ＳL ) 、又は右側ゲノムＤＮ
Ａアーム用の右側切断部位配列（ＳR ) を含み、完全切
断部位配列（ＳL ＳR) が修飾ウイルス ゲノム中で独
自になる。この態様を例示すると、特に、実施例２に記
載したような、細菌制限エンドヌクレアーゼ NotI によ
って鶏痘ウイルスベクターから生産されたＤＮＡアーム
があり、あるいは、実施例６に記載したような、挿入多
重クローニング部位の幾つかの独自部位のいずれかで切
断されたワクシニアウイルスベクター（vS4)のアームが
ある。
【０１３４】本発明の更に他の態様は、真核細胞質ＤＮ
Ａウイルスの修飾ウイルス ゲノムの直接分子クローニ
ング用キットに関するものである。このキットは、(I)
本発明の精製ＤＮＡ分子を含む。これらのＤＮＡ分子
は、本発明のゲノムウイルスＤＮＡアームと本発明の完
全な生存修飾ウイルス ゲノムとのいずれか一方を含む
か、又は双方を含む。これらのウイルスＤＮＡアーム
は、クローニングすべき外来性ＤＮＡセグメントへの直
接連結反応に有用であり、一方、生存ウイルスＤＮＡ
は、例えば、修飾ウイルス ゲノム中で独自な部位での
配列特異的エンドヌクレアーゼによる切断の後のクロー
ニングに有用である。
【０１３５】このキットは、更に、(II)ＤＮＡリガーゼ
及び (III)緩衝溶液と、ＤＮＡセグメントを一緒に連結
させて、前記修飾ウイルス ゲノムを含む修飾ＤＮＡ分
子を生産するのに好適な他の試薬とを含む。連結反応に
適した緩衝溶液及び試薬は、例えば、実施例１に記載し
ている。
【０１３６】一つの態様においては、このキットは、更
に、配列特異的エンドヌクレアーゼによって切断部位に
隣接された遺伝子形質発現カセットを含むプラスミドを
備える。適当な配列特異的エンドヌクレアーゼによって
切断されると、カセットに隣接するこれらの部位が、Ｄ
ＮＡ分子によって暗号化された修飾ウイルス ゲノムの
独自切断部位中へとこのカセットを挿入するのに和合的
な末端を生産する。
【０１３７】他の態様においては、このクローニングキ
ットが、更に、第一の宿主細胞と、修飾ウイルス ゲノ
ムを感染性ビリオン中へとパッケージングするのに好適
な第二の（ヘルパー）ウイルスとを含む。
【０１３８】本発明の更に他の態様は、本発明の修飾細
胞質ＤＮＡウイルスベクターの構成中で中間体として働
くのに特に適したプラスミドに関するものである。この
態様の一態様において提供するプラスミドは、各末端に
配列特異的エンドヌクレアーゼ用の同一の切断部位を備
えたＤＮＡセグメントを含む。この部位は、また、本発
明に基づく第一の細胞質ＤＮＡウイルス ゲノム中の独
自部位である。このＤＮＡセグメントは、プラスミド中
で独自な幾つかの近接した配列特異的エンドヌクレアー
ゼ切断部位を含む多重クローニング部位を有しており、
従って、外来性ＤＮＡセグメントをプラスミド中へと挿
入するのに有用である。
【０１３９】このプラスミドは、本発明の直接分子クロ
ーニング法を用いて、ＤＮＡセグメントの独自切断部位
中へと遺伝子を挿入し、続いてこのセグメントを細胞質
ＤＮＡウイルス独自切断部位中へと転移させるのに有用
である。このプラスミドを例示すると、プラスミド pN2
があり（実施例１，図３参照）、プラスミド pN2が有す
るＤＮＡセグメントは、NotI部位に隣接した多重クロー
ニング部位を有し、ここに記載する順序で更に下記の細
菌制限酵素部位を有する；XbaI, SpeI, BamHI,SmaI, Ps
tI, EcoRI, EcoRV, HindIII , 及び C1aI 。
【０１４０】本発明の他のプラスミドは、細胞質ＤＮＡ
ウイルス中の独自部位である切断部位を各末端に有する
ＤＮＡセグメントを含む。このプラスミドのＤＮＡセグ
メントは、また、このプラスミド中で独自な幾つかの制
限酵素切断部位を含む。更に、このＤＮＡセグメント
は、細胞質ＤＮＡウイルスプロモーター（例えば、ワク
シニアウイルスＰ7.5 プロモーター) の転写調節下にあ
る選択的マーカー遺伝子（例えば、大腸菌 gpt (E.coli
gpt) 遺伝子を含む。このプラスミドを例示すると、No
tI部位に隣接しかつワクシニアウイルスＰ7.5 プロモー
ターの転写調節下にある大腸菌 gpt (E. coli gpt)遺伝
子を有するＤＮＡセグメントを含んだ、pN2 −gpta及び
pN2 −gptbと称する二種類のプラスミドがある。このプ
ラスミドを作製するには、図３に示すように、プロモー
ター遺伝子カセットをプラスミド pN2の SmaI 部位中へ
と挿入する。
【０１４１】上記プラスミドの更に他の変形例において
ては、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有するＤＮＡ
配列へと有効に連鎖する第二のポックスウイルスプロモ
ーターが、ＤＮＡセグメントに更に含まれている。この
プラスミドは、プラスミドpN2 gpt −S3A （図25) に例
示したように、ワクシニアウイルスベクター中への転移
用の自身の読み始めコドンを欠いた読み取り枠を挿入す
るのに、使用することができる。同様に、このプラスミ
ド pN2 gpt−S4 (図25) を、ＡＵＧ翻訳読み始めコドン
を含む全読み取り枠を挿入するのに、使用することがで
きる。
【０１４２】他の態様においては、このプラスミドは更
に、ヒトプラスミノーゲンを暗号化するＤＮＡ配列を含
んでおり、ここでこのＤＮＡ配列は、ポックスウイルス
プロモーター及び読み始めコドンに有効に連鎖してい
る。このプラスミドを例示すると、ヒト glu−プラスミ
ノーゲンを暗号化するプラスミド pN2 gpt−GPg があ
り、また１ys−プラスミノーゲンを暗号化するプラスミ
ド pN2 gpt−LPg があり、ここでヒトプラスミノーゲン
のアミノ酸１−77のコード領域は欠失している（図27及
び図28) 。
【０１４３】関連形態においては、このプラスミドが更
に、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) gp160 を暗号化するＤ
ＮＡ配列を有しており、ここでこのＤＮＡ配列は、ポッ
クスウイルスプロモーター及び読み始めコドンへと有効
に連鎖している。これを例示すると、合成ワクシニアウ
イルスプロモーターＳ４によって調節された gp160遺伝
子を有するプラスミド pN2 gpt−gp160 がある。（図2
9) 。
【０１４４】本発明の他のプラスミドには、ウイルス
チミジンキナーゼ（tk) 遺伝子の局在化した細胞質ＤＮ
Ａウイルス ゲノムのセグメントが含まれる。このプラ
スミドにおいては、ｔｋ遺伝子のコーディング領域が、
活性ｔｋ酵素の形質発現を生じないように修飾 (欠失)
されていた。このプラスミドは、プラスミド pHindJ−
３を用いて、ワクシニアウイルスｔｋ遺伝子用に記載し
たように、従来の標識釈放法を用いて、欠失ｔｋ遺伝子
を有する細胞質ＤＮＡウイルスベクターを構成する際の
中間体として、有用である。関連する態様では、細胞質
ＤＮＡウイルスの修飾ｔｋ遺伝子領域を有するプラスミ
ドが、更に、このプラスミド中で独自である幾つかの近
くに隣接した配列特異的エンドヌクレアーゼ切断部位か
らなる多重クローニング部位を有する。更に、これらの
部位の各々が、修飾ｔｋ遺伝子領域の挿入されるべき細
胞質ＤＮＡウイルス中には存在しない。従って、これら
の独自部位を有する修飾ｔｋ遺伝子領域をこのウイルス
ゲノム中へと挿入した後に、本発明の直接クローニン
グ法に従って、この修飾ｔｋ遺伝子領域を荷う細胞質Ｄ
ＮＡウイルス ゲノム中へと外来性ＤＮＡセグメントを
挿入するために、これらの部位が有用である。
【０１４５】多重クローニング部位を有する修飾ｔｋ遺
伝子領域を含むこのプラスミドを例示すると、プラスミ
ド pHindJ −２の修飾ワクシニアウイルスｔｋ遺伝子領
域が、SfiI部位に隣接した、独自部位 NotI, SmaI, Apa
I 及び RsrIIを有する多重クローニング部位を挿入した
プラスミド pHindJ −３がある（図20) 。ワクシニアウ
イルスベクター中の強制クローニングを一層容易にする
ため、実施例４において詳説するように、SfiI認識配列
の可変性を利用することによって、二つのSfiI部位の各
々もベクター中で独自になる。
【０１４６】更に他の態様においては、プラスミドが、
このウイルスのゲノム中で独自である配列特異的エンド
ヌクレアーゼ切断部位を有している。このプラスミド
は、上記の独自部位を有するベクター中への転移のため
に遺伝子形質発現カセットを構成するのに特に好適であ
る。プラスミド pAOは、 vdTK ワクシニアウイルスベク
ターのマスタークローニング部位の独自部位を含むマス
タークローニング部位を有する塩基性プラスミドを例示
するものである (図21) 。この関連プラスミドpA1 及び
pA2は、ＤＮＡセグメント、例えば、合成又は天然プロ
モーターフラグメントの挿入のために設計されており、
pAO を切断しないしばしば切断性の酵素の第二の多重ク
ローニング部位を含むリンカーを、pAO の XhoI 部位中
へと挿入することによって構成した。双方のプラスミド
は、第二の多重クローニング部位の配向を除いて、同一
の構造を有している（図21) 。
【０１４７】更に他の態様では、プラスミドが、翻訳読
み始めコドンに有効に連鎖したポックスウイルスプロモ
ーターを含んでおり、ここでこの読み始めコドンが、第
二の制限エンドヌクレアーゼ切断部位中に挿入された読
み取り枠の翻訳を可能とするのに好適に配置された第二
の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に直接に続いてい
る。このプラスミドを例示すると、翻訳読み始めコドン
を含む、強い合成ポックスウイルスプロモーター S1 を
もたらすプラスミド pAI-S1 及び pA2-S1 があり、会合
した読み始めコドンを有しない読み取り枠の挿入に適し
た単独の EcoRI部位が続いている (図22) 。プラスミド
pA1-S2 及び pA2-S2 は pA1-S1 及び pA2-S1 に似てい
るが、しかし異なったポックスウイルスプロモーターで
ある S2 を有する (図23) 。
【０１４８】関連する態様では、上記のプラスミドは更
に、ヒトプロトロンビンを暗号化するＤＮＡ配列を含ん
でおり、ここで前記のＤＮＡ配列は、前記ポックスウイ
ルスプロモーター及び前記読み始めコドンへと有効に連
鎖している。このプラスミドを例示すると、修飾プロト
ロンビン cDNA がプラスミド pA1-S1 の単独 EcoRI部位
中に挿入されているプラスミド pA1S1-PT （図26) があ
る。
【０１４９】本発明の他のプラスミドは、K1L 宿主域遺
伝子の欠失したワクシニアウイルスＤＮＡの修飾 EcoRI
Kフラグメントを含む。K1L 及び C7L宿主域遺伝子の双
方を欠いたヘルパーウイルス vdhr は、この K1L宿主域
遺伝子の欠失した修飾 EcoRIKフラグメントによる標識
釈放によって、C7L −ネガティブ鎖 WR −612 から構成
される。図35参照。この修飾 EcoRI Kフラグメントが含
む選択的マーカー遺伝子 (大腸菌 gpt (E. coli gpt )
遺伝子）が、サム及びダンベル (Sam and Dumbe 11) に
よって 1981 年に記載されたように、細胞内標識釈放を
用いた修飾 EcoRI Kフラグメントが含む組み換え体 WR
−612 ゲノムの選択を容易にする。pEcoK −dhr と称す
るものは、このプラスミドの例示である (図35) 。
【０１５０】他の工程においては、pEcok −dhr が、No
tIによって直鎖状化され、NotI消化によってプラスミド
pN2−gpta (実施例４）に由来する 1.1kbのＰ7.5 −gp
t 遺伝子カセットと連結される。こうして得られたプラ
スミド pdhr −gpt （図35)を標識釈放実験において使
用し、サム及びダンベル (Sam and Dumbell)の 1981年
の標識釈放法に従ってヘルパーウイルス vdhr を発生さ
せる。
【０１５１】次いで、次に例示する実施例を参照しなが
ら、本発明を更に説明する。続く実施例においては、特
定の構成について、これらの特性を詳細に示す表を示し
た。これらの表においては，次の略号を用いる。
【０１５２】「ＣＤＳ」は暗号配列を示す。「ｒｃ」
は、逆相補的配列を示す。「rcCDS 」は、逆相補的暗号
配列を示す。アラビア数字はヌクレオチドの位置であ
る。「ＡＴＧ」は、翻訳読み始めコドンを示す。「ＥＭ
ＢＬ」ＩＤは、ＥＭＢＬ データバンク (DATABANK) に
おけるアイデンテファイアー (Identifier) を示す。
【０１５３】
【実施例】
実施例１ 選択的マーカー遺伝子（大腸菌gpt 遺伝子) を有する外
来性ＤＮＡオルトポックスウイルス（ワクシニア）のゲ
ノム中の独自（NotI) 切断部位中へと直接分子クローニ
ングする。
【０１５４】本実施例は、遺伝子処理されたポックスウ
イルスＤＮＡの細胞内パッケージングによって、本発明
に従って、遺伝子形質発現カセットをポックスウイルス
ゲノム中へと直接分子クローニングする例を示す。更に
は、本実施例は、挿入された選択的マーカー遺伝子を含
む修飾ワクシニアウイルスを効率的に回収する遺伝子選
択手順の使用法を示す。また、この実験結果の示すとこ
ろでは、ヘルパーウイルスＤＮＡが、パッケージングす
べきＤＮＡと相同である場合には、パッケージングの間
に、パッケージングすべきＤＮＡと感染性ヘルパーウイ
ルスのＤＮＡとの間でしばしば組み換えが起る。
【０１５５】更に特定的には、下記の第一の直接分子ク
ローニング実験の示すところでは、マーカー遺伝子（gp
t −遺伝子）カセットを、NotIの切断されたワクシニア
ウイルスＤＮＡ中の NotI 制限フラグメントとして挿入
することができ、次いでワクシニアウイルスに感染した
哺乳類細胞中でパッケージングすることができる。試験
した９つのプラークのうちの１つは、「ａ」配向におい
て gpt−遺伝子を一本挿入した予想の構造を有するウイ
ルスを含む（図11参照) 。このクローン (vp7と表示す
る) の構造は、選択剤のない大規模複製の間、安定であ
った。
【０１５６】クローニング実験の第二系列においては、
試験した12のクローンのうちの７個が、予想された構造
を有していた。しかし、この系列においては、緩徐にウ
イルスを複製する小さなプラーク（E1〜E4) が４つ含ま
れていたが、好ましくは、本発明の実施に際しては、こ
れらは通常は選択しない。選択的マーカー遺伝子の多重
挿入体を有する組み換え体もまた、選択的条件下では得
られた。これらの多重挿入物の安定性は、特定の非安定
構造体を安定化させることが知られている選択剤の非存
在下には、試験しなかった。フォークナー及びモス（Fa
lkner and Moss」の「ウイルス学誌：J. Virol. 」64 :
3108 〜3111 (1990) 参照。
【０１５７】部位特異的切断及びＤＮＡ分子の連結のた
めの遺伝子工学的方法の持つ既知の精度を与えたとき、
予想の構造体の収率が比較的低いことは予期しなかっ
た。しかし、このモデル系用、gpt −遺伝子カセット中
の挿入用に選択した特定の配列は、Ｐ7.5 プロモーター
のワクシニアウイルスＤＮＡ配列を含み、このＰ7.5 プ
ロモーターは、ワクシニア ゲノムの逆行末端反復内に
局在化した二つのワクシニアウイルス7.5 −KDポリペプ
チド遺伝子をドライブするワクシニアベクター中の二つ
の内因性プロモーターに対して相同である。ヴェンカテ
サン（Venkatesan) B., バロウディ (Baroudy)B. M. ,
及びモス (Moss) , Ｂ．の「細胞：Cell」25：805 〜81
3 (1981)参照。このＰ7.5 プロモーターは、従来の細胞
内組み換えによってワクシニアウイルス組み換え体を構
成するのに使用されてきており、ワクシニアチミジンキ
ナーゼ遺伝子中へと安定に組み込むことができる。マケ
ット及びスミス (Mackett and Smith) (1986) 参照。し
かし、時には、従来の組み換え体を分析する間にサブモ
ル量のＤＮＡフラグメントが現われており、これは二次
的組み換えの発生によるのかもしれない。
【０１５８】Ｐ7.5 プロモーターを内因性Ｐ7.5 プロモ
ーターの近くに (即ち、数キロ塩基内で) 挿入すると
き、逆行反復構造を有する組み換え体のみが安定であ
り、この観察を利用して、タンデムリピートされたＰ7.
5 プロモーターセグメントの挿入に基いた欠失方法を展
開させてきた。スペーナー (Spehner), D. , ドリリア
ン(DRILLIEN), R. 及びレコック (Lecocq), J. −P.
「ウイルス学誌：J. Virol.」64 : 527〜533 (1990)参
照。
【０１５９】ワクシニアウイルスの NotI 部位中へと g
pt遺伝子カセットを挿入する本実施例では、左側逆行末
端反復のＰ7.5 プロモーターと挿入カセットのＰ7.5 プ
ロモーターとの間の間隔が約 30kb であり、おそらく、
不安定化を生じさせる二次的組み換えの発生を引き起こ
すのに充分なほどに近い。実際には、僅かの緩徐に複製
する不安定なクローンを有する構造体のみが、挿入され
た内因性プロモーターのタンデムリピート配置を作り出
しうる「ｂ」配向で挿入体を有する。従って、この構造
体がまれにしか生じないことを最も確からしく説明しう
るのは、gpt −遺伝子カセットのＰ7.5 プロモーターと
内因性Ｐ7.5 プロモーターとの位置が近いことと、Ｐ7.
5 プロモーターのタンデムリピートコピーの持つ既知の
不安定性である。
【０１６０】対照的にウイルス vp ７及び幾つかの他の
分離株（Ａ１，Ａ４，Ｃ１及びＣ２) は「ａ」配向の挿
入体を有しており、安定である。一つの分離株であるＣ
４の構造分析は、先端一末端二本挿入体と一致する。
【０１６１】第二系列のクローニング実験（５個の異な
った試料）におけるパッケージングされた gpt−遺伝子
陽性ウイルスの力価は、８×106 個の細胞当り約１×10
5pfu であり、一方第一の実験においては、これと同じ
数の細胞から１〜２×102pfu の力価が得られた。修飾
ウイルスの力価は、連結及びパッケージング効率、クロ
ーニング手順における反応及び培養条件を含む幾つかの
因子によって影響されるし、また取扱いの間の高分子ベ
クターＤＮＡの剪断を避けるために取られた注意量によ
って影響される。下記の標準的条件下では、８×106 個
の細胞当り約105pfuの力価が、一般に予想される。
【０１６２】本実施例の示すところでは、ワクシニアウ
イルスの独自な遺伝子間 NotI 部位を外来ＤＮＡの挿入
のために使用できるけれども、本実施例がまた示すとこ
ろでは、提案された挿入体が、修飾ウイルスの不安定化
を引き起こすことが既知であるか、又は引き起すらしい
型及び配向のウイルス配列を含みうるかどうかを、考慮
する必要がある。挿入部位の近く（例えば、30Kb以内）
でウイルス配列との相同性を欠いた挿入体は、安定性の
点からは好ましい。従って、ベクターの転写系によって
認識される短い合成プロモーター配列のみを有する挿入
体が、ウイルスベクターの天然プロモーターを含むウイ
ルスＤＮＡの大きなセグメントを含む挿入体よりも好ま
しい。例えば、下記の実施例４における S1 プロモータ
ーを参照。
【０１６３】以下の材料及び方法を、特に断わらない限
りは、本実施例及び続くすべての実施例を通して用い
た。
【０１６４】 オルトポックスウイルス及びＤＮＡの精製。 ワクシニアウイルス（野性型ウエスタンリザーブ（Ｗ
Ｒ）株；アメリカン タイプ カルチャー コレクショ
ン No. VR 119 を、D. M. グローヴァー(GLOVER)の「Ｄ
ＮＡクローニング；実験的アプローチ (DNA CLONING :
A PRACTICAL APPROACH) 」中のマケット等 (Mackett, e
t al) 191 〜211 (IRL プレス, 1985年)に従って、二
つの連続的ショ糖勾配によって精製した。ウイルスＤＮ
Ａは、グロス−ベラール等（Gross-Bellard et al)，
「Eur. J. Biochem.」36：32〜38 (1973) に従ったプロ
ティナーゼＫ−SDS 法によって、調製した。
【０１６５】 分離されたポックスウイルスＤＮＡの処理。 ウイルスＤＮＡ（典型的には２〜５μｇ）を、通常の組
み換え体ＤＮＡ法に従って、適当量の一種以上の配列特
異的エンドヌクレアーゼ（例えば、細菌制限エンドヌク
レアーゼ NotI ）によって切断し、必要に応じて仔ウシ
腸アルカリ性ホスファターゼ (ボリンゲルインコーポレ
ーテッド : Boehringer, Inc.)で処理し、フェノール抽
出及びエタノール沈澱によって精製した。こうして得ら
れたウイルスＤＮＡアームを、このウイルスアームとの
連結に対して和合的な末端を有する、５〜50倍モル過剰
の挿入すべきＤＮＡフラグメントと連結した。この連結
反応の約数を、電場反転ゲル電気泳動によって分析し
た。
【０１６６】更に特定的には、下記の実験（Ａ〜Ｅ）の
第二系列においては、表１に要約したように、ホスファ
ターゼで処理していない２μｇの NotI −消化ワクシニ
アＤＮＡを、200 〜600ng の gpt−遺伝子カセット挿入
物と、30μｌの容量で、５〜15単位のＴ４リガーゼを用
いて、48時間12℃で、連結反応させた。
【０１６７】 哺乳類細胞内におけるインビボパッケージング。 ８×106 個のアフリカミドリザル (CV-1) 細胞に、ヘル
パーウイルス (ワクシニアＷＲ野性型又はＷＲ612 ウイ
ルス、又は指示したような他のウイルス) を0.2pfu／細
胞で２時間感染させた。ビリオンから分離した生ＤＮＡ
によるパッケージングを最初に示すために、20μg のウ
イルス (vPgD) ＤＮＡを使用した。細胞外処理したゲノ
ムをパッケージングするために、連結反応から精製した
１μgのＤＮＡを使用した。リン酸カルシウム沈降技術
（グラハム (Graham), F. L.及びヴァン デル Eb, 197
3 年）によって、ＤＮＡを細胞内へとトランスフェクシ
ョンした。これらの細胞を、15分間室温で培養し、次い
で、１mlの沈降物当り９mlの培地 (DMEM, 10％胎児仔ウ
シ血清、グルタミン及び抗生物質を、細胞へと加えた。
４時間後、培地を変更し、更に二日間培養した。
【０１６８】粗ウイルスストックを、標準的方法に従っ
て調製した。マケット等（Mackettet al) 1985 年参
照。プラークアッセイ及び大腸菌 gpt−遺伝子に対する
選択条件は、本技術分野において既知である。フォーク
ナー及びモス，「ウイルス学誌：J. Viro1. 」62 : 184
9 〜1854 (1988) ; ボイル及びクーパー (Boyle and Co
upar) , 「遺伝子；Gene」65 : 123〜128 (1988)参照。
【０１６９】電場反転ゲル電気泳動 (FIGE) 。 １％アガロースゲル上で、トリス／アセテート／ＥＤＴ
Ａ緩衝液（40mMのトリス／20mMの氷酢酸／２mMの EDTA
, pH8.0)中で、マイクロコンピューター制御電源「Con
sort モデル E790 」を用いて、ウイルスＤＮＡを分離
した。フラグメントの全域を分離するために、次のよう
に、四つのプログラムを連続的に実行した。プログラム
１：７Ｖ／cmで５時間、順パルス(F) ６秒、逆パルス
(R) ３秒、ポーズ１秒。プログラム２：７Ｖ／cmで５時
間、順パルス４秒、逆パルス２秒、ポーズ１秒。プログ
ラム３：７Ｖ／cmで５時間、順パルス２秒、逆パルス１
秒、ポーズ１秒。プログラム４：７Ｖ／cmで５〜10時
間、順パルス８秒、逆パルス４秒、ポーズ１秒。
【０１７０】プラスミド pN2の構成。プラスミドブルー
スクリプトII SK （ストラテジーンインコーポレーテッ
ド : Stratagene, Inc.)を HindII で消化し、NotIリン
カー (ファルマシア インコーポレーテッド : Pharmac
ia, Inc.) に連結させた。こうして得られたプラスミド
pN2は、NotI部位に隣接する多重クローニング部位を有
している。
【０１７１】更に特定的には、このpN2 の多重クローニ
ング部位は、次の順序で並んだ次の部位からなる。Not
I, XbaI, SpeI, BamHI, SmaI, PstI, EcoRI, EcoRV, Hi
ndIII,C1aI 及び NotI 。pN2 の挿入 NotI リンカー配
列と、ｐブルースクリプトII SK-( ストラテジーン イ
ンコーポレーテッド，ラジョラ（La JoIIa),米国) の
５′及び３′隣接領域の20個の塩基は、SEQ. ID. No.1
に示されている。この挿入配列は、位置21で始まり、位
置28で終わる。（５′−末端での最初の「Ｔ」残基は、
プラスミド pN2の位置番号2266に対応し、３′−末端で
の最後の「Ｇ」残基は、プラスミド pN2の位置番号2313
に対応する。
【０１７２】 プラスミド pN2-gpta 及び pN2−gptbの構成。 1.1 Kbの HpaI −DraIフラグメント (Ｐ7.5 プロモータ
ー gpt−遺伝子カセットを含む) を、プラスミド pTK g
pt−F1s ( フォークナー及びモス, 1988年) から分離
し、プラスミド pN2の SmaI 部位中へと挿入した (図
３）。こうして得られた二つのプラスミドは配向性異性
体であり、 pN2−gpta及び pN2−gptbと表示した。ワク
シニアウイルスＰ7.5 プロモーター大腸菌 (E.co1i) g
pt−遺伝子カセット及び pN2の５′−及び３′−隣接領
域の20個の塩基は、SEQ. ID. No.2 のpN2−gptaに示さ
れている。この挿入体は、位置21で始まり、位置1113で
終わる。 gpt−遺伝子の翻訳読み始めコドンのＡ−残基
は、位置519 に対応する。gpt−遺伝子の翻訳停止コド
ンのＴ−残基は、位置番号975 に対応する。（５′−末
端での最初の「Ｃ」残基は、プラスミド pN2−gptaの位
置番号2227に対応し、３′−末端での最後の「Ｔ」残基
は、位置番号3359に対応する。
【０１７３】ワクシニアウイルスＰ7.5 プロモーター -
大腸菌 (E.co1i) gpt−遺伝子カセットの逆相補的形態
及び pN2の５′及び３′−隣接領域の20個の塩基は、SE
Q. ID. No.3 の pN2−gptbに示されている。この挿入体
は、位置21で始まり、位置1113で終わる。翻訳読み始め
コドンＣＡＴの（逆補体の）Ｔ−残基は、位置615 に対
応する。gpt 遺伝子の翻訳停止コドンの (逆補体の）Ａ
−残基は、位置番号159 に対応する。
【０１７４】組み換え体ＤＮＡ分析の他の標準的技術
（例えば、サザブブロット、PAGE、ニックトランスレー
ション) を、J. サンブルック等 (J. SAMBROOK et al)
「分子クローニング : MOLECULAR CLONING」( コールド
スプリングハーバー ラボラトリープレス 1987 年）
に記載されているように、実施した。
【０１７５】裸のウイルスＤＮＡのパッケージング。 ヘルパーウイルスによって裸のポックスウイルスＤＮＡ
をパッケージングするのに必要な条件を確立するため、
例示の組み換え体ワクシニアウルス（vPgD) のビリオン
から分離した生ＤＮＡを、ヘルパーウイルス（ワクシニ
アＷＲ野性型）の感染したサル（CV−１）細胞中へとト
ランスフェクションさせた。この選択された組み換え体
ウイルスは、幾つかの容易にアッセイ可能な表現型マー
カーを有する。従って、この vPgD ゲノムが、ウイルス
チミジンキナーゼ(tk)遺伝子座内へと、薬剤耐性マーカ
ー用の遺伝子 (大腸菌の酵素キサンチン−グアニン−ホ
スホリボシルー変換酵素用の遺伝子、即ち、「gpt 」遺
伝子) 及び容易に検出されるマーカータンパク質( ヒト
プラスミノーゲン用の遺伝子) を移入させた。このウイ
ルスは、ワクシニアウイルス株から元来は構成された
「ＷＲ612 ; モス等(Moss et al) , ウイルス学誌 (J.
ViroI.) 40 : 387 −95 (1960) 。これは約９Kbの欠失
を有しており、従って、コトウオル等 (Kotwal et al)
によって、ネイチャー誌 (Nature) 335 : 176 −178 (1
988)に記載された、ウイルスの主要分泌35Ｋタンパク質
遺伝子を、形質発現しない。従ってこの予想された表現
型のパッケージングされたウイルスは、tk−陰性（即
ち、ブロモデオキシウリジンの存在下における複製）を
含み、gpt −陽性（即ち、マイコフェノール酸及びキサ
ンチンの存在下における複製）を含み、ヒトプラスミノ
ーゲン遺伝子を形質発現し、分泌35Ｋタンパク質を形質
発現しない。
【０１７６】上記パッケージング実験からの８個の gpt
−陽性プラークを分析した。すべてがｔｋ−陰性であっ
て、図１に示すように、すべてがプラスミノーゲン形質
発現した。これらの分離株のうち６つ（レーン５，６，
７，11, 12及び14) が、35Ｋ分泌ワクシニアタンパク質
を形質発現せず、従って、トランスフェクションされた
ゲノムＤＮＡのすべての性質を示した。また、これらの
プラークのうちの２つが、35Ｋタンパク質マーカーを形
質発現し (レーン４及び13) 、従って、ヘルパー野性型
ウイルス (レーン８及び15) と中に入れたウイルス ゲ
ノムとの間の組み換え体であった。
【０１７７】この実験により判明したところでは、ピリ
オンから抽出された裸のポックスウイルスＤＮＡは、こ
れらの試験条件下にヘルパーウイルス感染細胞内へとト
ランスフェクションしたときに、パッケージングされ
る。従って、図２に示したように、直接分子クローニン
グによって修飾されたゲノムポックスウイルスＤＮＡの
トランスフェクションに対して、これらの条件を採用す
る。
【０１７８】細胞外処理されたポックスウイルスＤＮＡ
のパッケージング。 ワクシニアウイルスのゲノムは、HindIII F フラグメン
トのような既知の領域内に、NotI配列特異的エンドヌク
レアーゼ用の独自切断部位を含む。この部位の周囲の配
列の検査が明らかにしたところでは (ゴーベル等 : Goe
bel et al,1990）、これは遺伝子間領域内に局在化して
おり、ウイルス複製に対して必須ではないらしい。マー
カー遺伝子形質発現カセットは、二つのプラスミド（pN
2-gpta及び pN2-gptb ; 図３）内に、二つの可能な配向
の各々に大腸菌 gpt遺伝子を挿入することによって、構
成した。このgpt 遺伝子は、コーコラン等 (Cochran et
al)「ウイルス学誌 : J. Vitol.」 54 : 30〜37 (198
5) に記載された 7.5 KDaタンパク質用のワクシニアウ
イルスゲノム暗号のプロモーターによって、調節された
（図２においてＰ１と標識し、図３においてＰ7.5 と標
識した) 。この全マーカー遺伝子カセットは、これらの
プラスミドの単独の 1.1Kbの NotI フラグメント上に残
存した。pN2 −gptaからの制限フラグメントは、NotI消
化されたＷＲ野性型ＤＮＡと連結され、ヘルパーウイル
ス（ＷＲ）の感染した細胞内へとトランスフェクション
された。
【０１７９】第一のクローニング実験においては、表現
型上 gpt−遺伝子のプラークのゲノム構造のサザンプロ
ット分析を行った。これらのウイルス分離株を、三回プ
ラーク精製し、gpt −選択の下に増幅した。異なったウ
イルスが感染した細胞 (CV-1) の HindIII−消化された
ＤＮＡフラグメントを、１％アガロースゲル上に、通常
の電気泳動と電場反転ゲル電気泳動とを組合せることに
よって、分離した。次いで、このゲルを、32ｐ−標識ワ
クシニアＷＲＤＮＡ及び gpt配列を含む標識プローブに
よって、ブロッティング及びハイブリッド形成した。こ
れらの結果によって確認されたところでは、表現型上マ
ーカー陽性のクローンはすべて、1.1Kbの gpt 挿入体
を含有していた。
【０１８０】図４は、９つのウイルス分離株（レーン４
〜12) ; プラーク 2.1.1. 〜7.1.1及び10.1.1〜12.1.1
の感染した細胞からの HindIII DNA フラグメントのブ
ロットを示す。gpt 配列を含有する予想された 0.8Kb H
indIIIフラグメントを、観察することができる。レーン
２及び３においては、 HindIII消化された野性型ウイル
スＤＮＡ（それぞれ100 及び50ng) を負荷しており、ウ
イルス配列に対する交差反応は見られない。
【０１８１】次の実験においては、９つの異なったプラ
ークが感染した CV-1 細胞培養物の全ＤＮＡを、NotIに
よって消化した。これらの分離されたフラグメントのサ
ザンブロットを図５に示す。予想に反して、ほとんどの
ウイルス分離株において二つのバンドが見られた。予想
された 1.1Kb挿入体と、第二の、より大きなフラグメン
トである。プラーク番号7.1.1 ( レーン８）のみが、予
想された単一の1.1Kbのバンドを示した。すべての試験
ＤＮＡにおいて、この大きい方のフラグメントのハイブ
リッド形成信号は同等の強さであるけれども、1.1Kb の
バンドの強度はＤＮＡからＤＮＡへの間で変化してお
り、1.1Kb の挿入体が、異なったゲノム中に異なったモ
ル量で存在しうることを示している。野性型ウイルスの
対照例 (レーン２）は、gpt −遺伝子プローブをハイブ
リッド形成しなかった。
【０１８２】また、これと同じブロットを、ワクシニア
ウイルスＤＮＡプローブとハイブリッド形成した。約14
5Kb 、45Kb及び 1.1Kbの三つのフラグメントが予想され
る。得られたブロットパターンにはこれらの予想のバン
ドが含まれていたが、しかしまた約５Kbで更にバンドが
見られた。プラーク 7.1.1のみが, 予期せざる５Kbのバ
ンドを有していなかった。
【０１８３】また、選択処理されたワクシニアゲノム中
のＤＮＡ挿入体の配向を、サザンブロティングによって
調べた。図２に示すように、ウイルスＤＮＡ内の挿入体
は、「ａ」または「ｂ」配向のいずれかをとることがで
き、これらは、適当な制限酵素を用いたＤＮＡの消化に
よって識別可能である。予備分析に続いて、クローンvp
７と称される分離株7.1.1 は、予想された修飾ウイルス
のゲノム構造を有しているように見え、従って、膨脹
(expanded) 及び精製した。このクローンのＤＮＡを、
野性型ウイルスのＤＮＡと、幾つかの制限酵素を用いて
消化し、電気反転ゲル電気泳動（図６）によってアガロ
ースゲル上で分離することによって、比較した。臭化エ
チジウムで染色した vp ７の NotI 消化物においては
(レーン２）、145 Kbか 45Kb のバンドのみが、可視と
なるのに充分なＤＮＡ量を含有しており、1.1Kb 挿入体
に対するバンドは、僅か約３ngのＤＮＡを含有するもの
と見積られた。しかし、gpt −特異的プローブとのハイ
ブリッド形成により、1.1Kb で弱いバンドが現れた (図
７、レーン２）。
【０１８４】HindIIIによる消化物では、1.4 及び 0.8K
bで予想のバンドが観察された。予想されたように、0.8
Kb のバンドがgpt −遺伝子プローブとハイブリッド形
成した（図５及び図７、レーン４）。NotI及び HindIII
による二重消化物では、予想された 0.8Kbのフラグメン
トも観察された (図６及び図７、レーン６）。
【０１８５】ＰstI による vp ７ＤＮＡの消化物におい
ては、gpt 配列を含む予想の 4.1Kbフラグメントが観察
された (図６及び図７、レーン８；図６における4.1Kb
の臭化エチジウム染色されたバンドは、実際には 4.1Kb
フラグメントのダブレットであり、これらのうち一方が
gpt挿入体を含有する) 。ＰstI 及び NotI の双方によ
る切断に際し、gpt 遺伝子カセットが、1.1Kb フラグメ
ントとして遊離する (図６及び図７、レーン10) 。
【０１８６】Sa1I（図６及び図７、レーン12) を含む、
これらの他の制限ヌクレアーゼによって得られた消化物
のパターンは、vp7 が、ワクシニアウイルス ゲノムの
NotI部位内へと「ａ」配向で組み込まれた gpt−遺伝子
を有する安定な修飾ウイルスであるという解釈と整合し
ている（図11参照) 。
【０１８７】若干条件を変更しつつ、第二系列のクロー
ニング実験を実施した（表１を参照。方法については、
上記を参照）。一定量の NotI −切断ワクシニアベクタ
ーＤＮＡを含有し、挿入ＤＮＡの量が増加するように、
５つの異なる連結反応（Ａ〜Ｅ）を設定した。ワクシニ
アウイルス感染したＣＶ−１細胞内で標準的条件下にパ
ッケージングを行った。すべての場合において、gpt −
陽性ワクシニアウイルスの力価は、８×106 個の細胞当
り約１×105pfuであった。すべてのクローニング実験に
おけるプラーク集団は、寸法が不均一であった。約半分
は標準的寸法を有し、この一方他の半分は標準よりも小
さかった。
【０１８８】
【表１】
【０１８９】系列Ａ，Ｃ及びＥと称する３つの系列の各
々について４つの、計12の gpt−陽性プラークを分離し
た。８つの標準的寸法（大きい）プラーク（Ａ１〜４及
びＣ１〜４）と、４つの小さいプラーク（Ｅ１〜４）が
含まれている。これらのプラークを各々、gpt −選択性
培地中でＣＶ−１細胞を感染させ、全細胞ＤＮＡを分離
し、これらを制限ヌクレアーゼで消化し、ＦＩＧＥでフ
ラグメントを分離し、ニトロセルロース膜上へブロッテ
ィングすることによって分析した。
【０１９０】図８において、ワクシニアウイルスＤＮＡ
プローブとハイブリッド形成したNotI消化ＤＮＡ試料を
示す（Ａ１〜４はレーン１〜４に示す。Ｃ１〜４は、レ
ーン５〜８に示す。Ｅ１〜４はレーン９〜12に示す) 。
ゲルの過負荷のために、バンドが幾分か不鮮明になって
いるが、基本的特徴は明瞭に見ることができる。145 Kb
及び45Kbバンドが、主要信号を与えている。起源の解ら
ない約５Kbの弱いバンドを、幾つかの試料で見ることが
できる。Ｐ7.5 −プロモーター−gpt −遺伝子カセット
を含む 1.1Kbバンドは、ウイルスのゲノムの0.6 ％のみ
を構成し、300 bpのハイブリッド形成配列、( 即ち、Ｐ
7.5 プロモーター) のみを含有する。従って、このバン
ドは、採用した条件の下で、検出可能なハイブリッド形
成信号を与えることは予想されなかった。ブロットを一
層長時間照射し、大きい方のバンドを大きく過照射した
場合には、この 1.1Kbのバンドも可視となった。
【０１９１】小さいプラーク表現型の性質によって、小
さいプラークE1, E3及び E4 は、弱いハイブリッド形成
信号のみを生じており (図８，レーン９〜12) 、これら
のプラーク中のウイルスが、標準的寸法のプラーク (レ
ーン１〜８）中のウイルスと同じ規模で複製しなかった
ことを示している。この一方、分離株Ｅ２は、検出可能
な量のＤＮＡを生産しなかった（レーン10) 。
【０１９２】また、図８に示した試料は、gpt −遺伝子
プローブとハイブリッド形成した（図９）。予想された
単位のハイブリッド形成信号は、プラークＡ１，Ａ４，
Ｃ１，Ｃ２，Ｃ４，Ｅ３及びＥ４（図９，レーン１，
４，５，６，８，11及び12) によって得られた。プラー
クＡ２（レーン２）は、45Kbバンド中へと組み込まれた
gpt −遺伝子を有していた（145Kb バンド中の弱い信号
は、第二の少量の種による汚染によるか、又は二次的な
組み換えが生じたことによるのであろう）。プラークＡ
３（レーン３）は、145Kb 及び45Kbバンド内へと組み込
まれたgpt −遺伝子配列を有し、一方プラークＣ３（レ
ーン７）は、145Kb バンド内及び NotI 部位内へのこれ
らの配列の組み込みを有する。プラークＡ２，Ａ３及び
Ｃ３は、おそらく、モデル遺伝子カセット挿入体中及び
ウイルスＤＮＡの逆反復中に存在する相同配列の、不規
則細胞内組み換えによって生ずる組み換え体である。
【０１９３】ワクシニアウイルスＤＮＡプローブの場合
のように、小さいプラークＥ１ 〜Ｅ４は、弱いハイブ
リッド形成信号のみを生じており（図９，レーン９〜1
2) 、これらのプラーク中のウイルスが、標準的寸法の
プラーク中のウイルスと同規模では複製しなかったこと
を示している。野性型ウイルスＤＮＡ及び非感染ＣＶ−
１細胞ＤＮＡは、gpt −遺伝子プローブとハイブリッド
形成しなかった（図９，レーン13及び15) 。
【０１９４】gpt−遺伝子挿入体の配向及びコピー数
は、図９に示す試料をＰstI で消化すること及びサザン
ブロット分析によって、測定した。 gpt−遺伝子の挿入
から生じた新しいＰstI フラグメントの予想寸法を、図
11に示す。gpt −遺伝子プローブとのハイブリッド形成
によって明らかになったところでは、プラークＡ１，Ａ
４，Ｃ１及びＣ２のバターンは（図10のレーン１，４，
５及び６）、「ａ」配向の一本挿入体に対して予想され
たような（図11) 4.1Kb の一本のＰstI フラグメントを
含んでいた。プラークＥ１に対しては、21Kbバンドから
の弱いハイブリッド形成信号が、このブロットを長時間
照射したときのみに観察され、gpt −遺伝子の挿入体の
「ｂ」配向と整合していた。
【０１９５】プラークＣ４及びＥ３（図10、レーン８及
び11) からのウイルスＤＮＡの構造は、「ｂ」配向にお
ける二本タンデム挿入体と整合していた。この場合は、
21Kb及び 1.1Kbのハイブリッド形成フラグメントが予想
される (図11) 。プラークＥ４中のウイルスの構造は、
4.1Kb 及び 1.1Kbの二つのフラグメントを含んでおり、
「ａ」配向での二つの gpt−遺伝子のタンデム挿入と整
合している。プラークＡ２，Ａ３及びＣ３からのＤＮＡ
は、多重部位での挿入を示す更に複雑なパターンを示し
ており、これ以上分析できなかった。
【０１９６】要約すると、第二のクローニング実験にお
いては、８つの標準寸法のプラークのうちの５つが、ワ
クシニアウイルス ゲノムの独自 NotI 部位中への一本
のgpt−遺伝子カセットの挿入に対して予想されるゲノ
ム構造を、有していた。一層緩徐に成長する小さい寸法
のプラークは、不安定な構造を示し、これは続くプラー
ク精製工程の間に失われた。
【０１９７】実施例２ 選択標識遺伝子（大腸菌 ｇｐｔ）の、修飾アビポック
スウイルス ゲノム（鶏痘ウイルスクローン ｆ−ＴＫ
２ａ）の独自（ＮｏｔＩ）切断部位への直接分子クロー
ニング。
【０１９８】この実施例はインビトロで処理されインビ
ボでパッケージされる修飾アビポックスウイルス ゲノ
ムへの適用について説明することによって修飾細胞質Ｄ
ＮＡウイルスゲノムの直接分子クローニングの一般的適
用性を示すようにしている。アビポックスウイルスはポ
ックスウイルス科の最も大きなゲノムを有している。鶏
痘ウイルス（ＦＰＶ）のゲノムは約３００ｋｂの大きさ
で、以前は外来性遺伝子を形質発現するＦＰＶ組換え体
は標識釈放法〔例えば、ボイルおよびクーパー、「Ｖｉ
ｒｕｓ Ｒｅｓ．」 １２０：３４３〜３５６（１９８
８）；テイラーら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」 ５：４９７〜
５０３（１９８８）を参照〕で作製されるに過ぎなかっ
た。
【０１９９】この実施例は組換え鶏痘ウイルス、ｆ−Ｔ
Ｋ２ａのゲノムの独自ＮｏｔＩ部位への大腸菌 ｇｐｔ
遺伝子を駆動させるポックスウイルス プロモーターを
含む遺伝子発現カセットの直接分子クローニングによる
修飾鶏痘ウイルスの生産を示している。このＮｏｔＩ部
位は以前この組換え体に細胞内組換え法により挿入した
ｌａｃＺ遺伝子中に存在する。処理したＤＮＡをｆ−Ｔ
Ｋ２ａ組換え体よりゆっくり複製するＨＰ２ヘルパー
鶏痘ウイルスを感染させた初代チキン胚繊維芽細胞でパ
ッケージする。処理した鶏痘ウイルスはｇｐｔ−陽性プ
ラークの選択により単離できる。ｌａｃＺマーカー遺伝
子がＮｏｔＩ部位での挿入により不活化されるため、子
孫ウイルスはｌａｃＺ遺伝子発現のブループラーク ア
ッセイにおいて、無色表現型により、挿入を欠くベクタ
ーウイルスから識別される。
【０２００】鶏痘ウイルスおよびＤＮＡの精製：鶏痘ウ
イルス（ＦＰＶ）株ＨＰ１〔メイル（Ｍｅｙｒ）および
マリッキイ（Ｍａｌｉｃｋｉ）、「Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ
ａｔｔ ｆ． Ｖｅｔｅｒｉａｒｍｅｄｉｚｉｎ、Ｒｅ
ｉｈｅ Ｂ」、１３：１〜１２（１９６６）〕および弱
毒化株ＨＰ１．４４１（ＨＰ１の継代番号４４１）をア
ー．メイル（Ａ．Ｍｅｙｒ）、ミュンヒェン（Ｍｕｎｉ
ｃｈ）から得た。鶏痘ウイルス株ＨＰ２をプラーク精製
によりＨＰ１．４４１から誘導した。初代チキン胚繊維
芽細胞（ＣＥＦ）を欧州特許出願公開第０ ３３８ ８
０７号明細書に開示されているように調製した。細胞は
５％牛胎児血清、グルタミンおよび抗生物質を添加した
組織培養培地１９９〔ＴＣＭ１９９；ギブコ ビーアー
ルエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）〕で増殖させた。鶏痘ウ
イルスはジョクリック、ダブリュー．ケー．（Ｊｏｋｌ
ｉｋ、Ｗ．Ｋ．）、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」 １８：９〜
１８（１９６２）の二連続ショ糖勾配(two successive
sucrose gradients)により精製した。ウイルスＤＮＡは
グロス−ベラールド（Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ）
ら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」 ３６：３２〜
３８（１９７３）のプロテイナーゼ Ｋ／ＳＤＳ法によ
り調製した。
【０２０１】挿入したＤＮＡセグメントに独自（Ｎｏｔ
Ｉ）切断部位を有す鶏痘ウイルスベクター（ｆ−ＴＫ２
ａ）の作製：ワクシニアウイルスｔｋ−遺伝子を大腸菌
ｌａｃＺ遺伝子とともに鶏痘ウイルスのｔｋ−遺伝子と
３′−ｏｒｆの間の遺伝子間領域に挿入した。プラスミ
ドｐＴＫｍ−ＶＶｔｋａおよびｐＴＫｍ−ＶＶｔｋｂは
中間体プラスミドｐＴＫｍ−ｓＰ１１に機能的ワクシニ
アウイルスｔｋ−遺伝子をクローニングして作製した。
ｐＴＫｍ−ＶＶｔｋａおよびｐＴＫｍ−ＶＶｔｋｂを野
生型鶏痘ウイルスＤＮＡで細胞内組換えする際に、２種
の新規ＦＰＶベクターが生じ、これらのベクターをそれ
ぞれｆ−ＴＫ２ａおよびｆ−ＴＫ２ｂと呼ぶ。各ベクタ
ーは２つの機能的ｔｋ−遺伝子、内在ＦＰＶ遺伝子およ
び挿入したワクシニアウイルスｔｋ−遺伝子、更に挿入
ｌａｃＺ遺伝子を有し、これらのいずれもが外来ＤＮＡ
の挿入に非必須な部位として使用できる。特に、ｌａｃ
Ｚ遺伝子のＮｏｔＩ部位はｆ−ＴＫ２ａおよびｂベクタ
ーの独自切断部位であり、従って、この部位はこれらの
ベクターで外来遺伝子を直接分子クローニングするのに
有効である。鶏痘ウイルスベクター、ｆ−ＴＫ２ａおよ
びｆ−ＴＫ２ｂの構造の詳細はシェイフリンガー（Ｓｃ
ｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ）らによる「組換え鶏痘ウイル
ス」と題する米国出願に開示されており、これはこの出
願と同時に提出された同等の欧州出願の優先権を主張し
ており、ここにこの欧州特許出願を参考のために記載す
る。
【０２０２】鳥類細胞でのインビボ パッケージング：
８×１０6 のＣＥＦ細胞を０．２ｐｆｕ／細胞のヘルパ
ーウイルス（ＨＰ２）で２時間感染させた。処理したＦ
ＰＶゲノムをパッケージングするために、１μｇの精製
した連結反応生成物を使用した。細胞をリン酸カルシウ
ム沈殿技術(calcium phosphate precipitation techniq
ue) （グラハムおよびファン デル エーベー、１９７
３）により、ＤＮＡでトランスフェクションし、室温で
１５分間温置した。１ｍｌの沈殿に対し９ｍｌの培地
（ＴＣＭ １９９、１０％牛胎児血清、グルタミンおよ
び抗生物質）をこの細胞に添加した。４時間後培地を交
換し更に２日間温置した。粗ウイルスストック(crude v
irus stocks)を標準法（マケットら、１９８５）により
調製した。プラークアッセイおよびｇｐｔ−選択はシェ
イフリンガーら、１９９１に従って行った。
【０２０３】鶏痘ウイルスゲノムの、独自ＮｏｔＩ切断
部位への直接分子クローニング：組換えＦＰＶ株ｆ−Ｔ
Ｋ２ａ（シェイフリンガーら、１９９１）は遺伝子カセ
ット、例えばここに記載するモデルｇｐｔ遺伝子カセッ
トを独自ＮｏｔＩ切断部位へ直接分子クローニングする
ためのベクターとして適している。このベクターのこの
ＮｏｔＩ部位はｌａｃＺ遺伝子の暗号化領域に存在し、
このｌａｃＺ遺伝子は遺伝子挿入において不活化するカ
ラー スクリーニング標識として役立つ。このように、
ｌａｃＺ−陽性ウイルスは色素生成性物質Ｘ−Ｇａｌの
存在で青色プラークを形成し、一方このＮｏｔＩ部位に
挿入を受けたウイルスは白色プラーク表現型を示す。ま
た、ｆ−ＴＫ２ａベクターのゲノムは、代替遺伝子挿入
領域(alternate gene insertion region) として役立つ
ワクシニアウイルス チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子
を組み込んでいる。ｌａｃＺおよびｔｋ遺伝子は共に鶏
痘チミジンキナーゼ遺伝子と３′−読み取り枠との間の
遺伝子間領域の鶏痘ウイルスゲノムに通常の方法（シェ
イフリンガーら、１９９１）で挿入した。
【０２０４】ＮｏｔＩによるＤＮＡ切断のパターンはＦ
ＰＶウイルスＨＰ１．４４１およびこのベクター株ｆ−
ＴＫ２ａのゲノムＤＮＡのために確立した（図１２）。
ＨＰ１．４４１は毒性ＦＰＶ株からチキン胚繊維芽細胞
の連続継代(serial passage)による弱毒化(attenuatio
n) を介して誘導した。ＨＰ１．４４１はＨＰ１の４４
１番目の継代で、鶏痘に対するワクチン株として使用さ
れ（メイルおよびマリッキイ、１９６６）、細胞培養で
の迅速複製によく適用される。
【０２０５】ＨＰ１．４４１からのＤＮＡをＨＰ１．４
４１から誘導したＦＰＶベクター株ｆ−ＴＫ２ａの対照
として分析した。ＨＰ１．４４１ＤＮＡの制限分析（図
１２、レーン１および２）はこの株がＮｏｔＩ部位を有
しないことを示した。ＮｏｔＩでベクターｆ−ＴＫ２ａ
ＤＮＡが切断されると約１００および２００ｋｂの２つ
の大きいフラグメント（図１２、レーン４）を生じた。
【０２０６】ｇｐｔ遺伝子を形質発現する鶏痘ウイルス
の直接分子作製：大腸菌 ｇｐｔ遺伝子を含むモデル遺
伝子発現カセットをＮｏｔＩ部位で横に並ぶ初期／後期
(early/late)ポックスウイルスプロモーターにより駆動
されたｇｐｔ遺伝子を含むプラスミドｐＮ２−ｇｐｔａ
中に作製した（図３）。
【０２０７】ベクターｆ−ＴＫ２ａへのクローニングの
ために、ｇｐｔ−遺伝子カセットをこのプラスミドから
削り取り、図１３に概略するｆ−ＴＫ２ａのＮｏｔＩ切
断ゲノムＤＮＡとつないだ。連結したＤＮＡを鶏痘ヘル
パーウイルス−感染ＣＥＦ細胞にトランスフェクション
した。更に、Ｘ−Ｇａｌを含むオーバーレイ(overlay)
の下で白色を示すｇｐｔ−陽性プラークをチキン胚繊維
芽細胞の感染後サザンブロッティングにより分析した。
すべての細胞ＤＮＡを単離し分離したＮｏｔＩフラグメ
ントを実施例１に記載するように、ヘルパー鶏痘（ＨＰ
２）およびｇｐｔ遺伝子配列の32Ｐ−標識ＤＮＡと共に
サザンブロッティングにかけた。適当な連結を示す１．
１ｋｂＮｏｔＩフラグメント上のｇｐｔ遺伝子を含むＧ
ｐｔ−陽性ウイルスはこのクローニング段階において発
生した。
【０２０８】１つの作製段階における両挿入配向を有す
る修飾ウイルスの生産：またこの実施例は各配向中に挿
入遺伝子カセットの１コピーを有するウイルス、ならび
に挿入遺伝子の多重コピーを含むウイルスがどのように
して単一の直接分子クローニング段階から回収できるか
を示している。選択され処理された鶏痘ゲノム中のＤＮ
Ａ挿入体の配向は適当な制限酵素で切断されたＤＮＡの
サザンブロッティングにより測定される。図１３に示す
ように、ウイルスＤＮＡに挿入したＤＮＡは「ａ」また
は「ｂ」配向のどちらにもすることができる。このモデ
ル遺伝子カセットによる挿入数および配向の予備的な分
析のために、例えば、選択プラークで感染細胞のすべて
のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩおよびＮｏ
ｔＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で分離する。
このブロットをｇｐｔ遺伝子プローブおよび鶏痘ウイル
スプローブでハイブリッド形成した。
【０２０９】組換えウイルスのＮｏｔＩ−消化ＤＮＡ試
料において、ｇｐｔカセットは１．１ｋｂフラグメント
として削り取られた。またａまたはｂ配向の挿入体を有
すＤＮＡのＣｌａＩでの切断は図１３に示す構造から決
定されるように、ｇｐｔ遺伝子プローブとハイブリッド
形成する異なった特性のフラグメントを与える。
【０２１０】実施例３ アビポックス（鶏痘）ヘルパーウイルスによる処理オル
トポックス（ワクシニア）ウイルスゲノムＤＮＡの異種
パッケージングおよび、それに次ぐ、ヘルパーウイルス
が複製できない種類の宿主細胞においての組換え体のた
めの選択。
【０２１１】ポックスウイルスＤＮＡの異種パッケージ
ング、例えば、アビポックスウイルスによるオルトポッ
クスウイルスＤＮＡのパッケージングは報告されていな
い。しかし、この実施例は細胞外で処理ワクシニアウイ
ルスＤＮＡのインビボパッケージングがチキン胚繊維芽
細胞の鶏痘ウイルスにより実施できることを示してい
る。ヘルパーウイルスとは違った宿主域を示すベクター
ウイルスの使用は処理ウイルスを１つのプラークアッセ
イ段階で精製するのに簡潔且つ優れた方法を提供する。
このように、この実施例において、組換えオルトポック
スウイルスをアビポックスヘルパーウイルスの十分な複
製を支持しない哺乳類（ＣＶ−１）細胞でのプラークア
ッセイにより回収した。ベクターに挿入したＤＮＡが優
性選択マーカーを含むことは選択プラークアッセイ条件
の使用を有効に促進し、所望の挿入を欠いたベクターＤ
ＮＡを含むウイルスを排除できる。
【０２１２】異種パッケージング法の他の利点はベクタ
ーとヘルパーウイルス間の組換えの可能性を減少させる
ことである。例えば、異なる属に属するオルトポックス
およびアビポックスウイルスは、異なる形態および複製
の容易さを有し、更に標準ハイブリッド形成条件におい
てクロス−ハイブリッド形成を欠くことから示されるよ
うに単に最小配列相同性を共有するにすぎない。従っ
て、アビポックスおよびオルトポックスウイルスのゲノ
ムの相同組換えは極めて困難であり、特にこれら２種の
ウイルスの使用は類縁ウイルスの相同配列間で頻発する
好ましくない組換え現象を排除できる〔フェナーおよび
コムベン、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」 ５：５３０〜５４８
（１９５８）；フェナー、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」
８： ４９９〜５０７ （１９５９）〕。パッケージン
グ中のベクター−ヘルパー組換えを防止するための第２
の方法は組換え不全ウイルス株または宿主細胞を使用す
ることである。
【０２１３】この実施例において、マーカー遺伝子（ポ
ックスウイルスプロモーターにより駆動される大腸菌ｇ
ｐｔ遺伝子）を含むモデル形質発現カセットをワクシニ
アウイルスＤＮＡの独自ＳｍａＩ部位に細胞外で挿入し
た。ウイルスＤＮＡを切断するこの制限酵素の使用はブ
ラントエンドを生成し、このブラントエンドはブラント
エンドを生成する他の任意のヌクレアーゼにより、また
は、例えば単鎖末端を有する挿入体からブラントエンド
を作りだすポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼの使
用により調製したブラントエンドを有すＤＮＡ挿入体に
有効につなげることができる。
【０２１４】パッケージングのために、処理ゲノムＤＮ
Ａを鶏痘ウイルス−感染宿主細胞にトランスフェクショ
ンし、この細胞中でワクシニアおよび鶏痘ウイルスを共
に複製できる（チキン胚繊維芽細胞）。鶏痘ヘルパーウ
イルスの宿主域が鳥類細胞に制限されるので、ワクシニ
アウイルスクローンを哺乳類宿主細胞（アフリカミドリ
ザル腎臓ＣＶ−１細胞）においてトランスフェクション
した細胞からの子孫のプラーク−精製により選択した。
ｇｐｔ遺伝子発現のための同時選択を使用して修飾ワク
シニアウイルスだけを単離した。１つの細胞内遺伝子交
雑において通常外来遺伝子の１コピーだけを１つの配向
に挿入できるポックスウイルス組換え体を生成する通常
の方法に比べ、本実施例では１つの挿入体の可能な両配
向、ならびにモデル遺伝子カセットの二本挿入を単一細
胞外ゲノム修飾反応の生成物として同定できた。
【０２１５】この実施例の実験結果は連結したワクシニ
アウイルスＤＮＡの鶏痘ヘルパーウイルスによるパッケ
ージング効率が無傷の(intact)ワクシニアウイルスＤＮ
Ａを鶏痘ウイルスでパッケージングするのと比べ低く、
３日間複製の後６×１０6 のチキン胚繊維芽細胞当たり
５×１０3 〜１×１０4 ｐｆｕの範囲の収量を生成する
ことを示す。１つのパッケージング実験（「Ｆ１２」系
列で表すプラークの生成、ｉｎｆｒａ）において、パッ
ケージした修飾ウイルスの収量は６×１０6 のチキン細
胞当たり９×１０2 ｐｆｕであり、第２の実験（「Ｆ１
３」系列の生成）では、６×１０6 のチキン細胞当たり
５×１０2 ｐｆｕであった。これら実験のこの比較的低
いパッケージング頻度の原因の１つはベクターＤＮＡア
ームの脱リン酸化処理の欠如であり、従ってこれは任意
の挿入体を伴わず効果的に再結合することができた。か
かる処理はブラントエンドを有すＤＮＡフラグメントの
脱リン酸化が通常効果的でないため略いた。この問題は
多重切断部位と「粘着性」末端を有する宿主ウイルス株
の作製により克服でき、これらは直接の「強制」クロー
ニングを可能にし、その結果外来ＤＮＡフラグメントの
挿入が極めてより効率的になる。
【０２１６】パッケージング効率に影響する他の因子は
ヘルパーウイルスとパッケージしたウイルスとの間の細
胞レベルでの干渉である。標準パッケージング条件下、
３日間の温置内にヘルパーウイルス（鶏痘）は通常、６
×１０6 のチキン胚繊維芽細胞当たり約１×１０8 ｐｆ
ｕの力価まで複製する。パッケージしたワクシニアウイ
ルスと比較して鶏痘ウイルスの著しい量は陰性干渉現象
を生じ、パッケージしたウイルスの複製を阻害する条件
を与えた。
【０２１７】この干渉は実施例７に記載するようにパッ
ケージングするのに、鶏痘ヘルパーウイルスと組み合わ
せて哺乳類細胞を使用することにより最小にできる。こ
の場合、宿主細胞は鶏痘ヘルパーウイルスの十分な複製
を支持できない。連結したワクシニアウイルスＤＮＡの
鶏痘ウイルスによるパッケージング効率に対する試験は
哺乳類宿主細胞では実施されなかったが、８×１０6 の
哺乳類（ＣＶ−１）細胞当たり２×１０6 ｐｆｕのパッ
ケージング収量が非切断ワクシニアウイルスＤＮＡで得
られた。
【０２１８】所定の挿入プラスミドを有す細胞内組換え
体により生ずる各ウイルス組換え体において、挿入体は
そのプラスミドにおける相同性の横に並んだ領域の極性
に依存する 1つの配向を有する。転写干渉現象のため、
例えば（インクおよびピックアップ、１９８９）、ポッ
クスウイルスベクターに挿入された遺伝子のための形質
発現レベルはウイルスゲノムに関して外来遺伝子の配向
に依存する。従って、可能ないずれかの配向を有する修
飾ウイルスを１つの反応段階で得ることが好ましい。こ
の実施例における手順の利点の１つは、挿入ＤＮＡの可
能な両配向が１つの連結反応で得られ、最も高い形質発
現レベルを有す変異体のための迅速スクリーニングを可
能にする。ワクシニアウイルスの選択ＳａｍＩ挿入部位
におけるこの実施例のカセットの好ましい配向は「ｂ」
配向であり、これは修飾ウイルスの多数がこのゲノム構
造を有する事実から証明される。このカセットにおい
て、外来遺伝子を制御するＰ７．５プロモーターは内在
性７．５ｋＤａポリペプチド遺伝子と比較して逆転反復
配向である。実施例１で記載しているように、内在性
７．５ｋＤａポリペプチド遺伝子はワクシニアゲノムの
逆転末端反復(invertedterminal repetitions) に存在
している。ｇｐｔ−遺伝子のＰ７．５プロモーターと左
末端反復でのＰ７．５プロモーターの距離は約２０ｋｂ
である。従って、「ａ」配向はより不安定で、より低頻
度であり、この配向が２度見出されたにすぎないという
観察結果と一致している。しかし、ウイルス単離体Ｆ１
３．４（配向ａ）およびｖＦ１２．５（配向ｂ）はｇｐ
ｔ−選択で大スケールに増殖でき、安定な予想できる構
造を有することが見出された。選択を伴わない多重挿入
体を含む種々の構造の安定性は測定する必要がある。
【０２１９】連結はベクターに対して数倍過剰の挿入体
を含み、従って、カセットの多重コピーの好ましい挿入
が観察された。しかし、何故この実施例においての二本
挿入が実施例１の頻度より高いのか明らかでない。内部
組換え現象のため、単に多重挿入体の特定の配置が安定
と考えられるにすぎない。多重挿入体を有するウイルス
の安定性および安定化のための挿入体に対するベクター
の最適比およびコピー数に依存する形質発現レベルを評
価するための更なる研究はすべて各構造に必要なものと
して、この出願の教えにより、処理できる。
【０２２０】ウイルスおよびＤＮＡの精製：実施例１お
よび２のウイルスおよび方法を使用した。
【０２２１】ウイルスＤＮＡの処理(engineering) ：ビ
リオンから精製したウイルスＤＮＡをＳａｍＩで切断
し、１回のフェノール抽出および３回のクロロホルム抽
出により精製した。以下の第１実験で、２μｇの切断し
たウイルスＤＮＡを４００ｎｇ（３５倍過剰モル）の挿
入体フラグメント（プラスミドｐＴＫｇｐｔ−Ｆ１ｓか
ら削り取った１．１ｋｂのＨｐａＩ−ＤｒａＩフラグメ
ント）と３０μｌの体積中で、４０時間、１５単位のＴ
４リガーゼ〔ベーリンガー、インコーポレーション（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｉｎｃ．）〕によりつなげた。第
２の連結実験は１７倍過剰モルの１．１ｋｂＳａｍＩ挿
入体および５単位のリガーゼを用いる以外は、同一条件
下で実施した。
【０２２２】鳥類細胞でのインビボ異種パッケージン
グ：チキン胚繊維芽細胞（６×１０6）にヘルパーウイ
ルス（０．５ｐｆｕ／ＨＰ１．４４１細胞）を感染さ
せ、２時間温置した。２μｇの連結したＤＮＡを、この
感染させた細胞にトランスフェクションし、更に実施例
１で相同パッケージングのために記載したのと同様に処
理した。初期のプラークアッセイは実施例１で記載した
ようにＣＶ−１細胞で実施した。
【０２２３】鶏痘ヘルパーウイルスによる修飾ワクシニ
アウイルスＤＮＡのパッケージングの例示：この実験の
設計図を図１４に示す。ワクシニアウイルスゲノムＤＮ
Ａをショ糖勾配精製したビリオンから調製し、制限エン
ドヌクレアーゼＳａｍＩで切断し、ブラントエンドを有
する外来遺伝子カセットとつないだ。連結したＤＮＡを
パッケージングのために鶏痘ウイルスを感染させたチキ
ン胚繊維芽細胞にトランスフェクションした。子孫ウイ
ルスは感染性ビリオンを生成する鶏痘ウイルスの完全な
複製を支持しない哺乳類（ＣＶ−１）細胞でのプラーク
アッセイにより同定した。
【０２２４】更に詳述すると、初めに、モデル遺伝子カ
セットを有するＨｐａＩ−ＤｒａＩフラグメント（ワク
シニアウイルスＰ７．５プロモーターにより駆動したｇ
ｐｔ遺伝子を含む）をプラスミドｐＴＫｇｐｔ−Ｆ１ｓ
から削り取り〔ファルクナー（Ｆａｌｋｎｅｒ）および
モス（Ｍｏｓｓ）、１９８８〕、およびワクシニア野生
型ウイルス（ＷＲ株）の独自ＳａｍＩ部位に直接につな
いだ。ｇｐｔ遺伝子は修飾ウイルスの陽性選択を可能に
するように選択された（ボイルおよびクーパー、１９８
８；ファルクナーおよびモス、１９８８）。ワクシニア
ウイルスＤＮＡ中の単一ＳａｍＩ部位はゲノムのＨｉｎ
ｄＩＩＩ Ａ フラグメントの読み取り枠Ａ５１Ｒに存
在する。Ａ５１Ｒ遺伝子は細胞培養においてのウイルス
複製に非必須である〔ゴーベルら、１９９０〕。
【０２２５】連結した材料は鶏痘ヘルパーウイルスを感
染させたチキン胚繊維芽細胞にトランスフェクションし
た。３日後細胞を収穫し、粗ウイルスストックを調製し
た。パッケージしたワクシニアウイルスを、ｇｐｔ遺伝
子を運ぶウイルスの感染を受けた細胞を選択する培地中
でアフリカミドリザル腎細胞系（ＣＶ−１）上のプラー
クアッセイにより同定した。この選択計画は挿入された
モデルｇｐｔ遺伝子カセットを有する修飾ウイルスにプ
ラークを形成させながら、自己連結した野生型ワクシニ
アウイルスＤＮＡを有するウイルスのプラーク形成を妨
げる。
【０２２６】パッケージング頻度は初期の実験では低か
った。６×１０6 のチキン胚繊維芽細胞から調製した粗
ストックでのｇｐｔ−陽性ワクシニアウイルスの力価は
１×１０2 〜１×１０3 ｐｆｕの範囲であった。
【０２２７】１３のｇｐｔ−陽性プラークをＣＶ−１細
胞のｇｐｔ−選択の下に増幅させた。感染細胞のすべて
のＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．７％
アガロースゲル上で分離し、更にサザンブロッティング
による分析のためにｇｐｔ−遺伝子プローブで処理し
た。図１５に示すように、異なった修飾ゲノム構造から
予想されるブロットパターンを有する種々のウイルスを
得た。
【０２２８】レーン２、４、１１および１３（プラーク
＃Ｆ１２．３、Ｆ１２．５、Ｆ１３．３およびＦ１３．
５に対応）において、約４５ｋｂの単一ハイブリッド形
成フラグメントが見出され、このフラグメントは１コピ
ーの遺伝子カセットがウイルスゲノムに「ｂ」配向で挿
入される際に予想できる（図１６参照）。また５．２ｋ
ｂの予想された新規フラグメントもすべての場合に存在
し、更にワクシニアウイルス プローブを使用した図１
５と同様なＤＮＡを試験する際に見出される。
【０２２９】「ａ」配向と一致したパターンを有する２
つのウイルスがレーン７および１２（プラーク＃Ｆ１
２．８、およびＦ１３．４に対応）で得られ、そこで約
５．７ｋｂの単一ｇｐｔハイブリッド形成フラグメント
が所望される。レーン７の５．７ｋｂフラグメントはよ
り長いオートラジオグラフの暴露において更に明瞭とな
る。レーン５に見られるパターン（プラークＦ１２．
６）は「ａ」配向の１つの挿入体を表すかもしれない
が、所望の５．７ｋｂバンドは未知の理由から多少大き
い。
【０２３０】３つのウイルス単離体のパターンは「ａ」
配向（レーン１、６および１０、プラーク＃Ｆ１２．
２、Ｆ１２．７、およびＦ１３．２に対応）でのタンデ
ム挿入に一致する。これらの場合に、５．７および１．
１ｋｂの２つのｇｐｔ−陽性ハイブリッド形成フラグメ
ントが所望される（図１６も参照）。また５．７および
１．１ｋｂのフラグメントはワクシニアウイルス プロ
ーブとのブロットハイブリッド形成においてウイルスＤ
ＮＡと等モル量で観察された。
【０２３１】レーン３（プラークＦ１２．４）の単離体
のゲノムは恐らく「ｂ」配向のタンデム重複挿入体(tan
dem duplicate insert) を含んでいる。この場合、４５
ｋｂおよび１．１ｋｂの２つのフラグメントはｇｐｔ−
遺伝子とハイブリッド形成すると考えられる。
【０２３２】レーン９（プラークＦ１３．１）のウイル
スＤＮＡは先端〜先端二本挿入(head to head double i
nsertion) を含む場合がある。この場合、４５ｋｂおよ
び５．７ｋｂのｇｐｔ−遺伝子プローブとハイブリッド
形成するフラグメントが所望される。しかし、かかるＤ
ＮＡはまたワクシニアＤＮＡプローブとハイブリッド形
成する新規０．６ｋｂフラグメントを含む必要があり、
更に、実際に、このフラグメントはワクシニアプローブ
とハイブリッド形成するブロット上で検出された。それ
にもかかわらず、所望の５．７ｋｂフラグメントは予想
されたものより若干小さく、所望のハイブリッド形成シ
グナルより弱いシグナルを生成した。従って、この組換
え体の構造の確立には更に詳細な分析を必要とする。
【０２３３】更なる分析はタンデム「ａ」構造(tandem
‘ａ’structure)と共に二本挿入を有するとして上述さ
れたウイルスＦ１２．７およびＦ１２．３、ならびにタ
ンデム「ｂ」構造と共に二本挿入を有するとして上述さ
れたウイルスＦ１２．４が実際にそれぞれ「ａ」または
「ｂ」配向で多重タンデム挿入を有していることを明ら
かにした。図１５のサザンブロット分析は二本タンデム
（double tandem)挿入と多重タンデム(multiple tande
m) 挿入間を識別しない。
【０２３４】実施例４ 直接マスタークローニング部位を有するオルトポックス
ウイルス（ワクシニア）ベクター（ｖｄＴＫ）および適
合性形質発現カセットを有するプラスミドの作製。
【０２３５】この実施例は本発明の方法の適用が直接分
子修飾および実在するポックスウイルスゲノムのクロー
ニングによる新規ポックスウイルスクローニング ベク
ターを作りだすことを示している。特に、この実施例は
外来遺伝子の短い「多重クローニング部位」セグメント
への指向性(directional) 挿入（即ち「強制クローニン
グ」）を起こさせるワクシニアウイルスベクター（ｖｄ
ＴＫ）を記載しており、このセグメントは種々の異なる
エンドヌクレアーゼ切断部位を含んでおり、ベクターゲ
ノム中それぞれが独自のものである。強制クローニング
は所望の組換え体を挿入のないベクターウイルスから識
別する選択およびスクリーニング法の必要性を排除す
る。それは異なるヌクレアーゼにより切断されたＤＮＡ
末端の不適合性(incompatibility) が外来挿入体を有さ
ないベクターアームの再結合を防止するためである。従
って、強制クローニング法はウイルスベクターに外来遺
伝子を挿入する最も効果的な方法である。
【０２３６】指向性ベクターｖｄＴＫはワクシニアウイ
ルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の代わりに多重
クローニング部位（独自ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、Ａｐａ
Ｉ、およびＲｓｒＩＩ部位を含む）を挿入して作りだす
（図１７参照）。この非必須の座(nonessential locus)
はワクシニアウイルスへの外来遺伝子の挿入に極めて頻
繁に使用される部位であり、これは主にｔｋ−陰性ウイ
ルスの陽性選択が可能だからである。このようにして、
連結したｖｄＴＫベクターＤＮＡをｔｋ−陽性ヘルパー
ウイルスによりパッケージする際に、このベクターウイ
ルスは過剰量のヘルパーウイルスから陽性選択できる。
更に、通常の方法によるワクシニアウイルスｔｋ−座へ
の外来ＤＮＡの挿入は一般に安定な組換え体を与える。
【０２３７】新規ｖｄＴＫベクターの多重クローニング
部位はベクターに独自なＮｏｔＩおよびＳｍａＩ切断部
位を含む。多重クローニング部位の挿入の前に、野生型
ワクシニアウイルス（ＷＲ株）に先在するＮｏｔＩおよ
びＳｍａＩ切断部位を本発明の直接分子修飾により欠失
させる。所望の修飾を有するウイルスを特定の核酸配列
の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応法(polymerase ch
ain reaction) （ＰＣＲ）に基づくスクリーニング法に
より検出する。
【０２３８】またこの実施例はｖｄＴＫワクシニアベク
ターの完全なまたは部分的な読み取り枠を暗号化するＤ
ＮＡの形質発現を促進するプラスミドの１組(a set) を
記載している。本発明は挿入した読み取り枠の形質発現
のために適所に配置したすべての適当な調節要素(regul
atory elements) を有するポックスウイルス形質発現ベ
クターへの読み取り枠の直接的挿入を包含する。しか
し、インスタント(instant) ｖｄＴＫベクターは挿入し
た読み取り枠の形質発現のためのかかる調節配列を有さ
ず、この読み取り枠はそれ自身の転写および翻訳シグナ
ルを欠いている。従って、この実施例のプラスミドは有
利な遺伝子発現カセットをポックスウイルス プロモー
ターへのおよび、随意に、翻訳開始コドンへの読み取り
枠の日常的連結のために提供する。次いで、読み取り枠
および関連した調節配列はｖｄＴＫベクター マスター
クローニング部位へ強制クローニングにより効果的に転
移される。どちらかの配向において挿入体を有する修飾
ウイルスは所望の配向でプラスミドのマスタークローニ
ング部位内に形質発現カセットを有する２つのプラスミ
ドの１つを使用することで得ることができる。このプラ
スミドのここに例示した遺伝子発現カセットは２つの制
限酵素切断部位のネステッド セット(nestedsets) を
有し、ｖｄＴＫベクターへの読み取り枠のクローニング
を促進する。このカセットはｖｄＴＫベクターのマスタ
ークローニング部位と同一の独自部位を含むマスターク
ローニング部位を有する。更に、このマスタークローニ
ング部位の中程に、このカセットはカセットへの読み取
り枠の挿入に有用なフリークエントリー カッティング
酵素(frequently cutting enzymes)のための種々の部位
を含んでいる。このようにして、フリークエントリー
カッター部位の方法によりカセットに挿入されたＤＮＡ
はｖｄＴＫベクターのマスタークローニング部位へのカ
セットの強制クローニングにとって適した種々の異なる
独自部位によりいずれかの側に横に並ぶ。
【０２３９】またこの例はワクシニアベクターｖｄＴＫ
の単一の独自部位への挿入のために適する遺伝子発現カ
セットを記載している。ベクターＤＮＡを切断するため
の単一酵素を使用して減少したクローニング効率を克服
するために、これらのプラスミドの発現カセットは選択
マーカーとして大腸菌ｇｐｔ遺伝子を含んでいる。
【０２４０】ｖｄＴＫワクシニアベクター系は実施例３
および７に記載した異種パッケージング手順と共に優先
的に使用される。またｇｐｔマーカーを含むプラスミド
はｇｐｔマーカーを欠く相同性ヘルパーウイルスと共に
使用できる。ｖｄＴＫベクターおよび関連するプラスミ
ド系を用いたポリペプチドの形質発現のための構造の例
は次の実施例５に示している。
【０２４１】上記利点に加え、またこの発明の発現カセ
ットプラスミドは、切断したポックスウイルスベクター
ＤＮＡおよび多くの挿入体ＤＮＡの末端間の不適合性の
一般的問題を克服する、合成アダプターＤＮＡセグメン
トの通常の使用に有利に代替えできる手段を提供する。
このようにして、読み取り枠を暗号化するＤＮＡフラグ
メントの単離は短く、従って、すべての天然ＤＮＡ配列
に高頻度でランダムに発生する認識配列を有する制限エ
ンドヌクレアーゼの使用により通常、促進される。他
方、かかるフリークエントリー カッティング酵素は一
般にポックスウイルスのゲノムと同様に大きいゲノムへ
の有効な直接クローニングに適当でなく、例えば、かか
る酵素が大きなＤＮＡを多くのフラグメントに切断する
からである。これらのフラグメントの再結合は無作為に
発生し、若干の無傷のウイルスゲノムを生成する。従っ
て、ワクシニアベクターでの挿入部位は一般に読み取り
枠フラグメントまたは挿入ＤＮＡの単離に好ましくない
インフリークエントリー カッティング 制限エンドヌ
クレアーゼ(infrequently cutting restriction endonu
cleases)の切断部位であるのが好ましい。本プラスミド
はこの一般的不適合性をインフリークエントリー カッ
ティング酵素(infrequently cutting enzyme)を用いる
ワクシニアベクターへの効果的な転移により生成させた
プラスミドにフリークエント カッター（frequent cut
ters) からのフラグメントを効果的に挿入することによ
り克服する。
【０２４２】野生型ワクシニア（ＷＲ）ウイルスからの
独自ＮｏｔＩ切断部位の欠失(deletion)：ワクシニアウ
イルスの独自ＮｏｔＩ部位はＮｏｔＩ−切断ＤＮＡとの
連結反応にとって適合性付着端を有するが、ＮｏｔＩエ
ンドヌクレアーゼによる認識に必要な配列を欠いた「Ｎ
ｏｔＩ欠失アダプター」セグメントのこの部位への挿入
により排除される場合がある。このようにして、連結し
たＮｏｔＩ−切断ウイルスＤＮＡおよびウイルスＤＮＡ
ならびにアダプターの付着端により形成した配列はＮｏ
ｔＩにより切断されない。またこのアダプターはＤＮＡ
フラグメントの方向付けられた(directed)挿入のための
種々の選択された制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含
む。
【０２４３】更に特に、１μｇのワクシニアウイルスＷ
Ｒ野生型ＤＮＡをＮｏｔＩで切断し、１μｇの２本鎖Ｎ
ｏｔＩ−欠失アダプターとつなぐ。このアダプターは２
つの特に相補的な鎖からなる：ｏｄＮ１（ＳＥＱ．Ｉ
Ｄ．ＮＯ．１６）およびｏｄＮ２（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
Ｏ．２３）。アダプターの中央部分は制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位ＳｔｕＩ、ＤｒａＩ、ＳｓｐＩおよびＥ
ｃｏＲＶを含む。アニールしたアダプターオリゴヌクレ
オチドを連結反応のために使用する。連結した材料を鶏
痘ウイルスを感染させたチキン胚繊維芽細胞にトランス
フェクションし、実施例３に記載したようにパッケージ
する。
【０２４４】ワクシニアウイルス（ＷＲ株）の単一Ｎｏ
ｔＩ部位の欠失のための第２の方法を図１８に概略す
る。第１段階で、ワクシニアウイルスＤＮＡをＳａｃＩ
で切断し、ＳａｃＩ「Ｉ」フラグメントを低融点アガロ
ースから単離して適当なプラスミド例えばｐＴＺ１９Ｒ
〔ファルマシア インコーポレーション（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ、Ｉｎｃ．から入手可能〕のＳａｃＩ部位にクロ
ーン化する。得られたプラスミド、ｐＴＺ−ＳａｃＩを
ＮｏｔＩで切断し、クレノウ ポリメラーゼ(Klenow po
lymerase) で処理し付着端で満たし再結合する。連結し
た材料を大腸菌細胞（ＨＢ１０１）にトランスフェクシ
ョンする。コロニーを標準クローニング法により単離す
る。得られたプラスミド、ｐＴＺ−ＳａｃＩｄＮは欠失
したＮｏｔＩ部位を有し、イサックス，エス．エヌ．
（Ｉｓａａｃｓ，Ｓ．Ｎ．）、コットワール，ジー．
（Ｋｏｔｗａｌ，Ｇ．）およびモス，ビー．（Ｍｏｓ
ｓ，Ｂ．）「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」１７８：６２６〜６３
０（１９９０）により記載されているように逆転(rever
se) ｇｐｔ選択実験に使用し、次のように修飾する：
【０２４５】ＣＶ−１細胞（８×１０6 ）はウイルス単
離体ｖｐ７、単一ＮｏｔＩ部位にｇｐｔ遺伝子カセット
を組込んだワクシニアウイルスの０．２ｐｆｕで感染さ
せる（実施例１参照）。次いで、プラスミドｐＴＺ−Ｓ
ａｃＩｄＮから調製した修飾ＳａｃＩフラグメントから
の２０μｇのＤＮＡを含むリン酸カルシウム沈殿をこの
細胞中にトランスフェクションする。この細胞を更に実
施例１のパッケージング法で記載しているように処理す
る。粗ウイルスストックを６−チオグアニン(6-thiogua
nine) （６−ＴＧ）の存在下にマウスＳＴＯ細胞〔アメ
リカン タイプカルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ），ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ），ＭＤ；ＡＴ
ＣＣ＃ＣＲＬ１５０３から入手した〕に感染させるため
に使用する。これは複製するウイルスにｇｐｔ−遺伝子
の欠損を要求し、従って、この場合に修飾ＳａｃＩ
「Ｉ」フラグメントの組込みを要求し、その結果、ｇｐ
ｔ遺伝子の欠失を要求する陰性選択法(negative select
ion procedure)である（イサックスら、１９９０）。６
−ＴＧの存在下に増殖するすべてのプラークはｇｐｔ遺
伝子を欠き、修飾ＳａｃＩフラグメントを含む必要があ
る。評価した収量はすべてのプラークの０．１〜０．２
％の範囲（即ち、標識釈放実験のこのタイプでの組換え
体の正常頻度）である。選択法が著しく有効なため（イ
サックスら、１９９０）、正確な構造の同定はクローン
の多数の試験を必要とすると思われない。しかし、前記
第１の方法または第２の方法のどちらかはワクシニアウ
イルスの単一ＮｏｔＩの欠失に使用され、次のスクリー
ニング法が所望の構造を確認するのに使用される場合が
ある。
【０２４６】欠失したＮｏｔＩ部位を有するウイルス
（ｖｄＮ）のＰＣＲ−スクリーニングによる同定：欠失
したＮｏｔＩ部位を有するワクシニアウイルス クロー
ンは鶏痘ヘルパーウイルスの増殖を支持しない細胞系
（ＣＶ−１）中で増殖するプラークの分析により同定す
ることができる。個々のプラーク中のウイルスのＤＮＡ
は次のような、ＰＣＲに基づくスクリーニング法により
分析される。
【０２４７】ＰＣＲ反応のための第１プライマーはオリ
ゴヌクレオチドｏｄＮ１（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６）
であり、更に第２プライマーはｏｄＮ３（ＳＥＱ．Ｉ
Ｄ．ＮＯ．２４）である。第２プライマーの配列はワク
シニアウイルスゲノム中、第１プライマー配列の約７７
０ｂｐ下流に存在する。テンプレートは単一プラークの
ウイルスの半分で感染させた１×１０6 ＣＶ−１細胞か
らのすべてのＤＮＡである。ＤＮＡは標準的方法により
調製し、約５０ｎｇをＰＣＲ反応に使用する。ＰＣＲ反
応は市販のＰＣＲキットを用いる標準的方法により実施
する。陽性のＰＣＲ反応(positive PCR reactions)は約
７７０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成する。欠失した
ＮｏｔＩ部位を有するかかるウイルスを「ｖｄＮ」で表
す。
【０２４８】ワクシニアウイルスｖｄＮからの独自Ｓｍ
ａＩ制限部位の欠失：ワクシニアウイルスのＷＲ株は細
胞培養でのウイルス複製に必須でない読み取り枠（Ａ５
１Ｒ）中に単一ＳｍａＩ部位を含んでいる（ゴーベル
ら、１９９０）。この部位は外来遺伝子挿入のため使用
される場合があるが、しかし、本実施例では、この部位
は多重クローニング部位カセットの部分として新規な独
自ＳｍａＩ部位を導入することで、より用途の広いワク
シニアウイルス ベクターを作りだすために欠失させ
た。
【０２４９】従って、ｖｄＮウイルスＤＮＡ（１μｇ）
をＳｍａＩで切断し、制限ヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ
（ｏｄＳ１，５′−ＡＡＧＣＴＴ−３′）のための認識
配列を有するヘキサマーリンカー(hexamer linker)の過
剰量とつなぐ。ワクシニアウイルスＳｍａＩ切断部位へ
のこのリンカーの挿入はＳｍａＩ認識配列の破壊をもた
らし、新規ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列の導入を起こす。連
結した材料を鶏痘ウイルスを感染させたｃｖａ細胞に実
施例７に記載するようにトランスフェクションすること
によりパッケージする。
【０２５０】或いはまた、ワクシニアウイルス（ＷＲ
株）の単一ＳｍａＩ部位を図１９に概略する方法に従っ
て、完全なワクシニアウイルスＤＮＡの直接修飾(direc
tly modifying)の代わりにワクシニアウイルスＤＮＡの
クローン化フラグメントを修飾することにより、欠失す
る。第１段階で、ワクシニアウイルスＤＮＡをＳａｌＩ
で切断し、ＳａｌＩ Ｆ−フラグメントを低融点アガロ
ースから単離して適当なプラスミド、例えばｐＴＺ９Ｒ
（ファルマシア インコーポレーションより入手可能）
のＳａｌＩ部位にクローン化する。得られたプラスミ
ド、ｐＴＺ−ＳａｌＦ、は２つのＳｍａＩ部位を有し、
１つは多重クローニング部位にあり他はワクシニア配列
にある（図１９）。ｐＴＺ−ＳａｌＦを部分的にＳｍａ
Ｉで消化し、次に示すＩ−ＳｃｅＩリンカーを添加す
る：第１鎖、Ｉ−ＳｃｅＩリンカー１（ＳＥＱ．ＩＤ．
ＮＯ．２５）およびその相補的鎖、Ｉ−ＳｃｅＩリンカ
ー２（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２６）。ワクシニア配列か
ら欠失したＳｍａＩ部位を有する正確なプラスミドをＳ
ｍａＩおよびＩ−ＳｃｅＩで切断することにより同定す
る。最終的プラスミド(final plasmid) 、ｐＴＺ−Ｓａ
ｌＦｄＳはＮｏｔＩ部位の欠失として記載しているよう
な逆転ｇｐｔ−遺伝子選択実験を用いたワクシニアウイ
ルス ゲノムへのＳｍａＩ欠失の導入に使用する。但
し、修飾されるべき好ましいウイルスは単離体Ｆ１２．
５であり、ウイルスが単一ＳｍａＩ部位にｇｐｔ遺伝子
カセットを組込まれていることを除く（実施例３参
照）。
【０２５１】エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩのための
部位に生成する挿入は直接分子クローニングにとって有
利である。なぜなら、この酵素は、酵母から単離され、
１８ｍｅｒ部位を認識し、従って、極稀にしかランダム
ＤＮＡ配列を切断しないからである。例えば、Ｉ−Ｓｃ
ｅＩは酵母ゲノムをただ１箇所しか切断しない チエリ
ー，エー．（Ｔｈｉｅｒｒｙ，Ａ．）、ペリン，エー．
（Ｐｅｒｒｉｎ，Ａ．）、ボイヤー，ジェイ．（Ｂｏｙ
ｅｒ，Ｊ．）、フェアヘッド，シー．（Ｆａｉｒｈｅａ
ｄ，Ｃ．）、ドゥジョン，ビー．（Ｄｕｊｏｎ，
Ｂ．）、フレイ，ビー．（Ｆｒｅｙ，Ｂ．）およびシュ
ミッツ，ジー．（Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｇ．）「Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」 １９：１８９〜１９０
（１９９１）。Ｉ−ＳｃｅＩはベーリンガー インコー
ポレーションから市販されている。Ｉ−ＳｃｅＩ部位は
この酵素のための先在部位を有さないベクターに導入さ
れ、従って遺伝子の挿入に使用される単一部位を有す新
規ベクターを作りだすのが好ましい。ワクシニアウイル
スＤＮＡかまたは他のベクターＤＮＡはこのベクターＤ
ＮＡの日常的制限分析により測定できるＩ−ＳｃｅＩ切
断のための部位を含む。
【０２５２】ワクシニアウイルスＤＮＡからのＳｍａＩ
部位の欠失のためにこの第２方法が使用される際、ベク
ターｖｄＴＫを作製するための段階の順序は次に示すよ
うである：ウイルスｖｄＳを生ずるＳｍａＩ部位の欠失
（前記参照）；ＮｏｔＩｇｐｔ−遺伝子カセットをｖｄ
Ｓの単一ＮｏｔＩ部位にクローニングおよびパッケージ
ングして挿入すること（実施例１参照）によるＮｏｔＩ
部位の欠失、ウイルスｖｄＳＮｇｐｔおよび前記逆転ｇ
ｐｔ−選択の生成および、標準釈放実験の基質としての
ｖｄＳＮｇｐｔおよびｐＴＺ−ＳａｃＩｄＮの使用；お
よび本実施例の次に概略するようなｔｋ−遺伝子の欠
失。
【０２５３】ベクターｖｄＴＫを実際に作製することに
よる第２の方法は次のようである。ワクシニア野生型ウ
イルスのＳｍａＩ部位を欠失し、中間体ウイルスｖｄＳ
を作りだした。第２実験において、ＮｏｔＩ部位をワク
シニア野生型ウイルスから欠失し中間体ウイルスｖｄＮ
を作りだした。ＣＶ−１細胞の両ウイルスを用いた共感
染(co-infection)および組換えウイルス〔単一遺伝交叉
現象(simple geneticcross-over event) により作りだ
した〕のＰＣＲスクリーニングによりウイルスｖｄＳＮ
を得た。異なる中間体の生存力(viability) は滴定によ
り測定した。
【０２５４】表４．１ＡはｖｄＮクローニング実験から
の個々の単離体を５度プラーク精製し（野生型ウイルス
フリー クローンを得ることを保証するために）、次い
で増幅させた後の結果を示す。滴定後、最初の増幅の粗
ウイルスストックを野生型対照（ＷＲ−ＷＴ）と共にＣ
Ｖ−１細胞に０．１ｐｆｕ／細胞で感染させるのに使用
した。これらの細胞を４８時間後に収穫し、再び滴定す
る(re-titer)粗ストックを調製するために使用した。こ
れらの結果を表４．１Ｂに示す。単離体ｖｄＮ／Ａ１＃
６．１１１１およびｖｄＮ／Ａ１＃１０．１１１１をそ
れぞれ、クローンｖｄＮ＃６およびｖｄＮ＃１０で表
し、大量ウイルス調製に使用した。
【０２５５】表４．２ＡはｖｄＳクローニング実験の単
一単離体を５度プラーク精製し、次いで増幅させ、滴定
した後の結果を示している。最初の増幅の粗ストックを
野生型対照（ＷＲ−ＷＴ）と共にＣＶ−１細胞に０．１
ｐｆｕ／細胞で感染させるのに使用した。これらの細胞
を４８時間後に収穫し、得られた粗ストックを再び滴定
した。これらの結果を表４．２Ｂに示す。単離体ｖｄＳ
＃７．１１をそれぞれ、クローンｖｄＳ＃２およびｖｄ
Ｓ＃７で表し、大量ウイルス調製に使用した。それぞれ
の場合に、最良の増殖特性を示すウイルス単離体を選択
して増幅させ、大量増殖させた。
【０２５６】
【表２】
【０２５７】
【表３】
【０２５８】欠失したＳｍａＩ部位を有するウイルス
（ｖｄＳＮ）のＰＣＲ−スクリーニングによる同定：欠
失したＳｍａＩ部位を有するｖｄＳＮワクシニアウイル
スのクローンは次のようなＰＣＲスクリーニングにより
同定される。
【０２５９】ＰＣＲ反応のための第１プライマーはオリ
ゴヌクレオチドｏｄＳ２（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７）
であり、更に第２プライマーはオリゴヌクレオチドｏｄ
Ｓ３（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２８）である。オリゴヌク
レオチドｏｄＳ２の配列はワクシニアゲノム中、Ｓｍａ
Ｉ部位の約３４０ｂｐ上流に存在し、一方オリゴヌクレ
オチドｏｄＳ３の配列はこの部位の約３４０ｂｐ下流に
存在する。テンプレートは前記ｖｄＮ同定に記載したよ
うにウイルスプラークで感染させたＣＶ−１細胞のすべ
てのＤＮＡである。約６８０ｂｐのＰＣＲ−増幅バンド
をＳｍａＩに対する感受性について、ＨｉｎｄＩＩＩま
たはＩ−ＳｃｅＩリンカーの挿入を示すＳｍａＩ切断に
対する抵抗性と共に試験し、一方野生型対照ＤＮＡを約
３４０ｂｐの２つの部分に切断する。ＳｍａＩ部位にリ
ンカーの所望の挿入を有するワクシニアウイルスをｖｄ
ＳＮで表す。
【０２６０】ワクシニアウイルスｖｄＳＮからのチミジ
ンキナーゼ遺伝子の暗号化領域の欠失：ワクシニアウイ
ルスｖｄＳＮからの、新規ベクター株（ｖｄＴＫで表
す）はチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の置換により作
られ、これは種々の独自制限エンドヌクレアーゼ切断部
位を含むセグメントと共に、ワクシニアゲノムの遺伝的
に安定な領域に存在する（図１７）。
【０２６１】チミジンキナーゼ（ｔｋ）暗号化配列はま
ずｔｋ遺伝子が存在するワクシニアゲノムのセグメント
（ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊセグメント）を含むプラスミド
（ｐＨｉｎｄＪ−１）から欠失される（図２０）。次い
でｔｋ−遺伝子の代わりに、ＳｆｉＩ部位で横に並ぶＮ
ｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＡｐａＩおよびＲｓｒＩＩを有する
多重クローニング部位が、挿入される。最後に、修飾ウ
イルスセグメントは次いでｖｄＴＫで表されるワクシニ
アウイルスゲノムｖｄＳＮに転移される（図１７）。更
に強制クローニングを促進するため、また２つのＳｆｉ
Ｉ部位のそれぞれもそのベクターにおいてＳｆｉＩ認識
配列（ＧＧＣＣＮＮＮＮ′ＮＧＧＣＣ）の可変性を利用
することにより独自のものとされる場合がある。２つの
ＳｆｉＩ部位の配列は次に示すようである：ＳｆｉＩ
（１）、ＧＧＣＣＧＧＣＴ′ＡＧＧＣＣ（ＳＥＱ．Ｉ
Ｄ．ＮＯ．２９）およびＳｆｉＩ（２）、ＧＧＣＣＡＴ
ＡＴ′ＡＧＧＣＣ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３０）。ｔｋ
遺伝子の最終的修飾を有するこのプラスミド（ｐＨｉｎ
ｄＪ−３）は前駆体プラスミドｐＨｉｎｄＪ−１からル
ープアウト(loop-out)突然変異誘発により作製され、更
にｔｋ−遺伝子の欠失は配列分析により確認される。
【０２６２】前駆体プラスミドｐＨｉｎｄＪ−１の構
造：野生型ワクシニアウィルスＤＮＡをＨｉｎｄIII に
より切断し、生成したフラグメントを０．８％の低融点
アガロースゲルで分離した。ＨｉｎｄIII Ｊフラグメン
トをＵＶ光下で切り取り、標準的な手法により調製し
た。フラグメントをプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ファーマ
シア(Pharmacia) 社）の単一ＨｉｎｄIII 部位に挿入
し、ｐＨｉｎｄＪ−１を生成した。
【０２６３】プラスミドｐＨｉｎｄＪ−２の構造：プラ
スミドｐＨｉｎｄＪ−１を大腸菌菌株ＮＭ５２２にトラ
ンスフェクションし、一本鎖ＤＮＡをファーマシアから
供給されたプロトコールによりヘルパーファージＭ１３
Ｋ０７で重複感染させることにより作った。一本鎖ＤＮ
Ａは、プライマーｏｄＴＫ１（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３
１）を用いる特定部位の指示突然変位誘発の鋳型として
の役割を有する。このプライマーはプロモーター領域お
よびｔｋ−遺伝子の翻訳停止コドンの周囲の領域と相補
的である。この中心部には独自制限部位ＢａｍＨＩ、Ｈ
ｐａＩ、ＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩを含める。この突然
変位誘発方法は、アマーシャム（Amersham) 社により供
給された突然変位キットを用いて、この供給者により与
えられた便覧により実施する。
【０２６４】ｐＨｉｎｄＪ−２を構造について、ｔｋ−
遺伝子配列がウァイア(Weir)Ｊ．Ｐおよびモス(Moss)
Ｂ，「J. Virol. 」４６：５３０〜５３７（１９８３）
に記載されている。このｔｋ−遺伝子配列は、アイデン
ティファイヤー(identifier)（ＩＤ）ＰＶＨＩＮＬＪの
下にＥＭＢＬデータ・ライブラリー(EMBL Data Librar
y) において入手できる。プラスミドのベクター部（ｐ
ＴＺ１９Ｒ）の配列は、ファーマシア社から入手でき
る。プラスミドｐＨｉｎｄＪ−２における欠失ワクシニ
アウィルス チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の周囲の
配列は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４に示している。ｔｋ−
遺伝子の５′領域（一覧表中の塩基＃１〜１９；ＩＤ
ＰＶＨＩＮＬＪにおける塩基＃４５４３〜＃４５６１）
に続き、独自制限部位ＢａｍＨＩ、ＨｐａＩ、ＮｒｕＩ
およびＥｃｏＲＩ並びにｔｋ−遺伝子（一覧表中におけ
る塩基＃４４〜＃６７；ＩＤ ＰＶＨＩＮＬＪにおける
塩基＃５１１９〜＃５１４２）の３′領域が存在する。
ｔｋ−プロモーターおよびｔｋ−遺伝子暗号領域の部分
を含むＩＤ ＰＶＨＩＮＬＪにおける塩基＃４５６２〜
５１１８はｐＨｉｎｄＪ−２から欠失している。
【０２６５】プラスミドｐＨｉｎｄＪ−３の構造：プラ
スミドｐＨｉｎｄＪ−２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ
により消化し、ｓｆｉＩ部位が横に並んだ独自制限部位
ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＲｓｒIIおよびＡｐａＩを含む二
本鎖リンカーを挿入した。このリンカーは、オリゴヌク
レオチドＰ−Ｊ（１）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３２）お
よびＰ−Ｊ（２）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３３）から成
る。ｐＨｉｎｄＪ−３の修飾配列をＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
Ｏ．５に示す。挿入した多重クローニング部位はオリゴ
ヌクレオチドＰ−Ｊ（１）に相当する。この挿入した配
列は位置２１において開始し、位置９９において終了す
る。横に並んだ配列（flanking sequences) は上記のｐ
ＨｉｎｄＪ−２に記載したものと同一であった。
【０２６６】ｔｋ欠失をワクシニアウィルスに挿入する
ために、プラスミドｐＨｉｎｄＪ−３をＨｉｎｄIII に
より消化し、ｔｋ遺伝子欠失を有する短縮されたＨｉｎ
ｄIII Ｊフラグメントを、サム(Sam) およびダンベル(D
umbell) （１９８１）により記載されたように標識釈放
実験に用いた。ｔｋ遺伝子が欠失したウィルスをｔｋ陰
性選択（マケット(Mackett) ら，１９８２）により分離
し、その後ＰＣＲスクリーニングにより同定した。特
に、ｐＨｉｎｄＪ−３に存在する修飾ＨｉｎｄIII フラ
グメントをＨｉｎｄIII により切り取り、低融点アガロ
ースゲルで分離した。標識釈放は、基本的にサムおよび
ダンベル（１９８１）により記載されたように、以下の
修飾により実施した。５×１０6 ＣＶ−１細胞を細胞あ
たり０．２ｐｆｕのワクシニアウィルスｖｄＳＮにより
感染させた。１時間の温置後、１μｇの修飾ＨｉｎｄII
I Ｊフラグメントを含むリン酸カルシウム沈殿１ｍｌを
感染した細胞内にトランスフェクションした。２日間の
成長の後、粗ウィルス ストックを実施例１に記載した
ように調製し、マケットら（１９８２）により記載され
たようにブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の存在下
でヒト１４３Ｂｔｋ陰性細胞で滴定した。ｔｋ陰性プラ
ークは、さらにＰＣＲスクリーニングにより分析するこ
とができる。
【０２６７】ＰＣＲスクリーニングによるチミジンキナ
ーゼ欠失ウィルス（ｖｄＴＫ）の同定：ＰＣＲ反応のた
めの第１のプライマーは、オリゴヌクレオチドｏｄＴＫ
２（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３４）であり、この配列はｔ
ｋ遺伝子の約３００ｂｐ上流に位置する。第２のプライ
マーｏｄＴＫ３（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３５）は、ｔｋ
遺伝子の停止コドンの約２２０ｂｐ下流に位置する。鋳
型は、ｖｄＮスクリーニングに記載したようにウィルス
プラークにより感染したＣＶ−１細胞の全ＤＮＡであ
る。ｔｋ遺伝子欠失を有するウィルスから生成した増幅
生成物は約５２０ｂｐであり、一方野生型の対照は約
１．１ｋｂのフラグメントを生成する。
【０２６８】ｖｄＴＫベクターへの転移のための遺伝子
形質発現カセットを有するプラスミドの構造：プラスミ
ドｐＡ０は、ｖｄＴＫワクシニアウィルスベクターのマ
スタークローニング部位の独自部位から成るマスターク
ローニング部位を有する基本プラスミドである。図２１
に示すように、プラスミドｐＡ０を、市場で入手できる
プラスミドの多重クローニング部位を、ｖｄＴＫベクタ
ーおよびＸｈｏＩ部位の独自部位から成るセグメントで
置き換えることにより構成する。特に、Ｐブルースクリ
プトIIＳＫファーゲミド(phagemid)（ストラタジーン
（Stratagene) ）の多重クローニング部位を欠失させる
ために、プラスミドをＳａｃＩおよびＡｓｐ７１８によ
り消化した。大きなベクターフラグメントをアニーリン
グしたオリゴヌクレオチドＰ−Ａ（０．１）（ＳＥＱ．
ＩＤ．ＮＯ．３６）およびＰ−Ａ（０．２）（ＳＥＱ．
ＩＤ．ＮＯ．３７）を有するアダプターとつないだ。
【０２６９】ｐＡ０の多重クローニング部位（オリゴヌ
クレオチドＰ−Ａ（０．１）に相当する）並びに２０塩
基のＰブルースクリプトIIＳＫ−の５′−および３′−
横配列領域をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６に示す。挿入体は
位置２１において開始し、位置９５において終了する。
（５′末端における第１の「Ａ」残留物はプラスミドｐ
Ａ０の位置番号２１８７に相当し、３′末端における最
終の「Ｇ」残留物は位置番号２３０１に相当する。）
【０２７０】プラスミドｐＡ１およびｐＡ２の構造：プ
ラスミドｐＡ１およびｐＡ２をＤＮＡセグメント、すな
わち、合成または天然プロモーターフラグメントの挿入
のために構成した。これらを、ｐＡ０を切断しないフリ
ークエントリー・カッティング酵素の第２の多重クロー
ニング部位を有するリンカーをｐＡ０のＸｈｏＩ部位内
に挿入することにより構成した。両方のプラスミドは、
第２の多重クローニング部位の配向を除いて同一の構造
を有する（図２１）。ｐＡ０プラスミドをＸｈｏＩによ
り消化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＰ−Ａ
（１．１）およびＰ−Ａ（１．２）を有するアダプター
とつないだ。両方の可能な配向のアダプターのプラスミ
ドを分離し、これらはｐＡ１およびｐＡ２と称すること
にした。
【０２７１】ｐＡ１の多重クローニング部位（オリゴヌ
クレオチドＰ−Ａ（１．１）に相当する）並びに２０塩
基のｐＡ０の５′−および３′−横配列領域をＳＥＱ．
ＩＤ．ＮＯ．７に示す。挿入体は位置２１において開始
し、位置８３において終了する。（５′末端における第
１の「Ｃ」残留物はプラスミドｐＡ１の位置番号２２２
２に相当し、３′末端における最終の「Ｃ」残留物は位
置番号２３２４に相当する。）ｐＡ２の多重クローニン
グ部位（オリゴヌクレオチドＰ−Ａ（１．２）に相当す
る）並びに２０塩基のｐＡ２の５′−および３′−末端
をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０に示す。挿入体は位置２１
において開始し、位置１９５において終了する。（５′
末端における第１の「Ｃ」残留物はプラスミドｐＡ２−
Ｓ１の位置番号２２５２に相当し、３′末端における最
終の「Ｇ」残留物は位置番号２４６６に相当する。）
【０２７２】プラスミドｐＡ１−Ｓ１およびｐＡ２−Ｓ
１の構造：プラスミドｐＡ１−Ｓ１およびｐＡ２−Ｓ１
は、関連する読み始めコドンが存在しない読み取り枠の
挿入に適した単一ＥｃｏＲＩ部位が続く翻訳読み始めコ
ドンを含む強力な合成ポックスウィルスプロモーターＳ
１を与える。プロモーターＳ１はＰ２と称する強力なポ
ックスウィルス後期プロモーターの修飾形態である。プ
ラスミドｐＡ１−Ｓ１およびｐＡ２−Ｓ１は、第１の二
本鎖プロモーターフラグメントをそれぞれｐＡ１または
ｐＡ２のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位に、強制クロー
ニングにより挿入することにより得られる（図２２の
Ａ）。特に、ベクターｐＡ１をＮｄｅＩおよびＢａｍＨ
Ｉにより消化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチド
Ｐ−Ｐ２ｍ１．１およびＰ−Ｐ２ｍ１．２から成るアダ
プターとつないだ。生成したプラスミドはｐＡ１−Ｓ１
と称する。
【０２７３】ｐＡ１−Ｓ１の合成プロモーター配列（オ
リゴヌクレオチドＰ−Ｐ２ｍ１．１に相当する）並びに
２０塩基のｐＡ１の５′−および３′−横配列領域をＳ
ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９に示す。挿入体は位置２１におい
て開始し、位置１９３において終了する。（５′末端に
おける第１の「Ｃ」残留物はプラスミドｐＡ１−Ｓ１の
位置番号２２２８に相当し、３′末端における最終の
「Ｇ」残留物は位置番号２４４０に相当する。）ベクタ
ーｐＡ２をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより消化し、上
記ｐＡ１−Ｓ１に関して、アニーリングしたオリゴヌク
レオチドＰ−Ｐ２ｍ１．１およびＰ−Ｐ２ｍ１．２を含
むアダプターとつないだ。生成したプラスミドはｐＡ２
−Ｓ１と称する。
【０２７４】ｐＡ２−Ｓ１の合成プロモーター配列（オ
リゴヌクレオチドＰ−Ｐ２ｍ１．２に相当する）並びに
２０塩基のｐＡ２の５′−および３′−横配列領域をＳ
ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０に示す。挿入体は位置２１にお
いて開始し、位置１９５において終了する。（５′末端
における第１の「Ｃ」残留物はプラスミドｐＡ２−Ｓ１
の位置番号２２５２に相当し、３′末端における最終の
「Ｇ」残留物は位置番号２４６６に相当する。）
【０２７５】プラスミドｐＡ１−Ｓ２およびｐＡ２−Ｓ
２の構造：プラスミドｐＡ１−Ｓ２およびｐＡ２−Ｓ２
は、ダビソン(Davison) およびモス(Moss)、「J. Mol.
Biol. 」２１０：７７１〜７８４（１９８９）により記
載された強力な後期合成ポックスウィルスプロモーター
の修飾された形態である強力な合成プロモーターＳ２を
含む。これらのプラスミドはプロモーターにより翻訳読
み始めコドンを提供せず、従って読み始めコドンを有す
る完全な読み取り枠に挿入するのに適する。これらのプ
ロモーターは、これら２つのプラスミド内のｖｄＴＫマ
スタークローニング部位に関して異なる配合を有する。
プラスミドｐＡ１−Ｓ２およびｐＡ２−Ｓ２は、第２の
二本鎖プロモーターフラグメントをそれぞれｐＡ１およ
びｐＡ２のＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ部位に強制クロー
ニングすることにより得られる（図２３のＡ）。特に、
プラスミドｐＡ１を酵素ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩによ
り消化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＰ−ａ
ｒｔＰ（５）およびＰ−ａｒｔＰ（６）から成る合成リ
ンカー配列とつないだ。生成したプラスミドはｐＡ１−
Ｓ２と称する。
【０２７６】ｐＡ１−Ｓ２の合成プロモーター配列（オ
リゴヌクレオチドＰ−ａｒｔＰ（５）に相当する）並び
に２０塩基のｐＡ１の５′−および３′−横配列領域を
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１に示す。挿入体は位置２１に
おいて開始し、位置６８において終了する。（５′末端
における第１の「Ｔ」残留物はプラスミドｐＡ１−Ｓ２
の位置番号２２４０に相当し、３′末端における最終の
「Ａ」残留物は位置番号２３２７に相当する。）同様
に、プラスミドｐＡ２を酵素ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ
により消化し、ｐＡ１−Ｓ２に関して、アニーリングし
たオリゴヌクレオチドＰ−ａｒｔＰ（５）およびＰ−ａ
ｒｔＰ（６）とつないだ。生成したプラスミドはｐＡ２
−Ｓ２と称する。ｐＡ２−Ｓ２の合成プロモーター配列
（オリゴヌクレオチドＰ−ａｒｔＰ（６）に相当する）
並びに２０塩基のｐＡ２の５′−および３′−横配列領
域をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２に示す。挿入体は位置２
１において開始し、位置７２において終了する。（５′
末端における第１の「Ｔ」残留物はプラスミドｐＡ２−
Ｓ２の位置番号２２６３に相当し、３′末端における最
終の「Ａ」残留物は位置番号２３５４に相当する。）
【０２７７】読み取り枠をプラスミドｐＡ１−Ｓ１、ｐ
Ａ２−Ｓ１、ｐＡ１−Ｓ２またはｐＡ２−Ｓ２のすべて
に挿入した後、形質発現カセット全体を切り取り、ウィ
ルスベクターｖｄＴＫ内の相当する部位に強制クローニ
ングすることにより挿入することができる。カセットは
ウィルスゲノム中に、用いるクローニングプラスミドに
よりいずれの配向においても挿入することができる。
【０２７８】形質発現カセットおよび選択マーカー（ｐ
Ｎ２ｇｐｔ−Ｓ３ＡおよびｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４）を有す
るプラスミドの構造：上に記載した強制クローニング用
に構成したプラスミドに加えて、２つの付加的なプラス
ミドを転移遺伝子用にポックスウィルスベクター中の独
自（ＮｏｔＩ）部位中に大腸菌ｇｐｔ選択性マーカー遺
伝子の補助により構成した。これらはまた、上に記載し
たＳ１およびＳ２プロモーターに加えて２つの付加的な
ポックスウィルスプロモーターを提供した。
【０２７９】プラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３Ａ（図２
５）を用いて、これら自体の開始コドンが欠失した読み
取り枠を挿入することができる。ワクシニアウィルス中
に転移される遺伝子（ｇｐｔマーカーおよび読み取り
枠）をＮｏｔＩ単独でまたは２つの酵素、例えばＮｏｔ
ＩおよびＳｍａＩ（またはＲｓｒIIまたはＡｐａＩ）に
より切り取ることができる。切り取ったフラグメントを
次にウィルスベクターｖｄＴＫの相当する部位に挿入す
る。プラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４（図２５）を用い
て、ＡＵＧ翻訳読み始めコドンを含む、完全な読み取り
枠を挿入することができる。ｇｐｔ標識遺伝子から成る
カセットおよび読み取り枠をｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３Ａにつ
いて記載したように切り取ることができる。プロモータ
ーＳ３ＡおよびＳ４は強力なポックスウィルス後期プロ
モーターの修飾形態である。
【０２８０】これらのプラスミドは、第１に、ＮｏｔＩ
（図３）を含む若干の独自制限部位が横に並んだワクシ
ニアウィルスＰ７．５プロモーターにより駆動された大
腸菌ｇｐｔ遺伝子を含むプラスミドｐＮ２−ｇｐｔａお
よびｐＮ２−ｇｐｔｂ（図２４）を作成することにより
構成した。Ｓ３ＡまたはＳ４プロモーターフラグメント
をｐＮ２−ｇｐｔｂ中の独自のＰｓｔＩおよびＣｌａＩ
部位に挿入した結果プラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３Ａお
よびｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４が生成した。
【０２８１】プラスミドｐＮ２−ｇｐｔａおよびｐＮ２
−ｇｐｔｂの構造：実施例１および図２４参照。
【０２８２】プラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３Ａの構造：
親プラスミドｐＮ２−ｇｐｔｂをＰｓｔＩおよびＣｌａ
Ｉにより消化し、オリゴヌクレオチドＰ−ａｒｔＰ
（７）およびＰ−ａｒｔＰ（８）（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
Ｏ．４０）から成る合成リンカー配列とつないだ。生成
したプラスミドはｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３Ａと称する。ｐＮ
２ｇｐｔ−Ｓ３Ａの合成プロモーター配列（オリゴヌク
レオチドＰ−ａｒｔＰ（７）に相当する）並びに２０塩
基のｐＮ２−ｇｐｔｂの５′−および３′−横配列領域
をｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３ＡとしてＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１
３に示す。挿入されたＤＮＡ配列は位置２１において開
始し、位置１０７において終了する。（５′末端におけ
る第１のＴ残留物はプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３Ａの
位置番号３３２８に相当し、３′末端における最終のＡ
残留物は位置番号３４５４に相当する。）
【０２８３】プラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４の構造：プ
ラスミドｐＮ２−ｇｐｔｂをＰｓｔＩおよびＣｌａＩに
より消化し、オリゴヌクレオチドＰ−ａｒｔＰ（９）お
よびＰ−ａｒｔＰ（１０）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４
１）から成るアダプター配列とつないだ。生成したプラ
スミドはｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４と称する。ｐＮ２ｇｐｔ−
Ｓ４の合成プロモーター配列（オリゴヌクレオチドＰ−
ａｒｔＰ（９）に相当する）並びに２０塩基のｐＮ２−
ｇｐｔｂの５′−および３′−横配列領域をｐＮ２ｇｐ
ｔ−Ｓ４としてＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４に示す。挿入
されたＤＮＡ配列は位置２１において開始し、位置１１
４において終了する。（５′末端における第１の「Ｔ」
残留物はプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４の塩基＃３３２
８に相当し、３′末端における最終の「Ａ」残留物は塩
基＃３４６１に相当する。）
【０２８４】実施例５ 遺伝子形質発現カセットの直接分子挿入によるワクシニ
アウィルスベクター（ｖｄＴＫ）におけるポリペプチド
の形質発現 本実施例は、クローン化した遺伝子を、実施例４に記載
した遺伝子形質発現カセットの直接分子挿入を用いてポ
ックスウィルス形質発現構造の急速な形成に用いる本発
明のワクシニアウィルスベクター（ｖｄＴＫ）に挿入す
ることができる可能性を示す。ここで、ｖｄＴＫベクタ
ー−カセット系を用いて若干の特定のモデルポリペプチ
ドの形質発現に用いる構造を作成することをヒト血液タ
ンパク質（プロトロビンおよびプラスミノーゲンの異
形）並びにヒトウィルス抗原（ＨＩＶｇｐ１６０）を含
めて記載した。
【０２８５】ヒトプロトロビンを発現する修飾したワク
シニアウィルス（ｖＰＴ１）の構造：ヒトプロトロビン
（ＰＴ）は、本発明のワクシニアウィルスベクターの外
来タンパク質形質発現のモデルとして作用する。プロト
ロビンを暗号化するｃＤＮＡは以前、ファルクナー(Fal
kner) らによる特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９１／００１３９
（「ファルクナー出願」）に開示されているように、従
来構成されている組み換え体ワクシニアウィルスにより
発現可能であることが示され、この全出願をここに参照
文献として包含した。
【０２８６】修飾プロトロビンｃＤＮＡを２．０ｋｂ
ＥｃｏＲＩフラグメントとしてプラスミドｐＴＫｇｐｔ
−ＰＴＨＢｂから切り取り、プラスミドｐＡ１−Ｓ１
（実施例４、図２２）の単一のＥｃｏＲＩ部位に挿入
し、プラスミドｐＡ１Ｓ１−ＰＴ（図２６）を生成し
た。このプラスミドの形質発現カセットにおいて、プロ
トロビンｃＤＮＡを、翻訳読み始めコドンを提供する合
成ポックスウィルスプロモーターＳ１により駆動した。
ヒトプロトロビンの配列は刊行された：デーゲン(Dege
n) Ｓ．Ｊ．Ｆ．，マックギリブレイ(MacGillivray)
Ｒ．Ｔ．Ａ．およびダビー(Davie) ，Ｅ．「Biochemist
ry」２２：２０８７〜２０９７（１９８３）。この配列
は、アイデンティファイヤー（ＩＤ）ＨＳＴＨＲ１の下
にＥＭＢＯ・データ・ライブラリーにおいて入手でき
る。ＩＤ ＨＳＴＨＲ１における配列は不完全である；
これは、プロトロビン暗号領域の最初の１９ｂｐが欠失
している。本発明者らは、ＩＤ ＨＳＴＨＲ１における
ｃＤＮＡの欠失した部分の配列を決定し、これを以下に
示す。多くの修飾および塩基の変化により、Ｓ１プロモ
ーターおよび２０塩基のプラスミドの横に並んだ配列を
含むこのヒトプロトロビンｃＤＮＡクローンの全配列を
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５に示す。
【０２８７】ファルクナー出願（ＰＣＴ／ＥＤ−９１／
００１３９）で概説した処理工程により、ｃＤＮＡを以
下のように修飾した：２つの付加的なコドン（塩基＃２
２〜２７）を導入し、２つの新規なアミノ酸を包含さ
せ；３′−未翻訳配列をＥｃｏＲＩ部位の導入により除
去し：塩基＃１９６３〜１９６５（＃１９２０〜１９２
２ ＩＤ ＨＳＴＨＲ１）を、特定部位の突然変異誘発
によりＴＧＧからＧＡＡに変化させた。一つの塩基対の
変化はこのＰＴ−ｃＤＮＡ中に見出され、この結果新規
なＮｃｏＩ部位が形成された：塩基＃５２５（ＩＤ Ｈ
ＳＴＨＲ１における＃４８２）がＣからＡに変化した。
これは、ＣＣＣコドン（Ｐｒｏ）がＣＣＡ（Ｐｒｏ）に
変化し、この結果新規なＮｃｏＩ部位が形成されたた
め、沈黙突然変位である。（ｐＡ１Ｓ１−ＰＴからのＳ
ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５における第１の塩基はプラスミ
ドｐＡ１Ｓ１−ＰＴの全配列の塩基＃２３９４に対応
し、最後の塩基は＃４３８１に対応する。）
【０２８８】ワクシニアウィルスベクターｖｄＴＫへの
転移のために、カセットをプラスミドｐＡ１Ｓ１−ＰＴ
からＮｏｔＩおよびＲｓｒIIエンドヌクレアーゼにより
切り取り、低融点アガロースゲルでの分離の後単離し
た。ウィルスベクターｖｄＴＫＤＮＡをＮｏｔＩおよび
ＲｓｒIIにより切断し、フェノールで抽出し、エタノー
ルで沈殿させた。ベクターＤＮＡの多量クローニング部
位の小さなＮｏｔＩ−ＲｓｒII結合フラグメントは、エ
タノール沈殿工程の間に欠失した。ワクシニアベクター
アームを２０倍のモル過剰量のカセットによりつない
だ。ニワトリ細胞における鶏痘ヘルパーウィルスにより
つながれたワクシニアウィルスＤＮＡのパッケージング
は実施例３に示した。ＣＶ−１細胞における感染により
形成したプラークからのパッケージされたウィルスは再
び精製されたプラークであり、小さな粗ストックを調製
した。分離されたウィルスをさらにサザンブロッティン
グにより分析することができ、形質発現分析をファルク
ナー出願に記載されたように実施することができる。プ
ロトロビンｃＤＮＡの挿入のための正確なゲノム構造を
有するウィルス分離体はｖＰＴ１と呼ばれる。標識釈放
により生成した類似の組換え体ワクシニアウィルスを、
細胞培養物上澄み液の約５０〜６０ｍＵ／ｍｌのレベル
の活性においてベロ(Vero)細胞中のプロトロビン形質発
現を誘発した。ファルクナー出願参照。
【０２８９】ヒトｇｌｕ−プラスミノーゲンを発現する
ワクシニア（ｖＧＰｇ１）の構造：天然の形態のプラス
ミノーゲン（Ｐｇはアミノ酸グルタミン酸（ｇｌｕ）で
始まるアミノ末端を有し、従ってｇｌｕ−プラスミノー
ゲン（ｇｌｕ−Ｐｇ）と称する。最初の７７のアミノ末
端アミノ酸（活性ペプチド）が欠失した部分的に加工し
た形態のプラスミノーゲンはｌｙｓ−プラスミノーゲン
（ｌｙｓ−Ｐｇ）と称する。ｌｙｓ−Ｐｇのこの基質フ
ィブリンに対する親和性はｇｌｕ−Ｐｇよりもはるかに
高い。さらに、組換えｌｙｓ−Ｐｇは、ｇｌｕ−Ｐｇ遺
伝子を運搬する（従来の）ワクシニア組換え体により感
染した細胞培養物の上澄み液中のｇｌｕ−Ｐｇより顕著
に安定である。
【０２９０】完全なヒトプラスミノーゲンｃＤＮＡ（こ
の翻訳読み始めおよび停止コドンを含む）をプラスミド
（ｐｂＰｌａｓ−６）からＢａｌＩ−ＳｍａＩフラグメ
ントとして切り取った。ヒトプラスミノーゲンの配列は
フォースグレン(Forsgren)Ｍ，ラデン(Raden) Ｂ，イス
ラエルソン(Israelsson)Ｍ，ラーソン(Larsson) Ｋおよ
びヘデン(Heden) Ｌ−Ｏ，「FEBS Letters」２１３：２
５４〜２６０（１９８７）に記載され、アイデンティフ
ァイヤー（ＩＤ）ＨＳＰＭＧＲの下でＥＭＢＯ・データ
・ライブラリー（ゲンバンク(GenBank) ）において入手
できる。従って、このプラスミドはプラスミノーゲンＤ
ＮＡ配列の独自の源でないため、このプラスミドの配列
は、インスタント配列リスティングに含まれていなかっ
た。しかし、このプラスミノーゲン配列の暗号化領域
は、記載された配列と、少なくとも１つのヌクレオチド
において異なる：位置＃１１２（ＩＤ ＨＳＰＭＧＲ）
における「Ａ」残留物はインスタントＤＮＡにおいて
「Ｇ」残留物であり、この結果１つのアミノ酸置換（Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｕ）が発生する。
【０２９１】プラスミノーゲンｃＤＮＡを、選択マーカ
ーにより遺伝子形質発現カセットの構成のために選択さ
れたプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４（実施例４、図２
５）のＨｐａＩ部位に挿入した。これは、プラスミノー
ゲンｃＤＮＡが２つのＡｐａＩ部位および１つのＲｓｒ
II部位を含み、従って強制クローニングのために作成さ
れた形質発現カセットが使用できなくなるためである。
生成したプラスミドはｐＮ２ｇｐｔ−ＧＰｇ（図２７）
と呼ばれる。プラスミノーゲンの開始コドン（一覧表中
の塩基＃３２；ＩＤ ＨＳＰＭＧＲにおける塩基＃５
５）を含むＳ４プロモーターの接合領域をｐＮ２ｇｐｔ
−ＧＰｇとしてＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７に示す。ｇｌ
ｕ−プラスミノーゲンの暗号領域は、配列リスティング
において省略した。配列は停止コドン（一覧表中の塩基
＃３５；ＩＤ ＨＳＰＭＧＲにおける塩基＃２４８５）
および３′−未翻訳プラスミノーゲン配列の２５塩基に
連続している。この配列の後にｐｈＰｌａｓ６の多重ク
ローニング部位の２９塩基およびプラスミドｐＮ２ｇｐ
ｔ−Ｓ４の多重クローニング部位の２０塩基が続く。
【０２９２】ｇｌｕ−プラスミノーゲン遺伝子カセット
をワクシニアウィルスゲノム中に転移させるために、２
つの遺伝子およびこれらのプロモーター（ｇｐｔ−選択
マーカーを調節するＰ７．５プロモーターおよびｇｌｕ
−プラスミノーゲン遺伝子を調節するＳ４−プロモータ
ー）を含むｐＮ２ｇｐｔ−ＧＰｇのＮｏｔＩフラグメン
トを低融点アガロースゲルから分離して精製した。この
カセットをＮｏｔＩにより切断されたワクシニアウィル
スｖｄＴＫ ＤＮＡのアームでつないだ。パッケージン
グおよびプラーク精製は実施例３に記載した。挿入され
たプラスミノーゲン遺伝子カセットの正確な構造を有す
るウィルスはｖＮ２ｇｐｔ−ＧＰｇと称する。このウィ
ルスは、標識釈放手法により構成された類似のワクシニ
アウィルスとして記載したＣＶ−１細胞内のプラスミノ
ーゲンの形質発現に用いられる。細胞培養上澄み液中の
分泌されたｇｌｕ−Ｐｇを、細胞培養物中の外来のタン
パク質の形質発現のワクシニアウィルスベクターの培養
のための標準条件下で従来構成されているワクシニアウ
ィルスで２４時間感染させた後に約１．５μｇ／１０6
細胞のレベルで検出した。細胞培養物上澄み液中のｇｌ
ｕ−プラスミノーゲンは、プロテアーゼ阻害剤（５０μ
ｇ／ｍｌのアプロチニン）の存在下でのみ検出可能であ
った。
【０２９３】ヒトｌｙｓ−プラスミノーゲンを発現する
ワクシニアウィルス（ｖＬＰｇｌ）の構造：ｌｙｓ−プ
ラスミノーゲンを暗号化する配列を、図２８に示すよう
に、完全なプラスミノーゲンｃＤＮＡから最初の７７の
アミノ酸（Ｇｌｕ１〜Ｌｙｓ７７）のプラスミノーゲン
として２３１ｂｐ暗号領域を欠失させることにより調製
した。この配列を、選択性マーカー遺伝子（大腸菌ｇｐ
ｔ）を有するプラスミド（ｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４）の遺伝
子形質発現カセットに挿入し、ｐＮ２ｇｐｔ−ＬＰｇと
称するプラスミドを生成した（図２８）。このプラスミ
ドにおいて、前配列（分泌を媒介するシグナルペプチド
を暗号化する）をプラスミノーゲン中のリジン残留物７
８の第１のヌクレオチドと直接融和させた。この融和に
より生成した新規なシグナルペプチド切断部位は多くの
既知のシグナル切断部位に類似している。例えばフォン
・ハインジェ(von Heinje)，「Eur. J. Biochem.」１３
３：１７〜２１（１９８３）参照。さらに、ＮｏｃＩ部
位をＰｇ ｃＤＮＡの開始コドンの部位に導入して、プ
ラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４の単一のＮｃｏＩ部位中へ
のクローニングを促進し、プロモーターおよびＰｇ−暗
号領域の最適な情況を達成した。Ｐｇ ｃＤＮＡのＮｃ
ｏＩによる切り取りを促進するために、２つの内部Ｎｃ
ｏＩ部位の１つ（ＮｃｏＩ（２）；図２８）を以下のよ
うにＰｇ ｃＤＮＡから欠失させた。
【０２９４】プラスミドｐｈＰｌａｓ６を大腸菌菌株Ｎ
Ｍ５２２中に転移し、一本鎖ＤＮＡをヘルパーファージ
Ｍ１３Ｋ０７で重複感染させることにより作った。第１
回の突然変異誘発を２つのオリゴヌクレオチド、ｏＮｃ
ｏ１およびｏＮｃｏ２により、一本鎖ｐｈＰｌａｓ６
ＤＮＡを鋳型として用いて市場で入手できる突然変位キ
ット（アマーシャム社）により実施した。オリゴヌクレ
オチドＮｃｏ１はプラスミノーゲン読み始めコドンの上
流の２つのＡ残留物を２つのＣ残留物に転化し、プラス
ミノーゲン前配列(pre-sequence)の暗号領域を変化させ
ずに読み始めコドンの周囲のＮｃｏＩ部位を生成した。
オリゴヌクレオチドｏＮｃｏ２は、ＰｇｃＤＮＡの内部
ＮｃｏＩ部位（ＮｃｏＩ（２））内のＴをＣ残留物に転
化し、このＮｃｏＩ部位を不活性化させる沈黙突然変位
を発生させた。
【０２９５】プラスミノーゲンのアミノ酸１〜７７に対
する暗号領域を、４２塩基オリゴヌクレオチドｏＮｃｏ
３を用いて第２のループアウト突然変位誘発工程により
欠失させた。全ての突然変位が配列決定および制限分析
により確認された。３つの突然変位、ｐｈＬｐｌａｓを
有するプラスミドをＳｍａＩにより直線化し、ＮｃｏＩ
により部分的に消化した。２．２ｋｂ ＮｃｏＩ−Ｓｍ
ａＩフラグメントを分離し、ＮｃｏＩおよびＳｍａＩに
より切断したプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４中に挿入し
た。生成したプラスミドはｐＮ２ｇｐｔ−ＬＰｇと呼ば
れる。
【０２９６】ｐＮ２ｇｐｔ−ＬＰｇにおけるプラスミノ
ーゲンｃＤＮＡの多くの修飾により、２０塩基のＳ４プ
ロモーターおよび２０塩基のｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４の下流
プラスミド領域を含むｐＬｐｌａｓのＮｃｏＩ−Ｓｍａ
Ｉフラグメントの全配列をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８に
示す。プラスミノーゲンｃＤＮＡ配列を以下のように修
飾した：位置＃１９および＃２０における前期の２つの
Ａ残留物（ＩＤ ＨＳＰＭＧＲにおける塩基＃５３およ
び５４）を２つのＣ残留物に変化させてＮｃｏＩ部位を
生成し；一覧表中の塩基＃２１（ＩＤ ＨＳＰＭＧＲに
おける＃５５）がプラスミノーゲン読み始めコドンのＡ
残留物であり；塩基＃２２２０（ＩＤＨＳＰＭＧＲにお
ける＃２４８５）が停止コドンのＴ残留物であり；ＩＤ
ＨＳＰＭＧＲにおける塩基＃１１１（一覧表中の塩基
＃７７）をＩＤ ＨＳＰＭＧＲにおける塩基＃３４３
（一覧表中の塩基＃７８）と接合して「活性ペプチド」
を暗号化する配列を欠失させ；Ｔ残留物＃９２６（ＩＤ
ＨＳＰＭＧＲにおける塩基＃１１９１）をＣ残留物に
変化させ（保存変化）て内部ＮｃｏＩ部位を消失させ
た。
【０２９７】ｌｙｓ−プラスミノーゲン遺伝子カセット
をワクシニアウィルスゲノムに転移させるために、２つ
のプロモーター−遺伝子結合体（Ｐ７．５プロモーター
−ｇｐｔ遺伝子およびＳ４プロモーター−ｌｙｓ−プラ
スミノーゲン遺伝子）から成る遺伝子形質発現カセット
を含むｐＮ２ｇｐｔ−ＬＰｇのＮｏｔＩフラグメントを
ワクシニアウィルスｖｄＴＫベクターＤＮＡを切断した
ＮｏｔＩとつなぎ、実施例７に示すようにパッケージし
た。ｖＮ２ｇｐｔ−ＬＰｇと称する、挿入された遺伝子
カセットの正確な構造を有する単離体を、細胞培養物中
のタンパク質の生成のためのワクシニアウィルス形質発
現ベクターの培養のための標準条件下で前に従来構成さ
れている組換え体に用いた条件下でＣＶ−１細胞のｌｙ
ｓ−プラスミノーゲンの形質発現に用いた。細胞培養物
上澄み液中の分泌されたｌｙｓ−Ｐｇを、従来の組換え
体により２４時間感染させた後約１．０〜２．０μｇ／
１０6 細胞のレベルで検出した。細胞培養物上澄み液中
のｌｙｓ−プラスミノーゲンは、プロテアーゼ阻害剤を
加えずに安定であった。
【０２９８】ヒト免疫不全ウィルス糖タンパク質１６０
（ＨＩＶｇｐ１６０）を発現するワクシニアウィルス
（ｖｇｐ１６０−１）の構造：ＨＩＶｇｐ１６０の完全
な読み取り枠をＭ１３ファージの複製型分子（ＲＦ）Ｄ
ＮＡから切り取ったものを含む２．５ｋｂ ＥｃｏＲＶ
フラグメント上に得た〔ｍｐＰＥｅｎｖ；フュエルスト
(Fuerst)ら，「Mol. Cell. Biol.」７：２５３８〜２５
４４（１９８７）〕。このフラグメントを図２９に概説
したようにプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４中に挿入し
た。生成したプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−ｇｐ１６０にお
いて、ｇｐ１６０遺伝子を合成ワクシニアプロモーター
Ｓ４により調節した。
【０２９９】ＨＩＶｇｐ１６０の配列は、ラットナー(R
atner)，Ｌ．ら，「Nature」３１３：２７７〜２８４
（１９８５）に記載された。クローンＢＨ８の配列は、
アイデンティファイヤー（ＩＤ）ＨＩＶＨ３ＢＨ８の下
でＥＭＢＯ・データ・ライブラリー（ゲンバンク）にお
いて入手できる。従って、ｇｐ１６０の配列はＳＥＱ．
ＩＤ．ＮＯ．１９に含めないが、Ｓ４プロモーターとｇ
ｐ１６０遺伝子の開始コドンを含むＥｃｏＲＶ ＨＩＶ
−ｇｐ１６０フラグメントとの接合領域（一覧表中の塩
基＃２８；ＩＤ ＨＩＶＨ３ＢＨ８における塩基２２
６）を示す。ＥｃｏＲＶ ＨＩＶ−ｇｐ１６０フラグメ
ントは、フュエルスト，Ｔ．Ｒ．，アール(Earl)，Ｐ．
およびモス，Ｂ．「Mol Cell. Biol. 」７：２５３８〜
２５４４（１９８７）に記載されたＭ１３ファージ（複
製型形態）ｍｐＰＥｅｎｖから生じる。この配列は、停
止コドン（一覧表中の塩基＃３１；ＩＤ ＨＩＶＨ３Ｂ
Ｈ８における塩基＃２７７９）および下流のＥｃｏＲＶ
部位の半分に連続する。この配列の後に２０塩基のプラ
スミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４の多重クローニング部位が続
く。一覧表中の第１の塩基（Ｔ）はｐＮ２ｇｐｔ−ｇｐ
１６０の配列における塩基＃３３６８に相当し、最終の
塩基（Ｇ）は＃５９７３に相当する。
【０３００】ＨＩＶｇｐ１６０遺伝子形質発現カセット
をワクシニアウィルスゲノム中に転移させるために、両
方の遺伝子−プロモーター結合体（Ｐ７．５プロモータ
ー−ｇｐｔ選択マーカーおよびＳ４プロモーター−ｇｐ
１６０遺伝子）を含む、ＮｃｏＩフラグメントをワクシ
ニアウィルスベクターｖｄＴＫのＮｏｔＩで切断したＤ
ＮＡにつなぎ、実施例７に示すようにパッケージした。
ｖＮ２ｇｐｔ−ｇｐ１６０と称する、カセットの挿入体
の正確な構造を有する分離体を、従来構成された組換え
体に前に用いた条件下でアフリカングリーンモンキー(A
frican green monkey)（ベロ）細胞におけるｇｐ１６０
の形質発現に用いた。バレット(Barrett) ら，「AIDS R
esearch and Human Retroviruses」６：１５９〜１７１
（１９８９）。
【０３０１】ｌａｃＺ遺伝子の共挿入(co-insertion)に
よる挿入体を運搬する修飾ウィルスのスクリーニングを
提供するワクシニアウィルスベクターの構造：大腸菌ｌ
ａｃＺ遺伝子の共挿入による挿入体のスクリーニングを
直接クローニング法と組み合わせて示すために、プラス
ミドｐＴＺｇｐｔ−Ｓ３ＡｌａｃＺは有用なモデル構造
を提供する（図３０）。プラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ファ
ーマシア社）をＰｖｕ１１により切断し、大きな２．５
ｋｂベクターフラグメントを調製し、ＮｏｔＩリンカー
（ボーエリンガー(Boehringer)社）でつないだ。生成し
たプラスミドｐＴＺ−Ｎは、ｐＴ２１９Ｒプラスミド中
のアルファ相補ヘプチドの配列内に配置された多重クロ
ーニング部位の欠失を有する。従って、ｐＴＺ−Ｎに挿
入されるｌａｃＺ遺伝子とアルファ相補ペプチドの配列
との間の可能な組換えが除外される。
【０３０２】直接分子クローニングに用いる遺伝子形質
発現カセットを構成するために、ｇｐｔ遺伝子カセット
およびＳ３Ａプロモーターを含む１．２ｋｂ ＮｏｔＩ
フラグメントをｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３Ａから切り取り（実
施例４）、ｐＴＺ−Ｎに挿入し、プラスミドｐＴＺｇｐ
ｔ−Ｓ３Ａを生成した。３．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ ｌａ
ｃＺフラグメント（プラスミドｐＴＫｇｐｔ−Ｆｌｓβ
から切り取った；ファルクナーおよびモス、１９８８）
をｐＴＺｇｐｔ−Ｓ３Ａの単一のＥｃｏＲＩ部位に挿入
した。生成したプラスミドはｐＴＺｇｐｔ−Ｓ３Ａｌａ
ｃＺと称する。２つのマーカー遺伝子（大腸菌ｇｐｔお
よびｌａｃＺ）から成るこのプラスミドの４．４ｋｂ
ＮｏｔＩフラグメントを、ウィルスｖｄＴＫのＮｏｔＩ
により切断されたＤＮＡとつないだ（実施例４）。連結
およびパッケージ条件は実施例３に示した。ｇｐｔ−選
択の場合における修飾ウィルスの概算の収量は実施例３
に示した。
【０３０３】付加的なワクシニアウィルスベクターを以
下のように構成した。プラスミドｐＴＺＳ４−ｌａｃＺ
ａおよびｐＴＺＳ４−ｌａｃＺｂは有用なモデル構造を
提供した（図３１）。プラスミドｐＴＺ−Ｎを上記のよ
うに構成した。ｇｐｔ遺伝子カセットおよびＳ４プロモ
ーターを含む遺伝子形質発現カセット、１．２ｋｂＮｏ
ｔＩフラグメントをｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４から切り取り
（実施例４）、ｐＴＺ−Ｎに挿入し、プラスミドｐＴＺ
ｇｐｔ−Ｓ４を生成した。３．３ｋｂ ＳｍａＩ−Ｓｔ
ｕＩ ｌａｃＺフラグメントをプラスミドｐｌａｃＺＮ
* から切り取り、これを、プラスミドｐＦＰ−Ｚｓａｒ
ｔをＮｏｔＩにより消化して（欧州特許出願第９１ １
１４ ３００．−６、組換え体鶏痘ウィルス）、ｐＦＰ
−ＺｓａｒｔをオリゴヌクレオチドＰ−ＮｏｔＩ（５′
−ＧＧＣＣＡＴ−３′）とつなぐことにより構成した。
この３．３ｋｂ ＳｍａＩ−ＳｔｕＩ ｌａｃＺフラグ
メントをｐＴＺｇｐｔ−Ｓ４の単一ＳｍａＩ部位に挿入
した。生成したプラスミドはｐＴＺＳ４−ｌａｃＺａお
よびｐＴＺＳ４−ｌａｃＺｂと称する。このプラスミド
の４．５ｋｂ ＮｏｔＩフラグメントを、ウィルスｖｄ
ＴＫのＮｏｔＩにより切断されたＤＮＡとつなぎ、上記
のようにパッケージした。
【０３０４】単一クローニング工程におけるｌａｃＺと
ｇｐｔ選択との組み合わせは、全てのｇｐｔ陽性プラー
クがｌａｃＺ遺伝子を含むため、何の利点も提供しな
い。しかし、種々の部位に挿入体を有するウィルスの構
成のために、第２のスクリーニング工程が好ましい。第
１の選択のマーカーはｇｐｔマーカーであるが、ｌａｃ
Ｚスクリーニングは、例えば標的ウィルスゲノムがすで
に選択性マーカーのコピー、例えば大腸菌ｇｐｔ遺伝子
を含む際、挿入体の検出の他の方法を提供する。かかる
スクリーニングのために、パッケージング（実施例３参
照）の後に調製した粗製ウィルス ストックの１／１
０、１／１００および１／１０００の希釈物２ｍｌを、
３０個の大きな（直径８．５ｃｍ）ペトリ皿（希釈物あ
たり１０個のペトリ皿）に取った。ブループラーク分析
を標準的な方法により実施した。チャクラバーティ(Cha
krabarti) ，Ｓ．，ブレクリング(Brechling) ，Ｋ．お
よびモス，Ｂ．「Mol. Cell. Biol.」５：３４０３〜３
４０９（１９８５）。
【０３０５】実施例６ 強い後期ワクシニアウィルスプロモーターの転写調節下
の直接マスタークローニング部位有するワクシニアウィ
ルスベクター（ｖＳ４）の構造 本実施例は、ワクシニアウィルスプロモーターに機能的
に連結されるマスタークローニング部位への完全を読み
取り枠の直接分子挿入に対して設計されるワクシニアウ
ィルスクローニングベクター（ｖＳ４）を記述する。従
って、本実施例の方法にかかるこのベクターを使用する
と、挿入プラスミドの構造を分離することなく、細胞内
再結合による再結合ポックスウィルスの従来構造におい
て要求されるように、ポックスウィルスベクターへの直
接的な遺伝子の挿入が可能となる。また、このベクター
は、上述したように、直接分子挿入によるワクシニアウ
ィルスベクターへの転移のための遺伝子形質発現カセッ
トの分離構造に対する必要性を除去する。
【０３０６】ベクターＳ４のマスタークローニング部位
はワクシニアウィルスゲノムの遺伝的に安定な中央域に
位置し、ベクタの独自な幾つかの切断部位から構成され
て、直接挿入が可能となる。マスタークローニング部位
の直ぐの上流域のＳ４プロモーターは、後期ワクシニア
ウィルスプロモーターの強い合成変異型である。この形
質発現ベクターは、ヒトの血液タンパク質、つまりフォ
ン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）により説明されるよう
に、直接クローニング及び翻訳読み始めコドンを含む大
きい読み取り枠の形質発現に適している。
【０３０７】ワクシニアウィルスベクターの構造： 合
成ワクシニアウィルスプロモーターＳ４を含むアダプタ
ーを独自なＮｏｔＩ部位（図３２）にてワクシニアウィ
ルスベクターｖｄＴＫ（実施例４、図１７，１８，１
９）に挿入する。選択アダプターオリゴヌクレオチドの
挿入は、上流域ＮｏｔＩ部位を不活化するが、一方、下
流域ＮｏｔＩ部位は独自なクローニング部位としての機
能を残す。更に特に、ベクターｖｄＴＫのＤＮＡ（１μ
ｇ）（実施例４、図１７，１８，１９）をＮｏｔＩを用
いて切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＰ−ａｒ
ｔＰ（１１）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３８及びＰ−ａｒ
ｔＰ（１２）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３９）を用いて連
結する。連結混合物をパッケージングし、実施例３で記
述したように、プラークを同定する。記述したように
（実施例４、ＰＣＲスクリーニングによるウィルスｖｄ
ＴＫの同定）、プラークはＰＣＲスクリーニングを受け
る。正確な配向の挿入体を有する分離体はｖＳ４を示さ
れる。
【０３０８】ｖＳ４へのフォン・ビルブラント因子ｃＤ
ＮＡの挿入： プラスミドｐｖＷＦはＮｏｔＩ部位が側
面に接した完全なフォン・ビルブラント因子ｃＤＮＡを
含む。ヒトのｖＷＦの配列は公開されている：（Bonthr
on. D.等、Nucl. Acids Res.14 : ７１２５〜７１２８
１９８６）。配列はアイデンティファイヤー (Identi
fier）（ＩＤ）ＨＳＶＷＦＲ１の下でＥＭＢＯデータラ
イブラリーで得られる。ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０は、
ウィルスＳ４プロモーターのｖｖＷＦのウィルスゲノム
及び翻訳読み始めコドン（このリストの塩基＃２４９；
ＩＤ ＨＳＶＷＦＲ１の塩基＃１００）までのプラスミ
ドｐｖＷＦの本ｖＷＦ ｃＤＮＡの５′−非翻訳域の接
合を示す。ｖＷＦの暗号域をインスタント配列リストに
おいて省略した。配列は、停止コドン（塩基＃２５２；
ＩＤ ＨＳＶＷＦＲ１）およびＮｏｔＩ部位までの３′
−非翻訳配列（塩基＃３０４）及びｖｖＷＦのウィルス
ゲノムの３′−域の重複の２０塩基に続く。
【０３０９】ｖＷＦ ｃＤＮＡフラグメントをＮｏｔＩ
を用いて放し、図３３で説明したように、ＮｏｔＩで切
断し、フォスファターゼで処理したｖＳ４ベクターＤＮ
Ａを用いて連結する。連結ＤＮＡの１μｇを実施例７で
記述したようにパッケージングする。プラークを取っ
て、ＰＣＲスクリーングで分析する。ＰＣＲ反応の第１
プライマーはｔｋ−遺伝子の約３００ｂｐ上流域に位置
するオリゴヌクレオチドｏｄＴＫ２であり、逆プライマ
ーｏｖＷＦ１は開始コドンの約５０ｂｐ下流域のｖＷＦ
遺伝子中に位置する。ＰＣＲ増大は、ｖＷＦ挿入体がベ
クターのＳ４プロモーターに関して正確な配向にあると
きのみ生じる。ＰＣＲ−陽性プラークを同定し、更に分
析する。別に、所望の修飾ウィルスの収率が低い、つま
り０．１〜０．０１％のオーダーの場合は、当業者周知
のその位置のプラークハイブリッド形成法により同定で
きる。参照：例えば、 Villareal, L. P. 及び Berg,
P. サイエンス１９６：１８３〜１８５（１９７７）。
【０３１０】ＰＣＲ又はハイブリッド形成によるｃＤＮ
Ａ挿入体を有し、更にＰｖｕIIを用いた所望の制限パタ
ーンを示すウィルスクローンはｖｖＷＦを示される。こ
のようなベクターは、実施例５の他のヒトのタンパク質
に対して記述され、当業者周知の遺伝処理原理にかかる
アプロプリエイト（appropriate ）として修飾されるフ
ォン・ビルブラントの形質発現を検定できる。
【０３１１】実施例７ アビポックス（鶏痘）ヘルパーウィルスによるオルトポ
ックス（ワクシニア）ウィルスゲノムＤＮＡの異型パッ
ケージング及びヘルパーウィルスが複製できない種類の
宿主細胞中の修飾ウィルスに対する同時選択 実施例３は、トリ細胞の鶏痘ヘルパーウィルスを用いた
修飾ワクシニアウィルスＤＮＡのパッケージング及びア
ビポックスヘルパーウィルスが複製できない哺乳動物
（ＣＶ−１）細胞中の子孫ウィルスプラークの続く分離
を記述している。本実施例はＣＶ−１細胞の直接的な鶏
痘によるワクシニアウィルスＤＮＡのパッケージングを
説明し、これにより同時パッケージング及びパッケージ
ングウィルスの宿主域選択が可能になる。子孫の初期ス
トックからヘルパーウィルスを除去するほかに、この手
順は、各パッケージング実験のヒナの胎児繊維芽細胞の
主要な培養を産生する退屈な要求を回避する。また、代
わりに、ワクシニアウィルス複製に共通に使用される連
続哺乳動物細胞系を鶏痘ヘルパーウィルスを用いてワク
シニアウィルスをパッケージングするのに使用できる。
【０３１２】鶏痘ウィルス（ＦＰＶ）はトリ細胞におい
てのみ完全に複製され、生存できる子孫ウィルスは感染
哺乳動物細胞から得られないことが知られている。哺乳
動物細胞中で複製が不稔なＦＰＶのライフサイクルにお
ける正確な点は知られていない。しかしながら、ＦＰＶ
は哺乳動物細胞中でウィルスタンパク質を産生し、生き
ているワクシニアとして使用される場合、哺乳動物の防
御免疫性さえ誘発することが知られている。Taylor等、
ワクシニア６：４９７〜５０３（１９８８）。それにも
かかわらず、ＦＰＶは、以前には異型ポックスウィルス
ゲノムＤＮＡ、特に直接処理したワクシニアウィルスＤ
ＮＡをパッケージングする能力を有することが示されな
かった。
【０３１３】初期実験において、ＣＶ−１細胞（５×１
０6 ）は鶏痘ウィルスの１つのｐｆｕ／細胞（菌株ＨＰ
１．４４１）を用いて感染され、１時間温置した。続い
て、カルシウム−リン酸沈殿物（１μｇのワクシニアウ
ィルス野生型ＤＮＡを含むもの１ｍｌ）を感染細胞中に
トランスフェクションする。室温で１５分後、１０ｍｌ
の培地（ＤＭＥＭ、１０％胎児子牛血清）を添加した。
細胞は４時間温置し、培地を交換した。その後、細胞を
６日間温置し、粗ウィルスストックを調整した。子孫ウ
ィルスをＣＶ−１細胞上でタイターした。典型的なワク
シニアプラークは２日後に見えた。ゲノムウィルスＤＮ
Ａの量へのパッケージング率の依存は５×１０6 ＣＶ−
１細胞当り０．１〜１０μｇのＤＮＡ量の範囲にわたっ
て決定された。図３４参照。インプットＤＮＡのｐｆｕ
／μｇに関してトランスフェクションの効率を減じる粗
カルシウム−リン酸沈殿物を産生する１μｇより多い
（例えば１０μｇ）ＤＮＡ量。図３４。
【０３１４】パッケージングの温置時間へのパッケージ
ングワクシニアウィルス収量の依存をワクシニアウィル
ス野生型ＤＮＡの一定量（１μｇ）及びＦＰＶヘルパー
ウィルスの一定量（１ｐｆｕ／細胞）を用いてトランス
フェクション後１５分で添加された培地を４時間後交換
することを除いてこの実施例の初期実験の上記の条件下
で分析し、その後、粗ウィルスストック（総体積２ｍ
ｌ）を調整する前に付加の１〜５日間細胞を温置した。
ＦＰＶのみを用いて感染し、５日間温置したコントロー
ル細胞からのウィルスストックは見えるプラークを産生
しなかった。この実験を３回くり返し、典型的な結果を
以下の表７．１に示す。
【０３１５】
【表４】
【０３１６】哺乳動物（ＣＶ−１）細胞におけるプラー
ク分析により検出された、パッケージングワクシニアウ
ィルスの力価は、２４時間における約１０2 ｐｆｕ／ｍ
ｌから１２０時間後の約２×１０7 まで継続して上がっ
た。４８〜７２時間の範囲の培養時間では都合のよいレ
ベルのパッケージングワクシニアウィルス（１０4 と１
０6 ｐｆｕ／ｍｌの間）を産生し、従って、哺乳動物細
胞の鶏痘ウィルスによるワクシニアウィルスＤＮＡのル
ーチンパッケージングに適している。
【０３１７】ワクシニアＤＮＡは鶏痘ウィルスを用いて
不稔的に感染した哺乳動物細胞中にパッケージングでき
る。鶏痘ウィルスは哺乳動物細胞にも感染し得るが、ウ
ィルスのライフサイクルはこれらのノン−タイピック
（non-typic ）宿主細胞において完結されないことは以
前には知られていなかった。細胞タイプに依存して、早
期か後期かいずれかの段階においてウィルスの成長は止
まり、生存できる鶏痘ウィルスは形成されない（Taylor
等、１９８８）。これらの発見は、連続哺乳動物細胞系
におけるパッケージングワクシニアＤＮＡへの研究を刺
激する。
【０３１８】ＣＶ−１細胞の融合単層をＦＰＶ菌株ＨＰ
１．４４１の０．０５ｐｆｕ／細胞を用いて感染し、そ
の後ＮｏｔＩ−切断ワクシニアウィルスＤＮＡ及びＮｏ
ｔＩ隣接部位を有するｇｐｔ遺伝子カセットからなる連
結混合物を用いてトランスフェクションした。更に特
に、ワクシニアＤＮＡ（１μｇ）をＮｏｔＩを用いて消
化し、示指量の挿入体ＤＮＡ（Ｐ７．５ｇｐｔ遺伝子カ
セット）を用いて連結する。ワクシニアウィルスの独自
なＮｏｔＩ部位はＨｉｎｄ IIIＦフラグメントの遺伝子
間域に位置する。Goebel等、Virology. 179 : ２４７
（１９９０）。３日間の温置後、細胞を収穫し、粗ウィ
ルスストックをｇｐｔ−選択培地の存在（＋ＭＰＡ）及
び不存在（−ＭＰＡ）のＣＶ−１細胞でタイターした。
結果を表７．２に要約する。
【０３１９】
【表５】
【０３２０】最も重要な結果は、鶏痘ウィルスがそれ自
身の成長を阻害する細胞タイプの修飾ワクシニアＤＮＡ
をパッケージングできることであった。更に、キメラプ
ラークの収量は５〜１０％の範囲であった。これは全プ
ラークの約０．１％が通常は組換え体である古典的なイ
ンビボ組換え技術と好ましく比較できる。ベクターアー
ム単独の連結（表７．２、実験＃５）は、挿入体を有す
る連結実験１〜４に比べより高い力価を得たが、これは
おそらくアガロース精製挿入分子が汚染されていないた
めである。分離ウィルスの幾つかをプラーク精製し、更
に特性を決定した。それらはワクシニアウィルスの典型
的なＨｉｎｄ III制限パターンを示し、加えて、単一挿
入体の２つの可能な配向に対する外来性の遺伝子帯特性
を示した。ＮｏｔＩ部位への挿入に関して、多重挿入を
有するウィルスは観察されなかった。
【０３２１】異型のパッケージングキメラワクシニアウ
ィルスは鶏痘ウィルスとクロスハイブリッドを形成しな
い。キノラワクシニアウィルスの構造におけるＦＰＶに
よる異型パッキングの効果を研究するために、ＮｏｔＩ
クローニング実験からの４つの精製分離体と鶏痘ウィル
スコントロールのＤＮＡの他に、分離体Ｆ１３．４、Ｆ
１２．５、Ｆ１３．２、Ｆ１３．２及びＦ１２．４のＤ
ＮＡを、Ｈｉｎｄ IIIを用いて消化し、得られたフラグ
メントを電気泳動にて分離し、スクロースグレジエント
−精製ビリオンから調整される鶏痘ウィルスプローブを
用いてサザンハイブリッドにより分析した。ＦＰＶ Ｄ
ＮＡを有するワクシニアウィルスのクロスハイブリッド
形成は観察されなかった。
【０３２２】実施例８ ヒトの細胞系で複製できないワクシニアウィルス宿主域
変異株（ｖｄｈｒ）による処理ワクシニアウィルスゲノ
ムＤＮＡの相同パッキング 本実施例は、その宿主域を制限する欠失を含むヘルパー
ポックスウィルスの構造及び使用、特に、あるヒトの細
胞系の複製能力を説明する。従って、ヘルパーウィルス
のない修飾ワクシニアウィルスを、この変異体ウィルス
を用いたベクターＤＮＡのパッキングにより、感染アプ
ロプリエイトヒト細胞による処理ウィルスのクローンを
分離することにより調整できる。この異変株ヘルパーウ
ィルスは、種々のヒトの細胞における複製不可能な、及
び野生型ワクシニアウィルスによる感染に対して許容な
多くの他の細胞における変化した細胞変成効果を示すワ
クシニアウィルスの宿主域異変株から得られる。参照：
例えば、Drillien等、Virology 111：４８８〜４９９
（１９８１）。特に、このヘルパーウィルスのゲノム
は、少なくとも１つの完全な宿主域遺伝子を有するワク
シニアウィルスゲノムのみが複製できるヒト（ＭＲＣ
５）細胞中で複製するのを防ぐ２つの宿主域遺伝子の突
然変異を含む。
【０３２３】宿主域異変株ワクシニアウィルスｖｄｈｒ
の構造： ヒト細胞の複製に必要な１つのワクシニアウ
ィルス遺伝子のゲノム位置及びＤＮＡ配列は、Gillard
等、Proc. NatI. Acad. Su. USA 83：５５７３〜５５７
７（１９８６）に記述されている。近年、この遺伝子は
Ｋ１Ｌを示された（ Goebel 等、１９９０）。第２ワク
シニアウィルス宿主域遺伝子をマップ化した〔 Perkus
等、J. Virolory 63：３８２９〜２８３６（１９９
０）〕。この第２遺伝子（ Goebel 等、１９９０に関し
Ｃ７Ｌを示された）は、Ｈｉｎｄ IIIＣ及びＨｉｎｄ I
IIＮフラグメントの領域包囲部分に存する。この領域は
ワクシニアウィルスＷＲ６／２菌株において欠失してい
る〔 Moss 等、J. Virol. 40：３８７〜３９５（１９８
１）〕。従って、菌株ＷＲ−６／２はＣ７Ｌ宿主域遺伝
子が欠乏する。
【０３２４】Ｋ１ＬとＣ７Ｌ宿主域遺伝子との両方が欠
乏するヘルパーウィルスｖｄｈｒは、Ｋ１Ｌ宿主域遺伝
子が欠失する修飾ＥｃｏＲＩ Ｋフラグメントを有する
標識釈放によるＣ７Ｌ−陰性菌株ＷＲ−６／２から構成
される。図３５参照。この修飾ＥｃｏＲＩ Ｋフラグメ
ントは選択標識遺伝子（大腸菌ｇｐｔ遺伝子）を含み、
Sam 及び Dumbell、１９８１に開示された細胞内標識釈
放を使用する修飾ＥｃｏＲＩ Ｋフラグメントを含む修
飾ＷＲ−６／２ゲノムの選択を促進する。また、ヒトの
細胞系での成長能力のない条件的致死突然変異株はPerk
us等、１９８９に開示されている。更に特に、ワクシニ
アウィルス野生型ＤＮＡの５．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ Ｋ
フラグメントはプラスミドｐＦＰ−ｔｋ１８ｉにサブク
ローン化される。得られたプラスミドはｐＦＰ−Ｅｃｏ
Ｋ１を示される。ワクシニアウィルス宿主域遺伝子Ｋ１
Ｌ（Gillard 等、１９８６）は欠失し、同時に独自なＮ
ｏｔＩ部位がオリゴヌクレオチドＰ−ｈｒ（３）（ＳＥ
Ｑ．ＩＤ．ＮＯ．４２）を使うループアウト突然変異誘
発により導入される。得られたプラスミドはｐＥｃｏＫ
−ｄｈｒを示される。
【０３２５】プラスミドｐＦＰ−ｔｋ１８ｉはプラスミ
ドｐＦＰ−ｔｋ−１０．４の修飾により構成された（参
照： Falkner等、欧州特許出願番号８９３０３８８７．
７、公開ＥＰＡ Ｏ ３３８８０７、実施例３於８、参
照によりここにおいて結果的に統一される完全な開
示）。プラスミドｐＦＰ−ｔｋ１０．４をＮｃｏＩを用
いて消化し、アニーリングしたヌクレオチドＰ−Ｎｃｏ
Ｉ（１）及びＰ−ＮｃｏＩ（２）から成るアダプターを
用いて連結し、制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｅｃｏ
ＲＩ、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄ IIIを用いてＦＰＶ ｔｋ
−遺伝子の単一ＮｃｏＩ部位に多重クローニング部位の
導入をなした。
【０３２６】ワクシニアウィルスの配列はGoebel. S.
J. 等、Virology 179：２４７〜２６６（１９９０）に
開示されている。これは、アクセション番号Ｍ３５０２
７の下でＥＭＢＯデータライブラリー（ＧｅｎＢａｎ
ｋ）にて得られる。ワクシニアウィルス宿主域遺伝子Ｋ
１Ｌの配列はGillard. S. 等、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83 ：５５７３〜５５７７（１９８６）に開示され
ており、アイデンティファイヤー（ＩＤ）ＰＸＶＡＣＭ
ＨＣの下でＥＭＢＯデータライブラリー（ＧｅｎＢａｎ
ｋ）にて得られる。従って、Ｋ１Ｌ遺伝子の配列暗証配
列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１には含まれない。ｐＥｃ
ｏＫ−ｄｈｒにおけるＫ１Ｌ遺伝子は欠失し、ＮｏｔＩ
部位により置換される。ＰＸＶＡＣＭＨＣ配列及びＮｏ
ｔＩ部位挿入体間の結合域が示される（ＩＤ ＰＸＶＡ
ＣＭＨＣにおける塩基＃７２−９１に合うこのリスティ
ングの塩基＃１−２０）。Ｋ１Ｌの暗号域は欠失し、２
つのＧ残基が続くＮｏｔＩ部位により置換される（配列
リスティングにおける塩基＃２１−３０）。配列は２０
ｂｐ隣接域（塩基＃３１−５０リスティング；ＩＤ Ｐ
ＸＶＡＣＭＨＣの塩基＃９４４−９６３に続く）。以降
の段階において、ｐＥｃｏＫ−ｄｈｒはＮｏｔＩを用い
て線状化され、ＮｏｔＩ消化によるプラスミドｐＮ２−
ｇｐｔａ（実施例４）からの１．１ｋｂＰ７．５−ｇｐ
ｔ遺伝子カセットを用いて連結される。得られたプラス
ミドｐｄｈｒ−ｇｐｔはヘルパーウィルスｖｄｈｒを発
生させるのに使用される。
【０３２７】ｐＥｃｏＫ−ｄｈｒに挿入されたＮｏｔＩ
カセット（Ｐ７．５プロモーター−ｇｐｔ−遺伝子カセ
ットを含む）及び５′及び３′隣接（flanking）域の２
０塩基をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２のｐｄｈｒ−ｇｐｔ
に示す。隣接域（このリスティングの塩基＃１−２０）
はＩＤ ＰＸＶＡＣＭＨＣの塩基＃７２−９１（参照：
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１対ｐＥｃｏＫ−ｄｈｒ）に合
う。挿入ＤＮＡ配列はポジション２１（ＮｏｔＩ部位の
第１“Ｇ”）にて始まり、ポジション１１８９（Ｎｏｔ
Ｉ部位の最後の“Ｃ”残基）にて終わる。ｇｐｔ−遺伝
子の翻訳読み始めコドンのＡ−残基がポジション＃５４
８に合う。ｇｐｔ−遺伝子の翻訳停止コドンのＴ−残基
はポジション番号＃１００４に合う。配列は隣接域の２
０塩基（このリスティングの塩基＃１１９２〜１２０
９；ＩＤ ＰＸＶＡＣＭＨＣの塩基＃９４４−９６１）
に続く。このリスティング中＃１１９０及び１１９１の
２つの“Ｇ”残基はｐＥｃｏＫ−ｄｈｒのポジション２
９及び３０に合う。
【０３２８】Ｅｃｏ Ｋフラグメントをワクシニアウィ
ルスに転移するため、プラスミドを、ワクシニアウィル
ス欠失変異株ＷＲ−６／２を用いて感染した主要なひよ
こ胚繊維芽細胞にトランスフェクトする。修飾ウィルス
はｇｐｔ−陽性として（ミコフェノール酸を用いて）選
択される。ｇｐｔ−陽性はＣＥＦ細胞中で３回プラーク
精製され、ｖｄｈｒを示される。ｖｄｈｒヘルパーウィ
ルスの特性決定： ｇｐｔ−陽性ワクシニアウィルスｖ
ｄｈｒの構造はサザンブロッティング及び宿主域テスト
により分析される。ｖｄｈｒウィルスはひよこ胚繊維芽
細胞及び２つのサル細胞系（ＢＳＣ４０とＶｅｒｏ）Ｅ
にプラークを形成可能であるが、ヒトの細胞系ＭＲＣ−
５中で複製できない。
【０３２９】ヘルパーウィルスとして宿主域変異株ｖｄ
ｈｒを使用した処理ワクシニアウィルスＤＮＡのパッケ
ージング： ヒトのプロトロンビンを暗号化するｃＤＮ
Ａの表現に対する構成はこのアプローチの使用を示す。
実施例５、図２６に記述された連結混合物からの生成物
をヘルパーウィルスとしてｖｄｈｒを用いて感染したひ
よこ胚繊維芽細胞にトランスフェクトする。２日後、細
胞を収穫し、粗ウィルスストックを調整する。パッケー
ジングウィルスを、所望のワクシニアウィルスは複製す
るが、変異株ｖｄｈｒヘルパーウィルスは複製しないヒ
ト（ＭＲＣ５）細胞におけるプラーク形成に対して分析
する。３日後、細胞は中性赤色に着色し、プラークはサ
ザンブロッティングにより更に分析するために選ばれ
る。所望の構造を有する修飾ワクシニアウィルスクロー
ンは同定される。また高度に相同なヘルパーウィルスを
用いた組換えを受けたウィルスが期得される。
【０３３０】実施例９ HIV gp 160(vP2-gp160MNＡ,vP2 gp160MNＢ及びvse1P-gp
160MN) を暗号化する新規なキメラワクシニアウイルス
の構成及びベロ細胞中の組換え体gp 160MNの形質発現
【０３３１】本例では、HIV-1 MN分離体のgp 160の大規
模な生成に関するワクシニアウイルス組換え体の直接分
子クローニングによる構成を示す。従来のように構成さ
れたワクシニアウイルス形質発現ベクターを用いる、ラ
トナー(Ratner)らによりネーチャー(Nature)313:277 〜
284(1985) に記載されたHIV IIIB分離体のgp 160の生成
は、バーレット(Barrett) らにより、エイズ リサーチ
エンド ヒューマンレトロウイルス(AIDS Research a
nd Human Retrouiruses)5:159 〜171(1989) に記載され
ている。しかし、HIV IIIB分離体は、稀少なHIV 変異体
である。
【０３３２】HIV エンベロープ(envelope)タンパク質を
基礎にしたワクチンの開発への試考には、ガルゴ(gurg
o) らによるヴィロロジー(Virology)164:531 〜536 (19
88)に、またキャロー(Carrow)らによるエイズ リサー
チ エンド ヒューマン レトロウイルス7 : 831 〜83
9 (1991)に記載されているように、例えばMN- 分離体の
ような多くの代表的なHIV-1 分離体が含まれる。従って
本発明のワクシニアウイルスベクターを直接分子クロー
ニングを介して構成させ、HIV MN分離体のgp 160タンパ
ク質を形質発現させる。
【０３３３】キメラウイルスvP2-gpt160MNA 及びvP2-gp
t160MNB のプラスミドpP2-gp 160MNの構成：ワクシニア
ウイルスへgp 160−遺伝子を挿入する計略には：（ｉ）
広域な５´−未翻訳領域（５´−UTR)を取り除き、読み
始めコドンの上流に適当なクローニング部位を導入する
ことによりgp 160−遺伝子を修飾し；（ii) 修飾された
gp 160−遺伝子を、強力な後期(strong late) 鶏痘P2−
プロモーター（欧州特許出願第91 114 300. −６, ８月
26日，1991）の下流にクローニングし、次いで(iii)P2
−gp 160及びP7.5−gpt −遺伝子カセットから成るブラ
ントエンドフラグメントを、適当なウイルス性宿主株の
単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位へ、すなわち宿
主ワクシニア株vdTK（実施例４）のSmI 部位、ワクシニ
ア株WR 6/2 モス(Moss)らによるJ.Virol,40 : 387 (19
81) 〕またはワクシニア野性型株WRのSmaI又はNotI部位
中へ挿入する。
【０３３４】かかる目的に関して、新規なSmaI部位をプ
ラスミドＰＮ ２gpt −S4（実施例４）に導入し、プラ
スミドpS2 gpt −S4（図３６, SEQ ID NO : 62)を得
た。次いで、S4−プロモーターをP2−プロモーターによ
り交換し、プラスミドpS2 gpt−P2（ SEQ ID NO : 63)
を得た。かかるプラスミドは、相同読み取り枠(orfs)の
クローンニングを可能にするが、それ自身の読み始めコ
ードンを欠失する非相同orfsをクローンするにも用いら
れる；例えば、開始コードンを、かかるプラスミドの単
一のNcoI部位
【外１】 へのクローニングの際設ける。プラスミド及びウイルス
の構成は、更に下記に詳述する。gp 160−遺伝子の修飾
に関しては、PCR −発生近位フラグメントを交換して、
最小な５´−UTR を伴うgp 160−遺伝子カセットに導い
た。このカセットは最終的な構造体、プラスミドpP2 −
gp 160MN（図３６, SEQ ID NO : 69)中に存在する。こ
のプラスミドの他の特性を次の表に示す。
【０３３５】
【表６】 プラスミドを次のように構成した。
【０３３６】pS2 gpt −S4：プラスミドpN2 gpt −S4
（実施例４）を、XbaIにより消化し(digest)、SmaI−ア
ダプタ−（SEQ ID NO : 43 :５´−CTAGCCCGGG-3´) と
連結して、XbaIを不活性化し、SmaI部位を創生する。得
られたプラスミドはpS2 gpt −S4(SEQ ID NO : 62)と表
示する。このプラスミドの他の特性を次の表に示す。
【０３３７】
【表７】
【０３３８】pS2 gpt −P2：プラスミドpS2 gpt −S4の
S4−プロモーター配列を、PstI及びHpaIを用いる切断に
より除去し、172 bp PstI −HpaI P2 −プロモーターセ
グメントに置き換えた。このプロモーターセグメント
は、鋳型としてプラスミドpIZgpt −P2a 〔ファルクナ
ー(Falkner) らによる欧州特許出願第91114300-6号、19
91年８月26日〕を、またプラスマーとしてオリゴヌクレ
オチドP-P2 5′(1) とP-P2 3′(1) を用いるＰＣＲによ
り発生した。ＰＣＲ−生成物はPstI及びHpaIで切断さ
れ、pS2 gpt −S4のPstI及びHpaI−切断大フラグメント
を連結した。P-P2 5′(1) (SEQ ID NO : 44)の配列は、
５′−ＧＴＡＣＧＴＡＣＧＧ ＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴ
ＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧ ＴＡＴＡＧＣＧＧＡＣ ＡＡＣ
ＴＡＡＧ−３′であり、P-P2 ３′(1) （SEQ ID NO :
45) の配列は、５′−ＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣ ＧＴＴＡ
ＡＣＧＡＴＴ ＴＡＴＡＧＧＣＴＡＴ ＡＡＡＡＡＡＴ
ＡＧＴＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴ−３′である。ＰＣＲフラ
グメントの正しい配列は、最終的なプラスミドの配列に
より確認され、pS2 gpt - P2（SEQ ID NO : 63) と表示
される。使用される配列プライマーはP-SM(2) （SEQ ID
NO : 46),５′−ＧＴＣ ＴＴＧ ＡＧＴ ＡＴＴ Ｇ
ＧＴ ＡＴＴ ＡＣ−３′及び P-SM (3) （SEQ ID NO
: 47),５′−ＣＧＡ ＡＡＣ ＴＡＴ ＣＡＡ ＡＡ
Ｃ ＧＣＴ ＴＴＡ ＴＣ−３′であった。このプラス
ミドpS2 gpt −P2の他の特性を次の表に示す。
【０３３９】
【表８】
【０３４０】pMNevn 2：プラスミドpMNevn 1と、アール
・ガロ(R.Gallo) 〔ナショナル カンサー インスティ
テュート（National Cancer Institute)、ベテスダ(Bet
hesda)、マリーランド(Maryland)により製造した。これ
には、ベクター pSP72〔プロメガ(Promega) 社) 中の3.
1 Kb EcoRI-PvuIIフラグメントとしてクローン化された
HIV MN−株のgp 160−遺伝子を含む。pMNenvl の0.6kb
EcoRI-Asp 718 フラグメントを0.13kb EcoRI-Asp 718フ
ラグメントに置き換え、gp 160−遺伝子の５′未翻訳領
域の大部分を除去した。この0.13kbフラグメントは、鋳
型としてプラスミドpMNenv1 を、またプライマーとして
オリゴヌクレオチドP-MN(1) 及びP-MN(2) を用いてPCR
により発生した。更に前者のプライマーP-MN(1) は、開
始コードンの上流にSTuI部位の１bpを導入する。P-MN
(1) (SEQ ID NO : 48)の配列は、５′−ＡＧＣＴＡＧＣ
ＴＧＡ ＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴ ＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧ
ＡＡＧＧＧＧＡＴＣＡ ＧＧＡＧＧＡＡＴＴＡ ＴＣ
Ａ−３′であり、P-MN(2) (SFEQ ID NO : 49)の配列
は、５′−ＣＡＴＣＴＧＡＴＧＣ ＡＣＡＡＡＡＴＡＧ
Ａ ＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧ−３′である。得られたプラ
スミドはpMNenv2 と表示される。突然変異を排除するた
めに、このプラスミド中のPCR 生成フラグメントは、プ
ライマーP-Seq (2) (SEQ ID NO :50) ５′−ＣＴＧ Ｔ
ＧＧ ＧＴＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＴＴ ＧＴＧ ＴＧ
Ｇ ＣＣＣ−３′及びＰ−Seq (3) (SEQ ID NO : 51)
５′−ＣＡＡ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＧＴ ＡＧＣ ＡＣ
Ｔ ＡＣＡＧＡＴ Ｃ−３′）とともに配列した。
【０３４１】pP2-gp 160MN：プラスミド pMNenv 2 から
分離された、MN gp 160 −遺伝子を含む2.7 kb Stui-Pv
uII フラグメントを、PS-P2 のHpaI部位に挿入し、プラ
スミドpP2-gp 160MN(SEQ ID NO : 69)を得た。
【０３４２】キメラウイルスvP2-gp 160MNA 及びvP2-gp
160MNB を次のようにして構成した：P2- gp 160及びP
7.5- gpt −遺伝子カセットから成るSmaI−フラグメン
トを、直接分子クローニングにより、宿主ワクシニア株
vdTK（実施例４）の単一SmaI部位に挿入し、キメラウイ
ルスvP2-gp 160MNA 及びvP2-gp 160MNB （図37)を得
た。特に、実施例４のワクシニアウイルスvdTKをその単
一SmaI部位で切断し、P7.5- gpt 遺伝子及びP2−gp 160
−遺伝子カセットを含む4.0kb SmaIフラグメントと連結
した。同様に、ワクシニア株ＷＲ ６／２をその単一Sm
aI (NotI) 部位で切断し、P7.5−gpt −遺伝子及びP2−
gp160 −遺伝子カセットを含む4.0kb SmaI(NotI)フラグ
メントと連結した。クローニング方法は、実施例１で記
載したような方法で実施する。ウイルスvP2 −gp 160MN
A 中において、この遺伝子がウイルス性チミジンキナー
ゼ遺伝子の周囲に集積されるように、gp160 −遺伝子は
同じ方向(direction) に転写される；
【０３４３】ウイルスP2−gp 160MNB 中においては、gp
160−遺伝子は逆方向に転写される。遺伝子位置効果(e
ffect)はワクシニア構造体中の形質発現レベルに影響を
及ぼすので、P2−gp 160及びP 7.5 −gpt −遺伝子カセ
ットから成るSmaI(NotI)−フラグメントを、更にWR6/2
株のSmaI(NotI)部位に挿入した。インビボパッケージン
グを、実施例３に記載されるように実施した。
【０３４４】キメラウイルスの構造。キメラウイルスの
理論的構造を確立するために（図38)、サザンブロット
分析を実施した。精製したウイルスのDNA をPstIで切断
し、得られたフラグメントをアガロ−スゲル上で分離
し、ニトロセルロース半透膜に移し、ワクシニアチミジ
ンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子及びgp 160−遺伝子プローブ
にハイブリッド形成した。ｔｋ−遺伝子プローブを用い
てVP2 −gp 160MNの場合、予想された6.9 及び14.3kbフ
ラグメントを明らかにし、VP2 −gp 160MNB に関して
は、予想された8.7 及び12.5kbフラグメントを明らかに
する。gp 160−プローブ（PMNenv1)を用いて、予想され
たvP2-gp 160MNA の14.3 kb 及びvP2-gp 160MNB の8.7
kbフラグメントを明らかにし、２つの異配向中の外来生
遺伝子カセットの組込みを確立する。
【０３４５】キメラウイルスvP2-gp 160MNA 及びvP2-gp
160MNB を用いる形質発現研究 ベロ細胞を形質発現研究用に選定した。細胞の成長、キ
メラウイルスによる感染性及び組み換え体gp 160タンパ
ク質の精製は、上記したバレット(Barrett) らにより記
載されたように実施した。
【０３４６】gp 160のウエスタンブロット：ウエスタン
ブロットをタウビン(Towbin)らによるProc.Natd.Sci.US
A 83 : 6672 〜6676 (1979) に記載されたように実施し
た。第１の抗体は、マウスモノクローナルアンチ−ＨＩ
Ｖ−gp 120抗体（デュポン社♯ＮＥＡ 9305)であり、
１：500 の希釈で用いた。第２の抗体は、ヤギ−アンチ
−マウス IgG（Ｈ＋Ｌ）であり、アルカリホスフェート
（バイオラド(BioRad)社、♯170-6520) と連結してお
り、１：1000の希釈で用いた。試薬（ＢＣＩＤ及びＮＢ
Ｔ）及び染色プロトコールはプロメガ(Promega) 社製の
ものを使った。
【０３４７】キメラウイルスvSe1p-gp 160MNのプラスミ
ドpse1P −gp 160MNの構造 強力な既知のワクシニアウイルスプロモータの１つであ
る合成性初期(early)／後期(late)プロモータselp(SEQ
ID NO : 70)〔エス．チャカバルティ（S.Chakrabarti)
及びビー. モス(B.Moss)らによる欧州特許出願第911143
00-6“鶏痘ウイルス組換え体”〕を、本例で用いて、Ｈ
ＩＶ−１MN株のgp 160−遺伝子を形質発現させた。第１
に、プラスミドpSe1P −gpt −L2を構成した（図39)。
かかるプラスミドは、相補性又は非相補性読み取り枠と
しての外来性遺伝子の挿入に関する多重クローニング部
位が続くSe1P−プロモーターを、そしてワクシニアウイ
ルス初期転写停止信号ＴＴＴＴＴＮＴが続く全ての読み
取り枠中の翻訳停止コードンを含む。これはローマン(R
ohrmann)らのセル(Cell)46：1029〜1035（1986）に記載
されている。P7.5 gpt−遺伝子カセットはプロモーター
に隣接して位置し、優性選択標識として作用する。この
ことは、フアルクナー(Falkner) らによるJ.Virol.62 :
1849 〜 1854 (1988)に記載されている。selP−プロモ
ーター／標識遺伝子カセットは、ワクシニアウイルスゲ
ノム（SfiI,NotI, RsrII) 中における唯一の制限エンド
ヌクレアーゼ切断部位に隣接し、更にブラントエンドフ
ラグメント（例えば、HpaI及びSnaBI での切断による)
として切断され得る。gp 160−遺伝子のpselP-gpt-L2へ
の挿入を可能にするため、NcoI部位を翻訳開始コードン
の周囲に導入した。かかる突然変異は、アミノ酸アルギ
ニン(AGA) のアラニン(GCC) への置換を生じさせる。信
号ペプチドの第２アミノ酸中のかかる突然変異は、gp 1
60−遺伝子の有効な形質発現を妨害することはないよう
である。クローニング化方法及び野生型と修飾gp 160−
遺伝子周囲の配列は図40に概略を示した。かかる突然変
異をgp 160−遺伝子に導入するために、ＰＣＲ−発生近
位フラグメントを交換した。プラスミドの構造を、下記
に詳細に説明する。
【０３４８】pL2 ：pL2 の構造に介して、プラスミドpT
M3の0.6kb xbaI-ClaI フラグメント（モス（Moss) らに
よるネーチャー, 348 : 91 (1990) 〕を、アニーリング
したオリゴヌクレオチドＯ−542 (SEQ ID NO : 52)５′
−ＣＧＡ ＴＴＡ ＣＧＴ ＡＧＴ ＴＡＡ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＧＣ Ｃ
ＴＡ ＧＣＣ ＧＧＣ ＣＡＴ ＡＡＡ ＡＡＴ−３′及びＯ−544 (SEQ ID NO
: 53)５′−ＣＴＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＧＣ
ＣＧＧ ＣＴＡ ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ
ＧＴＴ ＡＡＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＴ−３′から成る
ＸbaI −ＣlaI アダプターフラグメントと置換した。か
かるクローニング工程から得られる中間体プラスミドは
pL１と称した。0.84 kb AatII-Sph フラグメント（暗号
化されていないgpt 配列の部分）を、アニーリングされ
たオリゴヌクレオチドＯ−541 (SEQID NO : 54 : ５′
−ＣＴＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＧＧ
ＡＴＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＧＧＴ ＣＣＧ ＧＴＴ Ａ
ＡＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＧＡＣ ＧＴ−３′）及びＯ−
543 （SEQ ID NO : 55：５′−ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＧＴ
ＡＧＴ ＴＡＡ ＣＣＧ ＧＡＣ ＣＧＧ ＧＣＣ
ＡＴＡ ＴＡＧ ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ Ｇ
ＡＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＴＧ−３′）からなるAatII-Sp
hIアダプターフラグメントにより置換した。得られたプ
ラスミドはpl2 と称した。
【０３４９】ptz −L2：XbaI−SphIフラグメント（T7−
プロモーターEMC −T7−末端セグメント、多重クローニ
ング部位及びP7.5−gpt −遺伝子カセットから成る）
を、クレノウ−ポリメラーゼで処理し、プラスミドpTZ1
9R〔ファーマシア（Pharmacia)社〕のPvuII 部位間へ挿
入した。得られたプラスミドはPTZ −L2（SEQ ID NO :6
4) と称した。かかるプラスミドの他の特徴を次の表に
示す。
【０３５０】
【表９】
【０３５１】PTZ selP−L2及びpselP −gpt −L2:0.6 k
b ClaI−NcoIフラグメント（T7−プロモーター−EMC −
配列）を、アニーリングされたオリゴヌクレオチドＯ−
SelPI （SEQ ID NO : 56 :５′−CGA TAA AAA TTG AAA
TTT TAT TTT TTT TTT TTG GAA TAT AAA TAA GGC CTC −
３′：51メール(mer))及びＯ−sel PII （SEQ ID NO: 5
7 :５′−CAT GGA GGC CTT ATT TAT ATT CCA AAA AAA A
AA AAT AAA ATT TCAATT TTT AT3 ′) から成る合成プロ
モーターフラグメントと置き換えた。得られた中間体プ
ラスミドｐTZselP−L2はやはりT7−末端部（Terminato
r) 及びHpaI部位を含み、これらは、ワクシニア初期転
写停止信号を挿入し、P7.5プロモーターフラグメントを
0.28から0.18kbにそのサイズを減じることによる次のク
ローニンング工程で取り除かれた。239 bP SaII −NdeI
フラグメントは、アニーリングされたオリゴヌクレオチ
ドＯ−830 （SEQ ID NO : 58 :5 ′−TCG ACT TTT TAT
GA−３′）及びＯ−857 （SEQ ID NO : 59 : 5′−TAT
GAT AAA AAC −３′）から成るSaII−NdeIアダプターに
より置換された。得られるプラスミドはPselP −gpt −
L2（SEQ ID NO : 65) と称した。かかる構造体の他の特
性を次の表に示す。
【０３５２】
【表１０】
【０３５３】Psel P−gP 160MN : pMnenvIのEcoRI −Pv
uII フラグメントを含む3.1kb ｅnv遺伝子をEcoRI 及び
StuI切断プラスミド pselP−gPt-L2に挿入し、中間体プ
ラスミドpselP-gP160.1 を得た。pselP −gP160 の0.8k
b NcoI−NsiIフラグメントを、PCR −発生0.31kb NcoI
−NsiIフラグメントにより置換して、最終的なプラスミ
ドPsel P−gP160 MN（SEQ ID NO : 66) を得た。かかる
プラスミドの他の特性は、次の表に示す。
【０３５４】
【表１１】
【０３５５】PCR 反応に使用するプライマは、Ｏ−NcoI
（40メール（mer)) SEQ ID NO : 60: 5′−GAG CAG AAG
ACA GTG GCC ATG GCC GTG AAG GGG ATC AGG A −３′
及びＯ−Nsi I （30メール(mer)) SEQ ID NO : 61 : 5
′−CAT AAA CTG ATT ATA TCC TCA TGC ATC TGT −
３′であった。更にクローニングするために、PCR 生成
物をNcoI及びNsiIで切断した。
【０３５６】キメラウイルスvSelP −gP 160MN A vselP
−gP160 MNB を次のように構成する：Sel P −gP160 及
びP 7.5 −gpt −遺伝子カセットから成るHpaI−フラグ
メントを、直接分子クローニング（図41）により、極め
て弱毒化したワクシニアウイルス株であるワクシニア株
WR 6/2の単一のSmaI部位〔モス（Moss) らによるJ. Vio
l 40 : 387〜395(1981) 〕へ挿入した。（ブラー(Bulle
r)らによるネーチャー(Nature)317 : 413 〜815 (1985)
を参照) ワクシニアウイルス株WR 6/2〔モス(Moss)らに
よる, 上記〕を、その単一SmaI部位で切断し、P 7.5 −
gpt −遺伝子及びSel P −gP160 −遺伝子カセットを含
む4.0 kb HpaI フラグメントと連結した。クローンニ
ング方法は実施例１に記載したものを実施した。
【０３５７】得られたキメラウイルス、vseIP −gP 160
MNＡ及びvseIP −gP 160MNＢを精製し、更に性格付けし
た。ウイルスvseIP −gP 160MNＡにおいて、gP 160−遺
伝子を、遺伝子が挿入部位の周囲に集積するように同じ
方向（左から右）へ転写した〔Ａ51Ｒ読み取り枠、グー
ベル(Goebel)らによるパイオロジー179 : 247 〜266(19
90)〕。ウイルスvseIP −gP 160MNB において、gP 160
−遺伝子を逆方向に転写した。インビボパッケージング
を実施例３に記載したように実施した。
【０３５８】キメラウイルスの構造： キメラウイルス
の理論的構造を確立するために（図42）、サザンブロッ
ト分析を実施した。精製したウイルスのDNA をSalIで切
断し、フラグメントをアガロースゲル上で分離し、ニト
ロセルロース半透膜に移し、ワクシニアSalF−フラグメ
ントプローブ（pTZ −SalF) 及びgP 160−遺伝子プロー
ブ（pMNenvl)にハイブリッド形成した。SalF−フラグメ
ントプローブに関して、Vsel P−gP 160MNA に対し予想
された6.8 及び10.7kbフラグメントを明らかにする；vs
elP −gP 160MNB に対し、予想された3.5 及び13.7フラ
グメントを明らかにする。gP 160−プローブに関して、
同じフラグメントが観られるが、vselP−gP 160MNA 中
の10.7 kb フラグメントとvsel P−gP 160MNB 中の3.5k
b フラグメントは少し弱い感度の信号を示した。これ
は、各々のフラグメント全部の約400bp のみがプローブ
に対して相同性があるからである。
【０３５９】直接クローニングも、タンデム多重(multi
mer)構造の組込みを得ることができるので、ウイルスの
DNA も、挿入されたDNA を切断しないXbaIにより消化さ
れる。XbaI野性型フラグメントは447bP サイズである。
3.8kb サイズの挿入体の１つのコピーの組込みにより、
4.3 kbのフラグメントが得られる。多重性(multimeric)
構造において、4.3kb フラグメントのサイズは3.8kb の
増大(increment) を増加する。
【０３６０】キメラウイルスvselP −gP 160MNA 及びvs
elP −gP 160MNB に関する形質発現研究：ベロ細胞を、
形質発現研究用に用いた。細胞の成長、キメラウイルス
による感染性及び組み換え体gP 160タンパク質の精製
は、上記のバレット(Barrett)らにより記載されたよう
に実施した。
【０３６１】実施例１０ ヒトタンパク質Ｓ（vprots) を暗号化する新規なキメラ
ワクシニアウイルスの構成及び組み換え体タンパク質Ｓ
の形質発現 本例は、キメラワクシニアウイルスにより形質発現する
組み換え体タンパク質Ｓの構造を示す。ヒトタンパク質
Ｓは、血液凝固の調節因子中に含有される70ｋＤａ糖タ
ンパク質である。ディシピオ(Discipio)らによる、バイ
オケミストリー, 18，89〜904 （1979）に、記載。タン
パク質ＳのCDNA及びゲノムDNA がクローン化され、性格
づけられる。ランドウォール(Lundwall)らによる、Pro
c. Natl,Acad, Sci, USA, 83：6716（1986）に、ホスキ
ン(Hoskins) らによるProc. Natl, Acal. Sci, USA, 8
4：349 （1987）に、エデンブラント(Edenbrandt)らに
よるバイオケミストリー29：7861（1990）に、シュミデ
ル(Schmidel)らによるバイオケミストリー29：7845（19
90）に記載。
【０３６２】肝臓及び内皮細胞中で70ｋＤａタンパク質
として通常合成されるヒトタンパク質Ｓは〔ディスシピ
オ（Dis Scipio) らによる、上記〕、ヒト293 およひハ
ムスターＡＶ12−664 細胞（アデノウイルス形質転換細
胞系）から誘導される終生細胞系中に、７μｇ／106 細
胞／日〔グリンネル(Grinnell)らによるブラッド(Bloo
d) 、76：2546（1990）〕のレベルで、又はマウスＣ127
細胞／パピロマウイルス系中に同様の形質発現レベル
で形質発現する。これはマルム(Malm)らによるEur. J.
Biochem, 187：737 （1990）中に記載。
【０３６３】後者の細胞から誘導されるタンパク質は血
漿に由来するタンパク質Ｓよりも大きく、これは変体グ
リコシル化によると思われる。
【０３６４】タンパク質Ｓのこの形質発現は、ワクシニ
アプロモーターにより各々コントロールされるヒト血液
因子タンパク質Ｓ及びgpt 遺伝子に関する相補的DNA か
ら成る二重遺伝子カセットを用いた。これは、独自のNo
tI部位へクローニ化され、鶏痘ヘルパーウイルスに感染
した哺乳類細胞中にパッケージングされた。ヒトタンパ
ク質Ｓは、106 細胞あたり４〜６μｇのレベルで感染し
たベロ細胞中で形質発現した。
【０３６５】細胞スクリーニング、キメラワクシニアウ
イルスによる最適タンパク質Ｓ形質発現に関し、５つの
異なる宿主細胞系を用いた。WI38( ヒト胚芽肺線維芽細
胞)、CV−１及びベロ（サル腎細胞）、チャン肝細胞及
びSK Hep 1である。タンパク質Ｓは、血漿に由来するタ
ンパク質Ｓから種々の判定基準によっても区別がつきに
くい。この細胞系の感染細胞から誘導される組み換え体
物質は、血漿に由来するタンパク質Ｓと、同じ電気泳動
パターンを示し、また同じクロマトグラフィー溶離プロ
ファイルを示す。このことは、この複雑な糖タンパク質
の、正確な翻訳後(Post-translational)修飾が生じてい
ることを示す。方法を以下に説明する。
【０３６６】プラスミド pN2−gpt a ProtＳの構成 ヒトタンパク質Ｓ（アール・ティー・エー・マックギリ
ブレイ（R.T.A.McGillivray)により製造）に関するcDNA
暗号を含み、プラスミドP ブルースクリプトーProtＳか
ら製造される単一のDNA 鎖は、タンパク質Ｓ暗号領域の
翻訳読み始めコードンの周囲の領域をＮcoI 部位（CCAT
GG) 中に突然変異させるのに用いた。突然変異プライ
マ、oProtS1(SEQ ID NO : 68) は配列５′−ACC CAG GA
C CGC CATGGC GAA GCG CGC −３′を有し；突然変異誘
発は突然変異誘発プロトコール(Protocol)〔アマーシャ
ム(Amersham)社〕に記載されたように実施した。単一の
ペプチドを突然変異させ、第２のアミノ酸をArg からAl
a に変化させる（図43Ｂ及びSEQ ID No77 及び79) 。こ
のことは、更なるクローニングを要求するNcoI部位を導
入し、ATG 読み始めコードンを翻訳に対する最適なコン
テキストにした。このことは、タンパク質Ｓの分泌を改
善する。
【０３６７】タンパク質Ｓ cDNAは次いでN coI −NotI
フラグメントとして切断され、強力な合成ワクシニアプ
ロモータを提供するプラスミドであるワクシニア挿入プ
ラスミドＰTKgpt −selP〔ファルクナー(Falkner) らに
よる、上記〕に挿入した。次いでプロモータータンパク
質Ｓ遺伝子カセットをBglII-NotIフラグメントとして切
断し、プラスミドpN2-gpta( 実施例１）に挿入し、pN2-
gptaProts (SEQ ID NO:67）を得た。この構成物の他の
特性は次の表に示す。
【０３６８】
【表１２】
【０３６９】かかるプラスミドにおいて、ワクシニアウ
イルスＰ7.5 プロモーター及びタンパク質Ｓ cDNAによ
り制御されるgpt −遺伝子は、分岐して転写され、Not
I 部位に隣接する。
【０３７０】ヒトタンパク質Ｓに関するcDNAを、ワクシ
ニアウイルスの単一Not I 部位に挿入してvProt S を形
成。gpt 遺伝子及びタンパク質Ｓ遺伝子カセットから成
るNot I −フラグメントをワクシニアベクターアームと
連結し、FPV 感染した哺乳類CV−１細胞中にトランスフ
ェクションした。パッケージングされたワクシニアウイ
ルスのみが、かかる条件下で増殖した。更に特に、WR株
のワクシニア野性型DNA （１μg)をNot I で切断し、酵
素を65℃で30分間熱−不活性化した。ベクターを、15単
位のＴ４DNAリガーゼを用いて30μl 中で、１μｇの3.8
kb gpt／タンパク質Ｓ遺伝子カセット（Not I フラグ
メントとしてプラスミド pN2gpta−ProtS から切断）に
より１晩連結した。
【０３７１】５日間培養した後に生成した粗ウイルスス
トックを、マイコフェノール酸(MPA) の存在下又は不存
在下で滴定した。かかる工程は、キメラを逆連結野性型
ウイルスから識別した。MPA ４×104 とともに、及びこ
の薬品を用いないで、６×105pfu/106宿主細胞が得られ
た。約６〜７％のウイルス性プラークはキメラウイルス
であった。10のgpt −陽性分離体を、２度プラーグ精製
し、小さい粗ストックに成長させ、CV−１細胞を感染さ
せるのに用いた。全DNA を精製し、制限酵素Sac I 及び
Not I で切断し、サザンブロット分析（図44）に課し
た。クローン化Sac I −Ｉフラグメント（プラスミドpT
Z −Sac ；実施例４）によりハイブリッド形成されたこ
のSacI消化物は、挿入DNA の配向の決定を可能にする
が、これはSac I が挿入体を非対称に切断するからであ
る。全ての10の分離体において、挿入体はａ′−配向で
あり（6.3 及び4.6 kbフラグメント；図４４Ａ及びＣ参
照）、この立体配置は極めて好ましいことを示す。Not
I フラグメントをタンパク質Ｓプローブによりハイブリ
ッド形成した。この場合、3.8 kb Not I遺伝子カセット
が遊離した（図44B) 。
【０３７２】キメラワクシニアウイルスによるヒトタン
パク質Ｓの形質発現 粗ストックをgpt-陽性キメラウイルスから成長させ、種
々の哺乳類細胞系の感染に使用した。単層の５×106 細
胞を、50μg ／mlのビタミンＫで補足された無血清培地
（DMEM) の存在下で0.1 pfu ／細胞で感染させ、72時間
培養した。上澄を収集し、タンパク質Ｓ抗原を、ボーリ
ンガーマンハイム(Boehringer Mannheim) 、FRG （キッ
トNo 1360264) からのELISA 試験キットを用いて決定し
た。
【０３７３】合成されたタンパク質Ｓの量をミリユニッ
トで表１に示す（１Ｕは25μｇのタンパク質Ｓに対応す
る）。更に、ベロ細胞からの10μl の上澄を、標準とし
て50μg のヒトプラズマ由来のタンパク質Ｓと、“hu P
rot S ”〔アクセル(Axell) 〕（図45）に対して特異な
マウスポリクローナル血清を用いてウエスタンブロット
で分析した。
【０３７４】ブロットは、アルカリフォスターゼの接合
したヤギーアンチ−マウスポリクローナル血清〔ダコパ
ッツ(Dakopatts) 〕及びNBT/BCIPを基質として用いて染
色した。
【０３７５】細胞培養上澄からの組換え体タンパク質Ｓ
の精製は、グリンネル（Grinnell),1990, らにより記載
された方法で実施した。
【表１３】
【０３７６】実施例１１：ヒト因子IXを暗号化する新規
なキメラワクシニアウイルスの構成及び組み換え体因子
IXの形質発現
【０３７７】各々ワクシニアプロモーターによって調節
された、ヒト血液因子IX用の相補的DNA 及びgpt 遺伝子
からなる二重遺伝子カセットを、ワクシニアウイルスWR
ゲノムの独自NotI部位中へとクローニングし、鶏痘ヘル
パーウイルスの感染した哺乳類細胞中にパッケージング
した。ヒト因子IXを、幾つかの細胞型において形質発現
させた。
【０３７８】ヒト凝固因子IXは、血液凝固の調節因子中
に含まれる56KDa の糖タンパク質である。この凝固因子
は、複雑な翻訳後修飾を受ける: 第一の12グルタミン酸
残基のビタミンＫ依存カルボキシル化、グリコシル化、
アスパラギン酸の３- ヒドロキシル化及びアミノ末端タ
ンパク質プロセシングである。デイヴィー(Davie),E.W.
の「血液凝固因子: そのcDNA、遺伝子及び形質発現 (th
e Blood CoagulationFactors:Their cDNA s,Genes and
Expression 」;:「止血剤及び血栓症:Hemostasis and T
hrombosis 」コルマン (Colman),R.W., ハーシュ (Hirs
h), マーダー(Marder),V. J.及びザルツマン(Salzman),
E.W., 編集,J.B. リッピンコット（Ｌippincott 社)(19
87年) 。血友病B.X 染色体連結出血障害は、因子IXの突
然変異によって引き起される。血友病の患者は、血漿に
由来する因子IXによる置換によって最近は治療されてい
る。
【０３７９】因子IX(FIX) のcDNA及びゲノムDNA は、終
生細胞系内でクローニング及び性格付けされてきてお
り、FIX は、終生細胞系内で形質発現されてきている。
バスビー等(Basby et al.)の「ネイチャー誌:Nature
」,316:271(1985 年);カウフマン等(Kaufman,et al.)
の「J.Biol.Chem.」261:622 (1986 年);バラン等(Balla
nd,et al), 「Eur.J.Biochem.」172:565(1922年);及び
リン等(Lin et al),「J.Biol.Chem.」,265:144(1990
年) 。また、ワクシニア組み換え体中の因子IXの形質発
現も、記述されてきている。デ ラ サール等(da la S
alle,et al. 」の「ネイイチャー:Neture.」316:268(19
85年) 。
【０３８０】プラスミドの構成。 pN2gpta-FIX:このFIX cDNA( 親切にもR.T.A.マクギリヴ
レイ(Mac Gillivray)に提供して戴いた) を、EcoRI に
よってプラスミドp ブルースクリプト-FIXから切り出
し、EcoRI 直鎖状プラスミドpTM3と連結した。モス等
「ネイチャー:Nature 」348:91(1990 年) 。このFIX 挿
入物を正しい配向で含有する組み換え体プラスミドから
一本鎖DNA を分離し、オリゴヌクレオチドoFIX.1(SEQ I
D NO:71:5 ′-TCA TGT TCA CGS GCT CCA TGG CCG CGG C
CG CAC C-3′) 及び市販の突然変異誘発キット( アメル
シャム (Amershdm) インコーポレーテッドのキットN
o.PPN 1523)を用いた、オリゴヌクレオチド媒介部位に
向けた突然変異誘発によって、このFIX ATG 読み始めコ
ドンのまわりにNcoI部位(CCATGG)を導入した。ベクター
とFIX NcoI部位とを融合させ、挿入DNA をNcoI及びNotI
消化によって分離し、このNcoI/NotI 切断ベクターpTKg
pt-se 1Pと連結させた。フォークナー等(Falkner et a
l.)上記。プロモーター/FIXカセットを、このプラスミ
ドからBg IV及びNotIによって切り出し、BamHI/NotI直
鎖状ベクターpN2-gpta (実施例１）と連結させた。この
構成体から、FIX cDNA(se1P プロモータの調節下にあ
る) を含有するNot I カセットとgpt 遺伝子( ワクシニ
アP7.5プローモーターの調節下にある) を分離し、実施
例10に記載したように、インビトロ分子クローニング及
びパッケージングのために用いた。
【０３８１】このプラスミドの更なる特性を、下記の表
に示す。
【表１４】
【０３８２】ヒト因子IX用のcDNAを、ワクシニアウイル
スの単一NotI部位中へと挿入する。この因子IX cDNA を
ワクシニアウイルス中へと挿入するのに先立って、この
cDNAをプラスミドpN2-gpta中へと挿入し、プラスミド p
N2 gpta-FIX を得た (図46A,SEQ ID NO :72)。合成ワク
シニアプロモーターと因子IX暗号領域との間で最適の配
列コンテキストを得るため、因子IXの読み始めコドンに
新しいNcoI部位を導入し、かつこのNcoI部位を、プロモ
ーターによって与えられたNcoI部位と融合させることに
よって、因子IXの5 ´- 非翻訳領域を欠失させた。この
突然変異により、突然変異信号ペプチドが得られた (図
46B)。野性型の因子IXにおいては、この信号ペプチドの
第二のアミノ酸はグルタミン酸残基であり、一方pN2gpt
a-FIX においては、この第二のアミノ酸は、グルタミン
酸残基である。
【０３８３】このgpt-遺伝子及び因子IX遺伝子カセット
からなるNotIフラグメントを、ワクシニアベクターアー
ムと連結させ、FPV の感染した哺乳類CV-1細胞中へとト
ランスフェクションさせた。パッケージングされたワク
シニアウイルスのみが、これらの条件下で増殖した。５
日間の培養後に得られた粗ウイルスストックを、マイコ
フェノール酸(MPA) の存在下及び不存在下に滴定した。
この手順により、逆連結した野性型ウイルスからキメラ
を識別した。MPA を５×104 と共に、及びこの薬品なし
に、106 個の宿主細胞当り５×106 pfu の力価を得た。
この実施例においては、ウイルスプラークの約１％がキ
メラウイルスであった。これらのgpt-陽性の分離株のう
ち10を、二回プラーク精製し、小さな粗ストックとなる
まで成長させ、CV-1細胞に感染させるために用いた。全
DNA を、各ウイルス分離株の感染した８つの細胞培養物
から調製し、制限酵素SfrI,Ndel 及びNotIによって消化
し、サザンブロット分析に供した。
【０３８４】因子IXプローブとハイッブリット形成した
このSfuI消化物を、挿入DNA の配向決定に供した。なぜ
ならSfuIはこの挿入体を非対称的に切断するからであ
る。８つの分離株すべてにおいて、これらの挿入体は
「a 」配向であり(6.3及び4.6Kbのフラグメント; 図47
参照) 、この立体配置が強く優先することを示す。ま
た、NdeI(NotI)フラグメントも、因子IXプローブとハイ
ブリッド形成させた。この場合は、656Kb のフラグメン
ト(3.8KbのNotI遺伝子カセット) が遊離し、この予想さ
れた構造の存在が証明された。
【０３８５】ヒト因子IXの形質発現。粗ストックを、８
つの単一プラーク分離株から成長させ、種々の哺乳類細
胞系の感染のために用いた。10cmペトリ皿中の５×106
個の細胞を、無血清培地(DMEM)及び50μg/mlのビタミン
Ｋの存在下に、細胞１個当り0.1pfuのモイ(moi) で、感
染させた。感染した細胞を、ペトリ皿の底から細胞が離
れ始めるまで、72時間培養した。上澄液を集め、細胞フ
ラグメントを遠心分離によって除去し、ボリンゲル(Boe
hrimger)マンハイム,FRG (キット Nr.1360299)からのイ
ライザ試験キットを用いてFIX 量を測定した。FIX 抗原
の量と因子IX活性の量とを、表46に示す。
【０３８６】また、ベロ(Vero)細胞からの10μl の上澄
液を、標準として50ngのヒトプラズマ由来のhuFIX と、
huFIX(Axell)に特異的なマウス ポリクローナル血清と
を用いて、ウエスタンプロットで分析した。アルカリホ
スファターゼの接合したヤギーアンチーマウスポリクロ
ーナル血清 (ダコパッツ:Dako patts)及びNBT/BCIPを基
質として用いることで、ブロットを染色した。図48に示
すように、組み換え物質は、プラズマに由来する因子IX
標準に類似する広いバンドとして移動した。部分精製し
たベロ(Vero)細胞に由来する因子IXの凝固アッセイの示
すところでは、この物質の約50％が活性の因子IXであっ
た。このウイルス分離株♯5 (vFIX ♯5と示す) を大規
模に成長させ、更に実験用に用いた。
【０３８７】タンパク質Ｓキメラウイルス（実施例10)
の場合におけるように、因子EXを形質発現するキメラ
は、一つの好適な配向で挿入体を有していた。
【０３８８】興味の対象である遺伝子の転写のタンパク
質（因子IX及びタンパク質Ｓ）は、右から左であり、即
ち、NotI部位の周囲でクラスターされた遺伝子と同じ方
向である。従って、強く転写された単位は、NotIクラス
ター中へとクローニングする際には、好ましい転写方向
で配列されるのに違いないように思える。この立体配置
の挿入体を有するウイルスは、非常に好ましく、最高の
成長性を示す。第二の遺伝子カセット、P7.5gpt 遺伝子
の転写の方向は、左から右である。従って、このP7.5プ
ロモーターセグメントは、近くの7.5 KDa タンパク質用
の内因性遺伝子暗号に対して逆反復立体配置を有し、即
ち、この予想される安定な立体配置が好ましい。これと
逆の配向を有するキメラは見られないので、「b 」配向
はおそらく不安定である。上記の遺伝子カセットを「b
」配向でインビボ組み換えによって挿入することが失
敗であったとしたら、NotI遺伝子間領域がウイルスの成
長に不可欠であるという誤解をもたらしたからであろ
う。この状況は、直接分子クローニングというアプロー
チの持つ利点の一つを示すものである。即ち、「許容さ
れる」構造のみが形成されるのである。
【０３８９】単純で小さい遺伝子カセットを挿入するこ
とによって、双方の配向と多量体とが得られた（実施例
１）。一方、複雑な遺伝子カセット(P7.5 プロモーター
セグメントのような内部遺伝子に相同の分岐転写された
二重遺伝子カセット) を挿入することによって、好適な
構造体が形成された。
【０３９０】最適因子IXの形質発現の細胞スクリーニン
グが示すところでは、CV-1及びSK Hep1 細胞が感染する
と、最高の抗原レベルがもたらされる。CV-1 細胞から
の物質は、高い凝固活性 (表1５) を有し、この細胞系
が有効な翻訳後修飾系を有することを示す。因子IXは、
P7.5プロモーター及びHep G2及びBHK 細胞〔デ ラ サ
レ(de la Salle) らによる、1985〕を用いる従来のワク
シニア形質発現系において、前に(previously)形質発現
した。ベロ及びCV-1細胞のようなより良い成長特性を有
する細胞系は、インスタントウイルスにより高いレベル
の形質発現を生成することを示し、これは優れたプロモ
ーター及び方法に依るからである。更に、因子IX cDNA
の5 ´- 未翻訳領域の欠失及び信号ペプチドの修飾は、
分泌及び形質発現レベルに有利な効果をもたらす。
【０３９１】
【表１５】
【０３９２】実施例１２ キメラ鶏痘ウイルスｆ−envIIIB の構成及びニワトリ胚
繊維芽細胞における組み換え体HIV IIIBエンベロープタ
ンパク質の形質発現 ワクシニアウイルス−ベロ細胞形質発現系における大規
模なgp160 の生成が近年開示された〔バレット(Barret
t) ら、1989) 。ワクシニアウイルスは哺乳類を含む多
くの脊椎動物に大してやはり病原性であり、更に鶏痘ウ
イルスは鳥類に制限される宿主であるので、我々はアビ
ポックスを基礎として形質発現系を呈した（米国特許出
願第０７／７３４７４１号及びそのCIP)。キメラ鶏痘ウ
イルスは直接分子クローニングにより構成され、HIV-1
IIIB分離体〔ラトナ(ratner)らによる、1985) のエンベ
ロープ遺伝子を形質発現する。かかる組み換え体ウイル
スにおいて、env 遺伝子は、強力な合成後期プロモータ
ーにより制御される。エンベロープ糖タンパク質の生成
に関して、キメラ鶏痘ウイルスを用いて、ニワトリ胚集
合細胞培養に感染させた。マンド(Mundt) ら、PCT/WO 9
1 709 937 号。
【０３９３】 キメラ鶏痘ウイルスｆ-envIIIBの構造及び構成 ｆ−envIIIB の構成に関して（図４９）、Ｐ7.5-プロモ
ーター/gpt遺伝子及びS4- プロモーター/gp160遺伝子か
ら成る二重遺伝子カセットを、プラスミドpN2gpt-gp160
（実施例５）からNotI−フラグメントとして切断した。
かかるカセットを、鶏痘ウイルスf-TK2a（実施例２）の
NotI−切断ゲノムDNA と連結し、キメラウイルスをマテ
リアルズ エンド メソッド(Materials and Method)に
記載されたように分離した。12個の異なるプラークに感
染させたニワトリ胚繊維芽細胞からの全DNA を、SspIで
消化し、更にサザンブロットにより分析し、プローブと
して分離したgp160 フラグメントを用いてハイブリッド
形成した（図５０）。3.7,1.0及び0.8 kbの予期される
フラグメントは、11ケース中において、gp160 遺伝子が
ｂ′−配向に組込まれていることを示すことが観られ
た。
【０３９４】１個のウイルス性分離体、f-LF2eはgp 160
プローブにハイブリッド形成しなかった。挿入するのに
好ましい１つの配向が存在するということは、ｂ′配向
ウイルスの方がａ′−配向のものよりも優位に成長する
可能性を示し、これはａ′−配向が不安定であるからで
ある。ウイルス性のベクターが最も良い配向を選定する
のは、直接クローニングアプローチの利点として考えら
れる。
【０３９５】 キメラウイルスf-envIIIB に関する形質発現研究 形質発現研究を、ニワトリ胚繊維芽細胞(CEF) において
実施した。CEF の融合性単層を、異なるウイルス性の粗
ストックの細胞あたり0.1pFuで感染させ、５日間成長さ
せた。全体の細胞性タンパク質を10％のポリアクリルア
ミドゲル上に分離してニトロセルロース膜に移し、更に
マテアリルズ エンド メソッド(Materials and Metho
ds) に記載された方法で実施した。gp160, gp120及びgp
41の形質発現を示すウェスタンブロットを図５２及び５
３に示す。f-LF2eを除く全てのウイルス性分離体は、en
v 糖タンパク質の形質発現を誘発した。ウイルスf-LF2e
はサザンブロットにおいては陰性であるので、gp160 遺
伝子配列をキャリーしていない。
【０３９６】f-envIIIB の構成 ２マイクログラムの宿主ウイルスベクターf-TK2a（実施
例２）のDNA をNotIで切断し、500 ナノグラムのP7.5-
プロモーター／gpt 遺伝子及びS4−プロモーター／gp16
0 遺伝子から成る遺伝子カセットと連結した。この連結
は、20μl の容積で５Ｕのリガーゼ中で４日間、12℃で
実施した。連結混合物を、HP1441のプラーク−精製によ
り得られた鶏痘分離体にHP2 の細胞あたり0.5pfuで感染
させ、６×１０6CEFs にトランスフェクションした。５
日間培養した後、粗ストックを生成し（最終容積１ml)
、これを増殖させた。この粗ストックを６穴プレート
中でCFE 上に滴下し、gpt-選定下で５日間成長させた(2
5 μg/mlマイコフェノール(mycophenolic)酸、125 μg
キサンチン) 。最小の希釈が、観察できる細胞変性効果
をもたらす細胞を得ることができ、同じプロトコールに
おいて２倍に増殖させた。第２の増殖から得られる粗ス
トックを、gpt-選定及び12シングルプラーク(f-LF
2ａ−1)の存在下、CEF 上で行い、ピックした。
【０３９７】gp160 のウェスタンブロット。ウェスタン
ブロットをタウビン(Towbin)らによる上記に記載された
ように実施した。gp160/gp120 検出に関し、第１抗体
は、マウスモノクローナルアンチ−HIV-gp120 抗体（デ
ュポン社、＃NEA9305 、1:500の希釈で用いる) であっ
た。gp41検出に関しては、ヒトアンチ-HIV-gp41 3D6 Ma
b 〔エイチ．カチンガー(H. Katinger) により製造、ユ
ニバーシタット フューボーデン ワルター社(Univers
itat fur Bodenkultur) 、アンゲワンテ(Angewandte)、
ミクロバイオロジー(Mikrobiologie) を1:500 の希釈
で用いた。第２抗体はアルカリフォスフェートと結合し
たヤギ−アンチ−マウスIgG(H+L) バイオラド(BioRad)
社、#170〜6520〕を１：1000の希釈で用いた。試薬(BCI
P 及びNBT)と染色プロトコールはプロメガ(Promega) 社
から入手した。
【０３９８】配列の一覧表 (1)一般資料 (i) 出願人：Ｆ．ドルナー, Ｆ．シェイフリンガー Ｆ．Ｇ．ファルクナー, Ｍ．フライデラー (ii)発明の名称：修飾真核細胞質DNAウイルスゲノムの
直接分子クローニング (iii) 配列の数：４８ (iv)連絡先 : (A)受信人: フォーリー アンド チードナー (B)通り：ダイアナゴル ロード １８００ スウイー
ト ５００ (C)市 : アレクサンドリア (D)州 : バージニア (E)国 : アメリカ合衆国 (F)ジップコード :２２３１３−０２９９ (V) コンピュータ可読形式: (A) 媒体のタイプ：フロッピーディスク (B) コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ コンパティブル (C) 操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ (D) ソフトウェア：リリース(Release) # 1.0, バージ
ョン (Version) # 1.25中の特許 (vi)現出願データ: (A) 出願番号: ０７／７５００８０ (B) 出願日 : １９９１年８月２６日 (C) 分 類 : 未定 (Viii)代理人情報: (A) 氏 名 : ベント スティーブン エイ (B) 登録番号: ２９７６８ (C) レファレンス／ドケット番号：３０４７２／１０６
ＩＭＭＵ (ix)通信情報： (A) 電話：（７０３）８３６−９３００ (B) テレファックス：（７０３）６８３−４１０９ (C) テレックス：８９９１４９
【０３９９】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４８塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣ
Ｅ）： (B) クローン: ｐＮ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１：
【表１６】
【０４００】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１１３３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣ
Ｅ）： (B) クローン: ｐＮ２−ｇｐｔａ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２：
【表１７】
【０４０１】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１１３３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＮ２−ｇｐｔｂ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３：
【表１８】
【０４０２】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：６６塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＨｉｎｄＪ−２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４：
【表１９】
【０４０３】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１２７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＨｉｎｄＪ−３ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
５：
【表２０】
【０４０４】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１１５塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＡ０ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６：
【表２１】
【０４０５】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１０３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＡ１ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７：
【表２２】
【０４０６】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１０３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＡ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
８：
【表２３】
【０４０７】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２１３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＡ１−Ｓ１ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
９：
【表２４】
【０４０８】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２１５塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＡ２−Ｓ１ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０：
【表２５】
【０４０９】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：８８塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＡ１−Ｓ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
１：
【表２６】
【０４１０】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：９２塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＡ２−Ｓ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
２：
【表２７】
【０４１１】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１２７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３Ａ（図２５） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
３：
【表２８】
【０４１２】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１３４塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ４ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
４：
【表２９】
【０４１３】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１９８８塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＡ１Ｓ１−ＰＴ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
５：
【表３０】
【表３１】
【０４１４】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２６塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏｄＮ１ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
６：
【表３２】
【０４１５】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１１１塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＮ２ｇｐｔ−Ｇｐｇ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
７：
【表３３】
【０４１６】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２２９６塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＮ２ｇｐｔ−Ｌｐｇ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
８：
【表３４】
【表３５】
【０４１７】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５６塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＮ２ｇｐｔ−ｇｐ１６０ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
９：
【表３６】
【０４１８】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：３３１塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐｖＷＦ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
０：
【表３７】
【０４１９】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５０塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＥｃｏｋ−ｄｈｒ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
１：
【表３８】
【０４２０】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１２０９塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐｄｈｒ−ｇｐｔ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
２：
【表３９】
【０４２１】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２６塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏｄＮ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
３：
【表４０】
【０４２２】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２４塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏｄＮ３ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
４：
【表４１】
【０４２３】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１８塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｉ−ＳｃｅＩ リンカー １ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
５：
【表４２】
【０４２４】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１８塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｉ−ＳｃｅＩ リンカー ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
６：
【表４３】
【０４２５】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏｄｓ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
７：
【表４４】
【０４２６】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２６塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏｄＳ３ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
８：
【表４５】
【０４２７】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ＳｆｉＩ(1) (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
９：
【表４６】
【０４２８】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ＳｆｉＩ(2) (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
０：
【表４７】
【０４２９】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：６６塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏｄＴＫ１ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
１：
【表４８】
【０４３０】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：７９塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−Ｊ(1) (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
２：
【表４９】
【０４３１】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：７９塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−Ｊ(2) (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
３：
【表５０】
【０４３２】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１８塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏｄＴＫ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
４：
【表５１】
【０４３３】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２１塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏｄＴＫ３ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
５：
【表５２】
【０４３４】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：７５塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣ
Ｅ）： (B) クローン: Ｐ−Ａ（０，１） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
６：
【表５３】
【０４３５】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：８３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−Ａ（０，２） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
７：
【表５４】
【０４３６】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５５塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣ
Ｅ）： (B) クローン: Ｐ−ａｒｔＰ（１１） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
８：
【表５５】
【０４３７】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５５塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−ａｒｔＰ（１２） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
９：
【表５６】
【０４３８】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：９３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣ
Ｅ）： (B) クローン: Ｐ−ａｒｔＰ（８） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
０：
【表５７】
【０４３９】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：９７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−ａｒｔＰ（１０） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
１：
【表５８】
【０４４０】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５０塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: オリゴヌクレオチド Ｐ−ｈｒ（３） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
２：
【表５９】
【０４４１】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１０塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
３：
【表６０】
【０４４２】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−Ｐ２ ５′（１） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
４：
【表６１】
【０４４３】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５０塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−Ｐ２ ３′（１） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
５：
【表６２】
【０４４４】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２０塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−ＳＭ（２） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
６：
【表６３】
【０４４５】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−ＳＭ（３） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
７：
【表６４】
【０４４６】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−ＭＮ（１） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
８：
【表６５】
【０４４７】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：３０塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−ＭＮ（２） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
９：
【表６６】
【０４４８】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−Ｓｅｑ（２） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
０：
【表６７】
【０４４９】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２５塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: Ｐ−Ｓｅｑ（３） (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
１：
【表６８】
【０４５０】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４５塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−５４２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
２：
【表６９】
【０４５１】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−５４４ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
３：
【表７０】 CTAGATTTTT ATGGCCGGCT AGGCCGCGGC CGCGTTAACT ACGTAAT 47
【０４５２】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５０塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−５４１ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
４：
【表７１】 CTTTTTCTGC GGCCGCGGAT ATGGCCCGGT CCGGTTAACT ACGTAGACGT 50
【０４５３】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−５４３ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
５：
【表７２】 CTACGTAGTT AACCGGACCG GGCCATATAG GCCGCGGCCG CAGAAAAAGC ATG 53
【０４５４】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５１塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−ｓｅｌＰＩ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
６：
【表７３】 CGATAAAAAT TGAAATTTTA TTTTTTTTTT TTGGAATATA AATAAGGCCT C 51
【０４５５】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５３塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−ｓｅｌＰＩＩ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
７：
【表７４】 CATGGAGGCC TTATTTATAT TCCAAAAAAA AAAAATAAAA TTTCAATTTT TAT 53
【０４５６】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１４塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−８３０ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
８：
【表７５】 TCGACTTTTT ATCA 14
【０４５７】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１２塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−８５７ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
９：
【表７６】 TATGATAAAA AC 12
【０４５８】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４０塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−ＮｃｏＩ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
０：
【０４５９】
【表７７】 GAGCAGAAGA CAGTGGCCAT GGCCGTGAAG GGGATCAGGA 40 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：３０塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏ−ＮｓｉＩ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
１：
【表７８】 CATAAACTGA TTATATCCTC ATGCATCTGT 30
【０４６０】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４１４５塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＳ２ｇｐｔ−Ｓ４ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
２：
【表７９】
【表８０】
【表８１】
【０４６１】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４２７７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＳ２ｇｐｔ−Ｐ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
３：
【表８２】
【表８３】
【表８４】
【０４６２】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４７０１塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＴＺ−Ｌ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
４：
【表８５】
【表８６】
【表８７】
【０４６３】 (2) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：３８７８塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐｓｅｌｐ−ｇｐｔ−Ｌ２ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
５：
【表８８】
【表８９】
【表９０】
【０４６４】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：６４７４塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐｓｅｌｐ−ｇｐ１６０ＭＮ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
６：
【表９１】
【表９２】
【表９３】
【表９４】
【０４６５】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：６８１１塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＮ２−ｇｐｔａ ｐｒｏｔＳ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
７：
【表９５】
【表９６】
【表９７】
【表９８】
【０４６６】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：２７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏｐｒｏｔＳｌ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
８：
【表９９】 ACCCAGGACC GCCATGGCGA AGCGCGC 27
【０４６７】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：６９２６塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＰ２−ｇｐ１６０ＭＮ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
９：
【表１００】
【表１０１】
【表１０２】
【表１０３】
【０４６８】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４９塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｓｅｌｐ プロモーター (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
０：
【表１０４】 TATGAGATCT AAAAATTGAA ATTTTATTTT TTTTTTTTGG AATATAAAT 49
【０４６９】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：３４塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｏＦＩＸ．１ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
１：
【表１０５】 TCATGTTCAC GCGCTCCATG GCCGCGGCCG CACC 34
【０４７０】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５５３２塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：１本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｐＮ２ｇｐｔａ−ＦＩＸ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
２：
【表１０６】
【表１０７】
【表１０８】
【表１０９】
【０４７１】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１４塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：２本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: 野性型 ｇｐ１６０ＭＮ (ix) 特徴： (A) ネーム／キー（ＮＡＭＥ／ＫＥＹ）：ＣＤＳ (B) 位置：３．．１４ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
３：
【表１１０】 CA ATG AGA GTG AAG 14 Met Arg Val Lys 1
【０４７２】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４アミノ酸 (B) タイプ：アミノ酸 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：タンパク質 (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
４：
【表１１１】
【０４７３】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１４塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：２本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: ｖｓｅｌｐ−ｇｐ１６０ ウイルス中の
ｇｐ１６０ (ix) 特徴： (A) ネーム／キー：ＣＤＳ (B) 位置：３．．１４ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
５：
【表１１２】 CC ATG GCC GTG AAG 14 Met Ala Val Lys 1
【０４７４】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：４アミノ酸 (B) タイプ：アミノ酸 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：タンパク質 (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
６：
【表１１３】
【０４７５】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１８塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：２本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: 野性型タンパク質／Ｓ (ix) 特徴： (A) ネーム／キー：ＣＤＳ (B) 位置：４．．１８ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
７：
【表１１４】 GAA ATG AGG GTC CTG GGT 18 Met Arg Val Leu Gly 1 5
【０４７６】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５アミノ酸 (B) タイプ：アミノ酸 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：タンパク質 (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
８：
【表１１５】
【０４７７】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１８塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：２本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: キメラ中のタンパク質Ｓ′ (ix) 特徴： (A) ネーム／キー：ＣＤＳ (B) 位置：４．．１８ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
９：
【表１１６】 GCC ATG GCG GTC CTG GGT 18 Met Ala Val Leu Gly 1 5
【０４７８】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５アミノ酸 (B) タイプ：アミノ酸 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：タンパク質 (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
０：
【表１１７】
【０４７９】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：２本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: 野性型因子／ＩＸ (ix) 特徴： (A) ネーム／キー：ＣＤＳ (B) 位置：３．．１７ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
１：
【表１１８】 TT ATG CAG CGC GTG AAC 17 Met Gln Arg Val Asn 1 5
【０４８０】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５アミノ酸 (B) タイプ：アミノ酸 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：タンパク質 (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
２：
【表１１９】
【０４８１】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：１７塩基対 (B) タイプ：核酸 (C) 鎖の数：２本 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：他の核酸 (A) 分類学上の記載：合成 ＤＮＡ オリゴヌクレオチ
ド (vii) 即時型供給源： (B) クローン: 因子ＩＸ ｖＦＩＸ＃５ (ix) 特徴： (A) ネーム／キー：ＣＤＳ (B) 位置：３．．１７ (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
３：
【表１２０】 CC ATG GAG CGC GTG AAC 17 Met Glu Arg Val Asn 1 5
【０４８２】 （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４についての情報： (i) 配列の特性： (A) 長さ：５アミノ酸 (B) タイプ：アミノ酸 (D) トポロジー：直線状 (ii) 分子のタイプ：タンパク質 (xi) 配列の分類学上の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
４：
【０４８３】
【表１２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】ポックスウィルスの修飾ゲノムによる標識遺伝
子の形質発現を示す展開図である。
【図２】ポックスウィルス ゲノムの直接分子クローニ
ングを示す説明用線図である。
【図３】プラスミドｐＮ２−ｇｐｔａおよびｐＮ２−ｇ
ｐｔｂの構造を示す説明用線図である。
【図４】直接分子クローニングにより生成したポックス
ウィルス ゲノムからのプラーク−精製ウィルスＤＮＡ
のサザン・ブロット分析の結果を示す展開図である。
【図５】サザン−ブロット分析を用いて得た修飾ポック
スウィルスＤＮＡの構造を説明するための展開図であ
る。
【図６】野生型（ＷＴ）ワクシニアおよび修飾クローン
（ｖｐ７）からのＤＮＡの比較を説明するための展開図
である。
【図７】ｇｐｔ−遺伝子プローブを用いる図６に示すゲ
ルのサザン−ブロット分析の結果を示す展開図である。
【図８】感染細胞からのワクシニア ウィルスＤＮＡの
サザン−ブロット分析の結果を示す展開図である。
【図９】ｇｐｔ−遺伝子プローブを用いる図８に示すゲ
ルにおけると同じ試料のサザン−ブロット分析の結果を
示す展開図である。
【図１０】ｇｐｔ−遺伝子プローブを用い、ＰｓｔＩで
制限した図８に示すゲルにおけると同じウィルスＤＮＡ
のサザン−ブロット分析の結果を示す展開図である。
【図１１】ワクシニア ウィルスＤＮＡの修飾ＰｓｔＩ
「Ｃ」フラグメントの構造の外形を示す説明用線図であ
る。
【図１２】組換え体アビポックス（鶏痘（ＦＰ））の分
析の結果を示す展開図である。
【図１３】直接分子クローニングにより外来遺伝子を形
質発現する鶏痘ウィルスの構造を示す説明用線図であ
る。
【図１４】細胞外ゲノム工学技術および細胞内パッケー
ジングによる修飾ポックスウィルスを構成するプロセス
の各段階を説明する工程図である。
【図１５】処理ワクシニア ウィルス ゲノムが独自Ｓ
ｍａＩ切断部位において予想挿入を含んでいることを説
明するための展開図である。
【図１６】独自ＳｍａＩ部位に挿入した遺伝子カセット
を有する修飾ワクシニア ウィルス ゲノムの予想構造
の外形を示す説明用線図である。
【図１７】望ましくないＮｏｔＩおよびＳｍａＩ部位の
欠失を含むワクシニア ウィルスゲノムの直接分子修飾
だけを用いる方法を説明する工程図である。
【図１８】ワクシニア ウィルスおよび修飾プラスミド
による標識釈放技術を用いる図１７に示す方法とは別の
方法を説明する工程図である。
【図１９】プラスミドｐＴＺ−ＳａｌＦＨの構造を示し
ている、ＳｍａＩ部位を標識釈放により欠失する図１７
に示す方法とは別の方法を説明する工程図である。
【図２０】プラスミドｐＨｉｎｄＪ−３の構造を示す説
明用線図である。
【図２１】プラスミドｐＡ１およびｐＡ２の構造を示す
説明用線図である。
【図２２】プラスミドｐＡ１−Ｓ１およびｐＡ２−Ｓ１
の構造を示す説明用線図である。
【図２３】プラスミドｐＡ１−Ｓ２およびｐＡ２−Ｓ２
の構造を示す説明用線図である。
【図２４】プラスミドｐＮ２−ｇｐｔａおよびｐＮ２−
ｇｐｔｂの構造を示す説明用線図である。
【図２５】プラスミドｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ３ＡおよびｐＮ
２ｇｐｔ−Ｓ４の構造を示す説明用線図である。
【図２６】プラスミドｐＡ１Ｓ１−ＰＴの構造を示す説
明用線図である。
【図２７】プラスミドｐＮ２ｇｐｔ−ＧＰｇの構造を示
す説明用線図である。
【図２８】プラスミドｐＮ２ｇｐｔ−ＬＰｇの構造を示
す説明用線図である。
【図２９】プラスミドｐＮ２ｇｐｔ−ｇｐ１６０の構造
を示す説明用線図である。
【図３０】プラスミドｐＴＺｇｐｔ−Ｓ３ＡｌａｃＺの
構造を示す説明用線図である。
【図３１】プラスミドｐＴＺＳ４−ｌａｃＺａ／ｂの構
造を示す説明用線図である。
【図３２】ＶＶベクターｖＳ４の構造を示す説明用線図
である。
【図３３】ワクシニア ウィルス菌株ｖｖＷＦの構造を
示す説明用線図である。
【図３４】ワクシニア ウィルスＤＮＡを鶏痘ヘルパー
ウィルスによりパッケージングする場合のＤＮＡの添
加量の効果を示すグラフである。
【図３５】プラスミドｐＥｃｏＫ−ｄｈｒの構造を示す
説明用線図である。
【図３６】プラスミドｐＳ２ｇｐｔ−Ｐ２およびｐＰ２
ｇｐ１６０MNの構造を示す説明用線図である。
【図３７】ウィルスｖＰ２−ｇｐ１６０ＭＮＡおよびｖ
Ｐ２−ｇｐ１６０ＭＮＢの構造の外形を示す説明用線図
である。
【図３８】野生ワクシニア ウィルスのＰｓｔＩ−Ｅ−
フラグメントおよびｇｐ１６０遺伝子を含むキメラ ウ
ィルスのＰｓｔＩ−フラグメントの地図を示す説明用線
図である。
【図３９】プラスミドｐＴＺ−Ｌ２，ｐＴＺｓｅｌＰ−
Ｌ２およびｐｓｅｌＰ−ｇｐｔ−Ｌ２の構造を示す説明
用線図である。
【図４０】プラスミドｐｓｅｌＰ−ｇｐ１６０MNの構造
を示す説明用線図である。
【図４１】キメラ ウィルスｖｓｅｌＰ−ｇｐ１６０Ｍ
ＮＡおよびｖｓｅｌＰ−ｇｐ１６０ＭＮＢの構造の外形
を示す説明用線図である。
【図４２】野生型ワクシニア ウィルスのＳａ１Ｉ−Ｆ
−フラクション、およびキメラワクシニア ウィルスｖ
ｓｅ−ｇｐ１６０ＭＮＡおよびｖＰ２−ｇｐ１６０ＭＮ
ＢのＳａ１Ｉ−フラグメントの地図を示す説明用線図で
ある。
【図４３】プラスミドｐＮ２−ｇｐｔａＰｒｏｔＳの構
造を示す説明用線図である。
【図４４】タンパク質Ｓ遺伝子を担持するキメラ ワク
シニア ウィルスのサザン−ブロット分析の結果を示す
展開図である。
【図４５】プラスマ−誘導タンパク質および組換え体タ
ンパク質のウエスタン−ブロット分析の結果を示す展開
図である。
【図４６】プラスミドｐＮ２ｇｐｔａ−ＦＩＸの構造を
示す説明用線図である。
【図４７】因子ＩＸキメラのサザン−ブロット分析の結
果を示す展開図である。
【図４８】Ｖｅｒｏ細胞における因子ＩＸ形質発現のウ
エスタン−ブロット分析の結果を示す展開図である。
【図４９】キメラ鶏痘ウィルスｆ−ｅｎｖ IIIＢの構造
を示す説明用線図である。
【図５０】インビトロ クローン化した鶏痘ウィルスの
サザン−ブロット分析の結果を示す展開図である。
【図５１】キメラ鶏痘ウィルスのＳｓｐＩ制限フラグメ
ントの地図を示す説明用線図である。
【図５２】キメラ鶏痘ウィルスに感染したニワトリ胚繊
維芽細胞におけるｇｐ１６０の形質発現を示す展開図で
ある。
【図５３】キメラ鶏痘ウィルスに感染したニワトリ胚繊
維芽細胞におけるｇｐ４１形質発現を示す展開図であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月１６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４４】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４５】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４７】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４８】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５０】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５２】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ファルコ−ギュンター ファルクナー オーストリア国 アー−2304 マンスドル フ 番地なし (72)発明者 ミカエル フライデラー オーストリア国 アー−2285 ブライトシ ュテッテン 19

Claims (102)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 修飾ウイルスゲノムの直接分子クローニ
    ングにより修飾真核細胞質ＤＮＡウイルスを産生する方
    法であって、前記方法が、（Ｉ） 前記修飾ウイルスゲ
    ノムを含む修飾ＤＮＡ分子を産生するために、細胞外の
    条件下で第１真核細胞質ＤＮＡウイルスの第１ゲノムを
    含む精製ＤＮＡ分子を修飾し、（II） 前記修飾ＤＮＡ
    分子を、前記修飾ウイルスゲノムを感染性ビリオンにパ
    ッケージする第１宿主細胞に導入し、（III) 前記第１
    宿主細胞から前記修飾ウイルスゲノムを含む感染性ビリ
    オンを回収する、 工程を含むことを特徴とする修飾真核細胞質ＤＮＡウイ
    ルス産生方法。
  2. 【請求項２】 前記ＤＮＡ分子を細胞外の条件下で修飾
    する工程が前記ＤＮＡ分子を配列−特異的エンドヌクレ
    アーゼを用いて切断する工程を含むことを特徴とする請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ＤＮＡ分子を修飾する工程が第１Ｄ
    ＮＡ配列を前記第１ゲノムに挿入する工程を含むことを
    特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記第１ＤＮＡ配列を前記第１ゲノムに
    配列−特異的エンドヌクレアーゼに対する切断部位にて
    挿入することを特徴とする請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 配列−特異的エンドヌクレアーゼに対す
    る前記切断部位が前記第１ゲノム中の独自部位であるこ
    とを特徴とする請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ＤＮＡ分子を修飾する工程が、リン
    酸部分を、前記ＤＮＡ分子を配列−特異的エンドヌクレ
    アーゼを用いて前記独自部位にて切断することにより産
    生されるＤＮＡセグメントの末端から除去するために、
    ホスファターゼを使用する工程を含むことを特徴とする
    請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記第１ゲノムがワクシニアウイルスゲ
    ノムであり、且つ前記独自部位が細菌制限エンドヌクレ
    アーゼＮｏｔＩ又は細菌制限エンドヌクレアーゼＳｍａ
    Ｉに対する切断部位であることを特徴とする請求項６記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 前記第１ゲノムが自然発生しない第２Ｄ
    ＮＡ配列を真核細胞質ＤＮＡウイルスゲノム中に含み、
    且つ前記第２ＤＮＡ配列が前記独自部位を含むことを特
    徴とする請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記第１ゲノムが大腸菌β−ガラクトシ
    ダーゼ遺伝子の配列を含む鶏痘ウイルスゲノムであり、
    且つ前記独自部位が細菌制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ
    Ｉに対する切断部位であることを特徴とする請求項８記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記第１ＤＮＡ配列を前記第１ゲノム
    に、第１配列−特異的エンドヌクレアーゼに対する第１
    切断部位と第２配列−特異的エンドヌクレアーゼに対す
    る第２切断部位の間で挿入することを特徴とする請求項
    ３記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記第１及び前記第２切断部位の各々
    が前記第１ゲノムにおいて独自であることを特徴とする
    請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記第１ゲノムに挿入された前記第１
    ＤＮＡ配列の少なくとも１部分がプロモーターの転写調
    節下にあることを特徴とする請求項３記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記プロモーターを、前記第１ゲノム
    に挿入した前記第１ＤＮＡ配列中に配置することを特徴
    とする請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記プロモーターを、前記第１ゲノム
    に挿入した前記第１ＤＮＡ配列の上流域前記修飾ウイル
    スゲノムに配置することを特徴とする請求項１２記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】 前記プロモーターを、前記修飾ウイル
    スゲノムにより暗号化されたＲＮＡポリメラーゼにより
    利用することを特徴とする請求項１２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記プロモーターが前記真核細胞質Ｄ
    ＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始に
    好適であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記プロモーターが前記真核細胞質Ｄ
    ＮＡウイルスの自然発生するプロモーターの修飾を含む
    ことを特徴とする請求項１５記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ＤＮＡ分子を修飾する工程が前記
    第１ゲノムからＤＮＡ配列を欠失する工程を含むことを
    特徴とする請求項１記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ＤＮＡ分子を修飾する工程が前記
    第１ゲノムのＤＮＡ配列を置換する工程を含むことを特
    徴とする請求項１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記修飾ウイルスゲノムを感染性ビリ
    オンにパッケージングするために、形質発現する第２ゲ
    ノムを含む第２真核細胞質ＤＮＡウイルスを用いて前記
    第１宿主細胞を感染する工程を更に含むことを特徴とす
    る請求項１記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記修飾ＤＮＡ分子を前記第１宿主細
    胞に導入する工程を、前記第１宿主細胞を前記第２真核
    細胞質ＤＮＡウイルスを用いて感染する工程の後に約１
    時間実施することを特徴とする請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記第１宿主細胞中の前記第２ゲノム
    の形質発現が前記第２ゲノムを含む感染性ビリオンを産
    生しないことを特徴とする請求項２０記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記修飾ウイルスゲノムが修飾ワクシ
    ニアウイルスゲノムであり、前記第２ゲノムが鶏痘ウイ
    ルスゲノムであり、且つ前記第１宿主細胞が哺乳動物細
    胞であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記修飾ウイルスゲノムを含む感染性
    ビリオンを回収する工程が、前記第２宿主細胞中の前記
    第２ゲノムの形質発現が前記第２ゲノムを含む感染性ビ
    リオンを産生しない条件下で前記第１宿主細胞により産
    生された感染性ビリオンを用いて第２宿主細胞を感染す
    る工程を含むことを特徴とする請求項２０記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記修飾ウイルスゲノムは修飾ワクシ
    ニアウイルスゲノムであり、前記第２ゲノムは鶏痘ウイ
    ルスゲノムであり、前記第２宿主細胞は哺乳動物細胞で
    あることを特徴とする請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記修飾ウイルスゲノムは、感染性ビ
    リオンを前記第２宿主細胞中に産生するために必要な機
    能宿主域遺伝子を含み、前記第２ゲノムは前記機能宿主
    域遺伝子が欠乏することを特徴とする請求項２４記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】 前記修飾ウイルスゲノムは、ヒト細胞
    中に感染性ビリオンを産生するために必要な機能宿主域
    遺伝子を含む修飾ワクシニアウイルスゲノムであり、前
    記第２宿主細胞はヒト細胞であることを特徴とする請求
    項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記修飾ウイルスゲノムは選択マーカ
    ー遺伝子を含み、前記第２ゲノムは前記選択マーカー遺
    伝子が欠乏し、前記第２宿主細胞を感染する工程は前記
    選択マーカー遺伝子を形質発現するゲノムに対して選択
    する条件下で実施することを特徴とする請求項２４記載
    の方法。
  29. 【請求項２９】 前記第２宿主細胞中の前記選択マーカ
    ー遺伝子の形質発現は、前記選択マーカー遺伝子を形質
    発現するゲノムに対して選択するために十分なレベルに
    て前記第２宿主細胞の感染の間に存する細胞障害薬物に
    対する耐性を前記第２宿主細胞に与えることを特徴とす
    る請求項２４記載の方法。
  30. 【請求項３０】 請求項５，１１，１４のうちのいずれ
    か１項に記載の方法にかかる修飾ウイルスゲノムの直接
    分子クローニングにより産生される修飾真核細胞質ＤＮ
    Ａウイルス。
  31. 【請求項３１】 修飾ウイルスゲノムを含む修飾真核細
    胞質ＤＮＡウイルスであって、前記修飾ウイルスゲノム
    が（Ｉ） 第１ゲノムが配列−特異的エンドヌクレアー
    ゼに対する切断部位を含み、前記切断部位が前記第１ゲ
    ノム中の独自部位である、第１真核細胞質ＤＮＡウイル
    スの第１ゲノム、及び（II） 前記第１ゲノム中の前記
    独自部位に挿入された第１ＤＮＡ配列を含むことを特徴
    とする修飾真核細胞質ＤＮＡウイルス。
  32. 【請求項３２】 前記第１ＤＮＡ配列が真核細胞質ＤＮ
    Ａウイルスのゲノム中に自然発生しないことを特徴とす
    る請求項３１記載の修飾ウイルス。
  33. 【請求項３３】 前記第１ゲノムがワクシニアウイルス
    ゲノムであり、前記独自部位がＮｏｔＩ及びＳｍａＩか
    らなる群から選択される細菌制限エンドヌクレアーゼに
    対する切断部位であることを特徴とする請求項３２記載
    の修飾ウイルス。
  34. 【請求項３４】 前記第１ゲノムが真核細胞質ＤＮＡウ
    イルスのゲノム中に自然発生しない第２ＤＮＡ配列を含
    み、前記第２ＤＮＡ配列が前記独自部位を含むことを特
    徴とする請求項３２記載の修飾ウイルス。
  35. 【請求項３５】 前記第１ゲノムが大腸菌β−ガラクト
    シダーゼ遺伝子の第２ＤＮＡ配列を含む鶏痘ウイルスゲ
    ノムであり、前記独自部位が細菌制限エンドヌクレアー
    ゼＮｏｔＩに対する切断部位であることを特徴とする請
    求項３４記載の修飾ウイルス。
  36. 【請求項３６】 前記独自部位に挿入された前記第１Ｄ
    ＮＡ配列の少なくとも１部分がプロモーターの転写調節
    下にあることを特徴とする請求項３２記載の修飾ウイル
    ス。
  37. 【請求項３７】 前記プロモーターが前記第１ゲノム中
    に挿入された前記第１ＤＮＡ配列中に位置することを特
    徴とする請求項３６記載の修飾ウイルス。
  38. 【請求項３８】 前記第１ゲノムがポックスウイルスゲ
    ノムであり、前記プロモーターが自然発生するポックス
    ウイルスプロモーターの修飾を含むことを特徴とする請
    求項３７記載の修飾ウイルス。
  39. 【請求項３９】 修飾ウイルスゲノムを含む修飾真核細
    胞質ＤＮＡウイルスであって、前記修飾ウイルスゲノム
    が（Ｉ） 第１ゲノムが第１配列−特異的エンドヌクレ
    アーゼに対する第１切断部位及び第２配列−特異的エン
    ドヌクレアーゼに対する第２切断部位を含み、前記切断
    部位の各々が前記第１ゲノム中の独自部位である、第１
    真核細胞質ＤＮＡウイルスの第１ゲノム、及び（II）
    前記第１独自部位と前記第２独自部位との間で前記第１
    ゲノムに挿入された第１ＤＮＡ配列、を含むことを特徴
    とする修飾真核細胞質ＤＮＡウイルス。
  40. 【請求項４０】 前記第１ＤＮＡ配列が真核細胞質ＤＮ
    Ａウイルスのゲノム中に自然発生しないことを特徴とす
    る請求項３９記載の修飾ウイルス。
  41. 【請求項４１】 前記第１ゲノムが真核細胞質ＤＮＡウ
    イルスのゲノム中に自然発生しない第２ＤＮＡ配列を含
    み、前記第２ＤＮＡ配列が前記第１独自部位と前記第２
    独自部位との間に挿入された前記第１ＤＮＡ配列を含む
    ことを特徴とする請求項４０記載の修飾ウイルス。
  42. 【請求項４２】 前記第１ゲノムがワクシニアウイルス
    ゲノムであり、前記第１独自部位及び前記第２独自部位
    の各々がＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＡｐａＩ及びＲｓｒIIか
    らなる群から選択される細菌制限エンドヌクレアーゼに
    対する切断部位であることを特徴とする請求項４１記載
    の修飾ウイルス。
  43. 【請求項４３】 修飾ウイルスゲノムを含む修飾真核細
    胞質ＤＮＡウイルスであって、前記修飾ウイルスゲノム
    が（Ｉ） 第１ゲノムが第１ＤＮＡ配列を含み、前記第
    １ＤＮＡ配列が前記修飾ウイルスゲノム中の独自部位で
    ある配列−特異的エンドヌクレアーゼに対する切断部位
    を含む、第１真核細胞質ＤＮＡウイルスの第１ゲノム、
    及び（II） 前記第１ＤＮＡ配列が前記プロモーターと
    前記独自部位との間で翻訳読み始めコドンが欠乏し、前
    記独自部位に挿入されたＤＮＡ配列が前記プロモーター
    の転写調節下にあるように位置するプロモーター、を含
    むことを特徴とする修飾真核細胞質ＤＮＡウイルス。
  44. 【請求項４４】 前記第１ＤＮＡ配列が真核細胞質ＤＮ
    Ａウイルスのゲノム中に自然発生しないことを特徴とす
    る請求項４３記載の修飾ウイルス。
  45. 【請求項４５】 前記第１ゲノムがワクシニアウイルス
    ゲノムであり、前記第１ＤＮＡ配列が細菌制限エンドヌ
    クレアーゼＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＡｐａＩ及びＲｓｒII
    に対する切断部位を含む多重クローニング部位を含むこ
    とを特徴とする請求項４４記載の修飾ウイルス。
  46. 【請求項４６】 請求項３０記載の修飾ウイルスの修飾
    ウイルスゲノムを含むＤＮＡ分子。
  47. 【請求項４７】 請求項３１，３９，４３のうちいずれ
    か１項に記載の修飾ウイルスの修飾ウイルスゲノムを含
    むＤＮＡ分子。
  48. 【請求項４８】 真核細胞質ＤＮＡウイルスの修飾ウイ
    ルスゲノムの第１末端を含むＤＮＡ分子であって、
    （Ｉ） 前記修飾ウイルスゲノムの前記末端が真核細胞
    質ＤＮＡウイルスのゲノム中に自然発生しないＤＮＡ配
    列を含み、及び（II） 前記修飾ウイルスゲノムが前記
    修飾ウイルスゲノム中の独自部位である配列−特異的エ
    ンドヌクレアーゼに対する切断部位を含み、及び（III)
    前記ＤＮＡ分子が、前記配列−特異的エンドヌクレア
    ーゼを用いて前記修飾ウイルスゲノム中の前記独自部位
    を切断することにより産生される末端に相同である末端
    を有する、ことを特徴とするＤＮＡ分子。
  49. 【請求項４９】 真核細胞質ＤＮＡウイルスのゲノム中
    に自然発生しない前記ＤＮＡ配列が前記修飾ウイルスゲ
    ノム中の独自部位である配列−特異的エンドヌクレアー
    ゼに対する前記切断部位を含むことを特徴とする請求項
    ４８記載のＤＮＡ分子。
  50. 【請求項５０】 真核細胞質ＤＮＡウイルスの修飾ウイ
    ルスゲノムの直接分子クローニングのためのキットであ
    って、（Ｉ） 請求項４８又は４９記載の精製ＤＮＡ分
    子、（II） ＤＮＡリガーゼ、及び（III) 前記修飾ウ
    イルスゲノムを含む修飾ＤＮＡ分子を産するために、一
    緒にＤＮＡセグメントを連結するのに適した緩衝液及び
    試薬の溶液、を含むキット。
  51. 【請求項５１】 前記ＤＮＡ分子によって暗号化された
    前記修飾ウイルスゲノムの独自切断部位に前記カセット
    を挿入するのに適合する配列−特異的エンドヌクレアー
    ゼを用いて切断するための部位が側面に接する遺伝子形
    質発現カセットを含むプラスミドを更に含む請求項５０
    記載のキット。
  52. 【請求項５２】 感染性ビリオンに前記修飾ウイルスゲ
    ノムをパッケージングするのに適する第１宿主細胞及び
    第２ウイルスを更に含む請求項５０記載のキット。
  53. 【請求項５３】 各末端に細菌制限エンドヌクレアーゼ
    ＮｏｔＩに対する切断部位を有するＤＮＡセグメントを
    含むプラスミドであって、前記ＤＮＡセグメントが前記
    プラスミド中の独自な配列−特異的エンドヌクレアーゼ
    切断部位を含むことを特徴とするプラスミド。
  54. 【請求項５４】 図３に表わされ、ｐＮ２を示され、Ｓ
    ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１の配列を含む請求項５３記載のプ
    ラスミド。
  55. 【請求項５５】 前記ＤＮＡセグメントが、ポックスウ
    イルスプロモーターの転写調節下で選択マーカー遺伝子
    を更に含むことを特徴とする請求項５３記載のプラスミ
    ド。
  56. 【請求項５６】 図３に表わされ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
    Ｏ．２の配列を含むｐＮ２−ｇｐｔａ及びＳＥＱ．Ｉ
    Ｄ．ＮＯ．３の配列を含むｐＮ２−ｇｐｔｂを示される
    プラスミドの群から選択されることを特徴とする請求項
    ５５記載のプラスミド。
  57. 【請求項５７】 前記ＤＮＡセグメントが、制限エンド
    ヌクレアーゼ切断部位を含むＤＮＡ配列に操作的に連結
    される第２ポックスウイルス、プロモーターを更に含む
    ことを特徴とする請求項５５記載のプラスミド。
  58. 【請求項５８】 図２５に表わされ、ｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ
    ４を示され、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４の配列を含む請
    求項５７記載のプラスミド。
  59. 【請求項５９】 制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含
    む前記ＤＮＡ配列に操作的に連結される翻訳読み始めコ
    ドンを更に含む請求項５７記載のプラスミド。
  60. 【請求項６０】 図２５に表わされ、ｐＮ２ｇｐｔ−Ｓ
    ３Ａを示され、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３の配列を含む
    請求項５９記載のプラスミド。
  61. 【請求項６１】 ｖｄＴＫを示されたワクシニアウイル
    スベクターの第２マスタークローニング部位の独自部位
    を含む第１マスタークローニング部位を含み、図２１に
    表わされたプラスミドの以下の群：ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
    Ｏ．６の配列を含むｐＡ０、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７の
    配列を含むｐＡ１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８の配列を含
    むｐＡ２、から選択されるプラスミド。
  62. 【請求項６２】 図２２に表わされ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
    Ｏ．９の配列を含むｐＡ１−Ｓ１及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
    Ｏ．１０の配列を含むｐＡ２−Ｓ１のプラスミドの群か
    ら選択され、前記第１マスタークローニング部位に操作
    的に連結されるポックスウイルスプロモーター及び翻訳
    読み始めコドンを更に含む請求項６１記載のプラスミ
    ド。
  63. 【請求項６３】 図２３に表わされ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
    Ｏ．１１の配列を含むｐＡ１−Ｓ２及びＳＥＱ．ＩＤ．
    ＮＯ．１２の配列を含むｐＡ２−Ｓ２のプラスミドの群
    から選択され、前記第１マスタークローニング部位に操
    作的に連結されるポックスウイルスプロモーターを更に
    含む請求項６１記載のプラスミド。
  64. 【請求項６４】 前記プラスミドがヒトのプロトロンビ
    ンを暗号化するＤＮＡ配列を更に含み、更に前記ＤＮＡ
    配列が前記ポックスウイルスプロモーター及び前記読み
    始めコドンに操作的に連結されることを特徴とする請求
    項６２記載のプラスミド。
  65. 【請求項６５】 図２６に表わされ、プラスミドｐＡ１
    Ｓ１−ＰＴを示され、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５の配列
    を含む請求項６４記載のプラスミド。
  66. 【請求項６６】 前記プラスミドがヒトのプラスミノー
    ゲンを暗号化するＤＮＡ配列を更に含み、更に前記ＤＮ
    Ａ配列が前記ポックスウイルスプロモーター及び前記読
    み始めコドンに操作的に連結されることを特徴とする請
    求項５８記載のプラスミド。
  67. 【請求項６７】 図２７に表わされ、ヒトのｇｌｕ−プ
    ラスミノーゲンを暗号化し、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７
    の配列を含むプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−ＧＰｇ及び図２
    ８に示され、ｌｙｓ−プラスミノーゲンを暗号化し、Ｓ
    ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８の配列を含むプラスミドｐＮ２
    ｇｐｔ−ＬＰｇの群から選択される請求項６６記載のプ
    ラスミド。
  68. 【請求項６８】 前記プラスミドがヒトの免疫不全ウイ
    ルス（ＨＩＶ）ｇｐ１６０を暗号化するＤＮＡ配列を更
    に含み、更に前記ＤＮＡ配列を前記ポックスプロモータ
    ー及び前記読み始めコドンに操作的に連結することを特
    徴とする請求項５８記載のプラスミド。
  69. 【請求項６９】 図２９に表わされ、ｐＮ２ｇｐｔ−ｇ
    ｐ１６０を示され、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９の配列を
    含む請求項６８記載のプラスミド。
  70. 【請求項７０】 Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子が欠失するワクシ
    ニアウイルスＤＮＡの修飾ＥｃｏＲＩ Ｋフラグメント
    を含むプラスミド。
  71. 【請求項７１】 図３５に表わされ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
    Ｏ．２１の配列を含むプラスミドｐＥｃｏＫ−ｄｈｒ及
    びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２の配列を含むプラスミドｐ
    ｄｈｒ−ｇｐｔの群から選択される請求項７０記載のプ
    ラスミド。
  72. 【請求項７２】 ポックスウイルスのチミジンキナーゼ
    遺伝子を含むポックスウイルスゲノムのセグメントを含
    むプラスミドであって、前記チミジンキナーゼ遺伝子が
    活性チミジンキナーゼの形質発現を妨げるために修飾さ
    れていることを特徴とするプラスミド。
  73. 【請求項７３】 図２０に表わされ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
    Ｏ．４の配列を含むプラスミドｐＨｉｎｄＪ−２及びＳ
    ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５の配列を含むプラスミドｐＨｉｎ
    ｄＪ−３の群から選択される請求項７２記載のプラスミ
    ド。
  74. 【請求項７４】 細菌制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ
    に対する単一の切断部位を有する野生型ワクシニアウイ
    ルスゲノムの修飾を含む修飾ワクシニアウイルスであっ
    て、前記修飾が前記単一の切断部位を除去することを特
    徴とする修飾ワクシニアウイルス。
  75. 【請求項７５】 図１７に表わされ、ｖｄＮを示される
    請求項７４記載の修飾ワクシニアウイルス。
  76. 【請求項７６】 細菌制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩ
    に対する単一の切断部位を有する野生型ワクシニアウイ
    ルスゲノムの修飾を含む修飾ワクシニアウイルスであっ
    て、前記修飾が前記単一の切断部位を除去することを特
    徴とする修飾ワクシニアウイルス。
  77. 【請求項７７】 図１７に表わされ、ｖｄＳＮを示され
    る請求項７６記載の修飾ワクシニアウイルス。
  78. 【請求項７８】 細菌制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ
    に対する単一の切断部位、細菌制限エンドヌクレアーゼ
    ＳｍａＩに対する単一の切断部位、及びチミジンキナー
    ゼ遺伝子を有する野生型ワクシニアウイルスゲノムの修
    飾を含む修飾ワクシニアウイルスであって、前記修飾が
    （Ｉ） 細菌制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩに対する
    前記部位を除去する修飾、（II） 細菌制限エンドヌク
    レアーゼＳｍａＩに対する部位を除去する修飾、（III)
    細菌制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩに対する単一の
    切断部位及び細菌制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩに対
    する単一の切断部位を含む前記チミジンキナーゼ遺伝子
    中の挿入を含む修飾、を含むことを特徴とする修飾ワク
    シニアウイルス。
  79. 【請求項７９】 図１７に表わされ、ｖｄＴＫを示され
    る請求項７８記載の修飾ワクシニアウイルス。
  80. 【請求項８０】 ｖＰＴ１を示され、更にヒトのプロト
    ロンビンを暗号化するＤＮＡ配列を含む修飾ワクシニア
    ウイルスであって、前記配列がエンドヌクレアーゼＮｏ
    ｔＩとＲｓｒIIに対する切断部位の間に存するＳＥＱ．
    ＩＤ．ＮＯ．１５の配列を含むプラスミドｐＡ１Ｓ１−
    ＰＴの部分を含み、更に前記配列をエンドヌクレアーゼ
    ＮｏｔＩ及びＲｓｒIIに対する切断部位の間の前記ｖｄ
    ＴＫに挿入することを特徴とする請求項７９記載の修飾
    ワクシニアウイルス。
  81. 【請求項８１】 ｖＧＰｇ１を示され、ヒトのｇｌｕ−
    プラスミノーゲンを暗号化し、エンドヌクレアーゼＮｏ
    ｔＩに対する２つの切断部位の間に存するＳＥＱ．Ｉ
    Ｄ．ＮＯ．１７の配列を含むプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−
    ＧＰｇの部分を含むＤＮＡ配列を更に含む修飾ワクシニ
    アウイルスであって、更に前記配列をエンドヌクレアー
    ゼＮｏｔＩに対する切断部位の前記ｖｄＴＫに挿入する
    ことを特徴とする請求項７９記載の修飾ワクシニアウイ
    ルス。
  82. 【請求項８２】 ｖＬＰｇ１を示され、ｌｙｓ−プラス
    ミノーゲンを暗号化し、エンドヌクレアーゼＮｏｔＩに
    対する２つの切断部位の間に存するＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ
    Ｏ．１８の配列を含むプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−ＬＰｇ
    の部分を更に含む修飾ワクシニアウイルスであって、更
    に前記配列をエンドヌクレアーゼＮｏｔＩに対する切断
    部位の前記ｖｄＴＫに挿入することを特徴とする請求項
    ７９記載のワクシニアウイルス。
  83. 【請求項８３】 ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇ
    ｐ１６０を暗号化するＤＮＡ配列を更に含む修飾ワクシ
    ニアウイルスであって、前記配列がエンドヌクレアーゼ
    ＮｏｔＩに対する切断部位の間に存するＳＥＱ．ＩＤ．
    ＮＯ．１９の配列を含むプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−ｇｐ
    １６０の部分を含み、更に前記配列をエンドヌクレアー
    ゼＮｏｔＩに対する切断部位の前記ｖｄＴＫに挿入する
    ことを特徴とする請求項７９記載の修飾ワクシニアウイ
    ルス。
  84. 【請求項８４】 ｖＳ４を示され、合成ポックスウイル
    スプロモーターＳ４を暗号化するＤＮＡ配列を更に含む
    修飾ワクシニアウイルスであって、前記ＤＮＡ配列がＳ
    ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３８のオリゴヌクレオチドＰ−ａｒ
    ｔＰ（１１）の配列を含み、更に前記配列をエンドヌク
    レアーゼＮｏｔ１に対する切断部位の前記ｖｄＴＫに挿
    入することを特徴とする請求項７９記載の修飾ワクシニ
    アウイルス。
  85. 【請求項８５】 ｖｖＷＦを示され、ヒトのフォン・ビ
    ルブラント因子を暗号化するＤＮＡ配列を更に含む修飾
    ワクシニアウイルスであって、前記ＤＮＡ配列が、エン
    ドヌクレアーゼＮｏｔＩに対する切断部位の間に存する
    ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０の配列を含むプラスミドｐｖ
    ＷＦの部分を含み、更に前記配列をエンドヌクレアーゼ
    ＮｏｔＩに対する切断部位にて前記ｖＳ４に挿入するこ
    とを特徴とする請求項８４記載の修飾ワクシニアウイル
    ス。
  86. 【請求項８６】 機能Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子と機能Ｃ７Ｌ
    宿主域遺伝子の両方が欠乏する修飾ゲノムを含むｖｄｈ
    ｒを示された修飾ワクシニアウイルスであって、前記修
    飾ゲノムがＫ１Ｌ遺伝子の代わりに野生型ワクシニアウ
    イルスのＫ１Ｌ位置に挿入されたＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．
    ２２の配列を有するワクシニアウイルス（ＷＲ−６／
    ２）のＣ７Ｌ−陰性菌株のゲノムを含むことを特徴とす
    る修飾ワクシニアウイルス。
  87. 【請求項８７】 前記第１配列がタンパク質の産生を結
    果的に生ずる宿主細胞にて形質発現されることを特徴と
    する請求項３０記載の産生修飾ウイルス。
  88. 【請求項８８】 前記第１配列がタンパク質の産生を結
    果的に生ずる宿主細胞にて形質発現されることを特徴と
    する請求項３１又は３９記載の産生修飾ウイルス。
  89. 【請求項８９】 前記修飾ウイルスゲノムが修飾ポック
    スウイルスゲノムであることを特徴とする請求項３０記
    載の修飾ウイルス。
  90. 【請求項９０】 前記修飾ウイルスゲノムが修飾ポック
    スウイルスゲノムであることを特徴とする請求項３１，
    ３９，４３のうちいずれか１項に記載の修飾ウイルス。
  91. 【請求項９１】 前記修飾ウイルスゲノムが修飾ポック
    スウイルスゲノムであることを特徴とする請求項４６記
    載のＤＮＡ分子。
  92. 【請求項９２】 前記修飾ウイルスゲノムが修飾ポック
    スウイルスゲノムであることを特徴とする請求項４７記
    載のＤＮＡ分子。
  93. 【請求項９３】 図３６に表わされ、ｐＰ２−ｇｐ１６
    ０MNを示され、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６９の配列を含む
    ことを特徴とする請求項６８記載のプラスミド。
  94. 【請求項９４】 ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇ
    ｐ１６０を暗号化するＤＮＡ配列を更に含む修飾ワクシ
    ニアウイルスであって、前記配列がエンドヌクレアーゼ
    ＳｍａＩに対する切断部位の間に存するＳＥＱ．ＩＤ．
    ＮＯ．６９の配列を含むプラスミドｐＮ２ｇｐｔ−ｇｐ
    １６０の部分を含み、更に前記配列をエンドヌクレアー
    ゼＳｍａＩに対する切断部位の前記ｖｄＴＫに挿入する
    ことを特徴とする請求項７９記載の修飾ワクシニアウイ
    ルス。
  95. 【請求項９５】 前記プラスミドがヒトのタンパク質Ｓ
    を暗号化するＤＮＡ配列を更に含み、更に前記ＤＮＡ配
    列を前記ポックスウイルスプロモーター及び前記読み始
    めコドンに操作的に連結されることを特徴とする請求項
    ５８記載のプラスミド。
  96. 【請求項９６】 ｐＮ２−ｇｐｔａＰｒｏｔＳを示さ
    れ、図４３に表わされ、ヒトのタンパク質Ｓを暗号化
    し、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６７の配列を含むことを特徴
    とする請求項９５記載のプラスミド。
  97. 【請求項９７】 ｖＰｒｏｔＳを示され、ヒトのタンパ
    ク質Ｓを暗号化し、エンドヌクレアーゼＮｏｔＩに対す
    る２つの切断部位の間に存するＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６
    ７の配列を含むプラスミドｐＮ２ｇｐｔａＰｒｏｔＳの
    部分を含むＤＮＡ配列を更に含む修飾ワクシニアウイル
    スであって、更に前記配列をエンドヌクレアーゼＮｏｔ
    Ｉに対する切断部位の前記ｖｄＴＫに挿入することを特
    徴とする請求項７９記載の修飾ワクシニアウイルス。
  98. 【請求項９８】 前記プラスミドがヒトの因子ＩＸを暗
    号化するＤＮＡ配列を更に含み、更に前記ＤＮＡ配列を
    前記ポックスウイルスプロモーター及び前記読み始めコ
    ドンに操作的に連結することを特徴とする請求項５８記
    載のプラスミド。
  99. 【請求項９９】 ｐＮ２−ｇｐｔａ−ＦＩＸを示され、
    図４６に表わされ、ヒトの因子ＩＸを暗号化し、ＳＥ
    Ｑ．ＩＤ．ＮＯ．７２の配列を含むことを特徴とする請
    求項９８記載のプラスミド。
  100. 【請求項１００】 ｖＦＩＸ＃５を示され、ヒトの因子
    ＩＸを暗号化し、エンドヌクレアーゼＮｏｔＩに対する
    ２つの切断部位の間に存するＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７２
    の配列を含むプラスミドｐＮ２ｇｐｔａ−ＦＩＸの部分
    を含むＤＮＡ配列を更に含む修飾ワクシニアウイルスで
    あって、更に前記配列をエンドヌクレアーゼＮｏｔＩに
    対する切断部位の前記ｖｄＴＫに挿入することを特徴と
    する請求項７９記載の修飾ワクシニアウイルス。
  101. 【請求項１０１】 前記鶏痘ウイルスゲノムが細菌制限
    エンドヌクレアーゼＮｏｔＩに対する前記独自部位にて
    前記大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子の前記配列に挿
    入されるＨＩＶ ｅｎｖＩＩＩＢ遺伝子を暗号化するＤ
    ＮＡ配列を更に含むことを特徴とする請求項３５記載の
    修飾ウイルス。
  102. 【請求項１０２】 ｆ−ｅｎｖＩＩＩＢとして示され、
    エンドヌクレアーゼＮｏｔＩに対する切断部位の間に存
    するＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９の配列を含むプラスミド
    ｐＮ２ｇｐｔ−ｇｐ１６０の部分を更に含むことを特徴
    とする請求項１０１記載の修飾ウイルス。
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