HU219369B - Process for producing of modified chordopoxvirus by direct molecular cloning, modified chordopoxvirus and process for its use - Google Patents

Process for producing of modified chordopoxvirus by direct molecular cloning, modified chordopoxvirus and process for its use Download PDF

Info

Publication number
HU219369B
HU219369B HU9202737A HU9202737A HU219369B HU 219369 B HU219369 B HU 219369B HU 9202737 A HU9202737 A HU 9202737A HU 9202737 A HU9202737 A HU 9202737A HU 219369 B HU219369 B HU 219369B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
genome
dna
virus
modified
sequence
Prior art date
Application number
HU9202737A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT69927A (en
Inventor
Friedrich Dorner
Friedrich Scheiflinger
Falko-Guenter Falkner
Michael Pfleiderer
Original Assignee
Baxter Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/750,080 external-priority patent/US5445953A/en
Application filed by Baxter Ag filed Critical Baxter Ag
Publication of HUT69927A publication Critical patent/HUT69927A/hu
Publication of HU219369B publication Critical patent/HU219369B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus előállítására módosított virális genom közvetlen molekulárisklónozásával, amelynek során extracelluláris körülmények közöttmódosított vírusgenomot tartalmazó DNS-molekulát állítanak elő, azt avírusgenomot fertőző virionokba pakoló gazdasejtbe juttatják be, ésabból kinyerik a módosított virális genomot tartalmazó fertőzővirionokat. A találmány tárgya továbbá a közvetlen molekulárisklónozása útján előállított módosított chordopoxvírus, annak genomjáttartalmazó DNS-molekula, valamint eljárás rekombináns fehérjeelőállítására módosított vírus alkalmazásával. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus előállítására módosított virális genom közvetlen molekuláris klónozásával, amelynek során extracelluláris körülmények között módosított vírusgenomot tartalmazó DNS-molekulát állítunk elő, azt a vírusgenomot fertőző virionokba pakoló gazdasejtbe juttatjuk be, és abból kinyeijük a módosított virális genomot tartalmazó fertőző virionokat. A találmány tárgya továbbá a közvetlen molekuláris klónozása útján előállított módosított chordopoxvírus, annak genomját tartalmazó DNS-molekula, valamint eljárás rekombináns fehérje előállítására módosított vírus alkalmazásával.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható poxvírusok klónozása és rekombináns fehéqék előállítása területén.
A találmány egyik előnyös megvalósítási formája szerint a kívánt gént tartalmazó idegen DNS-fragmenst közvetlenül inzertáljuk egy genomiális poxvírus-DNSbe egy olyan restrikciós endonukleáz hasítási helyen, amely a virális genomban egyetlen, és a módosított virális DNS-t virionokba pakoljuk helperpoxvírussal fertőzött sejtekbe való transzfektálással.
Az eukarióták citoplazmatikus DNS-vírusai közé tartoznak a különféle poxvírusok és az iridovírusok, amelyek meleg vérűekben és rovarokban találhatók. Rekombináns genomokat tartalmazó poxvírusokat már alkalmaztak különféle inzertált gének expressziójára. Ilyen poxvírusok alkalmazhatók például biológiailag aktív polipeptidek előállítására sejttenyészetekben, például ana a célra, hogy vakcinaantigéneket közvetlenül egy állat vagy egy ember immunrendszerébe juttassanak. Idegen gének expressziójára alkalmas rekombináns iridovírus-genomok szerkesztését még nem ismertették a géntechnológia szakirodaimában.
Idegen géneket tartalmazó rekombináns poxvírusgenomok szerkesztésére a hagyományos módszerek részben in vivő (intracelluláris) rekombináción alapulnak. Az intracelluláris rekombináció alkalmazását először Sam és Dumbell [Ann. Virol. (Institut Pasteur) 132E, 135 (1981)] írták le mint a „marker rescue” folyamatát virális DNS szubgenomiális fragmenseivel. Fenti szerzők bizonyították, hogy egy hőmérséklet-érzékeny vacciniavírus mutáns valamely nyúl poxvírus szubgenomiális DNS-fragmensével való intracelluláris rekombinációval megmenthető. Az intracelluláris rekombinációra általuk alkalmazott módszereket még ma is használják.
A nem poxvírus (idegen) géneket tartalmazó rekombináns vacciniavírusok szerkesztését később Panicali és Paoletti írták le [Proc. Nat’l Acad. Sci. U. S. A. 79, 4927-4931 (1982); Mackett és munkatársai: Proc. Nat’l Acad. Sci. U. S. A. 79, 7415-7419 (1982); és 4 769 330 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Közelebbről a rekombináns poxvírusok előállítására használatos technológia két lépésből áll. Első lépésben egy olyan DNS-fragmenst készítenek, amely egy idegen gént körülvevő poxvírusgenommal homológ régiókat tartalmaz. Úgy is eljárhatnak, hogy egy inszerciós plazmidot szerkesztenek egy idegen génnek egy plazmiddal való in vitro intracelluláris rekombinálásával. Ez a plazmid egy rövid virális DNS-szekvenciát tartalmaz, amely homológ a poxvírusgenom azon régiójával, ahol a gén inszerciója végső soron kívánatos. Az idegen gént a plazmidba inzertálják a virális DNS-szekvenciákkal határolt helyen, és rendszerint egy poxvírus promoter után (5’->3’ irányban), amely az inzertált gén transzkripcióját szabályozni fogja. Második lépésben az inszerciós plazmidot a célpoxvírussal fertőzött gazdasejtekbe vezetik be. A gént ezután indirekt módon inzertálják a poxvírusgenomba, a poxvírusgenomban lévő homológ virális szekvenciák és a plazmid idegen gént tartalmazó része közötti rekombinálással. A kapott rekombináns genom ezután replikálódik, és ily módon fertőzőképes poxvírus keletkezik.
így minden egyes gén poxvírusgenomba való inszerciójához mindeddig egy külön plazmidra volt szükség, mely a virális szekvenciákkal határolt gént tartalmazta, amely szekvenciákat a kívánt inszerciós helyzet szempontjából választották meg. Ennek a megoldásnak az egyik hátránya az, hogy minden egyes rekombináns poxvírus előállításához egy új inszerciós plazmid szükséges. Minden egyes plazmidot extracelluláris rekombináns DNS-módszerekkel kell megszerkeszteni, sokszorosítani baktériumsejtekben, majd igen munkaigényesen izolálni és alaposan tisztítani kell, mielőtt a poxvírussal fertőzött gazdasejtekhez adnánk.
Az ismert módszer másik hátránya az, hogy a rekombináns genomokat igen alacsony hozammal nyerik, ami az egyes vírusok százainak szűrővizsgálatát teszi szükségessé azért, hogy egyetlen kívánt rekombinánst találjanak. Az alacsony hozam az egyes intracelluláris rekombinációs események kis gyakoriságának tulajdonítható azzal párosítva, hogy az inszerciós plazmid virális genomba való beépülésének elérésére több ilyen eseményre van szükség. Ennek eredményeként az intracelluláris rekombinációs módszerekkel előállított virális genomok többsége szülői genom, amelyben nincs jelen idegen gén. Ezért gyakran egy olyan szelektív markergént kell bevezetni a poxvírusgenomba a másik kívánt szekvenciával együtt, amely lehetővé teszi a kívánt ritka rekombinánsok detektálását anélkül, hogy szükség lenne a számos egyedi vírusklónból izolált DNS-ek jellemzésére.
Eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusokból származó tisztított DNS-ek képtelenek replikálódni, ha érzékeny gazdasejtekbe vezetik be azokat olyan módszerekkel, amelyek a sejtmagban replikálódó virális DNS-ekkel iniciálják a fertőzést. A citoplazmatikus DNS-vírusokból származó DNS-ek fertőzőképességének hiánya abból a tényből ered, hogy a virális transzkripciót a fertőzött sejtekben iniciálni kell egy vírusspecifikus RNSpolimerázzal, amely a fertőző virionokban normálisan jelen van.
A poxvírus-DNS reaktiválása - amelynek során egy inaktivált, nem fertőző poxvírusrészecskében lévő genomiális DNS-t fertőzőképes virionokba csomagolnak egy életképes helperpoxvírussal való együttfertőzés útján - már évtizedek óta ismert, lásd például Fenner és Woodroofe munkáját [Virology 11: 185-201 (1960)]. 1981-ben Sam és Dumbell bizonyították, hogy egy első
HU 219 369 Β poxvírusból izolált, nem fertőző genomiális DNS becsomagolható fertőző poxvírusvirionokba egy másik, genetikailag eltérő poxvírussal fertőzött sejtekben. [Sam és Dumbell, Ann. Virol. (Institut Pasteur) 132E; 135 (1981).] A csupasz poxvirus-DNS fenti bepakolását először egy virionokból vagy fertőzött sejtekből izolált, vad típusú ortopoxvirusgenomot tartalmazó módosítatlan DNS egy második, természetben előforduló ortopoxvírusgenommal fertőzött sejtekben való transzfekciójával bizonyították. Azonban a heterológ pakolást - azaz az egyik fajta poxvírusból (például ortopoxvírusból) származó DNS bepakolását egy másik fajta, például szárnyas poxvírus életképes virionjaival - eddig még nem ismertették.
Az intracelluláris rekombináció alkalmazását nem poxvirusgéneket expresszáló rekombináns poxvírusgenomok előállítására röviddel Sam és Dumbell után írták le, akik először ismertették a csupasz poxvirus-DNS bepakolását poxvírusvirionokba és a DNS-ffagmensekkel való marker rescue-t intracelluláris rekombináció segítségével. [Panicali és Paoletti (1982); Mackett és munkatársai (1982).] A következő évtizedben a vonatkozó irodalomban azonban nem található közvetlen molekuláris klónozásra vonatkozó leírás, azaz valamely eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus - főleg poxvírus - módosított genomjának megszerkesztése pusztán extracelluláris géntechnológiai módszerekkel. A szakirodalomban még csak arra sincsen bizonyíték, hogy felismerték volna az ilyen közvetlen klónozási módszerből származó előnyöket. Éppen ellenkezőleg azt a nézetet hangoztatták, hogy a közvetlen molekuláris klónozás nem praktikus a poxvírusok genetikai módosítása vonatkozásában, mivel a poxvirus-DNS nem fertőző [F. Fenner, R. Wittek és
K. R. Dumbell: The Poxviruses (Academic Press, 1989)]. Ugyanígy az ezen a szakterületen dolgozó többi kutató sem foglalkozott a poxvirus-DNS endonukleázos hasításával és újraligálásával, még akkor sem, amikor felismerték a rekombináns poxvírusgenomot tartalmazó izolált DNS fertőző vírus általi „megmentésének” lehetőségét [lásd például Mackett és Smith, J. Gén. Virol. 67, 2067-2082 (1986)]. Ezen túlmenően a legújabb irodalmi áttekintések is azt az elméletet támasztják alá, hogy a rekombináns poxvírusgenomok előállításának egyetlen járható útja az intracelluláris rekombinációs módszerek alkalmazásával jár [Miner & Hruby, TIBTECH 8, 20-25 (1990), és Moss Flexner, Ann. Rév. Immunoi. 5, 305-324(1987)].
A fentiek ismeretében célul tűztük ki olyan módszer kidolgozását eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusok, főleg poxvírusok módosított genomjainak megszerkesztésére, amely kiküszöböli az intracelluláris rekombináción alapuló hagyományos módszerekkel kapcsolatos fenti hátrányokat.
Másik célkitűzésünk a citoplazmatikus DNS-vírus genomok előállítására olyan módszerek kidolgozása volt, amelyek segítségével lényegesen nagyobb hozammal állíthatók elő a rekombinánsok, mint a meglévő módszerekkel.
További célkitűzésünk volt a citoplazmatikus DNSvírusok genomjának módosítására olyan módszerek kidolgozása, amelyek alkalmasak a genomiális vírusDNS közvetlen módosítására, és a módosított virális
DNS virionokba való intracelluláris pakolására helpervírusok segítségével.
További célkitűzésünk volt olyan módszerek kidolgozása a citoplazmatikus DNS-vírusok genomjának szerkesztésére, amelyek egyetlen rekombinációs reakciólépésben alkalmasak olyan módosított genomok előállítására, amelyek a két lehetséges orientáció közül mindkettőben tartalmazzák az inzertált idegen DNSszegmenst, és amely módosított genomokba több idegen DNS-szegmens van inzertálva.
A találmány újabb célja volt olyan módosított DNS-molekulák előállítása, amelyek alkalmasak idegen gének közvetlen molekuláris klónozására módosított citoplazmatikus DNS-vírus-genomban, amelyek egy genomiális vírus-DNS két részét foglalják magukban, amelyeket a virális genom egyetlen ilyen hasítási helyén szekvenciaspecifikus endonukleázos hasítással állítottunk elő. A találmány további célkitűzése volt olyan módosított genomot tartalmazó citoplazmatikus DNS-vírus, főleg poxvírus előállítása, amely módosított genom egy szekvenciaspecifíkus endonukleáz egyetlen ilyen hasítási helyébe inzertálva egy idegen DNS-t tartalmaz.
További célkitűzésünk volt olyan plazmidok előállítása, amelyek lehetővé teszik génkazetták szerkesztését és átvitelét citoplazmatikus DNS-vírusba, főleg poxvírusba közvetlen molekuláris klónozás alkalmazásával.
A fenti és egyéb célok megvalósítása során a találmány egyik tárgya értelmében kidolgoztunk egy eljárást módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus előállítására, egy módosított citoplazmatikus DNS-vírus genomot tartalmazó módosított DNS-molekula közvetlen molekuláris klónozásával. A találmány szerinti eljárás az alábbi lépéseket foglalja magában:
(i) valamely első citoplazmatikus DNS-vírus-genomot tartalmazó tisztított DNS-molekulát extracelluláris körülmények között módosítva előállítunk egy módosított virális genomot tartalmazó módosított DNS-molekulát;
(ii) a módosított DNS-molekulát bevisszük valamely első gazdasejtbe, amely a módosított DNS-molekulát fertőző virionokba pakolja; és (iii) a módosított virális genomot tartalmazó fertőző virionokat az első gazdasejtből kinyerjük.
A fenti eljárás egyik kiviteli alakja szerint a DNSmolekula módosításának lépése extracelluláris körülmények között a DNS-molekula szekvenciaspecifikus endonukleázzal való hasítását jelenti. Egy másik kiviteli alak szerint a DNS-molekula módosításának lépése valamely első DNS-szekvencia inzertálását jelenti valamely első virális genomba. Ezt az első DNS-szekvenciát előnyösen a szekvenciaspecifíkus endonukleáz hasítási helyén illesztjük az első genomba. Megjegyezzük, hogy amennyiben egy bizonyos szekvenciaspecifikus endonukleázt, például egy bakteriális restrikciós enzimet említünk név szerint, ez a név a megadott nukleáz bármely izoskizomerjét is jelenti.
A DNS-molekula módosításának lépése a találmány szerinti eljárás értelmében egy foszfatáz alkalma3
HU 219 369 Β zását is jelentheti, hogy a DNS-molekula szekvenciaspecifikus endonukleázzal való hasításával előállított DNS-szegmens végéről egy foszfátmaradékot eltávolítsunk.
A találmány szerinti eljárás egy bizonyos kivitelezési módja szerint az első virális genom egy vacciniavírus-genom, és az egyetlen hasítási hely az NotI vagy Smal bakteriális restrikciós endonukleáz hasítási helye. Az első genom egy eukarióta citoplazmatikus DNSvírus genomban természetes körülmények között nem előforduló második DNS-szekvenciát is tartalmazhat, mimellett ez a második DNS-szekvencia tartalmazza az egyetlen hasítási helyet. így például az első genom egy számyaspoxvírus-genom lehet, amely egy Escherichia coli β-galaktozidáz génszekvenciát foglal magában, és az egyetlen hasítási hely az ebben a génben elhelyezkedő NotI bakteriális restrikciós endonukleáz hasítási hely.
A fenti eljárás egy másik megvalósítási módja szerint az első DNS-szekvencia valamely első szekvenciaspecifikus endonukleáz első hasítási helye és valamely második szekvenciaspecifikus endonukleáz második hasítási helye közé van inzertálva az első virális genomban. Adott esetben az első és a második hasítási hely közül mind a kettő az egyetlen ilyen hely az első virális genomban.
A találmány szerinti eljárás egy további megvalósítási módja szerint az első genomba inzertált első DNSszekvenciának legalább egy része valamely promoter transzkripciós szabályozása alatt van. Ez a promoter az első virális genomba inzertált első DNS-szekvenciában helyezkedhet el. A promoter azonban elhelyezkedhet az első genomba inzertált első DNS-szekvencia előtt (3’->5’-irányban) is a módosított virális genomban. Bizonyos esetekben a promotert egy módosított virális genom által kódolt RNS-polimeráz hasznosítja. Ez a promoter alkalmas lehet a módosítandó eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus RNS-polimeráza általi transzkripció iniciálására is. Bizonyos módszerekben a promoter az eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus természetben előforduló promoterének egy módosított formája lehet.
A találmány szerinti eljárásban a DNS-molekula módosításának lépése egy DNS-szekvencia törlése is lehet az első genomból. Ez a lépés lehet az első genom egy DNS-szekvenciájának helyettesítése is.
Az első virális genom módosításának módszere magában foglalhatja az első gazdasejt valamely második eukarióta citoplazmatikus DNS-vírussal való infektálásának lépését is, amely egy második genomot tartalmaz, amely a módosított virális genom fertőző virionokba való bepakolását expresszálja. A módosított DNSmolekula gazdasejtbe való bevitelének lépését előnyösen az első gazdasejt valamely második eukarióta citoplazmatikus DNS-vírussal való infektálása után 1 órával hajtjuk végre.
A fenti eljárás egyik változata szerint az első gazdasejtet úgy választjuk meg, hogy a második genom expressziója az első gazdasejtben nem eredményez második virális genomot tartalmazó fertőző virionokat. Például abban az esetben, ha a módosított virális genom egy módosított vacciniavírus-genom, és a második genom egy számyaspoxvírus-genom, a választott első gazdasejt egy emlőssejt.
A virális genom módosítására szolgáló eljárás egy bizonyos formájában a módosított virális genomot tartalmazó fertőző virionok visszanyerésének lépése abból áll, hogy az első gazdasejt által termelt fertőző virionokkal infektálunk egy második gazdasejtet. Ezt olyan körülmények között végezzük, hogy a második genom expressziója a második gazdasejtben nem eredményez második genomot tartalmazó fertőző virionokat. így például ha a módosított virális genom egy módosított vacciniavírus-genom, a második genom egy számyaspoxvírus-genom lehet, és a második gazdasejt egy emlőssejt. A módosított virális genom tartalmazhat egy funkcionális gazdaspecifikus gént is, amely a második gazdasejtben a fertőző virionok termeléséhez szükséges, és a második genomból hiányzik ez a funkcionális gazdaspecifikus gén. Ezt az esetet azzal szemléltetjük, amikor a módosított virális genom egy módosított vacciniavírus-genom, amely humán sejtekben fertőző virionok termeléséhez szükséges funkcionális gazdaspecifikus gént tartalmaz, és a második gazdasejt egy humán sejt.
A fenti eljárás egy másik megvalósítási módja szerint a módosított virális genom egy szelektív markergént tartalmaz, a második genomból hiányzik ez a szelektív markergén, és a második gazdasejt infektálásának lépését olyan körülmények között hajtjuk végre, hogy ezt a szelektív markergént expresszáló genomra szelektálunk. A szelektív markergén expressziója a második gazdasejtben előnyösen a második gazdasejtnek rezisztenciát biztosít egy citotoxikus hatóanyaggal szemben, amely az infekció során olyan mennyiségben van jelen, amennyi elegendő a szelektív markergént expresszáló genomra való szelektáláshoz.
A találmány tárgya továbbá egy módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus, amelyet módosított virális genom közvetlen molekuláris klónozásával állítottunk elő a fent összefoglalt módszerek szerint. A találmány tárgyát képezi továbbá egy módosított virális genomot tartalmazó módosított eukarióta citoplazmatikus DNSvírus is, amely módosított virális genom tartalmazza: (i) egy első eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus első genomját; ez az első genom egy szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmaz, és ez a hasítási hely az egyetlen ilyen hely ebben az első genomban. A módosított genom ezenkívül tartalmaz (ii) egy, az első genom egyetlen hasítási helyére inzertált első DNSszekvenciát.
A találmány fenti tárgyának fő megvalósítási módja szerint az első DNS-szekvencia egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomjában természetes körülmények között nem fordul elő. Bizonyos előnyös esetekben az első genom egy vacciniavírus-genom, és az egyetlen hasítási hely az NotI vagy SamI bakteriális restrikciós endonukleázok valamelyikének hasítási helye.
Az első genom tartalmazhat egy második DNSszekvenciát is, amely eukarióta citoplazmatikus DNS4
HU 219 369 Β vírusok genomjában természetes körülmények között nem fordul elő, és ez a második DNS-szekvencia tartalmazza az egyedi hasítási helyet. Például az első genom egy számyaspoxvírus-genom, amely az Escherichia coli β-galaktozidáz-gént tartalmazza második DNSszekvenciaként, és az egyedi hasítási hely ebben a génben az NotI bakteriális restrikciós endonukleáz hasítási helye.
Bizonyos találmány szerinti módosított vírusokban a fenti, az egyedi hasítási helyre inzertált első DNSszekvenciának legalább egy része egy promoter transzkripciós szabályozása alatt áll. Ez a promoter az első genomba inzertált első DNS-szekvenciában helyezkedik el. Bizonyos esetekben az első genom egy poxvírusgenom, és a promoter egy poxvírus promoter, amely vagy egy természetben előforduló poxvírus promoter vagy annak egy módosított formája lehet.
A találmány további tárgya egy módosított virális genomot tartalmazó módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus, amelyben a módosított virális genom tartalmazza (i) egy első eukarióta citoplazmatikus DNSvírus első genomját. Ez az első genom valamely első szekvenciaspecifikus endonukleáz számára egy első hasítási helyet, és valamely második szekvenciaspecifikus endonukleáz számára egy második hasítási helyet tartalmaz. A fenti hasítási helyek közül mindkettő egyetlen ilyen hely az első genomban.
Ebben a módosított vírusban a módosított genom továbbá tartalmaz (ii) egy első DNS-szekvenciát az első genomba inzertálva az első egyetlen hasítási hely és a második egyetlen hasítási hely között. A fenti módosított vírus bizonyos formáiban az első DNS-szekvencia az eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusok genomjában természetes körülmények között nem fordul elő. Bizonyos esetekben az első genom tartalmaz egy második DNS-szekvenciát is, amely eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusok genomjában természetes körülmények között nem fordul elő, és ez a második DNS-szekvencia az első egyetlen hasítási hely és a második egyetlen hasítási hely közé inzertált első DNS-szekvenciában található. Ez a módosított vírus például tartalmazhat egy első genomot, amely egy vacciniavírus-genom, és az első egyetlen hasítási hely és a második egyetlen hasítási hely az NotI, Smal, Apai vagy Rsrll bakteriális restrikciós endonukleáz hasítási helye.
Egy találmány szerinti másik eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus egy olyan módosított virális genomot tartalmaz, amely (i) valamely első eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus első genomját tartalmazza. Ez az első genom egy első DNS-szekvenciát tartalmaz, és ez az első DNS-szekvencia tartalmaz egy szekvenciaspecifikus endonukleáz számára egy hasítási helyet, amely ebben a módosított virális genomban az egyetlen ilyen hely. Ennek a módosított vírusnak ez a genomja tartalmaz továbbá (ii) egy promotert, amely úgy helyezkedik el, hogy a virális genomban az egyetlen hasítási helyre inzertált DNS-szekvencia a promoter transzkripciós szabályozása alatt áll. Bizonyos kiviteli alakokban ez az első DNS-szekvencia nem tartalmaz transzlációs startkodont a promoter és az egyetlen inszerciós hely között. Ez az első DNS-szekvencia olyan szekvencia is lehet, amely eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomjában természetes körülmények között nem fordul elő. Ez a módosított vírus például egy olyan vírus lehet, amelynek az első genomja egy vacciniavírus-genom és az első DNS-szekvencia egy többszörös klónozóhelyet tartalmaz, amely az NotI, SamI, Apai és Rsrll bakteriális restrikciós endonukleázok számára tartalmaz hasítási helyeket.
A találmány továbbá olyan módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusra is vonatkozik, amelyben a módosított virális genomban lévő első szekvencia (egy inzertált érdekes szekvencia) egy gazdasejtben expresszálódva egy protein termelését eredményezi.
A találmány vonatkozik továbbá olyan DNS-molekulára is, amely egy találmány szerinti módosított vírus módosított virális genomját tartalmazza. Közelebbről a fenti DNS-molekula bizonyos formái tartalmazzák egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus módosított virális genomjának egyik végét, amelyben (i) a módosított virális genomnak ez a vége egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomjában természetes körülmények között nem előforduló DNS-szekvenciát tartalmaz. Ebben a DNS-molekulában (ii) a módosított virális genom egy szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmaz, amely az egyetlen ilyen hely ebben a módosított virális genomban; és (iii) a DNS-molekula olyan terminálissal rendelkezik, amely homológ a módosított virális genomban lévő egyetlen hasítási hely szekvenciaspecifikus endonukleázzal való hasításával kapott véggel.
A fenti DNS-molekula bizonyos alakjaiban az eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomjában természetes körülmények között nem előforduló DNS-szekvenciában van a hasítási hely a szekvenciaspecifikus endonukleáz számára, és ez az egyetlen ilyen hely ebben a módosított virális genomban.
A találmány továbbá egy készletre is vonatkozik eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus módosított virális genomjának közvetlen molekuláris klónozására, amely készlet tartalmaz (i) egy tisztított, találmány szerinti DNS-molekulát;
(ii) egy DNS-ligázt; és (iii) pufferoldatokat és reagenseket, amelyek alkalmasak DNS-szegmensek ligálására és ezáltal a módosított virális genomot tartalmazó módosított DNSmolekulák előállítására.
Az egyik kiviteli alak szerint ez a készlet tartalmaz továbbá egy plazmidot is, amely egy szekvenciaspecifikus endonukleáz számára megfelelő hasítási helyekkel határolt génkazettát tartalmaz, amely helyek alkalmasak arra, hogy a kazettát a készletben lévő DNS-molekula által kódolt módosított virális genom egyetlen hasítási helyére inzertáljuk. A készlet tartalmazhat ezenkívül egy első gazdasejtet és egy második vírust, amely alkalmas a módosított virális genom fertőző virionokba való pakolására.
A találmány vonatkozik továbbá olyan plazmidokra is, amelyek olyan DNS-szegmenst tartalmaznak, amely mindkét végén tartalmaz egy NotI bakteriális restrikciós
HU 219 369 Β endonukleáz hasítási helyet. Ebben a plazmidban ez a DNS-szegmens tartalmaz egy olyan szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet is, amely a plazmidban az egyetlen ilyen hely. Erre a plazmidra példát az 1.3 ábrán mutatunk be, ezt a plazmidot pN2-nek nevezzük, és az 1. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza. Ebben a plazmidban a DNS-szegmens tartalmazhat továbbá egy szelektív markergént is a poxvírus promoter transzkripciós szabályozása alatt. így például az ilyen plazmidok közé tartozik a pN2-gpta plazmid is, amely a 2. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza, és a pN2-gptb plazmid, amely a 3. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza.
Egy találmány szerinti másik plazmid olyan DNSszegmenst tartalmaz, amely egy restrikciós endonukleáz hasítási helyet tartalmazó DNS-szekvenciához működőképesen kötött poxvírus promotert tartalmaz. Ily módon erre a hasítási helyre inzertált DNS-szegmens ennek a promotemek a transzkripciós szabályozása alatt áll. Példaként említhetjük ezekre a plazmidokra a pAl-S2 plazmidot, amely all. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza, és a pA2-S2 plazmidot, amely a
12. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza. Egy olyan plazmidra, amely egy másik poxvírus promoter kontrollja alatt álló szelektív markergént is tartalmaz, példaként a pN2gpt-S4 plazmidot említjük, amely a
14. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza.
Egy találmány szerinti másik plazmid egy poxvírusgenom-szegmenst tartalmaz, amely ennek a poxvírusnak egy timidin-kináz génjét tartalmazza. A timidinkináz gént úgy módosítottuk, hogy az aktív timidinkináz expresszióját megakadályozzuk, mint például a pHindJ-2 plazmidban, amely a 4. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza, és a pHindJ-3 plazmidban, amely az 5. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza.
Egy másik találmány szerinti plazmid egy poxvírus promotert tartalmaz egy transzlációs startkodonhoz működőképesen kötve. Ezt a startkodont közvetlenül egy második restrikciós endonukleáz hasítási hely követi olyan elrendezésben, amely lehetővé teszi egy, ebbe a második restrikciós endonukleáz hasítási helybe inzertált nyitott leolvasási keret transzlációját. Erre a plazmidra példaként említhetjük a pAl-Sl plazmidot, amely a 9. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza és a pA2-Sl plazmidot, amely a 10. azonosítási szekvenciát tartalmazza, valamint a pN2gpt-S3A plazmidot, amely a 13. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza.
Ez utóbbi típusú plazmidok egyik képviselője tartalmaz továbbá egy humán protrombint kódoló DNS-szekvenciát is, amely DNS-szekvencia a poxvírus promoterhez és egy startkodonhoz van működőképesen kötve, amint azt az 5.1 ábra mutatja a pAlSl-olvadáspont plazmidban, amely a 15. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza.
Egy találmány szerinti másik plazmid egy humán plazminogént kódoló és egy transzlációs startkodont tartalmazó DNS-szekvenciát is tartalmaz, ahol ez a DNSszekvencia a poxvírus promoterhez van működőképesen kötve. Az 5.2 ábra szerint ezt a plazmidot a pN2gpt-S4-ből származó plazmidokkal szemléltetjük, ilyen például a pN2gpt-GPg plazmid, amely a humán glu-plazminogént kódolja, és a 17. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza, valamint a pN2gpt-LPg plazmid, amely a lys-plazminogént kódolja és a 18. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza.
Egy találmány szerinti másik plazmid tartalmaz továbbá humán immunhiányvírus (HÍV) gpl60-at kódoló és egy transzlációs startkodont tartalmazó DNS-szekvenciát is, amely a poxvírus promoterhez működőképesen van kötve, mint például az 5.4 ábrán látható, 19. azonosítási számú szekvenciát tartalmazó pN2gpt-gpl60 plazmid. Végül egy újabb plazmid humán von Willebrand-faktort kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, mint például a 6.2 ábrán látható, 20. azonosítási számú szekvenciát tartalmazó pvWF plazmid.
A találmány szerinti bizonyos plazmidok olyan szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmaznak, amely egyetlen a poxvírusgenomjában. Ezekre szolgál példaként a 4.3 ábrán látható pAO plazmid, amely a 6. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza, a pAl plazmid, amely a 7. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza, és a pA2 plazmid, amely a 8. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza.
Egy másik plazmid a vacciniavírus-DNS módosított EcoRI K-fragmensét tartalmazza, amelyből a K1L gazdaspecifikus gén törölve van, amint azt a 8.1 ábra mutatja. Erre két példát említünk, a pEcoK-dhr-t, amely a
21. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza, és a pdhr-gpt-t, amely a 22. azonosítási számú szekvenciát tartalmazza.
A találmány egyéb célkitűzései, jellemzői és előnyei az alábbi részletes leírásból kitűnnek. Megjegyezzük azonban, hogy a specifikus példák és a részletes leírás a találmány előnyös megvalósítási módjaira vonatkoznak, amelyeket a szemléletesség kedvéért közlünk pusztán, a korlátozás szándéka nélkül, és a különféle, szakember számára kézenfekvő változtatások és módosítások szintén a találmány tárgykörébe tartoznak. Az ábrákat röviden az alábbiakban ismertetjük.
Az 1.1 ábra szemlélteti a markergének expresszióját csupasz poxvírus-DNS reaktiválásával nyert módosított poxvírusgenomok által. Az ábrán látható a bepakolt vírusokkal (vpPg#l-vpPg#8) és kontrollként a vad típusú (WT) vírussal fertőzött sejtek tenyészetének felülúszójában termelődött proteinek ezüsttel festett poliakrilamid-gélelektroforézis képe. A felső nyíl a plazminogén markersávra mutat, az alsó nyíl a fő szekretált 35 K vaccinia marker proteinsávját mutatja. 1. és 9. sáv: a marker proteinek; a 2. és 10. sáv: a humán plazminogén standard (10 ng); 3. sáv: a vaccinia rekombináns vPgD (bepakolt DNS-forrása); 4-7. és
11-14. sávok: vpPg#l-8; a 8. és 15. sáv: a vad típusú vaccinia (WR WT).
A 1.2 ábra mutatja sematikusan poxvírusgenomok közvetlen molekuláris klónozását, amelyek egy génkazettát tartalmaznak egy markergén (E. coli gpt gén) expressziójára egy vacciniavírus promoter szabályozása alatt.
Az 1.3 ábra mutatja sematikusan a pN2-gpta és pN2-gptb plazmidok szerkesztését, amelyekből mint
HU 219 369 Β prekurzorokból a génexpressziós kazetták állíthatók elő egy promoter és egy nyitott leolvasási keret inzertálásával. Ezek a kazetták egy egyedi inszerciós hely és egy vacciniavírus promoter szabályozása alatt álló szelektálható markergén (gpt) alkalmazásával vacciniavírus-vektorokba való közvetlen molekuláris transzferre vannak tervezve. MCS=többszörös klónozási hely; P7,5=a vaccinia 7,5K polipeptidgén promotere; P11 = a vaccinia 11K polipeptidgén promotere. A nyilak jelzik a promoterekből való transzkripció irányait.
Az 1.4 ábrán bizonyítjuk, hogy a közvetlen molekuláris klónozással előállított poxvírusgenomok a gpt markergénkazettát az egyetlen NotI hasítási helyre inzertálva tartalmazzák, amint azt HindlII endonukleázzal emésztett, plakktisztított virális DNS-ek Southem-blotanalízise mutatja gpt-gén próba alkalmazásával. 1. sáv: marker DNS-ek (HindlII-mal emésztett λ-fág-DNS); 2. és 3. sáv: HindlII-mal hasított vad típusú vacciniavírus (WR)-DNS (500 és 100 ng); 4-9. sáv: a 2.1.1-7.1.1 jelzésű plakkokkal fertőzött sejtek DNS-ei; 10-12. sáv: 10.1.1-12.1.1 jelzésű plakkokkal fertőzött sejtek DNS-ei. Nyilak jelzik a marker restrikciós fragmenseinek méretét kilobázispárban.
Az 1.5 ábra illusztrálja továbbá a módosított poxvírus-DNS-ek szerkezetét a különféle izolátumokkal fertőzött sejtek Notl-gyel hasított DNS-einek Southemblot-analízisével, gpt-gén-próbával hibridizálva. 1 sáv: marker-DNS-ek (HindlII-mal emésztett λ-fág-DNS); 2. sáv: Notl-gyel hasított vad típusú (WT) vaccinia-DNS (50 ng); 3-8. sáv: 2.1.1-7.1.1 jelzésű rekombináns plakkokkal fertőzött sejtek DNS-ei; 9-11. sáv: 10.1.112.1,1 jelzésű plakkokkal fertőzött sejtek DNS-ei.
Az 1.6 ábra mutatja vad típusú (WT) vacciniából és a módosított klónból (vp7) származó DNS-ek összehasonlítását, a megadott restrikciós endonukleázokkal való hasítással kapott és agarózgélen szétválasztott DNS-fragmensek etídium-bromidos festésével. 1. és 2. sáv: Notl-gyel emésztett WT és vp7; 3. és 4. sáv: HindlII-mal emésztett WT és vp7; 5. és 6. sáv: HindlII-mal és Notl-gyel kombináltan emésztett WT és vp7; 7. és 8. sáv: Pstl-gyel emésztett WT és vp7; 9. és 10. sáv: Pstl-gyel és Notl-gyel együtt emésztett WT és vp7; 11. és 12. sáv: Sall-gyel emésztett WT és vp7; 13. sáv: marker-DNS-ek (ligáit és HindlII-mal emésztett λ-fág-DNS; és HaelII-mal hasított ΦΧ-fág). A bal oldali nyilak jelzik a fragmensek méretét kilobázispárban, az Notl-gyel emésztett WT vacciniában, a jobb oldali nyilak a markerek. Megjegyezzük, hogy az 1. és 2. sáv közel tízszer kevesebb DNS-t tartalmaz, mint a többi sávok.
Az 1.7 ábra mutatja az 1.6 ábrán látható gél Southem-blot-képét, próbaként gpt-gént alkalmazva. A nyilak jelzik a markerméreteket.
Az 1.8 ábra mutatja a fertőzött sejtekből nyert, Notl-gyel emésztett és vacciniavírus-próbával hibridizált vacciniavírus-DNS-ek Southem-blot-analízisét. 1-4. sáv: az A1-A4 jelzésű plakkokkal fertőzött sejtek DNS-e; 5-8. sáv: C1-C4 plakkok; 9-12 sáv: E1-E4 plakkok; 13. sáv: vad típusú vaccinia-DNS; 14. sáv: nem fertőzött CV-1 gazdasejtek DNS-e; 15. sáv:
marker-DNS-ek (HindlII-mal emésztett λ-fág-DNS;
HaelII-mal hasított ΦΧ-fág).
Az 1.9 ábra mutatja ugyanazon minta Southemblot-analízisét próbaként gpt-gént alkalmazva, mint amelynek elektroforetikus gélképét az 1.8 ábra mutatja. Az 1-12. sávok jelentése ugyanaz, mint az 1.8 ábrán;
13. sáv: fertőzetlen CV-1 gazdasejtek DNS-e; 14 sáv: vad típusú vaccinia-DNS; 15. sáv: marker DNS-ek (HindlII-mal emésztett λ-fág-DNS és HaelII-mal hasított ΦΧ-fág).
Az 1.10 ábra mutatja ugyanazon virális DNS-nek Southem-blot-analízisét Pstl-gyel végzett hasítás után, próbaként gpt-gént alkalmazva, mint amelynek elektroforetikus gélképét az 1.8 ábra mutatja. 1-12. sáv: mint az 1.8 ábrán; 13. sáv: fertőzetlen CV-1 gazdasejtek DNS-e; 14. sáv: WT vaccinia-DNS; 15. sáv: marker-DNS-ek (HindlII-mal emésztett λ-fág-DNS, és HaelII-mal hasított ΦΧ-fág).
Az 1.11 ábra mutatja a vacciniavírus-DNS-ek módosított PstI „C”-fragmensének várható szerkezetét a gpt génkazetta egyszeri vagy kettős inzertálásával. P=PstI és N=Notl hasítási hely. A számok a megfelelő PstI fragmensek méretét jelölik; a vastagon írott számok azokat a fragmenseket jelzik, amelyek várhatóan hibridizálnak a gpt-gén-próbával. Nyilak jelzik a gpt-gén (800 bp) transzkripciójának irányát a vacciniavírus promoter (300 bp) irányítása alatt.
A 2.1 ábra mutatja rekombináns madárpoxvírus (számyaspoxvírus, FP)-genomok analízisét NotI restrikciós endonukleázzal való emésztéssel és 1%-os aga-* rózgélen FIGE-elválasztással. 5. sáv: marker (λ-fág HindlII fragmens, nem hasított λ-fág és vaccinia WR); 1. és 2. sáv: HP1.441 számyaspoxvírus-DNS, nem hasított, illetve Notl-gyel hasított; 3. és 4. sáv: f-TK2a számyaspoxvírus-DNS, nem hasított, illetve Notl-gyel hasított.
A 2.2 ábra mutatja az idegen géneket expresszáló számyaspoxvírusok szerkesztését közvetlen molekuláris klónozással. A poxvírus promoter (P) szabályozása alatt álló E. coli gpt-gént tartalmazó génexpressziós kazettát Notl-gyel való hasítással kapott számyaspoxvírus (f-TK2a) DNS-ének jobb és bal karjához (ra, illetve la) ligáljuk. A pakolást helper-számyaspoxvírussal (HP2 törzs) végezzük csirkeembrió-fíbroblasztokban.
A 3.1 ábra mutatja a módosított poxvírusok előállításának folyamatát extracelluláris genomszerkesztéssel és intracelluláris pakolással. Egy vacciniavírus promoter szabályozása alatti gpt-gént tartalmazó génkazettát ligálunk az egyetlen hasítási helyen Smal endonukleázzal hasított vacciniavírus-DNS jobb kaijával (ra) és bal karjával (la). A pakolást helper-számyaspoxvírussal (HP 1.441 törzs) végezzük csirkeembrió-fibroblasztokban. Pl=a 7,5 kD polipeptidet kódoló vacciniavírusgén promotere.
A 3.2 ábrán Southem-blot-analízissel bizonyítjuk, hogy a helper-számyaspoxvírussal pakolt, genetikailag módosított vacciniavírus-genomok a várt inzertált szakaszt az egyetlen Smal hasítási helyen tartalmazzák. A fertőzött sejtekből izolált összes DNS-t HindlII-mal
HU 219 369 Β emésztettük, és a blotot gpt-gén-próbával hibridizáltuk. 1-8. sáv: F12.2-F12.9 plakkokkal fertőzött sejtekből izolált DNS-ek; 9-13. sáv: F13.1-F13.5 plakkok; 14. és 15. sáv: fertőzetlen és vad típusú vacciniavírussal (WR) fertőzött sejtekből izolált DNS-ek HindlII-mal hasítva; 16. sáv: marker (HindlII-mal hasított λ-fágDNS). A 8. sávban lévő DNS nem hibridizálódik, mivel az F12.9 számú vírusizolátum nem replikálódott.
A 3.3 ábra mutatja olyan módosított vacciniavírusok várható sematikus szerkezetét, amelyek az egyetlen Smal helyre inzertálva tartalmaznak egy génkazettát, közelebbről az egyetlen vagy kettős inszerciót tartalmazó vírusok módosított HindlII „A”-fragmenseit. H=HindIII restrikciós endonukleáz hasítási hely, S=SmaI restrikciós endonukleáz hasítási hely. A számok a HindlII fragmensek méretét jelzik, a kivastagított számok azokat a fragmenseket jelölik, amelyek várhatóan hibridizálnak a gpt-gén-próbával. A gpt-génkazetta egy körülbelül 300 bp méretű vacciniavírus promotert tartalmaz, amelyet egy belső HindlII hely választ el a gpt-szekvenciától (mintegy 800 bp). A nyilak jelzik a gpt-gén transzkripciójának irányát.
A 4.1 ábra mutatja a módosított timidin-kináz (tk)gént tartalmazó vacciniavírus-vektor (vdTK) szerkesztésének vázlatát. WR-WT=vacciniavírus (VV), vad típusú (WT) Western Reserve (WR) törzs. A 4.1A ábra mutatja a vacciniavírus-genom csak közvetlen molekuláris módosítását alkalmazó módszert, beleértve a nemkívánatos NotI és Smal helyek nem jelölt delécióját is. A 4.1B ábra egy másik módszert mutat be, az NotI deléciójára marker rescue-módszert alkalmazva, vacciniavírussal és egy módosított plazmiddal. A 4.IC ábra az Smal hely deléciójára egy másik módszert mutat be, mégpedig a marker rescue-technikát.
A 4.2 ábra mutatja olyan vacciniavírus-vektor (vdTK) szerkesztését, amelyben a timidin-kináz (tk)-gén egy többszörös klónozóhellyel van helyettesítve. A nyilak jelzik a vacciniavírus tk-gén (W-tk) transzkripciójának iniciálását és irányát pHindJ-1 plazmidba klónozott HindlIIJ fragmensben. A tk-gént a bemutatott módon helyettesítettük, és a végső pHindJ-3 plazmidot alkalmaztuk a módosított HindlIIJ fragmens vacciniavírusba való inzertálására.
A 4.3 ábra illusztrálja a pAl és pA2 plazmidok szerkesztését, amelyek prekurzorként használhatók a génexpressziós kazetták megszerkesztésére egy promoter és egy nyitott leolvasási keret inzertálásával. Az ilyen kazetták alkalmasak a vdTK vacciniavírus-vektorba való közvetlen molekuláris bevitelre irányított (erőszakolt) klónozás alkalmazásával.
A 4.4 ábra szemlélteti az olyan génexpressziós kazettát tartalmazó pAl-Sl és pA2-Sl plazmidok megszerkesztését, amely alkalmas a nyitott leolvasási keretek szintetikus poxvírus promoterrel (SÍ) és egy transzlációs startkodonnal való összekapcsolására. A kazettákat vdTK vacciniavírus-vektorba irányított klónozással való közvetlen molekuláris bevitelre terveztük. Az SÍ promoter a két plazmidban eltérő orientációban van jelen, amint azt a transzkripció irányát mutató nyilak jelzik.
A 4.5 ábra mutatja az olyan génexpressziós kazettákat tartalmazó pAl-S2 és pA2-S2 plazmidok megszerkesztését, amelyek alkalmasak egy transzlációs startkodont már tartalmazó nyílt leolvasási keretek összekapcsolására egy szintetikus poxvírus promoterrel (S2) a vdTK vacciniavírus-vektorba irányított klónozással való közvetlen molekuláris bevitelt megelőzően. Az S2 promoter a két plazmidban eltérő orientációban van jelen, amint azt a transzkripció irányát mutató nyilak jelzik.
A 4.6 ábra mutatja a pN2-gpta és pN2-gptb plazmidok megszerkesztését.
A 4.7 ábra mutatja az olyan génexpressziós kazettákat tartalmazó pN2gpt-S3A és pN2gpt-S4 plazmidok megszerkesztését, amelyek alkalmasak egy transzlációs startkodont tartalmazó (S4) vagy azt nem tartalmazó (S3A) nyílt leolvasási keret összekapcsolására egy szintetikus promoterrel (S3A vagy S4) a vdTK vacciniavírus-vektorban lévő egyetlen helyre való közvetlen molekuláris bevitelt megelőzően. A rövidítések azonosak az 1.3 ábrával kapcsolatban megadottakkal.
Az 5.1 ábra mutatja a pAlSl-PT génexpressziós kazetta plazmid megszerkesztését humán protrombin vdTK vacciniavírus-vektorban való expresszálására. A rövidítések jelentése azonos az 1.3 ábrán megadottakkal. A nyilak a transzkripció irányát jelzik.
Az 5.2 ábra mutatja a pN2gpt-GPg génexpressziós kazetta plazmid megszerkesztését humán glu-plazminogén expresszálására vdTK vacciniavírus-vektorban. S4=szintetikus poxvírus promoter; a többi rövidítés jelentése azonos az 1.3 ábrán megadottakkal.
Az 5.3 ábra mutatja a pN2gpt-LPg génexpressziós kazetta plazmid megszerkesztését humán lys-plazminogén expresszálására vdTK vacciniavírus-vektorban. A rövidítések jelentése azonos az 1.3 ábrán megadottakkal.
Az 5.4 ábra mutatja a pN2gpt-gpl60 génexpressziós kazetta plazmid megszerkesztését humán vírusantigén (HIV-gpl60) expresszálására vdTK vacciniavírus-vektorban. A rövidítések jelentése azonos az 1.3 ábrával kapcsolatban megadottakkal.
Az 5.5 ábra mutat egy módszert közvetlen molekuláris klónozással előállított módosított vacciniavírusok vizsgálatára, amely egy markergén (E. coli lacZ-gén) egyidejű inzertálásán alapul, ez a markergén egy szemmel látható megkülönböztető fenotípust biztosít (kék plakk, szemben a lacZ-gén nélküli vírusok fehér plakkjával).
Az 5.6 ábra mutatja a pTZS4-lacZa és pTZS4lacZb plazmidok szerkesztését.
A 6.1 ábra mutatja a vS4 vacciniavírus-vektor megszerkesztését, amely egy erős, késői vacciniavírus promoter (S4) kontrollja alatt álló, irányított ,jnester”-klónozóhellyel rendelkezik.
A 6.2 ábra mutatja a wWF módosított vacciniavírus megszerkesztését a von Willebrand-faktor expresszálására egy nyílt leolvasási keret vS4 vacciniavírus-vektorba való közvetlen molekuláris inzertálásával. vWF=von Willebrand-faktor-cDNS. A nyíl jelzi a transzkripció irányát az S4 promoterből.
A 7.1 ábra mutatja a hozzáadott DNS mennyiségének hatását a vacciniavírus-DNS pakolására segítő
HU 219 369 Β számyaspoxvírussal CV-1 emlőssejtekben, amelyben a számyaspoxvírus nem teljesen replikálódik. Öt tenyészetet számyaspoxvírussal fertőztünk, és ezt követően a megadott mennyiségű vacciniavírus-DNS-sel transzfektáltuk. Az első oszlop egy olyan tenyészetet mutat, amelyhez nem adtunk sem DNS-t, sem szárny aspoxvírust, az ötödik oszlop egy olyan tenyészetet mutat, amelyhez nem adtunk DNS-t, de számyaspoxvírussal fertőztük.
A 8.1 ábra mutatja gazdaspecifikus mutációkkal rendelkező segítő vírusként alkalmazható vacciniavírus (vdhr) szerkesztését, amely megakadályozza bizonyos humán sejtvonalakban a replikációt. hr-gén=gazdaspecifikus gén, amely a vacciniavírus EcoRI K fragmensében lokalizálódik; az egyéb rövidítések magyarázata az 1.3 ábrával kapcsolatban megadott.
A 9.1 ábrán látható a pS2gpt-P2 és pP2gpl60MN plazmidok szerkesztése. A plazmidokon belüli nyilak mutatják a megfelelő gének transzkripciójának irányát.
A 9.2 ábrán látható a vP2-gpl60MNA és vP2-gpl60MNB vírusok szerkesztésének sematikus vázlata.
A 9.3 ábrán látható a vad típusú vacciniavírus PstI E fragmensének és a gpl60 géneket tartalmazó kiméravírusok PstI fragmenseinek géntérképe. A nyilak jelzik a gpl60 gén transzkripciójának irányát. A számok jelölik a fragmensek méretét kilobázispárban.
A 9.4 ábra mutatja a pselP-gpt-L2 plazmid szerkesztését. Nyilak jelölik a megfelelő gének transzkripciójának irányát.
A 9.5 A) ábra mutatja a pselP-gpl60MN plazmid szerkesztését és a 9.5 B) ábra mutatja a vad típusú gének (szekvenciaazonosítási száma: 73.) és a módosított gpl60 gének (szekvenciaazonosítási száma: 75.) transzlációs startkodonjai környezetének szekvenciáit.
A 9.6 ábra mutatja a vselP-gpl60MNA és vP2-gpl60MNB kiméra-vacciniavírusok szerkesztését sematikus formában. Nyilak jelölik a gpl60 gén transzkripciójának irányát.
A 9.7 ábrán látható a vad típusú vacciniavírus Sáli F fragmensének és a vselP-gpl60MNA és vP2-gpl60MNB kiméra-vacciniavírusok Sáli fragmenseinek képe. Nyilak jelölik a gplóO gén transzkripciójának irányát. A számok a fragmensek méretét jelentik kilobázispárban.
A 10.1 A) ábra része mutatja a pN2-gptaProtS plazmid szerkezetét. A vaccinia P7,5 promoter (P7,5) által szabályozott gpt-génból és egy szintetikus poxvírus promoter (selP) által szabályozott humán S-protein-génből (huProtS) álló kettős génkazettát NotI restrikciós helyek határolják. A 10.1 B) ábra mutatja a vad típusú S-protein-gén (77. azonosítású számú szekvencia), illetve a kimérákban lévő S-protein-gén (79. azonosítású számú szekvencia) transzlációs startkodonja körüli szekvenciákat.
A 10.2 ábrán látható az S-protein-gént hordozó kiméra-vacciniavírusok Southern-blot-analízise. Az ábra A) részén látható a Sacl-gyel emésztett és vad típusú vaccinia SacI ffagmensével hibridizált összes celluláris DNS Southem-blotja. Az ábra B) része ugyanezen anyag képét mutatja Notl-gyel végzett emésztés és humán S-protein-szekvenciákkal való hibridizálás után.
Az ábra C) részén látható sematikus formában a vad típusú SacI I fragmens és a kiméra SacI fragmens az inzert ligálása után.
A 10.3 ábrán látható a plazmából származó S-protein (pdProtS) Westem-blot-analízise (1. és 2. sáv) és a rekombináns S-protein (rProtS) Westem-blotja. SK Hepl sejtek tenyészetének felülúszóiból 10 μΐ-eket vizsgáltunk 4-72 órán át tartó inkubációs periódus után.
A 11.1 ábra mutatja a pN2gpta-FIX plazmid szerkezetét. A vaccinia P7,5 promoter (P7,5) által szabályozott gpt-génből és egy szintetikus poxvirus promoter (selP) által szabályozott humán IX faktor génből álló kettős génkazettát NotI restrikciós helyek határolják.
A 11.2 ábrán látható a humán IX faktort kódoló gént hordozó kiméravírusok Southern-blot-analízise. Az ábra A) része: összes celluláris DNS-SfuI-gyel emésztve és humán IX faktor génpróbával hibridizálva (plazmid pBluescript-FIX). Mind a nyolc izolátum (1-6., 9. és 10.) és az inzertált szakasz is „a” orientációjú; m=marker; VV-WT/WR=vad típusú vaccinia WR-törzs. Az ábra B) része: kiméravírusok várható genomiális szerkezete.
A 11.3 ábra mutatja a plazmából származó IX faktor (pdFIX, 1. és 2. sáv) és a kiméra-vacciniavírussal Vero-sejtekben expresszált rekombináns IX faktor Westem-blot-analízisét. A sejttenyészetek felülúszójából 10 μΐ-eket vizsgáltunk 72 órás inkubáció után. 1-6., 9. és 10. =ízolált plakkok számjele; pd FIX=pIazmából származó IX faktor.
A 12.1 ábra mutatja az f-envIIIB kiméra-számyaspoxvírus szerkesztését egy HIBIIIB env-gén közvetlen molekuláris klónozásával.
A 12.2A ábrán látható az inzertált env-gén orientációit mutató kiméra-számyaspoxvírus izolátumok Sspl fragmenseinek Southern-blot-analízise. 1-12. sáv: f-LFa-1 vírusizolátumok; 13. és 14. sáv: HP1,441 és f-TK2a (negatív kontrollok); 15. sáv: pN2gpt-gpl60 Sspl-gyel való emésztésével kapott termék (10 ng, pozitív kontroll).
A 12.2B ábra mutatja a kiméra-számyaspoxvírusba két lehetséges orientációban inzertált Sspl fragmensek restrikciós térképét. A számok az Sspl fragmensek méretét jelentik kilobázispárban. A nyilak jelentik az inzertált szakaszok orientációját, amely megegyezik a gpl60 transzkripciós egység transzkripciójának frányával.
A 12.3 ábra mutatja a HIV-burok-glikoproteinek expresszióját csirkeembrió-fibroblasztokban Westemblot-analízissel. 1-8. sáv: f-LF2a-h vírusizolátumok;
9. és 15. sáv: gplóO standard (A. Mitterer Immuno AG, Orth/Donau, Ausztria) 10-13. sáv: f-LF2i-l vírusizolátumok; 14. sáv: markerproteinek; 16. és 17. sáv: HP 1.441 és f-TK2a számyaspoxvírus (negatív kontrollok).
A 12.4 ábra mutatja a fertőzött csirkeembrió-fibroblasztokban kiméra-vacciniavírusok által termelt HIV-gp41 kimutatását Western-blottal. 1-8. sáv: f-LF2a-h vírusizolátumok; 9. és 15. sáv: gpl60 standard; 10-13. sáv: f-LF2i-l vírusizolátumok; 14. sáv:
HU 219 369 Β markerproteinek; 16. és 17. sáv: HP1.441 és f-TK2a számyaspoxvírus (negatív kontrollok).
A találmány egy eukarióta citoplazmatikus DNSvírus, például egy poxvírus módosított genomjának teljesen egy éló sejt korlátain kívüli első felépítését képviseli. Ezt a felépítést egy izolált virális genomiális DNS alkalmazásával hajtjuk végre, amelyet egy szekvenciaspecifikus endonukleázzal hasítunk, majd egy idegen DNS-sel újra ligálunk. A kapott módosított DNS-t ezután fertőző poxvírusvirionokba pakoljuk segítő vírusként szolgáló másik poxvírussal fertőzött gazdasejtekbe való transzfektálással.
A találmány eltérő stratégiákat tesz lehetővé vektorok előállítására eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusokból, mint amelyeket korábban más DNS-vírusokra alkalmaztak különféle géntechnológiai problémák megoldására. így például ez a közvetlen klónozási eljárás lehetővé teszi olyan gének közvetlen klónozását citoplazmatikus DNS-vírusokba, például poxvírusokba, amelyek nem klónozhatok bakteriális rendszerekben vagy azért, mert túl nagyok a bakteriális vektorok számára, vagy azért, mert túl toxikusak a baktériumokra nézve, vagy a baktériumokban instabilak. A közvetlen molekuláris klónozás nagyobb pontosságot tesz lehetővé a géntechnológiai úton előállított virális genomok szerkesztése során, és optimális körülmények között növelheti a klónozás sebességét, valamint egyetlen ligálási reakcióban többféle terméket eredményezhet, amelyek eltérő orientációkban több inzertált szakaszt tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik az idegen gén optimális expresszióját biztosító szerkezetek gyors kiszűrését.
A leírásban eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus alatt iridovírusokat és poxvírusokat értünk. Az iridovírus alatt az Iridoviridae család tagjaként osztályozott vírusokat értjük, például az afrikai disznólázvírust, valamint bizonyos kétéltű- és rovarvírusokat. Poxvírus alatt a Poxviridae család tagjaként definiált vírusokat értjük, például a Chordopoxviridae alcsaládba (meleg vérű poxvírusok) és a Entomopoxviridae alcsaládba (rovarpoxvírusok) tartozó vírusokat [lásd például B. Moss: Β. N. Fields, D. M. Knipe és munkatársai, Virology 2080 (Raven Press, 1990)]. A chordopoxvírusok körébe tartoznak többek között az alábbi nemek, amelyek közül közelebbi példákat is tárgyalunk a leírásban, ezeket zárójelekben jelöltük: Orthopoxvírus (vaccinia); Avipoxvírus (számyashimlő); Capripoxvírus (birkahimlő); Leporipoxvírus [nyúl (Shope)-fibróma, myxoma]; és Suipoxvírus (sertéshimlő). Az entomopoxvírusoknak három nemzetségük van: az A, B és C.
A találmány egyik tárgya egy eljárás módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus előállítására egy módosított citoplazmatikus DNS-vírus-genom közvetlen molekuláris klónozásával. Ez az eljárás abból áll, hogy egy módosított citoplazmatikus DNS-vírus-genomot tartalmazó módosított DNS-molekula előállítása céljából egy első citoplazmatikus DNS-vírus-genomot tartalmazó tisztított DNS-molekulát extracelluláris körülmények között módosítunk.
A találmány szerinti módosításra alkalmas tisztított DNS-molekula például úgy állítható elő, hogy vírusrészecskékből genomiális DNS-t izolálunk a genomiális DNS-eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusokból való izolálására alkalmas ismert eljárásokkal, lásd például az 1. példát. A tisztított DNS-molekulák némelyike vagy akár mindegyik előállítható molekuláris klónozással vagy kémiai szintézissel is. Egy virális genomot tartalmazó tisztított DNS-molekula találmány szerinti módosítása abból áll, hogy ennek a genomnak a DNSszekvenciájában örökletes változásokat idézünk elő. Ilyen változások például egy DNS-szekvencia inzertálása ebbe a genomba, egy DNS-szekvencia deléciója ebből a genomból, vagy ebben a genomban lévő DNSszekvencia helyettesítése egy másik DNS-szekvenciával. Az inzertált, törölt vagy helyettesített DNS-szekvencia, amely egyetlen DNS-bázispárból vagy egynél több DNS-bázispárból áll.
A találmány fenti szempontja szerint az első DNSvírus-genomot tartalmazó DNS-molekula módosításának lépése bármely olyan módszerrel végrehajtható, amely alkalmas egy DNS-molekula szekvenciájának extracelluláris módosítására. így például a találmány szerinti DNS-molekula módosítása magában foglalja a tisztított DNS-molekula módosítását egy fizikai mutagénnel, például ultraibolya fénnyel vagy egy kémiai mutagénnel. A tisztított DNS-molekulák extracelluláris mutagenezisének számos módszere jól ismert a génsebészeti módosítások területén.
Másik kiviteli alak szerint a DNS-molekula módosításának lépése DNS-szegmensek összekapcsolásából áll, amellyel egy módosított virális genomot tartalmazó módosított DNS-molekulát alakítunk ki. A fenti megoldás egyik kivitelezési módja szerint a módosított DNSmolekula kialakítására egymással összekapcsolt DNSszegmensek közül néhányat vagy mindegyiket az első vírusgenomot tartalmazó DNS-molekula-nukleázzal, előnyösen egy szekvenciaspecifikus endonukleázzal való hasításával állítjuk elő. A módosított DNS-molekula kialakítására egymással összekapcsolt DNS-szegmensek közül némelyiket vagy mindegyiket kémiai szintézissel is előállíthatjuk jól ismert módszerek alkalmazásával.
Bizonyos kiviteli módok szerint a módosított DNSmolekula előállítására a DNS-szegmensek egymáshoz kapcsolását a fenti DNS-szegmensek extracelluláris ligálásával hajtjuk végre, például egy bakteriális vagy bakteriofág-ligáz alkalmazásával a jól ismert rekombináns DNS-módszerek szerint. Adott esetben ez a DNS módosítási lépés tartalmazza az első vírusgenomot tartalmazó, DNS-molekula hasításával kapott DNS-szegmensek végeinek egy foszfatázzal, például borjúbélfoszfatázzal való kezelését is. Ez az enzim eltávolítja a foszfátmaradékokat, és ezáltal megakadályozza a DNSmolekula hasításával kapott egyik DNS-szegmens újraligálását egy másik ilyen szegmenssel.
A DNS-szegmensek összekapcsolásának másik módszere az, hogy a DNS-szegmensek némelyikét vagy mindegyikét olyan ragadós végek extracelluláris illesztésével kapcsoljuk össze, amelyek megfelelő hosszúságúak ahhoz, hogy a módosított DNS-molekula képes legyen transzferálni egy gazdasejtet, ahol
HU 219 369 Β is az összeillesztett DNS-szegmensek ligálása végbemegy.
A módosított DNS-molekula előállítására az előbbi módszer egy másik kiviteli módja szerint az első virusgenomot tartalmazó DNS-molekula módosítását úgy végezzük, hogy az első vírus genomiális DNS-molekulájának hasításával kapott legalább néhány DNS-szegmenst kapcsoljuk össze egy további DNS-szegmenssel. A fenti módszer egy előnyös megvalósítása szerint a genomiális virális DNS-molekula hasítását egy szekvenciaspecifikus endonukleázzal végezzük az első vírusgenomban lévő egyetlen hasítási helyen, ezáltal a genomiális vírus-DNS-nek két DNS-kaqát állítjuk elő. A két kart azután egy érdekes szekvenciát tartalmazó idegen DNS-sel Egáljuk össze.
A leírásban érdekes DNS-szekvencia alatt a vírus DNS-karokkal ligáit olyan idegen DNS-szegmens szekvenciáját értjük egyik esetben, amely egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomjában természetes körülmények között nem fordul elő. Az érdekes DNSszekvencia másrészről olyan szekvenciát tartalmazhat, amely egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomjában természetes körülmények között előfordul, de olyat is, amely természetes körülmények között nem fordul elő egy ilyen genomban. Ezenkívül az érdekes szekvencia tartalmazhat csak olyan szekvenciákat, amelyek eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusban természetes körülmények között előfordulnak, de ez a szekvencia ennek a citoplazmatikus DNS-vírusnak a genomjába olyan helyzetben van inzertálva, amely különbözik a szekvencia természetes helyzetétől. Ezenkívül a természetben előforduló érdekes virális szekvencia inzertálása egyik DNS-vírusból egy másikba, vagy egy bizonyos virális genom egyik részéből ennek a genomnak egy másik részébe, szükségszerűen egy olyan szekvenciát eredményez, amely a találmány értelmében egy citoplazmatikus DNS-vírus genomjában természetes körülmények között nem fordul elő a virális genom és az inzertált érdekes virális szekvencia csatlakozásánál.
A genomiális vírus-DNS két karjához Egált idegen DNS-szegmens olyan végeket tartalmaz, amelyek a virális DNS karjainak végeivel a Egálás szempontjából összeférhetők. Az összeférhető végek komplementer ragadós végek vagy tompa végek lehetnek. A fenti módszer Egálási lépésének eredményeként olyan módosított DNS-molekulát kapunk, amely az első vírusgenomot tartalmazza, amelybe az egyetlen hasítási helyen az idegen DNS DNS-szekvenciája van inzertálva.
Az eljárásnak ezt a megvalósítási módját - amelyben egy DNS-szekvenciát inzertálunk az első vírus genomjába - a leírásban többek között azzal az eljárással szemléltetjük, amelyben egy vacciniavírus-genomba illesztünk egy génexpressziós kazettát az NotI vagy Smal bakteriális restrikciós endonukleázok egyetlen hasítási helyén, amint azt az 1., illetve a 3. példában leírtuk. Ezt az eljárást szemlélteti ezenkívül a 2. példa is, amelyben egy génkazettát inzertálunk egy rekombináns számyaspoxvírus-vektor genomjába, a rekombináns számyaspoxvírus-genomban lévő bakteriális gén szekvenciájában lévő egyetlen NotI helyre.
Egy idegen DNS inzertálása egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus-genom egyetlen hasítási helyére a találmány értelmében egy kívánt protein, főleg egy humán protein expresszálásának céljára használható. így például az 5. példában ismertetjük a plazminogént, protrombint és a humán immunhiányvírus glikoprotein 16O-at (HIV-gp 160) kódoló gének inzertálását egy vacciniavírus-vektor egyetlen hasítási helyére és a kapott módosított vacciniavírusok alkalmazását a fenti proteinek termelésére. Az idegen proteineket előállíthatjuk sejttenyészetekben, és így tisztított proteineket kapunk, vagy közvetlenül egy humán vagy állati gazdaszervezetben abból a célból, hogy a gazdát egy találmány szerinti módosított vírust tartalmazó vaccinával immunizáljuk.
Bizonyos megvalósítási módokban a virális genomDNS-szekvencia inzertálása általi módosítása egy markergénfunkció bevezetéséből vagy eltávolításából áll a módosított vírusgenom első virusgenomtól való megkülönböztetésére. A fenti megvalósítási mód egyik változata szerint az első vírusgenomba inzertált DNS-szekvencia egy szelektív markergént tartalmaz, és az első gazdasejtben termelődött fertőző módosított poxvírus-virionok visszanyerése abból áll, hogy a fenti fertőző virionokkal egy második gazdasejtet fertőzünk a szelektív markergént expresszáló poxvírusgenomokra való szelektálás körülményei között. A találmány szerinti fenti megoldás egyik előnyös kivitelezése szerint a szelektív markergén expressziója a második gazdasejtben a második gazdasejtnek egy citotoxikus hatóanyaggal szembeni rezisztenciát kölcsönöz. Ez a hatóanyag a második gazdasejt fertőzése során olyan mennyiségben van jelen, amely elegendő a szelektív markergént expresszáló poxvírusgenom szelektálására. Ebben az esetben a hatóanyag által szelektáljuk az inzertált szelektív markergént tartalmazó módosított vírusgenomokat, és kizárjuk azokat a genomokat, amelyekben ez a markergén nincs jelen.
A módosított virális genom első virális genomtól való megkülönböztetésére egy szelektív markergén inzertálása egy DNS-szekvenciába különösen hasznos abban az esetben, ha az első vírus genomiális DNSmolekuláját az egyetlen hasítási helyen hasítottuk, és ezért az így kapott virális DNS-karok hajlamosak a kívánt DNS-szekvencia inszerciója nélkül is újraligálódni. Ez a megoldás azzal az eljárással van példaszerűen bemutatva, amikor az Escherichia coli xantin-guaninfoszforibozil-transzferáz enzimet kódoló (továbbiakban gpt) gént inzertáljuk például egy vacciniavírusgenomba vagy egy számyaspoxvírus-genomba az egyetlen NotI helyen, amint azt az 1. és 2. példában ismertetjük.
Azt a módszert, amikor a módosított virális genom első genomtól való megkülönböztetésére eltávolítunk egy markergénfunkciót, a 2. példával szemléltetjük. Ebben a példában egy galaktozidázt kódoló E. coli lacZgénben lévő NotI helyre illesztünk be egy idegen DNSszekvenciát a számyaspoxvírus-genomba. Amint azt a 2. példában leírjuk, egy DNS-szekvencia inzertálása erre a helyre megbontja a lacZ-gén kódolószekvenciá11
HU 219 369 Β ját, és ezáltal megakadályozza a β-galaktozidáz termelődését. Az előbbi enzim expressziója ennek következtében egy kék plakk-fenotípust eredményez a lacZ-gént hordozó vírusokban. Ennek megfelelően az a módosított virális genom, amely erre a helyre inszertálva egy DNS-szekvenciát hordoz, fehér plakk-fenotípust eredményez, amely megkülönbözteti a módosított vírust az első vírustól. A találmány szerinti eljárás egy másik kiviteli módja szerint egy működőképes E. coli lacZ-gént egy másik érdekes génnel együtt viszünk be a vektorba azért, hogy ez a kívánt inszertált szakaszt tartalmazó módosított vírusok markereként szolgáljon.
A találmány szerinti eljárás egy további kiviteli módja szerint a DNS-molekula módosításának lépése egy szekvenciaspecifikus endonukleáz számára egy új hasítási hely bevezetését jelenti az első vírusgenomba. Ennek a megvalósítási módnak egyik példája az, amikor egy első poxvírusgenomban lévő egyetlen hasítási helyre egy szintetikus DNS-linkert tartalmazó idegen DNS-t inzertálunk, amint azt a 6. példában ismertetjük. Ez a linker egy többszörös klónozóhelyet tartalmaz, amelyben számos, egymással szorosan szomszédos hasítási hely van, amelyek alkalmasak idegen DNS inzertálására a módosított poxvírusgenomba. A többszörös klónozóhelyen lévő hasítási helyek előnyösen nincsenek jelen az első virális genomban, és ezért a módosított virális genomban ezek egyetlen ilyen helyek.
Közelebbről egy első virális genomot tartalmazó DNS-molekula módosításának lépése magában foglalja egy DNS-szekvencia inzertálását is egy szekvenciaspecifikus endonukleáz valamely első és valamely második hasítási helye közé. Az egyik ilyen megvalósítási mód szerint az első virális genom egy többszörös klónozóhelyet tartalmaz, amelyben olyan hasítási helyek vannak, amelyek egyedülállóak az első virális genomban. A fenti eljárás szerint egy első virális genomot tartalmazó DNS-molekula hasítása a többszörös klónozóhelyben lévő két ilyen egyedülálló helyen két ragadós végű virális DNS-kart eredményez, amelyek nem kompatibilisek az egymással való ligálódás szempontjából. A többszörös klónozóhelyben lévő két egyetlen hasítási hely közötti DNS-szegmenst a hasított virális DNS-karoktól például a fenti karok etanolos kicsapásával választjuk el, amint azt az 5. példában egy humán protrombingén módosított poxvírusvektorba való inzertálására ismertettük.
Egy DNS-szegmens két egyetlen hasítási hely közötti inzertálása egy virális genomba a vektor karjaival való ligálásra kompatibilis ragadós végeket tartalmazó DNS-inzertek kényszerített klónozására alkalmazható. Más szavakkal ez a módszer - amely szerint a virális DNS-t két helyen hasítjuk - alkalmas a virális DNS-karok ligálásából származó virális genomok hozamának növelésére ahhoz képest, amikor a karokat a virális DNS egyetlen helyen való hasításával állítjuk elő, mivel az utóbbi módszerrel előállított karok nem tartalmaznak a ligálás szempontjából kompatibilis végeket. Ez a kényszerített klónozási módszer a módosított virális genomba inzertált DNS orientációját is irányítja, mivel csak az egyik vírus-DNS-kar kompatibilis a ligálás szempontjából az inzertált DNS mindkét végével.
A találmány szerinti kényszerített klónozási módszert például az 5. példában szemléltetjük, amikor egy humán protrombingént tartalmazó génexpressziós kazettát illesztünk egy vacciniavírus-vektor többszörös klónozási helyére.
Egy előnyös kiviteli alak szerint az első virális genomban a két egyedi hasítási hely közötti közbenső DNS-szegmens nem esszenciális az első virális genom replikációja szempontjából, ezért a fenti szekvencia törlése vagy másik DNS-szegmenssel való helyettesítése nem akadályozza meg a kapott módosított genom replikációját. A közbenső DNS-szegmenst olyan DNSszegmenssel is helyettesíthetjük, amely a közbenső szekvencia virális replikáció szempontjából esszenciális részét tartalmazza egy olyan további DNS-szekvenciához kapcsolva, amelyet az első vírusgenomba akarunk inzertálni.
A találmány szerinti eljárás másik megvalósítási módja szerint az első vírusgenom módosítása egy szekvenciaspecifikus endonukleáz nemkívánatos hasítási helyének eltávolításából áll. A fenti típusú módosításokat kívánt esetben többször is elvégezhetjük például azért, hogy ugyanazon nukleáz számára a redundáns hasítási helyeket töröljük, ezáltal egy adott nukleáz számára egyetlen hasítási helyet tartalmazó módosított vírusgenomot állítsunk elő végső soron.
Azok a módszerek, amelyek különösen alkalmasak egy hasítási hely eltávolítására egy vírusgenomból, a szakemberek számára jól ismertek. Idetartoznak a különféle általános, helyspecifikus mutagenezis-módszerek. Egy endonukleáz hasítási hely vírusgenomból való eltávolításának egyik közelebbi módszere a genomiális vírus-DNS extracelluláris kezeséből áll, amellyel szelektáljuk azokat a mutáns genomiális DNS-molekulákat, amelyek rezisztensek a kérdéses endonukleáz általi hasítással szemben.
Egy hasítási hely vírusgenomból való eltávolításának másik módszere az, hogy egy hasított virális DNSmolekulát egy DNS-szegmenssel, például egy szintetikus DNS-szegmenssel ligálunk, amely egy, a hasított virális DNS-sel való ligálásra alkalmas véget tartalmaz, de hiányzik belőle azon nukleázfelismerő szekvenciájának egy része, amely a virális DNS-t hasította. Ebben az eljárásban a virális DNS-t hasító szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helye egy olyan nukleázfelismerő szekvenciát foglal magában, amely túlnyúlik a ragadós végeket tartalmazó szekvenciákon a ragadós végekkel közvetlenül szomszédos szekvenciákba. A szintetikus inzert ragadós végeket tartalmaz, amelyek kompatibilisek az egyetlen helyen hasított virális DNS-karokkal való ligálással. Azonban a szintetikus inzert egyik ragadós végével közvetlenül szomszédos szekvencia eltér attól a felismerőszekvenciától, amely azon enzim általi hasításhoz szükséges, amely a virális DNS-t hasította. Ezért a szintetikus DNS ezen végének ligálása egy víruskarral nem képez funkcionális hasítási helyet azon nukleáz számára, amely a virális DNS-t hasította. Egy hasítási hely virális genomból való eltá12
HU 219 369 Β volításának ezen módszerét a 4. példában ismertetjük, amikor is egy többszörös klónozóhelyet tartalmazó szintetikus DNS-szegmenst inzertálunk egy virális genom egyetlen hasítási helyére.
A virális genom módosítás következtében való inaktiválódásának megakadályozására nyilvánvaló, hogy egy virális genom találmány szerinti módosítását a virális genom azon régiójában kell végrehajtani, amely a vírus sejtkultúrában való szaporodásához nem esszenciális a kapott módosított vírus szaporítására alkalmazott körülmények között. A DNS-vírusok sejttenyészetben való szaporodásához nem esszenciális, egyébként találmány szerinti módosításra alkalmas szekvenciákat tartalmazó genomiális régiói többek között a gének közötti szekvenciák (azaz intergénrégiók) lehetnek, valamint azon génszekvenciák, amelyek a módosított virális genom szaporodásához nem szükségesek.
Egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus kiválasztott genomjának találmány szerinti módosítására alkalmas nem esszenciális helyet például úgy azonosíthatunk, hogy végrehajtjuk a kívánt módosítást, és meghatározzuk, hogy ez a módosítás zavarja-e a genom replikációját a kívánt fertőzési körülmények között. Még közelebbről egy virális genomban lévő restrikciós enzimhasítási helyeket - beleértve az egyedi ilyen helyeket is ebben a genomban - úgy azonosítjuk, hogy a genomiális DNS-t emésztjük, és a kapott fragmenseket analizáljuk a szakemberek számára jól ismert módszerek alkalmazásával. Egy rövid szintetikus DNS-szakasz találmány szerinti közvetlen klónozási módszerrel való kísérleti inzertálásával egy választott hasítási célhelyre a genomot szétroncsolhatjuk. A választott célhelyen kísérleti inzertet tartalmazó vírus visszanyerése közvetlen bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a célhely a genom egy nem esszenciális régiójában van. Ha nincs alkalmas hasítási hely egy adott genomiális célterületen, egy ilyen helyet ki lehet alakítani vagy közvetlen molekuláris klónozás, vagy hagyományos, marker rescuetechnikákon alapuló génszerkesztési eljárások alkalmazásával. Ebben az esetben a célterületen inzertált hasítási helyet tartalmazó vírus sikeres visszanyerése közvetlenül jelzi, hogy a célterület egy nem esszenciális régióban van, amely a találmány szerinti módosításra alkalmas.
A találmány szerinti eljárás kivitelezésére alkalmas nem esszenciális genomiális régiókat poxvírusok esetében például Goebel és munkatársai ismertették [Virology 179, 247-266 (1990), 1. táblázat], így ezeket a fenti irodalmi helyre való hivatkozással ismertetjük.
A találmány szerinti eljárás további kiviteli módja szerint az első virális genomba inzertált DNS-szekvenciának legalább egy része egy promoter transzkripciós szabályozása alatt áll. Bizonyos kiviteli módokban ez a promoter abban a DNS-szekvenciában lokalizálódik, amelyet az első virális genomba inzertáltunk, és ezért az inzertált DNS-szekvencia azon részének transzkripcióját szabályozza, amely a promoter után (5’->3’-irányban) helyezkedik el. Ezt a megoldást egy olyan génkazetta poxvírusgenomba való inzertálásával szemléltetjük, amely génkazetta egy nyílt leolvasási kerethez funkcionálisan kapcsolt promotert tartalmaz, amint azt az 1-5. példákban ismertetjük.
Egy másik előnyös kiviteli mód szerint az első virális genomba inzertált DNS-szekvencia transzkripcióját szabályozó promoter a módosított virális genomban az inzertált DNS-szekvencia előtt (3’ -> 5’-irányban) helyezkedik el. Ezt a megoldást a humán von Willebrandfaktor proteint kódoló cDNS többszörös klónozóhelybe való inzertálásával szemléltetjük, amely egy 3’ -> 5’irányban lévő promoterhez van funkcionálisan kapcsolva egy vacciniavírus-vektorban, amint azt a 6. példában ismertetjük.
Egy bizonyos kiviteli mód szerint az inzertált DNSszekvenciát szabályozó promotert egy, a módosított virális genom által kódolt RNS-polimeráz felismeri. Ezt a promotert más esetben egy másik genom, például egy másik vírus vagy celluláris genom által kódolt RNS-polimeráz ismeri csak fel. Ez az RNS-polimeráz például egy T7 bakteriofág-polimeráz lehet, amelyet egy másik citoplazmatikus DNS-vírus-genom vagy egy módosított gazdasejt genomja kódol. A T7 polimerázt és promotert például rekombináns poxvírusokban alkalmazták egy inzertált DNS-szekvencia expressziójának fokozására [például Fuerst, T. R. és munkatársai, J. Mól. Bioi. 205, 333-348 (1989)]. A T7 RNS-polimeráznak külön genomban való biztosítása alkalmas arra, hogy megakadályozzuk a módosított poxvírusgenomba inzertált DNS-szekvencia expresszióját azon esetektől eltekintve, amikor ez a külön genom jelen van.
Egy további kiviteli mód szerint az inzertet szabályozó promoter alkalmas a transzkripció valamely citoplazmatikus DNS-vírus RNS-polimeráz általi iniciálására. Bizonyos esetekben a promoter egy természetben előforduló virális promoter DNS-szekvenciájának egy módosított változatát tartalmazza. Egy ilyen kiviteli módot szemléltetünk egy „szintetikus” vacciniavírus promoter, például az 5. és 6. példában ismertetett S3A és S4 promoter alkalmazásával.
Az eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomiális szerkesztésének találmány szerinti módszere magában foglalja továbbá a módosított virális genomot tartalmazó módosított DNS-molekula bevezetését egy első gazdasejtbe, amely a módosított DNS-molekulát fertőző, módosított citoplazmatikus DNS-virus-virionokba csomagolja. A módosított DNS-molekulát az első gazdasejtbe az első gazdasejt DNS-molekulával való transzfekciójára alkalmas módszerekkel vezetjük be, például olyan módszerekkel, amelyek a szakirodalomból más DNS-ek hasonló gazdasejtekbe való transzfektálására ismertek. így például egy előnyös kiviteli mód szerint a módosított DNS-t az első gazdasejtbe a Graham és van dér Eb szerinti kalcium-foszfátos kicsapásos módszerrel visszük be [Virology 52, 456-467 (1973)].
Egy előnyös kiviteli mód szerint a módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus előállítására szolgáló eljárás magában foglalja továbbá az első gazdasejt fertőzését egy második citoplazmatikus DNS-vírussal, amely egy olyan második citoplazmatikus DNS-vírusgenomot tartalmaz, amely úgy expresszálódik, hogy a
HU 219 369 Β módosított DNS-molekulát fertőző, módosított citoplazmatikus DNS-vírus-virionokba pakolja. Az első gazdasejt második vírussal való fertőzésére szolgáló eljárásban a rekombináns DNS-molekula bevezetését az első gazdasejtbe előnyösen mintegy 1 órával az első gazdasejt második vírussal való fertőzése után hajtjuk végre.
Az előbbi módszer egy másik kiviteli módja szerint a szükséges pakolófunkciókat az első gazdasejtben egy, a második vírus teljes genomjától eltérő genetikus elem szolgáltatja, például egy plazmid vagy egy másik expressziós vektor, amely alkalmas az első gazdasejt transzformálására és a kívánt helpervírus-fiinkciók expresszálására. A helperfunkciók biztosítására egy nem virális genetikus elem alkalmazása lehetővé teszi genetikusán stabil helpersejtek előállítását, amelyek nem termelnek fertőző helpervírusokat. A módosított DNS-molekula pakolására első gazdasejtként ilyen helpersejtek alkalmazása előnyösen csak ezt a módosított DNS-t tartalmazó virionokat termel.
Az első gazdasejt második vírussal való fertőzését magában foglaló eljárásban a második vírust úgy választjuk meg, hogy a második virális genom expressziója az első gazdasejtben a módosított virális genomot tartalmazó fertőző virionokba pakolja a módosított DNS-molekulát. A találmány értelmében lehetségessé válik egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus-genomot tartalmazó módosított DNS intracelluláris pakolása egy rokon vírussal fertőzött sejtekbe való transzfektálással. így például egy első poxvírusfajból származó DNS-t egy ugyanazon vagy más fajból származó, de ugyanazon poxvírus alcsaládba tartozó második poxvírussal fertőzött gazdasejt pakolja be.
Bizonyos kiviteli módok szerint a második virális genom expressziója az első gazdasejtben a második virális genomot, valamint a módosított virális genomot tartalmazó fertőző virionokat termel. Ez a helyzet például egy bizonyos fajba tartozó első poxvírus-DNS-ek egy ugyanazon fajba tartozó második poxvírussal való homológ pakolása esetében. Noha a transzfektált DNS elméletileg közvetlenül, azaz a transzfektált genom transzkripciója nélkül is pakolható, a transzfektált DNSmolekula homológ pakolásával jár valószínűleg mind a transzfektált DNS, mind a helpervírus DNS-ének replikációja és transzkripciója. Ezt a helyzetet szemléltetjük többek között az 1. és 2. példában a poxvírus-DNS homológ pakolásával.
Más kiviteli alakokban azonban a második virális genom expressziója az első gazdasejtben nem eredményez második virális genomot tartalmazó fertőző virionokat. Heterológ pakolással járó esetekben például a passzív pakolás egyedül nem tud életképes vírusrészecskéket produkálni a transzfektált DNS-ből. Ilyen esetekben előnyösen egy második (helper-) vírust választunk, amely olyan RNS-polimerázt szolgáltat, amely templátként felismeri a transzfektált DNS-t, és ezáltal a transzkripció iniciálására és végső soron a transzfektált DNS replikálására szolgál. Ezt az esetet egy ortopoxvírus- (vaccinia-) vektor módosított genomjának avipoxvírus (baromfipoxvírus) mint helpervírus általi reaktiválásával példázzuk emlős-, első gazdasejtben, amelyben a madárpoxvírus nem képes avipoxvírus-genomot tartalmazó fertőző virionokat termelni (lásd a 3. példát).
Egy heterológ vírus alkalmazása módosított DNSmolekula pakolására - például szárnyas- vagy egérpoxvírus alkalmazása helpervírusként vacciniavírus szerkezetekben - előnyösen minimalizálja a rekombinációs eseményeket a helpervírusgenom és a transzfektált genom között, amelyek egyébként akkor mennek végbe, amikor hasonló vírusok homológ szekvenciái vannak jelen egy sejtben [lásd Fenner és Combén (1958); és Fenner (1959)].
A DNS pakolása céljából helpervírus alkalmazására kidolgozott eljárás bizonyos megvalósítási módjaiban a módosított virális genomot tartalmazó fertőző virionok visszanyerésének lépése abból áll, hogy egy második gazdasejtet az első gazdasejtben termelődött fertőző virionokkal fertőzünk. Előnyösen a második gazdasejtet olyan körülmények között fertőzzük, hogy a második virális genom expressziója a második gazdasejtben nem eredményez második vírusgenomot tartalmazó fertőző virionokat. Más szavakkal a második gazdasejtet olyan körülmények között fertőzzük, amely alkalmas a módosított vírus replikációjának szelektálására a helpervíruséval szemben. Az eljárást azzal az eljárással szemléltetjük, amelyben a módosított genom egy módosított vacciniavírus-genom, és a második genom egy számyaspoxvírus-genom, és a második gazdasejt egy emlőssejt. Ebben az eljárásban a módosított vírust az emlősgazdasejt-tenyészetben plakktisztítjuk, amelyben a számyaspoxvírus nem képez fertőző virionokat (lásd a 3. példát).
Egy másik megvalósítási mód szerint, amelyben a második gazdasejtet olyan körülmények között fertőzzük, amely módosított vírusra szelektál, a módosított vírusgenom egy olyan funkcionális gazdaspecifikus gént tartalmaz, amely a második gazdasejtben fertőző virionok termeléséhez szükséges. A második virális genomból hiányzik ez a funkcionális gazdaspecifikus gén. Ezt a megvalósítási módot azzal az eljárással szemléltetjük, amelyben a módosított virális genom egy módosított vacciniavírus-genom, amely a második gazdasejtként alkalmazott humán (MRC 5) sejtekben fertőző vacciniavírus termeléséhez szükséges funkcionális gazdaspecifikus gént tartalmaz (lásd a 8. példát).
Egy másik megvalósítási mód szerint - amely egy második gazdasejtben módosított vírusra való szelektálással jár - a módosított virális genom egy szelektív markergént tartalmaz, amely a második virális genomból hiányzik, és a második gazdasejt fertőzésének lépését olyan körülmények között végezzük, amely a szelektív markergént expresszáló vírusgenomra szelektál. így például a szelektív markergén expressziója a második gazdasejtben a sejteknek rezisztenciát biztosíthat egy citotoxikus hatóanyaggal szemben. A hatóanyag a második gazdasejt fertőzése során olyan koncentrációban van jelen, amely elegendő a szelektív markergént expresszáló virális genomra való szelektáláshoz. Ezt a megoldást azzal az eljárással szemléltetjük, amelynek során az E. coli gpt-gént inzertáljuk egy vacciniavírus-ge14
HU 219 369 Β nomba (lásd például az 1. példát), vagy egy számyaspoxvírus-genomba (lásd például a 2. példát), mindkét esetben szelektív markergént nem tartalmazó homológ helpervírus alkalmazásával.
Egy másik kiviteli mód szerint a módosított vírus szelekciójára egy második gazdasejtben, a módosított vírusgenom a második virális genomban jelen lévő szelektív markergén delécióját tartalmazza. Ebben az esetben a második gazdasejt fertőzését olyan körülmények között végezzük, amely a szelektív markergént expresszáló vírus genommal szemben szelektál. így például egy poxvírus timidin-kináz (tk)-gén expressziója a második gazdasejtben (azaz egy timidin-kináz negatív gazdasejtben) a második (helper-) vírust érzékennyé teszi a metabolikus inhibitor 5-bróm-dezoxi-uridinnal szemben. A 4. példában leírjuk ezeknek az inhibitoroknak az alkalmazását a második gazdasejt fertőzése során olyan vacciniavírus-vektorokra (vdTK) való szelektálásra, amelyekből a tk-gén törölve van, és egy többszörös klónozóhellyel van helyettesítve.
A találmány ezenkívül vonatkozik egy módosított virális genomot tartalmazó eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusra is. A találmány szerinti citoplazmatikus DNS-vírus módosított genomja elhatárolható DNSszekvenciákat tartalmaz, amelyek például szokásos nukleinsavhibridizációval vagy DNS-szekvenáló módszerekkel különböztethetők meg egymástól.
Bizonyos kiviteli alakok szerint például a módosított virális genom egy első eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus első genomját tartalmazza. Ez az első genom egy szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmaz, amely az egyetlen ilyen hely ebben az első genomban. Ebben a kiviteli alakban a módosított genom szekvenciái, amelyek az első virális genomot tartalmazzák, homológok egy természetben előforduló eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomjával. Ezenkívül az első vírus szekvenciájába egy fent megadott érdekes DNS-szekvencia van beépítve.
Annak meghatározására, hogy ez a szekvencia az első virális genomban lévő egyetlen hasítási helyre van-e inzertálva, amint az ezen módosított virális genom kiviteli alakjánál szükséges, összehasonlítjuk az inzertet közvetlenül határoló szekvenciákat a szekvenciaspecifikus endonukleázok hasítási helyeinek szekvenciáival.
A fenti kiviteli alak egyik változata szerint - amelyben a DNS-szekvenciát egyetlen hasítási helyen inzertáljuk az első virális genomba - az első virális genomba inzertált szekvenciát két azonos, érintetlen szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási hely határolja, és a teljes módosított genomban e nukleáz számára csak ez a két hasítási hely áll rendelkezésre. Mindkét fenti hasítási hely az első virális genomból származó hasított helyen és az inzertált DNS-szekvencia kombinált részeiből áll.
Közelebbről a valamely szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmazó kettős szálú DNS mindkét szála úgy tekinthető, hogy egy teljes hasításihely-szekvenciát (SLSR) foglal magában, amely egy bal oldali hasításihely-szekvenciából (SL) és egy jobb oldali hasításihely-szekvenciából (SR) tevődik össze, amelyeket egy monofoszfátkötés választ el egymástól, és ezt hasítja szét a megfelelő nukleáz a hasításkor. A fenti kiviteli alak bizonyos megvalósítási formáiban egy DNS-szekvencia inzertálása az egyetlen restrikciós helyre az inzertet határoló két teljes hasítási helyet hoz létre.
A fenti kiviteli alak bizonyos megvalósítási formáiban azonban a DNS-szekvencia inzertálása az egyetlen hasítási helyre nem az eredeti hasítási helyet hozza létre az inzertált DNS-szekvencia mindkét végén (lásd például a 6. példában az egy hasítási hely eliminálásának módszerét). így az inzertált DNS-t az egyik végén (például a bal oldali végén) egy teljes hasítási hely (SLSR) határolhatja, míg a jobb oldali végén egy olyan szekvenciában végződik, amely eltér az első virális genomban lévő SR szekvenciához közvetlenül kapcsolódó SL szekvenciától. Még általánosabban, egy találmány szerinti módosított virális genomban az első virális genom egyetlen helyére inzertált DNS-szekvenciát egy hasítási hely két összeillő része (SL és SR) határolja, amely az inzertált DNS-en kívül nem fordul elő a módosított virális genomban.
Egy másik kiviteli alak szerint a módosított virális genom egy DNS-szekvenciát tartalmaz, amely két egyetlen hasítási hely közé van inzertálva az első virális genomban. Ebben az esetben ha az első virális genom egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusban természetesen előforduló genom, az inzertet olyan virális szekvenciák fogják tartalmazni, amelyeket az idegen DNS-szekvenciától legalább a két különböző eredeti hasítási hely felismerhető SL és SR részei választják el.
Egy további kiviteli alak szerint a módosított virális genom egy egyetlen hasítási helyet tartalmaz egy olyan DNS-szekvenciában lokalizálva, amely egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomjában a természetben nem fordul elő. Ebben az esetben ezt az idegen DNS-t nem választják el a természetes virális szekvenciától a hasítási helyek felismerhető SL és SR részei. A fenti kiviteli alak bizonyos formáiban az első idegen DNS-szekvenciát egy második idegen DNS-szekvencia szakítja meg az első szekvenciában egy egyetlen hasítási helyre inzertálva, vagy az első szekvenciában két ilyen hely közé inzertálva. Ezekben a kiviteli alakokban a második idegen DNS-t az első idegen DNS-szekvenciáktól szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyek felismerhető SL és SR részei választják el. Ebben az esetben ezt a második idegen DNS-szekvenciát körülvevő minden szekvencia tartalmazza a találmány szerint az első vírus genomját.
A találmány szerinti módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusok előnyös kiviteli alakjai magukban foglalnak egy első fő kiviteli alakot, amiben a módosított virális genom tartalmazza (i) egy első eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus első genomját, amely egy szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmaz. Ez a hely az egyetlen ilyen hely ebben az első virális genomban. A fenti módosított virális genom tartalmaz ezenkívül (ii) egy első érdekes DNS-szekvenciát is. Ez a DNS-szekvencia az első citoplazmatikus
HU 219 369 Β
DNS-vírus-genom egyetlen hasítási helyére van inzertálva.
A módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus első kiviteli alakjának egyik variációjában az egyetlen hasítási helyet tartalmazó első virális genom egy természetben előforduló virális genom. Ezt a változatot egy olyan módosított poxvírusgenommal szemléltetjük, amely egy természetben előforduló vacciniavírus-genomot tartalmaz, amelyben az Notl és Smal bakteriális restrikciós endonukleázok számára van egyetlen hasítási hely (lásd az 1. és a 3. példát). Ebben a kiviteli alakban az első DNS-szekvencia, amely az egyetlen hasítási helyre van inzertálva, egy természetben előforduló vacciniavírus promoter által szabályozott E. coli gptgén, amely egy vacciniavírus-genom Notl helyére (1. példa) vagy Smal helyére (3. példa) van inzertálva.
A módosított vírus első kiviteli alakjának egy másik változatban az egyetlen hasítási helyet tartalmazó első virális genom egy olyan második DNS-szekvenciát is magában foglal, amely virális genomban a természetben nem fordul elő. Ezenkívül ez a második DNS-szekvencia tartalmazza az első DNS-szekvencia inzertálására az egyetlen hasítási helyet. Ezt a változatot egy olyan módosított számyaspoxvírus-genommal példázzuk, amely egy Escherichia coli β-galaktozidáz-gént kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz (2. példa). Ez a bakteriális gén a bakteriális restrikciós Notl endonukleáz hasítási helyét foglalja magában, amely az egyetlen ilyen hely a módosított számyaspoxvírus-genomban, és ezért különösen alkalmas idegen DNS-szekvenciák inzertálására.
A találmány szerinti módosított vírus első kiviteli alakjának másik változata szerint az egyetlen hasítási helyre inzertált első DNS-szekvenciának legalább egy része egy promoter transzkripciós szabályozása alatt áll. Bizonyos esetekben a promoter az első virális genomba inzertált első DNS-szekvenciában lokalizálódik. Ez az eset például, ha az inzertált DNS egy promotert és egy funkcionálisan kötött gént tartalmazó génkazettát foglal magában, lásd például többek között az 1. és a 2. példát.
A találmány szerinti módosított citoplazmatikus DNS-vírus második kiviteli alakja szerint a módosított virális genom tartalmaz (i) egy első és egy második hasítási helyet szekvenciaspecifikus endonukleázok számára egy első virális genomban, ahol a fenti helyek mindegyike az egyetlen ilyen ebben az első vírusgenomban. A fenti kiviteli alak egyik előnyös variációja szerint az első virális genom egy több egyedi hasítási helyet tartalmazó többszörös klónozóhelyet foglal magában.
A fenti második kiviteli alakban a módosított virális genom tartalmaz még (ii) egy első DNS-szekvenciát is, amely eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusban a természetben nem fordul elő, és ez az első DNS-szekvencia az első és második egyetlen hasítási hely közé van inzertálva az első virális genomban.
A találmány szerinti módosított citoplazmatikus DNS-vírusok harmadik kiviteli alakja egy olyan módosított virális genom, amely tartalmaz (i) egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusok genomjában természetes körülmények között nem előforduló első DNS-szekvenciát tartalmazó első virális genomot. Ez az első DNSszekvencia egy szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmaz, amely az egyetlen ilyen hely a módosított virális genomban. A fenti kiviteli alakban a módosított virális genom tartalmaz továbbá (ii) egy promotert, amely úgy helyezkedik el, hogy az egyetlen hasítási helyre inzertált DNS-szekvencia a promoter transzkripciós szabályozása alatt áll. Ez az első DNSszekvencia nem tartalmaz transzlációs startkodont a promoter és a DNS-szekvencia inzertálására alkalmazott egyetlen hely között. Ezt a kiviteli alakot a 6. példában ismertetett vS4 vacciniavírus-vektorral szemléltetjük, amely egy szintetikus poxvírus promotert tartalmaz úgy lokalizálva, hogy ez a promoter szabályozza a nyílt leolvasási keretek inzertálására tervezett többszörös klónozóhelyre inzertált DNS-szekvencia transzkripcióját.
A találmány vonatkozik továbbá olyan DNS-molekulára is, amely egy találmány szerinti módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus módosított genomját tartalmazza. Egy előnyös kiviteli alak szerint ezt a DNS-molekulát genomiális DNS-molekulák extrahálásával állítjuk elő a találmány szerinti módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus virionjaiból vagy a találmány szerinti módosított vírussal fertőzött sejtekből; A módosított virális genomiális DNS-ek virionokból való extrahálására alkalmas módszerek a szakirodalomból ismertek. Ezenkívül az eukarióta citoplazmatikus DNS-vírusok DNS-einek előállítására alkalmas módszereket az 1. példában is ismertetünk.
A találmány vonatkozik továbbá a találmány szerinti eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomiális DNS-kaijaira is. Ezek a genomiális DNS-karok idegen DNS-eket tartalmazó virális genomok közvetlen molekuláris klónozására alkalmasak. Közelebbről az előző vonatkozásban a találmány két DNS-molekulára vonatkozik, egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus módosított virális genomjának bal és jobb genomiális katjára. A találmány szerinti közvetlen klónozási módszer gyakorlati megvalósításában a fenti karok egyike vagy mindkettő teljes egészében olyan DNS-szekvenciából állhat, amely citoplazmatikus DNS-vírusban természetes körülmények között előfordul. A találmány szerinti fenti megoldás értelmében az új DNS-molekula azonban egy virális genomnak egy módosított kaqa, más szavakkal egy DNS-molekula, amely egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus módosított virális genomjának egyik végét tartalmazza. A módosított virális genom ezen vége egy érdekes DNS-szekvenciát foglal magában, amely ezt a DNS-molekulát megkülönbözteti azoktól a genomiális karoktól, amelyek csak egy citoplazmatikus DNS-vírusban természetes körülmények között előforduló szekvenciát foglalnak magukban. Ezenkívül a módosított virális genom, amelyből az új kar származik, tartalmaz egy szekvenciaspecifikus endonukleáz számára egy egyetlen hasítási helyet is. Ezenkívül ez a DNS-molekula olyan terminálissal rendelkezik, amely homológ a módosított virális genom16
HU 219 369 Β bán lévő egyetlen hasítási hely szekvenciaspecifikus endonukleázzal való hasításával kapott termékkel.
Egy előnyös kiviteli alak szerint ezt a genomiális kart tartalmazó DNS-molekulát úgy állítjuk elő, hogy egy módosított vírus genomiális DNS-ét egy szekvenciaspecifikus endonukleázzal az egyetlen hasítási helyen hasítjuk. Ezt a DNS-molekulát úgy is előállíthatjuk, hogy egy másik DNS-molekulát módosítunk, és ezáltal egy olyan terminálist alakítunk ki, amely homológ a módosított virális genomban lévő egyetlen hasítási helyen való hasítással kapott terminálissal. Például egy találmány szerinti fenti DNS-molekulát egy természetben előforduló genomiális virális DNS egyik karjából állíthatunk elő. Egy ilyen természetben előforduló virális karból a kívánt DNS-molekulát például egy szintetikus adapter DNS-szegmenshez való ligálással állíthatjuk elő, amely egy olyan hasítási helyből származó ragadós véget tartalmaz, amely az első virális genomban nincsen jelen. Ebben az esetben az első virális genom vége és a ligáit adapter együtt tartalmazzák egy módosított virális genom egyik végét. Ennek megfelelően ez a bizonyos DNS-molekula - noha nem egy módosított virális genomiális DNS hasításával állítjuk elő, mégis tartalmaz egy olyan terminálist, amely homológ azzal a terminálissal, amely egy módosított virális genom egyetlen hasítási helyén való hasítással keletkezik.
A találmány szerinti módosított virális DNS-kar egy másik kiviteli alakja szerint az egy eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus genomjában természetes körülmények között nem előforduló DNS-szekvencia tartalmaz egy szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet, amely egyetlen ilyen hely a módosított virális genomban. Ez a hasítási hely tartalmaz továbbá egy bal oldali hasításihely-szekvenciát (SL) a bal genomiális DNS-kar számára vagy egy jobb oldali hasításihelyszekvenciát (SR) a jobb genomiális DNS-kar számára, amely teljes hasításihely-szekvenciaként (SL, Sr) jelenik meg, és ez az egyetlen ebben a módosított virális genomban. Ezt a kiviteli alakot többek között számyaspoxvírus-vektorból NotI bakteriális restrikciós endonukleázzal előállított DNS-karokkal példázzuk (lásd a 2. példát) vagy vS4 vacciniavírus-vektor karjaival, amelyeket egy inzertált többszörös klónozóhely bármely egyedi hasítási helyén való hasítással állítottunk elő (például a 6. példa).
A találmány vonatkozik továbbá egy készletre is, amely eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus módosított virális genomjának közvetlen molekuláris klónozására alkalmas. Ez a készlet (i) találmány szerinti tisztított DNS-molekulákat tartalmaz. Ezek a DNS-molekulák vagy a találmány szerinti genomiális virális DNS-karokat tartalmazzák, vagy egy találmány szerinti teljes, intakt módosított virális genomot, vagy mind a kettőt. A virális DNS-karok a klónozandó idegen DNS-szegmensek közvetlen ligálására alkalmasak, míg az érintetlen virális DNS-ek egy szekvenciaspecifikus endonukleázzal való hasítás utáni klónozásra alkalmazhatók, amely hasítást a módosított virális genomban az egyetlen ilyen helyen végezzük.
A találmány szerinti készlet tartalmaz továbbá (ii) egy DNS-ligázt és (iii) oldatokat és egyéb reagenseket a DNS-szegmensek egymással való ligálására az előbbi módosított virális genomot tartalmazó módosított DNS-molekula előállítására. A ligálásra alkalmas puffért és reagenseket például az 1. példában ismertetjük.
Egy kiviteli alak szerint ez a készlet tartalmaz továbbá egy génexpressziós kazettát tartalmazó plazmidot, amely kazettát szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyek határolják. A megfelelő szekvenciaspecifikus endonukleázzal való hasításkor a kazettát határoló helyekből olyan végek keletkeznek, amelyek alkalmasak a fenti kazetta inzertálására a DNS-molekula által kódolt módosított virális genom egyetlen hasítási helyére.
Egy másik kiviteli alak szerint ez a klónozókészlet tartalmaz továbbá egy első gazdasejtet és egy második (helper-) vírust, amely alkalmas a módosított virális genom fertőző virionokba való pakolására.
A találmány vonatkozik továbbá plazmidokra is, amelyek különösen alkalmasak köztitermékként a találmány szerinti módosított citoplazmatikus DNS-vírusvektorok megszerkesztésére. A találmány előbbi kiviteli alakja szerint egy olyan plazmidot jelent, amely egy, mind a két végén ugyanazt a szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmazó DNS-szegmenst foglalja magában. Ez a hely egyúttal az egyetlen ilyen hely egy találmány szerinti első citoplazmatikus DNS-vírusgenomban is. Ez a DNS-szegmens több, egymással szoros szomszédságban lévő szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmazó többszörös klónozóhelyet is magában foglal, amely hasítási helyek a plazmidban egyetlenek, és ezért alkalmasak idegen DNSszegmensek inzertálására a plazmidba.
Ez a plazmid alkalmas gének inzertálására a DNSszegmens egyetlen hasítási helyére és szegmens ezt követő bevitelére egy citoplazmatikus DNS-vírus egyetlen hasítási helyére, a találmány szerinti közvetlen molekuláris klónozómódszer alkalmazásával. Ezt a plazmidot a pN2 plazmiddal szemléltetjük (lásd az 1. példát, az 1.3 ábrát), amely NotI helyekkel határolt többszörös klónozóhelyet tartalmazó DNS-szegmenssel rendelkezik, és az alábbi további bakteriális restrikciós enzim hasítási helyeket tartalmazza a megadott sorrendben: Xbal, Spel, BamHI, Smal, PstI, EcoRI, EcoRV, HindlII és Clal.
Egy találmány szerinti másik plazmid egy olyan DNS-szegmenst tartalmaz, amely mindkét végén olyan hasítási hellyel rendelkezik, amely az egyetlen ilyen hely egy citoplazmatikus DNS-vírusban. Ennek a plazmádnak a DNS-szegmense tartalmaz továbbá számos olyan restrikciós enzim hasítási helyet, amely a plazmidban egyedi. Ez a DNS-szegmens tartalmaz továbbá egy szelektív markergént (például egy E. coli gpt-gént), egy citoplazmatikus DNS-vírus promoter (például a vacciniavírus P7,5 promoter) transzkripciós szabályozása alatt. Ezt a plazmidot a pN2-gpta és pN2-gptb plazmidokkal szemléltetjük, amelyek NotI helyekkel határolt DNS-szegmenst tartalmaznak, és magukban foglalják az E. coli gpt-gént is egy vacciniavírus P7,5 promoter
HU 219 369 Β transzkripciós szabályozása alatt. Ezt a plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pN2 plazmid Smal hasítási helyére inzertáltuk a promoter génkazettát, amint azt az 1.3 ábrával kapcsolatban ismertetjük.
A fenti plazmid egy módosított formája szerint a DNS-szegmens tartalmaz továbbá egy második poxvírus promotert is, működőképesen kötve egy restrikciós endonukleáz hasítási helyet tartalmazó DNS-szekvenciához. Ez a plazmid - amelyet a pN2gpt-S3A plazmiddal szemléltetünk (4.7 ábra) - alkalmazható olyan nyílt leolvasási keretek inzertálására, amelyekben nincsen saját iniciációs kodon egy vacciniavírus-vektorba való transzferhez. Hasonlóképpen a pN2gpt-S4 plazmid (4.7 ábra) alkalmazható egy AUG transzlációs startkodont is tartalmazó teljes nyílt leolvasási keretek inzertálására.
Egy másik kiviteli alak szerint ez a plazmid tartalmaz továbbá egy humán plazminogént kódoló DNSszekvenciát, amelyben a DNS-szekvencia működőképesen van kötve a poxvírus promoterhez és startkodonhoz. Ezt a plazmidot a humán glu-plazminogént kódoló pN2gpt-GPg plazmiddal és a lys-plazminogént kódoló pN2gpt-LPg plazmiddal szemléltetjük, amelyből a humán plazminogén 1-77. aminosavját kódolórégió törölve van (5.2 és 5.3 ábra).
Egy hasonló kiviteli alak szerint ez a plazmid tartalmaz továbbá egy humán immunhiányvirus (HÍV) gpl60-at kódoló DNS-szekvenciát, amelyben a DNSszekvencia működőképesen van kötve a poxvírus promoterhez és startkodonhoz. Ezt a pN2gpt-gpl60 plazmiddal szemléltetjük, amely a szintetikus S4 vacciniavírus promoter által szabályozott gplóO gént tartalmazza (5.4 ábra).
Egy újabb találmány szerinti plazmid egy citoplazmatikus DNS-vírus-genom szegmenst tartalmaz, amelyben a virális timidin-kináz (tk)-gén lokalizálódik. Ebben a plazmidban a tk-gént kódolórégiót módosítottuk (töröltük), az aktív tk enzim expressziójának meggátlására. Ezt a plazmidot köztitermékként alkalmazhatjuk egy tk-gén hiányos citoplazmatikus DNS-virus-vektor szerkesztésére a hagyományos marker rescue-módszerek alkalmazásával, amint azt a vacciniavírus tk-gén esetében leírtuk pHindJ-3 plazmidot alkalmazva. Egy hasonló kiviteli alak szerint egy citoplazmatikus DNSvírus valamely módosított tk-gén régióját tartalmazó plazmid tartalmaz továbbá egy többszörös klónozóhelyet, amely számos olyan szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmaz szoros szomszédságban, amelyekből a plazmidban csak egy-egy van jelen. Ezenkívül a fenti helyek mindegyike hiányzik abból a citoplazmatikus DNS-vírusból, amelybe a módosított tk-gén-régiót inzertálni kívánjuk. Ezért a fenti egyes helyeket tartalmazó módosított tk-gén-régió virális genomba való inzertálása után ezek a helyek alkalmasak idegen DNS-szegmensek találmány szerinti közvetlen klónozási módszerrel való inzertálására a módosított tk-régiót tartalmazó citoplazmatikus DNS-vírusgenomba.
Ezt a többszörös klónozóhelyet tartalmazó módosított tk-gén-tartalmú plazmidot a pHindJ-3 plazmiddal szemléltetjük, amelyben a pHindJ-2 plazmid módosított vacciniavírus tk-gén-régiójába inzertáltunk egy többszörös klónozóhelyet, amely az NotI, Smal, Apai és Rsrll egyedi helyeket tartalmazza az Sfil helyek által határolva (4.2 ábra). A vacciniavírus-vektorba való kényszerített klónozás további elősegítésére kihasználva az Sfil felismerőszekvenciák variálhatóságát a két Sfil hely közül mind a kettő egyetlen a vektorban, amint azt a 4. példában részletesen ismertetjük.
Egy további kiviteli alakban egy plazmid olyan szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyet tartalmaz, amely a vírus genomjában egyetlen. Az ilyen plazmidok különösen alkalmasak génexpressziós kazetták szerkesztésére a fenti egyetlen helyet tartalmazó vektorokba való transzferhez. A pAO plazmiddal szemléltetjük azt az alapplazmidot, amely a vdTK vacciniavírusvektor mester-klónozóhelyének egyetlen helyeit tartalmazó mester-klónozóhelyet tartalmaz (4.3 ábra). Két hasonló, pAl és pA2 plazmidot terveztünk DNS-szegmensek, például szintetikus vagy természetes promoter fragmensek inzertálására, és ezeket úgy szerkesztettük meg, hogy a pAO vektor Xhol helyére inzertáltunk egy linkért, amely olyan gyakori hasító enzimek második többszörös klónozóhelyét tartalmazza, amelyek nem hasítják a pAO-t. Mind a két plazmid azonos szerkezettel rendelkezik, kivéve a második többszörös klónozóhely orientációját (4.3 ábra).
Egy másik kiviteli alakban a plazmid egy poxvírus promotert tartalmaz működőképesen kötve egy transzlációs startkodonhoz, mimellett ezt a startkodont közvetlenül követi egy második restrikciós endonukleáz hasítási hely olyan megfelelő elrendezésben, hogy lehetővé tegye a második restrikciós endonukleáz hasítási helyre inzertált nyílt leolvasási keret transzlációját. Ezt a plazmidot a pAl-Sl és pA2-Sl plazmidokkal szemléltetjük, amelyek egy transzlációs startkodont is tartalmazó erős Sl szintetikus poxvírus promotert tartalmaznak, ezt egy egyetlen EcoRI hely követi, amely alkalmas olyan nyílt leolvasási keretek inzertálására, amelyekben nincs kapcsolódó startkodon (4.4 ábra). A pAl -S2 és pA2-S2 plazmidok hasonlóak a pAl-Sl és a pA2-Sl plazmidhoz, de egy eltérő, S2 poxvírus promotert tartalmaznak (4.5 ábra).
Egy hasonló kiviteli alakban a fenti plazmid tartalmaz továbbá egy humán protrombint kódoló DNS-szekvenciát, és a fenti DNS-szekvencia működőképesen van kötve a fenti poxvírus promoterhez és a fenti startkodonhoz. Ezt a plazmidot a pAlSl-PT plazmiddal szemléltetjük (5.1 ábra), amelyben egy módosított protrombin cDNS-t inzertálunk a pAl-Sl plazmid egyetlen EcoRI helyére.
Egy másik találmány szerinti plazmid a vacciniavírus DNS módosított EcoRI K fragmensét tartalmazza, amelyből a K1L gazdaspecifikus gént töröltük. A vdhr helpervírust, amelyből mind a K1L, mind a C7L gazdaspecifikus gén hiányzik, a C7L-negatív WR-6/2 törzsből szerkesztettük, marker rescue-módszerrel, egy módosított EcoRI K fragmens alkalmazásával, amelyből a K1L gazdaspecifikus gént töröltük (lásd 8.1 ábrát). Ez a módosított EcoRI K fragmens egy
HU 219 369 Β szelektív markergént (E. coli gpt-gént) tartalmaz, a módosított EcoRI K fragmenst tartalmazó rekombináns WR-6/2 genomok szelektálásának megkönnyítésére, intracelluláris marker rescue-módszert alkalmazva Sam és Dumbell módszere szerint (1981). A példaszerűen bemutatott plazmidot pEcoK-dhr plazmidnak nevezzük (8.1 ábra).
Egy további lépésben a pEcoK-dhr-t Notl-gyel linearizáljuk, és a pN2-gpta plazmidból (4. példa) Notlgyel való emésztéssel kapott 1,1 kb P7,5 gpt-gén-kazettával ligáljuk. A kapott pdhr-gpt plazmidot (8.1 ábra) alkalmazzuk a marker rescue-kísérletekben a vdhr helpervírus előállítására Sam és Dumbell marker rescue-módszere szerint (1981).
A találmányt az alábbiakban kiviteli példákkal szemléltetjük. Az alábbi példákban bizonyos termékeket táblázatosán megadott adataik segítségével jellemzünk. Ezekben a táblázatokban az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk:
CDS=kódolószekvencia re=reverz komplementer szekvencia rcCDS= reverz komplementer kódolószekvencia, az arab számok a nukleotidok helyzetét jelölik
ATG=transzlációs startkodon
EMBL ID=azonosító az EMBL adatbankban.
1. példa
Szelektív markergént (E. coli gpt-gént) tartalmazó idegen DNS közvetlen molekuláris klónozása egy ortopoxvírus (vaccinia) genomjában lévő egyetlen (NotI) hasítási helyre
Ebben a példában szemléltetjük egy génexpressziós kazetta közvetlen molekuláris klónozását egy poxvírusgenomba a találmány szerinti eljárással, egy génsebészetileg módosított poxvírus-DNS intracelluláris pakolásával. Ezenkívül ez a példa illusztrálja az inzertált szelektív markergént tartalmazó módosított vacciniavírusok hatékony visszanyerésére szolgáló genetikus szelekciós eljárás alkalmazását. A kísérleti eredmények nyilvánvalóvá teszik azt is, hogy a rekombináció gyakran létrejön a pakolandó DNS és a fertőző helpervírus között a pakolás során, ha a helpervírus DNS-e homológ a pakolandó DNS-sel.
Közelebbről az alább ismertetett első közvetlen molekuláris klónozókísérlet azt mutatja, hogy egy markergén (gpt-gén) kazetta NotI restrikciós fragmensként inzertálható egy Notl-gyel hasított vacciniavírus DNS-be, és ezután vacciniavírussal fertőzött emlőssejtekben pakolható. A 9 vizsgált plakk közül 1 tartalmazott olyan vírust, amely a várt szerkezettel rendelkezett, mégpedig egy gpt-gén egyetlen inszerciójával „a” orientációban (lásd az 1.11 ábrát). A fenti, vp7-nek nevezett klón szerkezete stabil volt a nagy léptékű replikáció során, szelekciós szer távollétében.
A második klónozási kísérleti szériában 12 vizsgált klón közül 7 rendelkezett a várt szerkezettel. Ebbe a sorozatba tartozott azonban 4 kicsi (E1-E4), lassan replikálódó vírusplakk is, noha ezek előnyösen normális módon nem szelektálódnak a találmány szerinti eljárással. A szelektálás! körülmények között olyan rekombinánsokat is kaptunk, amelyek a szelektív markergént több inzertben tartalmazták. Az előbbi többszörös inzertet tartalmazó rekombinánsok stabilitását nem vizsgáltuk szelekciós szer távollétében, amelyről tudott, hogy az egyébként nem stabil szerkezeteket stabilizálja [lásd Falkner és Moss, J. Virol. 64, 3108-3111 (1990)].
A várt szerkezetek viszonylag alacsony hozama meglepő volt, tekintettel a DNS-molekulák helyspecifikus hasítására és ligálására alkalmazott génsebészeti módszerek ismert precizitására. Azonban az előbbi modellrendszerben az inzertálásra kiválasztott szekvencia, a gpt-gén-kazetta a P7,5 promoter vacciniavírus DNSszekvenciáit tartalmazza, amelyek homológok két endogén vacciniavektor promoterrel, amelyek a vacciniagenom invertált terminális ismétlődéseiben lokalizált két vacciniavírus 7,5 kD polipeptidgént szabályozzák [lásd Venkatesan, B., Baroudy Β. M. és Moss B., Cell 25, 805-813 (1981)]. Ezt a P7,5 promotert alkalmazták vacciniavírus rekombinánsok szerkesztésére hagyományos intracelluláris rekombinációval, és stabilan integrálható vaccinia timidin-kináz génbe [Mackett és Smith (1986)]. Esetenként azonban a DNS-fragmensek szubmoláris mennyiségei megjelennek a hagyományos rekombinánsok analízise során, ezek másodlagos rekombinációs eseményekből származhatnak. Ha a P7,5 promotert az endogén P7,5 promoterek közelébe (azaz néhány kilobázison belül) inzertáljuk, csak azok a rekombinánsok stabilak, amelyek egy invertált ismétlődő szerkezettel rendelkeznek, ezt a megfigyelést használták ki egy deléciós eljárás kifejlesztésére, amely egy tandemszerűen ismétlődő P7,5 promoter szegmens inzertálásán alapul [Spehner, D., Drillien, R. és Lecocq, J. P., J. Virol. 64, 527-533 (1990)].
A jelen esetben, amikor egy gpt-gén-kazettát inzertálunk a vacciniavírus NotI helyére, a bal invertált terminális ismétlődés és az inzertált kazetta P7,5 promoterei közötti távolság mintegy 30 kb, valószínűleg elég közeli ahhoz, hogy másodlagos destabilizáló rekombinációs eseményeket okozzon. Ténylegesen csak néhány lassan replikálódó instabil klón szerkezete tartalmaz inzertet „b” orientációban, amely az inzertált és az endogén promoterek tandem ismétlődő elrendeződését jelentené. így ennek a szerkezetnek a ritka előfordulása legvalószínűbben a gpt-gén-kazetta P7,5 promotereinek és az endogén P7,5 promoterek helyének közelségével, és a P7,5 promoter tandemszerűen ismétlődő kópiáinak ismert instabilitásával magyarázható.
Ezzel szemben a vp7 vírus és néhány más izolátum (Al, A4, Cl és C2) „a” orientációban tartalmaz inzerteket, és ezek stabilak. Egy izolátum, a C4 szerkezeti analízise egy fej-láb kettős inzertre utal.
A második klónozókísérlet-sorozatban (5 különböző mintában) a bepakolt gpt-génre pozitív vírusok titere közelítőleg 1 χ 105 pfu/8 χ 106 sejt, míg az első kísérletsorozatban ugyanilyen számú sejtre l-2x 102 pfu titert kaptunk. A módosított vírusok titerét számos faktor befolyásolja, többek között a ligálás és pakolás hatékonysága, a klónozási eljárásban alkalmazott reakció- és tenyésztési körülmények és az a gondosság, amit arra fordítunk, hogy elkerüljük nagy molekulájú vektor DNS19
HU 219 369 Β nyíródását a kezelés során. Az alábbiakban ismertetett standard körülmények között általában 105 pfü/8x 106 sejt körüli titerek várhatók.
Míg a jelen példa azt mutatja, hogy a vacciniavírus egyetlen, génen belüli NotI helye alkalmazható idegen DNS inzertálására, annak szükségességét is bemutatja, hogy meg kell fontolni, hogy egy javasolt inzert tartalmazhat-e olyan típusú virális szekvenciákat és orientációkat, amelyek ismert módon vagy feltehetőleg a módosított vírusok instabilitását okozzák. Stabilitás szempontjából előnyösek azok az inzertek, amelyekben nincs homológia az inszerció helyéhez közeli (például 30 kb-on belüli) virális szekvenciákkal. Ennek megfelelően a csak rövid, a vektor transzkripciós rendszere által felismerhető szintetikus promoter szekvenciákat tartalmazó inzertek előnyösek azokhoz képest, amelyek nagy virális DNS-szegmenseket tartalmaznak, beleértve a virális vektor természetes promotereit is (lásd például az Sl promotert a 4. példában alább).
Az alábbi anyagokat és módszereket alkalmaztuk ebben, és az összes többi példában, kivéve, ha azt másképp adjuk meg.
Ortopoxvírus és DNS tisztítása
A vacciniavírust [vad típusú Western Reserve (WR) törzs; American Type Culture Collection No. VR 119] két egymást követő szacharóz gradienssel tisztítjuk Mackett és munkatársai módszere szerint [D. M. Glover, DNA Cloning: Apractical approach, 191-211 (IRL Press, 1985)]. A vírus DNS-t proteináz K.-SDS eljárással állítjuk elő Gross-Bellard és munkatársai módszere szerint [Eur. J. Biochem. 36, 32-38 (1973)].
Izolált poxvírus DNS-módosítása
A virális DNS-t (rendszerint 2-5 pg-ot) megfelelő mennyiségű, egy vagy több szekvenciaspecifikus endonukleázzal (például NotI bakteriális restrikciós endonukleázzal) hasítjuk, adott esetben borjúból lúgos foszfatázzal (Boehringer, Inc.) kezeljük, és fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítjuk a szokásos rekombináns DNS-módszerek szerint. A kapott virális DNS-karokat 5-50-szeres mólfeleslegben lévő inzertálandó DNS-fragmenssel ligáljuk, amely a virális karral való ligálásra kompatibilis végekkel rendelkezik. A ligációs elegy egy aliquotját lengetett (field inversion) gélelektroforézissel analizáljuk.
Még pontosabban, az alább ismertetett második kísérletsorozatban (A-E) 2 pg Notl-gyel emésztett, foszfatázzal nem kezelt vacciniavírus-DNS-t ligálunk 200-600 ng gpt-gén-kazetta inzerttel 30 ml térfogatban, 5-15 egység T4 ligázzal, 12 °C-on, 48 órán keresztül, amint azt az 1. táblázatban összefoglaltuk.
In vivő pakolás emlőssejtekben
8xl06 afrikai zöldmajom (CV-l)-sejtet fertőzünk helpervírussal (vagy vaccinia WR vad típusú, vagy WR6/2 vírussal vagy más vírussal, ahogy azt jelezzük) 0,2 pfu/sejt koncentrációban 2 órán keresztül. A virionokból izolált intakt DNS-ekkel való pakolás bizonyítására először 20 pg virális (vPgD) DNS-t alkalmaztunk. Az extracellulárisan módosított genomok pakolására 1 pg DNS-t alkalmaztunk, amelyet a ligációs reakcióelegyből tisztítottunk. A DNS-eket kalcium-foszfátos precipitációs technikával transzfektáljuk a sejtekbe (Graham F. L. és van dér Eb, 1973). A sejteket szobahőmérsékleten 15 percen keresztül inkubáljuk, majd 9 ml tápközeget (DMEM, 10% magzati borjúszérum, glutamin és antibiotikumok) adunk a sejtekhez 1 ml precipitátumra számolva. 4 óra múlva a tápközeget kicseréljük, és az inkubálást 2 napon keresztül tovább folytatjuk.
A nyersvírus törzsszuszpenziókat standard eljárásokkal állítjuk elő (Mackett és munkatársai 1985). A plakkvizsgálatok és az E. coli gpt-génre való szelektálás körülményei a szakirodalomból ismertek [lásd Falkner és Moss, J. Virol. 62, 1849-1854 (1988); és Boyle és Coupar, Gene 65, 123-128 (1988)).
Lengetett (field inversion) gélelektroforézis (FLGE)
A virális DNS-t 1%-os agarózgélen választjuk szét Tris/acetát/EDTA-pufferben (40 mmol/1 Tris/20 mmol/1 jégecet/2 mmol/1 EDTA, pH 8,0) mikrokomputerrel szabályozott energiafonással (Consort Model E790). A fragmensek teljes skálájának szétválasztására egymást követően 4 programot futtatunk az alábbiak szerint: 1. pogram: 5 óra 7 V/cm-en, előre pulzus (F) 6 s, fordított pulzus (R) 3 s, szünet 1 s; 2. program: 5 óra 7 V/cm-en, F 4 s, R 2 s, szünet 1 s; 3. program: 5 óra 7 V/cm-en, F 2 s, R 1 s, szünet 1 s; és 4. program: 5-10 óra 7 V/cmen, F 8 s, R 4 s, szünet 1 s.
pN2 plazmid szerkesztése
A Bluescript II SK plazmidot (Stratagene, Inc.) HindlI-vel emésztjük, és NotI linkerekkel (Pharmacia Inc.) ligáljuk. A kapott pN2 plazmid NotI helyekkel határolt többszörös klónozóhelyet tartalmaz. Közelebbről a pN2 többszörös klónozóhelye az alábbi helyeket tartalmazza a megadott sorrendben: NotI, Xbal, Spel, BamHI, Smal, PstI, EcoRI, EcoRV, HindlII, Clal és NotI. A pN2 inzertált NotI linker szekvenciája és a pBluescript II SK (Stratagene, Inc., La Jolla, USA) 5’és 3’-határoló régióinak 20 bázisa az 1. azonosítási számú szekvenciában látható. Az inzertált szekvencia a 21-es helyzetben kezdődik és a 28-as helyzetben ér véget. (Az első T-maradék az 5’-végen a 2266-os helyzetnek felel meg, az utolsó G-maradék a 3-végen a 2313-as helyzetnek felel meg a pN2 plazmidban.) pN2-gpta és pN2-gptb plazmidok szerkesztése
A P7,5 promoter gpt-génkazettát tartalmazó 1,1 kb Hpal-Dral fragmenst a pTKgpt-Fls plazmidból (Falkner és Moss, 1988) izoláltuk, és a pN2 plazmid Smal helyére inzertáltuk (1.3 ábra). A kapott plazmidok orientációs izomerek, és ezeket pN2-gpta-nak és pN2-gptb-nek neveztük. A vacciniavírus P7,5 promoter-E. coli gpt-génkazetta és a pN2 5’- és 3’-határoló régióinak 20 bázisa a pN2-gpta esetében a 2. azonosítási számú szekvenciában látható. Az inzert a 21-es helyzetben kezdődik és az 1113-as helyzetben ér véget. A gpt-gén transzlációs iniciálókodonjának A-maradéka az 519-es helyzetnek felel meg. A gpt-gén transzlációs stopkondonjának T-maradéka a 975-ös helyzetnek felel meg. (Az 5’-végen az első C-maradék a 2227-es helyzetnek és a 3’-végen az utolsó T-maradék a 3359-es helyzetnek felel meg a pN2-gpta plazmidban.)
HU 219 369 Β
A P7,5 vacciniavírus promoter-E. coli gpt-génkazetta fordított komplementer formája, és a pN2 5’- és 3’-határoló régióinak 20 bázisa a pN2-gptb génre a 3. azonosítási számú szekvenciában látható. Az inzert a 21-es helyzetben kezdődik, és az 1113-as helyzetben ér véget. A CAT transzlációs iniciálókodon fordított komplementjének T-maradéka a 615-ös helyzetnek felel meg. A gpt-gén transzlációs stopkondonja fordított komplementjének A-maradéka a 159-es helyzetnek felel meg.
A rekombináns DNS-analízis egyéb szokásos eljárásait (például Southem-blot, PAGE, nick transzláció) a J. Sambrook és munkatársai által ismertetett módon hajtottuk végre [Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)].
Csupasz virális DNS pakolása
A csupasz poxvírus-DNS helpervírus általi pakolására szükséges körülmények megállapítása céljából egy rekombináns vacciniavírus (vPgD) virionjaiból izolált intakt DNS-t transzfektáltunk helpervírussal (vad típusú vaccinia WR) fertőzött majom (CV-1) sejtekbe. A kiválasztott rekombináns vírus számos, könnyen felismerhető fenotipikus markert tartalmaz. így a vPgD genom a virális timidin-kináz (tk) lokuszban egy gyógyszerrezisztencia markert tartalmaz (az E. coli xantinguanin-foszforibozil-transzferáz enzimjét kódoló gént; azaz a gpt-gént) és egy könnyen detektálható markerprotein (humán plazminogén) génjét. Ezt a vírust eredetileg egy vacciniavírus törzsből állították elő [WR 6/2: Moss és munkatársai J. Virol. 40, 387-395 (1960)], amelyben mintegy 9 kb deléció van, és ennek következtében nem expresszálja a Kotwal és munkatársai által ismertetett [Natúré 335, 176-178 (1988)] virális fő szekretált 35K proteingént. A pakolt vírus várt fenotípusa ezért: tk-negatív (azaz bróm-dezoxi-uridinjelenlétében replikálódik); gpt-pozitív (azaz mikofenolsav és xantin jelenlétében replikálódik); humán plazminogén gént expresszál, és nem expresszálja a szekretált 35K proteint.
Analizáltuk a fenti pakolókísérletből származó 8 gpt-pozitív plakkot. A plakkok mindegyike tk-negatív volt, és - amint azt az 1.1 ábra mutatja - mind expresszálta a plazminogént. Az izolátumokból 6 (5., 6., 7., 11., 12. és 14. sáv) nem expresszálta a 35K szekretált vacciniaproteint, így a transzfektált genomiális DNS összes jellemzőjét mutatta. A plakkok közül kettő a 35K proteinmarkert is expresszálta (4. és 13. sáv), ezért ezek a vad típusú helpervírus (8. és 15. sáv) és a bevitt virális genomok rekombinánsai.
Ez a kísérlet bizonyítja, hogy a virionokból extrahált poxvírus-DNS bepakolódik, amikor helpervírussal fertőzött sejtekbe transzfektáljuk a vizsgált körülmények között. Ezért ezeket a körülményeket alkalmaztuk az 1.2 ábrán vázolt közvetlen molekuláris klónozással módosított genomiális poxvírus-DNS transzfektálására is.
Extracellulárisan módosított poxvírus-DNS pakolása
A vacciniavírus-genomja az NotI szekvenciaspecifikus endonukleáz számára egyetlen hasítási helyet tartalmaz a HindlII F fragmens néven ismert régióban.
A szekvencia tanulmányozása ezen hely környezetében (Goebel és munkatársai, 1990) nyilvánvalóvá tette, hogy az egy gének közötti régióban lokalizálódik, amely nem valószínű, hogy esszenciális a virális replikációhoz. Egy markergén expressziós kazettát konstruáltunk két plazmidban (pN2-gpta és pN2-gptb, 1.3 ábra) oly módon, hogy az E. coli gpt-gént mind a két lehetséges orientációban inzertáltuk. A gpt-gén a 7,5 kD proteint kódoló vacciniavírus-gén promoterének [Cochran és munkatársai, J. Virol. 54, 30-37 (1985)] szabályozása alatt áll (Pl-gyei jelölve az 1.2 ábrán, és P7,5-tel az 1.3 ábrán). A teljes markergén-kazetta a fenti plazmidok egyetlen 1,1 kb hosszúságú NotI fragmensében helyezkedik el. A pN2-gpta-ból származó fenti restrikciós fragmenst Notl-gyel emésztett vad típusú WR DNS-sel ligáltuk és helpervírussal (WR) fertőzött sejtekbe transzfektáltuk.
Első kísérletsorozatban elvégeztük a fenotipikusan gpt-pozitív utódplakkok genomiális szerkezetének Southem-blot-analízisét. A virális izolátumokat háromszor plakktisztítottuk és gpt-szelekció alatt sokszoroztuk. A különböző vírusokkal fertőzött sejtek (CV-1) HindlII-mal emésztett DNS-fragmenseit 1%-os agarózgélen választottuk szét normális elektroforézis és lengetett gélelektroforézis kombinációjával. A gélt ezután blottoltuk, és 32P-jelzett vaccinia WR DNS-sel és egy gpt-szekvenciákat tartalmazó jelzett próbával hibridizáltuk. Az eredmények megerősítették, hogy az összes fenotipikusan marker-pozitív klón tartalmazza az 1,1 kb hosszúságú gpt-inzertet.
Az 1.4 ábrán látható a 9 vírusizolátummal fertőzött sejtekből származó HindlII DNS-fragmensek blotja (4-12. sáv; 2.1.1-7.1.1 plakkok és 10.1.1-12.1.1 plakkok). Megfigyelhetők a gpt-szekvenciákat tartalmazó várt 0,8 kb hosszúságú HindlII fragmensek. A 2. és 3. sávban - ahová a HindlII-mal emésztett vad típusú vírus DNS-t 100, illetve 50 ng mennyiségben vittük fel, nem látható kereszthibridizáció a virális szekvenciákkal.
A következő kísérletsorozatban a 9 különböző piákkal fertőzött CV-1-sejttenyészetek összes DNS-ét Notl-gyel emésztettük. A szétválasztott fragmensek Southem-blotja az 1.5 ábrán látható. Nem várt módon két sáv látható a legtöbb vírusizolátumban, az előre várt 1,1 kb hosszúságú inzert és egy második, nagyobb ffagmens. Csak egyetlen plakk, a 7.1.1 számú (8. sáv) mutatta a várt egyetlen 1,1 kb méretnek megfelelő sávot. Noha a nagyobb fragmens hibridizációs jele egyformán erős az összes vizsgált DNS-ben, az 1,1 kb méretnek megfelelő sáv intenzitása DNS-ről DNS-re változik, ami azt jelenti, hogy az 1,1 kb hosszúságú inzert különböző moláris mennyiségekben lehet jelen a különböző genomokban. A vad típusú víruskontroll (2. sáv) nem hibridizál a gpt-gén-próbával.
Ugyanezt a blotot egy vaccinicavírus DNS-próbával is hibridizáltuk. Három fragmenst vártunk, mintegy 145 kb, 45 kb és 1,1 kb hosszúságút. A kapott blotképek tartalmazzák a várt sávokat, de egy további, mintegy 5 kb hosszúságnak megfelelő sávot is mutatnak. Csak a 7.1.1 plakk nem tartalmazza a nem várt, 5 kb hosszúságnak megfelelő sávot.
HU 219 369 Β
A DNS-inzert orientációját a kiválasztott módosított vacciniagenomokban Southem-blottal is analizáltuk. Amint az 1.2 ábrán látható, a virális DNS-inzert orientációja vagy „a”, vagy „b” lehet, amelyek megkülönböztethetők a DNS-ek megfelelő restrikciós enzimekkel való emésztésével. Előzetes analízisek után a
7.1.1 izolátum - amelyet vp7 kiónnak jelöltünk -, úgy tűnt, hogy tartalmazza a várt módosított vírus genomiális szerkezetét, és ezért megsokszoroztuk és tisztítottuk. Ennek a klónnak a DNS-ét a vad típusú vírus DNS-ével hasonlítottuk össze számos restrikciós enzimmel való emésztéssel és agarózgélen lengetett gélelektroforézissel történő szétválasztással (1.6 ábra). A vp7 etídium-bromiddal festett Notl-es emésztési termékében (2. sáv) csak a 145 kb és 45 kb sávok tartalmaztak elegendő DNS-t ahhoz, hogy láthatók legyenek, mivel az 1,1 kb inzert sávja becslések szerint csak mintegy 3 ng DNS-t tartalmaz. Azonban egy gpt-specifikus próbával való hibridizálással láthatóvá vált egy gyenge sáv 1,1 kb-nál (1.7 ábra, 2. sáv).
A HindlII-mal kapott emésztési termékekben megfigyelhetők a várt sávok 1,4 és 0,8 kb-nál. Várható módon a 0,8 kb sáv hibridizált a gpt-gén-próbával (1.6 és
1.7 ábra, 4. sáv). Az Notl-gyel és HindlII-mal kapott kettős emésztési termékekben a várt 0,8 kb fragmens szintén megfigyelhető (1.6 és 1.7 ábra, 6. sáv).
A vp7 DNS Pstl-gyel kapott emésztési termékében megfigyelhető az előre várt gpt-szekvenciákat tartalmazó 4,1 kb fragmens (1.6 és 1.7 ábra, 8. sáv; az 1.6 ábrán a 4,1 kb méretnek megfelelő etídium-bromiddal festett sáv valójában a 4,1 kb fragmensek dublettje, amelyek közül az egyik tartalmazza a gpt-inzertet). Mind Pstlgyel, mind Notl-gyel való hasítás után a gpt-génkazetta
1,1 kb fragmensként szabaddá válik (1.6 és 1.7 ábra,
10. sáv).
A fenti és egyéb restrikciós nukleázokkal - beleértve a Sall-gyet (1.6 és 1.7 ábra, 12. sáv) - kapott emésztési minták egybevágnak azzal a feltételezéssel, hogy a vp7 egy stabil módosított vírus, amelyben a gpt-gén a vacciniavírus-genom NotI helyére épült be „a” orientációban (lásd 1.11 ábra).
A klónozási kísérletek második sorozatát kissé módosított körülmények között hajtottuk végre (lásd 1. táblázatot és a fent ismertetett módszereket). 5 különböző ligációs reakcióelegyet (A-E) készítettünk, amelyek azonos mennyiségben tartalmazták az Notl-gyel hasított vacciniavektor-DNS-t, és növekvő mennyiségekben az inzertált DNS-t. A pakolást a vacciniavírussal fertőzött CV-1-sejtekre megadott standard körülmények között végeztük. A gpt-pozitív vacciniavírusok titere az összes esetben mintegy 1 χ 105 pfu/8 xlO6 sejt volt. Az összes klónozókísérletben a plakkpopuláció méretét tekintve heterogén volt, mintegy fele normális méretű, míg a másik fele a normálisnál kisebb.
1. táblázat inzertált DNS-vektor DNS-hez viszonyított mennyiségének hatása a módosított vírusok hozamára
Kísérlet
A B C D E
Notl-gyel hasított vektor-DNS (pg) 2 2 2 2 2
gpt-gén inzert (pg) 0.2 0,2 0,4 0,4 0,6
Inzert moláris feleslege 17 17 34 34 51
T4 ligáz (egység) gpt-pozitív vírus (χ 105) 5 15 5 15 15
(pfu/8 χ 106 sejt) 1,12 0,88 0,96 0,96 1,16
gpt-pozitív plakkot izoláltunk, az A, C és E jelű sorozatok mindegyikében 4-4-et, amelyek közül 8 normális méretű (nagy) plakk (Al -4 és Cl -4) és 4 kisméretű plakk (El-4).
Ezen plakkok mindegyikét analizáltuk oly módon, hogy CV-1-sejteket gpt-re szelektív közegben fertőztük, izoláltuk az összes celluláris DNS-t és restrikciós nukleázokkal emésztettük, a fragmenseket FIGE-eljárással elválasztottuk, és nitrocellulóz membránra blottoltuk.
Az 1.8 ábrán mutatjuk be az Notl-gyel emésztett, vacciniavírus-DNS-próbával hibridizáló DNS-mintákat (Al-4: 1-4. sáv; Cl-4: 5-8. sáv; El —4: 9-12. sáv). A gél túltelítettsége miatt a sávok kicsit elkenődnek, azonban a lényeges jellemzők világosan láthatók. A 145 kb és 45 kb méretű sávok adják a fő jelet. Egy ismeretlen eredetű, mintegy 5 kb méretű gyenge sáv látható néhány mintában. A P7,5 promoter gpt-génkazettát tartalmazó 1,1 kb méretű sáv csak 0,6%-át teszi ki a virális genomnak, és hibridizálószekvenciából (azaz a P7,5 promoterből) csak 300 bp-t tartalmaz. Ezért ez a sáv várhatóan nem ad detektálható hibridizációs helyet az alkalmazott körülmények között. A biot hosszabb expozíciójával - amikor a nagyobb sávok erősen túlexponáltak - az 1,1 kb méretű sávok valóban láthatóvá válnak.
Ami a fenotipikusan kis plakkok természetét illeti, az El, E3 és E4 kis plakkok csak gyenge hibridizációs jeleket adnak (1.8 ábra 9-12. sáv), jelezvén, hogy a vírus ezekben a plakkokban nem replikálódik olyan jól, mint a normális méretű plakkokban (1-8. sávok), ugyanakkor az E2 izolátum nem ad detektálható mennyiségű DNS-t (10. sáv).
Az 1.8 ábrán látható mintákat gpt-gén-próbával is hibridizáltuk (1.9 ábra). Az Al, A4, Cl, C2, C4, E3 és
HU 219 369 Β
E4 plakkok a várható egyetlen hibridizációs jelet mutatják (1.9 ábra, 1., 4., 5., 6., 8., 11. és 12. sáv). Az A2 plakkban (2. sáv) a gpt-gén a 45 kb méretű sávba integrálódott. (A 145 kb méretű sávban látható gyenge jel egy második mellékes molekulával való szennyeződésnek vagy másodlagos rekombinációs eseményeknek tulajdonítható.) Az A3 plakkban (3. sáv) a gpt-génszekvenciák a 145 és a 45 kb méretű sávokba épültek be, míg a C3 plakkban (7. sáv) ezek a szekvenciák a 145 kb méretű sávba és az NotI helyre épültek be. Az A2, A3 és C3 plakkok valószínűleg olyan rekombinánsok, amelyek az alkalmazott génkazetta-inzertben és a virális DNS invertált ismétlődéseiben jelen lévő homológ szekvenciák rendellenes intracelluláris rekombinációjából keletkeztek.
Ami a vacciniavírus-DNS-próbát illeti, az E1-E4 kis plakkok csak gyenge hibridizációs jeleket mutatnak (1.9 ábra, 9-12. sáv), jelezvén, hogy a vírus ezekben a plakkokban nem replikálódik olyan nagy mértékben, mint a normális méretű plakkokban. A vad típusú vírusDNS és a nem fertőzött CV-1 celluláris DNS nem hibridizál a gpt-gén-próbával (1.9 ábra, 13. és 15. sáv).
A gpt-gén-inzertek orientációját és példányszámát úgy határoztuk meg, hogy az 1.9 ábrán bemutatott mintákat Pstl-gyel emésztettük, és Southem-blot-analízisnek vetettük alá. A gpt-gén inzertálásából származó új PstI fragmensek várt mérete az 1.11 ábrán látható. A gpt-gén-próbával való hibridizációval kimutattuk, hogy az Al, A4, Cl és C2 plakkok (1.10 ábra, 1., 4., 5. és 6. sáv) egyetlen 4,1 kb hosszúságú PstI fragmenst tartalmaznak, ami várható az egyetlen inzertre „a” orientációban (1.11 ábra). Az El plakkban egy 21 kb méretű sávból származó gyenge hibridizációs jelet figyeltünk meg a biot hosszan tartó expozíciójával, ez a gpt-géninzert „b” orientációjának felel meg.
A C4 és E3 plakkok virális DNS-ének szerkezete (1.10 ábra, 8. és 11. sáv) „b” orientációjú kettős tandem inzertnek felel meg. Ebben az esetben 21 és
1,1 kb hosszúságú hibridizáló fragmenseket vártunk (1.11 ábra). A vírus szerkezete az E4 plakkban - amely két, egy 4,1 és egy 1,1 kb hosszúságú fragmenst tartalmaz - két gpt-gén tandem inszerciójának felel meg „a” orientációban. Az A2, A3 és C3 plakkokból származó DNS összetettebb képet mutat, jelezvén, hogy az inszerció többszörös helyeken ment végbe, amelyet tovább nem analizáltunk.
Összefoglalva a második klónozókísérletben 8 normál méretű plakk közül 5 mutatott olyan genomiális szerkezetet, amely egyetlen gpt-génkazetta vacciniavírus-genom egyetlen NotI helyére való inszerciója esetén várható volt. A lassabban szaporodó kisméretű plakkok instabil szerkezeteket tartalmaztak, amelyek a további plakktisztítási lépések során elvesztek.
2. példa
Szelektív markergén (E. coli gpt) klónozása egy módosított avipoxvírus-genom (szárnyaspoxvirus f-TK2a klón) egyetlen (NotI) hasítási helyére Ez a példa mutatja be a módosított citoplazmatikus
DNS-vírus-genomok közvetlen molekuláris klónozásának általános alkalmazhatóságát olyan módosított avipoxvírus-genomok esetében alkalmazva, amelyeket in vitro állítottunk elő és in vivő pakoltunk. A poxvírus családban az avipoxvírusoknak van a legnagyobb genomja. A szárnyaspoxvirus (FPV) genomja mintegy 300 kb méretű, ezért az idegen géneket expresszáló FPV rekombinánsokat eddig csak markermentési technikákkal lehetett előállítani [lásd például Boyle és Coupar, Vírus Rés. 120, 343-356 (1988); Taylor és munkatársai: Vaccine 5, 497-503 (1988)].
Ebben a példában mutatjuk be módosított számyaspoxvírus előállítását egy E. coli gpt-gént szabályozó poxvírus promotert tartalmazó génexpressziós kazetta közvetlen molekuláris klónozásával egy rekombináns szárnyaspoxvirus, az f-TK2a genomjában az egyetlen NotI helyre. Ez az NotI hely a lacZ-génben lokalizálódik, amelyet intracelluláris rekombinációval inzertáltunk előzőleg ebbe a rekombinánsba. A manipulált DNS-t HP2 helper-számyaspoxvírussal fertőzött primer csirkeembrió-fibroblasztokba pakoljuk, a helpervírus sokkal lassabban replikálódik, mint az f-TK2a rekombináns. A gpt-pozitív plakkokra való szelektálás lehetővé teszi a módosított számyaspoxvírusok izolálását. Mivel a lacZ-markergént az NotI helyre való inszercióval inaktiváljuk, az utódvírust az inzertet nem tartalmazó vektorvírustól színtelen fenotípus különbözteti meg a lacZ-gén expressziójára végzett kék plakk vizsgálatban.
Szárnyaspoxvirus DNS tisztítása
A szárnyaspoxvirus (FPV) HP1 törzset [Mayr és Malicki, Zentralblatt f. Veterinármedizin, B sorozat, 13, 1-12 (1966)] és a gyengített HP1 441 törzset (a HP1 441. átoltása) A. Mayr (München) bocsátotta rendelkezésünkre. A szárnyaspoxvirus HP2 törzset a HP1 441 törzsből kaptuk plakktisztítással. A primer csirkeembrió-fibroblasztokat (CEF) a 0 338 807 számon publikált európai szabadalmi leírás szerint állítottuk elő. A sejteket 199-es szövettenyésztő közegben (TCM 199; Gibco BRL) tenyésztettük, amelyhez 5% magzati boíjúszérumot, glutamint és antibiotikumokat adtunk. A számyaspoxvírust két egymást követő szacharóz gradienssel tisztítottuk Joklik W. K. módszere szerint [Virology 18, 9-18 (1962)]. A vírus-DNS-t proteináz K/SDS-eljárással állítottuk elő Gross-Bellard és munkatársai módszere szerint [Eur. J. Biochem. 36, 32-38 (1973)].
Szárnyaspoxvírus-vektor (f- TR2a) szerkesztése, amely egy inzertált DNS-szegmensben tartalmaz egy egyetlen (NotI) hasítási helyet
A vacciniavírus tk-gént az E. coli lacZ-génnel együtt inzertáltuk a szárnyaspoxvirus tk-génje és 3’-orf-je közötti intergénrégióha. A pTKm-Wtka és pTKm-Wtkb plazmidokat úgy szerkesztettük meg, hogy a működőképes vacciniavírus tk-gént a pTKm-sPll köztes plazmidba klónoztuk. A pTKm-Wtka és pTKm-Wtkb vad típusú szárnyaspoxvirus DNS-sel való intracelluláris rekombinációjával két új FPV vektort állítottunk elő, amelyeket f-TK2a-nak és f-TK2b-nek neveztünk. Mind a két vektor két funkcionális tk-gént, az endogén FPV gént és az inzertált vacciniavírus tk-gént tartalmaz23
HU 219 369 Β za az inzertált lacZ-génen kívül, ezek közül bármelyik alkalmazható nem esszenciális helyként egy idegen DNS inzertálására. Közelebbről a lacZ-génben lévő NotI hely egy egyetlen hasítási helyet képvisel az f-TK2a és f-TK2b vektorokban, és ezért előnyösen alkalmazható idegen DNS-ek közvetlen molekuláris klónozására ezekbe a vektorokba. A f-TK2a és f-TK2b számyaspoxvírus-vektorok szerkesztésének részletes leírása a Scheiflinger és munkatársai által benyújtott „Rekombináns számyaspoxvírus” című amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban található (amelyben a jelen bejelentéssel egy időben benyújtott ekvivalens európai szabadalmi bejelentés elsőbbségét igénylik), amelynek teljes tartalmát referenciaként jelen leírásunkba beépítettük.
In vivő pakolás madársejtekbe
8χ 106 CEF-sejtet 0,2 pfu/sejt helpervírussal (HP2) fertőztünk 2 órán keresztül. A módosított FPV genomok pakolására 1 pg tisztított ligációs reakcióterméket alkalmaztunk. A sejteket kalcium-foszfátos kicsapásos technikával transzfektáltuk a DNS-sel (Graham és van dér Eb, 1973), és szobahőmérsékleten 15 percen keresztül inkubáltuk. A sejtekhez 9 ml tápközeget (TCM 199, 10% magzati borjúszérum, glutamin és antibiotikum) adtunk 1 ml csapadékra vonatkoztatva. 4 óra elteltével a tápközeget kicseréltük, és az inkubálást 2 napon keresztül tovább folytattuk. A nyersvírus törzsszuszpenziókat ismert eljárásokkal állítottuk elő (Mackett és munkatársai 1985). A plakkok vizsgálatát és a gpt-szelektálást Scheiflinger és munkatársai módszere szerint végeztük (1991).
Közvetlen molekuláris klónozás szárnyaspoxvírusgenom egyetlen NotI hasítási helyére
Az f-TK2a rekombináns FPV törzs (Scheiflinger és munkatársai 1991) alkalmas vektorként egy génkazetta közvetlen klónozására, például egy itt ismertetett gpt-génkazetta modell klónozására az egyetlen NotI hasítási helyre. A vektornak ez az NotI helye a lacZ-gén kódolórégiójában van, ami színszűrő markerként szolgál, mivel a gén inszerciója inaktiválja. Ennek megfelelően a lacZ-pozitív vírusok kék plakkokat képeznek a kromogén X-Gal szubsztrát jelenlétében, míg azok a vírusok, amelyek az NotI helyen inzertet tartalmaznak, fenotipikusan fehér plakkot képeznek. Az f-TK2a vektor genomjába a vacciniavírus timidin-kináz (tk)-gén is be van építve, amely alternatív géninszerciós régióként szolgál. Mind a lacZ-gén, mind a tk-gén hagyományos módszerekkel van beillesztve a számyaspoxvírus timidin-kináz gén és a 3’-nyitott leolvasási keret közötti intergénrégióba (Scheiflinger és munkatársai 1991).
Mind a HP1.441 FPV vírusok genomiális DNS-ében, mind a vektor f-TK2a törzsben elvégeztük a DNS hasítását Notl-gyel (2.1 ábra). A HP1.441 virulens FPV törzsből származik csirkeembrió-fibroblasztokba való sorozatos átoltással végrehajtott gyengítéssel. A HP1.441 a HP 1 441. átoltása, és ezt számyashimlő elleni vakcina törzsként alkalmazzák (Mayr és Malicki 1966), ez a törzs képes sejttenyészetekben gyorsan replikálódni.
A HP1.441-ből származó DNS-t összehasonlító anyagként analizáltuk az FPV vektor f-TK2a törzs vizsgálatára, amely a HP1.441-ból származik. A HP1.441 DNS-ének restrikciós analízise (2.1 ábra, 1. és 2. sáv) azt mutatja, hogy ebben a törzsben nincsen NotI hely. Az f-TK2a vektor DNS Notl-gyel való hasítása két nagy fragmenst eredményez, amelyek mérete mintegy 100 és 200 kb (2.1 ábra, 4. sáv).
Λ gpt-gént expresszáló számyaspoxvírus közvetlen molekuláris szerkesztése
A pN2-gpta plazmidban megszerkesztettünk egy E. coli gpt-gént tartalmazó génexpressziós kazettamodellt, melyben a gpt-gén NotI helyekkel határolt korai/késői poxvírus promoter szabályozása alatt áll (1.3 ábra).
Az f-TK2a vektorba való klónozáshoz a gpt-génkazettát a plazmidjából kivágtuk, és ligáltuk az Notlgyel hasított f-TK2a genomiális DNS-ével, amint azt a 2.2 ábra mutatja. A ligáit DNS-t számyaspoxvírus helpervírussal fertőzött CEF-sejtekbe transzfektáltuk. A gpt-pozitív plakkokat - amelyek fehérek maradtak az X-Gal-t tartalmazó felső réteg alatt - csirkeembriófibroblasztok fertőzése után Southem-blottal tovább analizáltuk. Izoláltuk az összes celluláris DNS-t és az elválasztott NotI fragmenseket a helper-számyaspoxvírus (HP2) 32P-jelzett DNS-ével és gpt-gén-szekvenciákkal vizsgáltuk Southem-blot-analízissel az 1. példában leírtak szerint. A gpt-gént az 1,1 kb hosszúságú NotI fragmensben tartalmazó gpt-pozitív vírusok azt jelzik, hogy a klónozási lépésben helyes ligálás ment végbe.
Az inzertet mindkét orientációban tartalmazó módosított vírusok előállítása egyetlen lépésben Ebben a példában azt is bemutatjuk, hogyan lehet kinyerni egyetlen közvetlen molekuláris klónozási lépésből olyan vírusokat, amelyek az inzertált génkazettát egyetlen példányban tartalmazzák valamelyik orientációban, illetve olyan vírusokat, amelyek az inzertált gén több példányát tartalmazzák. A DNS-inzert orientációját a vizsgált módosított szárny aspoxvírus-genomokban megfelelő restrikciós enzimekkel hasított DNS-ek Southem-blot-analízisével lehet meghatározni. Amint az a 2.2 ábrán látható, a virális DNS-be inzertált DNS az „a” és „b” orientáció egyikében lehet. A jelen génkazettamodellel az inzertek számának és orientációjának előzetes vizsgálatára például a kiválasztott plakkokkal fertőzött sejtek teljes DNS-ét Clal és NotI restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és 0,8%-os agarózgélen szétválasztjuk. A blotot gpt-gén-próbával és számyaspoxvírus-próbával hibridizáljuk.
A rekombináns vírusok Notl-gyel emésztett DNSmintáiban a gpt-génkazetta 1,1 kb hosszúságú fragmensként hasítódik ki. Azon DNS-ek Clal-gyel való hasítása, amelyek egy inzertet tartalmaznak „a” vagy „b” orientációban, szintén különböző jellegzetes fragmenseket eredményez, amelyek egy gpt-gén-próbával hibridizálnak, amint az a 2.2 ábrán látható szerkezetekből megállapítható.
3. példa
Módosított ortopoxvlrus (vacciniavírus) genomiális
DNS heterológ pakolása avipox (számyaspox) helpervírussal és a rekombinánsok szelektálása ezt kö24
HU 219 369 Β vetően olyan gazdasejtfajtákban, amelyekben a helpervírus nem tud replikálódni A poxvírus-DNS heterológ pakolása - például egy ortopoxvírus-DNS pakolása egy avipoxvírussal - eddig még nem volt ismertetve a szakirodalomban. Ebben a példában bemutatjuk, hogy extracellulárisan módosított vacciniavírus-DNS in vivő pakolható szárnyaspoxvírussal csirkeembrió-fibroblasztokban. A helpervírustól eltérő gazdaspecificitással rendelkező vektorvírus alkalmazása egyszerű és hatékony eljárást biztosít a módosított vírus tisztítására egyetlen plakkvizsgálati lépésben. így a jelen példában a rekombináns ortopoxvírust plakkvizsgálattal nyertük ki emlős (CV-l)-sejtekben, amelyek a helper-avipoxvírus teljes replikációját nem engedik meg. A vektorba inzertált DNS-be egy domináns szelektív marker beépítése elősegíti a szelektív plakkvizsgálati körülmények alkalmazását olyan vírusok kizárására, amelyek a kívánt inzerttől mentes vektor-DNS-t tartalmaznak.
A heterológ pakolási módszer másik előnye, hogy kisebb az esély a vektor- és a helpervírusok közötti rekombinációra. így például az ortopox- és avipoxvírusok különböző génuszokba tartoznak, amelyek különböző morfológiával és replikációs tulajdonságokkal rendelkeznek, és csak minimális szekvenciahomológiát mutatnak, amit standard hibridizációs körülmények között a kereszthibridizáció hiánya bizonyít. Ezért az avipox- és ortopoxvírusok genomjainak homológ rekombinációja nagyon valószínűtlen, és a fenti két vírus alkalmazásával gyakorlatilag elkerülhetők a nem kívánatos rekombinációs események, amelyek gyakran végbemennek a közeli rokon vírusok homológ szekvenciái között [Fenner és Combén, Virology 5, 530-548 (1958); Fenner, Virology 8, 499-507 (1959)]. A pakolás során a vektor- és a helpervírus közötti rekombináció kiküszöbölésének egy másik módja az, hogy rekombinációhiányos vírustörzseket vagy gazdasejteket alkalmazunk.
Ebben a példában egy markergént (poxvírus promoter szabályozása alatt álló E. coli gpt-gént) tartalmazó expressziós kazettamodellt inzertálunk extracellulárisan a vacciniavírus-DNS egyetlen Smal helyére. A virális DNS hasítására alkalmazott fenti restrikciós enzim tompa végeket alakít ki, amelyek előnyösen bármely egyéb, tompa végű hasítást eredményező nukleázzal előállított tompa végű DNS-inzerttel ligálhatók, vagy például egy polimerázt vagy exonukleázt alkalmazhatunk a tompa végek kialakítására egyszálú végekkel rendelkező inzertekből.
A vírus pakolására a módosított genomiális DNS-t számyaspoxvírussal fertőzött gazdasejtekbe transzfektáljuk, amelyekben mind a vacciniavírusok, mind a számyaspoxvírusok képesek replikálódni (csirkeembrió-fibroblasztok). Mivel a helper-számyaspoxvírus gazdaspecificitása madársejtekre korlátozódik, a vacciniavírus-klónokat emlős gazdasejtekben (afrikai zöldmajomvesesejtek, CV-1) szelektáltuk az utódok plakktisztításával a transzfektált sejtekből. A gpt-gén expresszióra való párhuzamos szelektálást alkalmaztunk a csak módosított vacciniavírusok izolálására. A poxvírus rekombinánsok előállítására hagyományosan alkalmazott eljárással szemben - amelyben egyetlen intracelluláris genetikus keresztezésben rendszerint az idegen génnek csak egy példányát tudjuk beilleszteni az egyik orientációban - a jelen példában az egyetlen inzert mindkét lehetséges orientációját, továbbá a génkazetta-modell kettős inszercióját is kimutattuk egyetlen extracelluláris genomiális módosítóreakció termékeiben.
A jelen példa kísérleti eredményei azt mutatják, hogy a ligáit vacciniavírus-DNS-ek helper-számyaspoxvírus általi pakolásának hatékonysága alacsony az intakt vacciniavírus-DNS számyaspoxvírussal való pakolásával összehasonlítva, amelynek hozama 3 napos replikáció után 5x103 - lxlO4 pfu/6 χ 106 csirkeembrió-fibroblaszt. Az egyik pakolási kísérletben (amelyben az F12 plakksorozatot állítjuk elő) a pakolt módosított vírus hozama 9χ102 pfü és egy másik kísérletben (amellyel az F13 sorozatot állítjuk elő) 5xl02 pfu/6xl06 csirkesejt. A fenti, viszonylag kis pakolási gyakoriság egyik oka ezekben a kísérletekben az, hogy hiányzik a vektor-DNS-karok defoszforilezéses kezelése, és ezért ezek képesek inzertek nélkül is újraligálódni. A fenti kezelést azért mellőztük, mivel a tompa végű DNS-fragmensek defoszforilezése rendszerint nem kielégítő. Ezt a problémát ragadós végű, többszörös hasítási hellyel rendelkező gazdavírus törzsek szerkesztésével küszöbölhetjük ki, amelyek nem képesek az irányított kényszerített klónozásra, ezáltal az idegen DNS-fragmensek inszerciója sokkal hatékonyabb.
A pakolás hatékonyságát befolyásoló másik faktor az a helper- és a pakolt vírus közötti interferencia celluláris szinten. Standard pakolókörülmények között 3 napos inkubáció alatt a helpervírus (számyaspoxvírus) rendszerint mintegy lxlO8 pfu/6 χ 106 csirkeembrió-fibroblaszt titerre replikálódik. A számyaspoxvírus nagy feleslege a pakolt vacciniavírushoz képest olyan feltételeket teremt, amelyek negatív interferenciajelenséget produkálnak, és gátolják a pakolt vírus replikációját.
Ezt az interferenciát minimálisra csökkenthetjük, ha a pakolásra emlőssejteket használunk helper-számyaspoxvírussal kombinációban a 7. példában leírtak szerint. Ebben az esetben a gazdasejtek nem segítik elő a segítő számyaspoxvírus teljes replikációját. Noha a ligáit vacciniavírus-DNS számyaspoxvírus általi pakolási hatékonyságát nem vizsgáltuk emlős gazdasejtben, nem hasított vacciniavírus-DNS-sel a pakolás hozama 2 χ 106 pfu/8 χ ΙΟ5 emiős (CV- l)-sejt volt.
Az egyes virális rekombinánsokban - amelyeket egy adott inszerciós plazmid intracelluláris rekombinációjával állítunk elő - az inzertnek egy orientációja van a homológ határoló-régió polaritásától függően a plazmidban. A transzkripciós interferenciajelenség következtében [például (Ink és Pickup 1989)] az egy poxvírusvektorba inzertált gének expressziós szintje az idegen gén virális genomhoz viszonyított orientációjától függ. Ezért előnyös, hogyha egyetlen reakciólépésben elő tudunk állítani olyan vírusokat, amelyek mindkét lehetséges orientációval rendelkeznek. Az e példában ismertetett eljárás egyik előnye, hogy egyetlen
HU 219 369 Β ligálási reakcióban előállítjuk az inzertált DNS mindkét lehetséges orientációját, ezáltal azonnal kiszűrhetjük azokat a variánsokat, amelyek a legnagyobb expreszsziós szinttel rendelkeznek. Ebben a példában a kazetta előnyös orientációja a vacciniavírus választott Smal inszerciós helyén a „b” orientáció, amit az a tény bizonyít, hogy a módosított vírusok többsége ezzel a genomiális szerkezettel rendelkezik. Ebben a kazettában az idegen gént szabályozó P7,5 promoter invertált ismétlődő orientációban van az endogén 7,5 kD polipeptidgénhez viszonyítva. Amint az 1. példában említettük, az endogén 7,5 kD méretű polipeptidgének a vacciniavírus-genom invertált terminális ismétlődéseiben lokalizálódnak. A gpt-gén P7,5 promoterének és a bal terminális ismétlődésben lévő P7,5 promotemek a távolsága mintegy 20 kb. Ezért az „a” orientációnak kevésbé stabilnak kell lennie, és ezért kisebb gyakorisággal keletkezik, összhangban azzal a megfigyeléssel, hogy ezt az orientációt csak két esetben tudtuk kimutatni. Azonban az FI3.4 vírusizolátumot („a” orientáció) és a vF12.5 vírusizolátumot („b” orientáció) gptszelektálással nagy léptékben szaporítottuk, és azt találtuk, hogy stabil, előre várt szerkezettel rendelkeznek. A többszörös inzertet tartalmazó különböző szerkezetek szelekció nélküli stabilitását még ezután kell meghatározni.
A ligációs elegyek többszörös feleslegben tartalmazták az inzertet a vektorhoz képest, ezáltal a megfigyelések szerint előtérbe került a kazetta több példányának inszerciója. Azonban az nem világos, hogy ebben a példában miért találtunk gyakrabban kettős inszerciót, mint az 1. példában. A belső rekombinációs események következtében csak bizonyos többszörös inzertkonfigurációk lesznek várhatóan stabilak. További tanulmányokat kell végezni a többszörös inzertet tartalmazó vírusok stabilitásának kiértékelésére, és az optimális vektor: inzert arány meghatározására a megfelelő stabilitás és expressziószint biztosítására, ami az inzert példányszámától függ, és minden egyes termék esetén meghatározásra szorul a találmány értelmében.
Vírus és DNS tisztítása
Az 1. és 2. példában ismertetett eljárásokat és vírusokat alkalmaztuk.
Vírus-DNS módosítása
A virionokból tisztított vírus-DNS-t Smal-gyel hasítjuk, és egy fenolos és három kloroformos extrahálással tisztítjuk. Az alábbi első kísérletsorozatban 2 pg hasított vírus-DNS-t ligálunk 400 ng (34-szeres mólfelesleg) inszerciós ffagmenssel (a pTKgpt-Fls plazmidból kivágott 1,1 kb hosszúságú Hpal-Dral fragmens) 30 μΐ térfogatban 40 órán keresztül 15 egység T4 ligázzal (Boehringer, Inc.). A második ligációs kísérletet ugyanilyen körülmények között végezzük, azzal az eltéréssel, hogy az 1,1 kb hosszúságú Smal inzertet 17-szeres mólfeleslegben alkalmazzuk, és 5 egység ligázt használunk.
In vivő heterológ pakolás madársejtekben
6xl06 csirkeembrió-fibroblasztot 0,5 pfu/sejt HP 1.441 helpervírussal fertőzünk, és 2 órán keresztül inkubáljuk. 2 pg ligáit DNS-t transzfektálunk a fertőzött sejtekbe, és az 1. példában a homológ pakolásra ismertetett eljárás szerint kezeljük tovább. Az első plakkvizsgálatot CV-1 -sejtekben végezzük az 1. példában leírtak szerint.
Módosított vacciniavírus-DNS helper-számyaspoxvírussal való pakolásának bizonyítása A kísérleti elrendezés a 3.1 ábrán látható. A vacciniavírus genomiális DNS-t szacharóz gradiensen tisztított virionokból állítjuk elő, Smal restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és tompa végű idegen génkazettával ligáljuk. A ligáit DNS-t számyaspoxvírussal fertőzött csirkeembrió-fibroblasztokba transzfektáljuk pakoláshoz. Az utódvírust plakkvizsgálattal azonosítjuk emlős (CV-l)-sejtekben, amelyek nem segítik elő a számyaspoxvírus teljes replikációját, hogy fertőző virionokat képezzenek.
Az eljárást részletesebben az alábbiakban ismertetjük. Első lépésben a pTKgpt-Fls plazmidból (Falkner és Moss, 1988) kivágjuk a vacciniavírus P7,5 promoter által szabályozott gpt-gént tartalmazó génkazetta-modellt hordozó Hpal-Dral fragmenst, és közvetlenül ligáljuk a vad típusú vacciniavírus (WR-törzs) egyetlen Smal helyére. A gpt-gént azért választottuk, hogy lehetővé tegye a módosított vírusok pozitív szelekcióját (Boyle és Coupar, 1988; Falkner és Moss, 1988). A vacciniavírus-DNS-ben az egyetlen Smal hely a genom HindlII A fragmensében, az A51R nyitott leolvasási keretben lokalizálódik. Az A51R gén nem esszenciális a virális replikációhoz sejttenyészetben (Goebel és munkatársai, 1990).
A ligáit anyagot helper-számyaspoxvírussal fertőzött csirkeembrió-fibroblasztokba transzfektáljuk. 3 nap elteltével a sejteket összegyűjtjük, és előállítjuk a nyersvírus törzsszuszpenziót. A pakolt vacciniavírust plakkvizsgálattal azonosítjuk afrikai zöldmajomvesesejt-vonalban (CV-1) olyan tápközegben, amely lehetővé teszi a gpt-gént hordozó vírussal fertőzött sejtek szelektálását. Ezzel a szelekciós módszerrel megakadályozzuk az önmagával ligáit vad típusú vacciniavírusDNS-t tartalmazó vírusok plakk-képzését, és elősegítjük az inzertált gpt-génkazetta modellt tartalmazó módosított vírusok plakk-képzését.
A kezdeti kísérletekben a pakolás gyakorisága kicsi volt. A gpt-pozitív vacciniavírus titere a 6χ 106 csirkeembrió-fibroblasztból előállított nyerstörzs szuszpenzióban lxl02 - lxl03pfu volt.
gpt-pozitív plakkot szaporítottunk gpt-szelekciós körülmények között CV-1-sejtben. Izoláltuk a fertőzött sejtek összes DNS-ét, HindlII-mal emésztettük, 0,7%-os agarózgélen szétválasztottuk, és gpt-gén-próbával Southem-blot-analízissel analizáltuk. A 3.2 ábrán látható, hogy számos vírust kaptunk, amely a különböző módosított genomiális szerkezetekre előre várható képet mutatja.
A 2., 4., 11. és 13. sávban (az F12.3, F12.5, F13.3 és F13.5 plakkoknak felel meg) mintegy 45 kb hosszúságú hibridizáló fragmens látható, amely akkor várható, ha a génkazetta egyetlen példányban van inzertálva a vírusgenomba „b” orientációban (lásd a 3.3 ábrát). Egy előre várt új, 5,2 kb hosszúságú fragmens is jelen
HU 219 369 Β van minden esetben, amelyek akkor is láthatók, hogy ha ugyanezeket a DNS-eket vacciniavírus-próbával vizsgáljuk a 3.2 ábrán bemutatott módon.
Két „a” orientációnak megfelelő képpel rendelkező vírust találtunk a 7. és 12. sávban (az F12.8 és F13.4 számú plakknak felel meg), ahol egyetlen gpt-vel hibridizáló, mintegy 5,7 kb hosszúságú fragmenst vártunk. A 7. sávban az 5,7 kb hosszúságú fragmens jobban látszik az autoradiográf hosszabb expozíciója esetében. Az 5. sávban látható kép (F12.6 plakk) „a” orientációban lévő egyetlen inzertet jelenthet, de a várt 5,7 kb hosszúságú sáv valamivel nagyobb ismeretlen okok miatt.
virusizolátum mutat „a” orientációjú tandem inszerciónak megfelelő képet (1., 6. és 10. sáv, amelyek az F12.2, F12.7 és F13.2 plakkoknak felelnek meg). Ezekben az esetekben két gpt-pozitiv hibridizáló fragmens várható, amelyek 5,7, illetve 1,1 kb hosszúságúak (lásd még a 3.3 ábrát). Az 5,7 és 1,1 kb hosszúságú fragmensek a vírus-DNS ekvivalens mennyiségei esetében vacciniavírus-próbával hibridizált blotban is megfigyelhetők.
A 3. sávban lévő izolátum genomja (F12.4 plakk) valószínűleg egy tandem kettős inzertet tartalmaz „b” orientációban. Ebben az esetben két fragmens, egy 45 kb és egy 1,1 kb hosszúságú fragmens fog várhatóan hibridizálni a gpt-génnel.
A 9. sávban lévő vírus-DNS (F13.1 plakk) egy fejfej kettős inszerciót tartalmazhat. Ebben az esetben várhatólag egy 45 kb és egy 5,7 kb hosszúságú fragmens fog hibridizálni a gpt-gén-próbával. Azonban ezenkívül az ilyen DNS-ben kell lennie egy új, 0,6 kb hosszúságú fragmensnek is, amely vaccinia-DNS-próbával hibridizál, és ténylegesen ezt a fragmenst ki is mutattuk a vacciniapróbával hibridizált blotban. Azonban a várt 5,7 kb hosszúságú fragmens valamivel kisebb volt, mint az előre megjósolt, és a vártnál gyengébb hibridizációs jelet produkált. Ezért ezen rekombináns szerkezetének megerősítése még részletesebb analízist igényel.
A további analízissel kiderítettük, hogy az F12.7 és F12.3 vírusok, amelyeket fent mint „a” konfigurációjú kettős tandem inszerciót tartalmazó vírusokat és az F12.4 vírus, amelyet mint „b” szerkezetű kettős tandem inszerciót tartalmazó vírust jellemeztünk, valójában több tandem inzertet tartalmaznak „a”, illetve „b” orientációban. A 3.2 ábrán látható Southem-blot-analízis nem tesz különbséget a kettős tandem és a többszörös tandem inzertek között.
4. példa
Irányított mesterklónozóhellyel rendelkező ortopoxvírus (vacciniavírus) vektor (vdTR) és kompatibilis expressziós kazettával rendelkező plazmidok szerkesztése
Ebben a példában mutatjuk be a találmány szerinti eljárások alkalmazását új poxvírusklónozó vektorok előállítására a meglévő poxvírusgenomok direkt molekuláris módosításával és klónozásával. Közelebbről ebben a példában egy olyan vacciniavírus-vektort (vdTK) ismertetünk, amely lehetővé teszi idegen gének irányított inszercióját (azaz kényszerített klónozását) egy rövid, többszörös klónozóhelyet tartalmazó szegmensbe, amely különböző olyan endonukleáz hasítási helyeket tartalmaz, amelyek mindegyike egyedi a vektorgenomban. A kényszerített klónozással feleslegessé válnak a szelekciós vagy szűrővizsgálatok a kívánt rekombinánsok megkülönböztetésére az inzertet nem tartalmazó vektorvírustól, mivel a különböző nukleázokkal hasított DNS-végek inkompatibilitása lehetetlenné teszi az idegen inzertet nem tartalmazó vektorkarok újbóli ligálását. Ennek következtében a kényszerített klónozási módszer a leghatékonyabb módja idegen gének virális vektorba való inzertálására.
Az irányított vdTK vektort úgy állítjuk elő, hogy egy egyedi NotI, Smal, Apai és RsrII helyet tartalmazó többszörös klónozóhelyet inzertálunk a vacciniavírus timidin-kináz (tk)-génjének helyére (lásd 4.1 A ábra). Ez a nem esszenciális lokusz az a hely, amelyet leggyakrabban alkalmaznak idegen gének vacciniavírusba való inzertálására, főleg azért, mert a tk-negatív vírusok pozitívan szelektálhatok. így ha a ligáit vdTK vektor-DNS-t egy tk-pozitív helpervírussal pakoljuk, a vektorvírust pozitívan szelektálhatjuk a helpervírus feleslegétől. Ezenkívül az idegen DNS-vacciniavirus tk-lokuszába való inzertálása hagyományos módszerekkel rendszerint stabil rekombinánsokat eredményez.
Az új vdTK vektor többszörös klónozóhelye NotI és Smal hasítási helyet tartalmaz, amelyek a vektorban egyetlenek. A többszörös klónozóhely inzertálása előtt a vad típusú vacciniavírusban (WR-törzs) eredetileg jelen lévő NotI és Smal hasítási helyeket a találmány szerinti közvetlen molekuláris módosítással töröljük. A kívánt módosításokkal rendelkező vírusokat olyan szűrővizsgálati módszerekkel detektáljuk, amelyek a specifikus nukleinsavszekvenciák megsokszorozására alkalmazott polimeráz láncreakciós (PCR) módszeren alapulnak.
A példában egy sor olyan plazmidot is ismertetünk, amelyek elősegítik a vdTK vacciniavektorban lévő teljes vagy részleges nyitott leolvasási kereteket kódoló DNS-ek expresszióját. A találmány magában foglalja a nyitott leolvasási keretek közvetlen inszercióját egy poxvírus expressziós vektorba, amely minden megfelelő szabályozóelemmel rendelkezik megfelelő elrendezésben az inzertált nyitott leolvasási keret expresziójára. Azonban a jelen vdTK vektorban nincsenek jelen ilyen regulátorszekvenciák egy olyan inzertált nyitott leolvasási keret expressziójára, amelyből hiányoznak a saját transzkripciós és transzlációs jelek. Ennek megfelelően a példa szerinti plazmidok célszerű génexpreszsziós kazettákat jelentenek nyitott leolvasási keretek rutinszerű kötésére poxvírus promoterekhez és adott esetben egy transzlációs startkodonhoz. A nyitott leolvasási keretet és a hozzá kapcsolt szabályozószekvenciákat ezután irányított klónozással hatékonyan bevihetjük a vdTK vektor mesterklónozóhelyére. Az inzertet a két orientáció bármelyikében tartalmazó módosított vírusokat két plazmid egyikét alkalmazva állíthatjuk elő, amelyek az expressziós kazettát a kívánt orientációban tartalmazzák mesterklónozóhelyükön. A példában bemuta27
HU 219 369 Β tott plazmidok génexpressziós kazettái két beépített restrikciós enzim hasítási hely sorozatot tartalmaznak a nyitott leolvasási keretek klónozásának elősegítésére a vdTK vektorban. A kazetták olyan mesterklónozóhelylyel rendelkeznek, amelyek ugyanazon egyedi hasítási helyeket tartalmazzák, mint a vdTK vektor mesterklónozóhelye. Ezenkívül a fenti mesterklónozóhely közepén a kazetták számos gyakori hasító enzim helyet tartalmaznak, amely nyitott leolvasási keretek kazettákba való inzertálására alkalmas. Ennek megfelelően azok a DNS-ek, amelyeket a kazettába gyakori hasító helyek segítségével inzertáltunk, mindkét oldalukon néhány különböző egyedi hasítási hellyel vannak határolva, amelyek alkalmasak a kazetta irányított klónozására a vdTK vektor mesterklónozóhelyére.
Ebben a példában ismertetünk olyan génexpreszsziós kazettákat is, amelyek alkalmasak egyetlen egyedi hasítási hely inzertálására a vdTK vacciniavírus-vektorba. A vektor-DNS hasítására egyetlen enzim alkalmazásából adódó csökkent klónozási hatékonyság kiküszöbölésére ezeknek a plazmidoknak az expressziós kazettái szelektív markerként egy E. coli gpt-gént tartalmaznak.
A vdTK vacciniavektor-rendszert előnyösen a 3. és 7. példában ismertetett heterológ pakolási eljárással összekapcsolva alkalmazzuk. A gpt-markert tartalmazó plazmidok gpt-markergén nélküli homológ helpervírusokkal is alkalmazhatók. A polipeptidek expressziójára vdTK vektort és rokon plazmid rendszereket alkalmazó szerkezetekre példákat az 5. példában ismertetünk.
A fenti előnyökön kívül a találmány szerinti expressziós kazetta plazmidok alkalmasak azon általános probléma megszüntetésére is, amelyek a hasított poxvírusvektor-DNS-ek végei és több inzert DNS közötti inkompatibilitásból adódnak célszerű lehetőségként a szokásos szintetikus adapter DNS-szegmensek alkalmazása helyett. így a nyitott leolvasási kereteket kódoló DNS-fragmensek izolálását rendszerint megkönnyíti olyan restrikciós endonukleázok alkalmazása, amelyek rövid és ennek következtében minden természetes DNS-szekvenciában nagy gyakorisággal előforduló felismerőszekvenciákkal rendelkeznek. Másrészről az ilyen gyakori hasító enzimek rendszerint nem alkalmasak az olyan nagy genomokba való közvetlen klónozásra, mint a poxvírusok genomja, például azért, mert az ilyen enzimek a nagy DNS-eket több fragmensre hasítják. Ezen fragmensek újraligálása statisztikusan megy végbe, és ezáltal kevés intakt virális genom keletkezik. Ezért egy vacciniavektorban az inszerciós helyek előnyösen a nem gyakori hasító restrikciós endonukleázok hasítási helyei, amelyeket általában nem alkalmaznak nyitott leolvasási keret fragmensek vagy DNS-inzertek izolálására. A találmány szerinti plazmidokban úgy küszöböljük ki ezt az általános inkompatibilitást, hogy a gyakori hasító enzimekkel kapott fragmensek hatékony inszercióját lehetővé tesszük a plazmidban, majd nem gyakori hasító enzimek alkalmazásával hatékony transzfert biztosítunk a vacciniavektorba.
Egyetlen NotI hasítási hely törlése vad típusú vaccinia (WR)-vírusból
A vacciniavírus egyetlen NotI helyét úgy eliminálhatjuk, hogy erre a helyre inzertálunk egy „NotI deléciós adapter” szegmenst, amely az Notl-gyel hasított DNS-sel való ligálás céljára kompatibilis végekkel rendelkezik, de nincsenek benne olyan szekvenciák, amelyek az NotI endonukleáz általi felismeréshez szükségesek. Ezért azok a szekvenciák, amelyek az Notl-gyel hasított vírus-DNS és a vírus-DNS és az adapter ragadós végeinek ligálásával keletkeznek, nem hasíthatok Notlgyel. Ez az adapter több választott restrikciós endonukleáz hasítási helyet is tartalmaz a DNS-fragmensek irányított inszerciójához.
Közelebbről úgy járunk el, hogy 1 pg vad típusú (WR) vacciniavírus-DNS-t Notl-gyel hasítunk, és 1 pg kettős szálú NotI deléciós adapterral ligáljuk. Az adapter két részlegesen komplementer szárból áll: odNl (16. azonosítási számú szekvencia) és odN2 (23. azonosítási számú szekvencia). Az adapter központi része tartalmazza az Stul, Dral, Sspl és EcoRV restrikciós endonukleáz hasítási helyeket. A ligációs reakcióhoz illesztett adapter oligonukleotidokat alkalmazunk. A ligáit anyagot számyaspoxvírussal fertőzött csirkeembrió-fibroblasztokba transzferáljuk, és a 3. példában leírtak szerint pakoljuk.
A vacciniavírus (WR-törzs) egyetlen NotI helyének törlésére egy másik eljárást a 4.1 ábra B részében ismertetünk. Első lépésben a vacciniavírus-DNS-t Satl-gyel hasítjuk, az Satl „I” fragmenst izoláljuk az alacsony olvadáspontú agarózból, és egy megfelelő plazmid, például a pTZ19R (beszerezhető a Pharmacia, Inc.-től) SacI helyére klónozzuk. A kapott pTZ-SacI plazmidot Notl-gyel hasítjuk, Klenow-polimerázzal kezeljük a ragadós végek betöltésére, és újraligáljuk. A ligáit anyagot E. coli sejtekbe (HB101) transzferáljuk. A telepeket standard rónozóeljárásokkal izoláljuk. A kapott pTZ-SaeldN plazmidból hiányzik az NotI hely, és ezt alkalmazzuk egy reverz gpt-szelekciós kísérletben Isaacs, S. N., Kotwal, G. és Moss B. módszere szerint [Virology 178, 626-630 (1990)] az alábbi módosításokkal.
8xl06 CV-1-sejtet 0,2 pfu vp7 vírusizolátummal (vacciniavírus, amely az egyetlen NotI helyre beépítve egy gpt-génkazettát tartalmaz, lásd az 1. példát) fertőzünk, ezt követően a sejteket pTZ-SaeldN plazmidból előállított módosított SacI fragmensből származó 20 pg DNS-t tartalmazó kalcium-foszfátos precipitátummal transzferáljuk. A sejteket ezután az 1. példában ismertetett pakolóeljárással kezeljük. A nyersvírus törzsszuszpenziókat használjuk STO egérsejtek (American Type Culture Collection, Rockville, MD; ATCC CRL 1503) fertőzésére 6-tioguanin (6-TG) jelenlétében. Ez egy negatív szelekciós eljárás, amelyben a vírus replikációjához a gpt-gén hiánya szükséges (Isaacs és munkatársai, 1990), és ezért a jelen esetben a módosított SacI „I” fragmens integrálódásához és ezáltal a gpt-gén deléciójához vezet. Azok a plakkok, amelyek 6-TG jelenlétében szaporodnak, szükségszerűen nem tartalmaznak gpt-gént, és módosított SacI I fragmenst tartalmaznak. A becsült hozam az összes plakkok mintegy 0,1 - 0,2%-a (vagyis azonos az ilyen típusú marker mentési kísérle28
HU 219 369 Β tekben a rekombinánsok normális gyakoriságával). Mivel a szelekciós eljárás igen hatékony (Isaacs és munkatársai, 1990), a helyes szerkezetek azonosításához várhatólag nem szükséges nagyszámú klón átvizsgálása. A kívánt szerkezet felismerésére az alábbi szűrővizsgálatot alkalmazzuk függetlenül attól, hogy a vacciniavirus egyetlen NotI helyének törlésére a fent ismertetett két eljárás közül melyiket alkalmaztuk.
NotI hely hiányos vírus (vdN) azonosítása PCR-szűrővizsgálattal
Azokat a vacciniavírus-klónokat, amelyekből az NotI helyet töröltük, CV-l-sejtekben szaporodó plakkok analízisével azonosíthatjuk, amely sejtvonal nem engedi meg a helper-számyaspoxvírus szaporodását. Egyes plakkokban a vírusok DNS-ét PCR alapú szűrővizsgálati módszerrel analizáljuk az alábbiak szerint.
A PCR-reakcióhoz az első primer az odNl oligonukleotid (16. azonosítási számú frekvencia), a második primer az odN3 (24. azonosítási számú frekvencia). A második primer szekvenciája a vacciniavírus-genomban mintegy 770 bp-vel az első primer szekvencia után (5'-irányban) helyezkedik el. A templát az egyetlen plakknyi vírus felével fertőzött lxlO6 CV-1-sejtből származó összes DNS. A DNS-t standard módszerrel állítjuk elő, és mintegy 50 ng-ot alkalmazunk a PCRreakcióban. A PCR-reakciókat szokásos módon hajtjuk végre kereskedelmi forgalomban kapható PCR készletek alkalmazásával. Pozitív PCR-reakciókkal egy mintegy 770 bp hosszúságú DNS-fragmenst kapunk. Azt a vírust, amelyből az NotI helyet delécióval töröltük, vdN-nek nevezzük.
Egyetlen Smal restrikciós hely deléciója vdN vacciniavlrusból
A vacciniavírus WR-törzs egyetlen Smal helyet tartalmaz egy nyitott leolvasási keretben (A51R), amely a vírus sejttenyészetben való replikációjához nem esszenciális (Goebel és munkatársai, 1990). Noha ez a hely alkalmas idegen gén inszerciójára, a jelen példában azonban ezt a helyet töröltük annak érdekében, hogy egy többszörös klónozóhely kazettarészeként egy új, egyetlen Smal hely bevezetésével sokoldalúbb vacciniavírusvektort állítsunk elő.
A fentieknek megfelelően 1 pg vdN vírus-DNS-t Smal-gyel hasítunk, és a HindlII restrikciós nukleáz felismerőszekvenciáját (odSl, 5’-AAGCTT-3’) tartalmazó hexamer linker feleslegével ligáljuk. Ezen linker inszerciója a vacciniavírus Smal hasítási helyére szétrombolja az Smal felismerőszekvenciát, és egy új, HindlII felismerőszekvencia kialakulását eredményezi. A ligáit anyagot számyaspoxvírussal fertőzött CV-1 sejtekbe való transzfekcióval pakoljuk a 7. példában leírtak szerint.
A vacciniavírus (WR-törzs) egyetlen Smal helyét a
4.1 ábra C részében ismertetett eljárással is törölhetjük oly módon, hogy a vacciniavírus-DNS klónozott fragmensét módosítjuk ahelyett, hogy a teljes vacciniavírus-DNS-t közvetlenül módosítanánk. Első lépésben a vacciniavírus-DNS-t Sall-gyel hasítjuk, a Sáli F-fragmenst izoláljuk alacsony olvadáspontú agarózból, és egy megfelelő plazmid, például a pTZ9R (Pharmacia,
Inc.) Sáli helyére klónozzuk. A kapott pTZ-SalF plazmid két Smal helyet tartalmaz, amelyek közül az egyik a többszörös klónozóhelyen van, és a másik a vacciniaszekvenciában (4.1 ábra C része). A pTZ-SalF-et részlegesen emésztjük Smal-gyel, és I-Scel linkereket adunk hozzá az alábbiak szerint: első szál, I-Scel 1. linker (25. azonosítási számú szekvencia) és ennek komplementer szála az I-Scel 2. linker (26. azonosítási számú szekvencia). A helyes plazmidot - amelyben a vacciniaszekvenciákból az Smal helyet delécióval töröltük - Smal-gyel és I-Scel-gyel való hasítással azonosítjuk. A termékplazmidot, a pTZ-SalFdS-t alkalmazzuk az Smal deléció bevitelére vacciniavírus-genomba, reverz gpt-génszelekciót alkalmazva, amint azt az NotI hely deléciójára leírtuk, azzal az eltéréssel, hogy módosítandó előnyös vírusként az FI2,5 izolátumot alkalmazzuk, amely egy olyan vírus, amelyben az egyetlen Smal helyre egy gpt-génkazetta van beépítve (lásd a 3. példát).
Az I-Scel endonukleáz hasítási hely így kapott inszerciója közvetlen molekuláris klónozásra előnyös, mivel ez az élesztőből izolált enzim egy 18mer helyet ismer fel, ezért a statisztikus DNS-szekvenciákat rendkívül kis gyakorisággal hasítja. így például az I-Scel az élesztógenomot csak egyszer hasítja [Thieiry, A., Perrin, A., Boyer, J., Fairhead, C., Dujon, B., Frey, B. és Schmitz, G., Nucleic Acids Rés. 19, 189-190 (1991)]. Az I-Scel kereskedelmi forgalomban kapható (Boehringer, Inc.). Egy I-Scel hely bevezetése egy olyan vektorba, amelyben azt megelőzően nincsen ilyen hely, olyan új vektort eredményez, amelyben van egy géninszercióra alkalmas egyedi hasítási hely. Azt, hogy egy vacciniavírus-DNS vagy más vektor-DNS tartalmaz-e egy I-Scel hasítási helyet, a vektor-DNS szokásos restrikciós analízisével határozhatjuk meg.
Ha az Smal hely vacciniavírus-DNS-ből való törlésére ezt a második eljárást alkalmazzuk, a vdTK vektor szerkesztésének műveleti sorrendje az alábbi: vdS vírus előállítása az Smal hely deléciójával (lásd fent); NotI hely deléciója az NotI gpt-génkazetta inszerciójával (lásd az 1. példát) a vdS egyetlen NotI helyére való klónozással és pakolás, az így kapott vdSNgpt vírus reverz gpt-szelekciója a fent ismertetett módon, vdSNgpt és pTZ-SaeldN mint szubsztrát alkalmazásával a marker mentési kísérletben; és a tk-gén deléciója, amint azt a jelen példában alább ismertetjük.
A vdTK vektort valójában egy másik módszerrel is előállítottuk, amelyet az alábbiakban ismertetünk. A vad típusú vacciniavírus Smal helyének deléciójával előállítottuk a köztes vdS vírust. Egy második kísérletben vad típusú vacciniavírusból töröltük az NotI helyet, és így előállítottuk a köztitermék vdN vírust. A CV-1 sejteket mindkét vírussal együtt fertőzve, és a rekombináns vírust PCR-módszerrel szűrve kaptuk a vdSN vírust (ezt a vírust egyetlen genetikus keresztezési esemény eredményeként kaptuk). A különböző köztitermékek életképességét titrálással határoztuk meg.
A vdN klónozókísérletből kapott egyes izolátumokat ötször plakktisztítottuk (ezáltal biztosítottuk a kapott kiónok vad típusú vírustól való mentességét), majd elsza29
HU 219 369 Β porítottuk, az eredményeket a 4.1 táblázat A része mutatja. Titrálás után az első elszaporítással nyert nyersvírus törzsszuszpenziókat a vad típusú kontrollal (WR-WT) együtt alkalmaztuk CV-l-sejtek fertőzésére 0,1 pfú/sejt mennyiségben. Ezeket a sejteket 48 óra múlva összegyűjtöttük, és az így nyert nyers törzsszuszpenziókat újratitráltuk. Ezeket az eredményeket a 4.1 táblázat B része tartalmazza. A vdN/Al 6.1111 és vdN/Al 10.1111 izolátumokat vdN6, illetve vdNIO kiónnak neveztük, és ezeket alkalmaztuk nagy léptékű vírustenyésztéshez.
4.1 táblázat vdN vírus köztitermék életképességének vizsgálata
A) 6 vdN virusizolátum titere első szaporítás után (pfu/ml nyers törzstenyészet)
vdN/Al 2.1111 1,0 χ 107 pfú/ml
vdN/Al 4.1111 1,3 xlO8 píú/ml
vdN/Al 6.1111 9,0 χ 107 pfu/ml
vdN/Al 8.1111 8,0 χ 107 pfú/ml
vdN/Al 10.1111 4,0 χ 107 pfú/ml
vdN/Al 12.1111 1,1 χ 108 pfú/ml
B) Titer a második szaporítás után
vdN/Al 2.1111 3,6 χ 108 pfú/ml
vdN/Al 4.1111 2,5 χ 108 pfú/ml
vdN/Al 6.1111 5,9 xlO8 pfú/ml
vdN/Al 8.1111 4,2 χ 108 pfú/ml
vdN/Al 10.1111 4,3 χ 108 pfú/ml
vdN/Al 12.1111 2,2 xlO8 pfu/ml
WR-WT 5,4 χ 108 pfú/ml
A vdS klónozókísérletből nyert egyes izok
ötször plakktisztítottuk, majd szaporítottuk és titráltuk, az eredményeket a 4.2 táblázat A része mutatja. Az első szaporítással kapott nyerstenyészeteket a vad típusú kontrollal (WR-WT) együtt alkalmaztuk CV-l-sejtek fertőzésére 0,1 pfú/sejt mennyiségben. A sejteket 48 óra múlva összegyűjtjük, és a kapott nyerstenyészeteket újratitráljuk. Ezek az eredmények a 4.2 táblázat B részében láthatók. A vdS 7.11 izolátumot vdS2, illetve vdS7 kiónnak neveztük, és ezeket alkalmaztuk a nagy léptékű víruspreparátumok előállítására. Minden esetben a legjobb szaporodási tulajdonságokat mutató vírusizolátumot választottuk ki a szaporításra és a nagy léptékű tenyésztésre.
4.2 táblázat vdS vírus köztitermékek életképességének vizsgálata A) 5 vdS virusizolátum titere első szaporítás után (pfú/ml nyers törzstenyészet)
vds 2.11 4,1 χ 107 pfú/ml
vds 3.11 6,5 xlO7 pfú/ml
vds 4.11 8,0 χ 107 pfú/ml
vds 5.11 2,7 xlO7 pfú/ml
vds 7.11 4,7 xlO7 pfú/ml
B) Titer a második szaporítás után
vds 2.11 1,6 χ 108 pfu/ml
vds 3.11 1,4 χ 108 pfú/ml
vds 4.11 8,0 χ 107 pfú/ml
vds 5.11 1,3 xlO8 pfu/ml
vds 7.11 1,7 xlO8 pfú/ml
WR-WT 2,8 xlO8 pfú/ml
Smal hely deléciót tartalmazó vírus (vdSN) azonosítása PCR szűréssel
Az Smal hely deléciót tartalmazó vdSN vacciniavírus-klónokat az alábbiak szerint azonosítottuk PCRszürővizsgálattal.
A PCR-reakcióban első primerként az odS2 oligonukleotidot (27. azonosítási számú szekvencia), második primerként az odS3 oligonukleotidot (28. azonosítási számú szekvencia) alkalmaztuk. Az odS2 oligonukleotidszekvencia a vacciniavírus-genomban mintegy 340 bázispárral az Smal hely előtt (3’-irányban) lokalizálódik, míg az odS3 oligonukleotidszekvencia mintegy 340 bázispárral ezen hely után (5’-irányban) helyezkedik el. Templátként egy vírusplakkal - a fentiekben a vdN azonosítására ismertetett módon - fertőzött CV-l-sejtek összes DNS-e szolgált. A mintegy 680 bp hosszúságú PCR-rel felerősített sáv Smal-gyel szembeni érzékenységét megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy az Smal hasítással szemben ellenálló, jelezvén a HindllI vagy I-Scel linker inszercióját, míg a vad típusú kontroll-DNS két, mintegy 340 bp hosszúságú darabra hasítódik. A kívánt linkért az Smal helyen inzertálva tartalmazó egyik vacciniavírust vdSN-nek nevezzük.
Timidin-kináz-gén kódolórégiójának deléciója vdSN vacciniavírusból
A vdSN vacciniavírusból egy új vektor törzset (neve vdTK) állítottunk elő azáltal, hogy a vacciniagenom genetikusán stabil régiójában lokalizálódó timidin-kináz (tk) gént egy több egyedi restrikciós endonukleáz hasítási helyet tartalmazó szegmenssel helyettesítettük (4.1 A ábra).
A timidin-kináz (tk) kódoló szekvenciát töröljük először a tk-gént tartalmazó vacciniagenom-szegmenst (HindllI J szegmens) magában foglaló plazmidból (pHindJ-1) (lásd a 4.2 ábrát). A tk-gén helyére ezután egy többszörös klónozóhelyet inzertálunk, amely egyetlen NotI, Smal, Apai és Rsrll helyet tartalmaz Sfíl helyekkel határolva. Végül a módosított vírusszegmenst vdSN vacciniavírus-genomba visszük be, amelyet ezután vdTK-nak nevezünk (4.1 A ábra). A kényszerített klónozás további elősegítésére a vektorban a két Sfil hely mindegyikét egyedivé tesszük, az Sfil felismerőszekvencia (GGCCNNNN’NGGCC) variálható természetét felhasználva. A két Sfil hely szekvenciája az alábbi: Sfil(l), GGCCGGCT’AGGCC (29. azonosítási számú szekvencia), és Sfil(2), GGCCATAT’AGGCC (30. azonosítási számú szekvencia). A tk-gén végső módosítását tartalmazó ezen plazmidot (pHindJ-3) a pHindJ-1 prekurzor plazmidból szerkesztjük meg „loop-out” mutagenezissel, és a tk-gén delécióját szekvenciaanalízissel igazoljuk.
Prekurzor pHindJ-1 plazmid szerkesztése
Vad típusú vacciniavírus-DNS-t HindlII-mal hasítunk, és a kapott fragmenseket 0,8%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen szétválasztjuk. A HindlIIJ fragmenst UV fény alatt kivágjuk, és ismert módszerekkel kipreparáljuk. A fragmenst a pTZ19R plazmid (Pharmacia, Inc.) egyetlen HindllI helyére inzertálva kapjuk a pHindJ-1 plazmidot.
HU 219 369 Β pHindJ-2 plazmid szerkesztése
A pHindJ-1 plazmidot E. coli NM522 törzsbe transzfektáljuk, és az egyszálú DNS-t helper M13K07 fággal a Pharmacia használati útmutatója szerint felülfertőzve állítjuk elő. Az egyszálú DNS szolgál templátként a primer odTKl-gyel (31. azonosítási számú szekvencia) végzett helyirányított mutagenezishez. Ez a primer a promoter régióval és a tk-gén transzlációs stopkodonja körüli régióval komplementer. Központi részében egyedi BamHI, Hpal, Nrul és EcoRI restrikciós helyeket tartalmaz. A mutagenézis eljárást az Amersham, Inc. által gyártott mutagenezis készlettel hajtjuk végre a gyártó előírásai szerint.
A pHindJ-2 szerkesztéséhez a tk-gén-szekvenciát Weir J. P. és Moss B. írta le [J. Virol. 45, 530-537 (1983)]. A tk-gén-szekvencia az EMBL Adatbankjában hozzáférhető PVHINLJ azonosító (ID) alatt. A plazmid vektorrészének (pTZ19R) szekvenciája a Pharmacia, Inc.-től beszerezhető. A delécióval törölt vacciniavírus timidin-kináz (tk)-gén körüli szekvencia a pHindJ-2 plazmidban a 4. azonosítási számú szekvenciának felel meg. A tk-gén 5’-régióját (szekvencialistánkban az 1-19. bázisok; az ID PVHINLJ-ben a 4543-4561. bázisok) követik a BamHI, Hpal, Nrul és EcoRI egyedi hasítási helyek és a tk-gén 3’-régiója (jelen szekvencialistánkban a 44-67. bázisok; az ID PVHINLJ-ben az 5119-5142. bázisok). Az ID PVHINLJ szerinti 4562-5118. bázisokat - amely szekvencia a tk promoter egy részét és a tk-gén kódolórégiót tartalmazza - a pHindJ-2 plazmidból delécióval töröltük.
pHindJ-3 plazmid szerkesztése
A pHindJ-2 plazmidot BamHI-gyel és EcoRI-gyel emésztjük, és inzertáljuk az Sfil helyekkel határolt, egyedi NotI, Smal, RsrII és Apai restrikciós helyeket tartalmazó kettős szálú linkért. A linker a P-J(l) (32. azonosítási számú szekvencia) és P-J(2) (33. azonosítási számú szekvencia) oligonukleotidokból áll.
A pHindJ-3 módosított szekvenciája az 5. azonosítási számú szekvenciának felel meg. Az inzertált többszörös klónozóhely a P-J(l) oligonukleotidnak felel meg. Az inzertált szekvencia a 21-es helyzeten kezdődik, és a 99-es helyzetben ér véget. A határolószekvenciák azonosak a pHindJ-2-ben ismertetettekkel.
A tk-deléció vacciniavírusba való inzertálására a pHindJ-3 plazmidot HindlII-mal emésztjük, és a tkgén-deléciót tartalmazó, megrövidített HindlII J fragmenst alkalmazzuk egy marker mentési kísérletben Sam és Dumbell (1981) módszere szerint. A tk-géndelécióval rendelkező vírusokat tk-negatív szelekcióval izoláljuk (Mackett és munkatársai, 1982), majd ezt követően PCR szűréssel azonosítjuk.
Közelebbről a pHindJ-3-ban jelen lévő módosított HindlII fragmenst HindlII-mal kivágjuk, és alacsony olvadáspontú agarózgélen izoláljuk. A markermentést lényegében Sam és Dumbell által leírt módon (1981) végezzük az alábbi módosításokkal. 5xl06 CV-l-sejtet fertőztünk 0,2 pfu/sejt vdSN vacciniavírussal. 1 órán át tartó inkubálás után a fertőzött sejtekbe 1 ml kalciumfoszfátos precipitátumot transzfektáltunk, amely 1 pg módosított HindIIIJ fragmenst tartalmaz. 2 napos szaporítás után egy nyersvírus törzstenyészetet kapunk az 1. példában ismertetett módon, és humán 143B tk-negatív sejteken titráljuk bróm-dezoxi-uridin (BrdU) jelenlétében Mackett és munkatársai (1982) módszere szerint. A tk-negatív plakkokat PCR szűrővizsgálattal tovább analizálhatjuk.
Timidin-kináz deléciós vírus (vdTR) azonosítása
PCR-szűrővizsgálattal
A PCR-reakcióban első printerként az odTK2 oligonukleotidot (34. azonosítási számú szekvencia) használtuk, amelynek a szekvenciája a tk-gén előtt mintegy 300 bp-vel helyezkedik el. A második primer az odTK3 (35. azonosítási számú szekvencia), amely a tkgén stopkodonja után mintegy 220 bázispárral helyezkedik el. A templát az egy vírusplakkal fertőzött CV-1sejtek teljes DNS-e, a vdN szűrővizsgálatára leírtak szerint. A tk-gén-delécióval rendelkező vírus sokszorozásával kapott termék mintegy 520 bp hosszúságú, míg a vad típusú kontrollal egy mintegy 1,1 kb hosszúságú fragmens keletkezik.
A vdTR vektor átvitelére alkalmas génexpressziós kazettákat tartalmazó plazmidok szerkesztése A kiindulási plazmid a pAO plazmid, amely a vdTK vacciniavírus-vektor mesterklónozóhelyének egyedi helyeiből álló mesterklónozóhelyet tartalmazza. A pAO plazmidot úgy konstruáltuk, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható plazmid többszörös klónozóhelyét egy olyan szegmenssel helyettesítettük, amely a vdTK vektor egyedi helyeit és egy Xhol helyet tartalmaz, amint azt a 4.3 ábra mutatja.
Közelebbről a pBluescript II SK fragmid (Stratagene) többszörös klónozóhelyének deléciója céljából a plazmidot Sacl-gyel és Asp718-cal emésztjük. A nagy vektorfragmenst egy adapterral ligáljuk, amely az öszszeillesztett P-A(O.l) oligonukleotidból (36. azonosítási számú szekvencia) és a P-A(0.2) oligonukleotidból (37. azonosítási számú szekvencia) áll.
A pAO többszörös klónozóhelye - amely a P-A(O.l) oligonukleotidnak felel meg - és a pBluescript II SK 5’- és 3’-határolórégióinak 20 bázisa a 6. azonosítási számú szekvenciában látható. Az inzert a 21-es helyzetben kezdődik és a 95-ös helyzetben fejeződik be. (Az első A-maradék az 5’-végen a 2187-es helyzetű bázisnak felel meg, és az utolsó G-maradék a 3’végen a 2301-es helyzetű bázisnak felel meg a pAO plazmidban.) pAI éspA2plazmidok szerkesztése
A pAI és pA2 plazmidokat DNS-szegmensek, például szintetikus vagy természetes promoter fragmensek inszerciójához terveztük. Ezeket úgy állítottuk elő, hogy a pAO Xhol helyére egy linkért inzertáltunk, amely olyan gyakori hasító enzimek második többszörös klónozóhelyét tartalmazza, amelyek a pAO-t nem hasítják. Mind a két plazmid szerkezete azonos, kivéve a második klónozóhely orientációját (lásd a 4.3 ábrát).
A pAO plazmidot Xhol-gyel emésztjük, és egy adapterral ligáljuk, amely az összeillesztett P-A(l.l) és P-A(1.2) oligonukleotidokból áll. Az adaptert mindkét lehetséges orientációban tartalmazó plazmidokat izoláltuk, és pAl-nek, illetve pA2-nek neveztük.
HU 219 369 Β
A pAl többszörös klónozóhelyét - amely a P-A(l.l) oligonukleotidnak felel meg - és a pAO 3’és 5’-határolórégióinak 20 bázisát a 7. azonosítási számú szekvencia mutatja. Az inzert a 21-es helyzetben kezdődik és 83-as helyzetben ér véget. (Az első Cmaradék az 5’-végen a 2222-es helyzetnek felel meg, és az utolsó C-maradék a 3’-végen 2324-es helyzetű maradéknak felel meg a pAl plazmidban.)
A pA2 többszörös klónozóhelyét - amely a P-A(1.2) oligonukleotidnak felel meg - és a pA2 5’és 3’-végeinek 20 bázisát a 10. azonosítási számú szekvencia mutatja. Az inzert a 21-es helyzetben kezdődik és a 195-ös helyzetben ér véget. (Az 5’-végen az első C-maradék a 2252-es helyzetnek felel meg, és a 3’végen az utolsó génmaradék a 2466-os helyzetnek felel meg a pA2-Sl plazmidban.) pAl-Sl éspA2-Sl plazmidok szerkesztése
ApAl-Sl éspA2-Sl plazmidok az SÍ erős szintetikus poxvírus promoterrel rendelkeznek, amely egy transzlációs startkodont tartalmaz, ezt egy egyetlen EcoRI hely követi, amely alkalmas kapcsolódó startkodonnal nem rendelkező nyílt leolvasási keretek inzertálására. Az SÍ promoter a P2-nek nevezett, erős poxvírus késői promotemek egy módosított változata.
A pAl-Sl és pA2-Sl plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy egy első kettős szálú promoter fragmenst inzertálunk a pAl vagy pA2 Ndel és BamHI helyére kényszerített klónozással (4.4 ábra A része). Közelebbről a pAl vektort Ndel-gyel és BamHI-gyel emésztjük, és egy adapterral ligáljuk, amely az összeillesztett P-P2ml.l és P-P2ml.2 oligonukleotidokból áll. A kapott plazmidot pAl - SÍ-nek nevezzük.
A pAl-Sl szintetikus promoterszekvenciát (amely a P-P2ml.l oligonukleotidnak felel meg) és a pAl 5’és 3’-határolórégióinak 20 bázisát a 9. azonosítási számú szekvencia mutatja. Az inzert a 21-es helyzetben kezdődik és a 193-as helyzetben ér véget. (Az első Cmaradék az 5’-végen a 2228-as helyzetnek felel meg, és az utolsó G-maradék a 3’-végen a 2440-es helyzetnek felel meg a pAl-Sl plazmidban.)
A pA2 vektort Ndel-gyel és BamHI-gyel emésztjük, és egy adapterral ligáljuk, amely az illesztett P-P2ml.l és P-P2ml.2 oligonukleotidokból áll, ahogy azt a pAl-Sl-re fent említettük. A kapott plazmidot pA2-S 1-nek nevezzük.
A pA2-Sl szintetikus promoterszekvencia (amely a P-P2ml.2 oligonukleotidnak felel meg) és a pA2 5’és 3’-határolórégióinak 20 bázisa a 10. azonosítási számú szekvenciában látható. Az inzert a 21-es helyzetben kezdődik és a 195-ös helyzetben ér véget. (Az első Cmaradék az 5’-végen a 2252-es helyzetnek felel meg és az utolsó G-maradék a 3’-végen a 2466-os helyzetnek felel meg a pA2-Sl plazmidban.) pAl-S2 és pA2-S2plazmidok szerkesztése
A pAl-S2 és pA2-S2 plazmidok az S2 erős szintetikus promotert - a Davison és Moss által leírt [J. Mól. Bioi. 210, 771-784 (1989)] erős késői szintetikus poxvírus promoter egy módosított változatát - tartalmazzák. Ezek a plazmidok nem tartalmaznak transzlációs startkodont a promoterrel kapcsolva, és ezért alkalmasak startkodont tartalmazó, teljes, nyílt leolvasási keretek inzertálására. A promoterek különböző orientációban vannak a vdTK mesterklónozóhelyhez viszonyítva ebben a két plazmidban.
A pAl-S2 és pA2-S2 plazmidokat egy második kettős szálú promoter ffagmensnek a pAl, illetve pA2 plazmid Hpal és EcoRI helyére való kényszerített klónozásával állítjuk elő (4.5 ábra A része). Közelebbről, az pAl plazmidot Hpal és EcoRI enzimekkel emésztjük, és az illesztett P-artP(5) és P-artP(6) oligonukleotidokból álló szintetikus linker szekvenciával ligáljuk. A kapott plazmidot pAl-S2-nek nevezzük.
pAl-S2 szintetikus promoterszekvencia - amely a P-artP(5) oligonukleotidnak felel meg - és a pAl 5’és 3’-határolórégióinak 20 bázisa all. azonosítási számú szekvencián látható. Az inzertált szekvencia a 21-es helyzetben kezdődik és a 68-as helyzetben ér véget. (Az 5’-végen az első T-maradék a 2240-es helyzetnek felel meg és a 3’-végen az utolsó A-maradék a 2327-es helyzetnek felel meg a pAl-S2 plazmidban.)
Hasonlóképpen a pA2 plazmidot Hpal és EcoRI enzimmel emésztjük, és az illesztett P-artP(5) és P-artP(6) oligonuldeotidokkal ligáljuk a pAl-S2-höz hasonló módon. A kapott plazmidot pA2-S2-nek nevezzük. A pA2-S2 szintetikus promoterszekvencia - amely a P-artP(6) oligonukleotidnak felel meg, és a pA2 5’- és 3’-határolórégióinak 20 bázisa a 12. azonosítási számú szekvencián látható. Az inzert a 21-es helyzetben kezdődik és 72-es helyzetben ér véget. (Az 5’végen az első T-maradék a 2263-as helyzetnek, a 3’végen az utolsó A-maradék a 2354-es helyzetnek felel meg a pA2-S2 plazmidban.)
ApAl-Sl, apA2-Sl, pAl-S2 vagy pA2-S2 plazmidok bármelyikébe egy nyitott leolvasási kerettel inzertálható, majd ezt követően az expressziós kazetta kivágható, és a vdTK vírusvektor megfelelő helyeire inzertálható irányított klónozással. A kazettát az alkalmazott klónozó plazmidtól függően bármelyik orientációban inzertálhatjuk a vírusgenomba.
Szelektív markerrel rendelkező expressziós kazettákat tartalmazó plazmidok szerkesztése (pN2gpt-S3A és pN2gpt-s4)
A kényszerített klónozásra tervezett plazmidokon kívül két további plazmidot is szerkesztettünk gének bevitelére egy poxvírusvektor egyetlen NotI helyére, egy E. coli gpt szelektáló markergén segítségével. Ezek két további poxvírus promotert is szolgáltatnak a fent ismertetett SÍ és S2 promotereken kívül. A pN2gpt-S3A plazmidot (4.7 ábra) olyan nyitott leolvasási keretek inzertálására alkalmazhatjuk, amelyek nem rendelkeznek iniciátorkodonnal. A vacciniavirusba beviendő géneket (a gpt-markert és a nyitott leolvasási keretet) vagy magával az Notl-gyel, vagy két enzimmel, például Notl-gyel és Smal-gyel (vagy RsrII-vel és Apaigyei) vághatjuk ki. A kivágott fragmenst ezután a vdTK vírusvektor megfelelő helyére (vagy helyeire) inzertálhatjuk.
A pN2gpt-S4 plazmidot (4.7 ábra) egy AUG transzlációs startkodont is tartalmazó teljes nyitott leolvasási keretek inzertálására alkalmazhatjuk. A gpt-markergént
HU 219 369 Β és a nyitott leolvasási keretet tartalmazó kazettákat a pN2gpt-S3A-ra fent ismertetett módon vághatjuk ki. Az S3A és S4 promoterek az erős poxvírus késői promoterek módosított változatai.
Az előbbi plazmidokat úgy szerkesztjük meg, hogy először előállítjuk a pN2-gpta és pN2-gptb plazmidokat (4.6 ábra), amelyek egy E. coli gpt-gént tartalmaznak a P7,5 vacciniavírus promoter szabályozása alatt, és ezeket egyedi restrikciós helyek - beleértve az Notl-et is - határolják (1.3 ábra). Az S3A vagy S4 promoter ffagmens inzertálása a pN2-gptb plazmid egyetlen PstI és Clal helyeire eredményezi a pN2-gpt-S3A és pN2gpt-S4 plazmidokat.
pN2-gpta és pN2-gptb plazmidok szerkesztése
Az előbbi plazmidok szerkesztését az 1. példában és a 4.6 ábrán ismertetjük.
pN2gpt-S3A plazmid szerkesztése
A kiindulási pN2-gptb plazmidot Pstl-gyel és Clal-gyel emésztjük, és a P-artP(7) és P-artP(8) oligonukleotidokból álló szintetikus linkerszekvenciával (40. azonosítási számú szekvencia) Egáljuk. A kapott plazmidot pN2gpt-S3A-nak nevezzük.
A pN2gpt-S3A szintetikus promoterszekvencia - amely a P-artP(7) oligonukleotidnak felel meg - és a pN2-gptb 5’- és 3’-határolórégióinak 20 bázisa látható a
13. azonosítási számú szekvenciában. Az inzertált DNSszekvencia a 21-es helyzetben kezdődik, és a 107-es helyzetben ér véget. (Az 5’-végen az első T-maradék 3328-as helyzetnek, a 3’-végen az utolsó A-maradék a 3454-es helyzetnek felel meg a pN2gpt-S3A plazmidban.) pN2gpt-S4 plazmid szerkesztése
A pN2gptb plazmidot Pstl-gyel és Clal-gyel emésztjük, és a P-artP(9) és P-artP(lO) oligonukleotidokból álló adapter szekvenciával (41. azonosítási számú szekvencia) Egáljuk. A kapott plazmidot pN2gpt-S4-nek nevezzük. A pN2gpt-S4 szintetikus promoterszekvencia - amely a P-artP(9) oligonukleotidnak felel meg és a pN2-gptb 5’- és 3’-határolórégióinak 20 bázisa a
14. azonosítási számú szekvenciában látható. Az inzertált DNS-szekvencia a 21-es helyzetben kezdődik és a 114-es helyzetben végződik. (Az 5’-végen az első Tmaradék a 3328-as helyzetnek, a 3’-végen az utolsó Amaradék a 3461-es helyzetnek felel meg a pN2gpt-S4 plazmidban.)
5. példa
Polipeptidek expressziója vacciniavírus-vektorban (vdTK) génexpressziós kazetták közvetlen molekuláris inszerciójával
Ebben a példában mutatjuk be azt a lehetőséget, hogy hogyan lehet egy találmány szerinti vacciniavírusvektorba (vdTK) klónozott géneket inzertálni poxvírus expressziós szerkezetek gyors előállítása céljából a 4. példában ismertetett génexpressziós kazetták közvetlen molekuláris inszerciójával. Ebben a példában ismertetjük a vdTK vektorkazetta-rendszer alkalmazását olyan szerkezetek előállítására, amelyek képesek különféle modellpeptideket - például a humán vérproteineket (protrombin és plazminogén variánsait) és egy humán vírusantigént (HIV-gpl60-at) expresszálni.
Humán protrombint expresszáló módosított vacciniavirus (vPTl) szerkesztése A humán protrombin (PT) modellként szolgál idegen proteinek expressziójára a találmány szerinti vacciniavírus-vektorban. Korábban kimutatták, hogy a protrombint kódoló cDNS expresszálható egy hagyományosan konstruált rekombináns vacciniavírus által (lásd PCT/EP91/00139 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, Falkner és munkatársai, amelynek tartalmát referenciaként beépítettük a leírásba).
A módosított protrombin cDNS-t 2,0 kb hosszúságú EcoRI fragmensként vágjuk ki a pTKgpt-PTHBb plazmidból és a pAl-Sl plazmid (4. példa, 4.4 ábra) egyetlen EcoRI helyére inzertáljuk, amelynek eredményeképpen kapjuk a pAlSl-PT plazmidot (5.1 ábra). A fenti plazmid expressziós kazettájában a protrombin cDNS az SÍ szintetikus poxvírus SÍ promoter szabályozása alatt áll, amely transzlációs iniciátorkodont is biztosít.
A humán protrombin szekvenciáját Degen S. J. F., MacGillivray R. T. A. és Davie, E. publikálta [Biochemistry 22, 2087-2097 (1983)]. Ez a szekvencia az EMBO Adatbankban hozzáférhető HSTHRI azonosítási számon. Az ID HSTHRI szekvencia nem teljes, hiányzik belőle a protrombin kódolórégiójának első 19 bázispáija. Mi szekvenáltuk az ID HSTHRI cDNS-éből hiányzó fenti részt, és az alábbiakban ismertetjük.
A több módosítás és báziscsere miatt a jelen humán protrombin cDNS-klón teljes szekvenciáját közöljük a
15. azonosítási számú szekvenciában, beleértve az SÍ promotert és a határoló plazmidszekvenciák 20 bázisát is.
A Falkner-féle bejelentésben (PCT/EP-91/00139) ismertetett műveletek szerint a cDNS-t az alábbiak szerint módosították: két további kodont (22-27-es helyzetű bázisok) vezettek be, amely két új aminosav beépülését eredményezi; a 3’-nem transzlatált szekvenciát egy EcoRI hely bevezetésével eltávolították; az 1963-1965ös helyzetű bázisokat (az ID HSTHRI szekvenciában az 1920-1922-es helyzetű bázisok) TGG-ről GAA-ra cserélték helyirányított mutagenezissel.
A jelen PT cDNS-ben egy bázispárcserét találtunk, amely egy új Ncol helyet eredményez : az 525-ös helyzetű bázis (ID HSTHRl-ben 482-es helyzetű bázis) cserélődik C-ről A-ra. Ez egy csendes mutáció, mivel a CCC kodon (Pro) cserélődik CCA kodonra (Pro), amelynek eredményeként egy új Ncol hely jön létre. (A 15. azonosítási számú szekvencia első bázisa a pAlSl-PT-ből a 2394-es helyzetű bázisnak felel meg, és az utolsó bázis a pAlSl -PT plazmid teljes szekvenciájában a 4381-es helyzetű bázisnak.
A vdTK vacciniavírus-vektorba való transzferhez a pAlSl-PT plazmidból NotI és Rsrll endonukleázokkal vágjuk ki a kazettát, és alacsony olvadáspontú agarózgélen való elválasztás után izoláljuk. A vdTK vírusvektor-DNS-t Notl-gyel és RsrII-vel hasítjuk, fenollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A vektor-DNS többszörös klónozóhelyének kis Notl-RsRII kapcsoló fragmense elvész az etanolos kicsapási lépésben. A vacciniavektor-karokat 20-szoros mólfeleslegben lévő kazet33
HU 219 369 Β tavai ligáljuk. A ligáit vacciniavírus-DNS pakolását helper-számyaspoxvírussal csirkesejtekben a 3. példában ismertetjük. A CV-1 sejtek fertőzésével előállított plakkokból származó pakolt vírusokat újra plakktisztításnak vetjük alá, és kis mennyiségű nyers törzstenyészeteket készítünk. A vírusizolátumokat tovább analizálhatjuk Southem-blot-analízissel és expressziós analízissel a Falkner bejelentésben leírtak szerint. A protrombin cDNS inszerciójára korrekt genomiális szerkezettel rendelkező vírusizolátumot vPTl-nek jelöljük. Egy hasonló rekombináns vacciniavírus - amelyet markermentéssel állítottak elő - Vero-sejtekben mintegy 50-60 milliegység/ml sejttenyészet-felülúszó aktivitással indukálja a protrombin expresszióját (lásd a Falkner bejelentést).
Humán glu-plazminogént expresszáló vacciniavírus (vGPgl) szerkesztése
A plazminogén (Pg) natív formája egy glutamin aminosavval kezdődő aminoterminálist tartalmaz, ezért glu-plazminogénnek (glu-Pg) is nevezik. A plazminogén egy részlegesen átalakított formájából hiányzik az első 77 aminoterminális aminosav (az aktivációs peptid), ezt lys-plazminogénnek (lys-Pg) nevezik. A lys-Pg affinitása a szubsztrátfibrinnel szemben sokkal nagyobb, mint a glu-Pg-é. Ezenkívül a rekombináns lysPg sokkal stabilabb, mint a glu-Pg gént hordozó (hagyományos) vaccinia rekombinánssal fertőzött sejttenyészetek felülúszójában.
A teljes humán plazminogén cDNS-t (amely transzlációs start- és stopkodonokat is tartalmaz) kivágjuk a plazmidból (phPlas-6) Ball-Smal fragmensként. A humán plazminogén szekvenciáját Forsgren M., Raden B., Israelsson M., Larsson K. és Heden L-O. publikálta [FEBS Letters 213, 254-260 (1987)] és az EMBO Adatbankban (Génbank) HSPMGR azonosítási számon (ID) hozzáférhető. Ezért ennek a plazmidnak a szekvenciáit nem közöltük a jelen bejelentés szekvencialistájában, mivel ez a plazmid nem az egyetlen forrása a plazminogén DNS-szekvenciának. Azonban a jelen plazminogénszekvencia kódolórégiója legalább egy nukleotidban különbözik a publikált szekvenciától: a 112-es helyzetű A-maradék (ID HSPMGR) egy G-maradékra változik a jelen DNS-ben, ami egy aminosavszubsztitúciót (Lys -> Glu) eredményez.
A plazminogén cDNS-t a pN2gpt-S4 plazmid (4. példa, 4.7 ábra) Hpal helyére inzertáljuk. Ezt a plazmidot azért választottuk egy szelektálómarkert tartalmazó génexpressziós kazetta szerkesztésére, mert a plazminogén cDNS két Apai helyet és egy RsrII helyet tartalmaz, és ezért nem engedi meg a kényszerített klónozásra tervezett expressziós kazetták alkalmazását. A kapott plazmidot pN2gpt-GPg-nek nevezzük (5.2 ábra).
A pN2gpt-GPg-re megadott 17. azonosítási számú szekvenciában látható a plazminogén iniciátor kodonját is tartalmazó S4 promoter csatlakozórégiója (jelen szekvenciában a 32-es helyzetű bázis; az ID HSPMGR-ben az 55-ös helyzetű bázis). A glu-plazminogén kódolórégióját nem közöljük a szekvencialistában. A szekvencia a stopkodonnal folytatódik (a jelen szekvenciában a 35-ös helyzetű bázis; ID HSPMGR-ben a 2485-ös helyzetű bázis) és a 3’-nem transzlatált plazminogénszekvencia 25 bázisával folytatódik. Ezt a szekvenciát követi a phPlasó többszörös klónozóhelyének 29 bázisa és a pN2gpt-S4 plazmid többszörös klónozóhelyének bázisa.
A glu-plazminogén génkazetta vacciniavírus-genomba való transzferjéhez a két gént és azok promotereit (a gpt-szelekciós markert szabályozó P7,5 promotert és a glu-plazminogén gént szabályozó S4 promotert) tartalmazó pN2gpt-GPg NotI fragmensét alacsony olvadáspontú agarózgélen izoláltuk és tisztítottuk. Ezt a kazettát ligáltuk az Notl-gyel hasított vdTK vacciniavírus-DNS karjaihoz. A pakolást és a plakktisztítást a 3. példában írjuk le. Az inzertált plazminogén génkazettára helyes szerkezettel rendelkező vírust vN2gpt-GPg-nek nevezzük. Ezt a vírust használjuk plazminogén expressziójára CV - 1-sejtekben, a markermentési módszerrel szerkesztett analóg vacciniavírusra ismertetett módon. A sejttenyészet felülúszójában a szekretált glu-Pg koncentrációja mintegy 1,5 pg/106 sejt hagyományosan szerkesztett vacciniavírussal való fertőzés után 24 órával a vacciniavírus-vektorok idegen proteinek sejttenyészetben való expressziójára alkalmazott standard tenyésztési feltételek között. A glu-plazminogén a sejttenyészet felülúszójában csak egy proteázinhibitor (50 pg/ml aprotinin) jelenlétében volt detektálható.
Humán lys-plazminogént expresszáló vacciniavírus (vLPgl) szerkesztése
Lys-plazminogént kódoló szekvenciát állítottunk elő a teljes plazminogén cDNS-ből az első 77 aminosavat (Glul-től Lys77) kódoló 231 bp hosszúságú régió deléciójával (lásd az 5.3 ábrát). Ezt a szekvenciát egy szelektálható markergént (E. coli gpt) tartalmazó pN2gpt-S4 plazmid génexpressziós kazettájába inzertáltuk, így nyertük a pN2gpt-LPg-nek nevezett plazmidot (5.3 ábra).
Ebben a plazmidban a preszekvencia (a szekréciót mediáló szignálpeptidet kódoló szekvencia) közvetlenül kapcsolódik a plazminogénben lévő 78. helyzetben lévő lizinmaradékot kódoló első nukleotiddal. Az ezen íuzióval előállított új szignálpeptid hasítási hely hasonló sok ismert szignál hasítási helyhez [lásd például von Heinje, Eur. J. Biochem. 133, 17-21 (1983)].
Ezenkívül a Pg cDNS-iniciátor kodonjának helyére egy új Ncol helyet vezettünk be, a pN2gpt-S4 plazmid egyetlen Ncol helyére való klónozás elősegítésére, és a promoter és a Pg-kódolórégió optimális kapcsolatának biztosítására. A Pg cDNS Ncol-gyel való kivágásának elősegítésére a két belső Ncol hely egyikét [Ncol(2);
5.3 ábra] az alábbiak szerint töröltük delécióval a Pg cDNS-ből.
A phPlasó plazmidot E. coli NM522 törzsbe vittük, és egyszálú DNS-t állítottunk elő a helper M13KO7 fággal való felülfertőzéssel. A mutagenezis első ciklusát két oligonukleotiddal, az oNco 1-gyel és az oNco2-vel végeztük, templátként az egyes szálú phPlasó DNS-t alkalmazva, kereskedelmi forgalomban kapható mutagenezis készlettel (Amersham, Inc.). Az Ncol oligonukleotid a plazminogén startkodonja előtti két A-mara34
HU 219 369 Β dékot két C-maradékká alakítja, ezzel egy Ncol hely alakul ki a startkodon környezetében, a plazminogén preszekvencia kódolórégiójának megváltoztatása nélkül. Az oNco2 oligonukleotid egy T-maradékot alakít C-maradékká a Pg cDNS belső Ncol helyén [Ncol(2)], ezáltal egy olyan csendes mutáció keletkezik, amely az Ncol helyet inaktiválja.
A plazminogén 1-77. aminosavait kódolórégiót delécióval töröltük a második „loop-out” mutagenezis lépéssel, egy 42 bázist tartalmazó oNco3 oligonukleotid alkalmazásával. Az összes mutációt szekvenálással és restrikciós analízissel megerősítettük.
A három mutációt tartalmazó phLplas plazmidot Smal-gyel linearizáltuk és Ncol-gyel részlegesen emésztettük. Izoláltuk a 2,2 kb hosszúságú Ncol-Smal fragmenst és Ncol-gyel és Smal-gyel hasított pN2gpt-S4 plazmidba inzertáltuk. A kapott plazmidot pN2gptLPg-nek nevezzük.
A pN2gpt-LPg-ben a plazminogén cDNS számos módosítása miatt a pLplas Ncol-Smal fragmensének teljes szekvenciáját bemutatjuk, amely az S4 promoter 20 bázisát és a pN2gpt-S4 5’-irányú plazmid régiójának 20 bázisát is tartalmazza (18. azonosítási számú szekvencia). A plazminogén cDNS-szekvenciát az alábbiak szerint módosítottuk: a 19-es és 20-as helyzetben korábban jelen lévő két A-maradékot (ID HSPMGRben az 53-as és 54-es helyzetű bázisok) két C-maradékra cseréltük, amely Ncol helyet eredményezett; a szekvencialistában megadott szekvencia 21-es helyzetű bázisa (ID HSPMGR 55-ös helyzetű bázisa) a plazminogén startkodonjának A-maradéka; a 2220-as helyzetű bázis (ID HSPMGR-ben a 2485-ös helyzetű bázis) a stopkodon T-maradéka; az ID HSPMGR 111-es helyzetű bázisa (jelen szekvenciában a 77-es helyzetű bázis) az ID HSPMGR 343-as helyzetű bázisával kapcsolódik (jelen szekvenciában a 78-as helyzetű bázis), amely az aktivációs peptidet kódoló szekvencia delécióját eredményezi; a 926-os helyzetű T-maradékot (ID HSPMGR-ben az 1191-es helyzetű bázis) C-maradékra cseréltük (konzervatív csere), amely egy belső Ncol hely eltűnését eredményezi.
A lys-plazminogén génkazetta vacciniavírus-genomba való bevitelére a két promoter gén (a P7,5 promoter gpt-gén és az S4 promoter lys-plazminogén gén) kombinációját tartalmazó génexpressziós kazettát tartalmazó pN2gpt-LPg NotI ffagmensét Egáljuk Notl-gyel hasított vdTK vacciniavírus vektor-DNS-sel, és a 7. példában leírtak szerint pakoljuk. Az inzertált génkazettára megfelelő szerkezetet tartalmazó egyik izolátumot - amelyet vN2gpt-LPg-nek nevezünk - használtuk a lys-plazminogén expressziójára CV-1-sejtekben olyan körülmények között, amelyeket korábban sejttenyészetben proteinek termelése céljából hagyományosan megszerkesztett rekombináns vacciniavírus expressziós vektorok standard körülmények közötti tenyésztésére alkalmaztunk. A sejttenyészet felülúszójában a szekretált lys-Pg mennyisége mintegy 1,0-2,0 pg/106 sejt a hagyományos rekombinánssal való fertőzés után 24 órával. A lys-plazminogén a sejttenyészet felülúszójában tehát inhibitor hozzáadása nélkül is stabil.
Humán immunhiányvírus glikoprotein 160 (HIV-gpl60) expresszálására alkalmas vacciniavírus (vgpl60-l) szerkesztése
A HIV-gpl60 komplett nyílt leolvasási keretét egy
2,5 kb hosszúságú EcoRV fragmensen kapjuk, amely egy Ml3 fág replikatív formájú (RF) DNS-éből kivágott DNS-t tartalmaz [mpPEenv; Fuerst és munkatársai, Mól. Cell. Bioi. 7, 2538-2544 (1987)]. Ezt a fragmenst egy pN2gpt-S4 plazmidba inzertáljuk az 5.4 ábrán ismertetett módon. A kapott pN2gpt-gpl60 plazmádban a gpl60 gén az S4 szintetikus vacciniavírus promoter szabályozása alatt áll.
A HIV-gpl60 szekvenciáját Ratner L. és munkatársai ismertették [Natúré 313, 277-284 (1985)]. A BH8 klón szekvenciája az EMBO Adatbankban (Génbank) ID HIVH3BH8 néven hozzáférhető. Ezért a gpl60 szekvenciát nem közöltük a 19. azonosítási számú szekvenciában, csak az S4 promoter kapcsolódó régióját és az egy gpl60 gén iniciátorkodonját magában foglaló EcoRV HIV-gpl60 fragmensét (28-as helyzetű bázis a jelen szekvencialistában közölt szekvenciában; 226-os helyzetű bázis az ID HIVH3BH8-ban). Az EcoRV HIV-gpl60 fragmens az M13 fág (replikatív forma) mpPEenv-ből származik, amelyet Fuerst T. R., Earl P. és Moss B. ismertettek [Mól. Cell. Bioi. 7, 2538-2544 (1987)]. A szekvencia a stopkodonnal (31-es helyzetű bázis a jelen szekvenciában; 2779-es számú bázis az ID HIVH3BH8-ban) és az EcoRV hely 5’-irányú részének egyik felével folytatódik. Ezt a szekvenciát a pN2gpt-S4 plazmid többszörös klónozóhelyének 20 bázisa követi. Az első bázis (T) az általunk közölt szekvenciában a 3368-as helyzetű bázisnak, az utolsó bázis (G) az 5973-as helyzetű bázisnak felel meg a pN2gptgpl60 szekvenciában.
A HIV-gp 160 génexpressziós kazetta vacciniavírus-genomba való transzferjéhez a mindkét génpromoter kombinációt (P7,5 promoter-gpt szelekciós marker és S4 promoter-gpl60 gén) tartalmazó NotI fragmenst ligáljuk a vdTK vacciniavírus-vektor Notlgyel hasított DNS-ével, és a pakolást a 7. példában leírtak szerint végezzük. Egy, az inzertált kazettát helyes szerkezetben tartalmazó izolátumot vN2gpt-gpl60-nak nevezünk, és ezt alkalmazzuk a gpl60 expressziójára afrikai zöldmajom (Verő) sejtekben olyan körülmények között, amelyeket korábban egy hagyományosan szerkesztett rekombináns expressziójára alkalmaztak. [Barrett és munkatársai, Aids Research and Humán Retrovíruses 6, 159-171 (1989)].
Inzerteket hordozó módosított vírusok szűrővizsgálatára alkalmas vacciniavírus-vektor szerkesztése egy lacZ-gén koinszerciójával
A pTZgpt-S3AlacZ plazmid (5.5 ábra) hasznos modellszerkezetet képvisel az inszerciók szűrővizsgálatának bemutatására egy E. coli lacZ-génnel találmány szerinti közvetlen klönozási módszerrel való koinzertálásával. A pTZ19R plazmidot (Pharmacia Inc.) PvuII-vel hasítjuk, és a nagy 2,5 kb hosszúságú vektor fragmenst izoláljuk, és NotI linkerekkel (Boehringer Inc.) Egáljuk. A kapott pTZ-N plazmid egy többszörös klónozóhelydeléciót tartalmaz, amely a pT219R plazmidban az alfa
HU 219 369 Β kiegészítő peptid szekvenciáján belül lokalizálódik. Ezért pTZ-N-be inzertálandó lacZ-gén és az alfa kiegészítő peptid szekvenciái közötti esetleges rekombinációs események ki vannak zárva.
A közvetlen molekuláris klónozáshoz egy génexpressziós kazetta konstruálására gpt-génkazettát és egy S3A promotert tartalmazó, 1,2 kb hosszúságú Notl fragmenst vágunk ki a pN2gpt-S3A-ból (4. példa), és a pTZ-N-be inzertáljuk, így kapjuk a pTZgpt-S3A plazmidot. A pTKgpt-Flsp-ból kivágott 3,0 kb hosszúságú EcoRI lacZ fragmenst (Falkner és Moss, 1988) a pTZgpt-S3A egyetlen EcoRI helyére inzertáljuk. A kapott plazmidot pTZgpt-S3AlacZ-nek nevezzük.
A fenti plazmid 4,4 kb hosszúságú Notl fragmensét - amely két markergént (E. coli gpt és lacZ) tartalmaz - a vdTK vírus (4. példa) Notl-gyel hasított DNS-ével ligáljuk. A ligálást és pakolást a 3. példában leírtak szerint végezzük. A módosított vírusok meghatározott hozama gpt-szelekció esetén a 3. példában található.
Egy további vacciniavirus-vektort konstruáltunk az alábbiak szerint. A pTZS4-lacZa és pTZS4-lacZb plazmidok használható modellszerkezeteket képviselnek (5.6 ábra). A pTZ-N plazmidot a fentiek szerint állítottuk elő. A génexpressziós kazettát, a gpt-génkazettát és az S4 promotert tartalmazó 1,2 kb hosszúságú Notl fragmenst, amelyet a pN2gpt-S4 plazmidból vágtuk ki (4. példa) és a pTZ-N-be inzertáltuk, az így kapott plazmidot pTZgpt-S4-nek nevezzük. A placZN* plazmidból - amelyet a pFP-Zsart plazmid (91 114 300-6 számú európai szabadalmi bejelentés, rekombináns számyaspoxvírus) Notl-gyel való emésztésével és a pFP-Zsart P-NotI oligonukleotiddal (5’-GGCCAT-3’) való ligálásával állítottak elő - kivágtunk egy 3,3 kb hosszúságú Smal-Stul lacZ fragmenst. Ezt a 3,3 kb hosszúságú Smal-Stul lacZ fragmenst a pTZgpt-S4 egyetlen Smal helyére inzertáltuk. A kapott plazmidokat pTZS4-lacZa-nak és pTZS4-lacZb-nek nevezzük.
Ennek a plazmidnak a 4,5 kb hosszúságú Notl fragmensét ligáljuk a vdTK vírus Notl-gyel hasított DNS-ével, és a fent leírtak szerint pakoljuk.
A lacZ és a gpt-szelekció kombinációja egyetlen klónozólépésben nem nyújt semmiféle előnyt, mivel az összes gpt-pozitív plakk tartalmazni fogja a lacZ-gént. Azonban olyan vírusok szerkesztésére, amelyek különböző helyeken tartalmaznak inszerciókat, egy második szűrővizsgálat kívánatos. Az elsőként választott marker a gpt-marker, de a lacZ-szürés egy alternatív módszert jelent az inzertek detektálására, például abban az esetben, ha a cél virális genom már tartalmazza a szelektálható marker egy példányát, például az E. coli gpt-gént.
Az ilyen szűrővizsgálathoz a pakolás után előállított nyersvírus törzstenyészetekből 2 ml 1/10, 1/100 és 1/1000 hígításokat (lásd a 3. példát) 30 db nagyméretű (8,5 cm átmérőjű) Petri-csészébe rétegezünk (hígításonként 10 Petri-csészét használunk). A kék plakk vizsgálatot a standard eljárások szerint végezzük [Chakrabarti S., Brechling K. és Moss B., Mól. Cell. Bioi. 5, 3403-3409 (1985)].
6. példa
Erős, késői vacciniavírus promoter transzkripciós szabályozása alatt álló, irányított mesterklónozóhellyel rendelkező vacciniavirus-vektor (vS4) szerkesztése
Ebben a példában ismertetjük egy olyan vacciniavírus-klónozó vektor (vS4) megszerkesztését, amelyet egy komplett nyílt leolvasási keret közvetlen molekuláris inzertálására terveztünk egy olyan mesterklónozóhelyre, amely egy vacciniavírus promoterhez van funkcionálisan kötve. Ennek megfelelően ennek a vektornak az alkalmazása a találmány szerinti eljárásokkal lehetővé teszi a gének direkt inzertálását egy poxvírusvektorba egy inszerciós plazmid külön megszerkesztése nélkül, ami a hagyományos rekombináns poxvírusok intracelluláris rekombinációval való előállításához szükséges. Ez a vektor egy génexpressziós kazetta külön megszerkesztését is feleslegessé teszi a vacciniavírus-vektorba való bevitelhez közvetlen molekuláris inszercióval a fentiekben ismertetett módon.
Az S4 vektor mesterklónozóhelye a vacciniavírusgenom genetikailag stabil központi régiójában lokalizálódik, és számos olyan hasítási helyet tartalmaz, amelyek egyetlenként fordulnak elő a vektorban, ezáltal lehetővé teszik az irányított inszerciót. A mesterklónozóhely előtt közvetlenül elhelyezkedő S4 promoter egy késői vacciniavírus promoter erős, szintetikus variánsa. Ez az expressziós vektor alkalmas olyan nagyméretű, nyitott leolvasási keretek közvetlen klónozására és expressziójára, amelyek egy transzlációs startkodont tartalmaznak, ezt a leírásban egy humán vérproteint, a von Willebrand-faktort (vWF) kódoló cDNS-sel illusztráljuk.
vS4 vacciniavirus-vektor szerkesztése
Az S4 vacciniavírus promotert tartalmazó adaptert a vdTK vacciniavírus-vektorba (4. példa, 4.1 ábra) inzertáljuk az egyetlen Notl helyre (6.1 ábra). A kiválasztott adapter oligonukleotidok inszerciója inaktiválja a 3’-irányban elhelyezkedő Notl helyet, míg az 5'-irányban elhelyezkedő Notl hely egyetlen klónozóhelyként funkcióképes marad.
Közelebbről 1 pg vdTK vektor DNS-t (4. példa, 4.1 ábra) Notl-gyel hasítunk, és 0,5 pg P-artP(ll) (38. azonosítási számú szekvencia) és P-artP(12) (39. azonosítási számú szekvencia) illesztett oligonukleotiddal ligáljuk. A ligációs elegyet pakoljuk, és a plakkokat a 3. példában leírtak szerint azonosítjuk. A plakkokat PCR szűrővizsgálatnak vetjük alá a leírtak szerint (4. példa, vdTK vírus azonosítása PCR szűrővizsgálattal). Inzertet megfelelő orientációban tartalmazó egyik izolátumot vS4-nek nevezzük.
Von Willebrand-faktor cDNS-inzertálása vS4-be
A pvWF plazmid a teljes von Willebrand-faktor cDNS-t tartalmazza Notl helyekkel határolva. A humán vWF szekvenciája ismert [Bonthron D. és munkatársai, Nucl. Acids Rés. 14, 7125-7128 (1986)]. Ez a szekvencia az EMBO Adatbankban ID HSVWFR1 néven megtalálható. A 20. azonosítási számú szekvencia mutatja az vvWF vírus genomjában a virális S4 promoter és a jelen vWF cDNS 5’-nem transzlatált régiójának kapcsolódását a pvWF plazmidban a transzlációs
HU 219 369 Β startkodonig (jelen szekvencia szerint a 249-es helyzetű bázis; az ID HSVWFRl-ben a 100-as helyzetű bázis). A vWF kódolórégióját kihagytuk a jelen szekvenciából. A szekvencia a stopkodonnal (252-es helyzetű bázis; az ID HSVWFRl-ben a 8539-es helyzetű bázis), a 3’-nem transzlatált szekvenciával az NotI helyig (304-es helyzetű bázis) és a virális genom vvWF 3’-régiójával való átfedés 20 bázisával folytatódik.
A vWF cDNS-fragmenst Notl-gyel felszabadítjuk, izoláljuk, és vS4 vektor-DNS-sel ligáljuk, amelyet Notl-gyel hasítottunk, és foszfatázzal kezeltünk a 6.2 ábrának megfelelően.
A ligáit DNS 1 pg-ját a 7. példában leírtak szerint pakoljuk. A plakkokat lekaparjuk, és PCR szűrővizsgálattal analizáljuk. A PCR-reakció első primerje az odTK2 oligonukleotid, amely mintegy 300 bázispárral a tk-gén előtt lokalizálódik; a reverz primer ovWFI az iniciátorkodon után mintegy 50 bázispámyira helyezkedik el a vWF génben. A PCR sokszorozás csak akkor megy végbe, hogy ha vWF inzert helyes orientációban van a vektorban az S4 promoterhez viszonyítva. A PCR-pozitív plakkokat azonosítjuk és tovább analizáljuk. Ha a kívánt módosított vírus hozama alacsony (mintegy 0,1-0,01%), úgy is eljárhatunk, hogy in situ plakkhibridizációs módszerrel azonosítjuk, amely módszer a szakirodalomból ismert [lásd például Vilareal
L. P. és Berg P. Science 196, 183-185 (1977)].
A PCR vagy hibridizációs módszer szerint a cDNS-inzertet tartalmazó vírusklónt, amely PvuII-vel hasítva a várt restrikciós képet mutatja, vvWF-nek nevezzük. A von Willebrand-faktor expresszálását az ilyen vektorok által az 5. példában más humán proteinekre ismertetett módszerek szerint vizsgálhatjuk, amelyeket adott esetben a géntechnológiában járatos szakemberek által ismert módon módosíthatunk.
7. példa
Ortopox (vaccinia)-vírus genomiális DNS heterológ pakolása madárhimlő (szárnyashimlőj-helpervirussal és a módosított vírus szimultán szelekciója olyan gazdasejtekben, amelyekben a helpervírus nem tud replikálódni
A 3. példában ismertetjük a módosított vacciniavírus-DNS pakolását helper-szárnyaspoxvírussal számyassejtekben, és ezt követően az utódvírusplakkok izolálását emlős (CV-l)-sejtekben, amelyekben a madárhimlő-helpervírus nem tud replikálódni. A jelen példában ismertetjük a vacciniavírus-DNS közvetlen pakolását számyaspoxvírussal való CV-1-sejtekben, ami lehetővé teszi a szimultán pakolást, és a pakolt vírusra a gazdaspecifikus szelekciót. Amellett, hogy a kiindulási utódtenyészetből elimináljuk a helpervírust, ezzel az eljárással megkerülhető az a fáradságos munka, hogy minden egyes pakolókísérletben elsődleges csirkeembriófibroblaszt tenyészeteket állítsunk elő. Ehelyett a vacciniavírus replikálására szokásosan használt folyamatos emlőssejtvonalak alkalmazhatók a vacciniavírus pakolására helper-szárnyaspoxvírussal.
Ismeretes, hogy a számyaspoxvírus (FPV) teljesen csak madársejtekben replikálódik, fertőzött emlőssejtekből nem kapható életképes utódvírus. Az FPV életciklusának azon meghatározott pontja, amelynél emlőssejtekben a replikáció meghiúsul, nem ismeretes. Az FPV azonban emlőssejtekben ismert módon képes virális proteineket képezni, és még védőimmunitást is képes indukálni emlősökben, ha élő vaccinaként alkalmazzuk [Taylor és munkatársai, Vaccine 6, 497-503 (1988)]. Azonban az FPV-ről korábban nem bizonyították, hogy képes lenne heterológ poxvírus genomiális DNS, különösen közvetlenül manipulált vacciniavírus DNS heterológ pakolására.
A kiindulási kísérletben 5xl06 CV-l-sejtet pfu/sejt számyaspoxvírussal (HP 1.441 törzs) fertőzünk, és 1 órán keresztül inkubáljuk. Ezt követően a fertőzött sejtekbe egy kalcium-foszfátos precipitátumot transzfektálunk, amelynek 1 ml-je 1 pg vad típusú vacciniavírus-DNS-t tartalmaz. 15 perc elteltével szobahőmérsékleten hozzáadunk 10 ml, 10% magzati boqúszérumot tartalmazó DMEM tápközeget. A sejteket 4 órán keresztül inkubáljuk, majd a tápközeget cseréljük. A sejteket ezután 6 napon keresztül inkubáljuk, ily módon kapjuk a nyersvírus törzstenyészetet. Az utódvírust CV-1-sejteken titráljuk. A tipikus vacciniaplakkok nap elteltével válnak láthatóvá.
A pakolás hatékonyságának az alkalmazott genomiális vírus-DNS mennyiségétől való függését 0,1-10 pg DNS/5xl06 CV-l-sejt tartományban határoztuk meg (7.1 ábra). Az 1 pg-ot meghaladó mennyiségű DNS (például 10 pg) durva kalcium-foszfátos precipitátumot eredményez, amely csökkenti a transzfekció hatékonyságát pfu/pg bevitt DNS-re számolva (7.1 ábra).
A pakolt vacciniavírus hozamának a pakolás inkubációs idejétől való függésére konstans mennyiségű vad típusú vírus-DNS-t (1 pg) és konstans mennyiségű FPV helpervírust (1 pfu/sejt) alkalmaztunk a kiindulási kísérletre fent leírt körülmények között, azzal az eltéréssel, hogy a transzfektálás után 15 perccel hozzáadott tápközeget 4 óra múlva cseréltük ki, és a sejteket ezután további 1 óra-5 napon keresztül inkubáltuk a nyersvírus törzstenyészet elkészítése előtt (össztérfogat 2 ml). A csak FPV-vel fertőzött kontrolisejtekből származó, 5 napon keresztül inkubált vírus törzstenyészetben nem keletkeztek látható plakkok. Ezt a kísérletet háromszor ismételtük meg, és a tipikus eredményeket a 7.1 táblázatban ismertetjük.
7.1 táblázat
Inkubációs idő hatása az emlőssejtekben (CV-1) helper-szárnyaspoxvírussal végzett DNS-pakolásból származó vacciniavírus hozamára
Inkubációs idő (óra) Titer (pfu/ml)
24 Ι,ΟχΙΟ2
48 4,6x1ο4
72 5,0x105
96 5,6x106
120 2,1x10’
HU 219 369 Β
A pakolt vacciniavírus titere - amelyet plakkvizsgálattal határoztunk meg emlőssejtekben (CV-1) - folyamatosan növekedik a 24 órás mintegy 102 pfü/ml-ről a 120. óráig, amikor is a titer mintegy 2xl07 pfu/ml. 48-72 órás inkubálási időintervallumban célszerű mennyiségű pakolt vacciniavírus keletkezik (mintegy 104-106 pfu/ml), így ezek az inkubációs idők megfelelnek vacciniavírus-DNS rutinszerű pakolására számyaspoxvírussal emlőssejtekben.
Vaccinia-DNS pakolása számyaspoxvírussal abortivan fertőzött emlőssejtekben
Korábban kimutatták, hogy a számyaspoxvírus fertőzhet ugyan emlőssejteket, de a vírus életciklusa ezekben a nem tipikus gazdasejtekben nem teljes. A sejt típusától függően a virális növekedés vagy a korai, vagy a késői stádiumban leáll, és nem keletkeznek életképes számyaspoxvírusok (Taylor és munkatársai, 1988). Ezen kísérleti eredmények miatt végeztük el a vaccinia-DNS pakolásának vizsgálatát egy összefüggő emlőssejtvonalban.
CV-1-sejtek összefüggő egyrétegű tenyészetét 0,05 pfii/sejt FPV HP1.441 törzzsel fertőztük, és egy Notl-gyel hasított vacciniavírus-DNS-t és egy NotI helyekkel határolt gpt-génkazettát tartalmazó ligációs eleggyel transzferáltuk. Közelebbről 1 pg vacciniaDNS-t Notl-gyel emésztettünk, és ligáltuk az inzert DNS (P7,5-gpt-génkazetta) megadott mennyiségeivel. A vacciniavírusban az egyetlen NotI hely a HindlII F fragmensben egy intergénrégióban lokalizálódik [Goebel és munkatársai, Virology, 179, 247 (1990)]. 3 napos inkubálás után a sejteket összegyűjtjük, és a vírus törzstenyészetet CV-1-sejteken titráljuk gpt-szelektív médium jelenlétében (+MPA) vagy távollétében (-MPA). Az eredményeket a 7.2 táblázatban öszszegezzük.
7.2 táblázat
Abortív pakolás utáni titerek
A kísérlet száma Inzert (ng) Titerek (pfiix Ι0 2/6χ 106 sejt) Kimérák (%)
-MPA* + MPA
1. 200 17,2 1,6 9,3
2. 200 42,5 5,1 12,3
3. 400 64,0 3,8 5,9
4. 400 26,8 3,8 14,2
1. 200 17,2 1,6 9,3
5. 210,0
*MPA=mikofenolsav.
A legfontosabb eredmény az volt, hogy a számyaspoxvírus képes módosított vaccinia-DNS pakolására olyan sejttípusban, melyben ő maga nem képes szaporodni. Ezenkívül a kiméraplakkok hozama 5-10%-os tartományban volt. Ez előnyösen hasonlítható össze a klasszikus in vivő rekombinációs technikával, amelyben rendszerint a rekombinánsok az összes plakkoknak mintegy 0,1%-át teszik ki. Csak a vektorkarok ligálása (7.2 táblázat, 5. kísérlet) magasabb titert eredményezett az inzertekkel végzett 1-4. számú ligációs kísérletekhez képest, valószínűleg az agarózban tisztított inzert molekulák szennyeződéseinek hiánya miatt.
Az izolált vírusok közül néhányat plakktisztítottunk és tovább jellemeztünk. Ezek a vacciniavírus jellegzetes HindlII restrikciós képét mutatták, és ezenkívül az egyetlen inzert két lehetséges orientációjára jellemző idegen génsávokat. Az NotI helyre való inzertálással nem kaptunk olyan vírust, amely többszörös inzertet tartalmazott volna.
Heterológon pakolt kiméra-vacciniavírusok nem kereszthibridizálnak számyaspoxvírussal. Az FPV általi heterológ pakolás kiméra-vacciniavírusok szerkezetére való hatásainak tanulmányozására az F13.4, F12.5, F13.2 és F12.4 számú DNS-izolátumokat, az Notl-gyel végzett klónozókísérletből származó négy tisztított izolátumot és a számyaspoxvírus-kontrollokat is HindlII-mal emésztettük, és a kapott fragmenseket elektroforézissel elválasztottuk, és Southem-blot-hibridizációval analizáltuk egy szacharóz gradiensen tisztított virionokból előállított szárnyaspoxvírus-próbával. A vacciniavírusok nem adtak kereszthibridizációt az FPV DNS-sel.
8. példa
Módosított vacciniavírus genomiális DNS homológ pakolása egy vacciniavírus gazdaspecificitás mutánssal (vdhr), amely nem képes humán sejtvonalakban replikálódni
Ebben a példában mutatjuk be egy helperpoxvírus szerkesztését és alkalmazását, amely olyan deléciókat tartalmaz, amelyek korlátozzák annak gazdaspecificitását, különösen azon képességét, hogy bizonyos humán sejtvonalakban replikálódjon. Helpervírustól mentes módosított vacciniavírus állítható elő a vektor-DNS ezen mutáns helpervírussal való pakolásával, és a módosított vírusklónok megfelelő humán sejtek fertőzése általi izolálásával.
Ez a mutáns helpervírus a vacciniavírus gazdaspecificitás mutánsaiból származik, amelyek nem képesek különféle humán sejtvonalakban replikálódni, és megváltozott citopatikus hatást mutatnak számos egyéb sejtvonalra is, amelyek egyébként vad típusú vacciniavírussal fertőzhetők [lásd például Drillien és munkatársai, Virology 111, 488-499 (1981)]. Közelebbről ezen helpervírus genomja két gazdaspecificitás génmutációját tartalmazza, amelyek együtt megakadályozzák a vírus replikációját humán (MRC 5) sejtekben, amelyekben csak a legalább egy intakt gazdaspecificitás génnel rendelkező vacciniavírus-genomok tudnak replikálódni.
Gazdaspecificitás mutáns vacciniavírus (vdhr) szerkesztése
Gillard és munkatársai leírták egy vacciniavírus-gén genomiális lokalizációját és DNS-szekvenciáját, amely a humán sejtekben való replikációhoz szükséges [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 5573-5577 (1986)]. Jelenleg ezt a gént KIL-nek nevezik [Goebel és munkatársai (1990)]. Egy másik vacciniavírus gazdaspecificitás gént is feltérképeztek [Perkus és munkatársai, J. Virology 63, 2829-2836 (1990)]. Ez a második gén - amelyet
HU 219 369 Β
Goebel és munkatársai (1990) után C7L-nek neveznek - a HindlII C és HindlII N fragmenseket magában foglaló régióban fekszik. Ez a régió a vacciniavírus WR.6/2 törzsből delécióval törölve van [Moss és munkatársai, J. Virol. 40, 387-395 (1981)]. A WR6/2 törzsből ezért hiányzik a C7L gazdaspecificitás gén.
A vdhr helpervírust - amelyből mind a K1L, mind a C7L gazdaspecificitás gén hiányzik - a C7L-negatív WR6/2 törzsből konstruáltuk markermentési módszerrel, egy módosított EcoRI K fragmenssel, amelyből a K1L gazdaspecificitás gént delécióval töröltük (lásd a
8.1 ábrát). Ez a módosított EcoRI K fragmens egy szelektív markergént (E. coli gpt-gén) tartalmaz a módosított EcoRI K fragmenst tartalmazó módosított WR6/2 genomok szelektálásának elősegítésére, intracelluláris markermentést alkalmazva Sam és Dumbell (1981) módszere szerint. Perkus és munkatársai (1989) ismertettek egy feltételes letális mutánst is, amely nem rendelkezik a humán sejtvonalakon való szaporodás képességével.
Közelebbről úgy járunk el, hogy a vad típusú vacciniavírus-DNS 5,2 kb hosszúságú EcoRI K fragmensét a pFP-tkl8i plazmidba szubklónozzuk. A kapott plazmidot pFP-EcoKl-nek nevezzük. A vacciniavírus gazdaspecificitás K1L gént Gillard és munkatársai, 1986) töröljük, és ezzel egyidejűleg egy egyedi NotI helyet vezetünk be „loop-out” mutagenezissel, P-hr(3) oligonukleotid (42. azonosítási számú szekvencia) alkalmazásával. A kapott plazmidot pEcoK-dhr-nek nevezzük.
A pFP-tkl8i plazmidot a pFP-tk-10.4 plazmid módosításával szerkesztjük meg (lásd Falkner és munkatársai, 89303887.7 számú, 0338 807 számon publikált európai szabadalmi leírás 3. és 8. példája, és a teljes kitanítás, amelyet jelen bejelentésünkben referenciaként beépítettünk). A pFP-tkl0.4 plazmidot Ncolgyel emésztjük, és egy adapterral ligáljuk, amely a P-Ncol(l) és P-Ncol(2) illesztett nukleotidokból áll, ezáltal az FPV tk-gén egyetlen Ecol helyére egy többszörös klónozóhelyet vezetünk be, amely az EcoRI, NotI és HindlII restrikciós endonukleáz hasítási helyeket tartalmazza.
A vacciniavírus szekvenciáját Goebel, S. J. és munkatársai publikálták [Virology 179, 247-266 (1990)]. Ez a szekvencia az EMBO Adatbankban (Génbank) M35027 számon hozzáférhető. A vacciniavírus gazdaspecificitás K1L gén szekvenciáját Gillard S. és munkatársai publikálták [Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83, 5573-5577 (1986)] és az EMBO Adatbankban (Génbank) ID PXVACMHC azonosítási néven hozzáférhető. Ezért a K1L gén kódolószekvenciáját nem közöltük a 21. azonosítási számú szekvenciában. A pEcoK-dhrben a K1L gén delécióval törölve van, és egy NotI hellyel van helyettesítve. Látható a PXVACMHC szekvencia és az inzert NotI hely kapcsolódó régiója (1-20-as helyzetű bázisok jelen szekvenciánkban, amelyek az ID PXVACMHC-ben a 72-91-es helyzetű bázisoknak felelnek meg). A K1L kódolórégiója delécióval törölve van, és ez helyettesítve van egy NotI hellyel, amelyet két G-maradék követ (21-30-as helyzetű bázisok jelen szekvenciában). A szekvencia egy 20 bp hosszúságú határolórégióval folytatódik (31-50-es helyzetű bázisok jelen szekvenciában; az ID
PXVACMHC-ben a 944-963-as helyzetű bázisok).
A következő lépésben a pEcoK-dhr-t Notl-gyel linearizáljuk, és a pN2-gpta plazmidból (4. példa) Notl-es emésztéssel kapott 1,1 kb hosszúságú P7,5-gpt-génkazettával ligáljuk. A kapott pdhr-gpt plazmidot használjuk a vdhr helper vírus előállítására.
A pEcoK-dhr-be illesztett NotI kazetta - amely a P7,5 promoter-gpt-génkazettát tartalmazza - és az 5’és 3’-határolórégiók 20 bázisa látható a pdhr-gpt-re megadott 22. azonosítási számú szekvenciában. A határolórégió (1-20-as helyzetű bázisok jelen szekvenciában) az ID PXVACMHC szekvenciában a 72-91-es helyzetű bázisoknak felelnek meg (lásd a pEcoK-dhrre megadott 21. azonosítási számú szekvenciát). Az inzertált DNS-szekvencia a 21-es helyzetben kezdődik (egy NotI hely első G-maradéka) és az 1189-es helyzetben ér véget (egy NotI hely utolsó C-maradéka). A gptgén transzlációs iniciátorkondonjának A-maradéka az 548-as helyzetnek felel meg. A gpt-gén transzlációs stopkodonjának T-maradéka az 1004-es helyzetnek felel meg. A szekvencia a határolórégió 20 bázisával folytatódik (jelen szekvenciában az 1192-1209-es helyzetű bázisok; az ID PXVACMHC-ben a 944-961-es helyzetű bázisok. A jelen szekvenciában 1190-es és 1191es helyzetben lévő két G-maradék a pEcoK-dhr 29-es és 30-as helyzetének felel meg.
Az Eco K fragmens vacciniavírusba való beviteléhez a plazmidot WR6/2 vacciniavírus deléciós mutánssal fertőzött elsődleges csirkeembrió-fíbroblaszt sejtekbe transzfektáljuk. A gpt-pozitívként szelektáljuk a módosított vírusokat (mikofenolsav alkalmazásával). A gpt-pozitív plakkokat háromszor plakktisztítjuk CEF sejtekben és vdhr-nek nevezzük.
A vdhr helpervírus jellemzése
A gpt-pozitív vdhr vacciniavírus szerkezetét Southem-blot-analízissel és specifikus vizsgálatokkal határoztuk meg. A vdhr vírus csirkeembrió-fibroblasztokon és két majomsejtvonalon (BSC40 és Verő) plakkokat tud képezni, de az MRC-5 humán sejtvonalban nem képes replikálódni.
Módosított vacciniavírus-DNS pakolása helpervírusként vdhr gazdaspecificitás mutáns alkalmazásával
A fenti megoldás hasznosítását a humán protrombint kódoló cDNS expressziójára szolgáló szerkezet szemlélteti. Az 5. példa 5.1 ábráján ismertetett ligációs elegyből származó terméket helpervírusként vdhr-rel fertőzött csirkeembrió-fibroblasztokba transzfektáljuk. 2 nap múlva a sejteket összegyűjtjük, és előállítjuk a nyersvírus törzstenyészetet. A pakolt vírust plakkképzés szempontjából humán MRC-5 sejteken vizsgáljuk, amelyekben a kívánt vacciniavírus replikálódik, de a mutáns vdhr helpervírus nem. 3 nap elteltével a sejteket semleges vörössel festjük, és további Southemblot-analízissel szelektáljuk a plakkokat. A kívánt szerkezettel rendelkező módosított vacciniavírus-klónokat azonosítjuk. Várhatók olyan vírusok is, amelyek az erő39
HU 219 369 Β sen homológ helpervírussal rekombináción mentek keresztül.
9. példa
HIV-gpl60-at kódoló új kiméra-vacciniavírusok (vP2-gpl60MNA, vP2-gpl60MNB és vselP-gpl60MN) szerkesztése és a rekombináns gpl60yN expressziója Vero-sejtekben
Ebben a példában szemléltetjük egy rekombináns vacciniavírus előállítását közvetlen molekuláris klónozással a HIV-1mn izolátum gpl60-jának nagy léptékű előállítására. A Ratner és munkatársai [Natúré 313, 277-284 (1985)] által ismertetett HIVII1B izolátum gpl60-jának expresszióját hagyományosan szerkesztett vacciniavírus expressziós vektor alkalmazásával Barrett és munkatársai [AIDS Research and Humán Retroviruses 5, 159-171 (1989)] ismertették. Azonban a HlVma izolátum egy igen ritka HIV-variáns. A HIV-burokproteineken alapuló vakcinák kifejlesztésére irányuló kísérleteknek sokkal gyakoribb HIV-1 izolátumokra, például MN-izolátumokra is ki kell terjednie [Gurgo és munkatársai: Virology 164, 531-536 (1988); Carrow és munkatársai: Aids Research and Humán Retroviruses 7, 831-839 (1991)]. Ennek megfelelően a találmány szerinti vacciniavírus-vektorokat közvetlen molekuláris klónozással a HIVMN izolátumok gpl60 proteinjének expresszálására szerkesztettük.
pP2-gpl60MN plazmid és a vP2-gptl60MNA és vP2-gpl60MNB kiméravírusok szerkesztése A gpl60 gén vacciniavírusba való inzertálására az alábbi stratégiát alkalmazzuk: (i) a gpl60 gént a nagy 5’-nem transzlatált régió (5’-UTR) eltávolításával és a startkodontól felfelé egy megfelelő klónozóhely bevezetésével módosítjuk; (ii) a módosított gpl60 gént a számyaspoxvírus erős, késői P2 promotertől lefelé klónozzuk (91 114 300-6 számú európai szabadalmi bejelentés, 1991. augusztus 26.), és (iii) a P2-gpl60 és P7,5-gpt génkazettákból álló tompa végű fragmenst egy megfelelő vírus gazdatörzs egyetlen restrikciós endonukleáz hasítási helyére, például a vdTK vaccinia gazdatörzs (4. példa) Smal helyére vagy a WR 6/2 vaccinia törzs [Moss és munkatársai: J. Virol. 40, 387 (1981)] vagy a vad típusú WR vaccinia törzs Smal vagy NotI helyére inzertáljuk.
A fenti célra a pN2gpt-S4 plazmidba (4. példa) egy új Smal helyet vezetünk be, amelynek eredményeképpen kapjuk a pS2gpt-S4 plazmidot (9.1 ábra, 62. azonosítási számú szekvencia). Ezt követően az S4 promotert P2 promoterrel helyettesítjük, amelynek eredményeképpen kapjuk a pS2gpt-P2 plazmidot (63. azonosítási számú szekvencia). Ez a plazmid lehetővé teszi a teljes nyitott leolvasási keretek (orf-ek) klónozását, de saját startkodonnal nem rendelkező, nem teljes orf-ek klónozására is alkalmazható; a startkodon akkor keletkezik, amikor például a fenti plazmid egyetlen Ncol helyére (CCATGG) klónozunk. A plazmidok és vírusok szerkesztését alább részletesen ismertetjük. A gpl60 gén módosítására egy PCR-rel előállított proximális helyzetű fragmens kicserélésével egy minimális 5’UTR-rel rendelkező gpl60 génkazettát állítunk elő. Ez a kazetta van jelen a végtermékben, vagyis a pP2gp!60MN plazmidban (9.1 ábra, 69. azonosítási számú szekvencia). A plazmid további jellemzői az alábbi táblázatban vannak összefoglalva.
pP2-gpl60MN (6926 bp) (69. azonosítási számú szekvencia)
Helyzet Leírás
1-3529 pS2gpt-P2 szekvenciák
2396-2851 E. coli gpt-gén rcCDS-ja
2851 a gpt-gén re TAC iniciációs kodonjának T-je
2395 re TTA stopkodon A-ja
3081-3323 a P7,5 vaccinia promoter rc-ja
3358-3526 az idézett európai szabadalmi leírás szerinti P2 promoter szekvencia avipox „intergé régió”
3534-6001 a HÍV-1 mn törzs gpl60 szekvencia CDS-a (EMBL ID REHIVmnC)
3534 a gplóŰMN ATG iniciátorkodonjának A-ja
6102 a gplóŰMN TAA stopkodonjának T-je
6173-6926 pS2gpt-P2 szekvenciák
A plazmidokat az alábbiak szerint konstruáljuk. pS2gpt-S4 szerkesztése
A pN2gpt-S34 plazmidot (4. példa) Xbal-gyel emésztjük és egy Smal adapterrel (43. azonosítási számú szekvencia: 5’-CTAGCCCGGG-3’) ligáljuk, ezáltal aktiváljuk az Xbal helyet, és egy Smal helyet alakítunk ki. A kapott plazmidot pS2gpt-S4-nek nevezzük (62. azonosítási számú szekvencia). A fenti plazmid további jellemzőit az alábbi táblázatban közöljük.
pS2gpt-S4 (4145 bp) (62. azonosítási számú szekvencia)
Helyzet Leírás
1-2226 14. azonosítási számú szekvencia pN2gpt-S4 szekvenciái. Az 1-es helyzet az első G nukleotidnak felel meg 5’-TGGCACTTT TCGGGGAAAT-3’
2227-2236 Smal adapter
5’-CTAGCCCGGG-3’
2396-2851 E. coli gpt-gén rcCDS-ja
2851 gpt gén re TAC iniciátorkodonjának T-je
2395 re TTA stopkodonjának A-ja
3081 -3323 vaccinia P7,5 promoter rc-ja
3358-3451 14. azonosítási számú szekvencia
S4 promotere [P-artP(9) oligonukleotid]
2237-4145 14. azonosítási számú szekvencia pN2gpt-S4 szekvenciái pS2gpt-P2 szerkesztése
A pS2gpt-S4 plazmid S4 promoter szegmensét Pstlgyel és Hpal-gyel való hasítással eltávolítjuk, és egy 172 bp hosszúságú Pstl-Hpal P2 promoter szegmenssel helyettesítjük. Ezt a promoter szegmenst PCR technikával állítjuk elő a pTZgpt-P2a plazmiddal (Falkner és
HU 219 369 Β munkatársai, 91 114300-6 számú európai szabadalmi bejelentés) mint templáttal, és primerként a P-P2 5’—(1) és P-P2 3’-(l) oligonukleotidokkal. A PCR terméket Pstl-gyel és Hpal-gyel hasítjuk, és a pS2gpt-S4 PstI és Hpal hasítással előállított nagy fragmensével ligáljuk. A P-P2 5’—(1) szekvenciája (44. azonosítási számú szekvencia): 5’-GTACGTACGG CTGCAGTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAG-3’; a P-P2 3’-(1) szekvenciája (45. azonosítási számú szekvencia): 5’-TCTGACTGAC GTTAACGATT TATAGGCTAT AAAAAATAGT ATTTTCTACT-3’. A PCR ffagmens helyes szekvenciáját a pS2gpt-P2-nek nevezett végtermék plazmid (63. azonosítási számú szekvencia) szekvenálásával azonosítjuk. Szekvencia primerként P-SM(2)-t (46. azonosítási számú szekvencia: 5’-GTC TTG AGT ATT GGT ATT AC-3)’ és P-SM(3)-at (47. azonosítási számú szekvencia: 5’-CGA AAC TAT CAA AAC GCT TTA TG-3’) alkalmazunk. A kapott pS2gpt-P2 plazmid jellemzői az alábbi táblázatban láthatók.
pS2gpt-P2 (4277 bp) (63. azonosítási számú szekvencia)
Helyzet Leírás
1-3357 pS2gpt-S3 szekvenciák
2396-2851 E. coli gpt-gén rcCDS-ja
2851 a gpt-gén re TAC iniciátorkodonjának T-je
2395 re TTA stopkodon A-ja
3081-3323 vaccinia P7,5 promoter rc-ja
2358-3526 P2 promoter szekvencia az EP szabadalmi leírás szerinti, avipox „intergénrégió”
3527-4277 pS2gpt-S4 szekvenciák
pMNevn2 szerkesztése
A p^envl plazmidot R. Gallo (National Cancer Institute, Bethesda, Maryland) bocsátotta rendelkezésünkre. Ez a HIV^ törzs gpl60 génjét tartalmazza
3,1 kb hosszúságú EcoRI-PvuII fragmensként klónozva a pSP72 vektorban (Promega, Inc.). A p^envl 0,6 kb hosszúságú EcoRI-Asp718 fragmensét egy 0,13 kb hosszúságú EcoRI-Asp718 fragmenssel helyettesítjük, ezáltal a gpl60 gén 5’-nem transzlatált régiójának nagy részét eltávolítjuk. Ezt a 0,13 kb hosszúságú fragmenst PCR technikával állítjuk elő templátként p^envl plazmidot és primerként P~mn(1) és P-mn(2) oligonukleotidokat alkalmazva. Az első P-mn(1) primer egy Stul helyet is bevisz, a startkodontól 1 bázispárral felfelé. A P-mnO) szekvenciája (48. azonosítási számú szekvencia): 5’-AGCTAGCTGA ATTCAGGCCT
CATGAGAGTG AAGGGGATCA GGAGGAATTA TCA-3’; a P-mn(2) szekvenciája (49. azonosítási számú szekvencia): 5’-CATCTGATGC ACAAAATAGA GTGGTGGTTG-3’. A kapott plazmidot pMNenv2-nek nevezzük. A PCR-rel előállított fragmens mutációinak kiküszöbölésére ezt a plazmidot a P-Seq (2) primerrel (50. azonosítási számú szekvencia: 5’-CTG TGG GTA CAC AGG CTT GTG TGG CCC-3’) és P-Seq (3) primerrel (51. azonosítási számú szekvencia: 5’-CAA TTT TTC TGT AGC ACT ACA GAT C-3’) szekvenáltuk.
pP2-gptl 60mn szerkesztése
A pMNenv2 plazmidból izolált, MNgpl60 gént tartalmazó 2,7 kb hosszúságú Stul-PvuII fragmenst a pS2gpt-P2 Hpal helyére inzertálva kapjuk a pP2gpl60MN plazmidot (69. azonosítási számú szekvencia).
A vP2-gpl60MNA és vP2-gpl60MNB kiméravírusokat az alábbiak szerint szerkesztettük meg. A P2-gpl60 és P7,5-gpt génkazettából álló Smal fragmenst közvetlen molekuláris klónozással illesztettük a vdTK gazda vaccinia törzs (4. példa) egyetlen Smal helyére, így kaptuk a vP2-gptl60MNA és vP2-gpl60MNB kiméravírusokat (9.2 ábra). Közelebbről a 4. példa szerinti vdTK vacciniavírust egyetlen Smal helyén hasítottuk, és a P7,5-gpt és P2-gpl60 génkazettákat tartalmazó 4,0 kb hosszúságú Smal fragmenssel ligáltuk. Hasonlóképpen a WR6/2 vaccinia törzset is hasítottuk az egyetlen Smal (NotI) helyen, és ligáltuk a P7,5-gpt gén és P2-gpl60 génkazettát tartalmazó 4,0 kb hosszúságú Smal (NotI) fragmenssel. A klónozóeljárást az 1. példában leírtak szerint hajtottuk végre. A vP2-gpl60MNA vírusban a gpl60 gén ugyanolyan irányban íródik át, mint a virális timidin-kináz környezetében lévő gének; a vP2-gpl60MNB vírusban a gpl60 gén fordított irányban íródik át. Mivel a gén helyzetéből adódó hatások befolyásolhatják az expresszió szintjét a génsebészeti úton előállított vacciniavírusokban, a P2-gpl60 és P7,5-gpt génkazettákat tartalmazó Smal (NotI) fragmenst a WR 6/2 törzs Smal (NotI) helyére is inzertáltuk. Az in vivő pakolást a 3. példában leírtak szerint végeztük.
A kiméravírusok szerkezete
A kiméravírusok várt szerkezetének megerősítésére (9.3 ábra) Southem-blot-analizist végeztünk. A tisztított vírusok DNS-eit Pstl-gyel hasítottuk, és a kapott fragmenseket agarózgélen szétválasztottuk, nitrocellulóz membránra vittük, és vaccinia timidin-kináz (tk)gén és gpl60 génpróbával hibridizáltuk. A tk-gén-próbával a vP2-gpl60MNA esetében láthatók a várt 6,9 és 14,3 kb hosszúságú fragmensek, és a vP2-gpl60MNB esetében a várt 8,7 és 12,5 kb hosszúságú fragmensek. A gpl60 próbával (pMNenvl) látható a vP2-gpl60MNA várt 14,3 kb hosszúságú, és a vP2-gpl60MNB várt
8,7 kb hosszúságú fragmense, megerősítve ezáltal az idegen génkazetták beépülését két különböző orientációban.
vP2-gpl60MNA és vP2-gpl60MNB kiméravírusokkal végzett expressziós kísérletek Az expresszió vizsgálatát Vero-sejteken végeztük.
A sejtek tenyésztését, kiméravírusokkal való fertőzését, és a rekombináns gpl60 protein tisztítását Barrett és munkatársai fent idézett eljárásai szerint hajtottuk végre.
gpl60 Western-blot-analízise
A Westem-blotokat lényegében Towbin és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6672-6676 (1979)] módszere szerint hajtottuk végre. Az első antitest egy egér monoklonális anti-HIV-gpl20 antitest (Du Pont, Inc. No. NEA9305), amelyet 1:500-as hígításban alkalmaztunk. A második antitest egy kecskeanti-egér IgG (H+L) lúgos foszfatázzal kapcsolva
HU 219 369 Β (BioRad., Inc., No. 170-6520), amelyet 1:1000-es hígításban alkalmaztunk. A BCIP és NBT reagensek és a festési eljárás a Promega Inc.-tői származnak.
pselP-gp 160mnplazmid és a vselP-gpl60MNkiméravírus szerkesztése
A selP szintetikus korai/késői promotert (70. azonosítási számú szekvencia) [S. Chakrabarti és B. Moss; 91 114 300-6 számú európai szabadalmi bejelentés, Rekombináns szárnyaspoxvirus) - amely a legerősebb ismert vacciniavírus promoterek egyike - alkalmaztuk ebben a példában a HIV-1^ törzs gpl60 génjének expresszálására. Először megszerkesztettük a pselPgpt-L2 plazmidot (9.4 ábra). Ez a plazmid magában foglalja a selP promotert, amelyet egy többszörös klónozóhely követ a teljes vagy nem teljes nyitott leolvasási keretek formájában lévő idegen gének inzertálására, és transzlációs stopkodonok mindegyik leolvasási keretben, amelyeket a vacciniavírus korai transzkripciós stopjel (TTTTTNT) követ [Rohrmann és munkatársa: Cell. 46, 1029-1035 (1986)]. A P7,5-gpt-gén-kazetta a promoter szomszédságában lokalizálódik, és domináns szelekciós markerként szolgál [Falkner és munkatársai: J. Virol. 62, 1849-1854 (1988)]. A selP promoter markergénkazettákat restrikciós endonukleáz hasítási helyek határolják, amelyek a vacciniavírus genomban egyediek (Sfil, NotI, RsrII), és tompa végű fragmensként is kivághatok (például Hpal-gyel és SnaBI-gyel végzett hasítással). A gpl6O gén pselPgpt-L2-be való inzertálására egy Ncol helyet vezetünk be a transzlációs startkodon közelében. Ez a mutáció az arginin (AGA) alaninnal (GCC) való helyettesítését eredményezi. Nem valószínű, hogy ez a mutáció a szignálpeptid második aminosavában zavarja a gpl60 gén kielégítő expresszióját. A klónozási eljárás és a vad típusú és módosított gpl60 gén körüli szekvencia a 9.5 ábrán látható. A fenti mutáció gpl60 génbe való bevezetésére egy PCR-technikával előállított központi fragmenst cseréltünk ki. A plazmidok szerkesztését részletesebben alább ismertetjük.
pL2 szerkesztése
A pL2 szerkesztésére a pTM3 plazmid [Moss és munkatársai: Natúré, 348, 91 (1990)] 0,6 kb hoszszúságú Xbal-Clal fragmensét helyettesítettük egy Xbal-Clal adapter fragmenssel, amely az összeillesztett o-542 oligonukleotidból (52. azonosítási számú szekvencia: 5’-CGA TTA CGT AGT TAA CGC GGC CGC GGC CTA GCC GGC CAT AAA AAT-3’) és o-544 oligonukleotidból (53. azonosítási számú szekvencia: 5’-CTA GAT TTT TAT GGC CGG CTA GGC CGC GGC CGC GTT AAC TAC GTA AT-3’) áll. A fenti klónozási lépésből származó köztes plazmidot pLl plazmidnak nevezzük. A 0,84 kb hosszúságú Aatll-Sphl fragmenst (a nem kódoló gpt-szekvenciák része) egy Aatll-Sphl adapter fragmenssel helyettesítettük, amely az összeillesztett o-541 oligonukleotidból (54. azonosítási számú szekvencia: 5’-CTT TTT CTG CGG CCG CGG ATA TGG CCC GGT CCG GTT AAC TAC GTA GAC GT-3’) és o-543 oligonukleotidból (55. azonosítási számú szekvencia: 5’-CTA CGT AGT TAA CCG GAC CGG
GCC ATA TAG GCC GCG GCC GCA GAA AAA GCA TG-3’) áll. A kapott plazmidot pL2-nek nevezzük.
pTZ-L2 szerkesztése
Az Xbal-Sphl fragmenst (amely a T7-promoterEMC-T7-terminátor szegmensből, a többszörös klónozóhelyből és a P7,5-gpt-génkazettából áll) Klenowpolimerázzal kezeljük, és a pTZ19R plazmid (Pharmacia, Inc.) PvuII helyei közé inzertáljuk. A kapott plazmidot pTZ-L2-nek nevezzük (64. azonosítási számú szekvencia). A plazmid további jellemzői az alábbi táblázatban láthatók.
pTZ-L2 (4701 bp) (64. azonosítási számú szekvencia)
Helyzet Leírás
1-55 pTZ19R szekvenciák (Pharmacia)
56-108 I linker re orientációban (5TNT, NotI, Sfil, RsrII, Hpal, SnaBI, AatlI)
110-860 E. coli gpt-szekvenciák re orientációban. A gpt nyitott leolvasási keret a 860-as helyzetben egy re TAC startkodonnal kezdődik, és egy re ATT stopkodonnal ér véget a 403-as helyzetben
861-1338 vacciniavírus p7.5 promoter szekvenciák re orientációban
1339-1344 Hpal hely a T7 bakteriofág terminátor és a vacciniavírus p7.5 promoter között
1345-1488 T7 bakteriofág terminátor szekvenciák re orientációban (Studier és munkatársai)
1489-1558 Többszörös klónozóhely re orientációban (Sáli, transzlációs stopkodonok mind a három nyitott leolvasási keretre, Stul, Xhol, PstI, BamHI, Spel, SacI, Smal, EcoRI, Ncol)
1559-2131 Encephalomyocaditis vírus (EMC-vírus) 5’-nem transzlatált régiójából származó szekvenciák re orientációban
2132-2187 T7 bakteriofág promoterszekvenciák re orientációban
2190-2242 II linker re orientációban (SnaBI, Hpal, NotI, Sfil, 5TNT)
2243-4701 pTZ19R szekvenciák (Pharmacia)
PTZselP-L2 és pselP-gpt-L2 szerkesztése A 0,6 kb hosszúságú Clal-Ncol fragmenst (T7-promoter-EMC szekvenciát) egy szintetikus promoter fragmenssel helyettesítjük, amely az összeillesztett o-selPI oligonukleotidból (56. azonosítási számú szekvencia: 5’-CGA TAA AAA TTG AAA TTT TAT TTT TTT TTT TTG GAA TAT AAA TAA GGC CTC-3’, 51mer) és o-SelPII oligonukleotidból (57. azonosítási számú szekvencia: 5’-CAT GGA GGC CTT ATT TAT ATT CCA AAA AAA AAA AAT AAA ATT TCA ATT TTT AT-3’) áll. A kapott pTZselP-L2 közti plazmid még mindig tartalmazza a T7-terminátort és
HU 219 369 Β pselP-gpl60MN (6474 bp) (66. azonosítási számú szekvencia) egy Hpal helyet, amelyet a következő klónozólépésben eltávolítunk, ezáltal egy vaccinia korai transzkripciós stopszignált építünk be, és a P7,5 promoter fragmens méretét 0,28-ról 0,18 kb-ra csökkentjük. A 239 bp hoszszúságú Sall-Ndel fragmenst Sáli-Ndel adapterrel helyettesítjük, amely az összeillesztett o-830 oligonukleotidból (58. azonosítási számú szekvencia: 5’-TCG ACT TTT TAT CA-3’) és o-857 oligonukleotidból (59. azonosítási számú szekvencia: 5’-TAT GAT AAA AAC-3’) áll. A kapott plazmidot pselP-gpt-L2-nek nevezzük (65. azonosítási számú szekvencia). Az így kapott plazmid további jellemzői az alábbi táblázatban láthatók.
pselP-gpt-L2 (3878 bp) (65. azonosítási számú szekvencia)
Helyzet Leírás
1-55 pTZ19R szekvenciák (Pharmacia)
56-108 I linker re orientációban (5TNT, NotI, Stíl, RsrII, Hpal, SnaBI, AatlI)
110-860 E. coli gpt-szekvenciák re orientációban. A gpt nyitott leolvasási keret a 860-as helyzetben egy re TAC startkodonnal kezdődik és egy re ATT stopkodonnal ér véget a 403-as helyzetben
861-1245 Vacciniavírus p7.5 promoterszekvenciák re orientációban, amelyek a p7,5 belső Ndel helyével kezdődnek 1241-es helyzetben
1246-1258 Vaccinaivírus korai transzkripciós stopszignál re orientációban egy Ndel hellyel (1245-ös helyzet) és egy Sáli hellyel (1253-as helyzet) határolva
1259-1322 Többszörös klónozóhely re orientációban (Sáli, transzlációs stopkodonok mind a három nyitott leolvasási keretre, Stul, Xhol, PstI, BamHI, Spel, Sacl, Smal, EcoRI, Ncol)
1323-1374 Vacciniavírus szintetikus korai/késői promoter re orientációban, 1317-es helyzetben egy Ncol hellyel és 1370-es helyzetben egy Clal hellyel határolva
1375-1414 II linker re orientációban (SnaBI, Hpal, NotI, Sfil, 5TNT)
1415-3878 pTZ19R szekvenciák (Pharmacia)
pSelP-gpl60MN szerkesztése A PMNenyI Ecorl-PvuII fragmensét tartalmazó
3,1 kb hosszúságú env gént inzertáljuk az EcoRI-gyel és Stul-gyel hasított pselP-gpt-L2 plazmidba, így kapjuk a köztes pselP-gpl60.1 plazmidot. A pselP-gpl60 0,8 kb hosszúságú Ncol-Nsil fragmensét egy PCR technikával előállított 0,31 kb hosszúságú Ncol-Nsil fragmenssel helyettesítve kapjuk a kívánt pselPgpl60MN plazmidot (66. azonosítási számú szekvencia). A fenti plazmid további jellemzői a következő táblázatban láthatók.
Helyzet Leírás
1-55 pTZ19R szekvenciák (Pharmacia)
56-108 I linker re orientációban (5TNT, Stíl, RsrII, Hpal, SnaBI, AatlI)
110-860 E. coli gpt-szekvenciák re orientációban. A gpt nyitott leolvasási keret 860-as helyzetben kezdődik az re TAC startkodonnal és 403-as helyzetben ér véget a re ATT stopkodonnal.
861-1245 Vacciniavírus p7,5 promoterszekvenciák re orientációban, melyek az 1241-es helyzetben a p7,5 belső Ndel helyével kezdődnek
1246-1258 Vacciniavírus korai transzkripciós stopjel re orientációban (1245-1252-es hely), amelyet 1241-es helyzetben egy Ndel hely és 1253-as helyzetben egy Sáli hely határol
1259-3916 HIV-MN env gén re orientációban. Az ORF 3916-os helyzetben kezdődik egy re TAC startkodonnal és 1348-as helyzetben ér véget egy re ATT stopkodonnal
3917-3970 Vacciniavírus szintetikus korai/késői promoter re orientációban, amelyet 3913-as helyzetben egy Ncol hely és 3966-os helyzetben egy Clal hely határol
3971-4015 II linker re orientációban (SnaBI, Hpal, NotI, Sfil, 5TNT)
4016-6474 pTZ19R szekvenciák (Pharmacia)
A PCR-reakcióban primerként 40-mer o-NcoI-et (60. azonosítási számú szekvencia: 5’-GAG CAG AAG ACA GTG GCC ATG GCC GTG AAG GGG ATC AGG A-’3) és 30-mer o-Nsil-et (61. azonosítási számú szekvencia: 5’-CAT AAA CTG ATT ATA TCC TCA TGC ATC TGT-3’) alkalmazunk. További klónozásra a PCR terméket Ncol-gyel és Nsil-gyel hasítjuk.
vselP-gp!60MNA és vselP-gpl60MNB kiméravírusok szerkesztése
A selP-gpl60 és P7,5-gpt-génkazettákat tartalmazó Hpal fragmenst közvetlen molekuláris klónozással illesztjük (9.6 ábra) a WR 6/2 vacciniavírus törzs Smal helyére [Moss és munkatársai: J. Virol. 40, 387-395 (1981)], amely egy erősen gyöngített vacciniavírus törzs [Buller és munkatársai: Natúré 317, 803-815 (1985)]. A WR 6/2 vacciniavírust (lásd Moss és munkatársai fenti munkáját) egyetlen Smal helyén hasítjuk, és egy 4,0 kb hosszúságú Hpal fragmenssel ligáljuk, amely a P7,5-gpt-gén és a selP-gpl60 génkazettákat tartalmazza. A klónozóeljárást az 1. példában leírtak szerint végezzük.
Az így kapott vselP-gpl60MNA és vselPgpl60MNB kiméravírusokat tisztítjuk, és tovább jellemezzük. A vselP-gpl60MNA vírusban a gpl60 gén
HU 219 369 Β ugyanazon irányban íródik át (balról jobbra) mint az inszerció helye körül felhalmozódó gének [az A51R nyitott leolvasási keret; Goebel és munkatársai, 179, 247-266 (1990)]. A vselP-gplóO^B vírusban a gpl60 gén fordított irányban íródik át. Az in vivő pakolást a 3. példában leírtak szerint végezzük.
A kiméravírusok szerkezete
A kiméravírusok várt szerkezetének (9.7 ábra) megerősítésére Southem-blot-analízist végeztünk. A tisztított vírusok DNS-ét Sall-gyel hasítjuk, a fragmenseket agarózgélen elválasztjuk, nitrocellulóz szűrőre visszük, és vaccinia SalF fragmens próbával (pTZ-SalF) és gpl60 gén próbával (pMNenvl) hibridizáljuk. A SalF fragmens próbával hibridizál va a vselP-gpl60MNA esetében látható az előre várt 6,8 és 10,7 kb hosszúságú fragmens, a vselP-gplóOMNB esetében pedig a várt 3,5 és 13,7 kb hosszúságú fragmens. A gpl60 próbával ugyanezek a fragmensek láthatók, de a 10,7 kb hosszúságú fragmens a vselP-gplőOmjjA esetében és a 3,5 kb hosszúságú fragmens a vselP-gplőOMNB esetében kevésbé intenzív jelet ad, mivel az egyes teljes fragmenseknek csak mintegy 400 bázispárja homológ a próbával.
Mivel a közvetlen klónozás tandem multimer szerkezetek kialakulását is eredményezi, a vírusok DNS-ét Xbal-gyel is hasítottuk, amely nem hasítja az inzertált DNS-t. A vad típusú Xbal fragmens hosszúsága 447 bp. A 3,8 kb hosszúságú inzert egy példányának beépülése egy 4,3 kb hosszúságú fragmenst eredményez. A multimer szerkezetekben a 4,3 kb fragmens mérete 3,8 kb növekményekkel növekedik.
vselP-gpl60MNA és vselP-gpl60MNB kiméravírusokkal végzett expressziós vizsgálatok Az expresszió vizsgálatára Vero-sejteket alkalmaztunk. A sejtek szaporítását, kiméra vírusokkal való fertőzését és a rekombináns gpl60 protein tisztítását Barrett és munkatársai fent idézett eljárásával végeztük.
10. példa
Humán S-proteint kódoló új kiméra-vacciniavírusok (vProtS) szerkesztése és a rekombináns S-protein expressziója
Ebben a példában mutatjuk be a rekombináns S-protein expresszálását kiméra-vacciniavírussal. A humán Sprotein egy 70 kD méretű glikoprotein, amely a véralvadás szabályozásában játszik szerepet [DiScipio és munkatársai: Biochemistry, 18, 89-904 (1979)]. Az S-protein cDNS-ét és genomiális DNS-ét már klónozták és jellemezték [Lundwall és munkatársa: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6716 (1986); Hoskins és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 349 (1987); Edenbrandt és munkatársai: Biochemistry, 29, 7861 (1990); Schmidel és munkatársai: Biochemistry, 29, 7845 (1990)].
A humán S-proteint - amely egyébként 70 kD méretű proteinként a májban és az endoteliális sejtekben szintetizálódik (DiScipio és munkatársai fent idézett munkája) - humán 293 és hörcsög AV12-664 sejtekből származó permanens sejtvonalakban (adenovírus transzformált sejtvonalak) expresszálták legfeljebb 7 μ g/106 sejt/nap koncentrációban [Grinnell és munkatársai: Blood 76, 2546 (1990)], vagy C127 egér sejt/papilloma vírusrendszerben, ahol hasonló expressziós szintek érhetők el [Maim és munkatársai: Eur. J. Biochem., 187, 737 (1990)]. Az utóbbi sejtekből származó protein nagyobb, mint a plazma eredetű S-protein, valószínűleg egy rendellenes glikozilezés következtében.
Az S-protein találmány szerinti expresszálására egy kettős gén kazettát alkalmazunk, amely a humán vérfaktor S-proteint kódoló komplementer DNS-ből és a gptgénből áll, mindkettő egy vaccinia promoter szabályozása alatt. Ezt a kazettát az egyetlen NotI helyre klónozzuk, és számyaspoxvírus helpervírussal fertőzött emlőssejtekben pakoljuk. A humán S-protein fertőzött Verő sejtekben 4-6 pg/106 sejtkoncentrációban expreszszálódik.
Az S-protein vacciniavírus általi optimális expreszsziójára alkalmas sejtek vizsgálatára öt különböző gazdasejtvonalat alkalmaztunk, ezek a WI 38 (humán embrionális tüdőfibroblaszt), CV-1 és Verő (majom vesesejtek), Chang-májsejt és SK Hepl. Az S-protein számos módszerrel nem volt megkülönböztethető a plazmából származó S-proteintől, a fenti sejtvonal fertőzött sejtjeiből származó rekombináns anyag ugyanazt az elektroforetikus vándorlási képet és ugyanazt a kromatográfiás elúciós profilt mutatta, mint a plazmából származó S-protein. Ez jelzi, hogy fenti komplex glikoprotein helyes poszttranszlációs módosítása végbement. Az eljárást részleteiben alább ismertetjük.
pN2-gptaProtSplazmid szerkesztése
A humán S-proteint kódoló cDNS-t tartalmazó pBluescript-ProtS plazmidból (amelyet R. T. A. McGillivray bocsátott rendelkezésünkre) készített egyszálú DNS-t alkalmaztuk az S-proteint kódolórégió transzlációs startkodonjának környezetében lévő régió mutagenezisére egy Ncol helyre (CCATGG). Az oProtSl mutagén primer (68. azonosítási számú szekvencia) szekvenciája 5’-ACC CAG GAC CGC CAT GGC GAA GCG CGC-3’; a mutagenezist az Amersham, Inc. által előírt protokoll szerint hajtottuk végre. A mutáció a szignálpeptidben megy végbe úgy, hogy a második aminosav argininről alaninra cserélődik (10.1 ábra B része és 77. és 79. azonosítási számú szekvenciák). Ez egy Ncol helyet vezet be a szekvenciába, amely a további klónozáshoz szükséges, és az ATG startkodont a transzlációhoz optimális helyzetbe hozza. Ez javíthatja az S-protein kiválasztását.
Ezután az S-protein cDNS-t NcoI-NotI fragmensként kivágjuk, és pTKgpt-selP vaccinia inszerciós plazmidba (Falkner és munkatársai fent idézett munkája) inzertáljuk, ez a plazmid egy erős szintetikus vaccinia promotert szolgáltat. Ezután a promoter-S-proteingén-kazettát BglII-NotI fragmensként kivágjuk, és a pN2-gpta plazmidba (1. példa) inzertáljuk, így kapjuk a pN2-gptaProtS plazmidot (67. azonosítási számú szekvencia). A fenti szerkezet további jellemzői az alábbi táblázatból láthatók.
pN2-gptaProtS (6811 bp) (67. azonosítási számú szekvencia)
Helyzet Leírás
1-2217 Bluescript II SK szekvenciák (Stratagene)
HU 219 369 Β
(a táblázat folytatása)
Helyzet Leírás
2218-2225 NotI hely (1)
2226-4938 ProtS szekvenciák re orientációban. A nyitott leolvasási keretek a 4938-as helyzetben kezdődnek egy re TAC startkodonnal és 2910-es helyzetben fejeződnek be egy re ATT stopkodonnal
4939-4992 Vacciniavírus szintetikus korai/késői promoter re orientációban, amelyet 4935-ös helyzetben egy Ncol hely és 4987-4992-es helyzetben egy fuzionált BglII/BamHI hely határol. Az Ncol hely tartalmazza a ProtS TAC startkodont.
4993-5493 Vacciniavírus p7,5 promoterszekvenciák
5494-6127 E: coli gpt-szekvenciák. Az ORF az 5494-es helyzetben ATG startkodonnal kezdődik és 5950-es helyzetben egy TAA stopkodonnal fejeződik be
6128-6235 NotI hely (2)
6236-6811 Bluescript II SK szekvenciák (Stratagene)
Ebben a plazmidban a vacciniavírus P7,5 promoter által szabályozott gpt-gén és az S-protein cDNS eltérően van átírva, és NotI helyekkel van határolva.
vProtS előállítása humán S-protein cDNB inzertálásával vacciniavírus egyetlen NotI helyére A gpt- és S-protein-kazettákat tartalmazó NotI fragmenst a vacciniavektor-karokkal ligáljuk, és FPV-vel fertőzött emlős CV-l-sejtekbe transzferáljuk. Csak a pakolt vacciniavírus szaporodik ilyen körülmények között. Közelebbről 1 pg vad típusú vacciniavírus DNS-t Notl-gyel hasítunk, az enzimet 30 percen keresztül 65 °C-on melegítve hővel inaktiváljuk. A vektort egy éjszakán keresztül ligáljuk 1 pg 3,8 kb hosszúságú gpt/Sprotein gén kazettával (amelyet a pN2-gpta-ProtS plazmidból NotI fragmensként hasítunk r) 30 pl elegyben, 15 egység T4 DNS-ligáz alkalmazásával.
Az 5 napos inkubálással előállított nyersvírus törzstenyészetet mikofenolsav (MPA) jelenlétében és annak távollétében titráljuk. Ezzel az eljárással különböztethető meg a rméra a visszaligált vad típusú vírustól. MPA jelenlétében 4x1ο4, anélkül 6xl05 pfú/106 gazdasejt litert kapunk. A vírusplakkoknak mintegy 6-7%-a kiméravírus. A gpt-pozitív izolátumok közül tízet plakktisztítottunk kétszer, kis mennyiségű nyers törzstenyészetet készítettünk, és CV-1-sejtek fertőzésére alkalmaztuk. Kipreparáltuk az összes DNS-t, SacI és NotI restrikciós enzimekkel hasítottuk, és Southem-blot-analízissel analizáltuk (10.2 ábra). A klónozott SacI-Ι fragmenssel (pTZ-SacI plazmid, 4. példa) hidridizált SacI emésztési tennék lehetővé tette az inzertált DNS orientációjának meghatározását, mivel a SacI az inzerteket aszimmetrikusan hasítja. Az inzertek mind a 10 izolátumban „a” orientációban vannak (6.3 és 4.6 kb hoszszúságú fragmensek, lásd a 10,2 ábra A és C részét), jelezvén, hogy ez a konfiguráció sokkal előnyösebb. Az
NotI fragmenseket az S-protein-próbával hibridizáltuk.
Ebben az esetben a 3,8 kb hosszúságú NotI génkazetta szabadult fel (10.2 ábra B része).
Humán S-protein expressziója kiméra-vacciniavírussal
A gpt-pozitív kiméravírusokból nyers törzstenyészeteket készítettünk, és különféle emlőssejtvonalak fertőzésére alkalmaztuk. 5 χ 106 sejtet tartalmazó egyrétegű sejttenyészeteket 0,1 pfu/sejttel fertőztünk, 50 pg/ml K-vitaminnal kiegészített szérummentes közegben (DMEM), és 72 órán keresztül inkubáltuk. A felülúszókat összegyűjtöttük, és az S-protein antigént ELISA-tesztkészlet alkalmazásával (Boehringer Mannheim, NSzK, a készlet száma: 1360264) meghatároztuk. Az elhasználódott Sprotein mennyiségét az 1. táblázatban milliegységben adjuk meg (1 egység 25 pg S-proteinnek felel meg).
Vero-sejtekből származó 10 pl felülúszót is analizáltunk Westem-blottal, standardként 50 ng humán plazmából származó S-protein és egy „hu Prot S”-re specifikus egér poliklonális szérum (Axell) alkalmazásával (10.3 ábra). A biotokat lúgos foszfatázzal konjugált kecske-antiegér poliklonális szérummal (Dakopatts) és szubsztrátként NBT/BCIP-vel festettük.
A rekombináns S-protein tisztítását sejttenyészetek felülúszójából Grinnell és munkatársai (1990) módszere szerint végeztük.
10.1 táblázat
Sejtvonal ATCC szám Milliegység, huProtS/106 sejt
SK Hepl (HTB52) 750
Verő (CCL 81) 127
Chang máj (CCL 13) 135
CV-1 (CCL 70) 450
WI 38 (CCL 75) 440
11. példa
Humán IX faktort kódoló kiméra-vacciniavírusok előállítása és rekombináns IX faktor expressziója Egy kettős gén kazettát - amely a humán IX vérfaktort kódoló komplementer DNS-t és a gpt-gént tartalmazza, mindkettőt egy vaccinia promoter szabályozása alatt - a vacciniavírus WR-genom egyetlen NotI helyére klónozunk, és helper-számyaspoxvírussal fertőzött emlőssejtekben pakoljuk.
A humán IX faktort számos sejttípusban expresszáljuk.
A humán IX véralvadási faktor egy 56 kD méretű glikoprotein, amely a véralvadás szabályozásában játszik szerepet. Ez a véralvadási faktor komplex poszttranszlációs módosításokon megy keresztül, ezek: az első 12 glutaminsav-maradék K-vitamintól függő karboxilezése, glikozilezés, aszparaginsav β-hidroxilezése és a protein aminoterminális átalakítása [Davie E. W., „The Blood Coagulation Factors: Their cDNAs, Genes and Expression”, Hemostasis and Thrombosis, szerkesztő Colman, R. W., Hirsh, J. Marder, V. J. and
HU 219 369 Β
Salzman, E. W. J. B. Lippincott Co. (1987)]. A B hemofiliát és az X kromoszómával kapcsolatos vérzési rendellenességet a IX faktor mutációja okozza. A hemofiliás betegeket napjainkban plazmából származó IX faktor helyettesítéssel kezelik.
A cDNS-t és a IX faktor genomiális DNS-ét („FIX”) klónozzuk és jellemezzük, és az FIX-et állandó sejtvonalakban expresszáljuk [Busby és munkatársai: Natúré, 316, 271 (1985); Kaufman és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 9622 (1986); Balland és munkatársai: Eur. J. Biochem., 172, 565 (1922) és Lin és munkatársai: J. Bioi. Chem., 265, 144 (1990)]. A IX faktor vaccinia rekombinánsokban való expressziója szintén ismert [de la Salle és munkatársai: Natúré, 316, 268 (1985)].
Plazmidok szerkesztése pN2gpta-FlX szerkesztése
Az FIX cDNS-t (amelyet R. T. A. MacGillivray bocsátott rendelkezésünkre) pBluescript-FIX plazmidból EcoRI-gyel vágták ki és EcoRI-gyel linearizált pTM3 plazmiddal ligálták. [Moss és munkatársai: Natúré, 348, 91 (1990)]. Az FIX inzertet helyes orientációban tartalmazó rekombináns plazmidból izoláljuk az egyes szálú DNS-t, és Ncol helyet (CCATGG) vezetünk be az FIX ATG startkodon közelébe oligonukleotid mediálta helyirányított mutagenezissel, oFIX.l oligonukleotidot (71. azonosítási számú szekvencia: 5’-TCA TGT TCA CGS GCT CCA TGG CCG CGG CCG CAC C-3’) és kereskedelmi forgalomban kapható mutagenezis készletet (Amersham, Inc., PPN 1523. készlet) alkalmazva. A vektort és az FIX Ncol helyeket fuzionáljuk, az inzertált DNS-t Ncol-gyel végzett hasítással izoláljuk, és NcoI/Notl-gyel hasított pTKgpt-selP vektorral ligáljuk (Falkner és munkatársai fent idézett munkája). Ebből a plazmidból BglII-vel és Notl-gyel kihasítjuk a promoter/FIX kazettát, és BamHI/Notl-gyel linearizált pN2gpta vektorral (1. példa) ligáljuk. Az így kapott szerkezetből izoláljuk az NotI kazettát, amely tartalmazza az FIX cDNS-t (a selP promoter szabályozása alatt) és a gpt-gént (a vaccinia P7,5 promoter szabályozása alatt), és ezt alkalmazzuk in vitro molekuláris klónozásra és pakolásra a 10. példában leírtak szerint. A fenti plazmid további jellemzői az alábbi táblázatból láthatók.
pN2gpta-FlX (5532bp) (72. azonosítási számú szekvencia)
Helyzet Leírás
-2217 Bluescript II SK szekvenciák (Stratagene)
2218-2225 NotI hely (1)
2226-3659 FIX szekvencia re orientációban.
A nyitott leolvasási keret a 3659-es helyzetben kezdődik egy re TAC startkodonnal, és 2276-os helyzetben ér véget egy re ATT stopkodonnal
3660-3713 Vacciniavírus szintetikus korai/késői promoter re orientációban, a 3656-os helyzetben egy Ncol hellyel határolva és 3708-3713-as helyzetben BglII/BamHI hellyel fuzionálva.
Helyzet Leírás
Az Ncol hely tartalmazza az FIX TAC startkodont
3714-4214 Vacciniavírus P7,5 promoterszekvenciák
4215-4848 E. coli gpt-szekvenciák. Az ORF
4215-ös helyzetben egy ATG startkodonnal kezdődik és 4671-es helyzetben egy TAA stopkodonnal ér véget
4849-4856 NotI hely (2)
4857-5532 Bluescript II SK szekvenciák (Stratagene)
Humán IX faktort kódoló cDNS-inzertálása vacciniavírus egyetlen NotI helyére AIX faktor cDNS-vacciniavírusba való inzertálását megelőzően ezt a cDNS-t a pN2-gpta plazmidba inzertáljuk, így kapjuk a pN2gpta-FIX plazmidot (11.1 ábra A része, 72. azonosítási számú szekvencia). A szintetikus vaccinia promoter és a IX faktort kódolórégió közötti optimális szekvenciakapcsolat biztosítására a IX faktor 5’-nem transzlatált régióját a IX faktor startkodonjával, egy új Ncol hely kialakításával és ezen Ncol hely és a promoter által biztosított Ncol hely fúziójával töröljük. Ez a mutáció egy mutált szignálpeptidet eredményez (11.1 ábra B része). A vad típusú IX faktorban a szignálpeptid második aminosavja egy glu* taminmaradék, míg a pN2gpta-FIX-ben a második aminosav egy glutaminsav-maradék.
A gpt-gén és a IX faktor génkazettákat tartalmazó
NotI fragmenst vacciniavektor-karokkal ligáljuk, és FPV-vel fertőzött emlős CV-1-sejtekbe transzfektáljuk. Ilyen körülmények között csak a pakolt vacciniavírus szaporodik. Az 5 napos inkubálással kapott nyersvírus törzsszuszpenziókat mikofenolsav (MPA) jelenlétében és távollétében titráljuk. Ezzel az eljárással megkülönböztetjük a kimérákat a visszaligált vad típusú vírustól. MP A-val 5 x1ο4, MPA nélkül 5xl06 pfu/106 gazdasejt titert kapunk. Ebben a példában a virális plakkoknak mintegy 1%-a kiméravírus. A gpt-pozitív izolátumok közül tízet kétszer plakktisztítunk, majd kis mennyiségű nyers törzstenyészeteket készítünk belőlük, és CV-l-sejtek fertőzésére alkalmazzuk. A megfelelő vírusizolátummal fertőzött sejttenyészetek közül nyolcból preparáljuk a teljes DNS-t, Sful, Ndel és NotI restrikciós enzimekkel emésztjük, és Southem-blot-analízissel analizáljuk.
A IX faktor próbával hibridizált Sful emésztési termék lehetővé teszi az inzertált DNS orientációjának meghatározását, mivel az Síül az inzertet aszimmetrikusan hasítja. Mind a nyolc izolátumban „a” orientációban van az inzert (6,3 és 4,6 kb hosszúságú fragmensek, lásd a 11.2 ábrát), jelezvén, hogy ez a konfiguráció előnyösebb. Az Ndel (NotI) fragmenseket szintén hibridizáljuk a IX faktorpróbával. Ebben az esetben egy 656 kb hosszúságú fragmens (a 3,8 kb NotI gén kazetta) válik szabaddá, ami alátámasztja a várt szerkezetet.
Humán IXfaktor expressziója
Nyolc plakkizolátumból külön-külön nyers törzstenyészeteket készítünk, és ezeket alkalmazzuk különféle
HU 219 369 Β emlős sejtvonalak fertőzésére. 10 cm-es Petri-csészékben lévő 5 χ 106 sejtet fertőzünk 0,1 pfü/sejttel 50 pg/ml K-vitamint tartalmazó szérummentes tápközeg (DMEM) jelenlétében. A fertőzött sejteket 72 órán keresztül inkubáljuk, amíg a sejtek kezdenek elválni a Petri-csésze aljától. A felülúszót összegyűjtjük, és a sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk, majd az FIX mennyiségeket ELISA-módszerrel (Boehringer Mannheim, NSzK, a készlet száma: 1360299) meghatározzuk. AIX faktor FIX antigénjének mennyiségeit a 11.1 táblázatban adjuk meg.
Másik kísérletben Vero-sejtekból származó 10 pl felülúszót Westem-blottal analizálunk, standardként 50 pg humán plazmából származó huFIX-et és egy huFIX-re specifikus egér poliklonális szérumot (Axell) alkalmazva. A biotokat lúgos foszfatázzal konjugált kecske-antiegér poliklonális szérummal (Dakopatts) és szubsztrátként NBT/BCIP alkalmazásával festjük. Amint az a 11.3 ábrából látható, a rekombináns anyag széles sávként mozog, a standard plazmából származó IX faktorhoz hasonlóan. A Vero-sejtekből származó, részlegesen tisztított IX faktorral végzett alvadási vizsgálatok azt mutatják, hogy az anyagnak mintegy 50%-a hatásos IX faktor. Az 5. számú vírusizolátumot (amelyet vFIX#5-nek nevezünk) nagy léptékben tenyésztjük, és ezt alkalmazzuk a további kísérletekben. Ugyanúgy, mint az S-protein kiméravírusok esetében (10. példa), a IX faktort expresszáló kimérák is az egyik előnyös orientációban tartalmazzák az inzerteket.
A kérdéses génről a protein (IX faktor és S-protein) transzkripciója jobbról balra történt, azaz ugyanazon irányban, mint az NotI hely körül lévő génekről. Ezért úgy tűnik, hogy az erősen átíródó egységeknek az előnyös transzkripciós irányban kell elhelyezkedniük, amikor az NotI helyre klónozzuk. Az inzertet a fenti konfigurációban tartalmazó vírusok igen előnyösek, és ezek mutatják a legjobb szaporodási tulajdonságokat. A másik génkazetta, a P7,5 gpt-gén transzkripciójának iránya balról jobbra volt. Ezért a P7,5 promoter szegmens fordított ismétlődő konfigurációban van a 7,5 kD-os proteint kódoló közeli endogén génhez viszonyítva, azaz a várt stabil konfiguráció az előnyös. Mivel nem találtunk fordított orientációval rendelkező kimérákat, a „b” orientáció valószínűleg instabil. A fenti génkazetták „b”-orientációjú inszerciója in vivő rekombinációval nem sikerült volna, ami ahhoz a téves feltételezéshez vezethet, hogy az NotI intergénrégió esszenciális a vírusnövekedéshez. Ez a helyzet a közvetlen klónozás egyik előnyét bizonyítja: csak a megengedett szerkezetek képződnek.
Egyszerű, kisméretű génkazetták inszerciójával mindkét orientáció és multimerek is keletkeznek (1. példa), míg komplex génkazetták inszerciójával (eltérően átíródó kettős gén kazetták, amelyek belső génekkel, például P7,5 promoter szegmenssel homológiát mutatnak) az előnyös szerkezetek alakulnak ki.
Amikor a sejteket a IX faktor optimális expressziója szempontjából vizsgáltuk, azt találtuk, hogy a CV-1 és SK Hepl sejtek mutatták a legmagasabb antigénszinteket. A CV-1-sejtekből származó anyag rendelkezett a legnagyobb véralvasztó aktivitással (11.1 táblázat), jelezvén, hogy ez a sejtvonal rendelkezik a megfelelő poszttranszlációs módosítórendszerekkel. A IX faktort korábban hagyományos vaccinia expressziós rendszerekben expresszálták P7,5 promoter és HepG2 és BHK sejtek (de la Salle és munkatársai, 1985) alkalmazásával. A jobb szaporodási jellemzőkkel rendelkező sejtvonalakról, például a Verő- és CV-1-sejtekről kimutattuk, hogy jelen vírusokkal magasabb expressziós szinteket mutatnak a jobb promoterek és módszerek következtében. Ezenkívül úgy tűnik, hogy a IX faktor cDNS 5’nem transzlatált régiójának törlése és a szignálpeptid módosítása pozitív hatást fejt ki az expressziós szintekre és a szekrécióra.
11.1 táblázat
A IX faktor expressziója különböző sejtvonalakban
Sejtvonal ATCC szám Antigén milliegység/ 1O6 sejt* Aktivitás milliegység /106 sejt* Arány (%)
SK Hepl (HTB52) 810 183 22,5
Verő (CCL81) 500 282 56,4
Chang máj (CCL 13) 190 100 52,6
CV-1 (CCL70) 850 1290 151,8
RK13 (CCL37) 300 460 153,3
* 1 egység 5 gg FIX/ml humán plazmának felel meg.
12. példa f-envIIIB kiméra-számyaspoxvírus szerkesztése és rekombináns HIV1I1B burokproteinek expressziója csirkeembrió-fibroplasztokban
Barrett és munkatársai ismertették a gpl60 nagy léptékű előállítását vacciniavírus-Vero-sejt expressziós rendszerben (1989). Mivel a vacciniavírus mégiscsak patogén számos meleg vérű számára (beleértve az emlősöket is), míg a számyaspoxvírus a madárfajokra nézve gazdaspecifikus, egy madár-poxvíruson alapuló expreszsziós rendszert fejlesztettünk ki (07/734 741 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és annak folytatólagos bejelentése). Kiméra-számyaspoxvírusokat is szerkesztettek közvetlen molekuláris klónozással a HIV-1 IIIB izolátum burokgénjének expresszálására (Ratner és munkatársai, 1985). Ebben a rekombináns vírusban az env gén egy erős, szintetikus késői promoter szabályozása alatt áll. A burok-glikoproteinek előállítására a kiméra-számyaspoxvírust alkalmazták csirkeembrió-aggregátum sejttenyészetek fertőzésére (Mundt és munkatársai, PCT/WO 91/709 937).
f-envIIIB kiméra-számyaspoxvírus szerkesztése és szerkezete
Az f-envIIIB megszerkesztésére (12.1 ábra) a pN2gpt-gpl60 plazmidból (5. példa) NotI fragmens formájában kivágjuk a P7,5 promoter/gpt génből és az S4-promoter/gpl60 génből álló kettős gén kazettát. Ezt a kazettát ligáljuk az f-TK2a számyaspoxvírus Notl-gyel hasított genomiális DNS-ével (2. példa) és a
HU 219 369 Β kiméravírust az anyagok és módszerek ismertetésében leírt módon izoláljuk. A 12 különböző piákkal fertőzött csirkeembrió-fibroblasztból származó összes DNS-t Sspl-gyel emésztettük, és Southem-blottal tovább analizáltuk, hibridizálásra próbaként egy izolált gpl60 fragmenst alkalmaztunk (12.2 ábra A része). 11 esetben megtaláltuk a várt 3,7, 1,0 és 0,8 kb hosszúságú fragmenseket, jelezvén, hogy a gpl60 gén „b” orientációban integrálódott (12.2 ábra B része). 1 vírusizolátum, az f-LF2e nem hibridizált a gpl60 próbával.
Az a tény, hogy az inzert egy előnyös orientációban van, arra a lehetőségre utal, hogy a „b” orientációjú vírus szaporodása előnyös az „a” orientációval szemben, az „a” orientáció még instabil is lehet. A közvetlen klónozási módszer egyik előnye lehet az, hogy a vírusvektornak lehetőséget ad a legjobb orientáció kiválasztására.
f-envIIIB kiméravírussal végzett expressziós vizsgálatok
Az expressziós vizsgálatokat csirkeembrió-fibroblasztokon (CEF) végeztük. A CEF összefüggő egyrétegű tenyészeteit 0,1 pfu/sejt mennyiségű, 5 napos nyersvírus törzsszuszpenziókkal fertőztük. 10%-os poliakrilamid-géleken elválasztottuk az összes celluláris proteint, és nitrocellulóz szűrőkre vive az anyagok és módszerek részben leírtak szerint analizáltuk tovább. A gpl60, gpl20 és gp41 expresszióját bemutató Westem-blotok a 12.3 és 12.4 ábrán láthatók. Az f-LF2e kivételével az összes vírusizolátum indukálta az env glikoproteinek expresszióját. Az f-LF2e vírus a Southemblot-analízis szerint is negatív volt, így nem hordozza a gpl60 génszekvenciákat.
f-envIIIB szerkesztése
Az f-TK2a gazdavírusvektor (2. példa) DNS-ének 2 pg-ját Notl-gyel hasítjuk, és 500 ng P7,5 promoter/gpt génből és S4 promoter/gpl60 génből álló génkazettával ligáljuk. A ligálást 20 pl térfogatban, 4 napon keresztül, 12 °C-on hajtjuk végre, és 5 egység ligázt alkalmazunk. A ligációs elegyet 0,5 pfu/sejt HP2-vel fertőzött 6xl06 CEF-be transzfektáljuk (a HP2 a HP1.441 plakktisztításával kapott számyaspoxvírus-izolátum). 5 napos inkubálással egy nyers törzsszuszpenziót állítunk elő (végtérfogat 1 ml), amelyet felnagyítunk. A nyers törzsszuszpenziót CEF-en titráljuk 6 rezervoáros lemezeken, és 5 napon keresztül gpt5 szelekció alatt (25 pg/ml mikofenolsav, 125 pg xantin) tenyésztjük. Azokat a sejteket, amelyeken a minimális hígítás látható citopatikus hatást eredményezett összegyűjtjük, és ugyanezzel a módszerrel kétszer felnagyítjuk. A második nagyítás után kapott nyers törzsszusz10 penziót CEF-sejteken titráljuk gpt-szelekciós nyomás alkalmazásával, és 12 különálló plakkot (f-LF2a-l) veszünk le.
gplóO Westem-blotjai
A Westem-blot-analízist lényegében Towbin és munkatársai fent idézett módszere szerint hajtjuk végre. A gpl60/gpl20 detektálására első antitestként egy egér monoklonális anti-HIV-gpl20 antitestet (Du Pont, Inc., száma: NEA9305) alkalmaztunk 1:500hígításban. A gp41 detektálására humán anti-HIV-gp41
3D6 Mab-t (H. Katinger, Universitát für Bodenkultur, Inst. für Angewandte Mikrobiologie) alkalmaztunk 1:500 hígításban. A második antitest egy kecske-antiegér IgG (H+L) lúgos foszfatázzal kapcsolva (BioRad., Inc., száma: 170-6520), amelyet 1:1000 hígításban al25 kalmaztunk. A reagensek (BCIP és NBT) és a protokollok a Promega, Inc.-től származtak.
Az azonosítási számokkal definiált szekvenciákat az alábbiakban ismertetjük.
SZEKVENCIALISTA
I. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 48 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonukleotid (vii) Közvetlen forrás:
(B) klón: pN2 (xi) Szekvencia leírása:
TCAAGCTTAT CGATACCGTC GCGGCCGCGA CCTCGAGGGG GGGCCCGG
2. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
Szekvencia jellemzői: 45 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 1133 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen fonás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pN2-gpta
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CTAGAACTAG TGGATCCCCC AACTTAAGGG TACCGCCTCG ACATCTATAT ACTATATAGT 60
AATACCAATA CTCAAGACTA CGAAACTGAT ACAATCTCTT ATCATGTGGG TAATGTTCTC 120
GATGTCGAAT AGCCATATGC CGGTAGTTGC GATATACATA AACTGATCAC TAATTCCAAA 180
CCCACCCGCT TTTTATAGTA AGTTTTTCAC CCATAAATAA TAAATACAAT AATTAA1TTC 240
TCGTAAAAGT AGAAAATATA TTCTAATTTA TTGCACGGTA AGGAAGTAGA ATCATAAAGA 300
ACAGTGACGG ATGATCCCCA AGCTTGGACA CAAGACAGGC TTGCGAGATA TGTTTGAGAA 360
HU 219 369 Β
TACCACTTTA TCCCGCGTCA GGGAGAGGCA GTGCGTAAAA AGACGCGGAC TCATGTGAAA 420
TACTGGTTTT TAGTGCGCCA GATCTCTATA ATCTCGCGCA ACCTATTTTC CCCTCGAACA 480
CTTTTTAAGC CGTAGATAAA CAGGCTGGGA CACTTCACAT GAGCGAAAAA TACATCGTCA 540
CCTGGGACAT GTTGCAGATC CATGCACGTA AACTCGCAAG CCGACTGATG CCTTCTGAAC 600
AATGGAAAGG CATTATTGCC GTAAGCCGTO GCGGTCTGGT ACCGGGTGCG TTACTGGCGC 660
GTGAACTGGG TATTCGTCAT GTCGATACCG TTTGTATTTC CAGCTACGAT CACGACAACC 720
AGCGCGAGCT TAAAGTCCTG AAACGCGCAG AAGGCGATGG CGAAGGCTTC ATCGTTATTG 780
ATGACCTGGT GGATACCGGT GGTACTGCGG TTGCGATTCG TGAAATGTAT CCAAAAGCGC 840
ACTTTGTCAC CATCTTCGCA AAACCGGCTG GTCGTCCGCT GGTTGATGAC TATGTTGTTG 900
ATATCCCGCA AGATACCTGG ATTGAACAGC CGTGGGATAT GGGCGTCGTA TTCGTCCCGC 960
CAATCTCCGG TCGCTAATCT TTTCAACGCC TGGCACTGCC GGGCGTTGTT CTTTTTAACT 1020
TCAGGCGGGT TACAATAGTT TCCAGTAAGT ATTCTGGAGG CTGCATCCAT GACACAGGCA 1080
AACCTGAGCG AAACCCTGTT CAAACCCCGC TTTGGGCTGC AGGAATTCGA TAT 1133
3. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
i) Szekvencia jellemzői: 25 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság : 1133 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa egyes (B) klón: pN2-gptb
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CTAGAACTAG TGGATCCCCC AAAGCGGGGT TTGAACAGGG TTTCGCTCAG GTTTGCCTGT 60
GTCATGGATG CAGCCTCCAG AATACTTACT GGAAACTATT GTAACCCGCC TGAAGTTAAA 120
AAGAACAACG CCCGGCAGTG CCAGGCGTTG AAAAGATTAG CGACCGGAGA TTGGCGGGAC 180
GAATACGACG CCCATATCCC ACGGCTGTTC AATCCAGGTA TCTTGCGGGA TATCAACAAC 240
ATAGTCATCA ACCAGCGGAC GACCAGCCGG TTTTGCGAAG ATGGTGACAA AGTGCGCTTT 300
TGGATACATT TCACGAATCG CAACCGCAGT ACCACCGGTA TCCACCAGGT CATCAATAAC 360
GATGAAGCCT TCGCCATCGC CTTCTGCGCG TTTCAGCACT TTAAGCTCGC GCTGGTTGTC 420
GTGATCGTAG CTGGAAATAC AAACGGTATC GACATGACGA ATACCCAGTT CACGCGCCAG 480
TAACGCACCC GGTACCAGAC CGCCACGGCT TACGGCAATA ATGCCTTTCC ATTGTTCAGA 540
AGGCATCAGT CGGCTTGCGA GTTTACGTGC ATGGATCTGC AACATGTCCC AGGTGACGAT 600
GTATTTTTCG CTCATGTGAA GTGTCCCAGC CTGTTTATCT ACGGCTTAAA AAGTGTTCGA 660
GGGGAAAATA GGTTGCGCGA GATTATAGAG atctggcgca CTAAAAACCA GTATTTCACA 720
TGAGTCCGCG TCTTTTTACG CACTGCCTCT CCCTGACGCG GGATAAAGTG GTATTCTCAA 780
ACATATCTCG CAAGCCTGTC TTGTGTCCAA GCTTGGGGAT CATCCGTCAC TGTTCTTTAT 840
GATTCTACTT CCTTACCGTG CAATAAATTA GAATATATTT TCTACTTTTA CGAGAAATTA 900
ATTATTGTAT ΤΤΑΤΤΑΊΤΤΑ TGGGTGAAAA ACTTACTATA AAAAGCGGGT GGGTTTGGAA 960
TTAGTGATCA GTTTATGTAT ATCGCAACTA CCGGCATATG GCTATTCGAC ATCGAGAACA 1020
HU 219 369 Β
TTACCCACAT GATAAGAGAT TGTATCAGTT TCGTAGTCTT GAGTATTGGT ATTACTATAT
1080
1133
TAT
AGTATATAGA TGTCGAGGCG GTACCCTTAA
4. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
GTTGGGCTGC AGGAATTCGA (ii) Molekula típusa:
(A) Megnevezés:
egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 66 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pHindJ-2
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CGCATTTTCT AACGTGATGG GATCCGTTAA CTCGCGAGAA TTCTGTAGAA AGTGTTACAT 60
CGACTC 66
5. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
I Szekvencia jellemzői: 15 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 127 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pHindJ-3
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CGCATTTTCT AACGTGATGG GATCCGGCCG GCTAGGCCGC GGCCGCCCGG GTTTTTATCT 60
CGAGACAAAA AGACGGACCG GGCCCGGCCA TATAGGCCCA ATTCTGTAGA AAGTGTTACA 120
TCGACTC 127
6. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 115 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav 30 (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pAO
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
AGGGAACAAA AGCTGGAGCT AGGCCGGCTA
ACAAAAAGAC GGACCGGGCC CGGCCATATA
GGCCGCGGCC GCCCGGGTTT TTATCTCGAG 60
GGCCAGTACC CAATTCGCCC TATAG 115
7. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 103 bázispár 40 leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pAl
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CTGCAGTTAA CGAATTCCAT GGGGATCCGA 60
AAAAAGACGG ACC 103
CGGCCGCCCG GGTTTTTATC TCGACATATG
TATCAAGCTT AGGCCTGTCG ACGTCGAGAC
8. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 103 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris
CGGCCGCCCG GGTTTTTATC TCGACGTCGA
GAATTCGTTA ACTGCAGCAT ATGTCGAGAC (ii) Molekula típusa:
(A) Megnevezés:
(vii) Közvetlen forrás: (B) klón:
(xi) Szekvencia leírása:
egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid pA2
CAGGCCTAAG CTTGATATCG GATCCCCATG 60
AAAAAGACGG ACC 103
HU 219 369 Β
9. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 213 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 5 (B) klón: pAl-Sl
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CCCGGGTTTT TATCTCGACA TACGGCTTGG
GAAAACGAAA CTATCAAAAC CGTTTATGAA
TATTTTAGTT TAAGTAACAG TAAAATAATG
AATCATGAAT TCGGATCCGA TATCAAGCTT
10. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
TATAGCGGAC AACTAAGTAA TTGTAAAGAA 60
ATGATAGAAA AAAGAATATA AATAATCCTG 120
AGTAGAAAAT ACTATTTTTT ATAGCCTATA 180
AGG 213 (ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés:
(A) hosszúság: 215 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 20 (B)klón: pA2-Sl
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukCAGGCCTAAG CTTGATATCG GATCCGAATT
TTCTACTCAT TATTTTACTG TTACTTAAAC
CTATCATTTC ATAAACGGTT TTGATAGTTT
CGCTATACCA AGCCGTATGT CGAGACAAAA
11. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
CATGATTTAT AGGCTATAAA AAATAGTATT
TAAAATACAG GATTATTTAT ATTCTTTTTT
CGTTTTCTTC TTTACAATTA CTTAGTTGTC
AGACG
120
180
215 (ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés:
(A) hosszúság: 88 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 35 (B)klón: pAl-S2
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TCTCGACATA TGCTGCAGTT GGGAAGCTTT ΤΤΤΤΤΤΤΊΤΓ TTTTTTTGGC ATATAAATAG 60
GCTGCAGGAA TTCCATGGGG ATCCGATA 88 egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonuk12. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés:
egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 92 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav 45 (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pA2-S2
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TTGATATCGG ATCCCCATGG AATTCCTGCA GCCTATTTAT ATGCCAAAAA AAAAAAAAAA 60
AAAAAGCTTC CCAACTGCAG CATATGTCGA GA 92
13. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 127 bázispár 55 leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: p2gpt-S3A (4.7 ábra)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
HU 219 369 Β
TACCCTTAAG TTGGGCTGCA GAAGCTTTTT ΊΤΊΤΤΤΠΤΤ TTTTTGGCAT ATAAATGAAT 60
TCCATGGCCC GGGAAGGCCT CGGACCGGGC CCGGCCATAT AGGCCAGCGA TACCGTCGCG 120
GCCGCGA 127
14. azonosítási számú szekvencia 10 (ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés: (vii) Közvetlen forrás: (B) klón: (xi) Szekvencia leírása: egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid pN2gpt-S4
(i) Szekvencia jellemzői: (A) hosszúság: (B) típus: (C) szál típusa: (D) topológia: TACCCTTAAG TTGGC 134 bázispár nukleinsav egyes lineáris JCTGCA GAAGCTTTTT
ATAAATCGTT 60
TTTTT TTTTT TTTTTGGCAT
AACGAATTCC ATGGCCCGGG AAGGCCTCGG ACCGGGCCCG GCCATATAGG CCAGCGATAC 120
CGTCGCGGCC GCGA 134
15. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: 20 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 1988 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pA ISI -olvadáspont
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TTTTATAGCC TATAAATCAT GAATTCCGCG CACGTCCGAG GCTTGCAGCT GCCTGGCTGC 60
CTGGCCCTGG CTGCCCTGTG TAGCCTTGTG CACAGCCAGC ATGTGTTCCT GGCTCCTCAG 120
CAAGCACGGT CGCTGCTCCA GCGGGTCCGG CGAGCCAACA CCTTCTTGGA GGAGGTGCGC 180
AAGGGCAACC TAGAGCGAGA GTGCGTGGAG GAGACGTGCA GCTACGAGGA GGCCTTCGAG 240
GCTCTGGAGT CCTCCACGGC TACGGATGTG TTCTGGGCCA AGTACACAGC TTGTGAGACA 300
GCGAGGACGC CTCGAGATAA GCTTGCTGCA TGTCTGGAAG GTAACTGTGC TGAGGGTCTG 360
GGTACGAACT ACCGAGGGCA TGTGAACATC ACCCGGTCAG GCATTGAGTG CCAGCTATGG 420
AGGAGTCGCT acccacataa GCCTGAAATC AACTCCACTA CCCATCCTGG GGCCGACCTA 480
CAGGAGAATT TCTGCCGCAA CCCCGACAGC AGCAACACGG GACCATGGTG CTACACTACA 540
GACCCCACCG TGAGGAGGCA GGAATGCAGC ATCCCTGTCT GTGGCCAGGA TCAAGTCACT 600
GTAGCGATGA CTCCACGCTC CGAAGGCTCC AGTGTGAATC TGTCACCTCC ATTGGAGCAG 660
TGTGTCCCTG ATCGGGGGCA GCAGTACCAG GGGCGCCTGG CGGTGACCAC ACATGGGCTC 720
CCCTGCCTGG CCTGGGCCAG CGCACAGGCC AAGGCCCTGA GCAAGCACCA GGACTTCAAC 780
TCAGCTGTGC AGCTGGTGGA GAACTTCTGC CGCAACCCAG ACGGGGATGA GGAGGGCGTG 840
TGGTGCTATG TGGCCGGGAA GCCTGGCGAC TTTGGGTACT GCGACCTCAA CTATTGTGAG 900
GAGGCCGTGG AGGAGGAGAC AGGAGATGGG CTGGATGAGG ACTCAGACAG GGCCATCGAA 960
GGGCGTACCG CCACAAGTGA GTACCAGACT TTCTTCAATC CGAGGACCTT TGGCTCGGGA 1020
GAGGCAGACT GTGGGCTGCG ACCTCTGTTC GAGAAGAAGT CGCTGGAGGA CAAAACCGAA 1080
AGAGAGCTCC TGGAATCCTA CATCGACGGG CGCATTGTGG AGGGCTCGGA TGCAGAGATC 1140
GGCATGTCAC CTTGGCAGGT GATGCTTTTC CGGAAGAGTC CCCAGGAGCT GCTGTGTGGG 1200
HU 219 369 Β
GCCAGCCTCA TCAGTGACCG CTGGGTCCTC ACCGCCGCCC ACTGCCTCCT GTACCCGCCC 1260
TGGGACAAGA ACTTCACCGA GAATGACCTT CTGGTGCGCA TTGGCAAGCA CTCCCGCACC 1320
AGGTACGAGC GAAACATTGA AAAGATATCC ATGTTGGAAA AGATCTACAT CCACCCCAGG 1380
TACAACTGGC GGGAGAACCT GGACCGGGAC ATTGCCCTGA TGAAGCTGAA GAAGCCTGTT 1440
GCCTTCAGTG ACTACATTCA CCCTGTGTGT CTGCCCGACA GGGAGACGGC AGCCAGCTTG 1500
CTCCAGGCTG GATACAAGGG GCGGGTGACA GGCTGGGGCA ACCTGAAGGA GACGTGGACA 1560
GCCAACGTTG GTAAGGGGCA GCCCAGTGTC CTGCAGGTGG TGAACCTGCC CATTGTGGAG 1620
CGGCCGGTCT GCAAGGACTC CACCCGGATC CGCATCACTG ACAACATGTT CTGTGCTGGT 1680
TACAAGCCTG ATGAAGGGAA ACGAGGGGAT GCCTGTGAAG GTGACAGTGG GGGACCCTTT 1740
GTCATGAAGA GCCCCTTTAA CAACCGCTGG TATCAAATGG GCATCGTCTC ATGGGGTGAA 1800
GGCTGTGACC GGGATGGGAA ATATGGCTTC TACACACATG TGTTCCGCCT GAAGAAGTGG 1860
ATACAGAAGG TCATTGATCA GTTTGGAGAG TAGGGGGCCA CTCATATTCT GGGCTCCTGG 1920
AACCAATCCC GTGAAAGAAT TATTTTTGTG TTTCTAAAAC TAGAATTCGG ATTCGATATC 1980
AAGCTTAG 1988
16. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság:
(B) típus:
(C) szál típusa:
(D) topológia:
bázispár nukleinsav egyes lineáris (ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés:
(vii) Közvetlen forrás: 30 (B)klón:
(xi) Szekvencia leírása:
egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid odNl
GGCCAGGCCT ΤΤΓΑΑΑΤΤΑΑ GATATC
17. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság:
(B) típus:
(C) szál típusa:
(D) topológia:
111 bázispár nukleinsav egyes lineáris (ii) Molekula típusa:
(A) Megnevezés:
(vii) Közvetlen forrás: (B) klón:
(xi) Szekvencia leírása:
egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid pN2gpt-GPg
TTTTTGGCAT ATAAATCGTT CCAGTCCCAA AATGTAATTG GACGGGAGAC AGAGTGACGC
ACGCGGCCGC TCTAGAACTA GTGGATCCCC
CAACGAATTC CATGGCCCGG G
111 egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonuk18. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(ii) Molekula típusa: 45 (A) Megnevezés:
(A) hosszúság: 2296 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pN2gpt-LPg
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
ATAAATCGTT AACGAATTCC ATGGAACATA AGGAAGTGGT TCTTCTACTT CTTTTATTTC 60
TGAAATCAGG TCAAGGAAAA GTGTATCTCT CAGAGTGCAA GACTGGGAAT GGAAAGAACT 120
ACAGAGGGAC GATGTCCAAA ACAAAAAATG GCATCACCTG TCAAAAATGG AGTTCCACTT 180
CTCCCCACAG ACCTAGATTC TCACCTGCTA CACACCCCTC AGAGGGACTG GAGGAGAACT 240
ACTGCAGGAA TCCAGACAAC GATCCGCAGG GGCCCTGGTG CTATACTACT GATCCAGAAA 300
AGAGATATGA CTACTGCGAC ATTCTTGAGT GTGAAGAGGA ATGTATGCAT TGCAGTGGAG 360
HU 219 369 Β
AAAACTATGA CGGCAAAATT TCCAAGACCA TGTCTGGACT GGAATGCCAG GCCTGGGACT 420
CTCAGAGCCC ACACGCTCAT GGATACATTC CTTCCAAATT TCCAAACAAG AACCTGAAGA 480
AGAATTACTG TCGTAACCCC GATAGGGAGC TGCGGCCTTG GTGTTTCACC ACCGACCCCA 540
ACAAGCGCTG GGAACTTTGC GACATCCCCC GCTGCACAAC ACCTCCACCA TCTTCTGGTC 600
CCACCTACCA GTGTCTGAAG GGAACAGGTG AAAACTATCG CGGGAATGTG GCTGTTACCG 660
TTTCCGGGCA CACCTGTCAG CACTGGAGTG CACAGACCCC TCACACACAT AACAGGACAC 720
CAGAAAACTT CCCCTGCAAA AATTTGGATG AAAACTACTG CCGCAATCCT GACGGAAAAA 780
GGGCCCCATG GTGCCATACA ACCAACAGCC AAGTGCGGTG GGAGTACTGT AAGATACCGT 840
CCTGTGACTC CTCCCCAGTA TCCACGGAAC AATTGGCTCC CACAGCACCA CCTGAGCTAA 900
CCCCTGTGGT CCAGGACTGC TACCACGGTG ATGGACAGAG CTACCGAGGC ACATCCTCCA 960
CCACCACCAC AGGAAAGAAG TGTCAGTCTT GGTCATCTAT GACACCACAC CGGCACCAGA 1020
AGACCCCAGA AAACTACCCA AATGCTGGCC TGACAATGAA CTACTGCAGG AATCCAGATG 1080
CCGATAAAGG CCCCTGGTGT TTTACCACAG ACCCCAGCGT CAGGTGGGAG TACTGCAACC 1140
TGAAAAAATG CTCAGGAACA GAAGCGAGTG TTGTAGCACC TCCGCCTGTT GTCCTGCTTC 1200
CAGATGTAGA GACTCCTTCC GAAGAAGACT GTATGTTTGG GAATGGGAAA GGATACCGAG 1260
GCAAGAGGGC GACCACTGTT ACTGGGACGC CATGCCAGGA CTGGGCTGCC CAGGAGCCCC 1320
ATAGACACAG CATTTTCACT CCAGAGACAA ATCCACGGGC GGGTCTGGAA AAAAATTACT 1380
GCCGTAACCC TGATGGTGAT GTAGGTGGTC CCTGGTGCTA CACGACAAAT CCAAGAAAAC 1440
TTTACGACTA CTGTGATGTC CCTCAGTGTG CGGCCCCTTC ATTTGATTGT GGGAAGCCTC 1S00
AAGTGGAGCC GAAGAAATGT CCTGGAAGGG TTGTGGGGGG GTGTGTGGCC CACCCACATT 1560
CCTGGCCCTG GCAAGTCAGT CTTAGAACAA GGTTTGGAAT GCACTTCTGT GGAGGCACCT 1620
TGATATCCCC AGAGTGGGTG TTGACTGCTG CCCACTGCTT GGAGAAGTCC CCAAGGCCTT 1680
CATCCTACAA GGTCATCCTG GGTGCACACC AAGAAGTGAA TCTCGAACCG CATGTTCAGG 1740
AAATAGAAGT GTCTAGGCTG TTCTTGGAGC CCACACGAAA AGATATTGCC TTGCTAAAGC 1800
TAAGCAGTCC TGCCGTCATC ACTGACAAAG TAATCCCAGC TTGTCTGCCA TCCCCAAATT 1860
ATGTGGTCGC TGACCGGACC GAATGTTTCA TCACTGGCTG GGGAGAAACC CAAGGTACTT 1920
TTGGAGCTGG CCTTCTCAAG GAAGCCCAGC TCCCTGTGAT TGAGAATAAA GTGTGCAATC 1980
GCTATGAGTT TCTGAATGGA AGAGTCCAAT CCACCGAACT CTGTGCTGGG CATTTGGCCG 2040
GAGGCACTGA CAGTTGCCAG GGTGACAGTG GAGGTCCTCT GGTTTGCTTC GAGAAGGACA 2100
AATACATTTT ACAAGGAGTC ACTTCTTGGG GTCTTGGCTG TGCACGCCCC AATAAGCCTG 2160
GTGTCTATGT TCGTGTTTCA AGGTTTGTTA CTTGGATTGA GGGAGTGATG AGAAATAATT 2220
AATTGGACGG GAGACAGAGT GACGCACGCG GCCGCTCTAG AACTAGTGGA TCCCCCGGGA 2280
AGGCCTCGGA CCGGGC 2296
HU 219 369 Β
19. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 56 bázispár
(B) típus: nukleinsav
(C) szál típusa: egyes 5
(D) topológia: lineáris
(ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonukleotid (vii) Közvetlen forrás:
(B) klón: pN2gpt-gptl60 (xi) Szekvencia leírása:
TTTTTGGCAT ATAAATCGTT ATCCACCATG TAAGATAACG AATTCCATGG CCCGGG (i)
20. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
Szekvencia jellemzői: 10 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 331 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pvWF
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TTTTTTTTGG CATATAAATC GCGGCCGCGG GTGGTTGGTG GATGTCACAG CTTGGGCTTT 60
ATCTCCCCCA GCAGTGGGAT TCCACAGCCC CTGGGCTACA TAACAGCAAG ACAGTCCGGA 120
GCTGTAGCAG ACCTGATTGA GCCTTTGCAG CAGCTGAGAG CATGGCCTAG GGTGGGCGGC 180
ACCATTGTCC AGCAGCTGAG TTTCCCAGGG ACCTTGGAGA TAGCCGCAGC CCTCATTTGC 240
AGGGGAAGAT GTGAGGCTGC TGCAGCTGCA TGGGTGCCTG CTGCTGCCTG CCTTGGCCTG 300
ATGGCGGCCG CCCGGGTTTT TATCTCGAGA C 331
21. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság:
(B) típus:
(C) szál típusa:
(D) topológia:
bázispár nukleinsav egyes lineáris (ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés:
(vii) Közvetlen forrás: 30 (B) klón:
(xi) Szekvencia leírása:
egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid pEcoK-dhr
ATTAGCGTCT
CGTTTCAGAC GCGGCCGCGG TAATTAGATT CTCCCACATT
22. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés:
(A) hosszúság: 1209 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pdhr-gpt
(D) topológia: lineáris 40 (xi) Szekvencia leírása:
egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukATTAGCGTCT CGTTTCAGAC GCGGCCGCTC TAGAACTAGT GGATCCCCCA ACTTAAGGGT 60
ACCGCCTCGA CATCTATATA CTATATAGTA ATACCAATAC TCAAGACTAC GAAACTGATA 120
CAATCTCTTA TCATGTGGGT AATGTTCTCG ATGTCGAATA GCCATATGCC GGTAGTTGCG 180
ATATACATAA ACTGATCACT AATTCCAAAC CCACCCGCTT TTTATAGTAA GTTTTTCACC 240
CATAAATAAT AAATACAATA ATTAATTTCT CGTAAAAGTA GAAAATATAT TCTAATTTAT 300
TGCACGGTAA GGAAGTAGAA TCATAAAGAA CAGTGACGGA TGATCCCCAA GCTTGGACAC 360
AAGACAGGCT TGCGAGATAT GTTTGAGAAT ACCACTTTAT CCCGCGTCAG GGAGAGGCAG 420
TGCGTAAAAA GACGCGGACT CATGTGAAAT ACTGGTTTTT AGTGCGCCAG ATCTCTATAA 480
TCTCGCGCAA CCTATTTTCC CCTCGAACAC TTTTTAAGCC GTAGATAAAC AGGCTGGGAC 540
ACTTCACATG AGCGAAAAAT ACATCGTCAC CTGGGACATG TTGCAGATCC ATGCACGTAA 600
ACTCGCAAGC CGACTGATGC CTTCTGAACA ATGGAAAGGC ATTATTGCCG TAAGCCGTGG 660
HU 219 369 Β
CGGTCTGGTA
TTGTATTTCC
AGGCGATGGC
TGCGATTCGT
TCGTCCGCTG
GTGGGATATG
GGCACTGCCG
TTCTGGAGGC
TTGGGCTGCA
TCTCCCACA
CCGGGTGCGT
AGCTACGATC
GAAGGCTTCA
GAAATGTATC
GTTGATGACT
GGCGTCGTAT
GGCGTTGTTC
TGCATCCATG
GGAATTCGAT
TACTGGCGCG
ACGACAACCA
TCGTTATTGA
CAAAAGCGCA
ATGTTGTTGA
TCGTCCCGCC
TITTTAACTT
ACACAGGCAA
ATCAAGCTTA
TGAACTGGGT
GCGCGAGCTT
TGACCTGGTG
CTTTGTCACC
TATCCCGCAA
AATCTCCGGT
CAGGCGGGTT
ACCTGAGCGA
TCGATACCGT
ATTCGTCATG
AAAGTGCTGA
GATACCGGTG
ATCTTCGCAA
GATACCTGGA
CGCTAATCTT
ACAATAGTTT
AACCCTGTTC
CGCGGCCGCG
TCGATACCGT
AACGCGCAGA
GTACTGCGGT
AACCGGCTGG
TTGAACAGCC
TTCAACGCCT
CCAGTAAGTA
AAACCCCGCT
GTAATTAGAT
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1209
23. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: 20 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 26 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: odN2
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GGCCGATATC ΤΤΑΑΤΓΤΑΑΑ AGGCCT 26
24. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 24 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav 30 (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: odN3
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CCAATGTTAC GTGGGTTACA TCAG 2-
25. azonosítási számú szekvencia 35 (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 18 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B)klón: I-Scel linker 1
(D) topológia: lineáris 40 (xi) Szekvencia leírása:
TAGGGATAAC AGGGTAAT lí
26. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 18 bázispár 45 leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen fonás:
(C) szál típusa: egyes (B)klón: I-Scel linker 2
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
ATTACCCTGT TATCCCTA 18
27. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 23 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B)klón: odS2
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GTATAAAGTC CGACTATTGT TCT 2·
HU 219 369 Β
28. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 26 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 5 (B) klón: odS3
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TCTGAGGCCT AATAGACCTC TGTACA 26
29. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: 10 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 13 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: Sfil(l)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GGCCGGCTAG GCC 13
30. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonu-
(A) hosszúság: 13 bázispár kleotid
(B) típus: nukleinsav 20 (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: Sfl(2)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GGCCATATAG GCC 13
31. azonosítási számú szekvencia 25 (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 66 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: odTKl
(D) topológia: lineáris 30 (xi) Szekvencia leírása:
GAGTCGATGT AACACTTTCT ACAGGATCCG TTAACTCGCG AGAATTCCAT CACGTTAGAA 60
AATGCG 66
32. azonosítási számú szekvencia 35 (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 79 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B)klón: P-J(l)
(D) topológia: lineáris 40 (xi) Szekvencia leírása:
GATCCGGCCG GCTAGGCCGC GGCCGCCCGG GTTTTTATCT CGAGACAAAA AGACGGACCG 60
GGCCCGGCCA TATAGGCCC 79
33. azonosítási számú szekvencia 45 (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 79 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: P-J(2)
(D) topológia: lineáris 50 (xi) Szekvencia leírása:
AATTGGGCCT ATATGGCCGG GCCCGGTCCG TCTTTTTGTC TCGAGATAAA AACCCGGGCG 60
GCCGCGGCCT AGCCGGCCG 79
34. azonosítási számú szekvencia 55 (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 18 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: odTK2
(D) topológia: lineáris 60 (xi) Szekvencia leírása:
HU 219 369 Β
AGAAGCCGTG GGTCATTG 18
35. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 21 bázispár 5 leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: odTK3
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TACCGTGTCG CTGTAACTTA C 21
36. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 75 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 15 (B)klón: P-A(O.l)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
AGGCCGGCTA GGCCGCGGCC GCCCGGGTTT TTATCTCGAG ACAAAAAGAC GGACCGGGCC 60
CGGCCATATA GGCCA 75
37. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 83 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 25 (B) klón: P-A(0.2)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GTACTGGCCT ATATGGCCGG GCCCGGTCCG TCTTTTTGTC TCGAGATAAA AACCCGGGCG 60
GCCGCGGCCT AGCCGGCCTA GCT • 83
38. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 55 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 35 (B) klón: P-artP(ll)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása: 55
GGCCACGTTT TTATGGGAAG CTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TÜÜCATATAA ATCGC
39. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: 40 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 55 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: P-artP(12)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GGCCGCGATT TATATGCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC TTCCCATAAA AACGT 55
40. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 93 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav 50 (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: P-artP(8)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CGCTGGCCTA TATGGCCGGG CCCGGTCCGA GGCCTTCCCG GGCCATGGAA TTCATTTATA 60
TGCCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCTTCT GCA 93
41. azonosítási számú szekvencia (C) szál típusa: egyes
(i) Szekvencia jellemzői: (D) topológia: lineáris
(A) hosszúság: 97 bázispár (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(B) típus: nukleinsav 60
HU 219 369 Β (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk- (vii) Közvetlen forrás:
leotid (B)klón: P-artP(lO) (xi) Szekvencia leírása:
CGCTGGCCTA TATGGCCGGG CGTCCGAGGC CTTCCCGGGC CATGGAATTC GTTAACGATT 60
TATATGCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC TTCTGCA 97
42. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 50 bázispár 10 leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: oligonukleotid P-hr(3)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
ATTAGCGTCT CGTTTCAGAC GCGGCCGCGG TAATTAGATT CTCCCACATT 50
43. azonosítási számú szekvencia (D) topológia: lineáris
(i) Szekvencia jellemzői: (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(A) hosszúság: 10 bázispár (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(B) típus: nukleinsav leotid
(C) szál típusa: egyes 20 (xi) Szekvencia leírása:
CTAGCCCGGG 10
44. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 47 bázispár 25 leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: P-P2 5’ (1)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GTACGTACGG CTGCAGTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAG 47
45. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus. DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 50 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 35 (B) klón: P-P2 3’(1)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TCTGACTGAC GTTAACGATT TATAGGCTAT AAAAAATAGT ATTTTCTACT 50
46. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: 40 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 20 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: P-SM(2)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GTCTTGAGTA TTGGTATTAC • 20
47. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 23 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav 50 (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: P-SM(3)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CGAAACTATC AAAACGCTTT ATG 23
48. azonosítási számú szekvencia 55 (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 53 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: P_mn(1)
(D) topológia: lineáris 60 (xi) Szekvencia leírása:
HU 219 369 Β
AGCTAGCTGA ATTCAGGCCT CATGAGAGTG AAGGGGATCA GGAGGAATTA TCA 53
49. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 30 bázispár 5 leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: P-mn(2)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CATCTGATGC ACAAAATAGA GTGGTGGTTG 30
50. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 27 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 15 (B) klón: P-Seq(2)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CTGTGGGTAC ACAGGCTTGT GTGGCCC 27
57. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: 20 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 25 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: P-Seq(3)
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CAATTTTTCT GTAGCACTAC AGATC 25
52. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 45 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav 30 (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: 0-542
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CGATTACGTA GTTAACGCGG CCGCGGCCTA GCCGGCCATA AAAAT 45
53. azonosítási számú szekvencia 35 (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 47 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen fonás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: o-544
(D) topológia: lineáris 40 (xi) Szekvencia leírása: 47
CTAGAITTTT ATGGCCGGCT AGGCCGCGGC CGCGTTAACT ACGTAAT
54. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 50 bázispár 45 leotid.
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: 0-541
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CTTTTTCTGC GGCCGCGGAT ATGGCCCGGT CCGGTTAACT ACGTAGACGT 50
55. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 53 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 55 (B)klón: o-543
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CTACGTAGTT AACCGGACCG GGCCATATAG GCCGCGGCCG CAGAAAAAGC ATG 53
56. azonosítási számú szekvencia (A) hosszúság: 51 bázispár
(i) Szekvencia j ellemzői: 60 (B) típus: nukleinsav
HU 219 369 Β (C) szál típusa:
(D) topológia: (ii) Molekula típusa:
(A) Megnevezés egyes (vii) Közvetlen forrás:
lineáris (B)klón: o-selPI egyéb nukleinsav (xi) Szekvencia leírása:
szintetikus DNS-oligonukleotid 5
CGATAAAAAT TGAAATTTTA ΤΊΤΓΓΤΤΤΤΤ TTGGAATATA AATAAGGCCT C 51
57. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői : (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 53 bázispár 10 leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: o-selPII
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
CATGGAGGCC TTATTTATAT TCCAAAAAAA AAAAATAAAA TTTCAATTTT TAT 53
58. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 14 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 20 (B) klón: O-830
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TCGACTTTTT ATCA 14
59. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: 25 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 12 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: o-857
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TATGATAAAA AC 12
60. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 40 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav 35 (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: o-NcoI
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GAGCAGAAGA CAGTGGCCAT GGCCGTGAAG GGGATCAGGA 40
61. azonosítási számú szekvencia 40 (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 30 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: o-Nsil
(D) topológia: lineáris 45 (xi) Szekvencia leírása:
CATAAACTGA TTATATCCTC ATGCATCTGT 30
62. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság: 4145 bázispár 50 leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón: pS2gpt-S4
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TA1TGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
HU 219 369 Β
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG Vi'-Ti'i'i'i Gv-A CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT ΤΤΤΤΑΑΊΤΓΑ AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG attcattaat 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGŰTTTGA ACAGGGTTTC 2280
HU 219 369 Β
GCTCAGGTTT GCCTGTGTCA TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340
CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400
CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460
GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520
TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580
CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC catcgccttc TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640
GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700
CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760
CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820
TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880
CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940
AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000
AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060
CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120
CTTTTACGAG AAATTAATTA TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180
GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240
TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300
ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGAA 3360
GCTTTTTTTT ΤΤΤΤΤΤΤΤΓΓ TTGGCATATA aatcgttaac GAATTCCATG GCCCGGGAAG 3420
GCCTCGGACC GGGCCCGGCC ATATAGGCCA GCGATACCGT CGCGGCCGCG ACCTCGAGGG 3480
GGGGCCCGGT ACCCAATTCG CCCTATAGTG AGTCGTATTA CGCGCGCTCA CTGGCCGTCG 3540
TTTTACAACG TCGTGACTGG GAAAACCCTG GCGTTACCCA ACTTAATCGC CTTGCAGCAC 3600
ATCCCCCTTT CGCCAGCTGG CGTAATAGCG AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC 3660
AGTTGCGCAG CCTGAATGGC GAATGGAAAT TGTAAGCGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC 3720
GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC 3780
TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG 3840
TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA 3900
TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC 3960
ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA 4020
CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT 4080
AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC 4140
GTCAG 4145
63. azonosítási számú szekvencia (B) típus: nukleinsav
i) Szekvencia jellemzői: (C) szál típusa: egyes
(A) hosszúság : 4277 bázispár 60 (D) topológia: lineáris
HU 219 369 Β (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk- (B)klón: pS2gpt-P2 leotid (xi) Szekvencia leírása:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 4 80
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
HU 219 369 Β
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA ACAGGGTTTC 2280
GCTCAGGTTT GCCTGTGTCA TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340
CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400
CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460
GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520
TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580
CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640
GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700
CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760
CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820
TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880
CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940
AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000
AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060
CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120
CTTTTACGAG AAATTAATTA TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180
GCGGGTGGGT TTGGAATTAG tgatcagttt ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240
TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300
ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGTT 3360
GTTAGAGCTT GGTATAGCGG ACAACTAAGT AATTGTAAAG AAGAAAACGA AACTATCAAA 3420
ACCGTTTATG AAATGATAGA AAAAAGAATA TAAATAATCC TGTAITTTAG TTTAAGTAAC 3480
AGTAAAATAA TGAGTAGAAA ATACTATTTT TTATAGCCTA TAAATCGTTA ACGAATTCCk 3540
TGGCCCGGGA AGGCCTCGGA CCGGGCCCGG CCATATAGGC CAGCGATACC GTCGCGGCCG 3600
CGACCTCGAG GGGGGGCCCG GTACCCAATT CGCCCTATAG TGAGTCGTAT TACGCGCGCT 3660
CACTGGCCGT CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC TGGCGTTACC CAACTTAATC 3720
GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC 3780
GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGAA ATTGTAAGCG TTAATATTTT 3840
GTTAAAATTC GCGTTAAATT TTTGTTAAAT CAGCTCATTT TTTAACCAAT AGGCCGAAAT 3900
CGGCAAAATC CCTTATAAAT CAAAAGAATA GACCGAGATA GGGTTGAGTG TTGTTCCAGT 3960
HU 219 369 Β
TTGGAACAAG AGTCCACTAT TAAAGAACGT GGACTCCAAC GTCAAAGGGC GAAAAACCGT 4020
CTATCAGGGC GATGGCCCAC TACGTGAACC ATCACCCTAA TCAAGTTTTT TGGGGTCGAG 4080
GTGCCGTAAA GCACTAAATC GGAACCCTAA AGGGAGCCCC CGATTTAGAG CTTGACGGGG 4140
AAAGCCGGCG AACGTGGCGA GAAAGGAAGG GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 4200
GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC TTAATGCGCC 4260
GCTACAGGGC GCGTCAG 4277
64. azonosítási számú szekvencia i) Szekvencia jellemzői: (A) hosszúság: 4701 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés: 15 (vii) Közvetlen forrás: (B) klón: (xi) Szekvencia leírása: egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid pTZ-L2
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120
GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180
TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240
CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300
CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360
TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420
GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480
ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540
GCTTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600
ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660
TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720
GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780
TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840
ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900
TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960
TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020
CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080
TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140
AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200
TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGGCTAT TCGACATCGA 1260
GAACATTACC CACATGATAA GAGATTGTAT CAGTTTCGTA GTCTTGAGTA TTGGTATTAC 1320
TATATAGTAT ATNNNNNNGG TAACNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1380
NNNNNNNAGA TCTCGATCCG GATATAGTTC CTCCTTTCAG CAAAAAACCC CTCAAGACCC 1440
HU 219 369 Β
GTTTAGAGGC CCCAAGGGGT TATGCTAGTT ATTGCTCANN NNNNNNNNGT CGACTTAATT 1500
AATTAGGCCT CTCGAGCTGC AGGGATCCAC TAGTGAGCTC CCCGGGGAAT TCCCATGGTA 1560
TTATCGTGTT TTTCAAAGGA AAAAAACGTC CCGTGGTTCG GGGGGCTCTN NNNNNNNNNN 1620
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1680
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1740
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1800
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1860
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1920
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1980
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2040
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2100
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NCCGCTAGAG GGAAACCGTT GTGGTCTCCC 2160
TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GATCGATTAC GTAGTTAACG CGGCCGCGGC 2220
CTAGCCGGCC ATAAAAATCT AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT 2280
CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGGAAATTGT AAACGTTAAT ATTTTGTTAA 2340
AATTCGCGTT AAATTTTTGT TAAATCAGCT CATTTTTTAA CCAATAGGCC GAAATCGGCA 2400
AAATCCCTTA TAAATCAAAA GAATAGACCG AGATAGGGTT GAGTCrTGTT CCAGTTTGGA 2460
ACAAGAGTCC ACTATTAAAG AACGTGGACT CCAACGTCAA AGGGCGAAAA ACCGTCTATC 2520
AGGGCGATGG CCCACTACGT GAACCATCAC CCTAATCAAG TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC 2580
GTAAAGCACT AAATCGGAAC CCTAAAGGGA GCCCCCGATT TAGAGCTTGA CGGGGAAAGC 2640
CGGCGAACGT GGCGAGAAAG GAAGGGAAGA AAGCGAAAGG AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG 2700
CAAGTGTAGC GGTCACGCTG CGCGTAACCA CCACACCCGC CGCGCTTAAT GCGCCGCTAC 2760
AGGGCGCGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTATTTT 2820
TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA atgcttcaat 2880
AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT 2940
TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG 3000
CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA 3060
TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC 3120
TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTGTTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC 3180
ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG 3240
GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA 3300
ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACATGG 3360
GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG 3420
ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGCAGCAA TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG 3480
HU 219 369 Β
GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC
TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC
GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA
CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC
TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC
CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT
GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC
TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT
TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT
TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG
GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA
CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA
AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG
GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG
ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC
GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA
GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG
TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC
CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA G
AATTAATAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG 3540
CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG 3600
TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT 3660
GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC 3720
AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT 3780
ATTTTTAATT TAAAAGGATC TAGGTGAAGA 3840
CTTAACGTGA gttttcgttc CACTGAGCGT 3900
CTTGAGATCC TTTTTTTCTG CGCGTAATCT 3960
CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC 4020
TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC 4080
TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC 4140
CTGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG 4200
AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT 4260
CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG 4320
GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG 4380
AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT 4440
TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG 4500
ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT 4560
CGTTATCCCC TGATTCTGTG GATAACCGTA 4620
GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT 4680
4701
65. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői: 40
(A) hosszúság: 3878 bázispár
(B) típus: nukleinsav
(C) szál típusa: egyes
(D) topológia: lineáris
(ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonukleotid (vii) Közvetlen forrás:
(B) klón: pselP-gpt-L2 (xi) Szekvencia leírása:
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120
GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180
TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240
CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300
CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360
TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420
GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480
ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTITTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540
HU 219 369 Β
GCTTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA fi00
ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660
TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720
GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780
TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840
ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900
TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960
TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020
CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080
TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140
AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200
TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGATAAA AAGTCGACTT 1260
AATTAATTAG GCCTCTCGAG CTGCAGGGAT CCACTAGTGA GCTCCCCGGG GAATTCCCAT 1320
GGAGGCCTTA TTTATATTCC AAAAAAAAAA ΑΑΤΑΑΑΑΤΊΤ CAATTTTTAT CGATTACGTA 1380
GTTAACGCGG CCGCGGCCTA GCCGGCCATA AAAATCTAGC TGGCGTAATA GCGAAGAGGC 1440
CCGCACCGAT CGCCCTTCCC AACAGTTGCG CAGCCTGAAT GGCGAATGGG AAATTGTAAA 1500
CGTTAATATT TTGTTAAAAT TCGCGTTAAA TTTTTGTTAA ATCAGCTCAT TTTTTAACCA 1560
ATAGGCCGAA ATCGGCAAAA TCCCTTATAA ATCAAAAGAA TAGACCGAGA TAGGGTTGAG 1620
TGTTGTTCCA GTTTGGAACA AGAGTCCACT ATTAAAGAAC GTGGACTCCA ACGTCAAAGG 1680
GCGAAAAACC GTCTATCAGG GCGATGGCCC ACTACGTGAA CCATCACCCT AATCAAGTTT 1740
TTTGGGGTCG AGGTGCCGTA AAGCACTAAA TCGGAACCCT AAAGGGAGCC CCCGATTTAG 1800
AGCTTGACGG GGAAAGCCGG CGAACGTGGC GAGAAAGGAA GGGAAGAAAG CGAAAGGAGC 1860
GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT CACGCTGCGC GTAACCACCA CACCCGCCGC 1920
GCTTAATGCG CCGCTACAGG GCGCGTCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC 1980
CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC 2040
CTGATAAATG CTTCAATAAT ATTGAAAAAG GAAGAGTATG AGTATTCAAC ATTTCCGTGT 2100
CGCCCTTATT CCCTTTTTTG CGGCATTTTG CCTTCCTGTT TTTGCTCACC CAGAAACGCT 2160
GGTGAAAGTA AAAGATGCTG AAGATCAGTT GGGTGCACGA GTGGGTTACA TCGAACTGGA 2220
TCTCAACAGC GGTAAGATCC TTGAGAGTTT TCGCCCCGAA GAACGTTTTC CAATGATGAG 2280
CACTTTTAAA GTTCTGCTAT GTGGCGCGGT ATTATCCCGT GTTGACGCCG GGCAAGAGCA 2340
ACTCGGTCGC CGCATACACT ATTCTCAGAA TGACTTGGTT GAGTACTCAC CAGTCACAGA 2400
AAAGCATCTT ACGGATGGCA TGACAGTAAG AGAATTATGC AGTGCTGCCA TAACCATGAG 24 60
TGATAACACT GCGGCCAACT TACTTCTGAC AACGATCGGA GGACCGAAGG AGCTAACCGC 2520
HU 219 369 Β
TTTTTTGCAC
TGAAGCCATA
GCGCAAACTA
GATGGAGGCG
TATTGCTGAT
AACATGGGGG
CCAAACGACG
TTAACTGGCG
GATAAAGTTG
AAATCTGGAG
ATCATGTAAC
AGCGTGACAC
AACTACTTAC
CAGGACCACT
CCGGTGAGCG
TCGCCTTGAT
CACGATGCCT
TCTAGCTTCC
TCTGCGCTCG
TGGGTCTCGC
CGTTGGGAAC
GCAGCAATGG
CGGCAACAAT gcccttccgg
GGTATCATTG
CGGAGCTGAA
CAACAACGTT
TAATAGACTG
CTGGCTGGTT
CAGCACTGGG
2580
2640
2700
2760
2820
GCCAGATGGT AAGCCCTCCC GTATCGTAGT TATCTACACG ACGGGGAGTC AGGCAACTAT 2880
GGATGAACGA AATAGACAGA TCGCTGAGAT AGGTGCCTCA CTGATTAAGC attggtaact 2940
GTCAGACCAA GTTTACTCAT ATATACTTTA GATTGATTTA AAACTTCATT TTTAATTTAA 3000
AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT AACGTGAGTT 3060
TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT GAGATCCTTT 3120
TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG 3180
TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC caactctttt TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA 3240
GATACCAAAT ACTGTCCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT 3300
AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG CCAGTGGCGA 3360
TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG CGCAGCGGTC 3420
GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT 3480
GAGATACCTA CAGCGTGAGC ATTGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA 3540
CAGGTATCCG GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG 3600
AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG agcgtcgatt 3660
TTTGTGATGC ACGGTTCCTG TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACG CGGCCTTTTT TATCCCCTGA 3720
GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATGTTC TTTCCTGCGT 3780
TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCTTTGA GTGAGCTGAT ACCGCTCGCC GCAGCCGAAC 3840
GACCGAGCGC AGCGAGTCAG TGAGCGAGGA AGCGGAAG 3878
66. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői: (A) hosszúság: 6474 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés: 45 (vii) Közvetlen forrás: (B) klón: (xi) Szekvencia leírása: egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid pselP-gplóOMN
AGCÜCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TCGAGCTT1T e>o
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG aggatttcgc 120
GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180
TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240
CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300
CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360
ttaaaaagaa CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420
HU 219 369 Β
GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480
ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540
GCTTTTOGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600
ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660
TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720
GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780
TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840
ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900
TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960
TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020
CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080
TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140
AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200
TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGATAAA AAGTCGACTT 1260
AATTAATTAG GCTGGTTCAG CTCGTCTCAT TCTTTCCCTT ACAGTAGGCC ATCCAGTCAC 1320
ACGTTTTGAC CATTTGCCAC CCATCTTATA GCAAAGCCCT TTCCAAGCCC TGTCTTATTC 1380
TTGTAGGTAT GTGGAGAATA GCTCTACCAG CTCTTTGCAG TACTTCTATA ACCCTATCTG 1440
TCCCCTCAGC TACTGCTATA GCTGTGGCAT TAAGCAAGCT AACAGCACTA CTCTTTAGTT 1500
CCTGACTCCA ATACTGTAGG AGATTCCACC AATATTTGAG GACTTCCCAC CCCCTGCGTC 1560
CCAGAAGTTC CACAATCCTC GCTGCAATCA AGAGTAAGTC TCTGTGGTGG TAGCTGAAGA 1620
GGAACAGGCT CCGCAGGTCG ACCCAGATAA TTGCTAAGAA TCCATGCACT AATCGACCGG 1680
ATGTGTCTCT GTCTCTCTCT CCACCTTCTT CTTCGATTCC TTCGGGCCTG TCGGGTCCCC 1740
TCGGAACTGG GGGGCGGGTC TGCAACGACA ATGGTGAGTA TCCCTGCCTA ACTCTATTCA 1800
CTATAGAAAG TACAGCAAAA ACTATTCTTA AACCTACCAA GCCTCCTACT ATCATTATGA 1860
ATATTTTTAT ATACCACAGC CAATTTGTTA TGTCAAACCA ATTCCACAAA CTTGCCCATT 1920
TATCCAATTC CAATAATTCT TGTTCATTCT TTTCTTGTTG GGTTTGCGAT TTTTCTAGTA 1980
ATGAGTATAT TAAGCTTGTG TAATTGTCAA TTTCTCTTTC CCACTGCATC CAGGTCATGT 2040
TATTCCAAAT ATCATCCAGA GATTTATTAC TCCAACTAGC ATTCCAAGGC ACAGTAGTGG 2100
TGCAAATGAG TTTTCCAGAG CAACCCCAAA ACCCCAGGAG CTGTTGATCC TTTAGGTATC 2160
TTTCCACAGC CAGGACTCTT GCCTGGAGCT GCTTGATGCC CCAGACTGTG AGTTGCAACA 2220
TATGCTGTTG CGCCTCAATG GCCCTCAGCA AATTGTTCTG CTGTTGCACT ATACCAGACA 2280
ATAATAGTCT GGCCTGTACC GTCAGCGTCA CTGACGCTGC GCCCATAGTG CTTCCTGCTG 2340
CTCCTAAGAA CCCAAGGAAC AGAGCTCCTA TCGCTGCTCT TTTTTCTCTC TGCACCACTC 2400
TTCTCTTTGC CTTGGTGGGT GCTACTCCTA ATGGTTCAAT TGTTACTACT TTATATTTAT 2460
HU 219 369 Β
ATAATTCACT TCTCCAATTG TCCCTCATAT CTCCTCCTCC AGGTCTGAAG ATCTCGGTGT 2520
CGTTCGTGTC CGTGTCCTTA CCACCATCTC TTGTTAATAG TAGCCCTGTA ATATTTGATG 2580
AACATCTAAT TTGTCCTTCA ATGGGAGGGG CATACATTGC TTTTCCTACT TCCTGCCACA 2640
TGTTTATAAT TTGTTTTATT TTGCATTGAA GTGTGATATT GTTATTTGAC CCTGTAGTAT 2700
TATTCCAAGT ATTATTACCA TTCCAAGTAC TATTAAACAG TGGTGATGTA TTACAGTAGA 2760
AAAATTCCCC TCCACAATTA AAACTGTGCA TTACAATTTC TGGGTCCCCT CCTGAGGATT 2820
GATTAAAGAC TATTGTTTTA TTCTTAAATT GTTCTTTTAA TTTGCTAACT ATCTGTCTTA 2880
AAGTGTCATT CCATTTTGCT CTACTAATGT TACAATGTGC TTGTCTTATA GTTCCTATTA 2940
TATTTTTTGT TGTATAAAAT GCTCTCCCTG GTCCTATATG TATCCTTTTT CTTTTATTGT 3000
AGTTGGGTCT TGTACAATTA ATTTGTACAG ATTCATTCAG ATGTACTATO ATGGTTTTAG 3060
CATTATCAGT GAAATTCTCA GATCTAATTA CTACCTCTTC TTCTGCTAGA CTGCCATTTA 3120
ACAGCAGTTG AGTTGATACT ACTGGCCTAA TTCCATGTGT ACATTGTACT GTGCTGACAT 3180
TTTTACATGA TCCTTTTCCA CTGAACTTTT TATCGTTACA TTTTAGAATC GCAAAACCAG 3240
CCGGGGCACA ATAGTGTATG GGAATTGGCT CAAAGGATAT CTTTGGACAA GCTTGTGTAA 3300
TGACTGAGGT ATTACAACTT ATCAACCTAT AGCTGGTACT ATCATTATCT ATTGATACTA 3360
TATCAAG1TT ATAAAGAAGT GCATATTCTT TCTGCATCTT ATCTCTTATG CTTGTGGTGA 3420
TATTGAAAGA GCAŰTTTTTC ATTTCTCCTC CCTTTATTGT TCCCTCGCTA TTACTATTGT 3480
TATTAGCAGT ACTATTATTG GTATTAGTAG TATTCCTCAA ATCAGTGCAA TTTAAAGTAA 3540
CACAGAGTGG GGTTAATTTT ACACATGGCT TTAGGCTTTG ATCCCATAAA CTGATTATAT 3600
CCTCATGCAT CTGTTCTACC ATGTTATTTT TCCACATGTT AAAATTTTCT GTCACATTTA 3660
CCAATTCTAC TTCTTGTGGG TTGGGGTCTG TGGGTACACA GGCTTGTGTG GCCCAAACAT 3720
TATGTACCTC TGTATCATAT GCTTTAGCAT CTGATGCACA AAATAGAGTG GTGGTTGCTT 3780
CTTTCCACAC AGGTACCCCA TAATAGACTG TGACCCACAA TTTTTCTGTA GCACTACAGA 3840
TCATTAATAA CCCAAGGAGC ATCGTGCCCC ATCCCCACCA GTGCTGATAA TTCCTCCTGA 3900
TCCCCTTCAC GGCCATGGAG GCCTTATTTA TATTCCAAAA AAAAAAAATA AAATTTCAAT 3960
TTTTATCGAT TACGTAGTTA ACGCGGCCGC GGCCTAGCCG GCCATAAAAA TCTAGCTGGC 4020
GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGAATGGCG 4080
AATGGGAAAT TGTAAACGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA 4140
GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA 4200
CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG 4260
ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGTGAACCAT 4320
CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG 4380
GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA 4440
AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA 4500
HU 219 369 Β
CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG 4560
GAAATüTGCvj CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC 4620
TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA 4680
TTCAACATTT CCGTGTCGCC CTTAITCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTnTTG 4740
CTCACCCAGA AACGCTGGTG AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG 4800
GTTACATCGA ACTGGATCTC AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC 4860
GTTTTCCAAT GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGTTG 4920
ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT 4980
ACTCACCAGT CACAGAAAAG CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG 5040
CTGCCATAAC CATGAGTGAT AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC 5100
CGAAGGAGCT AACCGCTTTT TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT 5160
GGGAACCGGA GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCTGCAG 5220
CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC 5280
AACAATTAAT AGACTGGATG GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC 5340
TTCCGGCTGG CTGGTTTATT GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA 5400
TCATTGCAGC ACTGGGGCCA GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG 5460
GGAGTCAGGC ÁACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA 5520
TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT GATTTAAAAC 5580
TTCATTTTTA ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA 5640
TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT 5700
CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GGAAACAAAA AAACCACCGC 5760
TACCAGCGGT GGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG 5820
GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC 5880
ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG TTACCAGTGG 5940
CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG 6000
ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA 6060
CGACCTACAC CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCATTG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG 6120
AAGGGAGAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA GAGCGCACGA 6180
GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT CGCCACCTCT 6240
GACTTGAGCG TCGATTTTTG TGATGCTCGT CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA 6300
(jÜAACÜCXfoU CTTTTTACGG TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTITGCTCAC ATGTTCTTTC 6360
CTGCGTTATC CCCTGATTCT GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG 6420
CTCGCCGCAG CCGAACGACC GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG GAAG 6474
HU 219 369 Β
67. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság (B) típus:
(C) szál típusa (D) topológia:
6811 bázispár nukleinsav egyes lineáris (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonukleotid (vii) Közvetlen forrás:
(B) klón:
(xi) Szekvencia leírása:
pN2-gpta ProtS
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
HU 219 369 Β
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1320
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCGTCGA CAGAAAAATT AATTAATTAT GGCCTCTCGA GCTGCAGCTG CCAAGAAGAA 2280
GATTCCTGTG CTGCTCTCAG GAAAATATGT CCCACTTGTT TTCTAATTCA ATAAAGATAC 2340
TGGTTTAAAT GTGAAGCCAC ACAAGAGAAA GATGAAGCCA AAGCTGGTCC CCCTGAGGAA 2400
TTGTTTTGAA ATAAGGCATT AGGACCCTCC ATTCAATTCA TATTTAATAG ACCACCATCT 2460
CTTCTGCCTT CATCAGGAAA AAAACAAAAA CATAAACAAA ATAGTATCTG CCTATGATTA 2520
ATAGTATTTA ATTACACGCA CTTTTGTTTG AGTTTACTTC CTTGCTTTCT GAAAAAAACA 2580
TAGGTATTTA GACACTAGTT CATGATGATA AAATTAAAAA TTTAGTTTTA CAAACAAAAA 2640
TTGAAACTGT CATTTGTAGG AAAAAAATTC AAATTTAAAA TTGTTATTTT TCACTATTCT 2700
TAGATAGCAA GAGAAGTAAG AATTTCTTTA CTGTGATTTA TATCACAACA GAATTTTTTT 2760
CCTTGACAAA GGACCTTTTA AAAATCCCAG GAAAGGACCA CAAAATAATC AAAGACTGCA 2820
CATTGTAAAT AAAACCCTTC AGCTGTTATT GAAACATAAG TATAATTACA CACAAGGAAA 2880
AGGTATTATA AGCAGAGAAA AGATGCCTTA AGAATTCTTT GTCTTTTTCC AAACTGATGG 2940
ACATGAGTGA GCTCTAATAT CATTATGTTT AGAAATGGCT TCATCCAGAT CCAACTGTAC 3000
ACCATTAATA TTCACTTCCA TGCAGCCATT ATAAAAGGCA TTCACTGGTG TGGCACTGAA 3060
TGGAACATCT GGAAGGCCAC CCAGGTATGT GGCCACTTTT GCTTTCATTG CTTTGTCCAA 3120
GACGGCAAGT TGTCTTTGAA GGTCTTCATG GGAGATGGTT TCTATTTTAA GTGGTGTCGA 3180
CAACTCCAGA TTGTTTCTGT TGACTCTAAA TTCCAGATGA GATTGTTGAT CGGAACATAG 3240
ACTTAGGGCC TGTATCCGAT ATATTACAGT ATTTTCAACA GATAACAGAA TATCCTGTGA 3300
TTTTTCAGAG GTGGAGTCCA CCAAGGACAC AGCAAAGGGC ACTGTGTTGT TACCAGAAAC 3360
CAAGGCAAGC ATAACACCAG TGCCCGTGGA TGGACGAATA TTCAAGGTCA CATTTACATG 3420
CCAACCCTCA GCACTGGATA CATTATTATA ATCTATGTGA AATTGAGCAA TTCCAGAACC 3480
AGGATAGTAG GAGCCCTTCT CCACAGTAAC CAGGCAATGC TTATTTTGTT TTTCTTGAAT 3540
AATTTCCTrr ATTCCAGAAG CTCCTTGCTT CATCAAATTC CAGCTTCGTA TACATCCATC 3600
TAGACGAGGG TTAATCGGTT TAATGAGTTC ACTTTCCACT TTCCGAGGGA ATCCTGCAAA 3660
GTATACTTTG GTTTCCAGCA ATCCATTTTC CGGCTTAAAA AGGGGTCCAG GTTTATTTAT 3720
ATCCATCACA GCTTCTTTAG CTATTTTAAT GCTAATACTA TGTTCTAATT CTTCCACAGA 3780
CACCKTATTC CATAGACCAT TATTAATAAC ATCACCTCCA GTTGTGATTT TGGATGTATG 3840
HU 219 369 Β
TTCATTCTTA AGCTGAACTT CAATCTTTCC ACCACGAAGT GCAATCAGGA GCCACGCTGA 3900
GTGATCGATA GATTCTGCGT ACAGTATCAC GCCTTCTGAA TCATATGTCC GGAAATCAAA 3960
TTCTGCTGAA AATCTGCTGA TTTCTGGCAA ACGAAATTTT AAATATAAAA CAACCCCTGC 4020
AAACTGCTCC GCCAAGTAAA GTAATTCATA CTTTGTGTCA AGGTTCAAGG GAAGGCACAC 4080
TGAAACAACC TCACAACTCT TCTGATCTTG GGCAAGTTTG AATCCTTTCT TCCCATCACA 4140
ATAGCAAGTG TAACCTCCAG GGTAATTGAC ACAAAGCTGA GCACACATGT TCTCAGAGCA 4200
TTCATCTATA TCTTCACAAG ACTTTGATTT GAGATTATAT CTGTAGCCIT CGGGGCATTC 4260
ACATTCAAAA TCTCCTGGGA TGTTCTTGCA CACAGCTGTG CCACAAATGC TTGGCTTCAA 4320
AGAGCATTCA TCCACATCTT TACAATCTTT CTTATTTGAA AGCATAACAA AACCATTTTT 4380
ACAGGAACAG TGGTAACTTC CAGGTGTATT ATCACAAATT TGACTGCAAC CTCCATTTAT 4440
ATTTGAGGGA TCTTTGCATT CATTTATGTC AAATTCACAC TTTTCTCCTT GCCAACCTGG 4500
TTTACAAGTG CAAGTAAAAG AAGCTTTTCC ATCTTTGCAG CTCATATATC CATCTTCATT 4560
GCATGGCAGA GGACTACACT GGTCTGGAAT GGCATTGACA CAGCTTCTTA GGTCAGGATA 4620
AGCATTAGTT GACTGACGTG CAGCAGTGAA TAACCCAGTT TGAAAAGAGC GAAGACAAAC 4680
TAAGTATTTT GGATAAAAAT AATCCGTTTC CGGGTCATTT TCAAAGACCT CCCTGGCTTC 4740
TTCTTTATTG CACAGTTCTT CGATGCATTC TCTTTCAAGA TTACCCTGTT TGGTTTCTTC 4800
AAGTAAAGAA TTTGCACGAC GCTTCCTAAC CAGGACTTGT GAAGCCTGTT GCTTTGACAA 4860
AAAGTTTGCC TCTGAGACGG GAAGCACTAG GAGGAGACAC GCCAGCAACG CCCCGCAGCG 4920
CCCACCCAGG ACCCCCATGG AGGCCTTATT TATATTCCAA AAAAAAAAAA TAAAATTTCA 4980
ATTTTTAGAT CCCCCAACTT AAGGGTACCG CCTCGACATC TATATACTAT ATAGTAATAC 5040
CAATACTCAA GACTACGAAA CTGATACAAT CTCTTATCAT GTGGGTAATG TTCTCGATGT 5100
CGAATAGCCA TATGCCGGTA GTTGCGATAT ACATAAACTG ATCACTAATT CCAAACCCAC 5160
CCGCTTTTTA TAGTAAGTTT TTCACCCATA AATAATAAAT ACAATAATTA ATTTCTCGTA 5220
AAAGTAGAAA ATATATTCTA ATTTATTGCA CGGTAAGGAA GTAGAATCAT AAAGAACAGT 5280
GACGGATGAT CCCCAAGCTT GGACACAAGA CAGGCTTGCG AGATATGTTT GAGAATACCA 5340
CTTTATCCCG CGTCAGGGAG AGGCAGTGCG TAAAAAGACG CGGACTCATG TGAAATACTG 5400
GTTTTTAGTG CGCCAGATCT CTATAATCTC GCGCAACCTA TTTTCCCCTC GAACACTTTT 54 60
TAAGCCGTAG ATAAACAGGC TGGGACACTT CACATGAGCG AAAAATACAT CGTCACCTGG 5520
GACATGTTGC AGATCCATGC ACGTAAACTC GCAAGCCGAC TGATGCCTTC TGAACAATGG 5580
AAAGGCATTA TTGCCGTAAG CCGTGGCGGT CTGGTACCGG GTGCGTTACT GGCGCGTGAA 5640
CTGGGTATTC GTCATGTCGA TACCGTTTGT ATTTCCAGCT ACGATCACGA CAACCAGCGC 5700
GAGCTTAAAG TGCTGAAACG CGCAGAAGGC GATGGCGAAG GCTTCATCGT TATTGATGAC 5760
CTGGTGGATA CCGGTGGTAC TGCGGTTGCG ATTCGTGAAA TGTATCCAAA AGCGCACTTT 5820
GTCACCATCT TCGCAAAACC GGCTGGTCGT CCGCTGGTTG ATGACTATGT TGTTGATATC 5880
HU 219 369 Β
CCGCAAGATA CCTGGATTGA ACAGCCGTGG GATATGGGCG TCGTATTCGT CCCGCCAATC 5940
TCCGGTCGCT AATCTTTTCA ACGCCTGGCA CTGCCGGGCG TTGTTCTTTT TAACTTCAGG 6000
CGGGTTACAA TAGTTTCCAG TAAGTATTCT GGAGGCTGCA TCCATGACAC AGGCAAACCT 6060
GAGCGAAACC CTGTTCAAAC CCCGCTTTGG GCTGCAGGAA TTCGATATCA AGCTTATCGA 6120
TACCGTCGCG GCCGCGACCT CGAGGGGGGG CCCGGTACCC AATTCGCCCT ATAGTGAGTC 6180
GTATTACGCG CGCTCACTGG CCGTCGTTTT ACAACGTCGT GACTGGGAAA ACCCTGGCGT 6240
TACCCAACTT AATCGCCTTG CAGCACATCC CCCTTTCGCC AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA 6300
GGCCCGCACC GATCGCCCTT CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGAAATTGTA 6360
AGCGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC 6420
CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG 6480
AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC CAACGTCAAA 6540
GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG AACCATCACC CTAATCAAGT 6600
TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG CCCCCGATTT 6660
AGAGCITGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA 6720
GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC CACACCCGCC 6780
GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCA G 6811
68. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: 30 (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság 27 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen fonás:
(C) szál típusa : egyes (B) klón: oProtSl
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
ACCCAGGACC GCCATGGCGA AGCGCGC 27
69. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(A) hosszúság 6926 bázispár leotid
(B) típus: nukleinsav 40 (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa : egyes (B) klón: pP2-gpl60MN
(D) topológia: lineáris GTGCGCGGAA (xi) Szekvencia leírása:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT CvvCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
HU 219 369 Β
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTCOA GCGAACOACC TACACCGAAC TGAGATACCT AGtfCGTGAS CTKTOMAM 15(0
G0GCCAC9CT TCCCGAMGG AjOAAAOGCGC ACKOGTATCC Q9XMfiOQ6C AOOGTCWJAA 1(20
CAGGAŰAeCe CACCAOCOM CTPCCSÖGOO GAAACGCCTC GTATCTTPAT ASTCCTGTCG 1(10
GOTTTCGCCA CCTCWACTT OA3CGTCGAT TTTTOTOATO CTCGTCAOOO GOGCOOftSCC 1740
TATGGAAAAA C6CCMGMC CCCGCCTm TACOGTPCCT Q5CCTTTTGC TaflCCTTCTO 1(00
CTCACATOTT CTTPCCTGOG TTATCCCCT3 ATTCTOTMA TMCOSWT ACCÖCCTTTO 11(0
ΑβΤβλβΰΓΟλ TACCGCTCGC CGCAflOCGAA CGACCtUUGCC CAOCOWTÖl GTOIOCIUOS 1920
ΑΜΟβΟΜΟΑ SCGCCCAATA CGCAAACCOC CTCTCCCCOC GCGTTOGCCG ATTCMTAAT 1910
GCAOCTGGCA COACAOOZTr CCCOACTOGA AASCSOGCK TCAGCGCAAC GOUmXUH 2040
TQA0TTA0CT CACTCATTAO CCACCCCAGG CTTTACACTT TATCCTTCCG <XCIC9X»X9T 2100 parrorGGAAT TGTOAOCaOA TAACAATZTC ACACAŰGAAA CAOCSASWbC CATGATTACO 2160
CCAAÖCGCGC AATTAACCCI CACTAASCGO AACAAAAÖCT QOAQCTCCAC C3CGGTGGCG 2220
SCCCCTCTAS CCCQOGCEAG AACTACTGGA TCCCCCAAAO CWOOTTTSU ACM0ÖTWC 2210 ocKMam occtototca tcgatscmc ctccacwox citoctmuui actaotou 2340
CCCOCCTOAA GTPAAAAAflA ACAACSCCCG GCAfilCCCAB GCGTTGAAAA GATTASCOAC 2400
CCGAGATTGG COGGACGAAT ACOACOCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAŰGTATCTP 24(0
GCGGCACATC AACAACATAQ TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCBCTITT GCGAAűATGG 2520
TGACAAAGTG oocrm’q» TACATTTCAC GAAXQaCMC CGCMMCCA ϋεασΕΑΚαΑ 35(0
CCAGOTCATC AATAACGATŰ AAflCCTTCGC CATC3CCTTC TOCBCGTTTC A3CACTTTAA 2640
HU 219 369 Β
GCTCQCGCTO GTTQTC9TQA TCOTAeCTQG AABXBCABAC «ΒΛΤΜΜΛ TGACGAAZAC 2700 CCAQTTCACG CÖCCASTAAC GCACCCOGTA CCAOACCGCC AC5QCTTACQ GCBATAATGC 2760 cttpccatw tkaousoc atcaötcögc TTacsran? acsxgcbsgg atctgcaacá 1120 T3TCCCAŰGT GACOKfCtTAX TTTTCGCTCA TQT3AAQT9? CCCBfiCCTO? TTXTCTACGQ 2180 CTÍAAAAAŰT 6TTCGA69S3 AAJUMAOGT? GCGC5BQATT AXBOBOKTCT GGOGCACZAA 2940 AMCXASTAT TKBCA.TOM3 TCCQCQTCtT TTTAOQCAC? GCCTCTCCCT GBOGCGCOW 3000 AAAŰTOQTAX TCTCAAAŰAI ATCTCQCAAO CCTOTCTPO? OTGCAUCTT SGOfiATCATC 3060 COTCBCTOTT CTrZKTOATT CTACTTCCTT ACCSTQCAAT AAATEBflAAT KSATÍTSCSk 3120 CTTTÍKCGAfl AJATTJAm TPCTATTIAT TBXTEMQQO TCAAAAACTT ACTATAUAA 3110 COGOOTOSOT nOOUSTAS TCJLTCAOTTT ATQTBTBTCS CAACTACCGÖ CMM00CIA 3210 TTCQACATCQ AŰJACBTttC CCACATMTA AOAOBTTTR TCAfiTTTCOT AŰTCTIWlflT 3300 KPsomaTA cw&Mm tatasatotc omoosotac ceemam qgctscott 33 «0 artBOBfiCTT οοταχακοο acaactawt aa.txoxaam ansajacoa aacxxtcaaa 3420 Acxamxea ααατοαταλα aaaaaoaaza taaasaatcc τ&εητπμ tttaaccaac 3410 MSCMAASAA ΤΟΒβΤλβΜΑ A3ACTBTRT TEMSOCÚSA. TWATCQTTC CTOOttMAS 3140
TGAAGGGGAT CAGGAGGAAT TATCAGCACT GGTGGGGATG GGGCACGATG CTCCTTGGGT 3600
TATTAATGAT CTGTAGTGCT ACAGAAAAAT TGTGGGTCAC AGTCTATTAT GGGGTACCTG 3660
TGTGGAAAGA AGCAACCACC ACTCTATTTT GTGCATCAGA TGCTAAAGCA TATGATACAG 3720
AGGTACATAA TGTTTGGGCC ACACAAGCCT GTGTACCCAC AGACCCCAAC CCACAAGAAG 3780
TAGAATTGGT AAATGTGACA GAAAATTTTA ACATGTGGAA AAATAACATG GTAGAACAGA 3840
TGCATGAGGA TATAATCAGT TTATGGGATC AAAGCCTAAA GCCATGTGTA AAATTAACCC 3900
CACTCTGTGT TACTTTAAAT TGCACTGATT TGAGGAATAC TACTAATACC AATAATAGTA 3960
CTGCTAATAA CAATAGTAAT AGCGAGGGAA CAATAAAGGG AGGAGAAATG AAAAACTGCT 4020
CTTTCAATAT CACCACAAGC ATAAGAGATA AGATGCAGAA AGAATATGCA CTTCTTTATA 4080
AACTTGATAT AGTATCAATA GATAATGATA GTACCAGCTA TAGGTTGATA AGTTGTAATA 4140
CCTCAGTCAT TACACAAGCT TGTCCAAAGA TATCCTTTGA GCCAATTCCC ATACACTATT 4200
GTGCCCCGGC TGGTTTTGCG ATTCTAAAAT GTAACGATAA AAAGTTCAGT GGAAAAGGAT 4260
CATGTAAAAA TGTCAGCACA GTACAATGTA CACATGGAAT TAGGCCAGTA GTATCAACTC 4320
AACTGCTGTT AAATGGCAGT CTAGCAGAAG AAGAGGTAGT AATTAGATCT GAGAATTTCA 4380
CTGATAATGC TAAAACCATC ATAGTACATC TGAATGAATC TGTACAAATT AATTGTACAA 4440
GACCCAACTA CAATAAAAGA AAAAGGATAC ATATAGGACC AGGGAGAGCA TTTTATACAA 4500
CAAAAAATAT AATAGGAACT ATAAGACAAG CACATTGTAA CATTAGTAGA GCAAAATGGA 4560
ATGACACTTT AAGACAGATA GTTAGCAAAT TAAAAGAACA ATTTAAGAAT AAAACAATAG 4620
HU 219 369 Β
TCTTTAATCA ATCCTCAGGA GGGGACCCAG AAATTGTAAT GCACAGTTTT AKTTGTGGAG 4680
GGGAATTTTT CTACTGTAAT ACATCACCAC TGTTTAATAG TACTTGGAAT GGTAATAATA 4740
CTTGGAATAA TACTACAGGG TCAAATAACA ATATCACACT TCAATGCAAA ATAAAACAAA 4800
TTATAAACAT GTGGCAGGAA GTAGGAAAAG CAATGTATGC CCCTCCCATT GAAGGACAAA 4860
TTAGATGTTC ATCAAATATT ACAGGGCTAC TATTAACAAG AGATGGTGGT AAGGACACGG 4920
ACACGAACGA CACCGAGATC TTCAGACCTG GAGGAGGAGA TATGAGGGAC AATTGGAGAA 4980
GTGAATTATA TAAATATAAA GTAGTAACAA TTGAACCATT AGGAGTAGCA CCCACCAAGG 5040
CAAAGAGAAG AGTGGTGCAG AGAGAAAAAA GAGCAGCGAT AGGAGCTCTG TTCCTTGGGT 5100
TCTTAGGAGC AGCAGGAAGC ACTATGGGCG CAGCGTCAGT GACGCTGACG GTACAGGCCA 5160
GACTATTATT GTCTGGTATA GTGCAACAGC AGAACAATTT GCTGAGGGCC ATTGAGGCGC 5220
AACAGCATAT GTTGCAACTC ACAGTCTGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCA AGAGTCCTGG 5280
CTGTGGAAAG ATACCTAAAG GATCAACAGC TCCTGGGGTT TTGGGGTTGC TCTGGAAAAC 5340
TCATTTGCAC CACTACTGTG CCTTGGAATG CTAGTTGGAG TAATAAATCT CTGGATGATA 5400
TTTGGAATAA CATGACCTGG ATGCAGTGGG AAAGAGAAAT TGACAATTAC ACAAGCTTAA 5460
TATACTCATT ACTAGAAAAA TCGCAAACCC AACAAGAAAA GAATGAACAA GAAITATTGG 5520
AATTGGATAA ATGGGCAAGT TTGTGGAATT GGTTTGACAT AACAAATTGG CTGTGGTATA 5580
TAAAAATATT CATAATGATA GTAGGAGGCT TGGTAGGTTT AAGAATAGTT TTTGCTGTAC 5640
TTTCTATAGT GAATAGAGTT AGGCAGGGAT ACTCACCATT GTCGTTGCAG ACCCGCCCCC 5700
CAGTTCCGAG GGGACCCGAC AGGCCCGAAG GAATCGAAGA AGAAGGTGGA GAGAGAGACA 5760
GAGACACATC CGGTCGATTA GTGCATGGAT TCTTAGCAAT TATCTGGGTC GACCTGCGGA 5820
GCCTGTTCCT CTTCAGCTAC CACCACAGAG ACTTACTCTT GATTGCAGCG AGGATTGTGG 5880
AACTTCTGGG ACGCAGGGGG TGGGAAGTCC TCAAATATTG GTGGAATCTC CTACAGTATT 5940
GGAGTCAGGA ACTAAAGAGT AGTGCTGTTA GCTTGCTTAA TGCCACAGCT ATAGCAGTAG 6000
CTGAGGGGAC AGATAGGGTT ATAGAAGTAC TGCAAAGAGC TGGTAGAGCT ATTCTCCACA 6060
TACCTACAAG AATAAGACAG GGCTTGGAAA GGGCTTTGCT ATAAGATGGG TGGCAAATGG 6120
TCAAAACGTG TGACTGGATG GCCTACTGTA AGGGAAAGAA TGAGACGAGC TGAACCAGAA 6180
CGAATTCCAT GGCCCGGGAA GGCCTCGGAC CGGGCCCGGC CATATAGGCC AGCGATACCG 6240
TCGCGGCCGC GACCTCGAGG GGGGGCCCGG TACCCAATTC GCCCTATAGT GAGTCGTATT 6300
ACGCGCGCTC ACTGGCCGTC GTTTTACAAC GTCGTGACTG GGAAAACCCT GGCGTTACCC 6360
AACTTAATCG CCTTGCAGCA CATCCCCCTT TCGCCAGCTG GCGTAATAGC GAAGAGGCCC 6420
GCACCGATCG CCCTTCCCAA CAGTTGCGCA GCCTGAATGG CGAATGGAAA TTGTAAGCGT 6480
TAATATTTTG TTAAAATTCG CGTTAAATTT TTGTTAAATC AGCTCATTTT TTAACCAATA 6540
GGCCGAAATC GGCAAAATCC CTTATAAATC AAAAGAATAG ACCGAGATAG GGTTGAGTGT 6600
TGTTCCAGTT TGGAACAAGA GTCCACTATT AAAGAACGTG GACTCCAACG TCAAAGGGCG 6660
HU 219 369 Β
AAAAACCGTC TATCAGGGCG ATGGCCCACT ACGTGAACCA TCACCCTAAT CAAGTTTTTT 6720 GGGGTCGAGG TGCCGTAAAG CACTAAATCG GAACCCTAAA GGGAGCCCCC GATTTAGAGC 6780 TTGACGGGGA AAGCCGGCGA ACGTGGCGAG AAAGGAAGGG AAGAAAGCGA AAGGAGCGGG 6840 CGCTAGGGCG CTGGCAAGTG TAGCGGTCAC GCTGCGCGTA ACCACCACAC CCGCCGCGCT 6900 TAATGCGCCG CTACAGGGCG CGTCAG 6926
70. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés:
(A) hosszúság: (B) típus: (C) szál típusa: (D) topológia: 49 bázispár nukleinsav egyes lineáris 15 (vii) Közvetlen forrás: (B) klón: (xi) Szekvencia leírása:
ΧΛΧλίΛϋΛΧΛ. Γ AAAAAIIViAA ΑΊΤΛ xAX X ΓΤ xxTTxTxTGG AATATAAAT
71. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa:
(i) Szekvencia j ellemzői: (A) Megnevezés:
(A) hosszúság: 34 bázispár 20
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes (B) klón:
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
TCATGTTCAC GCGCTCCATG GCCGCGGCCG CACC
72. azonosítási számú szekvencia (ii) Molekula típusa:
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Megnevezés:
(A) hosszúság: 5532 bázispár
(B) típus: nukleinsav (vii) Közvetlen forrás:
(C) szál típusa: egyes 30 (B)klón:
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid selP promoter egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid oFIX.l egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid pN2gpta-FIX
TAAATACATT 60
TATTGAAAAA 120
GCGGCATTTT 180
GAAGATCAGT 240
CTTGAGAGTT 300
TGTGGCGCGG 360
TATTCTCAGA 420
ATGACAGTAA 480
TTACTTCTGA 540
GATCATGTAA 600
GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
HU 219 369 Β
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT X
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC gcgttggccg ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTTGTT AATTTTCAAT TCCAATGAAT TAACCTTGGA AATCCATCTT TCATTAAGTG 2280
AGCTTTGTTT TTTCCTTAAT CCAGTTGACA TACCGGGATA CCTTGGTATA TATTCCATAT 2340
TTGCCTTTCA TTGCACACTC TTCACCCCAG CTAATAATTC CAGTTAAGAA ACTGGTCCCT 2400
TCCACTTCAG TAACATGGGG TCCCCCACTA TCTCCTTGAC ATGAATCTCT ACCTCCTTCA 2460
TGGAAGCCAG CACAGAACAT GTTGTTATAG ATGGTGAACT TTGTAGATCG AAGACATGTG 2520
GCTCGGTCAA CAAGTGGAAC TCTAAGGTAC TGAAGAACTA AAGCTGATCT CCCTTTGTGG 2580
AAGACTCTTC CCCAGCCACT TACATAGCCA GATCCAAATT TGAGGAAGAT GTTCGTGTAT 2640
TCCTTGTCAG CAATGCAAAT AGGTGTAACG TAGCTGTTTA GCACTAAGGG TTCGTCCAGT 2700
TCCAGAAGGG CAATGTCATG GTTGTACTTA TTAATAGCTG CATTGTAGTT GTGGTGAGGA 2760
ATAATTCGAA TCACATTTCG CTTTTGCTCT GTATGTTCTG TCTCCTCAAT ATTATGTTCA 2820
CCTGCGACAA CTGTAATTTT AACACCAGTT TCAACACAGT GGGCAGCAGT TACAATCCAT 2880
TTTTCATTAA CGATAGAGCC TCCACAGAAT GCATCAACTT TACCATTCAA AACAACCTGC 2940
HU 219 369 Β
CAAGGGAATT GACCTGGTTT GGCATCTTCT CCACCAACAA CCCGAGTGAA GTCATTAAAT 3000
GATTGGGTGC TTTGAGTGAT GTTATCCAAA ATGGTTTCAG CTTCAGTAGA ATTTACATAG 3060
TCCACATCAG GAAAAACAGT CTCAGCACGG GTGAGCTTAG AAGTTTGTGA AACAGAAACT 3120
CTTCCACATG GAAATGGCAC TGCTGGTTCA caggacttct GGTTTTCTGC AAGTCGATAT 3180
CCCTCAGTAC AGGAGCAAAC CACCTTGTTA TCAGCACTAT TTTTACAAAA CTGCTCGCAT 3240
CTGCCATTCT TAATGTTACA TGTTACATCT AATTCACAGT TCTTTCCTTC AAATCCAAAG 3300
GGACACCAAC ATTCATAGGA ATTAATGTCA TCCTTGCAAC TGCCGCCATT TAAACATGGA 3360
TTGGACTCAC ACTGATCTCC ATCAACATAC TGCTTCCAAA ATTCAGTTGT TCTTTCAGTG 3420
TTTTCAAAAA CTTCTCGTGC TTCTTCAAAA CTACACTTTT CTTCCATACA TTCTCTCTCA 3480
AGGTTCCCTT GAACAAACTC TTCCAATTTA CCTGAATTAT ACCTCTTTGG CCGATTCAGA 3540
ATTTTGTTGG CGTTTTCATG ATCAAGAAAA ACTGTACATT CAGCACTGAG TAGATATCCT 3600
AAAAGGCAGA TGGTGATGAG GCCTGGTGAT TCTGCCATGA TCATGTTCAC GCGCTCCATG 3660
GAGGCCTTAT TTATATTCCA AAAAAAAAAA ATAAAATTTC AATTTTTAGA TCCCCCAACT 3720
TAAGGGTACC GCCTCGACAT CTATATACTA TATAGTAATA CCAATACTCA AGACTACGAA 3780
ACTGATACAA TCTCTTATCA TGTGGGTAAT GTTCTCGATG TCGAATAGCC ATATGCCGGT 3840
AGTTGCGATA TACATAAACT GATCACTAAT TCCAAACCCA CCCGCTTTTT ATAGTAAGTT 3900
TTTCACCCAT AAATAATAAA TACAATAATT AATTTCTCGT AAAAGTAGAA AATATATTCT 3960
AATTTATTGC ACGGTAAGGA AGTAGAATCA TAAAGAACAG TGACGGATGA TCCCCAAGCT 4020
TGGACACAAG ACAGGCTTGC GAGATATGTT TGAGAATACC ACTTTATCCC GCGTCAGGGA 4080
GAGGCAGTGC GTAAAAAGAC GCGGACTCAT GTGAAATACT GGTTTTTAGT GCGCCAGATC 4140
TCTATAATCT CGCGCAACCT ATTTTCCCCT CGAACACTTT TTAAGCCGTA GATAAACAGG 4200
CTGGGACACT TCACATGAGC GAAAAATACA TCGTCACCTG GGACATGTTG CAGATCCATG 4260
CACGTAAACT CGCAAGCCGA CTGATGCCTT CTGAACAATG GAAAGGCATT ATTGCCGTAA 4320
GCCGTGGCGG TCTGGTACCG GGTGCGTTAC TGGCGCGTGA ACTGGGTATT CGTCATGTCG 4380
ATACCGTTTG TATTTCCAGC TACGATCACG ACAACCAGCG CGAGCTTAAA GTGCTGAAAC 4440
GCGCAGAAGG CGATGGCGAA GGCTTCATCG TTATTGATGA CCTGGTGGAT ACCGGTGGTA 4500
CTGCGGTTGC GATTCGTGAA ATGTATCCAA AAGCGCACTT TGTCACCATC TTCGCAAAAC 4560
CGGCTGGTCG TCCGCTGGTT GATGACTATG TTGTTGATAT CCCGCAAGAT ACCTGGATTG 4620
AACAGCCGTG GGATATGGGC GTCGTATTCG TCCCGCCAAT CTCCGGTCGC TAATCTTTTC 4680
AACGCCTGGC ACTGCCGGGC GTTGTTCTTT TTAACTTCAG GCGGGTTACA ATAGTTTCCA 4740
GTAAGTATTC TGGAGGCTGC ATCCATGACA CAGGCAAACC TGAGCGAAAC CCTGTTCAAA 4800
CCCCGCTTTG GGCTGCAGGA ATTCGATATC AAGCTTATCG ATACCGTCGC GGCCGCGACC 4860
TCGAGGGGGG GCCCGGTACC CAATTCGCCC TATAGTGAGT CGTATTACGC GCGCTCACTG 4920
GCCGTCGTTT TACAACGTCG TGACTGGGAA AACCCTGGCG TTACCCAACT TAATCGCCTT 4980
HU 219 369 Β
GCAGCACATC
TCCCAACAGT
CCCCTTTCGC
TGCGCAGCCT
CAGCTGGCGT AATAGCGAAG AGGCCCGCAC CGATCGCCCT
GAATGGCGAA TGGAAATTGT AAGCGTTAAT ATTTTGTTAA
5040
5100
AATTCGCGTT AAATTTTTGT TAAATCAGCT CATTTTTTAA CCAATAGGCC GAAATCGGCA S160
AAATCCCTTA TAAATCAAAA GAATAGACCG AGATAGGGTT GAGTGTTGTT CCAGTTTGGA 5220
ACAAGAGTCC ACTATTAAAG AACGTGGACT CCAACGTCAA AGGGCGAAAA ACCGTCTATC 5280
AGGGCGATGG CCCACTACGT GAACCATCAC CCTAATCAAG TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC 5340
GTAAAGCACT AAATCGGAAC CCTAAAGGGA GCCCCCGATT TAGAGCTTGA CGGGGAAAGC 5400
CGGCGAACGT GGCGAGAAAG GAAGGGAAGA AAGCGAAAGG AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG 5460
CAAGTGTAGC GGTCACGCTG CGCGTAACCA CCACACCCGC CGCGCTTAAT GCGCCGCTAC 5520
AGGGCGCGTC AG 5532
73. azonosítási számú szekvencia (vii) Közvetlen forrás:
(i) Szekvencia jellemzői: 20 (B)klón: vad típusú gplőÜMN
(A) hosszúság: 14 bázispár (ix) Jellemző:
(B) típus: nukleinsav (A) név/kulcsszó: CDS
(C) szál típusa: kettős (B) lokáció: 3...14
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
(ii) Molekula típusa: (A) Megnevezés: egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid 25
CA ATG AGA GTG AAG Két Arg Val Lys
74. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 4 aminosav (B) típus: aminosav
Met Arg Val Lys 1 (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: protein (xi) Szekvencia leírása:
75. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság:
(B) típus:
(C) szál típusa:
(D) topológia:
(ii) Molekula típusa:
(A) Megnevezés:
CC ATG GCC GTG AAG Met Alá Val Lys bázispár nukleinsav kettős lineáris egyéb nukleinsav szintetikus DNS-oligonukleotid (vii) Közvetlen forrás:
(B)klón: gpl60 vselP-gpl60 vírusban (ix) Jellemző:
(A) név/kulcsszó: CDS (B) lokáció: 3...14 (xi) Szekvencia leírása:
76. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 4 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: protein (xi) Szekvencia leírása:
Met Alá Val Lys 1
77. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 18 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: kettős (D) topológia: lineáris
HU 219 369 Β
(ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav (ix) Jellemző:
(A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk- (A) név/kulcsszó: CDS
leotid (B) lokáció: 4...18
(vii) Közvetlen forrás: (xi) Szekvencia leírása:
(B) klón: vad típusú-S protein 5
GAA ATG AGG GTC CTG GGT 18
Met Arg Val Leu Gly 1 5
78. azonosítási számú szekvencia 10 (D) topológia: lineáris
(i) Szekvencia jellemzői: (ii) Molekula típusa: protein
(A) hosszúság: 5 aminosav (xi) Szekvencia leírása:
(B) típus: aminosav
Met Arg Val Leu Gly
1 5
79. azonosítási számú szekvencia (vii) Közvetlen forrás:
(i) Szekvencia jellemzői: (B) klón: S-protein a kimérákban
(A) hosszúság: 18 bázispár (ix) Jellemző:
(B) típus: nukleinsav 20 (A) név/kulcsszó: CDS
(C) szál típusa: kettős (B) lokáció: 4...18
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
(ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:79:
(A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
leotid 25
GCC ATG GCG GTC CTG GGT 18
Met Ala Val Leu Gly
1 5
80. azonosítási számú szekvencia (D) topológia: lineáris
(i) Szekvencia jellemzői: 30 (ii) Molekula típusa: protein
(A) hosszúság: 5 aminosav (xi) Szekvencia leírása:
(B) típus: aminosav
Met Ala Val Leu Gly
1 5
81. azonosítási számú szekvencia (vii) Közvetlen forrás:
(i) Szekvencia jellemzői: (B) klón: vad típusú IX faktor
(A) hosszúság: 17 bázispár (ix) Jellemző:
(B) típus: nukleinsav (A) név/kulcsszó: CDS
(C) szál típusa: kettős 40 (B) lokáció: 3...17
(D) topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
(ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
leotid
TT ATG CAG CGC GTG AAC 17
Met Gin Arg Val Aen
1 5
82. azonosítási számú szekvencia (D) topológia: lineáris
(i) Szekvencia jellemzői: (ii) Molekula típusa: protein
(A) hosszúság: 5 aminosav 50 (xi) Szekvencia leírása:
(B) típus: aminosav
Met Gin Arg Val Asn
1 5
83. azonosítási számú szekvencia 55 (D) topológia: lineáris
(i) Szekvencia jellemzői: (ii) Molekula típusa: egyéb nukleinsav
(A) hosszúság: 17 bázispár (A) Megnevezés: szintetikus DNS-oligonuk-
(B) típus: nukleinsav leotid
(C) szál típusa: kettős (vii) Közvetlen forrás:
HU 219 369 Β (B)klón: IX faktor vFIXS (ix) Jellemző:
(A) név/kulcsszó: CDS
CC ATG GAG CGC GTG AAC Met Glu Arg Val Asn
5
84. azonosítási számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 5 aminosav (B) típus: aminosav
Met Glu Arg Val Asn 1 5

Claims (39)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás módosított eukarióta citoplazmatikus DNS-vírus előállítására módosított virális genom közvetlen molekuláris klónozásával, azzal jellemezve, hogy
    i) chordopoxvírus genomját tartalmazó tisztított DNS-molekula extracelluláris körülmények közötti módosításával előállítunk egy, a módosított vírusgenomot tartalmazó módosított DNS-molekulát;
    ii) a módosított DNS-molekulát egy gazdasejtbe juttatjuk be, amely a módosított vírusgenomot fertőző virionokba pakolja; és iii) a gazdasejtből kinyerjük a módosított virális genomot tartalmazó fertőző virionokat.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula extracelluláris körülmények közötti módosításának lépésében a DNS-molekulát egy szekvenciaspecifikus endonukleázzal hasítjuk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula módosításának lépésében a chordopoxvírus-genomba egy DNS-szekvenciát inzertálunk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát a genomba egy szekvenciaspecifikus endonukleáz valamely hasítási helyén inzertáljuk.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyeként a genomban egy egyetlen ilyen helyként előforduló helyre inzertáljuk a DNS-szekvenciát.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy genomként vacciniavírus-genomba inzertáljuk a DNS-szekvenciát, és egyedi hasítóhelyként NotI-, Smal-, Apai- vagy Rsrll-helyet alkalmazunk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vakciniavírus-genomként a 4.1 A ábrán bemutatott vdTK-vacciniavírusba inzertáljuk a DNS-szekvenciát.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy genomként egy, chordopoxvírus-genomból természetes körülmények között hiányzó, egyedi hasítási helyre inzertéit, további DNS-szekvenciát is tartalmazó genomot alkalmazunk.
  9. 9. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy genomként egy Escherichia coli β-galaktozidáz génszekvenciát tartalmazó számyas(B) lokáció: 3...17 (xi) Szekvencia leírása:
    (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: protein (xi) Szekvencia leírása:
    poxvírus-genomot, és az egyetlen hasítási helyként NotI bakteriális restrikciós endonukleáz hasítási helyet alkalmazunk.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát a genomba egy első szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helye és egy második szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helye közé inzertáljuk.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genomban az első és a második hasítási helyként egyaránt egyedi helyet alkalmazunk.
  12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genomba inzertált DNSszekvenciaként legalább egy részében egy promoter transzkripciós szabályozása alatt álló DNS-szekvenciát alkalmazunk.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a genomba inzertált DNS-szekvenciában elhelyezkedő promotert alkalmazunk.
  14. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a módosított vírusgenomban az inzertált DNS-szekvencia előtt 5’-irányban elhelyezkedő promotert alkalmazunk.
  15. 15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a módosított vírusgenom által kódolt RNS-polimeráz által hasznosított promotert alkalmazunk.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a chordopoxvírus egy RNS-polimeráza általi transzkripció iniciálására alkalmas promotert alkalmazunk.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a chordopoxvírus egy természetben előforduló promoterének módosított formáját alkalmazzuk.
  18. 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula módosításának lépése során egy DNS-szekvenciát deletálunk genomból.
  19. 19. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula módosításának lépése során egy DNS-szekvenciát szubsztituálunk genomban.
  20. 20. A 1-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a gazdasej86
    HU 219 369 Β tét egy további chordopoxvírussal is fertőzzük, amely egy további genomot tartalmaz, amely expresszálódva a módosított virális genomot fertőző virionokba pakolja.
  21. 21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított DNS-molekula bejuttatását a gazdasejtbe a gazdasejt további chordopoxvírussal való fertőzése után mintegy egy órával hajtjuk végre.
  22. 22. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a további genomnak a gazdasejtben való expressziójával nem állítunk elő olyan fertőző virionokat, amelyek a további genomot tartalmazzák.
  23. 23. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított virális genomként egy módosított vacciniavírus-genomot, további genomként egy számyaspoxvírus-genomot és gazdasejtként egy emlőssejtet alkalmazunk.
  24. 24. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított virális genomot tartalmazó fertőző virionok visszanyerésének lépésében egy további gazdasejtet fertőzünk a gazdasejtben olyan körülmények között keletkezett fertőző virionokkal, hogy a további genom expressziója a gazdasejtben nem eredményez olyan fertőző virionokat, amelyek a további genomot tartalmazzák.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy módosított virális genomként egy módosított vacciniavírus-genomot, további genomként egy szárny aspoxvírus-genomot és további gazdasejtként egy emlőssejtet alkalmazunk.
  26. 26. Az 1-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy módosított virális genomként szelektív markergént tartalmazó virális genomot és további genomként a szelektív markergént nem tartalmazó genomot alkalmazunk, és a gazdasejt fertőzésének lépését egy, a szelektív markergént expresszáló genomra szelektív körülmények között végezzük.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szelektív markergénnek a gazdasejtben való expressziója útján a gazdasejtet rezisztenssé tesszük egy, a gazdasejt fertőzése során a szelektív markergént expresszáló genom szelektálásához elegendően magas koncentrációban jelen lévő citotoxikus droggal szemben.
  28. 28. Módosított chordopoxvírus, azzal jellemezve, hogy chordopoxvírus-genom közvetlen molekuláris klónozása útján az alábbi lépések végrehajtásával állítható elő:
    (I) extracelluláris körülmények között egy, chordopoxvírus-genomot tartalmazó, tisztított DNS-molekula módosítása az alábbi lépésekkel:
    a) a DNS-molekula egy szekvenciaspecifikus endonukleáz egyedi hasítási helyén történő elhasítása, és természetes körülmények között a genomban elő nem forduló DNS-szekvencia inzertálása a hasítási helyre, vagy
    b) a DNS-molekulát egy első, egyedi szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyen és egy második, egyedi szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyen való elhasítása, és természetes körülmények között a genomban elő nem forduló DNS-szekvencia inzertálása a hasítási helyek közé, ezáltal a módosított virális genomot tartalmazó módosított DNS-molekula előállítása;
    (II) a módosított DNS-molekulának gazdasejtbe való bejuttatása és ezáltal a módosított virális genom fertőző virionokká történő pakolása; és (III) a módosított virális genomot tartalmazó fertőző virionoknak a gazdasejtből történő visszanyerése.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti módosított vírus, azzal jellemezve, hogy a chordopoxvirus-genomban természetes körülmények között elő nem forduló DNS-szekvencia többszörös klónozóhely.
  30. 30. A 28. igénypont szerinti módosított vírus, azzal jellemezve, hogy a chordopoxvirus-genomban természetes körülmények között elő nem forduló DNS-szekvencia polipeptidet kódoló DNS.
  31. 31. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti módosított vírus, azzal jellemezve, hogy a chordopoxvírusgenom egy vacciniavírus-genom és az egyedi hasítási hely a NotI, Smal, Apai vagy RsrII bakteriális endonukleázok bármelyikének hasítási helye.
  32. 32. A 28-31. igénypontok bármelyike szerinti módosított vírus, azzal jellemezve, hogy a chordopoxvírusgenom egy, chordopoxvirus-genomban természetes körülmények között elő nem forduló további DNS-szekvenciát tartalmaz, amely az egyedi restrikciós helyre van inzertálva.
  33. 33. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti módosított vírus, azzal jellemezve, hogy a chordopoxvírusgenom egy számyaspoxvírus-genom, amely további DNS-szekvenciaként az Escherichia coli β-galaktozidáz-gén DNS-szekvenciáját tartalmazza és az egyedi hasítási hely a bakteriális NotI restrikciós endonukleáz hasítási helye.
  34. 34. A 28-33. igénypontok bármelyike szerinti, módosított vírus, azzal jellemezve, hogy a chordopoxvirusgenomban természetes körülmények között elő nem forduló, az egyedi hasítási helyre inzertéit DNS-szekvencia legalább egy része egy promoter transzkripciós irányítása alatt áll.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti módosított vírus, azzal jellemezve, hogy a promoter a genomba inzertált DNSszekvenciában helyezkedik el.
  36. 36. A 34. igénypont szerinti módosított vírus, azzal jellemezve, hogy a promoter a módosított virális genomban a genomba inzertált DNS-szekvenciától 5’-irányban helyezkedik el.
  37. 37. A 34. igénypont szerinti módosított vírus, azzal jellemezve, hogy a genom chordopoxvírus-genom és a promoter a természetes körülmények között előforduló chordopoxvírus promoter egy változata.
  38. 38. Módosított chordopoxvírus-genomot tartalmazó DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy chordopoxvírus-genom tisztított DNS-molekulájának extracelluláris körülmények között végzett módosítása útján végrehajtott közvetlen molekuláris klónozással előállítható az alábbi lépések végrehajtásával.
    a) a DNS-molekula egy szekvenciaspecifikus endonukleáz egyedi hasítási helyén történő elhasítása, és egy,
    HU 219 369 Β természetes körülmények között a genomban elő nem forduló DNS-szekvencia inzertálása a hasítási helyre, vagy
    b) a DNS-molekulát egy első, egyedi szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási helyen és egy második, egyedi szekvenciaspecifikus endonukleáz hasítási he- 5 lyen való elhasitása, és egy, természetes körülmények között a genomban elő nem forduló DNS-szekvencia inzertálása a hasítási helyek közé, ezáltal egy, a módosított virális genomot tartalmazó módosított DNS-molekula előállítása.
  39. 39. Eljárás gazdasejtből rekombináns fehérje előállítására módosított vírus alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy a 28-37. igénypontok bármelyike szerinti, módosított vírus felhasználásával, megfelelő gazdasejtben, önmagában ismert módon rekombináns fehérjét expresszáltatunk, és adott esetben a fehérjét elkülönítjük.
HU9202737A 1991-08-26 1992-08-25 Process for producing of modified chordopoxvirus by direct molecular cloning, modified chordopoxvirus and process for its use HU219369B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/750,080 US5445953A (en) 1991-08-26 1991-08-26 Direct molecular cloning of a modified poxvirus genome
US91473892A 1992-07-20 1992-07-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT69927A HUT69927A (en) 1995-09-28
HU219369B true HU219369B (en) 2001-03-28

Family

ID=27115227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9202737A HU219369B (en) 1991-08-26 1992-08-25 Process for producing of modified chordopoxvirus by direct molecular cloning, modified chordopoxvirus and process for its use

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6265183B1 (hu)
EP (1) EP0561034B1 (hu)
JP (1) JPH06261763A (hu)
AT (1) ATE181108T1 (hu)
AU (1) AU652467B2 (hu)
BR (1) BR9203322A (hu)
CA (1) CA2076839C (hu)
CZ (1) CZ264192A3 (hu)
DE (1) DE69229390T2 (hu)
FI (1) FI111384B (hu)
HU (1) HU219369B (hu)
MX (1) MX9204926A (hu)
NO (1) NO310306B1 (hu)
PL (1) PL295733A1 (hu)
SI (1) SI9200190A (hu)
SK (1) SK264192A3 (hu)
YU (1) YU79092A (hu)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
EP0753581A1 (en) 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
EP1180157B1 (en) * 1999-05-28 2012-11-28 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector
US20040063653A1 (en) * 2000-12-21 2004-04-01 Shiver John W. Polynucleotide vaccines expressing codon optimized hiv-1 pol and modified hiv-1 pol
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
WO2002072754A2 (en) 2001-03-08 2002-09-19 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mva expressing modified hiv envelope, gag, and pol genes
US20020106798A1 (en) 2000-03-02 2002-08-08 Robinson Harriet L. DNA expression vectors and methods of use
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
WO2002095038A2 (en) * 2001-05-23 2002-11-28 Fornix Biosciences N.V. Vectors for enhanced expression of vegf for disease treatment
US7223740B2 (en) 2001-05-23 2007-05-29 Fornix Biosciences N.V. Vectors for enhanced expression of VEGF for atrial disease treatment
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
EP1450854A2 (en) * 2001-11-30 2004-09-01 Isis Innovation Limited Vaccine
GB2382578A (en) * 2001-11-30 2003-06-04 Isis Innovation Fowlpox-based vaccine
CA2425021A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-12 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Control of the ratio of lap to lip
WO2003097846A1 (en) * 2002-05-16 2003-11-27 Bavarian Nordic A/S Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome
GB0215621D0 (en) * 2002-07-05 2002-08-14 Imp College Innovations Ltd Improved poxvirus vaccines
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
EP2415783B1 (en) * 2006-10-16 2016-12-14 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
GB201006405D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
AR083533A1 (es) 2010-10-22 2013-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe
JP6415977B2 (ja) 2011-04-15 2018-10-31 ジェネラックス・コーポレイションＧｅｎｅｌｕｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株およびその使用方法
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
US20140140959A1 (en) 2012-10-05 2014-05-22 Aladar A. Szalay Energy Absorbing-Based Diagnostic and Therapeutic Methods Employing Nucleic Acid Molecules Encoding Chromophore-Producing Enzymes
MX360137B (es) 2013-02-21 2018-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Proteínas h5 del virus de la influenza h5n1 para usarse como un medicamento.
US10238700B2 (en) 2014-01-02 2019-03-26 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
BR102015012334A2 (pt) 2015-05-27 2016-11-29 Fundação Hemoct De Ribeirão Preto Fundherp processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea e fator vii de coagulação sanguínea
JP7150611B2 (ja) 2016-01-08 2022-10-11 ジオバックス・インコーポレイテッド 腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘起するための組成物及び方法
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
WO2024011250A1 (en) 2022-07-08 2024-01-11 Viromissile, Inc. Oncolytic vaccinia viruses and recombinant viruses and methods of use thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5155020A (en) 1989-03-08 1992-10-13 Health Research Inc. Recombinant poxvirus host range selection system
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5135855A (en) * 1986-09-03 1992-08-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid, versatile and simple system for expressing genes in eukaryotic cells
US5266313A (en) 1987-02-03 1993-11-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Raccoon poxvirus as a gene expression and vaccine vector for genes of rabies virus and other organisms
FR2619314B1 (fr) * 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
WO1990010693A1 (en) 1989-03-08 1990-09-20 Health Research, Inc. Recombinant poxvirus host selection system
WO1991011519A1 (en) * 1990-01-26 1991-08-08 Immuno Aktiengesellschaft Recombinantly produced blood factors and process for the expression of said blood factors, as well as vaccinia virus recombinants used in said process
US5204243A (en) 1990-02-14 1993-04-20 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus internal cores
AU658836B2 (en) 1990-09-25 1995-05-04 Xenova Research Limited Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line
JP3602530B2 (ja) 1991-03-07 2004-12-15 ヴァイロジェネティクス コーポレイション 遺伝子操作したワクチン菌株
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
US5989561A (en) 1991-03-07 1999-11-23 Virogenetics Corporation Recombinant poxvirus-calicivirus rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) compositions and uses
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
US5863542A (en) 1991-03-07 1999-01-26 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canaryopox virus containing heterologous HIV or SIV inserts
ATE288483T1 (de) 1992-07-30 2005-02-15 Akzo Nobel Nv Nicht-verbreitendes lebendes herpesvirusvakzin
JPH10512151A (ja) 1995-01-13 1998-11-24 ヴァイロジェネティクス コーポレイション Ｈｔｌｖ抗原を発現する組換え弱毒化ポックスウイルスを含有する免疫原性組成物

Also Published As

Publication number Publication date
FI923828A (fi) 1993-02-27
SI9200190A (en) 1993-03-31
YU79092A (sh) 1995-12-04
DE69229390T2 (de) 1999-11-11
MX9204926A (es) 1994-02-28
AU652467B2 (en) 1994-08-25
NO923323L (no) 1993-03-01
FI923828A0 (fi) 1992-08-26
PL295733A1 (en) 1993-05-17
SK264192A3 (en) 1995-08-09
FI111384B (fi) 2003-07-15
ATE181108T1 (de) 1999-06-15
CA2076839C (en) 2007-06-12
EP0561034B1 (en) 1999-06-09
JPH06261763A (ja) 1994-09-20
CA2076839A1 (en) 1993-02-27
BR9203322A (pt) 1993-03-30
CZ264192A3 (en) 1993-08-11
AU2126992A (en) 1993-03-04
NO310306B1 (no) 2001-06-18
EP0561034A3 (hu) 1995-04-26
HUT69927A (en) 1995-09-28
US6103244A (en) 2000-08-15
EP0561034A2 (en) 1993-09-22
NO923323D0 (no) 1992-08-25
DE69229390D1 (de) 1999-07-15
US6265183B1 (en) 2001-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI111384B (fi) Menetelmä modifioidun selkärankaispoxviruksen molekylaariseksi kloonaamiseksi, modifioitu virus, sen DNA ja sen käyttö
KR102604096B1 (ko) 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료
AU2020286323B2 (en) Co-stimulatory domains for use in genetically-modified cells
CN111344395A (zh) 产生经修饰的自然杀伤细胞的方法及使用方法
KR102550926B1 (ko) 이중 항체 구축물을 발현하는 aav를 포함하는 조성물 및 이들의 용도
KR20180097631A (ko) 핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법
JP2023036921A (ja) 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための物質および方法
KR20160138298A (ko) 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물
AU2018235957B2 (en) Engraftable cell-based immunotherapy for long-term delivery of therapeutic proteins
CN111733174B (zh) 一种分离的核酸分子及其用途
CN112912112A (zh) 肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途
CN111979240B (zh) 一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达调控方法和调控系统
CN113164560A (zh) 改善基因疗法的新工具及其用途
CN114990157B (zh) 用于构建lmna基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN110831614A (zh) 用于递送Na/K ATP酶/Src受体复合物拮抗剂的表达载体和相关方法
CA2515166C (en) Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome
CA2558864C (en) Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome
KR20220142502A (ko) 근육 특이적 핵산 조절 요소 및 이의 방법 및 용도
CN114958758B (zh) 一种乳腺癌模型猪的构建方法及应用
KR20220037964A (ko) 재조합 발생이 최소화된 유전자치료 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 레트로바이러스 및 상기 재조합 레트로바이러스를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN116323924A (zh) 具有最小化重组发生的基因疗法载体、包含载体的重组逆转录病毒和用于预防或治疗癌症的包含重组逆转录病毒的药物组合物
KR20240032025A (ko) 내이의 세포 유형-특이적 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법
CN115245144A (zh) 用于制备富含ω-3脂肪酸的猪的试剂盒及其制备方法和应用
KR20210013036A (ko) 신규 벡터 및 그 이용

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees