CN116323924A - 具有最小化重组发生的基因疗法载体、包含载体的重组逆转录病毒和用于预防或治疗癌症的包含重组逆转录病毒的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因疗法载体，在该基因疗法载体中重组发生被最小化。为了使重组发生(其是在病毒复制期间连续表达治疗基因的逆转录病毒载体病毒的生产和感染中的主要问题)最小化，在本发明中，通过基于重复序列切割MCMV启动子制备了经切割的MCMV启动子，并将该经切割的MCMV启动子引入以制备载体。证实了其中整合有经切割的MCMV启动子的载体即使在被孵育多次后也不会引起重组，并且显示治疗性蛋白的连续表达，并且在用含有该载体的病毒转染的细胞中，当向其施用前药时，有效地发生细胞死亡。因此，本发明的具有最小化重组发生的载体可有利地用于癌症治疗。

Description

具有最小化重组发生的基因疗法载体、包含载体的重组逆转 录病毒和用于预防或治疗癌症的包含重组逆转录病毒的药物 组合物
背景技术
1.发明领域
本发明涉及具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其含有胸苷激酶(HSV-TK)、酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)、人CD19基因或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为用于有效癌症治疗的治疗基因，并包含具有最小化重组同时保持该治疗基因的高表达率的最小MCMV启动子。
2.相关技术的描述
基因疗法是指通过在患者的细胞或组织中替换引起疾病的异常基因或通过插入有助于治疗疾病的基因来治疗疾病的技术。在基因疗法早期的发展中，基因疗法的主要概念是将外源DNA插入靶细胞的染色体中以表达特定的基因。但是，最近，使用反义寡脱氧核苷酸、siRNA等抑制与特定疾病相关的基因表达的反义疗法也包括在该范畴内。
这种基因疗法是一种与以前的治疗方法具有完全不同概念的方法，并且可以通过在分子水平上鉴定疾病来治疗它的根本原因。另外，由于基因疗法是核苷酸序列特异性作用，因此通过去除与主要疾病相关的基因，可以使在其它治疗方法中有问题的不必要的副作用最小化。只要控制表达水平的基因的核苷酸序列是已知的，则这种靶向基因的方法不需要在治疗剂的生产中进行任何优化，因此与抗体或化合物治疗剂相比，生产过程非常简单。另外，对于其它治疗剂难以靶向的靶标可以被靶向，只要引起该疾病的基因是已知的即可，因此具有作为下一代治疗剂的足够潜力。在这方面，有几个研究结果已经增加了通过对用现有医疗技术难以治疗的不可治愈的疾病、癌症、AIDS、遗传性疾病和神经系统疾病应用基因疗法进行治疗的可能性，并且也正在进行实际的临床试验(YOUNG等人,2006)。
基因疗法由基因载体(carrier)和治疗基因组成。基因载体是用于将基因递送到活体内的工具，可以大致分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体的制备是通过消除病毒的大多数病毒基因或一些必需基因，使得病毒不能自复制，并替代地在其中插入治疗基因(Lotze MT等人,Cancer Gene Therapy,9:692-699,2002)。病毒载体可以高效地递送基因，但取决于病毒的类型，具有诸如难以大量生产、诱导免疫应答、毒性或可复制病毒出现等问题。目前用于基因疗法开发的主要病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒和痘病毒。另一方面，非病毒载体不诱导免疫反应，毒性低，易于大量生产，但基因递送效率低，瞬时表达低。
逆转录病毒载体是临床实践中最广泛使用的病毒载体之一，1990年在美国国立卫生研究所进行的基因疗法的第一次临床试验中使用，并被认为是用于稳定插入治疗基因的最有用的载体。
相对大的基因可以被插入到具有有限自复制的非复制性逆转录病毒载体中，并且该载体的滴度为约106～107pfu/ml，因此在感染靶细胞时不存在主要问题。另外，由于包装细胞系已经被开发，逆转录病毒载体的制备方法是容易的。此外，通过将治疗基因插入逆转录病毒质粒，用逆转录病毒质粒感染包装细胞以产生重组病毒，并用重组病毒感染靶细胞，可以使逆转录病毒载体成规模。然而，在插入染色体的过程中，可能由于基因插入而发生突变。
可复制的逆转录病毒载体在基因组稳定性方面是高度有争议的，并且当开发为用于基因疗法的自复制病毒载体时，难以引入各种治疗基因，因为可被引入的基因的大小限于约1.3kb(J.of virology,Vol.75,6989-6998,2001)。
作为用于抗癌基因疗法的治疗基因，广泛使用通过前药给药诱导癌细胞自杀的基因，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶或胞嘧啶脱氨酶，可促进免疫应答的细胞因子基因诸如白介素-12或GM-CSF，和肿瘤特异性抗原基因诸如CEA或Her-2(Gottesman MM,Cancer GeneTherapy,10:501-508,2003)。自杀基因在被递送至癌细胞后杀死癌症，而细胞因子基因或肿瘤特异性抗原基因通过激活对癌症的免疫应答来攻击癌细胞。
最近，已经积极地进行了对选择性地对恶性肿瘤显示抗肿瘤作用的酶/前药的合成技术的研究。事实上，当自杀基因在癌组织中表达并且其前体全身性地施用至活体时，毒性不出现在正常细胞中，并且前体仅在表达该治疗基因的肿瘤细胞中转化为毒性物质，并破坏肿瘤细胞。
最广泛使用的自杀基因之一是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)。它具有以下旁观者效应：通过酶反应将对细胞无害的称为更昔洛韦(GCV)的前药转化为细胞毒性物质，诱导具有自杀基因的细胞以及通过间隙连接的邻近细胞的凋亡。进行了自杀基因的临床试验，直到第3期，以证明功效和稳定性(human gene therapy,4:725-731,1993；moleculartherapy,1:195-203,2000)。
另一个自杀基因是酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)，其将5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基化为强效抗癌剂5-氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU代谢为5-氟尿苷三磷酸酯(5-FUTP)和5-氟脱氧尿苷一磷酸酯(5-FdUMP)。与核糖核酸融合的5-FUTP干扰核糖体核糖核酸和载体核糖核酸的合成，而5-FdUMP通过不可逆地抑制胸苷合成酶而抑制DNA合成。此外，yCD具有杀伤yCD没有被递送到的周围细胞的旁观者效应。因此，在表达TK或yCD的肿瘤细胞中，它们通过将前药诸如GCV和5-FC转化为毒性代谢物而选择性杀伤癌细胞。
最近，对治疗癌症的免疫治疗剂已进行了许多研究，并且已开发了免疫治疗方法并正将其应用于临床，在所述免疫治疗方法中，将靶向在癌细胞中特异性表达的抗原的受体诸如CAR-T负载到病毒载体中并进行递送。该免疫治疗方法通过利用体内免疫细胞的特性来尽可能减少副作用，并可增强免疫应答，使得患者的身体对抗癌细胞。在癌细胞中特异性表达的抗原基因的实例包括CD19(分化簇19)、CEA(癌胚抗原)或HER2(人表皮生长因子受体2)。CD19，一种癌抗原基因，主要在血液恶性肿瘤中特异性表达，是由总共556个氨基酸组成的95kDa大小的跨膜糖蛋白。它由胞质C-末端、胞外N-末端和跨膜结构域组成。其中，胞外N-末端作为信号肽在结合CAR中起作用。C-末端的Y391、Y482和Y513酪氨酸残基分别参与胞内信号传导机制，诸如Vav PLC(磷脂酶C)和PI3K(磷酸肌醇3-激酶)/Lyn，并具有广泛的影响。
GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)是一种细胞因子，其作为白细胞生长因子以及粒细胞的增殖和产生起作用，并且通过快速增加对抗感染的巨噬细胞的数目来增加免疫应答。
同时将两种或更多种类型的治疗基因应用于基因疗法的技术在治疗效率方面是优异的，并且当表现出对特定基因疗法的抗性时特别有用。在这方面，由于最近已报道了对TK和CD给药治疗有抗性的癌症，能够在癌组织中同时表达TK和CD的基因疗法载体系统具有很大的优势。然而，将HSV-TK和CD二者均引入RRV(复制型逆转录病毒载体)导致基因组大小为大约10kb或更大，使得实际上不可能插入单个逆转录病毒载体。另外，由于除了原始逆转录病毒的基因组RNA外，外源基因也被引入到用于基因疗法的复制型逆转录病毒载体中，基因组RNA的大小增加，非同源序列增加，基因重组可能导致治疗基因的丢失，使得难以构建该载体。
为了解决这个问题，本发明人减小了包括在复制型逆转录病毒中的gag-pol-env基因组的大小以维持病毒的稳定性。此外，通过将gag-pol和env基因包括在与由一个基因组组成的gag-pol-env载体分开的载体中以允许引入其它治疗基因，构建了双复制型逆转录病毒载体。
已知鼠巨细胞病毒(MCMV)IE基因的启动子在特定细胞中诱导的表达是HCMV IE基因的启动子的几倍至几十倍高(Lafemina R等人,J Gen Virol.,69,355-374(1988))，并且在各种细胞中诱导均一稳定的表达(Aiba-Masago S等人,Am J Pathol.154,735-743(1999))。特别是，已经报道从MCMV主要立即早期启动子(MIEP)区去除上游区域会在灵长类和小鼠细胞中诱导非常强的表达(Kim和Risser,J.Virol.67,239-248(1993)；和Kim,Biochem.Biophys.Res.Comm.,203,1152-1159(1994))。另外，韩国专利No.10-0423022公开了MCMV启动子可用作动物的表达载体，因为该启动子在人和小鼠真核细胞中强烈且稳定地诱导基因表达。
然而，由于MCMV启动子中的重复核苷酸序列，在病毒复制期间，一些MCMV核苷酸序列丢失，或者从MCMV启动子开始的其它位置的病毒载体核苷酸序列一起丢失，导致了重组病毒，这是连续表达治疗基因的逆转录病毒载体的生产和感染中的主要问题。
因此，在开发用于基因疗法的其中不发生重组的病毒载体时，本发明人通过根据MCMV启动子中的重复核苷酸序列截短启动子，构建了含有HSV-TK、hopt-yCD、hCD19或GM-CSF基因的四种变体作为治疗基因，并开发了一种复制型逆转录病毒载体，在该载体中引入了经切割的MCMV启动子，并且由于在病毒感染过程中不发生重组，因此治疗基因没有丢失。本发明人通过证实在该载体中不发生病毒重组并且该载体具有优异的治疗基因表达和药物敏感性而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其含有作为治疗基因的胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、人CD19基因或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和MCMV启动子，用于治疗癌症。
本发明的另一个目的是提供含有该逆转录病毒载体的重组逆转录病毒，以及用该重组逆转录病毒感染的宿主细胞。
为了达到上述目的，本发明提供了一种具有最小化重组发生的复制型重组逆转录病毒载体，其包含含有MuLV的Gag-Pol基因、sEF1α启动子或MCMV启动子和第一治疗基因的第一重组表达载体；和含有病毒的Env基因、MCMV启动子和第二治疗基因的第二重组表达载体。
本发明还提供了一种包含所述载体的重组逆转录病毒。
本发明还提供了一种用所述重组逆转录病毒转染的宿主细胞。
本发明还提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含所述重组逆转录病毒作为活性成分。
本发明还提供了一种用于治疗癌症的包含所述重组逆转录病毒的基因递送组合物。
此外，本发明提供了一种用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)制备含有MuLV的Gag-Pol基因、sEF1α启动子或MCMV启动子和第一治疗基因的第一重组表达载体的步骤；和
2)制备含有病毒的Env基因、MCMV启动子和第二治疗基因的第二重组表达载体的步骤。
有益效果
本发明涉及一种基因疗法载体，在该基因疗法载体中重组发生被最小化。为了使重组发生(其是在病毒复制期间连续表达治疗基因的逆转录病毒载体病毒的生产和感染中的主要问题)最小化，在本发明中，通过基于重复序列切割MCMV启动子制备了经切割的MCMV启动子，并将该经切割的MCMV启动子引入以制备载体。证实了其中整合有经切割的MCMV启动子的载体即使在被孵育多次后也不会引起重组，并且显示治疗性蛋白的连续表达，并且在用含有该载体的病毒转染的细胞中，当向其施用前药时，有效地发生细胞死亡。因此，本发明的具有最小化重组发生的载体可有利地用于癌症治疗。
附图说明
图1是设计用于证实复制性逆转录病毒载体的感染性和重组类型的GaLV env-pMCMV-yCD/gag-pol-pMCMV-HSV1-TK载体的示意图。
图2是显示用于证实GaLV env-pMCMV-yCD/gag-pol-pMCMV-HSV1-TK载体的感染性和重组类型的实验程序的示意图。
图3是显示用于进行聚合酶链反应以证实GaLV env-pMCMV-yCD/gag-pol-pMCMV-HSV1-TK载体的重组类型的引物的位置的示意图。
图4是显示进行聚合酶链反应以证实spRRVe-yCD:env载体中是否发生了重组的结果的图，证实了病毒增殖和感染进展，但在病毒感染后的扩增期间发生了重组。
图5是证实GaLV env、MCMV启动子、yCD和3'核苷酸序列中发生的重组类型的图。
图6是显示MCMV启动子核苷酸序列中4个重复核苷酸序列(1.AACAGGAAA，2.GGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACA，3.TGGGTTTTTCC，4.GTACTTTCCCA)的图。
图7是显示其中经切割的MCMV启动子被引入GaLV Env的spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK载体的结构的图。
图8是显示其中经切割的MCMV启动子被引入MuLV Env的sRRVe-TK、sRRVe-F1-TK、sRRVe-F2-TK、sRRVe-F3-TK和sRRVe-F4-TK载体的结构的图。
图9是显示用于证实sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD、spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK载体中的重组的引物的位置以及是否重组的图。
图10是证实胸苷激酶(TK)蛋白在spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK载体中连续表达的图。
图11是证实spRRVe-F4-TK载体的重组不在spRRVe-F4-TK/sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD载体中发生并且酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白在其中连续表达的图。
图12是证实当用前药GCV和5-FC处理sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD、spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK载体时载体中表达的胸苷激酶和酵母胞嘧啶脱氨酶诱导细胞死亡的图。
图13是显示用于证实sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD、sRRVe-TK、sRRVe-F1-TK、sRRVe-F2-TK、sRRVe-F3-TK和sRRVe-F4-TK载体中的重组的引物的位置以及是否重组的图。
图14是显示用于证实sRRVgp-F4-hopt-yCD和sRRVe-F4-TK载体中的重组的引物的位置以及是否重组的图。
图15是证实胸苷激酶(TK)蛋白在sRRVe-TK、sRRVe-F1-TK、sRRVe-F2-TK、sRRVe-F3-TK和sRRVe-F4-TK载体中连续表达的图。
图16是证实当用前药GCV处理sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD、sRRVe-TK、sRRVe-F1-TK、sRRVe-F2-TK、sRRVe-F3-TK和sRRVe-F4-TK载体时载体中表达的胸苷激酶诱导细胞死亡的图。
图17是显示早用含有sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD和sRRVe-F4-TK载体的病毒转染的细胞中根据细胞死亡定量的细胞生存力的图。
图18是显示用于证实在sRRVe-F4-TK/sRRVgp-F4-hCD19载体中是否发生重组的引物的扩增位置的图。
图19是通过PCR证实在来自第3代的sRRVgp-F4-hCD19载体中发生了重组的图。
图20是显示用于证实在sRRVe-F4-hCD19/sRRVgp-F4-hopt-yCD载体中是否发生重组的引物的扩增位置的图。
图21是通过PCR证实在sRRVe-F4-hCD19载体中没有发生重组的图。
图22是sRRVe-F4-TK和sRRVgp-F4-hCD19t载体的示意图。
图23是通过PCR证实在引入了TK的sRRVe-F4-TK载体和引入了hCD19t的sRRVgp-F4-hCD19t载体中没有发生重组的图。
图24是sRRVgp-F4-hopt-yCD和sRRVe-F4-hCD19t载体的示意图。
图25是通过PCR证实在引入了hopt-yCD的sRRVgp-F4-hopt-yCD载体和引入了hCD19t的sRRVe-F4-hCD19t载体中没有发生重组的图。
图26是sRRVgp-F4-mGM-CSF和sRRVe-F4-hCD19t载体的示意图。
图27是通过PCR证实在引入了mGM-CSF的sRRVgp-F4-mGM-CSF载体和引入了hCD19t的sRRVe-F4-hCD19t载体中没有发生重组的图。
图28是sRRVgp-F4-hGM-CSF和sRRVe-F4-hCD19载体的示意图。
图29是通过PCR证实sRRVgp-F4-hGM-CSF载体的复制由于结构不稳定性而不完全发生的图。
图30是sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF和sRRVe-F4-hCD19载体的示意图。
图31是sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF和sRRVe-F4-hCD19t载体的示意图。
图32是通过PCR证实在病毒复制期间在引入了hopt-GM-CSF的sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体和引入了hCD19的sRRVe-F4-hCD19载体中没有发生重组的图。
图33是通过PCR证实在病毒复制期间在引入了hopt-GM-CSF的sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体和引入了hCD19t的sRRVe-F4-hCD19t载体中没有发生重组的图。
具体实施方式
以下，详细描述本发明。
本发明提供了一种具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其包含含有MuLV(鼠白血病病毒)的Gag-Pol基因、sEF1α启动子或MCMV启动子和第一治疗基因的第一重组表达载体；和含有病毒的Env基因、MCMV启动子和第二治疗基因的第二重组表达载体。
所述MCMV启动子是具有SEQ.ID.NO:3所示的核苷酸序列的646bp的多核苷酸。
所述MCMV启动子是鼠巨细胞病毒启动子，已知其在特定细胞中诱导的表达是人巨细胞病毒(HCMV)IE基因的启动子的几倍至几十倍高(Lafemina R等人,J Gen Virol.,69,355-374(1988))，并且在各种细胞中诱导均一稳定的表达(Aiba-Masago S等人,Am JPathol.154,735-743(1999))。特别是，已经报道其中去除了主要立即早期启动子(MIEP)位点上游区的MCMV启动子会在灵长类和小鼠细胞中诱导非常强的表达(Kim和Risser,J.Virol.67,239-248(1993)；和Kim,Biochem.Biophys.Res.Comm.,203,1152-1159(1994))。
然而，由于MCMV启动子中4个位点处的重复核苷酸序列，导致在起始于MCMV启动子的其它位点处的病毒载体核苷酸序列丢失，或者启动子中的一些核苷酸序列丢失，从而导致重组，这导致治疗基因丢失并且在连续表达治疗基因的逆转录病毒载体病毒的生产和感染中引起主要问题。
因此，为了使重组发生最小化，所述MCMV启动子的特征在于其是经切割的MCMV启动子。
所述经切割的MCMV启动子可以是选自具有SEQ.ID.NO:4、NO:5、NO:6和NO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸的任一个，优选地是选自具有SEQ.ID.NO:5、NO:6和NO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸的任一个，更优选地可以是具有SEQ.ID.NO:6或NO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸，并且最优选地可以是具有SEQ.ID.NO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸。
在本发明的一个具体实施方案中，证实了由于载体(spRRVe-yCD)和载体(sRRVgp-TK)中MCMV启动子的重复核苷酸序列而发生了基因重组，所述载体(spRRVe-yCD)含有MCMV启动子全长序列、GaLV env和编码酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白的基因，所述载体(sRRVgp-TK)含有MCMV启动子全长序列、gag-pol基因和编码胸苷激酶(TK)蛋白的基因(图1至图6)。
所述sEF1α(短延伸因子1α)启动子是具有SEQ.ID.NO:18所示的核苷酸序列的多核苷酸。
所述病毒Env基因是衍生自Gibbon猿白血病病毒(GaLV)、双嗜性MuLV、异嗜性MuLV、猫内源性逆转录病毒(RD114)、水泡性口炎病毒(VSV)和麻疹病毒(MV)Env基因的任一种。所述多核苷酸可以包括具有上述特征的变体。
所述GaLV Env基因是具有SEQ.ID.NO:19所示的核苷酸序列的多核苷酸。
所述MuLV Env基因是具有SEQ.ID.NO:20所示的核苷酸序列的多核苷酸。
所述第一治疗基因或所述第二治疗基因可以是选自通过前药给药诱导癌细胞自杀的自杀基因、细胞因子基因诸如白介素-12或促进免疫应答的GM-CSF和肿瘤特异性癌抗原基因诸如CD19、CEA或HER2的任一种。
所述自杀基因可以是胸苷激酶(TK)基因或酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因。
所述第一治疗基因和所述第二治疗基因是选自胸苷激酶(TK)基因、酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因和人CD19基因的至少一种。
所述胸苷激酶基因是具有SEQ.ID.NO:21所示的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸不仅可以包括编码胸苷激酶蛋白的氨基酸序列的多核苷酸序列，而且可以包括具有与该多核苷酸的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列及其片段的多核苷酸。具有基本上相同的核苷酸序列的多核苷酸可以与本发明的多核苷酸具有80％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高的同源性。如上所述，本发明的多核苷酸可以包括其中一个或多个核苷酸序列被取代、缺失或插入的变体，只要它编码具有与其等同的活性的蛋白质。
所述酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因是具有SEQ.ID.NO:22所示的核苷酸序列的多核苷酸。
所述胞嘧啶脱氨酶基因可以是用人密码子优化的基因。
本说明书中使用的术语“用人密码子优化”是指当DNA在宿主细胞中转录和翻译成蛋白质时，在指定氨基酸的密码子之间存在取决于宿主的优选密码子，所述密码子用人密码子替换以增加由核酸编码的氨基酸或蛋白质的表达效率。
所述胸苷激酶基因或所述酵母胞嘧啶脱氨酶基因激活前体药物。所述前体药物为选自更昔洛韦(GCV)和5-氟胞嘧啶(5-FC)的至少一种。在本发明的一个实施方案中，所述胸苷激酶基因可以激活更昔洛韦，所述酵母胞嘧啶脱氨酶基因可以激活5-氟胞嘧啶。
所述粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可以是用人密码子优化的。
本说明书中使用的术语“用人密码子优化”是指当DNA在宿主细胞中转录和翻译成蛋白质时，在指定氨基酸的密码子之间存在取决于宿主的优选密码子，所述密码子用人密码子替换以增加由核酸编码的氨基酸或蛋白质的表达效率。
所述人CD19(分化簇19)基因可以是经截短的人CD19基因，在该基因中胞质结构域中的氨基酸被去除，并且胞质结构域中的233个氨基酸可以被去除。
所述人CD19基因是具有SEQ.ID.NO:43或NO:53所示的核苷酸序列的多核苷酸。
所述gag基因可以是编码四种构成逆转录病毒核心的蛋白质的多核苷酸。同时，所述pol基因是编码逆转录病毒逆转录酶的多核苷酸，所述env基因是编码逆转录病毒包膜糖蛋白的多核苷酸。
所述MuLV-Gag基因是鼠白血病病毒的Gag基因，并且可以是由SEQ.ID.NO:23所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。所述MuLV-Pol基因是鼠白血病病毒的Pol基因，并且可以是由SEQ.ID.NO:24所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。所述MuLV Gag-Pol基因可以是由其中SEQ.ID.NO:23和24所示的核苷酸序列相融合的核苷酸序列组成的多核苷酸。
本说明书中使用的术语“可复制的”是指病毒载体可以在细胞中自复制，其中用含有动物细胞或特定基因的病毒载体转导或感染含有特定基因的病毒基因组。
如本文所用，术语“复制型逆转录病毒载体”是产生非裂解性病毒的载体，并且由于它通过核膜中的裂缝进入细胞核，它可以特异性感染分裂细胞，即癌细胞，因此可以防止插入的基因在其它正常细胞中表达。因此，该载体可以安全地将基因递送到癌细胞，并且由于其可以复制病毒，因此可以提高基因递送效率。
在本发明的一个具体实施方案中，通过去除MCMV启动子中的重复核苷酸序列以使重组最小化，制备了四个经切割的MCMV启动子，其大小分别为470bp、337bp、237bp和160bp(表2)。另外，构建了其中引入了经切割的MCMV启动子的基于GaLV env的载体(spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK)和基于MuLV的载体(sRRVe-TK、sRRVe-F1-TK、sRRVe-F2-TK、sRRVe-F3-TK和sRRVe-F4-TK)，构建了由表达酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白的gag-pol-sEF1α-hopt-yCD组成的sRRVe-sEF1α-hopt-yCD载体，作为引入的载体，与表达胸苷激酶蛋白的载体一起(图7和图8)，随后来证实重组发生。结果证实，在sRRVe-sEF1α-hopt-yCD载体中没有发生重组(见图9)，在其中MCMV启动子中的大部分重复序列被去除的spRVe-F4-TK载体中几乎没有发生重组(图10、图11和图13)。此外，证实了甚至在sRRVgp-F4-hopt-yCD与其中sRRVe-sEF1α-hopt-yCD载体的sEF1α被MCMV的F4截短启动子取代的载体的组合中没有发生重组(见图14)。还证实了在其中引入了人CD19基因作为治疗基因的sRRVgp-F4-hopt-yCD/sRRVe-F4-hCD19载体中没有发生重组(见图20和图21)。还证实了甚至在其中引入了具有人CD19基因胞质结构域截短的氨基酸的hCD19t作为治疗基因的sRRVe-F4-hCD19t载体中没有发生重组(见图23和图25)。还证实了甚至在其中引入了小鼠GM-CSF作为治疗基因的sRRVgp-F4-mGM-CSF载体中没有发生重组(见图27)。还证实了在其中引入了经密码子优化的人GM-CSF作为治疗基因的sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体中没有发生重组(见图32和图33)。
因此，本发明的载体中重组发生被最小化，因此其可有效地用于稳定地表达治疗基因而不丢失。
本发明还提供了一种包含所述载体的重组逆转录病毒。同时，含有MuLV的Gag-Pol基因、sEF1α启动子或MCMV启动子和第一治疗基因的第一重组表达载体；和含有病毒的Env基因、MCMV启动子和第二治疗基因的第二重组表达载体，可以分别或一起包含在所述重组逆转录病毒中。
在本发明的一个具体实施方案中，通过去除MCMV启动子中的重复核苷酸序列以使重组最小化，制备了四个经切割的MCMV启动子，其大小分别为470bp、337bp、237bp和160bp(表2)。另外，构建了其中引入了经切割的MCMV启动子的基于GaLV env的载体(spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK)和基于MuLV的载体(sRRVe-TK、sRRVe-F1-TK、sRRVe-F2-TK、sRRVe-F3-TK和sRRVe-F4-TK)，构建了由表达酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白的gag-pol-sEF1α-hopt-yCD组成的sRRVe-sEF1α-hopt-yCD载体，作为引入的载体，与表达胸苷激酶蛋白的载体一起(图7和图8)，随后来证实重组发生。结果证实，在sRRVe-sEF1α-hopt-yCD载体中没有发生重组(见图9)，在其中MCMV启动子中的大部分重复序列被去除的spRVe-F4-TK载体中几乎没有发生重组(图10、图11和图13)。此外，证实了甚至在sRRVgp-F4-hopt-yCD与其中sRRVe-sEF1α-hopt-yCD载体的sEF1α被MCMV的F4截短启动子取代的载体的组合中没有发生重组(见图14)。还证实了在其中引入了人CD19基因作为治疗基因的sRRVgp-F4-hopt-yCD/sRRVe-F4-hCD19载体中没有发生重组(见图20和图21)。还证实了甚至在其中引入了具有人CD19基因胞质结构域截短的氨基酸的hCD19t作为治疗基因的sRRVe-F4-hCD19t载体中没有发生重组(见图23和图25)。还证实了甚至在其中引入了小鼠GM-CSF作为治疗基因的sRRVgp-F4-mGM-CSF载体中没有发生重组(见图27)。还证实了在其中引入了经密码子优化的人GM-CSF作为治疗基因的sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体中没有发生重组(见图32和图33)。
因此，本发明的载体中重组发生被最小化，因此其可有效地用于稳定地表达治疗基因而不丢失。
本发明还提供了一种用重组逆转录病毒转染的宿主细胞。
所述宿主细胞可以是NS/O骨髓瘤细胞、人293T细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、HeLa细胞、CapT细胞(人羊水衍生细胞)、COS细胞、犬D17细胞、小鼠NIH/3T3细胞、逆转录病毒包装细胞、人间充质干细胞或猫PG4细胞。
通过在用重组逆转录病毒载体质粒转导的细胞中产生的重组病毒感染上述细胞来进行转染。
可以根据本领域已知的方法进行转染。例如，可以通过选自lipofectamine法、显微注射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体介导的转染法、DEAE-葡聚糖处理法和基因轰击法的一种或多种进行转染。在本发明的一个实施方案中，可以通过lipofectamine法进行转染。
可以使用通常用于培养动物细胞的培养基来培养被转染的细胞。例如，所述培养基可以是选自Eagles’s MEM、a-MEM、Iscove’s MEM、培养基199、CMRL 1066、RPMI 1640、F12、F10、DMEM与F12的混合培养基、Way-mouth’s MB752/1、McCoy’s 5A和MCDB系列培养基的至少一种。在本发明的一个实施方案中，所述培养基可以是DMEM。
本发明还提供了一直用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含所述重组逆转录病毒作为活性成分。
另一方面，含有MuLV(鼠白血病病毒)的Gag-Pol基因、sEF1α启动子和酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因的第一重组表达载体；和含有病毒的Env基因、MCMV启动子和胸苷激酶基因的第二重组表达载体，可以分别或一起包含在所述重组逆转录病毒中。
所述逆转录病毒可以靶向任何分裂细胞，并且具体地，所述细胞可以是癌细胞。所述癌细胞可以包括源自癌症的细胞，所述癌症诸如粘液细胞癌、圆细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性癌、尤因肉瘤、癌转移、淋巴样转移、鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、口腔癌、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病、流出物淋巴瘤(腹腔淋巴瘤(celiac lymphoma))、胸腺淋巴瘤肺癌、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肾上腺皮质癌、ACTH-产生肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、小细胞癌、导管癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、结肠直肠肿瘤相关息肉、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、原发性浅表性膀胱肿瘤、膀胱的侵入性膀胱转移性细胞癌、肌肉侵入性膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、原发性腹膜上皮瘤变、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、滤泡性实体瘤、睾丸瘤、阴茎癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、成神经细胞瘤、脑干神经胶质瘤、神经胶质瘤、中枢神经系统中的转移性肿瘤细胞浸润、骨瘤、骨肉瘤、恶性黑素瘤、人皮肤角化细胞的肿瘤进展、鳞状细胞癌、甲状腺癌、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、间皮瘤、维尔姆斯瘤、胆囊癌、滋养层肿瘤、血管周皮细胞瘤或卡波西肉瘤。
在本发明的一个具体实施方案中，证实了用作治疗基因的胸苷激酶和酵母胞嘧啶脱氨酶在基于GaLV env的载体(spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK)和基于MuLV的载体(sRRVe-TK、sRRVe-F1-TK、sRRVe-F2-TK、sRRVe-F3-TK和sRRVe-F4-TK)中稳定表达，并且所述治疗基因可通过作用于前药GCV和5-FC而杀伤细胞。
因此，含有根据本发明的载体的重组逆转录病毒可以有效地用于预防或治疗癌症。
本发明的药物组合物可以配制成肠胃外制剂。用于肠胃外给药的制剂可以包括注射剂，诸如无菌水溶液、水不溶性赋形剂、混悬液和乳液。
丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射酯诸如油酸乙酯可用作水不溶性赋形剂和混悬液。
可以通过选自皮肤外用、腹膜内注射、直肠注射、皮下注射、静脉内注射、肌内注射和胸内注射的方法进行肠胃外给药。
本发明的组合物可以以药学上有效的量施用。有效量可根据疾病类型、严重性、药物活性、患者对药物的敏感性、给药时间、给药途径、治疗持续时间、同时使用的药物等来确定。本发明的组合物可以单独施用或与其它治疗剂组合施用。在组合施用中，施用可以是顺序的或同时的。
所述组合物的有效剂量为重组病毒情况下的1011-1013个病毒颗粒(108-1010IU)/kg/1kg体重，和细胞情况下的103-106个细胞/kg，并且所述施用作为单次施用进行。
根据本发明的药物组合物可以含有基于所述组合物总重量的10-95重量％的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体作为活性成分。此外，本发明的药物组合物除了上述活性成分之外，还可以包含至少一种表现出相同或相似功能的活性成分。
本发明还提供了一种用于治疗癌症的包含所述重组逆转录病毒的基因递送组合物。
同时，含有MuLV(鼠白血病病毒)的Gag-Pol基因、sEF1α启动子或MCMV启动子和第一治疗基因的第一重组表达载体；和含有病毒的Env基因、MCMV启动子和第二治疗基因的第二重组表达载体，可以分别或一起包含在所述重组逆转录病毒中。
所述癌症可以包括如上所述的癌症。
本说明书中使用的术语“基因送递组合物”是指能够将基因转移到靶细胞中的组合物。
在本发明的一个具体实施方案中，证实了用作治疗基因的胸苷激酶和酵母胞嘧啶脱氨酶在基于GaLV env的载体(spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK)和基于MuLV的载体(sRRVe-TK、sRRVe-F1-TK、sRRVe-F2-TK、sRRVe-F3-TK和sRRVe-F4-TK)中稳定表达，并且所述治疗基因可通过作用于前药GCV和5-FC而杀伤细胞。
因此，含有根据本发明的载体的重组逆转录病毒可以有效地用于递送用于癌症治疗的基因。
此外，本发明提供了一种用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)制备含有MuLV(鼠白血病病毒)的Gag-Pol基因、sEF1α启动子或MCMV启动子和第一治疗基因的第一重组表达载体的步骤；和
2)制备含有病毒的Env基因、MCMV启动子和第二治疗基因的第二重组表达载体的步骤。
所述载体具有上述特征。例如，所述MCMV启动子选自具有SEQ.ID.NO:3、NO:4、NO:5、NO:6和NO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸，所述sEF1α启动子是具有SEQ.ID.NO:18所示的核苷酸序列的多核苷酸，并且所述病毒的Env基因是具有SEQ.ID.NO:19或NO:20所示的核苷酸序列的多核苷酸。
此外，所述第一治疗基因和所述第二治疗基因是选自胸苷激酶(TK)基因、酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因和人CD19基因的至少一种。
所述胸苷激酶基因是具有SEQ.ID.NO:21所示的核苷酸序列的多核苷酸，所述酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因是具有SEQ.ID.NO:22所示的核苷酸序列的多核苷酸，所述人CD19基因是具有SEQ.ID.NO:43所示的核苷酸序列的多核苷酸。
所述胸苷激酶基因可以激活前体药物更昔洛韦，所述胞嘧啶脱氨酶基因可以激活前体药物5-氟胞嘧啶。
在本发明的一个具体实施方案中，通过去除MCMV启动子中的重复核苷酸序列以使重组最小化，制备了四个经切割的MCMV启动子，其大小分别为470bp、337bp、237bp和160bp(表2)。另外，构建了其中引入了经切割的MCMV启动子的基于GaLV env的载体(spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK)和基于MuLV的载体(sRRVe-TK、sRRVe-F1-TK、sRRVe-F2-TK、sRRVe-F3-TK和sRRVe-F4-TK)，构建了由表达酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白的gag-pol-sEF1α-hopt-yCD组成的sRRVe-sEF1α-hopt-yCD载体，作为引入的载体，与表达胸苷激酶蛋白的载体一起(图7和图8)，随后来证实重组发生。结果证实，在sRRVe-sEF1α-hopt-yCD载体中没有发生重组(见图9)，在其中MCMV启动子中的大部分重复序列被去除的spRVe-F4-TK载体中几乎没有发生重组(图10、图11和图13)。还证实了甚至在sRRVgp-F4-hopt-yCD与其中sRRVe-sEF1α-hopt-yCD载体的sEF1α被MCMV的F4截短启动子取代的载体的组合中没有发生重组(见图14)。还证实了在其中引入了人CD19基因作为治疗基因的sRRVgp-F4-hopt-yCD/sRRVe-F4-hCD19载体中没有发生重组(见图20和图21)。还证实了甚至在其中引入了具有人CD19基因胞质结构域截短的氨基酸的hCD19t作为治疗基因的sRRVe-F4-hCD19t载体中没有发生重组(见图23和图25)。还证实了甚至在其中引入了小鼠GM-CSF作为治疗基因的sRRVgp-F4-mGM-CSF载体中没有发生重组(见图27)。还证实了在其中引入了经密码子优化的人GM-CSF作为治疗基因的sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体中没有发生重组(见图32和图33)。
因此，通过本发明的生产方法制备的载体中重组发生被最小化，因此其可有效地用于稳定地表达治疗基因而不丢失。
下文，将通过以下实施例对本发明进行详细说明。
但是，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容并不限于此。
<实施例1>复制型逆转录病毒载体的构建
<1-1>病毒载体的制备
如果将大于1.3kb的外源基因插入其中gag、pol和env基因被合成为单个基因组的常规的RRV载体，基因组大小增加，使得载体结构不稳定，因此无法倍增完整形式的病毒载体。因此，构建了两种载体，使得gag-pol基因和env基因分别在独立的载体中表达。此时，用对哺乳动物感染友好的MuLV(鼠白血病病毒)的env基因或对灵长类动物感染友好的GaLV(Gibbon猿白血病病毒)的env基因替换该env。作为治疗基因，分别将HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因克隆到gag-pol载体中，将yCD(酵母胞嘧啶脱氨酶)基因克隆到GaLV-env载体中，然后使用鼠巨细胞病毒(MCMV)启动子作为用于基因表达控制的启动子构建了载体。
具体地，如下构建了病毒载体。
1.spRRVe-yCD env载体(SEQ.ID.NO:25)：(图1)
切割存在于以前构建的spRRVeMCMV-MCS(GaLVEnv-MCMV-MCS-3'-LTR)载体的MCS(多克隆位点)中的PmeI，并用CIAP处理，以制备平端形式的截短载体的两端。用XhoI-HindIII消化其中插入了yCD的pcDNA-yCD载体以回收yCD基因，然后用T4 DNA聚合酶处理以制备平端形式的载体的两端。然后，使用T4 DNA连接酶连接spRRVeMCMV(PmeI，CIAP)载体和yCD(XhoI-HindIII，T4 DNA聚合酶)，以制备spRRVe-yCD。
2.sRRVgp-TK:gag-pol载体(SEQ.ID.NO:26)：(图1)
构建了不含启动子和转基因的sRRRVgp(具有逆转录病毒gag-pol的载体)载体。然后，将MCMV-TK引入gag-pol与3'-LTR之间的EcoRI位点。由于在一个克隆过程中不能完成sRRVgp-TK，首先克隆MCMV，然后在MCMV下引入TK以完成sRRVgp-TK，即终产物。该方法如下。
为了将MCMV克隆到sRRVgp的gag-pol与3'-LTR之间的EcoRI位点，通过PCR扩增了MCMV启动子。
MCMV-F-EcoRI：5'-cgGAATTCAACAGGAAAGTCCCATTGGA-3’(SEQ.ID.NO:47)
MCMV-R-PmeI-EcoRI：5'-cgGAATTCGTTTAAACCTGCGTTCTACGGTGGTCAGA-3'(SEQ.ID.NO:48)。用EcoRI消化扩增的MCMV启动子产物，通过用EcoRI和CIAP处理回收sRRRVgp载体，然后用T4 DNA连接酶连接以完成sRRVgpMCMV。然后，为了将TK基因克隆到sRRVgpMCMV载体的PmeI位点中，通过PCR扩增了TK基因以包括PmeI。
TK-F-PmeI：5'-cgGTTTAAACATGGCTTCGTACCCCTGCCATC-3'(SEQ.ID.NO:49)
TK-R-PmeI：5'-CGGTTTAAACTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCC-3'(SEQ.ID.NO:50)。通过用PmeI和CIAP处理，回收了sRRVgpMCMV，用PmeI消化TK基因并回收，然后用T4 DNA连接酶连接以构建终产物sRRVgp-TK。
<1-2>病毒生产
为了证实其中治疗基因在MCMV启动子控制下表达的复制型逆转录病毒载体的感染性和重组类型，根据图2的示意图所示的程序，使用实施例<1-1>中构建的载体生产了病毒。
具体地，通过将实施例<1-1>中制备的载体瞬时转导到293T细胞中生产了病毒，并用2E7gc(基因组拷贝)的病毒感染脑肿瘤细胞系U87MG。在初次感染3天后，取培养的上清液并重新感染新的U87MG，回收感染的U87MG细胞系并分离基因组DNA。
<1-3>spRRVe-yCD:env载体的重组的证实
用于基因疗法的复制型逆转录病毒载体由于引入的外源基因使基因组RNA的大小增大，而且由于添加了非同源序列，因此很可能引起重组。因此，为了构建用于基因疗法的有效且稳定的复制型逆转录病毒载体，非常重要的是证实在发育阶段的重组的存在和程度。为了证实病毒增殖和感染是否进行以及在病毒感染后的扩增过程期间是否发生重组，使用从实施例<1-2>中生产的病毒提取的基因组DNA进行了聚合酶链反应(PCR)。
具体地，使用下表1中列出的能够特异性扩增env载体的引物进行聚合酶链反应。如图3所示，对于spRRVe-yCD:env载体，使用扩增GaLV env和3'端作为靶位点的引物进行基因组DNA PCR，以证实基因是否扩增到预期的大小。将100ng基因组DNA、1X反应缓冲液、0.25mM dNTP、0.2pmol正向引物、0.2pmol反向引物和0.2单位Taq聚合酶加入PCR反应管中，并加入灭菌蒸馏水使最终体积为20μl。然后，在下表1所示的条件下进行PCR后，将扩增的DNA上样到1％琼脂糖凝胶上以证实PCR扩增产物，由此证实病毒的感染性和是否发生重组。
【表1】
序列(5'→3') SEQ.ID.NO:
GaLV 1624F GACTCAGTCAGCAAGTTAGAG 1
MFGSacIR CAATCGGAGGACTGGCGCCCCGAGTGA 2
结果，如图4所示，作为进行spRRVe-yCD:env载体的聚合酶链反应的结果，PCR产物在初次感染的第3天和第1至3代时被检测到，证实病毒增殖和感染进展。然而，由于从第2代中检测到了比预期的2,337bp扩增产物小的大量PCR产物，证实了在病毒感染后的扩增过程期间发生了重组。具体地，直到第1代才能观察到单一PCR条带，但在第2代和第3代中，证实扩增了几个PCR条带。
<1-4>spRRVe-yCD:env载体的重组类型的分析
由于逆转录病毒是通过逆转录过程合成的，因此基因组序列在该过程期间的不稳定性可产生各种类型的重组。因此，在使用实施例<1-3>中的spRRVe-yCD:env载体的基因组DNA的PCR反应后，回收p2和p3阶段重组条带(图4中红色方框所示的条带)的PCR产物，并克隆到pGEM-T载体中进行基因分析，并且纯化克隆，分析基因的核苷酸序列以分析重组类型。
结果，如图5所示，在回收的PCR产物中证实了其中在GaLV env、MCMV启动子、yCD和3'-LTR序列中发生重组的克隆。特别是，已经证实由于在起始于MCMV启动子的其它位点处的病毒载体核苷酸序列丢失，或者在图6所示的MCMV启动子中四个重复核苷酸序列(1.AACAGGAAA，2.GGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACA，3.TGGGTTTTTCC，4.GTACTTTCCCA)引起的启动子中的一些核苷酸序列丢失，发生重组。因此，通过切除MCMV启动子序列以使MCMV的重复序列最小化来预防重组并利于治疗基因的表达，设计了四种类型的具有不同大小的启动子。
<实施例2>具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的构建
<2-1>制备截短形式的MCMV启动子，用于构建具有最小化重组发生的载体
为了克服由MCMV启动子中的重复序列引起的复制型逆转录病毒载体的重组，通过去除MCMV启动子中的重复序列构建了经切割的MCMV启动子。
具体地，通过基于重复序列切割最初使用的约646bp的MCMV启动子，制备了4种类型的经切割的MCMV启动子(表2)。然后，将MCMV F1(470bp)、F2(337bp)、F3(237bp)和F4(160bp)引入该实验室中先前构建的sRRVe-TK和spRRVe-TK的646bp MCMV启动子位点中。使用含有下表3所述限制酶位点的扩增引物通过PCR获得了经切割的MCMV启动子。
【表2】
Figure BDA0004129582090000201
Figure BDA0004129582090000211
【表3】
Figure BDA0004129582090000212
Figure BDA0004129582090000221
<2-2>构建具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体(spRRVe(GaLV)-TK/sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD)
将用PmeI-BamHI消化的经切割的MCMV启动子克隆到spRRVe(GaLV)-TK的启动子位点中，以完成spRRVe-TK(SEQ.ID.NO:27)、spRRVe-F1-TK(SEQ.ID.NO:28)、spRRVe-F2-TK(SEQ.ID.NO:29)、spRRVe-F3-TK(SEQ.ID.NO:30)和spRRVe-F4-TK(SEQ.ID.NO:31)载体(图7)。然后，为了证实构建的分裂-双重RRV载体的有效性和是否发生重组，用由sEF1a启动子调节表达hopt-yCD的gag-pol载体的组合(sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD，SEQ.ID.NO:32)合成了病毒，然后感染U87MG细胞以确定是否发生重组。
<2-3>构建具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体(sRRVe(MuLV)-TK/sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD)
将用PmeI-NotI消化的经切割的MCMV启动子克隆到sRRVe(MuLV)-TK的启动子位点中，以完成sRRVe-TK(SEQ.ID.NO:33)、sRRVe-F1-TK(SEQ.ID.NO:34)、sRRVe-F2-TK(SEQ.ID.NO:35)、sRRVe-F3-TK(SEQ.ID.NO:36)和sRRVe-F4-TK(SEQ.ID.NO:37)载体(图8)。然后，为了证实构建的分裂-双重RRV载体的有效性和是否发生重组，用由sEF1a启动子调节表达hopt-yCD的gag-pol载体的组合(sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD)合成了病毒，然后感染U87MG细胞以确定是否发生重组。
<实施例3>具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体(spRRVe(GaLV)-TK/sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD)的重组类型的证实
以与实施例<1-3>相同的方式证实了实施例<2-2>中构建的载体的重组类型。
具体地，将构建的基于GaLV env的载体(spRRVe-TK、spRRVe-F1-TK、spRRVe-F2-TK、spRRVe-F3-TK和spRRVe-F4-TK)与sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD载体组合使用，以在293T细胞中合成病毒，然后以与实施例<1-3>相同的方式分析重组类型。表4所示的GaLV1932F和FGSacIR引物用于env载体特异性扩增，pol7130F和MFGSacIR引物用于gag-pol载体特异性扩增。
结果，如图9所示，作为基因组DNA PCR分析的结果，在所有5组sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD载体中没有发生重组。另一方面，在spRRVe-TK中从p1开始发生重组，在spRRVe-F1-TK和spRRVe-F2-TK中从p4开始发生重组，在spRRVe-F3-TK中从p5开始发生重组，在spRRVe-F4-TK中直到p10才发生重组。然而，除了p6至p10的PCR产物中的扩增条带之外，通过基因测序证实了下面的小条带，这表明gag-pol载体的完整hopt-yCD被相互重组并插入到env载体的TK位点中。
【表4】
引物 序列(5'→3') SEQ.ID.NO:
GaLV 1624F GACTCAGTCAGCAAGTTAGAG 1
GaLV 1932F GTTGCTCATCCTCGGGCCATG 14
Am1801F ATCATTGACCCTGGCCCTTC 15
pol7130F CGGCCCGGCACTCATTGGGAG 16
MuLV4194F AGCAAGCTATTGGCCACTG 17
MFGSacIR CAATCGGAGGACTGGCGCCCCGAGTGA 2
<实施例4>胸苷激酶(TK)和酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)蛋白在用含有具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体(spRRVe(GaLV)-TK/sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD)的病毒转染的细胞中的表达水平
然后，通过Western印迹证实了重组试验步骤中获得的U87MG细胞中胸苷激酶(HSV1-TK)和酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)的蛋白质表达水平。
具体地，如图2所示，人脑肿瘤细胞系U87MG用0.1MOI的逆转录病毒载体组合感染，三天后，取含病毒的细胞培养上清液，并依次感染新的脑肿瘤细胞系U87MG。在初次感染3天后，收获p1(第1代)～p10细胞，并重悬于100μl的T-PER组织提取剂(PIERCE，78510)+1x蛋白酶抑制剂中。然后，通过三次冻融破碎细胞，并通过以13,000rpm离心10分钟回收胞质上清液。使用BCA进行蛋白质定量后，取20μg细胞裂解物，与SDS样品加载染料混合至1％。在100℃加热块中反应5分钟后，将反应混合物移至冰上并反应2分钟。然后，将反应物上样到10％(TK)或13.5％(yCD)SDS-PAGE凝胶上，随后电泳。电泳结束后，在90V下将蛋白质转移到NC(硝化纤维)膜上2小时，然后放入封闭液(5％脱脂乳的1×TBS-T溶液)中，室温下反应1小时。然后，将膜加入到含有第一抗体(抗-兔-TK：Santa Cruze sc-28038，1:500稀释液，抗-绵羊yCD：Thermo Fisher Scientific PA1-85365，1:500，抗-小鼠b-肌动蛋白：SigmaA2228，1:1000)的1％脱脂乳/1X TBS-T中，然后在4℃冰箱中反应过夜。然后，在室温下用1×TBS-T将膜洗涤4次10分钟，然后在室温下与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗体反应1小时。之后，在室温下用1×TBS-T将膜洗涤4次10分钟，在ECL(增强化学发光，Bio-rad CatNo.170-5062)溶液中反应，之后在化学发光成像系统(ChemiDoc,Biorad CA)上进行分析。
结果，如图10和11所示，与基因组DNA PCR的结果一致，证实了随着启动子大小的降低，胸苷激酶(TK)蛋白的表达持续稳定，并且gag-pol载体(sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD)中的酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)蛋白也持续表达。
<实施例5>给予胸苷激酶和酵母胞嘧啶脱氨酶的前药后细胞死亡的证实
证实了实施例<2-2>中生产的spRRVe(GaLV)-TK/sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD病毒对更昔洛韦(GCV)和5-氟胞嘧啶(5-FC)的药物敏感性。
具体地，使用PLUS试剂(Invitrogen)和lipofectamine(Invitrogen)将spRRVe-TK/sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD病毒共转染到293T细胞系中。2天后，回收病毒上清液，并将前一天在6孔板中以1.5×105个细胞/孔的密度传代的U-87MG细胞用病毒和8μg/ml浓度的polybran感染8小时。感染后五天(感染后5d)，取细胞上清液并再次感染前一天在6孔板中以1.5×105个细胞/孔的密度传代的U-87MG细胞(p1)，然后以相同方式依次感染直至p4。用胰蛋白酶-EDTA处理各个感染阶段的细胞以制备单细胞，并以1.5×105个细胞/孔的密度在12孔板中传代，从传代后的第二天，分别处理30μg/ml的GCV和1mM 5-FC 5天或8天，以证实细胞死亡。
结果，如图12所示，证实了当用30μg/ml更昔洛韦(GCV)和1mM 5-氟胞嘧啶(5-FC)(前药)处理病毒感染的细胞时，细胞被杀死。
<实施例6>含有经切割的MCMV启动子的基于MuLV env的载体的重组类型的证实
在spRVe-sEF1a-TK/sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD组合的重组发生分析试验中，证实了在gag-pol载体中没有很好地发生重组，但证实了gag-pol载体的完整hopt-yCD被相互重组并插入到env载体的TK位点中。这是当gag-pol载体和env载体中使用的启动子相同时由启动子之间的同源重组引起的现象，并且不影响治疗基因的表达。另一方面，在sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD/spRRVe-F4-TK组合的情况下，启动子之间发生非同源重组，这影响有效治疗基因的表达。为了使这种重组的发生最小化，通过将F4启动子引入sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD的sEF1a位点中构建了sRRVgp-F4-hopt-yCD，然后以与实施例<1-3>中相同的方式证实了sRRVgp-F4-hopt-yCD/sRRV3 sRRVe-F4-TK载体的重组类型。
具体地，用EcoRI处理sRRVgp-sEF1a-TK载体以产生sEF1a-TK，使用spRVe-TK作为模板，用下表5所示的MCMV(F4)-EcoRI-F和MCMV-NotI-MluI-EcoRI-R引物进行PCR以克隆MCMVF4，所述引物含有用于克隆其它治疗基因的限制酶识别序列。然后，用EcoRI消化sRRVgp-sEF1a-TK和MCMV F4 PCR产物，并克隆以构建sRRVgp-MCMV F4载体。之后，使用hopt-yCD构建表5所示的hopet-yCD-NotI-F和hopet-yCD-NotI-R引物，并使用sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD载体作为模板进行PCR。
【表5】
Figure BDA0004129582090000251
然后，通过用NotI-MluI处理回收sRRVgp-MCMV F4载体和hopt-yCD PCR产物，并克隆以完成sRRVgp-F4-hopt-yCD载体。将构建的基于MuLV env的sRRVe-F4-TK载体与sRRVgp-F4-hopt-yCD载体组合使用以在293T细胞中合成病毒，然后以与实施例<1-3>中相同的方式进行重组类型分析试验。表4中所示的Am1801F和MFGSacIR引物用于env载体特异性扩增，pol7130F和MFGSacIR引物用于gag-pol载体特异性扩增。
结果，如图13所示，基因组DNA PCR分析的结果是，在所有5组gag-pol载体中没有发生重组。另一方面，在sRRVe-TK载体中，证实了从p2开始发生其中小尺寸丢失的重组。还证实了在sRRVe-F1-TK和sRRVe-F2-TK中从p7开始发生重组，而在sRRVe-F3-TK中从p8开始发生重组。另一方面，在sRRVe-F4-TK/sRRVgp-F4-hopt-yCD载体组合中，在sRRVe-F4-TK中直至p10才发生重组，并且甚至在直至p15的连续感染后也没有发生重组(图14)。
即，在基于MuLV env的RRV载体中，重组频率随着MCMV启动子大小的降低而降低，并且在其中去除了MCMV启动子的大部分重复序列的sRRVe-F4-TK载体中没有发生重组。因此，证实了含有经切割的MCMV启动子的复制型逆转录病毒载体不发生重组，因此治疗基因可以无丢失地被递送至靶细胞。
<实施例7>胸苷激酶(TK)在用含有具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体(sRRVe(MuLV)-TK/sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD)的病毒转染的细胞中的表达水平
然后，在与上述实施例4中所述相同的方法和条件下，通过Western印迹证实了在sRRVe-F4-TK之后在重组试验步骤中获得的U87MG细胞中TK蛋白表达水平。证实了因为在gag-pol载体中没有发生重组，所以yCD蛋白稳定表达，因此仅证实了TK蛋白的表达水平。
结果，如图15所示，与基因组DNA PCR的结果一致，证实了随着启动子大小降低，胸苷激酶(TK)蛋白的表达持续稳定。
<实施例8>给予胸苷激酶(TK)和酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)的前药后细胞死亡的证实
证实了含有实施例6中生产的sRRVe(MuLV)-TK/sRRVgp-F4-hopt-yCD载体的病毒对更昔洛韦(GCV)和5-氟胞嘧啶(5-FC)的药物敏感性。
具体地，使用PLUS试剂(Invitrogen)和lipofectamine(Invitrogen)将含有spRRVe-F4-hopt-yCD/sRRVgp-TK、spRRVe-F4-hopt-yCD/sRRVgp-F1-TK、spRRVe-F4-hopt-yCD/sRRVgp-F2-TK、spRRVe-F4-hopt-yCD/sRRVgp-F3-TK和spRRVe-F4-hopt-yCD/sRRVgp-F4-TK的病毒共转染到293T细胞系中。2天后，回收病毒上清液，并将前一天在6孔板中以1.5×105个细胞/孔的密度传代的U-87MG细胞用病毒和8μg/ml浓度的polybran感染8小时。感染后五天(感染后5d)，取细胞上清液并再次感染前一天在6孔板中以1.5×105个细胞/孔的密度传代的U-87MG细胞(p1)，然后以相同方式依次感染直至p4。用胰蛋白酶-EDTA处理各个感染阶段的细胞以制备单细胞，并以1.5×105个细胞/孔的密度在12孔板中传代，从传代后的第二天，分别处理30μg/ml的GCV和1mM 5-FC 5天或8天，以证实细胞死亡。
结果，如图16所示，在光学显微镜下证实了用30μg/ml的(GCV)和1mM5-氟胞嘧啶(5-FC)前药处理病毒感染的细胞时，细胞被杀死。用2E7基因组拷贝的sRRVe-F4-TK/sRRVgp-F4-hopt-yCD病毒感染U87MG 7天后，处理30μg/mlGCV和1mM 5-FC以定量评估细胞死亡。结果，当处理GCV时，直至感染后4天细胞生存力降低约80％，并且感染后10天仅约10％的细胞存活，表明GCV杀死超过90％的细胞。当处理5-FC时，感染后2天细胞生存力降低约40％，感染后8天仅约40％的细胞存活，表明5-FC杀死了超过60％的细胞(图17)。
<实施例9>其中引入了人CD19癌抗原基因的具有最小化重组发生的自复制型逆转录病毒载体的构建
<9-1>构建sRRVgp-F4-hCD19/sRRVe-F4-TK载体并证实重组的发生
最近，对治疗癌症的免疫治疗药物已进行了许多研究，并且事实上已开发了免疫治疗方法并正将其应用于临床，所述免疫治疗方法将靶向在癌细胞中特异性表达的抗原的受体诸如CAR-T负载到病毒载体上并进行递送。这些免疫治疗方法可以通过利用体内免疫细胞的特性来尽可能减少副作用，并可增强免疫应答，使得患者的身体对抗癌细胞。其中，主动免疫疗法是通过将癌细胞具有的肿瘤特异性抗原给予癌症患者来主动激活免疫系统，从而攻击癌细胞。因此，将人CD19基因引入自复制型逆转录病毒载体中，以用作具有最小化重组的癌症基因疗法载体。
具体地，为了将hCD19变体2克隆到sRRVgp-F4-hopt-yCD的hopt-yCD位点中，合成了含有限制酶位点的NotI-hCD19-MluI基因。然后，hCD19和sRRVgp-F4-hopt-yCD分别用NotI和MluI消化并回收，然后克隆以构建sRRVgp-F4-hCD19载体(SEQ.ID.NO:44)。如图18所示，用sRRVe-F4-TK(SEQ.ID.NO:37)和sRRVgp-F4-hCD19的组合合成乐病毒，并定量乐病毒载体的滴度。用0.1MOI的病毒感染脑肿瘤细胞系U87-MG后，将细胞传代13次，并在每个传代步骤从感染的细胞系纯化基因组DNA。然后，使用表6所示的引物对基因组DNA进行PCR，以分析重组类型。
结果，如图19所示，证实了重组PCR条带是从其中引入了hCD19的载体的p3扩增的。
【表6】
引物 序列(5'→3') SEQ.ID.NO:
AmEnv961F ACAAGACCCAAGAATGTTGGCT 42
Am 1801F ATCATTGACCCTGGCCCTTC 15
pol 7130F CGGCCCGGCACTCATTGGGAG 16
MFGSacIR CAATCGGAGGACTGGCGCCCCGAGTGA 2
<9-2>构建sRRVgp-F4-hopt-yCD/sRRVe-F4-hCD19载体并证实重组的发生
如实施例<9-1>所示，证实了在sRRVgp-F4-hCD19/sRRVe-F4-TK载体组合中，在病毒复制期间其中插入了hCD19的sRRVgp-F4-hCD19载体中发生了重组。因此，选择证实了在病毒复制期间没有发生重组的sRRVgp-F4-hopt-yCD gag-pol载体，并构建了其中sRRVe-F4-TK载体的TK基因被hCD19取代的sRRVe-F4-hCD19载体。
具体地，为了使用hCD19变体2将hCD19克隆到sRRVe-F4-TK的TK位点中，合成了含有限制酶位点的NotI-hCD19-MluI基因。然后，hCD19和sRRVgp-F4-TK用NotI和MluI消化并回收，然后克隆以构建sRRVe-F4-hCD19载体(SEQ.ID.NO:45)。如图20所示，用sRRVe-F4-hCD19(SEQ.ID.NO:45)和sRRVgp-F4-hopt-yCD(SEQ.ID.NO:46)的组合合成了病毒，并定量病毒载体的滴度。使用表6所示的引物，取0.1MOI的病毒进行重组类型分析实验。
如图21所示，使用能够证实env载体的复制和基因组稳定性的引物进行PCR。结果，AmEnv961F/MFGSacIR扩增产物的大小为3,460bp，AmEnv1801F/MFGSacIR扩增产物的大小为3,030bp。此外，使用能够证实gag-pol载体的复制和基因组稳定性的pol7130R/MFGSacIR引物的扩增产物的大小为2,092bp。因此，证实了在其中引入了hCD19的sRRVe-F4-hCD19载体和sRRVgp-F4-hopt-yCD载体的组合中，在病毒复制期间没有发生重组。
<实施例10>其中引入了人CD19t(经截短的人CD19，hCD19t)癌抗原基因的具有最小化重组发生的自复制型逆转录病毒载体的构建
<10-1>构建sRRVgp-F4-hCD19t载体并证实重组的发生
除了CD19 N-末端/CAR-T机制外，为了抑制可能通过CD19的C-末端发生的细胞内信号传导，去除了胞质结构域的233个氨基酸，并将由323个氨基酸组成的经截短的CD19(CD19t)引入自复制型逆转录病毒载体中，以将其用作具有最小化重组的癌基因治疗载体。CD19t由胞外N-末端、跨膜结构域和仅具有19个氨基酸的胞质C-末端组成。
如下构建了sRRVgp-F4-hCD19t载体。为了确保hCD19t，使用hCD19变体2作为模板，用下表7所示的引物扩增了hCD19t。
【表7】
引物 序列(5'→3') SEQ.ID.NO:
hCD19t-NotI-F cggcggccgcATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTC 51
hCD19t-MluI-R caacgcgtTCATCTTTTCCTCCTCAGGACCAGG 52
为了促进克隆，通过在5'侧插入NotI和在3'侧插入MluI来制备引物。然后，为了将hCD19t克隆到sRRVgp-F4-hopt-yCD载体的hopt-yCD位点中，用NotI-MluI消化载体，并用NotI-MluI消化扩增的hCD19t并回收，然后将其引入载体中以构建sRRVgp-F4-hCD19t载体(SEQ.ID.NO:54)(图22)。然后，用sRRVe-F4-TK(SEQ.ID.NO:37)和sRRVgp-F4-hCD19t的组合合成了病毒，并定量病毒载体的滴度。使用表6所示的引物，取0.1MOI的病毒进行重组类型分析实验。结果，如图23所示，证实了通过AmEnv961F/MFGSacIR引物的sRRVe-F4-TK载体的2,946bp的扩增产物和通过pol7130R/MFGSacIR引物的sRRVgp-F4-hCD19t载体的2,591bp的扩增产物在病毒复制和再感染期间被连续扩增，直至第12代。这些结果表明，病毒复制和再感染持续到第12代。上述结果表明，其中引入了TK的sRRVe-F4-TK载体以及其中引入了hCD19t的sRRVe-F4-hCD19t载体在病毒复制期间均显示出极好的基因组稳定性。
<10-2>构建sRRVe-F4-hCD19t载体并证实重组的发生
如下构建sRRVe-F4-hCD19t载体。为了确保hCD19t，使用hCD19变体2作为模板，用下表8所示的引物扩增hCD19t。
【表8】
引物 序列(5'→3') SEQ.ID.NO:
hCD19t-NotI-F cggcggccgcATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTC 51
hCD19t-SalI-R tggtcgacTCATCTTTTCCTCCTCAGGACCAGG 55
为了促进克隆，通过在5'侧插入NotI和在3'侧插入SalI来制备引物。然后，为了将hCD19t克隆到sRRVe-F4-hCD19载体的hCD19位点中，用NotI-SalI消化载体，并用NotI-SalI消化扩增的hCD19t并回收，然后将其引入载体中以构建sRRVe-F4-hCD19t载体(SEQ.ID.NO:56)(图24)。然后，用sRRVgp-F4-hopt-yCD(SEQ.ID.NO:46)和sRRVe-F4-hCD19t的组合合成了病毒，并定量病毒载体的滴度。使用表6所示的引物，取0.1MOI的病毒进行重组类型分析实验。结果，如图25所示，证实了通过AmEnv961F/MFGSacIR引物的sRRVe-F4-hCD19t载体的2,760bp的扩增产物和通过pol7130R/MFGSacIR引物的sRRVgp-F4-hopt-yCD载体的2,089bp的扩增产物被连续扩增，直至第12代。这些结果表明，病毒复制和再感染持续到第12代。上述结果表明，其中引入了hopt-yCD的sRRVgp-F4-hopt-yCD载体以及其中引入了hCD19t的sRRVe-F4-hCD19t载体在病毒复制期间均显示出极好的基因组稳定性。
<实施例11>其中引入了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的具有最小化重组发生的自复制型逆转录病毒载体的构建
<11-1>构建sRRVgp-F4-mGM-CSF载体和证实重组的发生
当将负载有治疗基因和经截短的hCD19的自复制型逆转录病毒载体应用于癌症患者时，如下将小鼠GM-CSF和人GM-CSF引入自复制型逆转录病毒载体中以促进患者的免疫增强。
首先，构建了sRRVgp-F4-mGM-CSF载体。为了确保小鼠GM-CSF(mGM-CSF)，使用构建的spRRVe-mGM-CSF(SEQ.ID.NO:57)作为模板，用下表9所示的引物扩增mGM-CSF。
【表9】
引物 序列(5'→3') SEQ.ID.NO:
mGM-CSF-F-NotI cggcggccgcAGGATGTGGCTGCAGAATTT 58
mGM-CSF-R-MluI tggtcgacTCATTTTTGGACTGGTTTTT 59
此时，为了促进克隆，通过在5'侧插入NotI和在3'侧插入MluI来制备引物。然后，为了将mGM-CSF克隆到sRRVe-F4-hopt-yCD载体的hopt-yCD位点中，用NotI-MluI消化载体，并用NotI-MluI消化扩增的mGM-CSF并回收，然后将其引入载体中以构建sRRVgp-F4-mGM-CSF载体(SEQ.ID.NO:60)(图26)。然后，用sRRVgp-F4-mGM-CSF和sRRVe-F4-hCD19t(SEQ.ID.NO:56)的组合合成了病毒，并定量病毒载体的滴度。使用表6所示的引物，取0.1MOI的病毒进行重组类型分析实验。结果，如图27所示，证实了通过AmEnv961F/MFGSacIR引物的sRRVe-F4-hCD19t载体的2,760bp的扩增产物和通过pol7130R/MFGSacIR引物的sRRVgp-F4-mGM-CSF载体的2,041bp的扩增产物在病毒复制和再感染期间被连续扩增，直至第12代。上述结果表明，其中引入了hCD19t的sRRVe-F4-hCD19t载体以及其中引入了mGM-CSF的sRRVgp-F4-mGM-CSF载体在病毒复制期间均显示出极好的基因组稳定性。
<11-2>构建sRRVgp-F4-hGM-CSF载体和证实重组的发生
如下构建了sRRVgp-F4-hGM-CSF载体。为了确保hGM-CSF，使用构建的spRRVe-hGM-CSF(SEQ.ID.NO:61)作为模板，用下表10所示的引物扩增hGM-CSF。
【表10】
引物 序列(5'→3') SEQ.ID.NO:
hGM-CSF-F-NotI cggcggccgcAGGATGTGGCTGCAGAGC 62
hGM-CSF-R-MluI tggtcgacTCACTCCTGGACTGGCTCCC 63
为了促进克隆，通过在5'侧插入NotI和在3'侧插入MluI来制备引物。然后，为了将hGM-CSF克隆到sRRVe-F4-hopt-yCD载体的hopt-yCD位点中，用NotI-MluI消化载体，并用NotI-MluI消化扩增的hGM-CSF并回收，然后将其引入载体中以构建sRRVgp-F4-hGM-CSF载体(SEQ.ID.NO:64)(图28)。然后，用sRRVgp-F4-hGM-CSF和sRRVe-F4-hCD19t(SEQ.ID.NO:56)的组合合成了病毒，并定量病毒载体的滴度。使用表6所示的引物，取0.1MOI的病毒进行重组类型分析实验。结果，如图29所示，通过AmEnv961F/MFGSacIR引物的sRRVe-F4-hCD19载体的3,460bp的扩增产物被连续扩增直至第6代，但通过pol7130R/MFGSacIR引物的sRRVgp-F4-hGM-CSF的扩增产物被观察到从初次感染至第6代的两种类型的扩增产物。因此，证实了从初次感染，复制由于基因组结构不稳定性而不完全发生。
<11-3>确保hGM-CSF的人密码子优化的核苷酸序列
为了解决实施例<11-2>中由于重组突变而复制不完全发生的问题，将hGM-CSF核苷酸序列转化为人密码子优化的核苷酸序列。
通过请求Cosmogentech Co.,Ltd.,Korea，进行确保和合成人密码子核苷酸序列。此时，为了促进克隆到自复制型逆转录病毒载体中，通过在5'侧插入NotI和在3'侧插入MluI合成了序列(SEQ.ID.NO:65)。
<11-4>构建sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体和证实重组的发生
通过将实施例<11-3>中合成的hopt-GM-CSF克隆到用NotI和MluI消化的sRRVe-F4-hopt-yCD载体的hopt-yCD位点中，构建了sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体(SEQ.ID.NO:66)(图30)。此后，用sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF和sRRVe-F4-hCD19(SEQ.ID.NO:45)(图30)或sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF和sRRVe-F4-hCD19t(SEQ.ID.NO:56)(图31)的组合合成了病毒，并定量病毒载体的滴度。采用表6所示的引物，取0.1MOI的病毒进行重组类型分析实验。
结果，如图32所示，证实了通过AmEnv961F/MFGSacIR引物的sRRVe-F4-hCD19载体的3,460bp的扩增产物和通过pol7130R/MFGSacIR引物的sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体的2,047bp的扩增产物在病毒复制和再感染期间被连续扩增，直至第12代。上述结果表明，其中引入了hCD19的sRRVe-F4-hCD19载体以及其中引入了hopt-GM-CSF的sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体在病毒复制期间均显示出极好的基因组稳定性。
此外，如图33所示，证实了通过AmEnv961F/MFGSacIR引物的sRRVe-F4-hCD19t载体的2,760bp的扩增产物和通过pol7130R/MFGSacIR引物的sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体的2,047bp的扩增产物在病毒复制和再感染期间被连续扩增，直至第12代。上述结果表明，其中引入了hCD19t的sRRVe-F4-hCD19t载体以及其中引入了hopt-GM-CSF的sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体在病毒复制期间均显示出极好的基因组稳定性。
<110> 阿迪雷尔股份公司
<120> 具有最小化重组发生的基因疗法载体、包含载体的重组逆转录病毒和用于
预防或治疗癌症的包含重组逆转录病毒的药物组合物
<130> LC23310004P
<150> KR 10-2020-0120797
<151> 2020-09-18
<160> 66
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GaLV 1624F
<400> 1
gactcagtca gcaagttaga g 21
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MFGSacIR
<400> 2
caatcggagg actggcgccc cgagtga 27
<210> 3
<211> 646
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV启动子
<400> 3
aacaggaaag ttccattgga gccaagtaca ttgagtcaat agggactttc caatgggttt 60
tgcccagtac ataaggtcaa tgggaggtaa gccaatgggt ttttcccatt actggcacgt 120
atactgagtc attagggact ttccaatggg ttttgcccag tacataaggt caataggggt 180
gaatcaacag gaaagtccca ttggagccaa gtacactgag tcaataggga ctttccattg 240
ggttttgccc agtacaaaag gtcaataggg ggtgagtcaa tgggtttttc ccattattgg 300
cacgtacata aggtcaatag gggtgagtca ttgggttttt ccagccaatt taattaaaac 360
gccatgtact ttcccaccat tgacgtcaat gggctattga aactaatgca acgtgacctt 420
taaacggtac tttcccatag ctgattaatg ggaaagtacc gttctcgagc caatacacgt 480
caatgggaag tgaaagggca gccaaaacgt aacaccgccc cggttttccc tggaaattcc 540
atattggcac gcattctatt ggctgagctg cgttcacgtg ggtataagag gcgcgaccag 600
cgtcggtacc gtcgcagtct tcggtctgac caccgtagaa cgcaga 646
<210> 4
<211> 470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV F1启动子
<400> 4
gggtgaatca acaggaaagt cccattggag ccaagtacac tgagtcaata gggactttcc 60
attgggtttt gcccagtaca aaaggtcaat agggggtgag tcaatgggtt tttcccatta 120
ttggcacgta cataaggtca ataggggtga gtcattgggt ttttccagcc aatttaatta 180
aaacgccatg tactttccca ccattgacgt caatgggcta ttgaaactaa tgcaacgtga 240
cctttaaacg gtactttccc atagctgatt aatgggaaag taccgttctc gagccaatac 300
acgtcaatgg gaagtgaaag ggcagccaaa acgtaacacc gccccggttt tccctggaaa 360
ttccatattg gcacgcattc tattggctga gctgcgttca cgtgggtata agaggcgcga 420
ccagcgtcgg taccgtcgca gtcttcggtc tgaccaccgt agaacgcaga 470
<210> 5
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV F2启动子
<400> 5
aaggtcaata ggggtgagtc attgggtttt tccagccaat ttaattaaaa cgccatgtac 60
tttcccacca ttgacgtcaa tgggctattg aaactaatgc aacgtgacct ttaaacggta 120
ctttcccata gctgattaat gggaaagtac cgttctcgag ccaatacacg tcaatgggaa 180
gtgaaagggc agccaaaacg taacaccgcc ccggttttcc ctggaaattc catattggca 240
cgcattctat tggctgagct gcgttcacgt gggtataaga ggcgcgacca gcgtcggtac 300
cgtcgcagtc ttcggtctga ccaccgtaga acgcaga 337
<210> 6
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV F3启动子
<400> 6
aacgtgacct ttaaacggta ctttcccata gctgattaat gggaaagtac cgttctcgag 60
ccaatacacg tcaatgggaa gtgaaagggc agccaaaacg taacaccgcc ccggttttcc 120
ctggaaattc catattggca cgcattctat tggctgagct gcgttcacgt gggtataaga 180
ggcgcgacca gcgtcggtac cgtcgcagtc ttcggtctga ccaccgtaga acgcaga 237
<210> 7
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV F4启动子
<400> 7
ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt ttccctggaa attccatatt 60
ggcacgcatt ctattggctg agctgcgttc acgtgggtat aagaggcgcg accagcgtcg 120
gtaccgtcgc agtcttcggt ctgaccaccg tagaacgcag a 161
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV F1-PmeI
<400> 8
cggtttaaac gggtgaatca acaggaaagt ccc 33
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV F2-PmeI
<400> 9
cggtttaaac aaggtcaata ggggtgagtc at 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV F3-PmeI
<400> 10
cggtttaaac aacgtgacct ttaaacggta ct 32
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV F4-PmeI
<400> 11
cggtttaaac ggaagtgaaa gggcagccaa a 31
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV-R-NotI
<400> 12
cggcggccgc tctgcgttct acggtggtca gacc 34
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV R-BamHI
<400> 13
cgggatcctc tgcgttctac ggtggtcaga cc 32
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GaLV 1932F
<400> 14
gttgctcatc ctcgggccat g 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Am1801F
<400> 15
atcattgacc ctggcccttc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pol7130F
<400> 16
cggcccggca ctcattggga g 21
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MuLV4194F
<400> 17
agcaagctat tggccactg 19
<210> 18
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sEF1alpha启动子
<400> 18
gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgat 60
ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120
gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180
tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac ag 212
<210> 19
<211> 2058
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GaLV env
<400> 19
atggtattgc tgcctgggtc catgcttctc acctcaaacc tgcaccacct tcggcaccag 60
atgagtcctg ggagctggaa aagactgatc atcctcttaa gctgcgtatt cggcggcggc 120
gggacgagtc tgcaaaataa gaacccccac cagcccatga ccctcacttg gcaggtactg 180
tcccaaactg gagacgttgt ctgggataca aaggcagtcc agcccccttg gacttggtgg 240
cccacactta aacctgatgt atgtgccttg gcggctagtc ttgagtcctg ggatatcccg 300
ggaaccgatg tctcgtcctc taaacgagtc agacctccgg actcagacta tactgccgct 360
tataagcaaa tcacctgggg agccataggg tgcagctacc ctcgggctag gactagaatg 420
gcaagctcta ccttctacgt atgtccccgg gatggccgga ccctttcaga agctagaagg 480
tgcggggggc tagaatccct atactgtaaa gaatgggatt gtgagaccac ggggaccggt 540
tattggctat ctaaatcctc aaaagacctc ataactgtaa aatgggacca aaatagcgaa 600
tggactcaaa aatttcaaca gtgtcaccag accggctggt gtaaccccct taaaatagat 660
ttcacagaca aaggaaaatt atccaaggac tggataacgg gaaaaacctg gggattaaga 720
ttctatgtgt ctggacatcc aggcgtacag ttcaccattc gcttaaaaat caccaacatg 780
ccagctgtgg cagtaggtcc tgacctcgtc cttgtggaac aaggacctcc tagaacgtcc 840
ctcgctctcc cacctcctct tcccccaagg gaagcgccac cgccatctct ccccgactct 900
aactccacag ccctggcgac tagtgcacaa actcccacgg tgagaaaaac aattgttacc 960
ctaaacactc cgcctcccac cacaggcgac agactttttg atcttgtgca gggggccttc 1020
ctaaccttaa atgctaccaa cccaggggcc actgagtctt gctggctttg tttggccatg 1080
ggcccccctt attatgaagc aatagcctca tcaggagagg tcgcctactc caccgacctt 1140
gaccggtgcc gctgggggac ccaaggaaag ctcaccctca ctgaggtctc aggacacggg 1200
ttgtgcatag gaaaggtgcc ctttacccat cagcatctct gcaatcagac cctatccatc 1260
aattcctccg gagaccatca gtatctgctc ccctccaacc atagctggtg ggcttgcagc 1320
actggcctca ccccttgcct ctccacctca gtttttaatc agactagaga tttctgtatc 1380
caggtccagc tgattcctcg catctattac tatcctgaag aagttttgtt acaggcctat 1440
gacaattctc accccaggac taaaagagag gctgtctcac ttaccctagc tgttttactg 1500
gggttgggaa tcacggcggg aataggtact ggttcaactg ccttaattaa aggacctata 1560
gacctccagc aaggcctgac aagcctccag atcgccatag atgctgacct ccgggccctc 1620
caagactcag tcagcaagtt agaggactca ctgacttccc tgtccgaggt agtgctccaa 1680
aataggagag gccttgactt gctgtttcta aaagaaggtg gcctctgtgc ggccctaaag 1740
gaagagtgct gtttttacat agaccactca ggtgcagtac gggactccat gaaaaaactc 1800
aaagaaaaac tggataaaag acagttagag cgccagaaaa gccaaaactg gtatgaagga 1860
tggttcaata actccccttg gttcactacc ctgctatcaa ccatcgctgg gcccctatta 1920
ctcctccttc tgttgctcat cctcgggcca tgcatcatca ataagttagt tcaattcatc 1980
aatgatagga taagtgcagt taaaattctg gtccttagac aaaaatatca ggccctagag 2040
aacgaaggta acctttaa 2058
<210> 20
<211> 1965
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MuLV env
<400> 20
atggcgcgtt caacgctctc aaaaccccct caagataaga ttaacccgtg gaagccctta 60
atagtcatgg gagtcctgtt aggagtaggg atggcagaga gcccccatca ggtctttaat 120
gtaacctgga gagtcaccaa cctgatgact gggcgtaccg ccaatgccac ctccctcctg 180
ggaactgtac aagatgcctt cccaaaatta tattttgatc tatgtgatct ggtcggagag 240
gagtgggacc cttcagacca ggaaccgtat gtcgggtatg gctgcaagta ccccgcaggg 300
agacagcgga cccggacttt tgacttttac gtgtgccctg ggcataccgt aaagtcgggg 360
tgtgggggac caggagaggg ctactgtggt aaatgggggt gtgaaaccac cggacaggct 420
tactggaagc ccacatcatc gtgggaccta atctccctta agcgcggtaa caccccctgg 480
gacacgggat gctctaaagt tgcctgtggc ccctgctacg acctctccaa agtatccaat 540
tccttccaag gggctactcg agggggcaga tgcaaccctc tagtcctaga attcactgat 600
gcaggaaaaa aggctaactg ggacgggccc aaatcgtggg gactgagact gtaccggaca 660
ggaacagatc ctattaccat gttctccctg acccggcagg tccttaatgt gggaccccga 720
gtccccatag ggcccaaccc agtattaccc gaccaaagac tcccttcctc accaatagag 780
attgtaccgg ctccacagcc acctagcccc ctcaatacca gttacccccc ttccactacc 840
agtacaccct caacctcccc tacaagtcca agtgtcccac agccaccccc aggaactgga 900
gatagactac tagctctagt caaaggagcc tatcaggcgc ttaacctcac caatcccgac 960
aagacccaag aatgttggct gtgcttagtg tcgggacctc cttattacga aggagtagcg 1020
gtcgtgggca cttataccaa tcattccacc gctccggcca actgtacggc cacttcccaa 1080
cataagctta ccctatctga agtgacagga cagggcctat gcatgggggc agtacctaaa 1140
actcaccagg ccttatgtaa caccacccaa agcgccggct caggatccta ctaccttgca 1200
gcacccgccg gaacaatgtg ggcttgcagc actggattga ctccctgctt gtccaccacg 1260
gtgctcaatc taaccacaga ttattgtgta ttagttgaac tctggcccag agtaatttac 1320
cactcccccg attatatgta tggtcagctt gaacagcgta ccaaatataa aagagagcca 1380
gtatcattga ccctggccct tctactagga ggattaacca tgggagggat tgcagctgga 1440
atagggacgg ggaccactgc cttaattaaa acccagcagt ttgagcagct tcatgccgct 1500
atccagacag acctcaacga agtcgaaaag tcaattacca acctagaaaa gtcactgacc 1560
tcgttgtctg aagtagtcct acagaaccgc agaggcctag atttgctatt cctaaaggag 1620
ggaggtctct gcgcagccct aaaagaagaa tgttgttttt atgcagacca cacggggcta 1680
gtgagagaca gcatggccaa attaagagaa aggcttaatc agagacaaaa actatttgag 1740
acaggccaag gatggttcga agggctgttt aatagatccc cctggtttac caccttaatc 1800
tccaccatca tgggacctct aatagtactc ttactgatct tactctttgg accttgcatt 1860
ctcaatcgat tagtccaatt tgttaaagac aggatatcag tggtccaggc tctagttttg 1920
actcaacaat atcaccagct gaagcctata gagtacgagc catag 1965
<210> 21
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胸苷激酶编码序列
<400> 21
atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540
agcatgacct cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720
ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780
cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840
cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900
aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cataccgacg 1080
atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg a 1131
<210> 22
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人密码子优化的酵母胞嘧啶脱氨酶编码序列
<400> 22
atggttactg ggggaatggc atctaagtgg gatcagaaag gtatggacat cgcttatgaa 60
gaggctgctc tcggctacaa agagggtgga gtgcctatcg gagggtgcct gatcaacaac 120
aaggacggca gtgtgctggg gaggggccac aatatgaggt tccaaaaagg ctccgccact 180
ctccacgggg aaattagtac cctcgagaat tgcggacgat tggaagggaa ggtgtacaag 240
gatacaacac tgtacaccac cctgtcaccc tgtgatatgt gcacaggcgc cattatcatg 300
tacggaatcc ctagatgtgt cgtgggggag aatgtaaact tcaaaagtaa gggggagaaa 360
tatctccaga cccgggggca cgaagtcgtc gttgtggacg atgaacggtg taagaagatc 420
atgaagcagt ttatcgatga gaggccccag gactggttcg aagacatcgg ggaataa 477
<210> 23
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MuLV gag
<400> 23
atgggccaga ctgttaccac tcccttaagt ttgaccttag gtcactggaa agatgtcgag 60
cggatcgctc acaaccagtc ggtagatgtc aagaagagac gttgggttac cttctgctct 120
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ccctacatcg tgacctggga agccttggct tttgaccccc ctccctgggt caagcccttt 300
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ctccaaaacg cgggcagaag ccccaccaat ttggccaagg taaaaggaat aacacaaggg 1080
cccaatgagt ctccctcggc cttcctagag agacttaagg aagcctatcg caggtacact 1140
ccttatgacc ctgaggaccc agggcaagaa actaatgtgt ctatgtcttt catttggcag 1200
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cagaaagaga aagaaagaga tcgtaggaga catagagaga tgagcaagct attggccact 1440
gtcgttagtg gacagaaaca ggatagacag ggaggagaac gaaggaggtc ccaactcgat 1500
cgcgaccagt gtgcctactg caaagaaaag gggcactggg ctaaagattg tcccaagaaa 1560
ccacgaggac ctcggggacc aagaccccag acctccctcc tgaccctaga tgactag 1617
<210> 24
<211> 3635
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MuLV pol
<400> 24
ggaggtcagg gtcaggagcc cccccctgaa cccaggataa ccctcaaagt cggggggcaa 60
cccgtcacct tcctggtaga tactggggcc caacactccg tgctgaccca aaatcctgga 120
cccctaagtg ataagtctgc ctgggtccaa ggggctactg gaggaaagcg gtatcgctgg 180
accacggatc gcaaagtaca tctagctacc ggtaaggtca cccactcttt cctccatgta 240
ccagactgtc cctatcctct gttaggaaga gatttgctga ctaaactaaa agcccaaatc 300
cactttgagg gatcaggagc tcaggttatg ggaccaatgg ggcagcccct gcaagtgttg 360
accctaaata tagaagatga gcatcggcta catgagacct caaaagagcc agatgtttct 420
ctagggtcca catggctgtc tgattttcct caggcctggg cggaaaccgg gggcatggga 480
ctggcagttc gccaagctcc tctgatcata cctctgaaag caacctctac ccccgtgtcc 540
ataaaacaat accccatgtc acaagaagcc agactgggga tcaagcccca catacagaga 600
ctgttggacc agggaatact ggtaccctgc cagtccccct ggaacacgcc cctgctaccc 660
gttaagaaac cagggactaa tgattatagg cctgtccagg atctgagaga agtcaacaag 720
cgggtggaag acatccaccc caccgtgccc aacccttaca acctcttgag cgggctccca 780
ccgtcccacc agtggtacac tgtgcttgat ttaaaggatg cctttttctg cctgagactc 840
caccccacca gtcagcctct cttcgccttt gagtggagag atccagagat gggaatctca 900
ggacaattga cctggaccag actcccacag ggtttcaaaa acagtcccac cctgtttgat 960
gaggcactgc acagagacct agcagacttc cggatccagc acccagactt gatcctgcta 1020
cagtacgtgg atgacttact gctggccgcc acttctgagc tagactgcca acaaggtact 1080
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actgaggcca gaaaagagac tgtgatgggg cagcctactc cgaagacccc tcgacaacta 1260
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caaaaggcct atcaagaaat caagcaagct cttctaactg ccccagccct ggggttgcca 1440
gatttgacta agccctttga actctttgtc gacgagaagc agggctacgc caaaggtgtc 1500
ctaacgcaaa aactgggacc ttggcgtcgg ccggtggcct acctgtccaa aaagctagac 1560
ccagtagcag ctgggtggcc cccttgccta cggatggtag cagccattgc cgtactgaca 1620
aaggatgcag gcaagctaac catgggacag ccactagtca ttctggcccc ccatgcagta 1680
gaggcactag tcaaacaacc ccccgaccgc tggctttcca acgcccggat gactcactat 1740
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accaccgaga ccgaggtaat ctgggctaaa gccctgccag ccgggacatc cgctcagcgg 2040
gctgaactga tagcactcac ccaggcccta aagatggcag aaggtaagaa gctaaatgtt 2100
tatactgata gccgttatgc ttttgctact gcccatatcc atggagaaat atacagaagg 2160
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ggacacagcg ccgaggctag aggcaaccgg atggctgacc aagcggcccg aaaggcagcc 2340
atcacagaga ctccagacac ctctaccctc ctcatagaaa attcatcacc ctacacctca 2400
gaacattttc attacacagt gactgatata aaggacctaa ccaagttggg ggccatttat 2460
gataaaacaa agaagtattg ggtctaccaa ggaaaacctg tgatgcctga ccagtttact 2520
tttgaattat tagactttct tcatcagctg actcacctca gcttctcaaa aatgaaggct 2580
ctcctagaga gaagccacag tccctactac atgctgaacc gggatcgaac actcaaaaat 2640
atcactgaga cctgcaaagc ttgtgcacaa gtcaacgcca gcaagtctgc cgttaaacag 2700
ggaactaggg tccgcgggca tcggcccggc actcattggg agatcgattt caccgagata 2760
aagcccggat tgtatggcta taaatatctt ctagttttta tagatacctt ttctggctgg 2820
atagaagcct tcccaaccaa gaaagaaacc gccaaggtcg taaccaagaa gctactagag 2880
gagatcttcc ccaggttcgg catgcctcag gtattgggaa ctgacaatgg gcctgccttc 2940
gtctccaagg tgagtcagac agtggccgat ctgttgggga ttgattggaa attacattgt 3000
gcatacagac cccaaagctc aggccaggta gaaagaatga atagaaccat caaggagact 3060
ttaactaaat taacgcttgc aactggctct agagactggg tgctcctact ccccttagcc 3120
ctgtaccgag cccgcaacac gccgggcccc catggcctca ccccatatga gatcttatat 3180
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tggcgcgttc aacgctctca aaacccctta aaaataaggt taacccgcga ggccccctaa 3600
tccccttaat tcttctgatg ctcagagggg tcagt 3635
<210> 25
<211> 9694
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> spRRVe-yCD env载体
<400> 25
aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag 60
gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 120
ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc 180
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cagccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa 300
atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc 360
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gattgactga gtcgcccggg tacccgtgta tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga 480
cttgtggtct cgctgttcct tgggagggtc tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg 540
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caccaccggg aggtaagctg gccagcaact tatctgtgtc tgtccgattg tctagtgtct 660
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acccgtggtg gaactgacga gttcggaaca cccggccgca accctgggag acgtcccagg 780
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ctttggtgca ccccccttag aggagggata tgtggttctg gtaggagacg agaacctaaa 900
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ccgacaccag actaagaacc tagaacctcg ctggaaagga ccttacacag tcctgctgac 1740
cacccccacc gccctcaaag tagacggcat cgcagcttgg atacacgccg cccacaattc 1800
gatcatacct ggtgttgctg actaccccga ccgcggtaaa agtcgatggt attgctgcct 1860
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aaattatcca aggactggat aacgggaaaa acctggggat taagattcta tgtgtctgga 2580
catccaggcg tacagttcac cattcgctta aaaatcacca acatgccagc tgtggcagta 2640
ggtcctgacc tcgtccttgt ggaacaagga cctcctagaa cgtccctcgc tctcccacct 2700
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tgcctctcca cctcagtttt taatcagact agagatttct gtatccaggt ccagctgatt 3240
cctcgcatct attactatcc tgaagaagtt ttgttacagg cctatgacaa ttctcacccc 3300
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agtacataag gtcaataggg gtgaatcaac aggaaagtcc cattggagcc aagtacactg 4200
agtcaatagg gactttccat tgggttttgc ccagtacaaa aggtcaatag ggggtgagtc 4260
aatgggtttt tcccattatt ggcacgtaca taaggtcaat aggggtgagt cattgggttt 4320
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gaaactaatg caacgtgacc tttaaacggt actttcccat agctgattaa tgggaaagta 4440
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gcttatggtg acagggggaa tggcaagcaa gtgggatcag aagggtatgg acattgccta 4740
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cacactacat ggtgagatct ccactttgga aaactgtggg agattagagg gcaaagtgta 4920
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atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc 360
ttatgctccc cgagctcaat aaaagagccc acaacccctc actcggggcg ccagtcctcc 420
gattgactga gtcgcccggg tacccgtgta tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga 480
cttgtggtct cgctgttcct tgggagggtc tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg 540
gggtctttca tttgggggct cgtccgggat cgggagaccc ctgcccaggg accaccgacc 600
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agt 10383
<210> 28
<211> 9993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> spRRVe-F1-TK载体
<400> 28
aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag 60
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attaaaacgc catgtacttt cccaccattg acgtcaatgg gctattgaaa ctaatgcaac 4200
gtgaccttta aacggtactt tcccatagct gattaatggg aaagtaccgt tctcgagcca 4260
atacacgtca atgggaagtg aaagggcagc caaaacgtaa caccgccccg gttttccctg 4320
gaaattccat attggcacgc attctattgg ctgagctgcg ttcacgtggg tataagaggc 4380
gcgaccagcg tcggtaccgt cgcagtcttc ggtctgacca ccgtagaacg cagaacgcgt 4440
atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 4500
ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 4560
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atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 4860
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tgtatcaaaa ttaatttggt tttttttctt aagtatttac attaaatggc catagtactt 6300
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gtgtgtgtga gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc atgtgtgtgt gtgtgactgt gtctatgtgt 6780
atgactgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gttgtgaaaa 6840
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ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 7500
taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 7560
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cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 7860
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<210> 29
<211> 9860
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> spRRVe-F2-TK载体
<400> 29
aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag 60
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acccgtggtg gaactgacga gttcggaaca cccggccgca accctgggag acgtcccagg 780
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ccgacaccag actaagaacc tagaacctcg ctggaaagga ccttacacag tcctgctgac 1740
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aaacaaggtc aataggggtg agtcattggg tttttccagc caatttaatt aaaacgccat 4020
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cctcttcccc caagggaagc gccaccgcca tctctccccg actctaactc cacagccctg 2760
gcgactagtg cacaaactcc cacggtgaga aaaacaattg ttaccctaaa cactccgcct 2820
cccaccacag gcgacagact ttttgatctt gtgcaggggg ccttcctaac cttaaatgct 2880
accaacccag gggccactga gtcttgctgg ctttgtttgg ccatgggccc cccttattat 2940
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gggacccaag gaaagctcac cctcactgag gtctcaggac acgggttgtg cataggaaag 3060
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catcagtatc tgctcccctc caaccatagc tggtgggctt gcagcactgg cctcacccct 3180
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<210> 32
<211> 10008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sRRVgp-sEF1a-hopt-yCD
<400> 32
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 60
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t 9901
<210> 35
<211> 9768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sRRVe-F2-TK载体
<400> 35
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cgacctggcg cgcacgtttg cccgggagat gggggaggct aactgatcga gaaacgcgtc 5340
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<210> 36
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<400> 36
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gcatctgtca ggatcaattt cccattatgc cagtcatatt aattactagt caattagttg 9600
atttttattt ttgacatata catgtgaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta 9660
gcttaagt 9668
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<211> 9592
<212> DNA
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<220>
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<400> 37
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gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 120
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acagcggacc cggacttttg acttttacgt gtgccctggg cataccgtaa agtcggggtg 2160
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caccatcatg ggacctctaa tagtactctt actgatctta ctctttggac cttgcattct 3660
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> sRRVgp-F4-hCD19载体
<400> 44
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 60
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 120
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 180
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 240
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 300
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 360
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 420
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 480
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 540
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 600
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 660
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 720
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aagtaacgcc attttgcaag gcatggaaaa atacataact gagaatagaa aagttcagat 1800
caaggtcagg aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 1860
gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga 1920
tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc 1980
ggtccagccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc 2040
tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc 2100
gcgcttatgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc cctcactcgg ggcgccagtc 2160
ctccgattga ctgagtcgcc cgggtacccg tgtatccaat aaaccctctt gcagttgcat 2220
ccgacttgtg gtctcgctgt tccttgggag ggtctcctct gagtgattga ctacccgtca 2280
gcgggggtct ttcatttggg ggctcgtccg ggatcgggag acccctgccc agggaccacc 2340
gacccaccac cgggaggtaa gctggccagc aacttatctg tgtctgtccg attgtctagt 2400
gtctatgact gattttatgc gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg 2460
gcggacccgt ggtggaactg acgagttcgg aacacccggc cgcaaccctg ggagacgtcc 2520
cagggacttc gggggccgtt tttgtggccc gacctgagtc caaaaatccc gatcgttttg 2580
gactctttgg tgcacccccc ttagaggagg gatatgtggt tctggtagga gacgagaacc 2640
taaaacagtt cccgcctccg tctgaatttt tgctttcggt ttgggaccga agccgcgccg 2700
cgcgtcttgt ctgctgcagc atcgttctgt gttgtctctg tctgactgtg tttctgtatt 2760
tgtctgagaa tatgggccag actgttacca ctcccttaag tttgacctta ggtcactgga 2820
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ccttctgctc tgcagaatgg ccaaccttta acgtcggatg gccgcgagac ggcaccttta 2940
accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc acctggcccg catggacacc 3000
cagaccaggt cccctacatc gtgacctggg aagccttggc ttttgacccc cctccctggg 3060
tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc ctcctcttcc tccatccgcc ccgtctctcc 3120
cccttgaacc tcctcgttcg accccgcctc gatcctccct ttatccagcc ctcactcctt 3180
ctctaggcgc caaacctaaa cctcaagttc tttctgacag tggggggccg ctcatcgacc 3240
tacttacaga agaccccccg ccttataggg acccaagacc acccccttcc gacagggacg 3300
gaaatggtgg agaagcgacc cctgcgggag aggcaccgga cccctcccca atggcatctc 3360
gcctacgtgg gagacgggag ccccctgtgg ccgactccac tacctcgcag gcattccccc 3420
tccgcgcagg aggaaacgga cagcttcaat actggccgtt ctcctcttct gacctttaca 3480
actggaaaaa taataaccct tctttttctg aagatccagg taaactgaca gctctgatcg 3540
agtctgttct catcacccat cagcccacct gggacgactg tcagcagctg ttggggactc 3600
tgctgaccgg agaagaaaaa caacgggtgc tcttagaggc tagaaaggcg gtgcggggcg 3660
atgatgggcg ccccactcaa ctgcccaatg aagtcgatgc cgcttttccc ctcgagcgcc 3720
cagactggga ttacaccacc caggcaggta ggaaccacct agtccactat cgccagttgc 3780
tcctagcggg tctccaaaac gcgggcagaa gccccaccaa tttggccaag gtaaaaggaa 3840
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gcaggtacac tccttatgac cctgaggacc cagggcaaga aactaatgtg tctatgtctt 3960
tcatttggca gtctgcccca gacattggga gaaagttaga gaggttagaa gatttaaaaa 4020
acaagacgct tggagatttg gttagagagg cagaaaagat ctttaataaa cgagaaaccc 4080
cggaagaaag agaggaacgt atcaggagag aaacagagga aaaagaagaa cgccgtagga 4140
cagaggatga gcagaaagag aaagaaagag atcgtaggag acatagagag atgagcaagc 4200
tattggccac tgtcgttagt ggacagaaac aggatagaca gggaggagaa cgaaggaggt 4260
cccaactcga tcgcgaccag tgtgcctact gcaaagaaaa ggggcactgg gctaaagatt 4320
gtcccaagaa accacgagga cctcggggac caagacccca gacctccctc ctgaccctag 4380
atgactaggg aggtcagggt caggagcccc cccctgaacc caggataacc ctcaaagtcg 4440
gggggcaacc cgtcaccttc ctggtagata ctggggccca acactccgtg ctgacccaaa 4500
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tccatgtacc agactgtccc tatcctctgt taggaagaga tttgctgact aaactaaaag 4680
cccaaatcca ctttgaggga tcaggagctc aggttatggg accaatgggg cagcccctgc 4740
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ccgtgtccat aaaacaatac cccatgtcac aagaagccag actggggatc aagccccaca 4980
tacagagact gttggaccag ggaatactgg taccctgcca gtccccctgg aacacgcccc 5040
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tgtttgatga ggcactgcac agagacctag cagacttccg gatccagcac ccagacttga 5400
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tggccctact aaaagccctc tttctgccca aaagacttag cataatccat tgtccaggac 6660
atcaaaaggg acacagcgcc gaggctagag gcaaccggat ggctgaccaa gcggcccgaa 6720
aggcagccat cacagagact ccagacacct ctaccctcct catagaaaat tcatcaccct 6780
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ccatttatga taaaacaaag aagtattggg tctaccaagg aaaacctgtg atgcctgacc 6900
agtttacttt tgaattatta gactttcttc atcagctgac tcacctcagc ttctcaaaaa 6960
tgaaggctct cctagagaga agccacagtc cctactacat gctgaaccgg gatcgaacac 7020
tcaaaaatat cactgagacc tgcaaagctt gtgcacaagt caacgccagc aagtctgccg 7080
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ctggctggat agaagccttc ccaaccaaga aagaaaccgc caaggtcgta accaagaagc 7260
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gactgacatg gcgcgttcaa cgctctcaaa accccttaaa aataaggtta acccgcgagg 7980
ccccctaatc cccttaattc ttctgatgct cagaggggtc agtaaacgaa ttcggaagtg 8040
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tgggagggag agcctccgtg tctcccaccg agggacagcc tgaaccagag cctcagccag 8760
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gtgtccaggg gccccctctc ctggacccat gtgcacccca aggggcctaa gtcattgctg 8880
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ttgttgcccc gggccacagc tcaagacgct ggaaagtatt attgtcaccg tggcaacctg 9000
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cttgtgggca ttcttcatct tcaaagagcc ctggtcctga ggaggaaaag aaagcgaatg 9180
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cagtacggga acgtgctgtc tctccccaca cccacctcag gcctcggacg cgcccagcgt 9300
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ctgtatgcag ccccccagct ccgctccatt cggggccagc ctggacccaa tcatgaggaa 9780
gatgcagact cttatgagaa catggataat cccgatgggc cagacccagc ctggggagga 9840
gggggccgca tgggcacctg gagcaccagg tgagtttaaa cacgcgtgaa ttcataaaat 9900
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gcaagctagc ttaagtaacg ccattttgca aggcatggaa aaatacataa ctgagaatag 10020
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ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg 10200
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gcttctgttc gcgcgcttct gctccccgag ctcaataaaa gagcccacaa cccctcactc 10380
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ttgcagttgc atccgacttg tggtctcgct gttccttggg agggtctcct ctgagtgatt 10500
gactacccgt cagcgggggt ctttcattgt tacttaaagt tacattggct tccttgaaat 10560
aaacatggag tattcagaat gtgtcataaa tatttctaat tttaagatag tatctccatt 10620
ggctttctac tttttctttt attttttttt gtcctctgtc ttccatttgt tgttgttgtt 10680
gtttgtttgt ttgtttgttg gttggttggt taattttttt ttaaagatcc tacactatag 10740
ttcaagctag actattagct actctgtaac ccagggtgac cttgaagtca tgggtagcct 10800
gctgttttag ccttcccaca tctaagatta caggtatgag ctatcatttt tggtatattg 10860
attgattgat tgattgatgt gtgtgtgtgt gattgtgttt gtgtgtgtga ctgtgaaaat 10920
gtgtgtatgg gtgtgtgtga atgtgtgtat gtatgtgtgt gtgtgagtgt gtgtgtgtgt 10980
gtgtgcatgt gtgtgtgtgt gactgtgtct atgtgtatga ctgtgtgtgt gtgtgtgtgt 11040
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgttg tgaaaaaata ttctatggta gtgagagcca 11100
acgctccggc tcaggtgtca ggttggtttt tgagacagag tctttcactt agcttgg 11157
<210> 45
<211> 10105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sRRVe-F4-hCD19载体
<400> 45
aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag 60
gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 120
ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc 180
tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc 240
cagccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa 300
atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc 360
ttatgctccc cgagctcaat aaaagagccc acaacccctc actcggggcg ccagtcctcc 420
gattgactga gtcgcccggg tacccgtgta tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga 480
cttgtggtct cgctgttcct tgggagggtc tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg 540
gggtctttca tttgggggct cgtccgggat cgggagaccc ctgcccaggg accaccgacc 600
caccaccggg aggtaagctg gccagcaact tatctgtgtc tgtccgattg tctagtgtct 660
atgactgatt ttatgcgcct gcgtcggtac tagttagcta actagctctg tatctggcgg 720
acccgtggtg gaactgacga gttcggaaca cccggccgca accctgggag acgtcccagg 780
gacttcgggg gccgtttttg tggcccgacc tgagtcctaa aatcccgatc gtttaggact 840
ctttggtgca ccccccttag aggagggata tgtggttctg gtaggagacg agaacctaaa 900
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gaaagatgtc gagcggatcg ctcacaacca gtcggtagat gtcaagaaga gacgttgggt 1140
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tacaccctca acctccccta caagtccaag tgtcccacag ccacccccag gaactggaga 2700
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caccatcatg ggacctctaa tagtactctt actgatctta ctctttggac cttgcattct 3660
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tcaacaatat caccagctga agcctataga gtacgagcca tagcacgtga aggctgccga 3780
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tcgcagtctt cggtctgacc accgtagaac gcagagcggc cgcatgccac ctcctcgcct 4020
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aagttcagat caaggtcagg aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct 8880
gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggaacagc tgaatatggg 8940
ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt 9000
ccccagatgc ggtccagccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc 9060
cccaaggacc tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc 9120
ttctgttcgc gcgcttctgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc cctcactcgg 9180
ggcgccagtc ctccgattga ctgagtcgcc cgggtacccg tgtatccaat aaaccctctt 9240
gcagttgcat ccgacttgtg gtctcgctgt tccttgggag ggtctcctct gagtgattga 9300
ctacccgtca gcgggggtct ttcattgtta cttaaagtta cattggcttc cttgaaataa 9360
acatggagta ttcagaatgt gtcataaata tttctaattt taagatagta tctccattgg 9420
ctttctactt tttcttttat ttttttttgt cctctgtctt ccatttgttg ttgttgttgt 9480
ttgtttgttt gtttgttggt tggttggtta attttttttt aaagatccta cactatagtt 9540
caagctagac tattagctac tctgtaaccc agggtgacct tgaagtcatg ggtagcctgc 9600
tgttttagcc ttcccacatc taagattaca ggtatgagct atcatttttg gtatattgat 9660
tgattgattg attgatgtgt gtgtgtgtga ttgtgtttgt gtgtgtgact gtgaaaatgt 9720
gtgtatgggt gtgtgtgaat gtgtgtatgt atgtgtgtgt gtgagtgtgt gtgtgtgtgt 9780
gtgcatgtgt gtgtgtgtga ctgtgtctat gtgtatgact gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 9840
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgttgtg aaaaaatatt ctatggtagt gagagccaac 9900
gctccggctc aggtgtcagg ttggtttttg agacagagtc tttcacttag cttgg 9955
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV-F-EcoRI
<400> 47
cggaattcaa caggaaagtc ccattgga 28
<210> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCMV-R-PmeI-EcoRI
<400> 48
cggaattcgt ttaaacctgc gttctacggt ggtcaga 37
<210> 49
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TK-F-PmeI
<400> 49
cggtttaaac atggcttcgt acccctgcca tc 32
<210> 50
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TK-R-PmeI
<400> 50
cggtttaaac tcagttagcc tcccccatct cc 32
<210> 51
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD19t-NotI-F
<400> 51
cggcggccgc atgccacctc ctcgcctcct cttc 34
<210> 52
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD19t-MluI-R
<400> 52
caacgcgttc atcttttcct cctcaggacc agg 33
<210> 53
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD19t多核苷酸序列
<400> 53
atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60
gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120
gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180
ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240
tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300
cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360
ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420
tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480
aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540
aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600
ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660
gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720
gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780
tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840
tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900
atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960
aggaaaagat ga 972
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sRRVgp-F4-hCD19t载体
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catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 60
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 120
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 180
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 240
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 300
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 360
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taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 480
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 540
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 600
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 660
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 720
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 780
atcaatctaa agtatatatg agtaacctga tcaggactct tccttttcat gaacaataaa 840
actgtctgct tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac 900
gtcttgctct aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg 960
ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga 1020
tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga 1080
gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat 1140
ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca 1200
ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct 1260
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tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga 1380
cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt 1440
ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga 1500
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caaggtcagg aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 1860
gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga 1920
tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc 1980
ggtccagccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc 2040
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gcgcttatgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc cctcactcgg ggcgccagtc 2160
ctccgattga ctgagtcgcc cgggtacccg tgtatccaat aaaccctctt gcagttgcat 2220
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gcgggggtct ttcatttggg ggctcgtccg ggatcgggag acccctgccc agggaccacc 2340
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gtctatgact gattttatgc gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg 2460
gcggacccgt ggtggaactg acgagttcgg aacacccggc cgcaaccctg ggagacgtcc 2520
cagggacttc gggggccgtt tttgtggccc gacctgagtc caaaaatccc gatcgttttg 2580
gactctttgg tgcacccccc ttagaggagg gatatgtggt tctggtagga gacgagaacc 2640
taaaacagtt cccgcctccg tctgaatttt tgctttcggt ttgggaccga agccgcgccg 2700
cgcgtcttgt ctgctgcagc atcgttctgt gttgtctctg tctgactgtg tttctgtatt 2760
tgtctgagaa tatgggccag actgttacca ctcccttaag tttgacctta ggtcactgga 2820
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ccttctgctc tgcagaatgg ccaaccttta acgtcggatg gccgcgagac ggcaccttta 2940
accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc acctggcccg catggacacc 3000
cagaccaggt cccctacatc gtgacctggg aagccttggc ttttgacccc cctccctggg 3060
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cccttgaacc tcctcgttcg accccgcctc gatcctccct ttatccagcc ctcactcctt 3180
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gaaatggtgg agaagcgacc cctgcgggag aggcaccgga cccctcccca atggcatctc 3360
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agtctgttct catcacccat cagcccacct gggacgactg tcagcagctg ttggggactc 3600
tgctgaccgg agaagaaaaa caacgggtgc tcttagaggc tagaaaggcg gtgcggggcg 3660
atgatgggcg ccccactcaa ctgcccaatg aagtcgatgc cgcttttccc ctcgagcgcc 3720
cagactggga ttacaccacc caggcaggta ggaaccacct agtccactat cgccagttgc 3780
tcctagcggg tctccaaaac gcgggcagaa gccccaccaa tttggccaag gtaaaaggaa 3840
taacacaagg gcccaatgag tctccctcgg ccttcctaga gagacttaag gaagcctatc 3900
gcaggtacac tccttatgac cctgaggacc cagggcaaga aactaatgtg tctatgtctt 3960
tcatttggca gtctgcccca gacattggga gaaagttaga gaggttagaa gatttaaaaa 4020
acaagacgct tggagatttg gttagagagg cagaaaagat ctttaataaa cgagaaaccc 4080
cggaagaaag agaggaacgt atcaggagag aaacagagga aaaagaagaa cgccgtagga 4140
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gtcccaagaa accacgagga cctcggggac caagacccca gacctccctc ctgaccctag 4380
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tccatgtacc agactgtccc tatcctctgt taggaagaga tttgctgact aaactaaaag 4680
cccaaatcca ctttgaggga tcaggagctc aggttatggg accaatgggg cagcccctgc 4740
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aaggtgtcct aacgcaaaaa ctgggacctt ggcgtcggcc ggtggcctac ctgtccaaaa 5940
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tggcagcctg gctggacagt caatgtggag ggcagcgggg agctgttccg gtggaatgtt 8580
tcggacctag gtggcctggg ctgtggcctg aagaacaggt cctcagaggg ccccagctcc 8640
ccttccggga agctcatgag ccccaagctg tatgtgtggg ccaaagaccg ccctgagatc 8700
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gacctcacca tggcccctgg ctccacactc tggctgtcct gtggggtacc ccctgactct 8820
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ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc agccctcagc agtttctaga gaaccatcag 9540
atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat 9600
cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata aaagagccca 9660
caacccctca ctcggggcgc cagtcctccg attgactgag tcgcccgggt acccgtgtat 9720
ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac ttgtggtctc gctgttcctt gggagggtct 9780
cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg ggtctttcat tgttacttaa agttacattg 9840
gcttccttga aataaacatg gagtattcag aatgtgtcat aaatatttct aattttaaga 9900
tagtatctcc attggctttc tactttttct tttatttttt tttgtcctct gtcttccatt 9960
tgttgttgtt gttgtttgtt tgtttgtttg ttggttggtt ggttaatttt tttttaaaga 10020
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sRRVe-F4-hCD19t载体
<400> 56
aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag 60
gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 120
ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc 180
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cagccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa 300
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<210> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> spRRVe-mGM-CSF
<400> 57
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gccttaaaac ctttctgact gatatcccct ttgaatgcaa aaaaccagtc caaaaatgag 5100
aattcgatat caagcttatc gatggggtac cagatccgat aaaataaaag attttattta 5160
gtctccagaa aaagggggga atgaaagacc ccacctgtag gtttggcaag ctagcttaag 5220
taacgccatt ttgcaaggca tggaaaaata cataactgag aatagagaag ttcagatcaa 5280
ggtcaggaac agatggaaca gctgaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt 5340
cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg gaacagctga atatgggcca aacaggatat 5400
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ccagccctca gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga 5520
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tcagaatgtg tcataaatat ttctaatttt aagatagtat ctccattggc tttctacttt 5940
ttcttttatt tttttttgtc ctctgtcttc catttgttgt tgttgttgtt tgtttgtttg 6000
tttgttggtt ggttggttaa ttttttttta aagatcctac actatagttc aagctagact 6060
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tcccacatct aagattacag gtatgagcta tcatttttgg tatatgattg attgattgat 6180
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gtgtgtgact gtgtctatgt gtatgactgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 6360
gtgtgtgtgt gtgttgtgaa aaaatattct atggtagtga gagccaacgc tccggctcag 6420
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ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 7080
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cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 7440
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agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 7740
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actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 7860
aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 7920
gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 7980
atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 8040
tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 8100
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agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 8280
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atgtttttat ttcataaggg tttcaatgtg catgaatgct gcaatattcc tgttaccaaa 9300
gctagtataa ataaaaatag ataaacgtgg aaattactta gagtttctgt cattaacgtt 9360
tccttcctca gttgacaaca taaatgcgct gctgagcaag ccagtttgca tctgtcagga 9420
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<212> DNA
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<223> mGM-CSF-F-NotI
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> mGM-CSF-R-MluI
<400> 59
tggtcgactc atttttggac tggttttt 28
<210> 60
<211> 9907
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sRRVgp-F4-mGM-CSF载体
<400> 60
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 60
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 120
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cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 300
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catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 780
atcaatctaa agtatatatg agtaacctga tcaggactct tccttttcat gaacaataaa 840
actgtctgct tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac 900
gtcttgctct aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg 960
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caaggtcagg aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 1860
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tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc 1980
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ctccgattga ctgagtcgcc cgggtacccg tgtatccaat aaaccctctt gcagttgcat 2220
ccgacttgtg gtctcgctgt tccttgggag ggtctcctct gagtgattga ctacccgtca 2280
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gtctatgact gattttatgc gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg 2460
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tgtctgagaa tatgggccag actgttacca ctcccttaag tttgacctta ggtcactgga 2820
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tacttacaga agaccccccg ccttataggg acccaagacc acccccttcc gacagggacg 3300
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actggaaaaa taataaccct tctttttctg aagatccagg taaactgaca gctctgatcg 3540
agtctgttct catcacccat cagcccacct gggacgactg tcagcagctg ttggggactc 3600
tgctgaccgg agaagaaaaa caacgggtgc tcttagaggc tagaaaggcg gtgcggggcg 3660
atgatgggcg ccccactcaa ctgcccaatg aagtcgatgc cgcttttccc ctcgagcgcc 3720
cagactggga ttacaccacc caggcaggta ggaaccacct agtccactat cgccagttgc 3780
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taacacaagg gcccaatgag tctccctcgg ccttcctaga gagacttaag gaagcctatc 3900
gcaggtacac tccttatgac cctgaggacc cagggcaaga aactaatgtg tctatgtctt 3960
tcatttggca gtctgcccca gacattggga gaaagttaga gaggttagaa gatttaaaaa 4020
acaagacgct tggagatttg gttagagagg cagaaaagat ctttaataaa cgagaaaccc 4080
cggaagaaag agaggaacgt atcaggagag aaacagagga aaaagaagaa cgccgtagga 4140
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cccaactcga tcgcgaccag tgtgcctact gcaaagaaaa ggggcactgg gctaaagatt 4320
gtcccaagaa accacgagga cctcggggac caagacccca gacctccctc ctgaccctag 4380
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ccgtgtccat aaaacaatac cccatgtcac aagaagccag actggggatc aagccccaca 4980
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accacacctg gtacacggat ggaagcagtc tcttacaaga gggacagcgt aaggcgggag 6360
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ccccctaatc cccttaattc ttctgatgct cagaggggtc agtaaacgaa ttcggaagtg 8040
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attctattgg ctgagctgcg ttcacgtggg tataagaggc gcgaccagcg tcggtaccgt 8160
cgcagtcttc ggtctgacca ccgtagaacg cagagcggcc gcaggatgtg gctgcagaat 8220
ttacttttcc tgggcattgt ggtctacagc ctctcagcac ccacccgctc acccatcact 8280
gtcacccggc cttggaagca tgtagaggcc atcaaagaag ccctgaacct cctggatgac 8340
atgcctgtca cgttgaatga agaggtagaa gtcgtctcta acgagttctc cttcaagaag 8400
ctaacatgtg tgcagacccg cctgaagata ttcgagcagg gtctacgggg caatttcacc 8460
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acctttctga ctgatatccc ctttgaatgc aaaaaaccag tccaaaaatg aacgcgtgaa 8640
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tgtaggtttg gcaagctagc ttaagtaacg ccattttgca aggcatggaa aaatacataa 8760
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tttccagggt gccccaagga cctgaaatga ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag 9060
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sRRVgp-F4-hGM-CSF载体
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actggaaaaa taataaccct tctttttctg aagatccagg taaactgaca gctctgatcg 3540
agtctgttct catcacccat cagcccacct gggacgactg tcagcagctg ttggggactc 3600
tgctgaccgg agaagaaaaa caacgggtgc tcttagaggc tagaaaggcg gtgcggggcg 3660
atgatgggcg ccccactcaa ctgcccaatg aagtcgatgc cgcttttccc ctcgagcgcc 3720
cagactggga ttacaccacc caggcaggta ggaaccacct agtccactat cgccagttgc 3780
tcctagcggg tctccaaaac gcgggcagaa gccccaccaa tttggccaag gtaaaaggaa 3840
taacacaagg gcccaatgag tctccctcgg ccttcctaga gagacttaag gaagcctatc 3900
gcaggtacac tccttatgac cctgaggacc cagggcaaga aactaatgtg tctatgtctt 3960
tcatttggca gtctgcccca gacattggga gaaagttaga gaggttagaa gatttaaaaa 4020
acaagacgct tggagatttg gttagagagg cagaaaagat ctttaataaa cgagaaaccc 4080
cggaagaaag agaggaacgt atcaggagag aaacagagga aaaagaagaa cgccgtagga 4140
cagaggatga gcagaaagag aaagaaagag atcgtaggag acatagagag atgagcaagc 4200
tattggccac tgtcgttagt ggacagaaac aggatagaca gggaggagaa cgaaggaggt 4260
cccaactcga tcgcgaccag tgtgcctact gcaaagaaaa ggggcactgg gctaaagatt 4320
gtcccaagaa accacgagga cctcggggac caagacccca gacctccctc ctgaccctag 4380
atgactaggg aggtcagggt caggagcccc cccctgaacc caggataacc ctcaaagtcg 4440
gggggcaacc cgtcaccttc ctggtagata ctggggccca acactccgtg ctgacccaaa 4500
atcctggacc cctaagtgat aagtctgcct gggtccaagg ggctactgga ggaaagcggt 4560
atcgctggac cacggatcgc aaagtacatc tagctaccgg taaggtcacc cactctttcc 4620
tccatgtacc agactgtccc tatcctctgt taggaagaga tttgctgact aaactaaaag 4680
cccaaatcca ctttgaggga tcaggagctc aggttatggg accaatgggg cagcccctgc 4740
aagtgttgac cctaaatata gaagatgagc atcggctaca tgagacctca aaagagccag 4800
atgtttctct agggtccaca tggctgtctg attttcctca ggcctgggcg gaaaccgggg 4860
gcatgggact ggcagttcgc caagctcctc tgatcatacc tctgaaagca acctctaccc 4920
ccgtgtccat aaaacaatac cccatgtcac aagaagccag actggggatc aagccccaca 4980
tacagagact gttggaccag ggaatactgg taccctgcca gtccccctgg aacacgcccc 5040
tgctacccgt taagaaacca gggactaatg attataggcc tgtccaggat ctgagagaag 5100
tcaacaagcg ggtggaagac atccacccca ccgtgcccaa cccttacaac ctcttgagcg 5160
ggctcccacc gtcccaccag tggtacactg tgcttgattt aaaggatgcc tttttctgcc 5220
tgagactcca ccccaccagt cagcctctct tcgcctttga gtggagagat ccagagatgg 5280
gaatctcagg acaattgacc tggaccagac tcccacaggg tttcaaaaac agtcccaccc 5340
tgtttgatga ggcactgcac agagacctag cagacttccg gatccagcac ccagacttga 5400
tcctgctaca gtacgtggat gacttactgc tggccgccac ttctgagcta gactgccaac 5460
aaggtactcg ggccctgtta caaaccctag ggaacctcgg gtatcgggcc tcggccaaga 5520
aagcccaaat ttgccagaaa caggtcaagt atctggggta tcttctaaaa gagggtcaga 5580
gatggctgac tgaggccaga aaagagactg tgatggggca gcctactccg aagacccctc 5640
gacaactaag ggagttccta gggacggcag gcttctgtcg cctctggatc cctgggtttg 5700
cagaaatggc agcccccttg taccctctca ccaaaacggg gactctgttt aattggggcc 5760
cagaccaaca aaaggcctat caagaaatca agcaagctct tctaactgcc ccagccctgg 5820
ggttgccaga tttgactaag ccctttgaac tctttgtcga cgagaagcag ggctacgcca 5880
aaggtgtcct aacgcaaaaa ctgggacctt ggcgtcggcc ggtggcctac ctgtccaaaa 5940
agctagaccc agtagcagct gggtggcccc cttgcctacg gatggtagca gccattgccg 6000
tactgacaaa ggatgcaggc aagctaacca tgggacagcc actagtcatt ctggcccccc 6060
atgcagtaga ggcactagtc aaacaacccc ccgaccgctg gctttccaac gcccggatga 6120
ctcactatca ggccttgctt ttggacacgg accgggtcca gttcggaccg gtggtagccc 6180
tgaacccggc tacgctgctc ccactgcctg aggaagggct gcaacacaac tgccttgata 6240
tcctggccga agcccacgga acccgacccg acctaacgga ccagccgctc ccagacgccg 6300
accacacctg gtacacggat ggaagcagtc tcttacaaga gggacagcgt aaggcgggag 6360
ctgcggtgac caccgagacc gaggtaatct gggctaaagc cctgccagcc gggacatccg 6420
ctcagcgggc tgaactgata gcactcaccc aggccctaaa gatggcagaa ggtaagaagc 6480
taaatgttta tactgatagc cgttatgctt ttgctactgc ccatatccat ggagaaatat 6540
acagaaggcg tgggttgctc acatcagaag gcaaagagat caaaaataaa gacgagatct 6600
tggccctact aaaagccctc tttctgccca aaagacttag cataatccat tgtccaggac 6660
atcaaaaggg acacagcgcc gaggctagag gcaaccggat ggctgaccaa gcggcccgaa 6720
aggcagccat cacagagact ccagacacct ctaccctcct catagaaaat tcatcaccct 6780
acacctcaga acattttcat tacacagtga ctgatataaa ggacctaacc aagttggggg 6840
ccatttatga taaaacaaag aagtattggg tctaccaagg aaaacctgtg atgcctgacc 6900
agtttacttt tgaattatta gactttcttc atcagctgac tcacctcagc ttctcaaaaa 6960
tgaaggctct cctagagaga agccacagtc cctactacat gctgaaccgg gatcgaacac 7020
tcaaaaatat cactgagacc tgcaaagctt gtgcacaagt caacgccagc aagtctgccg 7080
ttaaacaggg aactagggtc cgcgggcatc ggcccggcac tcattgggag atcgatttca 7140
ccgagataaa gcccggattg tatggctata aatatcttct agtttttata gatacctttt 7200
ctggctggat agaagccttc ccaaccaaga aagaaaccgc caaggtcgta accaagaagc 7260
tactagagga gatcttcccc aggttcggca tgcctcaggt attgggaact gacaatgggc 7320
ctgccttcgt ctccaaggtg agtcagacag tggccgatct gttggggatt gattggaaat 7380
tacattgtgc atacagaccc caaagctcag gccaggtaga aagaatgaat agaaccatca 7440
aggagacttt aactaaatta acgcttgcaa ctggctctag agactgggtg ctcctactcc 7500
ccttagccct gtaccgagcc cgcaacacgc cgggccccca tggcctcacc ccatatgaga 7560
tcttatatgg ggcacccccg ccccttgtaa acttccctga ccctgacatg acaagagtta 7620
ctaacagccc ctctctccaa gctcacttac aggctctcta cttagtccag cacgaagtct 7680
ggagacctct ggcggcagcc taccaagaac aactggaccg accggtggta cctcaccctt 7740
accgagtcgg cgacacagtg tgggtccgcc gacaccagac taagaaccta gaacctcgct 7800
ggaaaggacc ttacacagtc ctgctgacca cccccaccgc cctcaaagta gacggcatcg 7860
cagcttggat acacgccgcc cacgtgaagg ctgccgaccc cgggggtgga ccatcctcta 7920
gactgacatg gcgcgttcaa cgctctcaaa accccttaaa aataaggtta acccgcgagg 7980
ccccctaatc cccttaattc ttctgatgct cagaggggtc agtaaacgaa ttcggaagtg 8040
aaagggcagc caaaacgtaa caccgccccg gttttccctg gaaattccat attggcacgc 8100
attctattgg ctgagctgcg ttcacgtggg tataagaggc gcgaccagcg tcggtaccgt 8160
cgcagtcttc ggtctgacca ccgtagaacg cagagcggcc gcaggatgtg gctgcagagc 8220
ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc atctctgcac ccgcccgctc gcccagcccc 8280
agcacgcagc cctgggagca tgtgaatgcc atccaggagg cccggcgtct cctgaacctg 8340
agtagagaca ctgctgctga gatgaatgaa acagtagaag tcatctcaga aatgtttgac 8400
ctccaggagc cgacctgcct acagacccgc ctggagctgt acaagcaggg cctgcggggc 8460
agcctcacca agctcaaggg ccccttgacc atgatggcca gccactacaa gcagcactgc 8520
cctccaaccc cggaaacttc ctgtgcaacc cagattatca cctttgaaag tttcaaagag 8580
aacctgaagg actttctgct tgtcatcccc tttgactgct gggagccagt ccaggagtga 8640
acgcgtgaat tcataaaata aaagatttta tttagtctcc agaaaaaggg gggaatgaaa 8700
gaccccacct gtaggtttgg caagctagct taagtaacgc cattttgcaa ggcatggaaa 8760
aatacataac tgagaataga gaagttcaga tcaaggtcag gaacagatgg aacagctgaa 8820
tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 8880
gatggaacag ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc 8940
tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg cggtccagcc ctcagcagtt tctagagaac 9000
catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta 9060
accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg ctccccgagc tcaataaaag 9120
agcccacaac ccctcactcg gggcgccagt cctccgattg actgagtcgc ccgggtaccc 9180
gtgtatccaa taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt ggtctcgctg ttccttggga 9240
gggtctcctc tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc tttcattgtt acttaaagtt 9300
acattggctt ccttgaaata aacatggagt attcagaatg tgtcataaat atttctaatt 9360
ttaagatagt atctccattg gctttctact ttttctttta tttttttttg tcctctgtct 9420
tccatttgtt gttgttgttg tttgtttgtt tgtttgttgg ttggttggtt aatttttttt 9480
taaagatcct acactatagt tcaagctaga ctattagcta ctctgtaacc cagggtgacc 9540
ttgaagtcat gggtagcctg ctgttttagc cttcccacat ctaagattac aggtatgagc 9600
tatcattttt ggtatattga ttgattgatt gattgatgtg tgtgtgtgtg attgtgtttg 9660
tgtgtgtgac tgtgaaaatg tgtgtatggg tgtgtgtgaa tgtgtgtatg tatgtgtgtg 9720
tgtgagtgtg tgtgtgtgtg tgtgcatgtg tgtgtgtgtg actgtgtcta tgtgtatgac 9780
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgttgt gaaaaaatat 9840
tctatggtag tgagagccaa cgctccggct caggtgtcag gttggttttt gagacagagt 9900
ctttcactta gcttgg 9916
<210> 65
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人密码子优化的hGM-CSF多核苷酸序列
<400> 65
atgtggcttc aaagtttgtt gctccttgga accgtcgctt gctctattag cgcacccgca 60
cgcagcccaa gtccttccac gcagccttgg gaacatgtta atgcgatcca agaagcacgg 120
cgcctcttga atctttcccg agacacggcg gcagaaatga atgagacagt tgaagtcatt 180
tcagagatgt ttgatctcca agaacctact tgtttgcaga ctcgactcga actttacaag 240
cagggtctcc ggggaagttt gaccaagctc aagggtcccc ttacgatgat ggcgtcccac 300
tacaagcaac actgcccccc gacaccagaa acgtcatgtg ctacccaaat cattaccttt 360
gaatcattca aggagaacct caaggatttt ctgttggtca taccattcga ctgttgggag 420
cccgtgcagg aatga 435
<210> 66
<211> 9913
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sRRVgp-F4-hopt-GM-CSF载体
<400> 66
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 60
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 120
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 180
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 240
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 300
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 360
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 420
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 480
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 540
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 600
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 660
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 720
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 780
atcaatctaa agtatatatg agtaacctga tcaggactct tccttttcat gaacaataaa 840
actgtctgct tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac 900
gtcttgctct aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg 960
ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga 1020
tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga 1080
gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat 1140
ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca 1200
ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct 1260
gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg 1320
tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga 1380
cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt 1440
ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga 1500
ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga 1560
tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt 1620
tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga 1680
tgagtttttc taagaatttg tgaatgaaag accccacctg taggtttggc aagctagctt 1740
aagtaacgcc attttgcaag gcatggaaaa atacataact gagaatagaa aagttcagat 1800
caaggtcagg aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 1860
gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga 1920
tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc 1980
ggtccagccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc 2040
tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc 2100
gcgcttatgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc cctcactcgg ggcgccagtc 2160
ctccgattga ctgagtcgcc cgggtacccg tgtatccaat aaaccctctt gcagttgcat 2220
ccgacttgtg gtctcgctgt tccttgggag ggtctcctct gagtgattga ctacccgtca 2280
gcgggggtct ttcatttggg ggctcgtccg ggatcgggag acccctgccc agggaccacc 2340
gacccaccac cgggaggtaa gctggccagc aacttatctg tgtctgtccg attgtctagt 2400
gtctatgact gattttatgc gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg 2460
gcggacccgt ggtggaactg acgagttcgg aacacccggc cgcaaccctg ggagacgtcc 2520
cagggacttc gggggccgtt tttgtggccc gacctgagtc caaaaatccc gatcgttttg 2580
gactctttgg tgcacccccc ttagaggagg gatatgtggt tctggtagga gacgagaacc 2640
taaaacagtt cccgcctccg tctgaatttt tgctttcggt ttgggaccga agccgcgccg 2700
cgcgtcttgt ctgctgcagc atcgttctgt gttgtctctg tctgactgtg tttctgtatt 2760
tgtctgagaa tatgggccag actgttacca ctcccttaag tttgacctta ggtcactgga 2820
aagatgtcga gcggatcgct cacaaccagt cggtagatgt caagaagaga cgttgggtta 2880
ccttctgctc tgcagaatgg ccaaccttta acgtcggatg gccgcgagac ggcaccttta 2940
accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc acctggcccg catggacacc 3000
cagaccaggt cccctacatc gtgacctggg aagccttggc ttttgacccc cctccctggg 3060
tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc ctcctcttcc tccatccgcc ccgtctctcc 3120
cccttgaacc tcctcgttcg accccgcctc gatcctccct ttatccagcc ctcactcctt 3180
ctctaggcgc caaacctaaa cctcaagttc tttctgacag tggggggccg ctcatcgacc 3240
tacttacaga agaccccccg ccttataggg acccaagacc acccccttcc gacagggacg 3300
gaaatggtgg agaagcgacc cctgcgggag aggcaccgga cccctcccca atggcatctc 3360
gcctacgtgg gagacgggag ccccctgtgg ccgactccac tacctcgcag gcattccccc 3420
tccgcgcagg aggaaacgga cagcttcaat actggccgtt ctcctcttct gacctttaca 3480
actggaaaaa taataaccct tctttttctg aagatccagg taaactgaca gctctgatcg 3540
agtctgttct catcacccat cagcccacct gggacgactg tcagcagctg ttggggactc 3600
tgctgaccgg agaagaaaaa caacgggtgc tcttagaggc tagaaaggcg gtgcggggcg 3660
atgatgggcg ccccactcaa ctgcccaatg aagtcgatgc cgcttttccc ctcgagcgcc 3720
cagactggga ttacaccacc caggcaggta ggaaccacct agtccactat cgccagttgc 3780
tcctagcggg tctccaaaac gcgggcagaa gccccaccaa tttggccaag gtaaaaggaa 3840
taacacaagg gcccaatgag tctccctcgg ccttcctaga gagacttaag gaagcctatc 3900
gcaggtacac tccttatgac cctgaggacc cagggcaaga aactaatgtg tctatgtctt 3960
tcatttggca gtctgcccca gacattggga gaaagttaga gaggttagaa gatttaaaaa 4020
acaagacgct tggagatttg gttagagagg cagaaaagat ctttaataaa cgagaaaccc 4080
cggaagaaag agaggaacgt atcaggagag aaacagagga aaaagaagaa cgccgtagga 4140
cagaggatga gcagaaagag aaagaaagag atcgtaggag acatagagag atgagcaagc 4200
tattggccac tgtcgttagt ggacagaaac aggatagaca gggaggagaa cgaaggaggt 4260
cccaactcga tcgcgaccag tgtgcctact gcaaagaaaa ggggcactgg gctaaagatt 4320
gtcccaagaa accacgagga cctcggggac caagacccca gacctccctc ctgaccctag 4380
atgactaggg aggtcagggt caggagcccc cccctgaacc caggataacc ctcaaagtcg 4440
gggggcaacc cgtcaccttc ctggtagata ctggggccca acactccgtg ctgacccaaa 4500
atcctggacc cctaagtgat aagtctgcct gggtccaagg ggctactgga ggaaagcggt 4560
atcgctggac cacggatcgc aaagtacatc tagctaccgg taaggtcacc cactctttcc 4620
tccatgtacc agactgtccc tatcctctgt taggaagaga tttgctgact aaactaaaag 4680
cccaaatcca ctttgaggga tcaggagctc aggttatggg accaatgggg cagcccctgc 4740
aagtgttgac cctaaatata gaagatgagc atcggctaca tgagacctca aaagagccag 4800
atgtttctct agggtccaca tggctgtctg attttcctca ggcctgggcg gaaaccgggg 4860
gcatgggact ggcagttcgc caagctcctc tgatcatacc tctgaaagca acctctaccc 4920
ccgtgtccat aaaacaatac cccatgtcac aagaagccag actggggatc aagccccaca 4980
tacagagact gttggaccag ggaatactgg taccctgcca gtccccctgg aacacgcccc 5040
tgctacccgt taagaaacca gggactaatg attataggcc tgtccaggat ctgagagaag 5100
tcaacaagcg ggtggaagac atccacccca ccgtgcccaa cccttacaac ctcttgagcg 5160
ggctcccacc gtcccaccag tggtacactg tgcttgattt aaaggatgcc tttttctgcc 5220
tgagactcca ccccaccagt cagcctctct tcgcctttga gtggagagat ccagagatgg 5280
gaatctcagg acaattgacc tggaccagac tcccacaggg tttcaaaaac agtcccaccc 5340
tgtttgatga ggcactgcac agagacctag cagacttccg gatccagcac ccagacttga 5400
tcctgctaca gtacgtggat gacttactgc tggccgccac ttctgagcta gactgccaac 5460
aaggtactcg ggccctgtta caaaccctag ggaacctcgg gtatcgggcc tcggccaaga 5520
aagcccaaat ttgccagaaa caggtcaagt atctggggta tcttctaaaa gagggtcaga 5580
gatggctgac tgaggccaga aaagagactg tgatggggca gcctactccg aagacccctc 5640
gacaactaag ggagttccta gggacggcag gcttctgtcg cctctggatc cctgggtttg 5700
cagaaatggc agcccccttg taccctctca ccaaaacggg gactctgttt aattggggcc 5760
cagaccaaca aaaggcctat caagaaatca agcaagctct tctaactgcc ccagccctgg 5820
ggttgccaga tttgactaag ccctttgaac tctttgtcga cgagaagcag ggctacgcca 5880
aaggtgtcct aacgcaaaaa ctgggacctt ggcgtcggcc ggtggcctac ctgtccaaaa 5940
agctagaccc agtagcagct gggtggcccc cttgcctacg gatggtagca gccattgccg 6000
tactgacaaa ggatgcaggc aagctaacca tgggacagcc actagtcatt ctggcccccc 6060
atgcagtaga ggcactagtc aaacaacccc ccgaccgctg gctttccaac gcccggatga 6120
ctcactatca ggccttgctt ttggacacgg accgggtcca gttcggaccg gtggtagccc 6180
tgaacccggc tacgctgctc ccactgcctg aggaagggct gcaacacaac tgccttgata 6240
tcctggccga agcccacgga acccgacccg acctaacgga ccagccgctc ccagacgccg 6300
accacacctg gtacacggat ggaagcagtc tcttacaaga gggacagcgt aaggcgggag 6360
ctgcggtgac caccgagacc gaggtaatct gggctaaagc cctgccagcc gggacatccg 6420
ctcagcgggc tgaactgata gcactcaccc aggccctaaa gatggcagaa ggtaagaagc 6480
taaatgttta tactgatagc cgttatgctt ttgctactgc ccatatccat ggagaaatat 6540
acagaaggcg tgggttgctc acatcagaag gcaaagagat caaaaataaa gacgagatct 6600
tggccctact aaaagccctc tttctgccca aaagacttag cataatccat tgtccaggac 6660
atcaaaaggg acacagcgcc gaggctagag gcaaccggat ggctgaccaa gcggcccgaa 6720
aggcagccat cacagagact ccagacacct ctaccctcct catagaaaat tcatcaccct 6780
acacctcaga acattttcat tacacagtga ctgatataaa ggacctaacc aagttggggg 6840
ccatttatga taaaacaaag aagtattggg tctaccaagg aaaacctgtg atgcctgacc 6900
agtttacttt tgaattatta gactttcttc atcagctgac tcacctcagc ttctcaaaaa 6960
tgaaggctct cctagagaga agccacagtc cctactacat gctgaaccgg gatcgaacac 7020
tcaaaaatat cactgagacc tgcaaagctt gtgcacaagt caacgccagc aagtctgccg 7080
ttaaacaggg aactagggtc cgcgggcatc ggcccggcac tcattgggag atcgatttca 7140
ccgagataaa gcccggattg tatggctata aatatcttct agtttttata gatacctttt 7200
ctggctggat agaagccttc ccaaccaaga aagaaaccgc caaggtcgta accaagaagc 7260
tactagagga gatcttcccc aggttcggca tgcctcaggt attgggaact gacaatgggc 7320
ctgccttcgt ctccaaggtg agtcagacag tggccgatct gttggggatt gattggaaat 7380
tacattgtgc atacagaccc caaagctcag gccaggtaga aagaatgaat agaaccatca 7440
aggagacttt aactaaatta acgcttgcaa ctggctctag agactgggtg ctcctactcc 7500
ccttagccct gtaccgagcc cgcaacacgc cgggccccca tggcctcacc ccatatgaga 7560
tcttatatgg ggcacccccg ccccttgtaa acttccctga ccctgacatg acaagagtta 7620
ctaacagccc ctctctccaa gctcacttac aggctctcta cttagtccag cacgaagtct 7680
ggagacctct ggcggcagcc taccaagaac aactggaccg accggtggta cctcaccctt 7740
accgagtcgg cgacacagtg tgggtccgcc gacaccagac taagaaccta gaacctcgct 7800
ggaaaggacc ttacacagtc ctgctgacca cccccaccgc cctcaaagta gacggcatcg 7860
cagcttggat acacgccgcc cacgtgaagg ctgccgaccc cgggggtgga ccatcctcta 7920
gactgacatg gcgcgttcaa cgctctcaaa accccttaaa aataaggtta acccgcgagg 7980
ccccctaatc cccttaattc ttctgatgct cagaggggtc agtaaacgaa ttcggaagtg 8040
aaagggcagc caaaacgtaa caccgccccg gttttccctg gaaattccat attggcacgc 8100
attctattgg ctgagctgcg ttcacgtggg tataagaggc gcgaccagcg tcggtaccgt 8160
cgcagtcttc ggtctgacca ccgtagaacg cagagcggcc gcatgtggct tcaaagtttg 8220
ttgctccttg gaaccgtcgc ttgctctatt agcgcacccg cacgcagccc aagtccttcc 8280
acgcagcctt gggaacatgt taatgcgatc caagaagcac ggcgcctctt gaatctttcc 8340
cgagacacgg cggcagaaat gaatgagaca gttgaagtca tttcagagat gtttgatctc 8400
caagaaccta cttgtttgca gactcgactc gaactttaca agcagggtct ccggggaagt 8460
ttgaccaagc tcaagggtcc ccttacgatg atggcgtccc actacaagca acactgcccc 8520
ccgacaccag aaacgtcatg tgctacccaa atcattacct ttgaatcatt caaggagaac 8580
ctcaaggatt ttctgttggt cataccattc gactgttggg agcccgtgca ggaatgaacg 8640
cgtgaattca taaaataaaa gattttattt agtctccaga aaaagggggg aatgaaagac 8700
cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc atggaaaaat 8760
acataactga gaatagagaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac agctgaatat 8820
gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc aagaacagat 8880
ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca 8940
gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct agagaaccat 9000
cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt tgaactaacc 9060
aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctca ataaaagagc 9120
ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg ggtacccgtg 9180
tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc cttgggaggg 9240
tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt cattgttact taaagttaca 9300
ttggcttcct tgaaataaac atggagtatt cagaatgtgt cataaatatt tctaatttta 9360
agatagtatc tccattggct ttctactttt tcttttattt ttttttgtcc tctgtcttcc 9420
atttgttgtt gttgttgttt gtttgtttgt ttgttggttg gttggttaat ttttttttaa 9480
agatcctaca ctatagttca agctagacta ttagctactc tgtaacccag ggtgaccttg 9540
aagtcatggg tagcctgctg ttttagcctt cccacatcta agattacagg tatgagctat 9600
catttttggt atattgattg attgattgat tgatgtgtgt gtgtgtgatt gtgtttgtgt 9660
gtgtgactgt gaaaatgtgt gtatgggtgt gtgtgaatgt gtgtatgtat gtgtgtgtgt 9720
gagtgtgtgt gtgtgtgtgt gcatgtgtgt gtgtgtgact gtgtctatgt gtatgactgt 9780
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgttgtgaa aaaatattct 9840
atggtagtga gagccaacgc tccggctcag gtgtcaggtt ggtttttgag acagagtctt 9900
tcacttagct tgg 9913

Claims (38)

1.一种具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其包含含有Gag-Pol基因、sEF1α(短延伸因子1α)启动子或MCMV(鼠巨细胞病毒)启动子和第一治疗基因的第一重组表达载体；和含有病毒的Env基因、MCMV启动子和第二治疗基因的第二重组表达载体。
2.根据权利要求1所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述Gag-Pol基因是Gibbon猿白血病病毒(GaLV)或双嗜性鼠白血病病毒(MuLV)的Gag-Pol基因。
3.根据权利要求1所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述MCMV启动子是具有SEQ.ID.NO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸。
4.根据权利要求1所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述MCMV启动子是经切割的MCMV启动子。
5.根据权利要求4所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述经切割的MCMV启动子是选自具有SEQ.ID.NO:4、NO:5、NO:6和NO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸的任一个。
6.根据权利要求1所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述sEF1α启动子是具有SEQ.ID.NO:18所示的核苷酸序列的多核苷酸。
7.根据权利要求1所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述病毒Env基因是源自Gibbon猿白血病病毒(GaLV)、双嗜性鼠白血病病毒(MuLV)、异嗜性鼠白血病病毒(异嗜性MuLV)、猫内源性逆转录病毒(RD114)、水泡性口炎病毒(VSV)和麻疹病毒(MV)Env基因的任一种。
8.根据权利要求7所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述GaLV Env基因是具有SEQ.ID.NO:19所示的核苷酸序列的多核苷酸。
9.根据权利要求7所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述MuLV Env基因是具有SEQ.ID.NO:20所示的核苷酸序列的多核苷酸。
10.根据权利要求1所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述第一治疗基因或所述第二治疗基因是选自自杀基因、细胞因子基因和癌抗原基因的任一种。
11.根据权利要求10所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述自杀基因是胸苷激酶(TK)基因或酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因。
12.根据权利要求11所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述胸苷激酶基因是具有SEQ.ID.NO:21所示的核苷酸序列的多核苷酸。
13.根据权利要求11所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因是具有SEQ.ID.NO:22所示的核苷酸序列的多核苷酸。
14.根据权利要求10所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述细胞因子基因是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
15.根据权利要求14所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是用人密码子优化的。
16.根据权利要求15所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是具有SEQ.ID.NO:65所示的核苷酸序列的多核苷酸。
17.根据权利要求10所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述癌抗原基因是人CD19(分化簇19)、CEA(癌胚抗原)或HER2(人表皮生长因子受体2)。
18.根据权利要求17所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述人CD19基因是具有SEQ.ID.NO:43所示的核苷酸序列的多核苷酸。
19.根据权利要求17所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述人CD19基因是经截短的人CD19(hCD19)基因，其中胞质结构域中的氨基酸被去除。
20.根据权利要求17所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述经截短的人CD19基因是具有SEQ.ID.NO:53所示的核苷酸序列的多核苷酸。
21.根据权利要求12或13所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述胸苷激酶或酵母胞嘧啶脱氨酶基因激活前体药物。
22.根据权利要求21所述的具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体，其中所述前体药物为选自更昔洛韦(GCV)和5-氟胞嘧啶(5-FC)的至少一种。
23.一种包含权利要求1至20中任一项所述的载体的重组逆转录病毒。
24.一种用权利要求23所述的重组逆转录病毒转染的宿主细胞。
25.根据权利要求24所述的用重组逆转录病毒转染的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自NS/O骨髓瘤细胞、人293T细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、HeLa细胞、CapT细胞(人羊水衍生细胞)、COS细胞、犬D17细胞、小鼠NIH/3T3细胞、逆转录病毒包装细胞、人间充质干细胞和猫PG4细胞。
26.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求23所述的重组逆转录病毒作为活性成分。
27.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求24所述的用重组逆转录病毒转染的宿主细胞。
28.根据权利要求26或27的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中所述癌症选自粘液细胞癌、圆细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性癌、尤因肉瘤、癌转移、淋巴样转移、鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、口腔癌、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病、流出物淋巴瘤(腹腔淋巴瘤(celiac lymphoma))、胸腺淋巴瘤肺癌、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肾上腺皮质癌、ACTH-产生肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、小细胞癌、导管癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、结肠直肠肿瘤相关息肉、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、原发性浅表性膀胱肿瘤、膀胱的侵入性膀胱转移性细胞癌、肌肉侵入性膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、原发性腹膜上皮瘤变、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、滤泡性实体瘤、睾丸瘤、阴茎癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、成神经细胞瘤、脑干神经胶质瘤、神经胶质瘤、中枢神经系统中的转移性肿瘤细胞浸润、骨瘤、骨肉瘤、恶性黑素瘤、人皮肤角化细胞的肿瘤进展、鳞状细胞癌、甲状腺癌、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、间皮瘤、维尔姆斯瘤、胆囊癌、滋养层肿瘤、血管周皮细胞瘤和卡波西肉瘤。
29.一种用于治疗癌症的基因递送组合物，其包含权利要求23所述的重组逆转录病毒。
30.一种用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)制备含有MuLV(鼠白血病病毒)的Gag-Pol基因、sEF1α启动子或MCMV启动子和第一治疗基因的第一重组表达载体的步骤；和
2)制备含有病毒的Env基因、MCMV启动子和第二治疗基因的第二重组表达载体的步骤。
31.根据权利要求30所述的用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，其中所述MCMV启动子选自具有SEQ.ID.NO:3、NO:4、NO:5、NO:6和NO:7所示的核苷酸序列的多核苷酸。
32.根据权利要求30所述的用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，其中所述sEF1α启动子是具有SEQ.ID.NO:18所示的核苷酸序列的多核苷酸。
33.根据权利要求30所述的用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，其中所述病毒的Env基因是具有SEQ.ID.NO:19或NO:20所示的核苷酸序列的多核苷酸。
34.根据权利要求30所述的用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，其中所述第一治疗基因是选自胸苷激酶(TK)基因、酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因和人CD19基因的至少一种。
35.根据权利要求30所述的用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，其中所述第二治疗基因是选自胸苷激酶(TK)基因、酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因和人CD19基因的至少一种。
36.根据权利要求34或35所述的用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，其中所述胸苷激酶基因是具有SEQ.ID.NO:21所示的核苷酸序列的多核苷酸。
37.根据权利要求34或35所述的用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，其中所述酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)基因是具有SEQ.ID.NO:22所示的核苷酸序列的多核苷酸。
38.根据权利要求34或35所述的用于制备具有最小化重组发生的复制型逆转录病毒载体的方法，其中所述人CD19基因是具有SEQ.ID.NO:43所示的核苷酸序列的多核苷酸。
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