CN111344395B - 产生经修饰的自然杀伤细胞的方法及使用方法 - Google Patents

产生经修饰的自然杀伤细胞的方法及使用方法

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CN111344395B CN201880071474.1A CN201880071474A CN111344395B CN 111344395 B CN111344395 B CN 111344395B CN 201880071474 A CN201880071474 A CN 201880071474A CN 111344395 B CN111344395 B CN 111344395B
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Abstract

本文中公开了产生包括一或多种异源核酸的NK细胞的方法。所述方法包括在一或多种细胞因子存在下培养分离的NK细胞群体以产生经活化的NK细胞群体。所述经活化的NK细胞群体用包含所述一或多种异源核酸的病毒载体转导，例如通过使所述经活化的NK细胞与包括所述病毒载体的病毒粒子接触。然后在一或多种细胞因子存在下，且可选地在经辐射的饲养细胞存在下培养所得的经转导的NK细胞，以产生扩增的经转导的NK细胞群体。还公开了通过向患病(诸如肿瘤或过度增生性病症)的对象施用由本文所述的方法产生的NK细胞来治疗所述对象的方法。

Description

产生经修饰的自然杀伤细胞的方法及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月1日提交的美国临时申请号15/801,085的权益，该临时申请是2017年7月25日提交的国际申请PCT/US2017/043774的部分继续申请，其要求2016年7月25日提交的美国临时申请号62/366,493的权益，上述申请的全文以引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及产生经修饰的自然杀伤细胞的方法、包含所述经修饰的自然杀伤细胞的组合物及其使用方法。
背景技术
除抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞以外，先天免疫系统的细胞组分可有助于对恶性细胞生长的免疫监督。具体来说，自然杀伤(NK)细胞可消除异常细胞，而不致敏(priming)或敏化。通过平衡来自抑制性和活化NK细胞受体的信号来确定其活性。抑制性受体，诸如杀伤免疫球蛋白受体(KIR)与自身的主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原相互作用并且保护正常细胞免受NK细胞攻击。
二十多年以来，已研究致力于利用NK细胞的抗肿瘤活性来进行对人类癌症的免疫疗法。然而，许多恶性细胞表达MHC I类抗原且因此自然地对自体NK细胞的溶解产生抗性。因此，使用过继转移自体NK细胞的首次临床试验并未产生显著的治疗效果。调节NK细胞的细胞因子、趋化因子和活化/抑制性受体表达是一种具有吸引力的用于增强NK细胞抗肿瘤活性的策略。然而，难以实现对原代NK细胞的有效遗传修饰。
发明内容
需要简单且有效的基因转移方法来有效地传递和在原代NK细胞中表达感兴趣的基因。本文中公开有效的基于病毒载体的方法用于基因转移至NK细胞中，所述方法展现出对转基因的稳定且稳健的长期表达。
本文中公开产生包括或表达一或多种异源核酸的NK细胞(本文在一些实例中称为“经修饰的”NK细胞)的方法。所述方法包括在一或多种细胞因子(例如白细胞介素(IL)-2、IL-15和/或IL-21)的存在下，可选地在饲养细胞的存在下，培养分离的NK细胞(诸如从对象分离或纯化的NK细胞)群体以产生经活化的NK细胞群体。在一些实例中，在IL-2的存在下培养分离的NK细胞群体以产生经活化的NK细胞群体。在具体实例中，在IL-2的存在下并且不添加其他细胞因子来培养分离的NK细胞群体以产生经活化的NK细胞群体。所述经活化的NK细胞群体由包括所述一或多种异源核酸的病毒载体转导，例如通过使所述经活化NK细胞与包括所述病毒载体的病毒粒子接触。然后在一或多种细胞因子(例如IL-2，以及在一些实例中，IL-2并且不添加其他细胞因子)的存在下，且可选地在饲养细胞的存在下，培养得到的经转导的NK细胞以产生经扩增的经转导的NK细胞群体。
本文中还公开用所述经修饰的NK细胞治疗患病(诸如肿瘤或过度增生性病症或病毒性感染)对象的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从对象或供体获得分离的NK细胞群体并且在一或多种细胞因子(例如IL-2、IL-15和/或IL-21)的存在下，以及可选地在饲养细胞的存在下，培养所述分离的NK细胞群体以产生经活化的NK细胞群体。在一些实例中，在IL-2的存在下培养分离的NK细胞群体以产生经活化的NK细胞群体。在具体实例中，在IL-2的存在下并且不添加其他细胞因子而培养分离的NK细胞群体以产生经活化的NK细胞群体。所述经活化的NK细胞群体由适于治疗对象病症的包括一或多种异源核酸的病毒载体转导，例如通过使经活化的NK细胞与包括所述病毒载体的病毒粒子接触。然后在一或多种细胞因子(例如IL-2，以及在一些实例中，IL-2并且不添加其他细胞因子)的存在下，且可选地在饲养细胞的存在下，培养得到的经转导的NK细胞以产生经扩增的经转导的NK细胞群体，将其施用于对象(例如在包括药学上可接受的载体的组合物中)。
本文中还公开包括一或多种异源核酸的经修饰的NK细胞(诸如经修饰的NK细胞群体)，诸如由包括一或多种感兴趣的核酸的病毒载体(诸如慢病毒载体)转导的NK细胞。在一些实例中，所述异源核酸编码CD34、CD4、CD19、CXCR4、CCR7、CXCR3或CD16(例如高亲和性CD16或CD16-V158)。其它感兴趣的核酸显示在下文表1中。还公开包括经修饰的NK细胞(诸如经修饰的NK细胞群体)和药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，通过本文中公开的方法产生所述经修饰的NK细胞。
本公开的前述和其它特征根据下文参照附图进行的详细描述而将更清楚。
附图说明
图1A和1B是说明一种可用于所述公开方法(图1A)的示例性三质粒慢病毒载体系统和用于产生可用于转导靶细胞的非复制性慢病毒的示例性方法(图1B)的示意图。
图2是说明一种用于产生经扩增的经转导的NK细胞群体的示例性方法的示意图。
图3是显示增强型绿色荧光蛋白(eGFP)表达在转导之前在培养基中培养且以IL-2(500IU/ml)致敏的CD56+NK细胞中(条件1)或在转导之前在经辐射的类淋巴母细胞(LCL)细胞上培养且以白细胞介素-2(IL-2；500IU/ml)致敏的CD56+NK细胞中(条件2)的表达的一系列图。转导七天后，通过荧光激活细胞分拣法(FACS)进行分析。
图4是显示在转导之前在含有IL-2(500IU/ml)的培养基中培养指定天数的CD56+NK细胞中的转导效率的图表。转导两天后，除去病毒粒子并加入经辐射的LCL连同500IU/mlIL-2(LCL:NK比为10:1)。转导七天后，通过FACS分析eGFP表达。
图5A和5B是显示在转导之前以500IU/ml IL-2致敏三天的NK细胞中，在转导之后的转基因表达持久性(图5A)和细胞活力(图5B)的图表。
图6是显示在转导之前，在含有500IU/ml IL-2的培养基中在经辐射的LCL上培养指定天数的CD56+NK细胞中的转导效率的图表。转导两天后，除去病毒粒子并将细胞保持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。在转导七天后，通过FACS分析eGFP表达。
图7是显示转导后指定天数时，经转导的NK细胞中的eGFP表达持久性(上方)和细胞活力(下方)的一系列图表。在转导之前，将细胞在含有500IU/ml IL-2和经辐射的饲养细胞的培养基中培养0、3或7天。通过FACS分析eGFP表达并由锥虫蓝测定细胞活力。
图8A和8B是显示在转导之前以经辐射的LCL和500IU/ml IL-2扩增14天的来自三个对象的原代外周血NK细胞(NK-1、NK-2、NK-3)的转导效率的一系列图。图8A显示转导七天后，对每个细胞系的FACS分析。图8B是量化CD56+eGFP+NK细胞在转导后指定天数时的百分比的图表。
图9是显示在转导之前以500IU/ml IL-2(上排)、1000IU/ml IL-2(第二排)、10ng/ml IL-15(第三排)或500IU/ml IL-2加10ng/ml IL-15(下排)致敏三天的NK细胞中的eGFP表达的一系列图。转导两天后，除去病毒粒子并将细胞保留在具有500IU/ml IL-2的经辐射LCL(10:1LCL:NK)上。转导两周后，通过FACS分析eGFP表达。
图10是显示在转导之前用指定处理处理三天，在转导后指定天数时的转基因表达持久性的图表。
图11是显示指定受体在转导前以500IU/ml IL(上图)或500IU/ml IL-2加10ng/mlIL-15(下图)致敏三天的NK细胞上的表达的一系列图。转导两天后，除去病毒粒子并加入经辐射的LCL(10:1LCL:NK细胞)且将细胞保持在具有500IU/ml IL-2的培养基中。转导两周后，通过FACS进行分析。开放迹线，IsoAb；填充迹线，Ag-特异性Ab。
图12是显示指定受体在转导前以500IU/ml IL(上图)或500IU/ml IL-2加10ng/mlIL-15(下图)致敏三天的NK细胞上的表达的一系列图。转导两天后，除去病毒粒子并加入经辐射的LCL(10:1LCL:NK细胞)且将细胞保持在具有500IU/ml IL-2的培养基中。转导两周后，通过FACS进行分析。
图13是显示K562细胞(上图)或MOLM14细胞(下图)在转导前以指定条件致敏三天的NK细胞中的肿瘤细胞溶解的一系列图表。将细胞以经辐射的LCL扩增14天，之后通过51Cr释放测定来测试其肿瘤杀伤能力。
图14是显示表达GFP的NK细胞(圆形)和细胞活力(方形)相对于转导前的细胞因子刺激(500IU/ml IL-2)天数的分数的图表。在转导前，通过2-3天的细胞因子刺激实现转基因表达与活力的平衡(框图区域)。
图15是显示表达GFP的NK细胞在转导前以指定细胞因子处理的NK细胞中的分数的图表。单独的IL-2和IL-2与IL-15和/或IL-21的组合之间无显著差异。
图16A和16B是显示转导试剂对转导效率(图16A)和NK细胞扩增(图16B)的影响的图表。
图17是显示在指定启动子控制下用GFP以5、20或100的MOI转导的NK细胞的转导效率的图表。
图18是显示与第0天的表达(100％)相比，在转导后第7天和第14天，在指定启动子控制下用GFP转导的NK细胞中的GFP表达的倍数变化的图表。
图19是显示在与K562细胞接触扩增14天后，在指定启动子控制下用GFP转导的NK细胞或模拟(mock)转导细胞的活性(脱粒％)的图表。P/I表示用PMA/离子霉素进行处理来显示最大脱粒能力。
图20是显示在与K562细胞接触扩增14天后，与未经转导的细胞相比，在指定启动子控制下用GFP转导的NK细胞的活性的图表。P/I表示用PMA/离子霉素处理显示最大脱粒能力。
图21A和21B是用于表达CXCR4的慢病毒载体(图21A)或用于表达CD34t和CXCR4的慢病毒载体(图21B)的示意图。
图22A和22B是显示在用编码CXCR4的慢病毒载体(图22A)或编码CD34t和CXCR4的慢病毒载体(图221B)转导的NK细胞中的CXCR4和CD34表达的曲线图。
图23是显示在LCL饲养细胞存在或不存在下活化、继而病毒转导和在LCL饲养细胞存在或不存在下扩增的NK细胞的倍数扩增的图表。
图24A和24B显示在用pLV[Exp]-PGK>EGFP转导之前，如所示用500U/ml IL-2将来自PBMC的NK细胞培养0至5天的结果。转导后三天，通过流式细胞术测定细胞的GFP表达和活力。图24A显示了GFP+NK细胞的典型门控。图24B显示了来自3个供体的实验的平均值和SEM(几何平均荧光强度(GMFI)GFP的log10转换值)。*表示单向ANOVA后通过Dunnett多重比较，与未经IL-2刺激的细胞(第0天)相比，p<0.05。(图24B中所示的％膜联蛋白–PI–细胞在门控CD56+CD3-细胞上制表)。
图25A-25D是显示用IL-2刺激三天、继而用具有所示启动子和GFP的慢病毒载体转导的人NK细胞中GFP表达的图表。将经辐射的SMI-LCL饲养细胞添加到经转导的NK细胞中，再共培养14天(共20天)。转导后三天，通过流式细胞术检查NK细胞(图25A)并计算转导效率(图25B)和转基因表达水平(图25C)。通过将第6天EGFP％除以第20天EGFP％来量化NK细胞中转基因表达随时间的稳定性并表示为百分比(图25D)。分别显示了来自4个供体的实验的平均值和SEM(GMFI的log10转换值)。*表示在单向ANOVA后，通过Dunnett多重比较，与先前使用的含PGK启动子的载体相比，p<0.05。
图26A和26B显示插入序列的排列对转导效率的作用。来自PBMC的NK细胞用IL-2刺激三天，继而用含有所示插入序列的慢病毒载体转导，所述插入序列编码PGK启动子、GFP、P2A-接头、IRES、截短型CD34蛋白和密码子优化的截短型CD34蛋白(CD34opt)的组合。再过3天后，通过流式细胞术测量NK细胞的GFP和CD34的表面表达(图26A)。显示了来自3个供体的实验的平均值和SEM。*表示在单向ANOVA后，通过Tukey多重比较检验，所选比较的p<0.05。比较含有原始的和密码子优化的截短型CD34的构建体的典型染色(图26B)。
图27A-27D显示了在慢病毒转导之前在饲养细胞存在下NK细胞的预刺激作用。用IL-2或IL-2+SMI-LCL饲养细胞刺激来自PBMC的NK细胞3天。在用20：1MOI的pLV-EFS-GFP-2A-CD34opt病毒粒子转导之前，用抗CD56珠从共培养物中取出NK细胞。再过3天后，将SMI-LCL添加到两种条件中并培养NK细胞直到实验开始的第21天。通过流式细胞术检查NK细胞的GFP和CD34转基因表达(图27A)。显示了来自4个供体的实验的平均值和SEM。在整个培养中频繁计数NK细胞数，并计算倍数扩增(图27B)。与来自相同供体的未转导的NK细胞(其仅在第0天接受了SMI-LCL)的对照扩增相比，显示了平均值和SEM(log10转化值)。通过将每种条件下所有细胞的倍数扩增乘以GFP+CD34+分数，计算出相对于输入的转导细胞的总体产率(图27C)。显示了平均值和SEM(log10转换值)。进行类似的实验以确定在转导(pLV-EFS-GFP-2A-CD34opt以20:1的MOI)之前用SMI-LCL刺激的最佳时期(2-7天)(图27D)。对于来自3个供体的实验确定了相对于输入的经转导细胞的百分比、细胞的倍数扩增和经转导细胞的总体产率。
图28A和28B显示了在用LCL细胞预刺激的NK细胞的转导过程中包括BX795的作用。用SMI-LCL饲养细胞加IL-2刺激来自PBMC的NK细胞5天。在存在如所示的不同剂量的BX795的情况下，在用pLV-EFS-GFP-2A-CD34opt病毒粒子转导之前，用抗CD56珠从共培养物中取出NK细胞。一天后，将NK细胞交换入不含BX795的培养基。再过两天后，再次添加SMI-LCL并培养NK细胞直到实验开始的第21天，始终监控细胞数量。通过流式细胞术测定NK细胞的GFP和CD34表达(图28A)。通过将细胞的倍数扩增乘以GFP+CD34+细胞的分数，计算出相对于输入细胞的经转导细胞的总体产率。显示了来自三个供体的实验的平均值和SEM(倍数扩增的log10转换值)。*表示在单向ANOVA后，通过Dunnett多重比较检验，与缺乏药物的情况相比p<0.05。进行类似的实验以比较用IL-2或IL-2+SMI-LCL饲养细胞刺激5天，然后在添加或不添加1.5μM BX795的情况下转导的细胞(图28B)。相对于输入细胞的转导细胞的总体产率如上所述制表。
图29A和29B显示了来自优化的SMI-LCL方案的CD34opt、CD19和CD4的慢病毒表达。通过抗CD3 MACS磁珠耗竭，然后进行抗CD56 MACS磁珠阳性选择从PBMC中分离NK细胞。用SMI-LCL加IL-2刺激细胞4-5天。产生的细胞如所示在1.5μM BX795存在下，用编码密码子优化的截短型CD34、截短型CD19或截短型CD4的慢病毒载体转导。1天后，将细胞换入不含BX795的培养基。再过两天后，使用识别CD34、CD19或CD4的MACS珠选择经转导的NK细胞。阳性选择的NK细胞用SMI-LCL培养，然后细胞增殖直至实验开始后第21天。在MACS珠选择之前和之后，GFP和转基因表达的流式细胞术评估(图29A)。贯穿整个过程监控细胞数量并通过将细胞的倍数扩增乘以GFP和转基因表达均为阳性的分数来计算相对于输入细胞的经转导细胞的总体产率(图29B)。显示了来自3个供体的实验的平均值和SEM(log10转换值)。
图30显示了如图29A和29B中转导和扩增的NK细胞的脱粒(左上和左下)和IFN-γ(中上和中下)和TNF-α(右上和右下)产生。基于来自相同供体的、用SMI-LCL扩增的、未转导的NK细胞对照的测量值，将百分比归一化。
序列表
如37C.F.R.§1.822中定义，使用关于核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写来显示本文中或随附序列表中所列举的任意核酸和氨基酸序列。在至少一些情形下，只显示每个核酸序列的一条链，而应理解任何提及所示链时均包括互补链。
SEQ ID NO：1和2分别是示例性的CXCR4核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：3和4分别是示例性的截短型CD34核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：5和6分别是示例性的高亲和性CD16核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是示例性的密码子优化的高亲和性CD16核酸。
SEQ ID NO：8是示例性的慢病毒表达载体，其包括人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子和EGFP。
SEQ ID NO：9是示例性的慢病毒表达载体，其包括人真核翻译延伸因子1α(EF1A)启动子和EGFP。
SEQ ID NO：10是示例性的慢病毒表达载体，其包括短版人EF1A启动子(EFS)和EGFP。
SEQ ID NO：11是示例性的慢病毒表达载体，其包括与鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子和EGFP融合的人CMV早期增强子。
SEQ ID NO：12是示例性的慢病毒表达载体，其包括短版CAG启动子和EGFP。
SEQ ID NO：13是示例性的慢病毒表达载体，其包括猿猴SV40早期启动子和EGFP。
SEQ ID NO：14是示例性的慢病毒表达载体，其包括小鼠磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子和EGFP。
SEQ ID NO：15是示例性的慢病毒表达载体，其包括人遍在蛋白C启动子和EGFP。
SEQ ID NO：16是示例性的慢病毒表达载体，其包括小鼠PGK启动子和人CXCR4。
SEQ ID NO：17是示例性的慢病毒表达载体，其包括小鼠PGK启动子和截短型人CD34、T2A肽和人CXCR4。
SEQ ID NO：18是示例性的慢病毒表达载体，其包括短版人EF1A启动子、EGFP和截短型人CD4。
SEQ ID NO：19是示例性的慢病毒表达载体，其包括短版人EF1A启动子、EGFP和截短型人CD19。
具体实施方案
本文中公开用于在NK细胞中有效且稳定地表达转基因的方法。所述方法包括一种有效的基于病毒载体的方法用于基因转移至NK细胞中并且证明转基因的稳定且长期稳健表达。进入被转导的原代细胞中的高基因转移率以及产生高效价的病毒粒子以供大规模转导患者细胞的能力是临床试验的重要标准。诸如本文实施例中使用的那些慢病毒载体可高效价产生并浓缩，而不损害其转导效率。另外，目前所述的方法对于临床应用而言更廉价而且更简单，因为它并不要求需要在目前的逆转录病毒载体介导的基因转移方案中采用若干复杂且昂贵的步骤来获得适度的转导效率，诸如使用可能对被转导的原代NK细胞的活力具有显著有害影响的纤维连接蛋白(retronectin)、离心方法(spinoculation)以及重复/多重转导。另外，可使用在《药品生产质量管理规范》(GMP)条件下有效离体扩增NK细胞的方法用于基于过继性NK细胞的免疫疗法应用。本发明的高度有效的基于慢病毒载体的基因转移方法可用于补充多种目前的离体NK细胞扩增方法以产生大量遗传重编程的NK细胞，可能通过增强其在癌症或病毒性感染患者体内的抗肿瘤功效来变革基于NK细胞的免疫治疗方法。
所述公开的方法对于人类原代NK细胞的慢病毒载体介导的遗传操作而言具有优于其它方法的几种优势。本发明的基于慢病毒载体的方法产生一种有效、稳健且高度可重复的方法用于基因稳定转移至源自原代人类外周血的NK细胞中。这与缺少细胞分裂/长期培养的游离型载体、抑制核功能且最终引起宿主细胞溶解的痘病毒载体以及诸如仅允许瞬时表达引入基因的电穿孔法等的其它非病毒介导的基因传递方法形成对比。此外，与优先在接近转录起始位点处整合并且可能通过来自长末端重复序列(LTR)的启动子活化作用来活化癌基因的γ逆转录病毒载体不同，慢病毒载体优先在高表达的基因中整合。此外，所述公开的方法中使用的慢病毒载体具有改进的安全特征，诸如断裂基因组慢病毒包装设计和，并且通过在3'LTR中缺失而具有转移载体的自失活设计，由此减小启动子活化的可能性。
通过本文中公开的方法获得的经转导的原代NK细胞在表型和功能方面正常，并且因此允许多种基因疗法和免疫疗法应用。重要的是，目前的这种转导方法简单并且涉及用一或多种细胞因子体外培养NK细胞，接着暴露于浓缩的病毒粒子。转导之后，通过将细胞与受照射的饲养细胞在含有一或多种细胞因子的培养基中共同培养来大量扩增细胞。
I.缩写
CAR 嵌合抗原受体
EBV-LCL EB病毒(Epstein-Barr virus)转化的类淋巴母细胞细胞系
eGFP 增强型绿色荧光蛋白
FACS 荧光激活细胞分拣法
GMP 药品生产质量管理规范
IL 白细胞介素
LTR 长末端重复序列
MOI 感染复数
NK 自然杀伤细胞
PBMC 外周血单核细胞
shRNA 短发夹状RNA
II.术语
除非另外说明，根据传统用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于Lewin’s Genes X，编者Krebs等人,Jones and Bartlett Publishers,2009(ISBN0763766321)；Kendrew等人(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,由BlackwellPublisher出版,1994(ISBN 0632021829)；Robert A.Meyers(编),Molecular Biology andBiotechnology：a Comprehensive Desk Reference,由Wiley,John&Sons,Inc.出版,1995(ISBN0471186341)；以及George P.Rédei,Encyclopedic Dictionary of Genetics,Genomics,Proteomics and Informatics,第3版,Springer,2008(ISBN：1402067534)以及其它类似参考文献。
除非另外解释，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域一般技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文中另外明确表示，否则单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数的提及物。类似地，除非上下文中另外明确表示，否则词汇“或”意图包括“和”。因此，“包含A或B”意思是包括A、或B、或A和B。还应了解，对于核酸或多肽给定的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并且提供这些值用于描述。
尽管与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料均可用于实践或测试本发明，但在下文中描述合适的方法和材料。本文中提到的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入。在矛盾的情况下，以本说明书包括对于术语的解释为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的，并不意图是限制性的。
为了便于阅读本发明的各个实施方案，提供对具体术语的以下解释：
癌症：本文中也称为“恶性肿瘤”或“恶性赘生物”。具有以下特征的任意多种疾病：失控、异常的细胞增生，癌细胞可能局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部分(例如转移)以及任意多种特征性的结构和/或分子特征。“癌细胞”是具有特定结构性质、缺少分化并且能侵入和转移的细胞。
CD34：一种充当细胞-细胞粘附分子的细胞表面糖蛋白。CD34是一种具有高度糖基化胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的单向跨膜蛋白质。CD34在造血细胞上表达并且在细胞迁移中发挥作用。示例性的人类CD34序列包括GenBank登录号NM_001025109和NM_001773(核酸序列)以及NP_001020280和NP_001764(氨基酸序列)，其全部如同在2017年7月25日在GenBank存在般以引用的方式并入本文。
接触：以直接物理相关(association)的方式放置，包括固体和液体形式。在一种实例中，接触包括液体介质中的物质(诸如细胞因子)与一或多种细胞(诸如培养物中的NK细胞)之间的相关。可在体外与分离的细胞或组织发生接触或通过施用于对象在体内发生接触。
培养或细胞培养物：细胞群体在限定的条件集合下(诸如培养基、胞外基质、温度和/或培养时间)体外生长。在一些实例中，细胞培养物包括基本上纯的培养物(例如分离的NK细胞)。在其它实例中，细胞培养物包括混合培养物，诸如两种或更多种类型的细胞的共同培养物(例如NK细胞与饲养细胞的培养物)。在其它实例中，细胞培养物包括与胞外基质接触生长的细胞。
培养基：具有对于支持特定细胞(诸如NK细胞)群体的活力、功能和/或生长而言所必需的营养成分的合成的培养条件集合。培养基通常包括诸如碳源、氮源和维持pH的缓冲剂的组分。培养基中的其它组分还可包括以下的一或多种：血清(诸如热灭活血清)、细胞因子、激素、生长因子、蛋白酶抑制剂、蛋白水解物、剪切力保护剂、蛋白质、维生素、谷氨酰胺、微量元素、无机盐、矿物质、脂质和/或贴附因子(attachment factor)。
细胞因子：由影响其它细胞(诸如淋巴细胞)行为的细胞产生的蛋白质。在一个实施方案中，细胞因子是趋化因子，一种影响细胞运输的分子。术语“细胞因子”用作多种可溶性蛋白质和肽的通用名称，其在纳摩尔至皮摩尔浓度充当体液调节剂并且在正常或病理条件下均调节个别细胞和组织的功能活性。这些蛋白质还直接介导细胞之间的相互作用并调节发生在胞外环境中的过程。细胞因子的实例包括但不限于肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-21(IL-21)以及干扰素-γ(IFN-γ)。
有效量：规定药剂(例如在受所述药剂治疗的对象中)足以实现所需效果的量。在一些实例中，本文中公开的经修饰的NK细胞的有效量是在对象中足以治疗或抑制疾病或病症(诸如肿瘤、过度增生性病症或病毒性感染)的量。在其它实例中，有效量是经修饰的NK细胞的足以减轻或缓解对象的一或多种疾病或病症症状的量。有效量(例如缓解、抑制和/或治疗对象的病症的量)将取决于例如接受治疗的具体病症、接受治疗的对象、组合物的施用方式以及其它因素。
表达：基因的编码信息转化为细胞的操作性部分、非操作性部分或结构部分的过程，诸如蛋白质的合成。基因表达可受外部信号影响。例如，细胞暴露于激素可刺激激素诱导的基因的表达。不同类型的细胞对相同信号的反应可不同。也可在DNA至RNA至蛋白质途径中任意处调节基因的表达。调节可包括控制转录、翻译、RNA运输和加工，降解中间分子(诸如mRNA)或通过在产生特定蛋白质分子后对其进行活化、失活、区室化或降解。
饲养细胞：在离体或体外培养物中为另一种细胞类型提供支持的细胞。饲养细胞可为和饲养细胞培养的细胞提供其存活、生长和/或分化(或抑制分化)所需要的一或多种因子。饲养细胞通常经过辐射或以其它方式被处理来防止其在培养物中增殖。在本文公开的一些实例中，用饲养细胞诸如经辐射的EBV转化淋巴母细胞(例如EBV-LCL细胞)来培养NK细胞。
过度增生性疾病：细胞增殖比正常组织生长更快速的疾病或病症。因此，过度增殖的细胞是比正常细胞更快速增殖的细胞。在一些实例中，过度增生性病症包括恶性肿瘤或癌症，但也可包括良性肿瘤。
抑制或治疗病况：“抑制”病况指的是抑制病况或疾病(例如肿瘤)的全面发展。抑制病况可涵盖对疾病的部分抑制至基本上完全抑制的范围(例如包括但不限于预防)。在一些实例中，术语“抑制”指的是减轻或延迟病况的发作或进展。“治疗”指的是在疾病或病况开始发展后缓解其迹象或症状的治疗性干预。待被施用以有效量的所公开的NK细胞的对象可通过标准诊断技术来确认某种病症，例如存在所述疾病或病症或存在发生所述疾病或病症的风险因素。
分离：“分离”或“纯化”的生物学组分(诸如细胞、核酸、肽、蛋白质、蛋白质复合物或病毒样粒子)已基本上与其它组分(例如所述组分自然存在的细胞或生物体中的其它生物学组分)分离，或基本上产生不含所述其它组分，或基本上经纯化不含所述其它组分。经过“分离”或“纯化”的细胞、核酸、肽和蛋白质因此包括通过标准纯化方法纯化的细胞、核酸和蛋白质。
术语“分离”或“纯化”并未要求绝对纯度；相反，它预期作为一个相对术语。因此，例如分离的生物学组分是生物学组分在细胞、有机体、样品或生产容器(例如细胞培养系统)中比生物学组分在其天然环境中更富集的一种生物学组分。优选地，一种制剂经过纯化以便生物学组分占到所述制剂全部生物学组分含量的至少50％，诸如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高。
自然杀伤(NK)细胞：在不存在特异性抗原刺激而且不受MHC类别限制的情况下杀伤靶细胞的免疫系统细胞。靶细胞可为肿瘤细胞或携带病毒的细胞。NK细胞的特征在于存在CD56且不存在CD3表面标记。NK细胞通常在正常外周血中包含约10％至15％的单个核细胞部分。历史上，NK细胞首先因其在无需先前免疫或活化的情况下溶解某些肿瘤细胞的能力而被识别。NK细胞被认为通过下调MHC I类呈递来提供针对可能逃脱CTL应答的病毒和肿瘤的一种“备份型”保护机制。除了涉及直接细胞毒性杀伤以外，NK细胞在细胞因子产生中也发挥作用，这对于控制癌症和感染可能是重要的。
在一些实例中，“经修饰的NK细胞”是由异源核酸(诸如本文公开的一或多种核酸或载体)转导或表达一或多种异源蛋白质的NK细胞。术语“经修饰的NK细胞”和“经转导的NK细胞”在本文的一些实例中可互换使用。
药学上可接受的载体：适用于本发明中的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington：The Science and Practice of Pharmacy,The University of theSciences in Philadelphia,编者Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,第21版(2005)描述适用于药物递送一或多种治疗性组合物(诸如一或多种经修饰的NK细胞和/或其它药物制剂)的组合物和配制物。
一般来说，载体的性质将取决于采用的具体施用模式。例如，肠胃外配制物通常包含包括药学上和生理学上可接受的流体(诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等等)作为媒介物的可注射流体。对于固体组合物(例如粉剂、药丸、片剂或胶囊形式)而言，常规的无毒固体载体可包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体以外，待施用的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂以及pH缓冲剂等等，例如醋酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。
对象：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人类和非人类哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、兔、绵羊、马、奶牛以及非人灵长动物)的一类。
转导：将核酸转移至细胞中，诸如将异源核酸转移至宿主细胞中。如本文所用，术语转导(或转染或转化)包括将核酸引入细胞中的所有技术，包括但不限于用质粒载体转化、用病毒载体或病毒粒子感染以及通过电穿孔、核转染、脂转染或离子枪加速引入裸DNA。
转基因：例如通过转导引入细胞中的异源核酸。在一些实例中，转基因是编码感兴趣蛋白质的核酸。在其它实例中，转基因是能够调节感兴趣核酸的表达的核酸，诸如短发夹状RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或反义核酸。转基因可操作地连接至一或多种表达控制序列，例如启动子。
“异源”核酸或蛋白质指的是来源于不同遗传学来源的核酸或蛋白质。例如，与一种细胞异源的核酸或蛋白质来源于除其表达的所述细胞以外的生物体或个体。在其它实例中，异源核酸或蛋白质来源于除其表达的所述细胞以外的细胞类型(例如在NK细胞中正常不存在的核酸或蛋白质对NK细胞是异源的)。在其它实例中，异源核酸包括重组核酸，诸如与来自另一基因的启动子可操作地连接的蛋白质编码核酸和/或来自不同来源的两种或更多种可操作地连接的核酸。
载体：允许将外来或异源核酸插入细胞中而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列(诸如复制起点)。载体还可包括一或多种选择性标记基因和其它遗传元件。表达载体是含有允许插入的一或多个基因转录和/或翻译所必需的调节序列的载体。在一些非限制性实例中，载体是病毒载体，诸如逆转录病毒载体或慢病毒载体。
II.产生经修饰的NK细胞的方法
本文中公开产生经修饰的NK细胞(诸如包括或表达一或多种异源核酸或包括含有一或多种异源核酸的病毒载体的全部或一部分的NK细胞)的方法。在具体实例中，使用本文公开的方法来转导静止或短期经活化的NK细胞(而非NK细胞系或扩增的NK细胞)，所述静止或短期经活化的NK细胞先前用病毒载体进行了高效转导攻击。
在一些实施方案中，公开的方法利用慢病毒系统将一或多种异源核酸(“转基因”)引入NK细胞中。用于产生供转导的病毒的慢病毒系统通常在多个质粒间分散以增加其安全性。示例性的慢病毒系统包括具有三个质粒的“第二代”系统或具有四个质粒的“第三代”系统。图1A中说明一种示例性的三质粒系统。转基因核酸包括在转移质粒中并且可操作地连接至启动子(在一个非限制性的实例中为hPGK启动子)。转移质粒还包括5’和3’LTR并且可包括其它元件，诸如psi包装系统。用于产生病毒粒子的慢病毒蛋白质(诸如env、gag、pol、rev和/或tat)由两个或三个单独的质粒来编码。示例性的转移载体也显示在图21A和21B中。慢病毒质粒(三个或四个质粒)在哺乳动物细胞系中转染，产生无法复制的慢病毒粒子。慢病毒粒子然后用来转导其它细胞(诸如NK细胞)。一种产生用于本文公开的方法中的慢病毒(诸如非复制性慢病毒)的示例性方法示于图1B。
在一些实施方案中，本文中公开利用病毒载体转导产生经修饰的NK细胞的方法。图2中示出一种示例性方法的概览。在一些实例中，所述方法包括获得或制备经纯化的NK细胞并且通过将所述经纯化的NK细胞在包括一或多种细胞因子(诸如IL-2、IL-15和/或IL-21)的培养基中培养1-14天来活化(或“致敏”)所述NK细胞。例如，通过将经活化的NK细胞用病毒载体(例如包括病毒载体的病毒粒子)保温1-3天，用包括一或多种异源核酸的病毒载体(诸如慢病毒载体)来转导所述经活化的NK细胞。然后将经转导的NK细胞例如通过用一或多种细胞因子(诸如IL-2)和/或在饲养细胞存在下进行培养来扩增1-50天(或更长)，以产生扩增的经修饰的NK细胞。在一些实例中，由包括编码缺少胞内信号传导结构域的截短型CD34蛋白质(CD34t)的核酸(例如与另一种感兴趣核酸可操作连接的CD34t核酸)的病毒载体转导经活化的NK细胞。CD34t蛋白质包括CD34的胞外和跨膜区域，且因此在细胞表面上表达，但不影响表达截短型蛋白质的细胞的活性(Norell等人,CancerImmunol.Immunother.59:851-862,2010)。为了富集经转导的细胞，可用抗CD34抗体来识别表达CD34t的细胞(例如经转导的细胞)，并且可使用流式细胞术或免疫磁性方法来分离。在其他实例中，用包括编码CD4或CD19蛋白(或截短型CD4或CD19蛋白，例如缺少胞内结构域)的核酸的病毒载体转导经活化的NK细胞。为了富集经转导的细胞，可用抗CD4或抗CD19抗体来识别表达CD4或CD19的细胞，并且可使用流式细胞术或免疫磁性方法来分离。下文中更详细地论述用于产生经修饰的NK细胞的方法。
在所公开方法的具体实施方案中，在扩增之前和/或在不存在饲养细胞的情况下对经纯化或分离的NK细胞进行转导。通过在扩增之前转导NK细胞，与转导经扩增的NK细胞时相比可减少所需要的病毒粒子的量(诸如使病毒粒子的量减少至少约10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、5000倍或10,000倍)。另外，在一些实例中，在扩增之前转导NK细胞更简单和/或需要更少的劳动、成本和/或时间。在一些实例中，发明人观察到，当NK细胞在饲养细胞层存在下与病毒粒子接触时，病毒优先转导饲养细胞，而非NK细胞。此外，在一些实例中，转基因对于饲养细胞可具有毒性，并且可能负面影响NK细胞扩增。因此，在一些非限制性实例中，当不存在饲养细胞时，NK细胞被更有效地转导。
在其他实施方案中，在饲养细胞(例如经辐射的饲养细胞)的存在下，NK细胞被活化、转导和/或扩增。在一些实例中，如本文所述在饲养细胞(例如至少1:1的比例(饲养细胞:NK细胞)，例如至少2:1、5:1、10:1、15:1、20:1或更多)的存在下，在转导之前(例如1-5天，例如1、2、3、4或5天)活化NK细胞。然后仍然在饲养细胞存在下转导并培养NK细胞1-5天(例如1、2、3、4或5天，例如3天)。然后将NK细胞用饲养细胞(例如饲养细胞：NK细胞的比例至少为2:1、5:1、10:1、15:1、20:1)重新铺板以进行扩增。在一个非限制性实例中，分离NK细胞并将用饲养细胞以10:1饲养细胞:NK细胞比例铺板。在转导之前，先用IL-2将NK细胞活化2-3天。转导后三天，将NK细胞用10:1饲养细胞:NK细胞重新铺板并继续在IL-2的存在下进行培养以扩增。
在其他实施方案中，NK细胞在饲养细胞的存在下被活化。在转导经活化的NK细胞之前，充分地去除饲养细胞(例如使用对CD19或CD56的免疫磁性选择)。转导后，NK细胞在饲养细胞的存在下扩增。在一些实例中，如本文所述在饲养细胞(例如至少1:1的比例(饲养细胞:NK细胞)，例如至少2:1、5:1、10:1、15:1、20:1或更多)的存在下，在转导之前(例如1-5天，例如1、2、3、4或5天)活化NK细胞。然后在转导之前将饲养细胞与经活化的NK细胞分离。在一些实例中，使用对饲养细胞特异的细胞表面蛋白(例如用于LCL饲养细胞的CD19)的免疫磁性耗竭来去除饲养细胞。或者，可以使用NK细胞表面特异性蛋白例如CD56，将饲养细胞与NK细胞分离。然后在饲养细胞不存在下，将分离的NK细胞转导并培养1-5天(例如1、2、3、4或5天，例如3天)。经转导的NK细胞用饲养细胞(例如饲养细胞:NK细胞至少2:1、5:1、10:1、15:1、20:1的比例)重新铺板用于扩增。在一个非限制性实例中，分离NK细胞并用饲养细胞以10:1的饲养细胞:NK细胞比例铺板。在转导之前，用IL-2将NK细胞活化2-3天。在转导之前，使用CD19耗竭和/或CD56选择去除饲养细胞。转导后三天，将NK细胞用10:1饲养细胞:NK细胞重新铺板并继续在IL-2的存在下进行培养以扩增。
所公开的方法提供在经修饰的NK细胞中的高效转基因表达。在一些实施方案中，由所公开方法获得的NK细胞中的转基因表达大于25％，诸如至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，诸如30-60％、45-75％、50-80％、40-60％或40-50％。转基因表达在转导后也长时间持续，例如1-10周或更长(诸如2-4周、3-6周、4-8周、7-10周或更多)。在一些实例中，转基因在转导后表达至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天、至少28天、至少35天、至少42天、至少49天、至少56天或更多。在其它实例中，转基因表达在体外或施用于对象后持续NK细胞的生命周期。
A.NK细胞的分离和富集
本文中描述用于体外分离和富集NK细胞的技术。美国专利申请公开号2014/0086890中描述一种示例性方法，所述专利申请公开以全文引用的方式并入本文。本领域一般技术人员可识别用于扩增NK细胞的其它方法，例如Childs等人,Hematol.The EducationProgram 2013:234-246,2013中所述，其以全文引用的方式并入本文中。
单个核细胞收集自对象(诸如供体对象或患有肿瘤或过度增生性疾病或病毒性感染的对象)或收集自与待治疗的对象HLA匹配的供体。在一些实例中，通过血浆分离置换法程序(apheresis procedure)收集单个核细胞。例如通过使用免疫磁珠策略的阴性清除法(negative depleting)针对NK细胞富集单个核细胞。在一些实例中，通过使用生物素标记的单克隆抗体混合物清除T细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞、血小板、巨噬细胞和红细胞的单个核细胞样品来富集NK细胞。用与链霉抗生物素蛋白偶联的磁珠除去样品中的非NK细胞，产生NK细胞的富集制剂。一种用于此方法的示例性市售试剂盒是UntouchedTM人类NK细胞试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)。在另一个实例中，通过例如使用与抗CD56抗体缀合的磁珠(诸如CD56 MicroBeads,Miltenyi Biotec,Inc.,Auburn,CA)阳性选择CD56+NK细胞来富集NK细胞。在其它实例中，使用包括阴性清除(诸如T细胞耗竭)的两步法，然后阳性选择CD56+NK细胞来富集NK细胞。这些方法可在《现行药品生产质量管理规范》(cGMP)下进行或与其相适应。本领域一般技术人员可识别出可用于制备NK细胞富集群体的其它方法。
通过其它富集方法，诸如通过使用免疫磁珠或流式分拣法分离的大批NK细胞或NK细胞子集可生长在细胞培养基中。在一个实例中，培养基为含有10％人类AB血清、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素和500IU/mL IL-2的Cellgro SCGM无血清培养基(CellGenix,Gaithersburg,MD)或含有10％热灭活人类AB血清或10％自体血清的X-VIVOTM20培养基。
可通过流式细胞术来分析分离的NK细胞的标记表达，所述标记诸如CD56、CD16、TRAIL、FasL、NKG2D、LFA-1、穿孔素以及颗粒酶A和B。可使用铬释放分析来评估NK细胞针对靶细胞的细胞毒性。本领域一般技术人员可识别出用于评估分离的NK细胞群体的其它方法(例如纯度、生存力和/或活性)。
在一些实施方案中，富集的NK细胞(通常>99％的CD3阴性和>85％的CD56+)可选地也进行体外扩增。在一种非限制性实例中，将富集的NK细胞在包括500IU/ml IL-2的培养基中与经辐射的EBV-LCL饲养细胞系(诸如SMI-LCL)培养长达21天。使用此技术，可实现200倍至1000倍范围内的NK细胞扩增(扩增的NK细胞通常为>99％的CD3阴性和>90％的CD56+)。在一些实例中，富集的NK细胞的起始群体为总共约0.8-1.6x108个NK细胞，而其经过2-4周时间的体外扩增至1000倍或更多。在使用GMP条件的比例放大实验中扩增类似数量的NK细胞。在一些实例中，在容器中扩增NK细胞(Wilson Wolf,New Brighton,MN)。100容器支持NK扩增至2.5x108个NK细胞/kg或更高的剂量。在100容器中培养的NK细胞可按高达4x106个NK细胞/ml的浓度来培养。
B.NK细胞活化
公开的方法包括在转导之前活化(本文中也称为“致敏”)NK细胞。分离的NK细胞(例如，>95％CD3-和>85％CD56+或>99％CD3-和>90％CD56+)如IIA部分中所述来制备或以其它方式获得(例如由诸如冷冻保存的分离的NK细胞制剂的先前制剂来获得)。细胞因子刺激诱发代谢性活化并允许在NK细胞中类似其它淋巴细胞子集进行主动基因表达，这可有助于有效慢病毒载体介导的基因转导。
在公开方法的一些实施方案中，通过在转导之前将分离的NK细胞(诸如由对象或供体分离的NK细胞或由对象或供体分离且扩增的NK细胞)以一或多种细胞因子培养一段时间来活化所述分离的NK细胞。在转导之前，将NK细胞在包括一或多种细胞因子的培养基中培养1-14天(诸如1-10天、1-7天、1-5天、2-6天、3-8天、1-4天或1-3天)。在一些实例中，在转导之前，将NK细胞与一或多种细胞因子培养12小时、18小时或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。在一些实例中，通过在不存在饲养细胞的情况下用一或多种细胞因子培养使NK细胞致敏。可选地，通过在转导之前用一或多种细胞因子和经辐射的饲养细胞(诸如IIC部分中所述的那些)培养1-14天使NK细胞致敏。
在转导之前将NK细胞与一或多种细胞因子培养1-14天。所述一或多种细胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21。在一些实例中，在转导之前将NK细胞在包括IL-2的培养基中培养1-14天(诸如1-7天、2-6天、5-10天或7-14天)。在具体实例中，在IL-2的存在下并且不添加其他细胞因子，培养分离的NK细胞群体以产生经活化的NK细胞群体。培养基中包括约10-2000IU/ml(诸如约50-100IU/ml、100-500IU/ml、200-600IU/ml、500-1000IU/ml或1000-2000IU/ml，例如约10IU/ml、20IU/ml、50IU/ml、100IU/ml、200IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、1500IU/ml、2000IU/ml或更多)的IL-2。在一些非限制性实例中，将NK细胞在包括500IU/mlIL-2或1000IU/ml IL-2的培养基中活化1-6天、2-3天、3-5天或2天。
在其它实例中，在转导之前将NK细胞在包括IL-15的培养基中培养1-14天(诸如1-7天、2-6天、5-10天或7-14天)。培养基中包括约1-100ng/ml(诸如约1-10ng/ml、5-20ng/ml、10-50ng/ml、25-75ng/ml或50-100ng/ml，例如约1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml)的IL-15。在一个非限制性实例中，将NK细胞在包括10ng/ml或50ng/ml IL-15的培养基中活化1-6天、2-3天或3-5天。
在又一其它实例中，在转导之前将NK细胞在包括IL-2和IL-15的培养基中培养1-14天(诸如1-7天、2-6天、5-10天或7-14天)，例如包括1-1000IU/ml IL-2和1-100ng/ml IL-15的培养基。在一个非限制性实例中，将NK细胞在包括500IU/ml IL-2和10ng/ml或50ng/mlIL-15的培养基中活化1-6天、2-3天或3-5天。在其它实例中，在转导之前，将NK细胞在包括IL-2和IL-21的培养基中培养1-14天(诸如1-7天、2-6天、5-10天或7-14天)，例如包括1-1000IU/ml IL-2和1-100ng/ml IL-21的培养基。在一个非限制性实例中，将NK细胞在包括500IU/ml IL-2和20ng/ml IL-21的培养基中活化1-6天、2-3天或3-5天。在另一个实例中，在转导之前，将NK细胞在包括1-1000IU/ml IL-2、1-100ng/ml IL-15和1-100ng/ml IL-21的培养基中培养1-14天(诸如1-7天、2-6天、5-10天或7-14天)。在一个非限制性实例中，将NK细胞在包括500IU/ml IL-2、10ng/ml IL-15和20ng/ml IL-21的培养基中活化1-6天、2-3天或3-5天。
在一些实施方案中，在转导之前，还在先天免疫信号传导或病毒感测的一或多种抑制剂的存在下培养NK细胞，例如toll样受体(TLR)和/或RIG-I样受体(RLR)抑制剂、TBK1/IKKε抑制剂、AIM2样受体(ALR)抑制剂、环GMP-AMP(cGAS)抑制剂和/或干扰素基因刺激物(STING)抑制剂。TLR、RLR、ALR、cGAS和/或STING的示例性抑制剂包括ST2825、氯喹、羟基氯喹、CpG-52364、SM934、IRS-954、DV-1179、IMO-3100、IMO-8400、IMO-9200、IHN-ODN 2088、IHN-ODN-24888、RU.521、PF-06928215、Pepinh-MYD、Pepinh-TRIF、Z-VAD-FMK、2-氨基嘌呤、BAY11-7082、南蛇藤醇、CLI-095、H-89、去甲哈尔满以及IRAK1/4抑制剂(参见例如Gao etal.,Front.Physiol.8:508,2017；Vincent et al.,Nat.Commun.8:750,2017；Sutlu etal.,Human Gene Ther.23:1090-1100,2012；Hall et al.,PLoS One 12:e0184843,2017)。TBK1/IKKε的示例性抑制剂包括BX795、MRT67307、AZ13102909、MPI-0485520、氨来呫诺、化合物II、SR8185和CYT387(参见例如Hasan et al.,Pharmacol.Res.111:336-342,2016)。在一个非限制性实例中，抑制剂是BX795。在一些实例中，在转导之前，将NK细胞在饲养细胞存在或不存在下，在包括抑制剂(例如BX795)的培养基中培养1-14天(例如1-7天，2-6天，5-10天或7-14天)。在一个实例中，在转导之前，将NK细胞在包括抑制剂的培养基中培养约1-24小时(例如1-8小时，6-18小时或12-24小时)。在一个实例中，抑制剂为BX795，例如约0.25μM至15μM(例如约0.25μM至约3μM，约0.5μM至约5μM，约1.5μM至约12μM，约0.75μM至约3μM，或约0.5μM，约0.75μM，约1.5μM，约3μM，约6μM或约12μM)。在一个非限制性实例中，抑制剂是1.5μM BX795。
C.经转导的NK细胞的转导和扩增
用包括一或多种异源核酸(诸如编码感兴趣蛋白质的一或多种核酸或另一种感兴趣核酸(诸如shRNA))的病毒载体来转导经活化(致敏)的NK细胞诸如IIB部分中所述的那些。在具体的非限制性实例中，载体为慢病毒载体。
适合于将基因递送至NK细胞的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、禽痘和慢病毒载体。在本文公开的具体非限制性实例中，用包括一或多种感兴趣异源核酸的慢病毒载体转导NK细胞。使用慢病毒系统的一些优势包括转基因的长期表达、转导分裂细胞和非分裂细胞的能力、递送复杂遗传元件的能力、转导后缺少病毒蛋白质的表达、人类细胞中缺少插入诱变、产生高效价以及易于载体操纵和产生。
本文中公开了包括一或多种感兴趣的异源核酸的慢病毒载体或构建体。在具体实例中，慢病毒基因转移载体中包括感兴趣的一或多个核酸(诸如III部分中所述的那些)(例如参见图1A)。转移载体中的感兴趣的一或多个核酸可操作地连接至一或多种表达控制元件，诸如启动子。示例性的启动子包括组成型启动子，诸如巨细胞病毒(CMV)、SV40、磷酸甘油酸激酶(PGK)、泛素C(UBC)、延伸因子-1(EFS)、鸡β-肌动蛋白短启动子(CBH)、EF-1α(EF1a)启动子或EF-1α短启动子、杂合启动子(诸如与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的CMV增强子)或诱导型或组织特异性启动子。在其它实例中，例如当感兴趣的核酸为shRNA时，所述核酸可可操作地连接至RNA聚合酶III启动子，诸如U6或H1启动子。
转移载体中可包括的其它表达控制元件包括控制或调节核酸转录和/或翻译的序列，诸如增强子、前导序列、转录终止子、起始和/或终止密码子、内部核糖体进入位点(IRES)、剪接信号和聚腺苷酸化信号。在载体或构建体包括两种(或更多种)感兴趣的异源核酸的实例中，核酸可操作地连接例如由IRES或其它多顺反子元件(诸如P2A和/或T2A元件)分开。载体还可含有其它元件，诸如包装信号(例如慢病毒ψ包装信号)、中心多嘌呤片段(cPPT)、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)或Rev应答元件(RRE)。在一些实例中，慢病毒载体是自身灭活型的。
包括一或多种感兴趣的核酸的慢病毒载体可由本领域一般技术人员使用常规分子生物技术来制备。例如，可将感兴趣的核酸克隆到慢病毒转移载体中。慢病毒质粒系统(诸如3或4质粒系统)例如可由Clontech(Mountain View,CA)、ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)或Addgene(Cambridge,MA)购得。在一些实例中，慢病毒载体经修饰以适应具体用途，诸如用以获得在造血细胞中的持续表达。在一些实例中，修饰包括下文实施例1中所述的一或多种修饰。
在一些实施方案中，慢病毒载体包括与SEQ ID NO：8-19任一个具有至少90％序列同一性(例如至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性)的核酸序列或由所述核酸序列组成。在一些非限制性实例中，慢病毒载体包括SEQ IDNO：8-19任一个的核酸序列或由所述核酸序列组成。SEQ ID NO：16的载体图谱如图21A所示，SEQ ID NO：17的载体图谱如图21B所示。
在一些实施方案中，所公开的慢病毒载体包括与感兴趣的一或多个核酸可操作地连接的启动子。SEQ ID NO：8-19中的启动子和/或感兴趣的一或多个核酸可以被任何启动子和/或感兴趣的一或多个核酸置换。例如，SEQ ID NO：16和17的载体包括PGK启动子(例如在核苷酸位置1959-2469)；然而，该启动子可以用不同启动子例如EFS启动子(例如SEQ IDNO：10的核苷酸位置1959-2190)置换。备选地，与启动子连接的核酸可以被备选的一或多个核酸置换以表达。在一个实例中，SEQ ID NO：10的载体包括与编码EGFP的核酸(核苷酸位置2221-2940)连接的EFS启动子(例如在核苷酸位置1959-2190)。本文公开的载体中编码EGFP的核酸可以用编码不同的感兴趣核酸的核酸置换，包括但不限于编码CXCR4、CD16、CD34t(SEQ ID NO：16和17中的核酸位置如表3所示)、CD4(或截短型CD4)、CD19(或截短型CD19)的核酸或编码其他感兴趣核酸的核酸，例如表1中所示的转基因。在具体实例中，感兴趣核酸可操作地与PGK、EFS或SV40启动子连接。所公开的载体的其他元件(表4所示)也可以根据需要改变(例如置换)或修饰。
通过用慢病毒系统(诸如图1A中说明的三质粒系统)的质粒转染哺乳动物细胞系(诸如293T细胞或其衍生物)来产生慢病毒粒子。转染通过标准方法进行，例如使用磷酸钙或聚乙烯亚胺介导的转染或市售转染试剂诸如(ThermoFisherScientific,Waltham,MA)、(Promega,Madison,WI)、Universal TransfectionReagent(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)或(Qiagen,Valencia,CA)转染试剂。转染后，将慢病毒粒子释放至培养基中并收集。在一些实例中，将经转染的细胞培养约18-72小时(例如约18-36小时、24-48小时或36-72小时，诸如18、24、36、48、60或72小时)。收集含有包装的慢病毒粒子的含病毒培养基。在一些实例中，例如通过对培养物上清液进行超速离心来浓缩病毒(诸如约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多)。可对病毒制剂进行分析来确定特定体积中的病毒粒子数量(例如pfu/ml，例如通过p24ELISA)或确定包括感兴趣RNA的粒子数量(例如转导单位(TU)/ml，例如通过FACS分析)。在一些实例中，浓缩的病毒制剂含有约107-1010TU/ml(例如约107-109、108-1010或108-109TU/ml)。
通过使IIB部分中所述的活化的NK细胞与慢病毒粒子例如以约0.5至200(诸如约0.5-5、1-10、5-15、10-25、20-50、40-80、60-100、75-150或100-200，例如约0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200)的感染复数(MOI)接触来产生经转导的NK细胞。在一些实例中，使NK细胞与病毒以约10-20的MOI或约20的MOI接触。在一些实例中，在一或多种其它化合物诸如硫酸鱼精蛋白(例如5-50μg/ml，诸如5、10、20、30、40或50μg/ml)或海美溴铵(例如例如约4-40μg/ml，诸如4、8、12、16、20、24、28、32、36或40μg/ml)或纤连蛋白片段(例如)的存在下进行转导。将细胞与病毒粒子培养约6小时至5天(例如约6-24小时、12-48小时、24-72小时、48-60小时或72-96小时)，诸如约1、2、3、4或5天。
在一些实施方案中，在先天免疫信号传导或病毒感测的一或多种抑制剂(例如toll样受体(TLR)和/或RIG-I样受体(RLR)抑制剂、TBK1/IKKε抑制剂、AIM2样受体(ALR)抑制剂、环GMP-AMP(cGAS)抑制剂和/或干扰素基因刺激物(STING)抑制剂)的存在下转导NK细胞。TLR、RLR、ALR、cGAS和/或STING的示例性抑制剂包括ST2825、氯喹、羟基氯喹、CpG-52364、SM934、IRS-954、DV-1179、IMO-3100、IMO-8400、IMO-9200、IHN-ODN 2088、IHN-ODN-24888、RU.521、PF-06928215、Pepinh-MYD、Pepinh-TRIF、Z-VAD-FMK、2-氨基嘌呤、BAY11-7082、南蛇藤醇、CLI-095、H-89、去甲哈尔满以及IRAK1/4抑制剂(参见例如Gao et al.,Front.Physiol.8:508,2017；Vincent et al.,Nat.Commun.8:750,2017；Sutlu et al.,Human Gene Ther.23:1090-1100,2012；Hall et al.,PLoS One 12:e0184843,2017)。TBK1/IKKε的示例性抑制剂包括BX795、MRT67307、AZ13102909、MPI-0485520、氨来呫诺、化合物II、SR8185和CYT387(参见例如Hasan et al.,Pharmacol.Res.111:336-342,2016)。在一些实例中，在饲养细胞存在或不存在下，在包括抑制剂的培养基中转导NK细胞。在一个非限制性实例中，抑制剂为BX795，例如约0.25μM至15μM(例如约0.25μM至约3μM，约0.5μM至约5μM，约1.5μM至约12μM，约0.75μM至约3μM，或约0.5μM，约0.75μM，约1.5μM，约3μM，约6μM或约12μM)。在一个非限制性实例中，抑制剂是1.5μM BX795。
用慢病毒转导NK细胞之后，(例如通过更换培养基并且可选地洗涤细胞)去除病毒粒子(以及先天免疫信号传导或病毒感测的一或多种抑制剂，如果有的话)。在一些实例中，在扩增之前可选地选择表达转基因的NK细胞(下文)。例如，如果在细胞表面上表达转基因，则可通过免疫磁性技术或流式细胞术来富集表达转基因的NK细胞。例如，如果用包括编码截短型CD34分子(CD34t)、截短型CD19分子或截短型CD4分子的核酸的载体转导NK细胞，则可通过例如在转导后约2-4天，使经转导的NK细胞群体与适合的抗体(例如抗-CD34抗体)接触并例如使用流式细胞术或免疫磁珠(例如CliniCD34试剂系统，MiltenyiBiotec Inc.,San Diego,CA或300磁性细胞选择系统，Nexell TherapeuticsInc.,Irvine,CA)纯化表达所述分子(例如CD34)的NK细胞来选择或富集经转导的NK细胞。可以使用流式细胞术或特异于转基因的免疫磁珠，类似地选择或富集表达其他转基因(例如CD19或CD4)的NK细胞(参见例如图29A)。
然后通过将细胞培养1-40天或更多天(诸如3-14天、5-21天、7-28天、14-30天、21-40天或更多天，例如1、3、5、7、10、14、21、28、35、42天或更多天)来扩增经转导的NK细胞。在一些实例中，在含有至少一种细胞因子的细胞培养基中扩增经转导的NK细胞。在一些实例中，通过在包括IL-2(诸如1-1000IU/ml，例如500IU/ml IL-2)的培养基(诸如X-VIVOTM20或X-VIVOTM15培养基(Lonza,Basel,Switzerland))中培养来扩增经转导的NK细胞。在一些实施方案中，在扩增经转导的NK细胞中可使用一或多种其它细胞因子，包括但不限于IL-18、IL-7、IL-15和/或IL-12。在其他实例中，在IL-2的存在下并且不添加其他细胞因子，培养经转导的NK细胞群体。
在一些实例中，在扩增步骤期间向经转导的NK细胞培养物中加入饲养细胞(诸如经辐射的饲养细胞)。以可支持NK细胞扩增的量加入饲养细胞，诸如比率为至少2:1(饲养细胞:NK细胞)，例如5:1、10:1、15:1、20:1或更大。示例性的饲养细胞包括EBV-LCL(TM-LCL、SMI-LCL)、同种异体或自体PBMC、威尔姆氏肿瘤(Wilms tumor)细胞系HFWT以及K562细胞(诸如经过遗传修饰的K562细胞，例如K562-mb15-41BBL或K562-mbIL-21细胞)。在一些实例中，将经转导的NK细胞与饲养细胞以选定的比率混合并将细胞混合物铺板。
使用这些技术，可对经转导的NK细胞实现100倍至1000倍(诸如200倍至500倍、300倍至700倍或600倍至1000倍)范围内的扩增。
扩增后，将经修饰的NK细胞与饲养细胞(如果使用)分离。将经修饰的NK细胞洗涤一次或多次并重悬在适当的缓冲剂或其它药学上可接受的载体中，例如用以施用于对象。在一些实例中，收获细胞并洗涤(例如在诸如磷酸盐缓冲盐水的缓冲剂中)。可将NK细胞重悬于含有PLASMA-LYTETM复方电解质注射液(Baxter Healthcare)、自体血浆或药学上可接受的载体(例如平衡盐溶液)的培养基中。在一些实施例中，将一些或全部经修饰的NK细胞冷冻保存以供之后使用。
在一些实例中，在施用于对象之前，对经修饰的NK细胞进行测试，例如测试细胞生存力、肿瘤细胞细胞毒性以及转基因表达中的一或多种。在其它实例中，在施用之前对经修饰的NK细胞的表型进行评估，诸如通过流式细胞术测量一或多种细胞表面标记(诸如CD56、CD16、TRAIL、FasL、NKG2D、LFA-1、穿孔素或颗粒酶A和B)的存在和/或量来进行。
III.经修饰的NK细胞
本文中公开了包括异源核酸或表达一或多种异源蛋白质或感兴趣的核酸的NK细胞(本文中称为“经修饰的NK细胞”)。含有一或多种异源核酸的经修饰的或重组的NK细胞可通过例如使用本文中公开的方法，用包括具有所述一或多种异源核酸的载体(诸如慢病毒载体)的病毒粒子转染NK细胞来产生。经修饰的NK细胞可例如与一或多种药学上可接受的载体配制成治疗性组合物以施用于对象。下文IV部分中论述治疗性组合物及其使用方法。
经修饰的NK细胞是经包括一或多种转基因的病毒载体或病毒粒子(诸如慢病毒载体或慢病毒粒子)转导的NK细胞，所述转基因诸如一或多种编码感兴趣的蛋白质的异源核酸或一或多种能够调节另一种核酸或蛋白质(诸如shRNA、siRNA或反义核酸)的表达的异源核酸。在一些实施方案中，核酸编码的蛋白质促进表达所述蛋白质的经修饰的NK细胞靶向至靶组织或细胞类型。例如，核酸可编码使表达蛋白质的NK细胞增加靶向至肿瘤细胞或肿瘤细胞位点的蛋白质。在一种非限制性实例中，转基因使NK细胞增加靶向至骨髓或淋巴结(例如C-C趋化因子受体类型7(CCR7)、C-X-C趋化因子受体类型4(CXCR4；例如野生型CXCR4或CXCR4 R334X)或CD34)或发炎位点(诸如C-X-C趋化因子受体类型3(CXCR3))。在其它实例中，转基因编码与在肿瘤细胞上表达的表位结合的蛋白质(诸如嵌合抗原受体(CAR))。在其它实施方案中，核酸编码增加NK细胞的抗体依赖性细胞介导细胞毒性的蛋白质，诸如高亲和性CD16(CD16-V158)。
因此，在具体实例中，本文中公开的经修饰的NK细胞为包括编码趋化因子受体的异源核酸的NK细胞(诸如NK细胞群体)，所述趋化因子受体诸如CXCR4、CCR7或CXCR3。在其它实例中，经修饰的NK细胞为包括编码细胞表面蛋白的异源核酸的NK细胞(诸如NK细胞群体)，所述细胞表面蛋白诸如CD16(例如CD16-V158)、CD34、双阴性TGFβII型受体、VLA-4(α4β-1)、LFA-1、CD4或CD19。在其它实例中，经修饰的NK细胞为包括编码嵌合抗原受体(CAR)的异源核酸的NK细胞(诸如NK细胞群体)，所述嵌合抗原受体例如CD19-CAR、CD20-CAR、CD33-CAR、CD138-CAR、CS1-CAR、GD2-CAR、HER2-CAR、erbB2-CAR、癌胚抗原(CEA)-CAR、上皮细胞粘附分子(EpCAM)-CAR、自然-杀伤组2、成员D(member D)、长形式(long form)(NKG2D-L)-CAR或TRAIL受体1(TRAIL-R1)-CAR。在又一其它实例中，用以下转导经修饰的NK细胞：重组TRAIL(例如用以增强NK细胞TRAIL介导的肿瘤杀伤)、DR5特异性TRAIL、重组FAS-配体(例如用以增强FAS-配体介导的肿瘤杀伤)、DNAM-1(例如用以增强NK细胞活化和肿瘤杀伤)、NK细胞活化受体诸如NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp44或NKp46(例如用以增强肿瘤杀伤)或NKG2C(例如用以增强病毒感染细胞的NK细胞杀伤)。
在一种非限制性实例中，经修饰的NK细胞包括编码与启动子(诸如PGK启动子)可操作地连接的CXCR4的异源核酸或编码与启动子(诸如PGK启动子)可操作地连接的CD34t和CXCR4的核酸。在其它非限制性实例中，经修饰的NK细胞包括编码与启动子(诸如PGK启动子)可操作地连接的高亲和性CD16的异源核酸或编码与启动子(诸如PGK启动子)可操作地连接的CD34t和高亲和性CD16的核酸。在另一种非限制性实例中，经修饰的NK细胞包括编码与启动子(诸如PGK启动子)可操作地连接的CXCR4和高亲和性CD16的异源核酸或编码与启动子(诸如PGK启动子)可操作地连接的CD34t、CXCR4和高亲和性CD16的核酸。在一些实例中，编码CXCR4的核酸包括与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的核酸或由此核酸组成，和/或编码包括与SEQ ID NO：2具有至少95％同一性(诸如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列或由此氨基酸序列组成的蛋白质。在一些实例中，编码CD34t的核酸包括与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的核酸或由此核酸组成，和/或编码包括与SEQ IDNO：4具有至少95％同一性(诸如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列或由此氨基酸序列组成的蛋白质。在一些实例中，编码高亲和性CD16的核酸包括与SEQID NO：5或SEQ ID NO：6具有至少90％同一性(诸如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的核酸或由此核酸组成，和/或编码包括与SEQ IDNO：7具有至少95％同一性(诸如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列或由此氨基酸序列组成的蛋白质。
在其它实例中，经修饰的NK细胞可由包括编码小干扰RNA(siRNA)诸如小发夹状RNA(shRNA)的核酸的病毒载体来转导。在一个实例中，经修饰的NK细胞是包括异源NKG2AshRNA核酸的NK细胞(诸如NK细胞群体)。
IV.治疗或抑制病况的方法
本文中公开通过向患有疾病或病症的对象施用本文所述的经修饰的NK细胞来治疗所述对象的方法。本文所述的经修饰的NK细胞可施用于动物或人类对象。在一些实施方案中，所述疾病或病症为肿瘤或过度增生性疾病。在其它实施方案中，所述疾病或病症为病毒性感染(包括但不限于巨细胞病毒、腺病毒、呼吸道合胞体病毒、EB病毒或人类免疫缺陷病毒感染)。
本文所述的经修饰的NK细胞可并入药物组合物中。所述组合物通常包括经修饰的NK细胞群体和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等(例如参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy,The University of the Sciencesin Philadelphia,编者Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,第21版,2005)。所述载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(Ringer’ssolution)、右旋糖溶液、平衡盐溶液以及5％人类血清白蛋白。也可使用脂质体和非水媒介物诸如非挥发性油。也可将补充活性化合物并入组合物中。本领域技术人员已知或显而易见用于制备可施用组合物的实际方法，并且在诸如以下公布中更详细描述：Remington：TheScience and Practice of Pharmacy,The University of the Sciences inPhiladelphia,编者Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,第21版(2005)。在一种非限制性实例中，将转导的NK细胞悬浮在PLASMA-LYTETM复方电解质溶液中。
在一些实例中，组合物包括约104至1012个经修饰的NK细胞(例如约104-107个细胞、约106-109个细胞或约108-1012个细胞)。例如，组合物可制备成向对象施用约106至1010个经修饰的NK细胞/kg(诸如约106、107、108、109或1010个细胞/kg)。经修饰的NK细胞群体通常胃肠外施用，例如静脉内施用；然而，也可用于注射或输注至肿瘤中或肿瘤附近(局部施用)或施用于腹膜腔。本领域技术人员可确定适当的施用途径。
可向对象施用多剂量的经修饰的NK细胞群体。例如，所述经修饰的NK细胞群体可每天、每隔一天、每周两次、每周、每隔一周、每三周、每月或以更小的频率施用。技术人员可基于对象、治疗的病况、先前的治疗史以及其它因素来选择施用时间安排。
在其它实例中，还对对象施用一或多种细胞因子(诸如IL-2、IL-15、IL-21和/或IL-12)来支持NK细胞的存活和/或生长。一或多种细胞因子在NK细胞之前、之后或基本上与其同时施用。在一些实例中，一或多种细胞因子在NK细胞之后施用。在一个特定实例中，一或多种细胞因子在施用NK细胞后约1-8小时以内(诸如约1-4小时、约2-6小时、约4-6小时或约5-8小时以内)施用于对象。
在一些实例中，所述方法包括治疗或抑制过度增生性病症，诸如血液恶性肿瘤或实体瘤。血液恶性肿瘤的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如11q23-阳性急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病以及原始粒细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(无痛性和高级别形式)、外套细胞淋巴瘤、滤泡细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合症、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤(诸如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤以及其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、恶性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌(包括基底乳腺癌、导管癌和乳腺小叶癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆氏瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌以及CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
在具体实例中，可由本文中公开的方法来抑制或治疗的血液恶性肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、慢性髓性白血病、幼淋巴细胞/髓细胞白血病、浆细胞白血病、NK细胞白血病、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤以及滤泡性淋巴瘤。在其它具体实例中，可由本文中公开的方法来治疗或抑制的实体瘤包括肺癌、前列腺癌、胰腺癌(例如胰岛素瘤)、乳腺癌、结肠直肠腺癌或鳞状细胞癌、神经母细胞瘤、睾丸癌(诸如精原细胞瘤)以及卵巢癌。在特定的非限制性实例中，对象患有慢性髓性白血病或急性单核细胞白血病。表1中示出了可用于治疗患有示例性病症的对象的由经修饰的NK细胞表达的示例性转基因。然而，本领域一般技术人员可选择表达适当转基因的NK细胞用于治疗患有其它病症的对象。
表1.用于治疗具体病症的示例性的经修饰的NK细胞
在一些实例中，还向对象(诸如患有肿瘤或过度增生性病症的对象)施用一或多种化学治疗剂和/或放射治疗。本领域技术人员例如基于接受治疗的肿瘤或病症类型可选择其它化学治疗剂与本文所述的经修饰的NK细胞组合施用于对象。所述药剂包括烷化剂，诸如氮芥(诸如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、乌拉莫司汀或苯丁酸氮芥)、烷基磺酸盐类(诸如白消安)、亚硝基脲类(诸如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲菌素或达卡巴嗪)；抗代谢物，诸如叶酸类似物(诸如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(诸如5-FU或阿糖胞苷)以及嘌呤类似物，诸如巯基嘌呤或硫鸟嘌呤；或自然产物，例如长春花生物碱(诸如长春碱、长春新碱或长春地辛)、表鬼臼毒素(诸如依托泊苷或替尼泊苷)、抗生素(诸如放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素或丝裂霉素C(mitocycin C))以及酶(诸如L-天冬酰胺酶)。其它药剂包括铂配位络合物(诸如顺-二胺-二氯铂II，也称为顺铂)、取代脲(诸如羟基脲)、甲基肼衍生物(诸如丙卡巴肼)，以及肾上腺皮质抑制剂(诸如米托坦和氨鲁米特)；激素和拮抗剂，诸如肾上腺皮质类固醇类(诸如泼尼松)、孕激素(诸如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)、雌激素类(诸如己烯雌酚和炔雌醇)、抗雌激素类(诸如他莫昔芬)以及雄激素类(诸如丙酸睾酮和氟甲睾酮)。最常用的化学治疗药物的实例包括阿霉素、美法仑Ara-C(阿糖胞苷)、卡莫司汀、白消安、洛莫司汀、碳铂、顺铂、环磷酰胺柔红霉素、达卡巴嗪、5-氟脲嘧啶、氟达拉滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇(或其它紫杉烷，诸如多西紫杉醇)、长春碱、长春新碱、VP-16，而更新型的药物包括吉西他滨曲妥珠单抗伊立替康(CPT-11)、克拉立平、诺维本、利妥昔单抗伊马替尼(STI-571)、托泊替康卡培他滨、替伊莫单抗(ibritumomab，)以及骨化三醇。
在一些具体实例中，经修饰的NK细胞表达CD16 V158且另外的药剂为抗癌单克隆抗体。在特定的非限制性实例中，将表达CD16-V158的经修饰的NK细胞与结合CD38的抗体(诸如达雷木单抗(daratumumab))组合施用于患有多发性骨髓瘤的对象。在另一个具体实例中，将表达CD16-V158的经修饰的NK细胞与结合CD20的抗体(诸如利妥昔单抗)组合施用于患有淋巴瘤的对象。表2中提供可与表达CD16-V158的经修饰的NK细胞组合施用于对象的其它示例性单克隆抗体。
表2.与表达CD16-V158的NK细胞组合施用的示例性治疗性单克隆抗体
实施例
提供以下实施例来说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应理解为将本公开限制于所述的具体特征或实施方案。
实施例1
材料和方法
细胞系和试剂：在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich)、2mM谷氨酰胺和100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素(Life Technologies)的RPMI 1640中培养人髓性白血病细胞系(红白血病类型)K562(ATCC)和急性单核细胞白血病细胞系MOLM-14(ATCC)以及EBV–SMI–LCL。在补充有2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Invitrogen)以及10％FBS的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle'smedium，DMEM；Invitrogen)中培养293T细胞系，其为稳定地表达SV40大T抗原的人类胚胎肾细胞系293(来自ATCC)。在37℃和5％CO2，在95％湿度下培养细胞。
培养和扩增源自人类外周血的NK细胞：在美国国立卫生研究院输血医学科(Bethesda,MD,USA)，通过机构审查委员会批准的实验方案进行血液成分分离(AmicusSeparator；Fenwal,Lake Zurich,IL,USA)来收集来自健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)。通过在Ficoll密度梯度培养基上离心富集细胞。使用来自Miltenyi的NK细胞分离试剂盒，根据制造商的说明书自供体PBMC分离NK细胞。将指定的NK细胞以1:10比率在经辐射的EBV-SMI–LCL细胞的存在下，在NK细胞培养基(补充有10％热灭活人类AB血浆(Sigma-Aldrich)和500IU/ml重组人类IL-2(Roche)的X-VIVOTM20培养基(Lonza))中扩增11-21天。在37℃和6.5％CO2培养细胞。进入扩增5天时，用新鲜的NK细胞培养基替换一半的培养基。然后对NK细胞计数并从第7天开始，每48h调整为0.5-1×106个细胞/ml，直到在实验中使用。
慢病毒载体系统：除了在载体中引入另外的含有中心聚嘌呤片段(cPPT)的118-bp序列以外，此研究中使用的基于人类免疫缺陷病毒(HIV)-1的慢病毒基因转移载体与Dull等(J Virol.72：8463-8471,1998)所述的自我灭活型构建体pRRL-CMV-eGFP-SIN-18类似。另外，包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)骨架来增强转基因表达和/或病毒载体效价。通过基于聚合酶链反应(PCR)的扩增，用人类磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子来置换用于驱动转基因转录的内部巨细胞病毒(CMV)早期启动子CMV启动子。使用包装质粒pCMVΔR8.91(不含所有的HIV-1附属基因)来表达HIV-1gag、pol、tat和rev基因并由此产生慢病毒结构和调节蛋白。使用带有由CMV启动子驱动的水疱性口炎病毒包膜G蛋白质(VSV-G)编码序列且接着是β-珠蛋白聚腺苷酸化位点的质粒pMD.G来拟型载体粒子。质粒pRRL-CMV-eGFP-SIN-18、pCMVΔR8.91和pMD.G由Prof.D.Trono,Department of Genetics andMicrobiology,CMU,Geneva,Switzerland友情提供。
慢病毒载体产生：使用如前文所述的磷酸钙转染试剂盒(Clontech)，通过用12μg基因转移构建体pRRLsin.PPT.hPGK.eGFP.Wpre、10μg pCMVΔR8.91和5μg pMD.G对293T细胞进行3-质粒瞬时转染来产生以VSV-G包膜拟型的复制缺陷型慢病毒粒子(Chinnasamy等人,Blood 96:1309-1316.2000)。8小时后用新鲜培养基替换转染培养基。在转染后65小时收集病毒上清液并通过0.45μm滤器(Nalgene,Rochester,NY)过滤。通过在4℃以50,000g超速离心1.5小时将病毒上清液浓缩至50倍。将病毒沉淀重悬于X-VIVOTM20培养基(Lonza)中并在-80℃冷冻储存直至使用。通过由酶联免疫吸附分析(ELISA)(Coulter Diagnostics,Hialeah,FL)量化p24 gag以及还通过用连续稀释病毒上清液转导293T细胞，接着通过在转导后48小时对EGFP-阳性细胞进行流式细胞术分析来确定病毒上清液的效价。假定1ng的p24大致等效于1000至5000转导单位。通过在至少5次细胞传代后转导293T细胞并分析培养基中p24 gag的存在来测试所有慢病毒载体制剂中可复制型慢病毒(RCL)的存在。在经测试的任何载体制剂中均无法检测到RCL。
经细胞因子致敏或经LCL刺激的原代人类NK细胞的慢病毒转导：在硫酸鱼精蛋白(10μg/ml，Sigma-Aldrich)的存在下，在含有1ml/孔的NK培养基(补充有IL-2(500IU/ml或1000IU/ml)、IL-15(10ng/ml)或IL-2(500IU/ml)和IL15(10ng/ml))的24孔培养板中，用浓缩的慢病毒载体粒子以感染复数(MOI)转导经培养的人类NK细胞。转导48小时后，洗涤细胞并在存在或不存在经辐射的EBV-SMI-LCL(LCL与NK的比率为10:1)的情况下在含有IL-2(500IU/ml)的新鲜NK细胞培养基中培养细胞。在一些情况下，在用慢病毒载体转导48小时之前，将原代NK细胞与EBV-SMI-LCL(LCL与NK的比率为10:1)共同培养不同时间长度，且然后洗涤细胞并在含有IL-2(500IU/ml)的新鲜NK细胞培养基中培养细胞。在转导之前和之后，使用锥虫蓝(Sigma)染色定期监控NK培养物的生存力。通过流式细胞术以规律间隔监控表型和eGFP表达。
流式细胞术：根据标准程序，在培养和扩增后，在不同的时间点通过流式细胞术对经培养的NK细胞进行表型分析。在表型表征中使用以下试剂：来自Becton Dickinson(BD)的抗-CD56(NCAM-1)、抗-CD3(UCHT1)、抗-CD16(3G8)、抗-TRAIL(RIK-2)、抗-NKp46(29A1.4)和IgG1(MOPC21)；来自Beckman Coulter的抗-KIR2DL1/DS1(EB6)、抗-KIR2DL2/3/DS2(GL183)和抗-NKG2A(Z199)；来自Biolegend的抗-KIR3DL1(Dx9)、抗-CD57(HCD57)、NKp44(克隆p44-8)、FAS(克隆DX2)、CXCR3(克隆12G5)、CXCR4(克隆G025H7)和BV650-链霉抗生物素蛋白；来自eBioscience的抗-Lir-1(HP-F1)；来自R&D Systems的抗-NKG2C(134591)；来自Life Technologies的LIVE/DEAD生存力标记或碘化丙啶(PI)；来自UCSF的生物素标记的抗-KIR3DL2(Dx31)初次抗体。使用BV650-链霉抗生物素蛋白(Biolegend)来检测生物素标记的抗-KIR3DL2。简单来说，将细胞与适当浓度的不同染料缀合的单克隆抗体(mAb)混合。在加入初次Ab并在室温培育20分钟后，用含有1％FBS的PBS洗涤细胞。使用碘化丙啶(PI)或LIVE/DEAD染色进行死细胞排除。所有数据都使用具有FACS Diva软件(BD Biosciences)的Canto II或Fortessa流式细胞仪获得并使用FlowJo软件(Tree Star)分析。在每个样品中，使用对数放大的荧光和线性放大的侧面和正向散射信号在存活细胞的分析区域获取最少10,000个细胞。通过使用LIVE/DEAD或PI-阴性细胞在淋巴细胞群体周围设置适当的门(gate)来分析所有样品。通过用校准珠校准流式细胞仪(BD biosciences)确定分析参数的一致性。通过在FL1通道中使用530/30nm带通滤波器检测绿色荧光阳性细胞％来确定经转导的细胞中的EGFP表达。
细胞毒性分析：在37℃和5％CO2，在96孔板中以200μl终体积，将自然杀伤细胞与51Cr标记的K562细胞或Molm-14细胞以1:1的比率共同培养。4小时后，将上清液收集到Luma板上。使用Perkin Elmer 1450Microbeta Counter测量计数并使用下式计算特定靶溶解：[(NK细胞诱发的51Cr释放–自发的51Cr释放)/(最大51Cr释放-自发的51Cr释放)×100]。
实施例2
IL-2致敏对NK细胞的慢病毒转导的影响
此实施例描述以IL-2致敏对使用慢病毒载体转导NK细胞以及表征经转导的NK细胞的影响。
评估转导前使NK细胞致敏的条件以及转导后的培养条件。在最初的实验中，评估用IL-2使NK细胞致敏。在一个实验中，在以各种感染复数(MOI)的包括eGFP转基因的慢病毒粒子转导之前，将LCL饲养细胞上的NK细胞以500IU/ml IL-2致敏三天。将细胞与病毒粒子温育两天，然后洗掉病毒粒子并以包括500IU/ml IL-2的培养基培养细胞。在第二个实验中，在以包括eGFP转基因的慢病毒粒子转导之前，将NK细胞用500IU/ml IL-2致敏三天。将细胞温育两天，然后洗掉病毒粒子并在经辐射的LCL饲养细胞上用包括500IU/ml IL-2的培养基培养细胞。在转导后第7天，通过FACS评估eGFP表达。CD56+细胞上的eGFP表达在两种情况下类似(图3)，但在以LCL和IL-2致敏并且只在转导后在IL-2上生长的细胞中略微较高(情况1)。
通过在转导之前以500IU/ml IL-2使NK细胞致敏1-5天来评估IL-2致敏对NK细胞转导的影响。转导两天后，除去病毒粒子并以10:1的比率(LCL:NK细胞)加入经辐射的LCL并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。以IL-2致敏两天或更多天产生约25％或更高的转导效率(图4)。在以MOI 20转导之前，还以含有IL-2(500IU/ml)的培养基使NK细胞致敏三天。转导两天后，除去病毒粒子、加入经辐射的LCL(LCL:NK细胞的比率为10:1)并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。转基因表达在转导后保持稳定至少40天(图5A)且细胞生存力在转导后至少28天与未转导细胞保持相当(图5B)。
还评估LCL刺激对NK细胞转导的影响。在转导之前，在含有IL-2(500IU/ml)的培养基中以经辐射的LCL刺激NK细胞1-14天。转导两天后，除去病毒粒子并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。转导效率随转导之前LCL刺激的天数而增加(图6)。
测试在LCL刺激后的转导后的转基因表达和细胞生存力的持久性。将NK细胞在含有500IU/ml IL-2和经辐射的LCL(与NK细胞的比率为10:1)的培养基中培养并在第0天、第3天、第7天或第14天进行转导。转导两天后，除去病毒粒子并将细胞维持在含有500IU/mlIL-2的培养基中。在每种条件下转导后，eGFP表达保持稳定长达40天(图7，上图)。转导后长达21天的细胞生存力因致敏3天而改进，并且在转导前致敏7天的情况下为最高(图7，下图)。
在以MOI 10转导之前，将来自三个对象的原代人类外周NK细胞在经辐射的LCL上用500IU/ml IL-2培养14天。转导两天后，除去病毒粒子并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。在转导后第7天(图8A)以及转导后的其它时间点(图8B)通过FACS分析eGFP表达。
实施例3
IL-2和IL-15致敏对NK细胞的慢病毒转导的影响
此实施例描述用IL-2和IL-15致敏对使用慢病毒载体转导NK细胞以及表征经转导的NK细胞的影响。
评估IL-15单独或与IL-2组合致敏对NK细胞转导的影响。在以MOI 20转导之前，将NK细胞在包括IL-2(500IU/ml或1000IU/ml)、IL-15(10ng/ml)或IL-2(500IU/ml)加IL-15(10ng/ml)的培养基中培养3天。转导两天后，除去病毒粒子，加入经辐射的LCL(与NK细胞的比率为10:1)，并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。经IL-2加IL-15致敏的NK细胞比经IL-2或IL-15单独致敏的NK细胞更易于转导(图9)。经IL-2加IL-15致敏的细胞也以高频率维持转基因的长期表达至少28天(图10)。
实施例4
慢病毒转导对NK细胞表型的影响
此实施例描述经慢病毒转导的NK细胞的表型。
通过分析在NK细胞上克隆性表达的受体的表达来确定慢病毒转导对NK细胞表型的影响。在以MOI 20转导之前，将NK细胞在包括IL-2(500IU/ml)或IL-2(500IU/ml)加IL-15(10ng/ml)的培养基中培养3天。转导两天后，除去病毒粒子，加入经辐射的LCL(与NK细胞的比率为10:1)，并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。在两种条件下，对NK细胞表型均无影响(图11和12)。
为评估NK细胞活性，在转导之前将来自三个不同健康供体的NK细胞用经辐射的LCL加500IU/ml IL-2、单独的IL-2(500IU/ml)或IL-2(500IU/ml)加IL-15(10ng/ml)致敏三天。将细胞用经辐射的饲养LCL加500IU/ml IL-2扩增14天，然后测试其针对K562细胞(慢性髓性白血病细胞)或MOLM14细胞(急性髓性白血病细胞)的肿瘤杀伤能力。对于所有致敏条件，经转导的NK细胞的细胞杀伤活性与未经转导的细胞的细胞杀伤活性类似(图13)。
实施例5
培养和转导条件的进一步评估
此实施例描述评估NK细胞活化、转导和扩增条件的其它实验。
在用包括GFP转基因的慢病毒载体转导之前，通过用500IU/ml IL-2使NK细胞致敏1-6天来评估IL-2致敏对NK细胞转导的影响。转导两天后，除去病毒粒子并以10:1的比率(LCL:NK细胞)加入经辐射的LCL并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。转导效率在致敏的1-4天内增加，然后在第5天和第6天略微减小(图14)。细胞生存力在致敏的1-3天内保持接近100％，然后下降(图14)。因此，用IL-2致敏2-3天似乎提供转导效率与细胞生存力的最佳平衡。
再次评估用于致敏的细胞因子组合的影响。将NK细胞用500IU/ml IL-2、500IU/mlIL-2+10ng/ml或50ng/ml IL-15、500IU/ml IL-2+20ng/ml IL-12、或500IU/ml IL-2+10ng/ml IL-15+20ng/ml IL-12致敏3天。在用包括GFP转基因的慢病毒载体转导两天后，除去病毒粒子并以10:1的比率(LCL:NK细胞)加入经辐射的LCL并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。在单独的IL-2和细胞因子组合之间未观察到转导效率的显著差异(图15)。
还测试转导试剂的转导效率以及对后续NK细胞扩增的影响。将NK细胞用500IU/mlIL-2致敏3天，然后使用硫酸鱼精蛋白、或试剂，用包括GFP转基因的慢病毒载体进行转导。转导两天后，除去病毒粒子并以10:1的比率(LCL:NK细胞)加入经辐射的LCL并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。包括或试剂与硫酸鱼精蛋白相比显著地增加了转导效率(图16A)。与硫酸鱼精蛋白相比，在使用试剂转导的NK细胞中的后续NK细胞生存力显著减小，而在使用或试剂转导的NK细胞之间生存力并无显著差异(图16B)。
评估各种启动子的NK细胞转导效率。构建包括与PGK、UBC、EF1A、EFS、SV40、CMV、CAG或CBH启动子可操作地连接的GFP转基因的慢病毒载体。将NK细胞以500IU/ml IL-2致敏3天。在用慢病毒载体以5、20或100的MOI转导两天后，除去病毒粒子并以10:1的比率(LCL:NK细胞)加入经辐射的LCL并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。测试的所有构建体在经转导的NK细胞中均产生GFP表达(图17)。PGK、EFS和SV40启动子产生最大的转导效率。另外，与第0天的表达相比，在转导后的14天扩增期间GFP表达是稳定的(图18)。
最后，评估经转导的NK细胞的功能。将NK细胞以500IU/ml IL-2致敏3天。在用包括与PGK、EFS或SV40启动子连接的GFP转基因的慢病毒载体转导两天后，除去病毒粒子并以10:1的比率(LCL:NK细胞)加入经辐射的LCL并将细胞维持在含有500IU/ml IL-2的培养基中。经转导的细胞与模拟转导的细胞在应答K562细胞时展现等效脱粒，以及在应答PMA/离子霉素时展现自发和最大脱粒(图19)。所述细胞与未经转导的细胞相比，在应答K562细胞或P/I时也展现出等效CD107a表达(脱粒标记)以及IFNγ和TNFα分泌(图20)。
实施例6
用其它转基因转导NK细胞
此实施例描述用感兴趣的其它转基因转导NK细胞。
构建包括编码CXCR4的核酸的慢病毒载体(图21A)。在以MOI 20转导之前，将NK细胞在500IU/ml IL-2中活化3天。在病毒转导2天后，将经转导的NK细胞用经辐射的EBV-LCL扩增14天。经此载体转导的NK细胞与未转导的细胞相比显示增加的CXCR4表达(图22A)。构建一种慢病毒载体，其包括与编码截短型CD34分子(包括CD34的胞外和跨膜结构域，但缺少胞内信号传导结构域)的核酸连接的编码CXCR4的核酸(图21B)。经此载体(如上文所述)转导的NK细胞与未经转导的细胞相比显示出表达CD34并且增加的CXCR4表达(图22B)。
实施例7
评估小鼠模型中经转导的NK细胞
此实施例描述评估经修饰的表达异源核酸的NK细胞在过度增生性病症小鼠模型中的功能和效力的方法。然而，本领域技术人员将意识到偏离这些特定方法的方法也可用于在动物模型中评估经转导的NK细胞。
通过对免疫缺陷小鼠(诸如SCID、NOD/SCID、SCID-hu或SCID-rab小鼠)注射恶性浆细胞或通过对C57BL/KalwRij小鼠注射同种异体恶性浆细胞(诸如5T2MM、5T33或5TGM1细胞)产生骨髓瘤小鼠模型。在一个实例中，在NSG小鼠的尾静脉中注射多发性骨髓瘤细胞系并使其建立7-14天，之后通过静脉内输注NK细胞来治疗小鼠。将人类NK细胞活化(500IU/mlIL-2持续2-3天)，然后用包括编码萤光素酶或CXCR4的核酸的慢病毒载体转导。扩增之后(在EBV-LCL细胞上用500IU/ml IL-2扩增14天)，将经修饰的NK细胞(1百万至2千万个细胞)施用于小鼠。
在NK细胞输注后第7天、第14天和第21天处死小鼠，并确定骨(从股骨溢出的骨髓)中骨髓瘤细胞的％来评估不同NK细胞(经转导的相对于未经转导的)对肿瘤负荷的影响。通过对注射了用编码萤光素酶的载体转导的经修饰的NK细胞的小鼠进行生物发光成像来评估经修饰的NK细胞的存活和定位。
实施例8
治疗患有过度增生性病症的对象的方法
此实施例描述用表达异源核酸的经修饰的NK细胞治疗患有过度增生性病症的对象的方法。然而，本领域技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可用于成功地治疗或抑制对象的过度增生性病症。
患有过度增生性病症例如多发性骨髓瘤的对象经历血液成分分离来收集外周血单个核细胞。通过使用免疫磁性方法的阳性和/或阴性选择从PBMC分离NK细胞(例如CD56-阳性/CD3-阴性细胞)。将分离的NK细胞在含有500IU/ml IL-2的培养基中培养2天。然后使NK细胞与包括具有感兴趣的异源核酸的病毒载体的慢病毒粒子接触两天。所述异源核酸可为CXCR4、高亲和性CD16或两者。在一些实例中，所述载体还包括截短型CD34核酸。去除病毒粒子并加入含有500IU/ml IL-2和经辐射的饲养细胞的培养基(饲养细胞:NK细胞的比率为10:1)并将NK细胞扩增14-28天。如果载体包括CD34t，那么在加入IL-2和饲养细胞之前，使用CD34+免疫磁珠选择来富集表达CD34的NK细胞。可将经扩增的NK细胞冷冻保存以供后续使用，或可进行配制以施用于对象(例如在药学上可接受的载体中)。将包含106至1012个经扩增的NK细胞的组合物通过静脉内施用于对象。患有表达CD38的多发性骨髓瘤的患者也可由抗-CD38抗体(诸如达雷木单抗)来治疗。监控对象肿瘤的应答长达5年。
实施例9
慢病毒表达载体
使用Vectorbuilder设计服务(Cyagen Biosciences，Inc.，Santa Clara，CA)构建慢病毒表达载体。载体包括不同的启动子和EGFP或PGK启动子以及不同的人蛋白质。载体具有SEQ ID NO：8-17的序列，如表3所示。其他载体成分及其在每个序列中的位置如表4所示。
表3慢病毒表达载体
表4其他载体元件
表4继续
实施例10
与饲养细胞共培养的NK细胞的活化
在受100Gy照射的SMI-LCL存在或不存在下培养从人外周血分离的NK细胞。三天后，将细胞培养物在培养基上离心以去除死细胞，计数并用pLV[Exp]-PGK>EGFP:T2A:Luc(SEQ ID NO：14，其具有编码T2A肽和另外插入的密码子优化的萤光素酶的序列)进行慢病毒转导，使用(Takara Clontech)涂层板。再过三天后，对细胞重新计数并用10倍过量的LCL重新铺板。细胞自始至终维持在补充有10％热灭活的人AB血清、500IU/ml IL-2和2mM GlutaMAXTM补充剂的X-VIVOTM20培养基(Lonza)中并计数以确定倍数扩增。测试最初用LCL(10:1的比例)培养而未随后添加LCL的未转导的NK细胞用于比较。与在转导前未用LCL培养的细胞相比，在转导前用10倍过量的LCL培养的细胞具有改善的扩增，并且与未转导的细胞具有相似的倍数扩增(图23)。
实施例11
在转导前用IL-2培养的原代NK细胞的慢病毒转导
将来自PBMC的NK细胞与500U/ml IL-2培养0至5天，然后在RetroNectin涂层板中用20:1的MOI以pLV[Exp]-PGK>EGFP载体转导。转导后三天，通过流式细胞术测定细胞的GFP表达和活力。图24A显示了GFP+NK细胞的典型门控。显示了来自三个供体的实验的平均值和SEM(几何平均荧光强度(GMFI)GFP的log10转换值)(图24B)。这证实了在转导之前在IL-2存在下NK细胞的活化提供了有效转导并维持了NK细胞活力。
在用含有所示启动子序列和GFP的慢病毒载体转导之前，用IL-2刺激来自PBMC的NK细胞3天。转导后三天，通过流式细胞术检查NK细胞的GFP表达(百分比和GMFI)(图25A-C)。将经辐射的SMI-LCL饲养细胞添加到经转导的NK细胞中，再共培养14天(共20天)。通过将第6天EGFP％除以第20天EGFP％来量化NK细胞中转基因表达随时间的稳定性并表示为百分比(图25D)。PGK、EFS和SV40引物导致最大的转导效率(图25B)。然而，与PGK启动子相比，几种启动子提供了改善的转基因表达水平，包括EFS、SV40、CMV、CBH和EF1A启动子(图25C)。
测试了慢病毒载体内插入序列的不同组合在人NK细胞中的转导效率。用IL-2刺激来自PBMC的NK细胞3天，然后用慢病毒载体转导，该慢病毒载体含有编码如图26A所示的PGK启动子、GFP、P2A接头、IRES、截短型CD34蛋白和密码子优化的截短型CD34蛋白(CD34opt)的组合的插入序列。再过3天后，通过流式细胞术测量NK细胞的GFP和CD34的表面表达(图26A)。还测试了用编码CD34opt和EFS启动子的载体对NK细胞的转导(图26B)。将插入序列置于载体中GFP的远端似乎增强了其在人NK细胞中的转导效率。
还测试了在转导之前饲养细胞存在下用IL-2预刺激NK细胞的效果。用IL-2或IL-2+SMI-LCL饲养细胞(LCL+IL-2)刺激来自PBMC的NK细胞3天。在用20:1MOI以pLV-EFS-GFP-2A-CD34opt病毒粒子转导之前，先用抗CD56珠从共培养物中分离NK细胞。再过3天后，将SMI-LCL添加到两种条件中并培养NK细胞直到实验开始的第21天。通过流式细胞术检查NK细胞的GFP和CD34转基因表达(图27A)。在整个培养中频繁计数NK细胞数并计算倍数扩增(图27B)。通过将每种条件下所有细胞的倍数扩增乘以GFP+CD34+分数来计算出相对于输入的经转导细胞的总产率(图27C)。进行类似实验以确定在转导(20:1MOI的pLV-EFS-GFP-2A-CD34opt)之前用SMI-LCL刺激的最佳时期(2-7天)。转导后3天，在每种情况下，经转导的NK细胞第二次加入SMI-LCL，并跟踪培养直至实验开始的第21天。对于来自3个供体的实验，确定了相对于输入的经转导细胞的百分比、细胞的倍数扩增和经转导细胞的总产率(图27D)。在慢病毒转导之前用SMI-LCL饲养细胞预刺激人NK细胞似乎可以提高NK细胞经培养扩增后经转导细胞的总产率。
用SMI-LCL饲养细胞加IL-2刺激来自PBMC的NK细胞5天。在不同剂量的BX795存在下，在用pLV-EFS-GFP-2A-CD34opt病毒粒子转导之前，用抗CD56珠从共培养物中分离NK细胞。一天后，将NK细胞交换入不含BX795的培养基。再过两天后，再次添加SMI-LCL，培养NK细胞直至实验开始的第21天，始终监控细胞数量。通过流式细胞术测定NK细胞的GFP和CD34表达。通过将细胞的倍数扩增乘以GFP+CD34+细胞分数，计算出相对于输入细胞的经转导细胞的总产率(图28A)。进行类似实验以比较用(i)IL-2或(ii)IL-2+SMI-LCL饲养细胞刺激5天，然后在添加或不添加1.5μM BX795下转导的细胞(图28B)。BX795组合SMI-LCL饲养细胞的预刺激增加了慢病毒转导的离体扩增的人NK细胞的后续增殖。
通过抗CD3免疫磁珠耗竭，然后进行抗CD56免疫磁珠阳性选择，从PBMC中分离NK细胞。用SMI-LCL加IL-2刺激细胞4-5天。产生的细胞在1.5μM BX795存在下，用编码密码子优化的截短型CD34、截短型CD19或截短型CD4的慢病毒载体转导。1天后，将细胞交换入不含BX795的培养基。再过2天后，使用识别CD34、CD19或CD4的免疫磁珠选择经转导的NK细胞。阳性选择的NK细胞用SMI-LCL培养，然后细胞增殖直至实验开始后第21天(图29A和29B)。贯穿整个过程监控细胞数量并通过将细胞的倍数扩增乘以GFP和转基因表达均为阳性的分数来计算相对于输入细胞的经转导细胞的总产率。
如以上图29A和29B所述经转导和扩增的人NK细胞如所示与K562靶细胞铺板(1：1比例)或用PMA加离子霉素处理。2小时后用抗CD107a抗体测定脱粒并在6小时后通过针对IFN-γ和TNF-β的细胞内流式细胞术染色测定细胞因子产生。用SMI-LCL饲养细胞扩增的慢病毒转导的人NK细胞显示完全脱粒及IFN-γ和TNF-β产生(图30)。
作为上述的补充或替代，描述了以下实施方案：
实施方案1涉及一种产生包含一或多种异源核酸的自然杀伤(NK)细胞的方法，其包括：在白细胞介素-2(IL-2)存在下培养分离的NK细胞群体至少两天以产生经活化的NK细胞群体；用包含一或多种异源核酸的病毒载体转导所述经活化的NK细胞群体以产生经转导的NK细胞群体；以及在IL-2和经辐射的饲养细胞存在下培养所述经转导的NK细胞群体以产生扩增的经转导的NK细胞群体。
实施方案2涉及如实施方案1所述的方法，其中：a)在IL-2存在下和经辐射的饲养细胞不存在下培养NK细胞群体，和/或在经辐射的饲养细胞不存在下用病毒载体转导经活化的NK细胞；或者b)在IL-2和经辐射的饲养细胞存在下培养NK细胞群体，和/或在经辐射的饲养细胞存在下用病毒载体转导经活化的NK细胞。
实施方案3涉及如实施方案1或实施方案2所述的方法，其中在一或多种细胞因子存在下培养所述分离的NK细胞群体包括在含有500IU/ml IL-2的细胞培养基中培养所述分离的NK细胞群体。
实施方案4涉及如实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述包含一或多种异源核酸的病毒载体为慢病毒载体。
实施方案5涉及如实施方案4所述的方法，其中所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：8-17任一具有至少90％序列同一性的核酸序列或由所述核酸序列组成。
实施方案6涉及如实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述经辐射的饲养细胞与所述经转导的NK细胞的比率为10:1。
实施方案7涉及如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述经辐射的饲养细胞包含经EB病毒转化的类淋巴母细胞细胞系或K562细胞。
实施方案8涉及如实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述异源核酸编码：高亲和性CD16(CD16-V158)、CXCR4、CCR7、CXCR3、CD34、双阴性TGFβII型受体或VLA-4、LFA-1；与在肿瘤细胞上表达的抗原特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述异源核酸编码与CD19、CD20、CD33、CD138、CS1、GD2、HER2、erbB2-、CEA、EpCAM、NKG2D-L或TRAIL-R1特异性结合的CAR；编码缺少胞内结构域的截短型CD34蛋白质的核酸分子；和/或短发夹状RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或反义核酸。
实施方案9涉及如实施方案2b所述的方法，其中在IL-2和经辐射的饲养细胞存在下培养所述NK细胞群体以产生经活化的NK细胞群体，并使用CD19免疫耗竭使饲养细胞与经活化的NK细胞充分地分离。
实施方案10涉及一种治疗患有肿瘤、过度增生性疾病或病毒性感染的对象的方法，其包括：自对象或供体获得分离的自然杀伤(NK)细胞群体；在白细胞介素-2(IL-2)存在下培养所述分离的NK细胞群体至少两天以产生经活化的NK细胞群体；用包含一或多种异源核酸的病毒载体转导所述经活化的NK细胞群体以产生经转导的NK细胞群体；在IL-2和经辐射的饲养细胞存在下培养所述经转导的NK细胞群体以产生扩增的经转导的NK细胞群体；以及向所述对象施用包含所述扩增的经转导的NK细胞群体的组合物。
实施方案11涉及如实施方案10所述的方法，其中：a)在IL-2存在下和经辐射的饲养细胞不存在下培养NK细胞群体；和/或在经辐射的饲养细胞不存在下用病毒载体转导经活化的NK细胞；或者b)在IL-2和经辐射的饲养细胞存在下培养NK细胞群体；和/或在经辐射的饲养细胞存在下用病毒载体转导经活化的NK细胞。
实施方案12涉及如实施方案10或实施方案11所述的方法，其中在一或多种细胞因子存在下培养所述分离的NK细胞群体包括在含有500IU/ml IL-2的细胞培养基中培养所述分离的NK细胞群体。
实施方案13涉及如实施方案10至12中任一项所述的方法，其中所述包含一或多种异源核酸的病毒载体为慢病毒载体。
实施方案14涉及如实施方案13所述的方法，其中所述慢病毒载体包含与SEQ IDNO：8-17任一具有至少90％序列同一性的核酸序列或由所述核酸序列组成。
实施方案15涉及如实施方案13所述的方法，其中所述慢病毒载体包含与PGK、EFS或SV40启动子可操作地连接的感兴趣核酸。
实施方案16涉及如实施方案10至15中任一项所述的方法，其中所述经辐射的饲养细胞与所述经转导的NK细胞的比率为10:1。
实施方案17涉及如实施方案10至16中任一项所述的方法，其中所述经辐射的饲养细胞包含经EB病毒转化的类淋巴母细胞细胞系或K562细胞。
实施方案18涉及如实施方案10至17中任一项所述的方法，其中所述异源核酸编码：高亲和性CD16(CD16-V158)、CXCR4、CCR7、CXCR3、CD34、双阴性TGFβII型受体或VLA-4、LFA-1；与在肿瘤细胞上表达的抗原特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述异源核酸编码与CD19、CD20、CD33、CD138、CS1、GD2、HER2、erbB2-、CEA、EpCAM、NKG2D-L或TRAIL-R1特异性结合的CAR；编码缺少胞内结构域的截短型CD34蛋白质的核酸分子；和/或短发夹状RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或反义核酸。
实施方案19涉及如实施方案11b所述的方法，其中在IL-2和经辐射的饲养细胞存在下培养所述NK细胞群体以产生经活化的NK细胞群体，并使用CD19免疫耗竭使饲养细胞与经活化的NK细胞充分地分离。
实施方案20涉及如实施方案10至19中任一项所述的方法，其中所述包含扩增的经转导的NK细胞群体的组合物进一步包含药学上可接受的载体。
实施方案21涉及包含一或多种异源核酸的自然杀伤细胞，其通过实施方案1至9中任一项所述的方法产生。
实施方案22涉及一种组合物，其包含含有一或多种异源核酸的自然杀伤细胞和药学上可接受的载体，其中所述自然杀伤细胞通过实施方案10至20中任一项所述的方法产生。
鉴于本公开的原理可适用的许多可能的实施方案，应意识到所说明的实施方案仅是实例且不应视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由以下权利要求书来限定。因此我们请求保护在这些权利要求范围和精神内的所有内容作为我们的发明。
序列表
<110> 美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）
<120> 产生经修饰的自然杀伤细胞的方法及使用方法
<130> 4239-96570-04
<150> US 62/366,493
<151> 2016-07-25
<150> PCT/US2017/043774
<151> 2017-07-25
<150> US 15/801,085
<151> 2017-11-01
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人源
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1059)
<400> 1
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Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu
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<220>
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85 90 95
agt gac ccg gtg cag cta gaa gtc cat atc ggc tgg ctg ttg ctc cag 336
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
gcc cct cgg tgg gtg ttc aag gag gaa gac cct att cac ctg agg tgt 384
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
cac agc tgg aag aac act gct ctg cat aag gtc aca tat tta cag aat 432
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
ggc aaa ggc agg aag tat ttt cat cat aat tct gac ttc tac att cca 480
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
aaa gcc aca ctc aaa gac agc ggc tcc tac ttc tgc agg ggg ctt gtt 528
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
ggg agt aaa aat gtg tct tca gag act gtg aac atc acc atc act caa 576
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
ggt ttg gca gtg tca acc atc tca tca ttc ttt cca cct ggg tac caa 624
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
gtc tct ttc tgc ttg gtg atg gta ctc ctt ttt gca gtg gac aca gga 672
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
cta tat ttc tct gtg aag aca aac att cga agc tca aca aga gac tgg 720
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
aag gac cat aaa ttt aaa tgg aga aag gac cct caa gac aaa tga 765
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 6
<211> 254
<212> PRT
<213> 人源
<400> 6
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 7
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的高亲和性CD16
<400> 7
atgtggcagc tgctgctgcc aaccgccctg ctgctgctgg tgtccgccgg aatgaggaca 60
gaggacctgc caaaggccgt ggtgtttctg gagccccagt ggtacagagt gctggagaag 120
gactctgtga ccctgaagtg ccagggcgcc tattctcctg aggataacag cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctgat cagctcccag gcctctagct acttcatcga cgcagcaacc 240
gtggacgatt ccggagagta tcggtgccag accaacctga gcacactgtc cgatccagtg 300
cagctggagg tgcacatcgg atggctgctg ctgcaggcac ctagatgggt gtttaaggag 360
gaggacccca tccacctgcg ctgtcacagc tggaagaata ccgccctgca caaggtgaca 420
tacctgcaga acggcaaggg caggaagtac ttccaccaca attctgactt ttatatcccc 480
aaggccaccc tgaaggattc cggctcttat ttctgccgcg gcctggtggg cagcaagaac 540
gtgtcctctg agaccgtgaa tatcaccatc acacagggcc tggccgtgtc cacaatcagc 600
tccttctttc cccctggcta ccaggtgtct ttctgtctgg tcatggtgct gctgtttgcc 660
gtggacacag gcctgtattt ctccgtgaag accaacatcc ggtctagcac aagagactgg 720
aaggatcaca agttcaagtg gcggaaggac cctcaggata agtga 765
<210> 8
<211> 7495
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成慢病毒载体
<400> 8
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60
tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 480
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600
attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660
aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720
gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780
tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960
caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020
acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080
tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140
gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200
ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260
ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320
ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380
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ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgcta 1800
gcttttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata 1860
atagcaacag acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt 1920
actagtgatt atcggatcaa ctttgtatag aaaagttgta gttattaata gtaatcaatt 1980
acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 2040
ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 2100
cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 2160
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 2220
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 2280
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 2340
tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 2400
gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 2460
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gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 2640
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 2700
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 2760
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 2820
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 2880
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 2940
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 3000
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 3060
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 3120
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 3180
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 3240
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaaacc 3300
cagctttctt gtacaaagtg gtgataatcg aattccgata atcaacctct ggattacaaa 3360
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tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc 3660
gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg 3720
gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt 3780
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cggatctccc tttgggccgc ctccccgcat cgggaattcc cgcggttcgc tttaagacca 3960
atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa 4020
gggctaattc actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg 4080
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 4140
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 4200
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca 4260
tgtcatctta ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg 4320
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 4380
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 4440
tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 4500
ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 4560
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aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 5460
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tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 5640
gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 5700
aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 5760
agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 5820
acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 5880
actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 5940
accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 6000
actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 6060
cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 6120
cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 6180
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aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 6420
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<212> DNA
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<220>
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tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
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gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 2340
ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct ccccaccccc 2400
aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg 2460
ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg 2520
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gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg cgcgctgcct 2640
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gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag 2880
cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct 2940
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gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag 3300
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tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat 3660
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caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg 4560
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cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 6300
ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 6360
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ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc tgcaagctt 8639
<210> 12
<211> 7704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成慢病毒载体
<400> 12
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60
tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
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cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg 3720
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gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 2640
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 2700
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 2760
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 2820
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 2880
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggga 2940
agcggagcca cgaacttctc tctgttaaag caagcaggag atgttgaaga aaaccccggg 3000
cctatgaacc ggggagtccc ttttaggcac ttgcttctgg tgctgcaact ggcgctcctc 3060
ccagcagcca ctcagggaaa gaaagtggtg ctgggcaaaa aaggggatac agtggaactg 3120
acctgtacag cttcccagaa gaagagcata caattccact ggaaaaactc caaccagata 3180
aagattctgg gaaatcaggg ctccttctta actaaaggtc catccaagct gaatgatcgc 3240
gctgactcaa gaagaagcct ttgggaccaa ggaaactttc ccctgatcat caagaatctt 3300
aagatagaag actcagatac ttacatctgt gaagtggagg accagaagga ggaggtgcaa 3360
ttgctagtgt tcggattgac tgccaactct gacacccacc tgcttcaggg gcagagcctg 3420
accctgacct tggagagccc ccctggtagt agcccctcag tgcaatgtag gagtccaagg 3480
ggtaaaaaca tacagggggg gaagaccctc tccgtgtctc agctggagct ccaggatagt 3540
ggcacctgga catgcactgt cttgcagaac cagaagaagg tggagttcaa aatagacatc 3600
gtggtgctag ctttccagaa ggcctccagc atagtctata agaaagaggg ggaacaggtg 3660
gagttctcct tcccactcgc ctttacagtt gaaaagctga cgggcagtgg cgagctgtgg 3720
tggcaggcgg agagggcttc ctcctccaag tcttggatca cctttgacct gaagaacaag 3780
gaagtgtctg taaaacgggt tacccaggac cctaagctcc agatgggcaa gaagctcccg 3840
ctccacctca ccctgcccca ggccttgcct cagtatgctg gctctggaaa cctcaccctg 3900
gcccttgaag cgaaaacagg aaagttgcat caggaagtga acctggtggt gatgagagcc 3960
actcagctcc agaaaaattt gacctgtgag gtgtggggac ccacctcccc taagctgatg 4020
ctgagcttga aactggagaa caaggaggca aaggtctcga agcgggagaa ggcggtgtgg 4080
gtgctgaacc ctgaggcggg gatgtggcag tgtctgctga gtgactcggg acaggtcctg 4140
ctggaatcca acatcaaggt tctgcccaca tggtccaccc cggtgcagcc aatggccctg 4200
attgtgctgg ggggcgtcgc cggcctcctg cttttcattg ggctaggcat cttcttctgt 4260
gtcaggtgcc ggcactgaac ccagctttct tgtacaaagt ggtgataatc gaattccgat 4320
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 4380
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 4440
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 4500
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 4560
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 4620
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 4680
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 4740
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 4800
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 4860
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca tcgggaattc 4920
ccgcggttcg ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 4980
aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaagacaaga tctgcttttt 5040
gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta 5100
gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc 5160
cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa 5220
atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa 5280
tgaatatcag agagtgagag gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 5340
aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 5400
tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggctctagc tatcccgccc ctaactccgc 5460
ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 5520
tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag 5580
gaggcttttt tggaggccta gggacgtacc caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc 5640
gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 5700
taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 5760
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg 5820
cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 5880
cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 5940
ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 6000
cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 6060
ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 6120
tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 6180
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 6240
aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 6300
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 6360
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 6420
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 6480
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 6540
agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 6600
aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 6660
cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 6720
cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 6780
actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 6840
cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 6900
ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 6960
ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 7020
gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 7080
gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 7140
ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 7200
cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 7260
caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 7320
taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 7380
cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 7440
cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 7500
gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 7560
aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 7620
cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 7680
tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 7740
acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 7800
ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag agagaaaggc ggacaggtat 7860
ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 7920
tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 7980
tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 8040
ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 8100
gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 8160
cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 8220
gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 8280
agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac 8340
tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 8400
aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag 8460
ctggagctgc aagctt 8476
<210> 19
<211> 8203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成慢病毒载体
<400> 19
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60
tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 480
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600
attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660
aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720
gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780
tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960
caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020
acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080
tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140
gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200
ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260
ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320
ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380
atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
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acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
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agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgcta 1800
gcttttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata 1860
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actagtgatt atcggatcaa ctttgtatag aaaagttggg ctccggtgcc cgtcagtggg 1980
cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgatccg 2040
gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc 2100
tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt 2160
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ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 2340
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 2400
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 2460
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 2520
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 2580
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 2640
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 2700
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 2760
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 2820
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 2880
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggga 2940
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cctatgccac ctcctcgcct cctcttcttc ctcctcttcc tcacccccat ggaagtcagg 3060
cccgaggaac ctctagtggt gaaggtggaa gagggagata acgctgtgct gcagtgcctc 3120
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gagctgttcc ggtggaatgt ttcggaccta ggtggcctgg gctgtggcct gaagaacagg 3420
tcctcagagg gccccagctc cccttccggg aagctcatga gccccaagct gtatgtgtgg 3480
gccaaagacc gccctgagat ctgggaggga gagcctccgt gtctcccacc gagggacagc 3540
ctgaaccaga gcctcagcca ggacctcacc atggcccctg gctccacact ctggctgtcc 3600
tgtggggtac cccctgactc tgtgtccagg ggccccctct cctggaccca tgtgcacccc 3660
aaggggccta agtcattgct gagcctagag ctgaaggacg atcgcccggc cagagatatg 3720
tgggtaatgg agacgggtct gttgttgccc cgggccacag ctcaagacgc tggaaagtat 3780
tattgtcacc gtggcaacct gaccatgtca ttccacctgg agatcactgc tcggccagta 3840
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aggaggaaaa gaaagcgaat gactgacccc accaggagat tctaaaccca gctttcttgt 4020
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ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 4140
cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 4200
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gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 4440
aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 4500
tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 4560
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ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc 4920
ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt 4980
attcagtatt tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt 5040
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ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 5880
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agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 6180
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gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 6300
gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 6360
attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 6420
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cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 6660
gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 6720
cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 6780
gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 6840
ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 6900
acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 6960
ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 7020
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gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 8040
actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 8100
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attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctgcaag ctt 8203

Claims (20)

1.一种产生包含一或多种异源核酸的自然杀伤(NK)细胞的方法，其包括：
在500IU/ml白细胞介素-2(IL-2)和经辐射的饲养细胞存在下培养分离的NK细胞群体2-5天以产生经活化的NK细胞群体；
用包含一或多种异源核酸的病毒载体转导所述经活化的NK细胞群体以产生经转导的NK细胞群体，其中在BX795的存在下进行转导；以及
在500IU/ml的IL-2和经辐射的饲养细胞存在下培养所述经转导的NK细胞群体以产生扩增的经转导的NK细胞群体。
2.权利要求1的方法，其中在IL-2存在下并且不添加其他细胞因子，培养所述分离的NK细胞群体。
3.权利要求1或2的方法，其中所述包含一或多种异源核酸的病毒载体为慢病毒载体。
4.权利要求3的方法，其中所述慢病毒载体由SEQ ID NO：8-19任一的核酸序列组成。
5.权利要求1或2的方法，其中所述经辐射的饲养细胞与所述经转导的NK细胞的比率为10:1。
6.权利要求1或2的方法，其中所述经辐射的饲养细胞包含经EB病毒转化的类淋巴母细胞细胞系或K562细胞。
7.权利要求1或2的方法，其中所述异源核酸编码：
高亲和性CD16、CXCR4、CCR7、CXCR3、CD34、双阴性TGFβII型受体、VLA-4、LFA-1、CD19或CD4；
与在肿瘤细胞上表达的抗原特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与CD19、CD20、CD33、CD138、CS1、GD2、HER2、erbB2、CEA、EpCAM、NKG2D-L或TRAIL-R1特异性结合；
缺少胞内结构域的截短型CD34蛋白质；和/或
短发夹状RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或反义核酸。
8.权利要求1或2的方法，其中使用CD19免疫耗竭和/或CD56免疫选择使所述饲养细胞与所述经活化的NK细胞充分地分离。
9.包含通过如下方法获得的扩增的经转导的NK细胞群体的组合物在制备用于治疗患有肿瘤或病毒性感染的对象的药物中的用途，所述方法包括：
自对象或供体获得分离的自然杀伤(NK)细胞群体；
在500IU/ml白细胞介素-2(IL-2)和经辐射的饲养细胞存在下培养分离的NK细胞群体2-5天以产生经活化的NK细胞群体；
用包含一或多种异源核酸的病毒载体转导所述经活化的NK细胞群体以产生经转导的NK细胞群体，其中在BX795的存在下进行转导；以及
在500IU/ml的IL-2和经辐射的饲养细胞存在下培养所述经转导的NK细胞群体以产生扩增的经转导的NK细胞群体。
10.权利要求9的用途，其中在IL-2存在下并且不添加其他细胞因子，培养所述分离的NK细胞群体。
11.权利要求9或10的用途，其中所述包含一或多种异源核酸的病毒载体为慢病毒载体。
12.权利要求11的用途，其中所述慢病毒载体由SEQ ID NO：8-19任一的核酸序列组成。
13.权利要求12的用途，其中所述慢病毒载体包含与PGK、EFS或SV40启动子可操作地连接的所述一或多种异源核酸。
14.权利要求9或10的用途，其中所述经辐射的饲养细胞与所述经转导的NK细胞的比率为10:1。
15.权利要求9或10的用途，其中所述经辐射的饲养细胞包含经EB病毒转化的类淋巴母细胞细胞系或K562细胞。
16.权利要求9或10的用途，其中所述异源核酸编码：
高亲和性CD16、CXCR4、CCR7、CXCR3、CD34、双阴性TGFβII型受体、VLA-4、LFA-1、CD19或CD4；
与在肿瘤细胞上表达的抗原特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与CD19、CD20、CD33、CD138、CS1、GD2、HER2、erbB2、CEA、EpCAM、NKG2D-L或TRAIL-R1特异性结合；
缺少胞内结构域的截短型CD34蛋白质；和/或
短发夹状RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或反义核酸。
17.权利要求9或10的用途，其中使用CD19免疫耗竭和/或CD56免疫选择使所述饲养细胞与所述经活化的NK细胞充分地分离。
18.权利要求9或10的用途，其中包含所述扩增的经转导的NK细胞群体的所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
19.一种产生包含一或多种异源核酸的自然杀伤(NK)细胞的方法，包括：
在500IU/ml白细胞介素-2(IL-2)和经辐射的饲养细胞存在下培养分离的NK细胞群体2-5天以产生经活化的NK细胞群体；
在0.75-3μM的BX795存在下以包含一或多种异源核酸的病毒载体转导所述经活化的NK细胞群体以产生经转导的NK细胞群体；以及
在500IU/ml的IL-2和经辐射的饲养细胞存在下培养所述经转导的NK细胞群体以产生包含所述一或多种异源核酸的扩增的经转导的NK细胞群体。
20.权利要求19的方法，其中在IL-2存在下并且不添加其他细胞因子，培养所述分离的NK细胞群体。
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