CN115768890A - 通过分子和物理启动对t细胞免疫疗法的热控制 - Google Patents

通过分子和物理启动对t细胞免疫疗法的热控制 Download PDF

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穆罕默德·H·阿贝迪
米哈伊尔·夏皮罗
丹·I·皮拉纳
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Abstract

本文公开的包括适于通过分子和物理启动的组合在治疗性T细胞的时空调节中使用的方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，提供了热生物开关，所述热生物开关允许T细胞感测温度的微小改变并且将其用作启动遗传回路的输入。本文还公开了T细胞活性传感器。提供了能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导有效载荷表达的遗传回路。在一些实施方案中，提供了热启动免疫细胞和使用方法。还公开了防止T细胞耗尽的振荡器回路和方法。

Description

通过分子和物理启动对T细胞免疫疗法的热控制
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年4月15日提交的美国临时专利申请系列第63/010525号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
关于联邦赞助R&D的声明
本发明根据由DARPA授予的拨款号HR0011-14-1-0780在政府支持下进行。美国政府在本发明中具有某些权利。
序列表的引用
本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表被提供为题为30KJ_302427_WO的文件，创建于2021年4月14日，大小是384千字节。电子格式的序列表的信息通过引用以其整体并入本文。
背景
领域
本公开内容总体上涉及T细胞疗法领域，并且更具体地涉及T细胞活性的时空控制。
对相关技术的描述
与小分子和生物疗法不同，细胞具有在体内导航、持续存在和增殖的天然能力，提供更靶向和持续的疾病治疗的潜力。这种潜力通过细胞探测、加工和响应其环境并且进行宽范围的复杂行为(这些行为可以使用合成生物学的工具进行工程化)的能力增强。在被开发用于治疗的细胞类型中，T细胞由于其在癌症、感染性疾病和自身免疫性紊乱中的重要作用，以及其相对容易分离、遗传修饰和再移植而成为最有希望的细胞之一。例如，这种潜力已经在被工程化以表达模块靶向嵌合抗原受体(CAR)，允许它们特异性消除癌症诸如携带CD19抗原的淋巴瘤的T细胞中实现。遗憾的是，将这些成功的结果转化到实体瘤一直具有挑战性，在实体瘤中，CAR T细胞遇到更加免疫抑制的环境以及由于健康组织中存在肿瘤过表达的表位有时会有致命的击中靶未击中肿瘤毒性(on-target off-tumor toxicity)的风险。同样，使用T细胞通过局部免疫抑制治疗自身免疫性疾病的新方法也有降低靶组织外的重要免疫系统活性的风险。寻求降低脱靶毒性的现有的战略使用另外的靶识别元件或化学触发杀伤开关。然而，仅仅通过分子标志物确保完全识别可能是困难的，并且过早终止使用杀伤开关的T细胞疗法会关闭其有益的治疗作用。
正在开发遗传工程化T细胞，以进行多种治疗功能。然而，不存在稳健的机制来从外部控制在体内特定位置处的T细胞的活性。这样的时空控制可以有助于减轻针对实体瘤的应用诸如T细胞免疫疗法中由于分子特异性不完全而产生的潜在脱靶毒性。温度是可以使用诸如聚焦超声和磁热疗的技术递送至体内靶组织的多功能外部控制信号。对用于在耐受的温度范围(例如37℃-42℃)介导T细胞中遗传回路的热启动的组合物、方法、系统和试剂盒存在需求。对能够调节热激活的幅度和持续时间的遗传结构(geneticarchitectures)存在需求。对用于指导T细胞在被部署到体内之后的活性的组合物、方法、系统和试剂盒存在需求。对用于时空控制T细胞活性的组合物、方法、系统和试剂盒存在需求。
概述
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，核酸组合物包含：(a)可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因的转录，以产生有效载荷转录物；或者(b)可操作地连接至包含反式激活因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下诱导所述反式激活因子基因的转录以产生反式激活因子转录物，其中所述反式激活因子转录物能够被翻译以产生反式激活因子；并且其中，在存在反式激活因子和反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：各自可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸和包含反式激活因子基因的第二多核苷酸的第一诱导型启动子和第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，其中，在存在所述反式激活因子和反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，并且其中所述多顺反子转录物能够被翻译以产生反式激活因子和有效载荷蛋白和/或有效载荷RNA剂。
在一些实施方案中，第二启动子包含反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中反式激活因子在不存在反式激活因子结合化合物的情况下不能结合反式激活因子识别序列。在一些实施方案中，反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝包括tet操纵基因(TetO)的一个或更多个拷贝。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，核酸组合物包含：(a)可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因的转录，以产生有效载荷转录物；或者(b)可操作地连接至包含反式激活因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下诱导所述反式激活因子基因的转录以产生反式激活因子转录物，其中所述第二启动子包括反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中所述反式激活因子在存在所述反式激活因子结合化合物的情况下不能结合所述反式激活因子识别序列，其中所述反式激活因子转录物能够被翻译以产生反式激活因子；并且其中，在存在反式激活因子但不存在反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：各自可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸和包含反式激活因子基因的第二多核苷酸的第一诱导型启动子和第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，其中所述第二启动子包括反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中所述反式激活因子在存在所述反式激活因子结合化合物的情况下不能结合所述反式激活因子识别序列，其中，在存在所述反式激活因子但不存在反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，并且其中所述多顺反子转录物能够被翻译以产生反式激活因子和有效载荷蛋白和/或有效载荷RNA剂。
在一些实施方案中，反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝包括tet操纵基因(TetO)的一个或更多个拷贝。在一些实施方案中，第二启动子包括四环素应答元件(TRE)，并且其中TRE包括tet操纵基因(TetO)的一个或更多个拷贝。在一些实施方案中，反式激活因子包括反向四环素控制的反式激活因子(reverse tetracycline-controlledtransactivator，rtTA)。在一些实施方案中，反式激活因子包括四环素控制的反式激活因子(tTA)。在一些实施方案中，反式激活因子结合化合物包括四环素、多西环素或其衍生物。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接至串联基因表达元件。在一些实施方案中，串联基因表达元件是内部核糖体进入位点(IRES)、口蹄疫病毒2A肽(F2A)、马鼻炎A型病毒2A肽(E2A)、猪捷申病毒(porcine teschovirus)2A肽(P2A)或东亚细亚病毒(Thosea asigna virus)2A肽(T2A)或其任何组合。在一些实施方案中，有效载荷蛋白和反式激活因子被表达为单独的蛋白。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含嵌合抗原受体(CAR)基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导CAR基因的转录，以产生CAR转录物，其中所述CAR转录物能够被翻译以产生CAR，并且其中所述CAR的接合(engagement)产生免疫细胞刺激，并且从而诱导所述第一诱导型启动子。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含重组酶基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述重组酶基因的转录，以产生重组酶转录物，并且其中所述重组酶转录物能够被翻译以产生重组酶；第三启动子和包含有效载荷基因的第二多核苷酸，其中，在不存在重组事件的情况下，所述第三启动子和所述第二多核苷酸不被可操作地连接，其中所述重组酶能够催化重组事件，并且其中所述第三启动子和所述第二多核苷酸在所述重组事件之后被可操作地连接，使得所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
在一些实施方案中，重组事件包括去除侧翼为重组酶靶位点的序列或使侧翼为重组酶靶位点的序列倒位。在一些实施方案中，第二多核苷酸侧翼为重组酶靶位点。在一些实施方案中，在重组事件之前，所述有效载荷基因的序列相对于启动子是倒位的。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：位于第三启动子与有效载荷基因之间的至少一个终止盒，其中终止盒包括一个或更多个终止序列，并且其中一个或更多个终止盒侧翼为重组酶靶位点。在一些实施方案中，有效载荷转录物能够被翻译以产生有效载荷蛋白。在一些实施方案中，至少一个终止盒被配置为防止有效载荷基因的转录和/或有效载荷转录物的翻译。在一些实施方案中，一个或更多个终止序列包括多腺苷酸化信号、终止密码子、移码突变或其任何组合。在一些实施方案中，第三启动子包括遍在性启动子。在一些实施方案中，遍在性启动子是巨细胞病毒(CMV)介导的早期启动子、CMV启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)LTR、RSV启动子、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自痘苗病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长响应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β驱动蛋白(β-KIN)、人类ROSA 26基因座、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、3-磷酸甘油酸激酶启动子、巨细胞病毒增强子、人类β肌动蛋白(HBA)启动子、鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、CAG启动子、CBH启动子或其任何组合。在一些实施方案中，重组酶是Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022、HP1、γ6、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1、R4及其衍生物或其任何组合。在一些实施方案中，重组酶是Flp重组酶，并且所述重组酶靶位点是FRT位点。在一些实施方案中，重组酶是Cre重组酶，并且所述重组酶靶位点为loxP位点。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含活性调控因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述活性调控因子基因的转录，以产生活性调控因子转录物，其中所述活性调控因子转录物能够被翻译和/或加工以产生活性调控因子；并且其中所述活性调控因子能够降低T细胞活性。
在一些实施方案中，活性调控因子包括参与TCR/CAR信号转导的选自以下的泛素连接酶：c-CBL、CBL-B、ITCH、R F125、R F128、WWP2或其任何组合；在一些实施方案中，活性调控因子包括选自以下的负性调控酶(negative regulatory enzyme)：SHP1、SHP2、SHTP1、SHTP2、CD45、CSK、CD148、PTPN22、DGKα、DGKζ、DRAK2、HPK1、HPK1、STS1、STS2、SLAT或其任何组合。在一些实施方案中，活性调控因子是选自以下的负性调控支架/衔接蛋白：PAG、LIME、NTAL、LAX31、SIT、GAB2、GRAP、ALX、SLAP、SLAP2、DOK1、DOK2或其任何组合。在一些实施方案中，活性调控因子是选自以下的激活TCR信号传导组分的显性负性形式：ZAP70、LCK、FYN、NCK、VAV1、SLP76、ITK、ADAP、GADS、PLCγ1、LAT、p85、SOS、GRB2、NFAT、p50、p65、API、RAPl、CRKII、C3G、WAVE2、ARP2/3、ABL、ADAP、RIAM、SKAP55或其任何组合。在一些实施方案中，活性调控因子包括选自以下的负性共调控受体的胞质尾部：CD5、PD1、CTLA4、BTLA、LAG3、B7-H1、B7-1、CD160、TFM3、2B4、TIGIT或其任何组合。在一些实施方案中，活性调控因子以来源于LAT、PAG、LCK、FYN、LAX、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8a、PD1、SRC、LYN或其任何组合的靶向序列靶向质膜。在一些实施方案中，活性调控因子降低或消除选自以下的途径和/或功能：Ras信号传导、PKC信号传导、钙依赖性信号传导、NF-κB信号传导、NFAT信号传导、细胞因子分泌、T细胞存活、T细胞增殖、CTL活性、脱粒、肿瘤细胞杀伤、分化或其任何组合。
在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物，其中所述有效载荷转录物能够被翻译以产生有效载荷蛋白。
在一些实施方案中，第一诱导型启动子感测T细胞活性。在一些实施方案中，T细胞活性包括T细胞模拟、T细胞激活、细胞因子分泌、T细胞存活、T细胞增殖、CTL活性、T细胞脱粒和T细胞分化中的一种或更多种。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含振荡器基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述振荡器基因的转录，以产生振荡器转录物，其中所述振荡器转录物能够被翻译和/或加工以产生振荡器；和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第二启动子能够诱导有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物，其中有效载荷转录物能够被翻译以产生有效载荷蛋白，并且其中所述振荡器能够调节有效载荷转录物和/或有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性。
有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性可以与振荡器的浓度、定位、稳定性和/或活性呈负相关。在一些实施方案中，振荡器的浓度、定位、稳定性和/或活性与有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性呈负相关。在一些实施方案中，振荡器基因编码siRNA、shRNA、反义RNA寡核苷酸、反义miRNA、反式剪接RNA、引导RNA、单引导RNA、crRNA、tracrRNA、反式剪接RNA、pre-mRNA、mRNA或其任何组合。在一些实施方案中，振荡器包括蛋白酶。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括降解决定子(degron)和蛋白酶能够切割以暴露所述降解决定子的切割位点，并且其中有效载荷蛋白的降解决定子被暴露将有效载荷蛋白改变为有效载荷蛋白不稳定状态。在一些实施方案中，蛋白酶包括烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、烟草脉斑病毒(TVMV)蛋白酶、丙型肝炎病毒蛋白酶(HCVP)、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括笼形多肽(cage polypeptide)，其中笼形多肽包括：(a)螺旋束，包括2个与7个之间的α-螺旋，其中所述螺旋束包括：(i)结构区；和(ii)闩锁区，其中所述闩锁区包括位于所述闩锁区内的降解决定子，其中所述结构区与所述闩锁区相互作用以防止所述降解决定子的活性；以及(b)连接每个α螺旋的氨基酸接头。在一些实施方案中，振荡器包括能够与笼形多肽结构区结合的钥匙形多肽，从而置换闩锁区并激活降解决定子。
在一些实施方案中，振荡器包括沉默子效应物。在一些实施方案中，沉默子效应物包括微RNA(miRNA)、前体微RNA(pre-miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、其前体、其衍生物或其组合。在一些实施方案中，有效载荷基因包含3’UTR和/或5’UTR，并且其中所述有效载荷基因的3’UTR和/或5’UTR包含一个或更多个沉默子效应物结合序列。在一些实施方案中，所述沉默子效应物能够结合一个或更多个沉默子效应物结合序列，从而降低有效载荷转录物的稳定性和/或降低有效载荷转录物的翻译。在一些实施方案中，一个或更多个沉默子效应物结合序列包含miRNA结合位点。在一些实施方案中，有效载荷基因包含约1个沉默子效应物结合序列至约10个沉默子结合序列。在一些实施方案中，一个或更多个沉默子效应物结合序列的长度是约8个核苷酸至约22个核苷酸。在一些实施方案中，沉默子效应物包括与所述一个或更多个沉默子效应物结合序列的至少5个连续核苷酸互补的互补区。在一些实施方案中，沉默子效应物包括与一个或更多个沉默子效应物结合序列至少约50％的互补性。在一些实施方案中，免疫细胞刺激包括通过刺激分子与其在免疫细胞表面上的同源配体的结合诱导的信号转导。在一些实施方案中，同源配体是CAR或TCR。在一些实施方案中，热刺激包括加热至激活温度。在一些实施方案中，激活温度是约37.5℃、约38.0℃、约38.5℃、约39.0℃、约39.5℃、约40.0℃、约40.5℃、约41.0℃、约41.5℃、约42.0℃、约42.5℃、约43.0℃、约43.5℃、约44.0℃、约44.5℃、约45.0℃、约45.5℃或约46.0℃。
在一些实施方案中，在不存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下，有效载荷蛋白在免疫细胞中达到未刺激的稳态有效载荷蛋白水平。在一些实施方案中，未刺激的稳态有效载荷蛋白水平不足以对所述免疫细胞产生表型效应和/或治疗效应。在一些实施方案中，在热刺激和/或免疫细胞刺激后，来自第一诱导型启动子的有效载荷基因、反式激活因子基因、振荡器基因和/或重组酶基因的转录增加至少1.1倍。在一些实施方案中，有效载荷转录物的稳态水平、反式激活因子转录物的稳态水平、重组酶转录物的稳态水平、振荡器转录物的稳态水平和/或多顺反子转录物的稳态水平在热刺激和/或免疫细胞刺激后高至少1.1倍。在一些实施方案中，在热刺激和/或免疫细胞刺激后，有效载荷蛋白在免疫细胞中达到刺激的稳态有效载荷蛋白水平。在一些实施方案中，有效载荷蛋白不回到未刺激的稳态有效载荷蛋白水平。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平比未刺激的稳态有效载荷蛋白水平高至少1.1倍。在一些实施方案中，增加反式激活因子结合化合物浓度增加刺激的稳态有效载荷蛋白水平。在一些实施方案中，在第一持续时间之后，有效载荷蛋白从刺激的稳态有效载荷蛋白水平回到未刺激的稳态有效载荷蛋白水平，其中第一持续时间是约250小时、约200小时、约150小时、约96小时、约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平能够通过将一个或更多个非典型氨基酸取代引入到沉默子效应物结合序列、切割位点和/或降解决定子中来增加。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平能够通过将一个或更多个典型氨基酸取代引入到沉默子效应物结合序列、切割位点和/或降解决定子中来降低。
在一些实施方案中，在存在连续热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下，稳态有效载荷蛋白水平在调节表达范围的下限调节阈值(lower tuned threshold)与上限调节阈值(upper tuned threshold)之间振荡。在一些实施方案中，调节表达范围的下限未调节阈值(lower untuned threshold)与上限未调节阈值(upper untuned threshold)之间的差异大于约一个数量级。在一些实施方案中，调节表达范围的下限调节阈值与上限调节阈值之间的差异小于约一个数量级。在一些实施方案中，调节表达范围的下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过将一个或更多个非典型氨基酸取代引入沉默子效应物结合序列、切割位点和/或降解决定子中来增加。在一些实施方案中，调节表达范围的下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过将一个或更多个典型氨基酸取代引入沉默子效应物结合序列、切割位点和/或降解决定子中来降低。
在一些实施方案中，第一诱导型启动子包括或来源于哺乳动物热休克启动子(HSP)或秀丽线虫(C.Elegans)HSP。在一些实施方案中，哺乳动物HSP是人类HSP或小鼠HSP。在一些实施方案中，第一诱导型启动子包含与SEQ ID NO:1-14至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，第一诱导型启动子包括一个或更多个AP-1位点。在一些实施方案中，第一诱导型启动子不包括AP-1位点。在一些实施方案中，第一诱导型启动子包括双向启动子，任选地最小双向启动子。在一些实施方案中，第一诱导型启动子包括一个或更多个热休克元件(HSE)结合位点(例如，四个HSE结合位点)。在一些实施方案中，第一诱导型启动子不包括除了一个或更多个HSE结合位点之外的人类转录因子结合位点。
在一些实施方案中，核酸组合物包含：5'ITR、3'ITR、5'LTR、3'LTR或其任何组合。在一些实施方案中，核酸组合物包含：转录物稳定元件。在一些实施方案中，转录物稳定元件包括土拨鼠肝炎翻译后调控元件(WPRE)、牛生长激素多腺苷酸化(bGH-polyA)信号序列、人类生长激素多腺苷酸化(hGH-polyA)信号序列或其任何组合。在一些实施方案中，有效载荷基因包括5'UTR和/或3'UTR。在一些实施方案中，反式激活因子基因包括5'UTR和/或3'UTR。在一些实施方案中，重组酶基因包括5'UTR和/或3'UTR。在一些实施方案中，振荡器基因包括5'UTR和/或3'UTR。在一些实施方案中，5'UTR包括Kozak序列。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平、未刺激的稳态有效载荷蛋白水平、下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过调节Kozak序列的存在和/或序列来调节。在一些实施方案中，5’UTR包括一个或更多个微开放阅读框。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平、未刺激的稳态有效载荷蛋白水平、下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过调节一个或更多个微开放阅读框的存在和/或序列来调节。
在一些实施方案中，有效载荷基因编码有效载荷蛋白。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平、未刺激的稳态有效载荷蛋白水平、下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过调节串联基因表达元件的存在和/或序列来调节。在一些实施方案中，有效载荷基因编码有效载荷RNA剂，其中有效载荷RNA剂包括以下中的一种或更多种：dsRNA、siRNA、shRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA和snoRNA。在一些实施方案中，有效载荷基因编码siRNA、shRNA、反义RNA寡核苷酸、反义miRNA、反式剪接RNA、引导RNA、单引导RNA、crRNA、tracrRNA、反式剪接RNA、pre-mRNA、mRNA或其任何组合。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子选自白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、M-CSF、SCF、TSLP、抑癌蛋白M、白血病抑制因子(LIF)、CNTF、心肌营养因子-1、NNT-1/BSF-3、生长激素、催乳素、促红细胞生成素、血小板生成素、瘦素、G-CSF或其受体或配体。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括选自以下的TGF-β/BMP家族的成员：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3a、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8a、BMP-8b、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15、BMP-16、子宫内膜出血相关因子(EBAF)、生长分化因子-1(GDF-1)、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-12、GDF-14、米勒管抑制物质(MIS)、激活蛋白-1、激活蛋白-2、激活蛋白-3、激活蛋白-4和激活蛋白-5。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括选自以下的细胞因子TNF家族的成员：TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD 27配体、CD 30配体和4-1BBL。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括选自B7.1(CD80)和B7.2(B70)的细胞因子免疫球蛋白超家族的成员。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括干扰素。在一些实施方案中，干扰素选自α干扰素、β干扰素或γ干扰素。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括趋化因子。在一些实施方案中，趋化因子选自CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、嗜酸性粒细胞趋化因子、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括白细胞介素。在一些实施方案中，白细胞介素选自IL-10、IL-12、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-18或IL-21。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括肿瘤坏死因子(TNF)。在一些实施方案中，TNF选自TNF-α、TNF-β、TNF-γ、CD252、CD154、CD178、CD70、CD153或4-1BBL。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括局部下调内源免疫细胞活性的因子。在一些实施方案中，有效载荷蛋白能够重塑肿瘤微环境和/或降低受试者的靶部位处的免疫抑制。
在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，CAR和/或TCR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域中的一个或更多个。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括初级信号传导结构域、共刺激结构域或初级信号传导结构域和共刺激结构域两者。在一些实施方案中，初级信号传导结构域包括选自以下的一种或更多种蛋白的功能信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、共同FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12或其功能变体。在一些实施方案中，共刺激结构域包括选自以下的一种或更多种蛋白的功能结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD28-OX40、CD28-4-1BB、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D或其功能变体。在一些实施方案，抗原结合结构域结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原是实体瘤抗原。
在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变异体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞黏附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关黏蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚基β型9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰基Lewis黏附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关物(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类第5组成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ可变阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人类端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；成对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(印迹位点的BORIS或Brother调控因子)、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在性1(RU1)；肾遍在性2(RU2)；豆荚蛋白；人类乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人类乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的黏蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一些实施方案中，肿瘤抗原选自包括以下的组：CD150、5T4、ActRIIA、B7、BMCA、CA-125、CCNA1、CD123、CD126、CD138、CD14、CD148、CD15、CD19、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD261、CD262、CD30、CD33、CD362、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD46、CD5、CD52、CD53、CD54、CD56、CD66a-d、CD74、CD8、CD80、CD92、CE7、CS-1、CSPG4、ED-B纤连蛋白、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、GD2、GD3、HER1-HER2组合、HER2-HER3组合、HERV-K、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、HLA-DR、HM1.24、HMW-MAA、Her2、Her2/neu、IGF-1R、IL-11Rα、IL-13R-α2、IL-2、IL-22R-α、IL-6、IL-6R、Ia、Ii、L1-CAM、L1细胞黏附分子，Lewis Y、L1-CAM、MAGE A3、MAGE-A1、MART-1、MUC1、NKG2C配体、NKG2D配体、NY-ESO-1、OEPHa2、PIGF、PSCA、PSMA、ROR1、T101、TAC、TAG72、TIM-3、TRAIL-R1、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、VEGF、VEGFR2、WT-1、G蛋白偶联受体、甲胎蛋白(AFP)、血管生成因子、外源同源结合分子(ExoCBM)、癌基因产物、抗叶酸受体、c-Met、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白(D1)、人肝配蛋白B2、上皮肿瘤抗原、雌激素受体、胎儿乙酰胆碱e受体、叶酸结合蛋白、gp100、乙肝表面抗原、κ链、κ轻链、kdr、λ链、生存蛋白(livin)、黑素瘤相关抗原、间皮素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、黏蛋白16(MUC16)、突变p53、突变ras、坏死抗原、癌胎抗原、ROR2、孕酮受体、前列腺特异性抗原、tEGFR、生腱蛋白、β2-微球蛋白、Fc受体样5(FcRL5)或HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab′)2、单结构域抗体(SDAB)、VH结构域或VL结构域、骆驼VHH结构域、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、由抗体片段形成的双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、抗运载蛋白(anticalin)、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体或其任何组合。在一些实施方案中，抗原结合结构域通过铰链区连接至跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包括选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C或其功能变体。在一些实施方案中，CAR或TCR还包括先导肽。在一些实施方案中，TCR还包括恒定区和/或CDR4。
在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括降解决定子。在一些实施方案中，有效载荷蛋白的稳态水平可以通过改变降解决定子的序列来改变。在一些实施方案中，核酸组合物包含：一个或更多个第二转基因，其中所述一个或更多个第二转基因编码一个或更多个第二有效载荷RNA剂和/或一个或更多个第二有效载荷蛋白。
在一些实施方案中，核酸组合物包含一种或更多种载体；任选地，一种或更多种载体中的至少一种是病毒载体、质粒、裸露DNA载体、脂质纳米颗粒或其任何组合。在一些实施方案中，病毒载体是AAV载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、整合缺陷慢病毒(IDLV)载体。
本文公开的包括组合物。在一些实施方案中，组合物包含本文提供的核酸组合物。在一些实施方案中，组合物包含一种或更多种载体、核糖核蛋白(RNP)复合物、脂质体、纳米颗粒、外泌体、微囊泡或其任何组合。在一些实施方案中，载体是病毒载体、质粒、裸露DNA载体、脂质纳米颗粒或其任何组合。在一些实施方案中，病毒载体是AAV载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、整合缺陷慢病毒(IDLV)载体。在一些实施方案中，AAV载体包括单链AAV(ssAAV)载体或自互补AAV(scAAV)载体。
本文公开的包括热启动免疫细胞。在一些实施方案中，热启动免疫细胞包含本文公开的核酸组合物。在一些实施方案中，免疫细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是人类细胞。在一些实施方案中，免疫细胞来源于血液、脐带血、骨髓或iPSC。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是原代T细胞。在一些实施方案中，T细胞是自体T细胞或异体T细胞。在一些实施方案中，单次热刺激足以起始免疫细胞激活驱动的有效载荷表达的正反馈环。
本文公开的包括热启动免疫细胞的群体。在一些实施方案中，热启动免疫细胞的群体包括：多于一个本文公开的热启动免疫细胞。在一些实施方案中，有效载荷包括CAR和/或TCR，其中响应于CAR和/或所述TCR连续接合持续至少约24小时，热启动免疫细胞的群体的至少约5％具有在约下限调节阈值处的稳态有效载荷蛋白水平，并且热启动免疫细胞的群体的至少约5％具有在约上限调节阈值处的稳态有效载荷蛋白水平。在一些实施方案中，有效载荷包括CAR和/或TCR，并且其中响应于CAR和/或TCR连续接合持续至少约96小时，热启动免疫细胞的群体的小于约20％表现出耗尽。在一些实施方案中，耗尽包括T细胞耗尽。在一些实施方案中，有效载荷包括CAR和/或TCR，其中响应于CAR和/或TCR连续接合持续96小时，与不包含振荡器的热启动免疫细胞的群体相比，热启动免疫细胞的群体的至少约1.1倍更少的细胞表现出耗尽。在一些实施方案中，耗尽包括T细胞耗尽。在一些实施方案中，T细胞耗尽包括选自由包括以下T细胞耗尽生物标志物的组的一种或更多种T细胞耗尽生物标志物的表达：检查点抑制剂、PD-1(Pdcdl)、′IΠΜ-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpdl)、CD 160、脱中胚蛋白(eomesodermin)(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdml)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxpl、维甲酸受体α(Rara)或其任何组合。在一些实施方案中，有效载荷包括CAR和/或TCR，其中有效载荷在不存在热刺激的情况下不被表达，并且其中CAR和/或TCR的接合起始有效载荷的持续表达。
本文公开的包括产生热启动免疫细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括：将本文公开的核酸组合物或本文公开的组合物引入免疫细胞，从而产生热启动免疫细胞。在一些实施方案中，引入步骤包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、电核转运、化学转导、电转导、脂质体酰胺介导的转染、Effectene介导的转染、脂质纳米颗粒(LNP)介导的转染或其任何组合。
本文公开的包括治疗受试者中的疾病或紊乱的方法。在一些实施方案中，该方法包括：将包含本文公开的核酸组合物的组合物或本文公开的组合物引入一种或更多种免疫细胞，从而产生一种或更多种热启动免疫细胞；并且向受试者施用有效量的热启动免疫细胞。
本文公开的包括治疗受试者中的疾病或紊乱的方法。在一些实施方案中，该方法包括：向受试者施用有效量的本文公开的热启动免疫细胞。
在一些实施方案中，该方法包括：向受试者的靶部位施加足以将靶部位的局部温度增加至激活温度的热能，从而诱导有效载荷在靶部位处的热启动免疫细胞中的表达。在一些实施方案中，激活温度是约37.5℃、约38.0℃、约38.5℃、约39.0℃、约39.5℃、约40.0℃、约40.5℃、约41.0℃、约41.5℃、约42.0℃、约42.5℃、约43.0℃、约43.5℃、约44.0℃、约44.5℃、约45.0℃、约45.5℃或约46.0℃。在一些实施方案中，向受试者的靶部位施加热能包括应用聚焦超声(FUS)、磁热疗、微波、红外照射、基于液体的加热和接触加热中的一种或更多种。在一些实施方案中，基于液体的加热包括腹膜内化疗(HIPEC)。在一些实施方案中，施用与施加热能之间的时间段是约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟。在一些实施方案中，向靶部位施加热能包括在第二持续时间内向靶部位连续施加热能。在一些实施方案中，向靶部位施加热能包括在第二持续时间内向靶部位施加一个或更多个热能脉冲。在一些实施方案中，第二持续时间是约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟。在一些实施方案中，一个或更多个脉冲具有大于约1％且小于约100％的占空比。在一些实施方案中，一个或更多个脉冲各自具有约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟、或约5分钟、约1分钟、约1秒或约1毫秒的脉冲持续时间。在一些实施方案中，该方法包括：监测靶区域的温度。在一些实施方案中，监测通过磁共振成像(MRI)进行。在一些实施方案中，通过磁共振成像(MRI)在空间上引导向所述受试者的靶部位施加热能。
在一些实施方案中，在向靶部位处施加热能之后，靶部位处的热启动免疫细胞的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％表达有效载荷蛋白。在一些实施方案中，除了靶部位以外的部位处的热启动免疫细胞的小于约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％表达有效载荷蛋白。在一些实施方案中，受试者的靶部位处表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度与受试者的血液、血清或血浆中表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度的比是至少约2:1。在一些实施方案中，受试者的靶部位处的有效载荷蛋白浓度与受试者的血液、血清或血浆中的有效载荷蛋白浓度的比是约2:1至约3000:1、约2:1至约2000:1、约2:1至约1000:1或约2:1至约600:1。在一些实施方案中，靶部位包括靶细胞。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞(例如，实体瘤细胞)。在一些实施方案中，向受试者的靶部位施加热能导致靶细胞的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％死亡。在一些实施方案中，非靶细胞包括除了靶细胞以外的受试者的细胞，并且其中在施加热能之后靶细胞死亡与非靶细胞死亡的比是至少约2:1。在一些实施方案中，靶细胞死亡与非靶细胞死亡的比相比于包括组成型表达有效载荷蛋白的免疫细胞的方法大至少约1.1倍。
在一些实施方案中，靶部位包括实体瘤。在一些实施方案中，靶部位包括疾病或紊乱的部位或位于疾病或紊乱的部位附近。在一些实施方案中，疾病或紊乱的一个或更多个部位的位置是预先确定的、在方法期间确定的或两者。在一些实施方案中，靶部位是免疫抑制环境。在一些实施方案中，靶部位包括组织。在一些实施方案中，组织是发炎组织和/或被感染的组织。在一些实施方案中，组织包括肾上腺组织、阑尾组织、膀胱组织、骨、肠组织(bowel tissue)、脑组织、乳腺组织、支气管、冠状组织、耳组织、食道组织、眼组织、胆囊组织、生殖器组织、心脏组织、下丘脑组织、肾组织、大肠组织、肠组织(intestinal tissue)、喉组织、肝组织、肺组织、淋巴结、口组织、鼻组织、胰腺组织、甲状旁腺组织、垂体组织、前列腺组织、直肠组织、唾液腺组织、骨骼肌组织、皮肤组织、小肠组织、脊髓、脾组织、胃组织、胸腺组织、气管组织、甲状腺组织、输尿管组织、尿道组织、软组织和结缔组织、腹膜组织、血管组织和/或脂肪组织。在一些实施方案中，组织包括：(i)I级、II级、III级或IV级癌组织；(ii)转移癌组织；(iii)混合级癌组织；(iv)亚分级癌组织；(v)健康组织或正常组织；和/或(vi)癌组织或异常组织。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案，疾病或紊乱是自身免疫性紊乱。在一些实施方案中，疾病与肿瘤抗原的表达相关，其中与肿瘤抗原的表达相关的疾病选自由以下组成的组：增殖性疾病、癌前状况、癌症和与肿瘤抗原的表达相关的非癌相关指征。在一些实施方案中，疾病或紊乱是癌症。在一些实施方案中是实体瘤。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌症、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移病灶。在一些实施方案中，癌症是选自以下中的一种或更多种的血液学癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴白血病(ALL)、B细胞急性淋巴白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增生性状况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症或白血病前期。在一些实施方案中，该方法包括：在施用热启动免疫细胞之前、期间和/或之后，向受试者施用反式激活因子结合化合物。在一些实施方案中，反式激活因子结合化合物的量是有效诱导或减弱足够水平的有效载荷表达以治疗受试者的量。在一些实施方案中，反式激活因子结合化合物包括四环素、多西环素或其衍生物。
在一些实施方案中，该方法包括：向受试者施用一种或更多种另外的剂。在一些实施方案中，一种或更多种另外的剂增加热启动免疫细胞的效力。在一些实施方案中，一种或更多种另外的剂包括蛋白磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫抑制分子抑制剂和/或减少TREG细胞水平或活性的剂。在一些实施方案中，一种或更多种另外的剂包括免疫调节剂、抗转移剂、化疗剂、激素或生长因子拮抗剂、烷化剂、TLR激动剂、细胞因子拮抗剂、细胞因子拮抗剂或其任何组合。在一些实施方案中，一种或更多种另外的剂包括对检查点抑制剂或检查点刺激剂分子，诸如PD1、PD-L1、PD-L2、CD27、CD28、CD40、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3特异性的激动或拮抗抗体。在一些实施方案中，一种或更多种另外的剂选自由以下组成的组：烷化剂(氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐/酯、亚硝基脲和三氮烯(triazene))；尿嘧啶氮芥(Aminouracil
Figure BDA0004000640040000221
Figure BDA0004000640040000222
Figure BDA0004000640040000223
Uracil nitrogen
Figure BDA0004000640040000224
Figure BDA0004000640040000225
)；苯达莫司汀
Figure BDA0004000640040000226
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氮芥(chlormethine)
Figure BDA0004000640040000228
环磷酰胺(
Figure BDA0004000640040000229
Figure BDA00040006400400002210
RevimmuneTM)；异环磷酰胺
Figure BDA00040006400400002211
美法仑
Figure BDA0004000640040000231
苯丁酸氮芥(chlorambucil)
Figure BDA0004000640040000232
哌泊溴烷
Figure BDA0004000640040000233
三亚乙基蜜胺
Figure BDA0004000640040000234
三亚乙基硫代磷酰胺；替莫唑胺
Figure BDA0004000640040000235
塞替派
Figure BDA0004000640040000236
白消安
Figure BDA0004000640040000237
卡莫司汀
Figure BDA0004000640040000238
洛莫司汀
Figure BDA0004000640040000239
链脲酶素
Figure BDA00040006400400002310
雌莫司汀
Figure BDA00040006400400002311
福莫司汀(fotemustine)；irofulven；甘露舒凡(mannosulfan)；二溴甘露醇；尼莫司汀；丙卡巴肼；雷莫司汀；司莫司汀；三亚胺醌(triaziquone)；曲奥舒凡(treosulfan)；和达卡巴嗪
Figure BDA00040006400400002312
抗EGFR抗体(例如西妥昔单抗
Figure BDA00040006400400002313
帕尼单抗
Figure BDA00040006400400002314
和吉非替尼
Figure BDA00040006400400002315
抗Her-2抗体(例如曲妥珠单抗
Figure BDA00040006400400002316
和来自Genentech的其他抗体)；抗代谢物(包括不限于，叶酸拮抗剂(本文也称为抗叶酸)、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤
Figure BDA00040006400400002317
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00040006400400002318
Figure BDA00040006400400002319
氟尿苷
Figure BDA00040006400400002320
卡莫氟、阿糖胞苷(
Figure BDA00040006400400002321
TarabinePFS)、6-巯基嘌呤
Figure BDA00040006400400002322
6-硫代鸟嘌呤(Thioguanine
Figure BDA00040006400400002323
)、磷酸氟达拉滨
Figure BDA00040006400400002324
喷司他丁
Figure BDA00040006400400002325
培美曲塞
Figure BDA00040006400400002326
雷替曲塞(raltitrexed)
Figure BDA00040006400400002327
克拉屈滨
Figure BDA00040006400400002328
氯法拉滨
Figure BDA00040006400400002329
Figure BDA00040006400400002330
巯基嘌呤
Figure BDA00040006400400002331
卡培他滨
Figure BDA00040006400400002332
奈拉滨
Figure BDA00040006400400002333
阿扎胞苷
Figure BDA00040006400400002334
地西他滨
Figure BDA00040006400400002335
依诺他滨
Figure BDA00040006400400002336
沙帕他滨(sapacitabine)、替加氟尿嘧啶、噻唑呋林(tiazofurine)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、曲磷胺(trofosfamide)和吉西他滨
Figure BDA00040006400400002337
长春花生物碱类：长春碱
Figure BDA00040006400400002338
长春新碱
Figure BDA00040006400400002339
长春地辛
Figure BDA00040006400400002340
长春瑞滨
Figure BDA00040006400400002341
长春氟宁(vinflunine)
Figure BDA00040006400400002342
基于铂的剂：卡铂
Figure BDA00040006400400002343
顺铂
Figure BDA00040006400400002344
奥沙利铂
Figure BDA00040006400400002345
奈达铂、赛特铂和三铂(triplatin)；蒽环类：柔红霉素
Figure BDA00040006400400002346
Figure BDA00040006400400002347
多柔比星
Figure BDA00040006400400002348
表柔比星
Figure BDA00040006400400002349
伊达比星
Figure BDA00040006400400002350
米托蒽醌
Figure BDA00040006400400002351
戊柔比星
Figure BDA00040006400400002352
阿柔比星、氨柔比星(amrubicin)、脂质体多柔比星、脂质体柔红霉素、吡柔比星(pirarubicin)、pixantrone和佐柔比星(zorubicin)；拓扑异构酶抑制剂：托泊替康
Figure BDA00040006400400002353
伊立替康
Figure BDA00040006400400002354
依托泊苷
Figure BDA00040006400400002355
替尼泊苷
Figure BDA00040006400400002356
片螺素(lamellarin)D、SN-38、羟喜树碱(例如，IT-101)、倍罗替康和鲁比替康；紫杉烷类：紫杉醇
Figure BDA0004000640040000241
多西他赛
Figure BDA0004000640040000242
larotaxel、卡巴他赛(cabazitaxel)、沃塔紫杉醇(ortataxel)和替司他赛(tesetaxel)；抗生素类：放线菌素
Figure BDA0004000640040000243
博莱霉素
Figure BDA0004000640040000244
羟基脲
Figure BDA0004000640040000245
Figure BDA0004000640040000246
丝裂霉素
Figure BDA0004000640040000247
免疫调节剂：来那度胺
Figure BDA0004000640040000248
沙利度胺
Figure BDA0004000640040000249
免疫细胞抗体：阿仑单抗
Figure BDA00040006400400002410
吉妥单抗
Figure BDA00040006400400002411
利妥昔单抗
Figure BDA00040006400400002412
托西莫单抗
Figure BDA00040006400400002413
干扰素类(例如，IFNα
Figure BDA00040006400400002414
或IFNγ
Figure BDA00040006400400002415
白细胞介素类：IL-1、IL-2
Figure BDA00040006400400002416
IL-24、IL-6
Figure BDA00040006400400002417
IL-12；HSP90抑制剂(例如，格尔德霉素(geldanamycin)或其任何衍生物)。在某些实施方案中，HSP90抑制剂选自格尔德霉素、17-烷基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(“17-AAG”)或17-(2-二甲基氨基乙基)氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(“17-DMAG”)；抗雄激素，其包括但不限于尼鲁米特
Figure BDA00040006400400002418
和比卡鲁胺
Figure BDA00040006400400002419
抗雌激素，其包括但不限于他莫昔芬
Figure BDA00040006400400002420
托瑞米芬
Figure BDA00040006400400002421
来曲唑
Figure BDA00040006400400002422
Testolactone
Figure BDA00040006400400002423
阿那曲唑
Figure BDA00040006400400002424
比卡鲁胺
Figure BDA00040006400400002425
依西美坦
Figure BDA00040006400400002426
氟他胺
Figure BDA00040006400400002427
氟维司群
Figure BDA00040006400400002428
雷洛昔芬
Figure BDA00040006400400002429
Figure BDA00040006400400002430
和盐酸雷洛昔芬；抗高钙血症剂，其包括但不限于水合硝酸镓(III)
Figure BDA00040006400400002431
和帕米膦酸二钠
Figure BDA00040006400400002432
凋亡诱导物，其包括不限于乙醇、2-[[3-(2,3-二氯苯氧基)丙基]氨基]-(9Cl)、藤黄酸、伊利司莫(elesclomol)、恩贝酸(embelin)和三氧化二砷
Figure BDA00040006400400002433
极光激酶抑制剂，其包括但不限于双核素2；布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于土曲霉酸；钙调磷酸酶抑制剂，其包括但不限于氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、氰戊菊酯(fenvalerate)和酪磷蛋白(Tyrphostin)8；CaM激酶II抑制剂，其包括但不限于5-异喹啉磺酸、4-[{2S)-2-[(5-异喹啉基磺酰基)甲基氨基]-3-氧代-3-{4-苯基-1-哌嗪基)丙基]苯基酯]和苯磺酰胺；CD45酪氨酸磷酸酶抑制剂，其包括但不限于膦酸；CDC25磷酸酶抑制剂，其包括但不限于1,4-萘二酮、2,3-双-((2-羟基乙基)硫代)-(9Cl)；CHK激酶抑制剂，其包括但不限于debromohymenialdisine；环氧合酶抑制剂，其包括但不限于1H-吲哚-3-乙酰胺、1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-N-(2-苯基乙基)-(9Cl)、5-烷基取代的2-芳基氨基苯乙酸及其衍生物(例如，塞来昔布
Figure BDA0004000640040000251
罗非昔布
Figure BDA0004000640040000252
依托考昔
Figure BDA0004000640040000253
罗美昔布
Figure BDA0004000640040000254
伐地考昔
Figure BDA0004000640040000255
或5-烷基-2-芳基氨基苯乙酸)；cRAF激酶抑制剂，其包括但不限于3-(3,5-二溴-4-羟基亚苯基)-5-碘代-1,3-二氢吲哚-2-酮和苯甲酰胺、3-(二甲基氨基)-N-[3-[(4-羟基苯甲酰基)氨基]-4-甲基苯基]-(9Cl)；周期蛋白依赖性激酶抑制剂，其包括但不限于olomoucine及其衍生物、purvalanol B、roascovitine
Figure BDA0004000640040000256
靛玉红(indirubin)、kenpaullone、purvalanol A和靛玉红-3’-单肟；半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其包括但不限于4-吗啉甲酰胺、N-[(1S)-3-氟-2-氧代-1-(2-苯基乙基)丙基]氨基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-(9Cl)；DNA嵌入剂，其包括但不限于普卡霉素
Figure BDA0004000640040000257
和达托霉素
Figure BDA0004000640040000258
DNA链断裂剂(breaker)，其包括但不限于博来霉素
Figure BDA0004000640040000259
E3连接酶抑制剂，其包括但不限于N-((3,3,3-三氟-2-三氟甲基)丙酰基)磺胺；EGF途径抑制剂，其包括但不限于酪磷蛋白46、EKB-569、埃罗替尼
Figure BDA00040006400400002510
吉非替尼
Figure BDA00040006400400002511
拉帕替尼
Figure BDA00040006400400002512
以及以下中一般且具体公开的那些化合物：WO 97/02266、EP 0 564 409、WO 99/03854、EP0 520 722、EP 0 566 226、EP 0 787 722、EP 0 837 063、美国专利第5,747,498号、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983和WO 96/33980；法尼基转移酶抑制剂，其包括但不限于ahydroxyfarnesylphosphonic acid、丁酸、2-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-氨基-3-巯基丙基]氨基]-3-甲基戊基]氧基]-1-氧代-3-苯基丙基]氨基]-4-(甲基磺酰基)-1-甲基乙基酯(2S)-(9Cl)、替吡法尼
Figure BDA00040006400400002513
和手霉素(manumycin)A；Flk-1激酶抑制剂，其包括但不限于2-丙烯酰胺、2-氰基-3-[4-羟基-3,5-双(1-甲基乙基)苯基]-N-(3-苯基丙基)-(2E-)-(9Cl)；糖原合酶激酶-3(GSK3)抑制剂，其包括但不限于靛玉红-3’-单肟；组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，其包括但不限于辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid)(SAHA)、[4-(2-氨基-苯基氨甲酰基)-苄基]氨基甲酸吡啶-3-基甲基酯及其衍生物、丁酸、pyroxamide、曲古抑菌素A、oxamflatin、apicidin、酯肽、depudecin、trapoxin、伏立诺他
Figure BDA00040006400400002514
和WO 02/22577中公开的化合物；I-κB-α激酶抑制剂(IKK)，其包括但不限于2-丙烯氰、3-[(4-甲基苯基)磺酰]-(2E)-(9Cl)；咪唑四嗪酮类，其包括但不限于替莫唑胺
Figure BDA00040006400400002515
及其衍生物(例如，如美国专利第5,260,291号中一般且具体公开的)和米托唑胺；胰岛素酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于羟基-2-萘基甲基膦酸；c-Jun-N-末端激酶(JNK)抑制剂，其包括但不限于吡唑蒽酮和表没食子儿茶素没食子酸酯；丝裂原激活的蛋白激酶(MAP)抑制剂，其包括但不限于苯磺酰胺、N-[2-[[[3-(4-氯苯基)-2-丙烯基]甲基]氨基]甲基]苯基]-N-(2-羟基乙基)-4-甲氧基-(9Cl)；MDM2抑制剂，其包括但不限于反式4-碘代4’-硼烷基-查耳酮；MEK抑制剂，其包括但不限于丁二腈、双[氨基[2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-(9Cl)；MMP抑制剂，其包括但不限于放线酰胺素(Actinonin)、表没食子儿茶素没食子酸酯、胶原蛋白肽模拟物和非肽模拟物抑制剂、四环素衍生物马立马司他
Figure BDA0004000640040000261
普啉司他、incyclinide
Figure BDA0004000640040000262
鲨鱼软骨素提取物AE-941
Figure BDA0004000640040000263
Tanomastat、TAA211、MMI270B或AAJ996；mTor抑制剂，其包括但不限于雷帕霉素
Figure BDA0004000640040000264
及其类似物与衍生物、AP23573(也称为地磷莫司、deforolimus或MK-8669)、CCI-779(也称为坦西莫司)
Figure BDA0004000640040000265
和SDZ-RAD；NGFR酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于tyrphostin AG 879；p38 MAP激酶抑制剂，其包括但不限于苯酚、4-[4-(4-氟苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-(9Cl)和苯甲酰胺、3-(二甲基氨基)-N-[3-[(4-羟基苯甲酰基)氨基]-4-甲基苯基]-(9Cl)；p56酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于damnacanthal和tyrphostin 46；PDGF途径抑制剂，其包括但不限于tyrphostin AG1296、tyrphostin 9、1,3-丁二烯-1,1,3-三腈、2-氨基-4-(1H-吲哚-5-基)-(9Cl)、伊马替尼
Figure BDA0004000640040000266
和吉非替尼
Figure BDA0004000640040000267
以及在欧洲专利第0 564 409号和PCT公布第WO 99/03854号中一般且具体公开的那些化合物；磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂，其包括但不限于渥曼青霉素和槲皮素二水合物；磷酸酶抑制剂，其包括但不限于斑蝥酸、斑蝥素和L-亮氨酰胺；蛋白磷酸酶抑制剂，其包括但不限于斑蝥酸、斑蝥素、L-对溴四咪唑草酸酯、2(5H)-呋喃酮、4-羟基-5-(羟甲基)-3-(1-氧代十六烷基)-(5R)-(9Cl)和苄基膦酸；PKC抑制剂，其包括但不限于1-H-吡咯-2,5-二酮、3-[1-3-(二甲基氨基)丙基]-1H-吲哚-3-基]-4-(1H-吲哚-3-基)-(9Cl)、双吲哚基马来酰亚胺IX、Sphinogosine、星形孢菌素和金丝桃素；PKCδ激酶抑制剂，其包括但不限于rottlerin；多胺合成抑制剂，其包括但不限于DMFO；PTP1B抑制剂，其包括但不限于L-亮氨酰胺；蛋白酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于tyrphostin Ag 216、tyrphostin Ag 1288、tyrphostin Ag 1295、格尔德霉素、染料木素(genistein)和7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物，如PCT公布第WO 03/013541号和美国公布第2008/0139587号中一般且具体描述的；SRC家族酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于PP1和PP2；Syk酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于白皮杉醇(piceatannol)；Janus(JAK-2和/或JAK-3)酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于tyrphostin AG 490和2-萘基乙烯基酮；维A酸类，其包括但不限于异维A酸
Figure BDA0004000640040000271
Figure BDA0004000640040000272
和维A酸
Figure BDA0004000640040000273
Figure BDA0004000640040000274
RNA聚合酶H延伸抑制剂，其包括但不限于5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于2-氨基嘌呤；甾醇生物合成抑制剂，其包括但不限于鲨烯环氧酶和CYP2D6；VEGF途径抑制剂，其包括但不限于抗VEGF抗体，例如，贝伐单抗，和小分子，例如舒尼替尼
Figure BDA0004000640040000275
索拉非尼
Figure BDA0004000640040000276
ZD6474(也称为凡德他尼)(ZactimaTM)、SU6668、CP-547632和AZD2171(也称为西地尼布)(RecentinTM)。
在一些实施方案中，施用包括气溶胶递送、鼻递送、阴道递送、直肠递送、含服递送、眼部递送、局部递送、表面递送、脑池内递送、腹膜内递送、口服递送、肌内注射、静脉内注射、皮下注射、结内注射、瘤内注射、腹膜内注射、皮内注射或其任何组合。
附图简述
图1描绘了本文提供的遗传回路和工程化T细胞的非限制性示例性实施方案。
图2A-图2B描绘了与在原代T细胞中的候选pHSP相关的非限制性示例性数据和实施方案。(图2A)用于表征pHSP行为的筛选策略的图示。示出了用于测定pHSP的病毒构建体以及测试的启动子。LTR，长末端重复序列。(图2B)在37℃或42℃孵育1小时之后经由流式细胞术测量的24小时平均荧光强度。37℃与42℃之间的倍数变化列于每个样品的上方。在未看到的情况下，误差条(±SEM)比符号小。每个样品N＝3个生物重复。
图3A-图3F描绘了与用于在原代人类T细胞中激活pHSP的热参数相关的非限制性示例性数据和实施方案。来自由HSPB、HSPB’1、SynHSPB’3和HSP16F启动子驱动的构建体的GFP表达(图3A、图3C、图3E)和T细胞存活力(图3B、图3D、图3F)随着以下的变化：(图3A、图3B)诱导温度持续连续1小时刺激，(图3C、图3D)固定热暴露1小时以50％占空比在37℃与42℃之间交替递送的刺激脉冲持续时间，以及(图3E、图3F)在42℃连续加热的诱导持续时间。在未看到的情况下，误差条(±SEM)比符号小。每个样品N＝3个生物重复。
图4A-图4F描绘了与用于扩增和持续热激活的遗传回路相关的非限制性示例性数据和实施方案。(图4A)图示了热触发的前馈回路的图(上图)。对补充有多西环素的细胞在37℃或42℃诱导1小时后24小时进行荧光分析(下图)。(图4B)图示了由HSPB驱动的前馈回路的图，<K>指示不同的kozak强度(上图)。对补充有多西环素的细胞在37℃或42℃诱导1小时后24小时进行荧光分析(下图)。HSPB数据与图4A中的相同，并且在此重新显示以方便比较。(图4C)图示了热触发的正反馈回路的图(上图)。对补充有多西环素的细胞在37℃或42℃诱导1小时后24小时进行荧光分析(下图)。(图4D)对于直接HSPB驱动的回路、前馈HSPB回路和正反馈HSPB回路，在42℃诱导1小时之后，在7天内监测的归一化表达。回路已经被修饰，用不稳定的蛋白形式替代GFP。(图4E)被设计为在诱导后表达CAR-CD19的基于CRE的热触发永久稳定开关的图示。(图4F)细胞在37℃孵育或在42℃热刺激1小时，并且在24小时后分析以确定激活细胞的数量。在未看到的情况下，误差条(±SEM)比符号小。每个样品N＝3个生物重复。
图5A-图5B描绘了与温度激活的细胞因子释放相关的非限制性示例性数据和实施方案。(图5A)图示了用于表达IL-21的正反馈回路的图(上图)。在37℃或42℃诱导1小时的累积IL-21释放。在一个样品中，多西环素在24小时之后被去除(下图)。(图5B)用于测定CAR活性在反馈pHSP回路中触发IL-21表达的能力的构建体的图示(上图)。细胞在有及没有诱饵细胞的情况下在37℃孵育或在42℃热刺激1小时(下图)。在每个时间点收集培养基并冷冻，并且在收集结束时同时对所有样品进行分析。累积IL-21表达通过使用IL-21ELISA进行定量。在未看到的情况下，误差条(±SEM)比符号小。每个样品N＝3个生物重复。
图6A-图6B描绘与T细胞激活对pHSP驱动的回路的依赖性相关的非限制性示例性数据和实施方案。(图6A)用于测定CAR活性触发pHSP的能力的构建体的图示。(图6B)细胞在37℃孵育、在42℃热刺激1小时或与CD19+诱饵细胞孵育。pHSP触发的活性通过对诱导之后24小时的GFP表达进行定量来确定。在未看到的情况下，误差条(±SEM)比符号小。每个样品N＝3个生物重复。
图7A-图7D描绘了与自动持续热诱导的CAR表达和肿瘤细胞杀伤相关的非限制性示例性数据和实施方案。(图7A)用于测定pHSP(SynHSPB’3)驱动的CAR-CD19表达的病毒构建体的图示。细胞在37℃孵育或在42℃热刺激1小时，并且在诱导之后12小时，通过对附加至CAR上的HA标签进行表面染色定量pHSP触发的CAR-CD19表达。N＝3个生物重复。(图7B)在37℃或42℃诱导1小时之后6小时、12小时和24小时的CAR-CD19表达。N＝3个生物重复。37℃样本中的负值起因于减去从野生型T细胞获得的信号。原始数据提供于(图13)。(图7C)用于测试pHSP诱导型CAR表达有条件杀伤诱饵细胞的能力的病毒构建体和测定的图示。细胞在37℃孵育或在42℃热刺激1小时，然后与CD19+诱饵细胞孵育。(图7D)未修饰的T细胞和组成型表达CAR-CD19的T细胞分别用作阴性对照和阳性对照。在13天持续时间内通过计数与阴性对照相比存活的诱饵细胞的百分比来定量pHSP(SynHSPB’3)触发的杀伤活性。对于来自不同患者的两种T细胞集合，N＝3个生物重复，总计N＝6。在未看到的情况下，误差条(±SEM)比符号小。
图8描绘了与基因表达中热诱导移码相关的非限制性示例性数据。T细胞转染了来自图2的HSPB’1启动子病毒载体。直方图表示经由流式细胞术测量的感染的细胞在37℃或42℃孵育1小时后24小时的绿色荧光强度。热诱导导致跨越细胞群体的基因表达的均匀增加。
图9描绘了与控制感染可变性的转导标志物表达相关的非限制性示例性数据。我们实验中的构建体携带感染标志物，用于评价病毒整合效率的任何差异。在该实例中，T细胞感染了来自图4A的HSPB和HSPB’1前馈回路。两种构建体具有相似的感染标志物表达水平以及相当的转导效率，HSPB(63％)和HSPB’1(54％)。
图10描绘了与HSP CAR杀伤实验的诱饵细胞计数相关的非限制性示例性数据。原代T细胞在37℃孵育或在42℃热刺激1小时，然后与CD19+诱饵细胞孵育。未修饰的T细胞和组成型表达CAR-CD19的T细胞分别用作阴性对照和阳性对照。HSP(SynHSPB’3)触发的杀伤活性通过对13天内存活的诱饵细胞的数量进行计数来定量。N＝3个生物重复。在未看到的情况下，误差条(±SEM)比符号小。
图11A-图11B描绘了与来自组成型构建体和诱导构建体的CAR表达相关的非限制性示例性数据。(图11A)将感染了SynHSPB’3的原代T细胞在42℃热刺激1小时。通过使用抗HA抗体测定刺激后12小时的CAR表达。在CAR表达分析之前，根据转染标志物对细胞进行门控。(图11B)组成型表达CAR-CD19的原代T细胞用作阳性对照。(图11B)中的细胞没有用转染标志物进行门控。左峰表示未感染的细胞。
图12描绘了与评价刺激的T细胞的增殖能力相关的非限制性示例性数据。组成型表达CAR-CD19的T细胞用作对照，并且SynHSPB’3用作HSP T细胞。细胞在37℃孵育或在42℃热刺激1小时，然后与CD19+诱饵细胞孵育。T细胞增殖通过对存活的T细胞数量进行计数并且将其与第1天比较建立倍数变化来定量。N＝3个生物重复。在未看到的情况下，误差条(±SEM)比符号小。
图13A-图13B描绘了与热诱导CAR表达相关的非限制性示例性数据。图7A-图7B中示出的潜在数据的原始测量，包括野生型T细胞的荧光。将该背景值从实验细胞测量值中减去，以产生图7A-图7B中的图。(图13A)细胞在37℃孵育或在42℃热刺激1小时，并且在诱导之后12小时，pHSP触发的CAR-CD19表达通过对附加至CAR上的HA标签进行表面染色进行定量。N＝3个生物重复。(图13B)在37℃或42℃诱导1小时之后6小时、12小时和24小时的CAR-CD19表达。在未看到的情况下，误差条(±SEM)比符号小。
图14A-图14C描绘了与调控CAR活性以防止T细胞耗尽的基于HSP的反馈回路相关的非限制性示例性数据和实施方案。图14A描绘了非限制性示例性传统CAR T细胞和本文提供的示例性振荡CAR T细胞。图14B描绘了非限制性示例性振荡遗传回路。图14C描绘了病毒感染了图14B中的回路并且然后与诱饵细胞以Jurkat与诱饵1:5的比混合的Jurkat细胞相关的示例性数据。每天通过测定融合至CAR的GFP的强度来分析细胞的CAR表达。X轴：天数，Y轴：与第0天相比的GFP/CAR表达％。
详述
以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指示，否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文提供的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解的是，如本文一般描述的以及附图中图示的本公开内容的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确考虑并且构成本公开内容的一部分。
本文提及的所有专利、公开的专利申请、其他出版物和来自GenBank以及其他数据库的序列关于相关技术通过引用以其整体并入本文。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，核酸组合物包含：(a)可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因的转录，以产生有效载荷转录物；或者(b)可操作地连接至包含反式激活因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下诱导所述反式激活因子基因的转录以产生反式激活因子转录物，其中所述反式激活因子转录物能够被翻译以产生反式激活因子；并且其中，在存在反式激活因子和反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：各自可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸和包含反式激活因子基因的第二多核苷酸的第一诱导型启动子和第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，其中，在存在所述反式激活因子和反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，并且其中所述多顺反子转录物能够被翻译以产生反式激活因子和有效载荷蛋白和/或有效载荷RNA剂。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，核酸组合物包含：(a)可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因的转录，以产生有效载荷转录物；或者(b)可操作地连接至包含反式激活因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下诱导所述反式激活因子基因的转录以产生反式激活因子转录物，其中所述第二启动子包括反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中所述反式激活因子在存在所述反式激活因子结合化合物的情况下不能结合所述反式激活因子识别序列，其中所述反式激活因子转录物能够被翻译以产生反式激活因子；并且其中，在存在反式激活因子但不存在反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：各自可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸和包含反式激活因子基因的第二多核苷酸的第一诱导型启动子和第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，其中所述第二启动子包括反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中所述反式激活因子在存在所述反式激活因子结合化合物的情况下不能结合所述反式激活因子识别序列，其中，在存在所述反式激活因子但不存在反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，并且其中所述多顺反子转录物能够被翻译以产生反式激活因子和有效载荷蛋白和/或有效载荷RNA剂。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含嵌合抗原受体(CAR)基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导CAR基因的转录，以产生CAR转录物，其中所述CAR转录物能够被翻译以产生CAR，并且其中所述CAR的接合产生免疫细胞刺激，并且从而诱导所述第一诱导型启动子。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含重组酶基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述重组酶基因的转录，以产生重组酶转录物，并且其中所述重组酶转录物能够被翻译以产生重组酶；第三启动子和包含有效载荷基因的第二多核苷酸，其中，在不存在重组事件的情况下，所述第三启动子和所述第二多核苷酸不被可操作地连接，其中所述重组酶能够催化重组事件，并且其中所述第三启动子和所述第二多核苷酸在所述重组事件之后被可操作地连接，使得所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含活性调控因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述活性调控因子基因的转录，以产生活性调控因子转录物，其中所述活性调控因子转录物能够被翻译和/或加工以产生活性调控因子；并且其中所述活性调控因子能够降低T细胞活性。
本文公开的包括核酸组合物。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含振荡器基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述振荡器基因的转录，以产生振荡器转录物，其中所述振荡器转录物能够被翻译和/或加工以产生振荡器；和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第二启动子能够诱导有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物，其中有效载荷转录物能够被翻译以产生有效载荷蛋白，并且其中所述振荡器能够调节有效载荷转录物和/或有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性。
本文公开的包括组合物。在一些实施方案中，组合物包含本文提供的核酸组合物。
本文公开的包括热启动免疫细胞。在一些实施方案中，热启动免疫细胞包含本文公开的核酸组合物。本文公开的包括热启动免疫细胞的群体。在一些实施方案中，热启动免疫细胞的群体包括：多于一个本文公开的热启动免疫细胞。
本文公开的包括产生热启动免疫细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括：将本文公开的核酸组合物或本文公开的组合物引入免疫细胞，从而产生热启动免疫细胞。
本文公开的包括治疗受试者中的疾病或紊乱的方法。在一些实施方案中，该方法包括：将包含本文公开的核酸组合物的组合物或本文公开的组合物引入一种或更多种免疫细胞，从而产生一种或更多种热启动免疫细胞；以及向受试者施用有效量的热启动免疫细胞。在一些实施方案中，该方法包括：向受试者施用有效量的本文公开的热启动免疫细胞。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。参见，例如，Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第2版，J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。为了本公开内容的目的，下文定义了以下术语。
如本文使用的，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的，并且指任何核酸，无论是包括磷酸二酯连接或修饰的连接，诸如磷酸三酯、磷酰胺、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺、氨基甲酸酯、硫醚、桥接的磷酰胺、桥接的亚甲基膦酸酯、桥接的磷酰胺、桥接的磷酰胺、桥接的亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、桥接的硫代磷酸酯或磺酸内酯(sultone)连接，以及这样的连接的组合。术语“核酸”和“多核苷酸”还具体包括由除了五种生物存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的碱基构成的核酸。
如本文使用的术语“载体”可以指用于携带或转移核酸的媒介物。载体的非限制性实例包括质粒和病毒(例如，AAV病毒)。
如本文使用的术语“构建体”是指为表达一个或更多个特定核苷酸序列的目的而产生的重组核酸，或者用于构建其他重组核苷酸序列的重组核酸。
如本文使用的，术语“质粒”是指可以用于在宿主生物体内复制重组DNA序列的核酸。序列可以是双链DNA。
术语“元件”是指某物的单独的或不同的部分，例如，在较长的核酸序列中具有独立功能的核酸序列。术语“调控元件”和“表达控制元件”在本文可互换使用，并且指能够影响可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达的核酸分子。这些术语广泛用于并涵盖促进或调控转录的所有元件，包括启动子、RNA聚合酶和转录因子基本相互作用所需的核心元件、上游元件、增强子和应答元件(参见，例如，Lewin，Lewin,“Genes V”(OxfordUniversity Press,Oxford)第847-873页)。原核生物中的示例性调控元件包括启动子、操纵基因序列和核糖体结合位点。真核细胞中使用的调控元件可以包括但不限于提供和/或调控宿主细胞中编码序列的表达和/或编码多肽的产生的转录和翻译控制序列，诸如启动子、增强子、剪接信号、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号、内部核糖体进入元件(IRES)、2A序列等。
如本文使用的，术语“启动子”是允许RNA聚合酶结合并指导基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5’非编码区，接近基因的转录起始位点。启动子中在转录起始中起作用的序列元件通常以共有核苷酸序列为特征。启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括人类)的启动子。启动子可以是诱导型的、抑制型的和/或组成型的。诱导型启动子起始在其控制下的DNA增加的转录水平，以响应培养条件的某些改变，诸如温度的改变。
如本文使用的，术语“增强子”是指能够增加转录效率的一类调控元件，无论是增强子相对于转录起始位点的距离或定向如何。
如本文使用的，术语“可操作地连接”用于描述调控元件与基因或其编码区之间的连接。通常，基因表达处于一个或更多个调控元件(例如，但不限于组成型或诱导型启动子、组织特异性调控元件和增强子)的控制下。基因或编码区被称为“可操作地连接至(operably linked to)”或“可操作地连接至(operatively linked to)”调控元件或与调控元件“可操作地缔合(operably associated with)”意味着该基因或编码区受调控元件的控制或影响。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。
如本文使用的术语“构建体”是指为表达一个或更多个特定核苷酸序列的目的而产生的重组核酸，或者用于构建其他重组核苷酸序列的重组核酸。
如本文使用的，“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎动物和无脊椎动物，诸如鱼类、贝类、爬行动物，并且特别是哺乳动物。如本文使用的，“哺乳动物”是指属于哺乳动物纲的个体，并且包括但不限于人类、家养动物和农场动物、动物园动物、运动动物和宠物动物。哺乳动物的非限制性实例包括小鼠；大鼠；兔；豚鼠；犬；猫；绵羊；山羊；奶牛；马；灵长类动物，诸如猴、黑猩猩和猿，并且特别是人类。在一些实施方案中，哺乳动物是人类。然而，在一些实施方案中，哺乳动物不是人类。
如本文使用的，术语“治疗”是指响应于患者表现出的疾病、紊乱或生理状况而进行的干预。治疗的目的可以包括但不限于以下中的一个或更多个：减轻或预防症状，减缓或终止疾病、紊乱或状况的进展或恶化，以及缓解疾病、紊乱或状况。术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包括，例如，治疗性治疗、预防性治疗以及其中降低受试者将发展紊乱或其他风险因素的风险的应用。治疗不需要完全治愈紊乱，并且包括降低症状或潜在风险因素的实施方案。在一些实施方案中，“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)措施或预防性(preventive)措施。有治疗需要的那些包括已经受疾病或紊乱或不期望的生理状况影响的那些，以及待预防疾病或紊乱或不期望的生理状况的那些。如本文使用的，术语“预防”是指降低个体以后表现这些症状的负担的任何活动。这可以在一级、二级和/或三级预防水平上进行，其中：a)一级预防避免症状/紊乱/状况的发展；b)二级预防活动针对状况/紊乱/症状治疗的早期阶段，从而增加干预措施防止状况/紊乱/症状的发展和症状的出现的机会；以及c)三级预防通过例如恢复功能和/或降低任何状况/紊乱/症状或相关并发症来降低已经确定的状况/紊乱/症状的负面影响。术语“预防”并不需要100％消除事件的可能性。更准确地说，它表示在存在化合物或方法的情况下，事件发生的可能性已经降低。
如本文使用的，术语“有效量”是指足以产生有益或期望的生物和/或临床结果的量。
“药学上可接受的”载体是指在所用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的载体。“药学上可接受的”载体可以是但不限于适于所选择的应用模式，诸如口服应用或注射，并以常规药物制剂的形式，诸如固体诸如片剂、颗粒剂、粉末、胶囊和液体诸如溶液、乳剂、悬浮液等施用的有机或无机、固体或液体赋形剂。通常生理上可接受的载体是pH缓冲的水性溶液，诸如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。生理上可接受的载体还可以包括以下中的一种或更多种：抗氧化剂，包括抗坏血酸、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白诸如血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸、糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂诸如EDTA，糖醇诸如甘露醇或山梨醇，成盐平衡离子诸如钠和非离子表面活性剂诸如TweenTM、聚乙二醇(PEG)和PluronicsTM。还可以向载体中添加辅助剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂、粘合剂、pH调节剂控制剂、等渗剂等其他常规添加剂。
术语“抗体片段”应被赋予其普通含义，并且还应指保留与抗原的表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体诸如sdAb(VL或VH)、骆驼科动物(camelid)VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体，诸如包括在铰链区处通过二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段，以及抗体的分离的CDR或其他表位结合片段。抗原结合片段也可以掺入到单结构域抗体、最大抗体(maxibodies)、小分子抗体(minibodies)、纳米抗体、内抗体(intrabodies)、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中(参见，例如，Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可以接枝到基于多肽诸如III型纤维连接蛋白(Fn3)的支架中(参见美国专利第6,703,199号，该专利描述了纤维连接蛋白多肽小分子抗体)。
术语“自体”应被赋予其普通含义，并且也应指来源于与材料后来将被重新引入的个体为同一个体的任何材料。
术语“同种异体”应被赋予其普通含义，并且也应指来源于与材料被引入的个体相同物种的不同动物的任何材料。在一个或更多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被称为彼此是同种异体的。在某些方面，来自同一物种的个体的同种异体材料可能在遗传上足够不同而抗原性相互作用。
术语“刺激”应被赋予其普通含义，并且还应指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或CAR情况下的肿瘤抗原)的结合所诱导的初级应答，从而介导信号转导事件(诸如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导或经由适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导)。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
T细胞激活的热控制
正在开发遗传工程化T细胞，以进行多种治疗功能。然而，不存在稳健的机制来从外部控制在体内特定位置处的T细胞的活性。这样的时空控制可以有助于减轻针对实体瘤的应用诸如T细胞免疫疗法中由于分子特异性不完全而产生的潜在脱靶毒性。温度是可以使用诸如聚焦超声和磁热疗的技术递送至体内靶组织的多功能外部控制信号。如本文显示的，热休克启动子可以在37℃-42℃的良好耐受温度范围内介导原代人类T细胞中的遗传回路的热启动。本文公开了能够调节热激活的幅度和持续时间的遗传结构。本文提供了这些回路控制有效载荷(例如，嵌合抗原受体和细胞因子)的表达和靶细胞(例如，肿瘤细胞)的杀伤的用途。本文公开的方法和组合物提供了在T细胞被部署到体内后指导其活性的关键工具。
本文提供了通过分子和物理启动的组合以更大特异性调控治疗性T细胞的活性的细胞工程化方法。在一些实施方案中，该方法利用诸如聚焦超声(FUS)和磁热疗的技术在深层组织的精确位置处非侵入性地沉积热的能力。通过工程化允许T细胞感测温度的微小改变并且将其用作启动遗传回路的输入的热生物开关，这些渗透形式的能量能够利用公开的组合物和方法在空间上控制T细胞的活性。在一些实施方案中，该方法基于尚未在原代人类T细胞中测试的热休克启动子(pHSP)。这是重要的，因为pHSP的行为在细胞类型与细胞状态之间有很大的差异。如本文描述的，在原代T细胞中筛选了pHSP文库，并且工程化了基因回路，以响应于在37℃-42℃的良好耐受温度范围内的短暂的热刺激在T细胞中提供瞬时且持续激活的基因表达。本文提供的回路包括前馈扩增、正反馈和/或基于重组酶的状态开关。本文还提供了这些回路控制治疗性细胞因子的分泌、CAR的表达和靶肿瘤细胞的杀伤的用途。
核酸组合物
在一些实施方案中，提供了核酸组合物。核酸组合物可以包含：(a)可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因的转录，以产生有效载荷转录物；或者(b)可操作地连接至包含反式激活因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下诱导所述反式激活因子基因的转录以产生反式激活因子转录物，其中所述反式激活因子转录物能够被翻译以产生反式激活因子；并且其中，在存在反式激活因子和反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
在一些实施方案中，提供了核酸组合物。核酸组合物可以包含：各自可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸和包含反式激活因子基因的第二多核苷酸的第一诱导型启动子和第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，其中，在存在所述反式激活因子和反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，并且其中所述多顺反子转录物能够被翻译以产生反式激活因子和有效载荷蛋白和/或有效载荷RNA剂。
在一些实施方案中，第二启动子包含反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中反式激活因子在不存在反式激活因子结合化合物的情况下不能结合反式激活因子识别序列。反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝可以包括tet操纵基因(TetO)的一个或更多个拷贝。
在一些实施方案中，提供了核酸组合物。核酸组合物可以包含：(a)可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因的转录，以产生有效载荷转录物；或者(b)可操作地连接至包含反式激活因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下诱导所述反式激活因子基因的转录以产生反式激活因子转录物，其中所述第二启动子包括反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中所述反式激活因子在存在所述反式激活因子结合化合物的情况下不能结合所述反式激活因子识别序列，其中所述反式激活因子转录物能够被翻译以产生反式激活因子；并且其中，在存在反式激活因子但不存在反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
在一些实施方案中，提供了核酸组合物。核酸组合物可以包含：各自可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸和包含反式激活因子基因的第二多核苷酸的第一诱导型启动子和第二启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，其中所述第二启动子包括反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中所述反式激活因子在存在所述反式激活因子结合化合物的情况下不能结合所述反式激活因子识别序列，其中，在存在所述反式激活因子但不存在反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，并且其中所述多顺反子转录物能够被翻译以产生反式激活因子和有效载荷蛋白和/或有效载荷RNA剂。
反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝可以包括tet操纵基因(TetO)的一个或更多个拷贝。第二启动子可以包括四环素应答元件(TRE)。TRE可以包括tet操纵基因(TetO)的一个或更多个拷贝。反式激活因子可以包括反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)。反式激活因子可以包括四环素控制的反式激活因子(tTA)。反式激活因子结合化合物可以包括四环素、多西环素或其衍生物。第一多核苷酸和第二多核苷酸可以可操作地连接至串联基因表达元件。串联基因表达元件可以是内部核糖体进入位点(IRES)、口蹄疫病毒2A肽(F2A)、马鼻炎A型病毒2A肽(E2A)、猪捷申病毒2A肽(P2A)或东亚细亚病毒2A肽(T2A)或其任何组合。有效载荷蛋白和反式激活因子可以被表达为单独的蛋白。四环素调控转录元件或四环素反式激活因子(tTA)是将四环素阻遏蛋白(tetR)DNA结合结构域与VP-16的转录激活结构域组合，使得在tTA与包含tetR序列的最小启动子结合时靶基因的转录被激活的融合蛋白。四环素与tTA的结合通过引起tTA的tetR部分的构象改变，阻断tTA与tetR结合来阻止激活(Hinrichs，W.，等人，(1994)Science 264:418-420)；通过去除四环素来实现基因激活(Gossen,M.&Bujard,H.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551)。也可以使用四环素的衍生物或类似物，包括，例如，多西环素(DOX)、米诺环素、美他环素、山环素、氯-四环素、地美环素和替加环素。本文还设想了基于rtTA的反式激活因子的替代方案，诸如，例如，基于gal4的反式激活因子和基于Cas9的反式激活因子。在一些实施方案中，反式激活因子包括可操作地连接至转录激活结构域的Cas9多肽(例如，dCas9多肽或dCasl2多肽)。在一些实施方案中，转录激活结构域选自包括以下的组：VP16激活结构域、VP64激活结构域、p65激活结构域、MyoDl激活结构域、HSF1激活结构域、RTA激活结构域、SET7/9激活结构域、VP64-p65-Rta(VPR)激活结构域、小VPR激活结构域、酵母GAL4激活结构域、酵母HAP1激活结构域、组蛋白乙酰转移酶或其任何组合。反式激活因子识别序列可以被配置为被Cas9多肽识别。在一些实施方案中，第二启动子是TRE3G诱导型启动子、四环素调控的启动子、类固醇调控的启动子、金属调控的启动子、雌激素受体调控的启动子或UAS诱导型启动子。
在一些实施方案中，提供了核酸组合物。核酸组合物可以包含：可操作地连接至包含嵌合抗原受体(CAR)基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导CAR基因的转录，以产生CAR转录物，其中所述CAR转录物能够被翻译以产生CAR，并且其中所述CAR的接合产生免疫细胞刺激，并且从而诱导所述第一诱导型启动子。
在一些实施方案中，提供了核酸组合物。核酸组合物可以包含：可操作地连接至包含重组酶基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述重组酶基因的转录，以产生重组酶转录物，并且其中所述重组酶转录物能够被翻译以产生重组酶；第三启动子和包含有效载荷基因的第二多核苷酸，其中，在不存在重组事件的情况下，所述第三启动子和所述第二多核苷酸不被可操作地连接，其中所述重组酶能够催化重组事件，并且其中所述第三启动子和所述第二多核苷酸在所述重组事件之后被可操作地连接，使得所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
重组事件可以包括去除侧翼为重组酶靶位点的序列或使侧翼为重组酶靶位点的序列倒位。第二多核苷酸可以侧翼为重组酶靶位点。在一些实施方案中，在重组事件之前，有效载荷基因的序列相对于启动子是倒位的。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：位于第三启动子与有效载荷基因之间的至少一个终止盒，其中终止盒包括一个或更多个终止序列，并且其中一个或更多个终止盒侧翼为重组酶靶位点。有效载荷转录物可以能够被翻译以产生有效载荷蛋白。至少一个终止盒可以被配置为防止有效载荷基因的转录和/或有效载荷转录物的翻译。一个或更多个终止序列可以包括多腺苷酸化信号、终止密码子、移码突变或其任何组合。
第三启动子可以包括遍在性启动子。遍在性启动子可以选自包括以下的组：巨细胞病毒(CMV)介导的早期启动子、CMV启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)LTR、RSV启动子、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自痘苗病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长响应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β驱动蛋白(β-KIN)、人类ROSA 26基因座、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、3-磷酸甘油酸激酶启动子、巨细胞病毒增强子、人类β肌动蛋白(HBA)启动子、鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、CAG启动子、CBH启动子或其任何组合。
重组酶可以是Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022、HP1、γ6、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1、R4、其衍生物或其任何组合。重组酶可以是Flp重组酶，并且重组酶靶位点可以是FRT位点。重组酶可以是Cre重组酶，并且重组酶靶位点可以是loxP位点。如本文使用的，术语“lox位点”是指噬菌体PI的ere基因的产物Cre重组酶在其处能够催化位点特异性重组的核苷酸序列。多种lox位点是本领域已知的，包括但不限于天然存在的loxP(在PI基因组中发现的序列)、loxB、loxL和loxR(这些在大肠杆菌(E.coli)染色体中发现)以及许多突变体或变体lox位点，诸如loxP511、lox2272、loxA86、loxA117、loxC2、loxP2、loxP3和loxP2。如本文使用的术语“frt位点”是指酵母2pm质粒的FLP基因的产物FLP重组酶在其处能够催化位点特异性重组的核苷酸序列。
如本文使用的术语“重组酶”是指介导重组酶识别序列(例如，重组酶靶位点)之间的DNA重组，导致重组酶识别序列之间的DNA片段的切除、整合、倒位或交换(例如，易位)的位点特异性酶。重组酶可以分为两个不同的家族：丝氨酸重组酶(例如，解离酶和转化酶)和酪氨酸重组酶(例如，整合酶)。丝氨酸重组酶的实例包括但不限于Hin、Gin、Tn3、β-six、CinH、ParA、yδ、Bxb1、φC31、TP901、TG1、φBT1、R4、φRV1、φFC1、MR11、A118、U153和gp29。酪氨酸重组酶的实例包括但不限于Cre、FLP、R、Lambda、HK101、HK022和pSAM2。在核酸修饰(例如基因组修饰)的上下文中，术语“重组(recombine)”或“重组(recombination)”用于指通过重组酶蛋白的作用修饰两个或更多个核酸分子或单个核酸分子的两个或更多个区域的过程。重组可以尤其导致例如在一个或更多个核酸分子内或一个或更多个核酸分子之间的核酸序列的插入、倒位、切除或易位。如本文使用的，术语“重组位点序列”或“重组酶靶位点”是指由DNA重组酶特异性识别和作用的短多核酸序列，通常是回文的。DNA重组酶/重组位点序列对包括但不限于Cre/loxP、Dre/rox、VCre/VloxP、SCre/SloxP、Vika/vox、λ-int/attP、Flp/FRT、R/RRT、Kw/KwRT、Kd/KdRT、B2/B2RT和B3/B3RT。
在一些实施方案中，核酸组合物包含：一个或更多个第二转基因，其中所述一个或更多个第二转基因编码一个或更多个第二有效载荷RNA剂和/或一个或更多个第二有效载荷蛋白。在一些实施方案中，所述核酸组合物包含：可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物，其中所述有效载荷转录物能够被翻译以产生有效载荷蛋白。
核酸组合物可以包含一种或更多种载体。一种或更多种载体中的至少一种可以是病毒载体、质粒、裸露DNA载体、脂质纳米颗粒或其任何组合。病毒载体可以是AAV载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、整合缺陷慢病毒(IDLV)载体。在一些实施方案中，核酸组合物包含：5'ITR、3'ITR、5'LTR、3'LTR或其任何组合。
本文公开的包括组合物。在一些实施方案中，组合物包括本文提供的核酸组合物。组合物可以包含一种或更多种载体、核糖核蛋白(RNP)复合物、脂质体、纳米颗粒、外泌体、微囊泡或其任何组合。载体可以是病毒载体、质粒、裸露DNA载体、脂质纳米颗粒或其任何组合。病毒载体可以是AAV载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、整合缺陷慢病毒(IDLV)载体。AAV载体可以包括单链AAV(ssAAV)载体或自互补AAV(scAAV)载体。
来源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合并使其在子代细胞中繁殖。慢病毒载体相比于来源于肿瘤逆转录病毒(onco-retrovirus)诸如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。逆转录病毒载体也可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或更多个(例如两个)长末端重复序列(LTR)和感兴趣的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可能缺乏病毒结构基因，诸如gag、pol和env。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(Spleen-Focus Forming Virus，SFFV)和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)及来源于其的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如TobiasMaetzig等人，“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application”Viruses.2011 June；3(6):677-713。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒属在逆转录病毒中是独特的，在于其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，特别包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中提供的自失活慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其他实例包括但不限于，例如，来自Oxford BioMedica的
Figure BDA0004000640040000461
基因递送技术，来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可用的，并且将是本领域技术人员已知的。
载体技术是本领域中熟知的，并且在例如Sambrook等人，2012,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY，以及其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一种或更多种选择标志物(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经开发了用于将基因转移到哺乳动物细胞(例如，免疫细胞)中的许多基于病毒的系统。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了一个方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离，并且在体内或离体将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一种实施方案中，使用慢病毒载体。
核酸组合物可以是单链的或双链的。核酸组合物可以包含两种或更多种核酸。两种或更多种核酸可以呈相同形式(例如，第一质粒和第二质粒)或不同形式(例如，第一质粒和第一病毒载体)。核酸组合物可以包含能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导转录的单个启动子(例如，单个诱导型启动子)。核酸组合物可以包含能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导转录的两个或更多个启动子(例如，两个或更多个诱导型启动子)。能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导转录的两个或更多个启动子可以相同或不同(例如，包含在至少一个核苷酸方面不同的两个HSP启动子的核酸组合物)。根据使用者的需要，核酸组合物可以是本文所设想的包含启动子、诱导型启动子、多核苷酸和/或基因的任何配置的回路。在一些实施方案中，第一诱导型启动子感测T细胞活性。T细胞活性可以包括T细胞刺激、T细胞激活、细胞因子分泌、T细胞存活、T细胞增殖、CTL活性、T细胞脱粒和T细胞分化中的一种或更多种。在一些实施方案中，有效载荷包括CAR和/或TCR，其中有效载荷在不存在热刺激的情况下不被表达，并且其中CAR和/或TCR的接合起始有效载荷的持续表达。
有效载荷表达水平和调节(Tuning)
在一些实施方案中，在不存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下，有效载荷蛋白在免疫细胞中达到未刺激的稳态有效载荷蛋白水平。未刺激的稳态有效载荷蛋白水平可能不足以对所述免疫细胞产生表型效应和/或治疗效应。在一些实施方案中，在热刺激和/或免疫细胞刺激后，来自第一诱导型启动子的有效载荷基因、反式激活因子基因、振荡器基因和/或重组酶基因的转录增加至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，或这些值中任何两个之间的数字或范围)。在一些实施方案中，增加反式激活因子结合化合物浓度增加刺激的稳态有效载荷蛋白水平。
在一些实施方案中，有效载荷转录物的稳态水平、反式激活因子转录物的稳态水平、重组酶转录物的稳态水平、振荡器转录物的稳态水平和/或多顺反子转录物的稳态水平在热刺激和/或免疫细胞刺激后高至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，或这些值中任何两个之间的数字或范围)。在一些实施方案中，在热刺激和/或免疫细胞刺激后，有效载荷蛋白在免疫细胞中达到刺激的稳态有效载荷蛋白水平。在一些实施方案中，有效载荷蛋白不回到未刺激的稳态有效载荷蛋白水平。
刺激的稳态有效载荷蛋白水平可以比未刺激的稳态有效载荷蛋白水平高至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，或这些值中任何两个之间的数字或范围)。
在一些实施方案中，在第一持续时间之后，有效载荷蛋白从刺激的稳态有效载荷蛋白水平回到未刺激的稳态有效载荷蛋白水平，其中第一持续时间是约250小时、约200小时、约150小时、约96小时、约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟，或这些值中任何两个之间的数字或范围。
在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平能够通过将一个或更多个非典型氨基酸取代引入到沉默子效应物结合序列、切割位点和/或降解决定子中来增加。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平能够通过将一个或更多个典型氨基酸取代引入到沉默子效应物结合序列、切割位点和/或降解决定子中来降低。
在一些实施方案中，核酸组合物包含：转录物稳定元件。转录物稳定元件可以包括土拨鼠肝炎翻译后调控元件(WPRE)、牛生长激素多腺苷酸化(bGH-polyA)信号序列、人类生长激素多腺苷酸化(hGH-polyA)信号序列或其任何组合。有效载荷基因可以包括5'UTR和/或3'UTR。反式激活因子基因可以包括5'UTR和/或3'UTR。重组酶基因可以包括5’UTR和/或3’UTR。振荡器基因可以包括5'UTR和/或3'UTR。5’UTR可以包括Kozak序列。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平、未刺激的稳态有效载荷蛋白水平、下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过调节Kozak序列的存在和/或序列来调节。5’UTR可以包括一个或更多个微开放阅读框。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平、未刺激的稳态有效载荷蛋白水平、下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过调节一个或更多个微开放阅读框的存在和/或序列来调节。
诱导型启动子
在一些实施方案中，提供了能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导转录的启动子(例如，诱导型启动子)。在一些实施方案中，本文提供的诱导型启动子可以感测T细胞活性。第一诱导型启动子可以包括或可以来源于哺乳动物热休克启动子(HSP)或秀丽线虫(C.elegans)HSP。哺乳动物HSP可以是人类HSP或小鼠HSP。第一诱导型启动子可以包含与SEQ ID NO:1-14至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。第一诱导型启动子可以包括一个或更多个AP-1位点。在一些实施方案中，第一诱导型启动子不包括AP-1位点。第一诱导型启动子可以包括双向启动子和/或最小双向启动子。第一诱导型启动子可以包括一个或更多个热休克元件(HSE)结合位点(例如，四个HSE结合位点)。在一些实施方案中，第一诱导型启动子不包括除了一个或更多个HSE结合位点之外的人类转录因子结合位点。在一些实施方案中，第一诱导型启动子包括TATA盒、GC盒、CAAT信号和AP-1位点中的一个或更多个。本文提供的核酸可以包括启动子、增强子、正或负顺式作用序列、诱导型或抑制型控制元件、基因上游的5'UTR序列或其任何组合的一部分。公开的启动子(例如，第一诱导型启动子、第二启动子、第三启动子)可以包括0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个HSE结合位点。诱导型启动子可以包含表1所示的启动子序列。
所公开的启动子(例如，第一诱导型启动子、第二启动子、第三启动子)可以来源于选自包括以下的组的一个或更多个物种的热休克启动子(HSP)：拟南芥(Arabidopsisthaliana)；构巢曲霉(Aspergillus nidulans)；家蚕(Bombyx mori)；白色念珠菌(Candidaalbicans)；秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)；莱因衣藻(Chlamydomonasrheinhardtii)；灰仓鼠(Cricetulus griseus)；蓝盒藻(Cyanophora paradoxa)；筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)；斑马鱼(Danio rerio)；盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；雅库巴果蝇(Drosophila yakuba)；原鸡(Gallus gallus)；智人(Homo Sapiens)；恰氏利什曼原虫(Leishmania chagasi)；硕大利什曼原虫(Leishmania major)；长翼鱿鱼(Loligo pealii)；舞毒娥(Lymantriadispar)；短尾负鼠(Monodelphis domestica)；条纹狼鲈(Morone saxatilis)；小家鼠(Musmusculus)；红球丛赤壳(Nectria haematococca)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；烟草(Nicotiana tabacum)；水稻(Oryza sativa)；普通海胆(Paracentrotus lividus)；恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)；褐家鼠(Rattus norvegicus)；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；马铃薯(Solanumtuberosum)；紫球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)；总状共头霉(Syncephalastrumracemosum)；嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)；布氏锥虫(Trypanosoma brucei)；玉米黑粉菌(Ustilago maydis)；团藻(Volvox carteri)；和非洲爪蟾(Xenopus laevis)。
本文提供的启动子(例如，第一诱导型启动子、第二启动子、第三启动子)的长度可以变化。在一些实施方案中，公开的启动子(例如，第一启动子、第二启动子、第三启动子)的长度是以下或者是约以下：25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、110个核苷酸、120个核苷酸、128个核苷酸、130个核苷酸、140个核苷酸、150个核苷酸、160个核苷酸、170个核苷酸、180个核苷酸、190个核苷酸、200个核苷酸、210个核苷酸、220个核苷酸、230个核苷酸、240个核苷酸、250个核苷酸、260个核苷酸、270个核苷酸、280个核苷酸、290个核苷酸、300个核苷酸、310个核苷酸、320个核苷酸、330个核苷酸、340个核苷酸、350个核苷酸、360个核苷酸、370个核苷酸、380个核苷酸、390个核苷酸、400个核苷酸、410个核苷酸、420个核苷酸、430个核苷酸、440个核苷酸、450个核苷酸、460个核苷酸、470个核苷酸、480个核苷酸、490个核苷酸、500个核苷酸、510个核苷酸、520个核苷酸、530个核苷酸、540个核苷酸、550个核苷酸、560个核苷酸、570个核苷酸、580个核苷酸、590个核苷酸、600个核苷酸、610个核苷酸、620个核苷酸、630个核苷酸、640个核苷酸、650个核苷酸、660个核苷酸、670个核苷酸、680个核苷酸、690个核苷酸、700个核苷酸、710个核苷酸、720个核苷酸、730个核苷酸、740个核苷酸、750个核苷酸、760个核苷酸、770个核苷酸、780个核苷酸、790个核苷酸、800个核苷酸、810个核苷酸、820个核苷酸、830个核苷酸、840个核苷酸、850个核苷酸、860个核苷酸、870个核苷酸、880个核苷酸、890个核苷酸、900个核苷酸、910个核苷酸、920个核苷酸、930个核苷酸、940个核苷酸、950个核苷酸、960个核苷酸、970个核苷酸、980个核苷酸、990个核苷酸、1000个核苷酸、1050个核苷酸、1100个核苷酸、1150个核苷酸、1200个核苷酸、1250个核苷酸、1300个核苷酸、1350个核苷酸、1400个核苷酸、1450个核苷酸、1500个核苷酸、1550个核苷酸、1600个核苷酸、1650个核苷酸、1700个核苷酸、1750个核苷酸、1800个核苷酸、1850个核苷酸、1900个核苷酸、1950个核苷酸、1100个核苷酸、1150个核苷酸、1000个核苷酸、1050个核苷酸、1100个核苷酸、1150个核苷酸、1200个核苷酸、1250个核苷酸、1300个核苷酸、1350个核苷酸、1400个核苷酸、1450个核苷酸、1500个核苷酸、1550个核苷酸、1600个核苷酸、1650个核苷酸、1700个核苷酸、1750个核苷酸、1800个核苷酸、1850个核苷酸、1900个核苷酸、1950个核苷酸、2000个核苷酸、2050个核苷酸、2100个核苷酸、2150个核苷酸、2200个核苷酸、2250个核苷酸、2300个核苷酸、2350个核苷酸、2400个核苷酸、2450个核苷酸、2500个核苷酸、2550个核苷酸、2600个核苷酸、2650个核苷酸、2700个核苷酸、2750个核苷酸、2800个核苷酸、2850个核苷酸、2900个核苷酸、2950个核苷酸、3000个核苷酸或4000个核苷酸，或这些值中任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，公开的启动子(例如，第一启动子、第二启动子、第三启动子)的长度至少是以下或者至多是以下：25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、110个核苷酸、120个核苷酸、128个核苷酸、130个核苷酸、140个核苷酸、150个核苷酸、160个核苷酸、170个核苷酸、180个核苷酸、190个核苷酸、200个核苷酸、210个核苷酸、220个核苷酸、230个核苷酸、240个核苷酸、250个核苷酸、260个核苷酸、270个核苷酸、280个核苷酸、290个核苷酸、300个核苷酸、310个核苷酸、320个核苷酸、330个核苷酸、340个核苷酸、350个核苷酸、360个核苷酸、370个核苷酸、380个核苷酸、390个核苷酸、400个核苷酸、410个核苷酸、420个核苷酸、430个核苷酸、440个核苷酸、450个核苷酸、460个核苷酸、470个核苷酸、480个核苷酸、490个核苷酸、500个核苷酸、510个核苷酸、520个核苷酸、530个核苷酸、540个核苷酸、550个核苷酸、560个核苷酸、570个核苷酸、580个核苷酸、590个核苷酸、600个核苷酸、610个核苷酸、620个核苷酸、630个核苷酸、640个核苷酸、650个核苷酸、660个核苷酸、670个核苷酸、680个核苷酸、690个核苷酸、700个核苷酸、710个核苷酸、720个核苷酸、730个核苷酸、740个核苷酸、750个核苷酸、760个核苷酸、770个核苷酸、780个核苷酸、790个核苷酸、800个核苷酸、810个核苷酸、820个核苷酸、830个核苷酸、840个核苷酸、850个核苷酸、860个核苷酸、870个核苷酸、880个核苷酸、890个核苷酸、900个核苷酸、910个核苷酸、920个核苷酸、930个核苷酸、940个核苷酸、950个核苷酸、960个核苷酸、970个核苷酸、980个核苷酸、990个核苷酸、1000个核苷酸、1050个核苷酸、1100个核苷酸、1150个核苷酸、1200个核苷酸、1250个核苷酸、1300个核苷酸、1350个核苷酸、1400个核苷酸、1450个核苷酸、1500个核苷酸、1550个核苷酸、1600个核苷酸、1650个核苷酸、1700个核苷酸、1750个核苷酸、1800个核苷酸、1850个核苷酸、1900个核苷酸、1950个核苷酸、1100个核苷酸、1150个核苷酸、1000个核苷酸、1050个核苷酸、1100个核苷酸、1150个核苷酸、1200个核苷酸、1250个核苷酸、1300个核苷酸、1350个核苷酸、1400个核苷酸、1450个核苷酸、1500个核苷酸、1550个核苷酸、1600个核苷酸、1650个核苷酸、1700个核苷酸、1750个核苷酸、1800个核苷酸、1850个核苷酸、1900个核苷酸、1950个核苷酸、2000个核苷酸、2050个核苷酸、2100个核苷酸、2150个核苷酸、2200个核苷酸、2250个核苷酸、2300个核苷酸、2350个核苷酸、2400个核苷酸、2450个核苷酸、2500个核苷酸、2550个核苷酸、2600个核苷酸、2650个核苷酸、2700个核苷酸、2750个核苷酸、2800个核苷酸、2850个核苷酸、2900个核苷酸、2950个核苷酸、3000个核苷酸或4000个核苷酸。
在一些实施方案中，公开的启动子(例如，第一诱导型启动子、第二启动子、第三启动子)与SEQ ID NO:1-14中任何一个的序列之间的序列同一性可以是以下，或者是约以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，公开的启动子(例如，第一启动子、第二启动子、第三启动子)与SEQ ID NO:1-14中任何一个的序列之间的序列同一性可以是至少以下，或者是至多以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
公开的启动子(例如，第一诱导型启动子、第二启动子、第三启动子)可以包含由SEQ ID NO:1-14描述的序列的至少约20个连续核苷酸(例如，约20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、110nt、120nt、128nt、130nt、140nt、150nt、160nt、170nt、180nt、190nt、200nt、210nt、220nt、230nt、240nt、250nt、260nt、270nt、280nt、290nt、300nt、310nt、320nt、330nt、340nt、350nt、360nt、370nt、380nt、390nt、400nt、410nt、420nt、430nt、440nt、450nt、460nt、470nt、480nt、490nt、500nt、510nt、520nt、530nt、540nt、550nt、560nt、570nt、580nt、590nt、600nt、610nt、620nt、630nt、640nt、650nt、660nt、670nt、680nt、690nt、700nt、710nt、720nt、730nt、740nt、750nt、760nt、770nt、780nt、790nt、800nt、810nt、820nt、830nt、840nt、850nt、860nt、870nt、880nt、890nt、900nt、910nt、920nt、930nt、940nt、950nt、960nt、970nt、980nt、990nt、1000nt，或这些值中任何两个之间的数字或范围)。
本文还提供了与SEQ ID NO:16-44或其部分至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的核酸。本文还提供了包含由SEQ ID NO:16-44描述的序列的至少约20个连续核苷酸(例如，约20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、110nt、120nt、128nt、130nt、140nt、150nt、160nt、170nt、180nt、190nt、200nt、210nt、220nt、230nt、240nt、250nt、260nt、270nt、280nt、290nt、300nt、310nt、320nt、330nt、340nt、350nt、360nt、370nt、380nt、390nt、400nt、410nt、420nt、430nt、440nt、450nt、460nt、470nt、480nt、490nt、500nt、510nt、520nt、530nt、540nt、550nt、560nt、570nt、580nt、590nt、600nt、610nt、620nt、630nt、640nt、650nt、660nt、670nt、680nt、690nt、700nt、710nt、720nt、730nt、740nt、750nt、760nt、770nt、780nt、790nt、800nt、810nt、820nt、830nt、840nt、850nt、860nt、870nt、880nt、890nt、900nt、910nt、920nt、930nt、940nt、950nt、960nt、970nt、980nt、990nt、10000nt、50000nt，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的核酸。
表1：pHSP序列
Figure BDA0004000640040000541
Figure BDA0004000640040000551
Figure BDA0004000640040000561
Figure BDA0004000640040000571
Figure BDA0004000640040000581
有效载荷
在一些实施方案中，有效载荷基因编码有效载荷蛋白。有效载荷蛋白可以包括局部下调内源免疫细胞活性的因子。有效载荷蛋白可以能够重塑肿瘤微环境和/或降低受试者的靶部位处的免疫抑制。有效载荷蛋白可以包括降解决定子。在一些实施方案中，有效载荷蛋白的稳态水平可以通过改变降解决定子的序列来改变。在一些实施方案中，有效载荷包括分泌蛋白。在一些实施方案中，通过热刺激和/或免疫细胞刺激诱导第一诱导型启动子引起有效载荷分子的分泌。在一些实施方案中，刺激的稳态有效载荷蛋白水平、未刺激的稳态有效载荷蛋白水平、下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过调节串联基因表达元件的存在和/或序列来调节。在一些实施方案中，有效载荷包括CAR和/或TCR，其中有效载荷在不存在热刺激的情况下不被表达，并且其中CAR和/或TCR的接合起始有效载荷的持续表达。在一些实施方案中，有效载荷包括前药转化酶(例如，HSV胸苷激酶(TK)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、胱天蛋白酶-9、羧酸酯酶(Carboxylesterase)(CE)、硝基还原酶(NTR)、辣根过氧化物酶(HRP)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫氨酸α,γ裂解酶(MET)、胸苷磷酸化酶(TP))。
在一些实施方案中，有效载荷基因编码有效载荷RNA剂。有效载荷RNA剂可以包括dsRNA、siRNA、shRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA和snoRNA中的一种或更多种。在一些实施方案中，有效载荷基因编码siRNA、shRNA、反义RNA寡核苷酸、反义miRNA、反式剪接RNA、引导RNA、单引导RNA、crRNA、tracrRNA、反式剪接RNA、pre-mRNA、mRNA或其任何组合。
有效载荷蛋白可以包括细胞因子。细胞因子可以选自由以下组成的组：白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、M-CSF、SCF、TSLP、抑癌蛋白M、白血病抑制因子(LIF)、CNTF、心肌营养因子-1、NNT-1/BSF-3、生长激素、催乳素、促红细胞生成素、血小板生成素、瘦素、G-CSF或其受体或配体。
有效载荷蛋白可以包括选自由以下组成的组的TGF-β/BMP家族的成员：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3a、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8a、BMP-8b、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15、BMP-16、子宫内膜出血相关因子(EBAF)、生长分化因子-1(GDF-1)、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-12、GDF-14、米勒管抑制物质(MIS)、激活蛋白-1、激活蛋白-2、激活蛋白-3、激活蛋白-4和激活蛋白-5。有效载荷蛋白可以包括选自由以下组成的组的细胞因子TNF家族的成员：TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD 27配体、CD 30配体和4-1BBL。有效载荷蛋白可以包括选自由以下组成的组的细胞因子免疫球蛋白超家族的成员：B7.1(CD80)和B7.2(B70)。有效载荷蛋白可以包括干扰素。干扰素可以选自α干扰素、β干扰素或γ干扰素。有效载荷蛋白可以包括趋化因子。趋化因子可以选自CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、嗜酸性粒细胞趋化因子、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15。有效载荷蛋白可以包括白细胞介素。白细胞介素可以选自IL-10、IL-12、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-18或IL-21。有效载荷蛋白可以包括肿瘤坏死因子(TNF)。TNF可以选自TNF-α、TNF-β、TNF-γ、CD252、CD154、CD178、CD70、CD153或4-1BBL。
有效载荷蛋白可以包括CRE重组酶、GCaMP、细胞疗法组分、敲低基因疗法组分、细胞表面暴露表位或其任何组合。有效载荷蛋白可以包括嵌合抗原受体。
有效载荷蛋白可以包括可编程核酸酶。在一些实施方案中，可编程核酸酶选自包括以下的组：SpCas9或其衍生物；VRER、VQR、EQR SPCas9；xCas9-3.7；eSpCas9；Cas9-HF1；HypaCas9；evoCas9；HiFi Cas9；ScCas9；StCas9；NmCas9；SaCas9；CjCas9；CasX；Cas9 H940A切口酶；Cas12及其衍生物；dcas9-APOBEC1融合体、BE3和dcas9-脱氨酶融合体；dcas9-Krab、dCas9-VP64、dCas9-Tet1和dcas9-转录调控因子融合；Dcas9-荧光蛋白融合体；Cas13-荧光蛋白融合体；RCas9-荧光蛋白融合体；Cas13-腺苷脱氨酶融合体。可编程核酸酶可以包括锌指核酸酶(ZFN)和/或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。可编程核酸酶可以包括化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)、锌指核酸酶、TAL效应物核酸酶、兆核酸酶、MegaTAL、Tev-m TALEN、MegaTev、归巢内切核酸酶、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、C2c1、C2c3、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、其衍生物或其任何组合。核酸组合物可以包含编码(i)靶向分子和/或(ii)供体核酸的多核苷酸。靶向分子可以能够与可编程核酸酶缔合。靶向分子可以包括单链DNA或单链RNA。靶向分子可以包括单引导RNA(sgRNA)。
在一些实施方案中，有效载荷蛋白是治疗性蛋白或其变体。治疗性蛋白的非限制性实例包括血液因子，诸如β球蛋白、血红蛋白、组织纤溶酶原激活因子和凝血因子；集落刺激因子(CSF)；白细胞介素，诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等；生长因子，诸如角质形成细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF，诸如碱性FGF和酸性FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、生长分化因子-9(GDF-9)、肝癌来源生长因子(HDGF)、肌生成抑制蛋白(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子、血小板来源生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-a)、转化生长因子β(TGF-β)等；可溶性受体，诸如可溶性TNF受体、可溶性VEGF受体、可溶性白细胞介素受体(例如，可溶性IL-1受体和可溶性II型IL-1受体)、可溶性γ/δT细胞受体、可溶性受体的配体结合片段等；酶，诸如葡糖苷酶、imiglucarase、β-葡糖脑苷脂酶和阿糖脑苷酶(alglucerase)；酶激活因子，诸如组织纤溶酶原激活因子；趋化因子，诸如IP-10、γ-干扰素诱导的单核因子(Mig)、Gro/IL-8、RANTES、MIP-l、ΜΙΡ-Ιβ、MCP-1、PF-4等；血管生成剂，诸如血管内皮生长因子(VEGF，例如，VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2)、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子、胶质瘤来源生长因子、血管生成蛋白、血管生成蛋白-2等；抗血管生成剂，诸如可溶性VEGF受体；蛋白疫苗；神经活性肽，诸如神经生长因子(NGF)、缓激肽、胆囊收缩素、gastin、促胰液素、催产素、促性腺激素释放激素、β内啡肽、脑啡肽、P物质、生长抑素、催乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、铃蟾肽、强啡肽、华法林、神经降压素、胃动素、促甲状腺激素、神经肽Y、黄体化激素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、血管升压素、血管紧张素II、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽等；血栓溶解剂；心房利尿钠肽；松弛素；胶质纤维酸性蛋白；促卵泡素(FSH)；人类α-1抗胰蛋白酶；白血病抑制因子(LIF)；转化生长因子(TGF)；组织因子；黄体化激素；巨噬细胞活化因子；肿瘤坏死因子(TNF)；中性粒细胞趋化因子(NCF)；神经生长因子；金属蛋白酶组织抑制剂；血管活性肠肽；血管生成蛋白；促血管素；纤维蛋白；水蛭素；IL-1受体拮抗剂；等。有效载荷蛋白的一些其他非限制性实例包括睫状神经营养因子(CNTF)；脑来源神经营养因子(BDNF)；神经营养素3和4/5(NT-3和4/5)；胶质细胞来源神经营养因子(GDNF)；芳族氨基酸脱羧酶(AADC)；血友病相关凝血蛋白，诸如因子VIII、因子IX、因子X；抗肌萎缩蛋白(dystrophin)或小抗肌萎缩蛋白(mini-dystrophin)；溶酶体酸性脂肪酶；苯丙氨酸羟化酶(PAH)；糖原贮积病相关酶，诸如葡萄糖-6-磷酸酶、酸性麦芽糖酶、糖原脱支酶、肌糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶(例如，PHKA2)、葡萄糖转运蛋白(例如，GLUT2)、醛缩酶A、β烯醇化酶和糖原合酶；溶酶体酶(例如，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶A)；及其任何变体。
在一些实施方案中，有效载荷蛋白是蛋白(诸如任何前述蛋白)的活性片段。在一些实施方案中，有效载荷蛋白是包括两种或更多种蛋白中的一些或全部的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白可以包括上述任何蛋白的全部或部分。
在一些实施方案中，有效载荷蛋白是多亚基蛋白。例如，有效载荷蛋白可以包括两个或更多个亚基，或两个或更多个独立的多肽链。在一些实施方案中，有效载荷蛋白可以是抗体。抗体的实例包括但不限于各种同种型的抗体(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM)；通过本领域技术人员已知的任何手段产生的单克隆抗体，包括单克隆抗体的抗原结合片段；人源化抗体；嵌合抗体；单链抗体；抗体片段诸如Fv、F(ab’)2、Fab’、Fab、Facb、scFv等；条件是抗体能够与抗原结合。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。
在一些实施方案中，有效载荷基因编码促存活蛋白(pro-survival protein)(例如，Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1和A1)。在一些实施方案中，有效载荷基因编码凋亡因子或凋亡相关蛋白，诸如，例如，AIF、Apaf(例如，Apaf-1、Apaf-2和Apaf-3)、oder APO-2(L)、APO-3(L)、凋亡素(Apopain)、Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-xS、bik、CAD、钙蛋白酶、胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10和胱天蛋白酶11)、ced-3、ced-9、c-Jun、c-Myc、crm A、细胞色素C、CdR1、DcR1、DD、DED、DISC、DNA-PKcs、DR3、DR4、DR5、FADD/MORT-1、FAK、Fas(Fas-配体CD95/fas(受体)、FLICE/MACH、FLIP、胞衬蛋白(fodrin)、fos、G肌动蛋白、Gas-2、凝溶胶蛋白、颗粒酶A/B、ICAD、ICE、JNK、核层蛋白A/B、MAP、MCL-1、Mdm-2、MEKK-1、MORT-1、NEDD、NF-κB、NuMa、p53、PAK-2、PARP、穿孔蛋白、PITSLRE、PKCδ、pRb、衰老蛋白、prICE、RAIDD、Ras、RIP、鞘磷脂酶、来自单纯疱疹的胸苷激酶、TRADD、TRAF2、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3和/或转谷氨酰胺酶。
在一些实施方案中，有效载荷基因编码能够将至少部分分化的细胞转化为低分化细胞的细胞重编程因子，诸如，例如Oct-3、Oct-4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog、Lin28、ASCL1、MYT1 L、TBX3b、SV40大T、hTERT、miR-291、miR-294、miR-295或其任何组合。在一些实施方案中，有效载荷基因编码能够使给定细胞分化为期望分化状态的编程因子，诸如，例如，神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞介素-6(IL-6)、骨形态发生蛋白(BMP)、神经原素3(Ngn3)、胰腺和十二指肠同源异形框1(Pdx1)、Mafa或其任何组合。
在一些实施方案中，有效载荷基因编码能够引发固有免疫应答的人类佐剂蛋白，诸如例如诱导或增强固有免疫应答的细胞因子，包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、CCL21、GM-CSF和TNF-α；由巨噬细胞释放的细胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α；来自补体系统组分，包括C1q、MBL、C1r、C1s、C2b、Bb、D、MASP-1、MASP-2、C4b、C3b、C5a、C3a、C4a、C5b、C6、C7、C8、C9、CR1、CR2、CR3、CR4、C1qR、C1INH、C4bp、MCP、DAF、H、I、P和CD59；来自作为模式识别受体的信号传导网络的组分的蛋白，包括TLR和IL-1R1，而这些组分是模式识别受体的配体，包括IL-1α，IL-1β，β-防御素，热休克蛋白，诸如HSP10、HSP60、HSP65、HSP70、HSP75和HSP90、gp96、纤维蛋白原、纤连蛋白的Typlll重复额外结构域A；受体，包括IL-1RI、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11；信号转导器，包括Small-GTP酶信号传导的组分(例如，RhoA、Ras、Rac1、Cdc42)，PIP信号传导的组分(例如，PI3K、Src-激酶)，MyD88依赖性信号传导的组分(例如，MyD88、IRAK1、IRAK2)，MyD88非依赖性信号传导的组分(TICAM1、TICAM2等)；激活的转录因子，包括NF-κB、c-Fos、c-Jun、c-Myc；以及诱导的靶基因包括IL-1α、IL-1β、β-防御素、IL-6、IFNγ、IFNα、IFNβ；来自共刺激分子，包括CD28或CD40-配体或PD1；蛋白结构域，包括LAMP；细胞表面蛋白；或人类佐剂蛋白包括CD80、CD81、CD86、trif、flt-3配体、胸腺五肽、Gp96或纤连蛋白等，或以上人类佐剂蛋白中的任何一种的任何物种同源物。
如本文描述的，编码有效载荷蛋白的核苷酸序列可以被修饰以改进蛋白的表达效率。可用于改进本文的基因的转录和/或翻译的方法不受特别限制。例如，可以修饰核苷酸序列以更好地反映宿主密码子使用，以增加宿主(例如，哺乳动物)中的基因表达(例如，蛋白生产)。
免疫细胞中有效载荷基因表达的程度可以改变。例如，在一些实施方案中，有效载荷基因编码有效载荷蛋白。在受试者(例如，受试者的血清)中表达的有效载荷蛋白的量可以改变。例如，在一些实施方案中，蛋白可以以至少约9μg/ml、至少约10μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约300μg/ml、至少约400μg/ml、至少约500μg/ml、至少约600μg/ml、至少约700μg/ml、至少约800μg/ml、至少约900μg/ml或至少约1000μg/ml的量在受试者的血清中表达。在一些实施方案中，有效载荷蛋白以约9μg/ml、约10μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约200μg/ml、约300μg/ml、约400μg/ml、约500μg/ml、约600μg/ml、约700μg/ml、约800μg/ml、约900μg/ml、约1000μg/ml、约1500μg/ml、约2000μg/ml、约2500μg/ml或这些值中任何两个之间的范围的量在受试者的血清中表达。本领域技术人员将理解，该方法有效所需的有效载荷蛋白的表达水平可以根据非限制性因素诸如特定有效载荷蛋白和接受治疗的受试者而改变，并且蛋白的有效量可以由本领域技术人员使用本领域已知的常规方法容易地确定，而无需过度的实验。
由有效载荷基因编码的有效载荷蛋白可以具有各种长度。例如，有效载荷蛋白的长度可以是至少约200个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸或更长。在一些实施方案中，有效载荷蛋白的长度是至少约480个氨基酸。在一些实施方案中，有效载荷蛋白的长度是至少约500个氨基酸。在一些实施方案中，有效载荷蛋白的长度是约750个氨基酸。
在不同实施方式中，有效载荷基因可以具有不同的长度。在不同实施方案中，有效载荷基因的数量可以是不同的。在一些实施方案中，核酸组合物中有效载荷基因的数量可以是以下或者可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个，或这些值中任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，核酸组合物中有效载荷基因的数量可以是至少以下或者可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个。在一些实施方案中，有效载荷基因的长度是以下，或者是约以下：1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸、15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、110个核苷酸、120个核苷酸、128个核苷酸、130个核苷酸、140个核苷酸、150个核苷酸、160个核苷酸、170个核苷酸、180个核苷酸、190个核苷酸、200个核苷酸、210个核苷酸、220个核苷酸、230个核苷酸、240个核苷酸、250个核苷酸、260个核苷酸、270个核苷酸、280个核苷酸、290个核苷酸、300个核苷酸、310个核苷酸、320个核苷酸、330个核苷酸、340个核苷酸、350个核苷酸、360个核苷酸、370个核苷酸、380个核苷酸、390个核苷酸、400个核苷酸、410个核苷酸、420个核苷酸、430个核苷酸、440个核苷酸、450个核苷酸、460个核苷酸、470个核苷酸、480个核苷酸、490个核苷酸、500个核苷酸、510个核苷酸、520个核苷酸、530个核苷酸、540个核苷酸、550个核苷酸、560个核苷酸、570个核苷酸、580个核苷酸、590个核苷酸、600个核苷酸、610个核苷酸、620个核苷酸、630个核苷酸、640个核苷酸、650个核苷酸、660个核苷酸、670个核苷酸、680个核苷酸、690个核苷酸、700个核苷酸、710个核苷酸、720个核苷酸、730个核苷酸、740个核苷酸、750个核苷酸、760个核苷酸、770个核苷酸、780个核苷酸、790个核苷酸、800个核苷酸、810个核苷酸、820个核苷酸、830个核苷酸、840个核苷酸、850个核苷酸、860个核苷酸、870个核苷酸、880个核苷酸、890个核苷酸、900个核苷酸、910个核苷酸、920个核苷酸、930个核苷酸、940个核苷酸、950个核苷酸、960个核苷酸、970个核苷酸、980个核苷酸、990个核苷酸、1000个核苷酸、1100个核苷酸、1200个核苷酸、1300个核苷酸、1400个核苷酸、1500个核苷酸、1600个核苷酸、1700个核苷酸、1800个核苷酸、1900个核苷酸、2000个核苷酸、2100个核苷酸、2200个核苷酸、2300个核苷酸、2400个核苷酸、2500个核苷酸、2600个核苷酸、2700个核苷酸、2800个核苷酸、2900个核苷酸、3000个核苷酸、3250个核苷酸、3500个核苷酸、3750个核苷酸、4000个核苷酸、4250个核苷酸、4500个核苷酸、4750个核苷酸、5000个核苷酸、5500个核苷酸、6000个核苷酸、6500个核苷酸、7000个核苷酸、7500个核苷酸、8000个核苷酸、8500个核苷酸、9000个核苷酸、9500个核苷酸、10000个核苷酸，或这些值中任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，有效载荷基因的长度是至少以下，或者是至多以下：1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸、15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、110个核苷酸、120个核苷酸、128个核苷酸、130个核苷酸、140个核苷酸、150个核苷酸、160个核苷酸、170个核苷酸、180个核苷酸、190个核苷酸、200个核苷酸、210个核苷酸、220个核苷酸、230个核苷酸、240个核苷酸、250个核苷酸、260个核苷酸、270个核苷酸、280个核苷酸、290个核苷酸、300个核苷酸、310个核苷酸、320个核苷酸、330个核苷酸、340个核苷酸、350个核苷酸、360个核苷酸、370个核苷酸、380个核苷酸、390个核苷酸、400个核苷酸、410个核苷酸、420个核苷酸、430个核苷酸、440个核苷酸、450个核苷酸、460个核苷酸、470个核苷酸、480个核苷酸、490个核苷酸、500个核苷酸、510个核苷酸、520个核苷酸、530个核苷酸、540个核苷酸、550个核苷酸、560个核苷酸、570个核苷酸、580个核苷酸、590个核苷酸、600个核苷酸、610个核苷酸、620个核苷酸、630个核苷酸、640个核苷酸、650个核苷酸、660个核苷酸、670个核苷酸、680个核苷酸、690个核苷酸、700个核苷酸、710个核苷酸、720个核苷酸、730个核苷酸、740个核苷酸、750个核苷酸、760个核苷酸、770个核苷酸、780个核苷酸、790个核苷酸、800个核苷酸、810个核苷酸、820个核苷酸、830个核苷酸、840个核苷酸、850个核苷酸、860个核苷酸、870个核苷酸、880个核苷酸、890个核苷酸、900个核苷酸、910个核苷酸、920个核苷酸、930个核苷酸、940个核苷酸、950个核苷酸、960个核苷酸、970个核苷酸、980个核苷酸、990个核苷酸、1000个核苷酸、1100个核苷酸、1200个核苷酸、1300个核苷酸、1400个核苷酸、1500个核苷酸、1600个核苷酸、1700个核苷酸、1800个核苷酸、1900个核苷酸、2000个核苷酸、2100个核苷酸、2200个核苷酸、2300个核苷酸、2400个核苷酸、2500个核苷酸、2600个核苷酸、2700个核苷酸、2800个核苷酸、2900个核苷酸、3000个核苷酸、3250个核苷酸、3500个核苷酸、3750个核苷酸、4000个核苷酸、4250个核苷酸、4500个核苷酸、4750个核苷酸、5000个核苷酸、5500个核苷酸、6000个核苷酸、6500个核苷酸、7000个核苷酸、7500个核苷酸、8000个核苷酸、8500个核苷酸、9000个核苷酸、9500个核苷酸或10000个核苷酸。
有效载荷可以是细胞死亡的诱导物。有效载荷可以通过非内源细胞死亡途径(例如，细菌孔隙形成毒素)诱导细胞死亡。在一些实施方案中，有效载荷可以是促存活蛋白。在一些实施方案中，有效载荷是免疫系统的调节因子。有效载荷蛋白可以包括CRE重组酶、GCaMP、细胞疗法组分、敲低基因疗法组分、细胞表面暴露表位或其任何组合。
嵌合抗原受体和工程化T细胞受体
有效载荷蛋白可以包括嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，CAR包括T细胞受体(TCR)抗原结合结构域。术语“嵌合抗原受体”或可选地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两个多肽，在免疫效应细胞中时，为细胞提供对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性以及细胞内信号产生。术语“CAR”和“CAR分子”可互换使用。在一些实施方案中，CAR至少包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(在本文也称为“细胞内信号传导结构域”)，该胞质信号传导结构域包括来源于如下文定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽在同一多肽链中(例如，包括嵌合融合蛋白)。在一些方面，该组多肽是彼此连续的。在一些实施方案中，该组多肽彼此不连续，例如，在不同的多肽链中。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，在二聚化分子存在后，该开关可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，刺激分子是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。在一些实施方案中，胞质信号传导结构域还包括一个或更多个功能信号传导结构域，该功能信号传导结构域来源于如下定义的至少一种共刺激分子。在一些实施方案中，共刺激分子选自本文描述的共刺激分子，例如，4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一些实施方案中，CAR包括嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包括来源于刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包括来源于共刺激分子的功能信号传导结构域和来源于刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包括来源于一种或更多种共刺激分子的两个功能信号传导结构域和来源于刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包括来源于一种或更多种共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和来源于刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR在CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)处包含任选的前导序列。在一些实施方案中，CAR还在细胞外抗原结合结构域的N-末端处包括前导序列，其中在细胞加工和CAR定位于细胞膜期间，前导序列任选地被从抗原结合结构域(例如，scFv)裂解。
CAR和/或TCR可以包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域中的一个或更多个。CAR或TCR还可以包括先导肽。TCR还可以包括恒定区域和/或CDR4。术语“信号传导结构域”是指通过以下发挥作用的蛋白的功能部分：通过在细胞内传递信息，以通过产生第二信使或通过响应这种信使作为效应物起作用，经由确定的信号传导通路来调节细胞活性。如本文使用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生促进含CAR细胞(例如，CART细胞)的免疫效应物功能的信号。例如，CART细胞中免疫效应物功能的实例包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在一种实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包括来源于负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些细胞内信号传导结构域。在一种实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或不依赖抗原的刺激的分子的那些细胞内信号传导结构域。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。初级细胞内信号传导结构域可以包括信号传导基序，该信号传导基序被称为免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif)或ITAM。包含初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于来源于CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcR β(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。
细胞内信号传导结构域可以包括初级信号传导结构域、共刺激结构域或初级信号传导结构域和共刺激结构域两者。CAR的胞质结构域或区域包括细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责激活已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特定功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白中转导效应物功能信号并指导细胞进行特定功能的部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，没有必要使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度而言，只要它能转导效应物功能信号，这样的截短部分就可以被用来代替完整的链。因此，术语细胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
术语“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答(例如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子是有助于有效免疫应答的除了抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于，MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激分子的另外的实例包括CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可以用以下蛋白家族表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活NK细胞受体。细胞内信号传导结构域可以包括其来源分子的整个细胞内部分，或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段或衍生物。
用于在本文公开的CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后起始信号转导)、以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。已知，通过单独的TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且/或还可能需要第二或共刺激信号。因此，T细胞激活可以被认为是由两类不同的胞质信号传导序列介导的：通过TCR起始抗原依赖性初级活化的那些胞质信号传导序列(初级细胞内信号传导结构域)，以及以不依赖抗原的方式作用以提供次级或共刺激信号的那些胞质信号传导序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。初级信号传导结构域以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可能包含被称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。初级信号传导结构域可以包括选自由以下组成的组的一种或更多种蛋白的功能信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、共同FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12或其功能变体。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域被设计为包含两个或更多个，例如，2个、3个、4个、5个或更多个共刺激信号传导结构域。在一种实施方案中，两个或更多个，例如2个、3个、4个、5个或更多个共刺激信号传导结构域被接头分子，例如本文描述的接头分子分开。在一种实施方案中，细胞内信号传导结构域包括两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。共刺激结构域可以包括选自由以下组成的组的一种或更多种蛋白的功能结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD28-OX40、CD28-4-1BB、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D或其功能变体。
CAR的包括抗体或其抗体片段的部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，所述连续多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(在Harlow等人，1999,Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY中；在Harlow等人，1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.中；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人，1988,Science 242:423-426)。本文公开的CAR组合物的抗原结合结构域可以包括抗体片段。在一些实施方案中，CAR包括包含scFv的抗体片段。
在一些实施方案中，CAR包括靶特异性结合元件，也称为抗原结合结构域。部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域来识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标志物的配体。因此，可以充当CAR中抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌细胞相关的那些标志物。
在一些实施方案中，CAR介导的T细胞应答可以通过工程化将期望抗原特异性结合到CAR中的抗原结合结构域的方式来被引导至感兴趣的抗原。在一些实施方案中，CAR的包括抗原结合结构域的部分包括靶向肿瘤抗原(例如本文描述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人类抗体、人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体，诸如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和来源于骆驼科动物(camelid)的纳米抗体的可变结构域(VHH)，以及本领域已知的起抗原结合结构域作用的替代支架诸如重组纤连蛋白结构域、T细胞受体(TCR)或其片段，例如单链TCR等。在一些情况下，抗原结合结构域来源于最终将使用CAR的同一物种是有益的。例如，对于在人类中的使用，CAR的抗原结合结构域包括抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人类或人源化残基可能是有益的。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括人源化抗体或抗体片段。非人类抗体可以是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与在人类中天然产生的抗体或其片段的相似性。在一些实施方案中，抗原结合结构域是人源化的。
抗原结合结构域可以包括抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab′)2、单结构域抗体(SDAB)、VH结构域或VL结构域、骆驼VHH结构域、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、由抗体片段形成的双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、抗运载蛋白、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体或其任何组合。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如，单链TCR(scTCR)。制备这样的TCR的方法是本领域已知的。参见，例如，Willemsen R A等人，GeneTherapy 7:1369-1377(2000)；Zhang T等人，Cancer Gene Ther 11:487-496(2004)；Aggen等人，Gene Ther.19(4):365-74(2012)(参考文献以其整体并入本文)。例如，scTCR可以被工程化为包含由接头(例如，柔性肽)连接的来自T细胞克隆的Vα和Vβ基因。这种方法对本身在细胞内的癌症相关靶是非常有用的，然而，这样的抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞表面上。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是多特异性抗体分子。在一些实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一种实施方案中，第一表位和第二表位在同一抗原，例如，同一蛋白(或多聚体蛋白的亚基)上。在一种实施方案中，第一表位和第二表位重叠。在一种实施方案中，第一表位和第二表位不重叠。在一种实施方案中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如，不同的蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)上。在一种实施方案中，双特异性抗体分子包括对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一种实施方案中，双特异性抗体分子包括对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一种实施方案中，双特异性抗体分子包括对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一种实施方案中，双特异性抗体分子包括对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段和对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
抗原结合结构域可以被配置为与肿瘤抗原结合。术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指完整地或作为片段(例如，MHC/肽)在癌细胞的表面表达的分子(通常是蛋白、糖类或脂质)，并且可用于将药剂优先靶向癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如，谱系标志物，例如，B细胞上的CD19。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施方案中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与在正常细胞上表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原将完整地或作为片段(例如，MHC/肽)仅在癌细胞的细胞表面上表达，而不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施方案中，CAR包括包含与MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，来源于内源蛋白的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表免疫疗法的一类独特的细胞表面靶。已经描述了在人类白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情况下靶向来源于病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人，J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人，Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人，J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人，Gene Ther2001 8(21):1601-1608；Dao等人，Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev等人，Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，TCR样抗体可以从筛选文库，诸如，人类scFv噬菌体展示文库中鉴定。
肿瘤抗原可以是实体瘤抗原。肿瘤抗原可以选自由以下组成的组：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞黏附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关黏蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚基β型9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰基Lewis黏附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关物(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类第5组成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ可变阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人类端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；成对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(印迹位点的BORIS或Brother调控因子)、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在性1(RU1)；肾遍在性2(RU2)；豆荚蛋白；人类乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人类乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的黏蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
肿瘤抗原可以选自包括以下的组：CD150、5T4、ActRIIA、B7、BMCA、CA-125、CCNA1、CD123、CD126、CD138、CD14、CD148、CD15、CD19、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD261、CD262、CD30、CD33、CD362、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD46、CD5、CD52、CD53、CD54、CD56、CD66a-d、CD74、CD8、CD80、CD92、CE7、CS-1、CSPG4、ED-B纤连蛋白、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、GD2、GD3、HER1-HER2组合、HER2-HER3组合、HERV-K、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、HLA-DR、HM1.24、HMW-MAA、Her2、Her2/neu、IGF-1R、IL-11Rα、IL-13R-α2、IL-2、IL-22R-α、IL-6、IL-6R、Ia、Ii、L1-CAM、L1细胞黏附分子，Lewis Y、L1-CAM、MAGE A3、MAGE-A1、MART-1、MUC1、NKG2C配体、NKG2D配体、NY-ESO-1、OEPHa2、PIGF、PSCA、PSMA、ROR1、T101、TAC、TAG72、TIM-3、TRAIL-R1、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、VEGF、VEGFR2、WT-1、G蛋白偶联受体、甲胎蛋白(AFP)、血管生成因子、外源同源结合分子(ExoCBM)、癌基因产物、抗叶酸受体、c-Met、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白(D1)、人肝配蛋白B2、上皮肿瘤抗原、雌激素受体、胎儿乙酰胆碱e受体、叶酸结合蛋白、gp100、乙肝表面抗原、κ链、κ轻链、kdr、λ链、生存蛋白、黑素瘤相关抗原、间皮素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、黏蛋白16(MUC16)、突变p53、突变ras、坏死抗原、癌胎抗原、ROR2、孕酮受体、前列腺特异性抗原、tEGFR、生腱蛋白、β2-微球蛋白、Fc受体样5(FcRL5)或HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
抗原结合结构域可以通过铰链区连接至跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人类蛋白的铰链)被附接至CAR的细胞外区域(例如，CAR的抗原结合结构域)。例如，在一种实施方案中，铰链可以是人类Ig(免疫球蛋白)铰链(例如，IgG4铰链、IgD铰链)、GS接头(例如，本文描述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。
关于跨膜结构域，在多种实施方案中，CAR可以被设计为包含附接至CAR细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包含一个或更多个与跨膜区域相邻的另外的氨基酸，例如，一个或更多个与跨膜来源于其的蛋白的细胞外区域相关的氨基酸(例如，细胞外区域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个多达至15个氨基酸)和/或一个或更多个与跨膜蛋白来源于其的蛋白的细胞内区域相关的另外的氨基酸(例如，细胞内区域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个多达至15个氨基酸)。在一些实施方案中，跨膜结构域是与CAR的其他结构域之一缔合的结构域，例如，在一种实施方案中，跨膜结构域可以来自与信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域来源于的蛋白相同的蛋白。在一些实施方案中，跨膜结构域不来源于与CAR的任何其他结构域来源于的相同蛋白。在一些情况下，跨膜结构域可以被选择或通过氨基酸取代修饰，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以使与受体复合物其他成员的相互作用最小化。在一些实施方案中，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一CAR同源二聚化。在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以使与存在于同一个表达CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜结构域可以包括选自由以下组成的组的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C或其功能变体。跨膜结构域可以来源于天然来源或来源于重组来源。在来源是天然来源的情况下，结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一些实施方案中，每当CAR与靶结合时，跨膜结构域能够向一个或更多个细胞内结构域进行信号传导。
T细胞活性传感器及振荡器回路
虽然目前的几代CAR-T细胞疗法已经在B细胞恶性肿瘤中显示出高应答率，但它们在实体瘤中的效力却充其量平平。与其不良性能相关的主要因素之一是T细胞“耗尽”，其中CAR-T细胞的效应物功能降低。许多研究小组已经集中在研究这一现象，为实体瘤疗法产生新的疗法线索。在本文提供的方法和组合物中，T细胞耗尽可以通过CAR-T细胞的瞬时失活来逆转。在一些实施方案中，提供了利用HSP启动子通过周期性静息T细胞来规避T细胞耗尽的细胞自主遗传控制器。本文公开了基于HSP启动子(如本文描述)作为T细胞活性传感器的活性调控反馈回路，其在高CAR活性事件之后自主地下调CAR的表达以使T细胞静息。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，提供了防止T细胞耗尽的活性驱动振荡器。在一些实施方案中，公开的活性驱动振荡器的中心组件是本文描述的新类别的基于HSP的转录传感器。在一些实施方案中，T细胞使用基于HSP的启动子来感测其活性，并且在一定时间段的刺激之后下调CAR表达，允许T细胞静息。在一些实施方案中，静息的细胞将以振荡模式再次表达CAR。在一些实施方案中，治疗性T细胞将异步振荡，允许一些T细胞静息，而剩余细胞与肿瘤接合，从而导致持续的疗法，同时避免任何给定T细胞的过度活性。为了调控CAR表达，基于HSP的传感器的活性可以与靶向并降解工程化CAR的蛋白(诸如抗GFP纳米抗体和LOCKR)的表达相关。在一些实施方案中，为了增加静息周期的长度，在回路中包括前馈控制元件。在一些实施方案中，为了减少静息时间段，使用N末端规则来控制CAR半衰期。图14A-图14C描绘了与调控CAR活性以防止T细胞耗尽的基于HSP的反馈回路相关的非限制性示例性数据和实施方案。
“耗尽”或“无响应”是指细胞对响应于正常输入信号不进行其通常功能或活性的细胞状态，并且包括免疫细胞对刺激诸如经由激活受体或细胞因子的刺激的不应性。这样的功能或活性包括但不限于增殖或细胞分裂、进入细胞周期、细胞因子产生、细胞毒性、运输、吞噬活性或其任何组合。正常输入信号可以包括但不限于经由受体(例如，T细胞受体、B细胞受体、共刺激受体等)的刺激。
耗尽的免疫细胞相对于相同类型的对应对照免疫细胞在细胞毒活性、细胞因子产生、增殖、运输、吞噬活性或其任何组合方面可以具有至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的降低。在一种实施方案中，耗尽的细胞是CD8+T细胞(例如，抗原特异性的效应CD8+T细胞)。CD8细胞通常响应于T细胞受体和/或共刺激受体刺激，以及响应于细胞因子诸如IL-2增殖(例如，克隆性扩增)。因此，耗尽的CD8 T细胞是响应于正常输入信号不增殖和/或不产生细胞因子的细胞。熟知的是，效应物功能的耗尽可以根据几个阶段来描述，这最终导致终末或完全耗尽，并最终导致清除(deletion)(Yi等人(2010)(2010)Immunol.129:474-481；Wherry和Ahmed(2004)J.Virol.78:5535-5545)。在第一阶段，功能性T细胞进入“部分耗尽I”阶段，其特征是一亚组效应物功能丧失，包括IL-2产生的丧失、降低的TNFa产生以及降低的增殖能力和/或离体裂解能力。在第二阶段，在抗原刺激后IL-2和TNFa两者的产生终止并且IFNy的产生降低时，部分耗尽的T细胞进入“部分耗尽II”阶段。在CD8+T细胞在抗原刺激后丧失所有效应物功能，包括IL-2、TNFa和IFNy的产生的缺乏，以及丧失离体裂解能力和增殖潜能时，“完全耗尽”或“终末耗尽”发生。完全耗尽的CD8+T细胞是响应于正常输入信号不增殖、不裂解靶细胞(细胞毒性)和/或不产生适当的细胞因子，诸如IL-2、TNFa或IFNy的细胞。当抗原负载高和/或CD4帮助低时，这样的效应物功能的缺乏可能发生。这种层级功能损失还与共抑制剂免疫受体诸如PD-1、′HΜ-3、LAG-3等的表达相关(Day等人(2006)Nature443:350-4；Trauttnann等人(2006)Nat.Med 12:1198-202；以及Urbani等人(2006)J.Virol.80:1398-1403)。其他分子标志物区分免疫细胞耗尽的层级阶段，诸如高脱中胚蛋白(EOMES)和低TBET表达为终末期耗尽T细胞的标志物(Paley等人(2012)Science 338:1220-1225)。耗尽的T细胞的另外的标志物，诸如Bcl-b的降低和BLIMP-1(Pdrml)产生的增加。T细胞耗尽可以包括选自由以下组成的组的一种或更多种T细胞耗尽生物标志物的表达：检查点抑制剂、PD-1(Pdcdl)、TΠΜ-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpdl)、CD 160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdml)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxpl、维甲酸受体α(Rara)或其任何组合。
在一些实施方案中，提供了核酸组合物。核酸组合物可以包含：可操作地连接至包含振荡器基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述振荡器基因的转录，以产生振荡器转录物，其中所述振荡器转录物能够被翻译和/或加工以产生振荡器；和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第二启动子能够诱导有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物，其中有效载荷转录物能够被翻译以产生有效载荷蛋白，并且其中所述振荡器能够调节有效载荷转录物和/或有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性。
有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性可以与振荡器的浓度、定位、稳定性和/或活性呈负相关。振荡器的浓度、定位、稳定性和/或活性可以与有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性呈负相关。在一些实施方案中，振荡器基因编码siRNA、shRNA、反义RNA寡核苷酸、反义miRNA、反式剪接RNA、引导RNA、单引导RNA、crRNA、tracrRNA、反式剪接RNA、pre-mRNA、mRNA或其任何组合。
振荡器可以包括蛋白酶。在一些实施方案中，有效载荷蛋白包括降解决定子和蛋白酶能够切割以暴露所述降解决定子的切割位点，并且其中有效载荷蛋白的降解决定子被暴露将有效载荷蛋白改变为有效载荷蛋白不稳定状态。蛋白酶可以包括烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、烟草脉斑病毒(TVMV)蛋白酶、丙型肝炎病毒蛋白酶(HCVP)、其衍生物或其任何组合。
振荡器可以被配置为结合有效载荷蛋白并降低有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性。振荡器和/或有效载荷蛋白可以被配置为使振荡器与有效载荷蛋白结合。振荡器可以包括可以降低结合配偶体的浓度、定位、稳定性和/或活性的一个或更多个元件(例如，降解决定子)。例如，振荡器可以包括融合至AID降解决定子的抗GFP纳米抗体，并且有效载荷蛋白可以包括GFP。
有效载荷蛋白可以包括笼形多肽。笼形多肽可以包括：(a)螺旋束，包括2个与7个之间的α-螺旋，其中所述螺旋束包括：(i)结构区；和(ii)闩锁区，其中所述闩锁区包括位于所述闩锁区内的降解决定子，其中所述结构区与所述闩锁区相互作用以防止所述降解决定子的活性；以及(b)连接每个α螺旋的氨基酸接头。振荡器可以包括能够与笼形多肽结构区结合的钥匙形多肽，从而置换闩锁区并激活降解决定子。
在一些实施方案中，本文提供的遗传回路(例如，振荡器遗传回路)包括降解决定子LOCKR。本公开内容提供了非天然存在的笼形多肽，包括：(a)螺旋束，包括2个与7个之间的α-螺旋，其中所述螺旋束包括：(i)结构区；和(ii)闩锁区，其中所述闩锁区包括降解决定子，其中所述结构区与所述闩锁区相互作用以防止所述降解决定子的活性；以及(b)连接每个α螺旋的氨基酸接头。本实施方案的非天然存在的笼形多肽(本文也可以称为“锁(lock)”)可用作例如本文详细公开的振荡器遗传回路的组件。在以下的实施例中更详细地描述了笼形多肽和钥匙形多肽的组合使用，并且将其称为LOCKR开关。LOCKR代表闩锁正交笼形-钥匙形蛋白(Latching Orthogonal Cage-Key pRotiens)；每个LOCKR设计由笼形多肽和钥匙形多肽组成，它们是两条独立的多肽链。如本文使用的，“降解决定子”应被赋予其普通含义，并且还应指能够靶向笼形多肽和为了降解而融合的任何功能性多肽结构域的单个氨基酸或肽。例如，降解决定子可以通过靶向蛋白酶体(包括泛素依赖性降解决定子(泛素蛋白酶促附接至蛋白上，这标志蛋白用于降解/靶向蛋白酶体)和泛素非依赖性降解决定子(将蛋白靶向蛋白酶体而没有泛素的降解决定子)、靶向溶酶体或招募蛋白酶来靶向多肽进行降解。在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，当钥匙形多肽被表达并且通过与结构区相互作用激活笼形多肽时，降解决定子靶向笼形多肽和融合至笼形多肽的任何功能性多肽结构域和/或另外的生物活性结构域进行降解。以这种方式，融合至具有降解决定子的笼形多肽的感兴趣的功能性多肽结构域可以经由钥匙形多肽的表达以可滴定的方式有条件地降解。这在本文有时被称为降解决定子LOCKR。包括笼形多肽和钥匙形多肽的降解决定子LOCKR及其使用方法，已在先前公开，例如，在PCT申请公布第WO2020/146260号中公开，其内容在此通过引用以其整体明确并入。
振荡器可以包括沉默子效应物。沉默子效应物可以包括微RNA(miRNA)、前体微RNA(pre-miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、其前体、其衍生物或其组合。在一些实施方案中，有效载荷基因包含3’UTR和/或5’UTR，并且其中所述有效载荷基因的3’UTR和/或5’UTR包含一个或更多个沉默子效应物结合序列。沉默子效应物可以能够结合一个或更多个沉默子效应物结合序列，从而降低所述有效载荷转录物的稳定性和/或降低所述有效载荷转录物的翻译。一个或更多个沉默子效应物结合序列可以包括miRNA结合位点。有效载荷基因可以包括约1个沉默子效应物结合序列至约10个沉默子效应物结合序列。一个或更多个沉默子效应物结合序列的长度可以是约8个核苷酸至约22个核苷酸。沉默子效应物可以包括与一个或更多个沉默子效应物结合序列的至少5个连续核苷酸互补的互补区。沉默子效应物可以包括与一个或更多个沉默子效应物结合序列至少约50％的互补性。
在一些实施方案中，在存在连续热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下，稳态有效载荷蛋白水平在调节表达范围的下限调节阈值与上限调节阈值之间振荡。调节表达范围的下限未调节阈值与上限未调节阈值之间的差异可以大于约一个数量级。调节表达范围的下限调节阈值与上限调节阈值之间的差异可以小于约一个数量级。
在一些实施方案中，调节表达范围的下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过将一个或更多个非典型氨基酸取代引入沉默子效应物结合序列、切割位点和/或降解决定子中来增加。在一些实施方案中，调节表达范围的下限调节阈值和/或上限调节阈值能够通过将一个或更多个典型氨基酸取代引入沉默子效应物结合序列、切割位点和/或降解决定子中来降低。
在一些实施方案中，有效载荷包括CAR和/或TCR，其中响应于CAR和/或TCR连续接合持续至少约24小时，热启动免疫细胞群体的至少约5％具有在约下限调节阈值处的稳态有效载荷蛋白水平，并且热启动免疫细胞群体的至少约5％(例如，5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)具有在约上限调节阈值处的稳态有效载荷蛋白水平。
在一些实施方案中，有效载荷包括CAR和/或TCR，并且其中响应于CAR和/或TCR连续接合持续至少约96小时，热启动免疫细胞群体的小于约20％(例如，0％、0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)表现出耗尽(例如，T细胞耗尽)。在一些实施方案中，有效载荷包括CAR和/或TCR，其中响应于CAR和/或TCR连续接合持续96小时，与不包含振荡器的热启动免疫细胞群体相比，热启动免疫细胞群体中减少至少约1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的细胞表现出耗尽(例如，T细胞耗尽)。
在一些实施方案中，提供了核酸组合物。核酸组合物可以包含：可操作地连接至包含活性调控因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述活性调控因子基因的转录，以产生活性调控因子转录物，其中所述活性调控因子转录物能够被翻译和/或加工以产生活性调控因子；并且其中所述活性调控因子能够降低T细胞活性。活性调控因子可以包括参与TCR/CAR信号转导的选自包括以下的组的泛素连接酶：c-CBL、CBL-B、ITCH、R F125、R F128、WWP2或其任何组合。活性调控因子可以包括选自包括以下的组的负性调控酶：SHP1、SHP2、SHTP1、SHTP2、CD45、CSK、CD148、PTPN22、DGKα、DGKζ、DRAK2、HPK1、HPK1、STS1、STS2、SLAT或其任何组合。活性调控因子可以是选自包括以下的组的负性调控支架/衔接蛋白：PAG、LIME、NTAL、LAX31、SIT、GAB2、GRAP、ALX、SLAP、SLAP2、DOK1、DOK2或其任何组合。活性调控因子可以是选自包括以下的组的激活TCR信号传导组分的显性负性形式：ZAP70、LCK、FYN、NCK、VAV1、SLP76、ITK、ADAP、GADS、PLCγ1、LAT、p85、SOS、GRB2、NFAT、p50、p65、API、RAPl、CRKII、C3G、WAVE2、ARP2/3、ABL、ADAP、RIAM、SKAP55或其任何组合。活性调控因子可以包括选自以下的负性共调控受体的胞质尾部：CD5、PD1、CTLA4、BTLA、LAG3、B7-H1、B7-1、CD160、TFM3、2B4、TIGIT或其任何组合。活性调控因子可以以来源于LAT、PAG、LCK、FYN、LAX、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8a、PD1、SRC、LYN或其任何组合的靶向序列靶向质膜。在一些实施方案中，活性调控因子降低或消除选自以下的途径和/或功能：Ras信号传导、PKC信号传导、钙依赖性信号传导、NF-κB信号传导、NFAT信号传导、细胞因子分泌、T细胞存活、T细胞增殖、CTL活性、脱粒、肿瘤细胞杀伤、分化或其任何组合。活性调控因子可以包括沉默子效应物。沉默子效应物可以包括微RNA(miRNA)、前体微RNA(pre-miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、其前体、其衍生物或其组合。在一些实施方案中，沉默子效应物可以能够降低与T细胞活性相关的蛋白的表达。在一些实施方案中，活性调控因子是合成蛋白。例如，活性调控因子可以是蛋白酶(例如，切割CAR)或纳米抗体(例如，结合并降解CAR)，从而降低CAR/TCR活性。在一些实施方案中，活性调控因子包括本文描述的合成蛋白(例如，蛋白酶、纳米抗体、笼形多肽)，所述合成蛋白被配置为结合并降解促进T细胞活性的TCR/CAR以外的蛋白。
工程化免疫细胞
本文公开的包括热启动免疫细胞。在一些实施方案中，热启动免疫细胞包含本文公开的核酸组合物。免疫细胞可以是哺乳动物细胞(例如，人类细胞)。免疫细胞可以来源于血液、脐带血、骨髓或iPSC。免疫细胞可以是T细胞。T细胞可以是原代T细胞。T细胞可以是自体T细胞或同种异体T细胞。单次热刺激可以足以起始免疫细胞激活驱动的有效载荷表达的正反馈环。
本文公开的包括热启动免疫细胞的群体。在一些实施方案中，热启动免疫细胞的群体包括：多于一个本文公开的热启动免疫细胞。本文公开的热启动的免疫细胞可以通过T细胞活性(例如，免疫细胞刺激)和/或热刺激来启动(例如，诱导来自诱导型启动子的表达)。
本文公开的包括产生热启动免疫细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括：将本文公开的核酸组合物或本文公开的组合物引入免疫细胞，从而产生热启动免疫细胞。引入步骤可以包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、电核转运、化学转导、电转导、脂质体酰胺介导的转染、Effectene介导的转染、脂质纳米颗粒(LNP)介导的转染或其任何组合。
在本文描述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺乏功能性T细胞受体(TCR)和/或人类白细胞抗原(HLA)(例如，HLA类I和/或HLA类II)表达的同种异体T细胞。缺乏功能性TCR的T细胞可以例如被工程化使其在其表面上不表达任何功能性TCR、被工程化使其不表达构成功能性TCR的一个或更多个亚基、或者被工程化使其在其表面上产生非常少的功能性TCR。可选地，T细胞可以表达大体上受损的TCR，例如，通过表达TCR的一个或更多个亚基的突变或截短形式。术语“大体上受损的TCR”意指这种TCR不会在宿主中引起不良的免疫反应。缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何合适的手段获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或更多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指内切核酸酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。
在一些实施方案中，T细胞从供体受试者获得。在一些实施方案中，供体受试者是罹患癌症或肿瘤的人类患者。在其他实施方案中，供体受试者是未罹患癌症或肿瘤的人类患者。
免疫细胞可以通过本领域已知的任何来源获得。例如，T细胞可以从造血干细胞群体体外分化，或者T细胞可以从受试者获得。T细胞可以从例如以下获得：外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜渗出物、脾组织和肿瘤。此外，T细胞可以来源于本领域中可用的一种或更多种T细胞系。T细胞也可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，诸如FICOLLTM分离和/或单采术(apheresis)，从收集自受试者的单位血液中获得。通过单采术收集的细胞可以被洗涤以去除血浆级分，并且放置在适当的缓冲液或介质中用于随后的处理。在一些实施方案中，用PBS洗涤细胞。如将理解的，可以使用洗涤步骤，诸如通过使用半自动流通式离心机(semiautomatedflowthrough centrifuge)，例如CobeTM 2991细胞处理器、Baxter CytoMateTM等。在一些实施方案中，将洗涤的细胞重悬在一种或更多种生物相容缓冲液中，或有或没有缓冲剂的其他盐溶液中。在一些实施方案中，去除单采术样品的不期望的组分。分离T细胞用于T细胞疗法的另外的方法公开于美国专利公布第2013/0287748号中，该专利公布通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞，例如通过使用通过PERCOLLTM梯度的离心，来从PBMC中分离T细胞。在一些实施方案中，T细胞的特定亚群，诸如CD4+、CD8+、CD28+、CD45RA+和CD45RO+T细胞通过本领域已知的正选择或负选择技术进一步分离。例如，通过负选择富集T细胞群体可以通过针对对负选择的细胞独特的表面标志物的抗体的组合来实现。在一些实施方案中，可以使用经由负性磁性免疫黏附或流式细胞术(使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物)的细胞分选和/或选择。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20和HLA-DR的抗体。在一些实施方案中，使用流式细胞术和细胞分选分离感兴趣的细胞群体用于使用。
在一些实施方案中，免疫细胞，例如，T细胞，在使用已知方法分离后被遗传修饰，或者免疫细胞在被遗传修饰之前在体外被激活并扩增(或在祖细胞的情况下被分化)。在另一种实施方案中，免疫细胞，例如，T细胞，用本文描述的嵌合抗原受体遗传修饰(例如，用包含编码CAR的一种或更多种核苷酸序列的病毒载体转导)，并且然后在体外被激活和/或扩增。用于激活和扩增T细胞的方法是本领域已知的，并且描述于例如美国专利第6,905,874号；第6,867,041号；和第6,797,514号；以及PCT公布第WO2012/079000号中，其内容通过引用以其整体并入本文。通常，这样的方法包括在具有适当细胞因子(诸如IL-2)的培养基中，使PBMC或分离的T细胞与通常附接至珠或其他表面的刺激剂和共刺激剂(诸如抗CD3和抗CD28抗体)接触。附接至同一珠的抗CD3和抗CD28抗体用作“替代”抗原呈递细胞(APC)。一个实例是
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系统，用于生理激活人类“I”细胞的CD3/CD2S激活因子/刺激因子系统。在其他实施方案中，使用方法诸如美国专利第6,040,177号和第5,827,642号以及PCT公布第WO 2012/129514号(其内容通过引用以其整体并入本文)中描述的那些方法，用饲养细胞(feeder cell)和适当的抗体和细胞因子激活和刺激T细胞增殖。
将多核苷酸引入免疫细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，ColdSpring Harbor Press,NY)。用于将多核苷酸引入免疫细胞的优选方法是磷酸钙转染。
用于将多核苷酸引入免疫细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合的胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有的核酸靶向递送的其他方法是可用的，诸如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米尺寸递送系统递送多核苷酸。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。设想使用脂类制剂用于将核酸引入免疫细胞(体外、离体或体内)。在一些实施方案中，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子附接至脂质体上、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在包含脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、以悬浮液包含在脂质中、包含胶束或与胶束复合或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。
本文描述的核酸可以使用许多不同方法中的任何一种引入免疫细胞，例如，商业上可用的方法，包括但不限于，电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene PulserII(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂质体转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染或生物颗粒递送系统诸如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001))。
在一些实施方案中，可以使用非病毒方法将本文描述的核酸递送到免疫细胞中。在一些实施方案中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施方案中，转座子是可以将自身插入到基因组中的某个位置的DNA片段，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的DNA片段，或者可以从较长的核酸中剪接出来并插入基因组中的另一个位置的DNA片段。例如，转座子包括由侧接转座基因的反向重复序列构成的DNA序列。使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。在一些实施方案中，本文描述的热启动免疫细胞通过使用以下的组合来产生：使用SBTS的基因插入和使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统或工程化兆核酸酶、再工程化归巢内切核酸酶)的遗传编辑。在一些实施方案中，使用非病毒递送方法允许细胞(例如，T细胞)的重编程，以及将本文描述的热启动免疫细胞直接输注到受试者中。非病毒载体的优点包括但不限于生产满足患者群体所需的足够量的容易和相对低的成本、储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。
治疗疾病或紊乱的方法
本文公开的包括治疗受试者中的疾病或紊乱的方法。在一些实施方案中，该方法包括：将包含本文公开的核酸组合物的组合物或本文公开的组合物引入一个或更多个免疫细胞，从而产生一个或更多个热启动免疫细胞；以及向受试者施用有效量的热启动免疫细胞。
本文公开的包括治疗受试者中的疾病或紊乱的方法。在一些实施方案中，该方法包括：向受试者施用有效量的本文公开的热启动免疫细胞。
受试者可以是哺乳动物。在一些实施方案中，疾病与肿瘤抗原的表达相关，其中与肿瘤抗原的表达相关的疾病选自由以下组成的组：增殖性疾病、癌前状况、癌症和与肿瘤抗原的表达相关的非癌相关指征(non-cancer related indication)。疾病或紊乱可以是癌症(例如，实体瘤)。癌症可以选自由以下组成的组：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌症、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移病灶。
癌症可以是选自以下中的一种或更多种的血液学癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴白血病(ALL)、B细胞急性淋巴白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增生性状况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症或白血病前期。
疾病或紊乱可以是自身免疫性紊乱。“自身免疫性疾病”是指由受试者的身体针对通常存在于体内的物质和组织的不适当的免疫应答而引起的疾病。换言之，免疫系统把身体的一些部分误认为病原体，并且攻击身体自己的细胞。这可能限于某些器官(例如，自身免疫性甲状腺炎)或涉及不同部位的特定组织(例如，Goodpasture病，其可能影响肺和肾两者的基底膜)。自身免疫性疾病的治疗通常采用免疫抑制，例如，减少免疫应答的药物。示例性自身免疫性疾病包括，但不限于，肾小球肾炎、Goodpasture综合征、坏死性血管炎、淋巴结炎、结节性动脉周围炎(peri-arteritis nodosa)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、溃疡性结肠炎、系统性硬化病、皮肌炎/多发性肌炎、抗磷脂抗体综合征、硬皮病、寻常性天疱疮、ANCA相关性血管炎(例如，韦氏肉芽肿病、显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis))、葡萄膜炎、干燥综合征、克罗恩病、赖特综合征、强直性脊柱炎、莱姆病、吉兰-巴雷综合征、桥本甲状腺炎和心肌病。
在一些实施方案中，该方法包括：在施用热启动免疫细胞之前、期间和/或之后，向受试者施用反式激活因子结合化合物。反式激活因子结合化合物的量可以是有效诱导或减弱足够水平的有效载荷表达以治疗受试者的量。在一些实施方案中，反式激活因子结合化合物包括四环素、多西环素或其衍生物。
施用可以包括气溶胶递送、鼻递送、阴道递送、直肠递送、含服递送、眼部递送、局部递送、表面递送、脑池内递送、腹膜内递送、口服递送、肌内注射、静脉内注射、皮下注射、结内注射、瘤内注射、腹膜内注射、皮内注射或其任何组合。热启动免疫细胞可以以治疗有效量施用。例如，热启动免疫细胞的治疗有效量可以是至少约104个细胞、至少约105个细胞、至少约106个细胞、至少约107个细胞、至少约108个细胞、至少约109个或至少约1010个。在另一种实施方案中，热启动免疫细胞的治疗有效量是约104个细胞、约105个细胞、约106个细胞、约107个细胞或约108个细胞。在一种特定实施方案中，热启动免疫细胞的治疗有效量是约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg、约1×107个细胞/kg、约2×107个细胞/kg、约3×107个细胞/kg、约4×107个细胞/kg、约5×107个细胞/kg、约6×107个细胞/kg、约7×107个细胞/kg、约8×107个细胞/kg或约9×107个细胞/kg。
本文描述的热启动免疫细胞可以包括在用于治疗的组合物中。在一些实施方案中，组合物包含热启动免疫细胞的群体。组合物可以包括药物组合物，并且还包括药学上可接受的载体。可以施用治疗有效量的包含热启动免疫细胞的药物组合物。热启动免疫细胞可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群体组合施用。离体程序是本领域熟知的。简言之，从哺乳动物(例如人类)中分离细胞并且用本文公开的核酸组合物(例如载体)或本文公开的组合物进行遗传修饰(即，在体外转导或转染)，从而产生一个或更多个热启动免疫细胞。热启动免疫细胞可以被施用至哺乳动物受体以提供治疗性益处。哺乳动物受体可以是人类，并且热启动免疫细胞相对于受体可以是自体的。可选地，热启动免疫细胞相对于受体可以是同种异体的、同基因的或异种的。
应用热能
在一些实施方案中，该方法包括：向受试者的靶部位施加足以将靶部位的局部温度增加至激活温度的热能，从而诱导靶部位处热启动免疫细胞中有效载荷的表达。激活温度可以是约37.5℃、约38.0℃、约38.5℃、约39.0℃、约39.5℃、约40.0℃、约40.5℃、约41.0℃、约41.5℃、约42.0℃、约42.5℃、约43.0℃、约43.5℃、约44.0℃、约44.5℃、约45.0℃、约45.5℃或约46.0℃，或这些值中任何两个之间的数字或范围。
向受试者的靶部位施加热能可以包括应用聚焦超声(FUS)、磁热疗、微波、红外照射、基于液体的加热和接触加热中的一种或更多种。基于液体的加热可以包括腹膜内化疗(HIPEC)。术语“应用超声”应被赋予其普通含义，并且还应指向靶发送超声范围内的声能。由压电转换器产生的声能可以通过波束形成、通过换能器形状、透镜或使用控制脉冲来聚焦。形成的声波被传输至身体，然后被身体内的结构部分反射或散射；较大的结构通常反射，并且较小的结构通常散射。反射/散射至转换器的返回声能使转换器振动，并且将返回声能转换为电信号以进行分析以便成像。输入声能的频率和压力可以根据特定成像/递送任务的需要来控制和选择。
施用与施加热能之间的时间段可以是约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟，或这些值中任何两个之间的数字或范围。
向靶部位施加热能可以包括在第二持续时间内向靶部位连续施加热能。向靶部位施加热能可以包括在第二持续时间内向靶部位施加一个或更多个热能脉冲。第二持续时间可以是约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟，或这些值中任何两个之间的数字或范围。
在一些实施方案中，一个或更多个脉冲具有大于约1％且小于约100％的占空比。一个或更多个脉冲具有以下的占空比：约0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围。
在一些实施方案中，一个或更多个脉冲各自具有以下的脉冲持续时间：约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟、约1分钟、约1秒、约1毫秒，或这些值中任何两个之间的数字或范围。
在一些实施方案中，该方法包括：监测靶区域的温度。监测可以通过磁共振成像(MRI)进行。通过磁共振成像(MRI)在空间上引导向受试者的靶部位施加热能。
靶部位
靶部位可以包括实体瘤。靶部位可以包括疾病或紊乱的部位，或者可以位于疾病或紊乱的部位附近。疾病或紊乱的一个或更多个部位的位置可以是预先确定的、可以在该方法期间确定或者两者。靶部位可以是免疫抑制环境。靶部位可以包括组织。组织可以是发炎组织和/或被感染的组织。组织可以包括肾上腺组织、阑尾组织、膀胱组织、骨、肠组织、脑组织、乳腺组织、支气管、冠状组织、耳组织、食道组织、眼组织、胆囊组织、生殖器组织、心脏组织、下丘脑组织、肾组织、大肠组织、肠组织、喉组织、肝组织、肺组织、淋巴结、口组织、鼻组织、胰腺组织、甲状旁腺组织、垂体组织、前列腺组织、直肠组织、唾液腺组织、骨骼肌组织、皮肤组织、小肠组织、脊髓、脾组织、胃组织、胸腺组织、气管组织、甲状腺组织、输尿管组织、尿道组织、软组织和结缔组织、腹膜组织、血管组织和/或脂肪组织。组织可以包括：(i)I级、II级、III级或IV级癌组织；(ii)转移癌组织；(iii)混合级癌组织；(iv)亚分级癌组织；(v)健康组织或正常组织；和/或(vi)癌组织或异常组织。在一些实施方案中，在向靶部位处施加热能之后，靶部位处的热启动免疫细胞的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或这些值中任何两个之间的数字或范围表达有效载荷蛋白。在一些实施方案中，靶部位以外的部位处的热启动免疫细胞的小于约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或这些值中任何两个之间的数字或范围表达有效载荷蛋白。
受试者的靶部位处表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度与受试者的血液、血清或血浆中表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度的比可以变化。受试者的靶部位处表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度与受试者的血液、血清或血浆中表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度的比可以是以下，或者可以是约以下：1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1、10000:1，或这些值中任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，受试者的靶部位处表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度与受试者的血液、血清或血浆中表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度的比可以是至少以下，或者是至多以下：1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1或10000:1。
受试者的靶部位处的有效载荷蛋白的浓度与受试者的血液、血清或血浆中的有效载荷蛋白的浓度的比可以变化。在一些实施方案中，受试者的靶部位处的有效载荷蛋白的浓度与受试者的血液、血清或血浆中的有效载荷蛋白的浓度的比可以是以下，或者是约以下：1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1、10000:1，或这些值中任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，受试者的靶部位处的有效载荷蛋白的浓度与受试者的血液、血清或血浆中的有效载荷蛋白的浓度的比可以是至少以下，或者是至多以下：1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1或10000:1。
靶部位可以包括靶细胞。靶细胞可以是肿瘤细胞(例如，实体瘤细胞)。在一些实施方案中，向受试者的靶部位施加热能导致至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或这些值中任何两个之间的数字或范围的靶细胞死亡。非靶细胞可以包括除了靶细胞以外的受试者的细胞。在施加热能之后，靶细胞死亡与非靶细胞死亡的比可以是至少约2:1。在一些实施方案中，在施加热能之后，靶细胞死亡与非靶细胞死亡的比可以是以下，或者是约以下：1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1、10000:1或这些值中任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，在施加热能之后，靶细胞死亡与非靶细胞死亡的比可以是至少以下，或者是至多以下：1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1或10000:1。靶细胞死亡与非靶细胞死亡的比与包括组成型表达有效载荷蛋白的免疫细胞的方法相比，可以大至少约1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，或这些值中任何两个之间的数值或范围)。
另外的剂
该方法可以包括向受试者施用一种或更多种另外的剂。在一些实施方案中，一种或更多种另外的剂增加热启动免疫细胞的效力。一种或更多种另外的剂可以包括蛋白磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫抑制分子抑制剂和/或减少TREG细胞水平或活性的剂。一种或更多种另外的剂可以包括免疫调节剂、抗转移剂、化疗剂、激素或生长因子拮抗剂、烷化剂、TLR激动剂、细胞因子拮抗剂、细胞因子拮抗剂或其任何组合。一种或更多种另外的剂可以包括对检查点抑制剂或检查点刺激剂分子，诸如PD1、PD-L1、PD-L2、CD27、CD28、CD40、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3特异性的激动或拮抗抗体。
一种或更多种另外的剂可以选自由以下组成的组：烷化剂(氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐/酯、亚硝基脲和三氮烯)；尿嘧啶氮芥(Aminouracil
Figure BDA0004000640040000981
Figure BDA0004000640040000982
Uracil nitrogen
Figure BDA0004000640040000983
Figure BDA0004000640040000984
)；苯达莫司汀
Figure BDA0004000640040000985
Figure BDA0004000640040000986
氮芥
Figure BDA0004000640040000987
环磷酰胺(
Figure BDA0004000640040000988
Figure BDA0004000640040000989
RevimmuneTM)；异环磷酰胺
Figure BDA00040006400400009810
美法仑
Figure BDA00040006400400009811
苯丁酸氮芥
Figure BDA00040006400400009812
哌泊溴烷
Figure BDA00040006400400009813
三亚乙基蜜胺
Figure BDA00040006400400009814
三亚乙基硫代磷酰胺；替莫唑胺
Figure BDA0004000640040000991
塞替派
Figure BDA0004000640040000992
白消安
Figure BDA0004000640040000993
卡莫司汀
Figure BDA0004000640040000994
洛莫司汀
Figure BDA0004000640040000995
链脲酶素
Figure BDA0004000640040000996
雌莫司汀
Figure BDA0004000640040000997
福莫司汀；irofulven；甘露舒凡；二溴甘露醇；尼莫司汀；丙卡巴肼；雷莫司汀；司莫司汀；三亚胺醌；曲奥舒凡；和达卡巴嗪
Figure BDA0004000640040000998
抗EGFR抗体(例如西妥昔单抗
Figure BDA0004000640040000999
帕尼单抗
Figure BDA00040006400400009910
和吉非替尼
Figure BDA00040006400400009911
抗Her-2抗体(例如曲妥珠单抗
Figure BDA00040006400400009912
和来自Genentech的其他抗体)；抗代谢物(包括不限于，叶酸拮抗剂(本文也称为抗叶酸)、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤
Figure BDA00040006400400009913
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00040006400400009914
Figure BDA00040006400400009915
氟尿苷
Figure BDA00040006400400009916
卡莫氟、阿糖胞苷(
Figure BDA00040006400400009917
Tarabine PFS)、6-巯基嘌呤
Figure BDA00040006400400009918
6-硫代鸟嘌呤(Thioguanine
Figure BDA00040006400400009919
)、磷酸氟达拉滨
Figure BDA00040006400400009920
喷司他丁
Figure BDA00040006400400009921
培美曲塞
Figure BDA00040006400400009922
雷替曲塞
Figure BDA00040006400400009923
克拉屈滨
Figure BDA00040006400400009924
氯法拉滨
Figure BDA00040006400400009925
巯基嘌呤
Figure BDA00040006400400009926
卡培他滨
Figure BDA00040006400400009927
奈拉滨
Figure BDA00040006400400009928
阿扎胞苷
Figure BDA00040006400400009929
地西他滨
Figure BDA00040006400400009930
依诺他滨
Figure BDA00040006400400009931
沙帕他滨、替加氟尿嘧啶、噻唑呋林、硫鸟嘌呤、曲磷胺和吉西他滨
Figure BDA00040006400400009932
长春花生物碱类：长春碱
Figure BDA00040006400400009933
长春新碱
Figure BDA00040006400400009934
长春地辛
Figure BDA00040006400400009935
长春瑞滨
Figure BDA00040006400400009936
长春氟宁
Figure BDA00040006400400009937
基于铂的剂：卡铂
Figure BDA00040006400400009938
顺铂
Figure BDA00040006400400009939
奥沙利铂
Figure BDA00040006400400009940
奈达铂、赛特铂和三铂；蒽环类：柔红霉素
Figure BDA00040006400400009941
多柔比星
Figure BDA00040006400400009942
表柔比星
Figure BDA00040006400400009943
伊达比星
Figure BDA00040006400400009944
米托蒽醌
Figure BDA00040006400400009945
戊柔比星
Figure BDA00040006400400009946
阿柔比星、氨柔比星、脂质体多柔比星、脂质体柔红霉素、吡柔比星、pixantrone和佐柔比星；拓扑异构酶抑制剂：托泊替康
Figure BDA00040006400400009947
伊立替康
Figure BDA00040006400400009948
依托泊苷
Figure BDA00040006400400009949
替尼泊苷
Figure BDA00040006400400009950
片螺素D、SN-38、羟喜树碱(例如，IT-101)、倍罗替康和鲁比替康；紫杉烷类：紫杉醇
Figure BDA00040006400400009951
多西他赛
Figure BDA00040006400400009952
larotaxel、卡巴他赛、沃塔紫杉醇和替司他赛；抗生素类：放线菌素
Figure BDA00040006400400009953
博莱霉素
Figure BDA00040006400400009954
羟基脲
Figure BDA00040006400400009955
Figure BDA00040006400400009956
丝裂霉素
Figure BDA00040006400400009957
免疫调节剂：来那度胺
Figure BDA00040006400400009958
沙利度胺
Figure BDA00040006400400009959
免疫细胞抗体：阿仑单抗
Figure BDA00040006400400009960
吉妥单抗
Figure BDA0004000640040001001
利妥昔单抗
Figure BDA0004000640040001002
托西莫单抗
Figure BDA0004000640040001003
干扰素类(例如，IFNα
Figure BDA0004000640040001004
或IFNγ
Figure BDA0004000640040001005
白细胞介素类：IL-1、IL-2
Figure BDA0004000640040001006
IL-24、IL-6
Figure BDA0004000640040001007
IL-12；HSP90抑制剂(例如，格尔德霉素或其任何衍生物)。在某些实施方案中，HSP90抑制剂选自格尔德霉素、17-烷基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(“17-AAG”)或17-(2-二甲基氨基乙基)氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(“17-DMAG”)；抗雄激素，其包括但不限于尼鲁米特
Figure BDA0004000640040001008
和比卡鲁胺
Figure BDA0004000640040001009
抗雌激素，其包括但不限于他莫昔芬
Figure BDA00040006400400010010
托瑞米芬
Figure BDA00040006400400010011
来曲唑
Figure BDA00040006400400010012
Testolactone
Figure BDA00040006400400010013
阿那曲唑
Figure BDA00040006400400010014
比卡鲁胺
Figure BDA00040006400400010015
依西美坦
Figure BDA00040006400400010016
氟他胺
Figure BDA00040006400400010017
氟维司群
Figure BDA00040006400400010018
雷洛昔芬
Figure BDA00040006400400010019
和盐酸雷洛昔芬；抗高钙血症剂，其包括但不限于水合硝酸镓(III)
Figure BDA00040006400400010020
和帕米膦酸二钠
Figure BDA00040006400400010021
凋亡诱导物，其包括不限于乙醇、2-[[3-(2,3-二氯苯氧基)丙基]氨基]-(9Cl)、藤黄酸、伊利司莫、恩贝酸和三氧化二砷
Figure BDA00040006400400010022
极光激酶抑制剂，其包括但不限于双核素2；布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于土曲霉酸；钙调磷酸酶抑制剂，其包括但不限于氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和酪磷蛋白8；CaM激酶II抑制剂，其包括但不限于5-异喹啉磺酸、4-[{2S)-2-[(5-异喹啉基磺酰基)甲基氨基]-3-氧代-3-{4-苯基-1-哌嗪基)丙基]苯基酯]和苯磺酰胺；CD45酪氨酸磷酸酶抑制剂，其包括但不限于膦酸；CDC25磷酸酶抑制剂，其包括但不限于1,4-萘二酮、2,3-双-((2-羟基乙基)硫代)-(9Cl)；CHK激酶抑制剂，其包括但不限于debromohymenialdisine；环氧合酶抑制剂，其包括但不限于1H-吲哚-3-乙酰胺、1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-N-(2-苯基乙基)-(9Cl)、5-烷基取代的2-芳基氨基苯乙酸及其衍生物(例如，塞来昔布
Figure BDA00040006400400010023
罗非昔布
Figure BDA00040006400400010024
依托考昔
Figure BDA00040006400400010025
罗美昔布
Figure BDA00040006400400010026
伐地考昔
Figure BDA00040006400400010027
或5-烷基-2-芳基氨基苯乙酸)；cRAF激酶抑制剂，其包括但不限于3-(3,5-二溴-4-羟基亚苯基)-5-碘代-1,3-二氢吲哚-2-酮和苯甲酰胺、3-(二甲基氨基)-N-[3-[(4-羟基苯甲酰基)氨基]-4-甲基苯基]-(9Cl)；周期蛋白依赖性激酶抑制剂，其包括但不限于olomoucine及其衍生物、purvalanol B、roascovitine
Figure BDA00040006400400010028
靛玉红、kenpaullone、purvalanol A和靛玉红-3’-单肟；半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其包括但不限于4-吗啉甲酰胺、N-[(1S)-3-氟-2-氧代-1-(2-苯基乙基)丙基]氨基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-(9Cl)；DNA嵌入剂，其包括但不限于普卡霉素
Figure BDA0004000640040001011
和达托霉素
Figure BDA0004000640040001012
DNA链断裂剂，其包括但不限于博来霉素
Figure BDA0004000640040001013
E3连接酶抑制剂，其包括但不限于N-((3,3,3-三氟-2-三氟甲基)丙酰基)磺胺；EGF途径抑制剂，其包括但不限于酪磷蛋白46、EKB-569、埃罗替尼
Figure BDA0004000640040001014
吉非替尼
Figure BDA0004000640040001015
拉帕替尼
Figure BDA0004000640040001016
以及以下中一般且具体公开的那些化合物：WO 97/02266、EP 0 564 409、WO 99/03854、EP 0 520722、EP 0 566 226、EP 0 787 722、EP 0 837 063、美国专利第5,747,498号、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983和WO 96/33980；法尼基转移酶抑制剂，其包括但不限于ahydroxyfarnesylphosphonic acid、丁酸、2-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-氨基-3-巯基丙基]氨基]-3-甲基戊基]氧基]-1-氧代-3-苯基丙基]氨基]-4-(甲基磺酰基)-1-甲基乙基酯(2S)-(9Cl)、替吡法尼
Figure BDA0004000640040001017
和手霉素A；Flk-1激酶抑制剂，其包括但不限于2-丙烯酰胺、2-氰基-3-[4-羟基-3,5-双(1-甲基乙基)苯基]-N-(3-苯基丙基)-(2E-)-(9Cl)；糖原合酶激酶-3(GSK3)抑制剂，其包括但不限于靛玉红-3’-单肟；组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，其包括但不限于辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、[4-(2-氨基-苯基氨甲酰基)-苄基]氨基甲酸吡啶-3-基甲基酯及其衍生物、丁酸、pyroxamide、曲古抑菌素A、oxamflatin、apicidin、酯肽、depudecin、trapoxin、伏立诺他
Figure BDA0004000640040001018
和WO 02/22577中公开的化合物；I-κB-α激酶抑制剂(IKK)，其包括但不限于2-丙烯氰、3-[(4-甲基苯基)磺酰]-(2E)-(9Cl)；咪唑四嗪酮类，其包括但不限于替莫唑胺
Figure BDA0004000640040001019
及其衍生物(例如，如美国专利第5,260,291号中一般且具体公开的)和米托唑胺；胰岛素酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于羟基-2-萘基甲基膦酸；c-Jun-N-末端激酶(JNK)抑制剂，其包括但不限于吡唑蒽酮和表没食子儿茶素没食子酸酯；丝裂原激活的蛋白激酶(MAP)抑制剂，其包括但不限于苯磺酰胺、N-[2-[[[3-(4-氯苯基)-2-丙烯基]甲基]氨基]甲基]苯基]-N-(2-羟基乙基)-4-甲氧基-(9Cl)；MDM2抑制剂，其包括但不限于反式4-碘代4’-硼烷基-查耳酮；MEK抑制剂，其包括但不限于丁二腈、双[氨基[2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-(9Cl)；MMP抑制剂，其包括但不限于放线酰胺素、表没食子儿茶素没食子酸酯、胶原蛋白肽模拟物和非肽模拟物抑制剂、四环素衍生物马立马司他
Figure BDA0004000640040001021
普啉司他、incyclinide
Figure BDA0004000640040001022
鲨鱼软骨素提取物AE-941
Figure BDA0004000640040001023
Tanomastat、TAA211、MMI270B或AAJ996；mTor抑制剂，其包括但不限于雷帕霉素
Figure BDA0004000640040001024
及其类似物与衍生物、AP23573(也称为地磷莫司、deforolimus或MK-8669)、CCI-779(也称为坦西莫司)
Figure BDA0004000640040001025
和SDZ-RAD；NGFR酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于tyrphostin AG 879；p38 MAP激酶抑制剂，其包括但不限于苯酚、4-[4-(4-氟苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-(9Cl)和苯甲酰胺、3-(二甲基氨基)-N-[3-[(4-羟基苯甲酰基)氨基]-4-甲基苯基]-(9Cl)；p56酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于damnacanthal和tyrphostin 46；PDGF途径抑制剂，其包括但不限于tyrphostin AG1296、tyrphostin 9、1,3-丁二烯-1,1,3-三腈、2-氨基-4-(1H-吲哚-5-基)-(9Cl)、伊马替尼
Figure BDA0004000640040001026
和吉非替尼
Figure BDA0004000640040001027
以及在欧洲专利第0 564 409号和PCT公布第WO 99/03854号中一般且具体公开的那些化合物；磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂，其包括但不限于渥曼青霉素和槲皮素二水合物；磷酸酶抑制剂，其包括但不限于斑蝥酸、斑蝥素和L-亮氨酰胺；蛋白磷酸酶抑制剂，其包括但不限于斑蝥酸、斑蝥素、L-对溴四咪唑草酸酯、2(5H)-呋喃酮、4-羟基-5-(羟甲基)-3-(1-氧代十六烷基)-(5R)-(9Cl)和苄基膦酸；PKC抑制剂，其包括但不限于1-H-吡咯-2,5-二酮、3-[1-3-(二甲基氨基)丙基]-1H-吲哚-3-基]-4-(1H-吲哚-3-基)-(9Cl)、双吲哚基马来酰亚胺IX、Sphinogosine、星形孢菌素和金丝桃素；PKCδ激酶抑制剂，其包括但不限于rottlerin；多胺合成抑制剂，其包括但不限于DMFO；PTP1B抑制剂，其包括但不限于L-亮氨酰胺；蛋白酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于tyrphostin Ag 216、tyrphostin Ag 1288、tyrphostin Ag 1295、格尔德霉素、染料木素和7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物，如PCT公布第WO 03/013541号和美国公布第2008/0139587号中一般且具体描述的；SRC家族酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于PP1和PP2；Syk酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于白皮杉醇；Janus(JAK-2和/或JAK-3)酪氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于tyrphostin AG 490和2-萘基乙烯基酮；维A酸类，其包括但不限于异维A酸
Figure BDA0004000640040001028
Figure BDA0004000640040001029
和维A酸(
Figure BDA00040006400400010210
Retin-A
Figure BDA0004000640040001031
)；RNA聚合酶H延伸抑制剂，其包括但不限于5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，其包括但不限于2-氨基嘌呤；甾醇生物合成抑制剂，其包括但不限于鲨烯环氧酶和CYP2D6；VEGF途径抑制剂，其包括但不限于抗VEGF抗体，例如，贝伐单抗，和小分子，例如舒尼替尼
Figure BDA0004000640040001032
索拉非尼
Figure BDA0004000640040001033
ZD6474(也称为凡德他尼)(ZactimaTM)、SU6668、CP-547632和AZD2171(也称为西地尼布)(RecentinTM)。
实施例
上文讨论的实施方案的一些方面在以下实施例中进一步详细公开，其并不是以任何方式意在限制本公开内容的范围。
实施例1
工程化T细胞的热控制
材料和方法
质粒构建与分子生物学
所有质粒都使用SnapGene(GSL Biotech)设计，并且经由来自New EnglandBiolabs的用于KLD mutagenesis的试剂(E0554S)或用于Gibson Assembly的试剂(E2621L)组装。在组装之后，将构建体转化到NEB Turbo(C2984I)和NEB Stable(C3040I)大肠杆菌中进行培养和质粒制备。包含CD28和CD3z信号传导结构域的CAR-CD19基因是来自DavidBaltimore实验室(Caltech)的惠赠。整合DNA技术合成了其他基因、pHSP和所有PCR引物。图4C中使用的Kozak：CGG-ATG占75％，而ACCATGGGTTGAGCC-ATG(SEQ ID NO:15)占10％。原始kozak是ACC-ATG。
细胞系
Raji细胞(CCL-86)从ATCC获得，并且在具有1×青霉素/链霉素(Corning)的RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养。使用1000ng/ml多西环素诱导Tet启动子。经由由EF1a启动子驱动的GFP的病毒感染构建GFP+Raji细胞。使用第三代病毒载体和辅助质粒(D.Baltimore的惠赠)制备慢病毒。病毒被包装在生长在10cm培养皿中的HEK293T细胞中。在转染3天之后，经由超速离心浓缩病毒颗粒。感染遵循“RetroNectin”(T100BTakara Bio)试剂方案进行。在感染之后至少两周进行实验。
原代T细胞
用EasySep人类T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies 17951)从由健康供体获得的冷冻的人类外周血单个核细胞中分离T细胞。将T细胞用CD3/CD28 Dynabeads(Thermo Fisher Scientific 11132D)以1:1的细胞:珠比刺激1天，然后进行病毒转导。将Dynabeads在第7天去除，并且允许细胞静息直到第14天，然后进行实验。设计这种延迟以避免对HSP活性的任何激活干扰。将T细胞在每隔一天补充50U/ml IL-2(Miltenyi Biotech130-097-744)和1ng/ml IL-15(Miltenyi Biotech 130-095-762)的RPMI中培养。在适当时通过基于LNGFR磁珠的分选(Miltenyi Biotech 130-091-330)富集T细胞。
热调控测定
在Bio-Rad C1000热循环仪中对T细胞进行热刺激。如果需要，向100-200万/ml的T细胞补充多西环素并且充分混合，然后将50μl转移到无菌PCR管中。温度和刺激的持续时间根据实验程序而改变。在热刺激完成后，将细胞移回哺乳动物培养箱，并以1:1补充包含细胞因子且在一些情况下包含多西环素的新鲜培养基。除非另外说明，通常将细胞孵育24小时，然后用流式细胞仪(MACSQuant VYB)进行测定。死亡细胞通常经由FSC/SSC门控排除在常规测定之外。在图3中，使用LIVE/DEAD存活力/细胞毒性试剂盒(Thermo Fisher L3224)来更准确地量化细胞状态。活细胞经由转染标志物被进一步门控，以分离病毒感染的细胞用于进一步分析。使用细胞群体平均荧光的变化来表征pHSP构建体的倍数变化。考虑到细胞自体荧光，在每个实验中收集来自非转导T细胞的平均荧光信号，并且将其从实验T细胞的平均荧光中减去。使用抗HA抗体(Miltenyi Biotech 130-120-722)对CAR表达进行染色，并且使用V450小鼠抗人CD271对LNGFR进行染色(BD biosciences 562123)。使用人类IL-21DuoSet ELISA(R&D systems DY8879-05)测量IL-21表达。
T细胞诱饵测定
Raji细胞和GFP+Raji细胞用作CAR-CD19 T细胞的诱饵细胞。诱饵测定通过以3:1的比混合T细胞与诱饵细胞来起始。建立该比以避免T细胞接合之前诱饵细胞过度生长。使用GFP+Raji评价诱饵细胞的T细胞杀伤，并且随着时间推移追踪GFP+细胞的计数。
结果
在原代T细胞中评价候选pHSP
为了能够对T细胞活性进行热控制，需要在人类原代T细胞中具有稳健切换行为的pHSP。鉴于pHSP应答在细胞类型之间的差异，系统地评价了13种不同pHSP响应于在42℃孵育1小时的活性。基于大多数组织对这种热刺激的耐受性以及在潜在的临床场景中相对短的治疗持续时间的便利性，选择了这种热刺激。pHSP的组包括9个人类、3个小鼠和1个秀丽线虫启动子(表1)。人类启动子包括4个天然存在的序列(HSPB、HSPB’2、HSP A/A、HSP A/B)、通过改变HSPB’2的5’UTR产生的两种修饰(HSPB’1、HSPB’3)和受先前开发的细胞应激传感器启发的三种HSPB’2合理修饰(SynHSPB’1、SynHSPB’2、SynHSPB’3)。截短HSPB’2并保留192个碱基对导致SynHSPB’1NO。为了降低潜在的基线活性，将SynHSPB’1中的AP-1结合位点突变，得到SynHSPB’2。将SynHSPB’2复制4次，以增加热休克元件(HSE)的数量，得到SynHSPB’3。三个小鼠来源的pHSP是天然存在的启动子。将来源于秀丽线虫的HSP16合理修饰，形成包含四个HSE结合位点的最小双向启动子。HSP16不包括通常存在于人类启动子中的其他转录因子结合位点。将每个pHSP掺入标准化慢病毒构建体中，其中pHSP驱动绿色荧光蛋白(GFP)的表达，其中组成型表达的蓝色荧光蛋白(BFP)用作转导标志物(图2A)。
被刺激后，所有启动子显示出跨越细胞群体的一致的激活水平，允许使用平均荧光作为诱导倍数的度量(图8)。在13个启动子中，HSPB在37℃具有最低的基线表达(图2B)，这是在不存在热触发的情况下使活性最小化的重要特性。HSPB’1显示出在基因表达的最大倍数变化，反映了相对低基线表达和刺激时的强启动子活性的组合。在合理工程化的HSPB’2变体中，SYNHSPB’3具有比天然启动子低的基线，尽管在激活时具有较低的最大表达量。其余的人类和小鼠来源的启动子表现出高基线活性，导致它们被排除出进一步的实验。最后，秀丽线虫最小启动子表现出可接受的性能，并且被纳入进一步的测试，以研究其最小组成是否将有利于响应于温度的特异性激活。基于这些因素，选择了HSPB、HSPB’1、SynHSPB’3和HSP16作为进一步回路工程化的起点。
pHSP激活的热参数
在鉴定了四个候选pHSP之后，测试了它们对一系列诱导参数的响应。为了寻找向细胞提供快速诱导伴随最小热负荷的温度，将pHSP转导的T细胞在范围为37℃至44℃的温度孵育1小时。所有四个启动子在42℃时表现出活性显著增加(图3A)。诱导温度增加超过这一点时导致转录活性显著增强，但损害细胞存活力(图3B)。为了在最小细胞损伤的情况下优化诱导，选择42℃进行进一步实验。与用哺乳动物启动子在高于42℃观察到的基因表达逐渐增加不同，HSP16在该温度与43℃之间表现出大的跳跃，这在本文公开的多种回路工程化应用中都有应用。
为了降低热暴露对细胞存活力的影响，测试了具有50％占空比的脉冲式加热方案。在该方案中，细胞经历加热至42℃持续固定的时间段和在37℃等量时间的重复循环，在两小时处理时间段内加起来总计1小时在42℃。刺激时间段在1分钟与连续加热60分钟之间变化。该实验揭示了启动子活性(图3C)与细胞存活力(图3D)之间的取舍(trade-off)，其中较短的脉冲降低启动子活性但增加细胞存活力。为了T细胞疗法的目的，其中细胞可以在激活之后扩增，确定了细胞存活力减少40％是改进激活的合适取舍，因此选择了连续加热范式。这种范式也简化了在治疗期间加热的施加。还研究了范围为15分钟至120分钟的连续刺激持续时间。较短诱导增强存活力(图3E)，以较低基因表达为代价(图3F)，其中1个小时刺激提供合理平衡。最佳的刺激方案可以根据所使用的启动子、回路设计、靶向组织和所需的治疗剂量而变化。选择42℃的1小时连续刺激作为随后实验的加热范例，以使获得有意义响应的可能性最大化，尽管有可能对细胞造成损伤。
用于扩增和持续热激活的遗传回路
在一些实施方案中，pHSP本身在诱导后驱动相对少量的瞬时蛋白表达。为了能够在T细胞疗法应用中使用pHSP，扩大pHSP驱动回路的输出是有用的。例如，这将使细胞在单次热刺激之后释放相对大的治疗性团注(bolus)。为了达到这一目的，实现了其中pHSP驱动rtTA反式激活因子的前馈扩增回路，该回路产生用多西环素可调节的更强的转录激活。此外，组成型表达LNGFR以鉴定病毒转染的细胞(图4A)。掺入HSPB、HSPB’1、SynHSPB’3和HSP16的扩增回路都表现出它们诱导倍数的显著增加，而基线表达仅略有提高。HSPB显示出最好的性能，表明在前馈扩增驱动最大表达水平的背景下，具有较低泄漏的启动子(图2B)是优选的。组成型转导标志物的表达跨越构建体是相似的(例如图9)，表明感染水平并不影响它们的相对性能。为了进一步调节HSPB扩增器回路的性能，通过改变Kozak序列或在上游插入微开放阅读框来设计具有降低的GFP翻译的构建体(图4B)。这些修饰能够实现基线表达和最大激活水平两者的调节。
在一些治疗场景中，延长热诱导处理后T细胞的治疗作用是至关重要的。这将消除施加重复刺激来维持治疗效力的需要。为了发展这种能力，通过重新排列前馈扩增器的元件，使得rtTA能够在多西环素的存在下驱动其本身的表达，建立了正反馈扩增器回路(图4C)。HSPB反馈回路维持其热诱导水平，并且通过调节rtTA上游的Kozak序列降低基线活性。在一些实施方案中，在GFP有效载荷被放置在IRES元件之后时，正反馈回路的输出低于前馈扩增器的输出。在一些实施方案中，这样“低但稳定”的活性是期望的；在其他实施方案中，可以通过将IRES交换为2A元件来实现“高且稳定”模式。在一些实施方案中，IRES元件可以替代为2A元件。图4D中比较了直接、前馈和反馈HSPB回路的动态表达谱，显示出用正反馈的情况下延长的表达。
正反馈回路维持表达持续数天。在一些实施方案中，在反式激活因子的稀释或波动表达中，回路最终可以被关闭。为了建立永久性的热开关，测试了基因回路，其中将CRE重组酶的表达放置在候选pHSP的控制下(图4E)。在这些回路中，pHSP驱动的CRE表达通过使靶载体重组而永久地将回路从表达RFP切换至表达抗CD19 CAR。在Jurkat T细胞系中，这些回路显示出稳健激活和最小泄漏(图4F)。在本文公开的组合物和方法的一些实施方案中，在原代T细胞中测试时，观察到更高水平的背景激活(图4F)。不受任何特定理论约束，这可能是由于免疫刺激被用来维持培养中的原代T细胞的事实，以及下文讨论的我们的发现，即pHSP在刺激的原代T细胞中显示出显著的背景活性。总之，这些结果表明，在原代T细胞中，前馈扩增和反馈扩增为基因表达的热控制提供了稳健的方法。
温度激活的细胞因子释放
为了显示在热诱导之后正反馈回路维持治疗相关功能的能力，将正反馈回路的输出与细胞因子的产生相连。通过允许T细胞分泌免疫刺激因子，重塑肿瘤微环境和降低免疫抑制，从工程化T细胞中局部递送细胞因子在癌症免疫疗法中将是有用的。通过允许T细胞局部分泌因子，下调内源免疫细胞的活性，在治疗自身免疫性疾病中也将是有用的。选择IL-21作为模型细胞因子，由于其刺激NK细胞和CD8+T细胞的能力，IL-21在癌症免疫疗法中具有潜在的效用。将人类IL-21替代GFP掺入正反馈回路中(图5A)。在没有热诱导的情况下，用这种回路转导的原代T细胞产生最小IL-21。被刺激后，细胞快速分泌IL-21，在12小时内达到接近最大水平，并维持活性持续至少5天(图5A)。连续回路功能对多西环素的依赖提供了一层另外的控制，允许通过去除多西环素在期望的时间终止疗法产生。为了演示这种能力，在细胞诱导之后24小时去除多西环素，导致细胞因子产生在第5天消失。化学终止正反馈回路活性的能力增强了其在潜在治疗应用中的安全性谱。
在一些场景下，从组成型表达CAR的T细胞触发细胞因子释放将是有用的，这允许细胞因子在CAR指导的杀伤期间局部加强免疫激活。为了测试这种可能性，用正向IL-21回路和组成型表达的抗CD19 CAR共转导原代T细胞(图5B)。在不存在表达CD19的靶Raji诱饵细胞的情况下，通过热诱导良好控制了IL-21释放(图5B)。然而，即使在不存在热处理的情况下，与诱饵细胞共孵育3天之后，共培养导致激活IL-21的释放(图5B)。这些结果表明HSP活性可以由T细胞刺激驱动，如IL-21释放证明的。然而，由于某些T细胞亚群被显示在刺激时释放内源IL-21，我们开始使用非细胞因子输出直接测试T细胞刺激后的pHSP诱导，如下文讨论的。
pHSP驱动的回路对T细胞激活的依赖性
为了直接检查响应于CAR驱动的T细胞激活开启pHSP的可能性，测试了组成型表达CAR的T细胞中pHSP驱动的GFP在暴露于热刺激或诱饵细胞后的表达(图6A)。发现热刺激和CAR接合两者导致pHSP驱动的基因表达(图6B)。这种响应发生在表达基于HSPB、SynHSPB’3和HSPmin启动子的回路的细胞中。因为SynHSPB’3缺乏野生型pHSP诸如HSPB中存在的AP-1位点，而HSPmin仅由驱动最小启动子的HSE结合位点构成，这些结果表明pHSP诱导经由HSF1介导的机制发生。这一意想不到的发现表明，在一些实施方案中，激活的T细胞经历细胞应激—例如由于快速增殖—潜在地导致错误折叠蛋白的数量增加，导致HSP上调。这为热诱导型免疫疗法的设计提供了重要的见解。
自动持续热诱导CAR表达与肿瘤细胞杀伤
CAR接合驱动pHSP活性的发现表明，简单的、自动持续基因回路可以响应于热刺激和靶细胞的存在的组合驱动CAR介导的杀伤。具体地，假设将CAR表达置于pHSP控制之下(图7A)会导致T细胞没有初始CAR表达或活性，即使在存在靶细胞的情况下。在热诱导后，CAR将变得瞬时表达。如果CAR靶存在于T细胞附近，这些细胞将变得激活，由pHSP驱动另外CAR的持续表达和靶细胞杀伤。
正如预测的那样，这个pHSP-CAR回路在原代T细胞中没有显示基线CAR表达，但在热刺激时开始表达CAR(图7A)。在不存在靶接合的情况下，CAR表达在24小时之后大大降低(图7B)。在用CD19+诱饵细胞培养时(图7C)，热激活的pHSP-CAR T细胞在共培养9天之后消除了诱饵细胞(图7D、图10)。这种杀伤与携带由EF1α启动子驱动的组成型表达CAR的阳性对照T细胞一样完全，尽管时间跨度更长。不受任何特定理论约束，这种差异可能是由于pHSP驱动的CAR表达的最大水平低于用组成型EF1α启动子观察到的水平(图11)。在pHSP-CAR T细胞与诱饵细胞在没有热刺激的情况下共孵育时，无明显杀伤发生。在初始热刺激导致一些细胞死亡时，T细胞维持其增殖能力，并且快速弥补T细胞的初始损失(图12)。这些结果表明，热刺激可以起始CAR从pHSP的激活驱动表达的正反馈环，导致有效消除诱饵细胞。这种激活模式可以有助于减轻脱靶毒性，因为一旦T细胞离开肿瘤部位，CAR表达将消失。
讨论
本实施例中显示的结果表明，使用pHSP的工程化生物开关回路可以提供伴随轻度体温过高的T细胞疗法控制。虽然先前已经表明，光转换蛋白也可以赋予对T细胞活性的时空控制，但光具有对组织的不良穿透，限制了这样工具的效用。在另一方面，使用非侵入性方法，诸如FUS或磁热疗可以在任意深度和在高空间精度情况下提升温度。
我们的研究表明，在37℃-42℃的良好耐受范围内的温度可以以最小基线活性提供对T细胞功能的控制，包括细胞因子的合成和释放，以及体外CAR介导的对癌细胞的杀伤。在本文提供的方法的一些实施方案中，热组织损伤不是肿瘤疗法中的主要问题(其中它可以是协同的)。在本文提供的方法的一些实施方案中，FUS治疗持续时间实质上小于本研究中使用的1小时热脉冲。
本文公开了采用由T细胞受体途径产生的令人惊讶的非热pHSP诱导来产生持续杀伤回路的组合物和方法。
实施例2
振荡回路
虽然目前的几代CAR-T细胞疗法已经在B细胞恶性肿瘤中显示出高应答率，但它们在实体瘤中的效力却充其量平平。与其不良性能相关的主要因素之一是T细胞“耗尽”，其中CAR-T细胞的效应物功能降低。许多研究小组已经集中在研究这一现象，为实体瘤疗法产生新的疗法线索。在本文提供的方法和组合物中，T细胞耗尽可以通过CAR-T细胞的瞬时失活来逆转。在一些实施方案中，提供了利用HSP启动子通过周期性静息T细胞来规避T细胞耗尽的细胞自主遗传控制器。本文公开了基于HSP启动子(如本文描述)作为T细胞活性传感器的活性调控反馈回路，其在高CAR活性事件之后自主地下调CAR的表达以使T细胞静息。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，提供了防止T细胞耗尽的活性驱动振荡器。在一些实施方案中，公开的活性驱动振荡器的中心组件是本文描述的新类别的基于HSP的转录传感器。在一些实施方案中，T细胞使用基于HSP的启动子来感测其活性，并且在一定时间段的刺激之后下调CAR表达，允许T细胞静息。在一些实施方案中，静息的细胞将以振荡模式再次表达CAR。在一些实施方案中，治疗性T细胞将异步振荡，允许一些T细胞静息，而剩余细胞与肿瘤接合，从而导致持续的疗法，同时避免任何给定T细胞的过度活性。为了调控CAR表达，基于HSP的传感器的活性可以与靶向并降解工程化CAR的蛋白(诸如抗GFP纳米抗体和LOCKR)的表达相关。在一些实施方案中，为了增加静息周期的长度，在回路中包括前馈控制元件。在一些实施方案中，为了减少静息时间段，使用N末端规则来控制CAR半衰期。图14A-图14C描绘了与调控CAR活性以防止T细胞耗尽的基于HSP的反馈回路相关的非限制性示例性数据和实施方案。图14A描绘了非限制性示例性传统CAR T细胞和本文提供的示例性振荡CAR T细胞。图14B描绘了非限制性示例性振荡遗传回路。图14C描绘了以图14B中的回路进行病毒感染并且然后与诱饵细胞以Jurkat与诱饵1:5的比混合的Jurkat细胞相关的示例性数据。每天通过测定融合至CAR的GFP的强度来分析细胞的CAR表达。X轴：天数，Y轴：与第0天相比的％GFP/CAR表达。
在至少一些先前描述的实施方案中，在一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以可互换地在另一种实施方案中使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有此类修改和改变都旨在落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对于背景和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语，并且特别是所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中的术语，通常旨在作为“开放性的”术语(例如，术语“包括/包含(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括/包含(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图所介绍的权利要求陈述的特定数字，则这样的意图将明确地陈述于权利要求中，并且在不存在这种陈述的情况下，不存在这种意图。例如，为了帮助理解，所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含这种介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制到包含仅一种这种陈述的实施方案中，甚至当相同的权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字，本领域技术人员将认识到，这种陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。
此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的该范围的子范围和子范围组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围能被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所陈述的数字，并且指可以随后分解为如上文讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
尽管本文已经公开了各种方面和实施方案，但其他方面和实施方案对本领域技术人员将是明显的。本文公开的各种方面和实施方案用于说明的目的而并不意在限制由以下权利要求所指出的实际范围和精神。
序列表
<110> 加州理工学院
穆罕默德·H·阿贝迪
米哈伊尔·夏皮罗
丹·I·皮拉纳
贾斯汀·李
<120> 通过分子和物理启动对T细胞免疫疗法的热控制
<130> 30KJ-302427-WO
<150> 63/010525
<151> 2020-04-15
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPB
<400> 1
aattagcttg aggatcctcc acagccccgg ggagaccttg cctctaaagt tgctgctttt 60
gcagctctgc cacaaccgcg cgtcctcaga gccagccggg aggagctaga accttccccg 120
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tcttcggtct cacggaccga tccgcccgaa ccttctcccg gggtcagcgc cgcgctgcgc 240
cgcccggctg actcagcccg ggcgggcggg cgggaggctc tcgactgggc gggaaggtgc 300
gggaaggttc gcggcggcgg ggtcggggag gtgcaaaagg atgaaaagcc cgtggacgga 360
gctgagcaga tccggccggg ctggcggcag agaaaccgca gggagagcct cactgctgag 420
cgcccctcga cgcgggcggc agcagcctcc gtggcctcca gcatccgaca agaagcttca 480
gcc 483
<210> 2
<211> 538
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPB'1
<400> 2
aattagcttg agcctctaaa gttgctgctt ttgcagcctc tgccacaacc gcgcgtcctc 60
agagccagcc cggaggagct agaaccttcc ccgcatttct ttcagcagcc tgagtcagag 120
gcgggctggc ctggcgtagc cgcccagcct cgcggctcat gccccgatct gcccgaacct 180
tctcccgggg tcagcgccgc gccgcgccac ccggctgagt cagcccgggc gggcgagagg 240
ctctcaactg ggcgggaagg tgcgggaagg tgcggaaagg ttcgcgaaag ttcgcggcgg 300
cgggggtcgg gtgaggcgca aaaggataaa aagccggtgg aagcggagct gagcagatcc 360
gagccgggct ggctgcagag aaaccgcagg gagagcctca ctgctgagcg cccctcgacg 420
gcggagcggc agcagcctcc gtggcctcca gcatccgaca agaagcttga attcgagctc 480
gccggggatc ctctagtcag ctgacgcgtg ctagcgcggc cgcaccacta gtgccacc 538
<210> 3
<211> 526
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPB'2
<400> 3
aattagcttg agcctctaaa gttgctgctt ttgcagcctc tgccacaacc gcgcgtcctc 60
agagccagcc cggaggagct agaaccttcc ccgcatttct ttcagcagcc tgagtcagag 120
gcgggctggc ctggcgtagc cgcccagcct cgcggctcat gccccgatct gcccgaacct 180
tctcccgggg tcagcgccgc gccgcgccac ccggctgagt cagcccgggc gggcgagagg 240
ctctcaactg ggcgggaagg tgcgggaagg tgcggaaagg ttcgcgaaag ttcgcggcgg 300
cgggggtcgg gtgaggcgca aaaggataaa aagccggtgg aagcggagct gagcagatcc 360
gagccgggct ggctgcagag aaaccgcagg gagagcctca ctgctgagcg cccctcgacg 420
gcggagcggc agcagcctcc gtggcctcca gcatccgaca agaagcttga attcgagctc 480
gccggggatc ctctagtcag ctgacgcgtg ctagcgcggc gccacc 526
<210> 4
<211> 473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPB'3
<400> 4
aattagcttg agcctctaaa gttgctgctt ttgcagcctc tgccacaacc gcgcgtcctc 60
agagccagcc cggaggagct agaaccttcc ccgcatttct ttcagcagcc tgagtcagag 120
gcgggctggc ctggcgtagc cgcccagcct cgcggctcat gccccgatct gcccgaacct 180
tctcccgggg tcagcgccgc gccgcgccac ccggctgagt cagcccgggc gggcgagagg 240
ctctcaactg ggcgggaagg tgcgggaagg tgcggaaagg ttcgcgaaag ttcgcggcgg 300
cgggggtcgg gtgaggcgca aaaggataaa aagccggtgg aagcggagct gagcagatcc 360
gagccgggct ggctgcagag aaaccgcagg gagagcctca ctgctgagcg cccctcgacg 420
gcggagcggc agcagcctcc gtggcctcca gcatccgaca agaagcttca gcc 473
<210> 5
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SynHSPB'1
<400> 5
aattagcttg accccgatct gcccgaacct tctcccgggg tcagcgccgc gccgcgccac 60
ccggctgagt cagcccgggc gggcgagagg ctctcaactg ggcgggaagg tgcgggaagg 120
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gcatccgaca agaagcttca gcc 323
<210> 6
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SynHSPB'2
<400> 6
aattagcttg accccgatct gcccgaacct tctcccgggg tcagcgccgc gccgcgccac 60
ccggctgcag cagcccgggc gggcgagagg ctctcaactg ggcgggaagg tgcgggaagg 120
tgcggaaagg ttcgcgaaag ttcgcggcgg cgggggtcgg gtgaggcgca aaaggataaa 180
aagccggtgg aagcggagct gagcagatcc gagccgggct ggctgcagag aaaccgcagg 240
gagagcctca ctgctgagcg cccctcgacg gcggagcggc agcagcctcc gtggcctcca 300
gcatccgaca agaagcttca gcc 323
<210> 7
<211> 628
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SynHSPB'3
<400> 7
aattagcttg accccgatct gcccgaacct tctcccgggg tcagcgccgc gccgcgccac 60
ccggctgcag cagcccgggc gggcgagagg ctctcaactg ggcgggaagg tgcgggaagg 120
tgcggaaagg ttcgcgaaag ttcgcggccg gactagagtg gcgagatccc ccgatctgcc 180
cgaaccttct cccggggtca gcgccgcgcc gcgccacccg gctgcagcag cccgggcggg 240
cgagaggctc tcaactgggc gggaaggtgc gggaaggtgc ggaaaggttc gcgaaagttc 300
gcggcaatta gcttgacccc gatctgcccg aaccttctcc cggggtcagc gccgcgccgc 360
gccacccggc tgcagcagcc cgggcgggcg agaggctctc aactgggcgg gaaggtgcgg 420
gaaggtgcgg aaaggttcgc gaaagttcgc ggcggcgggg gtcgggtgag gcgcaaaagg 480
ataaaaagcc ggtggaagcg gagctgagca gatccgagcc gggctggctg cagagaaacc 540
gcagggagag cctcactgct gagcgcccct cgacggcgga gcggcagcag cctccgtggc 600
ctccagcatc cgacaagaag cttcagcc 628
<210> 8
<211> 476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPA/A
<400> 8
aattagcttg agccgcccac tcccccttcc tctcagggtc cctgtcccct ccagtgaatc 60
ccagaagact ctggagagtt ctgagcaggg ggcggcactc tggcctctga ttggtccaag 120
gaaggctggg gggcaggacg ggaggcgaaa accctggaat attcccgacc tggcagcctc 180
atcgagctcg gtgattggct cagaagggaa aaggcgggtc tccgtgacga cttataaaag 240
cccaggggca agcggtccgg ataacggcta gcctgaggag ctgctgcgac agtccactac 300
ctttttcgag agtgactccc gttgtcccaa ggcttcccag agcgaacctg tgcggctgca 360
ggcaccggcg cgtcgagttt ccggcgtccg gaaggaccga gctcttctcg cggatccagt 420
gttccgtttc cagcccccaa tctcagagcg gagccgacag agagcaggga accgcc 476
<210> 9
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPA/B
<400> 9
aattagcttg actccttccc attaagacgg aaaaaacatc cgggagagcc ggtccgtttc 60
tcaggcagac taggccatta ggtgcctcgg agaaaggacc caaggctgct ccgtccttca 120
cagacacagt ccaatcagag tttcccaggc acatcgatgc accgcctcct tcgagaaaca 180
aggtaacttt cgggttctgg ttgtctccaa agtcatccga ccaatctcgc accgcccaga 240
gcgggccctt cctgtcaatt acctactgaa gggcaggcgg ccagcatcgc catggagacc 300
aacacccttc ccaccaccac tccccctttc tctcagggcc cctgtcccct ccagtgaatc 360
ccagaagact ctggagagtt ctgagcagag ggcggcaccc tgccctctga ttggtccaag 420
gaaggctggg gggcaggacg ggaggcgaaa cccctggaat attcccgacc tggcagcctc 480
atcgagcttg gtgattggct cagaagggga aaggcgggtc tccacgacga cttataaaag 540
ccgaggggcg cgcggtccgg aaaacggcca gcctgaggag ctgctgcgag ggtccgcttc 600
gtctttcgag agtgactccc gcggtcccaa ggctttccag agcgaacctg tgcggctgca 660
ggcaccggcg tgttgagttt ccggcgttcc gaaggactga gctcttgtcg cggatcccgt 720
ccgccgtttc cagcccccag tctcagagcg gagcccacag agcagggcac cggc 774
<210> 10
<211> 1060
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPm1
<400> 10
aattagcttg aaaatcagtc aaacctaaga aaattctcaa ccgcatcaaa ccgaggacca 60
actgggacac agagcttctg ccccactcca atcagagcct tcccagctca cctgggatct 120
ctacgccttc gatccagttt ggaaaatttc aagtcgctga gcccctacga gaggagctcc 180
aggaacatac caaactgagg cagccggggt cccccccacc ccccaccccg cccctcccgg 240
caactttgag cctgtgctgg gacagagcct ctagttccta aattagtcca tgaggtcaga 300
ggcagcactg ccattgtaac cgcgattgga gaggatcacg tcaccggaca cgccccaggc 360
atctccctgg gtctcctaaa cttggccggg gagaagtttt agcccttaag gttttagcct 420
ttaaccccca tattcagaac tgtgcgagtt ggcgaaaccc cacaaatcac aacaaactgt 480
acacaacacc gaggctagag gtgatctttc ttgtccattc cacacaggcc ttagtaattg 540
cgtcgccata gcaacagtgt cactagtagc accagcacgt tccccacacc ctccccctca 600
ggaatccgta ctctccagtg aaccccagaa acctctggag agttctggac aagggcggaa 660
cccacaactc cgattactca agggaggcgg ggaagctcca ccagacgcga aactgctgga 720
agattcctgg ccccaaggcc tcctccggct cgctgattgg cccagcggag agtgggcggg 780
gccggtgaag actccttaaa ggcgcagggc ggcgagcacg gtcaccagac gctgacagct 840
actcagaacc aaatctggtt ccatccagag acaagcgaag acaagagaag cagagcagag 900
cggcgcgttc ccgatcctcg gccaggacca gccttcccca gagcatccct gccgcgggac 960
gcaaccttcc caggagcatc cctgccgcgg agcaactttc cccggagcat ccagcccgga 1020
cgcagccttc cagaagcacg agcccaccac tagtgccacc 1060
<210> 11
<211> 1064
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPm2
<400> 11
aattagcttg acctgcagcc tgaggcaaag ggagtggcta cagcctggca cggtcgatta 60
agccctgctc tccgggtcct gggacacttt cctttttcct cttttgagtc acaggtcctc 120
ctaacatgag aatcaagtat tttcacgctg atttccttat aaaattgtga gaactccata 180
ggcgatgtac cgcctactcc taccttaacc gtgatgtaaa gacagcaaaa caaatgaact 240
atactgcaag atctcttcta tttccctatt caaacctaaa atgaagaggg agggggagac 300
atggacaagc aagcattcca caggcgcccc tgcccaacgc tgtcactcaa accaggaccc 360
aatcacagac tttttagcca agccttatcc cgcctctctt gagaaacttt ctgcgtccgc 420
catcctgtag gaaggatttg tacactttaa actccctccc tggtctgagt cccacactct 480
caccacccag caccttcagg agctgaccct taacagcttc acccacaggg accccgaagt 540
tgcgtcgcct ccgcaacagt gtcaatagca gcaccagcac ttccccacac cctccccctc 600
aggaatccgt actctctagc gaaccccaga aacctctgga gagttctgga caagggcgga 660
acccacaact ccgattactc aagggaggcg gggaagctcc accagacgcg aaactgctgg 720
aagattcctg gccccaaggc ctcctccggc tcgctgattg gcccagcgga gagtgggcgg 780
ggccggtgaa gactccttaa aggcgcaggg cggcgagcag ggcaccagac gctgacagct 840
actcagaatc aaatctggtt ccatccagag acaagcgaag acaagagaag cagagcgagc 900
ggcgcgttcc cgatcctcgg ccaggaccag ccttccccag agcatccacg ccgcggagcg 960
caaccttccc aggagcatcc ctgccgcgga gcgcaacttt ccccggagca tccacgccgc 1020
ggagcgcagc cttccagaag cagagcgcca ccactagtgc cacc 1064
<210> 12
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPm3
<400> 12
accagacgct gacagctact cagaaccaaa tctggttcca tccagagaca agcgaagaca 60
agagaagcag agcgagcggc gcgttcccga tcctcggcca ggaccagcct tccccagagc 120
atccctgccg cggagcgcaa ccttcccagg agcatccctg ccgcggagcg caactttccc 180
cggagcatcc acgccgcgga gcgcagcctt ccagaagcag agcgcggcgc c 231
<210> 13
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSP16F
<400> 13
gattgtagtt tgaagatttc acaattagag tgaatgttgt ttggttcggt tttgtcactg 60
tatttatact catttccacc tttttctaga aggtcctaga tgcatctagg accttctaga 120
acattctaaa cggctgcagg atacgggtat ataagccaat cgtgttcaga ggaaaccaat 180
acactttgtt caagtgctta ctgttcattc tctaaacttc aagacacc 228
<210> 14
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPmin
<400> 14
acatttcctg tacaagtgcc ctaggagctc ggatccagga ggcctaactg gccggtacct 60
gagctcctgg aagattctag aacgttctgg aagattctag aacgttcctc gaggatatca 120
agatctggcc tcggcggcca agcttagaca ctagagggta tataatggaa gctcgacttc 180
cagcttggca atccggtact gttggtaaag cgccacc 217
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> kozak
<400> 15
accatgggtt gagccatg 18
<210> 16
<211> 9872
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTLL-phHsp70A1A
<400> 16
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 60
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 120
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 180
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 240
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 300
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 360
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 420
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 480
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 540
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 600
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 660
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 720
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 780
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 840
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 900
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 960
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 1020
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 1080
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 1140
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 1200
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 1260
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 1320
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 1380
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 1440
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 1500
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct 1560
cactaaaggg aacaaaagct ggagctgcaa gcttggccat tgcatacgtt gtatccatat 1620
cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaacattac cgccatgttg acattgatta 1680
ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 1740
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 1800
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 1860
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 1920
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 1980
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 2040
attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 2100
cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 2160
caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 2220
cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgggg tctctctggt 2280
tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 2340
aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 2400
actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 2460
cagggacctg aaagcgaaag ggaaaccaga ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc 2520
tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac 2580
tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat 2640
tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 2700
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 2760
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 2820
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 2880
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 2940
gaccaccgca cagcaagcgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca 3000
attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac 3060
ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt 3120
tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcctca atgacgctga 3180
cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg 3240
ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg 3300
caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt 3360
gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat 3420
ctctggaaca gattggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta 3480
cacaagctta atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca 3540
agaattattg gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg 3600
gctgtggtat ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt 3660
ttttgctgta ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca 3720
gacccacctc ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg 3780
agagagagac agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatctcg 3840
acacaaatgg cagtattcat ccacaatttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt 3900
gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa 3960
caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg acagcagaga tccagtttgg 4020
gaattagctt gagccgccca ctcccccttc ctctcagggt ccctgtcccc tccagtgaat 4080
cccagaagac tctggagagt tctgagcagg gggcggcact ctggcctctg attggtccaa 4140
ggaaggctgg ggggcaggac gggaggcgaa aaccctggaa tattcccgac ctggcagcct 4200
catcgagctc ggtgattggc tcagaaggga aaaggcgggt ctccgtgacg acttataaaa 4260
gcccaggggc aagcggtccg gataacggct agcctgagga gctgctgcga cagtccacta 4320
cctttttcga gagtgactcc cgttgtccca aggcttccca gagcgaacct gtgcggctgc 4380
aggcaccggc gcgtcgagtt tccggcgtcc ggaaggaccg agctcttctc gcggatccag 4440
tgttccgttt ccagccccca atctcagagc ggagccgaca gagagcaggg aaccgccatg 4500
gtgagcaagg gagaggagga taacatggcc tctctcccag ctacacatga gcttcacatc 4560
tttggatcca tcaacggtgt ggactttgac atggtgggtc agggaaccgg aaatccaaat 4620
gatggatatg aggagcttaa ccttaagtcc accaagggtg acctccagtt ctccccatgg 4680
attcttgtcc ctcatatcgg atatggattc catcagtacc ttccttaccc tgacggtatg 4740
tctcctttcc aggccgccat ggttgatgga tccggatacc aagtccatag aacaatgcag 4800
tttgaagatg gtgcctccct tactgttaac tacagataca cctacgaggg aagccacatc 4860
aaaggagagg cccaggtgaa gggaactggt ttccctgctg acggtcctgt gatgaccaac 4920
tctcttaccg ctgctgactg gtgcaggtct aagaaaactt accctaacga caaaaccatc 4980
atcagtacct ttaagtggag ttacaccact ggaaatggta agagatacag aagcactgct 5040
agaaccacct acacctttgc caagccaatg gctgctaact atcttaagaa ccagcctatg 5100
tacgtgttcc gtaagactga gctcaagcac tccaagaccg agctcaactt caaggagtgg 5160
caaaaggcct ttaccgatgt gatgggaatg gacgagcttt acaagtaatg tacaacacgt 5220
gctacgagat ttcgattccg agctcgaatt gacggatcgg gagatctact agaagctttg 5280
caaagatgga taaagtttta aacagagagg aatctttgca gctaatggac cttctaggtc 5340
ttgaaaggag tgggaattgg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca 5400
gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag aaggtggcgc 5460
ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga 5520
gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc 5580
agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac gggttatggc 5640
ccttgcgtgc cttgaattac ttccactggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc 5700
gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg 5760
cttgagttga ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc 5820
gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg 5880
cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta 5940
tttcggtttt tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg 6000
cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc 6060
ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc 6120
tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag 6180
ggagctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa 6240
ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc 6300
cgtccaggca cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg 6360
aggggtttta tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag 6420
cttggcactt gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca 6480
ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgaccgg 6540
tcgccaccat ggtgtctaag ggcgaagagc tgattaagga gaacatgcac atgaagctgt 6600
acatggaggg caccgtggac aaccatcact tcaagtgcac atccgagggc gaaggcaagc 6660
cctacgaggg cacccagacc atgagaatca aggtggtcga gggcggccct ctccccttcg 6720
ccttcgacat cctggctact agcttcctct acggcagcaa gaccttcatc aaccacaccc 6780
agggcatccc cgacttcttc aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg gagagagtca 6840
ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc caggacggct 6900
gcctcatcta caacgtcaag atcagagggg tgaacttcac atccaacggc cctgtgatgc 6960
agaagaaaac actcggctgg gaggccttca ccgagacgct gtaccccgct gacggcggcc 7020
tggaaggcag aaacgacatg gccctgaagc tcgtgggcgg gagccatctg atcgcaaacg 7080
ccaagaccac atatagatcc aagaaacccg ctaagaacct caagatgcct ggcgtctact 7140
atgtggacta cagactggaa agaatcaagg aggccaacaa cgagacctac gtcgagcagc 7200
acgaggtggc agtggccaga tactgcgacc tccctagcaa actggggcac aagcttaatt 7260
aatgtacaaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact 7320
atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg 7380
cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg 7440
aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa 7500
cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc 7560
ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg 7620
ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt 7680
ggctgctcgc ctatgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt 7740
cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc 7800
cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgctac 7860
aaggcagctg tagatccctt tcatagaagg cggcggtggt acctttaaga ccaatgactt 7920
acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 7980
ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 8040
agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 8100
gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 8160
gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc 8220
ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt 8280
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 8340
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 8400
tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 8460
cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 8520
ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 8580
cgtcgagacg tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc 8640
gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca 8700
catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa 8760
cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 8820
gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 8880
cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 8940
aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 9000
cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 9060
ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 9120
aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 9180
ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt 9240
acaatttccc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 9300
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 9360
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 9420
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 9480
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 9540
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 9600
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 9660
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 9720
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 9780
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 9840
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aa 9872
<210> 17
<211> 10170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTLL-phHsp70A1B
<400> 17
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 60
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 120
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 180
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 240
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 300
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 360
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 420
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 480
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 540
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 600
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 660
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 720
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 780
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 840
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 900
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 960
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 1020
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 1080
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 1140
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 1200
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 1260
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 1320
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 1380
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 1440
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 1500
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct 1560
cactaaaggg aacaaaagct ggagctgcaa gcttggccat tgcatacgtt gtatccatat 1620
cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaacattac cgccatgttg acattgatta 1680
ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 1740
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 1800
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 1860
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 1920
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 1980
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 2040
attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 2100
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caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 2220
cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgggg tctctctggt 2280
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ctgctcgcct atgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 8040
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ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 10140
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<210> 18
<211> 9879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTLL-phHsp70B
<400> 18
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 60
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 120
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acacaaatgg cagtattcat ccacaatttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt 3900
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ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 240
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<210> 21
<211> 9922
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTLL-pHsp70B'2(a6)
<400> 21
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<210> 22
<211> 9869
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTLL-pHsp70B'3(a6天然)
<400> 22
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gcttcctcta cggcagcaag accttcatca accacaccca gggcatcccc gacttcttca 1980
agcagtcctt ccctgagggc ttcacatggg agagagtcac cacatacgaa gacgggggcg 2040
tgctgaccgc tacccaggac accagcctcc aggacggctg cctcatctac aacgtcaaga 2100
tcagaggggt gaacttcaca tccaacggcc ctgtgatgca gaagaaaaca ctcggctggg 2160
aggccttcac cgagacgctg taccccgctg acggcggcct ggaaggcaga aacgacatgg 2220
ccctgaagct cgtgggcggg agccatctga tcgcaaacgc caagaccaca tatagatcca 2280
agaaacccgc taagaacctc aagatgcctg gcgtctacta tgtggactac agactggaaa 2340
gaatcaagga ggccaacaac gagacctacg tcgagcagca cgaggtggca gtggccagat 2400
actgcgacct ccctagcaaa ctggggcaca agcttaatta atgtacaaat caacctctgg 2460
attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 2520
gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 2580
tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 2640
ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 2700
ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 2760
aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 2820
attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tatgttgcca 2880
cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 2940
ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc 3000
agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgctaca aggcagctgt agatcccttt 3060
catagaaggc ggcggtggta cctttaagac caatgactta caaggcagct gtagatctta 3120
gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat tcactcccaa cgaagacaag 3180
atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 3240
ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 3300
tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 3360
cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct tattattcag tatttataac 3420
ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt tattgcagct tataatggtt 3480
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 3540
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggctctag ctatcccgcc 3600
cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 3660
ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca 3720
gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc gtcgagacgt acccaattcg 3780
ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 3840
gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 3900
cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 3960
gaatggcgcg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 4020
agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 4080
tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 4140
ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 4200
cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 4260
tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 4320
tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 4380
caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttccca ggtggcactt 4440
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 4500
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 4560
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 4620
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 4680
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 4740
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 4800
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 4860
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gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 4980
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 5040
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 5100
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 5160
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cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 5400
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 5460
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ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 5580
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caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 5700
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 5760
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ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 6060
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 6120
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 6180
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caattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggagctgca agcttggcca ttgcatacgt 6660
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cgggggagaa ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa 7740
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catcaaagga tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa 7980
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tatgagggac aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt 8100
aggagtagca cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg 8160
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gcagctccag gcaagaatcc tggctgtgga aagataccta aaggatcaac agctcctggg 8400
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attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa 8580
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tatcgataag ctaattcaca aatggcagta ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg 8940
attggggggt acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact 9000
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ctgagtccca cactctcacc acccagcacc ttcaggagct gacccttaac agcttcaccc 9600
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atctttggat ccatcaacgg tgtggacttt gacatggtgg gtcagggaac cggaaatcca 10260
aatgatggat atgaggagct taaccttaag tccaccaagg gtgacctcca gttctcccca 10320
tggattcttg tccctcatat cggatatgga ttccatcagt accttcctta ccctgacggt 10380
atgtctcctt tccaggccgc catggttgat ggatccggat accaagtcca tagaacaatg 10440
cagtttgaag atggtgcctc cctt 10464
<210> 25
<211> 10193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTLL-pm3Hsp70(a1a)
<400> 25
gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 60
acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 120
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ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 240
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cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 540
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 600
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 660
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cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 900
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tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 2040
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ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 3120
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gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 3360
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 3420
tggaacagat tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac 3480
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attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct 3600
gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt 3660
tgctgtactt tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac 3720
ccacctccca accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga 3780
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caaatggcag tattcatcca caattttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca 3900
ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa 3960
attacaaaaa ttcaaaattt tcgggtttat tacagggaca gcagagatcc agtttgggaa 4020
ttagcttgag gatcctccaa gttcctaaat tagtccatga ggtcagaggc agcactgcca 4080
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tcctaaactt ggcggggaga agttttagcc cttaagtttt agcctttaac ccccatattc 4200
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gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa 3960
caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg acagcagaga tccagtttgg 4020
gaattagctt gaccccgatc tgcccgaacc ttctcccggg gtcagcgccg cgccgcgcca 4080
cccggctgca gcagcccggg cgggcgagag gctctcaact gggcgggaag gtgcgggaag 4140
gtgcggaaag gttcgcgaaa gttcgcggcc ggactagagt ggcgagatcc cccgatctgc 4200
ccgaaccttc tcccggggtc agcgccgcgc cgcgccaccc ggctgcagca gcccgggcgg 4260
gcgagaggct ctcaactggg cgggaaggtg cgggaaggtg cggaaaggtt cgcgaaagtt 4320
cgcggcaatt agcttgaccc cgatctgccc gaaccttctc ccggggtcag cgccgcgccg 4380
cgccacccgg ctgcagcagc ccgggcgggc gagaggctct caactgggcg ggaaggtgcg 4440
ggaaggtgcg gaaaggttcg cgaaagttcg cggcggcggg ggtcgggtga ggcgcaaaag 4500
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ccaccaaggg tgacctccag ttctccccat ggattcttgt ccctcatatc ggatatggat 4860
tccatcagta ccttccttac cctgacggta tgtctccttt ccaggccgcc atggttgatg 4920
gatccggata ccaagtccat agaacaatgc agtttgaaga tggtgcctcc cttactgtta 4980
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ctggaaatgg taagagatac agaagcactg ctagaaccac ctacaccttt gccaagccaa 5220
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ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 9900
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gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 10020
ggaa 10024
<210> 29
<211> 9678
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPB-CRE回路
<400> 29
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 60
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 120
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cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc 7980
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<220>
<223> SYNHSPB'3-CRE回路
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<212> DNA
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<220>
<223> 切换(mscarlet到CAR)
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ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 60
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tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata 2340
cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa 2400
ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata 2460
aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt 2520
tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca 2580
accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga 2640
gacagatcca ttcgattagt gaacggatct cgacggtatc gatctcgaca caaatggcag 2700
tattcatcca caattttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa 2760
tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa 2820
ttcaaaattt tcgggtttat tacagggaca gcagagatcc agtttgggaa ttagcttgaa 2880
agctttgcaa agatggataa agttttaaac agagaggaat ctttgcagct aatggacctt 2940
ctaggtcttg aaaggagtgg gaattggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc 3000
gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag 3060
gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg 3120
tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt 3180
tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg 3240
ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cactggctgc agtacgtgat tcttgatccc 3300
gagcttcggg ttggaagtgg gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg 3360
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tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa 3660
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tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg 4140
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caccatggtg agcaagggcg aggcagtgat caaggagttc atgcggttca aggtgcacat 4380
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ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg ctccagggcc ttcatcaagc accccgccga 4560
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gggcgacatt aagatggccc tgcgcctgaa ggacggcggc cgctacctgg cggacttcaa 4860
gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca gatgcccggc gcctacaacg tcgaccgcaa 4920
gttggacatc acctcccaca acgaggacta caccgtggtg gaacagtacg aacgctccga 4980
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cctggtacag tccgtcgtgg ccttttcctc tccttctttc gcccttcatc ccgatttctg 5220
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ctggggcatc tgcgcttcgg gagaacttca cgcttcgata agcggcgaaa tctctgggag 5460
gggcgtatgg ctggtagtgc tttctggttg ggccaggcct tctaggggtc atgttcatgt 5520
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ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggctc tagctatccc 7260
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tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt 7380
ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcgtcgaga cgtacccaat 7440
tcgccctata gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 7500
tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 7560
tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 7620
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cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 7740
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gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 7860
tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 7920
ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 7980
tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 8040
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cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 8160
tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 8220
gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc 8280
ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg 8340
cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc 8400
ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat 8460
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tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 9240
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aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 9420
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gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 9840
aaaacgccag caacgcggcc tttttac 9867
<210> 32
<211> 10091
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EF1a-aCD19
<400> 32
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 60
ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 120
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gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg 1560
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accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga 2640
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caccttcgcg cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga 3480
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tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt 4020
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ccagcaccca gaccccctac acctgctcca actatcgcaa gtcagcccct gtcactgcgc 5040
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ctggtgactg tcgccttcat tatcttctgg gtgcggagca agaggtctcg cggtgggcat 5220
tccgactaca tgaacatgac ccctagaagg cctggcccaa ccagaaagca ctaccagcca 5280
tacgcccctc ccagagattt cgccgcttat cgaagcgtga agttctcccg aagcgcagat 5340
gccccagcct atcagcaggg acagaatcag ctgtacaacg agctgaacct gggaagacgg 5400
gaggaatacg atgtgctgga caaaaggcgg ggcagagatc ctgagatggg cggcaaacca 5460
agacggaaga acccccagga aggtctgtat aatgagctgc agaaagacaa gatggctgag 5520
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taccaggggc tgagtacagc aacaaaagac acctatgacg ctctgcacat gcaggctctg 5640
ccaccaagat gactgtatat ggtgatggcc cctctccctc ccccccccct aacgttactg 5700
gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat 5760
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ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag 5880
cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc 5940
ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac 6000
ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca 6060
aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt 6120
gtatgggatc tgatctgggg cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa 6180
aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat 6240
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gagggctcca tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac 6360
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gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccggg gtctctctgg 1740
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 1800
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 1860
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 1920
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 1980
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 2040
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 2100
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 2160
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct ggcctgttag 2220
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 2280
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 2340
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 2400
agaccaccgc acagcaagcg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga tatgagggac 2460
aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt aggagtagca 2520
cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct 2580
ttgttccttg ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcctc aatgacgctg 2640
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tgctctggaa aactcatttg caccactgct gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa 2880
tctctggaac agatttggaa tcacacgacc tggatggagt gggacagaga aattaacaat 2940
tacacaagct taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa 3000
caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa cataacaaat 3060
tggctgtggt atataaaatt attcataatg atagtaggag gcttggtagg tttaagaata 3120
gtttttgctg tactttctat agtgaataga gttaggcagg gatattcacc attatcgttt 3180
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ggagagagag acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatctcgacg gtatcgatct 3300
cgacacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca 3360
gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat acaaactaaa gaattacaaa 3420
aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag ggacagcaga gatccagttt 3480
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agaacgtata aggagtttac tccctatcag tgatagagaa cgtatgacca gtttactccc 3660
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cagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagg taggcgtgta cggtgggcgc 3780
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tttgtcttat acttactagg agctcggatc caggaggatc ctccacagcc ccggggagac 3900
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ccccctggaa ggcgagtcat ggcaagactt tctgcggaac aacgccaagt cataccgctg 4620
tgctctcctc tcacatcgcg acggggctaa agtgcatctc ggcacccgcc caacagagaa 4680
acagtacgaa accctggaaa atcagctcgc gttcctgtgt cagcaaggct tctccctgga 4740
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cggcctggaa ctaatcatat gtggcctgga gaaacagcta aagtgcgaaa gcggcgggcc 4980
gaccgacgcc cttgacgatt ttgacttaga catgctccca gccgatgccc ttgacgactt 5040
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ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc 5460
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accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac aaccatggtg 5700
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accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 5940
gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 6000
gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 6060
cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 6120
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gtggcctaca tagccttcaa gaggtggaac agctgacctt tcatagaagg cggcggtggt 7560
acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa 7620
ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac 7680
tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 7740
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cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 8040
catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg 8100
ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag 8160
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gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 8760
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tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 8940
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cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 9300
accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 9360
cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 9420
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ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 10020
<210> 35
<211> 9362
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 前馈HSP16F
<400> 35
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 60
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 120
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 180
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 240
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tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 360
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catgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 1260
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actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta ttacagggac 3540
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gcccttggac accatggtgt cttgaagttt agagaatgaa cagtaagcac ttgaacaaag 3660
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<223> 具有gfp kozak 10%的前馈HSPB
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acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 840
tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta 900
ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg 960
ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcgcg caattaaccc 1020
tcactaaagg gaacaaaagc tggagctgca agcttggcca ttgcatacgt tgtatccata 1080
tcataatatg tacatttata ttggctcatg tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt 1140
attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 1200
gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 1260
cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 1320
acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 1380
tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 1440
ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 1500
tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 1560
acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 1620
tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 1680
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ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 1800
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 1860
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 1920
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ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 2160
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agaccaccgc acagcaagcg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga tatgagggac 2460
aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt aggagtagca 2520
cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct 2580
ttgttccttg ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcctc aatgacgctg 2640
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caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa cataacaaat 3060
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aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag ggacagcaga gatccagttt 3480
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attactcaat ggagtcggta tcgaaggcct gacgacaagg aaactcgctc aaaagctggg 4080
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gcaagacttt ctgcggaaca acgccaagtc ataccgctgt gctctcctct cacatcgcga 4260
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tgacgctctt gacgattttg accttgacat gctccccggg taagtcagat taggccctgg 4740
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acacccccag agggctcgga cagcacagcc cccagcaccc aggagcctga ggcacctcca 6840
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tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca 7140
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gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata 7380
acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag cttataatgg 7440
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tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct agctatcccg 7560
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gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 9360
ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 9420
taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 9480
agaaaagatc aaaggatctt c 9501
<210> 38
<211> 9489
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有gfp kozak 75%的前馈HSPB
<400> 38
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120
cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360
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cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 660
gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 720
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acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 840
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tcactaaagg gaacaaaagc tggagctgca agcttggcca ttgcatacgt tgtatccata 1080
tcataatatg tacatttata ttggctcatg tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt 1140
attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 1200
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tcggatgggt tgagccatgt ctagactgga caagagcaaa gtcataaact ctgctctgga 4020
attactcaat ggagtcggta tcgaaggcct gacgacaagg aaactcgctc aaaagctggg 4080
agttgagcag cctaccctgt actggcacgt gaagaacaag cgggccctgc tcgatgccct 4140
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<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 前馈HSPB'1
<400> 39
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<223> 前馈SYNHSPB'3
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cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 600
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 660
gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 720
ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat 780
acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 840
tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta 900
ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg 960
ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcgcg caattaaccc 1020
tcactaaagg gaacaaaagc tggagctgca agcttggcca ttgcatacgt tgtatccata 1080
tcataatatg tacatttata ttggctcatg tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt 1140
attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 1200
gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 1260
cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 1320
acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 1380
tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 1440
ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 1500
tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 1560
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tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 1680
gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccggg gtctctctgg 1740
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 1800
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 1860
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acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 1980
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 2040
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ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 2160
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tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 2400
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cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct 2580
ttgttccttg ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcctc aatgacgctg 2640
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caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa cataacaaat 3060
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<210> 41
<211> 10636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPB'1-CAR
<400> 41
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cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg ccttacccat acgatgttcc 4620
agattacgct gacattcaga tgactcagac cacaagcagc ctcagtgcga gcctggggga 4680
cagggtgact atcagctgcc gggccagcca ggacatttcc aagtacctga attggtacca 4740
gcagaagccc gatggtactg tgaaactcct gatatatcat acttctaggc tccattccgg 4800
ggttccaagc cgattcagtg gctccggttc cggtacagat tattccctga ccattagcaa 4860
cttggaacag gaggacattg caacgtattt ctgtcagcaa ggcaacacat tgccctacac 4920
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cggcggtgga ggatcagaag tgaagctgca ggaaagtggc cccgggctgg tagccccaag 5040
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<210> 42
<211> 10581
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSPB-CAR
<400> 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<210> 44
<211> 9968
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSP nanodeg+GFP振荡器回路
<400> 44
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 60
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cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 420
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 480
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 540
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 600
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 660
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 720
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 780
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 840
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 900
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 960
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 1020
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 1080
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 1140
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 1200
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 1260
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 1320
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 1380
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 1440
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 1500
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct 1560
cactaaaggg aacaaaagct ggagctgcaa gcttggccat tgcatacgtt gtatccatat 1620
cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaacattac cgccatgttg acattgatta 1680
ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 1740
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 1800
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 1860
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 1920
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 1980
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 2040
attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 2100
cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 2160
caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 2220
cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgggg tctctctggt 2280
tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 2340
aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 2400
actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 2460
cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc 2520
tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac 2580
tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat 2640
tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 2700
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 2760
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 2820
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 2880
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 2940
gaccaccgca cagcaagcgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca 3000
attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac 3060
ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt 3120
tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcctca atgacgctga 3180
cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg 3240
ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg 3300
caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt 3360
gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat 3420
ctctggaaca gattggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta 3480
cacaagctta atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca 3540
agaattattg gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg 3600
gctgtggtat ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt 3660
ttttgctgta ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca 3720
gacccacctc ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg 3780
agagagagac agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatctcg 3840
acacaaatgg cagtattcat ccacaatttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt 3900
gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa 3960
caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg acagcagaga tccagtttgg 4020
gaattagctt gaccccgatc tgcccgaacc ttctcccggg gtcagcgccg cgccgcgcca 4080
cccggctgca gcagcccggg cgggcgagag gctctcaact gggcgggaag gtgcgggaag 4140
gtgcggaaag gttcgcgaaa gttcgcggcc ggactagagt ggcgagatcc cccgatctgc 4200
ccgaaccttc tcccggggtc agcgccgcgc cgcgccaccc ggctgcagca gcccgggcgg 4260
gcgagaggct ctcaactggg cgggaaggtg cgggaaggtg cggaaaggtt cgcgaaagtt 4320
cgcggcaatt agcttgaccc cgatctgccc gaaccttctc ccggggtcag cgccgcgccg 4380
cgccacccgg ctgcagcagc ccgggcgggc gagaggctct caactgggcg ggaaggtgcg 4440
ggaaggtgcg gaaaggttcg cgaaagttcg cggcggcggg ggtcgggtga ggcgcaaaag 4500
gataaaaagc cggtggaagc ggagctgagc agatccgagc cgggctggct gcagagaaac 4560
cgcagggaga gcctcactgc tgagcgcccc tcgacggcgg agcggcagca gcctccgtgg 4620
cctccagcat ccgacaagaa gcttcacgga tgatgaaaat ggagactgac aaaataatgg 4680
acgaaaccaa ctccaatgca caggccttca caaccactat gctgtacgac ccggtgcgca 4740
agaaagactc atcgcccacc taccaaacgg agcgggaact ctgctttcag tacttcaccc 4800
agtggagcga gtcgggccag gtggactttg tggagcacct gctgtcgcgc atgtgccact 4860
atcaacacgg acagatcaat gcctatctca agccgatgct ccagcgggac tttatcacat 4920
tgctgccaat caagggtctg gatcacatcg cagaaaacat tttgtcgtac ttggatgccg 4980
aatcgctcaa atcatccgag ctggtctgca aggaatggct gcgcgtcatt tccgagggca 5040
tgctctggaa gaagctcatc gaacgcaagg tgcgcacaga ttccttgtgg cgcggactgg 5100
ccgagcggcg taattggatg cagtacctct tcaagccaag accgggccag actcaacggc 5160
cacactcatt ccatcgcgag ttgttcccca agataatgaa tgacattgac agcatagaga 5220
acaactggcg gactggccgc cacctcgaga tggatcaagt ccaactggtg gagtctggtg 5280
gcgctttggt gcagccaggt ggctctctgc gtttgtcctg tgccgcttct ggcttcccag 5340
tgaaccgcta ttccatgcgc tggtatcgcc aggctccagg caaagagcgt gagtgggtag 5400
ccggtatgtc cagcgcgggt gatcgtagct cctatgaaga ctccgtgaag ggccgtttca 5460
ccatcagccg tgacgatgcc cgtaacacgg tgtatctgca aatgaacagc ttgaaacctg 5520
aagatacggc cgtgtattac tgtaatgtga acgtgggctt cgagtattgg ggccaaggca 5580
cccaggtcac cgtctccagc taaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc 5640
ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt 5700
ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg 5760
ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg 5820
ccgccagaac acaggtgacc ggtcgccacc atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg 5880
cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg ccttacccat acgatgttcc agattacgct 5940
gacattcaga tgactcagac cacaagcagc ctcagtgcga gcctggggga cagggtgact 6000
atcagctgcc gggccagcca ggacatttcc aagtacctga attggtacca gcagaagccc 6060
gatggtactg tgaaactcct gatatatcat acttctaggc tccattccgg ggttccaagc 6120
cgattcagtg gctccggttc cggtacagat tattccctga ccattagcaa cttggaacag 6180
gaggacattg caacgtattt ctgtcagcaa ggcaacacat tgccctacac attcgggggc 6240
gggactaaac tcgaaataac tggcggcggg ggttctggtg gcggcggcag cggcggtgga 6300
ggatcagaag tgaagctgca ggaaagtggc cccgggctgg tagccccaag tcagtccctg 6360
agtgtaacct gtacagtgag tggagtgtct cttcctgact acggggtaag ttggattcgg 6420
caacctccac gcaagggcct ggagtggctc ggcgtgattt ggggatctga gacaacttac 6480
tacaattccg ccctgaagag caggctgacc atcattaagg acaatagcaa gtcacaggtg 6540
tttctgaaga tgaactcact gcagaccgac gacaccgcca tctattactg cgccaaacat 6600
tattattatg gcgggagtta tgctatggac tactggggcc agggcactag cgtcaccgtc 6660
agcagtacta caactccagc acccagaccc cctacacctg ctccaactat cgcaagtcag 6720
cccctgtcac tgcgccctga agcctgtcgc cctgctgccg ggggagctgt gcatactcgg 6780
ggactggact ttgcctgtga tatctacttc tgggtgctgg tcgtggtcgg aggggtgctg 6840
gcctgttata gcctgctggt gactgtcgcc ttcattatct tctgggtgcg gagcaagagg 6900
tctcgcggtg ggcattccga ctacatgaac atgaccccta gaaggcctgg cccaaccaga 6960
aagcactacc agccatacgc ccctcccaga gatttcgccg cttatcgaag cgtgaagttc 7020
tcccgaagcg cagatgcccc agcctatcag cagggacaga atcagctgta caacgagctg 7080
aacctgggaa gacgggagga atacgatgtg ctggacaaaa ggcggggcag agatcctgag 7140
atgggcggca aaccaagacg gaagaacccc caggaaggtc tgtataatga gctgcagaaa 7200
gacaagatgg ctgaggccta ctcagaaatc gggatgaagg gcgaaagaag gagaggaaaa 7260
ggccacgacg gactgtacca ggggctgagt acagcaacaa aagacaccta tgacgctctg 7320
cacatgcagg ctctgccacc aagaatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 7380
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 7440
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 7500
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 7560
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 7620
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 7680
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 7740
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 7800
atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 7860
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 7920
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 7980
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 8040
ggcatggacg agctgtacaa gtaatggaag ggctaattca ctcccaacga agacaagatc 8100
tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg 8160
gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag 8220
tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag 8280
tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat tattcagtat ttataacttg 8340
caaagaaatg aatatcagag agtgagagga acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 8400
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 8460
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct 8520
aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 8580
actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa 8640
gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcgtc gagacgtacc caattcgccc 8700
tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 8760
aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 8820
aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 8880
tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 8940
gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 9000
ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 9060
cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt 9120
agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt 9180
aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt 9240
gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 9300
aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcccaggt ggcacttttc 9360
ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 9420
cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 9480
gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 9540
ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 9600
tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 9660
aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 9720
ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 9780
agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 9840
gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 9900
gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 9960
gttgggaa 9968

Claims (99)

1.一种核酸组合物，包含：
(a)可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因的转录，以产生有效载荷转录物；或者
(b)可操作地连接至包含反式激活因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，
其中所述第一诱导型启动子能够在存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下诱导所述反式激活因子基因的转录以产生反式激活因子转录物，
其中所述反式激活因子转录物能够被翻译以产生反式激活因子；并且
其中，在存在所述反式激活因子和反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
2.一种核酸组合物，包含：
各自可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸和包含反式激活因子基因的第二多核苷酸的第一诱导型启动子和第二启动子，
其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因和反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，
其中，在存在所述反式激活因子和反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，并且
其中所述多顺反子转录物能够被翻译以产生反式激活因子和有效载荷蛋白和/或有效载荷RNA剂。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二启动子包含反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中所述反式激活因子在不存在所述反式激活因子结合化合物的情况下不能结合所述反式激活因子识别序列，任选地所述反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝包括tet操纵基因(TetO)的一个或更多个拷贝。
4.一种核酸组合物，包含：
(a)可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因的转录，以产生有效载荷转录物；或者
(b)可操作地连接至包含反式激活因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，和可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，
其中所述第一诱导型启动子能够在存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下诱导所述反式激活因子基因的转录以产生反式激活因子转录物，
其中所述第二启动子包含反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中所述反式激活因子在存在所述反式激活因子结合化合物的情况下不能结合所述反式激活因子识别序列，
其中所述反式激活因子转录物能够被翻译以产生反式激活因子；并且
其中，在存在所述反式激活因子但不存在反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
5.一种核酸组合物，包含：
各自可操作地连接至包含有效载荷基因的第一多核苷酸和包含反式激活因子基因的第二多核苷酸的第一诱导型启动子和第二启动子，
其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述有效载荷基因和反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，
其中所述第二启动子包含反式激活因子能够结合以诱导转录的反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝，并且其中所述反式激活因子在存在所述反式激活因子结合化合物的情况下不能结合所述反式激活因子识别序列，
其中，在存在所述反式激活因子但不存在反式激活因子结合化合物的情况下，所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因和所述反式激活因子基因的转录以产生多顺反子转录物，并且
其中所述多顺反子转录物能够被翻译以产生反式激活因子和有效载荷蛋白和/或有效载荷RNA剂。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的核酸组合物，其中所述反式激活因子识别序列的一个或更多个拷贝包括tet操纵基因(TetO)的一个或更多个拷贝。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二启动子包括四环素应答元件(TRE)，并且其中所述TRE包括tet操纵基因(TetO)的一个或更多个拷贝。
8.根据权利要求1-3或7中任一项所述的核酸组合物，其中所述反式激活因子包括反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)。
9.根据权利要求3-7中任一项所述的核酸组合物，其中所述反式激活因子包括四环素控制的反式激活因子(tTA)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的核酸组合物，其中所述反式激活因子结合化合物包括四环素、多西环素或其衍生物。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的核酸组合物，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸可操作地连接至串联基因表达元件，任选地所述串联基因表达元件是内部核糖体进入位点(IRES)、口蹄疫病毒2A肽(F2A)、马鼻炎A型病毒2A肽(E2A)、猪捷申病毒2A肽(P2A)或东亚细亚病毒2A肽(T2A)或其任何组合。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷蛋白和所述反式激活因子被表达为单独的蛋白。
13.一种核酸组合物，包含：
可操作地连接至包含嵌合抗原受体(CAR)基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导CAR基因的转录，以产生CAR转录物，其中所述CAR转录物能够被翻译以产生CAR，并且其中所述CAR的接合产生免疫细胞刺激，并且从而诱导所述第一诱导型启动子。
14.一种核酸组合物，包含：
可操作地连接至包含重组酶基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，
其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述重组酶基因的转录以产生重组酶转录物，
并且其中所述重组酶转录物能够被翻译以产生重组酶；
第三启动子和包含有效载荷基因的第二多核苷酸，
其中，在不存在重组事件的情况下，所述第三启动子和所述第二多核苷酸不被可操作地连接，
其中所述重组酶能够催化所述重组事件，并且
其中所述第三启动子和所述第二多核苷酸在所述重组事件之后被可操作地连接，使得所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物。
15.根据权利要求14所述的核酸组合物，其中所述重组事件包括去除侧翼为重组酶靶位点的序列或使侧翼为重组酶靶位点的序列倒位，任选地所述第二多核苷酸侧翼为重组酶靶位点，还任选地在所述重组事件之前，所述有效载荷基因的序列相对于所述启动子是倒位的。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的核酸组合物，包含位于所述第三启动子与所述有效载荷基因之间的至少一个终止盒，其中所述终止盒包括一个或更多个终止序列，并且其中所述一个或更多个终止盒侧翼为重组酶靶位点。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷转录物能够被翻译以产生有效载荷蛋白。
18.根据权利要求16-17中任一项所述的核酸组合物，其中所述至少一个终止盒被配置为防止所述有效载荷基因的转录和/或所述有效载荷转录物的翻译，任选地所述一个或更多个终止序列包括多腺苷酸化信号、终止密码子、移码突变或其任何组合。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的核酸组合物，其中
(a)所述第三启动子包括遍在性启动子，任选地，所述遍在性启动子选自包括以下的组：巨细胞病毒(CMV)介导的早期启动子、CMV启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)LTR、RSV启动子、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自痘苗病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长响应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β驱动蛋白(β-KIN)、人类ROSA 26基因座、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、3-磷酸甘油酸激酶启动子、巨细胞病毒增强子、人类β肌动蛋白(HBA)启动子、鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、CAG启动子、CBH启动子或其任何组合；
(b)所述重组酶是Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022、HP1、γ6、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1、R4及其衍生物或其任何组合；
(c)所述重组酶是Flp重组酶，并且所述重组酶靶位点是FRT位点；和/或
(d)所述重组酶是Cre重组酶，并且所述重组酶靶位点为loxP位点。
20.一种核酸组合物，包含：
可操作地连接至包含活性调控因子基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，
其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导活性调控因子基因的转录以产生活性调控因子转录物，
其中所述活性调控因子转录物能够被翻译和/或加工以产生活性调控因子；并且
其中所述活性调控因子能够降低T细胞活性。
21.根据权利要求20所述的核酸组合物，其中所述活性调控因子：
(a)包括参与TCR/CAR信号转导的选自包括以下的组的泛素连接酶：c-CBL、CBL-B、ITCH、R F125、R F128、WWP2或其任何组合；
(b)包括选自包括以下的组的负性调控酶：SHP1、SHP2、SHTP1、SHTP2、CD45、CSK、CD148、PTPN22、DGKα、DGKζ、DRAK2、HPK1、HPK1、STS1、STS2、SLAT或其任何组合；
(c)包括选自包括以下的组的负性调控支架/衔接蛋白：PAG、LIME、NTAL、LAX31、SIT、GAB2、GRAP、ALX、SLAP、SLAP2、DOK1、DOK2或其任何组合；
(d)包括选自包括以下的组的激活TCR信号传导组分的显性负性形式：ZAP70、LCK、FYN、NCK、VAV1、SLP76、ITK、ADAP、GADS、PLCγ1、LAT、p85、SOS、GRB2、NFAT、p50、p65、API、RAPl、CRKII、C3G、WAVE2、ARP2/3、ABL、ADAP、RIAM、SKAP55或其任何组合；
(e)包括选自包括以下的组的负性共调控受体的胞质尾部：CD5、PD1、CTLA4、BTLA、LAG3、B7-H1、B7-1、CD160、TFM3、2B4、TIGIT或其任何组合；
(f)以来源于LAT、PAG、LCK、FYN、LAX、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8a、PD1、SRC、LYN或其任何组合的靶向序列靶向质膜；和/或
(g)降低或消除选自包括以下的组的途径和/或功能：Ras信号传导、PKC信号传导、钙依赖性信号传导、NF-κB信号传导、NFAT信号传导、细胞因子分泌、T细胞存活、T细胞增殖、CTL活性、脱粒、肿瘤细胞杀伤、分化或其任何组合。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的核酸组合物，还包含可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物，其中所述有效载荷转录物能够被翻译以产生有效载荷蛋白。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的核酸组合物，其中所述第一诱导型启动子感测T细胞活性，任选地T细胞活性包括T细胞刺激、T细胞激活、细胞因子分泌、T细胞存活、T细胞增殖、CTL活性、T细胞脱粒和T细胞分化中的一种或更多种。
24.一种核酸组合物，包含：
可操作地连接至包含振荡器基因的第一多核苷酸的第一诱导型启动子，
其中所述第一诱导型启动子能够在热刺激和/或免疫细胞刺激后诱导所述振荡器基因的转录以产生振荡器转录物，
其中所述振荡器转录物能够被翻译和/或加工以产生振荡器；以及
可操作地连接至包含有效载荷基因的第二多核苷酸的第二启动子，其中所述第二启动子能够诱导所述有效载荷基因的转录以产生有效载荷转录物，其中所述有效载荷转录物能够被翻译以产生有效载荷蛋白，并且
其中所述振荡器能够调节所述有效载荷转录物和/或所述有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性。
25.根据权利要求24所述的核酸组合物，其中：
(a)所述有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性与所述振荡器的浓度、定位、稳定性和/或活性呈负相关；和/或
(b)所述振荡器的浓度、定位、稳定性和/或活性与所述有效载荷蛋白的浓度、定位、稳定性和/或活性呈负相关。
26.根据权利要求24-25中任一项所述的核酸组合物，其中所述振荡器基因编码siRNA、shRNA、反义RNA寡核苷酸、反义miRNA、反式剪接RNA、引导RNA、单引导RNA、crRNA、tracrRNA、反式剪接RNA、pre-mRNA、mRNA或其任何组合。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的核酸组合物，其中所述振荡器包括蛋白酶，任选地所述蛋白酶包括烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、烟草脉斑病毒(TVMV)蛋白酶、丙型肝炎病毒蛋白酶(HCVP)、其衍生物或其任何组合，还任选地所述有效载荷蛋白包括降解决定子和所述蛋白酶能够切割以暴露所述降解决定子的切割位点，并且其中有效载荷蛋白的降解决定子被暴露将所述有效载荷蛋白改变为有效载荷蛋白不稳定状态。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷蛋白包括笼形多肽，其中所述笼形多肽包括：
(a)螺旋束，包括2个与7个之间的α-螺旋，其中所述螺旋束包括：
(i)结构区；和
(ii)闩锁区，其中所述闩锁区包括位于所述闩锁区内的降解决定子，其中所述结构区与所述闩锁区相互作用以防止所述降解决定子的活性；以及
(b)连接每个α螺旋的氨基酸接头，
任选地，所述振荡器包括能够与笼形多肽结构区结合的钥匙形多肽，从而置换所述闩锁区并激活所述降解决定子。
29.根据权利要求24-28中任一项所述的核酸组合物，其中所述振荡器包括沉默子效应物，并且其中：
(a)所述沉默子效应物包括微RNA(miRNA)、前体微RNA(pre-miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、其前体、其衍生物或其组合；
(b)所述有效载荷基因包含3’UTR和/或5’UTR，并且其中所述有效载荷基因的3’UTR和/或5’UTR包含一个或更多个沉默子效应物结合序列；
(c)所述沉默子效应物能够结合一个或更多个沉默子效应物结合序列，从而降低所述有效载荷转录物的稳定性和/或降低所述有效载荷转录物的翻译；
(d)所述一个或更多个沉默子效应物结合序列包含miRNA结合位点；
(e)所述有效载荷基因包含约1个沉默子效应物结合序列至约10个沉默子效应物结合序列；
(f)所述一个或更多个沉默子效应物结合序列的长度是约8个核苷酸至约22个核苷酸；
(g)所述沉默子效应物包括与所述一个或更多个沉默子效应物结合序列的至少5个连续核苷酸互补的互补区；和/或
(h)所述沉默子效应物包括与所述一个或更多个沉默子效应物结合序列至少约50％的互补性。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的核酸组合物，其中免疫细胞刺激包括通过刺激分子与其在免疫细胞表面上的同源配体的结合诱导的信号转导，任选地所述同源配体是CAR或TCR。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的核酸组合物，其中热刺激包括加热至激活温度，任选地，所述激活温度是约37.5℃、约38.0℃、约38.5℃、约39.0℃、约39.5℃、约40.0℃、约40.5℃、约41.0℃、约41.5℃、约42.0℃、约42.5℃、约43.0℃、约43.5℃、约44.0℃、约44.5℃、约45.0℃、约45.5℃或约46.0℃。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的核酸组合物，其中，在不存在热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下，所述有效载荷蛋白在免疫细胞中达到未刺激的稳态有效载荷蛋白水平，任选地，未刺激的稳态有效载荷蛋白水平不足以对所述免疫细胞产生表型效应和/或治疗效应。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸组合物，其中在热刺激和/或免疫细胞刺激后，来自所述第一诱导型启动子的有效载荷基因、反式激活因子基因、振荡器基因和/或重组酶基因的转录增加至少1.1倍。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷转录物的稳态水平、反式激活因子转录物的稳态水平、重组酶转录物的稳态水平、振荡器转录物的稳态水平和/或所述多顺反子转录物的稳态水平在热刺激和/或免疫细胞刺激后高至少1.1倍。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的核酸组合物，其中，在热刺激和/或免疫细胞刺激后，所述有效载荷蛋白在免疫细胞中达到刺激的稳态有效载荷蛋白水平，任选地，所述有效载荷蛋白不回到未受刺激的稳态有效载荷蛋白水平。
36.根据权利要求35所述的核酸组合物，其中刺激的稳态有效载荷蛋白水平比未刺激的稳态有效载荷蛋白水平高至少1.1倍，任选地，其中增加反式激活因子结合化合物浓度增加刺激的稳态有效载荷蛋白水平。
37.根据权利要求35-36中任一项所述的核酸组合物，。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的核酸组合物，其中，在第一持续时间之后，所述有效载荷蛋白从刺激的稳态有效载荷蛋白水平回到未刺激的稳态有效载荷蛋白水平，其中所述第一持续时间是约250小时、约200小时、约150小时、约96小时、约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的核酸组合物，其中：
(a)刺激的稳态有效载荷蛋白水平能够通过将一个或更多个非典型氨基酸取代引入到所述沉默子效应物结合序列、所述切割位点和/或所述降解决定子中来增加；和/或
(a)刺激的稳态有效载荷蛋白水平能够通过将一个或更多个典型氨基酸取代引入到所述沉默子效应物结合序列、所述切割位点和/或所述降解决定子中来降低。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的核酸组合物，其中，在存在连续热刺激和/或免疫细胞刺激的情况下，稳态有效载荷蛋白水平在调节表达范围的下限调节阈值与上限调节阈值之间振荡。
41.根据权利要求40所述的核酸组合物，其中：(a)所述调节表达范围的下限未调节阈值与上限未调节阈值之间的差异大于约一个数量级；或者(b)所述调节表达范围的下限调节阈值与上限调节阈值之间的差异小于约一个数量级。
42.根据权利要求40-41中任一项所述的核酸组合物，其中调节表达范围的所述下限调节阈值和/或所述上限调节阈值能够通过将一个或更多个非典型氨基酸取代引入所述沉默子效应物结合序列、所述切割位点和/或所述降解决定子中来增加。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的核酸组合物，其中调节表达范围的所述下限调节阈值和/或所述上限调节阈值能够通过将一个或更多个典型氨基酸取代引入所述沉默子效应物结合序列、所述切割位点和/或所述降解决定子中来降低。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的核酸组合物，其中所述第一诱导型启动子包括或来源于哺乳动物热休克启动子(HSP)或秀丽线虫(C.Elegans)HSP，任选地所述哺乳动物HSP是人类HSP或小鼠HSP。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的核酸组合物，其中所述第一诱导型启动子包括：
(a)与SEQ ID NO:1-14至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列；
(b)一个或更多个AP-1位点；
(c)双向启动子，任选地最小双向启动子；和/或
(d)一个或更多个热休克元件(HSE)结合位点，任选地四个HSE结合位点。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的核酸组合物，其中所述第一诱导型启动子不包括(a)除了一个或更多个HSE结合位点之外的人类转录因子结合位点；和/或(b)AP-1位点。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的核酸组合物，还包含5’ITR、3’ITR、5’LTR、3’LTR、转录物稳定元件或其任何组合，任选地所述转录物稳定元件包括土拨鼠肝炎翻译后调控元件(WPRE)、牛生长激素多腺苷酸化(bGH-polyA)信号序列、人类生长激素多腺苷酸化(hGH-polyA)信号序列或其任何组合。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的核酸组合物，其中：
所述有效载荷基因包括5'UTR和/或3'UTR；
所述反式激活因子基因包括5'UTR和/或3'UTR；
所述重组酶基因包括5'UTR和/或3'UTR；和/或
所述振荡器基因包括5'UTR和/或3'UTR。
49.根据权利要求48所述的核酸组合物，其中所述5’UTR包括Kozak序列，任选地刺激的稳态有效载荷蛋白水平、未刺激的稳态有效载荷蛋白水平、所述下限调节阈值和/或所述上限调节阈值能够通过调节所述Kozak序列的存在和/或序列来调节。
50.根据权利要求48-49中任一项所述的核酸组合物，其中所述5’UTR包括一个或更多个微开放阅读框，任选地刺激的稳态有效载荷蛋白水平、未刺激的稳态有效载荷蛋白水平、所述下限调节阈值和/或所述上限调节阈值能够通过调节所述一个或更多个微开放阅读框的存在和/或序列来调节。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷基因编码有效载荷蛋白，任选地刺激的稳态有效载荷蛋白水平、未刺激的稳态有效载荷蛋白水平、所述下限调节阈值和/或所述上限调节阈值能够通过调节所述串联基因表达元件的存在和/或序列来调节。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷基因编码有效载荷RNA剂，其中所述有效载荷RNA剂包括以下中的一种或更多种：dsRNA、siRNA、shRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA、snoRNA、siRNA、shRNA、反义RNA寡核苷酸、反义miRNA、反式剪接RNA、引导RNA、单引导RNA、crRNA、tracrRNA、反式剪接RNA、pre-mRNA、mRNA或其任何组合。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷蛋白包括：
(a)细胞因子，任选地所述细胞因子选自由以下组成的组：白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、M-CSF、SCF、TSLP、抑癌蛋白M、白血病抑制因子(LIF)、CNTF、心肌营养因子-1、NNT-1/BSF-3、生长激素、催乳素、促红细胞生成素、血小板生成素、瘦素、G-CSF或其受体或配体；
(b)选自由以下组成的组的TGF-β/BMP家族的成员：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3a、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8a、BMP-8b、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15、BMP-16、子宫内膜出血相关因子(EBAF)、生长分化因子-1(GDF-1)、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-12、GDF-14、米勒管抑制物质(MIS)、激活蛋白-1、激活蛋白-2、激活蛋白-3、激活蛋白-4和激活蛋白-5；
(c)选自由以下组成的组的细胞因子TNF家族的成员：TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD 27配体、CD 30配体和4-1BBL；
(d)选自由以下组成的组的细胞因子免疫球蛋白超家族的成员：B7.1(CD80)和B7.2(B70)；
(e)干扰素，任选地所述干扰素选自α干扰素、β干扰素或γ干扰素；
(f)趋化因子，任选地所述趋化因子选自CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、淋巴细胞趋化因子(XCL1)、嗜酸性粒细胞趋化因子、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13或CXCL15；
(g)白细胞介素，任选地所述白细胞介素选自IL-10、IL-12、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-18或IL-21；
(h)肿瘤坏死因子(TNF)，任选地所述TNF选自TNFα、TNFβ、TNFγ、CD252、CD154、CD178、CD70、CD153或4-1BBL；和/或
(i)局部下调内源免疫细胞活性的因子。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷蛋白能够重塑肿瘤微环境和/或降低受试者靶部位处的免疫抑制。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷蛋白包括嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，任选地所述CAR或TCR包括先导肽，任选地所述TCR包括恒定区和/或CDR4。
56.根据权利要求55所述的核酸组合物，其中所述CAR和/或TCR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域中的一个或更多个，任选地所述抗原结合结构域通过铰链区连接至所述跨膜结构域。
57.根据权利要求56所述的核酸组合物，其中所述细胞内信号传导结构域包括初级信号传导结构域、共刺激结构域或初级信号传导结构域和共刺激结构域两者。
58.根据权利要求57所述的核酸组合物，其中：
(a)所述初级信号传导结构域包括选自由以下组成的组的一种或更多种蛋白的功能信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、共同FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12或其功能变体；和/或
(b)所述共刺激结构域包括选自由以下组成的组的一种或更多种蛋白的功能结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD28-OX40、CD28-4-1BB、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D或其功能变体。
59.根据权利要求56-58中任一项所述的核酸组合物，其中所述抗原结合域结合肿瘤抗原，任选地所述肿瘤抗原是实体瘤抗原，任选地所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞黏附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关黏蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞黏附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚基β型9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰基Lewis黏附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关物(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类第5组成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ可变阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人类端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；成对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(印迹位点的BORIS或Brother调控因子)、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在性1(RU1)；肾遍在性2(RU2)；豆荚蛋白；人类乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人类乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的黏蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、CD150、5T4、ActRIIA、B7、BMCA、CA-125、CCNA1、CD123、CD126、CD138、CD14、CD148、CD15、CD19、CD20、CD200、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD261、CD262、CD30、CD33、CD362、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD46、CD5、CD52、CD53、CD54、CD56、CD66a-d、CD74、CD8、CD80、CD92、CE7、CS-1、CSPG4、ED-B纤连蛋白、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、GD2、GD3、HER1-HER2组合、HER2-HER3组合、HERV-K、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、HLA-DR、HM1.24、HMW-MAA、Her2、Her2/neu、IGF-1R、IL-11Rα、IL-13R-α2、IL-2、IL-22R-α、IL-6、IL-6R、Ia、Ii、L1-CAM、L1细胞黏附分子，Lewis Y、L1-CAM、MAGE A3、MAGE-A1、MART-1、MUC1、NKG2C配体、NKG2D配体、NY-ESO-1、OEPHa2、PIGF、PSCA、PSMA、ROR1、T101、TAC、TAG72、TIM-3、TRAIL-R1、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、VEGF、VEGFR2、WT-1、G蛋白偶联受体、甲胎蛋白(AFP)、血管生成因子、外源同源结合分子(ExoCBM)、癌基因产物、抗叶酸受体、c-Met、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白(D1)、人肝配蛋白B2、上皮肿瘤抗原、雌激素受体、胎儿乙酰胆碱e受体、叶酸结合蛋白、gp100、乙肝表面抗原、κ链、κ轻链、kdr、λ链、生存蛋白、黑素瘤相关抗原、间皮素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、黏蛋白16(MUC16)、突变p53、突变ras、坏死抗原、癌胎抗原、ROR2、孕酮受体、前列腺特异性抗原、tEGFR、生腱蛋白、β2-微球蛋白、Fc受体样5(FcRL5)或HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的核酸组合物，其中所述抗原结合结构域包括抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab′)2、单结构域抗体(SDAB)、VH结构域或VL结构域、骆驼VHH结构域、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、由抗体片段形成的双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、抗运载蛋白、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体或其任何组合。
61.根据权利要求56-60中任一项所述的核酸组合物，其中所述跨膜结构域包括选自由以下组成的组的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C或其功能变体。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的核酸组合物，其中所述有效载荷蛋白包括降解决定子，任选地，所述有效载荷蛋白的稳态水平能够通过改变所述降解决定子的序列来改变。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的核酸组合物，还包含一个或更多个第二转基因，其中所述一个或更多个第二转基因编码一个或更多个第二有效载荷RNA剂和/或一个或更多个第二有效载荷蛋白。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的核酸组合物，其中所述核酸组合物包含一种或更多种载体；任选地，所述一种或更多种载体中的至少一种是病毒载体、质粒、裸露DNA载体、脂质纳米颗粒或其任何组合；并且还任选地所述病毒载体是AAV载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、整合缺陷慢病毒(IDLV)载体。
65.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-63中任一项所述的核酸组合物，其中所述组合物包含一种或更多种载体、核糖核蛋白(RNP)复合物、脂质体、纳米颗粒、外泌体、微囊泡或其任何组合，任选地所述载体是病毒载体、质粒、裸露DNA载体、脂质纳米颗粒或其任何组合，任选地所述病毒载体是AAV载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、整合缺陷慢病毒(IDLV)载体，还任选地所述AAV载体包括单链AAV(ssAAV)载体或自互补AAV(scAAV)载体。
66.一种热启动免疫细胞，所述热启动免疫细胞包含权利要求1-64中任一项所述的核酸组合物。
67.根据权利要求66所述的热启动免疫细胞，其中所述免疫细胞是哺乳动物细胞，任选地所述哺乳动物细胞是人类细胞，还任选地所述免疫细胞来源于血液、脐带血、骨髓或iPSC。
68.根据权利要求66-67中任一项所述的热启动免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞，任选地所述T细胞是原代T细胞、自体T细胞、异体T细胞或其任何组合。
69.根据权利要求66-68中任一项所述的热启动免疫细胞，其中单次热刺激足以起始免疫细胞激活驱动的有效载荷表达的正反馈环。
70.根据权利要求66-69中任一项所述的热启动免疫细胞的群体。
71.根据权利要求70所述的群体，其中所述有效载荷包括CAR和/或TCR，其中响应于所述CAR和/或所述TCR连续接合持续至少约24小时，所述热启动免疫细胞的群体的至少约5％具有在约下限调节阈值处的稳态有效载荷蛋白水平，并且所述热启动免疫细胞的群体的至少约5％具有在约上限调节阈值处的稳态有效载荷蛋白水平。
72.根据权利要求70-71中任一项所述的群体，其中所述有效载荷包括CAR和/或TCR，并且其中响应于所述CAR和/或TCR连续接合持续至少约96小时，所述热启动免疫细胞的群体的小于约20％表现出耗尽，任选地耗尽包括T细胞耗尽。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的群体，其中所述有效载荷包括CAR和/或TCR，其中响应于所述CAR和/或所述TCR连续接合持续96小时，与不包含振荡器的所述热启动免疫细胞的群体相比，所述热启动免疫细胞的群体的至少约1.1倍更少的细胞表现出耗尽，任选地耗尽包括T细胞耗尽。
74.根据权利要求72-73中任一项所述的群体，其中所述T细胞耗尽包括选自由包括以下T细胞耗尽生物标志物的组的一种或更多种T细胞耗尽生物标志物的表达：检查点抑制剂、PD-1(Pdcdl)、′IΠΜ-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpdl)、CD 160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdml)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxpl、维甲酸受体α(Rara)或其任何组合。
75.根据权利要求70-74中任一项所述的群体，其中所述有效载荷包括CAR和/或TCR，其中所述有效载荷在不存在热刺激的情况下不被表达，并且其中所述CAR和/或TCR的接合起始所述有效载荷的持续表达。
76.一种产生热启动免疫细胞的方法，所述方法包括：
将权利要求1-64中任一项所述的核酸组合物或权利要求65所述的组合物引入免疫细胞，从而产生热启动的免疫细胞，任选地，引入步骤包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、电核转运、化学转导、电转导、脂质体酰胺介导的转染、Effectene介导的转染、脂质纳米颗粒(LNP)介导的转染或其任何组合。
77.一种治疗受试者中的疾病或紊乱的方法，所述方法包括：
将包含权利要求1-64中任一项所述的核酸组合物或权利要求65所述的组合物的组合物引入一种或更多种免疫细胞，从而产生一种或更多种热启动免疫细胞；并且
向所述受试者施用有效量的所述热启动免疫细胞。
78.一种治疗受试者中的疾病或紊乱的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的权利要求66-75中任一项所述的热启动免疫细胞。
79.根据权利要求77-78中任一项所述的方法，还包括向所述受试者的靶部位施加足以将所述靶部位的局部温度增加至激活温度的热能，从而诱导所述有效载荷在所述靶部位处的热启动免疫细胞中的表达，任选地，所述激活温度是约37.5℃、约38.0℃、约38.5℃、约39.0℃、约39.5℃、约40.0℃、约40.5℃、约41.0℃、约41.5℃、约42.0℃、约42.5℃、约43.0℃、约43.5℃、约44.0℃、约44.5℃、约45.0℃、约45.5℃或约46.0℃。
80.根据权利要求79所述的方法，其中向所述受试者的所述靶部位施加热能包括应用聚焦超声(FUS)、磁热疗、微波、红外照射、基于液体的加热和接触加热中的一种或更多种，任选地基于液体的加热包括腹膜内化疗(HIPEC)。
81.根据权利要求79-80中任一项所述的方法，其中所述施用与施加热能之间的时间段是约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟。
82.根据权利要求79-81中任一项所述的方法，其中向靶部位施加热能包括在第二持续时间内向所述靶部位连续施加热能，任选地所述第二持续时间是约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟。
83.根据权利要求79-82中任一项所述的方法，其中向靶部位施加热能包括在第二持续时间内向所述靶部位施加热能的一个或更多个脉冲，任选地所述第二持续时间是约48小时、约44小时、约40小时、约35小时、约30小时、约25小时、20小时、15小时、10小时、约8小时、约8小时、8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述一个或更多个脉冲具有大于约1％且小于约100％的占空比。
85.根据权利要求83-84中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个脉冲各自具有约1小时、约30分钟、约15分钟、约10分钟、或约5分钟、约1分钟、约1秒或约1毫秒的脉冲持续时间。
86.根据权利要求79-85中任一项所述的方法，包括监测靶区域的温度，任选地所述监测通过磁共振成像(MRI)进行。
87.根据权利要求79-86中任一项所述的方法，其中通过磁共振成像(MRI)在空间上引导向所述受试者的靶部位施加热能。
88.根据权利要求79-87中任一项所述的方法，其中：
(a)在向所述靶部位处施加热能之后，所述靶部位处的所述热启动免疫细胞的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％表达所述有效载荷蛋白；和/或
(b)除了所述靶部位以外的部位处的热启动免疫细胞的小于约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％表达所述有效载荷蛋白。
89.根据权利要求79-88中任一项所述的方法，其中：
(a)所述受试者的靶部位处表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度与所述受试者的血液、血清或血浆中表达有效载荷的热启动免疫细胞的浓度的比是至少约2:1；和/或
(b)所述受试者的靶部位处的有效载荷蛋白浓度与所述受试者的血液、血清或血浆中的有效载荷蛋白浓度的比是约2:1至约3000:1、约2:1至约2000:1、约2:1至约1000:1或约2:1至约600:1。
90.根据权利要求79-89中任一项所述的方法，其中所述靶部位包括靶细胞，任选地所述靶细胞是肿瘤细胞，还任选地所述肿瘤细胞是实体瘤细胞，还任选地所述靶部位包括实体瘤。
91.根据权利要求90所述的方法，其中：
(a)向所述受试者的靶部位施加热能导致所述靶细胞的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％死亡；
(b)非靶细胞包括除了靶细胞以外的受试者的细胞，并且其中在施加热能之后靶细胞死亡与非靶细胞死亡的比是至少约2:1；和/或
(c)靶细胞死亡与非靶细胞死亡的比相比于包括组成型表达所述有效载荷蛋白的免疫细胞的方法大至少约1.1倍。
92.根据权利要求79-91中任一项所述的方法，其中所述靶部位包括疾病或紊乱的部位或位于疾病或紊乱的部位附近，任选地，疾病或紊乱的一个或更多个部位的位置是预先确定的、在所述方法期间确定的或两者，还任选地，所述靶部位是免疫抑制环境。
93.根据权利要求79-92中任一项所述的方法，其中所述靶部位包括组织，任选地，所述组织包括肾上腺组织、阑尾组织、膀胱组织、骨、肠组织、脑组织、乳腺组织、支气管、冠状组织、耳组织、食道组织、眼组织、胆囊组织、生殖器组织、心脏组织、下丘脑组织、肾组织、大肠组织、肠组织、喉组织、肝组织、肺组织、淋巴结、口组织、鼻组织、胰腺组织、甲状旁腺组织、垂体组织、前列腺组织、直肠组织、唾液腺组织、骨骼肌组织、皮肤组织、小肠组织、脊髓、脾组织、胃组织、胸腺组织、气管组织、甲状腺组织、输尿管组织、尿道组织、软组织和结缔组织、腹膜组织、血管组织和/或脂肪组织，还任选地所述组织是发炎组织和/或被感染的组织，任选地所述组织包括：(i)I级、II级、III级或IV级癌组织；(ii)转移癌组织；(iii)混合级癌组织；(iv)亚分级癌组织；(v)健康组织或正常组织；和/或(vi)癌组织或异常组织。
94.根据权利要求77-93中任一项所述的方法，其中所述疾病或紊乱是自身免疫性紊乱。
95.根据权利要求77-94中任一项所述的方法，其中所述疾病与肿瘤抗原的表达相关，其中所述与肿瘤抗原的表达相关的疾病选自由以下组成的组：增殖性疾病、癌前状况、癌症和与所述肿瘤抗原的表达相关的非癌相关指征。
96.根据权利要求77-95中任一项所述的方法，其中所述疾病或紊乱是癌症，任选地实体瘤，还任选地，所述癌症选自由以下组成的组：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌症、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移病灶，任选地，所述癌症是选自以下中的一种或更多种的血液学癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴白血病(ALL)、B细胞急性淋巴白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增生性状况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症或白血病前期。
97.根据权利要求77-96中任一项所述的方法，包括在施用所述热启动免疫细胞之前、期间和/或之后向所述受试者施用反式激活因子结合化合物，任选地反式激活因子结合化合物的量是有效诱导或减弱足够水平的有效载荷表达以治疗所述受试者的量，还任选地所述反式激活因子结合化合物包括四环素、多西环素或其衍生物。
98.根据权利要求77-97中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用一种或更多种另外的剂，任选地所述一种或更多种另外的剂增加所述热启动免疫细胞的效力，还任选地所述一种或更多种另外的剂包括蛋白磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫抑制分子抑制剂和/或减少TREG细胞水平或活性的剂，任选地所述一种或更多种另外的剂包括免疫调节剂、抗转移剂、化疗剂、激素或生长因子拮抗剂、烷化剂、TLR激动剂、细胞因子拮抗剂、细胞因子拮抗剂或其任何组合，任选地所述一种或更多种另外的剂包括对检查点抑制剂或检查点刺激剂分子，诸如PD1、PD-L1、PD-L2、CD27、CD28、CD40、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3特异性的激动或拮抗抗体。
99.根据权利要求77-98中任一项所述的方法，其中施用包括气溶胶递送、鼻递送、阴道递送、直肠递送、含服递送、眼部递送、局部递送、表面递送、脑池内递送、腹膜内递送、口服递送、肌内注射、静脉内注射、皮下注射、结内注射、瘤内注射、腹膜内注射、皮内注射或其任何组合。
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