CN111979240B - 一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达调控方法和调控系统 - Google Patents

一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达调控方法和调控系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于Type I‑F CRISPR/Cas的基因表达调控方法和基因表达调控系统。本发明首次研究显示隶属于Type I‑F CRISPR/Cas系统的Cascade复合物，如PaeCascade复合物，能在哺乳动物细胞内高效结合靶位点；同时本发明对Type I‑F CRISPR/Cas系统进行了哺乳动物表达系统优化，使得其在哺乳动物细胞内能高效地将转录激活因子或转录抑制因子募集到靶位点上，成功构建了转录激活系统和转录抑制系统。本发明使得Type I‑F CRISPR/Cas系统在哺乳动物细胞的基因调控方面的应用成为可能，并为基于Type I‑F CRISPR/Cas系统的基因转录调控提供了必要工具。

Description

一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达调控方法和调控 系统
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于Type I-F CRISPRCas系统的基因表达调控方法和基因表达调控系统及应用。
背景技术
基因表达调控和基因编辑是靶向基因治疗领域的关键技术。基因表达调控不同于基因编辑，基因表达调控是指生物体内基因表达的调节控制，使细胞中基因表达的过程在时间、空间上处于有序状态，并对环境条件的变化作出反应的复杂过程。基因表达的调控可在多个层次上进行，包括基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控。CRISPR/Cas系统是一种被报道过的高效基因水平操作手段，主要用于基因编辑，越来越受到重视。同时有研究显示其在基因表达调控也有应用的可能。如ZL201610341363.0公开了利用拆分Cas系统进行基因编辑和表达调控方法。
规律成簇间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas)是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的获得性免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA或RNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能；第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9,Cpf1,C2c1等)来发挥功能。其中，目前被熟知的Cas9和Cas12均具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性。目前，Cas9和Cas12蛋白作为基因组编辑工具被广泛应用，克服了传统基因编辑技术步骤繁琐、耗时长、效率低等缺点，以其较少的成分、便捷的操作以及较高的效率满足了大多数领域的基因编辑需求，并有着潜在且巨大的临床应用价值。
在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，和单效应蛋白的CRISPR相对，I型(Type I)CRISPR系统由多效应蛋白组成，需要多亚基共同组装成为具有功能的CRISPR复合体(CRISPR-associated complex for antiviral defense，Cascade)执行功能。从亚基数量和排列等基因特征进行归类，I型CRISPR又可细分为8种亚型(I-A到I-G型，I-U型)。以目前研究最深入的大肠杆菌的I-E型CRISPR系统为例，该系统由5种效应蛋白和CRISPR RNA(crRNA)构成，其组装首先需要Cas6对crRNA进行加工，其后Cas5、6个Cas7、Cas8e和2个Cse2小亚基共同被招募形成具有共11个亚基的复合体。该复合体仅具有双链DNA(dsDNA)结合能力，需要与Cas3结合才能进行dsDNA切割。
和相对复杂的I-E型CRISPR相比，来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的I-F型CRISPR复合体(PaeCascade)结合dsDNA仅需4种效应蛋白(Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f)易用性存在一定的优势。研究指出PaeCascade可在体外和大肠杆菌中结合dsDNA(Chowdhury,S.,et al,Cell,2017)。在Cas3存在的情况下，PaeCascade复合体可招募Cas3在细菌内对满足PAM(protospacer abject motif)SEQ ID NO.5’-CC-3’要求的靶序列进行切割，实现靶基因编辑。PaeCascade自身可结合不同长度的crRNA，因而可轻易改变复合体大小，可能在信号放大方面存在优势。
然而关于Type I-F CRISPR系统对于基因表达调控是否有作用及相应的应用价值，尚未有任何的研究与报道，其能否可成为新一代的基因调控工具，仍是未知。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有Type I-F CRISPR系统的应用局限，探究其是否适用于基因调控，并开发适用于哺乳动物的基于Type I-F CRISPR/Cas系统的基因表达调控新工具。
本发明的目的是提供Type I-F CRISPR/Cas系统在调控基因表达方面的应用。
本发明另一目的是提供一种利用Type I-F CRISPR/Cas系统进行基因表达调控的方法。
本发明另一目的是提供一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达激活系统。
本发明另一目的是提供一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达抑制系统。
本发明再一目的是提供上述基因表达激活系统、基因表达抑制系统的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明通过对PaeCascade序列进行哺乳动物表达系统优化，将转录激活因子或转录抑制因子融合表达至PaeCascade上，进行了PaeCascade转录调控系统的构建、优化和活性检测。使得PaeCascade系统在哺乳动物细胞的改造为I型CRISPR基因调控工具的开发成为可能。
因此本发明提供了一下可应用方案：
Type I-F CRISPR/Cas系统在调控基因表达方面或在制备基因表达调控产品中的应用。所述Type I-F CRISPR/Cas系统包括Cas1,Cas3,Cas8f1(又名Csy1),Cas5f1(又名Csy2),Cas7f1(又名Csy3),Cas6f(又名Csy4)等蛋白亚基，以及由正向重复序列和间隔序列组成的CRISPR阵列。
所述的Type I-F CRISPR/Cas系统是来源于Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14的Cascade复合物，简称为PaeCascade。
基于此，本发明提供一种利用隶属于Type I-F CRISPR/Cas系统的PaeCascade复合物进行基因表达调控的方法，该方法是：首先对PaeCascade复合物的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f分别进行适应编辑对象的优化，然后将目标基因的靶向序列、优化后的Cas8f1、优化后的Cas5f1、优化后的Cas7f1、优化后的Cas6f以及基因调控因子共同呈递至靶细胞。
具体而言所述方法是：首先对PaeCascade复合物的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f分别进行适应编辑对象的优化，然后将目标基因的靶向序列、优化后的Cas8f1、优化后的Cas5f1、优化后的Cas7f1、优化后的Cas6f以任意组合插入表达载体(即将crRNA、Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f表达盒，或其融合蛋白，或共表达(如P2A或IRES)接头，以任意组合任意顺序，任意启动子驱动的任意载体组合)，得到重组质粒组合，再将基因调控因子插入所述重组质粒组合中任一个重组质粒中，最后所得重组质粒共同转染细胞。
优化后的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f分别记为hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f。
所述“以任意组合插入表达载体”包括但不限于以下组合方式：
(1)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f全部插入在同一个表达载体中，所得重组质粒即构成基因表达调控系统；
(2)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意四个组分插入在同一个表达载体中，余下一个组分插入在另一个表达载体中，构建成由2个重组质粒构成的基因表达调控系统；
(3)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意三个组分插入在同一个表达载体中，余下两个组分插入在另一个表达载体中，构建成由2个重组质粒构成的基因表达调控系统；
(4)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意三个组分插入在同一个表达载体中，余下两个组分各自分别插入在另外两个表达载体中，构建成由3个重组质粒构成的基因表达调控系统；
(5)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意两个组分插入在同一个表达载体中，余下三个组分中的任意两个插入在另一个表达载体中，余下一个组分插入在第三个表达载体中，构建成由3个重组质粒构成的基因表达调控系统；
(6)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中任意两个组分插入在同一个表达载体中，余下三个组分各自分别插入在另外三个表达载体中，构建成由4个重组质粒构成的基因表达调控系统；
(7)靶向序列、hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f分别单独插入5个表达载体中，构建成由5个重组质粒构成的基因表达调控系统。
因此，上述涉及到的融合质粒，具体是指由hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1、hCas6f中的任一种或任几种组合插入表达载体得到重组质粒，也在本发明的保护范围之内。
进一步优选地，还需将基因表达调控因子插入任意一个重组质粒中。
基于此，一种由上述融合质粒组成的基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达调控系统，也应在本发明的保护范围之内。
另外，作为一种可选择的实施方案，本发明以上述组合方式(5)为例，提供了一种利用隶属于Type I-F CRISPR/Cas系统的PaeCascade复合物进行基因表达调控的方法及基因表达调控系统，以及涉及到的优化效应蛋白及重组质粒。
具体展示如下：
一种利用隶属于Type I-F CRISPR/Cas系统的PaeCascade复合物进行基因表达调控的方法，包括如下步骤：
(1)对PaeCascade复合物的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f分别进行适应编辑对象的优化；
(2)选取目标基因中靶向序列，将靶向序列插入表达载体中构建crRNA靶向质粒A；
(3)将优化后的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f中任两个与启动子共同插入表达载体构建融合质粒B；
(4)将将优化后的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f中任两个与启动子和转录调控蛋白共同插入表达载体构建融合质粒C；
(5)将上述crRNA靶向质粒A和融合质粒B、融合质粒C共同转染细胞。
其中优选地，步骤(2)中靶向序列选择或crRNA设计规则是：在目标基因上游寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32-56bp作为靶向序列，对应crRNA的长度为32-56nt。
一种优化的PaeCascade效应蛋白，包括hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f。
所述hCas8f1的序列如SEQ ID NO.2所示，hCas5f1的序列如SEQ ID NO.3所示，hCas7f1的序列如SEQ ID NO.4所示，hCas6f的序列如SEQ ID NO.5所示。
一种融合质粒I，所述融合质粒I为：真核细胞表达载体-hCsy蛋白-启动子-hCsy蛋白；其中两个hCsy蛋白分别选自hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1或hCas6f且两个hCsy蛋白不同。
即所述融合质粒I可以为如下11种：
(1)真核细胞表达载体-hCas5f1-启动子-hCas8f1；
(2)真核细胞表达载体-hCas5f1-启动子-hCas7f1；
(3)真核细胞表达载体-hCas5f1-启动子-hCas6f；
(4)真核细胞表达载体-hCas8f1-启动子-hCas5f1；
(5)真核细胞表达载体-hCas8f1-启动子-hCas7f1；
(6)真核细胞表达载体-hCas8f1-启动子-hCas6f；
(7)真核细胞表达载体-hCas7f1-启动子-hCas8f1；
(8)真核细胞表达载体-hCas7f1-启动子-hCas5f1；
(9)真核细胞表达载体-hCas7f1-启动子-hCas6f；
(10)真核细胞表达载体-hCas6f-启动子-hCas8f1；
(10)真核细胞表达载体-hCas6f-启动子-hCas5f1；
(11)真核细胞表达载体-hCas6f-启动子-hCas7f1。
其中所述真核细胞表达载体如pCDNA3.1等。
所述启动子如PGK、EF1α，CMV，CBh等一般广泛性启动子。
优选地，所述融合质粒I为pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1。
或优选地，所述融合质粒I为pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1。
优选地，所述融合质粒I的N端添加核定位信号(NLS)PKKKRKV。
最优选地，所述融合质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1的序列如SEQ ID NO.9所示；
或所述融合质粒pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1的序列如SEQ ID NO.10所示。
另一种融合质粒II，所述融合质粒II为：真核细胞表达载体-hCsy蛋白-启动子-hCsy蛋白，其中两个hCsy蛋白分别选自hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1或hCas6f且两个hCsy蛋白不同；且融合质粒II中插入有转录激活蛋白。
优选地所述融合质粒II为：真核细胞表达载体-hCsy蛋白-转录激活蛋白-启动子-hCsy蛋白，
或优选地所述融合质粒II为：真核细胞表达载体-hCsy蛋白-启动子-hCsy蛋白-转录激活蛋白。
其中所述真核细胞表达载体如pCDNA3.1等。
所述转录激活蛋白如VPR、P300、VP16、VP64、SAM、HSF等转录激活蛋白。
所述启动子如PGK、EF1α，CMV，CBh等一般广泛性启动子。
优选地，所述融合质粒II为pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f，
或优选地，所述融合质粒II为pxCMV-hCas5f1-VPR-PGK-hCas8f1。
或优选地，所述融合质粒II为pxCMV-hCas8f1-VPR-PGK-hCas5f1。
或优选地，所述融合质粒II为pxCMV-hCas6f-VPR-PGK-hCas7f1。
优选地，所述融合质粒II中，融合质粒II的N端添加核定位信号(NLS)PKKKRKV。
最优选地，所述融合质粒pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f的序列如SEQ ID NO.11所示。
最优选地，所述融合质粒pxCMV-hCas5f1-VPR-PGK-hCas8f1的序列如SEQ IDNO.12所示。
最优选地，所述融合质粒pxCMV-hCas8f1-VPR-PGK-hCas5f1的序列如SEQ IDNO.13所示。
最优选地，所述融合质粒pxCMV-hCas6f-VPR-PGK-hCas7f1的序列如SEQ ID NO.14所示。
再一种融合质粒III，所述融合质粒III为：真核细胞表达载体-hCas7f1-转录抑制蛋白-启动子-hCas6f。
其中所述真核细胞表达载体如pCDNA3.1等。
所述转录抑制蛋白如KRAB、DMNT3L等转录抑制结构域。
所述启动子如PGK、EF1α，CMV，CBh等一般广泛性启动子。
优选地，所述融合质粒III为pxCMV-hCas7f1-KRAB-PGK-hCas6f。
优选地，所述融合质粒III中，融合质粒III的N端添加核定位信号(NLS)PKKKRKV。
最优选地，所述融合质粒pxCMV-hCas7f1-KRAB-PGK-hCas6f的序列如SEQID NO.15所示。
再一种融合质粒V，所述融合质粒V为在适于哺乳动物的表达载体中插入hCas6f-DR序列得到。
优选地，所述适于哺乳动物的表达载体包括pCDNA3.1等。
优选地，所述融合质粒V为pLenti-DR(hCas6f)-EV。其中，pLenti为骨架名称，可替换为任意真核表达载体。EV(empty vector)是指载体未连入识别任何靶向序列的序列，是可用来进行靶向序列克隆的空载体。DR(hCas6f)是指可被hCas6f识别的直接重复序列(简称DR序列)。
最优选地，所述融合质粒pLenti-DR(hCas6f)-EV的序列如SEQ ID NO.16所示。
基于上述优化的PaeCascade效应蛋白以及构建的多种融合质粒，本发明还提供基于Type I-F CRISPR/Cas的基因调控系统。具体如下：
一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达激活系统，包括以下三个组分：
(1)融合质粒I；
(2)融合质粒II；
(3)融合质粒V。
一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达抑制系统，包括以下三个组分：
(1)融合质粒I；
(2)融合质粒III；
(3)融合质粒V。
另外，上述系统在制备基因基因表达调控工具方面的应用，也应在本发明保护范围之内。
另外，优选地，利用本发明上述基因表达激活系统进行基因操作时，靶向序列选择或crRNA设计规则是：在目标基因上游寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32-56bp作为靶向序列。即crRNA的长度为32-56nt。
更优选地，是在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32-56bp作为靶向序列。即优选地crRNA的长度为32-56nt。
更优选地，是在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后44-56bp作为靶向序列。即优选地crRNA的长度为44-56nt。
更优选地，是在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后48-56bp作为靶向序列。即优选地crRNA的长度为48-56nt。
最优选地，是在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后50-56bp作为靶向序列。即优选地crRNA的长度为50-56nt。
最后，作为一种可选择的具体实施方案，基于上述优化构建的基因表达调控系统，进行基因表达调控的方法包括如下步骤：
(1)选取目标基因中靶向序列，将靶向序列插入质粒pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQID NO.16)中构建得到crRNA靶向质粒；
(2)将上述crRNA靶向质粒、融合质粒I、融合质粒II共同转染细胞。
优选地，步骤(1)中靶向序列选择或crRNA设计规则如上文所述。
优选地，步骤(2)中crRNA靶向质粒、融合质粒I、融合质粒II以1:1:1摩尔比进行转染。
优选地，步骤(2)中细胞可用HEK293T细胞。
本发明具有以下有益效果：
本发明对PaeCascade系统进行了哺乳动物表达系统优化优化，使得其在哺乳动物细胞内具有双链DNA结合活性。同时将转录激活因子、转录抑制因子融合表达至优化后的PaeCascade上，进行了PaeCascade转录调控系统的构建、优化和活性检测。
本发明提供了一种新型的PaeCascade哺乳细胞基因转录调控系统，使得PaeCascade系统在哺乳动物细胞的基因调控方面的应用成为可能，为I型CRISPR基因调控工具的开发成为可能，并为基于PaeCascade的基因转录调控提供了必要工具。
和现有的dCas9-VPR转录激活系统相比，本发明的PaeCascade-VPR转录激活系统有更高的转录激活效率，其可结合更长crRNA的特征和可加工多个crRNA的特征，可方便增强靶向基因的表达，也在同一个细胞可同时激活多个基因转录。进一步该系统构建方案同时也可被应用于其他I型CRISPR(如I-A、I-B、I-C、I-D、I-E、I-G型CRISPR)中。
本发明利用的PaeCascade系统其crRNA识别靶序列需32个碱基，对比于已有Cas9的20个碱基配对的gRNA长度更长。由于其识别序列所需碱基更长，因此PaeCascade系统对序列识别的要求更严谨，会有更强的特异性。
附图说明
图1为将VPR融合至PaeCascade不同亚基上的转录激活效果对比。
图2为PaeCascade-VPR与dCas9-VPR转录激活HEK293T内源HBG和SOX2位点对比。
图3为PaeCascade-VPR转录激活在HBG和SOX2位点启动子不同位置上激活效果。
图4为PaeCascade-VPR转录激活在HBB和HBG位点不同crRNA长度激活效率对比。
图5为PaeCascade-VPR转录激活在HBG和SOX2位点双crRNA激活效率对比。
图6为PaeCascade-VPR转录激活在HBB和HBG位点双crRNA和串联crRNA的转录激活。
图7为PaeCascade-KRAB对K562内源HBB/HBG/HBE位点的转录抑制。
图8为实施例12中不同构成的PaeCascade-VPR转录激活系统诱导GFP水平结果对比。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，所用试剂和材料均为市购。
除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
如下述实施例中所用的细胞培养所需培养基、转染所需optimem购买与Thermo公司。血清购买自Excell公司。RNA提取试剂RNAiso和TB Green II反转录试剂、qPCR试剂盒购买TAKARA公司。Phusion DNA聚合酶、涉及的内切酶、T4连接酶购买自Thermo公司。PCRclean up和凝胶回收试剂盒均购买自Qiagen公司。
实施例1 PaeCascade的序列优化
PaeCascade序列来源于Pseudomonas aeruginosa的I-F型CRISPR复合体。Jennifer A.Doudna团队于2011年在《Proc Natl Acad Sci》发表的一篇题为“RNA-guidedcomplex from a bacterial immune system enhances target recognition throughseed sequence interactions”的文章，其中报导PaeCascade可在体外结合dsDNA序列。其来源菌种为Pseudomonas aeruginosa。
由于PaeCascade位点4个蛋白(Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f)所在序列为受原核多顺反子调控，为原核偏好密码子编码序列(SEQ ID NO.1)。因而，为促进PaeCascade在哺乳动物细胞的表达，应对其序列特征进行优化改造。改造原则有三：1)拆分出单个蛋白，每个进行哺乳动物密码子优化；2)去除意外的真核转录终止信号；3)加入真核核定位信号。
就每个序列而言，其序列优化以http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/软件进行处理，多余真核转录终止信号以http://dnafsminer.bic.nus.edu.sg/PolyA.html进行检索并排除，最后加入真核核定位信号，对优化前后序列进行表达量差异分析，从Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f原序列得到hCas8f1(SEQ ID NO.2)、hCas5f1(SEQ ID NO.3)、hCas7f1(SEQ ID NO.4)、hCas6f(SEQ ID NO.5)序列。
将VPR转录激活因子融合表达至hCas7f1C端，构建为hCas7f1-VPR(SEQ ID NO.6)元件。
将KRAB转录抑制因子融合表达至hCas7f1C端，构建为hCas7f1-KRAB(SEQ IDNO.7)元件。
将mScarlett转录抑制因子融合表达至hCas7f1C端，构建为hCas7f1-mScarlett(SEQ ID NO.8)元件。
实施例2构建重组质粒
1、构建重组质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1(序列如SEQ ID NO.9所示)
通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将含NLS序列(PKKKRKV)的hCas8f1、hCas5f1连接并构建pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1质粒(SEQ ID NO.9)。
所用的改良pxCMV来源于px601质粒，其中在CMV启动子后加入AscI酶切位点，将PGK启动子、NotI酶切位点通过原KpnI和HindIII位点插入构建。
2、构建重组质粒pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1(序列如SEQ ID NO.10所示)：
通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将含NLS序列(PKKKRKV)的hCas7f1、hCas6f连接并构建pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1质粒(SEQ ID NO.10)。
所用的改良pxCMV来源于px601质粒，其中在CMV启动子后加入AscI酶切位点，将PGK启动子、NotI酶切位点通过原KpnI和HindIII位点插入构建。
3、构建重组质粒pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f(序列如SEQ ID NO.11所示)：
通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将含NLS序列(PKKKRKV)的hCas7f1、hCas6f和转录激活蛋白VPR连接并构建pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f质粒(SEQ ID NO.11)。
所用的改良pxCMV来源于px601质粒，其中在CMV启动子后加入AscI酶切位点，将PGK启动子、NotI酶切位点通过原KpnI和HindIII位点插入构建。
4、构建重组质粒pxCMV-hCas5f1-VPR-PGK-hCas8f1(序列如SEQ ID NO.12所示)
通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将含NLS序列(PKKKRKV)的hCas8f1、hCas5f1和转录激活蛋白连接并构建pxCMV-hCas5f1-VPR-PGK-hCas8f1质粒(SEQ ID NO.12)。
所用的改良pxCMV来源于px601质粒，其中在CMV启动子后加入AscI酶切位点，将PGK启动子、NotI酶切位点通过原KpnI和HindIII位点插入构建。
5、构建重组质粒pxCMV-hCas8f1-VPR-PGK-hCas5f1(序列如SEQ ID NO.13所示)
通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将含NLS序列(PKKKRKV)的hCas8f1、hCas5f1和转录激活蛋白连接并构建pxCMV-hCas8f1-VPR-PGK-hCas5f1质粒(SEQ ID NO.13)。
所用的改良pxCMV来源于px601质粒，其中在CMV启动子后加入AscI酶切位点，将PGK启动子、NotI酶切位点通过原KpnI和HindIII位点插入构建。
6、构建重组质粒pxCMV-hCas6f-VPR-PGK-hCas7f1(序列如SEQ ID NO.14所示)：
通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将含NLS序列(PKKKRKV)的hCas7f1、hCas6f和转录激活蛋白VPR连接并构建pxCMV-hCas6f-VPR-PGK-hCas7f1质粒(SEQ ID NO.14)。
7、构建重组质粒pxCMV-hCas7f1-KRAB-PGK-hCas6f(序列如SEQ ID NO.15所示)：
通过AscI与MluI酶切位点和NotI与HindIII酶切位点分别连于改良的pxCMV质粒，将hCas7f1、hCas6f和转录抑制蛋白KRAB连接并构建pxCMV-hCas7f1-KRAB-PGK-hCas6f质粒(SEQ ID NO.15)。
所用的改良pxCMV来源于px601质粒，其中在CMV启动子后加入AscI酶切位点，将PGK启动子、NotI酶切位点通过原KpnI和HindIII位点插入构建。
8、构建重组质粒pLenti-DR(hCas6f)-EV(序列如SEQ ID NO.16所示)：
PaeCascade crRNA骨架(Direct Repeat，DR)序列来源于Pseudomonasaeruginosa内源CRISPR repeat序列。
其中通过BsmBI和EcoRI酶切位点将crRNA克隆序列插入至Lenti gRNA puro载体中。
Direct Repeat序列：gttcactgccgtataggcagctaagaaa
crRNA克隆序列：Ggttcactgccgtataggcagctaagaaa TGAGACGGCAGCCAGGGATCCTATCCGTCTCA gttcactgccgtataggcagctaagaaaTTTTTTTg
实施例1、2中序列用于以下系统的构建，序列来源为合成序列。
实施例3构建PaeCascade-VPR转录激活系统
PaeCascade-VPR转录激活系统包括以下三个组分：
(1)融合质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1(序列如SEQ ID NO.9)，
或融合质粒pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1(序列如SEQ ID NO.10)；
(2)融合质粒pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f(序列如SEQ ID NO.11)，
或融合质粒pxCMV-hCas5f1-VPR-PGK-hCas8f1(序列如SEQ ID NO.12)，
或融合质粒pxCMV-hCas8f1-VPR-PGK-hCas5f1(序列如SEQ ID NO.13)，
或融合质粒pxCMV-hCas6f-VPR-PGK-hCas7f1(序列如SEQ ID NO.14)；
(3)crRNA表达质粒为pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQ ID NO.16)。
实施例4 VPR融合至PaeCascade不同亚基均能引起基因转录激活
1、实验方法：在TRE-GFP报告细胞系的TRE元件寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32bp作为靶向序列。通过BsmBI酶切的方法将靶向序列插入至质粒pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQ ID NO.16)中，构建出crRNA靶向质粒。然后将以下(1)、(2)、(3)以1:1:1摩尔比转染至以PEI或其他转染试剂后转染方法转染至HEK293T细胞中。转染后对GFP基因检测，可通过提取RNA结合qPCR检测、Western Blotting检测、流式细胞仪检测等常规手段进行。
(1)crRNA靶向质粒，
(2)融合质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1(序列如SEQ ID NO.9)或融合质粒pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1(序列如SEQ ID NO.10)，
(3)融合质粒pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f(序列如SEQ ID NO.11)，
或融合质粒pxCMV-hCas5f1-VPR-PGK-hCas8f1(序列如SEQ ID NO.12)，
或融合质粒pxCMV-hCas8f1-VPR-PGK-hCas5f1(序列如SEQ ID NO.13)，
或融合质粒pxCMV-hCas6f-VPR-PGK-hCas7f1(序列如SEQ ID NO.14)。
2、本实施例以TRE启动子下的GFP作为目标基因，利用不同组合的PaeCascade-VPR转录激活系统进行GFP位点激活实验。具体操作如下：
将将以下(1)、(2)、(3)加入optimem培养基100μl混匀，加入100μl含18μg/ml PEI的optimem，混匀室温静置15min，转染HEK293T细胞。转染后48h以流式细胞仪分析GFP阳新细胞，其中以非靶向序列作为空白对照。
(1)1μg含有TRE序列靶向位点的crRNA靶向质粒，
(2)1μg融合质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1(序列如SEQ ID NO.9)或融合质粒pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1(序列如SEQ ID NO.10)，
(3)1μg融合质粒pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f(序列如SEQ ID NO.11)，
或融合质粒pxCMV-hCas5f1-VPR-PGK-hCas8f1(序列如SEQ ID NO.12)，
或融合质粒pxCMV-hCas8f1-VPR-PGK-hCas5f1(序列如SEQ ID NO.13)，
或融合质粒pxCMV-hCas6f-VPR-PGK-hCas7f1(序列如SEQ ID NO.14)。
3、结果如图1所示，不同组合的PaeCascade-VPR转录激活系统均可有效诱导GFP水平上调，其中效率Cas7f1-VPR转录激活效果最佳。
实施例5 PaeCascade-VPR转录激活系统介导的哺乳动物内源位点激活
1、实验方法：在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32bp作为靶向序列。通过BsmBI酶切的方法将靶向序列插入至质粒pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQ ID NO.16)中，构建出crRNA靶向质粒。然后将crRNA靶向质粒和pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1质粒(SEQ ID NO.9)、pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f质粒(SEQ IDNO.11)以1:1:1摩尔比转染至以PEI或其他转染试剂后转染方法转染至HEK293T细胞中。转染后对内源基因检测，可通过提取RNA结合qPCR检测、Western Blotting检测、流式细胞仪检测等常规手段进行。
2、本实施例以HBG和SOX2作为目标基因，利用PaeCascade-VPR转录激活系统进行哺乳动物内源位点激活实验。具体操作如下：
将1μg含有HBG靶向位点或SOX2靶向位点的crRNA靶向质粒，以及1μg质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1(SEQ ID NO.9)和1μg质粒pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f(SEQ IDNO.11)加入optimem培养基100μl混匀，加入100μl含18μg/ml PEI的optimem，混匀室温静置15min，转染HEK293T细胞。转染后48h以RNAiso提取总RNA，以TB Green II反转录试剂盒反转录mRNA，并以qPCR分别对HBG和SOX2进行测定，以GAPDH作为内参以-△△Ct方法对HBG或SOX2相对表达量进行定量。其中以非靶向序列作为空白对照，dCas9-VPR激活系统和其相应gRNA作为对比参考。
3、结果如图2所示，PaeCascade-VPR转录激活系统可有效诱导内源HBG或SOX2转录水平上调，而且其效率比现有的dCas9-VPR转录激活效果更佳。
实施例6 PaeCascade-VPR转录激活系统介导的可调式转录激活
对于特定位点的基因，为阐明具体哪些靶向位点能促进有效的激活，我们针对HBG和SOX2两个位点，在其启动子上游-500～-100bp位置设计了一系列crRNA。通过实施例4所述方法将他们和PaeCascade-VPR转录激活系统转染至HEK293T细胞中，可发现在靶基因上游100-200bp处的位点设计的crRNA有最好的激活效果(图3)。因此这个区域为激活效果最优区域。
实施例7 PaeCascade-VPR转录激活系统介导的可调式转录激活
由于PaeCascade-VPR系统可通过改变crRNA长度，形成长短不一的复合体，因而在PaeCascade-VPR转录激活系统中可通过改变crRNA长度从而引起不同程度的转录激活。针对HBG和HBB两个位点，我们设计了不同长度的crRNA序列，通过实施例4所述方法将他们和PaeCascade-VPR转录激活系统转染至HEK293T细胞中，可发现随着crRNA的延长(图4)，转录水平得到上调，证明PaeCascade-VPR转录激活系统可轻易调控具体位点的转录激活水平。
实施例8 PaeCascade-VPR转录激活系统介导的叠加式转录增强效应
另外为探索增强转录程度的方案，我们将靶向同一个基因的两个crRNA同时转染至HEK293T，按照实施例4所述方法将他们和PaeCascade-VPR转录激活系统转染至HEK293T细胞中，发现可在HBG和SOX2位点显著上调转录激活水平(图5)。因此PaeCascade-VPR转录激活系统的转录激活是具有叠加效应的。
实施例9 PaeCascade-VPR转录激活系统介导的多重激活
由于PaeCascade系统可加工自身的crRNA，因此可构建串联的crRNA阵列，在同一个细胞内同时靶向多个不同基因。我们构建了能同时靶向HBG-HBB的crRNA阵列，并将他们以实施例4所述方法将他们和PaeCascade-VPR转录激活系统转染至HEK293T细胞中，可发现HBB和HBG可被同时激活(图6)。因此PaeCascade-VPR转录激活系统可实现多为点的多重激活。
综上结果可得出结论：和现有的dCas9-VPR转录激活系统相比，本发明的PaeCascade-VPR转录激活系统有更高的转录激活效率，其可结合更长crRNA的特征和可加工多个crRNA的特征，可方便增强靶向基因的表达，也在同一个细胞可同时激活多个基因转录。
实施例10构建PaeCascade-KRAB转录抑制系统
PaeCascade-KRAB转录抑制系统包括：
(1)pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1质粒(SEQ ID NO.9)，
(2)pxCMV-hCas7f1-KRAB-PGK-hCas6f质粒(SEQ ID NO.15)，
(3)crRNA表达质粒为pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQ ID NO.16)。
实施例11 PaeCascade-KRAB转录抑制系统介导的哺乳动物内源位点转录抑制
实验方法：在目标基因上游100-200bp处寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32bp作为靶向序列。通过BsmBI酶切的方法将靶向序列插入至pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQ ID NO.16)中，构建出crRNA靶向质粒。将crRNA靶向质粒和pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1质粒(SEQ ID NO.9)、pxCMV-hCas7f1-KRAB-PGK-hCas6f质粒(SEQ ID NO.15)以1:1:1摩尔比转染至以电转染或其他转染试剂后转染方法转染至HEK293T细胞中。转染后对内源基因检测，可通过提取RNA结合qPCR检测、Western Blotting检测、流式细胞仪检测等常规手段进行。
本实施例以HBB/HBG/HBE作为目标基因，利用PaeCascade-KRAB转录抑制系统进行哺乳动物内源位点转录抑制实验。具体操作如下：
将0.3μg含有HBB/HBG/HBE靶向位点靶向增强子位点的crRNA靶向质粒，以及0.3μg质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1(SEQ ID NO.9)和0.3μg pxCMV-hCas7f1-KRAB-PGK-hCas6f(SEQ ID NO.15)以电转染方式转染K562细胞。转染后72h以RNAiso提取总RNA，以TBGreen II反转录试剂盒反转录mRNA，并以qPCR分别对HBB/HBG/HBE进行测定，以GAPDH作为内参以-△△Ct方法对HBB/HBG/HBE相对表达量进行定量。其中以非靶向序列作为空白对照。
结果如图7所示，PaeCascade-KRAB转录抑制系统可有效诱导内源HBB/HBG/HBE转录下调。
实施例12
1、实验方法：在TRE-GFP报告细胞系的TRE元件寻找满足PAM-SEQ IDNO.6’-CC-3’特征的后32bp作为靶向序列。通过BsmBI酶切的方法将靶向序列插入至质粒pLenti-DR(hCas6f)-EV(SEQ ID NO.16)中，构建出crRNA靶向质粒。然后将以下(1)、(2)实验组分别以PEI或其他转染试剂后转染方法转染至HEK293T细胞中。转染后对GFP基因检测，可通过提取RNA结合qPCR检测、Western Blotting检测、流式细胞仪检测等常规手段进行。
2、本实施例以TRE启动子下的GFP作为目标基因，利用构成的PaeCascade-VPR转录激活系统进行GFP位点激活实验。具体操作如下：
将以下(1)、(2)实验组分别加入optimem培养基100μl混匀，加入100μl含18μg/mlPEI的optimem，混匀室温静置15min，转染HEK293T细胞。转染后48h以流式细胞仪分析GFP阳新细胞，其中以非靶向序列作为空白对照。
(1)1μg含有TRE序列靶向位点的crRNA靶向质粒，2μg同时包含Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1-VPR、Cas6f的质粒；
(2)1μg含有TRE序列靶向位点的crRNA靶向质粒，1μg质粒pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1(SEQ ID NO.9)和1μg质粒pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f(SEQ ID NO.11)
3、结果如图8所示，不同构成的PaeCascade-VPR转录激活系统均可有效诱导GFP水平上调，其中效率Cas7f1-VPR转录激活效果最佳。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达调控方法和调控系统
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<210> 1
<211> 3881
<212> DNA
<213> PaeCascade
<400> 1
atgacctctc ccctcccaac gcctacgtgg caggagcttc gccagttcat cgaatccttc 60
atccaggagc gcctccaggg caagctggac aaactccaac ccgacgaaga cgacaagcgc 120
cagacattgc tggccaccca ccggcgggag gcctggctgg ccgatgccgc ccggcgggtt 180
ggccagttgc agttggtgac ccacacgctc aagccgatcc atcccgacgc ccgcggcagc 240
aacctgcaca gcctgccgca agcacccggc caaccgggcc tcgccggttc ccatgagcta 300
ggtgacaggc tggtcagcga tgtggtgggc aatgccgcgg cgctggacgt attcaagttt 360
ctcagtctcc agtatcaggg taaaaatctt ctgaactggc tgacagaaga cagtgccgag 420
gcattacagg cgctgtccga taacgccgaa caggctcgcg aatggcggca agcgttcatc 480
ggcatcacga ccgtcaaagg cgctcccgcg tcccacagcc tggccaagca gttgtacttt 540
cccctgcccg gttccggcta ccacctgcta gcaccgctgt ttcccaccag tctggtgcat 600
cacgtccacg ctctgctccg cgaagcgcgc ttcggcgacg cggccaaggc ggcacgcgaa 660
gcgcgcagcc gccaggagtc atggccccac ggattcagcg agtaccccaa cctggcgatc 720
cagaagttcg gcggtaccaa gccgcagaac atcagtcagt tgaacaacga gcgccgtggc 780
gagaactggt tgctgccatc gcttccgccg aactggcaaa ggcagaatgt aaacgcgccg 840
atgcggcact cttcggtctt cgagcatgac ttcggaagaa ctcctgaagt atcccgccta 900
acccgtaccc tgcagcgttt tcttgccaag acagtccata acaacctcgc catccgccag 960
cggcgtgccc aattggtggc gcaaatctgc gacgaagccc tgcaatacgc cgcccgtctg 1020
cgcgaactgg agcccggctg gagcgcaacc cccgggtgcc aactgcatga cgcggagcag 1080
ctctggctcg atccgttgcg cgcacagacc gatgagacgt tcttgcagcg ccgactacga 1140
ggtgactggc ctgccgaggt cggaaatcgc ttcgccaact ggctgaaccg ggcggtcagc 1200
agcgacagtc agatactggg tagcccggaa gccgcccaat ggagccagga gctgagcaag 1260
gaactgacga tgttcaagga gatactcgaa gatgagcgtg actgatcccg aggcgctgct 1320
gttgctgcca cgcctgtcca tccagaacgc caacgccatt tccagcccct tgacctgggg 1380
tttcccttcg cccggcgctt tcaccggatt cgtccatgcc ttgcagcgtc gagtcggaat 1440
ctccctcgat atcgaactgg acggtgtcgg catcgtctgt caccgcttcg aagcgcagat 1500
atcgcaaccg gccggcaagc gcaccaaggt cttcaacctg acccgcaatc cgctgaaccg 1560
cgacggctcc accgcagcca tcgtcgaaga aggtcgcgcc catctggagg tcagtctgct 1620
gctcggagtg catggcgatg gtctggacga tcaccccgca caggaaatcg ccaggcaggt 1680
acaggagcag gctggcgcca tgcgcctcgc cggtggcagc atcctgccct ggtgcaatga 1740
gcgcttcccg gctccgaacg ccgaactgct gatgctgggt ggcagcgacg aacagcggcg 1800
caagaaccag cgccggctta cccgccgcct gctccccggc ttcgccctgg tgagtcgcga 1860
ggcgttgttg caacaacatc tggaaacctt gcgcaccacg ctccccgaag ccaccacgct 1920
cgatgcactg ctcgatcttt gtcgaatcaa cttcgagcct cctgcaacct cgtccgaaga 1980
agaagcatcg ccgcccgatg cagcctggca agtgcgcgac aagcccggct ggctggtgcc 2040
gatcccggct ggctacaacg ccctgtcacc cctgtacctc cccggcgaag tgcgaaatgc 2100
ccgtgataga gaaacaccgc tgcgcttcgt cgaaaacctc ttcggtctgg gcgaatggct 2160
cagcccccat cgcgtcgccg cgttatcgga cctgctttgg tatcaccacg ccgagcctga 2220
caaagggctc taccgctgga gcacaccccg tttcgtcgaa cacgccatcg cataaggaaa 2280
tcagcatgtc caagccaata ctgagcaccg cttccgtcct cgccttcgaa cgtaagctcg 2340
acccttccga cgcccttatg agcgctggcg cctgggcgca acgcgacgcc tcgcaggaat 2400
ggccggccgt gaccgtgcgc gagaagtccg tacgcggcac catctccaac cgcctcaaga 2460
ccaaggaccg tgacccggcc aagctggacg cctcgatcca gtcgcccaac ctgcagacgg 2520
tggacgtggc caacctgccg agcgacgccg acaccctcaa ggtccgcttc accctccgtg 2580
tgctcggcgg cgccggaaca ccgtctgcct gcaacgacgc ggcctaccgt gacaagctgc 2640
tgcaaacggt cgccacctac gtgaacgatc agggcttcgc cgagctggct cgtcgttatg 2700
cgcacaacct ggccaacgcc cgcttcctgt ggcgcaaccg ggtgggcgcg gaagcggtgg 2760
aagtccgtat caaccatatc cgccagggcg aggtggctcg cgcctggcgc ttcgacgccc 2820
tggccatcgg cttgcgcgac ttcaaggccg acgccgaact ggacgcgctc gccgaactga 2880
tcgccagcgg tctctcaggc agtgggcatg tcctgctcga agtggtcgcc ttcgcccgta 2940
tcggcgacgg ccaggaagtc ttcccctccc aggaactgat cctcgacaaa ggcgacaaga 3000
aaggccagaa gagcaagacc ctgtacagcg tacgcgatgc cgcggccatc cactcgcaga 3060
agatcggcaa tgccctgcgc accatcgata cgtggtatcc cgacgaagat ggcctcggcc 3120
ccatcgccgt ggagccctac ggctccgtca catcccaggg caaagcctat cgccagccca 3180
agcagaagct ggacttctat acgctgctcg acaactgggt actgcgcgac gaggcgcccg 3240
ccgtggagca acagcattat gtgatcgcca acctgatccg tggcggcgtg ttcggtgaag 3300
ccgaagagaa gtaagccatg gaccactacc tcgacattcg cttgcgaccg gacccggaat 3360
ttcccccggc gcaactcatg agcgtgctct tcggcaagct ccaccaggcc ctggtggcac 3420
agggcgggga caggatcggc gtgagcttcc ccgacctcga cgaaagccgc tcccggctgg 3480
gcgagcgcct gcgcattcat gcctcggcgg acgaccttcg tgccctgctc gcccggccct 3540
ggctggaagg gttgcgggac catctgcaat tcggagaacc ggcagtcgtg cctcacccca 3600
caccgtaccg tcaggtcagt cgggttcagg cgaaaagcaa tccggaacgc ctgcggcggc 3660
ggctcatgcg ccggcacgat ctgagtgagg aggaggctcg gaaacgcatt cccgatacgg 3720
tcgcgagagc cttggacctg cccttcgtca cgctacgcag ccagagcacc ggacagcact 3780
tccgtctctt catccgccac gggccgttgc aggtgacggc agaggaagga ggattcacct 3840
gttacgggtt gagcaaagga ggtttcgttc cctggttctg a 3881
<210> 2
<211> 1401
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<213> hCas8f1
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atgcccaaga agaagaggaa agtcacctct cccctcccaa cgcctacgtg gcaggagctt 60
cgccagttca tcgaatcctt catccaggag cgcctccagg gcaagctgga caaactccaa 120
cccgacgaag acgacaagcg ccagacattg ctggccaccc accggcggga ggcctggctg 180
gccgatgccg cccggcgggt tggccagttg cagttggtga cccacacgct caagccgatc 240
catcccgacg cccgcggcag caacctgcac agcctgccgc aagcacccgg ccaaccgggc 300
ctcgccggtt cccatgagct aggtgacagg ctggtcagcg atgtggtggg caatgccgcg 360
gcgctggacg tattcaagtt tctcagtctc cagtatcagg gtaaaaatct tctgaactgg 420
ctgacagaag acagtgccga ggcattacag gcgctgtccg ataacgccga acaggctcgc 480
gaatggcggc aagcgttcat cggcatcacg accgtcaaag gcgctcccgc gtcccacagc 540
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tttcccacca gtctggtgca tcacgtccac gctctgctcc gcgaagcgcg cttcggcgac 660
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ttgaacaacg agcgccgtgg cgagaactgg ttgctgccat cgcttccgcc gaactggcaa 840
aggcagaatg taaacgcgcc gatgcggcac tcttcggtct tcgagcatga cttcggaaga 900
actcctgaag tatcccgcct aacccgtacc ctgcagcgtt ttcttgccaa gacagtccat 960
aacaacctcg ccatccgcca gcggcgtgcc caattggtgg cgcaaatctg cgacgaagcc 1020
ctgcaatacg ccgcccgtct gcgcgaactg gagcccggct ggagcgcaac ccccgggtgc 1080
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ttcttgcagc gccgactacg aggtgactgg cctgccgagg tcggaaatcg cttcgccaac 1200
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aaagacgatg acgataagta a 1401
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<211> 1092
<212> DNA
<213> hCas5f1
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atgcctaaga agaagagaaa agtgagcgtg actgatcccg aggcgctgct gttgctgcca 60
cgcctgtcca tccagaacgc caacgccatt tccagcccct tgacctgggg tttcccttcg 120
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gccggcaagc gcaccaaggt cttcaacctg acccgcaatc cgctgaaccg cgacggctcc 300
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catggcgatg gtctggacga tcaccccgca caggaaatcg ccaggcaggt acaggagcag 420
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cgccggctta cccgccgcct gctccccggc ttcgccctgg tgagtcgcga ggcgttgttg 600
caacaacatc tggaaacctt gcgcaccacg ctccccgaag ccaccacgct cgatgcactg 660
ctcgatcttt gtcgaatcaa cttcgagcct cctgcaacct cgtccgaaga agaagcatcg 720
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cgcgtcgccg cgttatcgga cctgctttgg tatcaccacg ccgagcctga caaagggctc 960
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<212> DNA
<213> hCas7f1
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gtcctcgcct tcgaacgtaa gctcgaccct tccgacgccc ttatgagcgc tggcgcctgg 120
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atccagtcgc ccaacctgca gacggtggac gtggccaacc tgccgagcga cgccgacacc 300
ctcaaggtcc gcttcaccct ccgtgtgctc ggcggcgccg gaacaccgtc tgcctgcaac 360
gacgcggcct accgtgacaa gctgctgcaa acggtcgcca cctacgtgaa cgatcagggc 420
ttcgccgagc tggctcgtcg ttatgcgcac aacctggcca acgcccgctt cctgtggcgc 480
aaccgggtgg gcgcggaagc ggtggaagtc cgtatcaacc atatccgcca gggcgaggtg 540
gctcgcgcct ggcgcttcga cgccctggcc atcggcttgc gcgacttcaa ggccgacgcc 600
gaactggacg cgctcgccga actgatcgcc agcggtctct caggcagtgg gcatgtcctg 660
ctcgaagtgg tcgccttcgc ccgtatcggc gacggccagg aagtcttccc ctcccaggaa 720
ctgatcctcg acaaaggcga caagaaaggc cagaagagca agaccctgta cagcgtacgc 780
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<212> DNA
<213> hCas6f
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atgccaaaga agaagcggaa agtcgaccac tatctggaca tcagactgag gcccgatcct 60
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gcccaaggcg gagacagaat cggcgtgtcc ttccccgacc tggacgagtc ccggagtcgc 180
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gaccacgacg gagactacaa ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataaggat 720
aagtaa 726
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<212> DNA
<213> hCas7f1-VPR
<400> 6
atgccgaaga agaagaggaa agtttccaat gcatccaagc caatactgag caccgcttcc 60
gtcctcgcct tcgaacgtaa gctcgaccct tccgacgccc ttatgagcgc tggcgcctgg 120
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gaaaaaagaa agaggacgta tgaaactttc aagagcataa tgaaaaaaag tccgttctct 1380
ggtcctacag accccaggcc cccacctaga cgaatcgcgg ttccgagccg atcatcagcg 1440
agtgttccta agccagctcc acagccctat ccatttacgt ctagtctgtc tacgatcaac 1500
tacgacgagt tccccactat ggtattcccg tcaggccaga taagccaagc tagtgcgttg 1560
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gttagtgccc tcgcgcaagc gcctgccccg gttcctgttc tcgcacctgg gccaccgcag 1680
gcagttgcac cgccagcgcc aaagcccaca caggcagggg aaggtacgtt gagcgaagcc 1740
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cccgcagtat ttactgatct tgccagcgtg gacaattccg aatttcaaca gctcctgaac 1860
cagggaatcc cggtggctcc ccatacgaca gagcccatgc tcatggagta cccggaggcc 1920
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atgccgaaga agaagaggaa agtttccaat gcatccaagc caatactgag caccgcttcc 60
gtcctcgcct tcgaacgtaa gctcgaccct tccgacgccc ttatgagcgc tggcgcctgg 120
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taa 1383
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<212> DNA
<213> hCas7f1-mScarlett
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atgccgaaga agaagaggaa agtttccaat gcatccaagc caatactgag caccgcttcc 60
gtcctcgcct tcgaacgtaa gctcgaccct tccgacgccc ttatgagcgc tggcgcctgg 120
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atggacgagc tgtacaagta a 1761
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<212> DNA
<213> pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1质粒
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attcgtccat gccttgcagc gtcgagtcgg aatctccctc gatatcgaac tggacggtgt 960
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agaaggtcgc gcccatctgg aggtcagtct gctgctcgga gtgcatggcg atggtctgga 1140
cgatcacccc gcacaggaaa tcgccaggca ggtacaggag caggctggcg ccatgcgcct 1200
cgccggtggc agcatcctgc cctggtgcaa tgagcgcttc ccggctccga acgccgaact 1260
gctgatgctg ggtggcagcg acgaacagcg gcgcaagaac cagcgccggc ttacccgccg 1320
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atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 420
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 480
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 540
ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 600
tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 660
aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 720
tctatataag cagagctctc tggctaacta ccggcgcgcc accatgccca agaagaagag 780
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cctaacccgt accctgcagc gttttcttgc caagacagtc cataacaacc tcgccatccg 1740
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cgacctggac atgctgatta actctagaag ccaatacctc ccagacacag acgacaggca 2340
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<212> DNA
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tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 5340
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 5400
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 5460
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 5520
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 5580
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 5640
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 5700
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 5760
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 5820
aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 5880
aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 5940
tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 6000
agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 6060
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 6120
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 6180
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 6240
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 6300
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 6360
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 6420
cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 6480
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 6540
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 6600
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 6660
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 6720
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 6780
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 6840
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 6900
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 6960
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 7020
cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 7080
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 7140
cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 7200
accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 7260
acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcgcgcaa ttaaccctca 7320
ctaaagggaa caaaagctgg agctgcaagc 7350

Claims (4)

1.一种利用隶属于Type I-F CRISPR/Cas系统的PaeCascade复合物进行基因表达调控的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对PaeCascade复合物的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1和Cas6f分别进行适应编辑对象的优化，优化后的Cas8f1、Cas5f1、Cas7f1、Cas6f分别记为hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f，hCas8f1的序列如SEQ ID NO.2所示，hCas5f1的序列如SEQ ID NO.3所示，hCas7f1的序列如SEQ ID NO.4所示，hCas6f的序列如SEQ ID NO.5所示；
(2)选取目标基因中靶向序列，将靶向序列插入表达载体中构建crRNA靶向质粒A；所述靶向序列选择或crRNA设计规则是：在目标基因上游寻找满足PAM-SEQ ID NO.6’-CC-3’特征的后32～56bp作为靶向序列，对应crRNA的长度为50～56nt；
(3)将hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f中任两个与启动子共同插入表达载体构建融合质粒B；
(4)将hCas8f1、hCas5f1、hCas7f1和hCas6f中任两个与启动子和转录调控蛋白共同插入表达载体构建融合质粒C；
(5)将上述crRNA靶向质粒A和融合质粒B、融合质粒C共同转染细胞。
2.一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达激活系统，其特征在于，包括以下三个组分：
(1)融合质粒I，所述融合质粒I为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1或核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的pxCMV-hCas6f-PGK-hCas7f1；
(2)融合质粒II，所述融合质粒II为核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的pxCMV-hCas7f1-VPR-PGK-hCas6f、核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的pxCMV-hCas5f1-VPR-PGK-hCas8f1、核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的pxCMV-hCas8f1-VPR-PGK-hCas5f1或核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的pxCMV-hCas6f-VPR-PGK-hCas7f1中的任意一种；
(3)融合质粒V，所述融合质粒V为核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的pLenti-DR(hCas6f)-EV。
3.一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达抑制系统，其特征在于，包括以下三个组分：
(1)融合质粒I，所述融合质粒I为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的pxCMV-hCas5f1-PGK-hCas8f1；
(2)融合质粒III，所述融合质粒III为核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的pxCMV-hCas7f1-KRAB-PGK-hCas6f；
(3)融合质粒V，所述融合质粒V为核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的pLenti-DR(hCas6f)-EV。
4.权利要求2或3所述系统在制备基因表达调控工具方面的应用。
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