CN114574467B - 一种基因表达调控系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因表达调控系统及其应用。所述基因表达调控系统包含一种用于基因表达调控的质粒组合物，所述质粒组合物包含质粒1和质粒2，其中质粒1为表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的质粒；质粒2为表达mini‑CRISPR的质粒，所述mini‑CRISPR含有靶标序列以及在靶标序列的5’端和3’端均有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的序列。本发明提供的I‑F型CRISPR‑Cas双质粒系统能够准确识别并结合靶标基因的启动子区域，通过常规质粒转化即可实现对靶标基因转录表达的有效抑制。该系统在细菌基因功能研究中具有明显的简便性，同时在细菌生理学研究、代谢通路改造、天然化合物合成、药物靶点发现、新型药物开发、高通量筛选等方面都具有广阔的应用前景。

Description

一种基因表达调控系统及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种基因表达调控系统及其应用。
背景技术
CRISPR-Cas系统是一种广泛存在于原核生物中对抗噬菌体等外源可移动基因元件入侵的适应性免疫系统，CRISPR-Cas系统的发现推动分子生物学发生了前所未有的变革，在基因编辑、分子诊断、高通量筛选、细菌耐药研究等多个技术领域得到了广泛应用。目前CRISPR-Cas系统也被开发应用于基因的转录抑制，利用一个向导RNA(gRNA)引导Cas效应复合体或者缺失了核酸酶活性的Cas效应蛋白(如dCas9)至特定的靶标位置，通过阻止RNA聚合酶与靶标基因启动子的结合或阻止RNA聚合酶在DNA链上的延伸实现对靶标基因转录的抑制，引起相应的表型变化从而可以明确靶标基因的功能。该方法能够准确、高效地靶向任一基因并抑制基因表达，提高了基因功能研究的效率。
目前已经发现的CRISPR-Cas系统主要分为两类六型，其中1类系统由多个Cas蛋白所组成的效应复合体对靶标核酸序列执行剪切降解，包括I、III和IV型；2类系统则由单一Cas效应蛋白对靶标核酸序列执行剪切降解，包括II、V和VI型。由于2类系统效应蛋白比如dCas9结构的单一性，目前绝大多数CRISPR-Cas相关的转录抑制技术开发都集中围绕于dCas9展开，利用第1类系统特别是自然界中含量最丰富的I型系统对基因表达进行抑制的研究却鲜有报道。
据研究表明，I型系统在细菌特别是非模式菌株中具有较Cas9更为高效的靶向效率，开发基于I型系统的转录抑制技术将有望在更加广泛的细菌宿主中实现更为高效的基因转录抑制。但由于I型系统结构组成复杂，目前在异源细菌宿主中表达I型系统用于基因转录抑制的方法需将整个I型系统编码基因簇整合于细菌的基因组中，这将不可避免地对宿主基因组造成非预期的改变(DOI:10.1093/nar/gkab521)。如何在异源细菌宿主中使用质粒系统更为便捷地表达I型Cas效应复合体和gRNA对靶标基因的转录进行抑制尚未有报道。
发明内容
为了解决现有技术中制约I型CRISPR-Cas系统在异源细菌宿主中的应用难题，本发明提供了一种基因表达调控系统及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种用于基因表达调控的组合物。
本发明的第二个目的是提供一种用于基因表达调控的质粒组合物。
本发明的第三个目的是提供上述组合物和/或上述质粒组合物在基因表达调控中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种基因表达调控的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明基于铜绿假单胞菌UCBPP-PA14中的I-F型CRISPR-Cas系统(也称Csy系统)，在大肠杆菌中通过设计建立了能够分别稳定表达4种Csy蛋白和1个gRNA的双质粒系统，并将其应用于对靶标基因的转录表达调控。
一种用于基因表达调控的组合物，所述组合物包含Csy效应蛋白及mini-CRISPR，或包含Csy效应蛋白及gRNA；所述Csy效应蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述mini-CRISPR含有靶标序列，在靶标序列的5’端和3’端均有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的序列；所述gRNA从5’端到3’端依次为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的序列、靶标序列RNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的序列，所述靶标序列RNA为将靶标序列中的“T”换为“U”的RNA。
优选地，所述靶标序列为：在靶标基因中，正义链或反义链上的“5’-CC-3’”序列下游紧跟的长度为32bp的核苷酸序列。
更优选地，所述靶标序列为：在靶标基因的启动子区域中，正义链或反义链上的“5’-CC-3’”序列下游紧跟的长度为32bp的核苷酸序列。
所述Csy效应蛋白即为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的csy基因簇编码的4种Csy蛋白组成的复合体。
待mini-CRISPR转录出RNA后，Csy4蛋白识别该RNA中核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示序列对应的部分，将该RNA剪切加工成一个成熟的gRNA；gRNA继续与其余Csy蛋白结合组装成复合体后，通过gRNA中靶标序列RNA与受体细胞基因组上靶标序列的互补配对将Csy蛋白复合体结合于靶标序列处，通过阻止RNA聚合酶与启动子的结合抑制靶标基因的表达。
一种用于基因表达调控的质粒组合物，包含质粒1和质粒2，其中质粒1为表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列的质粒；质粒2为表达mini-CRISPR的质粒，所述mini-CRISPR含有靶标序列，在靶标序列的5’端和3’端均有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的序列。
优选地，所述质粒1中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列上游有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Ptrc启动子。
更优选地，所述质粒1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述质粒2中，mini-CRISPR的上游有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Ptrc启动子。
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Ptrc启动子既可以启动核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的csy基因簇的表达，又可以启动mini-CRISPR的表达。
上述组合物和/或上述质粒组合物在基因表达调控中的应用也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述基因表达调控为抑制基因的转录表达。
一种基因表达调控的方法，将上述质粒组合物导入靶细胞。
优选地，所述方法包括以下步骤：先将质粒1导入靶细胞；再将质粒2导入上一步所得的细胞。
优选地，所述靶细胞为大肠杆菌感受态细胞。
更优选地，所述大肠杆菌为MG1655菌株。
优选地，所述导入靶细胞的方法为电转化法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的I-F型CRISPR-Cas双质粒系统能够准确识别并结合靶标基因的启动子区域，通过常规质粒转化即可实现对靶标基因转录表达的有效抑制，实验表明具有可行性与高效性。该系统在细菌基因功能研究中具有明显的简便性，同时在细菌生理学研究、代谢通路改造、天然化合物合成、药物靶点发现、新型药物开发、高通量筛选等方面都具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为I-F型CRISPR-Cas双质粒系统的构成及工作原理的示意图；I-F型CRISPR-Cas双质粒系统包括两个基本质粒：pCsy质粒和pT-Empty质粒；I-F型CRISPR-Cas双质粒系统的工作过程为：pT-Empty质粒经过加工，连接有靶向靶标基因的mini-CRISPR，形成pT-Gene质粒；pT-Gene质粒转录出mini-CRISPR，经pCsy质粒转录翻译出的Csy4蛋白加工形成成熟的gRNA；gRNA与其余Csy蛋白结合组装成Csy-gRNA复合体，通过gRNA中靶标序列RNA与靶标基因启动子上的靶标序列进行互补配对，将Csy蛋白复合体结合于靶标序列处，通过阻止RNA聚合酶与启动子的结合抑制靶标基因的表达。
图2为MG1655 pCsy菌株中csy基因簇里4个csy基因表达的扩增曲线。
图3为MG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株的Lux发光值测定。
图4为MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株中的lacZ基因相对于MG1655 pCsy-pT-Empty菌株中lacZ基因的表达量。
图5为MG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株中的β-半乳糖苷酶活性。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明所用生物材料：感受态大肠杆菌DH5α菌株购自北京全式金生物技术有限公司(货号：CD201-02)；pBBR1-MCS5质粒、pMS402质粒、pACRISPR质粒、铜绿假单胞菌UCBPP-PA14菌株、大肠杆菌MG1655菌株均由华南农业大学群体微生物研究中心保存。
本发明所用试剂材料：庆大霉素购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(货号：AG139)；卡那霉素购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(货号：AK177)；Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(货号：CI175)；Ortho-Nitrophenyl-β-galactoside(ONPG)购自北京索莱宝科技有限公司(货号：O8040)。
实施例1 pCsy质粒的构建
以pBBR1-MCS5质粒为骨架，搭载来源于铜绿假单胞菌UCBPP-PA14基因组(NCBI基因组序列号：NC_008463.1)的csy基因簇(SEQ ID NO.1)，由Ptrc启动子(SEQ ID NO.2)驱动csy基因簇的表达。
pCsy质粒的具体构建方法如下：
1、以pACRISPR质粒(Addgene：Plasmid#113348)为模板扩增Ptrc启动子片段
(1)根据pACRISPR质粒的序列，设计上游扩增引物Ptrc启动子5’primer-1：5’-GATAAGCTTGATATCGAATTCCATATGGTATACACTTTGCCCTTTACA-3’及下游扩增引物Ptrc启动子3’primer-1：5’-CGAAAGCTGTGCTCCTGTTTAAACTCTAGAACTAGTCTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’，序列中下划线标注的为用于扩增的引物序列，其余为克隆连接所需的同源臂序列及新引入的限制酶识别位点序列。
(2)使用Vazyme公司的2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)对Ptrc片段进行PCR扩增。反应体系为：MilliQ H2O，20μL；Ptrc启动子5’primer-1(10μM)，2μL；Ptrc启动子3’primer-1(10μM)，2μL；2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)，25μL；pACRISPR质粒，1μL。反应程序为：98℃，30s；98℃，10s，60℃，5s，72℃，5s，共35个循环；72℃，1min。
(3)使用天根生化科技(北京)有限公司生产的Universal DNA纯化回收试剂盒(DP214)对PCR产物进行回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作，即得到Ptrc启动子片段-1。
2、以UCBPP-PA14基因组DNA为模板扩增csy基因簇
(1)使用北京全式金生物(TransGen Biotech)生产的
Figure BDA0003481652810000051
Genomic DNA Kit(目录号：EE101-01v)提取铜绿假单胞菌UCBPP-PA14的基因组(NCBI基因组序列号：NC_008463.1)，具体步骤根据试剂盒使用操作手册进行。
(2)以UCBPP-PA14基因组DNA(NCBI基因组序列号：NC_008463.1)为模板，通过PCR扩增得到含有csy1、csy2、csy3、csy4基因的csy基因簇。
所用上游扩增引物为csy基因簇5’primer：5’-ACTAGTTCTAGAGTTTAAACAGGAGCACA GCTTTCGAATGC-3’及csy基因簇3’primer：5’-CTATAGGGCGAATTGGAGCTCCGGCCAGCAGCCCTGA AG-3’，序列中下划线标注的为用于扩增的引物序列，其余为克隆连接所需的同源臂序列及新引入的限制酶识别位点序列。
(3)使用天根生化科技(北京)有限公司生产的Universal DNA纯化回收试剂盒(DP214)对PCR产物进行回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作，即得到csy基因簇片段。
3、酶切连接
(1)用EcoRI-HF(购自NEB公司)和SacI(购自NEB公司)对pBBR1-MCS5质粒进行双酶切，反应体系为：10×rCutSmart Buffer，5μL；pBBR1-MCS5质粒，5μg；EcoRI-HF，2μL；SacI，2μL；MilliQ H2O补足至50μL。37℃酶切2h，即得到酶切后的pBBR1-MCS5质粒。
(2)用
Figure BDA0003481652810000061
Ultra One Step Cloning Kit(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将酶切后的pBBR1-MCS5质粒和本实施例步骤1所得的Ptrc启动子片段-1及本实施例步骤2所得的csy基因簇片段进行连接。反应体系为：2×/>
Figure BDA0003481652810000062
Mix，5μL；酶切后的pBBR1-MCS5质粒，100ng；Ptrc启动子片段-1，50ng；csy基因簇片段，50ng；MilliQ H2O补足至10μL。
50℃反应15min后，置于冰上3～5min，加入感受态大肠杆菌DH5α细胞；经过42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基，37℃复苏1h；将菌液涂布到含有25μg/mL庆大霉素的LB固体培养基上，置于37℃培养箱倒置培养16h。
4、鉴定
挑取培养基上长出的菌落，用10μLMilliQ H2O重悬菌落后进行PCR鉴定，所用鉴定引物为：pCsy质粒5’primer：5’-GGCTCGTATGTTGTGTGGAA-3’、pCsy质粒3’primer：5’-TCTTCGCTATTACGCCAGCT-3’。反应体系为：MilliQ H2O，20μL；pCsy质粒5’primer(10μM)，2μL；pCsy质粒3’primer(10μM)，2μL；2×T5Super PCR Mix(Colony)(北京擎科生物科技有限公司)，25μL；菌落重悬液，1μL。
将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。
用天根生化科技(北京)有限公司生产的质粒小提试剂盒(DP103)提取经测序验证正确的质粒，即得到pCsy质粒(SEQ ID NO.3)。
本发明提供的pCsy质粒(SEQ ID NO.3)的结构如图1中的“pCsy”所示，用于表达csy基因簇，该质粒具有宿主范围广、拷贝数高、表达稳定等特点。
实施例2 pT-Empty质粒的构建
以pMS402质粒为骨架，首先在XhoI与BamHI位点之间引入Ptrc启动子及其它限制酶识别位点比如KpnI，用于后续连接mini-CRISPR。
pT-Empty质粒的具体构建方法如下：
1、以pACRISPR质粒(Addgene：Plasmid#113348)为模板扩增Ptrc启动子片段
(1)根据pACRISPR质粒的序列，设计上游扩增引物Ptrc启动子5’primer-2：5’-CCCTTTCGTCTTCACCTCGAGGTATACACTTTGCCCTTTACACATTTT-3’及下游扩增引物Ptrc启动子3’primer-2：5’-GCCGCAACTAGAGGATCCGCGGAATTCCGGGTACCCTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’，序列中下划线标注的为用于扩增的引物序列，其余为克隆连接所需的同源臂序列及新引入的限制酶识别位点序列。
(2)使用Vazyme公司的2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)对Ptrc片段进行PCR扩增。反应体系为：MilliQ H2O，20μL；Ptrc启动子5’primer-2(10μM)，2μL；Ptrc启动子3’primer-2(10μM)，2μL；2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)，25μL；pACRISPR质粒，1μL。反应程序为：98℃，30s；98℃，10s，60℃，5s，72℃，5s，共35个循环；72℃，1min。
(3)使用天根生化科技(北京)有限公司生产的Universal DNA纯化回收试剂盒(DP214)对PCR产物进行回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作，即得到Ptrc启动子片段-2。
2、酶切连接
(1)用XhoI(购自NEB公司)和BamHI-HF(购自NEB公司)对pMS402质粒进行酶切，反应体系为：10×rCutSmart Buffer，5μL；pMS402质粒，5μg；XhoI，2μL；BamHI-HF，2μL；MilliQH2O补足至50μL。37℃酶切2h，即得到酶切后的pMS402质粒。
(2)用
Figure BDA0003481652810000071
Ultra One Step Cloning Kit(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将酶切后的pMS402质粒和本实施例步骤1所得Ptrc启动子片段-2，进行连接。反应体系为：2×/>
Figure BDA0003481652810000072
Mix，5μL；酶切后的pMS402质粒，250ng；Ptrc启动子片段-2，50ng；MilliQ H2O补足至10μL。
50℃反应15min后，置于冰上3～5min，加入感受态大肠杆菌DH5α细胞；经过42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基，37℃复苏1h；将菌液涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，置于37℃培养箱倒置培养16h。
3、鉴定
挑取培养基上长出的菌落，用10μLMilliQ H2O重悬菌落后进行PCR鉴定，所用鉴定引物为：pT-Empty质粒5’primer：5’-CCGACGTCTAAGAAACCATT-3’、pT-Empty质粒3’primer：5’-TAGTCATATTTGCCATCCAT-3’。反应体系为：MilliQ H2O，20μL；pT-Empty质粒5’primer(10μM)，2μL；pT-Empty质粒3’primer(10μM)，2μL；2×T5 Super PCR Mix(Colony)(北京擎科生物科技有限公司)，25μL；菌落重悬液，1μL。
将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。
用天根生化科技(北京)有限公司生产的质粒小提试剂盒(DP103)提取经测序验证正确的质粒，即得到pT-Empty质粒(SEQ ID NO.4)。
本发明提供的pT-Empty质粒(SEQ ID NO.4)的结构如图1中的“pT-Empty”所示，Ptrc启动子除了驱动mini-CRISPR的表达，还同时驱动编码荧光脂酶的结构基因luxA、luxB、luxC、luxD、luxE的表达，即可通过检测Lux发光值来确定mini-CRISPR是否表达。
实施例3 pT-gene质粒的构建(以lacZ基因为例)
pT-gene质粒的结构如图1中的“pT-gene”所示。
以大肠杆菌MG1655(NCBI基因组序列号：NC_000913.3)的lacZ基因(基因ID：945006)作为靶标基因，构建pT-lacZ质粒。
(1)gRNA表达序列——mini-CRISPR的设计
在lacZ基因(基因ID：945006)的启动子区域中，选取核苷酸序列为“5’-CC-3’”下游连接的32bp核苷酸序列作为靶标序列设计gRNA，本发明中将gRNA的表达序列命名为mini-CRISPR。
本实施例在lacZ基因(基因ID：945006)的启动子区域中选取如下两段不同的序列作为gRNA的靶标序列：
lacZ1：5’-GCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAA-3’；
lacZ2：5’-TGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCAC-3’。
根据lacZ1的序列设计mini-CRISPR-lacZ1：
Figure BDA0003481652810000081
Figure BDA0003481652810000091
根据lacZ2的序列设计mini-CRISPR-lacZ2：
Figure BDA0003481652810000092
Figure BDA0003481652810000093
上述序列中，方框标注的为mini-CRISPR的5’端和3’端固定序列(SEQ ID NO.5)，中间无标注的为gRNA的靶标序列。
待mini-CRISPR转录出RNA后，Csy4蛋白识别该RNA中核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示序列对应的部分，将该RNA剪切加工成一个成熟的gRNA。
mini-CRISPR-lacZ1对应的gRNA-lacZ1为
Figure BDA0003481652810000094
/>
Figure BDA0003481652810000095
mini-CRISPR-lacZ2对应的gRNA-lacZ2为
Figure BDA0003481652810000096
Figure BDA0003481652810000097
上述序列中，5’端方框标注的为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的gRNA固定序列，3’端方框标注的为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的gRNA固定序列，中间无标注的为gRNA的靶标序列RNA，该靶标序列RNA为将靶标序列中的“T”换为“U”的RNA。
成熟的gRNA继续与其余Csy蛋白结合组装成复合体后，通过gRNA的靶标序列RNA与受体细胞基因组上靶标序列的互补配对将Csy蛋白复合体结合于靶标序列处。
(2)将mini-CRISPR-lacZ1和mini-CRISPR-lacZ2的序列送交生工生物生工生物工程(上海)股份有限公司，以pT-Empty质粒(SEQ ID NO.4)为骨架，在KpnI与BamHI位点之间插入mini-CRISPR-lacZ1或mini-CRISPR-lacZ2，合成即得到分别含有mini-CRISPR-lacZ1和mini-CRISPR-lacZ2的pT-gene质粒，分别命名为pT-lacZ1质粒和pT-lacZ2质粒。
实施例4 I-F型CRISPR-Cas双质粒系统的构建
1、电转感受态细胞的制备
(1)将冻存的大肠杆菌MG1655菌株在LB固体培养基上划线复苏。挑取一个单菌落于2mL LB液体培养基中37℃振摇(200rpm)培养过夜(约16h)。第二天取100μL菌液转接到10mL新鲜的LB培养基中，在37℃摇床中以200rpm转速继续振摇培养。
(2)当菌液OD600达到0.6左右，将大肠杆菌MG1655菌液置于冰上冷却30min，在4℃离心机中以4500rpm的转速离心10min。小心弃去上清，再将底部细菌沉淀重悬于5mL经灭菌、预冷处理的MilliQ H2O中。
(3)重复离心和重悬步骤3次之后，将细菌沉淀重悬于0.2mL经灭菌、预冷处理的MilliQ H2O中，即获得大肠杆菌MG1655电转感受态细胞。
2、大肠杆菌MG1655电转感受态细胞电转
(1)取0.1mL感受态细胞与500ng实施例1所得pCsy质粒(SEQ ID NO.3)混匀，转移至间隙为2mm的电转杯中进行电击，反应程序为：脉冲参数25AF；200Ω；2.5kV。
(2)电击结束后，立即加入1mL LB液体培养基混匀，并转移到培养管中，在37℃摇床中以200rpm转速孵育1h。
(3)5000rpm室温离心5min后，去除900μL的上清，并以剩余的上清重悬菌体，将重悬液涂布于含有25μg/mL庆大霉素的LB固体培养基上，于37℃培养箱中倒置培养16h，即获得含有pCsy质粒的MG1655菌株，命名为MG1655 pCsy菌株。
3、MG1655 pCsy菌株电转感受态细胞的制备
按照本实施例步骤1的方法制备得到MG1655 pCsy菌株电转感受态细胞。
4、MG1655 pCsy菌株电转感受态细胞电转
按照本实施例步骤2的方法，分别将实施例2所得pT-Empty质粒(SEQ ID NO.4)、实施例3所得pT-lacZ1质粒和pT-lacZ2质粒通过电击转化至MG1655 pCsy菌株电转感受态细胞，即获得分别含有pT-Empty质粒(SEQ ID NO.4)、实施例3所得pT-lacZ1质粒和pT-lacZ2质粒的MG1655 pCsy菌株，分别命名为MG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株。
MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株同时含有一个pCsy质粒(SEQ ID NO.3)和一个pT-lacZ质粒(分别为pT-lacZ1与pT-lacZ2)，其中pCsy质粒(SEQ IDNO.3)能够表达四种Csy蛋白，pT-lacZ1与pT-lacZ2质粒能够表达靶向lacZ基因启动子的gRNA。如图1所示，由Csy蛋白与gRNA所组成的Csy-gRNA复合体将在gRNA的引导下特异性地结合于基因组中lacZ基因的启动子，通过阻止RNA聚合酶与启动子的结合，抑制lacZ基因的转录表达。
实施例5双质粒电转菌株的功能鉴定
一、实验方法
1、csy基因的表达鉴定
(1)挑取1个MG1655 pCsy-pT-Empty菌株单菌落，在含有25μg/ml庆大霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃振摇(200rpm)培养过夜(约16h)。取100μL菌液转接到10mL含有25μg/mL庆大霉素和50μg/mL卡那霉素以及0.5mM IPTG的LB液体培养基中，在37℃摇床中以200rpm转速继续振摇培养使OD600达到0.4～0.5。
(2)以13000rpm的转速离心1min，收集1mL MG1655 pCsy-pT-Empty菌株的菌液，使用RNA提取试剂盒(购自上海普洛麦格生物产品有限公司，LOT号：0000465711)提取细菌总RNA，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。
(3)取1μg细菌总RNA，使用反转录试剂盒(购自北京全式金生物(TransGenBiotech)，目录号：AT311-02)反转录合成cDNA，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。
(4)将cDNA产物稀释20倍，使用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的Hieff
Figure BDA0003481652810000113
Power qPCR SYBR Green Master Mix(货号：11196ES08)试剂盒进行qPCR实验。所用检测引物如表1所示。
表1 qPCR引物信息
Figure BDA0003481652810000111
反应体系为：2×
Figure BDA0003481652810000112
Power qPCR SYBR Green Master Mix，10μL；csy1-F/csy2-F/csy3-F/csy4-F(10μM)，1μL；csy1-R/csy2-R/csy3-R/csy4-R(10μM)，1μL；cDNA，1μL；MilliQ H2O，7μL。反应程序为：95℃，30s；95℃，10s，60℃，30s，共40个循环。在ABI QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪(Life Technologies)进行qPCR反应，记录MG1655pCsy-pT-Empty菌株中csy1基因、csy2基因、csy3基因、csy4基因的扩增曲线。
2、靶标基因lacZ的表达鉴定
(1)分别挑取MG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655pCsy-pT-lacZ2菌株的单菌落各2个，在含有25μg/mL庆大霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃振摇(200rpm)培养过夜(约16h)。分别取100μLMG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株的菌液转接到10mL含有25μg/mL庆大霉素、50μg/mL卡那霉素以及0.5mM IPTG的LB液体培养基中，在37℃摇床中以200rpm转速继续振摇培养使OD600达到0.4～0.5。
(2)分别吸取0.2mLMG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株的菌液于白色96孔板中，用酶标仪(BioTek)分别测定三种菌液的Lux发光值。
(3)按照本实施例步骤1的方法分别提取MG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株的总RNA、反转录合成cDNA、qPCR反应。所用检测引物为lacZ-F：5’-TGTTCCGTCATAGCGATAA-3’、lacZ-R：5’-GTTCAGGCAGTTCAATCAA-3’。使用2-ΔΔCT的方法分析MG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株中lacZ基因的相对表达情况。
3、β-半乳糖苷酶活性测定
(1)分别挑取MG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655pCsy-pT-lacZ2菌株的单菌落各2个，在含有25μg/mL庆大霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃振摇(200rpm)培养过夜(约16h)。将100μLMG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株的菌液转接到10mL含有25μg/mL庆大霉素、50μg/mL卡那霉素以及0.5mM IPTG的LB液体培养基中，在37℃摇床中以200rpm转速继续振摇培养使OD600达到0.4～0.5，记录OD600数值。
(2)分别取0.2mLMG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株的菌液与0.2mL含有0.27％β-巯基乙醇的Z buffer(60mMNa2HPO4·7H2O,10mM KCl,40mM NaH2PO4·H2O,1mM MgSO4·7H2O)混合，加入20μL 0.1％SDS、10μL氯仿，剧烈震荡5min，置于37℃水浴锅中孵育5min。
(3)加入200μL 8.8mg/mLONPG，开始计时；继续在37℃水浴锅中反应，直至溶液颜色变黄；加入500μL 1M Na2CO3，停止计时。
(4)记录反应液的OD420与OD550值并计算β-半乳糖苷酶的活性。
二、实验结果
如图2所示，qPCR成功检测到4个csy基因(csy1基因、csy2基因、csy3基因、csy4基因)在MG1655 pCsy-pT-Empty菌株中的扩增曲线，说明pCsy质粒所搭载的csy基因簇能够在大肠杆菌MG1655中稳定表达。
如图3所示，MG1655 pCsy-pT-Empty菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655pCsy-pT-lacZ2菌株的菌液样品中均能检测到较高的发光值，说明MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株、MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株中的gRNA均已表达。
如图4所示，相比于MG1655 pCsy-pT-Empty菌株，MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株和MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株中lacZ基因的表达量分别降低了94％和97％，说明靶标基因lacZ的转录表达被有效抑制。
如图5所示，相比于MG1655 pCsy-pT-Empty菌株，MG1655 pCsy-pT-lacZ1菌株和MG1655 pCsy-pT-lacZ2菌株的β-半乳糖苷酶活性分别降低97％和94％，说明靶标基因lacZ的蛋白表达被有效抑制。
综上述结果表明，本发明成功构建能够抑制靶标基因表达的I-F型CRISPR-Cas双质粒系统，该双质粒系统具有可行性与高效性，通过常规的质粒转化即可实现对靶标基因的有效抑制，抑制率高达94％以上。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种基因表达调控系统及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4062
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 1
aggagcacag ctttcgaatg cgagcactcg tcaatgacaa tcgaccaagg aggcatggat 60
gacctctccc ctcccaacgc ctacgtggca ggagcttcgc cagttcatcg aatccttcat 120
ccaggagcgc ctccagggca agctggacaa actccaaccc gacgaagacg acaagcgcca 180
gacattgctg gccacccacc ggcgggaggc ctggctggcc gatgccgccc ggcgggttgg 240
ccagttgcag ttggtgaccc acacgctcaa gccgatccat cccgacgccc gcggcagcaa 300
cctgcacagc ctgccgcaag cacccggcca accgggcctc gccggttccc atgagctagg 360
tgacaggctg gtcagcgatg tggtgggcaa tgccgcggcg ctggacgtat tcaagtttct 420
cagtctccag tatcagggta aaaatcttct gaactggctg acagaagaca gtgccgaggc 480
attacaggcg ctgtccgata acgccgaaca ggctcgcgaa tggcggcaag cgttcatcgg 540
catcacgacc gtcaaaggcg ctcccgcgtc ccacagcctg gccaagcagt tgtactttcc 600
cctgcccggt tccggctacc acctgctagc accgctgttt cccaccagtc tggtgcatca 660
cgtccacgct ctgctccgcg aagcgcgctt cggcgacgcg gccaaggcgg cacgcgaagc 720
gcgcagccgc caggagtcat ggccccacgg attcagcgag taccccaacc tggcgatcca 780
gaagttcggc ggtaccaagc cgcagaacat cagtcagttg aacaacgagc gccgtggcga 840
gaactggttg ctgccatcgc ttccgccgaa ctggcaaagg cagaatgtaa acgcgccgat 900
gcggcactct tcggtcttcg agcatgactt cggaagaact cctgaagtat cccgcctaac 960
ccgtaccctg cagcgttttc ttgccaagac agtccataac aacctcgcca tccgccagcg 1020
gcgtgcccaa ttggtggcgc aaatctgcga cgaagccctg caatacgccg cccgtctgcg 1080
cgaactggag cccggctgga gcgcaacccc cgggtgccaa ctgcatgacg cggagcagct 1140
ctggctcgat ccgttgcgcg cacagaccga tgagacgttc ttgcagcgcc gactacgagg 1200
tgactggcct gccgaggtcg gaaatcgctt cgccaactgg ctgaaccggg cggtcagcag 1260
cgacagtcag atactgggta gcccggaagc cgcccaatgg agccaggagc tgagcaagga 1320
actgacgatg ttcaaggaga tactcgaaga tgagcgtgac tgatcccgag gcgctgctgt 1380
tgctgccacg cctgtccatc cagaacgcca acgccatttc cagccccttg acctggggtt 1440
tcccttcgcc cggcgctttc accggattcg tccatgcctt gcagcgtcga gtcggaatct 1500
ccctcgatat cgaactggac ggtgtcggca tcgtctgtca ccgcttcgaa gcgcagatat 1560
cgcaaccggc cggcaagcgc accaaggtct tcaacctgac ccgcaatccg ctgaaccgcg 1620
acggctccac cgcagccatc gtcgaagaag gtcgcgccca tctggaggtc agtctgctgc 1680
tcggagtgca tggcgatggt ctggacgatc accccgcaca ggaaatcgcc aggcaggtac 1740
aggagcaggc tggcgccatg cgcctcgccg gtggcagcat cctgccctgg tgcaatgagc 1800
gcttcccggc tccgaacgcc gaactgctga tgctgggtgg cagcgacgaa cagcggcgca 1860
agaaccagcg ccggcttacc cgccgcctgc tccccggctt cgccctggtg agtcgcgagg 1920
cgttgttgca acaacatctg gaaaccttgc gcaccacgct ccccgaagcc accacgctcg 1980
atgcactgct cgatctttgt cgaatcaact tcgagcctcc tgcaacctcg tccgaagaag 2040
aagcatcgcc gcccgatgca gcctggcaag tgcgcgacaa gcccggctgg ctggtgccga 2100
tcccggctgg ctacaacgcc ctgtcacccc tgtacctccc cggcgaagtg cgaaatgccc 2160
gtgatagaga aacaccgctg cgcttcgtcg aaaacctctt cggtctgggc gaatggctca 2220
gcccccatcg cgtcgccgcg ttatcggacc tgctttggta tcaccacgcc gagcctgaca 2280
aagggctcta ccgctggagc acaccccgtt tcgtcgaaca cgccatcgca taaggaaatc 2340
agcatgtcca agccaatact gagcaccgct tccgtcctcg ccttcgaacg taagctcgac 2400
ccttccgacg cccttatgag cgctggcgcc tgggcgcaac gcgacgcctc gcaggaatgg 2460
ccggccgtga ccgtgcgcga gaagtccgta cgcggcacca tctccaaccg cctcaagacc 2520
aaggaccgtg acccggccaa gctggacgcc tcgatccagt cgcccaacct gcagacggtg 2580
gacgtggcca acctgccgag cgacgccgac accctcaagg tccgcttcac cctccgtgtg 2640
ctcggcggcg ccggaacacc gtctgcctgc aacgacgcgg cctaccgtga caagctgctg 2700
caaacggtcg ccacctacgt gaacgatcag ggcttcgccg agctggctcg tcgttatgcg 2760
cacaacctgg ccaacgcccg cttcctgtgg cgcaaccggg tgggcgcgga agcggtggaa 2820
gtccgtatca accatatccg ccagggcgag gtggctcgcg cctggcgctt cgacgccctg 2880
gccatcggct tgcgcgactt caaggccgac gccgaactgg acgcgctcgc cgaactgatc 2940
gccagcggtc tctcaggcag tgggcatgtc ctgctcgaag tggtcgcctt cgcccgtatc 3000
ggcgacggcc aggaagtctt cccctcccag gaactgatcc tcgacaaagg cgacaagaaa 3060
ggccagaaga gcaagaccct gtacagcgta cgcgatgccg cggccatcca ctcgcagaag 3120
atcggcaatg ccctgcgcac catcgatacg tggtatcccg acgaagatgg cctcggcccc 3180
atcgccgtgg agccctacgg ctccgtcaca tcccagggca aagcctatcg ccagcccaag 3240
cagaagctgg acttctatac gctgctcgac aactgggtac tgcgcgacga ggcgcccgcc 3300
gtggagcaac agcattatgt gatcgccaac ctgatccgtg gcggcgtgtt cggtgaagcc 3360
gaagagaagt aagccatgga ccactacctc gacattcgct tgcgaccgga cccggaattt 3420
cccccggcgc aactcatgag cgtgctcttc ggcaagctcc accaggccct ggtggcacag 3480
ggcggggaca ggatcggcgt gagcttcccc gacctcgacg aaagccgctc ccggctgggc 3540
gagcgcctgc gcattcatgc ctcggcggac gaccttcgtg ccctgctcgc ccggccctgg 3600
ctggaagggt tgcgggacca tctgcaattc ggagaaccgg cagtcgtgcc tcaccccaca 3660
ccgtaccgtc aggtcagtcg ggttcaggcg aaaagcaatc cggaacgcct gcggcggcgg 3720
ctcatgcgcc ggcacgatct gagtgaggag gaggctcgga aacgcattcc cgatacggtc 3780
gcgagagcct tggacctgcc cttcgtcacg ctacgcagcc agagcaccgg acagcacttc 3840
cgtctcttca tccgccacgg gccgttgcag gtgacggcag aggaaggagg attcacctgt 3900
tacgggttga gcaaaggagg tttcgttccc tggttctgaa gaaccccgtc agcgccttat 3960
cggcatgtcc gcaacgaagt cccatggaaa gggacttcgt ttcgactggt gaccccggcc 4020
gacagcgaac cgcatcaatc gatacttcag ggctgctggc cg 4062
<210> 2
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtatacactt tgccctttac acattttagg tcttgcctgc tttatcagta acaaacccgc 60
gcgatttact tttcgacctc attctattag actctcgttt ggattgcaac tggtctattt 120
tcctcttttg tttgatagaa aatcataaaa ggatttgcag actacgggcc taaagaacta 180
aaaaatctat ctgtttcttt tcattctctg tattttttat agtttctgtt gcatgggcat 240
aaagttgcgt cgacgccttg ctcaaattgg aatcaggttt gtgccaatac cagtagaaac 300
agacgaagaa tccatggcgg ccgctgtcat gggcccttga caattaatca tccggctcgt 360
ataatgtgtg gcgagaccat tggtctcagt tttagagcta gaaatagcaa g 411
<210> 3
<211> 9219
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accttcggga gcgcctgaag cccgttctgg acgccctggg gccgttgaat cgggatatgc 60
aggccaaggc cgccgcgatc atcaaggccg tgggcgaaaa gctgctgacg gaacagcggg 120
aagtccagcg ccagaaacag gcccagcgcc agcaggaacg cgggcgcgca catttccccg 180
aaaagtgcca cctggcggcg ttgtgacaat ttaccgaaca actccgcggc cgggaagccg 240
atctcggctt gaacgaattg ttaggtggcg gtacttgggt cgatatcaaa gtgcatcact 300
tcttcccgta tgcccaactt tgtatagaga gccactgcgg gatcgtcacc gtaatctgct 360
tgcacgtaga tcacataagc accaagcgcg ttggcctcat gcttgaggag attgatgagc 420
gcggtggcaa tgccctgcct ccggtgctcg ccggagactg cgagatcata gatatagatc 480
tcactacgcg gctgctcaaa cctgggcaga acgtaagccg cgagagcgcc aacaaccgct 540
tcttggtcga aggcagcaag cgcgatgaat gtcttactac ggagcaagtt cccgaggtaa 600
tcggagtccg gctgatgttg ggagtaggtg gctacgtctc cgaactcacg accgaaaaga 660
tcaagagcag cccgcatgga tttgacttgg tcagggccga gcctacatgt gcgaatgatg 720
cccatacttg agccacctaa ctttgtttta gggcgactgc cctgctgcgt aacatcgttg 780
ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg cgtaacgcgc 840
ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg tacaaaaaaa cagtcataac aagccatgaa 900
aaccgccact gcgccgttac caccgctgcg ttcggtcaag gttctggacc agttgcgtga 960
gcgcatacgc tacttgcatt acagtttacg aaccgaacag gcttatgtca actgggttcg 1020
tgccttcatc cgtttccacg gtgtgcgtcc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag 1080
gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc 1140
agaatgctta atgaattaca acagttttta tgcatgcgcc caatacgcaa accgcctctc 1200
cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 1260
ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 1320
cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 1380
ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa 1440
aagctgggta ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc 1500
catatggtat acactttgcc ctttacacat tttaggtctt gcctgcttta tcagtaacaa 1560
acccgcgcga tttacttttc gacctcattc tattagactc tcgtttggat tgcaactggt 1620
ctattttcct cttttgtttg atagaaaatc ataaaaggat ttgcagacta cgggcctaaa 1680
gaactaaaaa atctatctgt ttcttttcat tctctgtatt ttttatagtt tctgttgcat 1740
gggcataaag ttgcgtcgac gccttgctca aattggaatc aggtttgtgc caataccagt 1800
agaaacagac gaagaatcca tggcggccgc tgtcatgggc ccttgacaat taatcatccg 1860
gctcgtataa tgtgtggcga gaccattggt ctcagtttta gagctagaaa tagcaagact 1920
agttctagag tttaaacagg agcacagctt tcgaatgcga gcactcgtca atgacaatcg 1980
accaaggagg catggatgac ctctcccctc ccaacgccta cgtggcagga gcttcgccag 2040
ttcatcgaat ccttcatcca ggagcgcctc cagggcaagc tggacaaact ccaacccgac 2100
gaagacgaca agcgccagac attgctggcc acccaccggc gggaggcctg gctggccgat 2160
gccgcccggc gggttggcca gttgcagttg gtgacccaca cgctcaagcc gatccatccc 2220
gacgcccgcg gcagcaacct gcacagcctg ccgcaagcac ccggccaacc gggcctcgcc 2280
ggttcccatg agctaggtga caggctggtc agcgatgtgg tgggcaatgc cgcggcgctg 2340
gacgtattca agtttctcag tctccagtat cagggtaaaa atcttctgaa ctggctgaca 2400
gaagacagtg ccgaggcatt acaggcgctg tccgataacg ccgaacaggc tcgcgaatgg 2460
cggcaagcgt tcatcggcat cacgaccgtc aaaggcgctc ccgcgtccca cagcctggcc 2520
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cccaacctgg cgatccagaa gttcggcggt accaagccgc agaacatcag tcagttgaac 2760
aacgagcgcc gtggcgagaa ctggttgctg ccatcgcttc cgccgaactg gcaaaggcag 2820
aatgtaaacg cgccgatgcg gcactcttcg gtcttcgagc atgacttcgg aagaactcct 2880
gaagtatccc gcctaacccg taccctgcag cgttttcttg ccaagacagt ccataacaac 2940
ctcgccatcc gccagcggcg tgcccaattg gtggcgcaaa tctgcgacga agccctgcaa 3000
tacgccgccc gtctgcgcga actggagccc ggctggagcg caacccccgg gtgccaactg 3060
catgacgcgg agcagctctg gctcgatccg ttgcgcgcac agaccgatga gacgttcttg 3120
cagcgccgac tacgaggtga ctggcctgcc gaggtcggaa atcgcttcgc caactggctg 3180
aaccgggcgg tcagcagcga cagtcagata ctgggtagcc cggaagccgc ccaatggagc 3240
caggagctga gcaaggaact gacgatgttc aaggagatac tcgaagatga gcgtgactga 3300
tcccgaggcg ctgctgttgc tgccacgcct gtccatccag aacgccaacg ccatttccag 3360
ccccttgacc tggggtttcc cttcgcccgg cgctttcacc ggattcgtcc atgccttgca 3420
gcgtcgagtc ggaatctccc tcgatatcga actggacggt gtcggcatcg tctgtcaccg 3480
cttcgaagcg cagatatcgc aaccggccgg caagcgcacc aaggtcttca acctgacccg 3540
caatccgctg aaccgcgacg gctccaccgc agccatcgtc gaagaaggtc gcgcccatct 3600
ggaggtcagt ctgctgctcg gagtgcatgg cgatggtctg gacgatcacc ccgcacagga 3660
aatcgccagg caggtacagg agcaggctgg cgccatgcgc ctcgccggtg gcagcatcct 3720
gccctggtgc aatgagcgct tcccggctcc gaacgccgaa ctgctgatgc tgggtggcag 3780
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cctggtgagt cgcgaggcgt tgttgcaaca acatctggaa accttgcgca ccacgctccc 3900
cgaagccacc acgctcgatg cactgctcga tctttgtcga atcaacttcg agcctcctgc 3960
aacctcgtcc gaagaagaag catcgccgcc cgatgcagcc tggcaagtgc gcgacaagcc 4020
cggctggctg gtgccgatcc cggctggcta caacgccctg tcacccctgt acctccccgg 4080
cgaagtgcga aatgcccgtg atagagaaac accgctgcgc ttcgtcgaaa acctcttcgg 4140
tctgggcgaa tggctcagcc cccatcgcgt cgccgcgtta tcggacctgc tttggtatca 4200
ccacgccgag cctgacaaag ggctctaccg ctggagcaca ccccgtttcg tcgaacacgc 4260
catcgcataa ggaaatcagc atgtccaagc caatactgag caccgcttcc gtcctcgcct 4320
tcgaacgtaa gctcgaccct tccgacgccc ttatgagcgc tggcgcctgg gcgcaacgcg 4380
acgcctcgca ggaatggccg gccgtgaccg tgcgcgagaa gtccgtacgc ggcaccatct 4440
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ccaacctgca gacggtggac gtggccaacc tgccgagcga cgccgacacc ctcaaggtcc 4560
gcttcaccct ccgtgtgctc ggcggcgccg gaacaccgtc tgcctgcaac gacgcggcct 4620
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tggctcgtcg ttatgcgcac aacctggcca acgcccgctt cctgtggcgc aaccgggtgg 4740
gcgcggaagc ggtggaagtc cgtatcaacc atatccgcca gggcgaggtg gctcgcgcct 4800
ggcgcttcga cgccctggcc atcggcttgc gcgacttcaa ggccgacgcc gaactggacg 4860
cgctcgccga actgatcgcc agcggtctct caggcagtgg gcatgtcctg ctcgaagtgg 4920
tcgccttcgc ccgtatcggc gacggccagg aagtcttccc ctcccaggaa ctgatcctcg 4980
acaaaggcga caagaaaggc cagaagagca agaccctgta cagcgtacgc gatgccgcgg 5040
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cgtaattttt ttaaggcagt tattggtgcc cttaaacgcc tggtgctacg cctgaataag 6360
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caccgcgacg caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgaggcgg ctacagccga 6720
tagtctggaa cagcgcactt acgggttgct gcgcaaccca agtgctaccg gcgcggcagc 6780
gtgacccgtg tcggcggctc caacggctcg ccatcgtcca gaaaacacgg ctcatcgggc 6840
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agttgctgct cgcccggata cagggtcggg atgcggcgca ggtcgccatg ccccaacagc 7020
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ctcgcaataa gcccggccca cgcctcatgc gctttgcgtt ccgtttgcac ccagtgaccg 7380
ggcttgttct tggcttgaat gccgatttct ctggactgcg tggccatgct tatctccatg 7440
cggtagggtg ccgcacggtt gcggcaccat gcgcaatcag ctgcaacttt tcggcagcgc 7500
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ggcgccgcag ccgccgtagg cggtcacgac tttgcgaagc aaagtctagt gagtatactc 8340
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cgttcttcga gaaggcgcac aagtggctgg cggacaagta cggggcggat cgcatcgtga 8760
cggccagcat ccaccgtgac gaaaccagcc cgcacatgac cgcgttcgtg gtgccgctga 8820
cgcaggacgg caggctgtcg gccaaggagt tcatcggcaa caaagcgcag atgacccgcg 8880
accagaccac gtttgcggcc gctgtggccg atctagggct gcaacggggc atcgagggca 8940
gcaaggcacg tcacacgcgc attcaggcgt tctacgaggc cctggagcgg ccaccagtgg 9000
gccacgtcac catcagcccg caagcggtcg agccacgcgc ctatgcaccg cagggattgg 9060
ccgaaaagct gggaatctca aagcgcgttg agacgccgga agccgtggcc gaccggctga 9120
caaaagcggt tcggcagggg tatgagcctg ccctacaggc cgccgcagga gcgcgtgaga 9180
tgcgcaagaa ggccgatcaa gcccaagaga cggcccgag 9219
<210> 4
<211> 12271
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggccgcaa aatggatggc aaatatgact aaaaaaattt cattcattat taacggccag 60
gttgaaatct ttcccgaaag tgatgattta gtgcaatcca ttaattttgg tgataatagt 120
gtttacctgc caatattgaa tgactctcat gtaaaaaaca ttattgattg taatggaaat 180
aacgaattac ggttgcataa cattgtcaat tttctctata cggtagggca aagatggaaa 240
aatgaagaat actcaagacg caggacatac attcgtgact taaaaaaata tatgggatat 300
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gcaggatgga tcattttgct ggtctggcgg aatatttatc gcggaatgga tttcatgtga 1680
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tgtctatagg aaagcagagc ttgttagcag tggttgattg gttaactaca cgaaaaataa 1800
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cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 7380
tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 7440
tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 7500
gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 7560
agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 7620
aagatgcttt tctgtgactg gtgagtttct taggccacac gttcaagtgc agccacagga 7680
taaatttgca ctgagcctgg gtgggattcg gactcgaccg catagccttc aggagtgagt 7740
tttgtgcaat accaaccgac gacttgaccc tgccaagcgg caccagattt cttgcgtacg 7800
cgatccccta agccaaaggt ggcactcagg ggaagcgcaa actgccctgc aacgggagcg 7860
ttggcttcat cgctactttg acccatgtcg aatccttctt gtgaatctat tatggcgaca 7920
agcaaatcga actctgactg cctaccccac aacaactact agaaagcacc agcacaacgg 7980
ctgcctaact ttgttttagg gcgactaccc tgctgcgtaa catcgttgct gttccataac 8040
atcaaacatc gacccacggc gtaacgcgct tagctagctt ggatgcccga ggctagactg 8100
tacaaaaaaa cagtcataac aagccatgaa aaccgccact gcgccgttac caccgctgcg 8160
ttcggtcaag gttctggacc agttgcgtga gcgcatacgc tacttgcatt acagtttacg 8220
aaccgaacag gcttatgtca actgggttcg tgaacgccgc tggtgccgct ggttggacgc 8280
caagggtgaa tccgcctcga taccctgatt actcgcttcc tgcgccctct caggcggcga 8340
taggggactg gtaaaacggg gattgcccag acgcctcccc cgccccttca ggggcacaaa 8400
tgcggcccca acggggccac gtagtggtgc gttttttgcg tttccaccct tttcttcctt 8460
ttccctttta aaccttttag gacgtctaca ggccacgtaa tccgtggcct gtagagttta 8520
aaaagggacg gatttgttgc cattaaggga cggatttgtt gttaagaagg gacggatttg 8580
ttgttgtaaa gggacggatt tgttgtattg tgggacgcag atacagtgtc cccttataca 8640
caaggaatgt cgaacgtggc ctcaccccca atggtttaca aaagcaatgc cctggtcgag 8700
gccgcgtatc gcctcagtgt tcaggaacag cggatcgttc tggcctgtat tagccaggtg 8760
aagaggagcg agcctgtcac cgatgaagtg atgtattcag tgacggcgga ggacatagcg 8820
acgatggcgg gtgtccctat cgaatcttcc tacaaccagc tcaaagaagc ggccctgcgc 8880
ctgaaacggc gggaagtccg gttaacccaa gagcccaatg gcaaggggaa aagaccgagt 8940
gtgatgatta ccggctgggt gcaaacaatc atctaccggg agggtgaggg ccgtgtagaa 9000
ctcaggttca ccaaagacat gctgccgtac ctgacggaac tcaccaaaca gttcaccaaa 9060
tacgccttgg ctgacgtggc caagatggac agcacccacg cgatcaggct ttacgagctg 9120
ctcatgcaat gggacagcat cggccagcgc gaaatagaaa ttgaccagct gcgaaagtgg 9180
tttcaactgg aaggccggta tccctcgatc aaggacttca agttgcgagt gcttgatcca 9240
gccgtgacgc agatcaacga gcacagcccg ctacaggtgg agtgggcgca gcgaaagacc 9300
gggcgcaagg tcacacatct gttgttcagt tttggaccga agaagcccgc caaggcggtg 9360
ggtaaggccc cagcgaagcg caaggccggg aagatttcag atgctgagat cgcgaaacag 9420
gctcgccctg gtgagacatg ggaagcggcc cgcgctcgac taacccagat gccgctggat 9480
ctggcctaga ggccgtggcc accacggccc ggcctgcctt tcaggctgcg caactgttgg 9540
gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct 9600
gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg 9660
gccagtgcca aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 9720
cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 9780
agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 9840
gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 9900
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 9960
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttataaggc tagtcctttt cctttgagtt 10020
gtgggtatct gtaaattctg ctagaccttt gctggaaaac ttgtaaattc tgctagaccc 10080
tctgtaaatt ccgctagacc tttgtgtgtt ttttttgttt atattcaagt ggttataatt 10140
tatagaataa agaaagaata aaaaaagata aaaagaatag atcccagccc tgtgtataac 10200
tcactacttt agtcagttcc gcagtattac aaaaggatgt cgcaaacgct gtttgctcct 10260
ctacaaaaca gaccttaaaa ccctaaaggc ttaagtagca ccctcgcaag ctcgggcaaa 10320
tcgctgaata ttccttttgt ctccgaccat caggcacctg agtcgctgtc tttttcgtga 10380
cattcagttc gctgcgctca cggctctggc agtgaatggg ggtaaatggc actacaggcg 10440
ccttttatgg attcatgcaa ggaaactacc cataatacaa gaaaagcccg tcacgggctt 10500
ctcagggcgt tttatggcgg gtctgctatg tggtgctatc tgactttttg ctgttcagca 10560
gttcctgccc tctgattttc cagtctgacc acttcggatt atcccgtgac aggtcattca 10620
gactggctaa tgcacccagt aaggcagcgg tatcatcaac aggcttaccc gtcttactgt 10680
ccctagtgct tggattctca ccaataaaaa acgcccggcg gcaaccgagc gttctgaaca 10740
aatccagatg gagttctgag gtcattactg gatctatcaa caggagtcca agcgagctct 10800
cgaaccccag agtcccgctc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg 10860
cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag 10920
ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag 10980
ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca 11040
ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgcgcgcct tgagcctggc 11100
gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag 11160
accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg 11220
gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt 11280
ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag 11340
ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt 11400
ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc 11460
ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga 11520
gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg 11580
agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg 11640
atcagatctt gatcccctgc gccatcagat ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac 11700
tttgcagggc ttcccaacct taccagaggg cgccccagct ggcaattccg acgtctaaga 11760
aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct 11820
tcacctcgag gtatacactt tgccctttac acattttagg tcttgcctgc tttatcagta 11880
acaaacccgc gcgatttact tttcgacctc attctattag actctcgttt ggattgcaac 11940
tggtctattt tcctcttttg tttgatagaa aatcataaaa ggatttgcag actacgggcc 12000
taaagaacta aaaaatctat ctgtttcttt tcattctctg tattttttat agtttctgtt 12060
gcatgggcat aaagttgcgt cgacgccttg ctcaaattgg aatcaggttt gtgccaatac 12120
cagtagaaac agacgaagaa tccatggcgg ccgctgtcat gggcccttga caattaatca 12180
tccggctcgt ataatgtgtg gcgagaccat tggtctcagt tttagagcta gaaatagcaa 12240
gggtacccgg aattccgcgg atcctctagt t 12271
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttcactgcc gtataggcag ctaagaaa 28
<210> 6
<211> 8
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cuaagaaa 8
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
guucacugcc guauaggcag 20

Claims (5)

1.一种用于细菌宿主中基因表达调控的质粒组合物，其特征在于，包含质粒1和质粒2，其中质粒1为表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列的质粒；质粒2为表达mini-CRISPR序列的质粒，所述mini-CRISPR序列含有靶标序列，且在所述靶标序列的5’端和3’端均有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的序列；
所述质粒1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述质粒2以核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的pT-Empty质粒为骨架、在KpnI与BamHI位点之间插入所述mini-CRISPR序列构建获得。
2.权利要求1所述质粒组合物在细菌宿主中的基因表达调控中的应用。
3.一种细菌宿主中的基因表达调控的方法，其特征在于，将权利要求1所述质粒组合物导入细菌靶细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：先将质粒1导入细菌靶细胞；再将质粒2导入上一步所得的细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述导入细菌靶细胞的方法为电转化法。
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