CN110819620A - 一种对类球红细菌进行基因突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对类球红细菌进行基因突变的方法。本发明提供了一种对类球红细菌进行基因点突变从而获得突变菌株的方法，包括如下步骤：基于基因编辑技术，用融合蛋白对类球红细菌的基因组进行编辑，通过筛选获得突变菌株；所述融合蛋白中含有具有DNA靶向作用的蛋白和具有单核苷酸定向突变功能的酶。本发明方法整个流程操作简单、步骤少；在针对特定代谢通路的调控上更加精准严密、脱靶率低；且具普遍适用性，是在工业生产和环境保护等方面具有重要应用价值的新型微生物基因改造技术。

Description

一种对类球红细菌进行基因突变的方法

技术领域

本发明涉及基因操作技术领域，具体涉及一种对类球红细菌进行基因突变的方法，特别涉及一种在类球红细菌中进行高通量基因点突变的方法，是一种基于基因编辑技术，将具有DNA靶向作用的蛋白和具有单核苷酸定向突变功能的酶融合在一起构建编辑质粒转化入类球红细菌中进行筛选、获得突变菌株的方法。

背景技术

基因编辑是指对靶标基因序列进行有目的地“修改”，包括DNA片段的插入、缺失、单个或多个碱基的突变等。原理是在特定核酸酶作用下导致靶标基因双链的断裂(Double-stranded break,DSB)，激活细胞天然的修复机制，通过非同源末端连接(Non-homologousend joining，NHEJ)或同源重组(Homology recombination,HR)等途径修复，从而实现对基因序列的改变。基因编辑技术发展迅速，已历经三代。

第一代为锌指核糖核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)，ZFN由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶FOKI构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成(一般3-4个)，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。但此技术专利被公司垄断，且锌指蛋白数量有限，可以识别的DNA序列数量也有限，其应用受到很大的限制。

第二代为转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)，它借助于TAL效应子：一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对，理论上可被设计识别和结合所有的目的DNA序列，但其操作过程较为繁琐，一定程度上限制了其应用。

第三代为成簇的有规律间隔的短回文重复序列/关联蛋白(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas)。CRISPR序列最早是1987年在大肠杆菌基因组中发现，但当时还不能解释，功能也未知。直到2007年该研究取得重大突破，分析得到对噬菌体有抗性的菌株基因组中含有获得的间隔序列并且该间隔序列能够匹配到对应的噬菌体上。这提供给我们一个假设：CRISPR/Cas系统会对入侵过的病毒或质粒进行遗传记忆，将其一段序列整合入自己的基因组中，等到第二次入侵的时候，便能够重启记忆，激活免疫反应。然后在2013年该系统被应用于细胞的基因组编辑，随即超越ZFN、TALEN，成为第三代的新型基因操作技术，进而引发了全球范围的基因编辑热潮并持续至今。

从CRISPRdb网站(http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/)收录的数据来看，大约87％的古菌和45％的细菌基因组中含有预测的较为可信的CRISPR系统。目前比较权威的划分方法是把CRISPR分作两大类(Class 1和Class 2)：Class 1为多亚基效应因子的复合物；Class 2为单个效应因子的蛋白。其中Class 1包括Type I、Type III、Type IV，Class 2包括Type II、Type V、Type VI。对Cas蛋白的数量、crRNA加工和打靶的机制、靶标是DNA还是RNA，不同类型各异。

CRISPR/Cas系统的作用机制可简单地分为三个步骤：获取(Acquisition)、表达(Expression)和干扰(Interference)。第一为获取阶段，首次入侵的外源DNA的前间隔序列(Protospacer)被古菌或细菌中的Cas蛋白获取，并作为间隔序列(Spacer)插入CRISPR中的两段重复序列之间。第二为表达阶段，外源DNA再次入侵时，细菌开始转录CRISPR，形成初级转录产物pre-crRNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA。第三为干扰阶段，成熟的crRNA与特异的CRISPR效应蛋白形成核糖核蛋白复合体，识别并切割能与crRNA互补配对的外源DNA。

细菌能够通过PAM分辨内源和外源序列，PAM通常为2-5bp长，TypeⅠ和TypeⅤ的PAM在5’端，TypeⅡ的PAM在3’端，而TypeⅢ不依赖PAM。不同来源的Cas9蛋白识别不同的PAM，除了经典的Streptococcus pyogenes(5’-NGG-3’)外，还有Staphylococcus aureus(5’-NNGRRT-3’)、Streptococcus thermophilus(5’-NNAGAAW-3’)等。目前报道的新凶手弗朗西斯菌Francisella novicida U112、氨基酸球菌Acidaminococcus sp.BV3L6和毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium ND2006来源的Cpf1(以下分别简称为FnCpf1、AsCpf1和LbCpf1)，其PAM分别为(5’-YTN-3’)和(5’-TTTN-3’)。

截至目前，研究最深入、应用最广泛的当属CRISPR Class 2的TypeII-A、来源于化脓链球菌Streptococcus pyogenes serotype M1的Cas9蛋白(以下简称SpCas9)。该蛋白全长1368个氨基酸(包含3个RuvC-like和1个HNH核酸酶结构域)，可以在sgRNA的引导下同时切割靶标DNA的模板链和非模板链。将SpCas9第10位的天冬氨酸突变为丙氨酸得到只切割非模板链(也叫反义链、互补链)的nCas9(D10A)，将SpCas9第840位的组氨酸突变为丙氨酸得到只切割模板链(也叫正义链、非互补链)的nCas9(H840A)，同时将这两个氨基酸突变为丙氨酸得到只具有DNA结合活性而没有切割活性的dCas9。

而CRISPR Class 2的TypeV-A的FnCpf1、AsCpf1和LbCpf1，分别含有1 300、1 307和1 228个氨基酸，与Cas9蛋白相比分子量较小，更适合病毒包装。Cpf1只需一段42-44个核苷酸组成的单链crRNA即可识别和剪切DNA，从而简化了实验设计步骤，更有利于多基因编辑；此外，Cpf1能够识别富含胸腺嘧啶(T)的PAM序列，进一步扩大了基因靶点的选择范围；由于Cpf1剪切会产生黏性末端，可促进目的基因通过非同源重组的方式插入靶点，便于新DNA序列插入。基于CRISPR-Cpf1的开发有利于突破和克服CRISPR-Cas9应用中的一些限制，这也是未来的一个热门方向。

胞嘧啶脱氨酶能将胞嘧啶(C)的氨基脱去形成尿嘧啶(U)，细胞在DNA复制的过程中会错误地把尿嘧啶这个变体识别成胸腺嘧啶来进行复制，因此最终把胞嘧啶突变成了胸腺嘧啶(C→T)。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)催化从含尿嘧啶的DNA上释放尿嘧啶，而尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂(UGI)可以与UDG进行竞争，使DNA上的尿嘧啶保留下来，进而提高了C→T置换的效率。同理，腺苷酸脱氨酶可以催化腺嘌呤(A)变为次黄嘌呤(I)，次黄嘌呤又可以与胞嘧啶进行配对，因此最终把腺嘌呤突变成了鸟嘌呤(A→G)。

类球红细菌(Rhodobacter Sphaeroides)属于紫色非硫细菌，光合细菌的一种。不仅可以产生辅酶Q10、类胡萝卜素、超氧化物歧化酶、5-氨基乙酰丙酸、氢气和D-阿洛酮糖等，还能降解农药残留、有机废水和多环芳烃等，固定二氧化碳和氮气以及补救放射性污染。Rhodobacter sphaeroides 2.4.1最早于1989年测出全基因组，作为该属的模式菌株，一直被作为发酵生产辅酶Q10的出发菌株，具有很高的工业价值。

传统的细菌基因敲除技术包括：质粒插入失活基因、转座子随机整合突变基因以及同源双交换介导的基因缺失等。其中同源双交换是最常用的方法，但其需要在质粒上先克隆出一个与靶基因有两个同源片段的突变基因，然后再进行二次交换，操作仍然费时耗力、效率低、周期长、而且通量有限，无法大规模筛选。

尽管CRISPR/Cas系统来自原核生物，但是目前却被广泛运用在真核生物中，一个很可能的因素是DNA的修复能力。一般地，DSB会被体内的非同源末端连接(NHEJ)途径或者同源重组(HR)途径来修复。在真核生物中，NHEJ占主导，HR仅仅发生在S晚期和G2期；而在原核生物中，HR占主导，几乎没有NHEJ。所以，在细菌中进行基因编辑的时候，一般都要同时引入同源重组的模板(环状的质粒DNA或者线性的双链DNA或者线性的单链DNA)。当不添加外源模板时，细菌往往直接死亡。

所以，从遗传操作水平来说，截止目前还没有通用的高效率、高通量的细菌基因编辑技术；从工业生产层面来讲，中国的次级代谢产物的产量及性质、市场占有率均不如日本、欧美等国；亟待开发出新型的针对有重大工业价值的微生物的基因组改造专利。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、有效、高通量的对类球红细菌进行基因点突变的方法。

本发明提供了一种对类球红细菌进行基因点突变从而获得突变菌株的方法。该方法可包括如下步骤：基于基因编辑技术，利用融合蛋白对类球红细菌的基因组进行编辑，通过筛选获得突变菌株；所述融合蛋白中含有具有DNA靶向作用的蛋白和具有单核苷酸定向突变功能的酶。

其中，所述基因编辑技术可为如下任一：CRISPR-Cas9技术、CRISPR-Cpf1技术、TALEN技术、ZFN技术等。所述具有DNA靶向作用的蛋白可为如下任一：Cas9蛋白、Cpf1蛋白、TALEN蛋白、ZFN蛋白等。所述具有单核苷酸定向突变功能的酶可为胞嘧啶脱氨酶或者腺苷酸脱氨酶。根据需要，所述融合蛋白中还可含有尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂。如所述融合蛋白为由所述具有DNA靶向作用的蛋白、所述具有单核苷酸定向突变功能的酶和所述尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂融合而成的融合蛋白。所述融合蛋白中的所述具有单核苷酸定向突变功能的酶和/或所述尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂既可以融合于所述具有DNA靶向作用的蛋白的N端，也可以融合于所述具有DNA靶向作用的蛋白的C端。

在本发明中，所述方法具体包括如下步骤(A)或(B)：

(A)基于CRISPR-Cas9技术，将Cas9蛋白的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因(或者腺苷酸脱氨酶的编码基因)融合在一起，得到融合基因A；利用所述融合基因A和sgRNA表达盒构建编辑质粒，所述sgRNA表达盒能够表达特异于待突变靶基因的sgRNA，然后将所述编辑质粒转化入类球红细菌中进行筛选，获得突变菌株。

(B)基于CRISPR-Cpf1技术，将Cpf1蛋白的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因(或者腺苷酸脱氨酶的编码基因)融合在一起，得到融合基因B；利用所述融合基因B和crRNA表达盒构建编辑质粒，所述crRNA表达盒能够表达特异于待突变靶基因的crRNA，然后将所述编辑质粒转化入类球红细菌中进行筛选，获得突变菌株。

所述突变菌株中的所述待突变靶基因序列发生点突变，导致基因功能的丧失或者改变。

该方法是一种基于CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1系统，利用Cas9-sgRNA或Cpf1-crRNA的定位功能和胞嘧啶脱氨酶(或腺苷酸脱氨酶)的脱氨基作用来对靶点附近的胞嘧啶进行突变成为胸腺嘧啶(或对腺嘌呤进行突变成为鸟嘌呤)的方法。

进一步地，所述融合基因A自5’端到3’端由如下组成：所述Cas9蛋白的编码基因、连接肽的编码基因、所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因(或所述腺苷酸脱氨酶的编码基因)、所述尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂的编码基因。

进一步地，所述融合基因B自5’端到3’端由如下组成：所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因或者所述腺苷酸脱氨酶的编码基因、连接肽的编码基因、所述Cpf1蛋白的编码基因。

在本发明的具体实施方式中，所述Cas9蛋白具体为来自于化脓链球菌的dCas9蛋白或nCas9(D10A)蛋白或nCas9(H840A)蛋白(这三个蛋白实际上是来源于一个蛋白SpCas9的三个突变体，其中dCas9蛋白是SpCas9蛋白的第10位和第840位的氨基酸同时突变为丙氨酸，nCas9(D10A)蛋白是SpCas9蛋白的第10位天冬氨酸突变为丙氨酸，nCas9(H840A)蛋白是SpCas9蛋白的第840位的组氨酸突变为丙氨酸)，所述Cpf1蛋白具体为来自于新凶手弗朗西斯菌的dCpf1(将FnCpf1蛋白的第917位、第1006位以及第1255位氨基酸同时突变为丙氨酸得到)(还可以为来源于别的物种的功能相似的其他蛋白，如也可以是其他的具有靶向性的DNA结合蛋白，如ZFN、TALEN等)。所述胞嘧啶脱氨酶具体为来自于七腮幔的胞嘧啶脱氨酶pmCDA1(还可以为来源于别的物种的功能相似的其他蛋白，如来自于大鼠的APOBEC1、来自于人的AICDA等)。所述腺苷酸脱氨酶具体为来自于大肠杆菌的tRNA腺苷酸脱氨酶TadA(还可以为来源于别的物种的功能相似的其他蛋白)。所述尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂具体为来自于枯草芽孢杆菌噬菌体的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂UGI(还可以为来源于别的物种的功能相似的其他蛋白)。

进一步地，所述来自于化脓链球菌的dCas9蛋白的氨基酸序列具体为SEQ IDNo.1，所述nCas9(D10A)蛋白的氨基酸序列具体为将SEQ ID No.1的第840位的丙氨酸替换为组氨酸后得到的序列，所述nCas9(H840A)蛋白的氨基酸序列为将SEQ ID No.1的第10位的丙氨酸替换为天冬氨酸后得到的序列。所述来自于新凶手弗朗西斯菌的dCpf1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2。所述来自于七腮幔的胞嘧啶脱氨酶pmCDA1的氨基酸序列具体为SEQ ID No.3。所述来自于大肠杆菌的tRNA腺苷酸脱氨酶TadA的氨基酸序列具体为SEQ IDNo.4。所述来自于枯草芽孢杆菌噬菌体的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂UGI的氨基酸序列具体为SEQ ID No.5。所述连接肽(Linker)的氨基酸序列具体为SEQ ID No.6。

根据需要，以上各蛋白的编码基因是经过密码子优化后的序列，除了按照大肠杆菌密码子优化，还可以按照其他物种的密码子表进行优化，只需保证蛋白正常表达即可。连接肽(Linker)除了本方法中的121个氨基酸外还可以是其他的柔性序列，长度及序列都无要求，只需保证不影响融合蛋白功能即可。

对应于基因水平，所述来自于化脓链球菌的dCas9蛋白的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.7；所述nCas9(D10A)蛋白的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为将SEQ ID No.7的第2518-2520位核苷酸突变为CAC后得到的序列；所述nCas9(H840A)蛋白的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为将SEQ ID No.7的第28-30位核苷酸突变为GAT后得到的序列。所述来自于新凶手弗朗西斯菌的dCpf1蛋白的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.8。所述来自于七腮幔的胞嘧啶脱氨酶pmCDA1的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.9。所述来自于大肠杆菌的tRNA腺苷酸脱氨酶TadA的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.10。所述来自于枯草芽孢杆菌噬菌体的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂UGI的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.11。所述连接肽(Linker)的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.12。

在所述方法中，所述编辑质粒中可存在一个所述sgRNA或crRNA表达盒(如对一个靶基因设计一个靶点)，也可以同时存在若干个串联的所述sgRNA或crRNA表达盒(如对一个靶基因设计多个靶点或者对多个靶基因设计多个靶点)。

这里，需要额外说明的是：当对一个基因设计一个靶点时，首先用引物sgRNA-1F(此引物中的20个N对应具体的靶点序列)和sgRNA-R以合成的sgRNA质粒为模板扩增出骨架产物，然后用引物sgRNA-2F和sgRNA-R以骨架产物为模板再次扩增得到“一个所述的sgRNA表达盒”；当对一个基因设计多个靶点或者对多个基因设计多个靶点时，具体可按照包括如下步骤的方法构建所述“若干个串联的所述sgRNA表达盒”：在两个所述sgRNA表达盒间设计接头序列adaptor，利用重叠延伸SOE PCR扩增出来多个所述sgRNA表达盒后再利用GibsonAssembly方法将其连接至目的质粒。例如用引物sgRNA-N₁-1F和sgRNA-N₁-R，以合成的sgRNA质粒为模板先扩增得到骨架再以该骨架产物为模板用sgRNA-N₁-2F和sgRNA-N₁-R扩增得到对应的完整sgRNA-N₁，同理可得sgRNA-N₂、sgRNA-N₃…….sgRNA-N_n-1、sgRNA-N_n，将这些sgRNA按顺序两两混合扩增可以得到2个sgRNA的串联体，再两两混合扩增可以得到4个sgRNA串联；以此类推可以最终得到n个sgRNA的串联(具体引物序列可参见表1)。构建crRNA的引物与sgRNA类似，同理可得到一个所述crRNA表达盒或者若干个所述串联的crRNA表达盒。

其中，所述sgRNA表达盒自5’端到3’端由启动子、用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列(即用于表达sgRNA中的crRNA中用于识别所述待突变靶基因中的靶标序列的DNA序列)、用于表达与Cas9蛋白结合部分的DNA序列以及终止子区域组成。

进一步地，所述启动子可为pj23119启动子。当然也可以换为其他的，如诱导型启动子T7、pLtetO-1等。spacer序列长度包括但不限于20bp，比如可以是18-25nt，只需保证Cas9结合效果即可。

更进一步地，所述pj23119启动子为SEQ ID No.13的第1-35位；所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.13的第36-55位；所述用于表达与Cas9蛋白结合部分的DNA序列为SEQ ID No.13的第56-97位；所述终止子区域为SEQ ID No.13的第98-137位。

更加具体地，所述sgRNA表达盒的序列为SEQ ID No.13。

所述crRNA表达盒自5’端到3’端由启动子、重复序列、用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列、以及终止子区域组成。

进一步地，所述启动子可为pj23119启动子。当然也可以换为其他的，如诱导型启动子T7、pLtetO-1等。间隔序列长度包括但不限于24bp，只需保证Cpf1结合效果即可。

更进一步地，所述pj23119启动子为SEQ ID No.14的第1-35位；所述重复序列为SEQ ID No.14的第36-55位；所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.14的第56-79位；所述终止子区域为SEQ ID No.14的第80-119位。

更加具体地，所述crRNA表达盒的序列为SEQ ID No.14。

相应的，所述编辑质粒可按照包括如下步骤的方法制备获得：(a1)向pIND4载体中克隆入筛选标记基因(如SacB基因)和多克隆位点(MCS)，得到中间质粒1；(a2)将所述融合基因克隆入所述中间质粒1的多克隆位点(MCS)处，得到中间质粒2；(a3)将一个所述sgRNA或crRNA表达盒或者若干个串联的所述sgRNA或crRNA表达盒克隆入所述中间质粒2，所得重组质粒即为所述编辑质粒。

进一步地，步骤(a1)是通过如下实现的：先对pIND4载体用NcoI和HindIII进行双酶切，得到pIND4载体骨架片段；然后将单链的引物MCS-1F和MCS-1R、引物MCS-2F和MCS-2R(具体序列见实施例)分别两两退火形成带有接头的双链DNA，接着进行磷酸化处理，然后与所述pIND4载体骨架片段连接(用T4连接酶)，形成质粒pIND4-MCS(带有多个酶切位点序列)；然后用MscI单酶切质粒pIND4-MCS后通过Gibson Assembly方法连入SacB基因，形成质粒pIND4-SacB-MCS(在高蔗糖浓度下该质粒会丢失)，即为所述中间质粒1。

进一步地，步骤(a2)是通过如下实现的：将所述中间质粒1(即质粒pIND4-SacB-MCS)用AgeI和SpeI进行双酶切，通过Gibson Assembly方法，将所述融合基因连入相应的酶切位点，形成质粒pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL或pIND4-dCpf1-CDA-UL或pIND4-TadA-dCas9(nCas9)或pIND4-TadA-dCpf1，即为所述中间质粒2。

进一步地，步骤(a3)是通过如下实现的：将所述中间质粒2(即质粒pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL或pIND4-dCpf1-CDA-UL或pIND4-TadA-dCas9(nCas9)或pIND4-TadA-dCpf1)用SpeI和SalI进行双酶切，通过Gibson Assembly方法，将一个所述sgRNA或crRNA表达盒或者若干个串联的所述sgRNA或crRNA表达盒连入相应的酶切位点，形成质粒pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL-sgRNA或pIND4-dCpf1-CDA-UL-crRNA或pIND4-TadA-dCas9(nCas9)-sgRNA或pIND4-TadA-dCpf1-crRNA，即为所述编辑质粒。

其中，所述编辑质粒的制备过程中所涉及的克隆方法不仅仅是Gibson Assembly，也可以是酶切连接或者是直接基因合成质粒，只需保证序列正确即可。

所述编辑质粒的制备过程中所采用的原始质粒也可以是除pIND4载体外的其他表达质粒(如pBBR1MCS-2、pRKSK1等)，带有别的抗性或者筛选标记，在细菌中能稳定存在并且表达蛋白的质粒都可以，拷贝数也无要求。pIND4载体自带卡那霉素抗性，其复制子为pBR322高拷贝数复制子，在酶切位点前有诱导型的Lac启动子，需要外源添加IPTG诱导蛋白表达。

在所述方法中，当融合胞嘧啶脱氨酶时，所述sgRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列所针对的所述待突变靶基因中的靶标序列具有如下所示结构中的任意一种：“C*GG”、“CC*G”。其中，*表示8-20个连续的脱氧核糖核苷酸，每个脱氧核糖核苷酸均可为A或T或C或G。所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列所针对的所述待突变靶基因中的靶标序列具有如下所示结构中的任意一种：“TT*C”、“G*AA”。其中，*表示8-24个连续的脱氧核糖核苷酸，每个脱氧核糖核苷酸均可为A或T或C或G。

在所述方法中，当融合腺苷酸脱氨酶时，所述sgRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列所针对的所述待突变靶基因中的靶标序列具有如下所示结构中的任意一种：“A*GG”、“CC*T”。其中，*表示8-20个连续的脱氧核糖核苷酸，每个脱氧核糖核苷酸均可为A或T或C或G。所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列所针对的所述待突变靶基因中的靶标序列具有如下所示结构中的任意一种：“TT*A”、“T*AA”。其中，*表示8-24个连续的脱氧核糖核苷酸，每个脱氧核糖核苷酸均可为A或T或C或G。

在本发明的具体实施方式中，所述待突变靶基因具体为appA基因和/或ppsR基因和/或crtB基因。

其中，所述appA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ppsR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述crtB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。

利用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑时，当融合胞嘧啶脱氨酶时，所述待突变靶基因为所述appA基因时，所述sgRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列具体为SEQ ID No.15的第174-193位的反向互补序列和/或第293-312位的反向互补序列。当所述待突变靶基因为所述ppsR基因时，所述sgRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.16的第1030-1049位和/或第1064-1083位的反向互补序列。当所述待突变靶基因为所述crtB基因时，所述sgRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.17的第589-606位。

利用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑时，当融合腺苷酸脱氨酶时，所述待突变靶基因为所述appA基因时，所述sgRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列具体为SEQ ID No.15的第1-16位。当所述待突变靶基因为所述ppsR基因时，所述sgRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.16的第1-12位。

利用CRISPR-Cpf1系统进行基因编辑时，当融合胞嘧啶脱氨酶时，所述待突变靶基因为所述appA基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列具体为SEQ ID No.15的第304-327位。当所述待突变靶基因为所述ppsR基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.16的第547-570位。当所述待突变靶基因为所述crtB基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.17的第817-840位。

利用CRISPR-Cpf1系统进行基因编辑时，当融合腺苷酸脱氨酶时，所述待突变靶基因为所述ppsR基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.16的第1-11位。当所述待突变靶基因为所述crtB基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.17的第1-17位。

另外，本发明还要求保护如下生物材料或应用：

所述生物材料为如下任一：(A1)前文所述的融合基因或所述的融合蛋白；(A2)前文所述的编辑质粒。

所述应用为如下任一：(B1)所述融合基因在制备所述编辑质粒中的应用；(B2)所述融合基因或所述融合蛋白或所述编辑质粒在对类球红细菌进行基因突变从而获得突变菌株中的应用。

本发明提供的是一种基于CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1，高通量对类球红细菌基因引入点突变的方法；整个流程操作简单、步骤少、无需添加外源修复模板，相比传统的同源双交换效率明显更高、实验周期明显更短；而且在针对特定的代谢通路的调控上将会更加精准严密、脱靶率低。由于dCas9或nCas9或dCpf1在细菌中一般都能表达而且毒性较小，对于较难利用wtCas9或wtCpf1直接来编辑的一些细菌来说，基因的点突变是很好的一种选择。因此本方法具有普遍适用性，是在工业生产和环境保护等方面具有重要应用价值的新型微生物基因改造技术。

附图说明

图1为编辑质粒图谱(以pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL-sgRNA为例)。

图2为实验操作流程图。

图3为待测菌株测序峰图(以ΔappA、ΔappAΔppsR为例)。

图4为待测菌株表型图(以ΔappA、ΔappAΔppsR为例)。

注：图3和图4中的NO.1为ΔappA1的突变株；NO.2为ΔappA2的突变株；NO.3为ΔappA1ΔppsR2的突变株；WT是野生型菌株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

质粒：pK18mobsacB来自于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；pIND4记载于文献“Alice C.Ind et.al.Inducible-expression plasmid for Rhodobactersphaeroides and Paracoccus denitrificans.Appl Environ Microbiol.2009Oct；75(20):6613-5”，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

下述实施例中所用到的引物序列具体如表1所示。

表1下述实施例中所用到的引物

实施例1、利用CRISPR-Cas9系统对类球红细菌进行单个基因的突变

本实施例以构建appA、ppsR、crtB基因突变株来验证本发明所述突变方法的有效性。编辑质粒图谱如图1所示，实验操作流程图如图2所示。

一、编辑质粒的构建

1、以化脓链球菌的dCas9或nCas9(nCas9蛋白分为两种，即nCas9(D10A)蛋白和nCas9(H840A)蛋白)、七腮幔的胞嘧啶脱氨酶pmCDA1(或大肠杆菌的腺苷酸脱氨酶TadA)、枯草芽孢杆菌噬菌体的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂UGI原始序列为基础，在IDT网站(http://sg.idtdna.com/codonopt)按照大肠杆菌密码子表进行密码子优化，形成新的dCas9或nCas9、pmCDA1(或TadA)、UGI。

来自于化脓链球菌的dCas9蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1；nCas9(D10A)蛋白的氨基酸序列为将SEQ ID No.1的第840位的丙氨酸替换为组氨酸后得到的序列；nCas9(H840A)蛋白为将SEQ ID No.1的第10位的丙氨酸替换为天冬氨酸后得到的序列。来自于七腮幔的胞嘧啶脱氨酶pmCDA1的氨基酸序列为SEQ ID No.3。来自于大肠杆菌的tRNA腺苷酸脱氨酶TadA的氨基酸序列为SEQ ID No.4。来自于枯草芽孢杆菌噬菌体的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂UGI的氨基酸序列为SEQ ID No.5。

来自于化脓链球菌的dCas9蛋白的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.7；nCas9(D10A)蛋白的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.7的第2518-2520碱基突变为CAC后得到的序列；nCas9(H840A)蛋白的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为将SEQ ID No.7的第28-30位碱基突变为GAT后得到的序列。来自于七腮幔的胞嘧啶脱氨酶pmCDA1的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.9。来自于大肠杆菌的tRNA腺苷酸脱氨酶TadA的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.10。来自于枯草芽孢杆菌噬菌体的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂UGI的编码基因的核苷酸序列(按照大肠杆菌密码子优化)具体为SEQ ID No.11。

全基因合成以上密码子优化后的dCas9或nCas9、pmCDA1(或TadA)、UGI序列，通过引物扩增(各引物及具体序列参见表1)连接至表达质粒pIND4，形成pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL或pIND4-TadA-dCas9(nCas9)。具体操作如下：

由于表达质粒pIND4自身可用的酶切位点不多，首先对pIND4用NcoI/HindIII进行酶切，通过两对引物MCS-1F/1R、MCS-2F/2R磷酸化退火等程序插入新的酶切位点以方便进一步的分子克隆操作，形成质粒pIND4-MCS；以pK18mobsacB为模板通过SacB-F/R引物扩增得到SacB基因(SEQ ID No.18)，然后用MscI单酶切pIND4-MCS后连接SacB基因，形成质粒pIND4-SacB-MCS，再将pIND4-SacB-MCS用AgeI/SpeI酶切，通过Gibson Assembly方法，将dCas9或nCas9、pmCDA1(或TadA)、UGI同时扩增后融合在一起(各引物及具体序列参见表1，最终所形成的融合基因自5’端到3’端由如下组成：dCas9或nCas9蛋白的编码基因、连接肽linker的编码基因、pmCDA1的编码基因、UGI的编码基因；或自5’端到3’端由如下组成：TadA的编码基因、连接肽linker的编码基因、dCas9或nCas9蛋白的编码基因。其中，连接肽linker的氨基酸序列为SEQ ID No.6，核苷酸序列为SEQ ID No.12)，构建质粒pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL或pIND4-TadA-dCas9(nCas9)。并经测序验证正确。

2、根据目的基因DNA的序列，设计对应的spacer，靶点的选择原则为PAM“NGG”的5’上游20bp左右序列。由于细菌基因组较小，脱靶效应极低，理论上对靶点无特殊要求。具体的sgRNA表达盒序列组成如下，从5’到3’依次为pj23119启动子、20bp左右的靶点、与Cas9结合的部分以及终止子区域。合成sgRNA表达盒的序列，具体如下：

TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.13)。其中，N表示A或T或G或C。

其中，SEQ ID No.13的第1-35位为pj23119启动子，第36-55位为靶点(即用于表达间隔序列spacer的DNA序列)，第56-97位为用于表达与Cas9蛋白结合部分的DNA序列，第98-137位为终止子区域。

本实施例选取在类球红细菌中具有颜色表型的appA基因(RSP_1565，核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)、ppsR基因(RSP_0282，核苷酸序列如SEQ ID No.16所示)、以及与辅酶Q10合成相关的crtB基因(RSP_0270，核苷酸序列如SEQ ID No.17所示)作为目的基因，其中当appA基因敲除后细菌由红色变为白色，而当ppsR基因敲除后细菌由红色变为深红色，而当crtB基因序列改变后可能会对辅酶Q10的产量有影响。

当融合的是胞嘧啶脱氨酶时，为了将appA、ppsR基因失活，将这两个基因序列按照“CGA*GG”或“CAG*GG”或“CAA*GG”或“CC*TGG”或“CC*ATG”的要求搜索合适的靶点来引入终止密码子(如CGA、CAG、CAA对应变为TGA、TAG、TAA；TGG变为TGA、TAG、TAA)或者突变起始密码子(如ATG变为ATA)，以终止该基因表达来失活该基因功能。注：其中*指的是若干DNA碱基，数量为6-18不等。当待突变靶基因为appA基因时，靶点位置具体为SEQ ID No.15的第174-193位的反向互补序列以及第293-312位的反向互补序列(以下简称appAsgRNA1和appAsgRNA2)。当待突变靶基因为ppsR基因时，靶点位置具体为SEQ ID No.16的第1030-1049位以及第1064-1083位的反向互补序列(以下简称ppsRsgRNA1和ppsRsgRNA2)。为了仅将crtB基因序列改变，将该基因序列按照“C*GG”或“CC*G”的大规律寻找靶点。当所述待突变靶基因为所述crtB基因时，靶点位置具体为SEQ ID No.17的第589-606位(以下简称crtBsgRNA3)。

当融合的是腺苷酸脱氨酶时，为了将appA、ppsR基因失活，将这两个基因序列按照“CC*ATG”的要求搜索合适的靶点来突变起始密码子(如ATG变为ACG)，以终止该基因表达来失活该基因功能。注：其中*指的是若干DNA碱基，数量为6-18不等。当待突变靶基因为appA基因时，靶点位置具体为SEQ ID No.15的第1-16位(以下简称appAsgRNA3)。当待突变靶基因为ppsR基因时，靶点位置具体为SEQ ID No.16的第1-12位(以下简称ppsRsgRNA3)。

3、将步骤2中得到的sgRNA分别克隆至pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL或pIND4-TadA-dCas9(nCas9)中形成编辑质粒pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL-appAsgRNA1/2、pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL-ppsRsgRNA1/2、pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL-crtB3和pIND4-TadA-dCas9(nCas9)-appAsgRNA3、pIND4-TadA-dCas9(nCas9)-ppsRsgRNA3。具体操作如下：对pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL或pIND4-TadA-dCas9(nCas9)用SpeI/SalI进行酶切，通过Gibson assembly方法将步骤2设计得到的sgRNA插入形成最终的编辑质粒。将经测序验证正确的编辑质粒先热激转化入大肠杆菌DH5α中，挑取单克隆摇菌培养，进行质粒大提操作，具体步骤见产品说明书。

上述步骤中所涉及的常规扩增PCR反应体系为：10-100ng模板；2.5μL正向引物(10μM)；2.5μL反向引物(10μM)；25μL 2×Q5reaction mix；ddH₂O补足至50μL。(当以菌落为模板时，需要另外添加1μL DMSO)

上述步骤中所涉及的常规扩增PCR反应程序为：98℃2min；98℃10s，50-60℃20s，72℃2Kb/min，30个循环；72℃5min；4℃保存。

上述步骤中所涉及的酶切反应体系为：1μg质粒；1μL NEB限制性内切酶A；1μL NEB限制性内切酶B；5μL 10×NEB CutSmart Buffer；ddH₂O补足至50μL。(若是单酶切时只需添加一种限制性内切酶并且其余用ddH₂O补足体系即可)。

上述步骤中所涉及的酶切反应程序为：37℃1h；65℃或80℃(不同的酶热变性失活的温度不一样)20min终止反应。

上述步骤中所涉及的连接反应体系为：2μL待连接片段；1μL已酶切回收的质粒；1μL10×T4DNA ligase buffer；1μL T4DNA ligase；ddH₂O补足至10μL。

上述步骤中所涉及的连接反应程序为：16℃12h。

上述步骤中所涉及的Gibson Assembly连接体系为：1μL已酶切回收的质粒；1μL待连接的片段；2μL 2×Gibson Assembly mix。

上述步骤中所涉及的Gibson Assembly反应程序为：50℃20min；65℃10min终止反应。

上述步骤中所涉及的引物磷酸化反应体系为：1μL引物1(100μM)；1μL引物2(100μM)；1μL T4Pnk；2μL 10×T4Pnk Buffer；2μL rATP(10mM)；ddH₂O补足至20μL。

上述步骤中所涉及的引物磷酸化反应程序为：37℃1h。

上述步骤中所涉及的菌落鉴定PCR反应体系为：1μL菌液；1μL正向引物(10μM)；1μL反向引物(10μM)；10μL 2×Taq PCR MasterMix；ddH₂O补足至20μL。

上述步骤中所涉及的菌落鉴定PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50-60℃30s，72℃1Kb/min，24个循环；72℃5min；4℃保存。

二、质粒转化及转化子筛选

1、将美国ATCC公司产品——货号为#17023的标准菌株Rhodobacter sphaeroidesATH 2.4.1(以下简称类球红细菌2.4.1)划线分离出单克隆，挑菌摇瓶培养制备电转化感受态，具体步骤如下：(1)从PYG平皿上挑取单个菌落于10ml摇菌管中过夜活化。(2)将活化的菌液按1:100转接到500ml三角瓶中摇至OD＝0.6-0.8。(3)将三角瓶放置在冰上预冷10-30min。(4)把菌液分装至50ml灭菌离心管中，5000rpm离心5-10min。(5)弃上清，加入40mlddH₂O，洗涤菌体数次后5000rpm离心10min。(6)弃上清，加入40ml 10％甘油，洗涤菌体数次后6000rpm离心10min。(7)弃上清，加入20ml 10％甘油，洗涤菌体数次后6000rpm离心10min。(8)弃上清，加入10ml 10％甘油，洗涤菌体数次后6000rpm离心10min。(9)弃上清，加入5ml 10％甘油，均匀混合菌体，在冰上分装至1.5ml灭菌离心管中。(10)于液氮中速冻并存放于-80℃冰箱。

其中，培养基及相关生长条件如下：

PYG培养基成分：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；葡萄糖1g/L；ddH₂O添加至1L，若用固体培养基则需另外添加琼脂粉15g-20g/L；若要消除质粒则需另外添加高浓度蔗糖；pH用盐酸调节为6.8～7.0。

PYG培养基115℃灭菌20min备用，若要添加抗生素需再添加卡那霉素至终浓度25μg/mL。这里需要说明的是：所述的培养基配方也可以是其他营养成分的组合，只需保证细菌的正常生长要求即可。

细菌28-30℃培养，摇床转速180-220rpm。

2、取步骤一中大提的编辑质粒1-5μg加入步骤1中制备的100μL电转化类球红细菌2.4.1感受态中，先在冰上静置一会，然后转移至预冷的0.1cm电击杯中，设置电转仪参数1.8kv并按下电击按钮，然后加入预热的PYG培养基(此时可添加适量IPTG)，30℃摇床恢复培养3-4h，最后均匀涂布在终浓度为0.5mM IPTG的卡那霉素抗性平皿上，放置于培养箱中培养。

这里需要说明的是：上述步骤中的所述大提质粒、电转化感受态的制备，也可以采用结合转移的方法进行，如利用带有编辑质粒的大肠杆菌S-17等直接与宿主菌悬液按适当比例混合也能够得到结合转化子，且此种方法无需大提质粒操作。

3、待5至7天后，步骤2中平皿上长出一定数量的克隆，随机挑取几个克隆，将其转移至含有高蔗糖的无抗性平皿上观察表型(当appA基因敲除后细菌由红色变为白色，而当ppsR基因敲除后细菌由红色变为深红色，而当crtB基因敲除后细菌由红色变为黄绿色)，同时利用菌落鉴定PCR检测靶点基因上下游1Kb附近是否有突变，具体反应体系见步骤一。上样琼脂糖电泳之后切取目的大小条带送样测序，相关鉴定引物如表1所示，其中appA-test-F/R扩增大小为1977bp，ppsR-test-F/R扩增大小为2162bp，crtB-test-F/R扩增大小为1989bp。

4、结果

待测菌株测序峰图如图3所示。待测菌株表型图如图4所示。统计待测菌株的序列差异及总的突变概率，详细见表2。当融合胞嘧啶脱氨酶时，对于dCas9的appAsgRNA1和appAsgRNA2靶点，阳性率为100％；ppsRsgRNA1靶点阳性率为88.9％；ppsRsgRNA2靶点阳性率为40％；crtBsgRNA3靶点的阳性率为25％；对于nCas9的appAsgRNA1、appAsgRNA2靶点和ppsRsgRNA2靶点，阳性率为100％；ppsRsgRNA1靶点阳性率为96.3％；crtBsgRNA3靶点的阳性率为66.7％。当融合腺苷酸脱氨酶时，对于dCas9的appAsgRNA3靶点阳性效是100％，对ppsRsgRNA3靶点阳性率是80％；对于nCas9的appAsgRNA3靶点的效率是100％，对ppsRsgRNA3靶点阳性率是87.5％。

表2单个基因突变数据统计(加阴影的碱基为突变碱基)

注：表中下划线为PAM“NGG”所在区域，PAM的5’上游为20bp靶点序列。括号内的分子为含有相应突变的克隆数，分母为检测的总克隆数

实施例2、利用CRISPR-Cas9系统对类球红细菌进行多个基因的同时突变

实施例2中所涉及的实验步骤同实施例1，不同的是实施例2中的sgRNA为多个sgRNA表达盒的串联，具体如下：

当要构建两个及以上的串联sgRNA时，按照顺序先把前两个sgRNA1、sgRNA2混合作模板，用两头的引物(sgRNA1-2F/sgRNA2-R)扩增得到sgRNA1-sgRNA2，再以该串联sgRNA1-sgRNA2和后面的sgRNA3混合作模板，用新的两头引物(sgRNA1-2F/sgRNA3-R)扩增得到sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3，再以该串联sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3和后面的sgRNA4混合作模板，用新的两头引物(sgRNA1-2F/sgRNA4-R)扩增得到sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-sgRNA4，依此类推可得到若干个sgRNA串联。

本实施例中具体操作如下：用表1中的引物appAsgRNA1-N₁-1F和appAsgRNA1-N₁-R以合成的sgRNA质粒为模板先扩增得到骨架产物，再用引物appAsgRNA1-N₁-2F和appAsgRNA1-N₁-R以该骨架产物为模板扩增得到appAsgRNA1，同理可得到appAsgRNA2，然后以appAsgRNA1、appAsgRNA2的混合物为模板，用两头的引物appAsgRNA1-N₁-2F和appAsgRNA2-N₂-R进行SOE PCR扩增得到两个串联的sgRNA，即appAsgRNA1-appAsgRNA2，同理可得到appAsgRNA1-ppsRsgRNA2以及appAsgRNA3-ppsRsgRNA3。当构建三个串联的sgRNA时，用ppsRsgRNA2-N₂-1F/ppsRsgRNA2-N₂-R’和ppsRsgRNA2-N₂-2F/ppsRsgRNA2-N₂-R’先后扩增得到ppsRsgRNA2，再按上述步骤得到appAsgRNA1-ppsRsgRNA2-crtBsgRNA3。

经过上述操作，实现：

1、将appAsgRNA1和appAsgRNA2串联得到对appA单个基因设计两个靶点的质粒pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL-appA1appA2，并经测序验证正确。

2、将appAsgRNA1和ppsRsgRNA2或者将appAsgRNA3和ppsRsgRNA3串联得到对appA、ppsR这两个基因各设计一个靶点的质粒pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL-appA1ppsR2或pIND4-TadA-dCas9(nCas9)-appA3ppsR3，并经测序验证正确。

3、将appAsgRNA1、ppsRsgRNA2、crtBsgRNA3串联得到对appA、ppsR、crtB这三个基因各设计一个靶点的质粒pIND4-dCas9(nCas9)-CDA-UL-appA1ppsR2crtB3，并经测序验证正确。

将上述质粒转化入类球红细菌2.4.1中，筛选转化子，结果如表3和表4所示。当融合胞嘧啶脱氨酶时，对于dCas9的appA1-appA2和appA1-ppsR2靶点，获得纯的双突变克隆的概率是33.3％(1/3)，appA1-ppsR2-crtB3靶点没有获得纯的三突变克隆，因此还需在含有相对较多突变的转化子的基础上进一步诱导突变并且分离纯化；对于nCas9的appA1-appA2和appA1-ppsR2靶点，仅获得混合的双突变克隆，而appA1-ppsR2-crtB3靶点同样没有获得纯的三突变克隆，这样就都需要对挑选的转化子再经过一次诱导突变并且分离纯化，不过最终都能得到相应的突变。当融合腺苷酸脱氨酶时，对于dCas9的appA3-ppsR3靶点，获得的双突变克隆的概率是33.3％(1/3)；对于nCas9的appA3-ppsR3靶点仅获得混合的双突变克隆。

表3多个基因突变数据统计(融合胞嘧啶脱氨酶)

表4多个基因突变数据统计(融合腺嘌呤脱氨酶)

注：mut为突变基因型，mix为混合的基因型，wt为野生基因型。

实施例3、利用CRISPR-Cpf1系统对类球红细菌进行单个基因的突变

本实施例同实施例1，不同的是将Cas9换为dCpf1，将sgRNA换为crRNA。

其中dCpf1蛋白来自于新凶手弗朗西斯菌，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2，对应的核苷酸序列(大肠杆菌密码子优化)为SEQ ID No.8。

crRNA表达盒的序列具体如下：

TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGGATCCGAATTTCTACTGTTGTAGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID No.14)。其中，N表示A或T或G或C。

其中，SEQ ID No.14的第1-35位为启动子；SEQ ID No.14的第36-55位为重复序列；SEQ ID No.14的第56-79位为用于表达间隔序列的DNA序列；SEQ ID No.14的第80-119位为终止子区域。

当融合胞嘧啶脱氨酶时，为了将appA、ppsR、crtB基因失活，按照“TT*CGA”、“TT*CAG”、“TT*CAA”、“ATG*AA”的要求来寻找靶点。注：其中*指的是若干DNA碱基，数量为6-21不等。当所述待突变靶基因为所述appA基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列具体为SEQ ID No.15的第304-327位(以下简称为appAcrRNA1)。当所述待突变靶基因为所述ppsR基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.16的第547-570位(以下简称为ppsRcrRNA1)。当所述待突变靶基因为所述crtB基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ IDNo.17的第817-840位(以下简称为crtBcrRNA1)。

当融合腺苷酸脱氨酶时，为了将ppsR、crtB基因失活，按照“ATG*AA”要求来寻找靶点。注：其中*指的是若干DNA碱基，数量为6-21不等。当所述待突变靶基因为所述ppsR基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.16的第1-11位(以下简称为ppsRcrRNA2)。当所述待突变靶基因为所述crtB基因时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列(spacer)的DNA序列为SEQ ID No.17的第1-17位(以下简称为crtBcrRNA2)。

首先，全基因合成经过大肠杆菌密码子优化的dCpf1、pmCDA1、UGI、TadA，通过引物扩增构建连接等步骤构建pIND4-dCpf1-CDA-UL或pIND4-TadA-dCpf1。

然后，将设计的crRNA克隆至上述中间载体形成pIND4-dCpf1-CDA-UL-appAcrRNA1、pIND4-dCpf1-CDA-UL-ppsRcrRNA1、pIND4-dCpf1-CDA-UL-crtBcrRNA1或pIND4-TadA-dCpf1-ppsRcrRNA2、pIND4-TadA-dCpf1-crtBcrRNA2。

接着将上述编辑质粒电转化进类球红细菌2.4.1中，筛选转化子，结果如下表5所示。

当融合胞嘧啶脱氨酶时，对于dCpf1的appAcrRNA1、ppsRcrRNA1、crtBcrRNA1靶点，阳性率分别为66.6％、100％、60％；当融合腺苷酸脱氨酶时，对于dCpf1的ppsRcrRNA2靶点阳性效是100％，对crtBcrRNA2靶点阳性率是75％。

表5单个基因突变数据统计(加阴影的碱基为突变碱基)

注：表中下划线为PAM“TTN”所在区域，PAM的3’下游为24bp靶点序列。括号内的分子为含有相应突变的克隆数，分母为检测的总克隆数

实施例4、利用CRISPR-Cpf1系统对类球红细菌进行多个基因的同时突变

本实施例同实施例3，不同的是本例中crRNA为多个crRNA表达盒的串联。

将appAcrRNA1和ppsRcrRNA1串联后连接至pIND4-dCpf1-CDA-UL得到pIND4-dCpf1-CDA-UL-appA1ppsR1，将appAcrRNA1、ppsRcrRNA1、crtBcrRNA1串联后连接至pIND4-dCpf1-CDA-UL得到pIND4-dCpf1-CDA-UL-appA1ppsR1crtB1，将ppsRcrRNA2、crtBcrRNA2串联后连接至pIND4-TadA-dCpf1得到pIND4-TadA-dCpf1-ppsR2crtB2。上述质粒经测序验证正确。

接着将上述编辑质粒电转化进类球红细菌2.4.1中，筛选转化子，结果如下表6和表7所示。

当融合胞嘧啶脱氨酶时，对于双靶点appA1ppsR1，效率为66.6％，对于三靶点appA1ppsR1crtB1，未能一次获得突变，需要进一步诱导分离纯化。当融合腺苷酸脱氨酶时，对于双靶点ppsR2crtB2，效率为33.3％。

表6多个基因突变数据统计(融合胞嘧啶脱氨酶)

表7多个基因突变数据统计(融合腺苷酸脱氨酶)

注：mut为突变基因型，mix为混合的基因型，wt为野生基因型。

若是用于单个靶点的突变，可以发现无论是用dCas9或者是nCas9都能获得相应的突变株，总的来说nCas9的效率高于dCas9；但是若是用于多靶点的突变，由于nCas9的微弱毒性可能长出来的克隆数会更少，因此这个时候利用dCas9会有优势。而且本研究发现，若对第一次长出来的混合的转化子进行二次诱导，那么将会获得更多的和更稳定的突变株。因此只需提高本底的细菌数量及诱导时间和剂量有望获得更多的突变类型。

另外，对高GC含量的类球红细菌全基因组进行分析，其编码基因有4287个，符合“C*GG”或“CC*G”或“A*GG”或“CC*T”要求的靶点所对应的基因几乎占100％；符合“CGA*GG”或“CAG*GG”或“CAA*GG”或“CC*TGG”或“CC*ATG”要求的靶点所对应的基因占98.6％(4226/4287)。所以本方法的实施覆盖范围广、靶点选择多。

综上所述，本发明是一种基于CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1系统，利用Cas9-sgRNA或Cpf1-crRNA的定位功能和胞嘧啶脱氨酶(或腺苷酸脱氨酶)的脱氨基作用来对靶点附近胞嘧啶进行突变成为胸腺嘧啶(或者对腺嘌呤进行突变成为鸟嘌呤)的方法。对于单个基因的突变效率为25％-100％，对于两个基因的同时突变效率为33.3％，对于三个基因同时突变效率为10％，对于更多基因的同时突变，可以在含有相对较多突变的菌株的基础上进一步加诱导剂后分离纯化。本文中的编辑质粒含有SacB基因，在高蔗糖浓度的条件下会发生丢失，因此还可以通过将获得的单个基因或多个基因的突变株消除质粒之后制备成感受态，再转化入带有新的靶点的质粒筛选将获得新的更多个基因突变的菌株。本方法操作简单、重复性好、通量高，可以建立质粒文库在全基因组水平进行筛选，实现精准基因突变，并可适用于其他细菌。

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<130> GNCLN181319

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<210> 1

<211> 1368

<212> PRT

<213> Streptococcus pyogenes serotype M1

<400> 1

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

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Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

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Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

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<213> Francisella tularensis subsp. novicida (strain U112)

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210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu

225 230 235 240

Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg

245 250 255

Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr

260 265 270

Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile

290 295 300

Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys

305 310 315 320

Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser

325 330 335

Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met

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Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys

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Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln

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Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr

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Leu Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys

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Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser

165 170 175

Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser

180 185 190

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr

195 200 205

Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg

210 215 220

Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly

225 230 235 240

Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala

245 250 255

Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg

260 265 270

Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys

275 280 285

Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val

290 295 300

Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His

305 310 315 320

Tyr Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala

325 330 335

Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln

340 345 350

Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly

355 360 365

Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

370 375 380

Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser

385 390 395

<210> 5

<211> 84

<212> PRT

<213> Bacillus phage AR9

<400> 5

Met Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

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Gly Asp Ile Leu Arg Ile Arg Asp Lys Pro Glu Glu Gln Trp Trp Asn

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His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Arg Leu Glu Ser

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Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60

atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420

aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600

attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660

cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720

ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780

gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840

caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900

ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960

atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020

caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080

ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140

gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200

aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260

gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320

gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380

cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440

gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500

aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560

tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620

tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680

gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740

tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800

attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860

ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920

cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980

cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040

gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100

agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160

catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220

gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280

attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340

atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400

gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460

gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatgcc 2520

attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580

gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640

aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700

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ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820

actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880

aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940

taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000

tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060

atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120

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cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240

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cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360

gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420

tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480

aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540

tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600

tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660

caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720

cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780

cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840

attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900

ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960

cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020

gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080

gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107

<210> 8

<211> 3903

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

atgtcgatct accaggagtt cgtgaataaa tatagcctga gcaagaccct ccggttcgag 60

ctgatccccc aggggaagac gctggagaat atcaaagcgc gcgggctgat cctggatgat 120

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gatgaagtct tcgaaatcgc caatttcaat aactacctca accagtcggg gatcaccaaa 840

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ctcttcatca aggatgataa gtactacctg ggggtcatga ataaaaaaaa caacaaaatc 1920

ttcgacgaca aggcgatcaa ggagaataag ggggaagggt acaagaaaat cgtctataaa 1980

ctgctgccgg gcgccaataa aatgctgccg aaagtcttct tcagcgccaa atcgatcaag 2040

ttctataatc cgagcgaaga tatcctccgc atccgcaatc attcgaccca caccaagaat 2100

ggcagcccgc agaaaggcta tgaaaaattc gagttcaaca tcgaggattg ccggaaattc 2160

atcgacttct ataaacagtc gatctccaaa caccccgaat ggaaggactt cgggttccgc 2220

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aaaaagttct tcgcgaagct gacgtccgtc ctcaatacca tcctccagat gcggaattcg 3660

aagacgggca ccgagctgga ttacctgatc tcgcccgtgg cggatgtcaa tggcaatttc 3720

ttcgatagcc ggcaggcgcc caagaatatg ccccaggacg ccgccgcgaa cggggcgtat 3780

catatcggcc tgaaagggct catgctgctc gggcggatca aaaataacca ggaggggaaa 3840

aaactgaacc tggtcatcaa gaatgaagag tatttcgaat tcgtgcagaa ccgcaacaac 3900

tga 3903

<210> 9

<211> 627

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

atgaccgacg ctgagtacgt gagaatccat gagaagttgg acatctacac gtttaagaaa 60

cagtttttca acaacaaaaa atccgtgtcg catagatgct acgttctctt tgaattaaaa 120

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ctcagagata acggggttgg gttgaatgta atggtaagtg aacactacca atgttgcagg 480

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ttgaagcgag ctgaaaaacg acggagcgag ttgtccatta tgattcaggt aaaaatactc 600

cacaccacta agagtcctgc tgtttga 627

<210> 10

<211> 1191

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

atgtcggagg tggagttctc gcacgagtac tggatgcgcc acgccctgac cctggccaaa 60

cgcgcctggg acgagcgtga agtgccggtg ggtgccgtgc tggtgcacaa caaccgcgtg 120

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ccgggcacct cggaatcggc caccccggaa tcgtcgggcg gctcttctgg cggctcgtcg 600

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cagtcgtcga ccgattcggg cggctcgtcg ggtggttcgt cgggctcgga aaccccgggc 1140

acctcggaat cggccacccc ggaatcgtcg ggcggttcgt cgggtggctc t 1191

<210> 11

<211> 255

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

atgaccaacc tttccgacat catagagaag gaaacaggca aacagttggt catccaagag 60

tcgatactca tgcttcctga agaagttgag gaggtcattg ggaataagcc ggaaagtgac 120

attctcgtac acactgcgta tgatgagagc accgatgaga acgtgatgct gctcacgtca 180

gatgccccag agtacaaacc ctgggctctg gtgattcagg actctaatgg agagaacaag 240

atcaagatgc tagga 255

<210> 12

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

ggtggaggag gttctggagg tggaggttct gctgagtatg tgcgagccct ctttgacttt 60

aatgggaatg atgaagagga tcttcccttt aagaaaggag acatcctgag aatccgggat 120

aagcctgagg agcagtggtg gaatgcagag gacagcgaag gaaagagggg gatgattcct 180

gtcccttacg tggagaagta ttccggagac tataaggacc acgacggaga ctacaaggat 240

catgatattg attacaaaga cgatgacgat aagtctaggc tcgagtccgg agactataag 300

gaccacgacg gagactacaa ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagtct 360

agg 363

<210> 13

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(55)

<223> n为a或t或c或g

<400> 13

ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagtnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngtttt 60

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cgagtcggtg ctttttt 137

<210> 14

<211> 119

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(79)

<223> n为a或t或c或g

<400> 14

ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg gatccgaatt tctactgttg tagatnnnnn 60

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgctttttt 119

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<211> 1353

<212> DNA

<213> Rhodobacter sphaeroides 2.4.1

<400> 15

atgcaacacg acctcgaggc ggacgtcacg atgacgggct cggatctggt ttcctgctgc 60

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aagcgcatca accccgaatt cctgctggcg aacgtcatgc cgagcgtgct gacccgcatc 1320

tcctcgcgcc aggaccgccg ccgcagcgcc tga 1353

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<212> DNA

<213> Rhodobacter sphaeroides 2.4.1

<400> 16

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accgcggccg acatctcgct gctcgtctcg caggaagggg tggtccggga ggtgatggcc 120

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gtgctgaccg ccgagagcgt cgccaagttc cgcctgcgca gcgaggggct tgaacccggc 240

cgcggatcgg tcgcggtcga gctgaaccac atcgatccgc gcagcttcga gtttccgatc 300

cgctacatcc tgcaccgcct gccggccgac cgctcgatcc tgatgctcgg gcgcgacctg 360

cgccccatcg cagaggtgca gcagcagctg gtcgcggcgc agcttgcgat ggaacgcgac 420

tacgagaccc agcgcgagat ggagacccgc taccgcgtgg tgctcgacgt gtcgcgcgat 480

ccgatggtgc tcgtctcgat gtccaccggg cggatcgtcg atctgaacag cgcggcgggg 540

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ggacggcggc gcggcgagtt catggagacg atgaccaatc tcgcggcgac cgaaagtgct 660

gcgccggtcg aggtgctggc gcggcggtcg cagaagcggc ttctggtggt gccgcgtgtc 720

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tggctcgatg accgcgagcg cccgctgctc gttcttgtcg tgcgggacac gagccgggcc 1140

gacacgatgc gcaggcccgt gcccgcgacg ggcgtgatcg acgagcccgc ccgcaatgtt 1200

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gagatgctct cgctgtcgcg gcagtcgctt tatgtgaagc tgcgcaagtt cggcctcctg 1380

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<210> 17

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<212> DNA

<213> Rhodobacter sphaeroides 2.4.1

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atgattgcct ctgccgatct cgatgcctgc cgggagatga tccgcaccgg ctcctattcc 60

ttccatgccg cgtcccgcct gctgcccgag cgcgtgcgcg cgccgtcgct ggcgctctat 120

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gaggatgccg aggtcaagcg ccgcgccgtc ctgagcctgc gcgaccggct ggacctcgtc 240

tatggcggcc gcccgcgcaa tgcgccggcc gaccgcgcct tcgccgcggt ggtcgaggag 300

ttcgagatgc cccgggcgct gcccgaggcg ctgctcgagg ggctcgcctg ggacgcggtg 360

gggcggagct acgacagttt ctcgggcgtg ctcgactatt cggcgcgggt ggccgcggcg 420

gtgggggcga tgatgtgcgt cctcatgcgg gtgcgcgatc ccgacgtgct ggcccgggcc 480

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cgctcgggac ggatctatct gccgcgcgac tggatggagg aggaggggct gccggtcgag 600

gagttcctcg cccggccggt ggtcgacgac cgcatccgcg cggtgacgca ccgcctgctg 660

cgcgcggccg accggctcta tctgcgttcg gaagcggggg tctgcggcct gcctctggcc 720

tgccggcccg gcatctatgc cgcgcgccac atctatgcgg gtatcggcga cgagatcgcg 780

cggaacggct atgacagcgt gacgcgccgc gccttcacca cgcggcgcca gaagctcgtc 840

tggctcgggc tctcggccac acgcgcggcc ctcagcccgt tcggccccgg ctgcgccacg 900

ctgcatgcgg cgcccgagcc cgaagtggcc ttcctcgtca atgccgccgc ccgggcccgg 960

ccgcagcgcg gccgctccga ggcgctgatc tcggttctgg cccagctcga ggcgcaggat 1020

cggcagatct cgcggcagcg actggggaac cgggccaacc cgatctag 1068

<210> 18

<211> 1868

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

cacatatacc tgccgttcac tattatttag tgaaatgaga tattatgata ttttctgaat 60

tgtgattaaa aaggcaactt tatgcccatg caacagaaac tataaaaaat acagagaatg 120

aaaagaaaca gatagatttt ttagttcttt aggcccgtag tctgcaaatc cttttatgat 180

tttctatcaa acaaaagagg aaaatagacc agttgcaatc caaacgagag tctaatagaa 240

tgaggtcgaa aagtaaatcg cgcgggtttg ttactgataa agcaggcaag acctaaaatg 300

tgtaaagggc aaagtgtata ctttggcgtc accccttaca tattttaggt ctttttttat 360

tgtgcgtaac taacttgcca tcttcaaaca ggagggctgg aagaagcaga ccgctaacac 420

agtacataaa aaaggagaca tgaacgatga acatcaaaaa gtttgcaaaa caagcaacag 480

tattaacctt tactaccgca ctgctggcag gaggcgcaac tcaagcgttt gcgaaagaaa 540

cgaaccaaaa gccatataag gaaacatacg gcatttccca tattacacgc catgatatgc 600

tgcaaatccc tgaacagcaa aaaaatgaaa aatatcaagt ttctgaattt gattcgtcca 660

caattaaaaa tatctcttct gcaaaaggcc tggacgtttg ggacagctgg ccattacaaa 720

acgctgacgg cactgtcgca aactatcacg gctaccacat cgtctttgca ttagccggag 780

atcctaaaaa tgcggatgac acatcgattt acatgttcta tcaaaaagtc ggcgaaactt 840

ctattgacag ctggaaaaac gctggccgcg tctttaaaga cagcgacaaa ttcgatgcaa 900

atgattctat cctaaaagac caaacacaag aatggtcagg ttcagccaca tttacatctg 960

acggaaaaat ccgtttattc tacactgatt tctccggtaa acattacggc aaacaaacac 1020

tgacaactgc acaagttaac gtatcagcat cagacagctc tttgaacatc aacggtgtag 1080

aggattataa atcaatcttt gacggtgacg gaaaaacgta tcaaaatgta cagcagttca 1140

tcgatgaagg caactacagc tcaggcgaca accatacgct gagagatcct cactacgtag 1200

aagataaagg ccacaaatac ttagtatttg aagcaaacac tggaactgaa gatggctacc 1260

aaggcgaaga atctttattt aacaaagcat actatggcaa aagcacatca ttcttccgtc 1320

aagaaagtca aaaacttctg caaagcgata aaaaacgcac ggctgagtta gcaaacggcg 1380

ctctcggtat gattgagcta aacgatgatt acacactgaa aaaagtgatg aaaccgctga 1440

ttgcatctaa cacagtaaca gatgaaattg aacgcgcgaa cgtctttaaa atgaacggca 1500

aatggtacct gttcactgac tcccgcggat caaaaatgac gattgacggc attacgtcta 1560

acgatattta catgcttggt tatgtttcta attctttaac tggcccatac aagccgctga 1620

acaaaactgg ccttgtgtta aaaatggatc ttgatcctaa cgatgtaacc tttacttact 1680

cacacttcgc tgtacctcaa gcgaaaggaa acaatgtcgt gattacaagc tatatgacaa 1740

acagaggatt ctacgcagac aaacaatcaa cgtttgcgcc gagcttcctg ctgaacatca 1800

aaggcaagaa aacatctgtt gtcaaagaca gcatccttga acaaggacaa ttaacagtta 1860

acaaatga 1868

Claims (10)

1.一种对类球红细菌进行基因突变从而获得突变菌株的方法，包括如下步骤：基于基因编辑技术，用融合蛋白对类球红细菌的基因组进行编辑，通过筛选获得突变菌株；所述融合蛋白中含有具有DNA靶向作用的蛋白和具有单核苷酸定向突变功能的酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因编辑技术为如下任一：CRISPR-Cas9技术、CRISPR-Cpf1技术、ZFN技术、TALEN技术；和/或

所述具有单核苷酸定向突变功能的酶为胞嘧啶脱氨酶或者腺苷酸脱氨酶；和/或

所述融合蛋白中还含有尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤(A)或(B)：

(A)基于CRISPR-Cas9，将Cas9蛋白的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因或者腺苷酸脱氨酶的编码基因以及尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂的编码基因融合在一起，得到融合基因A；利用所述融合基因A和sgRNA表达盒构建编辑质粒，所述sgRNA表达盒能够表达特异于待突变靶基因的sgRNA，然后将所述编辑质粒转化入类球红细菌中进行筛选，获得突变菌株；

(B)基于CRISPR-Cpf1技术，将胞嘧啶脱氨酶的编码基因或者腺苷酸脱氨酶的编码基因以及Cpf1蛋白的编码基因融合在一起，得到融合基因B；利用所述融合基因B和crRNA表达盒构建编辑质粒，所述crRNA表达盒能够表达特异于待突变靶基因的crRNA，然后将所述编辑质粒转化入类球红细菌中进行筛选，获得突变菌株；

进一步地，所述融合基因A自5’端到3’端由如下组成：所述Cas9蛋白的编码基因、连接肽的编码基因、所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因或者所述腺苷酸脱氨酶的编码基因、所述尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂的编码基因；

进一步地，所述融合基因B自5’端到3’端由如下组成：所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因或所述腺苷酸脱氨酶的编码基因、连接肽的编码基因、所述Cpf1蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Cas9蛋白为来自于化脓链球菌的dCas9蛋白或nCas9(D10A)蛋白或nCas9(H840A)蛋白；和/或

所述Cpf1蛋白为来自于新凶手弗朗西斯菌的dCpf1蛋白；和/或

所述胞嘧啶脱氨酶为来自于七腮幔的胞嘧啶脱氨酶pmCDA1或来自于大鼠的APOBEC1或来自于人的AICDA；和/或

所述腺苷酸脱氨酶为来自于大肠杆菌的TadA；和/或

所述尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂为来自于枯草芽孢杆菌噬菌体的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂UGI。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述来自于化脓链球菌的dCas9蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述nCas9(D10A)蛋白的氨基酸序列为将SEQ ID No.1的第840位的丙氨酸替换为组氨酸后得到的序列，所述nCas9(H840A)蛋白的氨基酸序列为将SEQ IDNo.1的第10位的丙氨酸替换为天冬氨酸后得到的序列；

所述来自于新凶手弗朗西斯菌的dCpf1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2；

所述来自于七腮幔的胞嘧啶脱氨酶pmCDA1的氨基酸序列为SEQ ID No.3；

所述来自于大肠杆菌的腺苷酸脱氨酶TadA的氨基酸序列为SEQ ID No.4；

所述来自于枯草芽孢杆菌噬菌体的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂UGI的氨基酸序列为SEQID No.5；

所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.6。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述来自于化脓链球菌的dCas9蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.7，所述nCas9(D10A)蛋白的编码基因的核苷酸序列为将SEQ ID No.7的第2518-2520位核苷酸突变为CAC后得到的序列，所述nCas9(H840A)蛋白的编码基因的核苷酸序列为将SEQ ID No.7的第28-30位核苷酸突变为GAT后得到的序列；

所述来自于新凶手弗朗西斯菌的dCpf1蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.8；

所述来自于七腮幔的胞嘧啶脱氨酶pmCDA1的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.9；

所述来自于大肠杆菌的腺苷酸脱氨酶TadA的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.10；

所述来自于枯草芽孢杆菌噬菌体的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂UGI的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.11；

所述连接肽的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12。

7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述编辑质粒中存在一个所述sgRNA表达盒或所述crRNA表达盒，或者所述编辑质粒中存在若干个串联的所述sgRNA表达盒或所述crRNA表达盒；

和/或

所述sgRNA表达盒自5’端到3’端由启动子、用于表达间隔序列的DNA序列、用于表达与Cas9蛋白结合部分的DNA序列以及终止子区域组成；

进一步地，所述启动子为pj23119启动子；

更进一步地，所述pj23119启动子为SEQ ID No.13的第1-35位；所述用于表达间隔序列的DNA序列为SEQ ID No.13的第36-55位；所述用于表达与Cas9蛋白结合部分的DNA序列为SEQ ID No.13的第56-97位；所述终止子区域为SEQ ID No.13的第98-137位；

更加具体地，所述sgRNA表达盒的序列为SEQ ID No.13；

和/或

所述crRNA表达盒自5’端到3’端由启动子、重复序列、用于表达间隔序列的DNA序列、以及终止子区域组成；

进一步地，所述启动子可为pj23119启动子；

更进一步地，所述pj23119启动子为SEQ ID No.14的第1-35位；所述重复序列为SEQ IDNo.14的第36-55位；所述用于表达间隔序列的DNA序列为SEQ ID No.14的第56-79位；所述终止子区域为SEQ ID No.14的第80-119位；

更加具体地，所述crRNA表达盒的序列为SEQ ID No.14。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述编辑质粒按照包括如下步骤的方法制备获得：(a1)向pIND4载体中克隆入筛选标记基因和多克隆位点，得到中间质粒1；(a2)将所述融合基因克隆入所述中间质粒1的多克隆位点处，得到中间质粒2；(a3)将一个所述sgRNA表达盒或所述crRNA表达盒或若干个串联的所述sgRNA达盒或所述crRNA表达盒克隆入所述中间质粒2，所得重组质粒即为所述编辑质粒。

9.根据权利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于：

当所述具有单核苷酸定向突变功能的酶为胞嘧啶脱氨酶时，所述sgRNA表达盒中所述用于表达间隔序列的DNA序列所针对的所述待突变靶基因中的靶标序列具有如下所示结构中的任意一种：“C*GG”、“CC*G”；其中，*表示8-20个连续的脱氧核糖核苷酸，每个脱氧核糖核苷酸均可为A或T或C或G；

当所述具有单核苷酸定向突变功能的酶为胞嘧啶脱氨酶时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列的DNA序列所针对的所述待突变靶基因中的靶标序列具有如下所示结构中的任意一种：“TT*C”、“G*AA”；其中，*表示8-24个连续的脱氧核糖核苷酸，每个脱氧核糖核苷酸均可为A或T或C或G；

当所述具有单核苷酸定向突变功能的酶为腺苷酸脱氨酶时，所述sgRNA表达盒中所述用于表达间隔序列的DNA序列所针对的所述待突变靶基因中的靶标序列具有如下所示结构中的任意一种：“A*GG”、“CC*T”；其中，*表示8-20个连续的脱氧核糖核苷酸，每个脱氧核糖核苷酸均可为A或T或C或G；

当所述具有单核苷酸定向突变功能的酶为腺苷酸脱氨酶时，所述crRNA表达盒中所述用于表达间隔序列的DNA序列所针对的所述待突变靶基因中的靶标序列具有如下所示结构中的任意一种：“TT*A”、“T*AA”；其中，*表示8-24个连续的脱氧核糖核苷酸，每个脱氧核糖核苷酸均可为A或T或C或G。

10.生物材料或应用，其特征在于：

所述生物材料为如下任一：(A1)权利要求1-9任一中所述的融合蛋白或权利要求3-8任一中所述的融合基因；(A2)权利要求3-9任一中所述的编辑质粒；

所述应用为如下任一：(B1)所述融合基因在制备所述编辑质粒中的应用；(B2)所述融合基因或所述融合蛋白或所述编辑质粒在对类球红细菌进行基因突变从而获得突变菌株中的应用。

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