CZ264192A3 - Direct molecular clonal selection of an eukaryotic cytoplasmatic dna-virus modified genome - Google Patents

Direct molecular clonal selection of an eukaryotic cytoplasmatic dna-virus modified genome Download PDF

Info

Publication number
CZ264192A3
CZ264192A3 CS922641A CS264192A CZ264192A3 CZ 264192 A3 CZ264192 A3 CZ 264192A3 CS 922641 A CS922641 A CS 922641A CS 264192 A CS264192 A CS 264192A CZ 264192 A3 CZ264192 A3 CZ 264192A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna
virus
genome
sequence
modified
Prior art date
Application number
CS922641A
Other languages
English (en)
Inventor
Friedrich Dorner
Friedrich Scheiflinger
Falko-Guenter Falkner
Michael Pfleiderer
Original Assignee
Immuno Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/750,080 external-priority patent/US5445953A/en
Application filed by Immuno Ag filed Critical Immuno Ag
Publication of CZ264192A3 publication Critical patent/CZ264192A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

AAsraov λΣΞίνΜλΛ Dhd cvyn
Přímé molekulární klonování modifikovaného genomu euka^yo-^ χ ε z tického cytoplasmatického ENA-viru í : 5 eaiQfl
Tato přihláška je částečným pokračováním přihláškyj č. 07/750080 ze dne 26. srpna 1991, nyní opuštěné. C í θ fs
Oblast techniky
Tento vynález se týká modifikovaných genomů eukaryotických DNA-virů, které se replikují v cytoplasmě hostitelské buňky, jako jsou například viry neštovic a iridoviry· Podrobněji se tento vynález týká přímého molekulárního klonování modifikovaného genomu cytoplasmatického DNA-viru, který je produkován modifikováním vyčištěné DNA molekuly obsahující genom cytoplasmatického DNA-viru za extracelulárních podmínek. Molekula modifikované DNA se pak pakážuje (vbalí) do infekčních virionů v buňce infikované pomocným óytoplasmatickým DNA-virem. Ve výhodném uspořádání podle tohoto vynálezu se fraggpnt cizí DNA obsahující žádaný gen vloží přímo do genomu DNA-viru neštovic v místě štěpení restrikční endonukleasou, která je jedinečná ve virovém genomu. Modifikovaný DNA-vir se vbalí do virionů transfekcí do buněk infikovaných pomocným virem neštovic.
Dosavadní stav techniky
Bukaryotické cytoplasmatické DNA-viry zahrnují různé viry neštovic a iridoviry nalézající se u obratlovců a u hmyzu.
Viry neštovic, které mají rekombinantní genopíp, se používají pro expresi rozmanitých vložených genů. Tak/viry neštovic se mohou používat pro produkci biologicky aktivních polypeptidů (například) v buněčných kulturách a pro dodávání vakcinových antigenů přímo do zvířecího nebo lidského imunitního systému. Zdá se, že konstrukce rekombinantních i-pidovirových genomů pro expresi cizích genů není dokumentována v odborné literatuře týkající se genetického inženýrství.
Konvenční techniky konstrukce rekombinantních genomů viru neštovic obsahující cizí geny spočívají v rekombinaci po částech, nebo in vivo (intracelulární). Použití intracelulární rekombinace bylo poprvé popsáno jako způsob markér rescue se subgenovými fragmenty virové DNA Samem á Dumbellem: Aňn. Virol. (Institut Pasteur) 152B, 135 (1981)« Tito autoři ukázali, žé n^teplotu citlivý mutant viru vakcínie by mohl být získán intraoelulární rekombinací s fragmentem subgenové DNA viru neštovic králíků. Způsoby, které použili pro intracelulární rekombinací, se stále ještě dodnes používají.
Konstrukce rekombinantních virů vakcínie obsahujících geny, které nejsou geny viru neštovic (cizí geny), byla později popsána Panicalim a Paolettimť Proč. 'Hati. Acad.
Sci. USA 22» *927 až 4931 (1982), Mackettem a spol.t Proč. Nati. Acad. Sci. USA 22» 7415 áž 7419 (1982) a v USA patentu δ. 4 769 350. Technologie přípravy rekombinantních virů neštovic zahořuje dva stupně. Nejdříve se připraví fragment LNA, který má oblasti homologní s genomem viru neštovic obklopující cizí gen. Insertní plasmid lze zkonstruovat také in vitro (extracelulárně) rekombinací cizího genu s plasmidem. Tento plasmid obsahuje krátké virové DNA sekvence, které jsou homologní s oblastí genomu viru neštovic, kde je žádoucí konečná inserce genu. Cizí gen se vloží do plasmidu v místě obklopeném sekvencemi virové DNA a typicky po směru vlákna promotoru viru neštovic, který kontroluje transkripci vloženého genu. V druhém stupni se insertní plasmid zavede do hostitelských buněk infektovaných cílovým virem neštovic. Tento gen se pak nepřímo vloží do genomu viru neštovic intracelulární rekombinací mezi homologní virové sekvence v genomu viru neštovic a část plasmidu zahrnující cizí gen. Výsledný rekombinantní genom se pak replikuje. Tím se připraví infekční vir neštovic.
Inserce každého příslušného genu do genomu viru neštovic dosud vyžadovala plasmid, který obsahoval tento gen obklopený virovými sekvencemi vybranými pro žádané místo inserce. Obtíže tohoto přístupu spočívají v tom, že pro každý rekombinantní vir neštovic je požadován nový insertní plasmid· Každý plasmid se musí zkontrolovat a zkonstruovat
- 3 způsoben extracelulární rekombinace DNA, amplifikovat v bakteriální buňce, prgcně isolovat a dobře vyčistit před tím, než se přidá do hostitelské buňky infektováné virem neštovic·
Jiným problémem dosavadní metodologie je nízký výtěžek rekombinantních genomů. To může způsobit, že je nutné testovat stovky individuálních virů, aby se nalezl jediný žádaný rekombinant. Nízký výtěžek souvisí s nízkým výskytem jedno« tlivých intracelulárních rekombinací spojených s požadavkem násobných událostí tohoto druhu, aby se dosáhlo integrace insertního plasmidu do virového genomu· Výsledkem je, že většina virových genomů získávaných způsoby intracelulární rekombinace jsou rodičovské genomy, kterým chybí cizí gen. Často je tedy nutné zavést do genomu viru neštovic gen selektivního markéru spolu s jakoukoliv jinou žádoucí sekvencí, aby se umožnila okamžitá detekce žádaných vzácných rekombinantů bez potřeby charakterizovat isolované DNA z početných klonů jednotlivých virů·
Vyčištěné DNA cytoplasmových DNA z eukaryotických virů nejsou schopny replikace, jestliže se vloží do vnímavé hostitelské buňky způsoby, které iniciují infekci virovými DNA, které se replikují v jádře. Tento nedostatek injfektivity DNA cytoplasmových DNA-virů vede ke skutečnosti, že virová transkripce musí být iniciována v infektovaných buňkách virově specifickou RNA polymerasou, která je nor. málně k disposici uvnitř infektujících virionů.
> “Reaktivace“ DNA viru neštovic, v nichž genomová DNA uvnitř deaktivované, neinfekční částice viru neštovic je vbalena (pakážována) do infekčních virionů koinřekcí živým pomocným virem neštovic, je známa desítky let· Například viz Penner a Woodroofe: Virology 11, 185 až 201 (1960)·
V roce 1981 Sam a Dumbell prokázali, že isolovaná neinfekční genomová DNA prvního viru neštovic může být vbalena do infekčních virionů viru neštovic v buňkách infektovaných druhým geneticky rozdílným virem neštovic (Sam a Dumbellí Ann· Virol· (Institut Pasteur) 132B. 135 (1981) ·). Toto i
L
- 4 vbalení nahé DNA viru neštovic bylo poprvé porkázáno transfekcí nemodifikované DNA obsahující první genom přírodního viru neštovic isolované 2 virionů nebo infektovaných buněk do buněk infektovaných druhým genomem v přírodě se vyskytujícího viru neštovic· Avšak heterologní pakážování (vbalování), pakážování DNA z jednoho rodu neštovic životaschopnými viriony jiného rodu (například neštovic ptáků) nebylo dosud popsáno·
Použití intracelulární rekombinace pro zkonstruování rekombinantního genomu viru neštovic, který expresí poskytuje geny viru nikoliv neštovic, bylo popsáno krátce po tom, co Sam a Dumbell poprvé popsali intracelulární pakážování nahé DNA viru neštovic do virionů viru neštovic a získání markéru fragmenty DNA intracelulární rekombinací (viz Panicali a Paoletti: 1982 a Mackett a spol·: 1982·)·
V odborné literatuře následujícího desetiletí však není popsáno přímé molekulární klonování, tj. konstrukce pouhým extracelulárním genetickým inženýrstvím, modifikovaného genomu kterékoliv cytoplasmové DNA eukaryotického viru, zvláště pak viru neštovic· V literatuře dokonce ani není uveden rozšířený názor jakékoliv výhodnosti možné realizace takového přímého klonování· Naopak, autoritativní spis konstatuje, že přímé molekulární klonování není praktické v souvislosti s genetickým inženýrstvím virů neštovic, protože DNA viru neštovic není infekční (P. Penner, R· Wittek a K. R. Dumbells The Poxviruses, Academie Press,. 1989·)· Podobně i jiné práce v této oblasti odepsali endonukleasové štěpení a religaci DNA viru neštovic, i když rozeznali jistý potenciál infekčních virů isolovaných DNA obsahujících rekombinantní genom viru neštovic· Viz například Mackett a Smiths J. Gen· Virol· 67, 2067 až 2082 (1986)·)· Nedávné souhrnné články navíc navrhly názor, že jediným proveditelným způsobem konstrukce rekombinantního genomu viru neštovic je způsob používající rekombinaci (viz Miner a Hrubý: TIBTECH 8, 20 až 29 41990) a Moss a Plexner: Ann· Bev. Immunol. 2» 305 až 324- (1987).
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je tedy získat způsob konstrukce modifikovaných genomů eukaryotických cytopžmatických DNA-virů, zvláště virů neštovic, který překonává shora uvedená omezení související s konvenčními technikami založenými na intracelulární rekombinaci.
Jiným předmětem tohoto vynálezu je získání technik konstrukce genomu cytoplasmatického DNA-viru, které poskytují podstatně vyšší výtěžky rekombinantů než stávající metodologie.
Dalším předmětem tohoto vynálezu je získat způsob modifikování genomu cytoplasmatického DNA-viru přímou modifikací genomové virové DNA a intracelulární pakážovánímodifikované virové DNA do virionů funkcí pomocného viru.
Dalším předmětem tohoto vynálezu je získat způsoby konstrukce genomu cytoplastamického DNA-viru, který v jednom rekombinantním reakčním stupni poskytuje modifikované genomy se segmentem cizí DNA vloženým v každé ze dvou možných orientací a modifikované genomy, které mají násobné inserce segmentu cizí DNA.
Ještě jiným předmětem tohoto vynálezu je získat způsob získání modifikovaných DNA molekul vhodných pro přímé molekulární klonování cizích genů do modifikovaného genomu cytoplasmatického DNA-viru, který obsahuje dvě části genomové virové DNA produkované štěpením endonukleasami specifickými pro sekvence v místě, které je jedinečným místem ve virovém genomu.
Ještě jiným předmětem tohoto vynálezu je získání cytoplasmatického DNA-viru, zvláště viru neštovic, který má modifikovaný genom obsahující cizí DNA vložen do jedinečného místa štěpení endonukleasami specifickými pro sekvence.
Ještě jiným předmětem tohoto vynálezu je získání
- 6 plasmidů, které umožňují konstrukci a přenos genových, kazet do cytopAma tického DNA-viru, zvláště do viru neštovic, s využitím přímého molekulárního klonování.
Při uskutečňování těchto a dalších předmětů tohoto vynálezu byl získán v souladu s jedním afektem tohoto vynálezu způsob přípravy modifikovaného eukaryotiokého cytopla srna tického DNA-viru přímým molekulárním klonováním modifikované DNA molekuly obsahující genom modifikovaného cytoplasrnatického DNA-viru. Tento vynalezený způsob obsahuje tři stupně: I) modifikování vyčištěné DNA molekuly obsahující první genom cytoplasrnatického DNA-viru za bezbuněčných podmínek tak, aby se získala modifikovaná DNA molekula obsahující modifikovaný virový genom, II) zavedení modifikované DNA molekuly do první hostitelské buňky, která vbalí (pakážuje) modifikovanou DNA molekulu do infekčních vironů a III) isolování infekčních virionů obsahujících modifikovaný virový genom z prvé hostitelské buňky.
Podle jednoho uspořádání tohoto způsobu stupeň modifikace molekuly DNA za extracelulárních podmínek obsahuje stupeň štěpení molekuly DNA endonukleasou specifickou pro sekvenci. Podle jiného uspořádání stupeň modifikování molekuly DNA obsahuje stupeň vložení první DNA sekvence do prvního virového genornu. S výhodou se tato první DNA sekvence vloží do prvního genornu v místě štěpení eňfanukleasou specifickou pro sekvenci. Je tedy třeba si při tom uvědomit, že v případě, kdy příslušná endonukleasa specifická pro sekvenci, jako je například bakteriální restrikční enzym, je zde popsána pouze názvem, tento název znamená také jakýkoliv isoschizomer pojmenované nukleasy.
Stupeň modifikování molekuly DNA podle tohoto vynálezu obsahuje popřípadě také stupeň použití fosfatasy pro odstranění fosfátové skupiny z konce DNA segmentu, který se získá štěpením molekuly DNA andonukleasou specifickou pro sekvenci.
V některých uspořádáních podle tohoto způsobu virový
- 7 genom znamená genom viru vakcínie a jedinečné místo znamená místo štěpení bakteriální restrikční endonukleasou Notl nebo bakteriální restrikcní endonukleasou Smál. První genom může obsahovat také druhou DNA sekvenci nevyskytující se přirozeně v genomu eukaryotického cytoplasmatického PNA-viru, při čemž tato druhá RNA sekvence obsahuje jedinečné místo štěpení. Například první genom může znamenat genom viru drůbežích neštovic obsahující sekvenci genu β-galaktosidasy Bscherichia coli a .jedinečné místo znamená místo štěpení bakteriální restrikční endonukleasou Notl, které je umístěno v tomto genu.
V jiných formách tohoto způsobu se první DNA sekvence vloží do prvního virového genomu mezi první místo štěpení první $§donuklea$i specifickou pro sekvenci a druhé místo štěpení druhou endonukleasou specifickou pro sekvenci. Obě místa štěpení, prvé i druhé místo štěpení, jsou jedinečnými místy štěpení v prvním virovém genomu.
Podle jiných uspořádání způsobu podle tohoto vynálezu alespoň část první DNA sekvence, která je vložena do prvního genomu, je pod transkripční kontrolou promotoru. Tento promotor může být umístěn do první DNA sekvence, která je vložena do prvního virového genomu. Promotor je umiste také v modifikovaném virovém genomu po směru vlákna první Dfctó sekvence, která je vložena do prvního genomu. V některých případech je promotor využíván SNA polymerasou kodovanou modifikovaným virovým genome». Tento promotor může být také vhodný pro iniciaci transkripce SNA polymerasou eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, který má být módi fikován. V některých případech promotor zahrnuje modifikaci přirozeně se vyskytujícího prostoru eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru.
Stupeň modifikace DNA molekuly podle způsobu podle tohoto vynálezu může obsahovat stupeň deletování DNA sekvence z prvního genomu. Tento stupeň také obsahuje stupeň substituování DNA sekvence prvního genomu.
Způsob modifikování prvního virového genomu může
- 8 také obsahovat stupně infikování první hostitelské buňky druhým eukaryotickým cytoplasmatickým DNA-virem obsahujícím druhý genom, který je expresován. Tím se modifikovaný virový genom pakážuje do infekčních virionů. Stupeň zavedeni modifikované DNA molekuly do první hostitelské buňky se provádí asi jednu hodinu po stupni infikování první hostitelské buňky druhým eukaryotickým cytoplasrnatickým DNA-virem.
V jedné variante tohoto způsobu se první hostitelská buňka vybere tak, aby exprese druhého genomu v první hostitelské buňce neprodukovala infekční viriony obsahující druhý virový genom. Například jestliže modifikovaný virový genom znamená modifikovaný genom viru vakcínie a druhý genom znamená genom viru dr^ůbezíoh neštovic, vybere se jako první hostitelská buňka savčí buňka.
V některých způsobech modifikování virového genomu stupeň isolace infekčních virionů obsahujících modifikovaný virový genom zahrnuje stupeň infikování druhé hostitelské buňky infekčními viriony produkovanými první hostitelskou buňkou} to se provádí za takových podmínek, aby exprese druhého genomu v druhé hostitelské buňce neprodukovala infekční viriony obsahující druhý genom. Například jestliže modifikovaný virový genom je modifikován genomem viru vakcínie, druhý genom může být genomem viru drůbežích neštovic a druhá hostitelská buňka je savčí buňkou. Modifikovaný virový genom také obsahuje gen funkční hostitelské oblasti potřebný pro produkci infekčních virionů v druhé hostitelské buňce a druhému genomu chybí takový gen funkční hostitelské oblasti. Tato ilustrace je dána příkladem, kdy modifikovaný virový genom znamená modifikovaný genom viru vakcínie obsahující gen funkční hostitelské oblasti. Produkují se tak infekční viriony v lidské buňce a druhou hostitelskou buňkou je lidská buňka.
Podle jiného způsobu modifikovaný virový genom obsahuje gen selektivního markéru, druhému genomu chybí gen selektivního markéru a stupeň infikování druhé hostitelské buňky se provádí za podmínek, které jsou selektivní pro gen expresující gen selektivního markéru. S výhodou exprese genu
- 9 selektivního markéru, v druhé hostitelské buňce propůjčuje druhé hostitelské buňce resistenci na cytotoxickou látku, která je přítomna během infektování v takových hladinách, které jsou postačující pro selekci genomu, který expresí poskytuje gen selektivního markéru.
Podle jiného aspektu tohoto vynálezu se získává modifikovaný eukaryotický cytoplasmatický DNA-virus produkovaný přímým molekulárním klonováním modifikovaného virového genomu podle způsobů zde shora souhrnně uvedených.
Ještě jiný aspekt tohoto vynálezu se týká modifikace ekuaryotického cytoplasmatickóho DNA-viru obsahujícího módi fikovaný virový genom, při čemž tento modifikovaný virový genom obsahuje: I) první genom prvého eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru. Tento první genom sestává z místa štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci a toto místo štěpení je jedinečným místem v prvním genomu. Modifikovaný genom dále obsahuje II) první DNA sekvenci vloženou do jedí nečného místa prvního genomu.
Podle hlavního uspořádání podle vynálezu první DNA sekvence je sekvence, která se nevy siry tuje přirozeně v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, V některých připadej, výhodných případech, první genom znamená genom viru vakcínie a jedinečné místo znamená místo Štěpení bakteriální restrikční endonukleasou vybranou ze skupiny sestávající z Notl a Smál.
První genom může obsahovat druhou DNA sekvenci, která se nevyskytuje přirozeně v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru. Druhá sekvence DNA obsahuje jedinečné místo štěpení. V jednom příkladu první genom znamená genom viru drůbežích neštovic obsahujících druhou DNA sekvenci Escherichia coli genu β-galaktosidasy a jedinečný# místem štěpení v tomto genu je místo štěpení bakteriální endonukleasou Notl.
V některých modifikovaných virech podle tohoto vynálezu alespoň část uvedené první DNA sekvence, která je vložena
- 10 do jedinečného místa štěpení, je pod transkripční kontrolou promotoru. Tento promotor je umístěn v první DITA sekvenci, která je vložena do prvního genomu. V některých případech první genom znamená genom viru neštovic a promotor obsahuje promotor viru neštovic, buj přirozeně se vyskytující promotor viru neštovic nebo jeho modifikaci.
Ještě jiný aspekt tohoto vynálezu se týká modifikací eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru obsahujícího modifikovaný virový genom, kde tento modifikovaný virový genom obsahuje I) první genom prvního eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru. Tento první genom obsahuje první místo štěpení endonukleasou specifickou pro první sekvenci a druhé místo štěpení endonukleasou specifickou pro druhou sékvenci. Každé z těchto míst je jedinečným místem v prvním genomu.
Modifikovaný genom v tomto modifikovaném viru dále obsahuje II) první DNA sek^vnci vloženou do prvního genomu mezi první jedinečné místo a druhé jedinečné místo. V některých formách tohoto modifikovaného viru první DNA sekvence se nevyskytuje přirozeně v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viruj v některých případech první genom obsahuje druhou DNA sekvenci přirozeně se nevyskytující v eukaryotickém cytopiasrnatickém DNA-viru. Tato druhá DNA sekvence obsahuje první DNA sekvenci vloženou mezi první jedinečné místo a druhé jedinečné místo. Například tento modifikovaný vir může obsahovat první genom, který je genomem viru vackínie, a obě místa štěpení, první místo štěpení a druhé místo štěpení, jsou místy štěpení bakteriální restrikční endonukleasou, která je vybrána ze skupipy sestávající z Notl, Smál, Apal a Hsrll.
Ještě jiný eukaryotický cytoplasmatický DNA-virus sestává z modifiovaného virového genomu, který obsahuje I) první genom prvního eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru. Tento první genom obsahuje první DNA sekvenci a tato první DNA sekvence obsahuje první místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečným místěm štěpení v tomto modifikovaném virovém genomu. Tento genom tohoto modifikovaného viru dále obsahuje II) promotor, který je umístěn tak, že DNA sekvence vložená do jedinečného místa Štěpení ve virovém genomu je pod transkripční kontrolou promotoru.
V jistých formách chybí této první DNA sekvenci start kodon translace mezi promotorem a jedinečným insertním místem.
Touto první DNA sekvencí muže být sekvence přirozeně se nevyskytující v cytoplasmovém eukaryotickém DNA-viru. Tento modifikovaný virus znamená virus, v němž prvním genomem je genom viru vakcínie a první DNA sekvence obsahuje násobné klonovací místo obsahující místo štěpení bakteriálními restrikčními endonukleasami Notl, Smál, Apal a Rsrll.
Ještě jiný aspekt tohoto vynálezu se týká modifikovaného eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru podle tohoto vynálezu, kde exprese první sekvence v modifikovaném virovém genomu (vložená sekvence, o kterou se jedná) v hostitelské buňce vede k produkci proteinu.
Podle jiného aspektu se tento vynález týká také DNA molekuly obsahující modifikovaný virový genom modifikovaného viru podle tohoto vynálezu. Zvláště některé formy této DNA molekuly obsahují jeden konec modifikovaného virového genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, v němž I) konec modifikovaného virového genomu obsahuje DNA sekvenci přirozeně se nevyskytující v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru. V této DNA molekule II) modifikovaný virový genom obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečným místem štěpení v tomto modifikovaném virovém genomu, a III) molekula DNA má konec, který je homologní s koncem, který se produkuje štěpením jedinečného místa v modifikovaném virovém genomu endonukleasou specifickou pro sekvenci.
V některých formách této DNA molekuly DNA sekvence přirozené se nevyskytující v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečným místem štěpení v tomto modifikovaném virovém genomu.
Ještě jiný a^ekt tohoto vynálezu se týká sestavy pro přímé molekulární klonování modifikovaného virového genomu
- 12 cytoplasmové DNA eukaryotického viru obsahující: I) vyčištěné DNA molekuly podle tohoto vynálezu, II) DNA ligasu a III) roztoky pufru a reakčnich činidel vhodných pro ligaci DNA segmentů, takže se získá modifikovaná DNA molekula obsahující modifikovaný virový genom. V jedné formě tato sestava dále obsahuje plasmid obsahující kazetu pro expresi genu obklopenou místy štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, která jsou slučitelná s insercí této kazety do jedinečného zníš ta štěpení modifikovaného virového genomu hodovaného DNA molekulou v sestavě· Tato sestava může dále o bsahovat první hostitelskou buňku a druhý vir vhodné pro pakážování modifikovaného virového genomu do infekčních virionů·
Podle dalšího afektu se tento vynález týká plasmidu obsahujícího DNA segment, který má na obou koncích místo štěpení bakteriální restrikční endonukleasou Notl· DNA segment v tomto plasmidu obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je v tomto plasmidu jedinečné· Příklad tohoto plasmidu, jak je to ukázáno na obrázku 1.3, je označen pN2 a obsahuje sekvenci sekvence číslo 1·
DNA segment v tomto plasmidu může dále obsahovat gen selektivního markéru pod transkripční kontrolou promotoru viru neštovic. Mezi takové plasmidy patři například plasmidy, které jsou označeny pN2-gpta obsahujácl sekvenci číslo 2 a pN2-gptb obsahující sekvenci číslo 3.
Jiný plasmid podle tohoto vynálezu obsahuje DNA segment, který dále obsahuje promotor viru nešVovic odštepitelně napojený na DNA sekvenci obsahující místo štěpení restráfení endonukleasou· DNA segment vložený do tohoto Místa štěpení je tedy pod transkripční kontrolou tohoto promotoru. Mezi příklady patří plasmidy označené pAl-S2, které obsahují sekvenci číslo 11 a plasmid pA2—S2, který obsahuje sekvenci číslo 12· Příkladem ta kove ^plasmidu, který obsahuje dále gen selektivního markéru pod kontrolou odděleného promotoru viru neštovic, je plasmid pN2gpt-S4, který obsahuje sekvenci číslo 14.
- 13 Ještě jiný plasmid obsahuje segment genomu viru neštovic, který obsahuje gen thymidin-kinasy tohoto viru neštovic. Tento gen thymidin-kinasy je modifikován tak, aby preventivně bránil expresi aktivní thymidin-kinasy, jako je například v plasmidu označeném pHindJ-2 obsahujícím sekvenci číslo 4 a pHindJ-3 obsahujícím sekvenci číslo 5*
Jiný jfesmid obsahuje promotor viru neštovic odštěpitelně navázaný na translační start kodon. Tento translační start kodon bezprostředně následuje předdruhým místem štěpení restrikčni endonukleasou, které je vhodně uspořádáno tak, aby umožňovalo translaci otevřené čtecí oblasti vložené do místa štěpení druhou restrikčni endonukleasou. Mezi příklady tohoto plasmidu patří plasmidy označené pAl-Sl obsahující sekvenci číslo 9, pA2-Sl obsahující sekvenci č* 10 a plasmid pN2gpt-S3A obsahující sekvenci číslo 13·
Jeden konkrétní plasmid tohoto typu dále obsahuje DNA. sekvenci kódující lidský protrombinf DNA sekvence je odštěpit elně napojena na promotor viru neštovic a start kodon, jak je to ilustrováno na obrázku 5.1 plasmidem označeným pAlSl-PT. Tento plasmid obsahuje sekvenci číslo 15·
Jiný plasmid dále obsahuje DNA sekvenci kódující lidský plasminogen včetně translačního start kodonu, kde DNA sekvence je odštěpíteleni napojena na promotor viru neštovic, ^ak ukazuje obrázek 5·2, příkladem tohoto plasmidu jsou plasmidy odvozené od pN2gpt-S4, jako je například pN2gpt-G3?g, kódující lidskýJplasminogen a obsahující sekvenci číslo 17, a pH2gpt-LPg, kódující lys-plasminogen a obsahující sekvenci číslo 18.
Ještě jiný plasmid podle tohoto vynálezu, jak shora uvedeno, dále obsahuje DNA sekvenci kódující vir lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) gpl60, včetně translačního start kodonu, která je odštěpitelně napojena na promotor viru neštovic, jak je to ukázáno na obrázku 5·4*, plasmidem pN2gpt-gpl60 obsahujícím sekvenci číslo 19. A konečně, jiný plasmid obsahuje DNA sekvenci kódující lidský von
Willebranddv faktor, jak je to ukázáno na obrázku 6.2.
- 14 Tento příklad je označen plasmid pvWP. Obsahuje sekvenci číslo 20.
Některé plasmidy podle tohoto vynálezu obsahují místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečné v genomu viru neštovic. Příklady jsou uvedeny na obrázku 4.3, včetně pAO obsahujícího sekvenci číslo 6, pAl obsahujícího sekvenci číslo 7 a pA2 obsahujícího sekvenci číslo 8.
Jiný plasmid obsahuje modifikovaný BcoEI K fragment DNA viru vakcínie z něhož byl deletován gen KIL hostitelské oblasti, jak je to uvedeno na obrázku 8.1. Dvěma příklady jsou pEcoE-dhr obsahující sekvenci číslo 21 a pdhr-gpt obsahující sekvenci číslo 22·
Jiné předměty, rysy a výhody tohoto vynálezu se ozřejmí z následujícího podrobného popisu· Tomu by však mělo být rozuměno tak, že podrobný popis a specifické příklady, i když představují výhodná uspořádání podle tohoto vynálezu, jsou uvedena pouze jako ilustrace neboč různé změny a modifikace v duchu a rozsahu tohoto vynálezu bodou odborníkům zřejmá z tohoto podrobného popisu·
V následující části tohoto spisu budou stručně popsány připojené obrázky.
Obrázek 1.1 ilustruje expresi genů markéru modifikovanými genomy viru neštovic získanými reaktivací DNA nahého viru neštovic· Je ukázán stříbrem obarvený pólyakrylamidový gel proteinů připravených v kultuře supernatantů buněk infektovaných pakážovanými viry (vpPg č. 1 až vpPg č. 8) a přírodním typem viru (WT) jako kontrola· Horní šipka ukazuje pás markéru plasminógenu, dolní šipka pás hlavního sekretovaného proteinu markéru 35& vakcínie· Pásy 1 a 9 znamenají proteiny markéru, pásy 2 a 10 znamenají standard lidského plasminógenu (10 ng), pás 3 znamená rekombíant vPgD vakcínie (zdroj pakážované DNA), pásy 4 až 7 a 11 až 14 znamenají vpPg č. 1 až 8 a pásy 8 a 15 znamenají vakcínii přírodního typu (WE WT).
- 15 Obrázek 1.2 je schematický diagram i lotrující molekulární klonování'genomů viru neštovic obsahujících kazetu genu pro expresi genu markéru CB.coli gpt gen) za kontroly promotorem viru vakcínie.
Obrázek 1·3 ϋθ schematická ilustrace konstrukce plas-* midů (pN2-gpta a pN2-gptb), které jsou prekursory pro konstrukci kaset pro expresi genů, inserci promotoru a otevřené čtecí oblasti. Takové kazety jsou určeny pro přímý molekulový transfer do vektorů viru vakcínie pomocí jedinečného insertního místa a genu selektovatelného markéru (gpt) řízený promotorem viru vakcínie. MCS znamená násobné klonovací místo. P7.5 znamená promotor genu polypeptidu 7 *5K vakcínie a Pil znamená promotor genu polypeptidu 11K vakcínie. Šipky označují směry transkripce od promotorů.
Obrázek 1.4 ukazuje, že genomy viru neštovic, produkované přímým molekulárním klonováním, obsahují kazetu genu gpt markéru vloženého do jedinečného (Notl) místa štepení. jak ukazují Southernovy blotové analýzy přes plak přečištěných virových DNA rozštěpených působením endonukleasy HindlU pomocí sondy gpt-genu. Pás 1 znamená DNA markéru (DNA fágu lambda rozštěpeném působením HindlII), pásy 2 a 3 znamenají DNA přírodního viru vakcínie (WR) rozštěpenou působením HindlII (500 ng a 100 ng), pásy 4 až 9 Znamenají DNA buněk infektovaných plaky podle 2.1.1 áž 7·1·1> pásy 10 až 12 znamenají DNA buněk infektovaných plaky podle 10.1.1 až 12.1.1. Šipky ukazují velikosti restrikčních fragmentů markéru v tisících párech nukleotidů.
Obrázek 1.5 dále ilustruje struktury modifikovaných DNA viru neštovic pomocí Southernových blotů DNA (rozštěpených působením Notl) buněk infektovaných různými isoláty a hybridizovaných sondou gpt-genu. Pás 1 znamená DNA m^ketřu (DNA fágu lambda rozštěpená působením HindlII), pás 2 znamená DNA přírodního viru vakcínie (WE) rozštěpenou působením Notl (50 ng), pásy 3 až 8 znamenají DNA buněk infektovaných rekonstruovanými plaky podle 2.1.1 až 7·1.1> pásy 9 až 11 znamenají DNA buněk infektovaných plaky podle 10.11 až
12.1.1*
Obrázek 1.6 ukazuje srovnání DNA z přírodní (WT) vakcínie a modifikovaného klonu (vp7) SNA fragmentů, které jsou rozštěpeny uvdenými restrikčními endonukleasami a odděleny na agar osovém gelu po vyfovení ethidiumbromidem. Pásy 1 a 2 znamenají WT a vp7 rozštěpené působením Loti, pásy 3 a 4 znamenají WT a vp7 rozštěpené působením HindlII, pásy 6a 7 znamenají WT a vp7 rozštěpené současně působením HindlII a Koti, pásy 7 a 8 ukazují WT a p7 rozštěpené působením Pstl, pásy 9 a 10 znamenají WT a vpz rozštěpené současně působením Pstl a Notl, pásy 11 a 12 znamenají WT a vp7 rozštěpené působením Sáli, pás 13 znamená DNA markéru (ligovaná a působením HindlII rozštěpená SNA fágu lambda} fág 0X. rozštěpený působením Haelll). Šipky na levé straně označují velikost fragmentů (v tisících párech nukleotidů) vakcínie WT rozštěpené působením Notl, šipky vpravo označuji markéry. Všimněte si, že pásy 1 a 2 obsahuji asi desetkrát méně SNA než jiné pásy.
Obrázek 1.7 ukazuje Southernův blot gelu uvedeného na obrázku 1.6 pomocí sondy gpt-genu. Šipky označují velikosti markéru.
Obrázek 1.8 ukazuje Southernovu blotovou analýzu SNA viru vakcínie infektovaných buněk rozštěpenou působením Notl a hybridizovanou sondou viru vakcínie. Pásy 1 až 4 znamenají SNA buněk infektovaných plaky označenými AI áž A4, pásy 5 až 8 znamenají plaky 01 až 04, pásy 9 až 12 znamenají plaky El až E4, pás 13 znamená SNA vakcínie WT, pás 14 zmámená SNA neinfěktovaných buněk hostitele OV-1, pás 13 znamená SNA markéru (SNA fágu lambda rozštěpenou působením HindlII a fág 0X rozštěpený působením Haelll).
Obrázek 1.9 ukazuje Southernovu blotovou analýzu stej- I ného vzorku jako v gelu na obrázku 1.8 pomoci sondy gpt-ge. nu. Pásy 1 až 12 znamenají jak uvedeno na obrázku. 1.8, pás znamená SNA neinfektovaných buněk hostitele OV-1, pás znamená SNA vakcínie WT, pás 13 znamená SNA markéru (DNA fágu lambda rozštěpená působením HindlII a fág I rozštěpený působením Haelll). j
- 17 Obrázek 1.10 ukazuje Southernovu blotovou analýzu stejných virových DNA jako v gelu na obrázku 1.8 rozštěpených působením Pstl pomocí sondy gpt-genu. Pásy 1 až 12 znamenají jak uvedeno na obrázku 1.8, pás 13 znamená DNA neinfektovaných buněk hostitele CV-1, pás 14 znamená DNA vakcínie WT, pás 13 znamená DNA markéru (DNA lambda fágu rozštěpená působením Hindlll a fág 0X rozštěpený působením HaelII).
Obrázek 1.11 představuje schéma předpověděné struktury modifikovaných Pátí ”0” fragmeatů DNA viru vakcínie s jednou nebo dvěma insercemi kazety gpt-gen. P znamená místo štěpení Pstl a N znamená místo štěpení Notl.
Čísla znamenají velikost příslušných Pstl fragmentů. Tučným typem čísel jsou označeny fragmenty, u nichž je očekávána, hybridizace sondou gpt-genu. Šipky označují směr transkripce gpt-genu (800 párů nukleotidů) promotorem viru vakcínie (300 párů nukleotidů).
Obrázek 2.1 ukazuje analýzu rekombinantů genomů ptačích neštovic (drůbeží neštovice, EP) štěpením působením restrikční endonukleasy Notl a rozdělením FIGE na 1% agarosovém gelu. Pás 3 znamená markér (fragmenty fágu lambda rozštěpeného působením Hindlll, nerbzštěpený fág lambda a vakcínie WR), pásy 1 a 2 znamenají DNA HP1.441 viru drůbežích neštovic, nerozštěpenou a rozštěpenou působením Notl, pásy 3 a 4 znamenají DNA f-TK2a viru drůbežích neštovic, nerozštěpenou a rozštěpenou působením Notl.
Obrázek č. 2.2 ilustruje konstrukci virů drůbežích neštovic, které expresí poskytují cizí geny přímým molekulárním klonováním. Kazeta exprese genu, sestávající z E.coli gpt genu kontrolovaného promotorem (P) viru neštovic, se ligu je s pravým a levým DNA raménkem (ra, respektive la) viru drůbežích neštovic (f-TK2a) získaných štěpením působením JNotl. Pakážování se provádí pomocným virem (kmen HP2) drůbežích neštovic ve fibroblastech kuřecího zárodku.
Obrázek 3.1 ilustruje způsob konstrukce modifikovaných
- 18 virů neštovic extracelulárním genomovým inženýrstvím a intracelulárním pakážovánim. Kazeta genu sestávající z gpt genu kontrolovaného promotorem viru vakcínie, se liguje s pravým raménkem (ra) a levým raménkj^e (la) DNA viru vakcínie rozštěpené v'jedinečném místě působením endonukleasy Smál· ťakázování se provádí pomocným virem drůbežích neštovic (kmen HP1.441) ve fibroblasetch kuřecího zárodku. PÍ znamená promotor genu viru vakcínie kódující polypeptid o molekulové hmotě 7 500.
Obrázek 3*2 ukazuje, že sestrojené genomy viru vakcínie pakážovaně pomocným virem drůbežích neštovic obsahují očekávaný insert v jedinečném místě Štěpení Smál, jak bylo stanoveno analýzou Southernovým blotem. Celková DNA isolovaná z infektovaných buněk se rozštěpí působením HindllI a blot se hybridizuje sondou gpt-genu^ Pásy 1 až 8 znamenají DNA z buněk infektovaných plaky označenými P12.2 až P12.9, pásy 9 až 13 znamenají plaky P13.1 až P13.5, pásy 14 a 15 znamenají DNA, která je isolována z ne infektovaných buněk nebo z buněk infektovaných virem vakcínie (WH přírodního typu), která je rozštěpena působením HindllI a pás 16 znamená markéry (DNA fágu lambda rozštěpená působením HindllI)
DNA v pásu 8 se protože virový isolát č.
P 12·9 se nereplikuje·
Obrázek 3.3 ukazuje schematický nástin očekávaných struktur modifikovaných genomů vakcínie, které mají genovou kazetu vloženu do jedinečného místa Smál, zvláště modifikované HindllI A fragmenty virů s jednou nebo dvěma insercemi· H znamená místo štěpení restrikční endonukleasou HindllI a S znamená místo štěpení restrikční endonukleasou Smál· čísla označují velikosti fragmentů HindllI. U těch, které jsou uvedeny tučným písmem, se očekává, že hybridizují sondou gpt-genu· Kazeta gpt-genu sestává.z promotoru viru vakcínie (o velikosti asi 3θθ párů nukleotidů) oddělených vnitřním místem HindllI z gpt sekvencí (asi 800 párů nukleotidů). Šipky označují směr transkripce gpt-genu.
Obrázek 4,1 ukazuje schematický plán konstrukce vektoru
- 19 vdTK viru vakcínie s modifikovaným genem thymidin-kinasy (tk). WR-WT znamená přírodní (WT) “Western Reserve (WR) kmen viru vakcínie (W). Na obrázků 4.LA je ukázán’způsob používající pouze přímou molekulární modifikaci genomu viru vakcínie» včetně delece nežádoucích míst Notl a Smál* Na obrázku 4.1B je nastíněn alternativní přístup pro deleci místa Notl technikami získávání markéru s virem vakcínie a modifikovaným plasmidem. Na obrázku 4.1C je uveden alternativní způsob delece místa Srna! získáváním markéru*
Obrázek 4*2 ilustruje konstruování vektoru (vdTK) viru vakcínie, jehož gen thymidin-kinasy (tk) je nahrazen násobným klonovacím místem* Šipka označuje počátek a směr transkripce genu viru vakcínie tk (W-tk) do HindlII J fragmentu klonovaného v plasmidu pHindJ-1. Gen tk je nahrazen a konečný plasmid pHindJJ se použije pro vložení modifikovaného HindlII J fragmentu do viru vakcínie.
Obrázek 4*3 nastiňuje konstrukci plasmidů (pál a pá2), které jsou prekursory konstrukce kazety pro expresi genu’ insercí promotoru a otevřené čtecí fáze* Takové kazety jsou vhodné pro jFímý molekulární přenos do vektoru vakcínie vdTK přímým (násilným) klonováním.
. Obrázek 4.4 ilustruje konstrukci plasmidů (pál-Sl a a pA2-Sl) obsahujících kazety pro expresi genu vhodných pro asociaci otevřených čtecích oblastí se syntetickým promotorem viru neštovic (Sl) a start kodonem translace. Tyto kazety jsou určeny pro přímý molekulární přenos do vektoru viru vakcínie vdTK násilným klonováním* Promotor Sl je přítomen v různých orientacích ve dvou plasmidech, jak označují šipky, které ukazují směr transkripce.
Obrázek 4.5 nastiňuje konstruování plasmidů (pál-S2 a pA2—S2) sestávajících z kazet exprese genu, které jsou vhodné pro asociaci otevřených čtecích oblastí, které mají start kodon translace, se syntetickým promotorem viru neštovic (S2), před přímým molekulárním přenosem do viru vakcínie vdTK násilným klonováním. Promotor S2 je přítomen
- 20 v různých orientacích ve dvou plasmidech, jak označují šipky, které ukazují směr tráfekripce.
Obrázek 4.6 ukazuje konstrukci plasmidů pN2-gpta a pN2-gptb.
Obrázek 4.7 ukazuje konstrukci plasmidů (pN2-gpt-S3A a pN2-gpt-S4) obsahující kazety exprese genu, kterým bud chybí (S3A) nebo které mají (S4) start kodon translace, se syntetickým promotorem (S3A, popřípadě S4), před přímým molekulárním přenosem do jedinečného místa ve vektoru viru vakcínie vdTK. Zkratky jsou uvedeny na obrázku 1.3.
Obrázek 3*1 ilustruje konstrukci kazet exprese genu (pAlSl-PT) pro expresi lidského protrombinu ve vektoru viru vakcínie vdTK. Zkratky mají stejný význam jako na obrázku 1.3. Šipky označuji směr transkripce.
Obrázek 3*2 představuje konstrukci plasmidů s. kazetou exprese genu (pN2gpt-GPg) pro expresi lidského glu-plasminogenu ve vektoru viru vakcínie vdTK. S4 znamená syntetický promotor viru neštovic. Ostatní zkratky mají stejný význam jako na ohrázku 1.3.
Obrázek 5·3 ukazuje konstrukci plasmidů s kazetou exprese genu (pN2gpt-IPg) pro expresi lidského lys-plasminogenu ve vektorů viru vakcínie vdTK. Zkratce mají význam stejně jako na obrázku 1.3.
Obrázek 5 A nastiňuje konstrukci plasmidů s kazetou exprese genu (pN2gpt-gpl60) pro expresi antigenu lidského viru (HIVgplGO) ve vektoru viru vakcínie vdTK. Zkratky mají stejným význam jako je shora uvedeno na obrázku 1.3.
Obrázek 5*5 ilustruje přístup k testování modifikovaných virů vakcínie připravených přímým molekulárním klonováním založeném na protiproudé inserci genu markéru flS.ooli lacZ gen), která uděluje vizuálně různý fenotýp (modrý” plak ve srovnání s normálními bílými plaky virůj jimž'chybí lacZ gen).
- 21 Obrázek 5·6 ilustruje konstrukci plasmidů pTZS4-lacZa a pTZS4-lacZb.
Obrázek 6.1 ilustruje konstrukci vektoru viru vakcinie (vS4) s přímým základním klonovacím místem pod kontrolou silného pozdního promotoru viru vakcínie (S4).
Obrázek 6.2 ukazuje konstrukci modifikovaného viru vakcínie (wWF) pro expresi von-Willebrandova faktoru přímou molekulární insercí otevřené čtecí oblasti do vektoru viru vakcínie vS4. vWP znamená cDNA von-Willebrandova fakm od toru. Šipky označují směr transkripce promotoru S4.
Obrázek 7.1 ilustruje vliv množství přidané DNA na pakážování DNA viru vakcínie pomocným virem drůbežích neštovic do savčích buněk (CV-1), v nichž se vir drůbežích neštovic nereplikuje úplně. Pět kultur bylo infektováno virem drůbežích neštovic a následně transfektováno vyznačenými množstvími DNA viru vakcinie. První sloupec znamená kulturu bez přidané DNA a bez viru drůbežích neštovic, pátý sloupec znamená kulturu bez přidané DNA, ale infektovanou virem drůbežích neštovic.
Obrázek 8.1 nastiňuje konstrukci viru vakcínie (vdhr) vhodného pro použiti jako pomocný vir s rozsáhlými mutacemi hostitele, které zabraňují replikaci v některých lidských buněčných liniích, hr-gen znamená gen hostitelské oblasti umístěný v EcoRI K fragmentu viru vakcínie. Ostatní zkratky mají stejný význam jako na obrázku 1.3.
Obrázek 9.1 ukazuje konstrukci plasmidů pS2gpt-P2 a pP2gpl60MN. Šipky uvnitř plasmidů ukazují směr transkripce příslušných genů.
Obrázek 9.2 je schematický nástin konstrukce virů vP2-gpl60MN-A a vP2-gpl60MN-B.
Obrázek 9.3 ukazuje mapy Pstl-E-fragmentu viru vakcínie přírodního typu a Pstl-fragmentů chimerních virů
- 22 obsahujících gpl60 geny· Šipky označují směr transkripce genu gpl60. Čísla označují velikosti fragmentů v tisících párech nukleotidů·
Obrázek 9*4 ukazuje konstrukci plasmidu pselP-gpt-L2· Šipky označují směr transkripce příslušných genů.
Obrázek 9*5 A) ukazuje konstrukci plasmidu pselP-gpl60MN a obrázek 9·5 B) ukazuje sekvenci kolem translačních start kodonů přírodního (sekvence čísla 75) a modifikovaného (sekvence číslo 75) gpl60-genu·
Obrázek 9.6 je schematický nástin konstrukce chimerních virů vakcínie vselP-gpl60MNA a vP2-gpl60MNB. Šipky označují směr transkripce gpl60-genu.
Obrázek 9·7 je. mapa SaII-P-fragmentu viru vakcínie přírodního typu a Sall-fragmentů chimerních vírů vakcínie vselP-gpl60MNA a vPlí-gpl60MNB. Šipky ukazují směr transkripce gpl60-genu. čísla označují velikosti fragmentů v tisících párech nukleotidů.
Obrázek 10.1 A) ukazuje strukturu plasmidu pN2-gptaProtS. Kazeta dvou genů sestávající z gpt genu kontrolovaného Ρ7·5 promotorem vakcínie (Ρ7·5) a genu lidského proteinu S (leuProtS) kontrolovaného syntetickým promotorem viru neštovic (seIP) je obklopena restrikčnímí místy Notl.
Obrázek 10.1 B) ukazuje sekvence kolem translačních start kodonů genu přírodního proteinu S (sekvence číslo 77) a genu proteinu S v chimérách (sekvence číslo 79).
Obrázek 10.2 ukazuje Southernovu blotovou analýzu chimerních virů vakcínie nesoucích gen proteinu S. A) Celkové buněčné DNA rozštěpená působením Sací a hybridizované Sací fragmentem vakcínie přírodního typu. B) Stejný materiál rozštěpený působením Notl a sondovaný sekvencemi lidského proteinu S. C) Schematický nástin SacI-I-fragmentu přírodního typu a chimerního Sacl-fragmentu po ligaci insertu.
Obrázek 10.5 ukazuje Vesternovu blotovou analýzu od
- *3 plasmy odvozeného proteinu S (pdProtS, pásy 1 a 2) a rekombinantniho proteinu S (rProtS). Supernatanty buněčné kultury (10 mikrolitrů) buněk SK Eepl byly analyzovány po inkubačňích periodách 24 až 72 hodiny.
Obrázek 11.1 ukazuje strukturu plasmidu pN2gpta-PIX. Kazeta dvou genů sestávající z gpt genu kontrolovaného P7.5 promotorem vakcínie (P7.5) a genu lidského faktoru IX kontrolovaného syntetickým promotoroem viru neštovic (selP) je obklopena restrikčními místy Notl.
Obrázek 11.2 ukazuje Southernovu blotovou analýzu chimerních virů nesoucích gen lidského faktoru IX. A): Celkové buněčné DNA rozštěpené působením Sfu a hybridizované sondou genu lidského faktoru IX (plasmid pBlu^cript-FIX) · Ve všech 'Sm^/Sisolátech (δ. 1 až 6j 9 a 10) měl insert orientaci A, m znamená markér, W-WT/WE znamená vakcínie přírodního typu, WR-kmen. B)í Předpověděné genomové struktury chimerních virů.
Obrázek 11.3 ukazuje Westernovu blotovou analýzu od plasmy odvozeného faktoru IX (pdPIX, pásy 1 a 2) a rekombinantního faktoru IX, získaného expresí chimerním virem vakcínie v buňkách VESO. Supernatanty buněčné kultury (10 yul) se analyzují po dvaasedmdesátihodinové inkubaci. 5. '1 a 6, a 10 znamenají isoláty plaků, pd PIX znamená od plasmy odvozený faktor IX.
Obrázek 12.1 ilustruje konstrukci chimerního viru drůbežích neštovic f-enu-IIIB přímým molekulárním klonováním ΞΓ7ΤΙΙΒ env genu.
Obrázek 12.2 A) ukazuje Southernovy bloty Sspl-frag^m^ů isolátů chimerního viru drůbežích neštovic ukazující inserty env genu. Pásy 1 až 12 znamenají virové isoláty f-EPa-1, pásy 13 a 14 znamenají BP1.441 a f-TK2a (negativní kontroly), pás 15 znamená SspI štěp (10 ng) pN2gpt-gpl60 (positivní kontrola). Obrázek 12.2 B) ukazuje reštrikční mapy Ss£ fragmentů insertů ve dvou možných orientacích v chimerním viru drůbežích neštovic, čísla označují velikosti Ssp I-fragmentů v tisících párech nukleotidů. Šipky označují orien- 24 taci insertu, která odpovídá směru transkripce transkripční jednotky gpl60.
Obrázek 12·3 ukazuje expresi HIV obalových glykoproteinů ve fibroblastech kuřecích zárodků (Westernový bloty)· Pásy 1 až 8 znamenají virové isoláty f-LF2a až h, pásy 9 a 15 znamenají standard gpl60 (poskytnutý A. Mittererem, Immuno Ag, Orth/donau, Eakousko), pásy 10 až 13 znamenají virové isoláty f-lF2i až 1, pás 14 znamená proteiny markéru, pásy 16 a 17 znamenají viry neštovic drůbeže HP1.441 a f-TK2a (negativní kontroly).
Obrázek 12.4 ukazuje detekci HIV gp41 produkovaných chimerními viry vakcínie^ infektovaných fibroblasetch kuřecího zárodku (Westernový bloty)· Pásy 1 až 8 znamenají virové isoláty ř-IP2a až h, pásy 9 a 15 znamenají standard gpl60, pásy 10 až 13 znamenají virové isoláty f-LF2i až 1, pás 4 znamená proteiny markéru, pásy 16 a 17 znamenají viry drůbežích neštovic HP1.441 a f-TK2a (negativní kontroly)·
V následující Části tohoto spisu jsou podrobně popsána výhodná uspořádání tohoto vynálezu·
Tento vynález znamená první konstrukci modifikovaného, genomu cytoplasmové DNA eukaryotického viru, jako je například vir neštovic, úplně mimo hranici živé buňky. Tato konstrukce se sestaví tak, že se použije virová genomová DNA, která se rozštěpí endonukleasou specifickou pro sekvenci a potom se religuje cizí DNA. Výsledná modifikovaná DNA se pak pakážuje do infekčních virionů viru neštovic transfekcí do hostitelských buněk infektovaných jiným virem neštovic, který slouží jako pomocný vir.
Tento vynález umožňuje různé strategie získávání vektorů z cytoplasmaAvfy^ eukaryotickýclkvirů, které byly dříve aplikovány na jiné DNA-viry pro řešení různých problémů v genetickém inženýrství· Například přístup přímého klonování nabízí možnost klonování genů přímo do cytoplasm-s ;^DRA-virů jako jsou například viry neštovic, které nemohou být klono- 25 vány v bakteriálních, systémech, ar už proto, že jsou pro bakteriální systémy příliš velké nebo proto, že jsou pro bakterie toxické a nebo že jsou v bakteriích nestálé. Přímé molekulární klonování dovoluje větší přenost než zkonstruování virových genom&, za optimálních podmínek může zvýšit rychlost klonování a produkují se také různé konstrukce v jediné ligační směsi, které mají násobné inserty s různými orientacemi. To umožňuje rychlé testování (skríning) uspořádání, které poskytuje optimální expresi cizího genu.
Pojem eukaryotický cytoplasmatický DNA-virus“, jak je zde.používán, zahrnuje jak iridoviry tak viry neštovic.
Mezi “iridoviry” patří jakýkoliv virus, který je klasifikován jako virus třídy IridoviričŽae, jako je například virus africké horečky prasat, a také viry obojživelníků a viry hmyzu. Mezi “viry neštovic“ patří jakýkoliv člen rodu Poxvirič^ae včetně podrodů Chordopoxviridiae (viry neštovic obratlovců) a Bntomopoxviridiae (viry neštovic hmyzu). Viz například B. Moss I B. N. Pields, D. M. Knipe a spol. “Virology“ 2080 (Raven Press, 1990). Mezi viry neštovic oĎratlovců (Chordopoxviridiae) patří mimo jiné následující rody, z nichž některé zvláštní příklady (uvedené v závorkách) jsou zde diskutovány: Orthopoxvirus (vakcínie), Avipoxvirus (virus drůbežích neštovic), Capripoxvirus (neštovice ovcí), Leporipoxvirus (firbom králíků (Shope), myxom) a Suipoxvirus (neštovice prasat). Bntomopoxviridiae zahrnují tři rody: A, Ba C.
Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu se získává způsob přípravy modifikovaného eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru přímým molekulárním klonováním modifikovaného genomu cytoplasmatického DNA-viru. Tento způsob zahrnuje stupeň modifikování za extracelulárních podmínek vyčištěné DNA molekuly obsahující první genom cytoplasmatického DNA-viru. Připraví se tak modifikovaná, molekula DNA, která obsahuje genom cytoplasmatického DNA-viru.
Vyčištěná DNA molekula vhodná pro modifikaci podle tohoto vynálezu se připravuje, například isolací genomové
DNA z částeček viru podle standardních způsobů ísolace geno-
zde dále uvedený příklad 1· Některé nebo všechny tyto vyčištěné DNA molekuly se mohou připravovat molekulárním klonováním nebo chemickou syntézou.
Modifikování vyčištěné DNA molekuly, která obsahuje virový genom podle tohoto vynálezu, zahrnuje provedení jakékoliv dědičné změny v DNA sekvenci tohoto genornu. Mezi takové změny patří, například, vloženi DNA sekvence do tohoto genomu, delece DNA z tohoto genornu nebo substituce DNA v tomto genornu jinou DNA sekvencí. Tato DNA sekvence, která je vložena, vynechána nebo substituována, se skládá z jednoho DNA páru nukleotidů nebo více než jednoho DNA páru nukleotidů.
Podle tohoto aspektu vynálezu se stupeň modifikování DNA molekuly, která obsahuje první genom DNA-viru, provádí jakoukoliv technikou, která je vhodná pro extracelulární modifikování sekvence DNA molekuly. Například modifikování DNA molekuly podle tohoto vynálezu zahrnuje modifikování vyčištěné DNA molekuly fyzikálním mutagenem, jako je například ultrafialové světlo, nebo chemickým mutagenem. V oblasti genetického inženýrství jsou dobře známy četné metody extracelulární mutagenese vyčištěných DNA molekul.
Podle jiného uspořádání stupeň modifikování DNA molekuly zahrnuje spojení segmentů DNA za vzniku modifikované DNA molekuly, která obsahuje modifikovaný virový genom.
Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu některé nebo všechny DNA segmenty napojené spolu za vzniku modifikované DNA molekuly se produkují štěpením DNA molekuly obsahující první virový genom nukleasou, s výhodou nukleasou specifickou pro sekvenci. Některé nebo všechny DNA segmenty napojené . spolu za vzniku modifikované DNA molekuly se produkují také chemickou syntézo» dobře známými způsoby.
V některých uspořádáních stupeň spojování DNA segmentů za vzniku modifikované DNA molekuly obsahuje metra naiulán-í stupen ligace takových DNA segmentů mezi sebou pomocí ligasy, jako je například balíferiální nebo bakteriofágová ligasa, podle obecně známých metod rekombinace DNA· Tento stupeň modifikování DNA molekuly obsahuje také zreagování konců DNA segmentů, které byly vyštěpeny z DNA molekuly obsahující první genom viru, fosfatasou, například telecí střevní fosfatasou. Tento enzym odstraňuje fosfátové zbytky a zabraňuje tedy opětovnému navázání (religaci) DNA segmentu, získaného štěpením DNA molekuly, s jiným takovým segmentem.
V alternativním přístupu spojování DNA segmentů se některé nebo všechny DNA segmenty spojí extracelulárním anelováním kohesivních konců, které jsou dostatečně dlouhé, aby umožnily transfekci modifikované DNA molekuly do hostitelské buňky, kde dochází k ligaci anelovaných DNA segmentů·
V jiném uspořádání tohoto způsobu stupeň modifikování DNA molekuly obsahující genom prvního viru zahrnuje stupeň spojení alespoň několika DNA segmentů, které se získají štěpením genomové DNA molekuly prvního viru s dalším DNA segmentem· Získá se tak modifikovaná DNA molekula· Ve výhodném uspořádání tohoto £^>ektu podle tohoto vynálezu tento stupeň obsahuje štěpení genomové virové DNA molekuly endonukleasou specifickou pro sekvenci v jedinečném místě štěpení genomu prvního viru. Získají se tak dvě DNA “raménka” genomové virové DNA. Tato dvě raménka se pak spojí (ligují) s cizí DNA, která obsahuje sekvenci, o kterou se jedná· DNA sekvence, o kterou se jedná, jak je zde popsána sekvence cizího DNA segmentu, která se ligu je s raménky virové DNA, obsahuje v prvním případě DNA sekvenci, která se nevyjsytuje přirozeně v genomu cytoplasmovéhir eukaryotickél&^viru.
DNA sekvence, o kterou se jedná, obsahuje sekvenci sestávající ze sekvence, která se vyskytuje přirozeně v genomu cytoplasmovébn eukaryotickébu^kru. a také sekvenci, která se nevyskytuje přirozeně v takovém genomu. A dále, sekvence, o kterou se jedná, může obsahovat pouze sekvence, které se vyskytují přirozeně v cytoplasmového eukaryotickéhoxviru, kde taková sekvence je vložena do místa v genomu takové%ytoplasmovéb<?hNA’Viru, které se liší od místa, v němž se tato sekvence přirozeně nachází· A navíc, inserce přirozeně se vyskytující virové sekvence, o kterou se jedná, z jedné DNA viru do jiné nebo z jedné části jednoho virového genomu do jiné části tohoto genomu, nutně vytvoří sekvenci, která se nevyskytuje přirozeně v genomu cytoplasmovéhfl DNA-viru podle tohoto vynálezu při napojení virového genomu a inserované virové sekvence, o kterou se jedná.
Tento cizí DNA segment, který se liguje se dvěma raménky genomové virové DNA, obsahuje konce, které jsou slučitelné pro ligaci s konci ramének virové DNA. Těmito slučitelnými konci mohou být doplňkové kohesivni konce nebo zarovnané konce. Stupen ligace tohoto způsobu poskytuje modifikovanou DNA molekulu, která obsahuje genom prvního viru s DNA sekvenci cizí DNA vložené do genomu prvního viru v jedinečném místě štěpení.
Toto uspořádání, při němž se DNA sekvence vkládá do genomu prvního viru, je zde ilustrována příkladem, mimo jiné, způsobu vloženi kazety exprese genu do genomu viru vakcínie v jedinečném místě štěpení bakteriální endonukleasou Notl nebo Smál, jak je to popsáno v příkladu 1, respektive v příkladu 3· Toto uspořádáni je také ilustrováno příkladem vložení kazety genu do genomu rekombinantního vektoru viru drůbežích neštovic v jedinečném místě štěpeni Notl v sekvenci bakteriálního genu genomu rekombinantního viru drůbežích neštovic, jak je to popsáno v příkladu 2.
Vložení (inserce) cizí DNA do jedinečného místa v genomu cytoplasmové DNA eukaryotického viru podle tohoto vynálezu je užitečné pro expresi žádaného proteinu, zvláště lidského proteinu. Například příklad 5 popisuje inserci genů pro plasminogen, protrombin a glykoprotein 160 viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV gpl60) do jedinečného místa štěpení vektoru viru vakcínie a použití výsledných modifikovaných virů vakcínie pro přípravu těchto proteinů. Tyto cizí proteiny se mohou připravovat v buněčných kulturách (při přípravě vyčištěných proteinů) nebo přímo v lidském nebo zvířecím hostiteli (při imunizaci hostitele vak- 29 cínou, která obsahuje modifikovaný vir podle tohoto vynálezu.
V některých uspořádáních stupen modifikování virového genomu insercí DNA sekvence obsahuje zavedení nebo odstranění funkce genu markéru pro rozlišení modifikovaného virového genomu od prvního virového genomu. Podle jednoho takového uspořádání DNA sekvence vložená do prvního virového genomu obsahuje gen selektivního markéru a stupen isolace infekčních modifikovaných virionů viru neštovic produkovaných první hostitelskou buňkou obsahuje stupen infektování druhé hostitelské buňky těmito infekčními viriony za podmínek, kdy dochází k selekci genomu viru neštovic, který expresí poskytuje gen selektivního markéru. Ve výhodném uspořádání tohoto přístupu podle tohoto vynálezu exprese genu selektivního markéru v druhé hostitelské buňce uděluje druhé hostitelské buňce resistenci na cytotoxickou látku.
Tato látka je přítomna během infektování druhé hostitelské buňky v hladinách, které jsou dostatečné pro selekci genomu viru neštovic, který expresí poskytuje gen selektivního markéru. V tomto případě tato látka vybere (selektuje) modifikovaný virový genom, který má vložen gen selektivného markéru, ale nikoliv genom, kterému chybí tento gen markéru.
Inserce DNA sekvence obsahující gen selektivního markéru pro rozlišení modifikovaného virového genomu od prvního virového genomu je zvláště užitečná, jestliže genomová DNA molekula prvního viru je rozštěpena v jedinečném místě Štěpení a tedy výsledná raménka virové DNA se pravděpodobně x.eligují (znovu naváží) bez vložení DNA sekvence, která je žádána. ®ěnto přístup je ukázán na příkladu způsobu vložení genu pro enzym xanthin-guanin-fosforibosyl-transferasu SscI&iohia coli (dále zde označovaný gpt gen) do, mimo jiné, genomu viru vakcínie nebo genomuviru drůbežích neštovic v jedinečném místě štěpení Notl, jak je to popsáno v příkladech 1, respektive 2.
Způsob odstraňování funkce genu markéru z prvního virového genomu pro rozlišení modifikovaného virového genomu od prvního genomu je uveden v příkladu 2. ^ento
- 30 způsob se týká inserce cizí DNA sekvence do genomu viru drůbežích neštovic v místě Notl v E. coli lacZ genu kódujícím β-galaktosidasu. Jak je to popsáno v příkladu 2 (neštovice ptáků), inserce DNA sekvence do tohoto místa přerušuje lacZ kódující seřenci a zabraňuje tedy produkci β-galaktosidasy. Exprese tohoto enzymu poskytuje fenotypmodrý plak” pro vir nesoucí lacZ gen. Modifikovaný virový génom, který’ nese v tomto místě inserci DNA sekvence, vykazuje fenotyp bílého plaku. Tímto způsobem se odliší modifikovaný vir od prvního viru. V jiném uspořádání způsobů podle tohoto vynálezu se funkční E.coli lacZ gen přenese do vektoru s jiným genem, o který se jedná. Slouží pak jako markér modifikovaných virů, které obsahují žádaný insert.
V ještě jiných uspořádáních podle tohoto vynálezu stupeň modifikování DNA molekuly obsahuje zavedeni nového místa štěpení ^édonukleasou specifickou pro sekvenci do prvního virového genomu. Jeden příklad tohoto uspořádání obsahuje vložení cizí DNA obsahující syntetický DNA linker* do exis· tu jícího jedinečného místa v prvním genomu viru neštovic, jak je to popsáno v příkladu 6. Tento linker obsahuje násobné klonovací místo, obsahující několik míst štěpeni úzce přilehlých, která jsou užitečná pro vložení cizí DNA ďo modifikovaného genomu viru neštovic. Místa štěpení v násobném klonovacím místě s výhodou nejsou přítomna v prvním virovém genomu a tedy jsou jedinečnými v modifikovaném virovém genomu.
Podrobněji - stupeň modifikování DNA molekuly obsahující první virový genom zahrnuje také vložení DNA sekvence mezi první a druhé místo štěpení nukleasou specifickou pro sekvenci. Podle jednoho takového uspořádání první virový genom obsahuje násobné klonovací místo obsahující místa štěpení, která jsou jedinečná v prvním virovém genomu. Podle tohoto způsobu štěpení DNA molekuly, která obsahuje první virový genom ve dvou takových jedinečných místech v násobném klonovacím místě, poskytuje dvě raménka virové DNA, která mají kohesivní konce, které nejsou slučitelné s ligací navzájem mezi sebou. DNA segment mezi těmito dvěma
- 31 jedinečnými místy štěpení v násobném klonovacím místě se odstraní od rozštěpených ramének virové DNA, například vysrážením těchto ramének ethanolem, jak je to popsáno při inserci genu lidského protrombinu do modifikovaného vektoru viru neštovic v příkladu 5·
Vložení DNA segmentu do virového genomu mezi dvě jedinečná místa štěpení je užitečné pro '‘násilné” klonování DNA insertů, které mají kohesivní konce slučitelné s ligací s každým raménkem vektoru. Jinými slovy, tento způsob, obsahující štěpení virové DNA ve dvou místech, je užitečný pro zvýšení výtěžku, virových genomů, které pocházejí od ligace ramének virové DNA, ve srovnání s raménky připravenými štěpením virové DNA v jediném místě, protože raménka podle tohoto způsobu nemají konce slučitelné s ligaci* Tento násilný způsob klonování také řídí orientaci DNA vložené do modifikovaného virového genomu, protože pouze jedno raménko virové DNA je slučitelné s ligaci s každým z konců vložené DNA.
Způsob násilného klonování podle tohoto vynálezu je ukázán například vložením kazety exprese genu obsahující gen lidského protrombinu do násobného klonovacího místa vektoru viru vakeínie, jak je to popsáno v příkladu 5·
Ve výhodném uspořádání DNA segment mezi dvěma jedinečnými místy štěpení v prvním virovém genomu není podstatný pro replikaci prvního virového genomu a tedy ani delece této sekvence ani její náhrada jiným DNA segmentem nezabrání replikaci výsledného modifikovaného genomu. Tento DNA segment lze také nahradit DNA segmentem obsahujícím takovou část této sekvence, která je podstatná pro virovou replikaci, svázanou s další DNA sekvencí, která se má vložit do prvního virového genomu.
Podle jiného aspektu tohoto způsobu stupen modifikování prvního virového genomu obsahuje eliminaci nežádoucího místa štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci. Modifikace tohoto typu se mohou provádět opakovaně, jestliže je to nutné, například pro vynechání přebytečných míst štěpení něk- 32 terými nukleasami, čímž se získá modifikovaný virový genom, který má jedinečné místo štěpení pro příslušnou nukleasu.
Způsoby, které jsou zvláště vhodné pro odstraněni míst štěpení z virového genomu, jsou dobře známy odborníkům· Patří mezi ně různé způsoby obvykle místně řízené mutagenese. Jedním ze způsobu odstranění místa štěpení endonukleasou z virového genomu, je extracelulární zpracování genomové virové DNA, aby se tak vybraly rautanty genomových DNA molekul, které jsou resistentní na štěpení příslušnou e ndonukleasou.
Jiným způsobem odstranění místa štěpeni z virového genomu je ligace rozštěpené virové DNA molekuly s DNA segmentem, například syntetickým DNA segmentem, který obsahuje konec slučitelný s ligací s rozštěpenou vx&ou DNA, ale kterému chybí část rozpoznávací sekvence pro nukleasu, která štěpí tuto virovou DNA. Podle tohoto způsobu místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, která štěpí virovou DNA, obsahuje rozpoznávací sekvenci pro nukleasu, která se nachází mimo sekvence obklopující kohesivní konec v sekvencích bezprostředně přiléhajících ke kohesivním koncům. Tento syntetický linker obsahuje kohesivní konce slučitelné s ligací s raménky virové DNA rozštěpené v jediném místě. Avšak tato sekvence bezprostředně přiléhající k jednomu kohesivnímu konci syntetického insertu se liší od rozpoznávací sekvence, která je požadována pro štěpení enzymem, který štěpí virovou DNA. Ligace tohoto konce syntetického DNA segmentu s virovým raménkem tedy nevytváří znovu funkční místo pro štěpení nukleasou, která štěpí virovou DNA. Příklad tohoto způsobu odstraňování místa štěpení z virového genomu je uveden v příkladu 4, kdy se syntetický DNA fragment obsahující násobné klonovací místo vloží do jedinečného místa štěpení virového genomu.
Aby se zabránilo deaktivaci virového genomu jako důsledku modifikace, je zřejmé, že modifikace virového genomu podle tohoto vynálezu se musí provádět v takové oblasti virového «* ·* genomu, která není podstatná pro multiplikaci viru v buněčné kultuře za podmínek používaných pro množení výsledného modifikovaného viru· Mezi genomové oblast DNA-viru obsahující sekvence, které nejsou podstatné pro multiplikaci v buněčné kultuře a jinak jsou vhdoné pro modifikaci podle tohoto způsobu, patří sekvence mezi geny (tj. intergenové oblasti) a sekvence genů, které nejsou potřebné pro multiplikaci modifikovaného virového genomu.
Nepodstatné místo vhodné pro modifikování vybraného genomu eukaryotického cytoplasaatického DNA-viru podle tohoto vynálezu lze identifikovat tak, že se připraví žádané modifikace a stanoví se, zda taková modifikace interferuje s replikací tohoto genomu za žádaných infekčních podmínek. Podrobněji - místa štěpení restrikčnimi enzymy ve virovém genomu včetně jedinečných míst v tomto genomu se identifikují například rozštěpením genomové DNA a analýzou výsledných fragmentů postupy, které jsou dobře zmány odborníkům. Tento genom lze rozštěpit pokusnou insercí krátkého segmentu syntetické DNA do vybraného cílového místa štěpení způsobem přímého klonování podle tohoto vynálezu. Isolace viru, kberý obsahuje insert v cílovém místě štěpení, je přímou indikací toho, že cílové místo je nepodstatnou oblastí tohoto genomu. Jestliže neexistuje žádné použitelné místo štěpení v příslušném genomovém cílovém místě, může se takové místo zavést bučí přímým molekulárním klonováním nebo konvenční konstrukcí genomu založené na technice získání mar^řru. V tomto případě úspěšná isolace viru, který obsahuje vložené místo štěpeni v cílovém místě, je přímou indikací toho, že cílové místo je npodstatnou oblastí vhodnou pro modifikaci podle tohoto vynálezu.
Byly popsány jisté nepodstatné genomové oblasti viru neštovic, které jsou vhodné pro účely podle tohoto vynálezu. Viz například citaci Goebel a spól.: Virology 179. 247 až 266 (1990), tabulka 1, která je zde uvedena jako odkaz.
V dalších uspořádáních tohoto způsobu je alespoň část
- 34 DNA sekvence, která je vložena do prvního virového genomu, pod transkripční kontrolkou promotoru. V některých uspořádáních je tento promotor umístěn v DNA sekvenci, která je vložena do prvního virového genomu a tedy kontroluje transkripci této části vložené DNA sekvence po směru vlákna od promotoru. Příkladem tohoto postupu je inserce genové kazety obsahující promotor funkčně navázaný na otevřenou čtecí oblast do genomu viru neštovic, jak je to popsáno v příkladech 1 až 5·
V jiném výhodném uspořádání je promotor kontrolující transkripci DNA sekvence, která je vložena do prvního virového genomu, umístěn v modifikovaném virovém genomu pro-, ti směru vlákna vložené DNA sekvence. Tento přístup je ilustrován inserci cDNA kódující protein lidského von Willebrandova faktoru do násobného klonovacího místa, které je funkčně navázáno na promotor proti směru vlákna ve vektoru viru vakcínie, jak je to popsáno v příkladu 6.
V některých uspořádáních je promotor kontrolující . vloženou DNA sekvenci rozeznáván RNA polymerasou kódovanou modifikovaným virovým genomem. Tento promotor může být rozeznáván pouze RNA polymerasou kodovanou jiným genomem, například jiným virovým genomem nebo buněčným genomem. Totu to RNA polymerasou může být například polymerasa £7 bakteriofágu, která je kódována jiným genomem cytoplasmove DNA-viřu nebo genomem modifikované hostitelské buňky. Polymerasa T7 a promotor byly použity například u rekombinantních virů neštovic pro zvýšení exprese vložené DNA sekvence. Viz například Ruerst T. R. a spol.: J. Mol. Biol. 205. 353 až 348 (1989). T7 ENA polymerasa na Odděleném genomu se používá pro zabránění exprese DNA sekvence vložené do modifikovaného genomu viru neštovic vyjma toho, kdy je oddělený genom přítomen.
V ještě jiných uspořádáních je promotor kontrolující insert vhodný pro iniciaci transkripce RNA polymerasou cytoplasmatického DNA-viru. V některých uspořádáních promotor obsahuje modifikaci DNA sekvence přirozeně se
-35vyskytujícího virového promotoru. Příkladem jednoho takového„.uspořádání je použití syntetického” promotoru viru vakcínie, jako je například *’S3A’’ nebo*S4 promotor popsaný mimo jiné v příkladu 5 a příkladu 6. ”
Konstrukce genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru podle tohoto vynálezu dále zahrnuje stupeň zavedení modifikované DNA molekuly obsahující modifikovaný virový genom do první hostitelské buňky, která pakážuje modifikovanou DNA molekulu do virionů modifikovaného eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru. Modifikovaná DNA molekula se zavede do první hostitelské buňky způsobem vhodným pro tra nsfekt ování této první hostitelské buňky DNA molekulovou, např. způsoby, které jsou známy odborníkům transfekce jiných DNA do srovnatelných hostitelských buněk. Například ve výhodném uspořádání se modifikovaná DNA molekula zavádí do první hostitelské buňky technikou srážení fosforečnanem vápenatým podle Grahama a van der Eba: Virology 52, & až 467 (1973).
Ve výhodném uspořádání tohoto způsobu přípravy modifikovaného eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru dále obsahuje stupeň infikování první hostitelské buňky druhým cytoplasrnatickým DNA-virem obsahujícím genom druhého cytoplasmatického DNA-viru, který expresí pakážuje modifikovanou DNA molekulu do infekčních virionů modifikovaného cytoplasmatického DNA-viru. Při způsobu, který zahrnuje infikování první hostitelské buňky druhým virem se zavedení rekombinantní DNA molekuly do první hostitelské buňky provádí s výhodou asi jednu hodinu po infikování hostitelské buňky druhým virem.
V jiném uspořádání podle tohoto vynálezu podle tohoto způsobu se nutné pakážování do první hostitelské buňky provede jiným genetickým prvkem než úplným genomem druhého viru, jako je například plasmid nebo jiný expresní vektor vhodný pro transformování první hostitelské buňky a expreso· vání žádaných funkcí pomocného viru. Použití nevirového genetického prvku pro dosažení pomocných funkcí umožňuje
- 36 přípravu geneticky stabilních pomocných buněk, které neprodukují infekční pomocný vir. Použití této pomocné buňky jako první hostitelské buňky pro pakážování modifikované DNA molekuly s výhodou produkuje pouze viriony obsahující tyto modifikované DNA molekuly.
Při způsobu, při němž dochází k infekci první hostitelské buňky druhým virem, se druhý vir vybere tak, že exprese druhého virového genomu v první hostitelské buňce pakážuje modifikovanou DNA molekulu do infekčních virionů. obsahujících modifikovaný virový genom. Podle tohoto vynálezu je možné uskutečnit intracelulární pakážování modifikované DNA obsahující genom eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru transfekcí do buněk infikovaných blízce příbuzným virem. Například DNA prvního viru rodu neštovic se pakážuje hostitelskou buňkou infikovanou druhým virem neštovic stejné podčeledi viru neštovic, aí už ze stejného nebo různého rodu.
V jistých uspořádáních exprese druhého virového genomu v první hostitelské buňce poskytuje infekční viriony obsahující druhý virový genom stejně jako modifikovaný virový genom. K této situaci dochází, například v případě homologního pakážování DNA prvního viru neštovic jednoho rodu druhým virem stejného rodu. I když transfektováná DNA by se mohla teoreticky pakážovat přímo, tj. bez transkripce transfektovaného genomu, homologní pakážování transfektováné DNA molekuly možná zahgřuje transkripci a replikaci jak transfektované DNA tak DNA pomocného viru. Tato situace je ilustrována mimo jiné homologním pakážováním DNA viru neštovic v příkladech 1 a 2.
Avšak v jiných uspořádáních exprese druhého virového genomu v první hostitelské buňce neprodukuje infekční viseny obsahující druhý virový genom. V případě heterologního pakážování, například pasivní pakážování samotné nemůže produkovat životaschopné virové částice z transfektované DNA.
V takovém případě je výhodný druhý (pomocný) vir, který poskytne RNA polymerasu, která rozeznává transfektovanou DNA jako templát a tedy slouží pro iniciaci transkripce a
-yi nakonec replikaci transfektované DNA. Tento případ je příkla dem reaktivace modifikovaného genornu vektoru viru neštovic (vakcínie) pomocným virem ptačích neštovic (drůbežích neštovic) v savčí první hostitelské buňce, v níž vir ptačích neštovic není schopen produkovat infekční viriony obsahující genom viru ptačích neštovic, jak je to popsáno v příkladu 3·
Použití heterologního viru pro pakážování modifikované DNA molekuly, jako je například použití viru neštovic drůbeže nebo viru myších neštovic (ektromelie) jako pomocného viru pro konstrukci viru vakcínie, s výhodou minimalizuje rekombinační události mezi pomocným virovým genomem a transfektovaným genomem, který je přítomen při tom, když homologní sekvence blízce příbuzných virů jsou přítomny v jedné buňce. Viz Penner a Comben (195Q) a Penner (1959)·
V jistých uspořádáních způsobu, kdyée pomocný vir používá pro DNA pakážování, stupeň isolování infekčních virionů obsahujících modifikovaný virový genom obsahuje stupeň infikování druhé hostitelské buňky infekčními viriony popdukovanými první hostitelskou buňkou. Druhá hostitelská buňka se s výhodou infikuje za takových podmínek, že expresí druhého virového genornu v druhé hostitelské buňce se neprodukují infekční viriony obsahující druhý virový genom. Jinými slovy - druhá hostitelská buňka je infikována za podmínek, které selektují replikaci modifikovaného viru, nikoliv pomocného viru. Příkladem tohoto způsobu je způsob, při němž modifikovaný genom znamená modifikovaný genom viru vakcínie, druhý genom znamená genom viru drůbežích neštovic a druhá hostitelská buňka znamená savčí buňku. Podle tohoto způsobu se modifikovaný vir vyčistí přes plak v kulturách savčí hostitelské buňkj, v nichž vir drůbežích neštovic neprodukuje infekční viriony, jak je to popsáno v příkladu 3.
V jiném uspořádání, v němž druhá hostitelská buňka se infikuje za podmínek, kdy dochází k selekci modifikovaného viru, modifikovaný virový genom obsahuje funkční gen hostitelské oblasti potřebný pro produkci infekčních virionů
- 38 v druhé hostitelské buňce. Druhému virovému genomu chybí tento funkční gen hostitelské oblasti. Toto uspořádání je ilustrováno způsobem, při němž modifikovaný virový genom znamená modifikovaný virový genom vakcínie obsahující funkční gen hostitelské oblasti potřebné pro produkci viru vakcínie v lidské (MRC 5) buňce, která se používá jako druhá hostitelská buňka, jak je to popsáno v příkladu 8.
V ještě jiném uspořádání zahrnujícím selekci modifikovaného viru v druhé hostitelské buňce modifikovaný virový genom obsahuje gen selektivního markéru, kterému chy bí genom druhého viru a stupen infikování druhé hostitelské buňky se provádí za podmínek, za kterých dochází k selekci virového genomu expresujícího gen selektivního markéru· Například exprese genu selektivního markéru v druhé hostitelské buňce může této buňce udělit resistenci na cytotoxickou lt/áku. Tato látka se dodá během infikování druhé hostitelské buňky v takových hladinách, které postačují pro selekci virového genomu expresujícího gen selektivního markéru. Tento přístup je ukázán na příkladu způsobu vložení genu pro B. coli gpt gen do genomu viru vakcínie, jako například v příkladu 1, nebo genomu viru drůbežích neštovic, jako například v příkladu 2} v obou případech se používá pomocný vir, kterému chybí gen selektivního markéru.
V ještě jiném uspořádání zahrnujícím selekci modifikovaného viru v druhé hostitelské buňce obsahuje modifikovaný virový geif^eleci genu selektivního markéru, který je přítomen v druhém virovém genomu. V tomto případě se stupeň infikování druhé hostitelské buňky provádí za podmínek, za kterých dochází k selekci virového genomu expresujícího gen selektivního markéru. Například exprese genu thymidin-kinasy (tk) viru neštovic v druhé hostitelské buňce (tj. hostitelská buňka negativní na thymidin-kinasu) způsobuje, že druhý (pomocný) vir je sensitivní na metabolický inhibitor, 5-brom-deoxyiiidin. Příklad 4 popisuje použití těchto inhibitorů během infikování druhé hostitelské buňky} dochází tak k selekci vektoru viru vakcínie (vdT#),
- 59 v němž je tk gen deletován a nahrazen násobným klonovacím místem.
Jiný aspekt tohoto vynálezu se týká eukaryotického cyto plasmatického DNA-viru obsahujícího modifikovaný virový genom. Modifikovaný genom cytoplasmatického DNA-viru podle tohoto vynálezu obsahuje různé sekvence DNA, které jsou od sebe odlišitelné, například rutinní hybridizací nukleovými kyselinami nebo DNA sekvenováním.
V některých uspořádáních modifikovaný virový genom obsahuje první genom prvního eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, Tento první genom obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečným místem štěpení v prvním genomu. V tomto uspořádání ty sekvence modifikovaného genomu, které obsahují první virový genom, jsou homologní s genomem přirozeně se vyletujícího eukary^oického cytoplasmatického DNA-viru. Dále pak jsou sekvence tohoto prvního viru přerušeny DNA sekvencí, o kterou se zde jedná.
Pro stanovení, jestli tato sekvence je vložena do jedinečného místa štěpení v prvním virovém genomu, jak je to potřebné pro uspořádání modifikovaného virového genomu, se sekvence, které bezprostředně obklopují insert, srovnají se sekvencemi místa štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci.
V jedné formě tohoto uspořádání, v němž DNA sekvence je vložena do jedinečného místa štěpení prvního virového genomu, je vložená sekvence v prvním virovém genomu obklopena dvěma identickými neporušenými místy štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci. Tato dvě místa jsou jedinými místy pro tuto nukleasu v úplném modifikovaném genomu. Každé z těchto dvou míst obsahuje spojené části rozštěpených míst a prvního virového genomu a vložené DNA sekvence.
Podroben ji lze uvést, že každé vlákno dvojvláknové DNA obsahující místo štěpení endonukleasou specifickou pro
- 40 sekvenci může být považováno za vlákno, které obsahuje sekvenci úplného místa štěpení (SjSg) sestávající ze sekvence levého místa štěpení (S^) a sekvence pravého místa štěpení (SR) oddělených monofosfátovou vazbou, které je přerušeno štěpením příslušnou nukleasou. V jistých formách tohoto uspořádání inserce DNA sekvence do jedinečného restrikčního místa reprodukuje dvě úplná místa obklopující insert.
V jiných formách tohoto uspořádání však inserce DNA sek vence do jedinečného místa štěpení nevytváří znovu původní místo štěpení na každém konci vložené DNA sekvence. Viz například způsob odstraňování místa štěpení, který je popsán v příkladu 6. Vložena DNA může být tedy obklopena na jednom konci (například na levém konci) úplným místem štěpení (SjSR), zatímco pravý konec končí sekvencí, která se liší od přímo navázané na sekvenci v prvním virovém genomu. Obecněji - v jakémkoliv modifikovaném virovém genomu podle tohoto vynálezu bude DNA sekvence vložená do jedinečného místa v prvním virovém genomu obklopena dvěma párovými částmi (S·^ a SR) míst štěpení, která se nevyskytují v modifikovaném virovém genomu mimo vloženou DNA.
V jiných uspořádáních modifikovaný virový genom sestává z DNA sekvence, která je vložena mezi dvě jedinečná místa v prvním virovém genomu. V tomto případě, jestliže první virový genom znamená přirozeně se vyskytující genom eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, insert bude obklopen virovými sekvencemi oddělenými od cizí DNA sekvence alespoň rozpoznatelnou a SR částí dvou různých původních míst ště· pění.
V dalších uspořádáních modifikovaný virový genom obsahuje jedinečné místo štěpeni umístěné v DNA sekvenci, která se nevyskytuje přirozeně v genomu eukaryotického plasmatického DNA-viru. V tomto případě tato cizí DNA sekvence není oddělena od přírodních virových DNA sekvencí rozpoznatelnou SL a SR částí míst štěpení. V jistých formách tohoto uspořádání je první cizí DNA sekvence přerušena druhou cizí DNA sekvencí vloženou do jedinečného místa Štěpení v první
- 41 sekvenci nebo mezi dvě taková místa v první sekvenci.
V těchto uspořádáních je druhá cizí DNA sekvence oddělena od první cizí DNA sekvence rozpoznatelnou S^ a S^ částí míst štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci. V tomto případě všechny sekvence obklopující tuto druhou cizí DNA sekvenci obsahují genom prvního viru podle tohoto vynálezu
Mezi výhodná uspořádáni modifikovaného eukaryotického plasmatického DNA-viru podle tohoto vyná^zu patří první hlavní uspořádání, v němž modifikovaný virový genom obsahuje
I) první genom prvního eukaryotickéno plasmatického DNA-viru, který obsahuje místo štěpení gédonukleasou specifickou pro sekvenci. Toto místo je jedinečným místem v prvním virovém genomu. Modifikovaný virový genom podle tohoto uspořádání obsahuje také II) první DNA sekvenci, o kterou se jedná. Tato DNA sekvence je vložena do jedinečného místa v prvním genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru.
v jedné variaci tohoto prvního uspořádání modifikovaného eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru první virový genom obsahující jedinečné místo znamená přirozeně se vyskytující virový genom. Tato variace je zde ukázána na příkladu modifikovaného genomu viru neštovic obsahujícího přirozené se vystůjící genom viru vakcínie, který má jeV dinečné místo štěpení (jedinečná místa štěpení) bakteriálními restrikčními endonukleasami Notl a Smál, jak je to popsáno v příkladu 1 a v příkladu 3· V tomto uspořádání je příkladem první DNA sekvence, o kterou se jedná, která je vložena do jedinečného místa, B. coli gpt gen řízený přirozeně se vyskytujícím promotorem viru vakcínie vložený do Notl místa (příklad 1) nebo Smál místa (příklad 3) genomu viru vakcínie.
Ve druhé formě tohoto prvního uspořádání modifikovaného viru pivní virový genom obsahující jedinečné místo obsahuje také druhou DNA sekvenci přirozeně se nevyskytující ve virovém genomu. Tato druhá DNA sekvence dále zahrnuje jedinečné místo pro vložení první DNA sekvence. Tato varianta je zde ukázána na přikladu modifikovaného genomu viru drůbežích neštovic obsahujícího DNA sekvenci kódující gen Esoherichia ooli β-galaktosidasy, jak je to popsáno v příkladu 2. Tento bakteriální gen zahrnuje místo štěpení bakteriální řestrikční endonukleasou Not I, které je jedinečné v modifikovaném genomu viru drůbežích neštovic, a je tedy zvláště vhodný pro vložení sekvencí cizích DNA.
V jiné variantě tohoto prvního uspořádání modifikovaného viru ahespoň část první DNA sekvence, která je vložena do jedinečného místa štěpení, je pod transkripční kontrolou promotoru.V některých případech je promotor umístěn v první DNA sekvenci, která je vložena do prvního virového genomu. K tomu dochází například tehdy, jestliže vložená DNA obsahuje genovou kazetu včetně promotoru a funkčně napojeného genu, jak je to popsáno, mimo jiné, v příkladech 1 a 2.
V druhém uspořádání modifikovaného cytoplasmatického DNA-viru podle tohoto vynálezu modifikovaný virový genom obsahuje I) první virový genom obsahující první a druhé místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, kde každé z těchto míst je jedinečné v prvním virovém genomu.
V jedné výhodné variantě tohoto uspořádání první virový genom obsahuje násobné klonovací místo sestavené z několika jedinečných míst štěpení.
V tomto druhém uspořádání modifikovaný virový genom obsahuje také II) první DNA sekvenci přirozeně se nevyskytující v genomu eukaryotiokého cytoplasmatického DNA-viru.
Tato DNA sekvence je vložena do prvního virového genomu mezi první a druhé jedinečné místo štěpení.
Ve 1&tím uspořádání modifikovaného cytoplasmatického DNA-viru podle tohoto vynálezu modifikovaný virový genom obsahuje I) první virový genom obsahující prvni DNA sekvenci přirozeně se nevyskytující v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru. Tato DNA sekvence obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečným místem v modifikovaném virovém genomu. Modifikovaný virový genom podle tohoto uspořádání dále obsahuje II) promotor
- 43 umístěný tak, že DNA sekvence, vložená do jedinečného místa, je pod transkripční kontrolou promotoru. První DNA sekvence nemá start kodon translace mezi promotorem a jedinečným místem použitým pro inserci DNA sekvence. Příkladem tohoto uspořádání je vektor viru vakcínie (vS4) popsaný v příkladu 6, který má promotor syntetického” viru neštovic umístěn tak, že tento promotor kontroluje transkripci DNA sekvence vložené do násobného klonovacího místa určeného pro vložení otevřených čtecích oblastí.
Jiný aspekt tohoto vynálezu se týká DNA molekuly obsahující modifikovaný virový genom modifikovaného eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru podle tohoto vynálezu. Ve výhodném uspořádání se tato DNA molekula připravuje extrakcí genomových DNA molekul z virionů. modifikovaného eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru podle tohoto vynálezu nebo z buněk infikovaných modifikovaným virem podle tohoto vynálezu. Způsoby, které jsou vhodné pro extrahování modifikovaných virových genomových DNA z virionů, jsou známy odborníkům. Navíc jsou vhodné způsoby přípravy DNA eukaryotických cy t opia srna ticJsých DNA-virů popsány v příkladu 1 tohoto spisu.
Ještě jiný aspekt tohoto vynálezu se týká genomových DNA ramének eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru podle tohoto vynálezu. Tato genomová DNA raménka jsou užitečná pro přímé molekulární klonování virových genomů obsahujících cizí DNA. Pod^rbněji se tento aspekt podle vynálezu týká dvou DNA molekul, levého a pravého genomového raménka modifikovaného virového genomu eukaryoticlsých cytoplasmatických DNA-virů. Při praktickém provádění shora popsaného přímého klonování podle tohoto vynálezu buč jedno nebo obě tato raménka sestávají zcela z DNA sekvence, která se přirozeně vyskytuje v cytoplasmatickém DNA-viru. Ale nová DNA molekula zde popisovaného apjíektu podle tohoto vynálezu je modifikované raménko virového genomu, jinými slovy je to DNA molekula obsahující jeden konec modifikovaného virového genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru. Tento konec modifikovaného virového genomu obsahuje DNA sekvenci,
- 44 o kterou se jedná, která odlišuje tuto DNA molekulu od genomových ramének sestávajících, pouze ze sekvence, která se přirozeně vyskytuje v cytoplasmatickém DNA-viru. Navíc, modifikovaný virový genom, od něhož je nové raménko odvozeno, obsahuje jedinečné místo štěpení endonukleasou spéci*· fickou pro sekvenci. Dále, tato DNA molekula má konec, který je homologní s produktem štěpení jedinečného místa v modifikovaném virovém genomu endonukleasou specifickou pro sekvenci.
Ve výhodném uspořádání se tato DNA molekula obsahující genomové raménko připravuje štěpením genomové DNA modifikovaného viru v jedinečném místě endonukleasou specifickou pro sekvenci. Tato DNA molekula se může připravovat také modifikováním jiné DNA molekuly. Získá se tak konec, který je homologní s koncem připraveným štěpením jedinečného místa v modifikovaném virovém genomu. Například DNA molekula podle tohoto afektu podle tohoto vynálezu se může připravit z ramének přirozeně se vyskytujícího virového raménka, například ligací se syntetickým adaptorem, DNA segmentem obsahujícím kohesivní konec odvožený od místa štěpení, které není přítomno v prvním virovém genomu. V tomto případě konec prvního virového genomu a ligovaný adaprot společně obsahují jeden konec modifikovaného virového genomu.
Tato příslušná DNA molekula se nezískává štěpením modifikované virové genomové DNA, ale obsahuje konec, který je homologní s koncem, který se získává štěpením jedinečného místa v modifikovaném virovém genomu.
V jiném uspořádání modifikovaného virového raménka DNA podle tohoto vynálezu, DNA sekvence nevyskytující se přirozeně v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečné v modifikovaném virovém genomu. Toto místo štěpení dále obsahuje sekvenci levého místa štěpení (S^) pro levé genomové raménko nebo sekvenci pravého místa štěpení (¾) pro pravé genomové DNA raménko. Tím se získá úplná sekvence místa štěpení (SjSR), která je jedinečná v modifikovaném virovém genomu. Příkladem tohoto
- 45 uspořádání jsou mimo jiné DNA raménka připravená z vektoru viru drůbežích neštovic bakteriální restrikčni endonukleasou Notl, jak je to popsáno v příkladu 2 nebo raménka vektoru viru vakeínie (vS4) rozštěpeného v kterémkoliv z několika jedinečných míst vloženého násobného klonovacího místa, tak jak je to popsáno v příkladu 6.
Ještě jiný aspekt tohoto vynálezu se týká sestavy pro přímé molekulární klonování modifikovaného virového genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru. Tato sestava obsahuje I) vyčištěné DNA molekuly podle tohoto vynálezu.
Tyto molekuly obsahují bu3 genomová virová DNA raménka podle tohoto vynálezu nebo úplný neporušený modifikovaný virový genom podle tohoto vynálezu nebo obojí. Virová DNA raménka jsou užitečná pro přímou ligaci s cizími DNA segmenty, které se mají klonovat, zatímco neporušené virové DNA se používají pro klonování po štěpení například endonukleasou specifickou pro sekvenci v místě, které je jedinečné v modifikovaném virovém genomu.
Tato sestava dále obsahuje II) DNA ligasu a III) roztoky pufru nebo jiných reakčních činidel vhodných pro ligaci DNA segmentů. Získá se tak modifikovaná DNA molekula obsahující uvedený modifikovaný virový genom. Vhodný pufr a vhodná reakční činidla pro ligaci jsou popsána například v příkladu 1.
V jednom uspořádání tato sestava dále obsahuje plasmid obsahující kazetu exprese genu obklopenou místy štěpení endonukleasou specifickou prJsekvenci. Jestliže se štěpí příslušnou endonukleasou specifickou pro sekvenci místa obklopující kazetu, produkují se konce, které jsou slučitelné s inserci této kazety jedinečného místa štěpení modifikovaného virového genomu, který je kodován DNA molekulou.
V jiném uspořádání tato klonovací sestava dále obsahuje první hostitelskou buňku a druhý (pomocný) vir vhodný pro pakášování modifikovaného virového genomu do infekčních virionů.
- 46 Ještě jiný aspekt tohoto vynálezu se týká plasmidů, které jsou zvláště vhodné jako meziprodukty pro konstrukci modifikovaných vektorů cytoplasrnatického DNA-viru podle tohoto vynálezu. Podle jednoho uspořádání podle tohoto vynálezu podle tohoto ^pektu se získává plasmid obsahující DNA segment, který má na koncích stejné místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci. Toto místo je také jedinečným místem v prvním genomu cytopla srna tického DNA-viru podle tohoto vynálezu. Tento DNA segment obsahuje násobné klonovací místo obsahující několik těsně přilehlých míst štěpení ^(edonukleasou specifickou pro sekvenci, která jsou v tomto plasmidu jedinečná a jsou tedy užiterjícá pro inserci cizích DNA segmentů do plasmidu.
Tento plasmid je užitečný pro vložení genů do jedinečného místa štěpení DNA segmentu pro následný přenos tohoto segmentu do jedinečného místa štěpení cytoplasmatického DNA-viru způsobem přímého molekulárního klonování podle tohoto vynálezu. Jako příklad tohoto plasmidu lze uvést plasmid pN2 (viz příklad 1, obrázek 1.5), který má DNA segment obsahující násobné klonovací místo obklopeno místy Notl obsahující následující další místa štěpení bakteriálními restrikčnimi enzymy v uvedeném pořadí: Xbal, Spěl, BamHl, Smál, Pstl, EcoRI, EcoRV, Hindlll a ClaI.
Jiný plasmid podle tohoto vynálezu obsahuje DNA segment, který má na koncích místo štěpení, které je jedinečným místem v cytoplasmatickém DNA viru. DNA segment tohoto plasmidu také obsahuje několik míst štěpení restrikčnimi enzymy, která jsou v tomto plasmidu jedinečná. Tento DNA segment dále obsahuje gen selektivního markéru (např. E. coli gpt gen), za trar^kripční kontroly promotorem cytoplasmatického DNA-viru (např. promotorem Ρ7·5 viru vakcínie). Příklady těchto plasmidů jsou dva plasmidy označené pN2-gpta a PN2-gptb, které obsahují DNA segment obklopený místy Notl a obsahující E.coli gpt gen za transkripční kontroly promotrem P7.5 viru vakcínie. Tento plasmid byl vytvořen inserci kazety promotor-gen do místa Smál plasmidu pN2, jak je to popsáno na obrázku 1.5·
- 47 V další modifikaci shora uvedeného plasmidu DNA segment dále obsahuje druhý promotor viru neštovic operativně napojený na DNA sekvenci obsahující místo štěpení restrikční endonukleasou. Příkladem tohoto plasmidu je plasmid pN2gpt-S3A (obrázek 4.7), který lae použít pro vložení otevřených čtecích oblastí, jimž chybí jejich vlastní iniciační kodon, pro přenos do vektoru viru vakcínie. Podobně lze použít plas mid pN2gpt-S4 (obrázek 4.7) pro vložení úplných otevřených čtecích oblastí včetně start kodonu AUG-translace.
V jiném uspořádání tento plasmid obsahuje DNA sekvenci kódující lidský plasminogen, kde DNA sekvence je odštěpitelně napojena na promotor viru neštovic a start kodon. Příkladem tohoto plasmidu je plasmid pN2gpt-GPg, kódující lidský glu-plasminogen, a plasmid pN2gpt-LPg, kódující lys-plasminogen, kde kódující oblast pro aminokyseliny 1 až 77 lidského plasminogenu je vynechána (obrázek 5*2 a 5· 3)
V příbuzné formě tento plasmid dále obsahuje DNA sekven ci l&lující vir lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) gpl60, kde DNA sekvence je odštěpitelně napojena na promotor viru neštovic a start kodon. Jako příklad lze uvést plasmid pN2gpt-gpl60, který má gpl60 gen kontrolovaný syntetickým promotorem viru vakcínie S4 (obrázek 5·4).
Jiný plasmid podle tohoto vynálezu obsahuje segment genomu cytoplasmatického DNA-viru, v němž je umístěn virový gen thymidin-kinasy (tk). V tomto plasmidu je modifikována (deletována) kódující oblast tk genu, aby se zabránilo expresi aktivního tk-enzymu. Tento plasmid je užitečný jako meziprodukt při konstruování vektoru cytoplasmatického DNA-viru, který má defektní tk gen využitím konvenčních způsobů vzniku markéru, jak je to popsáno pro tk gen viru vakcínie použitím plasmidu pHIndJ-3· V příbuzném uspořádání plasmid obsahující modifikovanou oblast tk genu cytoplasmatického DNA-viru, obsahuje násobné klonovací místo obsahující několik úzce přilehlých míst štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, která je jedinečná v tomto plasmidu. Dále, každé z těchto míst je nepřítomno v cytoplasmatickém
DNA-viru, do něhož má být vložena modifikovaná oblast tk genu. Po inserci modifikované oblasti tk genu, obsahující tato jedinečná místa, do virového genomu, jsou tedy tato místa užitečná pro inserci cizích DNA segmentů do genomu cytoplasmatického DNA-viru nesoucího modifikovanou oblast tk genu způsobem přímého klonování podle tohoto vynálezu.
Příkladem tohoto plasmidu, který obsahuje oblast modifikovaného tk-genu obsahující násobné klonovací místo, je plasmid pHindJ-3, v němž modifikovaná oblast tk genu viru vakcínie plasmidu pHindJ2 má vloženo násobné klonovací místo s jedinečnými místy Notl, Smál, Apal a Esrll, obklopené místy Sfil (obrázek 4.2). Aby se dále usnadnilo násilné klonování ve vektoru viru vakcínie, každé z těchto dvou Sfil míst se upraví tak, aby bylo jedinečné ve vektoru. Provede se to tak, že se využije proměnlivá povaha Sfil rozpoznávací sekvence, jak je to podrobněji uvedeno v přikladu 4.
V ještě jiném uspořádání plasmid obsahuje místo štěpení nukleasou specifickou pro ácvenci, které je jedinečné v genomu tohoto viru. Takové plasmidy jsou zvláště vhodné pro konstrukci kazet exprese genu pro přenos do vektoru, který má shora uvedené jedinečné místo. Plasmid pAO je příkladem základního plasmidu, který obsahuje hlavní klonovací místo obsahující jedinečná místa hlavního klonovacího místa vektoru vdTK viru vakcínie (obrázek 4.3)· Pro inserci DNA segmentů, například fragmentů syntetického nebo přírodního promotoru, byly navrženy příbuzné plasmidy pAl a pA2. Tyto plasmidy byly zkonstruovány vložením pAO linkeru obsahujícího druhé násobné klonovací místo enzymů, které neštěpí pAO, do místa Xhol. Oba plasmidy mají stejnou strukturu až na orientaci druhého násobného klonovacího místa (obrázek 4.3).
V ještě jiném uspořádání plasmid obsahuje promotor viru neštovic odštěpítělně navázaný na translační oblast start kodonu, při čemž po tomto start kodonu bezprostředně následuje druhé místo štěpení restrikční endonukleasou, které je vhodně uspořádáno tak, aby umožnilo translaci otevřené Čtecí oblasti do druhého místa štěpení podle tohoto vynáezu. Příkladem tohoto plasmidu jsou plasmidy pAl-Sl a pA2-Sl,
- 49 které poskytují silný syntetický promotor S1 viru neštovic včetně translačního start kodonu, po němž následuje jednoduché EcoRI místo vhodné pro inserci otevřených čtecích oblastí, které nemají asociovaný start kodon (obrázek 4.4). Plasmidy pAl-S2 a pA2-S2 jsou podobné plasmidůwpAl-Sl a pA2-Sl, ale mají jiný promotor viru neštovic, S2 (obrázek 4.5).
V podobném uspořádání shora uvedený plasmid dále obsahuje DNA sekvenci kódující J^Lský protrombin, v němž uvedená DNA sekvence je odštěpitelně napojena na uvedený promotor viru neštovic a uvedený start kodon. Příkladem tohoto plasmidu je plasmid pAlSl-PT (obrázek 5*1)> v němž je modifikovaná protrombinová oblast vložena do jediného EcoRI místa plasmidu pAl-Sl.
Jiný plasmid podle tohoto vynálezu obsahuje modifikovaný EcoRI K fragment DNA viru vakcínie, z něhož je deletován gen ELI» hostitelské oblasti. Pomocný virvdhr, jemuž chybí jak gen ELI» tak G7L hostitelské oblasti se zkonstruuje z C7L-negativního kmene WR-6/2 získáním markéru s modifikovaným EcoRI K fragmentem, z něhož je delféován gen KIL hostitelské oblasti. Viz obrázek 8.1. Tento modifkovaný EcoRI fragment obsahuje gen selektivního markéru (E. coli gpt gen) pro usnadnění selekce rekombinantních WR-6/2 genomů obsahujících modifikovaný EcoRI K fragment použitím intracelulárního získání mai^ekeru, jak je to popsáno Samem a Dumbellem (1981). Příkladem plasmidu je plasmid označený pEcoří-dhr (obrázek 8.1).
V dalším stupni se pEcoK-dhr linearizuje působením Notl a liguje se s každou P7.5 - gpt δθπ (o 1100 párech nukleotidů) odvozenou od plasmidu pN2-gpta (příklad 4) štěpením působením Notl. Výsledný plasmid pdhr-gpt (obrázek 8.1) se používá v pokusech získávání markéru pro generaci pomocného viru?)způsobem získávání markéru podle Sama a Dumbella (1981).
Tento vynález je zde dále popsán pomocí následujících ilustrujících příkladů.
- 50 V následujících, příkladech jsou některé konstrukce ilustrovány tabulkami, kde jsou uvedeny jejich vlastnosti. V těchto tabulkách jsou používány následující zkratky:
CDS znamená kódující sekvence rc znamená reversní komplementární sekvdke rcCDS znamená reversní komplementární kódující sekvence, arabská čísla udávají polohy nukleotidů ATG znamená translační start kodon EMBL ID znamená identifikátor v EMBL DATABANK
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Přímé molekulární klonování cizí DNA obsahující gen selektivního markéru (gpt E. coli gen) do jedinečného (Notl) místa štěpení v genomu viru neštovic (va“3^ínie)
Tento příklad demonstruje přímé molekulární klonování kazety exprese genu do genomu viru neštovic podle tohoto vynálezu intra celulár ním pakážováním geneticky sestavené DNA viru neštovic. Tento příklad dále ilustruje použití postupu genetické selekce pro účinnou isolaci modifikovaných virů vakcínie obsahující vložený gen selektivního markéru. Pokusné výsledky také odhalují, že k rekombinaci dochází často mezi DNA, která má být pakážována, a DNA infikujícího pomocného viru během pakážování, jestliže DNA pomocného viru je homologní s DNA, která má být pakážována.
Podrobněji uvedeno - první pokus přímého molekulárního klonování níže zde popsaný ukazuje, že kazeta genu markéru (gpt-gen) se může vložit jako Notl restrikční fragment do DNA viru vakcínie rozštěpené působením Notl, načež se pakážuje do savčích buněk infikovaných virem vakcínie. Jeden z devíti zkoumaných plaků obsahoval vir, který má předpověděnou strukturu jediného insertu gpt-genu s a orientací (viz obrázek 1.11). Struktura tohoto klonu‘(označená vp7) byla stabilní při replikaci ve velkém měřítku v nepřítomnosti selekčního činidla.
- 51 Ve druhé sérii klonovacích pokusů, mělo očekávanou strukturu sedm z dvanácti zkoumaných plaků. Tato serie však obsahovala čtyři malé plaky (El až E4) pomalu replikujících virů, i když s výhodou tyto plaky se obvykle nevyberou pro praktické použití podle tohoto vynálezu. Za selektivních podmínky byly získány také rekombinanty s násobnými inserty genu selektivního markéru. Stabilita těchto násobných insertů nebyla zkoumána v nepřítomnosti selektivního činidla, o němž je známo, že stabilizuje jisté nestabilní struktury.
Viz Palkner a Mossí J. Virol. 64, 3108 až 3111 (1990).
Relativně nízký výtěžek předpověděných struktur není očekáván na základě známých přímých způsobů genetickéiió inženýrství pro místně specifické štěpení a ligaci DNA molekul. Avšak příslušná sekvence vybraná pro vložení do tohoto modelového systému, kazeta gpt-genu, obsahovala DNA sekvenci viru vakcínie P7.5 promotoru, která je homologní se dvěma endogenními promotory ve vektoru vakcínie, které řídí dva geny poiypeptidu viru vakcínie o 7 500 párech nukleotidů, umístěné v převrácených koncových opakováních genomu vakcínie. Viz Venkatesan B., Baroudy B. M. a Moss B.; Cell 25.
805 až 813 (1981). Tento P7.5 promotor byl použit pro konstrukci rekombinantů viru vakcínie konvenční intracelulární rekombinaci a lze ho stabilně integrovat do genu thymidinkinasy vakcínie (Mackett a Smith (1986).). Příležitostně se však během analýz konvenčních rekombinantů objevují submolární množství DNA fragmentů, která mohou pocházet ze sekundárních rekombinaci. Jestliže se P7.5 promotor vloží blízko endogenních Ρ7·5 promotorů (tj. v rozmezí několika tisíc párů nukleotidů), jsou stabilní pouze ty rekombinanty, které mají převrácenou opakovanou strukturu. Využitím tohoto pozorování byl vyvinut způsob delece založený na insercí tandemového opakování segmentu P7.3 promotoru (Spehner D., Drillien R. a Lecocq J.-P.: J. Virol. 64. 527 až >33 (1990)·)·
V tomto případě inserce kazety gpt-genu do místa Notl viru vakcínie je vzdálenost mezi Ρ7·5 promotory levého převráceného konceového opakování a vložené kazety asi 3θ 000 párů nukleotidů, což je pravděpodobně dost blízko na to,
- 52 aby to způsobilo destabilizující sekundární rekombinace.
Ve skutečnosti pouze struktury několika pomalu se replikujících mají .insert s b orientací”, který by produkoval tandemové opakování uspořádání vloženého a endogenního promotoru. Vzácný výskyt těchto struktur lze tedy nejpravděpodobněji vysvětlit blízkostí umístění P7.5 promotorů, kazety kazety gpt-genu a endogenních P7.5 promotorů a známou nestabilitu tandémově se opakujících kopií promotoru P7.5·
Naopak vir vp7 a některé další isoláty (AI, A4, 01 a 02) měly inserty s a” orientací a byly stabilní. Strukturní analýza jednoho isolátu, 04·, odpovídala dvojitému insertu hlava-pata.
Titry pakážovaných na gpt-gen positivních virů v druhé sérii klonovacích pokusů (pět různých vzorků) byly přibližně 1.10^ plak tvořících jednotek (pfu) na 8.10 buněk, zatímco v prvním pokusu byl pro stejný počet buněk získán titr 1 až o
2.10 plak tvořících jednotek. Titr modifikocaných virů bude ovlivněn několika faktory. Mezi tyto fakt^joy patří účinnost ligace, účinnost pakážování, reakční podmínky, podmínky kultivace při klonovacím procesu a péče, která je věnována oddělování vektorové DNA o vysoké molekulové hmotě během postupu. Za standardních podmínek níže zde popsaných se obvykle očekávají titry asi 10^ jednotek tvořících plak na 8.10θ buněk.
I když tento příklad ukazuje, že pro inserci cizí DNA lze použít jedinečné intergenové místo Notl viru vakcínie, ilustruje také potřebu uvažování o tom, zda navržený insert může obsahovat virové sekvence typu a orientace, které jsou známy nebo pravděpodobně způsobují nestabilitu modifikovaných virů. Inserty, kterým chybí homologie s virovými sekvencemi blízko místa inserce (například v rozmezí 60 000 párů nukleotidů) by měly být výhodné z důvodu stability.
Také inserty, které obsahují pouze krátké sekvence syntetického promotoru, které jsou rozeznávány transkripčním systémem vektoru, jsou výhodné ve srovnání s těmi, které obsahují dlouhé segmenty virové DNA včetně přirozených promotorů
- 55 virového vektoru. Viz například, dále uvedený promotor SI v příkladu 4,
V tomto a ve třech následujících příkladech se používají následující materiály a způsoby, pokud není uvedeno jinak.
čištění viru neštovic a DNA: Vir vakcínie (přírodního typu kmene WR (Western Reserve), Americká sbírka typů kultur (American Type Gulture Collection, ATCC) č. VR 119) se vyčistí přes dva po sobě následující sacharosové gradienty podle Macketta a spol. v D. M. Glovers: ”DNA Cloning.
A Practical Approach·, str. 191 až 211 (IRL Press, 1985). Virová DNA se připraví postupem s proteinasou K-SDS podle Gross-Bellarda a spol.í Eur. J. Biochem. 36. 32 až 28 (1975)·
Sestavení isolované DNA viru neštovic: Virová DNA (typicky 2 až 5 mikrogramů) se rozštěpí příslušnými množstvími jedné nebo více endonukleas specifických pro sekvenci (například bakteriální restrikční endonukleasou Notl), popřípadě se nechá zreagovat s telecí střevní akličkou fosfatasou (Boehringer, lne.) a vyčistí extrakcí fenolem a vysrážením éthanolem podle rutinních způsobů rekombinace DNA. Výsledná virová DNA raménka se ligují s pěti- až padesátinásobkem molárního nadbytku DNA fragmentu, který má být vložen, s konci, které jsou slučitelné s ligací s virovými raménky. část této ligaení reakce se analyzuje gelovou elektroforesou s inversí pole.
Podrobněji - v druhé sérii pokusů (A až E) níže popsané se 2 yug DNA vakcínie, která nebyla nechána reagovat s fosfatasou, rozštěpené působením Notl, ligují se 200 až 600 ng insertu kazety gpt-genu v objemu 30 /ul s 5 až 15 jednotkami T4 ligasy čtyřicet osm hodin při teplotě 12 °G, jak je to souhrnně uvedeno v tabulce I.
In vivo pakážování v savčích buňkách: 8..0 buněk africké zelené opice (CV-1) se infikuje pomocným virem (buá vakcínie WR přírodního typu nebo virem WR 6/2 nebo jinými viry, jak je to uvedeno) v množství 0,2 plak tvořících jednotek na buňku dvě hodiny. Po úvodním průkazu pakážování neporušenou DNA isolovanou z virionů se použije 20 yUg virové (vPgD) DNA. Pro pakážování extracelulárně sestavených genomů se použije 1 mikrogram DNA vyčištěné z ligační reakce. DNA se transfektují do buněk srážecí technikou fosforečnanem vápenatým (Graham P. L. a van der Eb: 1973·)· Tyto buňky se inkubují patnáct minut za teploty místnosti. Potom sek buňkám přidá 9 ml media (DMEM, 10 % telecího plodového sera, glutamin a antibiotika) na 1 ml sraženiny. Po čtyřech hodinách se medium vymění a v inkubaci se pokračuje další dva dny.
Zásobní surový vir se připraví podle standardních postupů (Mackett a spol.: 1985). Testování plaků a výběr podmínek pro E. coli gpt gen jsou známy odborníkům (viz: Palkner a Moss:J. Virol. 62, 184-9 až 1854 (1988) a Bóyle a Coupars Gene 65, 123 až 128 (1988).
Gelová elektroforesa s inversním polem (PIGE): Virová DNA se dělí na 1% agarosovém gelu v pufru Tris/octan/EDTA (40mM Tris/20mM ledová kyselina octová/2mM EDTA, pH 8,0) s dodávkou proudu regulovanou mikropočítačem (Oonsort Model E79O). Pro rozdělení celé oblasti fragmentů byly postupně následující programy á&sobem, který je zde nyní uvedenFY5 hodin při 7V/cm puls vpřed (P) 6 vteřin, zpětný puls (R) 3 vteřiny, přestávka 1 vteřina} program 2:
hodin při 7V/cm puls P 4 vteřiny, R 2 vteřiny, přestávka 1 vteřinu} program 3* 5 hodin při 7V/cm, P 2 vteřiny, R 1 vteřinu, přestávka 1 vteřinu a program 4: 5 až 10 hodin při 7V/cm, P 8 vteřin, R 4 vteřiny a přestávka 1 vteřinu.
Konstrukce plasmidů pN2: Plasmid Bluscript II SK (Stratagene, lne.) se rozštěpí působením HindlII a liguje se s Notl linkery (Pharmacia, lne.). Výsledný plasmid, pN2, má násobné klonovací místo obklopeno místy Notl.
Podrobněji - násobné klonovací místo pN2 sestává z následujících míst v uvdeném pořadí: Notl, Xbal, Spěl, BamHI, Smál, Pstl, EcoRI, EcoRV, HindlII, Clal a Notl.
Vložená sekvence Notl linkeru pN2 a dvacet baží 5'- a 3'-obklopujících oblastí pBluscriptu II SK (Stratagene, lne.,
La Jolla, USA) jsou uvedeny v sekvenci číslo 1, Sekvence insertu začíná v poloze 21 a končí v poloze 28 (První zbytek *’T” na 5*-konci odpovídá poloze číslo 2266, poslední zbytek G na 3*-konci odpovídá poloze číslo 2313 plasmidu pN2.).'
Konstrukce plasmidů. pN2-gpta a pN2-gptb: Hpal-Dral fragment o 1100 párech nukleotidů, (obsahující P7.5 promotor-gpt genovou kazetu) se isoluje z plasmidu pTKgpt-Pls (Palkner a Mosss 1988.) a vloží se do místa Smál plasmidu pN2 (obrázek 1.3)· Dva výsledné plasmidy jsou orientačními isomery. Označí se pN2-gpta a pN2-gptb.
Kazeta Ρ7·5 promotor viru vakcínie - E.coli gpt-geň a dvacet baží 5*- a 3'-obklopujících oblastí plasmidu pN2 jsou pro pN2-gpta uvedeny v sekvenci číslo 2. Insert začíná v poloze 21 a končí v poloze 1113. A-zbytek translačního iniciačního kodonu gpt-genu odpovídá poloze 519· T-zby%k translačního stop kodonu gpt-genu odpovídá poloze číslo 975 (První C” zbytek na 5'-konci odpovídá poloze číslo 2227, poslední T zbytek na 3'-konci odpovídá poloze číslo 3359 plasmidu pN2-gpta.)·
Peversní doplňková forma kazety P7.5 promotor viru vakcínie - E.coli gpt gen a 20 nukleotidů. 5*- a 3*-obklopujících oblastí pN2 jsou pro pN2-gptb uvedeny v sekvenci číslo 3· Insert začíná v poloze 21 a končí v poloze 1113· T-zbytek (reversní doplněk) translačního iniciačního kodonu CAT odpovídá poloze 615. A-zbytek (reversní doplněk) translačního stop kodonu gpt genu odpovídá poloze číslo 159·
Jiné standardní techniky rekombinantní DNA analýzy (Southernův blot, PAG®, zářezová translace, například) se provádějí způsobem podle literatury (J. Sambrook a spol. í KMolecular Cloning“, Cold Bpring Harbor Laboratory Press 1989.) , Pakážování nahé virové DNA í Pro stanovení podmínek potřebných pro pakážování DNA nahých vitu neštovic pomocným
- 56 virem se neporušená DNA isolovaná z virionů rekombinantu viru vakcínie (vPgD) transfektuje do opičích buněk (CV-1) infikovaných pomocným virem (vakcínie WR přírodního typu). Vybraný rekombinantní vir má několik snadno testovatelných fenotypových markérů. Grenom v PgD tedy inkorporuje do místa virové thymidin-kinasy (tk) gen markéru resistence na látku (gen enzymu xanthin-guanin-fosforibosyl-transferasa Escherichia coli, tj. ”gpť* gen) a gen proteinu vhodně detegovatelného markéru (lidský plasminogen). Tento vir byl původně zkonstruován z kmene viru vakcínie ÍWR 6/2} Moss a spol.:
J. Virol· 40. 387 až 395 (1960), který má <&eci asi 9000 párů nukleotidů a tedy expresí neposkytuje gen virového hlavního sekretovaného 352 proteinu, popsaný Eotwalem a spol.: Nátuře 335. 176 až 178 (1988).). Očekávaný fenotyp pakážovaného viru je ted-yí tk-negativní (tj. replikace v přítomnosti bromdeoxyuridinu), gpt-positivní (t$. replikace v přítomnosti mykofenolové kyseliny a xanthinU), expresí poskytuje gen lidského plasminogenu a expresí neposkytuje sekretovaný 352 protein.
Bylo analyzováno osm gpt-positivních plaků ze shora uvedeného pokusu pakážování.
negativní a jak ukazuje obrázek 1.1, všechny expresí poskytovaly plasminogen.
Šest z těchto isolátů (pásy 5» 6, 7, 11, 12 a 14) expresí neposkytovaly 35 2 sekretovaný protein vakcínie a tedy vykazovaly všechny vlastnosti transfektované genomové DNA.
Dva z těchto plaků expresí poskytují také markér 352 proteinu (pásy 4 a 13), jde tedy o rekombinanty pomocného přírodního viru (Pásy 8a 15) a vklad virových genomů.
Tento pokus ukázal, že DNA nahého viru neštovic extraj hovaná z virionů se pakážuje, jestliže je transfektována do buněk infikovaných pomocným virem za testovaných podmínek.
Tyto podmínky byly proto použity pro transfekce genomové
DNA viru neštovic, která byla modifikována přímým molekulárním klonováním, jak ukazuje obrázek 1.2.
š
Pakážováni extracelulárně sestavené DNA viru neštovic: j
Genom viru vakcínie obsahuje jediné místo štěpení endonuklesou Notl specifickou pro sekvenci v oblasti známé jako HindlII P fragment. Zkoumání sekvence kolem tohoto místa (Goebel a spol.í I99O,) odhalilo, že je umístěna v intergenové oblasti, u níž je nepravděpodobné, že by byla podstatná pro virovou replikaci. Zkonstruuje se kazeta exprese genu markéru ve dvou plasmidáh (pN2-gpta a pN2-gptbj obrázek 1.3) insercí E. coli gpt genu do obou možných orientací. Gen gpt se kontroluje promotorem genu viru vakcínie kódujícím protein o molekulové hmotě 7 500» jak popisuje Cochran sspol.: J. Virol. 54, 30 až 37 (1985) (labelovaný PÍ na obrázku 1.2 a Ρ7·5 na otázku 1.3)· Kazeta genu celého markéru je umístěna na jediném Notl fragmentu o 1100 párech nukleotidtyfcěchto plasmidů. Tento restrikční fragment z pN2-gpta se liguje s WE DNA přírodního typu rozštěpené působením Notl a transfektuje se do buněk, které byly infikovány pomocným virem (W)
V prvním pokusu klonování se provede analýza Southernovým blotem genomových struktur plaků fenotypově gpt-positivních progenů. Virové isoláty se třikrát přečistí přes plak a amplifikují ae za gpt-selekce. DNA fragmenty rozštěpené působením HindlII buněk (CV-1) infikovaných různými viry se rozdělí na. 1% agarosovém gelu kombinací normální elektroforesy a gelové elektroforesy s inversním polem. Gel se pak blotuje a hybridizuje ^2P-značenou DNA vakcínie WH a značenou sondou obsahující gpt sekvence. Výsledky potvrdily, že všechny klony fenotypicky positivní na markér obsahovaly gpt insert o 1100 párech nukleotidů.
Obrázek 1.4 ukazuje bloty HindlII DNA fragmentů z buněk infikovaných devíti virovými isoláty (sloupce 4 až 12), plaky 2.1.1 až 7·1·1 a 10.11 až 12.1.1. Byl pozorován očekávaný HindlII fragment o 800 párech nukleotidů, který obsahuje gpt-sekvence. V pásech 2 a 3, kde byla nanesena DNA viru přírodního typu rozštěpená působením HindlII, nebyla viditelná žádná zkřížená hybridizace s virovými sekvencemi.
V dalším pokusu byly celkové DNA z kutlury buněk CV-1 rozštěpený působením Notl (kultura buněk CV-1 byla infikována devíti různými plaky). Southernův blot rozdělných — 58 — fragmentů, je uveden na obrázku 1.5· Neočekávaně byly ve většibě virových isolátů viditelné dva pásy, předpověděný insert o 1100 párech nukleotidů a druhý - velký fragment.
Jenom plak č. 7.1.1 (pás 8) vykazoval očekávaný jediný pás o 1100 párech nukleotidů. I když hybridizační signál většího fragmentu je stejně silný ve všech zkoumaných DNA, intensita pásu o 1100 párech nukleotidů se měnila od DNA k DNA. To ukazuje na možnost, že insert o 1100 párech nukleotidů může být v různých genomech přítomen v různých molárních množstvích. Kontrola viru přírodního typu (sloupec 2) se něhybridžovála sondou gpt-genu.
Stejný blot se hybridizuje sondou DNA viru vakcínie. Očekává se vznik tří fragmentů o velikosti asi 145 000,
000 a 1 100 párů nukleotidů. Bylo však zjištěno, že vedle očekávaných fragmentů byl identifikován také fragment o asi 5000 párech nukleotidů. Jenom plak, který je označen 7.1.1, neposkytl tento^očekávaný fragment o asi 5000 párech nukleotidů.
Orientace DNA insertu ve vybraných sestavených genomech vakcínie byla zkoumána také Southernovým blotováním. Jak je ukázáno na obrázku 1.2, insert ve virových DNA může mít bu5 a” nebo ^b orientací, které jsou odlišitelné štěpením DNA příslušnými restrikčními enzymy. Podle předběžných analýz se zdálo, že isolát 7*1.1, který by označen jako klon vp7, má genomovou strukturu očekávaného modifikovaného viru. Byl tedy rozmnožen a vyčištěn. DNA tohoto klonu byla srovnána s DNA viru přírodního typu štěpenímněkolika restrikčními enzymy a rozdělením na agarosovém gelu gelovou elektroforesou s inversním polem (obrázek 1.6). V Notl štěpu vp7 obarveném ethidiumb^midem (sloupec 2) pouze fragmenty o 145 000 párech nukleotidů a 45 000 párech nukleotidů obsahovaly dostatečné množství DNA tak, aby byly viditelné.
Pás, který byl vyhodnocen jako insert o 1100 párech nukleotidů, obsahoval pouze asi 3 ng DNA. Hybridizací gpt-specifickou sondou byl však zjištěn slabý pás o 1100 párech nukleotidů (obrázek 1.7, sloupec 2).
- 59 Ve štěpech získaných působením HindlII byly pozorovány očekávané pásy o 1400 párech nukleotidů a 800 párech nukfeotidů. Jak bylo předpověděno, pás o 800 párech nukleotidů se hybridizuje sondou gpt-genu (obrázek 1.6 a 1.7, sloupec 4). Při dvojnásobném štěpení působením Notl a HindlII byl pozorován očekávaný pás o 800 párech nukleotidů (obrázek 1.6 a obrázek 1.7, sloupec 6).
Ve štěpech vp7 DNA působením Pstl byl pozorován očekávaný fragment o 4100 párech nukleotidů obsahující gpt sekvence (obrázek 1.6 a 1.7» sloupec 8} pás obarvený ethidiumbromidem o 4100 párech nukleotidů na obrázku. 1.6 je ve skutečnosti dublet fragmentů -o 4100 párech nukleotidech, z nichž jeden obsahuje gpt insert). Po štěpení působením jak Pstl tak Notl se kazeta gpt genu uvolní jako fragment o 1100 párech nukleotidů (obrázek 1.6 a 1.7, sloupec 10).
Obrázky štěpů, které se získají působením těchto a dalších restrikčních endonukleas, včetně Sáli (obrázek 1.6 a obrázek 1.7, sloupce 12), jsou v souladu s interpretací^e vp7 je stabilně modifikovaný vir, který má gpt-gen integrovaný do Notl místa genomu viru vakcínie v “a orientaci * Λ (viz obrázek 1.11).
Druhé serie klonovacích pokusů byly prováděny za mírně modifikovaných podmínek (viz tabulka I a shora uvedené způsoby). Bylo provedeno pět různých ligačních reakcí (A až E) obsahujících konstantní množství DNA vektoru vakcínie rozštěpené působením Notl a zvyšující se množství vložené DNA. Pakážování bylo provedeno za standardních podmínek v buňkách GV-1 infikovaných virem vakcínie. Titry virů vakcínie positivních na gpt byly ve všech případech 1.10 plak tvořících jednotek na 8.10θ buněk. Populace plaků ve všech pokusech klonování byla heterologní, pokud jde o velikost: asi polovina měla normální velikost, zatímco druhá polovina měla menší než normální velikost.
- 60 Ta bulka I
Vliv poměru insertu k vektorové DNA na výtěžek modifikovaných virů
pokus: A B C D E
vektorová DNA rozštěpená půso-
bením Notl (/Ug) 2 2 2 2 2
insert gpt-genu ( yug) 0,2 0,2 0,4 0, *0,$
molární nadbytek insertu 17 17 34 34 51
T4 ligasa (jednotek) 5 15 5 15 15
gpt-positivních virů
(10^ pfu/8.10® buněk) 1,12 0,96 1,16
0,88 0,96
Bylo isolováno dvanáct plaků positivních na gpt, po čtyřech v každé ze tří sérií označených A, 0 a B, které obsahovaly osm plaků o normální velikosti (velké) (AI až A4 a Cl až C4) a čtyři malé plaky (El až E4). Každý z těchto plaků byla analyzován infikováním buněk CV-1 v gpt-selektivním mediu, isolováním celkych buněčných DNA a jejich rozštěpením restrikčními endonukleasami, oddělením fragmentů FISE a blotováním na nitrocelulosové membráně.
Na obrázku 1.8 jsou vzorky DNA rozštěpené působením Notl hybridizované sondou DNA viru vakeínie (AI až 4, sloupce 1 až 4, Cl až C4, sloupce 5 až 8 a El až E4, sloupce 9 až 12). Vzhledem k předávkování gelu jsou tyto pásy poněkud rozmazané, ale jejich rysy jsou zřetelně viditelné. Hlavní signál poskytuje pásy o 145 000 párech nukleotidů a 45 000 párech nukleotidů. V některých těchto vzorcích lze vidět slabý pás neznámého původu o asi 5QQQ párech nukleotidů.
Pás o 1100 párech nukleotidů, obsahující kazetu P7.5 promotor-gpt-gen, tvoří pouze 0,6 % virového genomu a obsahuje pouze 300 párů nukleotidů hybridizující sekvence (tj. Ρ7·5 promotor). 0 tomto pásu nelze očekávat, že poskytne detegovatelný hybridizační signál za použitých podmínek. Při delší exposici blotu, jestliže jsou větší pásy značně přeexponovány, pásy o 1100 párech nukleotidů se staly viditelné.
- 61 Pokud jde o fenotyp malých, plaků, malé plaky El, E3 a E4 poskytovaly pouze slabé hybridizační signály (obrázek
1.8, sloupce 9 až 12). To ukazuje, že vir se v těchto plácích nereplikoval tak intensivně, jako je replikován v plácích o normální velikosti (sloupce 1 až 3). Isolát E2 neprodukoval detegovatelné množství DNA (sloupec 10).
Vzorky, které jsou uvedeny na obrázku 1.8, byly Sbridizovány také sondou gpt-genu (obrázek 1.9)· Očekávaný jeden hybridizační signál byl získán's jiaky AI, A4, 01, 02, 04, BJa E4 (obrázek 1.9» Sloupce 1, 4, 5, 6, 8, 11 a 12). Plak A2 (sloupec 2) měl gpt-gen integrovaný do pásu o 45 000 párech nukleotidů (Slabý pás o 145 000 párech nukleotidů může pocházet oď znečištěni druhým minoritním druhem nebo od sekundárních rekombinací·). Plak A3 (sloupec 3) má sekvence gpt-genu integrovány do pásů o 145 000 párech nukleotidů a 45 000 párech nukleotidů, zatímco plak 03 (sloupec 7) má integrovány tyto sekvence do pásu o 145 000 párech nukleotidů a do místa Notl. Plaky A2, A3 a 03 jsou možná ty rekombinanty, které vznikly nelegitimní intracelulární rekombinací homologních sekvencí přítomných v insertu kazety modelového genu a v převrácených opakováních virové DNA.
Pokud jde o sondu DNA viru vakcínie, malé plaky El až E4 poskytovaly pouze slabší hybridizační signály (obrázek
1.9, sloupce 9 až 12), což znamená, že vir v těchto plácích se nereplikoval tak intensivně, jako se replikuje v plácích o normální velikosti. DNA viru přírodního typu a DNA neinfikováných CV-1 buněk se nehybridizo^vly sondou gpt-genu (obrázek 1.9, sloupce 13 a 15)·
Orientace a počet kopií insertů gpt-genu se stanovuji štěpením vzorků uvedených na obrázku 1.9 působením Pstl a Southernovou blotovou analýzou. Očekávané velikosti nových Pstl fragmentů, pocházejících od inserce gpt-genu, jsou uvedena na obrázku 1.11. Hybridizace sondou gpt-genu odhalila, že sestava plaků AI, A4, Cl a C2 (obrázek 1.10, sloupce 1, 4,5 a 6) obsahuje jediný Pstl fragment o 4100 párech nukleotidů, jak bylo očekáváno pro jeden insert v a orientaci (obrázek 1.11). N plaku El byl slabý hybridizační signál
- 62 od pásu o 21 ooo párech nukleotidů, který byl pozorován pouze při dlouhých exposicích blotů, v souhlasu s b orientací insertu gpt— genu.
Struktury virových DNA z plaků C4 a E3 (obrázek 1.10, sloupce 8 a 11) byly v souhlasu s dvojitou tandemovou inserci v “b orientaci. V tomto případě byly očekávány hybridizujici fragmenty o 21 000 a 1 100 párech nukleotidů (obrázek 1.11). Struktura viru v plaku E4, který obsahuje dva fragmenty o 4 100 a 1 100 párech nukleotidů, je v souhlasu s tandemovou inserci dvou gpt-genů v a“ orientaci.
DNA z plaků A2, A3 a 03 vykazovala složitější‘sestavu, což ukazuje na inserce do násobných míst, které nebyly dále analyzovány.
Souhrnně lze říci, že v druhém klonovacím pokusu pět z osmi plaků o ngGmální velikosti mělo genomové struktury, které byly očekávány pro inserci jediné kazety gpt-genu do jedinečného místa Notl genomu viru vakcínie. Pomaleji rostoucí plaky o malé velikosti vykazovaly nestabilní struktury, které byly ztraceny během následujících stupňů čištění přes plaky.
Příklad 2
Přímé molekulární klonování genu selektivního markéru (E. coli gpt) do jedinečného místa štěpení (Notl) modifikovaného genomu viru ptačích neštovic (klon f-TK2a viru drůbežích neštovic) Tento příklad ilustruje obecnou použitelnost přímého molekulárního klonování modifikovaných genomů cytopiasmátických DNA-virů tím, že ilustruje aplikaci na modifikované genomy virů ptačích neštovic, které jsou geneticky sestaveny in vitro a pakážovány in vivo. Viry ptačích neštovic mají j největší genomy z čeledi neštovic. Genom viru drůbežích neštovic (PPV) má velikost asi 300 000 párů nukleotidů a proto PFV rekombinanty, které expresí poskytují cizí geny, jsou zkonstruovány pouze technikami získávání markéru i
i tviz například! Boyle a Coupar: Virus Ses. 120. 343 až 356 (1988), Taylor a spol.: Vaccine 2» 497 až 503 (1988).J,
Tento příklad ilustruje přípravu modifikovaných virů drůbežích neštovic přímým molekulárním klonováním gazety exprese genu sestávající z promotoru viru neštovic,'který směruje E. coli gpt gen do jedinečného místa Notl v genomu rekombinantního viru drůbežích neštovic, f-TK2a. Toto Notl místo je umístěno v lacZ genu, který byl již dříve vložen do tohoto rekombinantu intracelulární rekombinací. Sestavená DNA se pakážuje v primárních fibroblastech kuřecího zárodku infikovaných HP2 pomocným virem drůbežích neštovic, který se replikuje pomaleji než rekombinant f-TK2a. Selekce gg>t-positivních plaků vede k isolaci sestavených virů drůbežích neštovic. Jelikož gen lacZ merkeru je desaktivován insercí do místa Notl, progenový vir je odlišitelný od vektorového viru, jemuž chybí insert, bezbarvým fenotypem v testu modrých plaků na expresi lacZ genu.
Čištění viru drůbežích neštovic a DNA: Čištění se provádí následujícím způsobem. Vir drůbežích neštovic (EPV) kmen HP1 (Mayr a Malickis Zentralblatt f. Veterinármedizin, fteihe B, 13. 1 až 12 (1966).) a atenuovaný kmen HP1.441 (pasážové číslo 441 HP1) byly získány od A. Mayrg (Mnichov). Vir drůbežích neštovic kmen HP2 byl odvozen od BP1.441 čištěním přes plak. Primární fir kuřecího zárodku (CEP) byly připraveny podle způsobu, který je popsán v evropské patentové přihlášce č. 0 358 807. Buňky byly kultivovány v mediu 199 pro tkáňovou kulturu (TCM199, Gibco BEL) doplněném 5 % plodového telecího sera, glutiminem a antibiotiky. Virus drůbežích neštovic byl vyčištěn dvěma postupnými sacharosovými gradienty podle Joklika W. K.í Virology 18, 9 až 18 (1962). Virová DNA byla připravena postupem s proteinasou K/SDS podle Gross-Bellarda a spol.: Eur. J. Biochem. 56, 32 až 38 (1975)·
Konstrukce vektoru viru drůbežích neštovic (f-TK2a) s jedinečným (Notl) místem štěpení ve vloženém DNA segmentu:
- 64 Do intergenové oblasti mezi tk-gen a 3*-orf viru. drůbežích neštovic se vloží tk-gen viru vakcínie spolu s E.coli lacZ genem. Plasmidy pTLm-Wtki a pTKm-Wtkb byly zkonstruovány klonováním funknčího tk-genu viru vakcínie do meziproduktového plasmidu pTKm-sPll. Po intracelulární rekombinaci pTKm-Wtka a pTKm-Wtkb s DNA viru drůbežích neštovic přírodního typu se vytvořily dva nové FPV vektory nazvané f-TK2a a f-TK2b. Každý vektor obsahuje dva funkční tk-geny, endogenní EFV gen a vložený tk-gen viru vakcínie. Vedle vloženého lacZ genu kterýkoliv z nich může být použit jako nepodstatné místo pro vložení cizí DNA. Místo Notl v lacZ genu je jedinečným místem štěpení ve vektorech f-TK2a a f-TK2b a je tedy výhodné pro přímé molekulární klonování cizí DNA do tě$cto vektorů. Všechny podrobnosti konstrukce vektorů drůbežích neštovic, f-TK2a a f-TK2b, jsou popsány v USA patentové přihlášce nazvané Rekombínantní vir drůbežích neštovic” (Scheiflinger a spol·), v níž jsou uvedeny priority ekvivalentní s Evropskou patentovou přihláškou podanou současně s touto přihláškou. Celý obsah této přihlášky je zde zahrnut jako citace.
In vivo pakážování v ptačích buňkách: 8,10 buněk CEP se infikuje 0,2 plak tvořících jednotek/buňku pomocného viru (HP2) dvě hodiny. Po£ pakážování sestavených EPV genomů se použije 1 mikrogram vyčištěného ligačniho reakčního produktu. Buňky se transfektují DNA technikou srážením fosforečnanem vápenatým (Graham a van der Eb: 1973·) a inkubují se patnáct minut za teploty místnosti. Osm mililitrů media (TCM199> 10 % plodového telecího sera, glutamin a antibiotika) na 1 ml sraženina se přidá k buňkám. Po čtyřech hodinách se medium vymění a dále se inkubuje dva dny. Zásoby surového viru se připraví podle standardních postupů (Mackett a spol.: 1985.). Analýza plaků a gpt-selekce se provádějí podle způsobu, který popsal Scheiflinger a spol.: 1991.
Přímé molekulární klonování do jedinečného místa štěpení Notl genomu viru drůbežích neštovic: Rekombiantní EFV kmen f-TK2a (Scheiflinger a spol.: 1991·) je vhodný jako
- 55 vektor pro přímé klonování kazety genu, např. modelové kazety gpt genu jak zde popsáno, do jedinečného místa štěpení Notl. Toto Notl místo vektoru je kódující oblast lacZ genu, který slouží jako barevný markér pro testování (vyhledávání), který je desaktivován po vložení genu. LacZ-positivní viry tedy tvoří modré plaky v přítomnosti chrosjgenního substrátu (X-gal), zatímco viry s inserty v tomto Notl místě vykazují fenotyp bílých plaků. Genom vektoru f-TK2a zahrnuje gen thymidin-kinasy (tk) viru vakcínie, který slouží také jako alternativní oblast pro inserci genu. Jak lacZ gen tak tk gen byl vložen do genomu viru drůbežích neštovic v intergenové oblasti mezi gen thymidin-kinasy viru drůbežích neštovic a 3'-otevřenou čtecí oblast konvenčními způsoby (Scheiflinger a spol.í 1991).
Sestavy DNA rozštěpené působením Notl byly získány pro genomové DNA PFV virů HP1.441 a vektorového kmene f-TE2a (obrázek 2.1). HP1.441 byl odvozen od virulentního PFV kmene atenuací seriálovým pasážováním ve fibroblastech kuřecího zárodku. HP1.441 znamená 441. pasáž HP1. Používá se jako vakcínový kmen proti viru drůbežích neštovic (Mayr a Malicki, 1966.). Dobře se adaptuje pro rychlou replikaci v buněčné kultuře·
DNA z HP1.441 se analyzuje jako reference pro FPV vektorový kmen f-TK2a, který je derivátem HP1.441. Restrikční analýza DNA HP1.441 (obrázek 2.1, sloupce 1 a 2) ukázala, že tento kmen nemá žádná Notl místa. Štěpení vektorové f-TK2a DNA působením Notl vede ke dvěma velkým fragmentům o asi 100 000 párech nukleotidů a 200 000 párech nukleotidů (obrázek 2.1, sloupec 4).
Přímá molekulární konstrukce viru drůbežích neštovic, který expresí poskytuje gpt-gen: Modelová kazeta exprese genu obsahující Ξ. coli gpt gen byla zkonstruována v plasmidu pN2-gpts, který obsahuje gpt gen řízený časným/pozdním promotorem viru neštovic obklopeným místy Notl (obrázek 1.3)·
Pro klonování do vektoru f-TK2a se kazeta gpt-genu vystřihne z jeho plasmidu a liguje sé s genomvou DNA z f-TK2a
- 66 rozštěpenou působením Notl, jak je to nastíněno na obrázku. 2.2« Ligovaná DNA sytransfektuje do buněk CEP, které jsou infikovány virem drůbežích, neštovic. Plaky, které jsou positivní na gpt a které zůstávají bílé po převrstvení vrstvou obsahující X-gal, se dále analyzují Southernovým blotováním po infikování fibroblastů kuřecího zárodku. Isoluje se celková buněčná DNA a oddělené Notl fragmenty se podrobí Southernovu blotování P-znaňenými DNA pomočeného viru drůbežích neštovic (HP2) a sekvencí gpt genu, jak je to popsáno v příkladu 1. Gpt—positivní viry obsahující gpt gen v v Notl fraá&ntu o 1100 párech nukleotidů ukazují^ že ve stupni klonování došlo ke správné ligaci.
Příprava modifikovaných virů s oběma orientacemi vzorků v jednom konstrukčním stupni: Tento příklad ilustruje také to, jak mohou být isolovány viry s jednou kopií vložené kazety genu v kterékoliv orientaci a rovněž i viry obsahující více kopií vloženého genu z jediného stupně přímého molekulárního klonování. Orientace DNA insertu ve vybraných genomech geneticky sestaveného viru drůbežích neštovic se stanoví Southernovým blotováním DNA rozštěpených příslušnými restrikčními enzymy. Jak ukazuje obrázek 2.2, může mít DNA vložená do virové DNA bučí a” nebo ”b orientaci. Při předběžné analýze počtu insertů á orientace modelovou kazetou genu se celková DNA buněk infikovaných vybranými plaky rozštěpí restrikčními endonukleasami Glal a Notl a rozdělí se na 0,8% agarosovém gelu. Blot se hybridizuje sondou gpt genu a sondou viru drůbežích neštovic. V DNA vzorcích rekombinantních virů, které se roštěpí působením Notl, se gpt kazeta vystřihne jako fragment o 1100 párech nukleotidů. Štěpení DNA, které mají insert s a- nebo b-orientací, působením Olal také vede k rozdílným charakteristickým fragmentům hybridizujícím se sondou gpt genu, jak to bylo stanoveno ze struktur uvedených na obrázku 2.2.
Příklad 3
Heterologní pakážování geneticky sestavených genomových DNA viru neštovic (vakcínie) pomocným virem ptačích neštovic
- 67 (drůbežích, neštovic) a následná selekce rekombinantů v hostitelských. buňkách druhů, v nichž se pomocný virus nemůže replikovat·
Heterologní pakážování DNA viru neštovic, například fázování DNA viru neštovic virem ptačích neštovic, nebylo dosud popsáno. Tento příklad však ukazuje, že in vivo pakážování extracelulárně sestavené DNA viru vakcínie lze docílit virem drůbežích neštovic ve fi^Soblastech kuřecího zárodku. Použití vektorového viru, který má jinou hostitelskou oblast než pomocný vir, poskytuje jednoduchý a účinný postup čištění sestaveného viru v jednou stupni analýzy přes plak.
V tomto příkladu se tedy rekombinantní virus neštovic isoluje analýzou přes plak na savčích (CV-1) buňkách, které plně nepodporují replikaci pomocného viru ptačích neštovic. Zahrnutí dominantního selektivního markéru do DNA vložené do vektoru s výhodou usnadňuje použití selektivních podmínek analýzy přes plak pro eliminaci virů obsahujících vektorovou DNA, které chybí žádaný insert.
Jinou výhodou přístupu heterologního pakážování je snížená možnost rekombinace vektoru s pomocnými viry. Například viry neštovic a ptačích neštovic patří k různým rodům, mají různé morfologie, různě snadné možnosti replikace a sdílejí pouze minimální homologii sekvencí, jak na to ukazuje chybějící zkřížená hybridizace za standardních hybridizaČních podmínek. Homologní rekombinace genomů virů ptačích neštovic a neštovic (vakcínie) je tedy nepravděpodobná. Použití těchto dvou virů může prakticky odstranit nežádoucí rekombinace, ke kterým často dochází mezi homologními sekejvncemi blízce příbuzných virů ÍFenner a Comben: Virology £, 530 až 543 (1953), Fenner? Virology 8, 499 až 5θ7 (Ί959)·Ί· Alternativním přístupem preventivního zabránění rekombinací vekto ru s pomocným virem během pakážování je používání rekombinací deficitních virových kmenů nebo hostitelských buněk.
V tomto příkladu modelová kazeta exprese obsahující gen markéru (E. coli gpt gen řízený promotorem viru neštovic) byla vložena extracelulárně do jedinečného Smál místa DNA viru vakcínie. Použití tohoto restrikčního enzymu
- 63 pro štěpeni virové DNA poskytuje zarovnané konce, které mohou být ligovány s inserty DNA se zarovnanými konci připravenými jakoukoliv jinou nukleasou, která produkuje zarovnané konce nabo například použitím polymerasy nebo exonukleasy se vytvoří zarovnané konce z insertu, který má jednovláknové konce.
Pro pakážování se geneticky sestavená genomová DNA transfektuje do hostitelských buněk infikovaných virem drůbežích neštovic, v nichž mohou replikovat jak viry vakcínie tak viry drůbežích neštovic(fibrcblasty Jkuřecího zárodku).
Jelikož hostitelské rozmezí pomocného viru drůbežích neštovic je omezeno na ptačí buňky, klony viru vakcínie se vyberou vyčištěním progenu z transfektovaných buněk na savčí hostitelské buňky (buňky CV-1 ledvin africké zelené opice) čištěním přes plak. Pro isolaci pouze modifikovaných virů vakcínie se použijí simultánní selekce na expresi gpt genu. Na rozdíl od konvenčního způsobu získávání rekombinantů viru neštovic, kde do jednoho intracelulárního genetického zkřížení lze obvykle vložit pouze jednu kopii cizího genu v jediné orientaci, v tomto příkladu byly jako produkty jediné extracelulární genomové modifikační reakce identifikovány obě možné orientace jediného insertu stejně jako dvojí inserce modelové kazety genu.
Experimentální výsledky v tomto příkladu ukazují, že účinnost pakážování ligovaných DNA viru vakcínie pomocným virem drůbežích neštovic byla velmi nízká ve srovnání s pakážováním neporušené DNA viru vakcínie virem drůbežích neš5 4 tovic, které poskytuje výtěžek v rozmezí 5·1θ až 1.10 plak tvořících jednotek na 6.10^ fibroblastů kuřecího zárodku po třech dnech replikace. V jednom pokusu pakážování (produkujícím plaky označené ”F12” serie,.viz výše) byl výtěžek pakážovaných modifikovaných virů 9.10 plak tvořících jednotek a v druhém pokusu (produkujícím plaky E13” serie) 5·1θ2 plak tvořících jednotek na 6.10 6 kuřecích buněk. Jedni důvodem tohoto relativně nízkého pakážování v těchto pokusech je chybějící defosforylační zpracování vektorových DNA ramének, která proto byla schopna se úspěšně religovat bez jakékoliv inserce. Toto zpracování bylo vynecháno, protože defosforylace DNA fragmentů, se zarovnanými konci je obvykle neúčinná. Tento problém lze překonat konstrukcí takových kmenů virů hostitele, které mají násobná místa štěpení s “přečnívajícími konci, která umožňují přímé (násilné) klonování. Tím se značně zlepší účinnost vkládání cizích DNA fragmentů.
Jiným faktorem, který ovlivňuje účinnost pakážování, je interference mezi pomocným a pakážovacím virem na buněčné úrovni. Za standardních podmínek pakážování během tří dnů inkubace pomocné/viru (viru drůbežích neštovic) obvykle ret Q plikují na titry asi 1.10 plak tvořících jednotek na g
6.10 fibroblastů kuřecího zárodku. Velký nadbytek viru drůbežích neštovic ve srovnání s pakážovaným virem vakcínie vytváří podmínky, které poskytují negativní interferenční jevy a inhibuje replikaci pakážovaného viru.
Tato interference je minimalizována tím, že se použijí pro pakážování savčí buňky v kombinaci s pomocným virem drůbežích neštovic, jak je to popsáno v příkladu 7. V tomto případě hostitelské buňky nepodporují plně replikaci pomocného viru drůbežích neštovic. Ačkoliv nebylo děláno žádné testování ligované DNA viru vakcínie na účinnost pakážování virem drůbežích neštovic v savčí hostitelské buňce, výtěžek pakážování 2.10 plak tvořících jednotek na 8.10 savčích (OV-l) buněk byl získán s nerozštěpenou Tviru vackínie.
V každém virovém rekombinantu generovaném intracelulární rekombinací s daným insertním plasmidem má insert jednu orientaci závisející na polaritě homologních obklopujících oblastí v tomto plasmidu. Díky transkripčním interferenčním jevům (například Ink a Pickup, 1989), hladiny exprese genů vložených do vektoru viru neštovic závisí na orientaci cizího genu vzhledem k virovému genomu. Je tedy žádoucí zíakat v jednom reakčním stupni modifikované viry s jakoukoliv možnou orientací. Jedna z výhod postupu v tomto příkladu je to, že obě možné orientace vložené DNA jsou získány v jedné ligační reakci, umožňující bezprostřední testování variant, které mají nejvyšší úroveň exprese. Výhodná orientace kazety tohoto příkladu ve vybraném Smál inserčním místě viru vakcínie je íb orientace, jak bylo prokázáno skutečností, že většina 'modifikovaných virů měla tuto genomovou strukturu.
V této kazetě je P7.5 promotor kontrolující cizí gen v převrácené opakovači orientaci vzhledem k endogennímu genu polypeptidu o molekulové hmotě 750θ· Jak bylo diskutováno v příkladu 1, endogenní geny polypeptidu o molekulové hmotě 75θθ jsou umístěny v převrácených koncových opakováních genomu vakcínie. Vzdálenost Ρ7·5 promotoru gpt genu od Ρ7·5 promotoru v levém koncovém opakování je asi 20 000 párů nukleotidů. Orientace a” by měla být tedy méně stabilní a měla by se získávat méně často v souladu s pozorováním, že tato orientace byla nalezena pouze dvakrát. Virové isoláty P13.4 (orientace a) a vF12.5 (orientace b) byly však množeny ve velkém měřítku s gpt sélekčí a bylo zjištěno, že mají stabilní předpověděné struktury. Zbývá stanovit stabilitu různých struktur obsahujících násobné inserty bez selekce.
Ligace obsahovaly několikanásobný nadbytek insertu k vek toru. Tím se usnadňuje inserce více kopií kazety, jak to bylo pozorováno. Není však jasné, proč v tomto příkladu byla dvojitá inserce častější než v příkladu 1. Vzhledem k vnitřním rekombinacím se očekává, že jsou stabilní jenom některé konfigurace násobných insertů. Pro vyhodnocení stability virů násobných insertů a optimálního poměru vektoru k insertu na na stabilitu a hladinu exprese, která závisí na počtu kopií, lze provést další studie^ pokud je to potřeba, pro každou konstrukci, podle toho, jak je to popsáno v této přihlášce.
čištění viru a DNA: Byly použity viry a způsoby uvedené v příkladu 1 a v příkladu 2.
Sestavování virové DNA: Virová DNA vyčištěná z virionů se rozštěpí působením Smál a vyčistí se jednou extrakcí fenolem a třemi extrakcemi chloroformem. V prvním výše uvedeném pokusu se dva mikrogramy rozštěpené DNA viru ligují se 400 nanogramy (34-násobný molární nadbytek) fragmentu insertu (Hpal-Dral fragment o 1100 párech nukleotidů vyštěpený z
-π plasmidu pTKgpt-Pls) v objemu 50 mikrolitrů 40 hodin s 15 jednotkami T4 ligasy (Boehringer, lne.)· Druhý pokus ligace byl proveden za stejných podmínek až na to, že se použije sedmnáctinásobný molární nadbytek Srna! insertu o 1100 párech nukleotidů a 5 jednotek ligasy.
v „
In vivo heterologní pakážování ptačích buňkách: Pibroblasty kuřecího zárodku (6.10S) byly infikovány pomocným virem (0,5 plak tvořících jednotek na buňku HP1.441) a inkubovány dvě hodiny. Do infikovaných buněk se tranšfěktují dva mikrogramy ligované DNA. Pak se pokračuje stejně jako je to shora popsáno pro postup homologního pakážování v příkladu 1.
Ukázka pakážování modifikované DNA viru vakcínie pomocným virem drůbežích neštovic: Návrh tohoto pokusu je ukázán na obrázku 5.1. Genomová DNA viru vakcínie byla připravena z virionů vyčištěním sacharosovým gradientem, rozštěpena řestrikční endonukleasou Smál a ligována s kazetou cizího genu se zarovnanými konci. Digovaná DNA se transfektuje do fibroblastů kuřecího zárodku infikovaných virem drůbežích neštovic pro pakážování. Progenový vir se identifikuje analýzou plaků na savčích (CV-l) buňkách, které nepodporují uplnou replikaci viru drůbežích neštovic za vzáku infekčních virionů.
Podrobněji - nejdříve se Hpal-Dral fragment nesoucí kazetu modelového genu (obsahující gpt gen řízený Ρ7·5 promotorem viru vakcínie) vyštěpí z plasmidu pTKgpt-Pls (Palkner a Moss: 1938.) a liguje se přímo do jedinečného místa Smál viru vakcínie přírodního typu (kmen WR). Vybere se gpt gen, který umožní positivní selekci modifikovaných virů (Boyle a Goupar: 1988 a Palkner a Moss: 1988.). Jediné Smál místo v DNA viru vakcínie je umístěno v otevřené čtecí oblasti A51K v HindlII A fragmentu genomu. A51& gen je nepodstatný pro virovou replikaci v buněčné kultuře (Goebel a spol.: 199θ·)·
Ligovaný materiál se transfektuje do fibroblastů kuřecího
- 72 zárodku infikovaných, pomocným virem drůbežích neštovic. Po třech dnech se buňky isolují a připraví se surový zásobní virus. Pakážovaný virus vakcínie se identifikuje analýzou plaků na linii buněk (CV-1) ledvin africké zelené opice v mediu, kterém vybere buňky infikované virem nesoucím gpt gen. Toto reakční schéma zabrání virům obsahujícím samoligovanou DNA viru vakcínie přírodního typu tvořit plaky, ale umožňuje tvoření plaků modifikovanými viry, které obsahují vloženou kazetu modelového gpt genu.
V původních pokusech byla četnost pakážování nízká.
Titr gpt-positivního viru vakcínie v surovém zásobním stavu připraveném z 6.106 fibroblastů kuřecího embrya byl v rozmezí 1.10 až 1.10·2 plak tvořících jednotek.
Třináct gpt-positivních plaků bylo amplifikováno za gpt-selekce v buňkách CV-1. Isoluje se celková DNA infikovaných buněk, rozštěpí se působením HindllI, rozdělí se na 0,7% agarosovém gelu a analyzuje se Southernovým blotováním sondou gpt-genu. Jak ukazuje obrázek 3*2, bylo získáno několik virů, které měly sestavy blotu předpověděné pro různě modifikované genomové struktury.
Ve sloupcích 2, 4, 11 a 13 (odpovídajících plakům č. P12,3, F12.5, Ϊ13.3 a Ρ13·5) je viditelný jeden hybridizující fragment o asi 45 000 párech nukleotidů, který je očekáván, jestliže je do virového genomu vložena jedna kopie kazety genu v “b” orientaci (viz obrázek 3· 3). Ve všech případech je přítomný také očekávaný nový fragment o 5200 párech nukleotidů a objevuje se také, jestliže jsou stejné DNA jako na obrázku 3.2 testovány pomocí sondy viru vakcínie.
Dva viry, jejichž sestava je v souladu s a orientací, byly získány ve sloupcích 7 a 12 (odpovídájící'plakům č.
F12.8 a P13.4), kde je očekáván jediný gpt-hybridizující fragment o aši 5700 párech nukleotidů. Fragment s 5700 páry nukleotidů ve sloupci 7 je viditelnější při delších exposicích auto-radiografu. Sestava, která je vidět ve sloupci 5 (plak F12.6), může představovat jediný insert v a orien- 73 taci, ale očekávaný pás 0.5700 párech nukleotidů je z neznámých důvodů poněkud větší.
Sestava tří virových isolátů je v souladu s tandemovou inserci v a orientaci (sloupce 1, 6 a 10 odpovídající plakům č. F12.2J F12.7 a P13.2). V těchto případech jsou očekávány dva gpt-positivní hybřidizující fragmenty, o 5700 párech nukleotidů a 1100 párech nukleotidů (viz také obrázek 3.3). Fragmenty o 5700 párech nukleotidů a 4100 párech nukleotidů byly také pozorovány v ekvimolárních množstvích u virové DNA v blotu hybridizovaném sondou viru vakcínie.
Genom isolátů ve sloupci 3 (plak č. P12.4) možná obsahuje insert tandemových duplikátů v Mb” orientaci. V tomto případě se očekává, že dva fragmenty'o’45 000 párech nukleotidů a 1100 párech nukleotidů se hybridizují gpt-genem.
Virová DNA ve sloupci 9 (plak š. Ρ13·1) může obsahovat dvojitou inserci hlava-hlava. V tomto případě se očekává fragé^nt o 45 000 párech nukleotidů a 5700 párech nukleotidů hybridizujíci se sondou gpt-genu. Navíc by však taková DNA měla obsahovat nový fragment o 600 párech nukleotidů, který se hybridizuje sondcu DNA vakcínie. Tento fragment byl skutečně detegován na blotu hybridizovaném sondou vak*· cínie. Nicméně očekávaný fragment o 57θθ párech nukleotidů byl o něco menší než předpověděný a poskytoval hybridizační signál, který je slabší než bylo očekáváno. Potvrzení struktury tohoto rekombinantu vyžaduje tedy podrobnější analýzu»
Další analýza odhalila, že viry P12.7 a P12.3, které byly interpretovány jako viry s dvojitou inserci tandemu a” struktur, a virus P12.4, který byl interpretován jako virus s dvojitou inserci tandemu ”b” struktur”, mají ve skutečnosti násobné tandemové inserty v “a” a b orientaci. Southernova blotová analýza na oř^bázkú 3· 2nerozlišuje mezi inserty dvojitého tandemu a násobného tandemu.
- 74 Příklad 4
Konstrukce vektoru viru neštovic (vakcínie) (vdTK) s řídícím hlavním klonovacím místem a plasmidů se slučitelnými kazetami exprese
Tento příklad demonstruje aplikaci způsobů podlo tohoto vynálezu při tvoření nových klonovacích vektorů virů neštovic přímou molekulární modifikací a klonováním existujících genomů viru neštovic. Tento příklad popisuje vektor viru vakcínie (vdTK), který umožňuje řízenou inserci (tj. násilné klonování”) cizích genů' do krátkého segmentu násobného klonovacího místa” obsahujícího místa štěpení'různými nukleasami, při čemž každé z nich je jedinečné v genomu vektoru* Násilné klonování odstraňuje potřebu postupu výběru (selekce) nebo testování při odlišení žádaných rekombinantů od viru vektoru, jemuž chybí insert, neboň neslučitelnost DNA konců rozštěpených různými nukleasami bráni religaci vektorových ramének bez cizího insertu. Přístup s násilným klonováním je nejúčinnějším způsobem vložení cizího genu do virového vektoru.
Sídící vektor vdTK se vytvoří vložením násobného klonovacího místa (obsahující jedinečná místa Notl, Smál, Apal a RsrX) do místa genu thymidin-kinasy (tk) viru vakcínie (viz obrázek 4.1A). Toto nepodstatné místo je místem nejČastěji používaným pro vložení cizích genů do viru vakcínie, hlavně kvůli tomu, že je možná positivní selekce tk-negativních virů. Jestliže se tedy DNA ligovaného vdTK vektoru pakážuje tk-positivním pomocným vi£em, může se z nadbytku pomocných virů vybrat vektorový virus. A dále, vloženi cizí DNA do tk-místa viru vakcínie konvenčními způsoby obecně vede ke stabilním rekombinantům.
Násobné klonovací místo nového vdTK vektoru obsahuje místa štěpení Notl a Smál, která jsou v tomto vektoru jedi- j nečná. Před vložením násobného klonovacího místa se místa j štěpení Notl a Smál, která před tímto vložením existují ve
- 75 viru. vakcínie přírodního typu. (kmen WR), vynechají přímými molekulárními modifikacemi podle tohoto vynálezu. Viry, které mají žádané modifikace, se detegují testovacími (vyhle dávacími, skríning) technikami, které jsou založeny na PC? metodě (polymerase chain reaction) amplifikace sekvencí specifických nukleových kyselin.
Tento příklad popisuje také řadu p^jĚy»idů, které usnadňují expresi DNA kódujících úplné nebo částečné otevřené čtecí oblasti ve vektoru vakcínie vdTK. Tento vynález v sobě zahrnuje inserci otevřené čtecí oblasti přímo do expres ního vektoru viru neštovic, který má všechny příslušné regulační prvky vhodně umístěné pro expresi vložené otevřené čtecí oblasti. Avšak tento vdTK vektor nemá takové regulační sekvence pro expresi vložené otevřené čtecí oblasti, které chybí její vlastní transkripční a translační signály. Plas-, midy podle tohoto vynálezu podle tohoto příkladu tedy poskytují vhodné kazety exprese genů. pro rutinní navázání otevřených čtecích oblastí na promotory viru neštovic a popřípadě na translační start kodon. Ot^Vená čtecí oblast a související regulační sekvence jsou tedy efektivně přeneseny do vdTK vektorového hlavního místa klonování násilným klonováním. Modifikované viry, které mají insert v jakékoliv orientaci, se mohou získat použitím jednoho ze dvou plasmidů., které mají kazetu exprese se žádanou orientací v jeho hlavním místě klonování. Kazety exprese genu plasmidů, jejichž příklady jsou zde uvedeny, mají dvě uhnízdění řady míst štěpení restrikčními enzymy, což usnadňuje klonování otevřených čtecích oblastí do vdTK vektoru. Tyto kazety mají hlavní místo klonování, které obsahuje stejná jedinečná místa, jako hlavní místo klonování vdTK vektoru. A navíc, ve středu tohoto hlavního místa klonování tyto kazety obsahují různá místa často se vyskytujících štěpících enzymů, která jsou užitečná pro vložení otevřených čtecích oblastí do kazet. DNA, které jsou vloženy do kazet pomocí často se vyskytujících míst štěpení, jsou obklopeny na kterékoliv straně několika různými jeáhečnými místy, která jsou vhodná pro násilné klonování kasety do hlavního místa klonování vdTK vektoru.
-76 Tento příklad také popisuje kazety exprese genů. vhodné pro vložení do jediného jedinečného místa ve vektoru vdTK viru vakeínie. Pro překonání snížené klonovací účinnosti při používání jediného enzymu pro štěpení DNA kazety exprese těchto plasmidů obsahují E. coli gpt gen jako selekční markér.
Vektorový systém vdTK vakeínie se s výhodou používá ve spojení s heterologním pakážovacím postupem popsaným v příkladech 3 a 7· Plasmidy obsahující gpt markér se mohou používat také s homologním pomocným virem, kterému chybí gpt markér. Příklady konstrukcí pro expresi poly^j>eptidů, používající vdTK vektor a příbuzné plasmidové systémy jsou zde uvedeny níže v příkladu 5·
Vedle shora uvedených výhod expresní kazetové plasmidy podle tohoto vynálezu poskytují také prostředek pro překonání obecného problému neslučitelnosti mezi konci rozštěpených vektorových DNA viru neštovic a mnoha DNA inserty, jako vhodnou alternativou k obvyklému použiti segmentů. DNA syntetického adaptoru. Isolace DNA fragmentů, které kódují otevřené čtecí oblasti, je obvykle usnadněna tím, že se používají restrikčni endonukleasy, které mají rozeznávací sekvence, které jsou krátké a náhodně se vyskytují ve vysokých frekvencích ve všech přírodních DNA sekvencích. Na druhé straně takové často se vyskytující štěpící enzymy obvykle nejsou vhodné pro účinné přímé klonování do tak velkých genomů, jako jsou například genomy viru neštovic, protože takové enzymy štěpí velké DNA na mnoho fragmentů. K religaci těchto fragmentů by docházelo v náhodném pořadí za vzniku několika neporušených virových genomů. Insertní místa ve vektoru vakeínie s výhodou znamenají místa štěpení ne příliš často se vyskytujících štěpících restrikčních endonukleas, které se pravděpodobně obecně nepoužívají pro isolaci fragmentů otevřené čtecí oblasti nebo DNA insertu. Zde uvedené plasmidy překonávají tuto obecnou neslučitelnost tím, že umožňují efektivní inserce fragmentů z často se vyskytujících štěpících enzymů do plasmidu a následující účinný přenos do vektoru vakeínie použitím štěpících enzymů, které
-77 se často nevyskytují.
Delece jedinečného místa štěpení Notl viru vakcínie přírodního typu (7/R): Jedinečné m^sto štěpení Notl2viru vakcínie lze odstranit tak, že se do tohoto místa vloží segment ”NotI deleční adaptor”, který má kohesivní konce slučitelné s ligací s DNA rozštěpenou působením Notl, ale které chybí sekvence potřebné pro rozpoznávání Notl endonukleasou. Sek^vence tvořené ligovanými kohesivními konci virové DNA rozštěpené působením Notl, virové DNA a adaptoru nejsou štěpitelné působením Notl. Tento adaptor obsahuje také několik vybraných míst štěpení restrikčními endonukleasami pro řízenou inserci DNA fragmentů.
Podjrobněji - 1 mikrogram DNA viru vakcínie WE přírodního typu se rozštěpí působením Notl a liguje se s jedním mikrogramem dvojvláknového Notl-delečního adaptoru. Tento adaptor sestává ze dvou částečně doplr^vých vláken: odNl (sekvence identifikační čájío 16) a odN2 (sekvence identifi-ů kační číslo 23). Střední část tohoto ad^toru obsahuje místa štepení restrikčními endonukleasami Stul, Dral, SspI a BcoRV Anelované adaptorové oligonukleotidy se používají pro ligační reakce. Ligovaný materiál se transfektuje do fibroblastů kuřecího zárodku infikovaného virem drůbežích neštovic a pakážuje se jak je to popsáno v příkladu 3·
Alternativní postup deletování jediného Notl místa viru vakcínie (kmen WR) je nastíněn na obrázku 4.1, panel B.
V prvním stupni se DNA viru vakcínie rozštěpí působením Sací Sací ”Ifragment se isoluje na nízkotající agarose a klonuje še'do Sýstl místa vhodného plasmidu, jako je například pTZ19R (získátelného od firmy Pharmacia, lne.). Výsledný plasmid, pTZ-SacI, se rozštěpí působením Notl, nechá se zreagovat s HLenowovou polymerasou, aby se doplnil na přeční vajících kontech a religuje se. Ligovaný materiál se transfektuje do buněk E. coli (ΞΒ 101). Standardními klonovacími postupy se isolují kolonie. Výsledný plasmid, pTZ-SaddN, má deletováno místo Notl a používá se v pokusu reversní gpt-selekce jak je to popsáno Isaacsem S. N., Kotwalem G. a
- 78 Mosssem B.: Virology 178. 626 až 630 (1990) způsobem úpravěným následujícím způsobem: CV-1 buňky (8.10°) se infikují 0,2 piek tvořícími jednotkami virového'isolátu vp7, viru vakcínie, který byl integrován do jediného místa Notl kazety gpt-genu (viz příklad 1). Potom se sraženina fosforečnanem vápenatým, která obsahuje 20 yug DNA z modifikovaného Sací fragmentu připraveného z plasmidů pTZ-GasIdN transfektuje do buněk. Tyto buňky se dále zpracují jak je to popsáno v pakážovacím postupu v příkladu 1. Zásobní surový virus se , použije pro infikování myších buněk STO (získaných z Amer^iké sbírky typů kultur (American Type Culture Oollection), Rockville, Md., ATCC č, CEL 1503) v přítomnosti 6-thioguaninu (6-TG). Toto je negativní selektivní postup, který vyžaduje ztrátu gpt-genu u viru, který se replikuje (Issacs a spol·, 1990.) a vede tedy v tomto případu k integraci modifikovaného Sací I” fragmentu a tudíž k deleci gpt-genu· Všem plakům, které rostou v přítomnosti 6-TG, by měl chybět gpt-gen a měly by obsahovat modifikovaný Sací I fragment. Odhadnutý výtěžek je v rozmezí 0,1 a 0,2 % ze všech plaků (tj. normální frekvence rekombinantů v tomto typu pokusů'získávání markéru). Jelikož selekční postup je mimořádně účinným postupem (Isaacs a spol.: 1990.), nepředpokládá se, že by identifikace přesných struktur vyžadovala zkoumání velkého počtu klonů. ΑΪ se však pro deleci jediného Notl viru vakcínie použije shora uvedený první postup nebo tonto alternativní postup, pro identifikování žádané konstrukce se může použít následující testovací postup.
Identifikace PGR-testováním viru (vdN), který má dele_ tován místo Notl: Klony viru vakcínie, které mají deletovány místo Notl, se mohou identifikovat analýzou plaků rostoucích v buněčné linii (GV-1), která nepodporuje růst pomocného viru drůbežích neštovic. DNA virů v jednotlivých plácích se analyzují PGR-testovací metodou následujícím způsobem.
Prvním primerem pro PGR reakci je oligonukleotid odNl (sekvence identifikační číslo 16), druhým primerem je odN3 (sekvence identifikační číslo 24) · druhého primeru je umístěna v genornu viru vakcínie asi 770 párů nukleotidů
- 79 po směru vlákna sekvence prvního primeru. Teraplátem je celková DNA z 1.10 CV-1 buněk infikovaných polovinou viru jediného plaku. DNA se připraví standardními technikami. Pro PCR reakci se použije asi 50 ng· PCR reakce se provádějí podle standardních technik komerčně dostupnými PCR sestavami. Positivní PCR reakce produkují DNA fragment o asi 770 párech nukleotidů. Takový virus, který má deletováno místo Notl, se označuje ”vdN“,
Delece jedinečného restrikčního místa Srna! z viru vakcínie vdNí WR kmen viru vakcínie obsahuje jediné Smál místo v otevřené čtecí oblasti (A51P), které není podstatné pro replikaci viru v buněčné kultuře (Goebel a spol.: 1990).
I když se toto místo může použít pro vložení cizího genu, v tomto příkladu je však toto místo deletováno ve prospěch tvořícího se mnohostrannějšího vektoru viru vakcínie zavedením nového jedinečného místa Smál jako části kazety násobného klonovacího místa.
DNA vdN viru (1 /Ug) se tedy rozštěpí působením Smál a ligu je se nadbytkem hexamerového linkeru, který má rozpoznávací sekvenci pro restrikční endonukleasu HindlII (odSl, 5*-AAGCTT-3'). Inserce tohoto linkeru do místa štěpení Smál viru vakcínie vede k destrukci sekvence rozeznávající Smál a k zavedení nové HindlII rozpoznávací sekvence. Iúgovaný materiál se pakážuje do cva buněk, které byly infikovány virem drůbežích neštovic, jak je to popsáno v příkladu 7·
Jediné Smál místo viru vakcínie (kmen WR) se může deletovat také podle postupu nastíněného na obrázku 4.1, panel C, modifikováním klonovaného fragmentu DNA viru vakcínie místo přímého modifikování úplné DNA viru vakcínie. V prvním stupni se DNA viru vakcínie rozštěpí působením Sáli, Sáli P-fragment se isoluje z nízkotající agarosy a klonuje se do místa Sáli vhodného plasmidů, jako je například pTZ9R (získátelného od firmy Pharmacia, lne.). Výsledný plasmid pTZ-SalP má dvě místa Smál, jedno v násobném klonovacím místě a druhé v sekvencích vakcínie (obrázek 4.1, panel G). pTZ-SalP se částečně rozštěpí působením Sňal a přidají se I-Scel linkery
- 80 následujícím postupem: první vlákno, LU3ceI linker (sekvence identifikační číslo 25) a jeho doplňkové vlákno, I Scel linker 2 (sekvence identifikační Číslo 26). Správný plasmid, který má deletováno místo Smál v sekvencích vakcínie, se identifikuje štěpením působením Smál a I-Scel. Konečný plasmid, pTZ-SalPdS, se použije pro zavedení delece Smál do genomu viru vakcínie s použitím pokusu reversní selekce gpt-genu, jak je to popsáno pro deletování místa Notl až na to, že výhodným virem, který má být modifikován, je isolát P12.5 virus, který je integrován do jediného Smál místa kazety gpt-genu (viz příklad 3).
Výsledná inserce místa pro endonukleasu I-Scel je výhodná pro přímé molekulární klonování, protože tento enzym, isolovaný z kvasinek, rozeznává 18-merní místo a tedy štěpí náhodné DNA sekvence mimořádně á?ídka. Například I-Scel štěpí genom kvasinek kenom jednou (Thierry A., Perrin A., Boyer J.M Fairhead C., Dujon B., Frey B. a Schmitz G.: Nucleic Acids Ses. 19« 189 až 190 (1991)·)· I-Scel je komerčně dostupná od Boehringer, lne. LJ3ceI místo se s výhodou zavádí do vektoru, který nemá žádná předn^ existující místa pro tento enzym. Vytváří se tím nový vektor s jediným místem které může být použito pro genové inserce. Místo štěpení působeníÍTScel, aí už DNA viru vakcínie nebo DNA jiných vektorů, může být stanoveno rutinní restrikční analýzou vektorové DNA.
Jestliže se používá tento alternativní postup pro deleci místa Smál z DNA viru vakcínie, pořadí stupňů pro zkonstruování vektoru vdTK je následující: delece místa Srna-I vedoucí k viru edS (viz výše), delece místa Notl insercí kazety Notl gpt-gen (viz příklad 1) do jediného Notl místa viru vdS klonováním a pakážováním, což vede k viru vdSNgpt, reversní selekce (gpt-selekce) jak shora popsáno s použitím vdSNgpt a pTZ-SaddN jako substrátů pro pokus získání markéru a delece tk-genu, jak je to nastíněno níže v tomto příkladu.
Alternativní postup, podle kterého byl vektor vdTK
- 81 skutečně zkonstruován, je následující. Místo Smál viru vakcínie přírodního typu se deletuje. Vytvoří se tak mezi-produkt - virus vdS. V druhém pokusu se deletuje místo Notl viru vakcínie přírodního typu. Vytvoří se tak meziprodukt - virus vdN. Virus vdSN byl získán koinfekcí buněk CV-1 oběma viry a PCE-testováním rekombinantního viru (který byl vytvořen jednoduchým genetickým zkříženým postupem). Životnost různých meziproduktů byla stanovena titracemi.
Tabulka 4.1A ukazuje výsledky po tom, co jednotlivé isoláty z vdN klonovacího pokusu byly vyčištěny pětkrát přes plak (aby bylo jisté, že byly získány klony bez viru přírodníhcyfcypu) a potom amplifikovány. Po titraci byly surové virové kmeny z první amplifikace společně s kontrolou přírodního typu (WE-WT) použity pro infikování CV-1 buněk v množství 0,1 pfu/buňku. Tyto buňky se po 48 hodinách isolují a použijí se pro přípravu kmenů, které se přetitrují. Tyto výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.1B. Isoláty vdN/Al č. 6.1111 a vdN/ΑΙ č. 10.1111 byly označeny jako klony vdN č. 6 a vdN č. 10 a použity pro přípravu viru ve velkém měřítku.
Tabulka 4.2A ukazuje výsledky po tom, co jednotlivé isoláty vdS klonovacího pokusu byly pětkrát přečištěny přes plak a potom amplifikovány a zti^trovány. Pro infikování buněk CV-1 v množství 0,1 plak tvořících jednotek na buňku byly použity surové kmeny z první amplifikace spolus s přírodní kontrolou (!JE-WT). Buňky byly isolovány po 48 hodinách. Výsledné surové zásoby byly přetitrovány· Tyto výsledky jsou uvedeny na obrázku 4.2B. Isoláty vdS č 7.11 byly označeny jako klony vdS č. 2 a vdS č.7 a použity pro přípravu viru ve velkém měřítku. V každém případě se virový isolát, který vykazuje nejlepší růstové vlastnosti, vybere pro amplifikaci a pro kultivace ve velkém měřítku.
- 82 Tabulka 4.1
Studie životaschopnosti virového meziproduktu vdN
A) Titr po první amplifikaci šesti virových vdN-isolátů (plaků tvořících jednotek na ml surového kmene):
vdN/Al v c. 2.1111 1,0.10? pfu/ml
vdN/Al xz c. 4.1111 1,3.108 pfu/ml
vdN/Al \z c. 6.1111 9,0.10? pfu/ml
vdN/Al v c. 8.1111 8,0.10? pfu/ml
vdN/Al č. 10.1111 4,0.10? pfu/ml
vdN/Al č. 12.1111 1,1.108 pfu/ml
B) Titr po druhé amplifikaci:
vdN/Al xz c. 2.1111 3,6.10 pfu/ml
vdN/Al c. 4.1111 2,5.108 pfu/ml
vdN/Al xz c. 6.1111 5,9.108 pfu/ml
vdN/Al v c. 8.1111 4,2.1θ| pfu/ml
vdN/Al \z c. 10.1111 4,3.10. pfu/ml
vdM/Al Xz c. 12.1111 2,2.108 pfu/ml
WR-WT 5Λ. 10a pfu/ml
Tabulka 4.2
Studie životaschopnosti virových meziproduktů vdS
A) Titr po prvjní amplifikaci pěti živých vdS-virových isolátů (pfu/ml surového kmene)
vdS xz c. 2.11
vdS č. 3.11
vdS č. 4.11
vdS ě. 5.11
vdS ě. 7.11
4,1,10? pfu/ml 6,5.10? pfu/ml 8,0.10? pfu/ml 2,7.10? pfu/ml 4,7.10? pfu/ml
B) Titr po vdS č. 2.11 vdS S. 3.11 vdS č. 4.11 vdS č. 5.11 vdS č. 7.H WR-;7T druhé amplifikaci:
1.6.108 pfu/ml
1.4.108 pfu/ml 8,0.10? pfu/ml
1.3.108 pfu/ml
1.7.108 pfu/ml
2,3.108 pfu/ml
- 33 Identifikace viru (vdSN), který má deletováno místo Smál, PCR-testováním: Klony vdSN viru vakcínie, které mají místo Smál deletováno, byly identifikovány PCR testováním následujícím způsobem.
Prvním primerem pro PCR reakci je oligonukleotid odS2 (sekvence identifikační číslo 27) a druhým primerem je oligonukleotid odS3 (sekvence identifikační číslo 23). Sekvence oligonukleotidu od32 je umístěna v genomu vakcínie asi 340 p árů nukleotidů proti směru vlákna od místa Smál. Sekvence oligonukleotidu odS3 je umístěna asi 340 párů nukleotidů po směru vlákna tohoto místa. Templátem je celková DNA buněk CV-1 infikovaných plakem viru jak shora popsáno pro vdN identifikaci. PCR-amplifikovaný pás o asi 680 párech nukleotidů se testuje na vnímavost na Smál s resistencí na Smál štěpení indukující inserci HindlII nebo IScel linkeru, zatímco přírodní kontrolní DNA je Štěpena na dva kusy o asi 340 párech nukleotidů. Virus vakcínie, který má žádanou inseroi linkeru v mistě Smál, se označí vdSN.
Deleoe kódující oblasti genu thymidin-kinasy z viru vak cínie vdSN: Z viru vakcínie vdSN byl vyvinut nový vektorový kmen (označený vdTK) náhradou genu thymidin-kinasy (tk), který je umístěn v geneticky stabilní oblasti genomů vakcínie, segmentem obsahujícím několik míst štěpení jedinečnou restrikční endonukleasou (obrázek 4.1A).
Nejdříve se deletuje sekvence kódující thymidin-kinasu (tk) z plasmidu (pHindJ-1), který obsahuje segment genomu vakcínie (HindlII J segment), v němž je umístěn tk-gen (viz obrázek 4.2). Do místa tk-genu se pak vloží násobné klonovací místo s jedinečnými místy Notl, Smál, Apal a Rsrll obklopené místy Sfil. Nakonec se přenese modifikovaný segment viru do genomu vdSN viru vakcínie, který se pak označí vdTK (obrázek 4.1A). Aby se násilné klonování dále usnadnilo, obě místa Sfil se stanou jedinečnými místy ve vektoru tím, že se využije přirozená povaha rozpoznávací sekvence Sfil (GGCCNNNN*NGGOC). Sekvence dvou Sfil míst jsou pak následující: Sfil(l), GGCCGGCI*AGGCC (sekvence identifikač- 84 ní číslo 29) a Sfil(2), GGCCATAT'AGG-CO (^cvence identifikační číslo JO). Tento plasmid, který obsahuje konečnou modifikaci tk-genu (pHindJ-3), se zkonstruuje.z prekursorového plasmidu pHindJ-1 smyčkovou mutagenesí. Dalece tk-genu se potvrdí sekvenační analýzou.
Konstrukce prekursorového plasmidu pHindJ-1: DNA viru vakcínie přírodního typu se rozštěpí působením HindlII. Výsledné fragmenty se rozdělí na 0,8% gelu nízkotající agarosy. Fragment HindlII J se vyštěpí pod ultrafialovým světlem a připraví se podle standardních technik· Tento fragment se vloží do jediného HindlII místa plasmidu pTZ19H (Pharapcia,Inc.). Získá se takpHindJ-1.
Konstrukce plasmidu pHindJ-2i Plasmid pHindJ-1 se transfektuje do E. coli kmene NM522. Jednovláknová DNA se připraví superinfekcí pomocným fágem MI3KO7 podle protokolu dodávaného firmou Pharmacia. Jednovláknová DNA slouží jako templát pro místně řízenou mutagenesí s primerem odTEL (sekvence identifikační číslo 31). Tento primer je doplňkový k promotorové oblasti a k oblasti kolem translačního stop kodonu tk-genu. Ve středové části obsahuje jedinečná restrikční místa BamHI, Hpal, Nrul a EcoRI. Postup mujragenese se provádí se sestavou pro mutagenesí dodávanou firmou Amersham, lne. podle příručky dodávané dodavatelem.
Pro konstrukci pHindJ-2 byly popsána sekvence tfr-genu v práci Veira J. P. a Mosse B.í J, Virol. 46, 530 až 537 (1983). Sekvence tk-genu je dostupná v EMBL Data Library pod identifikačním označením (ID) PVHINU. Sekvence vektorové části (pTZ19R) plasmidu je dostupná od firmy Pharmacia, lne. Sekvence kolem delegovaného genu thymidin-kinasy (tk-gen) viru vakcínie v plasmidu pHindJ-2 je uvedena v sekvenci identifikační číslo 4. 5*-0blast tk-genu (nukleotidy číslo 1 až 19 v tomto seznamu, nukleotidy č. 4543 až 4561 v ID PVHINLJ) je následována jedinečnými restrikčními místy BamHI, Hpal, Nrul a EcoRI a 3*- oblastí tk-genu (nukleotidy číslo 44 až 67 v tomto seznamů, nukleotidy Č. 5119 až 5142 v ID PVHINU). Nukleotidy číslo 4562 až 5118 v ID PVHINU,
- 85 které obsahují část tk-pr^otoru a oblast kódující tk-gen, jsou v pHindJ-2 deletovány.
Konstrukce plasmidu pHindJ-3: Plasmid pHindJ-2 se rozštěpí působením BamHI a EcoRI. Vloží se dvouvláknový linker obsahující jedinečná restrikční místa Notl, Smál, Rsrll a Apal, která jsou obklopena místy Sfil. Tento linker sestává z oligónukleotidů P-^(l) (sekvence identifikační číslo 32) a P-J(2) (sekvence identifikační číslo 35)·
Modifikované sekvence plasmidu pHindJ-3 je uvedena v sekvenci identifikační číslo 5· Vložené násobné klonovací místo odpovídá oligonuHeotifu P-J(l). Vložená sekvence začíná v poloze 21 a končí v poloze'99· Obklopující sekvence jsou stejné jako je to popsáno výše u HindJ-2.
vložení tk-delece do viru vakcínie se plasmid pHindJ-3 rozštěpí působením HindlII. Při pokusu získání markéru se použije obrácený HindlII J fragment, který má de· leči tk-genu, jak je to popsáno Samem a Dumbellem (1981). Viry, které mají deletován tk<-gen, se isolují tk-něgativní selekcí (Mackett a spol.: 1932) a identifikují se následným PCR-testov^ním.
Podrobněji - modifikovaný HindlII fragment, přítomný v HindJ-3, se vyštěpí působením HindlII a isoluje se na gelu nízkotající agarosy. Získání marg/ícru se provádí v podsta· tě tak, jak je to popsáno Samem a Dumbellem (1981) s následujícími modifikacemi. 5·1θ^ buněk CV-1 se infikuje 0,2 plak tvořících jednotek na buňku vdSN viru vakcínie. Po jednohodinové inkubaci se jeden mililitr sraženiý^ foaforeč· nanem vápenatým obsahující 1 /Ug modifikovaného HindlII J fragmentu transfektuje do infikovaných buněk. Po dvou dnech růstu se připraví podle postupu shora popsaného v příkladu 1 surový virový kmen a titruje se na lidské 14-3B tk-negativ ní buňky v přítomnosti bromdeoxyuridinu (BrdU) jak popsali Mackett a spol. v roce 1982. Tk-negativní plaky se mohou dále analyzovat PCR testováním.
Identifikace viru s delecí thymidin-kinasy (vdTK)
- 86 PCR-testováním: Prvním primerem pro PCR reakci je oligonukleotid odTK2 ^sekvenci identifikační číslo 34), sekvence, která je umístěn asi 300 párů nukleotidů proti směru vlákna tk-genu. Druhý primer, odTK3 (sekvenci identifikační číslo 35), je umístěn asi 220 párů nukleotidů po směru vlákna stop kodonu tk-genu. Templátem je celková DNA buněk OV-1 infikovaných plakem viru, jak je to popsáno pro vdN testování. Amplifikační produkt, který pochází od viru majícího deleci tk-genu, má asi 520 párů nukleotidů, zatímco přírodní kontrola poskytuje fragment o asi 1100 párech nukJeotidů.
Konstrukce plasmidů obsahujících kazety exprese genu pro přenos do vdTK vektoru: Plasmid pAO je základní plasmid, který obsahuje hlavní klonovací místo vektoru obsahující jedinečná místa hlavního klonovacího vektoru vdTK viru vakcínie. Plasmid pAO byl zkonstruován nahrazením násobného klonovacího místa komerčně dostupného plasmidu segmentem obsahujícím jedinečná místa vektoru vdTK a místo Xhol, jak je to ilustrováno na obrázku 4.3.
Podrobněji - při deletování násobného klonovacího místa plasmidu Bluescript II SK-phagemid (Stratagene) se plasmid rozštěpí působením Sací a Asp713. Velký vektorový fragment se liguje s adaptorem obsahujícím anelované oligonukleotidy P-A (0.1) (sekvence identifikační šišlo 36) a P-A (0.2) (sekvence identifikační číslo 37).
Násobné klonovací místo pAO (odpovídající oligodkleotidu P-A(O.l) a 20 nukleotidů 5*- a 3'-obklopujících oblastí pBluescript II SK- jsou uvedeny v sekvenci identifikační číslo 6. Insert začíná v poloze 21 a končí v poloze 95 (První ”A” zbytek na 5'-konci odpovídá poloze číslo 2187, poslední G zbytek na 3z-konci odpovídá poloze číslo 2301 plasmidu pAO.).
Konstrukce plasmidů pAl a pA2: Plasmidy pAl a pA2 byly navrženy pro inserci DNA segmentů, například fragmentů syntetického /přírodního promotoru. Byly zkonstruovány vložením linkeru obsahujícího druhé klonovací místo často štěpících
- 37 enzymů, které neštěpí pAO, do Xhol místa pAO. Oba plasmidy mají stejnou strukturu až na orientaci druhého násobného klonovacího místa (obrázek 4.3).
Plasmid pAO se rozštěpí působením Xhol a liguje se s adaptorem obsahujícím anelované oligonukleotidy P-A(l.l) a P-A(1.2). Byly isolovány obě možné orientace adaptoru a označeny pAl a pA2.
Násobné klonovací místo pAl odpovídající oligonukleotidu P-A(l.l) a 20 nukleotidů 5'- a 3'-obklopujících oblastí pAO jsou uvedeny v sekvenci identifikační Číslo 7. Insert začíná v poloze 21 a končí v poloze 83 (První C zbytek na 5-konci odpovídá poloze číslo 2222,posledňí’”0“ zbytek na 3*-konci odpovídá poloze 2324 plasmidu pAl.).
Násobné klonovací místo pA2 (odpovídající oligonukleotidu P-A(1.2)) a 20 nukleotidů 5'- a 3'-obklopujících oblastí pA2 jsou uvedeny v sekvegfti identifikační číslo 10. Insert začíná v poloze 21 a končí v poloze 195 (První C” zbytek na 5'-konci odpovídá poloze 2252, poslední ”G zbytek na 3'-konci odpovídá poloze číslo 2466 plasmidu pA2-Sl.).
Konstrukce plasmidů pAl-Sl a pA2-Sls Plasmidy pAl-Sl a pA2-Sl poskytují silný syntetický promotor S1 viru neštovic zahrnující translační start kodon následovaný jediným EcoSI místem vhodným pro inserci otevřených čtecích oblastí, které nemají asociovaný start kodon. Promotor sl modifikovaná verse silného pozdního promotoru viru neštovic označeného P2.
Plasmidy pAl-Sl a pA2-Sl se získají vložením fragmentu prvního dvouvláknového promotoru do místa Ndel a BamHI pAl nebo pA2 násilným klonováním (obrázek 4.4, panel A). Podrobněji lze uvést, že vektor pAl se rozštěpí působením Ndel a BamHI a liguje se s adaptorem sestávajícím z anelovaných oligonukleotidů P-P2ml.l a P-P2ml.2. Výsledný plasmid se označí pAl-Sl.
Sekvence syntetického promotoru z p^l-S^L (odpovídající oligonukleotidu P-P2ml.l) a 20 nukleotidu 5 - a 3 - obklo- 38 pujících oblastí pAl jsou uvedeny v sekvenci identifikační číslo 9. Insert začíná v poloze 21 a končí v poloze 195 (První **C insert na 5'-konci odpovídá poloze číslo 2223, poslední nG zbytek na 3*-konci odpovídá poloze číslo 2440 plasmidu pAl-Sl.).
Vektor pA2 se rozštěpí působením Ndel a BamHl a liguje se s adaptorem sestávajícím z mutovaných, oligonukleotidů P-P2ml.l a P-P2ml.2, jako shora pro pAl-Sl. Výsledný plasmid se označí pA2-SL.
Sekvence syntetického promotoru z pA2-Sl (odpovídající oligonukleotidů P-P2ml.2) a 20 nukleotidů 5*- a 5'-obklopujících oblastí pA2 jsou uvedeny v sekvenci identifikační číclo 10. Insert začíná v poloze 21 a končí v poloze 195 (První C zbytek na 5'-konci odpovídá poloze číslo 2252, poslední G zbytek na 5'-konci odpovídá poloze číslo 2466 plasmidu pA.x-Sl.).
Konstrukce plasmidů pAl-S2 a pA2-S2: Plasmidy pAl-S2 a pA2-32 obsahují silný syntetický promotor 32, modifikovanou versi silného pozdního promotoru viru neštovic (popsaného Davisonem a Mossemi J. Mol. Biol. 210. 771 až 784 (1989).). Tyto plasmidy neposkytují traňslační start kodon s promotorem a jsou tedy vhodné pro inserci úplných otevřených čtecích oblastí, které zahrnují start kodon. Promotory mají různé orientace vzhledem k vdTE hlavnímu klonovacímu místu v těchto dvou plasmidech. Plasmidy pAl-32 a pA.-S2 se získávají násilným klonováním fragmentu druhého dvouvláknového promotoru do míst Hpal a EcoRI pAl a pA2 (obrázek 4.5, panel A). Podrobněji - plasmid pAl se rozštěpí působením enzymů Hpal a EcoRI a liguje se se sekvencí syntetického linkeru obsahující anelované oligonukleotidy P-artP(5) a P-artP(6). Výsledný plasmid se označí pAl-S2.
Sekvence syntetického promotoru z pAl-S2 (odpovídající oligonukleotidů ?-artP(5) a 20 nukleotidů '5'- a 5*-obklopujících oblastí pAl jsou uvedeny v sekvenci identifikační číslo 11. Insert začíná v poloze 21 a končí v poloze 68.
- 8S (První *’T” zbytek na 5*-konci odpovídá poloze číslo 2240, poslední A zbytek na 3'-konci odpovídá poloze číslo 232? plasmidu pAl-S2.).
Podobně plasmid pA2 se rozštěpí působením enzymů Hpal a EcoBI a liguje se s anelovanými oligonukleotidy P-artP(5) a P-art P (6) jako u pAlS2. Výsledný plasmid se označí pA2-S2. Sekvence syntetického promotoru z pA2-S2 (odpovídající oligonukleotidu P-artP(6)) a dvacet nukleotidů 5*- a 3'-obklopujících, oblasti z pA2 jsou uvedeny v sekvenci identifikační číslo 12. Insert začíná v poloze 21 a končí v poloze 72. (První T zbytek na 5'-konci odpovídá poloze číslo 2263, poslední”A” zbytek na 3'-konci odpovídá poloze číslo 2354 plasmidu pA2-S2).).
Po vložení otevřené čtecí oblasti do kteréhokoliv z plasmidů pAl-Sl, pA2-Sl, pAl-S2 nebo pA2-S2, lze úplnou kazetu exprese vyštěpit a násilným klonováním vložit do odpovídajících míst ve vektoru vdTK viru. Kazeta může být vložena do genomu viru v jakékoliv orientaci podle toho, jaký klonovací plasmid se použije.
Konstrukcejplasmidů obsahujících kazety exprese se selektivním ma^řerem (pN2gpt-S3A a pN2-gpt-S4)i Vedle shora popsaných plasmidů určených pro násilné klonování byly zkonstruovány dva další plasmidy pro přenos genů do jedinečného (Notl) místa ve vektoru viru neštovic pomocí genu E.coli gpt selektovatelného marekeru, Vedle shora popsaných promotorů 81 a S2 poskytují také dva další promotory viru neštovic.
Plasmid pN2gpt-S3A (obrázek 4,7) lze použít pro vložení otevřených čtecích oblastí, jimž ch-ybí jejich vlastní iniciační kodon. Geny, které se mají přenést do viru vakeínie (gpt markér a otevřená čtecí oblast), se mohou vyštěpit bua působením Notl samotné nebo působením dvou enzymů, například Notl a Smál (nebo Ssrll nebo Apal). Vyštěpený fragment se pak vloží do odpovídajícího místa (odpovídajících míst) vektoru vdTK viru.
- 90 Plasmid pN2gpt-S4 (obrázek 4.7) lze použít pro vložení úplných otevřených čtecích oblastí zahrnujících AUG translační start kodon. Tyto kazety obsahující gen gpt-markeru a otevřenou čtecí oblast se mohou vyštěpit jak shora popsáno pro pN2gpt-S3A. Promotory S3A a S4 jsou modifikovanými versemi silných pozdních promotorů viru neštovic.
Tyto plasmidy byly zkonstruovány tak, že se nejdříve připraví plasmidy pN2-gpta a pN2-gptb (obrázek 4.6), kterc obsahují E. coli gpt gen řízený P7.5 promotorem viru vakcínie obklopeným několika jedinečnými restrikčními místy včetně Notl (obrázek 1.3)· Inserce S3A nebQ S4 promotorového fragmentu do jedinečných míst Pstl a Clal v pN2-gptb poskytuje plasmidy pN2gpt-S3A a pN2gpt-S4.
Konstrukce plasmidů pN2gpta a pN2gptb: viz příklad 1 a obrázek 4.6.
Konstrukce plasmidu pN2gpt-S3A: Rodičovský plasmid pN2gptb se rozštěpí působením Pstl a Clal a liguje se se sekvencí syntetickým linkerem sestávajícím z oligonukleotidů P-artP(7) a P-artP(8) (sekvence identifikační číslo 40). Výsledný plasmid se označí pN2gpt-S3A,.
SekgPhce syntetického promotoru plasmidu pN2gpt-S3A (odpovídající oligonukleotidu P-artP(7) a dvacet nukleotidů 5*- a 3'-obklopujících oblastí z pN2-gptb jsou uvedeny pro pN2gpt-S3A v sekvenci identifikační číslo 13. Vložená DMA sekvence začíná v poloze 21 a končí v poloze 107 (První T zbytek na 5'-konci odpovídá poloze číslo 3328, poslední A zbytek na 3*-konoi odpovídá poloze Číslo 3454 plasmidu pN2gpt-S3A.).
Konstrukce plasmidu pN2gpt-S4: Plasmid pN2-gptb se rozštěpí působením Pstl a Clal a liguje se s adaptorovou sekvencí sestávající z oligonukleotidů P-artP(9) a P-artP(lO) (sekvence identifikační číslo 41). Výsledný plasmid se označí pN2gpt-S4.
Sekvence syntetického promotoru z pN2gpt-S4 (odpovídá- 91 ?c jící oligonukleotidu P-art($) a dvacet nukleotidů 5#- a 3'obklopujících oblastí pN2gptb jsou uvedeny pro pN2gpt-S4 v sekvenci identifikační číslo 14. Vložená DNA sekvence začíná v poloze 21 a končí v poloze 114 (První ”T” zbytek na 5*- konci odpovídá nukleotidu Číslo 3323, ^slední A“ zbytek na 3'-konci opodpídá poloze nukleotidu číslo 3461 plasmidu pN2gpt-S4).
Příklad 5
Exprese polypeptidů ve vektoru vakcínie (vdTK) přímou molekulární insercí kazet exprese genu
Tento příklad demonstruje snadnost, s níž mohou být klonované geny vloženy do vektoru (vdTK) viru vakcínie podle tohoto vynálezu při rychlém vytvoření konstrukcí exprese viru neštovic pomocí přímé' molekulární inserce kazet exprese genu popsaných v příkladu 4. Zde je popsáno použití systému vdTK vektor-kazeta pro vytvoření konstrukcí expresujíoích několik příslušných modelových polypeptidů včetně lidských krevních proteinů (protrombin a varianty plasminogenu) a antigenu lidského’viru (HIV gpl6O).
Konstrukce modifikovaného viru vakcínie (vPTl), který expresí poskytuje lidslsý protrombin: Lidský protrombin (PT) slouží jako model pro expresi cizího proteinu ve vektoru viru vakcínie pojíde tohoto vynálezu. Dříve bylo ukázáno, že cDNA kódující protrombin je expresovatelná konvenčně zkonstru ováným rekombinantním virem vakcínie, jak je to podáno v patentové přihlášce PGT/EP91/OO139 (Palkner a spol. (Falknerova přihláška”.), tento celý popis je zde zahrnut jako citace,
Modifikovaná protrombinová cDNA se vyštípne jako EcoPI fragment o 2000 párecl^ínukleotidů z plssmidu pTKgpt-PTH3b a vlo4 ží se do jedinečného EcoPJ místa plasmidu pAl-Sl (Příklad 4, obrázek 4.4). Získá se tak plasmid pAlSl-PT (obrázek 5*1)♦
V expresní kazetě tohoto plasmidu je protrombinová cDNA řízena syntetickým promotorem S1 viru neštovic, který také poskytuje translační iniciační kodon.
- 52 Sekvence lidského protrombinu je publikována: Degen
S. J. F., KíacGillivray R. T. A, a Davie E. í Biochemistry 22, 203? až 2057 (I5S3). Tato sekvence je dostupná z EM30 Data Library pod identifikátorem (ID) HSTER1. Sekvence v ID HSTHR1 není úplná. Chybí jí prvních 19 párů nukleotidů oblasti kódující protrombin. Autoři tohoto vynálezu sekvenovali chyoějící část cDNA v ID HSTHR1 a výsledek je zde uveden níže. Vzhledem ke mnoha modifikacím a změnám nukleotidů je úplná sekvence zde uvedeného cDNA klonu lidského protrombinu včetně S1 promotoru a dvaceti nukleotidů obklopujících sekvencí plasmidu uvalena v sekvenci identifikační číslo 15.
I
Konstrukčními stupni nastíněnými ve Falknerově přihlášce (PCT/EP-91/00139) se cDNA modifikuje následujícím způsobem: zavedou se dva další kodony (nukleotidy č. 22 až 27), což vede k inkorporaci dvou nových aminokyselin. 3'-Nepřekládaná sekvence se odstraní zavedením EcoRI místa: nukleotid Číslo 1963 až 1965 (č. 1920 až 1922 ID HSTHR1) se změní z TGG na GAA místně řízenou rnutagenesí.
Jedna změna pg/áů nukleotidů byla nelezena v PT-cDNA. To vede k novému místu Ng£l: nukleotid číslo 525 (číslo 482 v ID HSTHR1) je změněn na A z C. V tomto případě jde o tichou mutaci, protože kodon CCC (Pro) je změněn na CCA (Pro), což vede k novému místu Ncol. (První nukleotid sekvence identifikační číslo 15 z pAlSl-PT odpovídá nukleotidu číslo 2354, poslední nuldaotid odpovídá nukleotidu č. 4331 úplné sekvence plasmidu pAlSl-PT).
Pro přenos do vektoru vdTK vakcínie se kazeta vyštípne z plasmidu pAlSIPT působením endonukleas Notl a Rsrll a isoluje se po dělení na gelu nízkotajfcí agarosy. DNA vektoru vdTK viru se rozštěpí působením Notl a Rsrll, extrahuje se fenolem a vysráží se ethaholem. Během stupně srážení ethanolem se ztratí malý Notl-Hsrll spojující fragment násobného klonovacího místa DNA vektoru. Raménka vektoru vakcínie se ligují s dvacetinásobným molárním přebytkem kazety. Pakážování ligované DNA viru vakcínie pomocným virem drůbežích neštovic v kuřecích buňkách je popsáno v příkladu 3·
- 93 Pakážováné viry z plaků získaných infikováním CV-1 buněk
Virové isoláty se mohou dále analyzovat Southernovým blotováním a analýzou expresí, jak je to popsáno ve Falknerově přihlášce. Virový isolát, který má správnou genomovou strukturu pro inserci cDNA protrombinu, se označí vPTl. Podobný rekombinantní virus vakcínie, který se připraví získáním markéru, indukoval expresi protrombinu v buňkách Věro na úrovních aktivit asi 50 až 60 milijednotek/ml supernatantu buněčné kultury. Viz Palknerova přihláška.
Konstrukce viru vakcínie (vGPgl), který expresí poskytuje lidský glu-plasminogení Aminový konec přírodní formy plasminogenu (Pg) začíná aminokyselinou glu (glutamová kyselina). Nazývá se'proto glu-plasminogen (glu-Pg). Částečně opracovaná forma plasminogenu, které chybí prvních 77 aminokyselin na aminovém konci (aktivační peptid) se nazývá lysplasminogen (lys-Pg). Afinita lys-Pg k jeho substrátu fibrinu je mnohem vyšší než afinita glu-Pg. Navíc, rekombinantní lys-Pg je značně stabilnější než glu-Pg v supernatantech buněčných kultur infikovaných (konvenčním) rekombinantním rekombinantem vakcínie nesoucím gen glu-Pg.
Úplná cDNA lidského plasminogenu (včetně translačního start a stop kodonu) se vyštípne z plasmidů (phPlas-6) jako Ball-Smal fragment. Sekvence lidského plasminogenu již byla publikována Forsgrenem M, Radenem B., Israelssonem M., Larssonem K. a Hedenem L. 0.: FEBS Letters 213» 254 až 260 (1987). Je přístupná z EMBO Data Library (GenBank) pod identifikátorem (ID) HSPMGR. Sekvence tohoto piasmidu tedy nebyly zařazeny ve zde uvedené sekvenci, protože tento plasmid není jediným zdrojem sekvence DNA plasminogenu. Kódující oblast této sekvence plasminogenu se však liší od publikované sekvence alespoň v jednom nukleotidu: Zbytek “A” v poloze číslo 112 (ID HSPMGR) odpovídá zbytku ”G” v DNAzde uvedené, což znamená substituci aminokyslin (Lys^Glu).
cDNA plasminogenu se vloží do Hpal místa piasmidu
- 94 pN2gpt-S4 (příklad 4, obrázek 4.7), který byl vybrán pro zkonstruování kazety exprese genu se selektovatelným markérem, protože cDNA plasminogenu obsahuje dvě Apal místa a jedno Rsrll místo a nedovoluje tedy použít kazety exprese navržené pro násilné klonování. Výsledný plasmid byl označen pN2gpt-GPg (podle obrázku 5*2).
Oblast napojení promotoru S4 zahrnující iniciační kodon plasminogenu (nukleotid číslo 52 této sekvence, nukleotid číslo 55 v ID HSPMGR) je pro pN2gpt-GPg uvedena v sekvenci identifikační číslo 17. Kódující oblast glu-plasminogenu byla v seznamu sekvencí vynechána. Tato sekvence pokračuje stop kodonem (nukleotid ó, 35 této sekvence, nukleotid číslo 2485 v ID HSPMGR) a dvaceti pěti nukleotidy 3'-nepřekládané sekvence plasminogenu. Po této sekvenci následuje 29 nukleotidů násobného klonovacího místa phPlas6 a dvacet nukleotidů násobného klonovacího místa plasmidu pN2gpt-S4.
Aby se pře^dla kazeta genu glu-plasminogenu do genomu viru vakcínie, Notl fragment plasmidu pN2gpt-GPg, který obsahuje dva geny a jejich promotory (P7.5 promotor kontrolující gpt-selekční markér a S4-promotor kontrolující gen glu-plasminogenu), se isoluje z gelu nískotající agarosy a vyčistí se. Tato kazeta se liguje s raménky vdTK DNA viru vakcínie rozštěpené působením Notl. Pakážování a čištění přes plak je popsáno v příkladu 3. Virus, který má správnou strukturu vložené kazety genu plasminogenu, se označí vN2gpt-GPg. Tento virus se použije pro expresi plasminogenu v buňkách CV-1, jak je to popsáno pro analogický virus vakcínie zkonstruovaný technikami zíkání markéru. Sekretovaný glu-Pg v supernatantech buněčné kultury byl detegován na úrovni asi 1,5 ^ug/105 buněk 24 hodin po infikování konvenčně zkonstruovaným virem vakcínie za standardních podmínek kultivace vektorů viru vakcínie při expresi cizích proteinů v kultuře buněk. Glu-plasminogen v supernatantu kultury buněk byl detegovatelný pouze v přítomnosti inhibitoru proteasy (50 mikrogramů na mililitr aprotininu).
Konstrukce viru vakcínie (vLPgl), který expresí posky- 95 tuje lidský lys-plasminogen: Sekvence, která kóduje lysplasminogen, se připraví delecí oblasti o 251 páru nukleotidů kódujících prvních 77 aminokyselin (Glu 1 až Lys 77) plasminogenu z úplné cDNA plasminogenu, jak je to ukázáno na obrázku 5·5· Tato sekvence se vloží do kazety exprese genu z plasmidu (pN2gpt-S4), který má gen selektivního markéru (E. c°ll SPt). Získá se tak plasmid, který je označen pN2gpt-EPg (obrázek 5*5)·
V tomto plasmidu je presekvence (kódující signální peptid, který zprostředkuje sekreci) přímo napojen/na první nukleotid lysinového zbytku 73 v plasminogenu. Místo štěpení nového signálního peptidu vytvořené napojením, je podobné mnoha známým signálním místům Štěpení. Viz například von Heinje: Bur. J. Biochem. 155« 17 až 21 (1985).
Do místa iniciačního kodonu cDNA Pg bylo zavedeno také místo Ncol, aby se usnadnilo klonování do jediného Ncol místa plasmidu pN2gpt-S4 a aby se dosáhlo optimální souvi- . slosti promotoru s oblastí, která kóduje Pg. Aby se usnadnilo vyštěpení Pg cDNA působením Ncol, jedno ze dvou vnitřních míst Ncol míst (Ncol(2), obrázek 5*3) se deletuje z PgCDNA následujícím postupem.
Plasmid phPlasS se přenese do E. coli kmene NM522. Jednovláknová DNA se připraví superinfekcí pomocným fágem M15KO7. První kolo mutagenese se provede se dvěma oligonukleotidy, oNcol a oNco2. Použije se jednovláknová phPlas 6 DNA jako templát s komerčně dostupnou sestavou pro mutagenese (Amersham, lne·). OligonukleotiddftcoL převádí dva A-zbytky proti směru vlákna start kodonu plasminogenu na dva C-zbytky. Získá se tak Ncol místo kolem start kodonu bez měnění oblasti kódující presekvenci plasminogenu. Oligonukleotid oNco2 převádí T zbytek na C zbytek ve vnitřním Ncol místě (Ncol(2)) Pg cDNA. Dojde tak k tiché mutaci, která desaktivuje toto Ncol místo.
Kódující oblast aminokyselin 1 až 77 plasmi nogenu se
X—· deletuje ve stupni smyčkové mutagenese použitím oligonuk$6 leotidu oNco3 o 42 párech nukleotidů. Všechny mutace byly potvrzeny sekvenováním a restrikční analýzou.
Plasmid phLplas, který má tři mutace, se linearizuje působením Smál a částečně se rozštěpí působením Ncol. Isoluje se fragment Ncol-Smal o 2200 párech nukleotidů a vloží se do plasmidů pN2gpt-S4, který se rozštěpí působením Ncol a Smál. Výsledný plasmid se označí pN2gpt-LPg.
Kvůli mnoha modifikacím cDNA plasminogenu v pN2gpt-IPg jo úplná sekvence Ncol-Smal fragmentu plasmidů pLplas včetně dvaceti nukleotidů S4 promotoru a 20 nukleotidů plasmidové oblasti plasmidů pN2gpt-S4 po směrů, vlákna uvedena v sekvenci identifikační číslo 18. Sekvence cDNA plasminogenu byla modifikována následujícím způsobem: dva A-zbytky v polohách česlo 19 a číslo 20 (nukle^oidy číslo 55 a 5^ v ID HSPMGR) se změní na dva C-zbytky. Získá se tak místo Ncol. Nukleotid číslo 21 v tomto číslování (nukleotid číslo 55 v ID HSP MGR) znamená A-zbytek start kodonu plasminogenu, nukleotid číslo 2220 (nukleotid číslo 2435 v ID HSPMGR) znamená T-zbytek stop’kodonu, nukleotid číslo 111 v ID HSPMGR (nukleotid číslo 77 v tomto číslování) se napojí s nukleotidem číslo 543 v ID HSPMGR (nukleotid číslo 73 v tomto číslování). Dojde tak k deleci'sekvence kódující “aktivační peptid“. T-zbytek číslo 926 (nukleotid číslo 1191 v ID HSPMGR) še změní na C-zbytek (konzervativní výměna), což vede ke zmizení vnitřního místa Ncol.
Pro přenesení kazety genu lys-plasminogenu do genomu viru vakcínie se Nóbl fragment plasmidů pN2gpt-IPg, který obsahuje kazetu exprese genu obsahující dvě kombinace promotor-gen (Ρ?·5 promotor - gpt-gen a S4 promotor - gen lysplasminogenu) liguje s vdTK vektorovou DNA viru vakcínie rozštěpenou působením Notl a pakážuje se jak je to shora popsáno v příkladu 7· Isolát, který má příslušnou strukturu vložené kazety genu, označený vN2gpt-LPg, se použije pro expresi lys-plasminogenu v buňkách CV-1 za podmínce použitých dříve pro konvenčně zkonstruovaný rekombinant za standardních podmínek kultivace expresních vektorů viru
- 97 vakcínie. V buněčné kultuře se tak produkují proteiny. Sekretovaný lys-Pg v supernatantech buněčné kuhySry se deteguje na úrovni asi 1,0 až 2,0 buněk po dvaceti čtyř hodinách, od infekce konvenčním rekombinantem. Lysplasminogen v supernatantu buněčné kultury byl stabilní bez přidání inhibitoru proteasy.
Konstrukce viru vakcínie (vgpl60-l) pro přípravu glykopr oteinu 160, viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV gpl60)expresí: Úplná otevřená čtecí oblast glykoproteinu HIV gpl60 se získá na EcoEV fragmentu o 2500 párech nukleotidů vy štěpením z replikační formy (BP) DNA fágu M13 ImpPSenv, Puerst a spol.: Mol. Cell. Biól. 2, 2538 až 2544 (1987.3.
Tento fragment se vloží do plasmidu pN2gpt-S4, jak je to nastíněno na obrázku 5·4. Ve výsledném plasmidu pN2gpt-gpl60 je gen gpl60 kontrolován syntetickým promotorem S4 viru vakcínie·
Sekvence HIV gpl60 byla publikována Eatnerem I». a spol.: Nátuře 313. 277 až 284 (1985). Sekvence klonu BH8 je dostupná z EMBO Data Library (GenBank) pod identifikátorem (ID) HIVH3BH8. Proto není sekvence gp!60 zahrnuta v sekvenci identifikační číslo 19, ale oblast spojení S4 promotoru a EcoEI HIV-gpl60 fragmentu včetně iniciačního kodonu genu gpl60 (nukleotid číslo 28 v této sekvenci, nukleotid číslo 226 v ID HIVH3BH8) je uvedena. EcoEV HIV-gpl60 fragment se nachází proti směru vlákna od mpPEenv fágu M13 (replikační forma) , jak popisuje Puerst T. E., Earl P. a Moss B.:
Mol. Cell. Biol. £, 2538 až 2544 (1987). Tato sekvence pokračuje stop kodonem (nukleotid číslo 31 v této sekvenci, nukleotid číslo 2279 v ID HTVH3BH8) a polovinou EcoEV místa po směru vlákna. Po této sekvenci následuje dvacet nukleotidů násobného klonovacího místa plasmidu pN2gpt-S4. První nukleotid (T) této sekvence odpovídá nukleotidu číslo 3568, poslední nukleotid (G) odpovídá nukleotidu číslo 5973 v sekvenci pN2gpt-gpl60.
Při přenosu kazety exprese genu HIV gpl60 do genomu viru vakcínie se Notl fragment obsahující obě kombinace
- 98 gen-promotor (P7.5 promotor - gpt selekční markér a S4 promotor - gen gplSO) ligují s DNA vektoru vdTK víru vakcínie rozštěpenou působením Notl a pakážují se, jak je to popsáno v příkladu 7. Isolát, který má správnou strukturu insertu kazety, označený vN2gpt-gpl60, se použije pro expresi gpl60 v buňkách africké zelené opice (Věro) za podmínek, které byly dříve popsány pro konvenčně zkonstruovaný rekombinant (Barrett a spol.: AIDS Research and Húman Retroviruses 6,
159 až 171 (1989).).
Konstrukce vektoru viru vakcínie pro testování modifikovaných virů nesoucích inserce koinsercí lacZ genu: Pro testování inserce koinsercí E. coli lacZ genu v kombinaci s přístupem přímého klonování je užitečnou modelovou konstrukcí plasmid pTZgpt-S3AlacZ (obrázek 5.5)· Plasmid pTZ19R (Pharmacia, lne.) se rozštěpí působením Pvul.
Připraví se velký vektorový fragment o 2500 párech nukleotidů a ten se liguje s Notl linkery (Boehringery lne.). Výsledný plasmid pTZ_N má deleci násobného klonovacího místa, které je umístěno v sekvencích alfa doplňkového peptídu v plasmidů pT219E. Jsou proto vyloučeny možné rekombinaoe mezi sekvencemi alfa doplňkového peptídu a lacZ genem, který se má vložit do pTZ-N.
s
Při konstruování kazety exprese genu pro přímé molekulární klonování se Notl fragment o 1200 párech nukleotidů, obsahující kazetu gpt-genu a S3A promotor, vyštěpí z pN2gpt-S3A (příklad 4) a vloží se do pTZ-N. Získá se tak plasmid pTZgpt-S3A. EcoRI lacZ fragment o 5000 párech nukleotidů (vystřižený z plasmidů pTKgpt-Flspj Palkner a Moss: ’
1988.) se vloží do jediného EcoRI místa plasmidů pTKgpt-S3.
•AlacZ. Výsledný plasmid se označí pTZgpt-S3AlacZ.
Notl fragment tohoto plasmidů o 4400 párech nukleotidů, sestávající ze dvou genů markéru (E. coli gpt a lacZ), se liguje s DNA viru vdTK rozštěpené působením Notl (příklad 4). Podmínky ligace a pakážování jsou popsány v příkladu 3.
Odhadnutý výtěžek modifikovaných virů v případě gpt-selekce je popsán v příkladu 3·
- 99 Další vektor viru vakcínie byl zkonstruován následujícím způsobem. Plasmidy pTZS4-lacZa a pTZS4-lacZb poskytují užitečné modelové konstrukce (obrázek 5·6). Plasmid pTZN se zkonstruuje jak shora uvedeno. Kazeta exprese genu,
Notl fragment o 1200 párech nukleotidů obsahující kazetu gpt-genu a S4 promotor, se vystřihne z pN2gpt-S4 (příklad 4) a vloží se do pTZ-N. Získá se tak plasmid pTZgpt-S4. Smal-Stul lacZ fragment o 33θ0 párech nukleotidů se vystřihne z plasmidu placZN+, který byl zkonstruován štěpením plasmidu pPP-Zsart (evropská patentová přihláška č. 91 114 300.-6, Rekombinantní virus drůbežích neštovic) působením Notl a ligací pPP-Zsart s oligonukLeotidem P-Notl (5*-GG0CAT-3*). Tento Smal-Stul lacZ fragment o 33θθ párech nukleotidů byl vložen do jediného Smál místa plasmidu pTZgpt-S4. Výsledné plasmidy se označí pTZS4-lacZa a pTZS4-lacZb.
Notl fragment tohoto plasmidu o 4500 párech nukleotidů byl ligován s DNA viru vdTK rozštěpenou působením Notl a pakážován jak shora uvedeno.
Kombinace lacZ a gpt-selekce v jediném klonovacím stupni nepo^sytuje žádnou výhodu, protože všechny gpt-positivní plaky budou obsahovat lacZ gen. Pro konstrukci virů, které mají inserce v různých místech, je však žádoucí druhý způsob testování. Markérem, který sa vybere jako první (výhodnější), je gpt markér; lacZ testování nabízí alternativní způsob detekce insertů, například jestliže cílový virový genom již obsahuje kopii selektovatelného markéru, jako je například E. coli gpt gen.
Při tomto testována, se dva ml zředění 1 : 10^. 1 : 100, resp. 1 : 1000 surových virových kmenů připravených po pakážováni (viz příklad 3 výše) vysejí na třicet velkých (o průměru 8,5 om) Petriho misek (10 Petriho misek pro jedno zředění).
Test modrého plaku se provádí podle standardních postupů (Ohakrabarti S., jorechling K. a Moss 3.: Mol. Oell. Biol, í, 5*05 až 5*09 (1935).).
- 100 Příklad 6
Konstrukce vektoru (vS4) viru vakcínie s řídícím hlavním klonovacím místem za transkripcní kontroly silného pozdního promotoru viru vakcínie
Tento příklad popisuje klonovací vektor (vS4) viru vakcínie, který je navržen pro přímnu molekulární insercl úplné čtecí oblasti (otevřené čtecí oblasti) do hlavního kloňovacího místa, které je funkčně navázáno na promotor viru vakcínie. Použití tohoto vektoru podle způsobů, podle tohoto vynálezu umožňuje inserci genů. přímo do vektoru viru neštovic bez odděleného zkonstruování insertního plasmidů, jak je to potřebné při konvenčním konstruování rekombinantních virů. neštovic intracelulární rekombinací. Tento vektor také obchází potřebu odděleného zkonstruování kazety exprese genu pro přenos do vektoru viru vakcínie přímou molekulární insercí, jak je to shora popsáno.
Hlavní klonovací místo vektoru S4 je umístěno v geneticky stabilní centrální oblasti genornu viru vakcínie a obsahuje několik míst štěpení, která jsou jedinečná v tomto vektoru, což umožňuje přímou inserci. S4 promotor bezprostředně proti směru vlákna hlavního klonovacího místa je silná syntetická varianta pozdního promotoru viru vakcínie.
Tento expresní vektor je vhodný pro přímé klonování a pro expresi velkých otevřených čtecích oblastí, které obsahují transSlJpní start kodon, jak je to zde ilustrováno cDNA, která kóduje lidský krevní protein, von Willebrandův faktor (virVF).
Konstrukce vektoru vS4 viru vakcínie: Adaptor, který obsahuje syntetický promotor S4 viru vakcínie, se vloží do vektoru vdTK viru vakcínie (příklad 4, obrázek 4.1) v jedinečné)® místě Notl (obrázek 6.1). Inserci se aesaktivuje místo Notl proti směru vlákna, zatímco místo Notl po směru vlákna zůstává funkční jako jedinečné klonovací místo.
Podrobněji - DNA (1 /Ug) vektoru vdTK (příklad 4, obrázek 4.1) se rozštěpí působením Notl a liguje se s (0,5 yug) anelovanými oligonukleotidy P-artP(ll)
- 101 (sekvence identifikační číslo 33) θ P-artP(12) (sekvence identifikační číslo 39)· Ligační směs se pakážuje a plaky se identifikují jak je to popsáno v příkladu 3. Plaky se PCRtestují jak shora popsáno (příklad 4, identifikace viru vdTK PCR testováním). Isolát, který má insert se správnou orientací, se označí vS4.
Inserce cDNA von Willebrandova faktoru do vS4: Plasmid pvWF obsahuje úplnou cDNA von Willebrandova faktoru obklopenou místy Notl. Sekvence lidského vWP byla publikována: Bouthron D. a spol.: Nucl. Acids Res. 14. 7125 až 7128 (1986). Tato sekvence je dostupná z EMBO Data Library pod identifikátorem (ID) HSVWPR1. Sekvence identifikační číslo 20 ukazuje napojení v genomu viru wWP virového S4 promotoru a 5'-nepřekládané oblasti cDNA vWP v plasmidu pvWF až translačnímu start kodonu (nukleotid číslo 249 v této sekvenci, nukleotid číslo 100 v ID HSVWPR1). Oblast kódující vWP byla v této sekvenci vynechána. Sekvence pokračuje stop kodonem (nukleotid číslo 252, nukleotid číslo 8539 v ID HSVWPR1) a 3'-nepřekládanou sekvencí až k Notl místu (nukleotid číslo 304) a dvaceti nukleotidy překryvu s 3'-oblastí wWF virového genomu.
vWP cDNA fragment se uvolní působením Notl, isoluje se a liguje s vS4 vektorovou DNA, která je rozštěpena působením Notl a zpracována s fosfatasou, jak ilustruje obrázek 6.2.
Jeden mikrogram ligováné DNA se pakážuje jak je to popsáno v příkladu 7. Plaky se vyberou a analyzují se PCRtestováním. Prvním primerem pro PGR reakci je oligonukleotid odTK2, který je umístěn asi 3θ° párů nukleotidů proti směru vlákna tk-genu, reversní primer ovWPl je umístěn v genu vOT asi 50 párů nukleotidů po směru vlákna iniciačního kodonu. K PGR amplifikaci dochází pouze tehdy, jestliže vWP insert má správnou orientaci vzhledem k S4 promotoru ve vektoru. PCR-positivní plaky se identifikují a dále se analyzují. Jestliže výtěžek žádaného modifikovaného viru je nízký, řádově 0,1 až 0,01 %, potom mohou být identifikovány
- 102 in šitu způsoby hybridizace plaků přizpůsobenými podle těoh, které jsou známy z literatury. Viz například Villareal I».
P, a Berg P.í Science 196. 183 až 185 (1977)·
Virový klon, který má cDNA insert podle PCR nebo hybridizace a který vykazuje očekávanou restrikční sestavu při štěpení působením PvuII, se označí wTO. Takové vektory se mohou testovat na expresi von Willebrandova faktoru způsoby, jak je to popsáno pro jiné lidské proteiny v příkladu 5, upravenými podle příslušných zásad genetického inženýrství, které jsou dobře známy odborníkům.
Příklad 7
Heterologní pakážování genomové DNA viru neštovic (vakcínie) pomocným virem ptačích neštovic (drůbežích neštovic) a současná selekce modifikovaného viru v hostitelských buňkách druhů, v nichž se pomocný virus nemůže replikovat.
Příklad 3 popisuje pakážování modifikované DNA viru vakcínie pomocným virem drůbežích neštovic v ptačích bufu kách a následnou isolaci plaků progenu viru v savčích (ČV-1) buňkách, v nichž se pomocný virus ptačích neštovic nemůže replikovat. Tento příklad ilustruje pakážování DNA viru vakcínie drůbežími neštovicemi přímo v CV-1 buňkách, čímž se umožní současné pakážování a výběr hostitele pro pakážovaný virus. Vedle eliminace původního^viru^pomocného knene progenu, tento postup obchází požadavek přípravy primárních kultur fibroblastů kuřecího zárodku pro každý pokus pakážování. Místo toho se také mohou pro pakážování viru vakcínie pomocným virem drůbežích neštovic použít kontinuální savčí buněčné linie, které se obvykle používají pro replikaci viru vakcínie.
Je známo, že virus drůbežích neštovic (FPV) se replikuje v ptačích buňkách, žádný živý progenový virus nebyl získán z infikovaných savčích buněk. Přesný bod v životním cyklu ÍPV, při němž dochází k selhání replikace v savčích buňkách, není známý. Je však známo, že PPV produkuje v sav- Křáčích buňkách, virové proteiny a dokonce indukuje ochrannou imunitu, jestliže se používá jako živá vakcína (Taylor a spol.: Vaccine 6, 497 až 505 (1988). Nicméně však dosud nebylo ukázáno, že TTV má schopnost pakážovat heterologní genomovou DNA viru neštovic, zvláště přímo sestavenou DNA viru vakcínie.
V původním pokusu se 07-1 buňky (5·10 ) infikují jednou plak tvořící jednotkou (pfu) na buňku viru drůbežích neštovic (kmen HP1.441) a inkubují se jednu hodinu. Potom se sraženina fosforečnanem vápenatým (jeden mililitr obsahující jeden mikrogram DNA viru vakcínie přírodního typu) transfektuje do infikovaných buněk. Po patnácti minutách za teploty místnosti se přidá 10 ml media (DMEM, 10 % plodového telecího sera). Buňky se inkubují čtyři hodiny a medium se vymění. Buňky se pak inkubují šest dnů. Připraví se tak surový virový kmen. Progenový virus se titruje na C7-1 buňky. Typické plaky vakcínie byly viditelné po dvou dnech.
Závislost účinnost pakážování na množství genomové virové DNA byly stanovována pro DNA v množstvích od 0,1 do 10 mikrogramů na 5·10 07-1 buněk. 7iz obrázek 7·1· Množství
DNA více než 1 mikrogram (například 10 mikrogramů) poskytovala surovou sraženinu fosforečnanem vápenatým, což snižuje účinnost transfekce v hodnotách pfu//Ug vnesené DNA. 7iz obrázek 7.1.
výtěžku
Závislost‘v$akážovaného viru vakcínie na době inkubace pakážování bylyt analyzována s použitím konstantního množství DNA viru vakcínie přírodního typu (1 ^ug) a konstantního množství pomocného viru EF7 (1 pfu/bunku) za shora popsaných podmínek pro původní pokus v tomto příkladu s tím, že medium přidané 15 minut po transfekcí bylo vyměněno po čtyřech hodinách a že buňky byly potom inkubovány další jeden až pét dnů před přípravou surového virového kmene (celkový objem 2 ml). 7irový kmen z kontrolních biSěk infikovaných pouze EPV a inkubovaných pět dnů neposkytl žádné viditelné plaky. Tento pokud byl třikrát zopakován. Typický výsledek je uveden níže v tabulce 7·!·
- 103 Tabulka 7·1
Vliv inkubační doby na výtěžek viru vakcínie z DNA pakážování pomocným virem drůbežích neštovic v savčích (GV-1) buňkách
inkubační doba (hodiny) titr (pfu/ml)
24 1,0.102
43 4,6.104
72 5,0.105
96 5,6.106
120 2,1.107
Titr pakážovaného viru vakcínie, detegovaného analýzou plaku na savčích (CV-1) buňkách, se postupně zvyšoval o
od asi 10 plak tvořících jednotek na ml po 24 hodinách do asi 2.10' po 120 hodinách. Inkubační doby v rozmezí od 48 do 72 hodin poskytovaly vhodné hladiny pakážovaného viru vakcínie (mezi 104 a 106 pfu/ml) a jsou tedy vhoEjáé pro rutinní pakážování DNA viru vakcínie virem drůbežích neštovic v savčích buňkách.
DNA vakcínie máže být pakážována v savčích buňkách nepodařeně infikovaných virem drůbežích neštovic. Již bylo ukázáno, že virus drůbežích neštovic může infikovat také savčí buňky, ale virový životní cyklus není v těchto netypických hostitelských buňkách úplný. Podle typu buněk se virový růst zastaví bud v časném nebo v pozdním stupni a nevytvoří se životaschopný virus drůbežích neštovic (Taylor a spol., 1988.). Tato zjištění byla příčinou výzkumu pakážování DNA vakcínie v kontinuální savčí buněčné linii.
Konfluentní monovrstvy buněk GV-1 se infikují 0,05 pfu. ns buňku EPV kmene HP1.441. Potom se transfektují ligační směsí sestávající z DNA viru vakcínie rozštěpené působením Notl. Podrobněji - DNA vakcínie (1 mikrogram) se rozštěpí působením Notl a liguje se s uvedenými množstvími DNA (kazeta P7.5 gpt genu). Jedinečné místo Notl ve viru vakcínie je umístěno v intergenové oblasti v Hindlll E fragmentu
- 104 (Goebel a spol.: Virology 179, 247 (1990).). Po třídenní inkubaci se buňky isolují a surový virový kmen se titruje na GV-l-buňkách v přítomnosti (+MPA) a v nepřítomnost (-MPA) gpt-selektivního media. Výsledek je souhrnně uvg^fenv tabulce 7.2.
Tabulka 7.2
Titry po nezdařeném pakážování
pokus č. insert (ng) titry (pfu. 10-2/5.buněk) chiméry W
- MPA+ + MPA
1 200 17,2 1,6 9,3
2 200 42,5 5,1 12,3
3 400 64,0 3,8 5,9
4 400 26,8 3,8 14,2
5 210,0
+ MPA znamená mykofenoiová kyselina
Nejdůležitějším výsledkem bylo, že virus drůbežích neštovic by mohl pakážovat modifikovanou DNA vakcínie v buněčném typu, který brání jeho vlastnímu růstu. Navíc, výtěžek chimerních plaků byl v rozmezí 5 až 10 %. Toto srovnání je příznivé ve srovnání s klasickou in vivo rekombinační technikou, při níž obvykle asi 0,1 % z celkového množství plaků jsou rekombinanty. Ligace vektorových ramének samotných (tabulka 7.2, pokus č. 5) vede k vyššímu titru při srovnání s ligačními pokusy 1 až 4 s insertem, možná proto, že chybějí znečištěniny, které jsou přítomny v molekulách insertu vyčištěných na agarose.
Některé z isolovaných virů byly vyčištěny přes plak a byly dále charakterizovány. Vykazovaly typické HindlII restrikční sestavy viru vakcínie a navíc pásy cizího genu charakteristické pro dvě možné orientace jediného insertu.
Při inserci do místa Notl nebyl pozorován žádný virus s násobnými inserty.
Heterologní pakážování chimerní viry vakcínie se
- 105 nehybridizují zkříženě s virem drůbežích neštovic. Pro studium vlivů, heterologního pakážování virem drůbežích neštovic (EPV) na strukturu chimerních virů vakeínie se DNA isolátů F13.4, Ρ12.5» 213*2 a P12.4 spolu s DNA čtyř vyčištěných isolátů z Notl klonovacího pokusu a kontrol viru drůbežích neštovic rozštěpí působením HindlII. Výsledné fragmenty se rozdělí elektroforesou a analyzují se Southernovou hybridizací sondou viru drůbežích neštovic připravenou z viri^onů vyčištěných přes gradient sacharosy. Nebyla pozorována žádná zkřížená hybridizace viru vakeínie s PPV DNA.
Příklad 8
Homologní pakážování sestavené DNA viru vakeínie mutantem hostitelské oblasti viru vakeínie (vdhr), který není schopen replikace v lidské buněčné linii
Tento příklad ilustruje konstrukci a využití pomocného viru neštovic obsahující delece, které omezují jeho hostitelský rozsah, zvláště schopnost replikovat v jistých buněčných liniích. Modifikovaný virus vakeínie bez pomocného viru lze připravit pakážováním vektorové DNA s tímto mutantním pomocným virem a isolováním klonů sestaveného viru infikováním příslušných lidských buněk.
'^ento mutantní pomocný virus je odvozen od mutantů hostitelské řady viru vakeínie, které nejsou schopny replikovat se v různých lidských buňkách a které mají pozměněné cytopathické účinky na mnoho jiných buněk, jež jsou dovoleny pro infekci přírodním virem vakeínie (viz například Drillen a spol.: Virology 111« 488 až 499 (1981).). Podrobněji řečeno - genom tohoto pomocného viru obsahuje mutace dvou genů hostitelských oblastí, které společně zabraňují replikaci v lidských (MHO 5) buňkách, v nichž pouze genomy viru vakcíoie mají alespoň jeden neporušený gen hostitelské oblasti, který může replikovat.
Konstrukce mutovaného viru vakeínie hostitelské oblasti vdhr: Genomové umístění a DNA sekvence jednoho genu viru
- 106 vakcínie potřebného pro replikaci v lidských buňkách byla popsána Gillardem a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83. 5573 až 5577 (1936). V nedávné době byl tento gen označen Kil (Goebel a spol.: 1990.). Byl zmapován druhý gen hostitelské oblasti viru vakcínie (Perkus a spol.: J. Virology
3329 až 3833 (1990)·) . Tg£to druhý gen (označený podle Goebela a spol. (1990) jako 071») leží v oblasti zahrnující části HindlII G a HindlII N fragmentů. Tato oblast je deletována ve viru vakcínie kmene WR6/2 (Moss a spol.: J. Virol.
40. 337 až 395 (1931)·)· Kmeni WR6/2 tedy chybí gen G7L hostitelské oblasti.
Pomocný virus, jemuž chybí jak ώ tak G7L gen oblasti hostitelů, se zkonstruuje z C7L-negativního kmene 0-6/2 získáním markéru s modifikovaným scoRI K fragmentem, z něhož je deletován KIL gen hostitelské oblasti. Viz obrázek 8.1. Tento modifikovaný EcoRI K fragment obsahuje gen selektivního markéru (Ξ. coli gpt gen), který usnadňuje selekci modifikovaných 0-6/2 genomů obsahujících modifikovaný EcoRI K fragment využitím intracelulárního získávání markéru, jak to popsali Sam a Dumbell (1981). Podmíněný lethální mutant, kterému chybí schopnost růst na lidských buněčných liniích, byl popsán také Perkusanem a spol. (1989).
DNA/
Podrobněji - EcoRI K fragment viru vakcínie přírodního typu je subklonován do plasmidu pPR-tkl8i. Výsledný plasmid se označí pPP-EcoKl. Gen KIL hostitelské oblasti viru vakcínie (Gillard a spol. 1986) se deletuje. Současně se zavede jedinečné místo Notl smyčkovou mutagenesí pomocí oligonukleotidu P-hr(3) (sekvence identifikační číslo 42). Výsledný plasmid se označí pEcoK-dhr.
Plasmid pFP-tkl8i se zkonstruuje modifikací plasmidu pPP-tk-10.4 (viz Falkner a spol.: Evropská patentová přihláška číslo 89303337.7, publikovaná evropká patentová přihláška O 338 801, příklady 3 a 8} celý objev teto přihlášky je zde zahrnut jako odkaz). Plasmid pPP-tklO.4 se rozštěpí působením Ncol a liguje se s adaptorem obsahujícím anelované nukleotidy P-Ncol(l) a P-Ncol(2). Výsledkem je zavedení
- 107 násobného klonovacího místa do jediného Nco místa FPV tk-genu s místy štěpení restrikčními endonukleasami EcoHI, Notl a Hindlll.
Sekssňce viru vakcínie byla publikována Goebelem S. J. a spol.: Virology 179. 247 až 26ó (1990). Je dostupná z ”EM30 Data Library (GenBank) pod číslem M35027. Sekvence genu KIL hostitelského rozmezí viru vakcínie byla publikována Gillardem S. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83. 5373 as 5577 (1986) a je dostupná z EmBQ Data Library” pod identifikátorem (ID) PXVACIviHO. Kódující sekvence genu KIL tedy není zahrnuta v sekvenci identifikační číslo 21.
Gen KIL v pEcoK-dhr je delětován a je nahrazen Notl místem. Oblast napojení mezi PXVACMHC sekvencí a vloženým Notl místem (nukleotidy Číslo 1 až 20 této sekvence odpovídají nukleotidům čísla 72 až 91 v ID PXVACMHC). Oblast kódující KIL se deletuje a nahradí se Notl místem následovaným dvěma G zbytky (nukleotidy číslo 21 až 3θ v této sekvenci). Sekvence obsahuje obklopující oblast o 20 párech nukleotidů (nukleotidy číslo 31 až 50 v této sekvenci, nukleotidy č.
944 až 963 v ID PXVACMHC).
V dalším stupni se pEcoK-dhr linearizuje působením Notl a liguje se s kazetou P7*5-gpt-gen e 1100 párech nukleotidů odvozenou od plasmidu pN2-gpta (příklad 4) štěpením působením Notl. Výsledný plasmid pdhr-gpt se použije pro generaci pomocného viru vdhr.
Kazeta Notl (obsahující kazetu P7.5 promotor - gpt-gen) vložená do pEcoK-dhr a 20 nukleotidů 5'- a 3'-obklopujících oblastí jsou pro pdhr-gpt uvedeny v sekvenci identifikační číslo 22. Obklopující oblast (nukleotidy číslo 1 až 20 této sekvence) odpovídá nukleotidům číslo 72 až 91 v'ID PXVACMHC (viz sekvence identifikační číslo 21 pro EcoK-dhr). Vložená DNA sekvence začíná v poloze 21 (první ”G”-zbytek místa Notl) a končí v poloze 1139 (poslední C-zbytek místa Notl). A-zoytek translačního iniciačního kodonu gpt-genu odpovídá poloze číslo 548. T-zbyek translačního stop kodonu gpt-genu odpovídá poloze číslo 1004. Sekvence obsahuje
- 108 dvacet nukleotidů, obklopující oblasti (nukleotidy číslo 1192 až 1209 této sekvence, nukleotidy číslo 944 až 961 v ID PXVACMHC). Dva G zbytky číslo 1190 a 1191 této sekvence odpovídají polohám 29 a 30 vpEcoK-dhr.
Při přenosu EcoK fragmentu do viru vakcínie se plasmid transfektuje do primárních fibrablastových buněk kořecího zárodku infikovaných delečnim mutantem viru vakcínie WR-6/2. Modifikované viry se vyberou jako gpt-positivní (pomocí mykofenolové kyseliny). Gpt— positivní viry se vyčistí přes plak (třikrát)) v CEP buňkách a označí se vdhr.
Charakterizace pomocného viru vdhr: Struktura gpt-positivního viru vakcínie vdhr se analyzuje Southernovým blotováním a testy hostitelské oblasti. Virus vdhr je schopný tvořit plaky na fibroblastech kuřecího zárodku a na dvou opičích buněčných liniích (BSC40 a Věro), ale je defektivní při replikaci v lidské buněčné linii MRC-5.
Pakážování vestavené DNA viru vakcínie využitím mutantu hostitelské oblasti vdhr jako pomocného viru. Konstrukce pro expresi cDNA, která kóduje lidský protrombin, demonstruje užitečnost tohoto přístupu. Produkt z ligační směsi popsané v příkladu 5» obrázek 5·1, se transfektuje do fibroblastů kuřecího zárodku infikovaných vdhr jako pomocným virem. Po dvou dnech se buňky isolují a připraví se surový virový kmen. Pakážovaný virus se testuje tvorbou plaků na lidských (MRC 5) buňkách, v nichž žádaný virus vakcínie replikuje, ale mutovaný vdhr pomocný virus nereplikuje.
Po třech dnech se buňky obarví neutrální červení. Vyberou se plaky pro další analýzu Southernovým Plotováním. Identifikují se modifikované klony viru vakcínie, které mají žádoucí strukturu. Očekávány jsou také viry, které podlehly rekombinaci s vysoce homologním pomocným virem.
Příklad 9
Konstrukce nových chimerních virů vakcínie kódujících HIV ΒΡίβΟ (vP2-gpl50tsHA . vP2-splS0Ii:1TB a vselP-gplSOffl,) a
- 109 exprese rekombinantů gpL60^ v buňkách Věro
Tento příklad ilustruje konstrukci HIV-1^ isolátu přímým molekulárním klonováním rekombinantů viru vakcínie pro přípravu gpl60 ve velkém měřítku. Příprava gpl60 isolátu . ^^IHB’ P°Psana Ratnerem a spol.: Nátuře 315. 277 až 284 (1985), využitím konvenčně zkonstruovaného expresního vektoru viru vakcínie, byla popsána Barrettem a spol.: AIDS Research and Human Retroviruses 159 až 171 (1989).
Isolát HlVjj-j-g je však vzácnou variantou. Úsilí vyvinout vakcíny, kterou jsou založeny na HIV obalových proteinech, by mělo zahrnovat representativnější HIV-1 isoláty, jako je například MN-isolát. Gurgo a spol.: Virology 164. 531 až 53θ (1988), Carrow a spol·: Aids Research and Human Retroviruses 2.9 831 až 839 (1991)· Zde uvedené vektory viru vakcínie byly proto zkonstruovány přímým molekulárním klonováním tak, aby expresí poskytovaly gpl60 protein HIV^ isolátu.
Konstrukce plasmidu pP2-gpl60^ a chimerních virů vP2-gptl60]fflT a vP2-gpl6O2fljjB: Strategie vložení gpl60-genu do viru vakcínie zahrnuje: i) modifikování gpl60-genu odstraněním velké 5'-nepřekládané oblasti (5'-8TR) a zavedení vhodného klonovacího místa proti směru vlákna start kodonu, ii) klonování modifikovaného gpl60-genu po směru vlákna silného pozdního P2-promotoru viru drůbežích neštovic (evropská patentová přihláška č. 91 114 3θΟ·-β, 26. srpna 1991) a iii) vložení fragmentu se zarovnaným koncem, který obsahuje kazety P2-gpl60 a P7.5-gpt-gen, do jediného místa štěpeni restrikční endonukleasou příslušných kmenů virového hostitele, například do Smál místa hostitelského kmene vdTK vakcínie (příklad 4), Smál nebo Notl míst kmene WR 6/2 vakcínie (Moss a spol.: J. Virol. 40, 387 (1981).) nebo kmene ’<VR vakcínie přítodního typu.
Pro tyto účely se zavede nové Smál místo do plasmidu pN2gpt-S4 (příklad 4). Výsledkem je plasmid pS2gpt-S4 (0brázek 9.1, sekvence identifikační číslo 62). Potom byl S4 promotor vyměněn za P2-promotor. Získal se tak plasmid
- 110 pS2gpt-P2 (sekvence identifikační číslo 63). Tento plasmid umožňuje klonování úplné otevřené čtecí oblasti (orfs), ale může být použit také pro klonování neúplné orfs, které chabí její vlastní start kodon. Start kodon se získá například tak, že se klonuje do jediného Ncol místa (GCATGG) tohoto plasmidu. Konstrukce plasmidů a virů je podrobné popsána níže. Při modi^aci gploO-genu se PGR-generováný sousední fragment změní na kazetu gp -160-genu s minimálním 5*-NTR. Tato kazeta je přítomna v konečné konstrukci, plasmidu pP2-gpl60yy (obrázek 9*1» sekvence identifikační číslo 69). Další vlastnosti plasmidu jsou uvedeny v následující tabulce.
Plasmid pP2gpl60mn (6926 párů nukleotidů) (sekvence identifikační číslo 69)í umístěni popis až 3529 2396 až 2851 2851 2395
308Ů až 3323 3358 až 3526
3534 až 6001
3534
6102
6173 až 6926 pS2gpt-P2 sekvence rcCDS E. coli gpt genu
T rc iniciačního kodonu TAG gpt genu A rc stop kodonu TTA rc P7.5 promotoru vakcínie sekvence P2 promotoru podle evropské přihlášky Avipox Intergenic region
ODS HIV-l kmene MN gpl60 sekvence (EMBL:
ID ΒΕΞ3ΠΥΜΝ0)
A iniciačního kodonu ATG z gplGOMN T stop kodonu TAA z gpl60MN pS2gpt-P2 sekvence
Plasmidy byly zkonstruovány následujícími postupy.
Plasmid pS2gpt-S4: Plasmid pN2gpt-S4 (příklad 4) se rozštěpí půsonením Kbal a liguje se Smal-adaptorem (sekvence identifikační číslo 4pí 5'-CTAGCCGGGG-3') deaktivujícím místo Kbal a tvořícím místo Smál. Výsledný plasmid se označí pi32gpt-S4 (sekvence identifikační číslo 62). Další vlastnosti plasmidu jsou uvedeny v následující tabulce.
- 111 Basmid pS2gpt-S4 (4145 párů nukleotidů) (sekvence identifikační číslo 62) umístění: popis:
až 2226 pN2gpt-S4 sekvence sekvence identifikačního čísla 14. Poloha 1 odpovídá prvnímu nukleotidu G 5'-TGGGAGTTT TCGGGGAAAT-3*.
2227 až 2236 Smal-adaptor 5'-CTAGGGGGGG-3'
2396 až 2851 rcCDS E.coli gpt genu
2851 T re iniciačního kodonu TAC gpt genu
2395 A rc stop kodonu TTA
3081 až 3323 rc P7.5 promotoru vakcínie
3356 až 3451 S4-promotor sekvence identifikační číslo 14 (oligonukleotid P-artP(9) viz strana 3-2 )
2237 až 4145 pN2gpt-S4 sekvence sekvence identifikačního Čísla 14
Plasmid pS2gpt-P2: S4-promotorový segment piasmidu pS2gpt-S4 se odstraní štěpením působením Pstl a Hpal a nahradí se Pstl-Kpal P2-promotorovým segmentem o 172 párech nukleotidů. Tento promotorovy segment se generuje PGR plasmidem pTZgpt-P2a (Palkner a spol.: evropská patentová přihláška číslo 91 114 300.-6, 26. srpna 1991) jako templát a oligonukleotidý P-P2 5*(1) a P-P2 3*(1) jako primery. PGR-produkt byl rozštěpen působením Pstl a Hpal a ligován s velkým fragmentem piasmidu pS2gpt-S4 rozštěpeným působením Pstl a Hpal. Sekvence P-P2 5*(1) (sekvence identifikační číslo 44) je: 5'-GTACGTAGGG GTGGAGTTGT TAGAGGTTGG TATAGGGGAG AACTAAG-3Í sekvence P-P2 3*(1) (sekvence identifikační číslo 45) je: 5'-TGTGAGTGAC GTTAAGGATT TATAGGGTAT AAAAAATAGT ATTTTGTACT-3'. Přesná sekvence PGS fragmentu byla potvrzena sekvenováním konečného piasmidu, označeného pS2gpt-P2 (sekvence identifikační číslo 53). Jako sekvence primeru byla použita P-SM(2) (sekvence identifikačníčíslo -s), 5' —GTG TTG AGT ATT GGT ATT AG-3'a P-SM(3) (sekvence identifikační číslo 47), 5'-CGA AAC TAT GAA AAC GGT TTA TG-3'. Další vlastnosti piasmidu pS2gpt-P2 jsou uvedeny v následující tabulce.
- 112 Plasmid pS2gpt-P2 (4277 párů nukleotidů) (sekvence identifikační číslo 63) umístění_ až 3357 2306 až 2851 2851 2395
3081 až 3523 3358 až 3526
3527 až 4277 popis_ pS2gpt-S4 sekvence rcGDS E. coli gpt genu
T rc iniciačního kodonu TAG gpt genu A rc stop kodonu TTA rc P7.5 promotoru vakcínie sekvence P2 promotoru podle evropské přihlášky Avipox ”intergenie region pS2gpt-S4 sekvence
Plasmid pMNenv2: Plasmid pMNenvl poskytl R. Gallo (National Oancer Institute, Bethesda, Maryland).· Obsahuje gpl60-gen ΗΓ7 MN-kmene klonovaného jako EcoRI-PvulI fragment o 3100 párech nukleotidů ve vektoru pSP72 (Promega, lne·). EcoRI-Asp718 fragment o 600 párech nukleotidů z pMNenvl se nahradí EcoRI-Asp718 fragmentem o 130 párech nukleotidů.
Odstraní se tak velké části 5'-nepřekládané oblasti gpl60genu. Tento fragment o 130 párech nukleotidů se generuje PCR použitím plasmidů pMNenvl jako templátu a oligonukleotidů P-MN(l) a P-MN(2) jako primerů. První primer P-MN(l) zavedl navíc místo Stul jeden pár nukleotidů proti směru vlákna start kodonu. Sekvence P-MN (1) (sekvence identifikační číslo 48) je sekvence 5'-AGCTAGCTGA ATTGAGGGGT CATGAGAGTG AAGGGGATCA GGAGGAATTA TCA-3Í sekvence P-MN(2) (sekvence identifikační číslo 49) je sekvence 5'-GATCTGATGC AGAAAATAGA GTGGTGGTTG-3'. Výsledný plasmid se označí pMNenv2. Pro vyloučení mutací byl PGR generovaný fragment in tomto plasmidů sekvenován primery P-seq (2) (sekvence identifikační číslo 50) 5'-GTG TGG GTA GAG AGG CTT GTG TGG GGC-3' a P-Seq(3) (sekvence identifikační číslo 51) 5'-GAA TTT TTG TGT AGC ACT AGA GAT G-3'.
Plasmid pP2-gpl60MN: StuI-PvuII fragment o 2700 párech nukleotidů obsahující MN gpl60-gen, který byl isolován z plasmidů pMNenv-2, se vloží do Hpal místa plasmidů pS2gpt-P2. Získá se tak plasmid pP2-gpl60MN (sekvence identifikační číslo 69).
- 113 Chimerní viry vP2-gpl60^A a vP2-gpl60iflNB byly zkonstruovány následujícím postupem? Smal-fragment, který obsahuje kazety P2-gpl60 a p7.5-gpt-gen, se vloží přímým molekulárním klonováním do jediného Smál místa hostitelského kmene vdTK vakcínie (příklad 4). Získají se chimerní viry vP2-gpl6QMřJA a vP2-gpl60^B (obrázek 9.2). vdTK viru vakcínie z příkladu 4 se rozštěpí v Jediném Smál místě a lisuje se se SmaJ^ fragmentem o 4000 párech nukleotidů, který obsahujerP7.5gpt gen a P2-gpl60-gen. Kmen WR 6/2 vakcínie se rozštěpí v jediném Smál místě (Notl) a liguje se se Smál (Notl) fragmentem o 4000 párech nukleotidů, který obsahuje kazety 1’7.5-SP‘b-gen a P2-gpl60-gen. Postupy klonování jsou shora popsány v příkladu 1. Ve viru vP2-gpl60^A se gpl60-gen trabskribuje ve stejném směru jako geny kolem virového genu thymidin-kinasy. Ve viru vP2-gpl60^3 se gen gpl60 transkribuje v opačném směru. Jelikož vlivy polohy genu mohou ovlivnit hladiny exprese v konstrukcích vakcínie, Smál (Notl)-fragqient se také vloží (obsahující kazety p2-gpl60 a P7.5-gpt-gen) do Smál (Notl) místa kmene WR 6/2. Pakážování in vivo se provádí podle shora popsaného příkladu 3.
Struktura chimerních virů: Pro potvrzení teoretických struktur chimerních virů (obrázek 9· 3) byla provedena analý*· za Southernovým blotováním. DNA vyčištěných virů se roštěpí působením Pstl. Výsledné fragmenty se rozdělí na agarosovém gelu, přenesou se na nitrocelulosovou membránu a hybridizují se sondou genu thymidin-kinasy (tk) a gpl60-genu.
U sondy tk-genu v případě vP2-gpl60iv-^A jsou viditelné předpověděné fragmenty o 6900 párech nukleotidů a 14 300 párech nukLeotidů. U vP2-gpl60Ii(4ÍÍB jsou viditelné předpověděné fragmenty o 8700 párech nukleotidů a 12 500 párech nukleotidů. U sondy Ejgl60-genu (phN envl) je viditelný předpověděný fragment o 14 300 párech nukleotidů u vP2-gpl60^A a o 8700 párech nukleotidů u vP2-gpl60^T3. To potvrzuje integraci kazet cizích genů ve dvou různých orientacích.
Studie exprese s chimerními viry vPR-gplóO^A a vP2-gpl60^B: Pro srudie exprese byly vybrány buňky Věro. kultivace buněk, infikování chimerními viry a čištění re- 114 kombinantního pJglSO proteinu se provádí tak, jak je to popsáno shora Barrettem a spol.
Westernový bloty gpl60: 'Westernový bloty se provádějí v podstatě tak, jak je to popsáno Towbinem a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 8^, 6672 až 6676 (1979). První protilátkou je myší monoklonální anti-HIV-gpl20 protilátka (Du Pont, lne. č. NEA 9305) používaná ve zředění 1 : 500. Druhou protilátkou je kozí-protimyší IgG (H+L) kondenzovaný s alkalickou fosfatasou (BioSad. Inc·, č. 170-6520) používaná ve zředění 1 : 1000. Reakční činidla (BCIP/NBT) a postupy vybarvování jsou od firmy Promega, Inc.
Konstrukce plasmidů pselP-gpl60M a chimerního viru vselP-gplóO·^: V tomto příkladu byl použit syntetický časný /pozdní promotor selP (sekvence identifikační číslo 70) (S., Chakrabarti a B. Moss, viz evropská patentová přihláška číslo 91 114 300.-6, Rekombinantní virus drůbežích neštovic), který je jedním z nejsilnějších známých promotorů viru vakcínie pro expresi gpl60-genu kmene HIV-1 MN. Nejdříve se zkosntruuje plasmid pselP-gpt-L2 (obrázek 9·4). Tento plasmid obsahuje selP-promotor, po němž následuje násobné klonovaci místo pro inserci cizích genů, buú jako úplné nebo neúplné otevřené čtecí oblasti, a translační stop kodony ve všech čtecích fázích následované časným transkripčním stop signálem viru vakcínie, TTTTTNT (Rohrmann a spol.: Gell 46. 1029 až 1035 (1986).). Kazeta P7·5-gpt-gen je umístěna vedle promotoru a slouží jako dominantní selekční markér (Palkner a spol.: J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988).). Kazety selP-promotor/markér jsou obklopeny místy štěpení restrikčními endonukleasami, které jsou jedinečné v genornu viru vakcínie (Sfil, Notl, Rsrll) a mohou být vystřiženy jako fragmenty se zarovnanými konci (například štěpením působením Hpal a SnaBI). Aby bylo možné vložit gpl60-gen do pselP-gptL2, zavedlo se kolem translačního start kodonu místo Ncol. Tato mutace vede k substituci aminokyseliny arginin (AGA) alaninem (GCC). Tato mutace v druhé aminoJsyselině signálního peptidu pravděpodobně neinterferuje s účinnou expresí gpl60-genu. Postup klonování a sekvence okolo přírodního a
- 115 a modifikocaného gpl60-genu je nastíněna na obrázku 9.5·
Aby se tato mutace zavedla do gpl60-fenu, byl změněn PCR-generováný sousední fragment. Konstrukce plasmidů, je podrobněji popsána níže.
Plasmid pL2: Při konstrukci plasmidů pL2 se Xbal-Clal fragment plasmidů pTM3 o 600 párech nukleotidů (Moss a spol.: Nátuře j43, 91 (1990)·) substituuje Xbal-Clal adaptorovým fragmentem sestávajícím z anelovaných oligonuk^eotidů o-542 (sekvence identifikační číslo 52) 5Z-OOA TTA CGT AGT TAA CGG GGO CGG GGC OTA GCC GGG CAT AAA ÁAT-3'a 0-544 (sekvence identifikační číslo 55) 5Z-OTA GSI TTT TAT GGC CGG CTA GGC CGC GGC CGC GTT AAC TAC GTA AT-3'. Výsledný plasmidový meziprodukt, který se získá z tohoto stupně klonováním, se nazývý pLl, Aatll-Sphl fragment o 840 párech nukleotidů (části nekódujících gpt-sekvencí) se substituuje Aatll-Sphl adaptorovým fragmentem sestávajícím z anelovaných oligonukleotidů 0-541 (sekvence identifikační číslo 54) 5*-CTT TTT CTG CGG CGG CGG ATA TGG CCC GGT CCG GTT AAC TAC GTA GAC GT-3' a o-543 (sekvence identifikační číslo 55) 5*-CTA CGT AGT TAA CCG GAC CGG GCC ATA TAG GCC GCG GCC GCA GÁA AAA GCA TG-3'. Výsledný plasmid se nazývý pL2.
Plasmid pTZ-L2: Xbal-Sphl fragment (sestávající ze segmentu T7-promotor-EIviC-T7-terminátor, násobné klonovací místo a kazeta P7.5-gpt-gen) se nechá zr,eagovat s klenowovou polymerasou a vloží se mezi PvuII místa plasmidů pTZ19R (Pharmacia, lne.)» Výsledný plasmid byl nazván pTZ-L2 (sekvence identifikační číslo 64). Další vlastnosti tohoto plasmidů jsou uvedeny v tabulce níže.
Plasmid pTZ-L2 (4701 párů nukleotidů) (sekvence identifikační číslo 64) umístění: 1 až 55 56 až 108 popis:
pTZ19R sekvence (Pharmacia) linker I v rc orientaci (5INT, Noci, Sfil, Rsrll, Hpal, SnaBI a AatlI)
116 110 až 860
861 až 1338
1339 až 1344 13^5 až 1488 1489 82 I558
1559 až 2131
2132 až 2187
2190 až 2242
2243 až 4701
E.coli gpt sekvence v rc orientaci; gpt otevřená čtecí oblast začíná rc TAC start kodonem v poloze 860 a končí rc ATT stop kodonem v poloze 403 ρ7·5 promotorova sekvence viru vakcínie v rc orientaci
Hpal místo mezi T7 terminátorem bakteriofágu a ρ7·5 promotorem viru vakcínie sekvence terminátoru T7 bakteriofágu v rc 0rientaci (Studier a spol.) násobné klonovací místo v rc orientaci (Sáli, transg^ční stop kodony pro všechny tři otevřené čtecí oblasti, Stul, Xhol, Pstl, BamHl, Spěl, Sací, Smál, EcoRI, Ncol) sekvence 5'-nepřekládané oblasti viru encefalomyokarditidy (EM®-virus) O v rc orientaci sekvence promotoru T7 bakteriofágu v rc orientaci () linker II v rc orientaci (SnaBI, Hpal, Notl, Sfil, 5M?) pTZ19E sekvence (Pharmacia)
Plasmidy PTZselP-L2 a pselP-gpt-L2: Clal-Ncol fragment o 600 párech nukleotidů (sekvence T7-promotor-EM0) se nahradí syntetickým promotorovým fragmentem sestávajícím z anelovaných oligonukleotidů oselPI (sekvence identifikační číslo 56: 5Z-OGA TAA AAA TTG AAA TTT TAT TTT TTT TTT TTG GAA TAT AAA TAA GGC CT0-3Í 51-mer) a o-selPII (sekvence identifikační číslo 57í 5'-0AT GGA GGC CTT ATT TAT ATT CCA AAA AAA AAA AAT AAA ATT TCA ATT TTT AT 3*). Výsledný plasmidový meziprodukt pTZselP-L2 ještě obsahuje T7-terminátor a Hpal^ísto, které byly odstraněny v následujícím stupni klonování/časného transkripcního stop signálu vakcínie a sníženínrvelikos ti fragmentu P7.5 promotoru z 280 párů nukleotidů na 180,
Sall-Hdel fragment o 239 párech nukleotidů se substituuje Sall-Hdel adaptorem obsahujícím anelované oligonukleotidy 0-83O (sekvence identifikační číslo 56: 5'-TCG ACT TTT TAT CA-3') a 0-857 (sekvence identifikační číslo 55« 5'-TAT GAT AAA AAC-3'). Výsledný plasmid se nazývá pselP-gpt-L2 (sek- 117· vence identifikační číslo 65). Další vlastnosti této konstruk ce jsou uvedeny v tabulce níže.
Plasmid pselP-gpt-L2 (5873 párů nukleotidů) (sekvence identifikační číslo 65) umístění:
až 55 56 až 108
110 až 860
861 až 1245
1246 až 1258
1259 až 1322
1323 až 1374
1375 až 1414
1415 až 3878 popisí pTZl^R sekvence (Parmacia) linker I v re orientaci (5'TNT, Notl, Sfil, Hsrll, Hpal, SnaBI, AatlI)
E. coli gpt sekvence v rc orientaci, otevřená čtecí fáze začíná rc TAO start kodonem v poloze 860 a končí rc ATT stop kodonem v poloze 403 sekvence promotoru ρ7·5 viru vakcínie v rc orientaci počínající ρ7·5 vnitřním Sděl místem v poloze 1241 časný transkripční stop signál viru vakcínie v rc orientaci obklopený Ndei místem (poloha 1245) a Sall místem (poloha 1253) násobné klonovací místo v rc orientaci (Sall translační stop kodony pro všechny tři čtecí oblasti, Stul, Xhol, Pstl, BamHI,
Spěl, Sací, Smál, Ecofil, Ncol) syntetický časný pozdní promotor viru vakcínie v rc orientaci obklopený místem Ncol v poloze 1317 a Clal místem v poloze 1370 linker II v rc orientaci (SnaBI, Hpal, Notl, Sfil, 5TNT) sekvence pTZl^R (Pharmacia)
Plasmid pselP-gpl60MN: env gen o 3100 párech nukleotidů, obsahující EcoSI-PvuII fragment plasmidu pMNenv-I, se vloží di plasmidu pselP-gpt-12, který je rozštěpen působením Ecofil a Stul. Získá se meziproduktový plasmid pselP-gpl50.1. Ncol-Nsil fragment plasmidu pselP-gpl60 o 300 párech nukleotidů se substituuje PCfi-generováným Ncol-Nsil fragmentem o 310 párech nukleotidů. Získá se tak konečný plasmid pselP-gploQ^j (sekvence identifikační číslo 66). Další vlastnosti tohoto plasmidu jsou uvedeny v následující tabulce.
- 118 Plasmid pselP-gpl60MN (6474 párů. nukleotidů) (sekvence identifikační číslo 66) umístění:
až 55 56 až 108
110 až 860
861 až 1245
1246 až 1258
1259 až 3916
3917 až 3970
3971 až 4015
4016 až 6474 poloha:
pTZ19E sekvence (Pharmacia) linker I v re orientaci (5'TNT, Sfil, Esrll, Hpal, SnaBI, Aa&II)
E. coli gpt sekvence v rc orientaci, gpt otevřená čtecí fáze začíná v poloze 860 ro TAG start kodonem a končí v poloze 403 rc ATT stop kodonem sekvence promotoru ρ7·5 viru vakcínie v rc orientaci počínající ρ7·5 vnitřním místem Ndel v poloze 1241 časný trankripční stop signál viru vakcínie v rc orientaci (poloha 1245 až 1252) obklopený Ndel místem v poloze 1241 a Sáli místem v poloze 1253
HIV-MN env gen v rc orientaci, OEP začíná v poloze 3916 rc TAO start kodonem a končí v poloze 1348 rc ATT stop kodonem syntetický pozdní časný promotor- viru vakcínie v ro orientaci obklopený Ncol místem (poloha 3913) a Glal místem (poloha 3966) linker II v rc orientaci (SnaBI, Hpal, Notl, Sfil, 5TNT) pTZ19R sekvence (Pharmacia)
Pro PGE-reakci byly použity primery 0-Ν00Ι (4o-mer) (sekvence identifikační číslo 60): 5Z-GAG GAG AAG AGA GTG GGC ATG GCG GTG AAG GGG ATG AGG A-3' a o-Nsil (30-mer) (sekvence identifikační číslo 61): 5^-GAT AAA GTG ATT ATA TCO TGA TGG ATG TGT-3'. Pro další klonování se PGE produkt rozštěpí působením Ncol a Nsil.
Chimerní viry vselP-gpl60^A a vselP-gplbG-^B byly zkonstruovány následujícím způsobem: Hpal-fragQ^nt sestávající z kazet selP-gpl60 a P7.5-gpt-gen se vloží přímým
- 119 molekulárním klonováním (obrázek 9·8) do jediného místa Smál kmene TO0/2 vakcínie ÍMoss a spol·: J. Virol. 40, 587 až 595 (1981).J, který je vysoce atenuovaným kmenem viru vakcínie íviz Buller a spol.: Nátuře 517« 805 až 315 (1935)
Sněn TO 6/2 viru vakcínie ÍMoss a spol.: viz výše.J se rozštěpí v jediném Smál místě a liguje se s Hpal fragmentem o 4000 párech nukleotidů, který obsahuje kazety P7»5-gpt-gen a selP-gpl60-gen. Postup klonování je stejný jako shora popsáno v příkladu 1.
Výhodné chimerní viry, vselP-gpl60^A a vselP-gpl60^B, se vyčistí a dále se charakterizují. Ve viru vselP-gpl60^A se gpl60~gen přepisuje ve stejném směru (zleva doprava) jako geny nahromaděné kolem insertního místa ÍA51S otevřená čtecí oblast} Goebel a spol.: Virology 179« 247 až 266 (199ο)··3· Ve viru vsellP-gplSOj^B se gen gpl60 přepisuje v opačném směru. Postup in vivo pakážování je stejný jako shora popsáno v příkladu 5·
Struktura chimerních virů: Teoretické struktury chimerních virů (obrázek 9*7) byly potvrzeny analýzou Southernovým blotováním. DNA vyčištěných virů se rozštěpí působením Sáli. Fragmenty se rozdělí na agarosovém gelu, přenesou se na nitrocelulosovou membránu a hybridizují se sondou SalP-fragmentu vakcínie (pTZ-SalP) a sondou gpl60-genu (pMNenv-1). Sondou SalP-fragmentu bylyuvselP-gpl60&ajA viditelné předpověděné fragmenty o 6S00 párech nukleotidů a 10 700 párech nukleotidů. U vselP-gpl60^B jsou viditelné předpověděné fragmenty o 5500 párech nukleotidů a 15 700 párech nukleotidů. U sondy gp-160-genu jsou vidět stejné fragmenty,ale fragment o 10 700 párech nukleotidů u vselP-gpl60^A a fragment o 5500 párech nukleotidů u vselP-gpieO^s poskytují méně intensivní signály, protože pouze asi 400 párů nukleotidů z každého fragmentu je homologních se sondou.
Jelikož přímé klonování také vede k integraci tandemových vícemerních struktur, DNA těchto virů se také rozštěpí působemím Xbal, která neštěpí vloženou DNA. Xbal přírodní fragment má velikost 447 párů nukleotidů. Integrace jedné
- 120 kopie insertu o velikosti 3800 párů nukleotidů vede k fragmentu se 43ΟΟ páry nukleotidů. Ve vicemerních strukturách se velikost fragmentu o 4300 párech nukleotidů zvýší o přírůstky 3800 párů nukleotidů.
Studie exprese s chimerními viry vselP-gpl60^A a vselP-gpl60^B: Pro studie exprese se použijí buňky Věro.
Růst buněk, infikování chimerními viry a čištění rekombinantního gpl60 proteinu se provádí podle Barj^bta a spod: viz výše.
Příklad 10
Konstrukce nových chimerních virů vakcínie, které kódují lidský protein S (vProtS) a exprese rekombinantního proteinu S
Tento příklad ilustruje konstrukci rekombinantního proteinu S, který se získává expresí chimerním virem vakcínie. Lidský protein S je glykoprotein o molekulové hmotě 70 000, který funguje při regulaci srážlivosti krve (DiScipio a spol.: Biochemistry 18. 89 až 904 (1979)·)· cLNA a genomová LNA proteinu S byly klonoványCharakterizovány ÍLundwall a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci., USA 83. 6716 (1936), Hoskins a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci., USA 84, 3^9 (1987), Ebenhardt a spol·: Biochemistry 29, 7861 (1990) a Schmidel a spol.: Biochemistry 29. 7845 (1990).J.
Lidský protein S, normálně syntetizovaný jako protein o molekulové hmotě 28 000 v jaterních a nndotheliálních buňkách (DiScipio a spol.: shora uvedená citace.) je expresován ve stálých buněčných liniích odvozených od lidshých 293 buněk a buněk AV12-664 křečka (transformovaná buněčná linie adenovirem) v hladinách 7 mikrogramů na 10° bunšk za den (Grimell a spol.: Blojá 76« 2546 (1990).) nebo v systému mycích C127 buněk/virus papilomu v podobných hladinách exprese (Malm a spoL: Eur. J. Biochem. 187. 737 (1990).). Protein, který byl odvozen od později uvedených buněk, byl větší než protein S odvozený z plasmy, možná díky odchylné glykosylaci.
- 121 Zde uvedená exprese proteinu S používá kazetu se dvěma geny obsahující komplementární DNA lidského krevního faktoru proteinu S a gpt genu, v obou případech kontrolovaných promotorem vakeínie. Tato kazeta byla klonována do jedinečného místa Notl a pakážována v savčích buňkách infikovaných pomocným virem drůbežích neštovic. K expresi lidského proteinu S v infikovaných „buňkách Věro dochází v úrovních čtyři až šest mikrogramů na 10 buněk.
Při testování buněk na optimální expresi proteinu chimerním virem vakeínie se použije pět různých hostitelských buněčných linií, WI JQ (lidský mebryonální plicní fibroblast), buňky CV-1, buňky Věro (buňky ledvin opic), jaterní buňky Ohang a SK Hepl. Protein S byl nerozlišitelný od proteinu odvozeného z plasmy podle několika kriterií: rekombinantní materiál odvozený od infikovaných buněk této buněčné linie vykazoval stejné elektroforetické migrační sestavy a stejné chromátografické eluční profily jako protein S odvozený od plasmy. To ukazuje, že došlo ke správné post-translační modifikaci tohoto komplexního glykoproteinu. 2yto způsoby jsou podrobněji popsány níže.
Konstrukce plasmidu pN2-gpta-ProtS: jednovláknová DNA, která se připraví z plasmidu pBluesoript-ProtS a která obsahuje cDNA kódující lidsky protein S (poskytnutý E. T. A· ^cGillivrayem), se použije pro mutagenizování oblasti kolem translačního start kodonu oblasti kódující protein S v Ncol místě (CGATGG). mutagenní primer o^rotSl (sekvence identifikační číslo 68) má sekvenci 5'-ACC GAG GAG GGG GAT GGG GAA GGG GGG-3*. Mutagenese se provádí podle postupu, který je uveden v mutagenjzačním protokolu (Amersham, lne.). Signální peptid je mutován tak, že se druhá aminokyselina změní z Arg na Ala (obrázek 10.13 a sekvence identifikační číslo 77 a 79). Tím se zavede Ncol místo, které je potřebné pro další klonování, a ATG start kodon se vnese do optimální polohy pro translaci. Tím se může zlepšit sekrece proteinu S.
cDNA proteinu S se pak vystřihne jako Ncol-Notl fragment a vloží se do insertního plasmidu pTKgpt-selP vakeínie
- 122 (Ealkner a spol.: viz výše.). Získá se silný syntetický promotor vakcínie. Kazeta promotor-gen proteinu S se pak vystřihne jako BglII-Notl fragment a vloží se do plasmidu pN2-gpta (příklad 1). Získá se tak plasmid pN2-gptaProtS (sekvence identifikační číslo 67). Další vlastnosti této konstruk ce jsou uvedeny v následující tabulce.
Plasmid pN2-gptaProt S (6311 párů nukleotidů) (sekvence identifikační číslo 6?) umístění:
až 2217 2213 až 2225 2226 až 4938
4939 až 4992
4993 až 5493 5494 až 6127
6123 až 6235 6236 až 6311 popis:
sekvence Bluescript II-SK (Stratagene) místo Notl 1 sekvence ProtS v rc orientaci, otevřená čtecí fáze (oblast) začíná v políze 4938 rc TAC start kodonu a končí v poloze 2910 rc ATT stop kodonu syntetický časný pozdní promotor viru vakcínie v rc orientaci obklopený Ncol místem (poloha 4935) a napojené BglII/BamHI místo (poloha 4987 až 4992). Ncol místo nese Prot S rc start kodon TAG sekvence Ρ7·5 promotoru viru vakcínie E. coli gpt sekvence. OSE začíná v poloze 5494 ATG start kodonem a končí v poloze 5950 TAA stop kodonem.
Notl místo 2 sekvence Bluscript II SK- (Stratagene)
V tomto plasmidu gpt-gen kontrolovaný P7.5 promotorem viru vakcínie a cDNA protein S jsou transkribovány rozdílně a jsou obklopeny místy Notl.
Inserce -cDNA lidského proteinu S do jediného místa Notl viru vakcínie za vzniku vProtS: Notl-fragment, sestávající z kazet gpt genu a genu proteinu S, se liguje s raménky vektoru vakcínie a transfektuje se do savčích CV-Γ buněk infikovaných EPV. Za těchto podmínek se multiplikoval pouze pakážovaný virus vakcínie. Podrobněji - DNA vakcínie přírodního typu kmene WR (1 mikrogram) se rozštěpí působením Notl.
- 123 Enzym se desaktivuje teplem při 65 °C po dobu třiceti minut. Vektor se liguje přes noc s jedním mikrogramem kazety genů gpt-Protein S o 3800 párech nukleotidů (vyštěpené jako Notl fragment z plasmidu pN2gpta-ProtS) ve 30 mikrolitrech pomocí 15 jednotek T4 DNA ligasy.
Surové virové kmeny připravené po pěti dnech inkubace se ztitrují v přítomnosti a v nepřítomnosti mykofenolové kyseliny (MPA). Tento postup rozlišuje chimerní virus od zpětně navázaného viru přírodního £ypu. S MPA bylo získáno zl ς <?í
4.10 a bez MPA bylo získáno 6.10-^ plak tvořich jednotek na 10 8 hostitelských buněk. Asi 6 až 7 % virových plaků byly chimerní viry. Deset z gpt-positivních isolátů bylo dvakrát přečištěno přes plak, byly nechány vyrůst ma malé surové kmeny a byly použity pro infikování buněk OV-1. Byla připravena celková DNA, rozštěpena restrikčními enzymy Sací a Notl a podrobena analýze Southernovým blotováním (obrázek 10.2). Sací štěp, hybridizovaný klonovaným Sacl-I fragmentem (plasmid pTZ-SscI, příklad 4), umožnil stanovit orientace vložené DNA, protože Sací štěpí insertyasy metriahy. Ve všech desetimisolátech byly inserty v *‘-orientaci (fragmenty o 6300 a 4600 párech nukleotidů, viz obrázek 10.2A a 0). To ukazuje, že taková konfigurace je silně výhodná. Notl-fragmenty byly hybridizovány sondou proteinu S. V tomto případě byla uvolněna kazeta Notl genu o 3300 párech nukleotidů (obrázek 10.2B).
Exprese lidského proteinu S chimerním virem vakcínie i Byly nechány vyrůst surové kmeny z gpt-positivních chimerních virů a použity pro infikování různých savhích buněčných linií. Monovrstvy 5·108 buněk se infikují 0,1 pfu na buňku v přítomnosti media bez sera (DMEM) doplněného o 50 /Ug/ml vitaminu K a inkubují se 72 hodiny. Odebere se supernatant. Antigen proteinu S se stanoví sestavou pro test EUSA od firmy Boehringer Mannheim, SRN (sestava číslo 1360264). Množství syntetizovaného proteinu S jsou uvedena v tabulce 1 v mílijednotkách (jedna jednotka odpovídá 25 yug proteinu S).
- 124 Analýza se může provádět také tak, že se 10 yUl supernatantu buněk Věro analyzuje Westernovým blotováním se standardem 50 ng proteinu S odvozeného od lidské plasmy a s my^šim polyklonálním šerem specifickým pro ”hu Prot S Axell) (obrázek 10.3). Bloty se obarví kozím proti-myším polyklonálním šerem konjugovaným s alkalickou fosfoatasou (Dakopatts) a N3T/BGIP jako substrátem.
Vyčištění rekomoinantniho proteinu S ze supernatantů buněčné kultury se provádí podle pos$bu popsaného Grinnellem a spol. (1990).
Tabulka 10.1
buněčná linie ATCG č. mjednotek huProtS na 10° buněk
SK Hepl (HTB52) 750
Věro (CCL 81) 127
Chang jaterní (CGL 13) 135
OV-1 (OGL 70) 450
WI 38 (ooi, 75) 440
Příklad 11
Konstrukce nových chimerních virů vakcínie kódujících lidský faktor IX a exprese rekombinantního faktoru IX
Kazeta se dvěma geny, která obsahuje cDNA lidského krevního faktoru IX a gpt-gen, každý kontrolovaný promotorem vakcínie, se klonuje do jedinečného místa Notl genomu viru vakcínie WE a pakážuje se v savčích buňkách infikovaných pomocným virem drůbežích neštovic. Lidský faktor IX byl získán expresí v několika typech buněk.
Lidský srážecí faktor IX je glykoprotein o molekulové hmotě 56 000, který se účastní regulace srážení krve. Tento srážecí faktor podléhá složitým posttranslačnim modifikacím: na vitaminu K závislé karboxylaci prvních dvanácti glutamových zbytků, glykosylaci, 3-hydroxylaci kyseliny asparagové a opracování proteinu na aminovém konci ÍDavie E. W.:
- 125 “The Blood Coagulatiom Factorsi Their cDNAs, Cenes and Expression, Hemostašis and Thrombosis, Colman R. 17., Hirsh J., Marder V. J. a Salzman. E. 7/. (red.), J. B. Lippincott Co. (1987).J. Hemofilie B, porucha krvácivosti související s X chromosomem, je způsobena mutací faktoru IX. Pacienti s hemofilií jsou průběžně léčeni náhradou faktorem IX odvozeným od plasmy.
cDNA a genomová DNA faktoru IX (FIX”) byly klonovány a cl&akterizovány. FIX byl získáván expresí ve stálých buněčných liniích ÍBusby a spol.í Nátuře 513. 271 (1985), Kaufman a spol.: J. Biol. Chem. 261. 9622 (1986), 3alland a spol.í Eur. J. Biochem. 172. 535 (1922) a Lin a spol.í J. Biol. Chem. 265. 144 (1990).]- Byla popsána také exprese faktoru IX v rekombinantech vakcínie Ide la Salle a spol.i Nátuře 516, 268 (1985).].
V následující části tohoto spisu budou popsány konstrukce plasmidů.
Plasmid pN2gpta-Fixí FIX cDNA (laskavě poskytnutá R.
T. A. MacGillivrayem) se vyštěpí působením EcoRI z plasmidu p31uescript-FIX a liguje se s EcoRI linearizovaným plasmidem pTIú5 [Moss a spol.í Nátuře 548. 91 (1990).]. Z rekombinantní ho plasmidu se isoluje jednovlákňová DNA, která obsahuje FIX insert ve správné orientaci. Notl místo se zavede (místo COATGG) do oblasti kolem FIX ATG start kodonu oligonukleotidem zprostředkovanou místně řízenou mutagenesí pomocí oligonukleotidu oFIX.l (sekvence identifikační číslo 71· 5'-TCA TGT TCA CGS GCT CCA TGG CCG CGG CCG CAC C-5') a komerční sestavou pro mutagenesí (Amersham, lne., sestava číslo PPN 1525·)· Vektor a FIX Ncol místo se spojí, insert DNA se isoluje rozštěpením působením Ncol a Notl a liguje se s vektorem pTKgpt-selř rozštěpeným působením Ncol/Notl (Falkner a spol.: vis výše.). Kazeta promotor/FIX se vyštepí z plasmidu působením Bglll a Notl a liguje se s vektorem pN2-gpta linearizovaným BamEI/Notl (příklad 1). Z této konstrukce se isoluje kazeta Notl obsahující FIX cDNA (pod kontrolou promotoru selP) a gpt gen (pod kontrolou promotoru
- 126 P7.5 vakcínis) a použiji se pro in vitro molekulární klonování a pakážování jak je to popsáno v příkladu 10. Další vlastnosti tohoto plasmidu jsou uvedeny v následující tabulce.
Plasmid pN2gpta-FIX (5552 páru nukleotidů) (sekvence identifikační číslo 72) umístění:
až 2217 2218 až 2225 2226 až 3659
3660 až 3713
3714 až 4214 4215 až 4348
4349 až 4858 4357 až 5532 popis:
Bluscript II SK-sekvence (Stratagene)
Notl místo 1
FIX sekvence v rc orientaci. Otevřená čtecí oblast začíná v poloze 3659 rc TAC start kodonem a končí v poloze 2276 rc ATT stop kodonem syntetický časný pozdní promotor viru vakcínie v rc orientaci obklopený Ncol místem (poloha 3656) a napojené BglII/BamHI místo (poloha 3703 až 3713). Ncol místo nese FIX rc start kodon TAO sekvence P7.5 promotoru viru vakcínie
Ξ. coli gpt sekvence. OEF začíná v poloze 4215 ATG start kodonem a končí v poloze 4671 TAA stop kodonem
Notl místo 2
Bluescript II SK-sekvence (Stratagene)
Inserce cDNA lidského faktoru IX do jediného Notl místa viru vakcínie: Před inserci cDNA faktoru IX do viru vakcínie se tato cDNA vloží do plasmidu pN2-gpta. Získá se tak plasmid pN2gpta-FIX (obrázek 11.1A, sekvence identifikační Číslo 72). Pro získání optimální souvislosti sekvencí syntetického promotoru vakcínie a oblasti kódující faktor IX se 5'-nepřekládaná oblast faktoru IX deletuje zavedením nového Ncol místa se start kodonem faktoru IX a napojením tohoto Ncol místa s Ncol místem poskytnutým promotorem. Tato mutace vede k mutovanému signálnímu peptidu (obrázek 11.1B). V přírodním faktoru IX je druhou aminokyselinou signálního peptidu glutaminový zbytek, zatímco v pN2gpta-FIX je druhou aminokyselinou zbytek kyseliny glutamové.
- 127 Notl fragment, který obsahuje kazety gpt-genu a genu faktoru IX, se liguje s vektorovými raménky vakcínie a transfektuje se do savčích CV-1 buněk infikovaných FPV. Za těchto podmínek multiplikoval pouze pakážovaný virus vakcínie. Surové virové kmeny, které byly připraveny po pětidenní inkubaci, se ztitrují v přítomnosti a v nepřítomnosti mykofenolové kyseliny (MPA). Tímto postupem se rozliší chimemí forma viru od zpětně ligovsného přírodního viru. Bylo získáno 5.10^ plak tvořících jednotek na IQ6 hostitelských buněk v případě, že byla přítomna MPA a 5·10θ plak tvořících jednotek na 106 hostitelských buněk v případě, že nebyla přítomna MPA. V tomto příkladu bylo asi 1 % z virových plaků chimerních virů. Deset gpt-positivních isolátu bylo dvakrát vyčištěno přes plak, byly vykultivovány malé surové kmeny a ty byly použity pro infikování CV-1 buněk. Celková DNA byla připravena z osmi buněčných kultur infikovaných příslušnými virovými isoláty, rozštěpena restrikčními enzymy Sful, Ndel, Notl a podrobena analýze Southernovým blotem.
Sful štěp, hybridizovaný sondou faktoru IX, umožnil stanovení orientace vložené DNA, protože Sful štěpí inserty asymetricky. Ve všech osmi isolátech byly iaserty v ”a-orientaci (fragmenty o 6300 párech nukeotidů a 4600 párech nukleotidů, viz obrázek 11.2). To znamená, že tato konfigurace je silně výhodná. Ndel (Notl) fragmenty byly hybridzovány také sondou faktoru IX. V tomto případě převažoval fragment o 656 000 párech nukleotidů (kazeta Notl genu o 3300 párech nukleotidů), což potvrzuje předpověděnou strukturu.
Exprese lidského faktoru IXí Z osmi isolátu jednotlivých plaků byly vykultivovány surové kmeny, které se použijí pro infikování různých savčích buněčných linií. 5.10° buněk v lOcm Petriho miskách se infikuje 0,1 pfu/buňku v přítomnosti media bez sere (DMEM) s 50 mikrogramy vitaminu K v 1 ml. Infikované buňky se inkubují 72 hodiny, dokud se buňky nezačnou odtahovat ode dna Petriho misek. Supernatanty se spojí, buněčné fragmenty se odstraní odstřelováním a množství FIX se stanoví sestavou pro test ELISA od firmy
123 Boehringer Mannheim, SRN (sestava číslo 1560299). Množství antigenu FIX a aktivity faktoru IX jsou uvedeny v tabulce 11.1.
Deset mikrolitrů supernatantu z buněk Věro lze analyzovat také Westernovým blotem pomocí 50 ng hu FIX odvozeného od lidské plasmy jako standardu a myšího polyklonálního sera specifickoého pro hu FIX (Axell). Bloty byly obarveny konjugátem alkalické fosfatasy’s kozím protimyšim polyklonálním šerem (Dakopatts) a NBT/BOIP jako substrátem. Jak ukazuje obrázek 11.5, rekombinantní materiál migroval jako široký pás podobný standardnímu faktoru IX odvozenému od plasmy. Srážecí testy částečně vyčištěného faktoru IX ^y^zeného od buněk Věro ukázály, že asi 5θ % materiálu je aktivní faktor IX. Virový isolát číslo 5, který je označen vFIX č. 5» byl kultivován ve velkém měřítku a byl použit pro další pokusy.
Jako v případě chimerních virů. proteinu S (příklad 10), faktor IX, který expresí poskytuje chiméry, měl inserty v jedné výhodné orientaci.
Protein genu, o který nám jde (faktor IX a protein S), byl transkribován zprava doleva, tj. ve stejném směru jako geny nahromaděné kolem místa Notl. Zdá se tedy, že silně transkribované jednotky musí být seřazeny ve výhodném směru transkripce, jestliže se klonuje do oblasti Notl. Viry s touto konfigurací, o které jde, jsou silně výhodné a vykazují nejlepší růstové vlastnosti. Směs trankripce kazety druhého genu, P7.5-gpt-genu, byl zleva doprava. Segment P7.5 promotoru je tedy v invertové opakovači konfiguraci vzhledem k vedlejšímu endogennímu genu, který kóduje protein o molekulové hmotě 75^0, tj. očekávaná stabilní konfigurace je výhodná. Jelikož nebyly nalezeny žádné chiméry s opačnou orientací, b”-orientace je pravděpodobně nestálá. Vložení shora uvedených kazet genu v nb‘’-orientaci in vivo rekombinací by selhalo. To vede k chybnému vysvětlení, že intergenová oblast Notl je podstatná pro virový růst. Tato situace ilustruje jednu z výhod přístupu přímého klonovánít tvoří se pouze dovolené” struktury.
129 Vložením kazet jediného malého genu se získají obě orientace a multimery (příklad 1), zatímco vložením kazet složitého genu (různě tra&ribované kazety dvou genů s homologb· emi vnitřních genů, jako je například segment P7.5 promotoru) se tvoří výhodné struktury.
Testování buněk na optimální expresi faktoru IX ukázalo, že infikování buněk CV-1 a SK Hepl vede k nejvyšším hladinám antigenů. Materiál z buněk CV-1 měl největší srážecí účinnosti (tabulka 11.1), což ukazuje, že tato buněčná linie má účinné post-translační modifikační systémy. Faktor IX byl již dříve získáván v konvenční vakcínii expresí pomocí 97*5 promotoru a buněk HepG2 a BEK (de la Salle a spol., 1985). Buněčné linie s lepšími růstovými vlastnostmi, jako jsou například buňky Věro a CV-1, poskytovaly vyšší úioveň exprese u zde uvedených virů díky zlepšeným promotorům a způsobům. Navíc se zdá, že delece 5 '-nepřekládané oblasti cDNA faktoru IX a modifikace signálního peptidu mají positivní vlivy na úroveň sekrece a exprese.
Tabulka 11.1
Exprese faktoru IX v různých buněčných liniích
buněčná line ATCC č. antigen aktivi (mj./ΐθ’ rta . poměr(%) » buněk)+
SK Hepl (HTB52) 810 183 22,5
Věro (CCL81) 500 232 56,4
Chang j. (CCL13) 190 100 52,6
CV-1 (CCL7O) 850 1290 151,8
RK13 (CCL37) 300 460 153,3
+ Jedna jednotka odpovídá 5/Ug FIX na ml lidské plasmy.
Příklad 12
Konstrukce chimerního viru drůbežích neštovic f-envIII3 a exprese rekombinantních ΗΓ/ΙΙΙΒ oosalových proteinů ve fibroblastech kuřecího zárodku
Nedávno byla popsana příprava gploO ve velkém měřítku v expresním systému viru vakcínie - buňky Věro (Barrett a spol.,
- 130 1939). Jelikož virus vakcínie je ještě pathogenní pro mnohé obratlovce včetně savců a virus drůbežích neštovic je omezen pokud jde o hostitele na ptačí hostitele, vyvinuli $ne expresní systém, který je založen na ptácích neštovicích (USA patentová přihláška 07/734 741 a její CIP). Byly zkonstruovány chimerní viry drůbežích neštovic přímým molekulárním klonováním. Tím lze expresí získat obalový gen KIV-1 III8 isolátů (Satner a spol., 1985.). V tomto rekombinantním viru je env gen kontrolován silným syntetickým pozdním promotorem. Při přípravě obalových glykoproteinů se chimerní virus drůbežích neštovic použije pro infikování agregátu buněčných kultur kuřecího zárodku (Mundt a spol.: PCT/UO 91 709 937.).
Konstrukce a struktura chimerního viru drůbežích neštovic f-envIIIB: Při konstrukci f-envIIIB (obrázek 12.1) se kazeta se dvěma geny, obsahující P7.5 promotor/gpt gen a S4-promotor/gpl60 gen, vystřihne jako Notl fragment z plasmidu pN2gpt-gpl60 (příklad 5). Tato kazeta se liguje s genomovou DNA viru drůbežích neštovic f-TK2a (příklad 2) rozštěpenou působením Notl. Chimerní virus se isoluje podle postupu, který je popsán na počátku příkladů provedení vynálezu. Výsledná celková DNA (z fibroblastů kuřecího zárodku infikovaných dvanácti různými' plaky) se rozštěpí působením SspI a dále se analyzuje Southernovým blotováním a hybridizací isolovaným gpl50 fragmentem jako sondou (obrázek 12.2A). V jedenácti případech byly nalezeny předpověděné segmenty o 3700, 1000 a 300 párech nukleotidů. To ukazuje, že gpl60 gen byl integrován v b“ orientaci (obrázek 12.23). Jeden virový isolát, f-UF2e, aehybridizoval gploO sondu.
Skutečnost, že existuje jedna výhodná orientace insertu, vede k možnosti, že virus s nb”-orientací je výhodnější pokud jde o růst ve srovnání s ”a”-orientací} ”a-orientace může být dokonce nestabilní. To, že se virovému vektoru ponechá možngfot vybrat nejlepší orientaci, může být považováno za výhodou přístupu přímého klonování.
Studie exprese s chimerním virem f-envIIIB: Studie
- 131 exprese Pyly prováděny ve fibroblastech kuřecího zárodku (CEP). Konfluentní monovrstvy GEP se infikují 0,1 plak tvořících jednotek na buňku různých virových surových kmenů a nechají se růst pět dnů. Na 10% polyakrylamidových gelech se oddělí celkové buněčné proteiny, přenesou se na nitrocelulosové membrány a dále se postupuje jako je to uvedeno na počátku části Příklady provedení vynálezu”. Westernův blot, který ukazuje na expresi gploO, gpl20 a gp41, je uveden na obrázcích 12.3 a 12.4. Všechny virové isoláty, vyjma f-LP2e, indukovaly expresi env glykoproteinu. Virus f-LF2e byl negativní také v Southernově blotu a nenese tedy sekvence genu gplSO.
Konstrukce fenv-IIIB: Dva mikrogramy DNA vektoru f-TK2a hostitelského viru (příklad 2) se rozštěpí působením
Notl a ligují se s 50θ ng kazety genů obsahující P.7 promotor/gpt gen a S4-promotor/gpl60 gen. Ligace se provádí v objemu 20 mikrolitrů s pěti jednotkami ligasy čtyři dny při Λ teplotě 12 G. Ligační směs se transfektuje do 6.10 GEP infikovaných 0,5 pfu HP2 na buňku isolátu drůbežích neštovic získaného čištěním HP1.441 přes plak. Po inkubační době pět dnů byl připraven surový kmen (konečný objem jeden ml), který byl amplifikován. Surový, kmen se titruje na GEP na deskách se šesti jamkami a nechá se růst pět dnů za gpt-selekce (25 /Ug/ml mykofenolové kyseliny, 125 ng xanthinu).
Buňky, u nichž minimální ředění vedlo k viditelnému cytopathickému efektu, byly isolovány a dvakrát amplifikovány podle stejného postupu. Surový kmen, který se získá z druhé na amplif ikace, se ztistuje GBP v přítomnosti gpt-selekce· Vybere se dvanáct jednotlivých plaků (f-LP2a-l).
Westernový bioty gpl60: Westernový bloty byly dělány v podstatě stejným způsobem , jako to popsali Towbin a spol. (shora uvedená citace).,Při detekci gpl60/gp!20 byla první protilátka myší monoklonální^protilátka (Du Pont, Ino. č.
ΝΈΑ 9305) použita v ředění 1 : 5θ0· Kro detekci gp41 byla použita lidská anti-HIV-gp41 3D6 Mab (poskytnutá B. Katingerem, universitat fúr Bodenkultur, Ins. fúr Angewandte Mikrobiologie) v ředění 1 : 500· Druhou protilátkou byl kozí
- 132 proti-myší IgG (H+L) kondenzovaný s alkalickým fosfátem (BioRad, lne. Č. 170-6520) použitý v ředění 1 : 1000. Reakční Činidla (3GIP a NBT) a postupy barvení byly od firmy f'r omega, lne.
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) žadatel: Dorner F., Scheiflinger F., Falkner F. G.,
Pfleiderer lví « (ii) Název vynálezu: Přímé molekulární klonování modifikovaného genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru (iii) : počet sekvencí: 84 (iv) : Korespondenční adresa:
(A) adresát: Foley a Lardner (B) ulice: 1300 Diagonál Road, Suitě 500 (G) město: Alexandria (D) stát: Va.
(B) země: USA (F) poštovní směrovací číslo: 22513-0299 (v) forma počítačového vyjádření:
(A) typ media: flopy disk (B) počítač: IBM pG kompatibilní (G) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: Patentln Release č. 1.0, verse č. 1.25 (ví) údaje o přihlášce:
(A) číslo přihlášky: 07/750»03° (3) datum podání: 26. srpna 1991 (0) klasifikace: neznámá (viii) informace o zástupei/agentovi:
(A) jméno: Bent Stephen A.
(3) registrační číslo: 29 768 (G) odkaz (docket number) 30472/106 IMLU (ix) informace o telekomunikačním spojení:
(A) telefon: (703) 356-9300 (B) fax: (703) 683-4109 (C) telex: 899149
- 133 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo li (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka : 43 párů nukleotidů.
(3) typ: nukleová kyselina (G) druhá vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pN2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 1: TGAAGGTTAT CGATACCGTC GGGGGGGGGA GCTGGAGGGG GGGGGGGG 48 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo 2:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 1133 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pN2-gpta (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 2:
CTAGAACTAG TGGATCCCCC AACTTAAGGG TACCGCCTCG acatctatat ACTATATAGT 60
AATACCAATA CTCAAGACTA CGAAACTGAT ACAATCTCTT ATCATGTGGG TAATGTTCTC 120
GATGTCGAAT AGCCATATGC CGGTAGTTGC GATATACATA AACTGATCAC TAATTCCAAA 180
CCCACCCGCT TTTTATAGTA AGTTTTTCAC CCATAAATAA TAAATACAAT AATTAATTTC 240
TCGTAAAAGT agaaaatata TTCTAATTTA TTGCACGGTA AGGAAGTAGA ATCATAAAGA 300
ACAGTGACGG ATGATCCCCA AGCTTGGACA CAAGACAGGC TTGCGAGATA TGTTTGAGAA 360
TACCAC1TTA TCCCGCGTCA GGGAGAGGCA GTGCGTAAAA AGACGCGGAC TCATGTGAAA 420
TACTGGTTTT TAGTGCGCCA GATCTCTATA ATCTCGCGCA ACCTATTTTC CCCTCGAACA 480
CTTTTTAAGC CGTAGATAAA CAGGCTGGGA CACTTCACAT GAGCGAAAAA TACATCGTCA 540
CCTGGGACAT GTTGCAGATC CATGCACGTA AACTCGCAAG CCGACTGATG CCTTCTGAAC 600
AATGGAAAGG CATTATTGCC GTAAGCCGTG GCGGTCTGGT ACCGGGTGCG TTACTGGCGC 660
GTGAACTGGG TATTCGTCAT GTCGATACCG TTTGTATTTC CAGCTACGAT CACGACAACC 720
- 134 -
AGCGCGAGCT TAAAGTGCTG AAACGCGCAG AAGGCGATGG CGAAGGCTTC ATCGTTATTG 780
ATGACCTGGT GGATACCGGT GGTACTGCGG TTGCGATTCG TGAAATGTAT CCAAAAGCGC 840
ACTTTGTCAC CATCTTCGCA AAACCGGCTG GTCGTCCGCT GGTTGATGAC TATGTTGTTG 900
atatcccgca AGATACCTGG ATTGAACAGC CGTGGGATAT GGGCGTCGTA TTCGTCCCGC 960
CAATCTCCGG TCGCTAATCT TTTCAACGCC TGGCACTGCC GGGCGTTGTT CTTTTTAACT 1020
TCAGGCGGGT TACAATAGTT TCCAGTAAGT ATTCTGGAGG CTGCATCCAT GACACAGGCA 1080
AACCTGAGCG AAACCCTGTT CAAACCCCGC TTTGGGCTGC AGGAATTCGA TAT 1133
(2) Informace o sekvenci identifikační číslo 3* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 1133 párů nukleotidů (3) typ : nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: pN2-gptb (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 3:
CTAGAACTAG TGGATCCCCC AAAGCGGGGT TTGAACAGGG TTTCGCTCAG GTTTGCCTGT 60
GTCATGGATG CAGCCTCCAG AATACTTACT GGAAACTATT GTAACCCGCC TGAAGTTAAA 120
AAGAACAACG CCCGGCAGTG CCAGGCGTTG AAAAGATTAG CGACCGGAGA TTGGCGGGAC 180
GAATACGACG CCCATATCCC ACGGCTGTTC AATCCAGGTA TCTTGCGGGA TATCAACAAC 240
ATAGTCATCA ACCAGCGGAC GACCAGCCGG TTTTGCGAAG ATGGTGACAA AGTGCGCTTT 300
TGGATACATT TCACGAATCG CAACCGCAGT ACCACCGGTA TCCACCAGGT CATCAATAAC 360
GATGAAGCCT TCGCCATCGC CTTCTGCGCG TTTCAGCACT TTAAGCTCGC GCTGGTTGTC 420
GTGATCGTAG CTGGAAATAC AAACGGTATC GACATGACGA ATACCCAGTT CACGCGCCAG 480
TAACGCACCC GGTACCAGAC CGCCACGGCT TACGGCAATA ATGCCTTTCC ATTGTTCAGA 540
AGGCATCAGT CGGCTTGCGA GTTTACGTGC ATGGATCTGC AACATGTCCC AGGTGACGAT 600
GTATTTTTCG CTCATGTGAA GTGTCCCAGC CTGTTTATCT ACGGCTTAAA aagtgttcga 660
GGGGAAAATA GGTTGCGCGA GATTATAGAG ATCTGGCGCA CTAAAAACCA GTATTTCACA 720
TGAGTCCGCG TCTTTTTACG CACTGCCTCT CCCTGACGCG GGATAAAGTG GTATTCTCAA 780
ACATATCTCG CAAGCCTGTC TTGTGTCCAA GCTTGGGGAT CATCCGTCAC TGTTCTTTAT 840
gattctactt CCTTACCGTG CAATAAATTA GAATATATTT TCTACTTTTA CGAGAAATTA 900
- 155 ATTATTGTAT ΤΓΑΤΤΑΤΤΤΑ TGGGTGAAAA ACTTACTATA AAAAGCGGGT GGGTTTGGAA 960
TTAGTGATCA GTTTATGTAT ATCGCAACTA CCGGCATATG GCTATTCGAC ATCGAGAACA 1020
TTACCCACAT GATAAGAGAT TGTATCAGTT TCGTAGTCTT GAGTATTGGT ATTACTATAT 1080
AGTATATAGA TGTCGAGGCG GTACCCTTAA GTTGGGCTGC AGGAATTCGA TAT 1133 (2) Iníormace o sekvenci identifikační číslo 4:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 66 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh. vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (á) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pHindJ-2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační Číslo 4:. CGCATTTTCT AAOGTGATGG GATCCGTTAA CTCGCGAGAA TTGTGTAGAA 50 AGTGTTACAT CGAOTO 66 (2) Informace o sekvenci identifikační Číslo 55 (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 127 párů nukleotidů (3) typ: nukieová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D), topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pHindJ-5 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 5
CGCATTTTOT
AAOGTGATGG
CGA GA CA A A A
GATCOGGGGG GGTAGGGGGG GGCGGCCGGG AGACGGAGGG GGCGCGGCCA TATAGGCCCA
ATTJTGTAGA
AAGTGTTACA
TCGACTC
100
127 (2) Informace o sekvenci identifikační Číslo 6: (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 115 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topol..gie: lineární
- 136 (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) dopid: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: pAO (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 6: AGGGAAGAAA AGGTGGAGGT AGGGGGGGTA GGGGGCGGGG GGGGGGGTTT 50
TTATCTCGAG AGAAAAAGAG GGAGGGGGGG GGGGGATATA GGGGAGTAGG 100
GAATTGGGGC TATAG 115 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo 7: (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 103 páry nukleotidů.
(B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: pAl (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 7: GGGGGGGCGG GGTTTTTATC TGGAGATATG GTGCAGITAA CGAííTTCGAT 50 GGGGATGCGA TAIGAAGCTT AGGGGTGTGG ACGTCGAGAC AAAAAGAGGG 100 ACG 103 (2) Informace o sekvenci číslo 8:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 103 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pA2 (xi) popis sekvence: sekveč^ne identifikační číslo 3:
/i ,-·» -iirt p ^rnrufiínrn λ m rn,λ ρίχη/ΐΛΛ
CAGGGGTAAG o.
?GA
ΊΠΊΡβΑ J'3 A ΓΠ.'Ί
GASGGGGATG GAaTICGTTA AGTGCAGGAT ATGTGGAGAG AAAAAGAGGG
100
AGG
103
- 137 (2) informace o sekvence identifikační číslo 9* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 213 párů. nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pAl-Sl (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 9:
GCGGGGTTTT TATGTCGACA TACGGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAGTAA 50
TTGTAAAGAA GAAAAC-GAAA CTATCAAAAC OGTTTATGAA ATGATAGAAA 100
AAAGAATATA AATAATGGTG TATTTTAGTT TAAGTAACAG TAAAATAATG 150
AGTAGAAAAT AGTATTTTTT ATAGGOTATA AATOATGAAT TCGGATOCGA 200
TATOAAGOTT AGG 213 (2) informace o sekvenci číslo 10:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 215 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pA2-Sl (xi) po$5 sekvence: sekvence identifikační číslo 10: OAGGOOTAAG CTTGATATOG GATGGGAATT GATGATTTAT AGGOTATAAA 50
AAAlAGTATT TTCTAGTGAT TATTTTACTG TTAOTTAAAG TAAAATAGAG 100
GATTATTTAT ATTGTTTTTT OTATOATTTG ATAAAOGGTT TTGA^TTT 150
GGTTTTGTTG TTTAOAATTA GTTAGTTGTG GGGTATAGGA AGGGGTATGT 200
GGAGAGAAAA AGACG 215 (2) informace o sekvenci identifikační Číslo 11:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 38 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina
- 133 (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: pAl-S2 (xi): popis sekvence: sekvence identifikační číslo 11: TGTGGAGATA TGGTGGAGTT GGGAAGGTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTGGC 50 ATATAAATAG GGTGGAGGAA TTCCATGGGG ATGCGATA 38 , (2) informace o sekvenci identifikační číslo 12:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 92 párů. nukleotidů.
(B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: pA2-S2 (xi): popis sekvence: sekvence identifikační číslo 12: TTGATATGGG ATGCGCATGG AATTCCTGGA GGCTATTTAT ATGCGAAAAA 50
AAAAAAAAAA AAAAAGGTTG CCAAGTGCAG GATATGTGGA GA 92 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 13:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 127 párů nukleotidů . (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová ’ (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: pN2gpt-S3A (obrázek 4.7) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 13: TACCCTTÁAG TTGGGGTGGA GAAGGTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGGCAT 50
ATAAATGAAT TCCATGGGGC GGGAAGGGGT GGGAGGGGGC GGGGGGATAT 100
AGGOCAGCGA TACCGTOGGG GGGGGGA 127
- 159 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 14:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 154 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pN2gpt-S4 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 14: TAGGGTTAAG TTGGGCTGCA GAAGCTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGGGAT 50 ATAAATGGTT AAGGAATTGC ATGGCCCGGG AAGGGCTGGG AGCGGGCCCG 100 GCCATAIAGG CCAGCGATAC CGTCGCGGCC GGGA 154 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 15:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 1988 párů nukleotidů (5) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: pAlSl-FT
Úi) popis se. kvence: s ekvénce identifika· ční číslo 15:
TTTTATAGCC TATAAATCAT GAATTCCGCG CACGTCCGAG GCTTGCAGCT GCCTGGCTGC eo
CTGGCCCTGG CTGCCCTGTG TAGCCTTGTG CACAGCCAGC atgtgttcct GGCTCCTCAG 120
CAAGCACGGT CGCTGCTCCA GCGGGTCCGG CGAGCCAACA CCTTCTTGGA GGAGGTGCGC 180
AAGGGCAACC TAGAGCGAGA GTGCGTGGAG GAGACGTGCA GCTACGAGGA GGCCTTCGAG 240
GCTCTGGAGT CCTCCACGGC TACGGATGTG TTCTGGGCCA AGTACACAGC TTGTGAGACA 300
GCGAGGACGC CTCGAGATAA GCTTGCTGCA TGTCTGGAAG GTAACTGTGC TGAGGGTCTG 360
GGTACGAACT ACCGAGGGCA TGTGAACATC ACCCGGTCAG GCATTGAGTG CCAGCTATGG 420
AGGAGTCGCT ACCCACATAA GCCTGAAATC AACTCCACTA CCCATCCTGG GGCCGACCTA 480
CAGGAGAATT TCTGCCGCAA CCCCGACAGC AGCAACACGG GACCATGGTG CTACACTACA 540
GACCCCACCG TGAGGAGGCA GGAATGCAGC ATCCCTGTCT GTGGCCAGGA TCAAGTCACT 600
140
GTAGCGATGA CTCCACGCTC CGAAGGCTCC AGTGTGAATC TGTCACCTCC ATTGGAGCAG 660
TGTGTCCCTG ATCGGGGGCA GCAGTACCAG gggcgcctgg CGGTGACCAC ACATGGGCTC 720
CCCTGCCTGG CCTGGGCCAG CGCACAGGCC AAGGCCCTGA GCAAGCACCA GGACTTCAAC 780
TCAGCTGTGC AGCTGGTGGA GAACTTCTGC CGCAACCCAG ACGGGGATGA GGAGGGCGTG 840
TGGTGCTATG TGGCCGGGAA GCCTGGCGAC TTTGGGTACT GCGACCTCAA CTATTGTGAG 900
GAGGCCGTGG AGGAGGAGAC AGGAGATGGG CTGGATGAGG ACTCAGACAG GGCCATCGAA 960
GGGCGTACCG CCACAAGTGA GTACCAGACT TTCTTCAATC CGAGGACCTT TGGCTCGGGA 1020
GAGGCAGACT GTGGGCTGCG ACCTCTGTTC GAGAAGAAGT CGCTGGAGGA CAAAACCGAA 1080
AGAGAGCTCC TGGAATCCTA CATCGACGGG CGCATTGTGG AGGGCTCGGA TGCAGAGATC 1140
GGCATGTCAC CTTGGCAGGT gatgcttttc CGGAAGAGTC CCCAGGAGCT GCTGTGTGGG 1200
GCCAGCCTCA TCAGTGACCG CTGGGTCCTC ACCGCCGCCC ACTGCCTCCT GTACCCGCCC 1260
TGGGACAAGA ACTTCACCGA GAATGACCTT CTGGTGCGCA TTGGCAAGCA CTCCCGCACC 1320
AGGTACGAGC GAAACATTGA AAAGATATCC ATGTTGGAAA AGATCTACAT CCACCCCAGG 1380
TACAACTGGC GGGAGAACCT GGACCGGGAC ATTGCCCTGA TGAAGCTGAA GAAGCCTGTT 1440
GCCTTCAGTG ACTACATTCA CCCTGTGTGT CTGCCCGACA GGGAGACGGC AGCCAGCTTG 1500
CTCCAGGCTG GATACAAGGG GCGGGTGACA GGCTGGGGCA ACCTGAAGGA GACGTGGACA 1560
GCCAACGTTG GTAAGGGGCA GCCCAGTGTC CTGCAGGTGG TGAACCTGCC CATTGTGGAG 1620
CGGCCGGTCT GCAAGGACTC CACCCGGATC CGCATCACTG ACAACATGTT CTGTGCTGGT 1680
TACAAGCCTG atgaagggaa ACGAGGGGAT GCCTGTGAAG GTGACAGTGG GGGACCCTTT 1740
GTCATGAAGA GCCCCTTTAA CAACCGCTGG TATCAAATGG GCATCGTCTC atggggtgaa 1800
GGCTGTGACC gggatgggaa ATATGGCTTC TACACACATG TGTTCCGCCT GAAGAAGTGG 1860
ATACAGAAGG TCATTGATCA GTTTGGAGAG TAGGGGGCCA CTCATATTCT GGGCTCCTGG 1920
AACCAATCCC GTGAAAGAAT TATTTTTGTG TTTCTAAAAC TAGAATTCGG attcgatatc 1980
AAGCTTAG 1983 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 16:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 26 párů. nukleotidů.
(B) typ: nukleová kyselina (J) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuiy: jiná nukleová kyselina (a) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) Klon: odNl (xi): popis sekvence: sekvence identifikační číslo 16:
GGCCSGGCCT ΤΤΪΑΑΑΤΤΑΑ GATATO
- 141 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 17:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: lil páru nukleotidu (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (L) topologie: lineární (ii) typ molexuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický LNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pN2gpt-GPg (xi) popis sekvence: sekvence identifikační Číslo 17: TTTTTGGCAT ATAAATCGTT CCAGTCCCAA AATGTAATTG GACGGGAGAC AGAGTGACGC I
ACGCGGCCGC TCTAGAACTA GTGGATCCCC CAACGAATTC CATGGCCCGG G i:
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 13:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 2296 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A): popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pN2gpt-ISPg (xi): popis sekvence: sekvence identifikační číslo 18:
ATAAATCGTT AACGAATTCC ATGGAACATA AGGAAGTGGT TCTTCTACTT CTTTTATTTC 60
TGAAATCAGG TCAAGGAAAA GTGTATCTCT CAGAGTGCAA GACTGGGAAT ggaaagaact 120
ACAGAGGGAC GATGTCCAAA ACAAAAAATG GCATCACCTG TCAAAAATGG AGTTCCACTT 180
CTCCCCACAG ACCTAGATTC TCACCTGCTA CACACCCCTC AGAGGGACTG GAGGAGAACT 240
ACTGCAGGAA TCCAGACAAC GATCCGCAGG GGCCCTGGTG CTATACTACT GATCCAGAAA 300
AGAGATATGA CTACTGCGAC ATTCTTGAGT GTGAAGAGGA ATGTATGCAT TGCAGTGGAG 360
AAAACTATGA CGGCAAAATT TCCAAGACCA TGTCTGGACT GGAATGCCAG GCCTGGGACT 420
CTCAGAGCCC ACACGCTCAT GGATACATTC CTTCCAAATT TCCAAACAAG AACCTGAAGA 480
AGAATTACTG TCGTAACCCC GATAGGGAGC TGCGGCCTTG GTGTTTCACC ACCGACCCCA 540
ACAAGCGCTG GGAACTTTGC GACATCCCCC GCTGCACAAC ACCTCCACCA TCTTCTGGTC 600
- 142 -
CCACCTACCA GTGTCTGAAG GGAACAGGTG AAAACTATCG CGGGAATGTG GCTGTTACCG 660
TTTCCGGGCA CACCTGTCAG CACTGGAGTG CACAGACCCC TCACACACAT AACAGGACAC 720
CAGAAAACTT CCCCTGCAAA AATTTGGATG AAAACTACTG CCGCAATCCT GACGGAAAAA 780
GGGCCCCATG GTGCCATACA ACCAACAGCC AAGTGCGGTG GGAGTACTGT AAGATACCGT 840
CCTGTGACTC CTCCCCAGTA TCCACGGAAC AATTGGCTCC CACAGCACCA CCTGAGCTAA 900
CCCCTGTGGT CCAGGACTGC TACCACGGTG ATGGACAGAG CTACCGAGGC ACATCCTCCA 960
CCACCACCAC AGGAAAGAAG TGTCAGTCTT ggtcatctat GACACCACAC CGGCACCAGA X020
AGACCCCAGA AAACTACCCA AATGCTGGCC TGACAATGAA CTACTGCAGG AATCCAGATG 1080
CCGATAAAGG CCCCTGGTGT TTTACCACAG ACCCCAGCGT CAGGTGGGAG TACTGCAACC 1140
TGAAAAAATG CTCAGGAACA GAAGCGAGTG TTGTAGCACC TCCGCCTGTT GTCCTGCTTC. 1200
CAGATGTAGA GACTCCTTCC GAAGAAGACT GTATGTTTGG GAATGGGAAA GGATACCGAG 1260
GCAAGAGGGC GACCACTGTT ACTGGGACGC CATGCCAGGA CTGGGCTGCC CAGGAGCCCC 1320
ATAGACACAG CATTTTCACT CCAGAGACAA ATCCACGGGC GGGTCTGGAA AAAAATTACT 1380
GCCGTAACCC TGATGGTGAT GTAGGTGGTC CCTGGTGCTA CACGACAAAT CCAAGAAAAC 1440
TTTACGACTA CTGTGATGTC CCTCAGTGTG CGGCCCCTTC ATTTGATTGT GGGAAGCCTC 1500
AAGTGGAGCC GAAGAAATGT CCTGGAAGGG TTGTGGGGGG GTGTGTGGCC CACCCACATT 1560
CCTGGCCCTG GCAAGTCAGT CTTAGAACAA GGTTTGGAAT GCACTTCTGT GGAGGCACCT 1620
TGATATCCCC AGAGTGGGTG TTGACTGCTG CCCACTGCTT GGAGAAGTCC CCAAGGCCTT 1680
CATCCTACAA GGTCATCCTG GGTGCACACC AAGAAGTGAA TCTCGAACCG CATGTTCAGG 1740
AAATAGAAGT GTCTAGGCTG TTCTTGGAGC CCACACGAAA AGATATTGCC TTGCTAAAGC 1800
TAAGCAGTCC TGCCGTCATC ACTGACAAAG TAATCCCAGC TTGTCTGCCA TCCCCAAATT 1860
ATGTGGTCGC TGACCGGACC gaatgtttca TCACTGGCTG GGGAGAAACC CAAGGTACTT 1920
TTGGAGCTGG CCTTCTCAAG GAAGCCCAGC TCCCTGTGAT TGAGAATAAA GTGTGCAATC 1980
gctatgagtt TCTGAATGGA AGAGTCCAAT CCACCGAACT CTGTGCTGGG CATTTGGCCG 2040
GAGGCACTGA CAGTTGCCAG GGTGACAGTG GAGGTCCTCT GGTTTGCTTC GAGAAGGACA 2100
AATACATTTT ACAAGGAGTC acttcttggg gtcttggctg TGCACGCCCC AATAAGCCTG 2160
GTGTCTATGT TCGTGTTTCA AGGTTTGTTA CTTGGATTGA GGGAGTGATG AGAAATAATT 2220
AATTGGACGG GAGACAGAGT GACGCACGCG GCCGCTCTAG AACTAGTGGA TCCCCCGGGA 2280
AGGCCTCGGA CCGGGC 2296
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 19:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 56 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární
- 143 (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pN2gpt-gpl60 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 19 í TTTTTGGCAT ATAAATCGTT ATCCACCATG TAAGATAACG AATTCCATGG CCCGGG 56 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 20:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 331 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pvWF (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 20:
TTTTTTTTGG CATATAAATC GCGGCCGCGG GTGGTTGGTG GATGTCACAG CTTGGGCTTT 60 ATCTCCCCCA GCAGTGGGAT TCCACAGCCC CTGGGCTACA TAACAGCAAG ACAGTCCGGA 120 GCTGTAGCAG ACCTGATTGA GCCTTTGCAG CAGCTGAGAG CATGGCCTAG GGTGGGCGGC 1Θ0 ACCATTGTCC AGCAGCTGAG TTTCCCAGGG ACCTTGGAGA TAGCCGCAGC CCTCATTTGC 240 AGGGGAAGAT GTGAGGCTGC TGCAGCTGCA TGGGTGCCTG CTGCTGCCTG CCTTGGCCTG 300 ATGGCGGCCG CCCGGGTTTT TATCTCGAGA C 331 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 21:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délxa: 50 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) typologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (a) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pEcoK-dhr (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 21:
ATTAGCGTCT CGTTTCAGAC GCGGCCGCGG TAATTAGATT CTCCCACATT
- 144 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 22:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 1209 pard nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pdhr-gpt (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 22:
ATTAGCGTCT CGTTTCAGAC GCGGCCGCTC TAGAACTAGT GGATCCCCCA ACTTAAGGGT 60
ACCGCCTCGA CATCTATATA CTATATAGTA ATACCAATAC TCAAGACTAC GAAACTGATA 120
caatctctta TCATGTGGGT aatgttctcg ATGTCGAATA GCCATATGCC GGTAGTTGCG 180
ATATACATAA ACTGATCACT AATTCCAAAC CCACCCGCTT TTTATAGTAA GTTTTTCACC 240
CATAAATAAT AAATACAATA ATTAATTTCT CGTAAAAGTA GAAAATATAT TCTAATTTAT 300
TGCACGGTAA GGAAGTAGAA TCATAAAGAA CAGTGACGGA TGATCCCCAA GCTTGGACAC 360
AAGACAGGCT TGCGAGATAT GTTTGAGAAT ACCACTTTAT CCCGCGTCAG GGAGAGGCAG 420
TGCGTAAAAA GACGCGGACT CATGTGAAAT ACTGGTTTTT AGTGCGCCAG ATCTCTATAA 480
TCTCGCGCAA CCTATTTTCC CCTCGAACAC TTTTTAAGCC GTAGATAAAC AGGCTGGGAC 540
ACTTCACATG AGCGAAAAAT ACATCGTCAC CTGGGACATG TTGCAGATCC ATGCACGTAA 600
ACTCGCAAGC CGACTGATGC CTTCTGAACA ATGGAAAGGC ATTATTGCCG TAAGCCGTGG 660
CGGTCTGGTA CCGGGTGCGT TACTGGCGCG TGAACTGGGT attcgtcatg TCGATACCGT 720
TTGTATTTCC AGCTACGATC ACGACAACCA GCGCGAGCTT AAAGTGCTGA AACGCGCAGA 780
AGGCGATGGC GAAGGCTTCA TCGTTATTGA TGACCTGGTG GATACCGGTG GTACTGCGGT 840
TGCGATTCGT GAAATGTATC CAAAAGCGCA CTTTGTCACC ATCTTCGCAA AACCGGCTGG 900
TCGTCCGCTG GTTGATGACT ATGTTGTTGA TATCCCGCAA GATACCTGGA TTGAACAGCC 960
GTGGGATATG GGCGTCGTAT TCGTCCCGCC AATCTCCGGT CGCTAATCTT TTCAACGCCT 1020
GGCACTGCCG GGCGTTGTTC TTTTTAACTT CAGGCGGGTT ACAATAGTTT CCAGTAAGTA 1080
TTCTGGAGGC TGCATCCATG ACACAGGCAA ACCTGAGCGA AACCCTGTTC AAACCCCGCT 1140
TTGGGCTGCA GGAATTCGAT ATCAAGCTTA TCGATACCGT CGCGGCCGCG GTAATTAGAT 1200
TCTCCCACA
1209
- 145 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 2$:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 26 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zd roj:
(3) klon: odN2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 25* GGCCGATATC TTAATTTAAA AGGCGT 26 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 24:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 24 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: odN3 (xi)’popis sekvence: sekvence identifikační číslo 24: OGAATGTTAG GTGGGTTAGA TGAG 24 (2) informace o sekvenci idetifikační číslo 25* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 13 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: I-Scel linker 1 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 25: TAGGGATAAC AGGGTAAT 13
- 146 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 26:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 13 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (3) druh vlákna: jednovláknová (D) topologieí lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroji . (B) klon: I-Scel linker 2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 26: ATTACCGTGI TATGGGTA 18 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 27s (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 23 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: odS2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 27: GTATAAAGTC CGACTATTGT TCT 23 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 28:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 26 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: odS3 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 23: TGTGAGGCGT AATAGAGGTO TGTAGA 26
- 147 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 29i (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 13 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) ’typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: Sfil (1) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 2$: GGCGGGGTAG GGG 13 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 3θϊ (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 13 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: Sfil (2) (xi) popis sekvence': sekvence identifikační číslo 30: GGGCATATAG GCG 13 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 31 * (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 66 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: odlKL (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo GAGTGGATGT AACAGTTTGT AGAGGATGCG TTAAGTGGGG AGAATTGCAT 50 GAGGTTAGAA AATGGG 66
- 148 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 32:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 79 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: jednovláknová (ii) ‘typ molekuly: jiná nukleová kyselina U) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: P-J(l) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 32: GATGGGGGGG GCTAGGCGGG GGGGGGCCGG GTTTTTATCT CGAGAGAAAA 50 AGACGGACCG GGOCCGGCGA TATAGGCCC 79 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 33s (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 79 párů nukleotidů (B> typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: P-J(2) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 33* AATTGGGCCT ATATGGCCGG GCCCGGTCCG TCTTTTTGTC TOGAGATAAA 50 AACCCGGGCG GCCGCGGCCT AGCCGGCCG 79 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 34:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 18 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: odTK2
- 149 ~ (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 54: AGAAGGGGTG GGTGATTG (2) informace o sekvencí identifikační číslo 35:
(i.) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 21 párů. nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: odTK3 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 35: TAGGGTGTGG CTGTAACTTA C 21 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 36:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 75 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: P-A(O.l) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 36: AGGGGGGGTA GGGGGCGGGG GGGGGGGTTT TTATGTG3AG AGAAAAAGAG 50 GGAGGGGGGG CGGGCATATA GGGCA 75
I (2) informace o sekvenci identifikační číslo 37 J (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 83 párů nukleotidů (3) typ: jiná nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid
- 150 (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: P-A(0.2) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 37* GTAGTGGGCT ATAIGGCGGG GCCCGGTGGG TCTTTTTGTC TGGAGATAAA 50 AACCCGGGCG GOGGGGGOGT AGCGGGGOTA GGT 33 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 38* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 55 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna* jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: P-artP(ll) (xi)’popis sekvence: sekvence identifikační číslo 38* GGGGAGGTTT TTATGGGAAG ΟΪΤΤΤΤΤΤΤΤ TTTTTTTTTT TGGGATATAA 50 ATGGG 55 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 39:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 55 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: P-artP(12) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 39* GGOOGCGATT TATATGOCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC TTOOOATAAA 50 AAOGT 55 (2) informace o sekvenci identifikační Číslo 40:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 95 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina
- 151 (C) druh vlákna: jednovláknová CD) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: P-artP(3) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 405 CGCTGGCCTA TATGGCCGGG CCCGGTCCGA GGCCTTCGGG GGCCaTGGAA 50
TTCATTTATA TGCCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCTTCT GGA 93 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 41:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 97 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: P-artP(lO) (xi) popis sekvence:'sekvence identifikační číslo 41: CGCTGGCCTA TATGGCCGGG CGTCCGAGGC CTTCCCGGGC CATGGAATTC 50
GTTAACGATT TATAIGCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC TTCTGCA 97 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 42:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 50 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlakna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: oligonukleotid P-hr(3) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 42: ATTAGCGTCT CGITTCAGAC GCGGCCGCGG TAATTAGATT CTCCCACATT 50 (2) informace o sekvenci identifikační Číslo 43:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 10 párů nukleotidů
- 152 (3) typ: nukleová kyselina (G) druh. vlákna! jedno vláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly! jiná nukleová kyselina (A) popis! syntetický DNA oligonukleotid (xi) popis sekvence! sekvence identifikační číslo 43! GTAGGGGGGG 10 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 44:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 47 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly! jiná nukleová kyselina (Á) popis· syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj :
(3) klon: P-P2 5'(1) (xi) popis sekvence! sekvence identifikační číslo 44: GTAGGTAGGG GTGGAGTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAG AAGTAAG 47 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 45!
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka! 50 párů nukleotidů (B) typ! nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: P-P2 3'(1) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační Číslo 45: TGTGAGTGAG GTTAAGGATT TATAGGGTAT AAAAAATAGT ATTTTGTAGT 50 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 46:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 20 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová
- 153 (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: P-SM(2) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 46: GTGTTGAGTA TTGGTATTAG 20 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 47:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 23 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh. vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) ’typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: P-SM(3) (xi)'popis sekvence: sekvence identifikační číslo 47: GGAAACTATO AAAACGCTTT ATG 23 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 48:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 53 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: P-LiN (1) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 43: AGGTAGGTGA ATTGAGGGGT CATGSGAGTG AAGGGGATCA GGAGGAATTA TGA 53 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 49:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 30 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová
- 154 (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: P-MN (2) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 4$: GATGTGATGG AGAAAATAGA GTGGTGGTTG 30 (2) informace o sekvenci identifikační číslo $0:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 27 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: P-seq(2) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 50t CTGTGGGTAC AGAGGCTTGT GTGGGCC 27 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 51 (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 25 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: P-seq(3) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 51* GAATTTTTCT GTAGGAOTAO AGATO 25 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 52:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 45 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová
- 155 (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: 0-542 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 52: GGATTACGTA GTTAACGCGG GGGGGGCGTA GGGGGGGATA AAAAT 45 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 55:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 47 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: 0-544 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 53: CTAGATTTTT ATGGCCGGCT AGGCCGCGGC CGCGTTAACT ACGTAAT 47 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 54:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 50 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: 0-541 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 54: CTTTTTCTGG GGCCGCGGAT ATGGCGCGGT CGGGTTAACT ACGTSGACGT 50 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 55s (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 53 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární
- 156 (ii) typ molekuly! jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DITA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: o-545 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 55 GTACGTAGTT AAGCGGAGGG GGCCATATAG GCGGCGGCCG GAGAAAAAGG ATG 55 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 56:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 51 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh. vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DITA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: o-selPI (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 56: GGATAAAAAT TGAAATTTTA TTTTTTTTTT TTGGAATATA AATAAGGGGT O 51 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo 57* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 53 párů nukleotidů (?) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: o-selFII (xi) popis sekvence: sekvence identifikační Číslo 57
ΡΛ-'ΌΑΠΛΖΊ.ΠΓ’ Γ' ιΤΙΓΠΛ ΓΊΓηΠΛΓΠΛφ ίΤΙΠΛΑ Λ * Λ .
Λ A 7 A ΑΓΠΛ Λ ·*· ·*ΠΓ·1Γ rn a m xxi-i.
(2) informace o sekvenci identifikační (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 14 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie : lineární číslo
53:
- 157 (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: o-330 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 53* TGGAGTTTTT ATGA 14 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 59* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 12 párů. nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: o-857 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 59* TATGATAAAA AC 12 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 60:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 40 párů nukleotidů (B) .typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly5 jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: o-NcoI (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 60: GAGGAGAAGA GAGTGGGCAT GGGGGTGAAG GGGATOAGGA 40 (2) informace o seicvenci identifikační číslo 61:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 50 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna* jednovláknová (D) topologie: lineární
158 <ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonuidLeotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: oNsil <xi) popis sekvence: sekvence identifikační Číslo 61: CATAAAJTGA TTATATOCTC ATGOATOTGT 30 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 62:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 4145 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pS2gpt-S4 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 62:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT ISO
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG atctcaacag CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG aaaagcatct TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
- 159 -
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA aaaggatcta GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC gcaattaatg 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA acagggtttc 2280
GCTCAGGTTT GCCTGTGTCA TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340
CCCGCCTGAA gttaaaaaga ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400
CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460
GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520
TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580
CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640
GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700
CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760
CTTTCCATTG TTCAGAAGGC atcagtcggc TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820
TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880
CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940
AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT gacgcgggat 3000
AAAGTGGTAT TCTCAAACAT atctcgcaag CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060
- 160 -
CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120
CTTTTACGAG AAATTAATTA TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180
GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240
TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300
ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGAA 3360
tau-i-ri-rn-rr TTTTTTTTTT TTGGCATATA AATCGTTAAC GAATTCCATG GCCCGGGAAG 3420
GCCTCGGACC GGGCCCGGCC ATATAGGCCA GCGATACCGT CGCGGCCGCG ACCTCGAGGG 3480
GGGGCCCGGT ACCCAATTCG CCCTATAGTG AGTCGTATTA CGCGCGCTCA CTGGCCGTCG 3540
'1T1TACAACG TCGTGACTGG GAAAACCCTG GCGTTACCCA ACTTAATCGC CTTGCAGCAC 3600
ATCCCCCTTT CGCCAGCTGG CGTAATAGCG AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC 3660
AGTTGCGCAG CCTGAATGGC GAATGGAAAT TGTAAGCGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC 3720
GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC 3780
TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG GTTGAGTGTT gttccagttt GGAACAAGAG 3840
TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA 3900
TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC AAGTTTTTTG gggtcgaggt GCCGTAAAGC 3960
ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT tgacggggaa AGCCGGCGAA 4020
CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT 4080
AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC 4140
GTCAG 4145 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 63:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 4277 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) cezprostřední zdroj:
(3) klon: pS2gpt-P2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 63:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
- 161 -
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG atctcaacag CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA gcacttttaa AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC aactcggtcg CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG aaaagcatct TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT ΊΤΤΤΑΑΤΤΤΑ AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAk 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT acagcgtgag CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG acaggtatcc GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
tatggaaaaa CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA gtgagcgagg 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG attcattaat 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC gcaattaatg 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
- 162 —
GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA ACAGGGTTTC 2280
GCTCAGGTTT GCCTGTGTCA TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340
CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400
CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460
GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520
TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580
CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640
GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700
CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760
CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820
TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880
CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940
AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000
AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060
CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120
CTTTTACGAG ΑΑΑΤΓΑΑΤΤΑ TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180
GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240
TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT agtcttgagt 3300
ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGTT 3360
GTTAGAGCTT GGTATAGCGG ACAACTAAGT AATTGTAAAG AAGAAAACGA AACTATCAAA 3420
ACCGTTTATG AAATGATAGA AAAAAGAATA TAAATAATCC TGTATTTTAG TTTAAGTAAC 3480
AGTAAAATAA TGAGTAGAAA ATACTATTTT TTATAGCCTA TAAATCGTTA ACGAATTCCA 3540
TGGCCCGGGA AGGCCTCGGA CCGGGCCCGG CCATATAGGC CAGCGATAGC GTCGCGGCCG 3600
CGACCTCGAG GGGGGGCCCG GTACCCAATT CGCCCTATAG TGAGTCGTAT TACGCGCGCT 3660
CACTGGCCGT CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC TGGCGTTACC CAACTTAATC 3720
GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC 3780
GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGAA ATTGTAAGCG TTAATATTTT 3840
GTTAAAATTC GCGTTAAATT TTTGTTAAAT CAGCTCATTT TTTAACCAAT AGGCCGAAAT 3900
CGGCAAAATC CCTTATAAAT CAAAAGAATA GACCGAGATA GGGTTGAGTG TTGTTCCAGT 3960
TTGGAACAAG AGTCCACTAT TAAAGAACGT GGACTCCAAC GTCAAAGGGC GAAAAACCGT 4020
CTATCAGGGC GATGGCCCAC TACGTGAACC ATCACCCTAA TCAAGTTTTT TGGGGTCGAG 4080
GTGCCGTAAA gcactaaatc GGAACCCTAA AGGGAGCCCC CGATTTAGAG CTTGACGGGG 4140
AAAGCCGGCG AACGTGGCGA GAAAGGAAGG GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 4200
GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC TTAATGCGCC 4260
GCTACAGGGC GCGTCAG
4277
163 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 64:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 4701 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: pTZ-L2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 64:
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG aggatttcgc 120
GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180
TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240
CTAGCGTCGA ggtttcagga TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGITTG 300
CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360
TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420
GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC aggtatcttg CGGGATATCA 480
ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540
GCXTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600
ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660
TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720
GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780
TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840
acgatgtatt TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900
TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960
TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020
CTCAAACATA TCTCGCAAGC ctgtcttgtg TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080
TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140
AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200
TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGGCTAT TCGACATCGA 1260
GAACATTACC CACATGATAA GAGATTGTAT CAGTTTCGTA GTCTTGAGTA TTGGTATTAC 1320
TATATAGTAT ATNNNNNNGG TAACNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1380
NNNNNNNAGA TCTCGATCCG GATATAGTTC CTCCTTTCAG CAAAAAACCC CTCAAGACCC 1440
164
GTTTAGAGGC CCCAAGGGGT TATGCTAGTT ATTGCTCANN NNNNNNNNGT CGACTTAATT 1500
AATTAGGCCT CTCGAGCTGC AGGGATCCAC TAGTGAGCTC CCCGGGGAAT TCCCATGGTA 1560
TTATCGTGTT TTTCAAAGGA AAAAAACGTC CCGTGGTTCG GGGGGCTCTN NNNNNNNNNN 1620
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1680
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1740
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1800
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1860
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1920
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1980
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2040
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2100
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NCCGCTAGAG GGAAACCGTT GTGGTCTCCC 2160
TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GATCGATTAC GTAGTTAACG CGGCCGCGGC 2220
CTAGCCGGCC ATAAAAATCT AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT 2280
CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGGAAATTGT AAACGTTAAT ATTTTGTTAA 2340
AATTCGCGTT AAATTTTTGT TAAATCAGCT CATTTTTTAA CCAATAGGCC GAAATCGGCA 2400
AAATCCCTTA TAAATCAAAA GAATAGACCG AGATAGGGTT GAGTGTTGTT CCAGTTTGGA 2460
ACAAGAGTCC actattaaag AACGTGGACT CCAACGTCAA AGGGCGAAAA ACCGTCTATC 2520
AGGGCGATGG CCCACTACGT GAACCATCAC CCTAATCAAG TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC 2580
GTAAAGCACT AAATCGGAAC CCTAAAGGGA GCCCCCGATT TAGAGCTTGA CGGGGAAAGC 2640
CGGCGAACGT GGCGAGAAAG GAAGGGAAGA AAGCGAAAGG AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG 2700
CAAGTGTAGC GGTCACGCTG CGCGTAACCA CCACACCCGC CGCGCTTAAT GCGCCGCTAC 2760
AGGGCGCGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTATTTT 2820
TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT 2880
AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT 2940
TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG 3000
CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA 3060
TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC 3120
TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTGTTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC 3180
ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG 3240
GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA 3300
ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACATGG 3360
GGGATCATGT AACTCGCCTT gatcgttggg AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG 3420
ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGCAGCAA TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG 3480
165
GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG 3540
TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG GTTTATTGCT gataaatctg 3600
GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT 3660
CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC 3720
AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT 3780
CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC ATTTTTAATT TAAAAGGATC TAGGTGAAGA 3840
TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT 3900
CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC TTTTTTTCTG CGCGTAATCT 3960
GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC 4020
TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC 4080
TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC 4140
TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG 4200
GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT 4260
CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG 4320
AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG 4380
GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT 4440
ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG 4500
GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT 4560
GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC TGATTCTGTG GATAACCGTA 4620
TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT 4680
CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA G 4701
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 65:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 3878 párů. nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pselP-gpt-32 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 65:
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120
166
GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180
TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240
CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300
CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360
TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420
GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480
ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540
GCTTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600
ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660
TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720
GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780
TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840
ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900
TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960
TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020
CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAftGCTTG gggatcatcc GTCACTGTTC 1080
TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140
AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200
TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGATAAA AAGTCGACTT 1260
AATTAATTAG GCCTCTCGAG CTGCAGGGAT CCACTAGTGA GCTCCCCGGG GAATTCCCAT 1320
GGAGGCCTTA TTTATATTCC AAAAAAAAAA AATAAAATTT CAATTTTTAT CGATTACGTA 1380
GTTAACGCGG CCGCGGCCTA GCCGGCCATA AAAATCTAGC TGGCGTAATA GCGAAGAGGC 1440
CCGCACCGAT CGCCCTTCCC aacagttgcg CAGCCTGAAT GGCGAATGGG AAATTGTAAA 1500
CGTTAATATT TTGTTAAAAT TCGCGTTAAA TTTTTGTTAA atcagctcat TTTTTAACCA 1560
ATAGGCCGAA ATCGGCAAAA TCCCTTATAA ATCAAAAGAA TAGACCGAGA TAGGGTTGAG 1620
TGTTGTTCCA GTTTGGAACA AGAGTCCACT ATTAAAGAAC GTGGACTCCA ACGTCAAAGG 1680
GCGAAAAACC GTCTATCAGG GCGATGGCCC ACTACGTGAA CCATCACCCT AATCAAGTTT 1740
TTTGGGGTCG AGGTGCCGTA AAGCACTAAA TCGGAACCCT AAAGGGAGCC CCCGATTTAG 1800
AGCTTGACGG GGAAAGCCGG CGAACGTGGC GAGAAAGGAA GGGAAGAAAG CGAAAGGAGC 1860
GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT CACGCTGCGC GTAACCACCA CACCCGCCGC 1920
GCTTAATGCG CCGCTACAGG GCGCGTCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC 1980
CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC aaatatgtat CCGCTCATGA GACAATAACC 2040
CTGATAAATG CTTCAATAAT ATTGAAAAAG GAAGAGTATG AGTATTCAAC ATTTCCGTGT 2100
CGCCCTTATT CCCTTTTTTG CGGCATTTTG CCTTCCTGTT TTTGCTCACC CAGAAACGCT 2160
- 167 -
GGTGAAAGTA AAAGATGCTG AAGATCAGTT GGGTGCACGA GTGGGTTACA TCGAACTGGA 2220
TCTCAACAGC GGTAAGATCC TTGAGAGTTT TCGCCCCGAA GAACGTTTTC CAATGATGAG 2280
CACTTTTAAA GTTCTGCTAT GTGGCGCGGT ATTATCCCGT GTTGACGCCG GGCAAGAGCA 2340
ACTCGGTCGC CGCATACACT attctcagaa TGACTTGGTT GAGTACTCAC CAGTCACAGA 2400
AAAGCATCTT ACGGATGGCA TGACAGTAAG AGAATTATGC AGTGCTGCCA TAACCATGAG 2460
TGATAACACT GCGGCCAACT TACTTCTGAC AACGATCGGA GGACCGAAGG AGCTAACCGC 2520
TTTTTTGCAC AACATGGGGG ATCATGTAAC TCGCCTTGAT CGTTGGGAAC CGGAGCTGAA 2580
TGAAGCCATA CCAAACGACG AGCGTGACAC CACGATGCCT GCAGCAATGG CAACAACGTT 2640
GCGCAAACTA TTAACTGGCG AACTACTTAC TCTAGCTTCC CGGCAACAAT TAATAGACTG 2700
GATGGAGGCG GATAAAGTTG CAGGACCACT TCTGCGCTCG GCCCTTCCGG CTGGCTGGTT 2760
TATTGCTGAT AAATCTGGAG CCGGTGAGCG TGGGTCTCGC GGTATCATTG CAGCACTGGG 2820
GCCAGATGGT AAGCCCTCCC gtatcgtagt TATCTACACG acggggagtc AGGCAACTAT 2880
GGATGAACGA AATAGACAGA TCGCTGAGAT AGGTGCCTCA CTGATTAAGC ATTGGTAACT 2940
GTCAGACCAA GTTTACTCAT ATATACTTTA GATTGATTTA AAACTTCATT TTTAATTTAA 3000
AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT AACGTGAGTT 3060
TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT GAGATCCTTT 3120
TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG 3180
TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC CAACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA 3240
GATACCAAAT ACTGTCCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT 3300
AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG CCAGTGGCGA 3360
TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG CGCAGCGGTC 3420
GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT 3480
GAGATACCTA CAGCGTGAGC ATTGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA 3540
CAGGTATCCG GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG 3600
AAACGCCTGG TATCTXTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG AGCGTCGATT 3660
TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACG CGGCCTTTTT 3720
ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATGTTC TTTCCTGCGT TATCCCCTGA 3780
TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCTTTGA GTGAGCTGAT ACCGCTCGCC GCAGCCGAAC 3840
GACCGAGCGC AGCGAGTCAG TGAGCGAGGA AGCGGAAG
3878
168 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 66:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 6476 párů. nukleotidů k3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pselP-gpl60MN (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 66:
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120
gtgggtcaat GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180
TGGTTTTACC atcaagggcc GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240
CTAGCGTCGA ggtttcagga TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300
CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360
TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420
GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480
ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540
GCTTTTGGAT acatttcacg AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600
ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660
TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720
GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780
TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840
acgatgtatt TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900
TTCGAGGGGA aaataggttg CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960
TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020
CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080
TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140
AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAftACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200
TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGATAAA aagtcgactt 1260
AATTAATTAG GCTGGTTCAG CTCGTCTCAT TCTTTCCCTT ACAGTAGGCC ATCCAGTCAC 1320
- 169 -
ACGTTTTGAC CATTTGCCAC CCATCTTATA GCAAAGCCCT TTCCAAGCCC TGTCTTATTC X380
TTGTAGGTAT GTGGAGAATA GCTCTACCAG CTCTTTGCAG TACTTCTATA ACCCTATCTG 1440
TCCCCTCAGC TACTGCTATA GCTGTGGCAT TAAGCAAGCT AACAGCACTA CTCTTTAGTT 1500
CCTGACTCCA ATACTGTAGG AGATTCCACC AATATTTGAG GACTTCCCAC CCCCTGCGTC 1560
CCAGAAGTTC CACAATCCTC GCTGCAATCA AGAGTAAGTC TCTGTGGTGG TAGCTGAAGA 1620
GGAACAGGCT CCGCAGGTCG ACCCAGATAA TTGCTAAGAA TCCATGCACT AATCGACCGG 1680
atgtgtctct GTCTCTCTCT CCACCTTCTT CTTCGATTCC TTCGGGCCTG TCGGGTCCCC 1740
TCGGAACTGG GGGGCGGGTC TGCAACGACA ATGGTGAGTA TCCCTGCCTA ACTCTATTCA 1800
CTATAGAAAG TACAGCAAAA actattctta AACCTACCAA GCCTCCTACT ATCATTATGA 1860
ATATTTTTAT ATACCACAGC CAATTTGTTA TGTCAAACCA ATTCCACAAA CTTGCCCATT 1920
TATCCAATTC CAATAATTCT TGTTCATTCT TTTCTTGTTG GGTTTGCGAT TTTTCTAGTA 1980
ATGAGTATAT TAAGCTTGTG TAATTGTCAA TTTCTCTTTC CCACTGCATC CAGGTCATGT 2040
TATTCCAAAT ATCATCCAGA GATTTATTAC TCCAACTAGC ATTCCAAGGC ACAGTAGTGG 2100
TGCAAATGAG TTTTCCAGAG CAACCCCAAA ACCCCAGGAG CTGTTGATCC TTTAGGTATC 2160
TTTCCACAGC CAGGACTCTT GCCTGGAGCT GCTTGATGCC CCAGACTGTG AGTTGCAACA 2220
TATGCTGTTG CGCCTCAATG GCCCTCAGCA aattgttctg CTGTTGCACT ATACCAGACA 2280
ATAATAGTCT ggcctgtacc GTCAGCGTCA CTGACGCTGC GCCCATAGTG CTTCCTGCTG 2340
CTCCTAAGAA CCCAAGGAAC AGAGCTCCTA TCGCTGCTCT TTTTTCTCTC TGCACCACTC 2400
TTCTCTTTGC CTTGGTGGGT GCTACTCCTA ATGGTTCAAT TGTTACTACT ΤΤΑΤΑΤΓΓΑΤ 2460
ataattcact TCTCCAATTG TCCCTCATAT CTCCTCCTCC aggtctgaag atctcggtgt 2520
CGTTCGTGTC CGTGTCCTTA CCACCATCTC TTGTTAATAG TAGCCCTGTA ATATTTGATG 2580
AACATCTAAT TTGTCCTTCA ATGGGAGGGG CATACATTGC TTTTCCTACT TCCTGCCACA 2640
TGTTTATAAT TTGTTTTATT TTGCATTGAA GTGTGATATT GTTATTTGAC CCTGTAGTAT 2700
TATTCCAAGT ATTATTACCA TTCCAAGTAC TATTAAACAG TGGTGATGTA TTACAGTAGA 2760
AAAATTCCCC TCCACAATTA AAACTGTGCA TTACAATTTC TGGGTCCCCT CCTGAGGATT 2820
GATTAAAGAC TATTGTTTTA TTCTTAAATT GTTCTTTTAA TTTGCTAACT ATCTGTCTTA 2880
AAGTGTCATT CCATTTTGCT CTACTAATGT TACAATGTGC TTGTCTTATA GTTCCTATTA 2940
TATTTTTTGT TGTATAAAAT GCTCTCCCTG GTCCTATATG TATCCTTTTT CTTTTATTGT 3000
AGTTGGGTCT TGTACAATTA ATTTGTACAG ATTCATTCAG ATGTACTATG ATGGTTTTAG 3060
CATTATCAGT GAAATTCTCA GATCTAATTA CTACCTCTTC TTCTGCTAGA CTGCCATTTA 3120
ACAGCAGTTG AGTTGATACT ACTGGCCTAA TTCCATGTGT ACATTGTACT GTGCTGACAT 3180
TTTTACATGA TCCTTTTCCA CTGAACTTTT TATCGTTACA TTTTAGAATC GCAAAACCAG 3240
CCGGGGCACA ATAGTGTATG GGAATTGGCT CAAAGGATAT CTTTGGACAA GCTTGTGTAA 3300
170
TGACTGAGGT ATTACAACTT atcaacctat AGCTGGTACT ATCATTATCT attgatacta 3360
TATCAAGTTT ATAAAGAAGT GCATATTCTT TCTGCATCTT ATCTCTTATG CTTGTGGTGA 3420
TATTGAAAGA GCAGTTTTTC ATTTCTCCTC CCTTTATTGT TCCCTCGCTA TTACTATTGT 3480
TATTAGCAGT ACTATTATTG GTATTAGTAG TATTCCTCAA ATCAGTGCAA TTTAAAGTAA 3540
CACAGAGTGG GGTTAATTTT ACACATGGCT TTAGGCTTTG ATCCCATAAA CTGATTATAT 3600
CCTCATGCAT CTGTTCTACC ATGTTATTTT TCCACATGTT AAftATTTTCT GTCACATTTA 3660
CCAATTCTAC TTCTTGTGGG TTGGGGTCTG TGGGTACACA GGCTTGTGTG GCCCAAACAT 3720
TATGTACCTC TGTATCATAT GCTTTAGCAT CTGATGCACA AAATAGAGTG GTGGTTGCTT 3780
CTTTCCACAC AGGTACCCCA TAATAGACTG TGACCCACAA TTTTTCTGTA GCACTACAGA 3840
TCATTAATAA CCCAAGGAGC ATCGTGCCCC ATCCCCACCA GTGCTGATAA TTCCTCCTGA 3900
TCCCCTTCAC GGCCATGGAG GCCTTATTTA TATTCCAAAA AAAAAAAATA AAATTTCAAT 3960
TTTTATCGAT TACGTAGTTA ACGCGGCCGC GGCCTAGCCG GCCATAAAAA TCTAGCTGGC 4020
GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGAATGGCG 4080
AATGGGAAAT TGTAAACGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA 4140
GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA 4200
CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG 4260
ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGTGAACCAT 4320
CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG 4380
GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA 4440
AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA 4500
CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG 4560
GAAATGTGCG CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGČ 4620
TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA 4680
TTCAACATTT CCGTGTCGCC CTTATTCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG 4740
CTCACCCAGA aacgctggtg AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG 4800
GTTACATCGA ACTGGATCTC AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC 4860
GTTTTCCAAT GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGTTG 4920
ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT 4980
ACTCACCAGT CACAGAAAAG CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG 5040
CTGCCATAAC CATGAGTGAT AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC 5100
CGAAGGAGCT AACCGCTTTT TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT 5160
GGGAACCGGA GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCTGCAG 5220
CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC 5280
171
AACAATTAAT AGACTGGATG GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC 5340
TTCCGGCTGG CTGGTTTATT GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA 5400
TCATTGCAGC ACTGGGGCCA GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG 5460
GGAGTCAGGC AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA 5520
TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT gatttaaaac 5580
TTCATTTTTA atttaaaagg ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA 5640
TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT 5700
CTTCTTGAGA GGTTTGTTTG CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC 5760
TACCAGCGGT CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG 5820
GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC 5880
ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG TTACCAGTGG 5940
CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG 6000
ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA 6060
CGACCTACAC CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCATTG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG 6120
AAGGGAGAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA GAGCGCACGA 6180
GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT CGCCACCTCT 6240
GACTTGAGCG TCGATTTTTG TGATGCTCGT CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA 6300
GCAACGCGGC CTTTTTACGG TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTCTTTC 6360
CTGCGTTATC CCCTGATTCT GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG 6420
CTCGCCGCAG CCGAACGACC GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG GAAG 6474
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 67:
(i) vlastnosti sekvence:
(á) délka: 6811 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh. vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (á) popis: syntetický DEA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pN2-gpta ProtS
172
(xi) popis sekvence: sekvence identifika ční číslo 67í
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT ΤΤΤΤΑΑΤΓΓΑ AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
ggtttcgcca CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC tggccititg 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
- 175 : 3
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCGTCGA CAGAAAAATT AATTAATTAT GGCCTCTCGA GCTGCAGCTG CCAAGAAGAA 2280
GATTCCTGTG CTGCTCTCAG GAAAATATGT CCCACTTGTT TTCTAATTCA ATAAAGATAC 2340
TGGTTTAAAT GTGAAGCCAC ACAAGAGAAA GATGAAGCCA AAGCTGGTCC CCCTGAGGAA 2400
TTGTTTTGAA ATAAGGCATT AGGACCCTCC ATTCAATTCA TATTTAATAG ACCACCATCT 2460
CTTCTGCCTT CATCAGGAAA AAAACAAAAA CATAAACAAA ATAGTATCTG CCTATGATTA 2520
ATAGTATTTA ATTACACGCA CTTTTGTTTG AGTTTACTTC CTTGCTTTCT GAAAAAAACA 2580
TAGGTATTTA GACACTAGTT CATGATGATA AAATTAAAAA TTTAGTTTTA CAAACAAAAA 2640
TTGAAACTGT CATTTGTAGG AAAAAAATTC AAATTTAAAA TTGTTATTTT TCACTATTCT 2700 '
TAGATAGCAA GAGAAGTAAG AATTTCTTTA CTGTGATTTA TATCACAACA GAAITTTITT 2760
CCTTGACAAA GGACCTTTTA AAAATCCCAG GAAAGGACCA CAAAATAATC AAAGACTGCA 2820
CATTGTAAAT AAAACCCTTC AGCTGTTATT GAAACATAAG TATAATTACA CACAAGGAAA 2880
AGGTATTATA AGCAGAGAAA AGATGCCTTA AGAATTCTTT GTCTTTTTCC AAACTGATGG 2940
ACATGAGTGA GCTCTAATAT CATTATGTTT AGAAATGGCT TCATCCAGAT CCAACTGTAC 3000
ACCATTAATA TTCACTTCCA TGCAGCCATT ATAAAAGGCA TTCACTGGTG TGGCACTGAA 3060
TGGAACATCT GGAAGGCCAC CCAGGTATGT GGCCACTTTT GCTTTCATTG CTTTGTCCAA 3120
E
GACGGCAAGT TGTCTTTGAA GGTCTTCATG GGAGATGGTT TCTATTTTAA GTGGTGTCGA 3180
CAACTCCAGA TTGTTTCTGT TGACTCTAAA TTCCAGATGA GATTGTTGAT CGGAACATAG 3240
ACTTAGGGCC TGTATCCGAT ATATTACAGT ATTTTCAACA GATAACAGAA TATCCTGTGA 3300
TTTTTCAGAG GTGGAGTCCA CCAAGGACAC AGCAAAGGGC ACTGTGTTGT TACCAGAAAC 3360
CAAGGCAAGC ATAACACCAG TGCCCGTGGA TGGACGAATA TTCAAGGTCA CATTTACATG 3420
CCAACCCTCA GCACTGGATA CATTATTATA ATCTATGTGA AATTGAGCAA TTCCAGAACC 3480
AGGATAGTAG GAGCCCTTCT CCACAGTAAC CAGGCAATGC TTATTTTGTT TTTCTTGAAT 3540
AATTTCCTTT ATTCCAGAAG CTCCTTGCTT CATCAAATTC CAGCTTCGTA TACATCCATC 3600
TAGACGAGGG TTAATCGGTT TAATGAGTTC ACTTTCCACT TTCCGAGGGA ATCCTGCAAA 3660
GTATACTTTG GTTTCCAGCA ATCCATTTTC CGGCTTAAAA AGGGGTCCAG GTTTATTTAT 3720
ATCCATCACA GCTTCTTTAG CTATTTTAAT GCTAATACTA TGTTCTAATT CTTCCACAGA 3780 1
CACCATATTC CATAGACCAT TATTAATAAC ATCACCTCCA GTTGTGATTT TGGATGTATG 3840
- 174 -
TTCATTCTTA AGCTGAACTT CAATCTTTCC ACCACGAAGT GCAATCAGGA GCCACGCTGA 3900
GTGATCGATA GATTCTGCGT ACAGTATCAC GCCTTCTGAA TCATATGTCC GGAAATCAAA 3960
TTCTGCTGAA AATCTGCTGA TTTCTGGCAA ACGAAATTTT AAATATAAAA CAACCCCTGC 4020
AAACTGCTCC GCCAAGTAAA GTAATTCATA CTTTGTGTCA AGGTTCAAGG GAAGGCACAC 4080
TGAAACAACC TCACAACTCT TCTGATCTTG GGCAAGTTTG AATCCTTTCT TCCCATCACA 4140
ATAGCAAGTG TAACCTCCAG GGTAATTGAC ACAAAGCTGA GCACACATGT TCTCAGAGCA 4200
TTCATCTATA TCTTCACAAG ACTTTGATTT GAGATTATAT CTGTAGCCTT CGGGGCATTC 4260
ACATTCAAAA TCTCCTGGGA TGTTCTTGCA CACAGCTGTG CCACAAATGC TTGGCTTCAA 4320
AGAGCATTCA TCCACATCTT TACAATCTTT CTTATTTGAA AGCATAACAA AACCATTTTT 4380
ACAGGAACAG TGGTAACTTC CAGGTGTATT atcacaaatt TGACTGCAAC CTCCATTTAT 4440
ATTTGAGGGA TCTTTGCATT CATTTATGTC AAATTCACAC TTTTCTCCTT GCCAACCTGG 4500
TTTACAAGTG CAAGTAAAAG AAGCTTTTCC ATCTTTGCAG CTCATATATC CATCTTCATT 4560
GCATGGCAGA GGACTACACT GGTCTGGAAT GGCATTGACA CAGCTTCTTA GGTCAGGATA ’ 4620
AGCATTAGTT GACTGACGTG CAGCAGTGAA TAACCCAGTT TGAAAAGAGC GAAGACAAAC 4680
TAAGTATTTT GGATAAAAAT aatccgtttc CGGGTCATTT TCAAAGACCT CCCTGGCTTC 4740
TTCTTTATTG CACAGTTCTT CGATGCATTC TCTTTCAAGA TTACCCTGTT TGGTTTCTTC 4800
AAGTAAAGAA TTTGCACGAC GCTTCCTAAC CAGGACTTGT GAAGCCTGTT GCTTTGACAA 4860
AAAGTTTGCC TCTGAGACGG GAAGCACTAG GAGGAGACAC GCCAGCAACG CCCCGCAGCG 4920
CCCACCCAGG ACCCCCATGG AGGCCTTATT TATATTCCAA AAAAAAAAAA TAAAATTTCA 4980
ATTTTTAGAT CCCCCAACTT AAGGGTACCG CCTCGACATC TATATACTAT ATAGTAATAC 5040
CAATACTCAA GACTACGAAA CTGATACAAT CTCTTATCAT GTGGGTAATG TTCTCGATGT 5100
CGAATAGCCA TATGCCGGTA GTTGCGATAT ACATAAACTG ATCACTAATT CCAAACCCAC 5160
CCGCTTTTTA TAGTAAGTTT TTCACCCATA AATAATAAAT ACAATAATTA ATTTCTCGTA 5220
AAAGTAGAAA ATATATTCTA ATTTATTGCA CGGTAAGGAA GTAGAATCAT AAAGAACAGT 5280
GACGGATGAT CCCCAAGCTT GGACACAAGA CAGGCTTGCG AGATATGTTT GAGAATACCA 5340
CTTTATCCCG CGTCAGGGAG AGGCAGTGCG TAAAAAGACG CGGACTCATG TGAAATACTG 5400
GTTTTTAGTG CGCCAGATCT CTATAATCTC GCGCAACCTA TTTTCCCCTC GAACACTTTT 5460
TAAGCCGTAG ATAAACAGGC TGGGACACTT CACATGAGCG AAAAATACAT CGTCACCTGG 5520
GACATGTTGC AGATCCATGC ACGTAAACTC GCAAGCCGAC TGATGCCTTC TGAACAATGG 5580
AAAGGCATTA TTGCCGTAAG CCGTGGCGGT CTGGTACCGG GTGCGTTACT GGCGCGTGAA 5640
CTGGGTATTC GTCATGTCGA TACCGTTTGT ATTTCCAGCT ACGATCACGA CAACCAGCGC 5700
GAGCTTAAAG TGCTGAAACG CGCAGAAGGC GATGGCGAAG GCTTCATCGT TATTGATGAC 5760
CTGGTGGATA CCGGTGGTAC TGCGGTTGCG ATTCGTGAAA TGTATCCAAA AGCGCACTTT 5820
- 175 -
GTCACCATCT TCGCAAAACC GGCTGGTCGT CCGCTGGTTG ATGACTATGT TGTTGATATC 5880
CCGCAAGATA CCTGGATTGA ACAGCCGTGG GATATGGGCG TCGTATTCGT CCCGCCAATC 5940
TCCGGTCGCT aatcttttca ACGCCTGGCA CTGCCGGGCG TTGTTCTTTT TAACTTCAGG 6000
CGGGTTACAA TAGTTTCCAG TAAGTATTCT GGAGGCTGCA TCCATGACAC AGGCAAACCT 6060
GAGCGAAACC CTGTTCAAAC CCCGCTTTGG GCTGCAGGAA TTCGATATCA AGCTTATCGA 6120
TACCGTCGCG GCCGCGACCT CGAGGGGGGG CCCGGTACCC AATTCGCCCT ATAGTGAGTC 6180
GTATTACGCG CGCTCACTGG CCGTCGTTTT ACAACGTCGT GACTGGGAAA ACCCTGGCGT 6240
TACCCAACTT AATCGCCTTG CAGCACATCC CCCTTTCGCC AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA 6300
GGCCCGCACC GATCGCCCTT CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGAAATTGTA 6360
AGCGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC 6420
caataggccg AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG 6480
AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC CAACGTCAAA 6540
GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG AACCATCACC CTAATCAAGT 6600
TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG CCCCCGATTT 6660
AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA 6720
GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC CACACCCGCC 6780
GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCA G 6811
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 68:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 27 párů. nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (C) druh. vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: o^rotSl (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 68: ACCCAGGAOG GCCATGGCGA AGCGCGG
176 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 69: (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 6926 párů nukleotidů (3) typ: nukleová icyselina (C) druh vlákna: jodnovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: pP2-gpl60MN (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 69:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT ΤΤΤΤΑΑΊΤΤΑ AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
- 177 -
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA aagcgggcag TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA ACAGGGTTTC 2280
GCTCAGGTTT gcctgtgtca TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340
CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG gcagtgccag GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400
CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460
GCGGGATATC aacaacatag TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520
TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580
CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640
GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700
CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760
CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820
TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2380
CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940
AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000
AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060
CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT atattttcta 3120
CTTTTACGAG AAATTAATTA TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180
GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240
TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300
ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGTT 3360
GTTAGAGCTT GGTATAGCGG ACAACTAAGT AATTGTAAAG AAGAAAACGA AACTATCAAA 3420
ACCGTTTATG AAATGATAGA AAAAAGAATA TAAATAATCC TGTATTTTAG TTTAAGTAAC 3480
AGTAAAATAA TGAGTAGAAA ATACTATTTT TTATAGCCTA TAAATCGTTC CTCATGAGAG 3540
- 178 -
TGAAGGGGAT CAGGAGGAAT TATCAGCACT GGTGGGGATG GGGCACGATG CTCCTTGGGT 3600
TATTAATGAT CTGTAGTGCT ACAGAAAAAT TGTGGGTCAC AGTCTATTAT GGGGTACCTG 3660
TGTGGAAAGA AGCAACCACC ACTCTATTTT GTGCATCAGA TGCTAAAGCA TATGATACAG 3720
AGGTACATAA TGTTTGGGCC ACACAAGCCT GTGTACCCAC AGACCCCAAC CCACAAGAAG 3780
TAGAATTGGT AAATGTGACA gaaaatttta ACATGTGGAA AAATAACATG GTAGAACAGA 3840
TGCATGAGGA TATAATCAGT TTATGGGATC AAAGCCTAAA GCCATGTGTA AAATTAACCC 3900
CACTCTGTGT TACTTTAAAT TGCACTGATT TGAGGAATAC TACTAATACC AATAATAGTA 3960
CTGCTAATAA CAATAGTAAT AGCGAGGGAA caataaaggg AGGAGAAATG AAAAACTGCT 4020
CTTTCAATAT CACCACAAGC ATAAGAGATA AGATGCAGAA AGAATATGCA CTTCTTTATA 4080
AACTTGATAT AGTATCAATA GATAATGATA GTACCAGCTA TAGGTTGATA AGTTGTAATA 4140
CCTCAGTCAT TACACAAGCT TGTCCAAAGA TATCCTTTGA GCCAATTCCC ATACACTATT 4200
GTGCCCCGGC TGGTTTTGCG ATTCTAAAAT GTAACGATAA AAAGTTCAGT GGAAAAGGAT 4260
CATGTAAAAA TGTCAGCACA GTACAATGTA CACATGGAAT TAGGCCAGTA gtatcaactc 4320
AACTGCTGTT aaatggcagt CTAGCAGAAG AAGAGGTAGT AATTAGATCT GAGAATTTCA . 4380
CTGATAATGC TAAAACCATC ATAGTACATC TGAATGAATC TGTACAAATT AATTGTACAA 4440
GACCCAACTA CAATAAAAGA AAAAGGATAC ATATAGGACC AGGGAGAGCA TTTTATACAA 4500
CAAAAAATAT AATAGGAACT ATAAGACAAG CACATTGTAA CATTAGTAGA GCAAAATGGA 4560
ATGACACTTT AAGACAGATA GTTAGCAAAT TAAAAGAACA ATTTAAGAAT AAAACAATAG 4620
TCTTTAATCA ATCCTCAGGA GGGGACCCAG AAATTGTAAT GCACAGTTTT AATTGTGGAG 4680
GGGAATTTTT CTACTGTAAT ACATCACCAC TGTTTAATAG TACTTGGAAT GGTAATAATA 4740
CTTGGAATAA TACTACAGGG TCAAATAACA ATATCACACT TCAATGCAAA ATAAAACAAA 4800
TTATAAACAT GTGGCAGGAA GTAGGAAAAG CAATGTATGC CCCTCCCATT GAAGGACAAA 4860
TTAGATGTTC ATCAAATATT ACAGGGCTAC TATTAACAAG AGATGGTGGT AAGGACACGG 4920
ACACGAACGA CACCGAGATC TTCAGACCTG GAGGAGGAGA TATGAGGGAC AATTGGAGAA 4980
GTGAATTATA TAAATATAAA GTAGTAACAA TTGAACCAIT AGGAGTAGCA CCCACCAAGG 5040
CAAAGAGAAG AGTGGTGCAG AGAGAAAAAA GAGCAGCGAT AGGAGCTCTG TTCCTTGGGT 5100
TCTTAGGAGC AGCAGGAAGC ACTATGGGCG CAGCGTCAGT GACGCTGACG GTACAGGCCA 5160
GACTATTATT GTCTGGTATA GTGCAACAGC AGAACAATTT GCTGAGGGCC ATTGAGGCGC 5220
AACAGCATAT GTTGCAACTC ACAGTCŤGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCA AGAGTCCTGG 5280
CTGTGGAAAG ATACCTAAAG GATCAACAGC TCCTGGGGTT TTGGGGTTGC TCTGGAAAAC 5340
TCATTTGCAC CACTACTGTG CCTTGGAATG CTAGTTGGAG TAATAAATCT CTGGATGATA 5400
TTTGGAATAA CATGACCTGG ATGCAGTGGG AAAGAGAAAT TGACAATTAC ACAAGCTTAA 5460
TATACTCATT ACTAGAAAAA TCGCAAACCC AACAAGAAAA GAATGAACAA GAATTATTGG 5520
AATTGGATAA ATGGGCAAGT TTGTGGAATT GGTTTGACAT AACAAATTGG CTGTGGTATA 5580
- 179 -
ΤΑΑΑΑΑΤΑΤΓ CATAATGATA GTAGGAGGCT TGGTAGGTTT AAGAATAGTT TTTGCTGTAC 5640
TTTCTATAGT GAATAGAGTT AGGCAGGGAT ACTCACCATT GTCGTTGCAG ACCCGCCCCC 5700
CAGTTCCGAG GGGACCCGAC AGGCCCGAAG GAATCGAAGA AGAAGGTGGA GAGAGAGACA 5760
GAGACACATC CGGTCGATTA GTGCATGGAT TCTTAGCAAT TATCTGGGTC GACCTGCGGA 5820
GCCTGTTCCT CTTCAGCTAC CACCACAGAG ACTTACTCTT GATTGCAGCG AGGATTGTGG 5880
AACTTCTGGG ACGCAGGGGG TGGGAAGTCC TCAAATATTG GTGGAATCTC CTACAGTATT 5940
GGAGTCAGGA ACTAAftGAGT AGTGCTGTTA GCTTGCTTAA TGCCACAGCT ATAGCAGTAG 6000
CTGAGGGGAC AGATAGGGTT ATAGAAGTAC TGCAAAGAGC TGGTAGAGCT ATTCTCCACA 6060
TACCTACAAG AATAAGACAG GGCTTGGAAA GGGCTTTGCT ATAAGATGGG TGGCAAATGG 6120
TCAAAACGTG TGACTGGATG GCCTACTGTA AGGGAAAGAA TGAGACGAGC TGAACCAGAA 6180
CGAATTCCAT GGCCCGGGAA GGCCTCGGAC CGGGCCCGGC CATATAGGCC AGCGATACCG 6240
TCGCGGCCGC GACCTCGAGG GGGGGCCCGG TACCCAATTC GCCCTATAGT GAGTCGTATT 6300
ACGCGCGCTC ACTGGCCGTC GTTTTACAAC GTCGTGACTG GGAAAACCCT GGCGTTACCC 6360
AACTTAATCG CCTTGCAGCA CATCCCCCTT TCGCCAGCTG GCGTAATAGC GAAGAGGCCC 6420
gcaccgatcg CCCTTCCCAA CAGTTGCGCA GCCTGAATGG CGAATGGAAA TTGTAAGCGT 6480
TAATATTTTG TTAAAATTCG CGTTAAATTT TTGTTAAATC AGCTCATTTT TTAACCAATA 6540
GGCCGAAATC GGCAAAATCC CTTATAAATC AAAAGAATAG ACCGAGATAG GGTTGAGTGT 6600
TGTTCCAGTT TGGAACAAGA GTCCACTATT AAAGAACGTG GACTCCAACG TCAAAGGGCG 6660
AAAAACCGTC TATCAGGGCG ATGGCCCACT ACGTGAACCA TCACCCTAAT CAAGTTTTTT 6720
GGGGTCGAGG TGCCGTAAAG CACTAAATCG GAACCCTAAA GGGAGCCCCC GATTTAGAGC 6780
TTGACGGGGA AAGCCGGCGA ACGTGGCGAG AAAGGAAGGG AAGAAAGCGA AAGGAGCGGG 6840
CGCTAGGGCG CTGGCAAGTG TAGCGGTCAC GCTGCGCGTA accaccacac CCGCCGCGCT 6900
TAATGCGCCG CTACAGGGCG CGTCAG 6926
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 70:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 49 párů. nukleotidů.
(3) typ: nukleová kyselina (3) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (Δ) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: selP promotor (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 7θ: TATGAGÁTCI AAAAATTGAA ΔΤΤΤΤΔΤΤΤΤ fTTTTTTTGG ΔΔΤΔΤΔΔΑΤ 49
- 180 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 71 i (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 34 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DKA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: oFIX.l (xi) popis sekvence: sekvence identifikační Číslo 71í TCATGTTCAC GGGGTGCATG GGGGGGGGCG CACC 34 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 72:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 5532 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: pN2gpta-FlX (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 72:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
gtgggtctcg CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
- 181 -
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT acagcgtgag CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT cactcattag GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTTGTT AATTTTCAAT TCCAATGAAT TAACCTTGGA AATCCATCTT TCATTAAGTG 2280
AGCTTTGTTT TTTCCTTAAT CCAGTTGACA TACCGGGATA CCTTGGTATA TATTCCATAT 2340
TTGCCTTTCA TTGCACACTC TTCACCCCAG CTAATAATTC CAGTTAAGAA ACTGGTCCCT 2400
TCCACTTCAG TAACATGGGG TCCCCCACTA TCTCCTTGAC ATGAATCTCT ACCTCCTTCA 2460
TGGAAGCCAG CACAGAACAT GTTGTTATAG ATGGTGAACT TTGTAGATCG AAGACATGTG 2520
GCTCGGTCAA CAAGTGGAAC TCTAAGGTAC TGAAGAACTA AAGCTGATCT CCCTTTGTGG 2580
AAGACTCTTC CCCAGCCACT TACATAGCCA GATCCAAATT TGAGGAAGAT GTTCGTGTAT 2640
TCCTTGTCAG CAATGCAAAT AGGTGTAACG TAGCTGTTTA GCACTAAGGG TTCGTCCAGT 2700
TCCAGAAGGG CAATGTCATG GTTGTACTTA TTAATAGCTG CATTGTAGTT GTGGTGAGGA 2760
ATAATTCGAA TCACATTTCG CTTTTGCTCT GTATGTTCTG TCTCCTCAAT ATTATGTTCA 2820
CCTGCGACAA CTGTAATTTT AACACCAGTT TCAACACAGT GGGCAGCAGT TACAATCCAT 2880
TTTTCATTAA CGATAGAGCC TCCACAGAAT GCATCAACTT TACCATTCAA AACAACCTGC 2940
- 182 -
CAAGGGAATT GACCTGGTTT GGCATCTTCT CCACCAACAA CCCGAGTGAA GTCATTAAAT 3000
GATTGGGTGC TTTGAGTGAT GTTATCCAAA ATGGTTTCAG CTTCAGTAGA ATTTACATAG 3060
TCCACATCAG GAAAAACAGT CTCAGCACGG GTGAGCTTAG AAGTTTGTGA AACAGAAACT 3120
CTTCCACATG GAAATGGCAC TGCTGGTTCA CAGGACTTCT GGTTTTCTGC AAGTCGATAT 3180
CCCTCAGTAC AGGAGCAAAC CACCTTGTTA TCAGCACTAT TTTTACAAAA CTGCTCGCAT 3240
CTGCCATTCT TAATGTTACA TGTTACATCT AATTCACAGT TCTTTCCTTC aaatccaaag 3300
GGACACCAAC ATTCATAGGA ATTAATGTCA TCCTTGCAAC TGCCGCCATT TAAACATGGA 3360
TTGGACTCAC ACTGATCTCC ATCAACATAC TGCTTCCAAA ATTCAGTTGT TCTTTCAGTG 3420
TTTTCAAAAA CTTCTCGTGC TTCTTCAAAA CTACACTTTT CTTCCATACA TTCTCTCTCA 3480
AGGTTCCCTT GAACAAACTC TTCCAATTTA CCTGAATTAT ACCTCTTTGG CCGATTCAGA 3540
ATTTTGTTGG CGTTTTCATG ATCAAGAAAA ACTGTACATT CAGCACTGAG TAGATATCCT 3600
AAAAGGCAGA TGGTGATGAG GCCTGGTGAT TCTGCCATGA TCATGTTCAC GCGCTCCATG 3660
GAGGCCTTAT TTATATTCCA AAAAAAAAAA ATAAAATTTC AATTTTTAGA TCCCCCAACT 3720
TAAGGGTACC GCCTCGACAT CTATATACTA TATAGTAATA CCAATACTCA AGACTACGAA 3780
ACTGATACAA TCTCTTATCA TGTGGGTAAT GTTCTCGATG TCGAATAGCC ATATGCCGGT 3840
AGTTGCGATA TACATAAACT GATCACTAAT TCCAAACCCA CCCGCTTTTT ATAGTAAGTT 3900
: TTTCACCCAT AAATAATAAA TACAATAATT AATTTCTCGT AAAAGTAGAA AATATATTCT 3960
AATTTATTGC ACGGTAAGGA AGTAGAATCA TAAAGAACAG TGACGGATGA TCCCCAAGCT 4020
TGGACACAAG ACAGGCTTGC GAGATATGTT TGAGAATACC ACTTTATCCC GCGTCAGGGA 4080
GAGGCAGTGC GTAAAAAGAC GCGGACTCAT GTGAAATACT GGTTTTTAGT GCGCCAGATC 4140
TCTATAATCT CGCGCAACCT ATTTTCCCCT CGAACACTTT TTAAGCCGTA GATAAACAGG 4200
CTGGGACACT TCACATGAGC GAAAAATACA TCGTCACCTG GGACATGTTG CAGATCCATG 4260
CACGTAAACT CGCAAGCCGA CTGATGCCTT CTGAACAATG GAAAGGCATT ATTGCCGTAA 4320
GCCGTGGCGG TCTGGTACCG GGTGCGTTAC TGGCGCGTGA ACTGGGTATT CGTCATGTCG 4380
ATACCGTTTG TATTTCCAGC TACGATCACG ACAACCAGCG CGAGCTTAAA GTGCTGAAAC 4440
GCGCAGAAGG CGATGGCGAA GGCTTCATCG TTATTGATGA CCTGGTGGAT ACCGGTGGTA 4500
CTGCGGTTGC GATTCGTGAA ATGTATCCAA AAGCGCACTT TGTCACCATC TTCGCAAAAC 4560
CGGCTGGTCG TCCGCTGGTT GATGACTATG TTGTTGATAT CCCGCAAGAT ACCTGGATTG 4620
AACAGCCGTG GGATATGGGC GTCGTATTCG TCCCGCCAAT CTCCGGTCGC TAATCTTTTC 4680
AACGCCTGGC ACTGCCGGGC GTTGTTCTTT TTAACTTCAG GCGGGTTACA ATAGTTTCCA 4740
GTAAGTATTC TGGAGGCTGC ATCCATGACA CAGGCAAACC TGAGCGAAAC CCTGTTCAAA 4800
CCCCGCTTTG GGCTGCAGGA ATTCGATATC AAGCTTATCG ATACCGTCGC GGCCGCGACC 4860
TCGAGGGGGG GCCCGGTACC CAATTCGCCC TATAGTGAGT CGTATTACGC GCGCTCACTG 4920
gccgtcgttt TACAACGTCG TGACTGGGAA AACCCTGGCG TTACCCAACT TAATCGCCTT 4980
- 1Q3 GCAGCACATC CCCCTXTCGC CAGCTGGCGT AATAGCGAAG AGGCCCGCAC CGATCGCCCT 5040
TCCCAACAGT TGCGCAGCCT GAATGGCGAA TGGAAATTGT AAGCGTTAAT ATTTTGTTAA 5100
AATTCGCGTT AAATTTTTGT TAAATCAGCT CATTTTTTAA CCAATAGGCC GAAATCGGCA 5160
AAATCCCTTA TAAATCAAAA GAATAGACCG AGATAGGGTT GAGTGTTGTT CCAGTTTGGA 5220
ACAAGAGTCC ACTATTAAAG AACGTGGACT CCAACGTCAA AGGGCGAAAA ACCGTCTATC 5280
AGGGCGATGG CCCACTACGT GAACCATCAC CCTAATCAAG TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC 5340
GTAAAGCACT AAATCGGAAC CCTAAAGGGA GCCCCCGATT TAGAGCTTGA CGGGGAAAGC 5400
CGGCGAACGT GGCGAGAAAG GAAGGGAAGA AAGCGAAAGG AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG 5460
CAAGTGTAGC GGTCACGCTG CGCGTAACCA CCACACCCGC CGCGCTTAAT GCGCCGCTAC 5520
AGGGCGCGTC AG 5532 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 73* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 14 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh. vlákna: dvouvláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (á) popis: syntetický DNá oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: přírodní gpl60MN (ix) vlastnosti:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 3··14 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 73*
CA ATG AGA GTG AAG 14
Met Arg Val Lys 1 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 74:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 4 aminokyseliny (S) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 74:
Met Arg Val Lys
- 184 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 75* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 14 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: dvojvláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: gpl60 ve viru vselP-gpl6Q (ix) povaha:
(A) název/klíč: GDS (B) umístění: 3··14 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 75* CG ATG GGG GTG AAG
Met Ala Val Lys 1 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 76* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 4 aminokyseliny (3) typ: aminokyselina (L) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 76: Met Ala Val Lys (2) informace o sekvenci identifikační číslo 77:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 18 párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: dvojvláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: Protein 3 přírodního typu
- 185 (ix) povaha:
(A) název/klíč: ODS (B) umístění: 4. .18 (xi) popis sekvence: sekvenci identifikační čtgj/io 77 s GAA ATG AGG GTG CTG GGT
Met Arg Val Leu Gly 1 5 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 73:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 5 aminokyselin (3) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 78: Met Arg Val Leu Gly i 5 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 79J (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 18 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: dvouvláknová (D) topologie: lineární (ii) 'typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: Protein S v chimérách (ix) povaha:
(A) názsv/klíč: ODS (3) umístění: 4..13 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační Číslo 79*· GGG ATG GGG GTG CTG GGT
Met Ala Val Leu Gly 1 5 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 80:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 5 aminokyselin
- 136 (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 30: Met Ala Val Leu Gly
5 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 31:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 1? párů nukleotidů (3) typ: nukleová kyselina (G) druh. vlákna: dvouvláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický LNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(3) klon: přírodní faktor XX (ix) povaha:
(A) název/klíč: GDS (3) umístění: 3··«17 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 81: TT ATG GAG GGG GTG AAG
Met Gin Arg Val Asn 1 5 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 82:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 5 aminokyselin (3) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 82: Met Gin Arg Val Asn
5 (2) informace o sekvenci identifikáční číslo 3$:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 17 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina
- 137 (G) druh vlákna: dvouvláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) dopis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostřední zdroj:
(B) klon: faktor IX vPIX č. 5 (ix) povaha:
(A) název/klíč: ODS (3) umístění 3··17 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 33: GC ATG GAG CGG GTG AAG
Met Glu Arg Val Asn 1 5 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 84:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 5 aminokyselin (3) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ií) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 84: Met Glu Arg Val Asn
5
PATE N TOV

Claims (74)

  1. PATE N TOV
    - 18$ N Á &
    - o C7 =- ÍO ' —J r~ /'Xx
    Způsob přípravy modifikovaného eukaryotického eýTbplaema^ tického -^íA-viru přímým molekulárním klonováním modifikovaného virového genomu, vyznačující se tím , že tento způsob zahrnuje stupně:
    I) modifikování za extracelulárních podmínek vyčištěné DNA molekuly, která obsahuje první genom prvního eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, čímž se získá modifikovaná DNA molekula, která obsahuje uvedený modifikovaný virový genom,
    II) zavedení uvedené modifikované DNA molekuly do první hostitelské buňky, která pakážuje uvedený modifikovaný virový genom do infekčních virionů, a
    III) isolaci infekčních virionů obsahujících modifikovaný virový genom z první hostitelské buňky.
  2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že stupeň modifikování DNA molekuly za extracelulárních podmínek obsahuje stupeň štěpení DNA molekuly endonukleasou specifickou pro sekvenci.
  3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že stupeň modifikování DNA molekuly obsahuje stupeň vložení první DNA sekvence do prvního genomu.
  4. 4. Způsob podle bodu 3. vyznačující se tím, že první DNA sekvence je vložena do prvního genomu v místě štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci.
  5. 5. Způsob podle bodu 4, vyznačující se tím, že místem štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci je jedinečné místo v prvním genomu.
  6. 6. Způsob podle bodu 5, t i m, že stupeň modifikovaní DNA molekuly obsahuje stupeň použití fosfatasy, při kterém se odstraní fosforečnánový zbytek z konce DNA segmentu, který se připraví štěpením DNA molekuly endonukleasou specifickou pro sekvenci v jedinečném místě.
    - 189
  7. 7. Způsob podle bodu 6, vyznačující se tím, že se jako první genom používá genom viru vakcínie a že se jako jedinečné místo používá místo štěpení bakteriální restrikční endonukleasou Notl nebo místo štěpení bakteriální restrikční endonukJeasou Smál.
    3. Způsob přípravy podle bodu 7, vyznačující se t í m , že první genom obsahuje druhou DNA sekvenci, která se nevyskytuje přirozené v genornu eukaryotického cytopissmatického DNA-viru a že tato druhá DNA sekvence obsahuje jedinečné místo štěpení.
  8. 9. Způsob přípravy podle bodu 3, vyznačující se t í m , že se jako první genom používá genom viru drůbežích neštovic obsahující sekvenci Bscherichia coli β-galaktosidasového genu a že se jako jedinečné místo štěpení používá místo štěpení bakteriální restrikční endonukleasou Notl.
  9. 10. Způsob přípravy podle bodu 5» vyznačující se t í m , že frvní DNA sekvence je vložena do prvního genornu viru mezi první místo štěpení první endonukleasou specifickou pro sekvenci a druhé místo štěpení druhou endonukleasou specifickou pro sekvenci.
  10. 11. Způsob přípravy podle bodu 10, vyznačující se t í m , ze jak první tak druhé místo štěpení je jedinečné v prvním genornu.
  11. 12. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že alespoň část první DNA sekvence, která je vložena do prvního genornu je pod transkripcní kontrolou promotoru.
  12. 13. Způsob podle bodu 12, vyznačující se tím, že promotor je umístěn v první DNA sekvenci, která je vložena do prvního genornu.
  13. 14. Způsob podle bodu 12, vyznačuj.ící se tím, že promotor je umístěn v modifikovaném virovém genornu proti směru vlákna první DNA sekvence, která je vložena do prvního genornu.
    - 190
  14. 15. Způsob podle bodu 12, vyznačující se tím, že promotor je využíván SNA polymerasou kočovanou modifikovaným virovým gen orném.
  15. 16. Způsob podle bodu 15, vyznačující se tím, že promotor je vhodný pro iniciaci transkripce SNA polymerasou uvedeného eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru,
  16. 17. Způsob podle bodu 15, vyznačující se tím, že promotor obsahuje modifikaci přirozeně se vyskytujícího promotoru eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru.
  17. 18. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že stupeň modifikování DNA molekuly obsahuje stupeň deletování DNA sekvence z prvního genomu.
  18. 19· Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že stupeň modifikování DNA molekuly obsahuje stupeň substituování DNA sekvence z prvního genomu.
  19. 20. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že stupeň infikování první hostitelské buňky druhým eukaryotickým oytoplasmatickým DNA-virem obsahuje druhý genom, který je expres ován, modifikovaný virový genom se tak pa kážu je do infekčních virionů.
  20. 21. Způsob podle bodu 20, vyznačující se tím, že stupeň zavedení modifikované DNA molekuly do prvn$ hostitelské buňky se provádí asi jednu hodinu po stupni infikování první hostitelské buňky druhým eukaryotiokým oytoplasmatickým DNA-virem.
  21. 22. Způsob podle bodu 20, vyznačující se tím, že se expresí druhého genomu v první hostitelské buňce neprodukují infekční viriony obsahující druhý genom.
  22. 23. Způsob podle bodu 20, vyznačující se tím, že se jako modifikovaný virový genom používá modifikovaný genom viru vakcínie, jako druhý genom genom viru drůbežích
    - 191 neštovic a jako první hostitelská buňka savčí buňka.
  23. 24. Způsob podle bodu 20, vyznačující se tím, že stupeň isolování infekčních virionů obsahujících modifikovaný virový genom obsahuje stupeň infikování druhé hostitelské buňky infekčními viriony produkovanými první hostitelskou buňkou za takových podmínek, kdy exprese druhého genomu v druhé hostitelské buňce neposkytuje infekční viriony obsahující druhý genom.
  24. 25· Způsob podle bodu 24, vyznačující se tím, že se jako modifikovaný virový genom používá modifikovaný genom viru vakcínie, jako druhý genom genom viru drůbežích neštovic a jako druhá hostitelská buňka savčí buňka·
  25. 26. Způsob podle bodu 24, vyznačující se tím, že modifikovaný virový genom obsahuje funkční gen hostitelské oblasti, který je potřebný pro to, aby se v druhé hostitelské buňce produkovaly infekční viriony a druhému genomu chybí funkční gen hostitelské oblasti.
  26. 27. Způsob podle bodu 26, vyznačující se tím, že se jako modifikovaný virový genom používá modifikovaný genom viru vakcínie obsahující funkční gen hostitelské oblasti, který je potřebný pro to, aby se v lidské buňce produkovaly infekční viriony a jako druhá hostitelská buňka se používá lidská buňka.
  27. 28. Způsob podle bodu 24, vyznačující se tím, že modifikovaný virový genom obsahuje gen selekčního markéru, druhému genu chybí gen selekčního markéru a stupeň infikování druhé hostitelské buňky se provádí za podmínek, které vedou k výběru genomu, který expresí poskytuje gen selekčního markéru.
  28. 29. Způsob podle bodu 24, vyznačující se tím, že exprese genu selekčního markéru v druhé hostitelské buňce uděluje druhé hostitelské buňce resistenci na cytotoxickou látku, která je během infikování druhé hostiteli
    - 192 ské budky přítomna v takové hladině, která je dostatečná pro výběr genomu, který expresí poskytuje gen selekčního markéru.
  29. 30. Modifikovaný eukaryotický cytoplasmatický DNA-virus, vyznačující se tím, že se připravuje přímým molekul^áním klonováním modifikovaného virového genomu podle způsobu podle kteréhokoliv z bodů 5, 11 nebo 14.
  30. 31. Modifikovaný eukaryotický cytoplasmatický DNA-virus obsahující modifikovaný virový genom, vyznačující se t í m , že modifikovaný virový genom obsahuje:
    I) první genom prvního eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, při čemž první genom obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci a toto místo štěpení je jedinečným místem v tomto virovém genomu, a
    II) první DNA sekvenci vloženou do tohoto jedinečného místa štěpení v prvním genomu.
  31. 32. Modifikovaný virus podle bodu 31,vyznačující se t í m , že první DNA sekvence se nevyskytuje přirozeně v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru.
  32. 33· Modifikovaný virus podle bodu 32, vyznačující se tím , že se jako první genom používá genom viru vakcínie a jedinečným místem je místo štěpení bakteriální endonukleasou, která je vybrána ze skupiny sestávající z Notl a Smál.
  33. 34. Modi^kovaný virus podle bodu 32, vyznačující se t i m , že první genom obsahuje druhou DNA sekvenci, která se nevyskytuje přirozeně v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, a tato druhá DNA sekvence obsahuje uvedené jedinečné místo.
  34. 35· Modifikovaný virus podle bodu 34, vyznačující se tím , že se jako první sekvence používá genom viru drůbežích neštovic obsahující druhou DNA sekvenci genu β-galaktosidasy Escherichia coli a jedinečným
    - 193 místem je místo štěpení bakteriální řestrikční endonukleasou Notl.
  35. 36. Modifikovaný virus podle bodu 32, vyznačující se tím , že alespoň část první DNA sekvence, která je vložena do jedinečného místa, je pod transkripční kontrolou promotoru.
  36. 37. Modifikovaný virus podle bodu 38, vyznačující se tím , že promotor je umístěn v první DMA sekvenci, která je vložena do prvního genomu.
  37. 38. Modifikovaný virus podle bodu 37, vyznačující se tím , že se jako prvni genom používá genom viru neštovic a promotor obsahuje modifikaci přirozeně se vyskytujícího promotoru viru neštovic.
  38. 39· Modifikovaný eukaryotický cytoplasmatický DNA-virus obsahující modifikovaný virový genom, vyznačující se tím , že tento modifikovaný virový genom obsahuje:
    I) první genom prvního eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, kde tento první genom obsahuje první místo štěpení prvni endonukleasou specifickou presekvenci a druhé místo štěpení druhou endonukleasou specifickou pro sekvenci a každé z uvedených míst štěpení je jedinečným místem v prvním genomu, a
    II) první DNA sekvenci vloženou do prvního genomu mezi první jedinečné místo a druhé jedinečné místo.
  39. 40. Modifikovaný eukaryotický cytoplasmatický DNA-virus podle bodu 39,vyznačující se tím, že první DMA sekvence se přirozeně nevyskytuje v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru.
  40. 41. Modifikovaný virus podle bodu 40, vyznačující se tím , že první genom obsahuje druhou DNA sekvenci, která se přirozeně nevyskytuje v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru a druhá DNA sekvence obsahuje první DNA sekvenci vloženou mezi první jedinečné místo a
    194 druhé jedinečné místo.
  41. 42. Modifikovaný virus podle bodu 41, vyznačující se t i m , že se jako první genom používá genom viru vakcínie a že první místo štepení i druhé místo štepení znamenají místa štěpení bakteriální restrikční endonukleasou, která je vybrána ze skupiny nukleas sestávající z Notl, Smál, Apal a Rsrll.
  42. 43. Modifikovaný eukaryotický cytoplasmatický DNA-virus obsahující modifikovaný virový genom, vyznačující se tím , že tento modifikovaný virový genom obsahuje I) první genom prvního eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, kde tento první genom obsahuje první DNA sekvenci a tato první DNA sekvence obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečným místem štěpení v modifikovaném virovém genomu, a
    II) promotor, který je umístěn tak, že DNA sekvence vložená do jedinečného místa je pod transkripční kontrolou promotoru, při čemž první DNA sekvenci chybí translační start kodon mezi promotorem a jedinečným místem.
  43. 44. Modifikovaný virus podle bodu 43, vyznačující se tím , že první DNA sekvence se nevyskytuje přirozeně v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru.
  44. 45. Modifikovaný virus podle bodu 44, vyznačující se tím , že se jako první genom používá genom viru vakcínie a že první DNA sekvence obsahuje násobné klonovací místo obsahující místa štěpení bakteriální restrikční endonukleasou Notl, Smál, Apal a Rsrll.
  45. 46. DNA mol^ula, vyznačující se tím , ž obsahuje modifikovaný virový genom modifikovaného viru podle bodu 3θ·
  46. 47. DITA molekula, vyznačující se tím, že obsahuje modifikovaný virový genom modifikovaného viru podle kteréhokoliv z bodu 31, 39 nebo 43.
    -43S
  47. 48. DNA molekula, vyznačující se tím, že obsahuje jeden konec modifikovaného virového genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, při čemž
    I) tento konec modifikovaného virového genomu obsahuje DNA sekvenci, která se přirozeně nevyskytuje v genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru,
    II) modifikovaný virový genom obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečným místem v tomto modifikovaném virovém genomu, a
    XII) DNA molekula má konec, který je homologní s koncem, který se získá štěpením uvedeného jedinečného místa v modifikovaném virovém genomu endonukleasou specifickou pro sekvenci.
  48. 49. DNA molekula podle bodu 48, vyznačující se tím, že DNA sekvence nevyskytující se přirozeně v genomu eukaryotického cytpplasmatického DNA-viru obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečným místem v modifikovaném virovém genomu.
  49. 50. Sestava pro přímé molekulární klonováni modifikovaného virového genomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-viru, vyznačující se tím, že obsahuje:
    I) vyčištěnou DNA molekulu podle bodu 48 nebo bodu 4y,
    II) DNA ligasu a
    III) roztoky pufru a reakčnich činidel vhodných pro ligaci DNA segmentů za vzniku, modfikované DNA molekuly obsahující modifikovaný virový genom.
  50. 51. Sestava podle bodu 5θ, vyznačující se tím, že dále obsahuje plasmid obsahující kazetu expresu genu obklopenou místy štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, která jsou slučitelná s insercí uvedené kasety do jedinečného místa, štěpení modifikovaného virového genomu kódovaného DNA molekulou.
  51. 52. Sestava podle bodu 50, vyznačující se tím, že dále obsahuje první hostitelskou buňku a druhý virus vhodný pro .pakážování modifikovaného virového genomu do
    - 196 infekčních virionů.
  52. 53. Plasmid, vyznačující se tím, že obsahuje segment DNA, který má místo štěpení bakteriální restrikóni enaonukleasou Notl na každém konci, při čemž uvedený DNA segment obsahuje místo štěpení endonukleasou specifickou pro sekvenci, které je jedinečné v uvedeném piasmidu.
  53. 54. Plasmid podle bodu 53, jak je uveden na obrázku 1.3, který je označen pN2, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci identifikační číslo 1.
  54. 55. Plasmid podle bodu 53, vyznačující se tím, že DNA segment dále obsahuje gen selekčního markéru pod transkripční kontrolou promotoru viru neštovic.
  55. 56. Plasmid podle bodu 5?, jak je uveden na obrázku 1.3, vyznačující se tím, že je vybrán ze skupiny plasmidů označených pN2-gpta obsahujících sekvenci identifikační číslo 2 a pN2-gptb obsahujících sekvence identifikační číslo 3«
  56. 57. Plasmid podle bodu 55, vyznačující se tím, že DNA segment dále obsahuje druhý promotor viru neštovic odštěpitelně napojený na DNA sekvenci obsahující místo štěpení restrikční endonukleasou.
    53. Plasmid podle bodu 57, jak je uveden na obrázku 4.7, který je označen pN2gpt-S4, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci identifikační číslo 14.
  57. 59. Plasmid podle bodu 57, vyznačující se tím, že dále obsahuje translační start kodon odštěpitelně napojený na DNA sekvenci, která obsahuje místo štěpení restrikční endonukleasou.
    50. Plasmid podle bodu 59, jak je uveden na obrázku 4.7, označený pN2gpt-S3A, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci identifikační číslo 13.
    - 197 61. Plasmid, vyznačující se tím , že obsahuje první hlavní klonovací místo obsahující jedinečná místa druhého hlavního klonovacího místa vektoru viru vakcínie, označeného vdTK, který je vybrán z následující skupiny plasmidů. uvedených na obrázku 4.3: pAO obsahujícího sekvenci identifikační číslo 6, pAl obsahujícího sekvenci identifikační číslo 7 a pA2 obsahujícího sekvenci identifikační číslo 8.
  58. 62. Plasmid podle bodu 61, vyznačující se tím, že dále obsahuje promotor viru neštovic a translační start kodon odštěpitelně napojený na první hlavní klonovací místo, jak ukazuje obrázek 4.4, který je vybrán ze skupiny plasmidůi pAl-Sl obsahující sekvenci identifikační číslo 9 a pA2-Sl obsahující sekvenci identifikační číslo 10.
  59. 63. Plasmid podle bodu 61, vyznačující se tím, že dále obsahuje promotor viru neštovic odštěpitelně napojený na první hlavní klonovací místo, jak ukazuje obrázek 4.5, který je vybrán ze skupiny plasmidů: pAl-S2 obsahující sekvenci identifikační číslo 11 a pA2-S2 obsahující sekvenci identifikační íóíslo 12.
  60. 64. Plasmid podle bodu 62, vyznačující se tím, že tento plasmid dále obsahuje DNA sekvenci kódující lidský protrombin, v němž je tato DNA sekvence odštěpitelně napojena na promotor viru neštovic a start kodon.
  61. 65· Plasmid podle bodu 64, jak je uveden na obrázku 5»1, označený jako plasmid pAlSl-PT, vyznačující se tím , že obsahuje sekvenci identifikační číslo 15.
  62. 66. Plasmid podle bodu 53, vyznačující se tím , že tento plasmid dále obsahuje DNA sekvenci kódující lidský plasminogen, v němž je tato sekvence DNA odštěpitelně napojena na promotor viru neštovic a start kodon.
  63. 67. Plasmid podle bodu 66, vyznačující se tím , že je vybrán z této skupiny plasmidů: pN2gpt-GPg,
    - 193 jek je uveden na obrázku 5.2, který kóduje lidský glu-plasminogen a který obsahuje sekvenci identifikační číslo 17, a pN2-gpt-IPg, jak je uveden na obrázku 5·3, který kóduje lys-plasminogen a který obsahuje sekvenci identifikační číslo 13.
    63. Plasmid podle bodu 58, vyznačující se tím, že tento plasmid dále obsahuje DNA sekvenci, která kóduje virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) gpl6O, při čemž tato sekvence je odštepitelne napojena na promotor viru neštovic a start kodon.
  64. 69. Plasmid podle bodu 68, jak je uveden na obrázku 5.4, označený pN2gpt-gpl6Q, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci identifikační číslo 19.
  65. 70. Plasmid, vyznačující se tím, že obsahuje modifikovaný EcoRI K fragment DNA viru vakcínie, z něhož je deletován genKLL hostitelské oblasti.
  66. 71. Plasmid podle bodu 70, jak je uveden na obrázku 3.1, vyznačující se t i m , že je vybrán z této skupiny plasmidů: pEcoK-dhr obsahujícího sekvenci identifikační číslo 21 a pdhr-gpt obsahujícího sekvenci identifikační číslo 22.
  67. 72. Plasmid, vyznačující se tím , že obsahuje segment genonn/viru neštovic, který obsahuje gen thymidin-kinasy viru neštovic, při čemž gen thymidin-kinasy je modifikován tak, aby zabránil expresi aktivní thymidin-kinasy.
  68. 73. Plasmid podle bodu 72, jak je uveden na obrázku 4.2, vyznačující se tím , že je vybrán z této skupiny plasmidu: pHindJ-2 obsahujícího sekvenci identifikační číslo 4 a pHindJ-3 obsahujícího sekvenci identifikační číslo 5.
  69. 74. Modifikovaný virus vakcínie, vyznačující se
    - 199 tím, že obsahuje modifikaci genomu viru vakcínie přírodního typu, který má jediné místo štěpení bakteriální restrikSní endonukleasou Notl, při čemž tato uvedená modifikace odstraňuje toto jediné místo štěpení·
  70. 75· Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 74, který je popsán na obrázku 4.1A a který je označen vAn.
  71. 76. Modifikovaný virus vakcínie, vyznačující se t i m , že obsahuje modifikaci genomu viru vakcínie přírodního typu, který má jediné místo štěpení řestrikční endonukleasou Smál, při čemž uvedená modifikace odstraňuje toto jediné místo štěpení.
  72. 77. Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 78, který je popsán na obrázku 4.1A a který je označen vdSN.
  73. 78. Modifikovaný virus vakcínie, vyznačující se tím , že obsahuje modifikaci genomu viru vakcínie přírodního typu, který má jediné místo štěpení bakteriální řestrikční endonukleasou Notl, jediné místo štěpení bakteriální řestrikční endonukleasou Smál a gen thymidin-kinasy, při čemž tato modifikace zahrnuje^ •v š
    I) modifikaci, která odstraňuje místo štpení bakteriální řestrikční endonukleasou Notl,
    II) modifikaci, která odstraňuje místo pro bakteriální řestrikční endonukleasu Smál a
    III) modifikaci, která obsahuje inserci v genu thymidin-kinasy, který obsahuje jediné místo štěpeni bakteriální řestrikční endonukleasou Notl a jediné místo štěpení bakteriální řestrikční endonukleasou Smál.
  74. 79· Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 73, který je popsán na obrázku 4.1A a který je označen vdTK.
    30. Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 79, označený vPTl, vyznačující se tím , že dále obsahuje DNA sekvenci, která kóduje lidský protrombin, při čemž tato sekvence obsahuje část plasmidu pAlSl-PT obsahujícího
    200 sekvenci identifikační číslo 15, která leží mezi místy štěpení endonukleasami Notl a Rsrll, kde poslední uvedená sekvence je vložena do vdTK mezi místa štěpení endonukleasami Notl a Rsrll.
    31. Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 79, označený vGPgf vyznačující se tím , že dále obsahuje DNA sekvenci, která obsahuje část plasmidů pN2gpt-GPg „ v kódující lidský glu-plasminogen a obsahující sekvenci identífimační číslo 17, která leží mezi místy štěpeni enaonukleasami Notl, kde poslední uvedená sekvence je vložena do vdTK v místě štěpení endonukleasou Notl.
    32. Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 79, označený VlPgl, vyznačující se tím , že dále obsahuje tu část plasmidů pN2gpt-LPg kódující lys-plasminogen a obsahující sekvenci identifikační číslo 13, která leží mezi dvěma místy štěpení endonukleasami Notl, kde poslední uvedená sekvence je vložena do vdTK v místě štěpení endonukleasou Notl.
    33. Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 79, vyznačující se tím , že dále obsahuje DNA sekvenci kódující virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) gpl60, při čemž uvedená sekvence obsahuje část.bplasmidu pN2gpt-gplS0 obsahujícího sekvenci identifikační číslo 19, která leží mezi místy štěpení endonukleasou Notl, kde poslední uvedená sekvence je vložena do vdTK v místě štěpení endonukleasou ITotl·
    34. Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 79» označený v.S4, vyznačující se tím , že dále obsahuje DNA sekvenci kódující syntetický promotor S4 viru neštovic, při čemž uvedená DNA sekvence obsahuje sekvenci oligonukleotidu P-artP^ll) sekvence identifikačního čísla 33, kde poslední uvedená sekvence je vložena do vdTK v místě štěoení endonukleasou Notl.
    35. Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 34, označený wWP,
    - 201 vyznačující se tím , že dále obsahuje DNA sekvenci kódující lidský von Willebrandův faktor, při čemž uvedená DNA sekvence obsahuje část plasmidu pvW obsahující sekvenci identifikační číslo 20, která leží mezi místy štěpení endonukleasou Notl, kde poslední uvedená sekvence je vložena do vs4 v místě štěpení endonukleasou Notl.
    86. Modifikovaný virus vakcínie, označený vdhr, v y z n a č u jící se tím , že obsahuje modifikovaný genom, kterému chybí jak funkční gen ICLL hostitelské oblasti tak funkční gen 07L hostitelské oblasti, při čemž uvedený modifikovaný genom obsahuje genom C7D~negativního kmene viru vakcínie (V/R-6/2), který má sekvenci identifikační číslo 22 vloženu do KIL místa viru vakcínie přírodního typu v místě genu KIL.
    87. Modifikovaný virus připravený podle bodu 3θ> vyznačující se tím , že exprese první sekvence v hostitelské buňce vede k produkci proteinu.
    38. Modifikovaný virus připravený podle bodu 31 nebo 39, vy značující se tím, že exprese první sekvence v hostitelské buňce vede k produkci proteinu,
    89. Modifikovaný virus podle bodu 30, vyznačující se t i m , že se jako modifikovaný virový genom používá modifikovaný genom viru neštovic.
    90. Modifikovaný virus podle kteréhokoliv z bodů 31, 39 nebo 4-3, vyznačující se tím , že se jako modifikovaný virový genom používá modifikovaný genom viru neštovic.
    91. DNA molekula podle bodu 46, vyznačující se tím , že se jako modifikovaný virový genom používá modifikovaný genom viru neštovic.
    92. DNA molekula podle bodu 47, vyznačující
    - 202 tím, že se jako modifikovaný genom používá modifikovaný genom viru neštovic.
    93. Plasmid podle bodu 68, jak je uveden na obrázku 9*1» označený pP2-gpl60j^ a obsahující sekvenci identifikační číslo 69·
    94. Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 79» vyznačující se tím , že dále obsahuje DNA sekvenci kódující virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) gp 160, při čemž uvedená sekvence obsahuje tu část plasmidu pN2gpt-gplS0 obsahujícího sekvenci identifikační číslo 69, která leží mezi místy štěpení endonukleasou Smál, kde poslední uvedená sekvence je vložena do vdTK v místě štěpení endonukleasou Smál.
    95* Plasmid podle bodu 58, vyznačující se tím, že tento plasmid dále obsahuje DNA sekvenci kódující lidský protein S, při čemž posledně uvedená DNA sekvence je odštěpitelně napojena na promotor viru neštovic a start kodon.
    96· Plasmid podle bodu 95, označený pN2-gptaProtS, jak je uvedeno na obrázku 10.1, kódující lidský protein S, vyznačující se tím , že obsahuje sekvenci identifikační číslo 67.
    97. Modifikovaný virus vakcínie podle bodu 79» označený vPr^Ss vyznačující se tím , že dále obsahuje DNA sekvenci obsahující část plasmidu pN2gptaProtS kódující lidský protein S a obsahující sekvenci identifikační číslo 67, která leží mezi dvěma místy štěpení endonukleasou Notl, při čemž poslední uvedená sekvence je vložena do vdTK v místě štěpení endonukleasou Notl.
    93. Plasmid podle bodu 58, vyznačující se tím, že tento plasmid dále obsahuje DNA sekvenci kódující lidský faktor IX, při čemž posledně uvedená DNA sekvence je odštěpitelně napojena na promotor viru neštovic a start kodon.
    - 203 95. Plasmid podle bodu. 98, označený pN2gpta-FIX, jak je uveden na obrázku 11.1, kódující lidský faktor IX, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci identifikační číslo 72.
    100. Modifikovaný virus vakcinie podle bodu 79, označený vPIX č.5, vyznačující se tím , že dále obsahuje
    DNA sekvenci obsahující část plasmidu pN2gptřPIX kódující lidský faktor IX a obsahující sekvenci identifikační číslo 72, která leží mezi dvěma místy štěpení endonukleasou Notl, při čemž posledně uvedená sekvence je vložena do vdTK v místě štěpení endonukleasou Notl.
    101. Modifikovaný virus podle bodu 35, vyznačující se tím , že genom viru drůbežích neštovic dále obsahuje DNA sekvenci kódující HIV envIIIB gen vložený do sekvence Esoherichia ooli 3-galaktosidasového genu v místě štěpení bakteriální restrikční endonukleasou Notl.
    102. Modifikovaný virus drůbežích neštovic podle bodu 101, označený jako f-envIIIB, vyznačující se tim, že dále obsahuje část plasmidu pN2gpt-gplS0 obsahující sekvenci identifikační číslo 19, která leží mezí místy štěpení endonukleasou Notl.
    Zastupuje:
CS922641A 1991-08-26 1992-08-26 Direct molecular clonal selection of an eukaryotic cytoplasmatic dna-virus modified genome CZ264192A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/750,080 US5445953A (en) 1991-08-26 1991-08-26 Direct molecular cloning of a modified poxvirus genome
US91473892A 1992-07-20 1992-07-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ264192A3 true CZ264192A3 (en) 1993-08-11

Family

ID=27115227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS922641A CZ264192A3 (en) 1991-08-26 1992-08-26 Direct molecular clonal selection of an eukaryotic cytoplasmatic dna-virus modified genome

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6265183B1 (cs)
EP (1) EP0561034B1 (cs)
JP (1) JPH06261763A (cs)
AT (1) ATE181108T1 (cs)
AU (1) AU652467B2 (cs)
BR (1) BR9203322A (cs)
CA (1) CA2076839C (cs)
CZ (1) CZ264192A3 (cs)
DE (1) DE69229390T2 (cs)
FI (1) FI111384B (cs)
HU (1) HU219369B (cs)
MX (1) MX9204926A (cs)
NO (1) NO310306B1 (cs)
PL (1) PL295733A1 (cs)
SI (1) SI9200190A (cs)
SK (1) SK264192A3 (cs)
YU (1) YU79092A (cs)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
EP0753581A1 (en) 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
EP2325321A1 (en) * 1999-05-28 2011-05-25 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector
US20040063653A1 (en) * 2000-12-21 2004-04-01 Shiver John W. Polynucleotide vaccines expressing codon optimized hiv-1 pol and modified hiv-1 pol
AU2002211948B2 (en) 2000-03-02 2007-09-13 Emory University DNA expression vectors and methods of use
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
CA2454959C (en) 2001-03-08 2018-07-10 Bernard Moss Mva expressing modified hiv envelope, gag, and pol genes
WO2002095038A2 (en) * 2001-05-23 2002-11-28 Fornix Biosciences N.V. Vectors for enhanced expression of vegf for disease treatment
US7223740B2 (en) 2001-05-23 2007-05-29 Fornix Biosciences N.V. Vectors for enhanced expression of VEGF for atrial disease treatment
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
GB2382578A (en) * 2001-11-30 2003-06-04 Isis Innovation Fowlpox-based vaccine
AU2002347317B2 (en) * 2001-11-30 2008-06-26 Isis Innovation Limited Vaccine
AU2003203527A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-30 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Control of the ratio of lap to lip
CN102199628A (zh) * 2002-05-16 2011-09-28 巴法里安诺迪克有限公司 表达插入痘病毒基因组中的同源基因的重组痘病毒
GB0215621D0 (en) * 2002-07-05 2002-08-14 Imp College Innovations Ltd Improved poxvirus vaccines
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
EP2415783B1 (en) * 2006-10-16 2016-12-14 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
GB201006405D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
AR083533A1 (es) 2010-10-22 2013-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe
EA201301173A1 (ru) 2011-04-15 2015-08-31 Дженелюкс Корпорейшн Клональные штаммы аттенуированных вакцинирующих вирусов и способы их использования
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
US20140140959A1 (en) 2012-10-05 2014-05-22 Aladar A. Szalay Energy Absorbing-Based Diagnostic and Therapeutic Methods Employing Nucleic Acid Molecules Encoding Chromophore-Producing Enzymes
WO2014127825A1 (en) 2013-02-21 2014-08-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh H5 proteins of h5n1 influenza virus for use as a medicament
WO2015103438A2 (en) 2014-01-02 2015-07-09 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
BR102015012334A2 (pt) * 2015-05-27 2016-11-29 Fundação Hemoct De Ribeirão Preto Fundherp processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea e fator vii de coagulação sanguínea
CA3011014A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Harriet Robinson Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
WO2024011250A1 (en) 2022-07-08 2024-01-11 Viromissile, Inc. Oncolytic vaccinia viruses and recombinant viruses and methods of use thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5155020A (en) 1989-03-08 1992-10-13 Health Research Inc. Recombinant poxvirus host range selection system
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5135855A (en) * 1986-09-03 1992-08-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid, versatile and simple system for expressing genes in eukaryotic cells
US5266313A (en) 1987-02-03 1993-11-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Raccoon poxvirus as a gene expression and vaccine vector for genes of rabies virus and other organisms
FR2619314B1 (fr) * 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
CH682669A5 (fr) 1989-03-08 1993-10-29 Health Research Inc Virus recombinant modifié pour exprimer un produit de gènes chez un hôte, procédés et vaccin correspondants.
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
WO1991011519A1 (en) * 1990-01-26 1991-08-08 Immuno Aktiengesellschaft Recombinantly produced blood factors and process for the expression of said blood factors, as well as vaccinia virus recombinants used in said process
US5204243A (en) 1990-02-14 1993-04-20 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus internal cores
WO1992005263A1 (en) 1990-09-25 1992-04-02 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line
US5989561A (en) 1991-03-07 1999-11-23 Virogenetics Corporation Recombinant poxvirus-calicivirus rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) compositions and uses
US5863542A (en) 1991-03-07 1999-01-26 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canaryopox virus containing heterologous HIV or SIV inserts
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
JP3602530B2 (ja) 1991-03-07 2004-12-15 ヴァイロジェネティクス コーポレイション 遺伝子操作したワクチン菌株
ATE288483T1 (de) 1992-07-30 2005-02-15 Akzo Nobel Nv Nicht-verbreitendes lebendes herpesvirusvakzin
EP1840209A3 (en) 1995-01-13 2008-03-05 Virogenetics Corporation Adeno-associated virus vectors and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP0561034A2 (en) 1993-09-22
AU652467B2 (en) 1994-08-25
EP0561034A3 (cs) 1995-04-26
FI111384B (fi) 2003-07-15
FI923828A0 (fi) 1992-08-26
YU79092A (sh) 1995-12-04
FI923828A (fi) 1993-02-27
DE69229390D1 (de) 1999-07-15
CA2076839C (en) 2007-06-12
JPH06261763A (ja) 1994-09-20
HUT69927A (en) 1995-09-28
EP0561034B1 (en) 1999-06-09
DE69229390T2 (de) 1999-11-11
ATE181108T1 (de) 1999-06-15
SI9200190A (en) 1993-03-31
BR9203322A (pt) 1993-03-30
SK264192A3 (en) 1995-08-09
PL295733A1 (en) 1993-05-17
CA2076839A1 (en) 1993-02-27
AU2126992A (en) 1993-03-04
MX9204926A (es) 1994-02-28
US6265183B1 (en) 2001-07-24
US6103244A (en) 2000-08-15
NO923323L (no) 1993-03-01
NO923323D0 (no) 1992-08-25
NO310306B1 (no) 2001-06-18
HU219369B (en) 2001-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI111384B (fi) Menetelmä modifioidun selkärankaispoxviruksen molekylaariseksi kloonaamiseksi, modifioitu virus, sen DNA ja sen käyttö
AU2020286323B2 (en) Co-stimulatory domains for use in genetically-modified cells
KR102604096B1 (ko) 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료
CN111344395A (zh) 产生经修饰的自然杀伤细胞的方法及使用方法
KR102550926B1 (ko) 이중 항체 구축물을 발현하는 aav를 포함하는 조성물 및 이들의 용도
AU2021273652A1 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
KR20180097631A (ko) 핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법
JP2023036921A (ja) 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための物質および方法
AU2018235957B2 (en) Engraftable cell-based immunotherapy for long-term delivery of therapeutic proteins
CN111979240B (zh) 一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达调控方法和调控系统
CN112912112A (zh) 肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途
CN113164560A (zh) 改善基因疗法的新工具及其用途
KR20240032025A (ko) 내이의 세포 유형-특이적 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법
CN114990157B (zh) 用于构建lmna基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN114958762B (zh) 一种构建神经组织特异过表达人源snca的帕金森病模型猪的方法及应用
CN110831614A (zh) 用于递送Na/K ATP酶/Src受体复合物拮抗剂的表达载体和相关方法
CN114958758B (zh) 一种乳腺癌模型猪的构建方法及应用
CA2515166C (en) Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome
CA2558864C (en) Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome
NL2027815B1 (en) Genomic integration
KR102290555B1 (ko) 슈도바이러스 제작용 기초유전자와 확인인자를 발현시키는 슈도바이러스 생산용 세포주
KR20220037964A (ko) 재조합 발생이 최소화된 유전자치료 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 레트로바이러스 및 상기 재조합 레트로바이러스를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN116323924A (zh) 具有最小化重组发生的基因疗法载体、包含载体的重组逆转录病毒和用于预防或治疗癌症的包含重组逆转录病毒的药物组合物
CN115245144A (zh) 用于制备富含ω-3脂肪酸的猪的试剂盒及其制备方法和应用