KR102290555B1 - 슈도바이러스 제작용 기초유전자와 확인인자를 발현시키는 슈도바이러스 생산용 세포주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신변종바이러스가 대부분 고위험병원체나 생물안전 3등급 시설에서 실험해야 하는 특성상 많이 사용되는 슈도바이러스의 생산 효율 향상을 위한 범용 슈도바이러스 생산용 세포주에 대한 것으로, 슈도바이러스 제작에 필요한 구조벡터 유전자와 제작 확인시 필요한 발현유전자를 293T 세포에 단독 또는 동시에 안정적, 지속적으로 발현시켜 슈도바이러스의 생산이 용이하고 효율을 증가시키는 세포주를 발명하였다.

Description

슈도바이러스 제작용 기초유전자와 확인인자를 발현시키는 슈도바이러스 생산용 세포주 {Pseudovirus production cell line expressing basic genes and confirmatory factors for pseudovirus production}

본 발명은 슈도바이러스 (Pseudovirus) 제작용 기초유전자와 확인인자를 발현시키는 슈도바이러스 생산용 세포주에 관한 것이다.

대부분의 신변종바이러스는 생물안전 3등급 이상의 실험실에서 실험을 수행해야 하며 고위험병원체도 다수 포함되어 있다.

한편, 슈도바이러스 (Pseudovirus)는 바이러스 감염시 tropism을 결정하는 바이러스의 envelope를 발현시켜 감염성바이러스로 진행해야 하는 모든 분야 (혈청학적 스크리닝, 백신 효능평가, 유전자 형질도입 및 바이러스 감염관련 연구 등)에 광범위하게 이용되고 있다.

슈도바이러스 제작은 세포에 구조단백 기초유전자 (packaging mix)와 종을 결정하는 target mix를 섞어 co-transfection하고 슈도바이러스를 수확하게 되는데, 이때 3 내지 5개의 DNA를 한꺼번에 도입시켜야 하므로, 불완전한 형태의 바이러스 및 낮은 효율로 바이러스가 생성되는 등의 문제가 있다. 따라서, 슈도바이러스 생산에 있어 높은 적정 농도 (titer)의 슈도바이러스를 생산해야 하는 문제가 있다.

따라서, 본 발명에서는 슈도바이러스 제작시 세포에 트랜스펙션 (transfection)되는 유전자의 수를 줄이기 위해, 종을 결정하는 유전자를 제외한 기초유전자 (packaging mix)와 확인인자 (vector plasmid)를 세포내에서 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하여, 슈도바이러스 생산 효율을 높일 수 있는 범용 슈도바이러스 생산용 세포주를 개발하였다.

더욱 자세히는, 슈도바이러스 제작에 최적화된 기초유전자 (packaging mix) 또는 발현유전자 (vector plasmid)를 각각 또는 상기 두 개 유전자를 동시에 항생제 내성 벡터에 클로닝하고, 트랜스펙션 (transfection)을 통해 세포내로 도입하였다. 이때 항생제를 지속적으로 처리하여 세포내 기초유전자가 포함되어 있는 세포만을 선별하였다. 또한, 세포주가 약 50계대까지 기초유전자와 확인인자를 지속적으로 발현하고 슈도바이러스 생산능력도 지속되는 등 안정성도 확인하였고, 이를 활용하여 메르스 임상혈청에도 적용하여 우수한 모델 (gold standard)인 프라크억제중화시험법 (PRNT)과 비교한 결과 0.9이상의 상관관계를 확인하는 등의 효용성을 확인하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 슈도바이러스 제작에 필요한 구조벡터 유전자 (packaging plasmid)와 슈도바이러스 제작에 대한 확인시 필요한 발현 유전자 (vector plasmid)를 293T 세포에 단독 plasmid 각각 또는 2개 plasmids를 안정적, 지속적으로 발현시키는 세포주를 제공한다. 본 발명에서 제작한 세포주를 이용하여 슈도바이러스를 제작시 293T 발현세포주에 발현된 유전자를 제외한 유전자만을 이용하여 슈도바이러스 생산이 가능해지고, 효율의 측면에서 볼 때, 슈도바이러스 생산 효율이 기존 293T 세포 이용시보다 3 내지 4배 증가하는 등의 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다. 또한 본 발명은 세포주가 약 50계대까지 기초유전자와 확인인자를 지속적으로 발현하고 슈도바이러스 생산능력도 지속되는 등 안정성도 확인하였고, 이를 활용하여 메르스 임상혈청에도 적용하여 우수한 모델 (gold standard)인 프라크억제중화시험법 (PRNT)과 비교한 결과 0.9이상의 상관관계를 확인하는 등의 효용성을 확인하였다.

상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 1)루시퍼레이즈 (Luciferase) 유전자; 2)형광단백질 유전자 및 3)항생제 내성 유전자;를 포함하는, 슈도바이러스 제작용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “재조합 벡터”는 슈도바이러스의 생산 효율을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “프로모터”는 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) CMV 프로모터, 레트로바이러스 (retrovirus)의 LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (rous sarcoma virus) RSV 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것인 슈도바이러스 제작용 재조합 벡터인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “형광단백질 유전자”는 증강 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein, EGFP), 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP), 노랑 형광 단백질 (Yellow Fluorescent Protein, YFP), 적색 형광 단백질 (Red Fluorescent Protein, RFP) 및 청색 형광 단백 (cyan fluorescent protein, CFP)으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “항생제 내성 유전자”는 퓨로마이신 (puromycin), 무피로신 (mupirocin), 제오신 (zeocin), 암피실린 (ampicillin), 겐타마이신 (gentamicin), 카베니실린 (carbenicillin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 카나마이신 (kanamycin), 제네티신 (geneticin), 네오마이신 (neomycin) 및 테트라사이클린 (tetracycline)으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “재조합 벡터”는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 1)gagpol 유전자; 2)항생제 내성 유전자; 3)형광단백질 유전자 및 4)루시퍼레이즈 (Luciferase) 유전자;를 포함하는, 슈도바이러스 제작용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “프로모터”는 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) CMV 프로모터, 레트로바이러스 (retrovirus)의 LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (rous sarcoma virus) RSV 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “항생제 내성 유전자”는 제오신 (zeocin), 퓨로마이신 (puromycin), 무피로신 (mupirocin), 암피실린 (ampicillin), 겐타마이신 (gentamicin), 카베니실린 (carbenicillin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 카나마이신 (kanamycin), 제네티신 (geneticin), 네오마이신 (neomycin) 및 테트라사이클린 (tetracycline)으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “형광단백질 유전자”는 적색 형광 단백질 (Red Fluorescent Protein, RFP), 증강 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein, EGFP), 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP), 노랑 형광 단백질 (Yellow Fluorescent Protein, YFP) 및 청색 형광 단백 (cyan fluorescent protein, CFP)으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “재조합 벡터”는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 1)루시퍼레이즈 (Luciferase) 유전자; 2)형광단백질 유전자 및 3)항생제 내성 유전자;로 이루어진 벡터 및 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 1)gagpol 유전자; 2)항생제 내성 유전자; 3)형광단백질 유전자 및 4)루시퍼레이즈 (Luciferase) 유전자;로 이루어진 벡터를 포함하는 슈도바이러스 제작용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 제1항의 벡터 및 제7항의 벡터 중 어느 하나 이상을 293T 세포에 트랜스펙션 (transfection)하여 포함하는 슈도바이러스 생산용 세포주를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “슈도바이러스 생산용 세포주”는 세포주가 35 내지 50계대까지 상기 제1항의 벡터 및 제7항의 벡터 중 어느 하나 이상을 지속적으로 발현하고 슈도바이러스 생산능력도 지속되는 안정성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “슈도바이러스 생산용 세포주”는 MERS S1 슈도바이러스 생산 효율이 기존 293T 세포주 대비 3 내지 4배를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 슈도바이러스 제작에 필요한 구조벡터 유전자 (packaging plasmid)와 슈도바이러스 제작에 대한 확인시 필요한 발현 유전자 (vector plasmid)를 293T 세포에 단독 플라스미드 각각 또는 2개의 플라스미드를 안정적 및 지속적으로 발현시키는 세포주에 대한 것이다.

본 발명에 따라 제작된 범용 슈도바이러스 생산용 세포주를 이용할 경우, 신변종바이러스의 감염성 실험에 필요한 슈도바이러스 제작시 필요한 유전자의 종류가 감소하고, 제작효율이 증가하므로, 추후 신변종바이러스를 이용한 백신 평가, 혈청학적 진단법 개발, 감염기전 확인 등 바이러스 감염을 기초로 한 모든 연구 및 제품 개발, 평가 등에 다양하게 활용 가능할 것이다.

도 1은 본 발명의 기존 슈도바이러스 제작모식도 (A)와 지속발현 범용 슈도바이러스 생산 세포를 이용한 슈도바이러스 제작 모식도 (B)를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 슈도바이러스 제작용 세포주 개발용 기초유전자 클로닝 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 pLenti cloning vector를 통한 확인인자 (vector plasmid) 발현 (상기 도 1의 제작방법 B 중 b의 관련 세포주 제작 벡터)을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 pNL4.3 cloning vector의 확인인자 발현을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 pLenti cloning vector의 FACS sorting를 통한 세포주 (상기 도 1의 제작방법 B 중 b의 관련 세포주) 선별 및 유지를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 pNL4.3 cloning vector의 기초유전자 (packaging plasmid) 발현 확인 및 세포주 선별 (상기 도 1의 제작방법 B 중 a, c의 관련 세포주 제작)을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 제오신 (Zeocin) 항생제를 이용한 세포주 선별을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 기존 방법에 비해 고농도 슈도바이러스 제작 가능성을 루시퍼라아제 (luciferase) activity로 확인 결과 (VSV-G 이용)를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 메르스 S1 슈도바이러스 생산시 기존방법과 범용 슈도바이러스 생산 세포주 이용시 효율비교를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 MERS S 슈도바이러스 제작 효율 비교한 도이다.
도 11은 본 발명의 2nd generation 메르스 S 슈도바이러스 제작을 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 1st 메르스 S 슈도바이러스 시간대별 생산 효율을 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 Stable 세포주로 제작한 메르스 슈도바이러스에 대한 중화능을 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 2016년 (이전 발명) 및 2018년 (본 발명)의 PNT50 실험결과를 비교한 도이다.
도 15는 본 발명의 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA)와 PNT50의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 프라크억제중화시험법 (PRNT)와 PNT50의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명의 세포주 계대배양에 따른 기초유전자의 지속 발현유무를 확인한 도로, (A) GFP 발현을 확인 (30kDa) 및 (B) Luciferase 발현을 확인 (60kDa)한 도이다.
도 18은 본 발명의 세포주 계대배양에 따른 기초유전자의 지속 발현유무를 확인한 도로, (C) P24 발현을 확인 (24kDa), (D) Red Fluorescence Protein (RFP) 발현을 확인 (36kDa) 및 (E) GAPDH 발현을 확인 (37kDa)한 도이다.
도 19는 본 발명의 p24 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA) 모식도 및 MERS 슈도바이러스의 계대별 생산능을 확인한 도이다.
도 20은 본 발명의 p24 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA) 조건을 확인하여 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명의 p24 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA) 조건을 확인하여 나타낸 도이다.
도 22는 본 발명의 MERS 슈도바이러스 계대별 생산능을 확인 (p24 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA))한 도이다.
도 23은 본 발명의 기초유전자 발현 세포주의 계대별 슈도바이러스 생산능을 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.

일 측면에서, 본 발명은 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 1)루시퍼레이즈 (Luciferase) 유전자; 2)형광단백질 유전자 및 3)항생제 내성 유전자;를 포함하는, 슈도바이러스 제작용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 일 측면에서, 본 발명은 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 1)gagpol 유전자; 2)항생제 내성 유전자; 3)형광단백질 유전자 및 4)루시퍼레이즈 (Luciferase) 유전자;를 포함하는, 슈도바이러스 제작용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli (예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C.(1984), J. Bacteriol., 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.(1980), Ann. Rev. Genet., 14:399-445)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 바이러스 벡터, 선형 DNA 및 플라즈미드 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에서 용어, "바이러스 벡터"는 원하는 세포, 조직 및/또는 기관으로 치료 유전자 또는 유전물질을 전달할 수 있는 바이러스 벡터이다.

상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 (Adenovirus), 아데노 조력 바이러스 (Adeno-associated virus), 렌티바이러스, 레트로바이러스, HIV (Human immunodeficiency virus), MLV (Murine leukemia virus), ASLV (Avian sarcoma/leukosis), SNV (Spleen necrosis virus), RSV (Rous sarcoma virus), MMTV (Mouse mammary tumor virus) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 예로, 레트로바이러스 (Retrovirus)는 숙주세포의 게놈에 통합기능이 있으며, 인체에 해가 없지만 통합 시 정상세포의 기능을 억제할 수 있고, 다양한 세포에 감염되고, 증식이 쉬우며, 1~7 kb 정도의 외부 유전자를 수용할 수 있고, 복제결핍 바이러스를 생성할 수 있는 능력이 있다는 특징을 갖는다. 그러나 레트로바이러스는 유사분열 이후의 세포에 감염되기 힘들며, in vivo 상태에서 유전자 전달이 어렵고, 체세포 조직을 항시 in vitro에서 증식하여야만 한다는 단점도 지니고 있다. 또한, 레트로바이러스는 원형암유전자 (proto-oncogene)에 통합될 수 있어 돌연변이의 위험성이 있고 세포를 괴사시킬 수도 있다.

한편, 아데노바이러스 (Adenovirus)는 클로닝 벡터 (cloning vector)로 여러가지 장점을 가지는데, 중간정도의 크기로 세포 핵 속에서 복제될 수 있으며, 임상적으로 무독성이고, 외부 유전자를 삽입하여도 안정적이며, 유전자의 재배열이나 손실이 일어나지 않고, 진핵생물을 형질전환시킬 수 있으며, 숙주세포 염색체에 통합되어도 안정적이면서도 높은 수준으로 발현된다. 아데노바이러스의 좋은 숙주세포는 인간의 조혈, 림프, 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나 선상 DNA라서 증식이 어렵고, 감염된 바이러스를 회복시키는 것이 쉽지 않으며, 바이러스의 감염율이 낮다. 또한 전달된 유전자의 발현이 1~2주 후에 가장 많이 되고, 일부 세포에서는 3~4주 정도만 발현이 유지된다. 또한, 문제가 되는 것은 높은 면역 항원성을 갖는다는 것이다.

아데노-조력 바이러스 (Adeno-associated virus, AAV)는 상기와 같은 문제점들을 보완할 수 있으면서, 유전자 치료제로의 많은 장점을 가지고 있어 최근에 선호되고 있다. 이는는 아데노-위성 바이러스 (adeno-satellitovirus)라고도 불린다. 아데노-조력 바이러스 입자의 직경은 20 nm이며, 인체에 해가 거의 없는 것으로 알려져 유럽에서 유전자 치료제로 판매가 승인되기도 하였다.

상기 아데노-조력 바이러스는 단일가닥의 원바이러스 (Provirus)로서, 복제하기 위하여 보조 바이러스를 필요로 하고, 아데노-조력 바이러스 게놈 (genome)은 4,680 bp로서 감염세포의 염색체 19번 특정부위에 삽입이 가능하다. 트랜스 유전자 (trans-gene)는 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복 (inverted terminal repeat, ITR) 서열부분과 시그날 서열 (signal sequence)부분에 의해 연결된 플라즈미드 DNA (plasmid DNA)에 삽입된다. 아데노-조력 바이러스 rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 다른 플라즈미드 DNA와 함께 트랜스펙션 (transfection)시키고 아데노 바이러스는 보조 바이러스로서 첨가한다. 아데노-조력 바이러스는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고, 반복투여 시 면역 부작용이 적으며, 유전자 발현 기간이 긴 장점을 지니고 있다. 더구나, 아데노-조력 바이러스 게놈이 숙주세포의 염색체에 통합되어도 안전하고, 숙주의 유전자발현을 변형시키거나 재배열시키지 않는다.

상기 아데노-조력 바이러스는 4종의 혈청형이 있는 것으로 알려져 있다. 목적 유전자의 전달에 사용될 수 있는 많은 아데노-조력 바이러스의 혈청형들 중에서, 가장 널리 연구된 벡터는 아데노-조력 바이러스 혈청형 2 (Adeno-associated virus serotype 2)로, 낭포성섬유증, 혈우병 및 카나반 병의 임상적 유전자 전달에 현재 사용되고 있다. 또한, 최근에는 암 유전자 치료 분야 (cancer gene therapy)에서 rAAV (recombinant adeno-associated virus)의 잠재성이 증가하고 있다. 본 발명 에서 사용한 것 역시 아데노-조력 바이러스 혈청형 2이며, 적절한 바이러스벡터를 선택하여 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 벡터에서 외래 유전자를 발현시키는 경우, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터 및 HSV의 사 프로모터)가 이용될 수 있으며, 구체적으로, 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터, 레트로바이러스의 LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스 RSV 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며, 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 퓨로마이신 (puromycin), 제오신 (zeocin), 무피로신 (mupirocin), 암피실린 (ampicillin), 겐타마이신 (gentamicin), 카베니실린 (carbenicillin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 카나마이신 (kanamycin), 제네티신 (geneticin), 네오마이신 (neomycin) 및 테트라사이클린 (tetracycline)에 대한 내성 유전자가 있으나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1. 슈도바이러스 신속제작용 세포주 개발 위한 벡터 구축

1-1. 슈도바이러스 제작용 stable cell line 개발을 위한 기초유전자 클로닝

슈도바이러스 최종 생산 여부는 제작 후 vero cell이나 huh-7 cell에 감염 72시간 후에 루시퍼레이즈 (luciferase)나 베타-갈락토시다아제 (beta-galactosidase)를 통해 확인하는데, 시간 단축을 위해 슈도바이러스 제작용 stable cell line 구축용 벡터에 형광 유전자와 지속유지에 필요한 항생제 유전자를 추가하였다. 도 2에서 슈도바이러스 제작용 기초유전자 클로닝 모식도를 나타내었다.

1-2. 슈도바이러스 제작용 stable cell line 위한 기초유전자 발현 확인

(1) 벡터의 세포내 정상 작동확인을 위해 슈도바이러스 기초유전자 중 (A) pLenti-Puro-CMV-LUC-EGFP clone을 293T 세포에 트랜스펙션 (transfection) 후 72시간 뒤 녹색형광단백직 (green fluorescent protein; GFP)와 루시퍼레이즈 (luciferase) activity를 확인하였다 (도 3참조).

(2) pNL4.3-Zeo-LUC-RFP clone도 트랜스펙션 (transfection) 후 RFP, P24 (gagpol)의 발현 확인시 슈도바이러스 제작에 필요한 gagpol, RFP, Luciferase activity가 전부 확인된 clone이 도 4에서와 같이 2-9번임을 확인하여 FACS sorting (Fluorescence Activated Cell Sorting) 하였다.

1-3. 슈도바이러스 신속제작용 기초유전자 발현 세포주 선별 및 유지

(1) pLenti-Puro-CMV-LUC-EGFP clone을 트랜스펙션 (transfection)하고 FACS sorting (Fluorescence Activated Cell Sorting) 후 형광발현과 puromycin으로 선별하였다 (도 5참조).

(2) 선별한 GFP 발현 pLenti-Puro-CMV-LUC-EGFP stable 293T 세포주에 pNL4.3-Zeo-LUC-RFP를 트랜스펙션 (transfection)하여 확인인자가 발현되는 것을 확인하였다 (도 6참조).

(3) pNL4.3-Zeo-LUC-RFP clone을 293T 세포와 pLenti-Puro-CMV-LUC-EGFP 293T stable 세포주에 트랜스펙션 (transfection)한 경우 FACS sorting (Fluorescence Activated Cell Sorting)시 red 형광 선별이 불가능하여 zeocin 항생제로 세포주 선별을 진행하였다 (도 7참조).

1-4. 슈도바이러스 발현용 세포주를 이용한 슈도바이러스 제작

하기 표 1과 같이 슈도바이러스 제작 방법에 따른 벡터를 선별하였다.

	기존방법	Stable cell 방법
홍콩대 제공	pNL4.3-Luc-R.E pCAGGS-MERS-S	-
KNIH 자체제작	pNL4.3-Luc-R.E pcDNA3.1-S1(Kor) pLenti-CMV-Luc	-
PC(VSV-G)	pNL4.3-Luc-R.E pVSV-G pLenti-CMV-Luc	-
GFP (pLenti) stable cell + VSV-G	pNL4.3-Luc-R.E pVSV-G pLenti-CMV-Luc	pNL4.3-Luc-R.E pVSV-G
RFP (tdTomato) stable cell + VSV-G	pNL4.3-Luc-R.E pVSV-G pLenti-CMV-Luc	pVSV-G pLenti-CMV-Luc
GFP & RFP stable cell + VSV-G	pNL4.3-Luc-R.E pVSV-G pLenti-CMV-Luc	pVSV-G

(1) 기존 방법과 stable cell을 이용한 슈도바이러스의 발현량을 비교하기 위해, Envelope를 발현하는 VSV-G vector를 이용하여 기존 방법과 선별된 세포 (Stable cell 1: pLenti-Puro-CMV-LUC-EGFP stable 293T cell, stable cell 2: pNL4.3-Zeo-LUC-RFP clone, stable cell 3: pLenti-Puro-CMV-LUC-EGFP vector 및 pNL4.3-Zeo-LUC-RFP vector 2개가 동시에 발현된 세포주)에서 트랜스펙션 (transfection) 후 슈도바이러스를 수확 하고 루시퍼라아제 (luciferase) activity를 확인하였다.

(2) 도 8에서 나타난 것과 같이 기존방법에 비해 루시퍼레이즈 (luciferase) activity가 증가하여 고농도 슈도바이러스 제작 가능성을 확인하였고, 여러개의 vector를 트랜스펙션 (transfection) 할 필요없이 간편하게 제작할 수 있는 가능성을 확인하였다.

실시예 2. 기초유전자 발현 세포주를 이용한 슈도바이러스 제작

2-1. 기초유전자 발현 세포주를 이용한 generation별 제작

(1) 상기 실시예 1에서 확립한 기초유전자 발현 세포주를 이용하여 메르스 슈도바이러스 제작용 벡터들을 다양하게 조합하여 제작하였다.

(2) 벡터의 비율과 농도 transfection reagent 종류에 따른 생성효율을 최적화하였고, 벡터 비율 [plenti stable cell=packing vector:MERS-S 발현 벡터= 1:1, pNL4.3 stable (RFP) cell=luciferase 발현 벡터: MERS-S 발현 벡터= 1:1]과 Transfection reagent[fugene HD reagent]가 가장 적합함을 확인하였다.

(3) 또한, 기존 293T 세포를 이용한 슈도바이러스 제작을 대조군으로 우선적으로 MERS S1 슈도바이러스 생산 효율을 비교해 보았다. 도 9에서 나타난 것과 같이 기초유전자 발현 세포주들 중 특정 세포주의 경우, stable 방법 (stable 세포내의 벡터를 제외한 1~2개 벡터로 제작) 이용시 3 내지 4배의 luciferase activity를 가지는 것을 확인하였다.

(4) 선별된 세포주를 이용하여 MERS S 슈도바이러스 generation별 벡터를 이용하여 슈도바이러스를 제작한 결과, 도 10에서 나타난 것과 같이 1st generation 방법으로는 기초유전자 발현 세포주의 종류에 상관없이 기존 방법보다 luciferase activity 효율이 높은 것을 확인하였고, 2nd 및 3rd generation 방법은 벡터의 종류 및 농도, 비율을 다양하게 진행한 결과 pLenti stable 세포주와 pLenti+pNL stable 세포주에서 생산 가능한 것을 확인하였다. 하지만, 1st generation 방법이 가장 고농도의 슈도바이러스 제작이 가능하므로 메르스바이러스의 슈도를 이용한 중화실험은 1st generation으로 제작한 슈도바이러스를 적용하였고, 2nd 및 3rd 방법은 추후 다른 병원체 슈도바이러스 제작에 적용할 수 있을 것으로 보인다 (도 11참조).

(5) 그 후 1st generation 방법의 최적효율을 확인하기 위해 감염후 시간대별 luciferase activity를 측정시 도 12에서와 같이 48hr 이후가 슈도바이러스 생성효율이 높은 것을 확인할 수 있었다.

2-2. MERS 슈도바이러스를 이용한 중화능 평가법 적용

메르스 임상혈청 105건 (기존 메르스 발생시 슈도바이러스 중화능 실험이 진행된 검체)에 대해 실험을 수행하고 이전 실험결과와 비교분석하였다.

중화실험은 Huh-7 세포에서 진행하였고, 혈청희석배수는 1/20부터 2-fold 로 1/40960까지 측정하였고, 중화능 선정기준으로 메르스 슈도바이러스가 혈청없이 나타나는 기본 luciferase activity의 50%를 중화하는 희석배수를 PNT50으로 설정하였다. 도 13에 Stable 세포주로 제작한 메르스 슈도바이러스에 대한 중화능을 나타내었고, 도 14에는 2016년과 2018년 (본 발명)의 PNT50 실험결과 비교한 것을 나타내었다.

슈도바이러스 중화능에 대한 경향성은 2016년 결과와 비슷하나 stable 세포주로 만든 슈도바이러스는 초기단계 중화능이 상대적으로 낮고, peak 기간이 좀더 높은 중화능을 보이는 것을 확인하였다. 이는 luciferase activity가 기존 (5만미만)에서 10만으로 2배 이상 향상되어 높은 혈청 희석배수에서 검출이 안됐던 수치가 검출되는 등의 이유로 추정된다.

2-3. 혈청학적 진단법간 비교

혈청학적 검사법간 상관 관계 (correlation)를 비교한 결과, affinity를 확인하는 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA)와 중화능을 보는 프라크억제중화시험법 (PRNT), PNT는 상관관계가 다소 낮은 0.6~0.7 정도를 보이며 프라크억제중화시험법 (PRNT)와 PNT같은 경우 0.9의 상관관계를 확인하였다 (도 15 및 도 16참조).

2-4. 기초유전자 발현 세포주 검증

(1) 기초유전자 발현 세포주의 기능유지 기간을 확인하기 위해 50 계대 (passage)까지 계대배양을 통해 계대 (passage)별 유전자 발현 유지정도와 슈도바이러스 제작가능 여부를 확인하였다. 도 17의 (A)에서는 GFP 발현을 확인 (30kDa) 할 수 있었고, 도 17의 (B)에서는 Luciferase 발현을 확인 (60kDa) 하였다. 또한, 도 18의 (C)에서는 P24 발현을 확인 (24kDa) 하였으며, 도 18의 (D)에서는 Red Fluorescence Protein(RFP) 발현을 확인 (36kDa) 하였고, 도 18의 (E)에서는 GAPDH 발현을 확인 (37kDa) 하였다.

(2) p24 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA) (슈도바이러스 particle과 p24 항체와의 결합능 확인)를 확립하여 슈도바이러스 제작능을 간접적으로 확인하였다. 도 19에는 p24 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA) 모식도 및 조건확인 실험을 나타낸 것이고, 도 20에는 p24 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA)조건 확인 결과를 나타내었다. p24 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA) 조건으로 B Ab (antibody) 100ng, 슈도바이러스 1/4 희석, biotin p24 Ab 1:1000, 스트렙타비딘 (streptavidin) HRP Ab 1:1000로 5~50 계대 (passage)까지 3 계대 (passage) 간격으로 제작된 슈도바이러스에 반응성을 확인하였다. 세포주 계대배양에 따른 슈도바이러스 제작능을 지속적으로 유지할 수 있는지 ELISA를 통해 간접적으로 확인한 결과, 도 21에서 나타난 것과 같이에서 1) pNL4.3-Zeo-LUC-Tomato (tdTomato) 세포주의 경우 38계대, 2) pLenti-Puro-CMV-LUC-EGFP (pLenti) 세포주의 경우 50계대, 3) pNL4.3-Zeo-LUC-Tomato 및 pLenti-Puro-CMV-LUC-EGFP 세포주의 경우 41계대까지 안정적으로 슈도바이러스를 생산할 수 있는 것을 확인하였다.

따라서, p24 효소면역정량법 (Enzyme Linked Immunosorbent assays; ELISA) 결과 기초유전자 발현 세포주 중 일부에서 50 계대 (passage) 까지 슈도바이러스 제작능을 지속적으로 유지하는 것을 확인하여 stable한 세포주로 추후 신종 바이러스 슈도바이러스 제작시 활용할 수 있다 (도 21 및 도 22참조).

따라서 본 발명은 신변종바이러스가 대부분 고위험병원체나 생물안전 3등급 시설에서 실험해야 하는 특성상 많이 사용되는 슈도바이러스의 생산 효율 향상을 위한 범용 슈도바이러스 생산용 세포주에 대한 것으로, 슈도바이러스 제작에 필요한 구조벡터 유전자와 제작 확인시 필요한 발현유전자를 293T 세포에 단독 또는 동시에 안정적, 지속적으로 발현시켜 슈도바이러스의 생산이 용이하고 효율을 증가시키는 세포주를 발명을 완성하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다.본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> KOREA CENTERS FOR DISEASE CONTROL & PREVENTION <120> Pseudovirus production cell line expressing basic genes and confirmatory factors for pseudovirus production <130> PN1911-651 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector name is pLenti-puro-CMV-Luc-EGFP <400> 1 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480 acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg 540 ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag 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Claims (15)

1. 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 1)루시퍼레이즈 (Luciferase) 유전자; 2)형광단백질 유전자 및 3)항생제 내성 유전자;로 이루어진 확인인자를 포함하는 재조합 벡터 및 프로모터; 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 1)gagpol 유전자; 2)항생제 내성 유전자; 3)형광단백질 유전자 및 4)루시퍼레이즈 (Luciferase) 유전자;로 이루어진 기초유전자를 포함하는 재조합 벡터를 293T 세포에 트랜스펙션 (transfection)하는 1단계; 및
   상기 1단계에서 트랜스펙션된 확인인자를 포함하는 재조합 벡터 및 기초유전자를 포함하는 재조합 벡터가 포함된 293T 세포를 선별하는 2단계;를 포함하는 슈도바이러스 제작용 안정화 세포주(stable cell line) 제조방법에서,
   상기 안정화 세포주는 슈도바이러스의 생산 효율을 증가시키는 것이며,
   상기 안정화 세포주는 35 내지 50계대까지 상기 제1단계에서 트랜스펙션 재조합 벡터를 지속적으로 발현하고 슈도바이러스 생산능력 지속되는 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는, 슈도바이러스 제작용 안정화 세포주(stable cell line) 제조방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) CMV 프로모터, 레트로바이러스 (retrovirus)의 LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (rous sarcoma virus) RSV 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것인 슈도바이러스 제작용 안정화 세포주(stable cell line) 제조방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 형광단백질 유전자는, 증강 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein, EGFP), 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP), 노랑 형광 단백질 (Yellow Fluorescent Protein, YFP), 적색 형광 단백질 (Red Fluorescent Protein, RFP) 및 청색 형광 단백 (cyan fluorescent protein, CFP)으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것인 슈도바이러스 제작용 안정화 세포주(stable cell line) 제조방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 항생제 내성 유전자는, 퓨로마이신 (puromycin), 무피로신 (mupirocin), 제오신 (zeocin), 암피실린 (ampicillin), 겐타마이신 (gentamicin), 카베니실린 (carbenicillin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 카나마이신 (kanamycin), 제네티신 (geneticin), 네오마이신 (neomycin) 및 테트라사이클린 (tetracycline)으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것인 슈도바이러스 제작용 안정화 세포주(stable cell line) 제조방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 확인인자를 포함하는 재조합 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것인 슈도바이러스 제작용 안정화 세포주(stable cell line) 제조방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 제1항에 있어서,
    상기 기초유전자를 포함하는 재조합 벡터는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것인 슈도바이러스 제작용 안정화 세포주(stable cell line) 제조방법.
12. 삭제
13. 제1항, 제3항 내지 제6항 및 제11항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 슈도바이러스 제작용 안정화 세포주(stable cell line).
14. 삭제
15. 메르스 바이러스의 Envelope를 발현하는 MERS-S 발현 벡터를 제13항의 안정화 세포주 (stable cell line)에 트렌스펙션 (transfection)하는 단계;를 포함하는 MERS S1 슈도바이러스 생산 방법에서,
    상기 방법은 MERS S1 슈도바이러스 생산 효율이 기존 293T 세포주 대비 3 내지 4배를 갖는 것을 특징으로 하는, MERS S1 슈도바이러스 생산 방법.
    

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