CN108277208B - 携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆及制备方法和应用。一种携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.1所示。该感染性克隆成功制备出携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒。本发明成功获得的稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒，在神经元标记、脑结构分析、核磁共振成像、水疱性口炎病毒神经毒性分析等方面具有广泛的应用价值。

Description

携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克 隆及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆的制备方法和应用，利用本发明提供的方法制备的感染性克隆，可成功拯救出病毒，用于包括在神经元标记、脑结构分析、核磁共振成像、水疱性口炎病毒神经毒性分析中。

背景技术

人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础，神经网络的正常连接，使得机体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，尚无有效手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。目前嗜神经病毒在脑神经网络连接信息中的应用日益广泛，但是能够快速进行神经元标记并进行活体全脑成像的方法尚不成熟。因此，开发的能够进行活体神经网络连接信息提取的工具十分重要，且有巨大的应用前景。

核磁共振成像是一种对大脑神经环路进行无创检测的方式，它可以提供大脑的结构、功能以及代谢信息，因此近年来被广泛用于科学研究和临床诊断中。磁共振成像提供了大脑脑区之间的功能连接信息，但并不提供神经元之间的精确解剖信息以及突触连接情况。转铁蛋白被证实可以作为磁共振成像的报告基因，并通过腺病毒的方式提供核磁信息。然而由于其表达丰度较低以及腺病毒不能跨突触传播的局限，在用于神经科学研究时，并不能提供大脑的结构信息。

水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)属于弹状病毒科水疱病毒属，其基因组为单股负链RNA，长度约为11kb。基因组编码3个结构蛋白(N、M和G)和2个非结构蛋白(P和L)。水疱性口炎病毒具有广泛的宿主范围，包括：人、猪、鼠、猴、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟类等，能够感染神经系统。水疱性口炎病毒感染脑神经系统的特性使其具备解析神经环路的能力。但是目前VSV在神经科学的研究中仅限于标记神经元，且需要对脑经行灌注切片才能观察到病毒标记效果。尚无能够在活体水平直接观察病毒表达水平的方法。而本发明通过反向遗传学手段，结合磁共振报告基因，获得了能够稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明采用反向遗传学的技术途径获得了具有稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的感染性克隆及其重组水疱性口炎病毒。将在神经元标记、脑结构分析、核磁共振成像、水疱性口炎病毒神经毒性分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种携带绿色荧光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein，EGFP)以及转铁蛋白(Ferritin)的水疱性口炎病毒(Vesicular StomatitisVirus，VSV)感染性克隆，所述的感染性克隆的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的在于提供了一种携带绿色荧光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein，EGFP)以及转铁蛋白(Ferritin)的水疱性口炎病毒(Vesicular StomatitisVirus，VSV)感染性克隆的制备方法，通过将Ferritin-t2a-EGFP(SEQ ID NO.8所示)基因插入到水疱性口炎病毒的Leader序列和N基因之间获得，方法简单，易行。

本发明的目的在于提供了一种携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆的应用，该感染性克隆在神经元标记、脑结构分析、核磁共振成像、水疱性口炎病毒神经毒性分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种携带绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)以及转铁蛋白(Ferritin)的水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)感染性克隆，所述的感染性克隆的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

一种携带绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)以及转铁蛋白(Ferritin)的水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)感染性克隆，其制备方法包括将Ferritin-t2a-EGFP(SEQ ID NO.8所示)基因插入到水疱性口炎病毒的Leader序列和N基因之间获得。

以上所述的方法中，具体的，是以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO：7为模板，使用SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:6所示引物通过重叠PCR扩增片段SEQ ID NO:8，使用XhoI+MscI酶切，然后采用T4连接酶将SEQ ID NO:8片段插入到pVSV-EYFP，鉴定并测序正确的克隆命名为pVSV-Ferritin-2a-EGFP，其序列为SEQ ID NO:1所示。

一种携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆的应用，包括利用该感染性克隆制备神经元标记药物、制备脑结构分析药物、制备用于核磁共振成像药物、制备水疱性口炎病毒神经毒性分析的药物。

所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猴、豚鼠、人、大鼠、蝙蝠、猪、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟等动物的神经环路标记。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明制备了稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒，其具有可视化以及可活体成像的特点，便于开展相关的研究。目前国内外还没有用于稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒，本发明填补了该空白。

2.本发明对于开展VSV的应用性研究(如神经元标记、脑结构分析、核磁共振成像、水疱性口炎病毒神经毒性分析等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值；

3.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。VSV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于鼠等非灵长类动物，而且还能用于非人灵长类动物的脑科学研究。

附图说明

图1为一种稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的感染性克隆的构建示意图。

图2为一种稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒的感染示意图。

A：实验组在紫外光激发下的照片；

B：对照组在紫外光激发下的照片；

图3为一种稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒的一步生长曲线。

图4为一种稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组水疱性口炎病毒的标记效果图。

A：病毒注射小鼠纹状体后七天观察到的核磁共振成像图；

B：病毒注射小鼠纹状体后七天观察到的荧光图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，本发明所述试剂或材料，如未特别说明。

实施例1：携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆的构建：

本发明所述的感染性克隆是将Ferritin-t2a-EGFP(SEQ ID NO.1所示)基因插入到水疱性口炎病毒的Leader序列和N基因之间(图1),具体过程包括如下几个方面：

1)以携带转铁蛋白的质粒pcDNA3.0-TRPV4-p2A-ferritin-p2A-mCherry(来自addgene，编号74309)为模板，使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物扩增片段SEQ IDNO：7；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mMdNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃20s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

2)以携带有EGFP的VSV糖蛋白缺失型感染性克隆质粒pVSV-EGFP-dG(Kevin T.Beier and Sean P.J.Whelang 2011)(来自addgene，编号31842)为模板，使用SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示引物扩增片段SEQ ID NO:4；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mMdNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

3)以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO：7为模板，使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6所示引物通过重叠PCR扩增片段SEQ ID NO:8,按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；。

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mMdNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃2.5min，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用XhoI+MscI酶切SEQ ID NO:8和pVSV-EYFP(来自addgene，编号36399)，然后采用T4连接酶将SEQ ID NO:8片段插入到pVSV-EYFP，将连接产物转化感受态Stbl3，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pVSV-Ferritin-2a-EGFP。

实施例2：pVSV-Ferritin-2a-EGFP成功制备出携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的VSV，其步骤是：

用普通质粒提取试剂盒分别提取pVSV-Ferritin-2a-EGFP及其辅助质粒(分别表达VSV结构蛋白N、G和非结构蛋白P、L,NATHAN D.LAWSON,E.A.S.,MICHAEL A.WHIT,ANDJOHN K.ROSE(1995)."Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA."Proc.Natl.A cad.Sci Vol.92:pp.4477-4481)，五质粒共转染BH21K细胞，35℃，53％(v/v)CO₂培养箱中培养，三天后取上清感染BHK21细胞，并同时设置未转染质粒的细胞作为对照组，通过Olympus倒置荧光显微镜观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达情况。实验组使用波长为405nm的激光激发可见明显的绿色荧光(图2)。对照组无荧光。表明本发明的感染性克隆成功制备稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的重组VSV(从基因结构设计上，Ferritin和GFP共表达，GFP存在则Ferritin存在)。

实施例3：稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的VSV的一步生长曲线测定，其步骤是

在感染复数(MOI)为0.1的情况下，将重组VSV病毒感染BHK-21，每天收集病毒上清，然后用plaque assay的方法确定病毒滴度，从而绘制病毒在BHK-21上的生长动力特征(图3所示)。

实施例4：稳定携带绿色荧光蛋白以及核磁共振成像报告基因转铁蛋白的VSV的扩增及浓缩，其步骤是：

将实施例2制备的P0代病毒按照MOI＝0.1感染BHK21细胞，每次感染4个T75细胞培养瓶。感染2天后收集上清，使用口径为0.45um的过滤膜去除细胞。使用贝克曼高速离心机经行浓缩。浓缩条件为：4.0℃，50000g，2h。浓缩后去除上清，用PBS将沉淀重悬后进行蔗糖密度梯度离心。离心条件为：4.0℃，50000g，2h。离心完成后去除上清，用PBS重悬沉淀，3ul每管分装。取其中一支进行滴度测试。

实施例5：pVSV-Ferritin-2a-EGFP制备的重组VSV在制备研究脑神经环路平台药物中的应用，其步骤是：

取0.1μl重组VSV病毒定位注射到鼠运动皮层M1，在感染后7天后麻醉动物，在7T小动物核磁共振成像仪中进行活体全脑成像。在病毒注射位点及其下游脑区可观察到清楚的核磁信号(图4中A)，表明病毒成功感染神经元并且能够表达具有核磁信号的转铁蛋白。成像结束后用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。在注射位点及其下游脑区可观察到清楚的绿色荧光信号(图4中B)

最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所

<120> 携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆的制备方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgaagacaa acaaaccatt attatcatta aaaggctcag gagaaacttt aacagtaatc 60

agaattctcg agatgacctc tcagattcgt cagaattatt ccaccgaggt ggaagctgcc 120

gtgaaccgcc tggtcaactt gcacctgcgg gcctcctaca cctacctctc tctgggcttc 180

ttttttgatc gggatgacgt ggctctggag ggcgtaggcc acttcttccg cgaattggcc 240

gaggagaagc gcgagggcgc ggagcgtctc ctcgactttc agaacgatcg cgggggccgt 300

gcactcttcc aggatgtgca gaagccatct caagatgaat ggggtaaaac ccaggaggcc 360

atggaagctg ccttggccat ggagaagaac ctgaatcagg ccctcttgga tctgcatgcc 420

ctgggttctg cccgcgcgga ccctcatctc tgtgacttcc tggaaagcca ctatctggat 480

aaggaggtga aactcatcaa gaagatgggc aaccatctga ccaacctccg cagggtggcg 540

gggccacaac cagcgcagac tggcgcgccc caggggtctc tgggcgagta tctctttgag 600

cgcctcactc tcaagcacga cgcgcgcggc ggcggcggca gcgattataa agatgatgat 660

gataaaggcg gcggcggcag ccgcgtgatg accaccgcgt ctccctcgca agtgcgccag 720

aactaccacc aggacgcgga ggctgccatc aaccgccaga tcaacctgga gttgtatgcc 780

tcctacgtct atctgtctat gtcttgttat tttgaccgag atgatgtggc tctgaagaac 840

tttgccaaat actttctcca ccaatctcat gaggagaggg agcatgccga gaaactgatg 900

aagctgcaga accagcgagg tggccgaatc ttcctgcagg atataaagaa accagaccgt 960

gatgactggg agagcgggct gaatgcaatg gagtgtgcac tgcacttgga aaagagtgtg 1020

aatcagtcac tactggaact gcacaaactg gctactgaca agaatgatcc ccacttatgt 1080

gacttcattg agacgtatta tctgagtgaa caggtgaaat ccattaaaga actgggtgac 1140

cacgtgacca acttacgcaa gatgggtgcc cctgaagctg gcatggcaga atatctcttt 1200

gacaagcaca ccctgggaca cggtgatgag agcgagggca gaggaagtct gctaacatgc 1260

ggtgacgtcg aggagaatcc tggcccaatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 1320

gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 1380

ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 1440

ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 1500

ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 1560

ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 1620

gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 1680

aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 1740

tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 1800

atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 1860

ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 1920

cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 1980

ctcggcatgg acgagctgta caagtaatgg ccatatgaaa aaaactaaca gtaatcaaaa 2040

tgtctgttac agtcaagaga atcattgaca acacagtcat agttccaaaa cttcctgcaa 2100

atgaggatcc agtggaatac ccggcagatt acttcagaaa atcaaaggag attcctcttt 2160

acatcaatac tacaaaaagt ttgtcagatc taagaggata tgtctaccaa ggcctcaaat 2220

ccggaaatgt atcaatcata catgtcaaca gctacttgta tggagcatta aaggacatcc 2280

ggggtaagtt ggataaagat tggtcaagtt tcggaataaa catcgggaaa gcaggggata 2340

caatcggaat atttgacctt gtatccttga aagccctgga cggcgtactt ccagatggag 2400

tatcggatgc ttccagaacc agcgcagatg acaaatggtt gcctttgtat ctacttggct 2460

tatacagagt gggcagaaca caaatgcctg aatacagaaa aaagctcatg gatgggctga 2520

caaatcaatg caaaatgatc aatgaacagt ttgaacctct tgtgccagaa ggtcgtgaca 2580

tttttgatgt gtggggaaat gacagtaatt acacaaaaat tgtcgctgca gtggacatgt 2640

tcttccacat gttcaaaaaa catgaatgtg cctcgttcag atacggaact attgtttcca 2700

gattcaaaga ttgtgctgca ttggcaacat ttggacacct ctgcaaaata accggaatgt 2760

ctacagaaga tgtaacgacc tggatcttga accgagaagt tgcagatgaa atggtccaaa 2820

tgatgcttcc aggccaagaa attgacaagg ccgattcata catgccttat ttgatcgact 2880

ttggattgtc ttctaagtct ccatattctt ccgtcaaaaa ccctgccttc cacttctggg 2940

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acattgagta tacatctctt actacagcag gtttgttgta cgcttatgca gtaggatcct 3060

ctgccgactt ggcacaacag ttttgtgttg gagataacaa atacactcca gatgatagta 3120

ccggaggatt gacgactaat gcaccgccac aaggcagaga tgtggtcgaa tggctcggat 3180

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tcatgtcact gcaaggccta agagagaaga caattggcaa gtatgctaag tcagaatttg 3300

acaaatgacc ctataattct cagatcacct attatatatt atgctacata tgaaaaaaac 3360

taacagatat catggataat ctcacaaaag ttcgtgagta tctcaagtcc tactctcgtc 3420

tagatcaggc ggtaggagag atagatgaga tcgaagcaca acgagctgaa aagtccaatt 3480

atgagttgtt ccaagaggac ggagtggaag agcatactag gccctcttat tttcaggcag 3540

cagatgattc tgacacagaa tctgaaccag aaattgaaga caatcaaggc ttgtatgtac 3600

cagatccgga agctgagcaa gttgaaggct ttatacaggg gcctttagat gactatgcag 3660

atgaggacgt ggatgttgta ttcacttcgg actggaaaca gcctgagctt gaatccgacg 3720

agcatggaaa gaccttacgg ttgacattgc cagagggttt aagtggagag cagaaatccc 3780

agtggctttt gacgattaaa gcagtcgttc aaagtgccaa acactggaat ctggcagagt 3840

gcacatttga agcatcggga gaaggggtca tcataaaaaa gcgccagata actccggatg 3900

tatataaggt cactccagtg atgaacacac atccgtacca atcagaagcc gtatcagatg 3960

tttggtctct ctcaaagaca tccatgactt tccaacccaa gaaagcaagt cttcagcctc 4020

tcaccatatc cttggatgaa ttgttctcat ctagaggaga attcatctct gtcggaggta 4080

acggacgaat gtctcataaa gaggccatcc tgctcggtct gaggtacaaa aagttgtaca 4140

atcaggcgag agtcaaatat tctctgtaga ctatgaaaaa aagtaacaga tatcacaatc 4200

taagtgttat cccaatccat tcatcatgag ttccttaaag aagattctcg gtctgaaggg 4260

gaaaggtaag aaatctaaga aattagggat cgcaccaccc ccttatgaag aggacactag 4320

catggagtat gctccgagcg ctccaattga caaatcctat tttggagttg acgagatgga 4380

cacctatgat ccgaatcaat taagatatga gaaattcttc tttacagtga aaatgacggt 4440

tagatctaat cgtccgttca gaacatactc agatgtggca gccgctgtat cccattggga 4500

tcacatgtac atcggaatgg cagggaaacg tcccttctac aaaatcttgg cttttttggg 4560

ttcttctaat ctaaaggcca ctccagcggt attggcagat caaggtcaac cagagtatca 4620

cgctcactgc gaaggcaggg cttatttgcc acataggatg gggaagaccc ctcccatgct 4680

caatgtacca gagcacttca gaagaccatt caatataggt ctttacaagg gaacgattga 4740

gctcacaatg accatctacg atgatgagtc actggaagca gctcctatga tctgggatca 4800

tttcaattct tccaaatttt ctgatttcag agagaaggcc ttaatgtttg gcctgattgt 4860

cgagaaaaag gcatctggag cgtgggtcct ggattctatc agccacttca aatgagctag 4920

tctagcttcc agcttctgaa caatccccgg tttactcagt ctctcctaat tccagccttt 4980

cgaacaacta atatcctgtc ttttctatcc ctatgaaaaa aactaacaga gatcgatctg 5040

tttccttgac acgcgtcacg atgaagtgcc ttttgtactt aaccttttta ttcattgggg 5100

tgaattgcaa gttcaccata gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc 5160

cttctaatta ccattattgc ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag 5220

gcacagcctt acaagtcaaa atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga 5280

tgtgtcatgc ttccaaatgg gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata 5340

taacacattc catccgatcc ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac 5400

aaacgaaaca aggaacttgg ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa 5460

ctgtgacgga tgccgaagca gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg 5520

aatacacagg agaatgggtt gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat 5580

gccccactgt ccataactct acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg 5640

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tgggaaagga gggcacaggg ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg 5760

cctgcaaaat gcaatactgc aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg 5820

agatggctga taaggatctc tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa 5880

gtatctctgc tccatctcag acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga 5940

tcttggatta ttccctctgc caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct 6000

ctccagtgga tctcagctat cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca 6060

taatcaatgg taccctaaaa tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc 6120

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ctgatgatga gagtttattt tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg 6420

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taatcattgg actattcttg gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc 6540

acaccaagaa aagacagatt tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aagtaactcg 6600

cggccgccct gcacaacaga ttcttcatgt ttgaaccaaa tcaacttgtg atatcatgct 6660

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tggaagtcca cgattttgag accgacgagt tcaatgattt caatgaagat gactatgcca 6780

caagagaatt cctgaatccc gatgagcgca tgacgtactt gaatcatgct gattacaatt 6840

tgaattctcc tctaattagt gatgatattg acaatttgat caggaaattc aattctcttc 6900

cgattccctc gatgtgggat agtaagaact gggatggagt tcttgagatg ttaacatcat 6960

gtcaagccaa tcccatctca acatctcaga tgcataaatg gatgggaagt tggttaatgt 7020

ctgataatca tgatgccagt caagggtata gttttttaca tgaagtggac aaagaggcag 7080

aaataacatt tgacgtggtg gagaccttca tccgcggctg gggcaacaaa ccaattgaat 7140

acatcaaaaa ggaaagatgg actgactcat tcaaaattct cgcttatttg tgtcaaaagt 7200

ttttggactt acacaagttg acattaatct taaatgctgt ctctgaggtg gaattgctca 7260

acttggcgag gactttcaaa ggcaaagtca gaagaagttc tcatggaacg aacatatgca 7320

ggattagggt tcccagcttg ggtcctactt ttatttcaga aggatgggct tacttcaaga 7380

aacttgatat tctaatggac cgaaactttc tgttaatggt caaagatgtg attataggga 7440

ggatgcaaac ggtgctatcc atggtatgta gaatagacaa cctgttctca gagcaagaca 7500

tcttctccct tctaaatatc tacagaattg gagataaaat tgtggagagg cagggaaatt 7560

tttcttatga cttgattaaa atggtggaac cgatatgcaa cttgaagctg atgaaattag 7620

caagagaatc aaggccttta gtcccacaat tccctcattt tgaaaatcat atcaagactt 7680

ctgttgatga aggggcaaaa attgaccgag gtataagatt cctccatgat cagataatga 7740

gtgtgaaaac agtggatctc acactggtga tttatggatc gttcagacat tggggtcatc 7800

cttttataga ttattacact ggactagaaa aattacattc ccaagtaacc atgaagaaag 7860

atattgatgt gtcatatgca aaagcacttg caagtgattt agctcggatt gttctatttc 7920

aacagttcaa tgatcataaa aagtggttcg tgaatggaga cttgctccct catgatcatc 7980

cctttaaaag tcatgttaaa gaaaatacat ggcccacagc tgctcaagtt caagattttg 8040

gagataaatg gcatgaactt ccgctgatta aatgttttga aatacccgac ttactagacc 8100

catcgataat atactctgac aaaagtcatt caatgaatag gtcagaggtg ttgaaacatg 8160

tccgaatgaa tccgaacact cctatcccta gtaaaaaggt gttgcagact atgttggaca 8220

caaaggctac caattggaaa gaatttctta aagagattga tgagaagggc ttagatgatg 8280

atgatctaat tattggtctt aaaggaaagg agagggaact gaagttggca ggtagatttt 8340

tctccctaat gtcttggaaa ttgcgagaat actttgtaat taccgaatat ttgataaaga 8400

ctcatttcgt ccctatgttt aaaggcctga caatggcgga cgatctaact gcagtcatta 8460

aaaagatgtt agattcctca tccggccaag gattgaagtc atatgaggca atttgcatag 8520

ccaatcacat tgattacgaa aaatggaata accaccaaag gaagttatca aacggcccag 8580

tgttccgagt tatgggccag ttcttaggtt atccatcctt aatcgagaga actcatgaat 8640

tttttgagaa aagtcttata tactacaatg gaagaccaga cttgatgcgt gttcacaaca 8700

acacactgat caattcaacc tcccaacgag tttgttggca aggacaagag ggtggactgg 8760

aaggtctacg gcaaaaagga tggagtatcc tcaatctact ggttattcaa agagaggcta 8820

aaatcagaaa cactgctgtc aaagtcttgg cacaaggtga taatcaagtt atttgcacac 8880

agtataaaac gaagaaatcg agaaacgttg tagaattaca gggtgctctc aatcaaatgg 8940

tttctaataa tgagaaaatt atgactgcaa tcaaaatagg gacagggaag ttaggacttt 9000

tgataaatga cgatgagact atgcaatctg cagattactt gaattatgga aaaataccga 9060

ttttccgtgg agtgattaga gggttagaga ccaagagatg gtcacgagtg acttgtgtca 9120

ccaatgacca aatacccact tgtgctaata taatgagctc agtttccaca aatgctctca 9180

ccgtagctca ttttgctgag aacccaatca atgccatgat acagtacaat tattttggga 9240

catttgctag actcttgttg atgatgcatg atcctgctct tcgtcaatca ttgtatgaag 9300

ttcaagataa gataccgggc ttgcacagtt ctactttcaa atacgccatg ttgtatttgg 9360

acccttccat tggaggagtg tcgggcatgt ctttgtccag gtttttgatt agagccttcc 9420

cagatcccgt aacagaaagt ctctcattct ggagattcat ccatgtacat gctcgaagtg 9480

agcatctgaa ggagatgagt gcagtatttg gaaaccccga gatagccaag tttcgaataa 9540

ctcacataga caagctagta gaagatccaa cctctctgaa catcgctatg ggaatgagtc 9600

cagcgaactt gttaaagact gaggttaaaa aatgcttaat cgaatcaaga caaaccatca 9660

ggaaccaggt gattaaggat gcaaccatat atttgtatca tgaagaggat cggctcagaa 9720

gtttcttatg gtcaataaat cctctgttcc ctagattttt aagtgaattc aaatcaggca 9780

cttttttggg agtcgcagac gggctcatca gtctatttca aaattctcgt actattcgga 9840

actcctttaa gaaaaagtat catagggaat tggatgattt gattgtgagg agtgaggtat 9900

cctctttgac acatttaggg aaacttcatt tgagaagggg atcatgtaaa atgtggacat 9960

gttcagctac tcatgctgac acattaagat acaaatcctg gggccgtaca gttattggga 10020

caactgtacc ccatccatta gaaatgttgg gtccacaaca tcgaaaagag actccttgtg 10080

caccatgtaa cacatcaggg ttcaattatg tttctgtgca ttgtccagac gggatccatg 10140

acgtctttag ttcacgggga ccattgcctg cttatctagg gtctaaaaca tctgaatcta 10200

catctatttt gcagccttgg gaaagggaaa gcaaagtccc actgattaaa agagctacac 10260

gtcttagaga tgctatctct tggtttgttg aacccgactc taaactagca atgactatac 10320

tttctaacat ccactcttta acaggcgaag aatggaccaa aaggcagcat gggttcaaaa 10380

gaacagggtc tgcccttcat aggttttcga catctcggat gagccatggt gggttcgcat 10440

ctcagagcac tgcagcattg accaggttga tggcaactac agacaccatg agggatctgg 10500

gagatcagaa tttcgacttt ttattccaag caacgttgct ctatgctcaa attaccacca 10560

ctgttgcaag agacggatgg atcaccagtt gtacagatca ttatcatatt gcctgtaagt 10620

cctgtttgag acccatagaa gagatcaccc tggactcaag tatggactac acgcccccag 10680

atgtatccca tgtgctgaag acatggagga atggggaagg ttcgtgggga caagagataa 10740

aacagatcta tcctttagaa gggaattgga agaatttagc acctgctgag caatcctatc 10800

aagtcggcag atgtataggt tttctatatg gagacttggc gtatagaaaa tctactcatg 10860

ccgaggacag ttctctattt cctctatcta tacaaggtcg tattagaggt cgaggtttct 10920

taaaagggtt gctagacgga ttaatgagag caagttgctg ccaagtaata caccggagaa 10980

gtctggctca tttgaagagg ccggccaacg cagtgtacgg aggtttgatt tacttgattg 11040

ataaattgag tgtatcacct ccattccttt ctcttactag atcaggacct attagagacg 11100

aattagaaac gattccccac aagatcccaa cctcctatcc gacaagcaac cgtgatatgg 11160

gggtgattgt cagaaattac ttcaaatacc aatgccgtct aattgaaaag ggaaaataca 11220

gatcacatta ttcacaatta tggttattct cagatgtctt atccatagac ttcattggac 11280

cattctctat ttccaccacc ctcttgcaaa tcctatacaa gccattttta tctgggaaag 11340

ataagaatga gttgagagag ctggcaaatc tttcttcatt gctaagatca ggagaggggt 11400

gggaagacat acatgtgaaa ttcttcacca aggacatatt attgtgtcca gaggaaatca 11460

gacatgcttg caagttcggg attgctaagg ataataataa agacatgagc tatccccctt 11520

ggggaaggga atccagaggg acaattacaa caatccctgt ttattatacg accacccctt 11580

acccaaagat gctagagatg cctccaagaa tccaaaatcc cctgctgtcc ggaatcaggt 11640

tgggccaatt accaactggc gctcattata aaattcggag tatattacat ggaatgggaa 11700

tccattacag ggacttcttg agttgtggag acggctccgg agggatgact gctgcattac 11760

tacgagaaaa tgtgcatagc agaggaatat tcaatagtct gttagaatta tcagggtcag 11820

tcatgcgagg cgcctctcct gagcccccca gtgccctaga aactttagga ggagataaat 11880

cgagatgtgt aaatggtgaa acatgttggg aatatccatc tgacttatgt gacccaagga 11940

cttgggacta tttcctccga ctcaaagcag gcttggggct tcaaattgat ttaattgtaa 12000

tggatatgga agttcgggat tcttctacta gcctgaaaat tgagacgaat gttagaaatt 12060

atgtgcaccg gattttggat gagcaaggag ttttaatcta caagacttat ggaacatata 12120

tttgtgagag cgaaaagaat gcagtaacaa tccttggtcc catgttcaag acggtcgact 12180

tagttcaaac agaatttagt agttctcaaa cgtctgaagt atatatggta tgtaaaggtt 12240

tgaagaaatt aatcgatgaa cccaatcccg attggtcttc catcaatgaa tcctggaaaa 12300

acctgtacgc attccagtca tcagaacagg aatttgccag agcaaagaag gttagtacat 12360

actttacctt gacaggtatt ccctcccaat tcattcctga tccttttgta aacattgaga 12420

ctatgctaca aatattcgga gtacccacgg gtgtgtctca tgcggctgcc ttaaaatcat 12480

ctgatagacc tgcagattta ttgaccatta gcctttttta tatggcgatt atatcgtatt 12540

ataacatcaa tcatatcaga gtaggaccga tacctccgaa ccccccatca gatggaattg 12600

cacaaaatgt ggggatcgct ataactggta taagcttttg gctgagtttg atggagaaag 12660

acattccact atatcaacag tgtttggcag ttatccagca atcatttccg attaggtggg 12720

aggctatttc agtaaaagga ggatacaagc agaagtggag tactagaggt gatgggctcc 12780

caaaagatac ccgaatttca gactccttgg ccccaatcgg gaactggatc agatctttgg 12840

aattggtccg aaaccaagtt cgtctaaatc cattcaataa gatcttgttc aatcagctat 12900

gtcgtacagt ggataatcat ttgaagtggt caaatttgcg aaaaaacaca ggaatgattg 12960

aatggatcaa tgggcgaatt tcaaaagaag accggtctat actgatgttg aagagtgacc 13020

tacatgagga aaactcttgg agagattaaa aaatcaggag gagactccaa actttaagta 13080

tgaaaaaaac tttgatcctt aagaccctct tgtggttttt atttttttat ctggttttgt 13140

ggtcttcgtg ggtcggcatg gcatctccac ctcctcgcgg tccgacctgg gcatccgaag 13200

gaggacgtcg tccactcgga tggctaaggg agagctcgga tccggctgct aacaaagccc 13260

gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg 13320

cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggatcgagat 13380

cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttgtattcta tagtgtcacc taaatcgtat 13440

gtgtatgata cataaggtta tgtattaatt gtagccgcgt tctaacgaca atatgtacaa 13500

gcctaattgt gtagcatctg gcttactgaa gcagacccta tcatctctct cgtaaactgc 13560

cgtcagagtc ggtttggttg gacgaacctt ctgagtttct ggtaacgccg tcccgcaccc 13620

ggaaatggtc agcgaaccaa tcagcagggt catcgctagc cagatcctct acgccggacg 13680

catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat 13740

caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg 13800

tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc accattcctt 13860

gcggcggcgg tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg 13920

cataagggag agcgtcgaat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt 13980

aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 14040

ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 14100

accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt 14160

taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 14220

cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 14280

ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 14340

ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 14400

aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 14460

actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 14520

gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 14580

agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 14640

cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 14700

catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 14760

aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 14820

gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 14880

aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 14940

agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 15000

ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 15060

actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 15120

aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 15180

gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 15240

atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 15300

tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 15360

tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 15420

ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 15480

agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 15540

ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 15600

tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 15660

gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 15720

cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 15780

ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 15840

agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 15900

tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 15960

ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 16020

ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 16080

ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 16140

accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagg gggatctcga tcccgcgaaa 16200

ttaatacgac tcactatagg 16220

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taacatgcgg tgacgtcgag gagaatcctg gcccaatggt gagcaagggc gaggagc 57

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atatggccat tacttgtaca gctcgtccat gcc 33

<210> 4

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccaatggtga gcaagggcga ggagctgttc 60

accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 120

gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 180

accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 240

cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 300

cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 360

cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 420

gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 480

aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 540

cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 600

ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 660

aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 720

atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taatggccat at 762

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attctcgaga tgacctctca gattcgtcag 30

<210> 6

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcctcgacg tcaccgcatg ttagcagact tcctctgccc tcgctctcat caccgtgtcc 60

c 61

<210> 7

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

attctcgaga tgacctctca gattcgtcag aattattcca ccgaggtgga agctgccgtg 60

aaccgcctgg tcaacttgca cctgcgggcc tcctacacct acctctctct gggcttcttt 120

tttgatcggg atgacgtggc tctggagggc gtaggccact tcttccgcga attggccgag 180

gagaagcgcg agggcgcgga gcgtctcctc gactttcaga acgatcgcgg gggccgtgca 240

ctcttccagg atgtgcagaa gccatctcaa gatgaatggg gtaaaaccca ggaggccatg 300

gaagctgcct tggccatgga gaagaacctg aatcaggccc tcttggatct gcatgccctg 360

ggttctgccc gcgcggaccc tcatctctgt gacttcctgg aaagccacta tctggataag 420

gaggtgaaac tcatcaagaa gatgggcaac catctgacca acctccgcag ggtggcgggg 480

ccacaaccag cgcagactgg cgcgccccag gggtctctgg gcgagtatct ctttgagcgc 540

ctcactctca agcacgacgc gcgcggcggc ggcggcagcg attataaaga tgatgatgat 600

aaaggcggcg gcggcagccg cgtgatgacc accgcgtctc cctcgcaagt gcgccagaac 660

taccaccagg acgcggaggc tgccatcaac cgccagatca acctggagtt gtatgcctcc 720

tacgtctatc tgtctatgtc ttgttatttt gaccgagatg atgtggctct gaagaacttt 780

gccaaatact ttctccacca atctcatgag gagagggagc atgccgagaa actgatgaag 840

ctgcagaacc agcgaggtgg ccgaatcttc ctgcaggata taaagaaacc agaccgtgat 900

gactgggaga gcgggctgaa tgcaatggag tgtgcactgc acttggaaaa gagtgtgaat 960

cagtcactac tggaactgca caaactggct actgacaaga atgatcccca cttatgtgac 1020

ttcattgaga cgtattatct gagtgaacag gtgaaatcca ttaaagaact gggtgaccac 1080

gtgaccaact tacgcaagat gggtgcccct gaagctggca tggcagaata tctctttgac 1140

aagcacaccc tgggacacgg tgatgagagc gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt 1200

gacgtcgagg ag 1212

<210> 8

<211> 1953

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attctcgaga tgacctctca gattcgtcag aattattcca ccgaggtgga agctgccgtg 60

aaccgcctgg tcaacttgca cctgcgggcc tcctacacct acctctctct gggcttcttt 120

tttgatcggg atgacgtggc tctggagggc gtaggccact tcttccgcga attggccgag 180

gagaagcgcg agggcgcgga gcgtctcctc gactttcaga acgatcgcgg gggccgtgca 240

ctcttccagg atgtgcagaa gccatctcaa gatgaatggg gtaaaaccca ggaggccatg 300

gaagctgcct tggccatgga gaagaacctg aatcaggccc tcttggatct gcatgccctg 360

ggttctgccc gcgcggaccc tcatctctgt gacttcctgg aaagccacta tctggataag 420

gaggtgaaac tcatcaagaa gatgggcaac catctgacca acctccgcag ggtggcgggg 480

ccacaaccag cgcagactgg cgcgccccag gggtctctgg gcgagtatct ctttgagcgc 540

ctcactctca agcacgacgc gcgcggcggc ggcggcagcg attataaaga tgatgatgat 600

aaaggcggcg gcggcagccg cgtgatgacc accgcgtctc cctcgcaagt gcgccagaac 660

taccaccagg acgcggaggc tgccatcaac cgccagatca acctggagtt gtatgcctcc 720

tacgtctatc tgtctatgtc ttgttatttt gaccgagatg atgtggctct gaagaacttt 780

gccaaatact ttctccacca atctcatgag gagagggagc atgccgagaa actgatgaag 840

ctgcagaacc agcgaggtgg ccgaatcttc ctgcaggata taaagaaacc agaccgtgat 900

gactgggaga gcgggctgaa tgcaatggag tgtgcactgc acttggaaaa gagtgtgaat 960

cagtcactac tggaactgca caaactggct actgacaaga atgatcccca cttatgtgac 1020

ttcattgaga cgtattatct gagtgaacag gtgaaatcca ttaaagaact gggtgaccac 1080

gtgaccaact tacgcaagat gggtgcccct gaagctggca tggcagaata tctctttgac 1140

aagcacaccc tgggacacgg tgatgagagc gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt 1200

gacgtcgagg agaatcctgg cccaatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 1260

gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 1320

gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 1380

aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 1440

agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 1500

tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 1560

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 1620

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 1680

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 1740

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 1800

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 1860

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 1920

ggcatggacg agctgtacaa gtaatggcca tat 1953

Claims (8)

1.一种携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆，所述的感染性克隆的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的感染性克隆的制备方法，其步骤包括将SEQ ID NO.8所示核苷酸序列插入到水疱性口炎病毒的Leader序列和N基因之间。

3.根据权利要求1所述的方法，是以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO：7为模板，使用SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:6所示引物通过重叠PCR扩增片段SEQ ID NO:8，使用XhoI+MscI酶切，然后采用T4连接酶将SEQ ID NO:8片段插入到pVSV-EGFP，鉴定并测序正确的克隆即得。

4.权利要求1所述的感染性克隆在制备神经元标记药物中的应用。

5.权利要求1所述的感染性克隆在制备脑结构分析药物中的应用。

6.权利要求1所述的感染性克隆在制备用于核磁共振成像药物中的应用。

7.权利要求1所述的感染性克隆在制备水疱性口炎病毒神经毒性分析药物中的应用。

8.根据权利要求4或5或6或7所述的应用，所述的对象为鼠、猴、豚鼠、人、大鼠、蝙蝠、猪、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟。

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