CN104403998A - 一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有p63基因的慢病毒载体，所述的含p63基因的重组载体是pLV.EX3d.P/neo-EF1A>TP63/flag>IRES/eGFP，利用慢病毒将p63基因转载至脂肪干细胞，通过Q-PCR检测 ， 其表达超过未转染的脂肪干细胞，改良后的脂肪干细胞向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞，达到快速有效的覆盖并修复创面的效果，本发明具有目的基因的转导效率高，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达的特性；同时具有取材方便、生长迅速、自体组织无排异反应等优点。广泛应用于烧伤、整形外科领域。
Description
技术领域
本发明属于细胞和基因工程的技术领域。具体的说，本发明涉及一种利用基因工程技术改造脂肪干细胞，影响其分化方向，并且这种改造后的改良式脂肪干细胞应用于表皮损伤修复中应用的技术领域。
背景技术
皮肤是人体或动物体最大的器官，覆盖全身，使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭，具有重要的生理功能。由于炎症、溃疡、烧伤等因素造成的皮肤损伤，严重的可危及生命。临床治疗方式有自体皮肤移植、异体皮肤移植以及异种皮肤移植。通过皮肤移植可以挽救病生命、并有助于创面愈合。表皮干细胞(ESC) 等干细胞移植治疗，在正常情况下，保证了皮肤的微环境和毛发生长，在组织损伤后参与其修复，同时其也是潜在的多能干细胞，完全可以利用其构建出具有完整表皮、真皮、皮肤附属器的功能健全的人工皮肤，实现创面由暂时性解剖修复向功能永久性修复的转变；当烧伤面积超过50％时，由于自体皮肤来源有限，因此在大多数情况下无法应用自体皮肤移植，而且自体皮肤移植给患者造成新的创伤，治疗费用巨大。尽管异体皮肤移植和异种皮肤移植可以克服以上问题，充当临时的伤面覆盖物，但是伴随移植会产生排斥反应和可能的一些移植疾病。
脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs) 是一种具有多向分化潜能的干细胞，ADSCs 在体外稳定增殖且衰亡率低，在体内体外具有多向分化潜能，不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子。
大面积深度烧伤以及慢性难愈性创面修复一直是临床治疗的难点。随着干细胞研究的开展和深入，体内外实验证明位于皮下脂肪组织内的脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）可以有效促进皮肤创面愈合。脂肪源性干细胞是一类与骨髓源性干细胞相类似的成体干细胞，具有多向分化潜能；同时脂肪源性干细胞具有少量组织可获取大量干细胞及取材方便等优点。而在细胞移植前，将目的基因转染干细胞，可增强细胞治疗的效果，因此细胞治疗与基因技术结合具有良好的应用前景。
目前，在整形外科和烧伤外科的手术中，皮肤组织缺损的修复是常见问题。如烧伤、外伤或体表肿物切除等原因造成皮肤缺损，均需考虑患处皮肤组织的恢复问题。大面积的轻度烧伤或小面积的皮肤全层缺损，可以通过残存皮肤附件的细胞再生或临近皮肤的上皮细胞迁移而愈合；而深度烧伤创面或大面积的皮肤全层缺损，则需要采用自体皮肤移植或人工组织工程化皮肤进行修复。临床常用的修复方法存在着许多缺点，如造成供区的损伤、大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮肤；而异体皮移植存在免疫排斥反应，且目前应用于临床的皮肤组织工程产品仍存在一定的免疫排斥反应、治疗效果欠佳等问题。因此如何能够快速覆盖并修复创面，是临床上急需且具有重要的研究价值和治疗前景的方向。
Ramos等证实,将分选纯化后的脂肪干细胞植入裸鼠体内,可显著促进创面愈合,且具有表皮细胞再生的能力（Ramos TV,Wang T,Maki CB,et al．Adipose stem cell side population in the mouse. J Tissue Eng Regen Med . 2009）。有国内研究证明，转表皮生长因子基因的脂肪干细胞在体内成活并继续分化为表皮细胞,同时通过自分泌的途径协同促进创面的修复（王先成. EGF基因转染人脂肪干细胞体外诱导表皮细胞修复创面的实验研究[D].中国协和医科大学,2006.）。Koster认为, p63基因是上皮感应复层化指令的分子开关, 它在决定体表外胚层向表皮细胞系分化步骤中起至关重要的作用（Koster MI, Kim S, Mills AA, et a l. p63 is themolecu larsw itch forin it iation of an epithelia lstrat if ication program [ J ] . Genes Dev,2004, 18( 2 ) : 126-131.）。因此，根据以上研究，可以认为选取合适的刺激环境，能够有效调控脂肪干细胞分化的程度和方向，提高皮肤修复的质量。
随着干细胞治疗技术在临床上的逐渐应用，越来越多的技术投向干细胞治疗大面积皮肤缺损的修复。体内动物实验已表明， 脂肪干细胞可成功的向成表皮细胞。如能实现脂肪干细胞的体外迅速扩增，那将为组织工程学研究注入新的生命力。
目前国内外有关本领域的研究现状，目前临床上用于深度烧伤或大面积的皮肤缺损创面的修复方法，存在着许多缺点，如造成供区的损伤、大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮肤、而异体皮移植及皮肤组织工程产品存在免疫排斥反应、治疗效果欠佳等问题。因此如何能够快速覆盖并修复创面，是临床上急需且具有重要的研究价值和治疗前景的方向。
发明内容
针对目前国内外在临床上用于深度烧伤或大面积的皮肤缺损创面的修复方法中客观存在着许多缺点，如造成供区的损伤、大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮肤、而异体皮移植及皮肤组织工程产品存在免疫排斥反应、治疗效果欠佳等现实问题的研究现状。本发明旨在于提供一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞。
本发明采用的主要技术方案：
本发明通过提供一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有p63基因的慢病毒载体，所述的含p63基因的重组载体是pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP，利用慢病毒将p63基因转载至脂肪干细胞，通过Q-PCR和western-blot检测，均发现表皮干细胞特异性标志物p63，其表达均远超过未转染的脂肪干细胞，表明改良后的脂肪干细胞向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞。验证了本发明制备的改良式脂肪干细胞拥有更好的向表皮细胞分化的能力，证实了制备获得改良式脂肪干细胞用于皮肤组织缺损修复具有显著突出的技术效果。
本发明提供一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有确定基因的慢病毒载体，利用慢病毒将确定基因转载至脂肪干细胞，通过慢病毒转染人脂肪干细胞，促进人脂肪干细胞向表皮分化，改良式脂肪干细胞具体通过如下方法制备获得。
（1） 脂肪干细胞的分离及体外培养鉴定：
无菌获取人脂肪组织并进行体外培养鉴定，以胶原酶振荡消化后离心收集细胞，常规传代及冻存,并对细胞进行细胞生长曲线及CD44、CD45、CD29、CD105表面标志物的流式细胞鉴定。
（2）脂肪干细胞的多向分化潜能鉴定：
对所获人脂肪干细胞分别进行成脂和成骨分化鉴定，即分别以成脂和成骨诱导液诱导细胞，2周后分别对成脂细胞和成骨细胞进行油红染色和茜素红染色的鉴定。
（3） 构建含p63基因的慢病毒载体：
从GeneBank 中查寻TP63 （p63？）基因序列，设计引物，分别以attB1-Koza k-TP63-F，attB2-flag-R为引物，进行目的基因TP63的PCR 扩增；再利用Gateway Technology构建pDown- TP63-flag，最后利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体，通过菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆质粒并测序。
（4）将上述制备的含p63基因的慢病毒载体转染到人脂肪干细胞：
所获得的pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体转染到293FT细胞中，进行病毒包装，收集培养上清对病毒进行荧光表达观察及滴度测定；最后将Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo加入人脂肪干细胞，通过脂质体进行转导；荧光显微镜下观察转导效果，并进行PCR、WB和免疫荧光检测。
（5）利用p63基因的作用促使脂肪干细胞向表皮细胞分化。
进一步，本发明提供构建含p63基因的慢病毒载体，所述的重组载体是pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP。
本发明同时提供了p63基因序列具体参见附后的序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列。本发明所述的TP63 也是p63另一种表达。
本发明上述所述的含p63基因的慢病毒载体pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP具有如序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列。
同时，本发明提供一种促进人脂肪干细胞向表皮分化的方法，所述的方法具体如下。
（1）人脂肪干细胞的分离及体外培养：无菌获取人脂肪组织并进行体外培养，以胶原酶振荡消化后离心收集细胞，常规传代及冻存；对细胞进行细胞生长曲线及CD29、CD44、CD45、CD105表面标志物的流式细胞鉴定；此外对所获人脂肪干细胞进行对成脂和成骨分化鉴定，以确定其多向分化潜能。
(2) 构建了含有p63基因的慢病毒载体pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP。
一是目的基因片段获取。
引物设计：从GeneBank 中查寻p63基因序列，分别设计引物attB1-Kozak-TP63-F、flag-TP63-R 和ttB2-flag-R如下，
attB1-Kozak-TP63-F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGAATTTTGAAACTTCACGGTGTG;
flag-TP63-R：
TTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTCCCCCTCCTCTTTGATGCG;
attB2-flag-R：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC。
PCR 扩增目的基因：分别以attB1-Kozak-TP63-F，attB2-flag-R为引物，进行目的基因TP63的PCR 扩增；反应体系为50 μL，目的基因TP63的PCR 反应循环条件: 98℃ 3 min→( 94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 2.5m) 30 循环→72℃ 10 min→4℃;PCR扩增获得attB1-Kozak-TP63-flag -attB2片段。
二是利用Gateway Technology构建pDown- TP63-flag载体。25℃，BP反应1 h；反应体系：attB1-K-TP63-flag-attB2 100 ng，pDONR221 100 ng，BP clonase 1 μl，TE buffer up to 5 μl；加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10 min，转化BP反应产物到大肠杆菌Stbl3，把100μL转化物涂到含有50 μg/mL Kan的LB平板上，37℃孵育过夜；菌落PCR筛选阳性克隆，体积30 μl，PCR鉴定程序：94℃ 3 min94℃, 30 S ; 60℃, 30 S ; 72℃, 1.5min（2kb/min）;29个循环，72℃ 5min，PCR鉴定结果；阳性克隆质粒测序验证反应。
三是利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP 。
25℃，LR反应16 h；反应体系：pUp-EF1A 12.89 ng，pDown- TP63-flag 15.21 ng，pTail- IRES/eGFP 13.03 ng，母载体pLV.Des3d.P/neo 60.28 ng，LR clonase 1 μl，TE buffer up to 5 μl；加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10 min；转化LR反应产物到Stbl3；菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆质粒，测序验证。
（3）利用慢病毒将p63基因转载至脂肪干细胞。
所获得的pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体转染到293FT细胞中，进行病毒包装，收集培养上清对病毒进行荧光表达观察及滴度测定；最后将Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo加入人脂肪干细胞，通过脂质体进行转导；荧光显微镜下观察转导效果，并进行PCR、WB和荧光显微镜检测。
进一步，本发明提供上述提供制备的改良式脂肪干细胞在皮肤组织缺损修复方面的应用，其包括，根据p63 是目前所知基因中唯一确定的表皮干细胞特异性标志物, 对维持表皮干细胞的生存具有重要作用；p63是最早启动外胚层层化的分化标志物, 被证实是外胚层感应复层化指令的分子开关这一发现，通过构建了p63基因的慢病毒载体，将其转染到体外培养的脂肪干细胞，促进脂肪干细胞向表皮细胞分化。
本领域熟知，近年来的研究发现，在体外培养脂肪干细胞的过程中加入不同的刺激因子,模拟皮肤的微环境,能诱导成为具有各种表型的细胞；p63 是目前所知基因中唯一确定的表皮干细胞特异性标志物, 对维持表皮干细胞的生存具有重要作用。
本发明提供的一种改良式脂肪干细胞将应用于临床的大面积皮肤创伤修复领域，具有材料丰富、无排异反应等优点。
通过实施本发明具体的内容，可以达到以下有益效果。
（1）临床上收治的大面积烧伤或皮肤缺损的患者，一方面在自体皮肤不足的情况下，需要有效的皮肤覆盖方法，而目前本技术领域无论异体皮肤移植或组织工程学产品，都存在一定的排异反应；另一方面，利用自体干细胞移植治疗，又必须满足取材方便、易于培养、生长迅速等要求。本发明所提供的改良后脂肪干细胞，由于其为自体组织，因此无排异反应；同时由于脂肪干细胞的生长特性，采用体外培养可以满足临床要求。
（2） 采用本发明提供的改良后的脂肪干细胞，其p63表达超过未转染的脂肪干细胞；通过Q-PCR检测报告检测结果显示，改良后的脂肪干细胞，其p63表达超过未转染的脂肪干细胞（16930.77%）。
（3）采用本发明提供的改良后的脂肪干细胞，向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞；通过Q-PCR检测报告检测结果显示，改良后的脂肪干细胞，向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞；转染后的脂肪干细胞有明显的表皮细胞标记物角蛋白ck10（112.28%）、ck15（84.79%）、ck19（52.71%）表达及整合素β1（76.69%）表达。
附图说明
图1显示为不同代次人脂肪干细胞形态图。图中， a 、b、c分别为40倍视野下P4、P6、P11代人脂肪干细胞形态，d、e、f分别为100倍视野下P4、P6、P11代细胞形态。
图2显示为人脂肪干细胞成脂分化鉴定图。图中，a（40x）、b（100x）分别为成脂分化2周后油红O染色结果。
图3显示为人脂肪干细胞成骨分化鉴定图。图中，a（40x）、b（100x）分别为成骨诱导后茜素红染色结果。
图4显示为人脂肪干细胞生长曲线图。
图5显示为人脂肪干细胞表面标记流式分析图。
图6显示为PCR鉴定筛选pLV.EX3d.P/neo -EF1A >TP63/flag>IRES/eGFP图。图中，图中，M: 1kb DNA Marker，Lane1～Lane4: pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP ①～④号克隆。
图7显示为载体结构图谱。
图8显示为病毒包装结果图。图中， 图中A、B为TP63阳性质粒转染293T细胞48h病变情况，200×视野，20mm荧光曝光率：C、D为eGFP/neo质粒转染293T细胞48h病变情况图，200×视野，20mm荧光曝光率。
图9 显示为细胞稳转结果图。
图10显示为转染后人脂肪干细胞的western-blot检测图。图中，1、2、3号样本分别为：hADSC/ TP63、hADSC /GFP、hADSC。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的结构组成及其工作模式与原理作进一步说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中设备和材料有：
脂肪来源：在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于人的任何部位的脂肪组织，较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织；本发明所述的TP63 也是p63另一种表达。
主要实验设备仪器：研究级倒置显微镜（OLYMPUS IX51）；洁净工作台（苏净安泰SW-CJ-2FD）；二氧化碳孵箱（Nuaire NU4750E）；DMEM(Hyclone);PCR仪，美国BIO-RAD，型号PTC-220/ALS-1296G/ALD1244G；电泳仪，北京市六一仪器厂，型号DYY-12；水平电泳槽，北京市六一仪器厂，型号DYCP-31DN；UV transilluminator,美国UVP，型号M-26；微波炉，中国美的，型号MW721AAU-PW；风热式电热恒温干燥箱，广州东方电热干燥设备厂，型号东方－B；恒温水浴锅，HENGAO，型号HWT-6B；全温空气摇床，上海福玛实验设备有限公司，型号QYC-200；各种量程移液器，美国Thermo；实时荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems，型号AB7500；小型高速离心机，美国Eppendorf，型号5418；微型离心机，东胜创新，型号EW-6000；超微量分光光度计，美国Thermo，型号NANO DROP 2000。水平摇床，北京市六一仪器厂，型号WD-9405D；核酸蛋白测定仪，Thermo，型号NANODROP2000；微型垂直电泳槽，Tanon，型号VE180；Fiuorchem，Cell biosciences，型号HD2；
主要化学试剂及耗材：0.25胰蛋白酶（Hyclone）；胎牛血清（Gibcol）；Ⅰ型胶原酶（Sigma）；细胞培养瓶（Costar）；RIPA裂解液(强)（碧云天，P0013B）；ECL蛋白印记底物（Thermo，NC14109）；30%Acry/Bis；10% SDS；10%APS；TEMED；1.5M Tris/HCl（PH 8.8）；1M Tris/HCl（PH 6.8）；Trizol Reagent（Ambion，15596026）；三氯甲烷(国产分析纯)；异丙醇(国产分析纯)；无水乙醇(国产分析纯)；DEPC（上海生工生物，DB0154-5mL）；DNase Ι，RNase-free（Thermo，#EN0521）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo，#K1622）；SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，QPK-201）；10 uM引物溶液（上海捷瑞生物）；Gateway? BP Clonase? II Enzyme Mix，invitrogen，货号11789-020；Gateway? LR Clonase? II Plus Enzyme Mix，invitrogen，货号12538-120；QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN,货号28704；质粒小提试剂盒，TIANGEN， 目录号DP103-02；Taq DNA Polymerase，美国Fermentas，货号#EP0404；dNTP Mix，美国Fermentas，货号#R0192;PrimeSTAR? HS DNA Polymerase， Takara，货号DR010S；GeneRuler? 1kb DNA Ladder，Fermentas，货号#SM0311。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞的制备
1.人脂肪干细胞的分离及体外培养鉴定：
人脂肪干细胞的分离培养：脂肪组织剪成糜状，用PBS冲洗数遍，以0.1%胶原酶I置37℃摇床消化，离心30 min去上清，沉淀重悬于含10% 胎牛血清的DMEM 培养液中，移入培养皿中；隔天更换培养液；达到对数生长期后，用0.25%胰酶消化，按1：3的比例进行传代，结果参见附图1。
生长曲线的检测：取处于对数生长期的细胞，用胰酶消化，洗涤离心，制备单细胞悬液，接种到24 孔板中。每天随机取4 孔细胞消化、记数，取其均值，连续7天，即可制备生长曲线，结果参见附图4，由附图4可知人脂肪干细胞倍增时间为26h。
流式细胞检测：流式细胞仪对第3代脂肪干细胞表面相对特异性抗原进行检测。0. 25% 胰蛋白酶消化细胞, 1500r /分离心10 分钟, 在细胞沉淀中(细胞数量约1* 106 ) 分别加入FITC- CD105荧光抗体, PE - CD29荧光抗体,FITC-CD45,,FITE-CD44荧光抗体各20ul , 4℃ 孵育30分钟, 再用PBS 缓冲液清洗2 遍, 最后用10%福尔马林固定细胞, 上流式细胞仪测定抗原的阳性率，结果参见附图5，由附图5可知，在人脂肪干细胞中，表面标记分子CD45含量为0.23%，CD29为99.24%，CD44为85.7%，CD105为96.49%。
2.人脂肪干细胞的多向分化潜能鉴定：
对所获人脂肪干细胞分别进行成脂和成骨分化鉴定，即分别以成脂和成骨诱导液诱导细胞，2周后分别对成脂细胞和成骨细胞进行油红染色和茜素红染色的鉴定。
2.1.成脂分化：细胞贴壁100%汇合后，加入间质干细胞成脂诱导液，成脂诱导72小时后，细胞内有小脂滴出现，约2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉淀，结果参见附图2可知，a（40x）、b（100x）分别为成脂分化2周后油红O染色结果，可见细胞内脂滴数量多并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，提示有大量脂质沉淀。
2.2.成骨分化：取第3代细胞，加入间质干细胞成骨诱导液(基础培养液加10 mol／L地塞米松、10 mmmol／Lβ一甘油磷酸钠、50 mg／L抗坏血酸)，诱导培养3天后，细胞体积增大，呈短梭形；诱导第7天，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多；14天，胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间可见钙质沉积；29天，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节，结果参见附图3可知，a（40x）、b（100x）分别为成骨诱导后茜素红染色结果，可见加入间质干细胞成骨诱导液后，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节。
3.含p63基因的慢病毒载体的构建。
3.1.目的基因片段获取。
3.1.1.引物设计：从GeneBank 中查寻TP63 基因序列，设计引物
从GeneBank 中查寻p63基因序列，分别设计引物attB1-Kozak-TP63-F、flag-TP63-R 和ttB2-flag-R如下，
attB1-Kozak-TP63-F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGAATTTTGAAACTTCACGGTGTG;
flag-TP63-R：
TTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTCCCCCTCCTCTTTGATGCG;
attB2-flag-R：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC。
3.1.2.PCR 扩增目的基因：分别以attB1-Kozak-TP63-F，attB2-flag-R为引物，进行目的基因TP63的PCR 扩增。反应体系为50 μL，目的基因TP63的PCR 反应循环条件: 98℃ 3 min→( 94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 2.5m) 30 循环→72℃ 10 min→4℃ + ∞ ;PCR扩增获得attB1-Kozak-TP63-flag -attB2片段。
3.2.利用Gateway Technology构建pDown- TP63-flag载体。
25℃，BP反应1 h。反应体系：
attB1-K-TP63-flag-attB2 100 ng
pDONR221 100 ng
BP clonase 1 μl
TE buffer up to 5 μl
加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10 min，转化BP反应产物到大肠杆菌Stbl3，把100μL转化物涂到含有50 μg/mL Kan的LB平板上，37℃孵育过夜；菌落PCR筛选阳性克隆；体积30 μl，PCR鉴定程序：94℃ 3 min94℃, 30 S ; 60℃, 30 S ; 72℃, 1.5min（2kb/min）;29个循环，72℃ 5min；阳性克隆质粒测序验证反应。
3.3.利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP 。
25℃，LR反应16 h。反应体系：
pUp-EF1A 12.89 ng
pDown- TP63-flag 15.21 ng
pTail- IRES/eGFP 13.03 ng
母载体pLV.Des3d.P/neo 60.28 ng
LR clonase 1 μl
TE buffer up to 5 μl
加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10 min；转化LR反应产物到Stbl3；菌落PCR筛选阳性克隆，鉴定结果参见附图6，由附图6可知，PCR鉴定条带理论大小为2100bp，与目的条带大小相符的克隆即为阳性克隆；挑取阳性克隆质粒，测序验证，获得载体图谱见附图7。
4.将上述制备的含p63基因的慢病毒载体转染到人脂肪干细胞。
4.1.病毒包装：对数生长期的293FT细胞接种于培养皿中，DNA- Lipofectamine 2000复合物添加到293FT细胞中，转染后48小时收集培养上清进行浓缩；转染后72小时再次收集浓缩；对病毒进行荧光表达观察及滴度测定，结果参见附图8。
4.2.细胞稳转：待人脂肪干细胞完全贴壁后，选取两孔细胞分别加入30μL的Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo，充分的摇匀后放入培养箱中培养。转导6小时后，更换新鲜培养液继续培养，转导48小时后，于荧光显微镜下观察转导效果。待细胞扩增至足够细胞量，然后将细胞传代接种6孔板以及24孔板用于PCR、WB和免疫荧光检测，结果参见附图9、附图10。
由附图9可知，转导48小时后观察TP63和GFP的转导率分别在50%和90%左右，其中TP63的荧光表达较弱，在传代培养后荧光液没有明显提升，但GFP的表达则较强。
5.利用p63基因的作用促使脂肪干细胞向表皮细胞分化。
5.1.细胞蛋白提取。
5.1.1.将100×PMSF 按比例加入到RIPA裂解液中，同时将PBS置于冰上，预冷备用。
5.1.2.将待提取蛋白的细胞吸去培养基，置于冰上，加入适量预冷的PBS清洗2次。
5.1.3.吸去PBS，加入80μl RIPA裂解液，晃动培养皿，使裂解液覆盖整个皿，冰上裂解5min，用细胞刮刮下细胞，转移EP管中，12000 rmp/min 离心 5min，将上清转移到新的EP管中。
5.1.4.用核酸蛋白测定仪测定样品蛋白总浓度。
5.2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.2.1.按照8%分离胶和5%的浓缩胶配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
5.2.2.调整上样量为总蛋白量100ug，加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀，95℃水浴5分钟。浓缩胶中8 0V电泳，分离胶中120 V电泳 。
5.3.蛋白质的电转移以及膜的封闭。
5.3.1.300mA，湿法转膜70分钟。
5.3.2.取出膜，置于5%脱脂牛奶封闭液中，室温封闭1小时。
5.4.抗原抗体反应。
5.4.1.将一抗以适当浓度的比例加入到5%脱脂牛奶封闭液中稀释 。
5.4.2.将封闭后的PVDF膜放入封闭袋中，加入4 mL一抗，室温震荡孵育1小时后，放4℃冰箱孵育过夜，第二天取出，再室温震荡孵育1小时。
5.4.3.弃去一抗，用1×TBS/T 洗膜 3次，每次5分钟，以除去过量的一抗 。
5.4.4.将膜转移至另一新的封闭袋中，加入4 mL 适当稀释二抗，室温振荡孵育1小时。
5.4.5.用1×TBS/T 洗膜 3次，每次5分钟，以除去未结合的二抗。
5.5.ECL显色。
5.5.1.将ECL A液和 B 液以1：1(V/V)混合，室温反应1-2分钟。
5.5.2.将混合液滴加于 PVDF 膜表面，孵育1 -2分钟 ，置于Fiuorchem HD2凝胶成像分析系统中，观察、拍照，结果见图10。
实施例二：促进人脂肪干细胞向表皮分化的方法
1.人脂肪干细胞的分离及培养鉴定。
1.1.通将脂肪组织剪成0.3cm×0.3cm×0.3cm 大小，用0.1mmol／L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后移入瓶中，以0.1%胶原酶I消化，反复剪碎至糊状后置37℃摇床， 1000 r/min 离心30 min去上清，沉淀重悬于0.075mmol/L氯化钾，静置10min后离心去上清，沉淀重悬于含10% 胎牛血清的DMEM 培养液中，移入培养皿中；隔天更换培养液。达到对数生长期后，用0.25%胰酶37℃消化，按1：3的比例进行传代结果参见附图1。
1.2.绘制细胞生长曲线，参见附图4，流式细胞仪检测抗原cd105、cd29、cd44、cd45，结果见图5，分别进行成脂诱导分化，参见附图2；成骨诱导分化参见附图3。
2.慢病毒载体的制备。
2.1.目的基因片段获取。
2.1.1.引物设计：从GeneBank 中查寻TP63 基因序列，设计引物
从GeneBank 中查寻p63基因序列，分别设计引物attB1-Kozak-TP63-F、flag-TP63-R 和ttB2-flag-R如下，
attB1-Kozak-TP63-F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGAATTTTGAAACTTCACGGTGTG;
flag-TP63-R：
TTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTCCCCCTCCTCTTTGATGCG;
attB2-flag-R：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC。
2.1.2.PCR 扩增目的基因：分别以attB1-Kozak-TP63-F，attB2-flag-R为引物，进行目的基因TP63的PCR 扩增。反应体系为50 μL，目的基因TP63的PCR 反应循环条件: 98℃ 3 min→( 94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 2.5m) 30 循环→72℃ 10 min→4℃;PCR扩增获得attB1-Kozak-TP63-flag -attB2片段。
2.2.利用Gateway Technology构建pDown- TP63-flag载体
25℃，BP反应1 h。反应体系：
attB1-K-TP63-flag-attB2 100 ng
pDONR221 100 ng
BP clonase 1 μl
TE buffer up to 5 μl
加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10 min，转化BP反应产物到大肠杆菌Stbl3，把100μL转化物涂到含有50 μg/mL Kan的LB平板上，37℃孵育过夜。菌落PCR筛选阳性克隆。体积30 μl，PCR鉴定程序：94℃ 3 min94℃, 30 S ; 60℃, 30 S ; 72℃, 1.5min（2kb/min）;29个循环，72℃ 5min，PCR鉴定结果参见附图6；阳性克隆质粒测序验证反应；载体结构参见附图7。
2.3.利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP 。
25℃，LR反应16 h。反应体系：
pUp-EF1A 12.89 ng
pDown- TP63-flag 15.21 ng
pTail- IRES/eGFP 13.03 ng
母载体pLV.Des3d.P/neo 60.28 ng
LR clonase 1 μl
TE buffer up to 5 μl
加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10 min。转化LR反应产物到Stbl3。菌落PCR筛选阳性克隆，鉴定结果参见附图6。挑取阳性克隆质粒，测序验证，获得载体图谱参见附图7。
3.病毒包装。
3.1.取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿5×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5%CO2 的培养箱中培养过夜；
3.2.第二天转染前去除旧的培养液，加入5mL新鲜的含10%血清DMEM培养液；制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，以一个10cm培养皿的用量为示范：一支无菌的5mL离心管，先加入1.5mL无血清Opti-MEM?I培养液，再加入pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5、目的质粒（各4ug），轻轻颠倒混匀；另外一支无菌的5mL离心管里，加入1.5mL无血清Opti-MEM?I培养液和40μL的Lipofectamine 2000，轻轻颠倒混匀；室温孵育5分钟；5分钟后，将已稀释DNA加入到含有Lipofectamine 2000的无血清Opti-MEM?I培养液，轻轻颠倒混匀。室温孵育20分钟。
3.3.将DNA- Lipofectamine 2000复合物一滴一滴地添加到293FT细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。放置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中过夜培养。
3.4.转染后一天，更换10mL含10%血清DMEM培养液。放置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养。
3.5.转染后48小时收集培养上清进行浓缩；加入10ml新鲜的培养液继续培养，转染后72小时再次收集浓缩；3000rpm低速离心15min，上清用0.45μm滤器进行过滤，以彻底去除细胞碎片；每个UT离心管装20mL滤液，50000×g高速离心90min沉淀病毒颗粒，弃去上清；每管沉淀用200ul培养液重悬病毒沉淀，分装进2个0.5ml进口AXYGEN管中，每管100ul。
3.6.分装好的病毒放置-80℃保存，病毒转染结果参见附图8。
4.Western Blot检测对比未转染的脂肪干细胞与转染后的脂肪干细胞向表皮细胞分化能力。
4.1.细胞蛋白提取。
4.1.1.将100×PMSF 按比例加入到RIPA裂解液中，同时将PBS置于冰上，预冷备用。
4.1.2.将待提取蛋白的细胞吸去培养基，置于冰上，加入适量预冷的PBS清洗2次。
4.1.3.吸去PBS，加入80μl RIPA裂解液，晃动培养皿，使裂解液覆盖整个皿，冰上裂解5min，用细胞刮刮下细胞，转移EP管中，12000 rmp/min 离心 5min，将上清转移到新的EP管中。
4.1.4.用核酸蛋白测定仪测定样品蛋白总浓度。
4.2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4.2.1.按照8%分离胶和5%的浓缩胶配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
4.2.2.调整上样量为总蛋白量100ug，加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀，95℃水浴5分钟。浓缩胶中8 0V电泳，分离胶中120 V电泳 。
4.3.蛋白质的电转移以及膜的封闭。
4.3.1. 300mA，湿法转膜70分钟。
4.3.2.取出膜，置于5%脱脂牛奶封闭液中，室温封闭1小时。
4.4.抗原抗体反应。
4.4.1.将一抗以适当浓度的比例加入到5%脱脂牛奶封闭液中稀释 。
4.4.2.将封闭后的PVDF膜放入封闭袋中，加入4 mL一抗，室温震荡孵育1小时后，放4℃冰箱孵育过夜，第二天取出，再室温震荡孵育1小时。
4.4.3.弃去一抗，用1×TBS/T 洗膜 3次，每次5分钟，以除去过量的一抗 。
4.4.4.将膜转移至另一新的封闭袋中，加入4 mL 适当稀释二抗，室温振荡孵育1小时。
4.4.5.用1×TBS/T 洗膜 3次，每次5分钟，以除去未结合的二抗。
4.5. ECL显色。
4.5.1.将ECL A液和 B 液以1：1(V/V)混合，室温反应1-2分钟。
4.5.2.将混合液滴加于 PVDF 膜表面，孵育1 -2分钟 ，置于Fiuorchem HD2凝胶成像分析系统中，观察、拍照，结果参见附图10。
实施例三：Q-PCR检测试验
1.RNA抽提。
1.1.吸去培养液，加入1 mL Trizol，室温放置5分钟后反复吹打细胞，将细胞裂解物移入一个1.5 mL EP管。
1.2.剧烈振荡15秒，加入0.2倍体积氯仿，振荡15秒，室温放置2～3分钟。
1.3.12000 rpm，离心10分钟。
1.4.吸取上层水相，移到另一新EP管中，加入1.1倍体积的异丙醇，充分混匀，室温放置10分钟。
1.5.12000 rpm，离心10分钟，弃去上清液。
1.6.加入1mL无水乙醇洗涤RNA沉淀。
1.7. 7500 rpm，离心5分钟，弃去上清液。
1.8.充分吸干乙醇残留液，稍微晾干2~3分钟，加入20 uL DEPC-treated water溶解RNA沉淀。
1.9.用超微量分光光度计测定抽提的RNA浓度和纯度，-80℃保存。
2.逆转录反应。
2.1.RNA 1 μg；
oligo (dT)18 primer 1 μL；
DEPC-treated water up to 12 μL；
65℃孵育5分钟后立即放在冰上；
依次加入：
5× Reaction Buffer 4 μL；
RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μL) 1 μL；
10 mM dNTP Mix 2 μL；
RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U/μL) 1 μL；
2.2.离心混合均匀：42℃孵育60分钟；70℃孵育5分钟。
2.3.合成后的cDNA样品-20 ℃保存。
3.Real-time PCR。
3.1.引物序列:
TP63-F1：AGTTGTGTTGGAGGGATGAACCG
TP63-R1：TCCGAAACTTGCTGCTTTCTGATG
Human GAPDH-F：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG
Human GAPDH-R：ACCACCCTGTTGCTGTAGCC
3.2.反应体系:见如下表1。
表1：PCR反应体系
| 成分 | 浓度 | 使用量 | 终浓度 |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | 2× | 10 uL | 1× |
| Forward Primer | 10 uM | 0.4 uL | 0.2 uM |
| Reverse Primer | 10 uM | 0.4 uL | 0.2 uM |
| Template Solution | 2 uL | ||
| ddH2O | 7.2 uL | ||
| Total Volume | 20 uL |
3.3.反应条件：预变性：95℃，60s；PCR循环（×40 cycles）。95℃，15s 60℃，1min。溶解曲线分析。95℃，15s 100% 70℃，1min 1% 95℃，30s。
结论：采用本发明上述实施例制备提供的改良后的脂肪干细胞，其p63表达超过未转染的脂肪干细胞。通过Q-PCR检测报告检测结果显示，改良后的脂肪干细胞，其p63表达超过未转染的脂肪干细胞（25187.90%），实验结果见表1。
实施例四：多基因Q-PCR检测
1.RNA抽提。
1.1.吸去培养液，加入1 mL Trizol，室温放置5分钟后反复吹打细胞，将细胞裂解物移入一个1.5 mL EP管。
1.2.剧烈振荡15秒，加入0.2倍体积氯仿，振荡15秒，室温放置2～3分钟。
1.3.12000 rpm，离心10分钟。
1.4.吸取上层水相，移到另一新EP管中，加入1.1倍体积的异丙醇，充分混匀，室温放置10分钟。
1.5. 12000 rpm，离心10分钟，弃去上清液。
1.6.加入1mL无水乙醇洗涤RNA沉淀。
1.7. 7500 rpm，离心5分钟，弃去上清液。
1.8.充分吸干乙醇残留液，稍微晾干2~3分钟，加入20 uL DEPC-treated water溶解RNA沉淀。
1.9.用超微量分光光度计测定抽提的RNA浓度和纯度，-80℃保存。
2.逆转录反应。
2.1. RNA 1 μg；
oligo (dT)18 primer 1 μL；
DEPC-treated water up to 12 μL；
2.2. 65℃孵育5分钟后立即放在冰上；
2.3. 依次加入：
5× Reaction Buffer 4 μL；
RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μL) 1 μL；
10 mM dNTP Mix 2 μL；
RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U/μL) 1 μL；
离心混合均匀：42℃孵育60分钟；70℃孵育5分钟；
合成后的cDNA样品-20 ℃保存。
3. Real-time PCR
3.1.引物序列:
TP63-F：AGTTGTGTTGGAGGGATGAACCG
TP63-R：TCCGAAACTTGCTGCTTTCTGATG
CK19-F：TACAGCCACTACTACACGACCATC
CK19-R：CGCAGAGCCTGTTCCGTCTC
ITGA6-F：TATCGGTCTCGGGAGTTGCTAAAC
ITGA6-R：GCCACTGAATGTTCAAGGTTGCTG
CK10-F：AGCGTGGAGGCTGACATCAAC
CK10-R：CACATTCACATCACCAGTGGACAC
CK15-F：AGATCGCTACTTACCGCAGC
CK15-R：CCACCTGTCCATCCACTGAC
ITGβ1-F：CAAGTGTCGTGTGTGTGAGTGC
ITGβ1-R：TTTGCCCTTGAAACTTCGGATCTG
Human GAPDH-F：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG
Human GAPDH-R：ACCACCCTGTTGCTGTAGCC
3.2.反应体系: 见如下表2。
表2：PCR反应体系
| 成分 | 浓度 | 使用量 | 终浓度 |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | 2× | 10 uL | 1× |
| Forward Primer | 10 uM | 0.4 uL | 0.2 uM |
| Reverse Primer | 10 uM | 0.4 uL | 0.2 uM |
| Template Solution | 2 uL | ||
| ddH2O | 7.2 uL | ||
| Total Volume | 20 uL |
3.3. 反应条件：
预变性：95℃，60s。PCR循环（×40 cycles）；95℃，15s 60℃，1min。溶解曲线分析；95℃，15s 100% 70℃，1min 1% 95℃，30s。
实验结果见表3至表8。
表3： 转染后人脂肪干细胞目中基因TP63的Q-PCR检测
表4：转染后人脂肪干细胞中CK19的Q-PCR检测
表5：转染后人脂肪干细胞中ITGA6的Q-PCR检测
表6： 转染后人脂肪干细胞中CK10的Q-PCR检测
表7： 转染后人脂肪干细胞中CK15的Q-PCR检测
表8： 转染后人脂肪干细胞中ITGβ1的Q-PCR检测
结论：采用本发明上述实施例制备提供的改良后的脂肪干细胞，向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞。通过Q-PCR检测报告检测结果显示，改良后的脂肪干细胞，向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞：转染后的脂肪干细胞有明显的表皮细胞标记物角蛋白ck10（112.28%）、ck15（84.79%）、ck19（52.71%）表达及整合素β1（76.69%）表达。
通过上述各系列实施例提供的试验得出，本发明提供的改良后的脂肪干细胞向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞，具有更好的向表皮细胞分化的能力，获得的改良式脂肪干细胞用于皮肤组织缺损修复具有显著突出的技术效果，是一种可广泛应用于临床的大面积皮肤创伤修复技术，具有材料丰富、无排异反应等优点。
临床上收治的大面积烧伤或皮肤缺损的患者，一方面在自体皮肤不足的情况下，需要有效的皮肤覆盖方法，而目前无论异体皮肤移植或组织工程学产品，都存在一定的排异反应；另一方面，利用自体干细胞移植治疗，又必须满足取材方便、易于培养、生长迅速等要求。本发明所提供的改良后脂肪干细胞，由于其为自体组织，因此无排异反应；同时由于脂肪干细胞的生长特性，可以满足临床要求。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
SEQ ID NO.1
<110> 新疆医科大学，冯树梅
<120> TP63 gene squence
<130> 一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2040
<212> DNA
<213> human
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2040)
<400> 1
atgaattttg aaacttcacg gtgtgccacc ctacagtact gccctgaccc ttacatccag 60
cgtttcgtag aaaccccagc tcatttctct tggaaagaaa gttattaccg atccaccatg 120
tcccagagca cacagacaaa tgaattcctc agtccagagg ttttccagca tatctgggat 180
tttctggaac agcctatatg ttcagttcag cccattgact tgaactttgt ggatgaacca 240
tcagaagatg gtgcgacaaa caagattgag attagcatgg actgtatccg catgcaggac 300
tcggacctga gtgaccccat gtggccacag tacacgaacc tggggctcct gaacagcatg 360
gaccagcaga ttcagaacgg ctcctcgtcc accagtccct ataacacaga ccacgcgcag 420
aacagcgtca cggcgccctc gccctacgca cagcccagct ccaccttcga tgctctctct 480
ccatcacccg ccatcccctc caacaccgac tacccaggcc cgcacagttt cgacgtgtcc 540
ttccagcagt cgagcaccgc caagtcggcc acctggacgt attccactga actgaagaaa 600
ctctactgcc aaattgcaaa gacatgcccc atccagatca aggtgatgac cccacctcct 660
cagggagctg ttatccgcgc catgcctgtc tacaaaaaag ctgagcacgt cacggaggtg 720
gtgaagcggt gccccaacca tgagctgagc cgtgaattca acgagggaca gattgcccct 780
cctagtcatt tgattcgagt agaggggaac agccatgccc agtatgtaga agatcccatc 840
acaggaagac agagtgtgct ggtaccttat gagccacccc aggttggcac tgaattcacg 900
acagtcttgt acaatttcat gtgtaacagc agttgtgttg gagggatgaa ccgccgtcca 960
attttaatca ttgttactct ggaaaccaga gatgggcaag tcctgggccg acgctgcttt 1020
gaggcccgga tctgtgcttg cccaggaaga gacaggaagg cggatgaaga tagcatcaga 1080
aagcagcaag tttcggacag tacaaagaac ggtgatggta cgaagcgccc gtttcgtcag 1140
aacacacatg gtatccagat gacatccatc aagaaacgaa gatccccaga tgatgaactg 1200
ttatacttac cagtgagggg ccgtgagact tatgaaatgc tgttgaagat caaagagtcc 1260
ctggaactca tgcagtacct tcctcagcac acaattgaaa cgtacaggca acagcaacag 1320
cagcagcacc agcacttact tcagaaacag acctcaatac agtctccatc ttcatatggt 1380
aacagctccc cacctctgaa caaaatgaac agcatgaaca agctgccttc tgtgagccag 1440
cttatcaacc ctcagcagcg caacgccctc actcctacaa ccattcctga tggcatggga 1500
gccaacattc ccatgatggg cacccacatg ccaatggctg gagacatgaa tggactcagc 1560
cccacccagg cactccctcc cccactctcc atgccatcca cctcccactg cacaccccca 1620
cctccgtatc ccacagattg cagcattgtc agtttcttag cgaggttggg ctgttcatca 1680
tgtctggact atttcacgac ccaggggctg accaccatct atcagattga gcattactcc 1740
atggatgatc tggcaagtct gaaaatccct gagcaatttc gacatgcgat ctggaagggc 1800
atcctggacc accggcagct ccacgaattc tcctcccctt ctcatctcct gcggacccca 1860
agcagtgcct ctacagtcag tgtgggctcc agtgagaccc ggggtgagcg tgttattgat 1920
gctgtgcgat tcaccctccg ccagaccatc tctttcccac cccgagatga gtggaatgac 1980
ttcaactttg acatggatgc tcgccgcaat aagcaacagc gcatcaaaga ggagggggag 2040
SEQ ID NO.2
<110> 新疆医科大学 ，冯树梅
<120> pLV.EX3d.P/neo-EF1A> TP63/flag >IRES/eGFP vector squence
<130> 一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12079
<212> DNA
<213> Human
<400> 1
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60
tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 480
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600
attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660
aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720
gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780
tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960
caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020
acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080
tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140
gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200
ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260
ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320
ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380
atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgcta 1800
gcttttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata 1860
atagcaacag acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt 1920
actagtatca actttgtata gaaaagttgg gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca 1980
catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga 2040
gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg 2100
agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg 2160
ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta 2220
cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg 2280
atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc 2340
cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct 2400
ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt 2460
gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc 2520
tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc 2580
gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt 2640
ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg gtctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct 2700
gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg 2760
gccctgctgc agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt 2820
cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg 2880
agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt 2940
taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg 3000
aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg 3060
gatcttggttcattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg 3120
tgtcgtgaca agtttgtaca aaaaagcagg ctgccaccat gaattttgaa acttcacggt 3180
gtgccaccct acagtactgc cctgaccctt acatccagcg tttcgtagaa accccagctc 3240
atttctcttg gaaagaaagt tattaccgat ccaccatgtc ccagagcaca cagacaaatg 3300
aattcctcag tccagaggtt ttccagcata tctgggattt tctggaacag cctatatgtt 3360
cagttcagcc cattgacttg aactttgtgg atgaaccatc agaagatggt gcgacaaaca 3420
agattgagat tagcatggac tgtatccgca tgcaggactc ggacctgagt gaccccatgt 3480
ggccacagta cacgaacctg gggctcctga acagcatgga ccagcagatt cagaacggct 3540
cctcgtccac cagtccctat aacacagacc acgcgcagaa cagcgtcacg gcgccctcgc 3600
cctacgcaca gcccagctcc accttcgatg ctctctctcc atcacccgcc atcccctcca 3660
acaccgacta cccaggcccg cacagtttcg acgtgtcctt ccagcagtcg agcaccgcca 3720
agtcggccac ctggacgtat tccactgaac tgaagaaact ctactgccaa attgcaaaga 3780
catgccccat ccagatcaag gtgatgaccc cacctcctca gggagctgtt atccgcgcca 3840
tgcctgtcta caaaaaagct gagcacgtca cggaggtggt gaagcggtgc cccaaccatg 3900
agctgagccg tgaattcaac gagggacaga ttgcccctcc tagtcatttg attcgagtag 3960
aggggaacag ccatgcccag tatgtagaag atcccatcac aggaagacag agtgtgctgg 4020
taccttatga gccaccccag gttggcactg aattcacgac agtcttgtac aatttcatgt 4080
gtaacagcag ttgtgttgga gggatgaacc gccgtccaat tttaatcatt gttactctgg 4140
aaaccagaga tgggcaagtc ctgggccgac gctgctttga ggcccggatc tgtgcttgcc 4200
caggaagaga caggaaggcg gatgaagata gcatcagaaa gcagcaagtt tcggacagta 4260
caaagaacgg tgatggtacg aagcgcccgt ttcgtcagaa cacacatggt atccagatga 4320
catccatcaa gaaacgaaga tccccagatg atgaactgtt atacttacca gtgaggggcc 4380
gtgagactta tgaaatgctg ttgaagatca aagagtccct ggaactcatg cagtaccttc 4440
ctcagcacac aattgaaacg tacaggcaac agcaacagca gcagcaccag cacttacttc 4500
agaaacagac ctcaatacag tctccatctt catatggtaa cagctcccca cctctgaaca 4560
aaatgaacag catgaacaag ctgccttctg tgagccagct tatcaaccct cagcagcgca 4620
acgccctcac tcctacaacc attcctgatg gcatgggagc caacattccc atgatgggca 4680
cccacatgcc aatggctgga gacatgaatg gactcagccc cacccaggca ctccctcccc 4740
cactctccat gccatccacc tcccactgca cacccccacc tccgtatccc acagattgca 4800
gcattgtcag tttcttagcg aggttgggct gttcatcatg tctggactat ttcacgaccc 4860
aggggctgac caccatctat cagattgagc attactccat ggatgatctg gcaagtctga 4920
aaatccctga gcaatttcga catgcgatct ggaagggcat cctggaccac cggcagctcc 4980
acgaattctc ctccccttct catctcctgc ggaccccaag cagtgcctct acagtcagtg 5040
tgggctccag tgagacccgg ggtgagcgtg ttattgatgc tgtgcgattc accctccgcc 5100
agaccatctc tttcccaccc cgagatgagt ggaatgactt caactttgac atggatgctc 5160
gccgcaataa gcaacagcgc atcaaagagg agggggagga ttacaaggat gacgacgata 5220
agtaaaccca gctttcttgt acaaagtggg cccctctccc tccccccccc ctaacgttac 5280
tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat 5340
attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat 5400
tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga 5460
agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca 5520
gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac 5580
acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt 5640
caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca 5700
ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggta cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt 5760
aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg 5820
ataatatggc cacaaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 5880
tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 5940
agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 6000
ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 6060
accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 6120
aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 6180
tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 6240
gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 6300
ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 6360
gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 6420
tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 6480
agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 6540
acgagctgta caagtaacaa ctttattata catagttgat caattccgat aatcaacctc 6600
tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 6660
tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca 6720
ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 6780
tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca 6840
ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg 6900
cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg 6960
acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg 7020
ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg 7080
accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc 7140
ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca tcgggaattc ccgcggttcg 7200
aattctaccg ggtaggggag gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag 7260
ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca 7320
ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc 7380
ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg 7440
aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg 7500
taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc 7560
tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc 7620
gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt 7680
tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga cctcacgtgc gcatgattga acaagatgga 7740
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 7800
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 7860
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg 7920
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 7980
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 8040
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 8100
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 8160
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatcaggacg aagagcatca ggggctcgcg 8220
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 8280
acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 8340
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 8400
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 8460
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg 8520
ggactctggg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 8580
ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca agatctgctt 8640
tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa 8700
ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt 8760
gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg 8820
aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata acttgcaaag 8880
aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 8940
agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 9000
ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct agctatcccg cccctaactc 9060
cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa 9120
ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt 9180
gaggaggctt ttttggaggc ctagggacgt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta 9240
cgcgcgctca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 9300
acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 9360
caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag 9420
cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 9480
cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 9540
tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 9600
cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 9660
gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 9720
aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc 9780
gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa 9840
caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 9900
atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 9960
taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 10020
cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 10080
aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 10140
aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 10200
tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 10260
ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 10320
catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 10380
aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 10440
ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 10500
gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 10560
aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 10620
gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 10680
gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 10740
gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 10800
gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 10860
gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 10920
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 10980
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 11040
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 11100
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 11160
ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 11220
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 11280
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 11340
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 11400
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 11460
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 11520
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 11580
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 11640
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 11700
gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 11760
gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 11820
cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 11880
ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 11940
cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 12000
ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa 12060
aagctggagc tgcaagctt 12079
Claims (5)
1.一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有确定基因的慢病毒载体，利用慢病毒将确定基因转载至脂肪干细胞，通过慢病毒转染人脂肪干细胞，促进人脂肪干细胞向表皮分化，其特征在于，具体通过如下方法制备获得：
（1） 脂肪干细胞的分离及体外培养鉴定：无菌获取人脂肪组织并进行体外培养鉴定，以胶原酶振荡消化后离心收集细胞，常规传代及冻存,并对细胞进行细胞生长曲线及CD44、CD45、CD29、CD105表面标志物的流式细胞鉴定；
（2）脂肪干细胞的多向分化潜能鉴定：对所获人脂肪干细胞分别进行成脂和成骨分化鉴定，即分别以成脂和成骨诱导液诱导细胞，2周后分别对成脂细胞和成骨细胞进行油红染色和茜素红染色的鉴定；
（3） 构建含p63基因的慢病毒载体：从GeneBank 中查寻p63基因序列，设计引物，分别以attB1-Koza k-TP63-F，attB2-flag-R为引物，进行目的基因TP63的PCR 扩增；再利用Gateway Technology构建pDown- TP63-flag，最后利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体，通过菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆质粒并测序；
（4）将上述制备的含p63基因的慢病毒载体转染到人脂肪干细胞：所获得的pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体转染到293FT细胞中，进行病毒包装，收集培养上清对病毒进行荧光表达观察及滴度测定；最后将Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo加入人脂肪干细胞，通过脂质体进行转导；荧光显微镜下观察转导效果，并进行PCR、WB和免疫荧光检测；
（5）利用p63基因的作用促使脂肪干细胞向表皮细胞分化。
2.如权利要求1所述的一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，其特征在于，所述的用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞通过如下具体方法制备获得：
（1） 脂肪干细胞的分离及体外培养鉴定：脂肪组织剪成糜状，用PBS冲洗数遍，以0.1%胶原酶I置37℃摇床消化，离心30 min去上清，沉淀重悬于含10% 胎牛血清的DMEM 培养液中，移入培养皿中；隔天更换培养液；达到对数生长期后，用0.25%胰酶消化，按1：3的比例进行传代；
生长曲线的检测：取处于对数生长期的细胞，用胰酶消化，洗涤离心，制备单细胞悬液，接种到24 孔板中；每天随机取4 孔细胞消化、记数，取其均值，连续7天，即可制备生长曲线；
流式检测脂肪干细胞表面标记：流式细胞仪对第3代脂肪干细胞表面相对特异性抗原进行检测；0. 25% 胰蛋白酶消化细胞, 1500r /分离心10 分钟, 在细胞沉淀中细胞数量为1* 106 ，分别加入FITC- CD105荧光抗体, PE - CD29荧光抗体,FITC-CD45,FITE-CD44荧光抗体各20ul , 4℃ 孵育30分钟, 再用PBS 缓冲液清洗2 遍, 最后用10%福尔马林固定细胞, 上流式细胞仪测定抗原的阳性率；
（2）脂肪干细胞定向分化及鉴定：
成脂分化：细胞贴壁100%汇合后，加入间质干细胞成脂诱导液，成脂诱导72小时后，细胞内有小脂滴出现，约2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉淀；
成骨分化：取第3代细胞，加入间质干细胞成骨诱导液，基础培养液加10 mol／L地塞米松、10 mmmol／Lβ一甘油磷酸钠、50 mg／L抗坏血酸，诱导培养3天后，细胞体积增大，呈短梭形；诱导第7天，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多；14天，胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间可见钙质沉积；29天，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节；
（3） 构建含p63基因的慢病毒载体：PCR扩增attB1-Kozak-TP63-flag -attB2，再利用Gateway Technology构建pDown- TP63-flag，最后利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP ，挑取阳性克隆质粒，送交阳性克隆测序；
（4）将上述制备的含p63基因的慢病毒载体转染到人脂肪干细胞：
病毒包装：对数生长期的293FT细胞接种于培养皿中，DNA- Lipofectamine 2000复合物添加到293FT细胞中，转染后48小时收集培养上清进行浓缩；转染后72小时再次收集浓缩；对病毒进行荧光表达观察及滴度测定；
细胞稳转：待人脂肪干细胞完全贴壁后，选取两孔细胞分别加入30μL的Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo，充分的摇匀后放入培养箱中培养；转导6小时后，更换新鲜培养液继续培养，转导48小时后，于荧光显微镜下观察转导效果；待细胞扩增至足够细胞量，然后将细胞传代接种6孔板以及24孔板用于PCR、免疫荧光检测；
（5）利用p63基因的作用促使脂肪干细胞向表皮细胞分化。
3.一种含p63基因的慢病毒载体，其特征在于，所述的含p63基因的慢病毒载体pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP。
4.如权利要求2所述的一种含p63基因的慢病毒载体，其特征在于，所述的含p63基因的慢病毒载体pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP具有如序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列。
5.一种促进人脂肪肝细胞向表皮分化的方法，其特征在于，所述的促进人脂肪肝细胞向表皮分化的具体方法如下：
（1）脂肪干细胞的分离及体外培养：脂肪组织剪成糜状，用PBS冲洗数遍，以0.1%胶原酶I置37℃摇床消化，离心30 min去上清，沉淀重悬于含10% 胎牛血清的DMEM 培养液中，移入培养皿中；隔天更换培养液；达到对数生长期后，用0.25%胰酶消化，按1：3的比例进行传代；
(2) 构建了含有p63基因的慢病毒载体，含p63基因的重组载体是pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP，含p63基因的重组载体通过PCR扩增attB1-Kozak-TP63-flag -attB2，再利用Gateway Technology构建pDown- TP63-flag，最后利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP ，挑取阳性克隆质粒，送交阳性克隆测序等过程构建；
（3）利用慢病毒将p63基因转载至脂肪干细胞：
病毒包装：对数生长期的293FT细胞接种于培养皿中，DNA- Lipofectamine 2000复合物添加到293FT细胞中，转染后48小时收集培养上清进行浓缩；转染后72小时再次收集浓缩；对病毒进行荧光表达观察及滴度测定；
细胞稳转：待人脂肪干细胞完全贴壁后，选取两孔细胞分别加入30μL的Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo，充分的摇匀后放入培养箱中培养；转导6小时后，更换新鲜培养液继续培养，转导48小时后，于荧光显微镜下观察转导效果；待细胞扩增至足够细胞量，然后将细胞传代接种6孔板以及24孔板用于PCR、免疫荧光检测。
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| CN201410828141.2A CN104403998A (zh) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | 一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106727706A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 湖南新起源医疗技术有限公司 | 一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法 |
| CN109568270A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-05 | 佛山科学技术学院 | 一种含脂肪干细胞分泌物的脂质体及其制备方法 |
| CN111549000A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-08-18 | 中国医学科学院整形外科医院 | 一种过表达Hpgds的重组脂肪干细胞、制备方法及其应用 |
| CN112746074A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-05-04 | 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） | Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞系的构建及诱导分化方法 |
-
2014
- 2014-12-26 CN CN201410828141.2A patent/CN104403998A/zh active Pending
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| CN112746074A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-05-04 | 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） | Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞系的构建及诱导分化方法 |
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