CN110650975B - 双顺反子嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

双顺反子嵌合抗原受体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明的实施方案提供了双顺反子嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体。公开了与CAR构建体相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群和药物组合物。还公开了检测哺乳动物的癌症存在的方法以及治疗或预防哺乳动物的癌症的方法。公开了制备CAR构建体的方法。

Description

双顺反子嵌合抗原受体及其用途
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2017年5月15日递交的第62/506,268号美国临时专利申请的权益，其通过引用整体并入本文中。
关于联邦政府资助的研究和开发的声明
本发明在在美国国立卫生研究院、美国国家癌症研究所(the NationalInstitutes of Health,National Cancer Institute)的项目编号为Z01BC011565的政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。
通过引用并入电子递交的材料
通过引用整体并入本文中的是将计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，所述核苷酸/氨基酸序列表与本文同时递交且识别如下：日期为2018年5月15日的名称为“739267_ST25.TXT”的一个180,939字节的ASCII(文本)文件。
发明背景
癌症是一个公共卫生问题。尽管诸如化学疗法的治疗取得了进步，但是包括血液恶性肿瘤的许多癌症的预后可能不良。因此，存在对癌症(特别是血液恶性肿瘤)的另外的治疗的未满足的需求。
发明概述
本发明的实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含：(a)可切割的结构域；(b)第一CAR，所述第一CAR包含第一抗原结合结构域、第一跨膜结构域和第一胞内T细胞信号传导结构域；以及(c)第二CAR，所述第二CAR包含第二抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二胞内T细胞信号传导结构域；其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述可切割的结构域连接，其中所述第一抗原结合结构域包含m971抗体的抗原结合结构域，其中当从所述构建体切割所述第一CAR时，所述第一抗原结合结构域具有针对CD22的抗原特异性。
本发明的另一实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含：(a)可切割的结构域；(b)第一CAR，所述第一CAR包含第一抗原结合结构域、第一跨膜结构域和第一胞内T细胞信号传导结构域；以及(c)第二CAR，所述第二CAR包含第二抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二胞内T细胞信号传导结构域；其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述可切割的结构域连接，其中所述第一抗原结合结构域包含FMC63抗体的抗原结合结构域，其中当从所述构建体切割所述第一CAR时，所述第一抗原结合结构域具有针对CD19的抗原特异性。
本发明的另一实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含：(a)两个或更多个可切割的结构域；(b)第一CAR，所述第一CAR包含第一抗原结合结构域、第一跨膜结构域和第一胞内T细胞信号传导结构域；以及(c)第二CAR，所述第二CAR包含第二抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二胞内T细胞信号传导结构域；其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述两个或更多个可切割的结构域连接。
本发明的另一实施方案提供了制备嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体的方法，所述方法包括在(a)和(b)之间设计两个或更多个可切割的结构域：(a)第一CAR，所述第一CAR包含第一抗原结合结构域、第一跨膜结构域和第一胞内T细胞信号传导结构域；和(b)第二CAR，所述第二CAR包含第二抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二胞内T细胞信号传导结构域；其中所述第一和第二CAR通过所述两个或更多个可切割的结构域连接；以及将包含从N末端至C末端的所述第一CAR、所述两个或更多个可切割的结构域和所述第二CAR的序列克隆至质粒内。
本发明的另一实施方案提供了包含如本文中所述的氨基酸序列的CAR氨基酸构建体。
本发明的其他实施方案提供了与本发明的CAR氨基酸构建体相关的相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群和药物组合物。
本发明的另外的实施方案提供了检测哺乳动物中癌症存在的方法以及治疗或预防哺乳动物的癌症的方法。
附图的简要说明
图1呈现了根据本发明的实施方案的示例性CAR构建体的示意图。
图2A-2C呈现了荧光激活细胞分选点状图，其比较了根据本发明的实施方案的人T细胞上以下的表面表达：(2A)当用编码单一抗CD19 CAR或V1 CAR构建体(也被表示为双顺反子-V1或bicis-V1)的载体转导T细胞时的抗CD19 CAR(被表示为“CD19 CAR”的抗CD19CAR)和CD3；(2B)当用编码单一抗CD22 CAR或V1 CAR构建体的载体转导T细胞时的抗CD22CAR(被表示为“CD22 CAR”的抗CD22 CAR)和CD3；以及(2C)当用编码V1 CAR构建体的载体转导细胞时的抗CD19 CAR和抗CD22 CAR。
图3呈现了荧光激活细胞分选点状图，其比较了当用编码单一抗CD19 CAR、单一抗CD22 CAR、环CAR6(the LoopCAR6)的载体转导，或者用编码单一抗CD19 CAR和单一抗CD22CAR的单独的载体共转导时，人T细胞上的抗CD19 CAR和抗CD22 CAR的表面表达。
图4呈现了荧光激活细胞分选点状图，其比较了当用编码根据本发明的实施方案的V1 CAR构建体、V5 CAR构建体(也被表示为双顺反子-V5或bicis-V5)，或者环CAR6的载体转导时，人T细胞上的抗CD19 CAR和抗CD22 CAR的表面表达。
图5A、5B、6A、6B、7A、7B和8是显示根据本发明的实施方案的基于细胞因子产生的体外活性的柱状图。图5A显示了当将表达CD19、CD22、二者或无任何一种的K562细胞与根据本发明的实施方案的用编码V1 CAR构建体、单一抗CD19 CAR(CAR19)或单一抗CD22 CAR(CAR22)的载体转导的T细胞接触时测量的IL2的水平，并且图5B显示了当将表达CD19、CD22、二者或无任何一种的K562细胞与根据本发明的实施方案的用编码V1 CAR构建体、单一抗CD19 CAR(CAR19)或单一抗CD22 CAR(CAR22)的载体转导的T细胞接触时测量的IFNγ的水平。图6A显示了当将表达CD19、CD22、二者或无任何一种的K562细胞与根据本发明的实施方案的用编码V1 CAR构建体、V5 CAR构建体、环CAR6、单一抗CD19 CAR或单一抗CD22 CAR的载体转导的T细胞接触时测量的IL2的水平，并且图6B显示了当将表达CD19、CD22、二者或无任何一种的K562细胞与根据本发明的实施方案的用编码V1 CAR构建体、V5 CAR构建体、环CAR6、单一抗CD19 CAR或单一抗CD22 CAR的载体转导的T细胞接触时测量的IFNγ的水平。图7A显示了当将CD19KO和/或CD22KO NALM6细胞与根据本发明的实施方案的用编码V1CAR构建体、V5 CAR构建体、环CAR6、单一抗CD19 CAR或单一抗CD22 CAR的载体转导的T细胞接触时测量的IL2的水平，并且图7B显示了当将CD19KO和/或CD22KO NALM6细胞与根据本发明的实施方案的用编码V1 CAR构建体、V5 CAR构建体、环CAR6、单一抗CD19CAR或单一抗CD22CAR的载体转导的T细胞接触时测量的IFNγ的水平。图8显示了将CAR T细胞与NALM6肿瘤细胞共孵育18小时，并且通过ELISA测量培养物上清液中IL2产生的水平(“-N”：NALM6；“-N-19”：NALM6-CD19neg；“-N-19-22”：NALM6-CD19neg-CD22neg)。
图9-14呈现了与模拟的T细胞(未转导的T细胞)相比，在使用根据本发明的实施方案的用编码单一抗CD19 CAR、单一抗CD22 CAR、环CAR6、V1 CAR构建体或V5 CAR构建体的载体转导的T细胞，治疗后，体内白血病进展的生物性发光成像。如通过增加的色差(shading)水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。“Lenti”指示CAR已被设计并在在慢病毒骨架内制备。
图15是显示CD19丢失之前和之后患者中的CD22表达的线形图。
图16是显示CRISPR CD19neg和CD22neg白血病系相对于亲本NALM6系的CD19和CD22表达的点状图。
图17呈现了显示CRISPR CD19neg和CD22neg白血病细胞相对于亲本NALM6细胞的体内进展的比较的图像。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图18呈现了显示使用如本文中所述的CAR的治疗方法的比较的图像。在第0天用2.5E5个NALM6和NALM6-CD19neg以及NALM6-CD22neg白血病系的混合物攻击NSG小鼠。连续治疗组中的小鼠在第3天接受3E6个CAR+，并在第9天接受3E6个CAR+ T细胞。共注射组中的小鼠在第3天总共接受6E6个CAR+ T细胞，其中有3E6个抗CD19 CAR+和3E6个抗CD22 CAR+ T细胞。共转导组中的小鼠接受8E6个总T细胞，其中含有3E6个抗CD19+和3E6个抗CD22+CAR T细胞。CD19或CD22组中的小鼠接受3E6个CAR+ T细胞。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。抗CD19和抗CD22CAR的共注射或共转导表明同时靶向CD19和CD22可以减少白血病的复发。
图19是显示用抗CD19和抗CD22 CAR构建体的单一载体转导相对于共转导的比较的点状图。
图20是如实施例7中所述的CAR治疗后的白血病表型的图形图示。
图21用概略地呈现了根据本发明的实施方案的实施例7的TanCAR。
图22A和22B是显示根据本发明的实施方案的用K562、K562-CD19、K562-CD22和K562-CD19CD22靶细胞系的本文中所述的各种CAR的细胞因子产生的柱状图。
图23A呈现了显示基于体内白血病治疗的TanCAR1和TanCAR4的比较的图像。在第0天用1E6个表达荧光素酶的NALM6白血病攻击NSG小鼠。在第3天，向小鼠IV注射3E6个表达CAR的T细胞。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图23B-23D呈现了显示根据本发明的实施方案的与每种CAR或模拟的T细胞产物共孵育的孵育细胞(Incucyte)杀死测定的点状图。
图24用概略地呈现了根据本发明的实施方案的实施例7的环CAR。
图25A-25C呈现了显示根据本发明的实施方案的用K562、K562-CD19、K562-CD22和K562-CD19CD22靶细胞系的各种CAR的细胞因子产生的柱状图。
图26是显示根据本发明的实施方案的用K562、K562-CD19、K562-CD22和K562-CD19CD22靶细胞系的各种CAR的细胞因子产生的柱状图。
图27是显示根据本发明的实施方案的用每种CAR或模拟的T细胞产物与10:1的NALM6:NALM6-CD19neg细胞共孵育的孵育细胞杀死测定的点状图。
图28是显示根据本发明的实施方案的用每种CAR或模拟的T细胞产物与10:1的NALM6:NALM6-CD22neg细胞共孵育的孵育细胞杀死测定的点状图。
图29A-29F是显示当与靶标抗原共孵育时，环CAR6产生多种细胞因子的柱状图。图29A：干扰素γ；图29B：IL6；图29C：TNFα；图29D：IL8；图29E：IL13；图29F：IL2。
图30呈现了图像。在第0天用1E6个表达荧光素酶的NALM6白血病攻击NSG小鼠。在第3天，向小鼠IV注射3E6个表达CAR的T细胞。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图31呈现了图像。在第0天用1E6个表达荧光素酶的NALM6白血病攻击NSG小鼠。在第3天，向小鼠IV注射9E6个、3E6个和1E6个表达环F CAR(其在本文中也被列为环CAR6)的T细胞。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图32呈现了图像。在第0天用1E6个NALM6攻击NSG小鼠。连续治疗组中的小鼠在第3天接受3E6个CAR+，并在第7天接受3E6个CAR+ T细胞。共注射组中的小鼠在第3天总共接受6E6个CAR+ T细胞，其中有3E6个抗CD19 CAR+和3E6个抗CD22 CAR+ T细胞。共转导组中的小鼠接受10E6个总T细胞，其中含有3E6个抗CD19+和3E6个抗CD22+CAR T细胞。抗CD19或抗CD22组中的小鼠接受3E6个CAR+ T细胞。抗CD19和抗CD22 CAR的共注射或共转导表明同时靶向CD19和CD22可以减少白血病的复发。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图33A呈现了图像。在第0天用5E5个NALM6-CD19neg表达荧光素酶的白血病和5E5个NALM6-CD22neg表达荧光素酶的白血病的混合物攻击NSG小鼠。在第3天，用3E6个表达CAR的T细胞治疗小鼠。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图33B呈现了图像。在第0天用如图上所指示的1E6个表达荧光素酶的白血病细胞攻击NSG小鼠。用1％的NALM6-CD19neg或NALM6-CD22neg细胞向这些组中的几组中的白血病中加标(spiked in)。在第3天，用6E6个表达CAR的T细胞治疗小鼠。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图34A呈现了图像。在第0天用1E6个NALM6白血病攻击NSG小鼠。小鼠在第7天接用受8E6个模拟的T、CD19、CD22或环F CAR+ T细胞的治疗。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图34B呈现了图像。在第0天用1E6个NALM6白血病攻击NSG小鼠。小鼠在第7天接受用8E6个模拟的T、CD19、CD22或环F CAR+ T细胞的治疗。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图35A和35B是显示根据本发明的实施方案的在与代表正常组织的各种细胞系共孵育后的环CAR6的IFNγ产生的柱状图。
图36是显示在第8天分析的CD19 CAR和CD22 CAR的人PBMC表面表达的点状图。
图37A-37G：对于细胞因子的产生，用1×PBS将CAR T细胞(1E5个)洗涤3次，并与等量的靶细胞在96孔板中的200ml RPMI培养基中于37℃恒温箱中共孵育15至20小时。对于高抗原靶细胞，使用了表达CD19或CD22或者CD19和CD22两者的K562，并将K562细胞用作阴性对照。对于低靶标抗原系，使用了NALM6和NALM6-CD19neg以及NALM6-CD22neg，并将NALM6-CD19neg CD22neg用作阴性对照。所有测试均为一式三份。用R&D的ELISA试剂盒检测培养物上清液中的IL2的细胞因子水平。图37A：具有不同的共刺激结构域并在不同的抗原密度水平下的CD19和CD22 CAR的细胞因子的产生。图37B：具有不同的共刺激结构域并在不同的抗原密度水平下的双顺反子CAR的细胞因子的产生。图37C：双顺反子CAR的细胞因子产生与二价CAR的细胞因子产生的比较。图37D-37F：对于孵育细胞杀伤测定，将等量的CAR T细胞与5E4个的靶标肿瘤细胞共孵育。每30分钟扫描板的GFP荧光表达以监测细胞，持续40小时。对每个时间点的细胞杀死的百分比进行基线校正。图37G：用NALM6CD19negCD22neg细胞的孵育细胞杀死测定。
图38：RNAseq分析证明了与共刺激结构域的不同配对相关的独特的基因表达。将双顺反子CAR T细胞与等量的NALM6在AMV培养基中共孵育24小时。用磁珠去除NALM6细胞，并立即提取TRNA，并用于RNAseq分析。PCA图指示与共刺激结构域的不同配对相关的有区别的基因表达谱。
图39A和39B呈现了图像。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。图39A：在第0天用1E6个表达荧光素酶的NALM6白血病攻击NSG小鼠。在第3天，向小鼠IV注射5E6个表达CAR的T细胞。生物性发光强度代表肿瘤负荷。图39B：在第0天用1E5个表达荧光素酶的NALM6、NALM6-CD19neg和NALM6-CD22neg白血病细胞攻击NSG小鼠。在第3天，向小鼠IV注射3E6个表达CAR的T细胞。
图40：在第0天用2.5E5个表达荧光素酶的NALM6-CD19neg和NALM6-CD22neg白血病细胞攻击NSG小鼠。在第3天，向小鼠IV注射3E6个表达CAR的T细胞。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图41：向NSG小鼠IV注射表达荧光素酶的HMB28患者来源的所有异种移植体(CD19neg CD22+，1×106)。在第8天，向小鼠注射如图中所指示的3E6个表达CAR的T细胞。如通过增加的色差水平所显示的生物性发光强度代表肿瘤负荷。
图42是显示如实施例7中所述的位点密度的图。
发明详述
本发明的实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含：(a)可切割的结构域；(b)第一CAR，所述第一CAR包含第一抗原结合结构域、第一跨膜结构域和第一胞内T细胞信号传导结构域；以及(c)第二CAR，所述第二CAR包含第二抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二胞内T细胞信号传导结构域；其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述可切割的结构域连接，其中所述第一抗原结合结构域包含m971抗体的抗原结合结构域，其中当从所述构建体切割所述第一CAR时，所述第一抗原结合结构域具有针对CD22的抗原特异性。
CAR是人工构建的杂种蛋白质或多肽，其含有与T细胞信号传导结构域连接的一种或多种抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))。CAR的特征包括它们利用单克隆抗体的抗原结合性质，以非MHC限制性的方式将T细胞特异性和反应性重新定向针对选定的靶标的能力。非MHC限制性的抗原识别给予了表达CAR的T细胞不依赖于抗原加工而识别抗原，从而避开了肿瘤逃逸的主要机制的能力。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。如本文中所用的短语“抗原(的)特异性”和“引起抗原特异性的应答”意指CAR能够特异性地结合并免疫性地识别抗原，使得CAR与抗原的结合引起免疫应答。
CD22是属于免疫球蛋白(Ig)超家族的谱系限制性的B细胞抗原。CD22在60％-70％的B细胞淋巴瘤和白血病(例如，B-慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤)中表达，并且不存在于B细胞发育的早期阶段的细胞表面上或干细胞上(Vaickus等人,Crit.Rev.Oncol./Hematol.,11:267-297(1991)；Bang等人,Clin.Cancer Res.,11:1545-50(2005))。CD19(也被称为B淋巴细胞抗原CD19、B4和CVID3)是仅由B淋巴细胞和造血系统的滤泡树突状细胞表达的细胞表面分子。它是待表达的最早的B谱系限制性的抗原，并且存在于大多数前B细胞和大多数非T细胞急性淋巴细胞性白血病细胞和B细胞类型慢性淋巴细胞性白血病细胞上(Tedder和Isaacs,J.Immun.,143:712-717(1989))。
在本发明的实施方案中，本发明提供了多种CAR(例如，两种、三种、四种、五种或更多种)，每种与单一抗原结合，其中每种CAR通过可切割的结构域被分开。在本发明的实施方案中，切割可切割的结构域从CAR构建体释放每种CAR(例如，第一CAR和第二CAR)，使得每种切割的CAR单独地存在于T细胞表面上，每种具有针对其各自靶标的抗原特异性，并且每种可以引起抗原特异性的应答。在实施方案中，此类CAR构建体可以具有两种切割的/释放的CAR，例如，双顺反子CAR。不希望受到理论或机制的限制，可以在全序列的完全翻译后或在每种CAR和可切割的结构域的翻译后切割这些CAR的可切割的结构域，使得CAR在序列中的下一CAR的翻译之前被切割/释放。本文中此类CAR的实例包括V1、V5、V6、V7和V8。
在本发明的实施方案中，本发明提供了CAR，其中每种CAR能够同时结合两种抗原(例如，CD19和CD22)。这些CAR具有针对CD22和CD19的双特异性。如本文中关于CAR所用的短语“双特异性(dual specificity)”、“双特异性的(dual specific)”、“双特异性的(bispecific)”和“二价的”意指相同的CAR能够特异性地结合并免疫性地识别两种不同的抗原，使得CAR与两种抗原中的至少一种的结合引起免疫应答。本文中此类CAR的实例包括TanCAR 2-4和环CAR 1-5。在另一实施方案中，双特异性的CAR可以通过可切割的结构域连接。
本发明的实施方案提供了包含m971抗体(“m971”)的抗CD22抗原结合结构域的CAR。m971的抗原结合结构域特异性地结合CD22。就此而言，本发明的优选的实施方案提供了包含抗CD22抗原结合结构域的CAR，所述抗CD22抗原结合结构域包含m971的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)、由m971的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)组成，或基本上由m971的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)组成。HA22免疫毒素和m971抗体与不同的CD22表位结合。
抗CD22抗原结合结构域可以包含轻链可变区和/或重链可变区。在本发明的实施方案中，重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区。就此而言，抗CD22抗原结合结构域可以包含以下中的一种或多种：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1区；包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR2区；以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR3区。优选地，抗CD22抗原结合结构域的重链包含SEQ ID NO:4、6和8中的所有的氨基酸序列。
在本发明的实施方案中，抗CD22抗原结合结构域的轻链可变区可包含轻链CDR1区、轻链CDR2区和轻链CDR3区。就此而言，抗CD22抗原结合结构域可以包含以下中的一种或多种：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR1区；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR2区；以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3区。优选地，抗CD22抗原结合结构域的轻链包含SEQ ID NO:12、14和16中的所有的氨基酸序列。在特别优选的实施方案中，抗CD22抗原结合结构域包含SEQ ID NO:4、6、8、12、14和16中的所有的氨基酸序列。
抗CD22抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO:3-9的氨基酸序列、由SEQ ID NO:3-9的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:3-9的氨基酸序列组成。抗CD22抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:11-17的氨基酸序列、由SEQ ID NO:11-17的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:11-17的氨基酸序列组成。因此，在本发明的实施方案中，抗CD22抗原结合结构域包含：含有SEQ ID NO:3-9的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:11-17的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，抗CD22抗原结合结构域包含SEQ ID NO:3-9和11-17的氨基酸序列。
在本发明的实施方案中，当从构建体切割第二CAR时，第二抗原结合结构域具有针对CD19的抗原特异性。
在本发明的实施方案中，第二抗原结合结构域包含FMC63抗体的抗原结合结构域。在本发明的实施方案中，第二抗原结合结构域包含：含有如下文所述的FMC63的氨基酸序列的重链可变区和含有如下文所述的FMC63的氨基酸序列的轻链可变区。在本发明的实施方案中，第二抗原结合结构域包含如下文所述的FMC63的氨基酸序列。
本发明的另一实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含：(a)可切割的结构域；(b)第一CAR，所述第一CAR包含第一抗原结合结构域、第一跨膜结构域和第一胞内T细胞信号传导结构域；以及(c)第二CAR，所述第二CAR包含第二抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二胞内T细胞信号传导结构域；其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述可切割的结构域连接，其中所述第一抗原结合结构域包含FMC63抗体的抗原结合结构域，其中当从所述构建体切割所述第一CAR时，所述第一抗原结合结构域具有针对CD19的抗原特异性。在实施方案中，当从所述构建体切割所述第二CAR时，所述第二抗原结合结构域具有针对CD22的抗原特异性。
本发明的实施方案提供了CAR，其包含FMC63抗体(“FMC63”)的抗CD19抗原结合结构域。FMC63的抗原结合结构域特异性地结合CD19。就此而言，本发明的优选的实施方案提供了包含抗CD19抗原结合结构域的CAR，所述抗CD19抗原结合结构域包含FMC63的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)、由FMC63的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)组成，或基本上由FMC63的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)组成。
抗CD19抗原结合结构域可以包含轻链可变区和/或重链可变区。
在本发明的实施方案中，抗CD19抗原结合结构域的轻链可变区可以包含轻链CDR1区、轻链CDR2区和轻链CDR3区。就此而言，抗CD19抗原结合结构域可以包含以下中的一种或多种：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR1区；包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR2区；以及包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR3区。优选地，抗CD19抗原结合结构域的轻链包含SEQ ID NO:24、26和28中的所有的氨基酸序列。
在本发明的实施方案中，抗CD19抗原结合结构域的重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区。就此而言，抗CD19抗原结合结构域可以包含以下中的一种或多种：包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列的重链CDR1区；包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链CDR2区；以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链CDR3区。优选地，抗CD19抗原结合结构域的重链包含SEQ ID NO:32、34和36中的所有的氨基酸序列。在特别优选的实施方案中，抗CD19抗原结合结构域包含SEQ ID NO:24、26、28、32、34和36中的所有的氨基酸序列。
抗CD19抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO:31-37的氨基酸序列、由SEQ ID NO:31-37的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:31-37的氨基酸序列组成。抗CD19抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:23-29的氨基酸序列、由SEQ IDNO:23-29的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:23-29的氨基酸序列组成。因此，在本发明的实施方案中，抗CD19抗原结合结构域包含：含有SEQ ID NO:31-37的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:23-29的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，抗CD19抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23-29和31-37的氨基酸序列。
抗CD22抗原结合结构域和抗CD19抗原结合结构域可以分别包含抗CD22或抗CD19抗体的任何抗原结合部分。抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点(如Fab、F(ab’)2、dsFv、scFv、双体和三体)的任何部分。优选地，抗原结合部分是单链可变区片段(scFv)抗体片段。scFv是包括经合成的肽连接子与轻抗体链的V结构域连接的抗体重链的可变(V)结构域的截短的Fab片段，其可以使用常规重组DNA技术的技术产生。类似地，可以通过重组DNA技术制备二硫键稳定的可变区片段(dsFv)。
在本发明的实施方案中，抗CD22抗原结合结构域的轻链可变区和重链可变区可以通过连接子彼此连接。连接子可以包含任何合适的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，连接子为约1至约100个、约3至约20个、约5至约30个、约5至约18个或约3至约8个氨基酸长度的Gly/Ser连接子，并且由序列中的甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。因此，Gly/Ser连接子可以由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。优选地，Gly/Ser连接子包含GGGGS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列，并且在连接子内可以存在多个SEQ ID NOs:10。在本发明的另一实施方案中，连接子包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。任何连接子序列可以被用作抗原结合结构域和跨膜结构域之间的间隔子。
在本发明的实施方案中，抗CD19抗原结合结构域的轻链可变区和重链可变区可以通过连接子彼此连接。连接子可以为本文中关于本发明的其他方面所描述的任何连接子。在本发明的实施方案中，抗CD19抗原结合结构域的轻链可变区和重链可变区通过包含SEQID NO:10或30的氨基酸序列的连接子彼此连接。
在实施方案中，抗CD22抗原结合结构域包含轻链可变区、重链可变区和连接子。就此而言，包含轻链可变区、重链可变区和连接子的抗CD22抗原结合结构域的实施方案包含SEQ ID NO:3-17中的所有、由SEQ ID NO:3-17中的所有组成，或基本上由SEQ ID NO:3-17中的所有组成。
在实施方案中，抗CD19抗原结合结构域包含轻链可变区、重链可变区和连接子。就此而言，包含轻链可变区、重链可变区和连接子的抗CD19抗原结合结构域的实施方案包含SEQ ID NOs:23-37中的所有、由SEQ ID NO:23-37中的所有组成，或基本上由SEQ ID NO:23-37中的所有组成。
本发明的CAR构建体的第一CAR和第二CAR通过1、2、3、4个或更多个可切割的结构域彼此连接。可切割的结构域可以包含任何合适的可切割的结构域中的一个或多个，其包括被可切割的酶识别的结构域或自我切割的结构域。合适的结构域包括例如2A结构域(如T2A和/或P2A)，以及弗林蛋白酶切割序列。表1呈现了示例性的合适的可切割的结构域。
表1
*可以添加GSG残基以改善切割效率。
在本发明的实施方案中，CAR构建体含有多于一个的可切割的结构域，其中可切割的结构域都是相同的。在本发明的实施方案中，CAR构建体含有位于CAR构建体内的邻近的多于一个的可切割的结构域，其中至少一个可切割的结构域是不同的。
在实施方案中，抗原结合结构域包括前导序列。在本发明的实施方案中，前导序列可以位于CAR构建体内的抗CD19 CAR的氨基末端处。在本发明的另一实施方案中，前导序列可以位于CAR构建体内的抗CD22CAR的氨基末端处。前导序列可以包含任何合适的前导序列。在实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:62的氨基酸序列、由SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:62的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:62的氨基酸序列组成。在本发明的实施方案中，虽然前导序列可以促进细胞表面上释放的/切割的CAR的表达，但在表达CAR中存在的前导序列不是为了CAR发挥功能必需的。在本发明的实施方案中，在CAR在细胞表面上表达之后，可以从释放的CAR切除前导序列。因此，在本发明的实施方案中，释放的CAR缺少前导序列。在本发明的实施方案中，CAR构建体内的CAR缺少前导序列。
在本发明的实施方案中，CAR构建体包含铰链结构域。在本发明的实施方案中，铰链结构域是CD8铰链结构域。在优选的实施方案中，CD8铰链结构域是人的。优选地，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO:18、由SEQ ID NO:18组成，或基本上由SEQ ID NO:18组成。在本发明的实施方案中，铰链结构域是CD28铰链结构域。在优选的实施方案中，CD28铰链结构域是人的。优选地，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:40、由SEQ ID NO:40组成，或基本上由SEQ IDNO:40组成。
在本发明的实施方案中，CAR构建体包含跨膜(TM)结构域。在本发明的实施方案中，TM结构域是CD8TM结构域。在优选的实施方案中，CD8TM结构域是人的。优选地，CD8TM结构域包含SEQ ID NO:19、由SEQ ID NO:19组成，或基本上由SEQ ID NO:19组成。在本发明的实施方案中，TM结构域是CD28TM结构域。在优选的实施方案中，CD28TM结构域是人的。优选地，CD28TM结构域包含SEQ ID NO:41、由SEQ ID NO:41组成，或基本上由SEQ ID NO:41组成。
在本发明的实施方案中，CAR构建体包含胞内T细胞信号传导结构域。在本发明的实施方案中，胞内T细胞信号传导结构域包含4-1BB胞内T细胞信号传导序列。4-1BB(也被称为CD137)向T细胞传输有效的共刺激信号，促进T淋巴细胞的分化和增强T淋巴细胞的长期存活。优选地，4-1BB胞内T细胞信号传导序列是人的。在优选的实施方案中，4-1BB胞内T细胞信号传导序列包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列、由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。
在本发明的实施方案中，胞内T细胞信号传导结构域包含CD3ζ胞内T细胞信号传导序列。CD3ζ与TCR缔合以产生信号，并且含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。优选地，CD3ζ胞内T细胞信号传导序列是人的。在优选的实施方案中，CD3ζ胞内T细胞信号传导序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列、由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。
在本发明的实施方案中，胞内T细胞信号传导结构域包含CD28胞内T细胞信号传导序列。优选地，CD28胞内T细胞信号传导序列是人的。在优选的实施方案中，CD28胞内T细胞信号传导序列包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列、由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成。
第一CAR和第二CAR可以以任何合适的方向位于CAR构建体中。在本发明的实施方案中，CAR构建体从N末端至C末端包含：抗CD19CAR、一个或多个可切割的结构域，然后抗CD22 CAR。在本发明的另一实施方案中，CAR构建体从N末端至C末端包含：抗CD22 CAR、一个或多个可切割的结构域，然后抗CD19 CAR。
图1呈现了根据本发明的实施方案的示例性的CAR构建体的示意图。
本发明的另外的实施方案提供了全长CAR构建体，其包含表2-6中所示的氨基酸序列中的任一个、由表2-6中所示的氨基酸序列中的任一个组成，或基本上由表2-6中所示的氨基酸序列中的任一个组成。
表2–V1 CAR构建体
表3–V5 CAR构建体
表4–V6 CAR构建体
表5–V7 CAR构建体
表6–V8 CAR构建体
表7–TanCAR 1构建体
表8–TanCAR 2构建体
表9–TanCAR 3构建体
表10–TanCAR 4构建体
表11–环CAR 1构建体
表12–环CAR 2构建体
表13–环CAR 3构建体
表14–环CAR 4构建体
表15–环CAR 5构建体
表16–环CAR 6构建体
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为V1)具有以下序列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:48)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为V5)具有以下序列：MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRKRRGSGTPDPWGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:49)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为V6)具有以下序列：MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKSGAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRKRRGSGTPDPWGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:50)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为V7)具有以下序列：MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRKRRGSGTPDPWGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:51)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为V8)具有以下序列：MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKSGAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRKRRGSGTPDPWGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:52)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为TanCAR2)具有以下序列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:63)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为TanCAR3)具有以下序列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQID NO:64)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为TanCAR4)具有以下序列：MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:65)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为环CAR1)具有以下序列：ATMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:66)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为环CAR2)具有以下序列：ATMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGCGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGCGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:67)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为环CAR3)具有以下序列：MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:68)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为环CAR4)具有以下序列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKTSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:69)。
在实施方案中，CAR构建体(本文中被表示为环CAR5)具有以下序列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSCGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGCGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:70)。
本发明的CAR构建体可以提供许多优势。在本发明的实施方案中，例如，本发明的CAR构建体可以有利地减少或预防癌细胞逃逸，这是由于癌细胞表达的一种抗原(例如，CD19或CD22)的丢失。例如，据信本发明的CAR构建体可以减少或预防复发，这已在用具有仅针对CD19或CD22的抗原特异性的CAR治疗并且其癌症已丧失所述抗原的表达后的癌症患者中观察到。同样，本发明的CAR构建体也可能有利于治疗具有不均一的CD19或CD22表达水平的患者不均一。本发明的CAR构建体也可以增加可被成功治疗的患者群体。例如，可能对仅靶向CD19的CAR疗法应答失败的患者可能对靶向CD22的CAR疗法应答，并且可能对仅靶向CD22的CAR疗法应答失败的患者可能对靶向CD19的CAR疗法应答。另外，关于本发明的可切割的CAR，使用每种具有单一CAR的两种载体的T细胞的共转导仅提供了低百分比的表达两种CAR的细胞，以及大量的仅表达一种或另一种CAR的T细胞；使用本发明的可切割的CAR构建体的优势在于在成功整合构建体的每种T细胞中存在相等的或基本上相等的每种CAR的表达。此外，与仅靶向单一抗原的疗法相比，通过靶向CD19和CD22两者，本发明的可切割的和不可切割的CAR构建体可以有利地提供协同应答，并且还可以为在癌细胞上具有不均一CD19和CD22中的一种或两种的不均一表达的患者提供更广泛有效疗法。
因此，不受特定理论或机制的束缚，据信通过引起针对两种抗原(例如CD22和CD19)的抗原特异性应答，本发明的CAR构建体提供了任何以下中的一种或多种：靶向并破坏表达CD22的癌细胞，靶向并破坏表达CD19的癌细胞，减少或消除癌细胞，促进免疫细胞向肿瘤位点的浸润以及增强/扩展抗癌应答。
本发明的范围包括本文中所述的本发明的CAR构建体的功能部分。当关于CAR使用时，术语“功能部分”是指本发明CAR构建体的任何部分或片段，所述部分或片段保留了将其作为一部分的CAR构建体(亲本CAR构建体)的生物活性。功能部分涵盖例如，保留了以与亲本CAR构建体相似的程度、相同的程度或更高的程度识别靶细胞或检测、治疗或预防癌症的能力的CAR构建体的那些部分。关于亲本CAR构建体，功能部分可以包含例如约10％、约25％、约30％、约50％、约68％、约80％、约90％、约95％或更多的亲本CAR。
功能部分可以在部分的氨基末端或羧基末端或两个末端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸在亲本CAR构建体的氨基酸序列中未被发现。期望地，另外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能，例如，识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望地，与亲本CAR构建体的生物活性相比，另外的氨基酸增强了生物活性。
本发明的范围包括本文中所述的本发明的CAR构建体的功能变体。如本文中所用的术语“功能变体”是指与亲本CAR构建体具有基本上的或显著的序列同一性或相似性的CAR构建体、多肽或蛋白质，所述功能变体保留了将其作为变体的CAR的生物活性。功能变体涵盖例如本文中所述的CAR构建体(亲本CAR构建体)的那些变体，其保留了以与亲本CAR构建体相似的程度、相同的程度或更高的程度识别靶细胞的能力。关于亲本CAR构建体，功能变体可以与亲本CAR构建体具有例如至少约30％、约50％、约75％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多相同的氨基酸序列。
功能变体可以例如，包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。可替代地或另外地，功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本CAR构建体的氨基酸序列。在这种情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强功能变体的生物活性，使得与亲本CAR构建体相比，功能变体的生物活性增加。
本发明的CAR构建体的氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代在本领域中是已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸被交换为具有相同或相似的化学或物理性质的另一个氨基酸的氨基酸取代。例如，保守氨基酸取代可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸被取代为另一个酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸被取代为具有非极性侧链的另一个氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、碱性/带正电的极性氨基酸被取代为另一个碱性/带正电的极性氨基酸(例如Lys、His、Arg等)、具有极性侧链的不带电荷的氨基酸被取代为具有极性侧链的另一个不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)、具有β分枝侧链的氨基酸被取代为具有β分枝侧链的另一个氨基酸(例如，Ile、Thr和Val)、具有芳香族侧链的氨基酸被取代为具有芳香族侧链的另一个氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)等。
CAR构建体可以基本上由本文中所述的指定的氨基酸序列组成，使得其他组分(例如其他的氨基酸)不会实质上改变功能变体的生物活性。
本发明的实施方案的CAR构建体(包括功能部分和功能变体)可以为任何长度，即可以包含任何数量的氨基酸，只要CAR构建体(或其功能部分或功能变体)保留它们的生物活性，例如，特异性地结合抗原的能力、检测哺乳动物中的患病细胞的能力，或者治疗或预防哺乳动物的疾病的能力等。例如，CAR可以为约50至约5000个氨基酸长，如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸的长度。
本发明的实施方案的CAR构建体(包括本发明的功能部分和功能变体)可以包含合成的氨基酸，以代替一个或多个天然存在的氨基酸。此类合成的氨基酸是本领结构域已知的，并且包括例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨甲基-半胱氨酸、反式3-羟脯氨酸和反式4-羟脯氨酸、4-氨基苯基丙氨酸，4-硝基苯基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、4-羧基苯基丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯基丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基赖氨酸、N’,N’-二苄基赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
本发明的实施方案的CAR构建体(包括功能部分和功能变体)可以被糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫键环化，或者被转化成酸加成盐和/或任选地被二聚化或聚合或缀合。
可以通过本领结构域已知的方法获得本发明的实施方案的CAR构建体(包括其功能部分和功能变体)。可以通过任何合适的制备多肽或蛋白质的方法(包括从头合成)来制备CAR构建体。同样，可以使用标准的重组方法，使用本文中所述的核酸重组产生CAR构建体。参见，例如，Green等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual),第4版,冷泉港出版社，冷泉港(Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor),NY 2012。此外，可以从诸如植物、细菌、昆虫、哺乳动物(例如大鼠、人)等的来源分离和/或纯化本发明的一些CAR构建体的部分(包括其功能部分和功能变体)。分离和纯化的方法是本领域公知的。可替代地，可以由诸如Synpep(都柏林,CA)、Peptide TechnologiesCorp.(盖瑟斯堡,MD)和Multiple Peptide Systems(圣地亚哥,CA)的公司商业合成本文中所述的CAR构建体(包括其功能部分和功能变体)。在这方面，本发明的CAR构建体可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
本发明的另一实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含：(a)两个或更多个可切割的结构域；(b)第一CAR，所述第一CAR包含第一抗原结合结构域、第一跨膜结构域和第一胞内T细胞信号传导结构域；以及(c)第二CAR，所述第二CAR包含第二抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二胞内T细胞信号传导结构域；其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述两个或更多个可切割的结构域连接。在实施方案中，两个或更多个可切割的结构域紧邻，或在至少两个可切割的结构域之间具有至少一个连接子。在实施方案中，仅有两个可切割的结构域。
本发明的另一实施方案提供了制备嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体的方法，所述方法包括在(a)和(b)之间设计两个或更多个可切割的结构域：(a)第一CAR，所述第一CAR包含第一抗原结合结构域、第一跨膜结构域和第一胞内T细胞信号传导结构域；和(b)第二CAR，所述第二CAR包含第二抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二胞内T细胞信号传导结构域；其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述两个或更多个可切割的结构域连接；以及将包含从N末端至C末端的所述第一CAR、所述两个或更多个可切割的结构域和所述第二CAR的序列克隆至质粒内。在实施方案中，两个或更多个可切割的结构域紧邻，或在至少两个可切割的结构域在之间具有至少一个连接子。在实施方案中，仅有两个可切割的结构域。
本发明的实施方案还提供了包含编码本文中所述的任何CAR构建体(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列的核酸。本发明的核酸可以包含编码本文中所述的任何前导序列、抗原结合结构域、跨膜结构域、连接子和/或胞内T细胞信号传导结构域的核苷酸序列。
在实施方案中，核酸包含编码本文中所述的任何CAR构建体的核苷酸序列。在本发明的实施方案中，核酸可以包含以下序列的核苷酸序列、由以下序列的核苷酸序列组成，或基本上由以下序列的核苷酸序列组成：SEQ ID NO:53(抗CD19/抗CD22V1 CAR)、SEQ ID NO:54(抗CD19/抗CD22V5 CAR)、SEQ ID NO:55(抗CD19/抗CD22V6 CAR)、SEQ ID NO:56(抗CD19/抗CD22V7 CAR)、SEQ ID NO:57(抗CD19/抗CD22V8CAR)、SEQ ID NO:71(TanCAR2)、SEQID NO:72(TanCAR3)、SEQ ID NO:73(TanCAR4)、SEQ ID NO:74(环CAR1)、SEQ ID NO:75(环CAR2)、SEQ ID NO:76(环CAR3)、SEQ ID NO:77(环CAR4)或SEQ ID NO:78(环CAR5)。
如本文中所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的、合成的或从天然来源获得的(例如，分离的和/或纯化的)，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间连接(如磷酰胺连接或硫代磷酸酯连接)，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒置和/或取代。然而，如本文中所论述的，在一些情况下，核酸包含一个或多个插入、缺失、倒置和/或取代可能是合适的。在一些实施方案中，核酸可以编码不影响CAR构建体的功能并且在宿主细胞表达核酸后可以被翻译或可以不被翻译的另外的氨基酸序列。
本发明的实施方案的核酸可以是重组的。如本文中所用的，术语“重组”是指：(i)通过将天然的或合成的核酸部分与可以在活细胞中复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或(ii)从上述(i)中所述的那些复制而产生的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
重组核酸可以是具有非天然存在的序列，或者具有通过序列的两个其他的单独的部分人工组合制成的序列的核酸。该人工组合通常通过化学合成或更普遍地通过核酸的分离的部分的人工操纵，例如通过遗传工程技术(如Green等人(同上)中描述的那些)来实现。可以使用本领结构域已知的方案，基于化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。参见例如，Green等人(同上)。例如，可以使用天然存在的核苷酸或设计用于增加分子的生物稳定性或用于增加在杂交后形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成核酸。可用于产生核酸的修饰的核苷酸的实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(β-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁氧苷(Wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。可替代地，可以从诸如Macromolecular Resources(柯林斯堡,CO)和Synthegen(休斯顿,TX)的公司购买本发明的核酸中的一种或多种。
核酸可以包含任何分离的或纯化的核苷酸序列，其编码任何CAR构建体或其功能部分或功能变体。可替代地，核苷酸序列可以包含简并为任何序列或简并序列的组合的核苷酸序列。
本发明的实施方案还提供了分离的或纯化的核酸，其包含与本文中所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者在严格条件下与本文中所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列可以在高严格条件下杂交。通过“高严格条件”意指核苷酸序列以可检测地比非特异性的杂交更强的量特异性地与靶标序列(任何本文中所述的核酸的核苷酸序列)杂交。高严格条件包括将区分具有精确互补的序列的多核苷酸或仅含有少量分散的错配的多核苷酸与恰巧具有匹配核苷酸序列的少量较小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列。此类互补的小区域比14-17个或更多个碱基的全长互补序列更易于熔化，并且高严格杂交使得它们易于区分。相对高的严格条件将包括例如，低盐和/或高温条件，如在约50-70℃的温度下提供的约0.02-0.1M NaCl或等价物。此类高严格条件容许很少的核苷酸序列与模板或靶标链之间的错配(如果有的话)，且特别适合检测任何本发明的CAR构建体的表达。通常应理解，通过添加增加量的甲酰胺可以使条件更加严格。
本发明还提供了核酸，其包含与本文中所述的任何核酸至少约70％或更多，例如，约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的核苷酸序列。
在实施方案中，可以将本发明的核酸掺入至重组表达载体内。就此而言，本发明的实施方案提供了包含任何本发明的核酸的重组表达受体。为了本文中的目的，术语“重组表达载体”意指遗传改良的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下使载体与细胞接触时，所述构建体允许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。本发明的载体总体上并非是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达受体可以包含任何类型的核苷酸，所述核苷酸包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的、合成的或部分从天然来源获得的，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间连接，或两种类型的连接。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。示例性的载体骨架是SEQ ID NO:58的慢病毒载体(lenti-vector)骨架。
在实施方案中，本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以被用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括被设计用于增殖和扩增，或用于表达或二者的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自：pUC系列(Fermentas LifeSciences,格伦伯尼,MD)、pBluescript系列(Stratagene,拉由拉市,CA)、pET系列(Novagen,麦迪逊,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,乌普萨拉,瑞典)和pEX系列(Clontech,帕洛阿尔托,CA)。也可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达受体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达受体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如，逆转录病毒载体或慢病毒载体。
在实施方案中，可以使用例如，Green等人(同上)中描述的标准的重组DNA技术制备本发明的重组表达受体。环状的或线性的表达受体的构建体可被制备为含有原核或真核宿主细胞中的复制系统功能。复制系统可以来源于例如，ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
视情况而定，并且考虑载体是否为基于DNA或基于RNA的，重组表达载体可以包含特异性针对载体所引入的宿主细胞(例如，细菌、真菌、植物或动物)类型的调控序列，如转录和翻译的起始和终止密码子。重组表达载体还可以包含限制位点以促进克隆。
重组表达载体可以包含一个或多个标志基因，其允许选择转化的或转染的宿主细胞。标志基因包括杀生物剂抗性(例如，对抗生素、重金属等的抗性)、营养缺陷性宿主中的互补性，以提供原养型等。本发明的表达载体的合适的标志基因包括例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可以包含天然的或非天然的启动子，其与编码CAR构建体(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列可操作地连接，或者与编码CAR构建体的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列可操作地连接。选择例如强的、弱的、可诱导的、组织特异性的和发育特异性的启动子，在技术人员的普通技能范围之内。类似地，将核苷酸序列与启动子组合也在技术人员的技能范围之内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子，或在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。
本发明的重组表达受体可被设计用于瞬时表达、稳定表达或二者。同样，重组表达受体可被制备为用于组成型表达或用于可诱导型表达。
此外，重组表达受体可被制备为包括自杀基因。如本文中所用的，术语“自杀基因”是指造成表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予其中基因被表达的细胞对试剂(例如药物)的敏感性并当细胞与试剂接触或暴露至试剂时造成细胞死亡的基因。自杀基因是本领域已知的，并且包括例如单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(daminase)、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
本发明的范围包括缀合物(例如生物缀合物)，其包含任何本发明的CAR构建体(包括其任何功能部分或变体)的生物缀合物、核酸、重组表达载体、宿主细胞或宿主细胞群。缀合物以及合成缀合物的方法通常是本领域已知的。
本发明的实施方案还提供了包含本文中所述的任何重组表达载体的宿主细胞。如本文中所用的，术语“宿主细胞”是指可以含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞(例如，植物、动物、真菌或藻类)或者可以是原核细胞(例如，细菌或原生动物)。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞(即直接从例如人的生物体分离的)。宿主细胞可以是粘附细胞或悬浮细胞(即悬浮生长的细胞)。合适的宿主细胞是本领域已知的，并且包括例如，DH5α大肠杆菌(E.coli)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以是原核细胞，例如，DH5α细胞。为了产生重组CAR构建体的目的，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。虽然宿主细胞可以为任何细胞类型、可以源于任何类型的组织，并且可以为任何发育阶段，但宿主细胞可以为外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。宿主细胞可以是T细胞或自然杀伤细胞(NK细胞)。
为了本文中的目的，T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如，原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如，Jurkat、SupT1等，或者获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，则T细胞可以获自众多来源，包括但不限于：血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他的组织或流体。还可以富集或纯化T细胞。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是从人分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以为任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如，Th1和Th2细胞)、CD8+ T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞等。T细胞可以是CD8+ T细胞或CD4+ T细胞。
本发明的实施方案还提供了包含本文中所述的至少一种宿主细胞的细胞群。细胞群可以是异源群体，其除了包含至少一种其他的细胞(例如，不包含任何重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞))，或者除T细胞外的细胞(例如，B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等)，还包含含有所述的任何重组表达载体的宿主细胞。可替代地，细胞群可以是基本上同源的群体，其中所述群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如，基本上由其组成)。所述群体也可以是克隆细胞群，其中所述群体中的所有细胞均是包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，使得所述群体中的所有细胞均包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是包含含有如本文中所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
可以分离和/或纯化本发明的CAR构建体(包括其功能部分和变体)、核酸、重组表达载体和宿主细胞(包括其群体)(其所有在下文中统称为“本发明的CAR构建体物质”)。如本文中所用的，术语“分离的”意指已经从其天然环境中移出。术语“纯化的”或“分离的”不需要绝对的纯化或分离；相反，其旨在作为相对的术语。因此，例如，纯化的(或分离的)宿主细胞制备物是其中宿主细胞比体内它们天然环境中的细胞更纯的制备物。可以例如通过标准纯化技术产生此类宿主细胞。在一些实施方案中，纯化了宿主细胞的制备物，使得宿主细胞代表制备物的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以为至少约50％，可以大于约60％、约70％或约80％，或者可以为约100％。
可以将本发明的CAR构建体物质配制成组合物(如药物组合物)。就此而言，本发明的实施方案提供了药物组合物，其包含本文中所述的任何本发明的CAR构建体物质和药学上可接受的载体。本发明的含有任何本发明的CAR构建体物质的药物组合物可以包含多于一种本发明的CAR构建体物质，例如，CAR构建体和核酸，或两种或更多种不同的CAR构建体。可替代地，药物组合物可以包含本发明的CAR构建体物质与其他的药学活性试剂或药物的组合，所述其他的药学活性试剂或药物如化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等。在优选的实施方案中，药物组合物包含本发明的宿主细胞或其群体。
关于药物组合物，药学上可接受的载体可以是任何常规使用的那些，并且仅受诸如溶解性和缺少与活性试剂的反应性的化学物理因素以及施用途径的限制。本文中所述的药学上可接受的载体(例如，媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂)是本领域技术人员熟知的，并且容易为公众获取。优选地，药学上可接受的载体是在使用条件下不具有有害副作用或毒性的药学上可接受的载体。
载体的选择将部分由特定的本发明的CAR构建体物质以及用于施用本发明的CAR构建体物质的特定方法决定。因此，有多种合适的本发明的药物组合物的制剂。用于制备可施用的(例如，肠道外可施用的)组合物的方法是本领域技术人员已知的或对其显而易见的，并且在例如Remington:药学的科学和实践(The Science and Practice ofPharmacy)，医药出版社(Pharmaceutical Press)；第22版(2012)中有更详细的描述。
可以以任何合适的方式施用本发明的CAR构建体物质。优选地，通过注射(例如，皮下、静脉内、瘤内、动脉内、肌内、皮内、腹腔内或鞘内)施用本发明的CAR构建体物质。优选地，静脉内施用本发明的CAR构建体物质。用于注射本发明的CAR构建体物质的合适的药学上可接受的载体可以包括任何等渗载体，诸如例如，生理盐水(约0.90％w/v的NaCl的水溶液、约300mOsm/L NaCl的水溶液，或每升水约9.0g NaCl)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,芝加哥,IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter,迪尔菲尔德,IL)、约5％葡萄糖的水溶液，或林格氏乳酸盐。在实施方案中，药学上可接受的载体补充有人血清白蛋白。
“有效量”或“有效治疗的量”是指足以预防或治疗个体的癌症的剂量。对于治疗或预防用途有效的量将取决于例如，患者的正在治疗的疾病或病症的阶段和严重程度、年龄、体重和总体健康状况，以及处方医生的判断。剂量的大小还取决于所选的活性成分、施用的方法、施用的时间和频率、可能伴随特定活性成分施用的任何不良副作用的存在、性质和程度，以及期望的生理效应。本领域技术人员将理解，不同的疾病或病症可能需要涉及多次施用的延长的治疗，可能在每轮或不同轮的施用中使用本发明的CAR构建体物质。通过实例的方式并且不旨在限制本发明，当本发明的CAR构建体物质是宿主细胞时，宿主细胞的示例性剂量可以是最少一百万个细胞(1×106个细胞/剂量)。
为了本发明的目的，施用的本发明的CAR构建体物质的量或剂量应当足以经合理的时间范围影响对象或动物的治疗或预防应答。例如，本发明的CAR构建体物质的剂量应足以在从施用时间起约2小时或更长的时期(例如，约12至约24小时或更多小时)内与抗原结合或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间段可能甚至更长。剂量将由特定的本发明的CAR构建体物质的功效和动物(例如，人)的状况，以及待治疗的动物(例如，人)的体重来决定。
为了本发明的目的，可以使用测定来确定待施用给哺乳动物的起始剂量，所述测定包括例如，比较在向每个施用了不同的剂量的T细胞的一系列哺乳动物中的哺乳动物施用给定剂量的此类T细胞后，靶细胞溶解和/或表达所释放的本发明的CAR构建体的CAR的T细胞分泌IFN-γ的程度。可以通过本领域已知的方法来测定在施用某一剂量后靶细胞溶解和/或分泌IFN-γ的程度。
当将本发明的CAR构建体物质与一种或多种另外的治疗剂一起施用时，可以向哺乳动物施用一种或多种另外的治疗剂。通过“共施用”意指在时间上足够接近地施用一种或多种另外的治疗剂和本发明的CAR构建体物质，使得本发明的CAR构建体物质可以增强一种或多种另外的治疗剂的效应，或者反之亦然。就此而言，可以首先施用本发明的CAR构建体物质，其次施用一种或多种另外的治疗剂，或者反之亦然。可替代地，可以同时施用本发明的CAR构建体物质和一种或多种另外的治疗剂。可以与CAR构建体物质共施用的示例性的治疗剂是IL-2。据信，IL-2增强了本发明的CAR构建体物质的治疗效应。
预期本发明的CAR构建体物质可以被用于治疗或预防哺乳动物的疾病的方法中。不受特定理论或机制的束缚，本发明的CAR构建体具有生物活性(例如，释放/切割识别抗原(例如CD19和CD22中的一种或两种)的CAR的能力)，使得释放的CAR当被细胞表达时，能够介导针对表达抗原(例如CD19和CD22中的一种或两种)的细胞的免疫应答。就此而言，本发明的实施方案提供了治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物的癌症的量向哺乳动物施用任何本发明CAR构建体、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群和/或药物组合物。
本发明的实施方案还包括在施用本发明的CAR构建体物质之前对哺乳动物进行淋巴细胞耗尽(lymphodepleting)。淋巴细胞耗尽的实例包括但可能不限于：非清髓性淋巴细胞耗尽性化学疗法(nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy)、清髓性淋巴细胞耗尽性学疗法、全身辐照等。
为了本发明的方法的目的，其中施用了宿主细胞或细胞群，细胞可以是哺乳动物同种异体的自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。
本文中所指的哺乳动物可以是任何哺乳动物。如本文中所用的，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(Rodentia)的哺乳动物(如小鼠和仓鼠)以及兔形目(Logomorpha)的哺乳动物(如兔)。哺乳动物可以来自食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可以来自偶蹄目(Artiodactyla)(包括牛科动物(奶牛)和猪(Swines)(猪))，或者奇蹄目(Perssodactyla)(包括马(Equines)(马))。哺乳动物可以是灵长目(Primates)、卷尾猴科(Ceboids)或猴科(Simoids)(猴)，或者类人猿目(Anthropoids)(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。
关于本发明的治疗方法，癌症可以是任何癌症，包括任何急性淋巴细胞性癌症、急性髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌症(例如，膀胱癌)、骨癌、脑癌(例如，成神经管细胞瘤)、乳腺癌，肛门、肛管或肛门直肠的癌症，眼癌、肝内胆管癌、关节癌，颈、胆囊或胸膜的癌症，鼻、鼻腔或中耳的癌症，口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性癌症、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类类癌肿瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌(kidney cancer)、喉癌、白血病、液体瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B-慢性淋巴细胞性白血病、B-前体急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)、前B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(BCP-ALL)、B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌，腹膜、网膜和肠系膜的癌症、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌(renal cancer)、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和输尿管癌。优选地，癌症是血液恶性肿瘤(例如，白血病或淋巴瘤，包括但不限于：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、CLL、急性淋巴细胞性癌、急性髓性白血病、B-慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)(也被称为“急性成淋巴细胞性白血病”)、B-ALL、BCP-ALL、B细胞淋巴癌和伯基特淋巴瘤)。优选地，癌症的特征在于CD22和CD19中的一种或两种的表达，并且更优选地，为特征在于CD22和CD19中的一种或两种的表达的血液恶性肿瘤。
如本文中所用的，术语“治疗”和“预防”以及由其衍生的词不一定意味着100％的或完全的治疗或预防。而是，存在本领域普通技术人员将其识别为具有潜在的益处或治疗效应的不同程度的治疗或预防。在这方面，本发明的方法可以提供任何量的任何水平的哺乳动物的癌症的治疗或预防。此外，由本发明的方法提供的治疗或预防可以包括对被治疗或预防的疾病(例如癌症)的一种或多种病况或症状的治疗或预防。同样，为了本文中的目的，“预防”可以涵盖延迟疾病或其症状或病况的发作。
本发明的另一实施方案提供了本发明的CAR构建体、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或药物组合物用于治疗或预防哺乳动物的癌症的用途。
本发明的另一实施方案提供了检测哺乳动物中癌症存在的方法，其包括：(a)使包含来自哺乳动物的一个或多个细胞的样品与本发明的CAR构建体、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或药物组合物接触，从而形成复合物，(b)以及检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示哺乳动物中存在癌症。
可以通过任何合适的方法(例如活组织检查或尸体剖检)获得样品。活组织检查是从个体中去除组织和/或细胞。此类去除可以是从个体收集组织和/或细胞，以便对去除的组织和/或细胞进行实验。该实验可以包括确定该个体是否患有和/或正患有某种病况或疾病状态的实验。所述病况或疾病可以是。例如癌症。
关于本发明的检测哺乳动物中癌症存在的方法的实施方案，包含哺乳动物的细胞的样品可以是包含全细胞、其溶解物或全细胞溶解物的级分(例如，核或细胞质级分、完整蛋白质级分或核酸级分)的样品。如果样品包含全细胞，则细胞可以是哺乳动物的任何细胞，例如，任何器官或组织的细胞(包括血液细胞或内皮细胞)。
为了本发明的检测方法的目的，关于哺乳动物的接触可以发生于体外或体内。优选地，接触为体外的。
同样，复合物的检测可以通过本领结构域已知的任何数量的方法发生。例如，可以用可检测的标记(如例如放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒))来标记本文中所述的本发明的CAR构建体、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群。
测试CAR识别靶细胞的能力及其抗原特异性的方法是本领域已知的。例如，Clay等人,J.Immunol.,163:507-513(1999)教导了测量释放的细胞因子(例如干扰素γ、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子a(TNF-α)或白介素2(IL-2))的方法。另外，如Zhao等人,J.Immunol.,174:4415-4423(2005)中所述的，可以通过测量细胞的细胞毒性来评估CAR功能。
以下包括本发明的某些方面。
1.嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含：
(a)可切割的结构域；
(b)第一CAR，所述第一CAR包含：
第一抗原结合结构域，
第一跨膜结构域，和
第一胞内T细胞信号传导结构域；以及
(c)第二CAR，所述第二CAR包含：
第二抗原结合结构域，
第二跨膜结构域，和
第二胞内T细胞信号传导结构域；
其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述可切割的结构域连接，
其中所述第一抗原结合结构域包含m971抗体的抗原结合结构域，
其中当从所述构建体切割所述第一CAR时，所述第一抗原结合结构域具有针对CD22的抗原特异性。
2.如第1方面所述的CAR构建体，其中切割所述可切割的结构域从CAR构建体释放所述第一CAR和所述第二CAR。
3.如第1方面或第2方面所述的CAR构建体，其中所述第一抗原结合结构域包含：含有SEQ ID NO:3-9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:11-17的氨基酸序列的轻链可变区。
4.如第1-3方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:3-9和11-17的氨基酸序列。
5.如第1-4方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中当从所述构建体切割所述第二CAR时，所述第二抗原结合结构域具有针对CD19的抗原特异性。
6.如第1-5方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述第二抗原结合结构域包含FMC63抗体的抗原结合结构域。
7.如第1-6方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述第二抗原结合结构域包含：含有SEQ ID NO:31-37的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:23-29的氨基酸序列的轻链可变区。
8.如第1-7方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述第二抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23-29和31-37的氨基酸序列。
9.嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含：
(a)可切割的结构域；
(b)第一CAR，所述第一CAR包含：
第一抗原结合结构域，
第一跨膜结构域，和
第一胞内T细胞信号传导结构域；以及
(c)第二CAR，所述第二CAR包含：
第二抗原结合结构域，
第二跨膜结构域，和
第二胞内T细胞信号传导结构域；
其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述可切割的结构域连接，
其中所述第一抗原结合结构域包含FMC63抗体的抗原结合结构域，
其中当从所述构建体切割所述第一CAR时，所述第一抗原结合结构域具有针对CD19的抗原特异性。
10.如第9方面所述的CAR构建体，其中切割所述可切割的结构域从所述CAR构建体释放所述第一CAR和所述第二CARs。
11.如第9方面或第10方面所述的CAR构建体，其中所述第一抗原结合结构域包含：含有SEQ ID NO:31-37的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:23-29的氨基酸序列的轻链可变区。
12.如第9-11方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23-29和31-37的氨基酸序列。
13.如第9-12方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中当从所述构建体切割所述第二CAR时，所述第二抗原结合结构域具有针对CD22的抗原特异性。
14.如第1-13方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述第一或跨膜结构域或所述第二跨膜结构域包含CD8跨膜结构域和CD8铰链结构域。
15.如第14方面所述的CAR构建体，其中所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且所述CD8铰链结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
16.如第1-15方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述第一胞内T细胞信号传导结构域或所述第二胞内T细胞信号传导结构域包含4-1BB胞内T细胞信号传导序列。
17.如第16方面所述的CAR构建体，其中所述4-1BB胞内T细胞信号传导序列包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
18.如第1-17方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述第一胞内T细胞信号传导结构域或所述第二胞内T细胞信号传导结构域包含CD3ζ胞内T细胞信号传导序列。
19.如第18方面所述的CAR构建体，其中所述CD3ζ胞内T细胞信号传导序列包含SEQID NO:21的氨基酸序列。
20.如第1-19方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述可切割的结构域为2A或弗林蛋白酶。
21.如第1-20方面中的任一方面所述的CAR构建体，其中所述CAR构建体仅包含两个CAR，其分别为所述第一CAR和所述第二CAR。
22.嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含SEQ ID NO:48、49、50、51或52的氨基酸序列。
23.嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含与SEQ ID NO:63-70中的任一项具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性(例如，100％)的氨基酸序列。
24.嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其包含：
(a)两个或更多个可切割的结构域；
(b)第一CAR，所述第一CAR包含：
第一抗原结合结构域，
第一跨膜结构域，和
第一胞内T细胞信号传导结构域；以及
(c)第二CAR，所述第二CAR包含：
第二抗原结合结构域，
第二跨膜结构域，和
第二胞内T细胞信号传导结构域；
其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述两个或更多个可切割的结构域连接。
25.如第24方面所述的CAR构建体，其中所述两个或更多个可切割的结构域紧邻，或在至少两个可切割的结构域之间具有至少一个连接子。
26.如第25方面或第24方面所述的CAR构建体，其中仅有两个可切割的结构域。
27.核酸，其包含编码第1-26方面中的任一方面所述的CAR构建体的核苷酸序列。
28.如第27方面所述的核酸，其包含SEQ ID NO:53-57或71-78中的任一项的核苷酸序列。
29.重组表达载体，其包含第27方面或第28方面所述的核酸。
30.分离的宿主细胞，其包含第29方面所述的重组表达载体。
31.细胞群，其包含至少一种第30方面所述的宿主细胞。
32.药物组合物，其包含第1-26方面中的任一方面所述的CAR构建体、第27方面或28方面所述的核酸、第29方面所述的重组表达载体、第30方面所述的宿主细胞或第31方面所述的细胞群，以及药学上可接受的载体。
33.检测哺乳动物中癌症存在的方法，其包括：
(a)使包含来自哺乳动物的一个或多个细胞的样品与第1-26方面中的任一方面所述的CAR构建体、第27方面或第28方面所述的核酸、第29方面所述的重组表达载体、第30方面所述的宿主细胞、第31方面所述的细胞群或第32方面所述的药物组合物接触，从而形成复合物，以及
(b)检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示哺乳动物中存在癌症。
34.如第1-26方面中的任一方面所述的CAR构建体、第27方面或第28方面所述的核酸、第29方面所述的重组表达载体、第30方面所述的宿主细胞、第31方面所述的细胞群或第32方面所述的药物组合物，其用于治疗或预防哺乳动物的癌症的用途。
35.如第34方面所述用途的CAR构建体，其中所述癌症为血液恶性肿瘤。
36.制备嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体的方法，所述方法包括在(a)和(b)之间设计两个或更多个可切割的结构域：
(a)第一CAR，所述第一CAR包含：
第一抗原结合结构域，
第一跨膜结构域，和
第一胞内T细胞信号传导结构域；和
(b)第二CAR，所述第二CAR包含：
第二抗原结合结构域，
第二跨膜结构域，和
第二胞内T细胞信号传导结构域；
其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述两个或更多个可切割的结构域连接；
以及
将包含从N末端至C末端的所述第一CAR、所述两个或更多个可切割的结构域和所述第二CAR的序列克隆至质粒内。
37.如第36方面所述的方法，其中所述两个或更多个可切割的结构域紧邻或在至少两个可切割的结构域之间具有至少一个连接子。
38.如第36或第37方面所述的方法，其中仅有两个可切割的结构域。
以下实施例进一步阐示了本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例1
该实施例证明了根据本发明的实施方案的CAR构建体、编码CAR构建体的慢病毒载体和表达CAR的T细胞的产生，以及用于比较的其他CAR的产生。
由GENEWIZ(South Plainfield,NJ,USA)合成CAR构建体，然后亚克隆至慢病毒质粒骨架的NhE1位点和HincII位点之间。
通过瞬时转染293T细胞系而产生编码CAR构建体的慢病毒载体。简言之，将293T细胞接种至聚D赖氨酸包被的15cm板(BD Biosciences,圣何塞,CA,USA)中。第二天，使用lipofectamine 3000(Life Technologies,卡尔斯巴德,CA,USA)将编码CAR构建体的质粒连同包装和包膜载体(pMDLg/pRRE、pMD-2G和pRSV-Rev)一起转染293T细胞。在转染后48-72小时收集慢病毒上清液，在3000RPM下离心10分钟以去除细胞碎片，然后储存在-80℃。用于含有40IU/mL重组IL-2(rhIL-2；Roche,巴塞尔,瑞士)的AIM-V培养基中的1:1比例的CD3/CD28微珠(Life Technologies)，将来自正常供体的人PBMC活化24小时。以每3mL的慢病毒上清液2百万个细胞，加上具有10μg/mL硫酸鱼精蛋白和100IU/mL IL-2的1mL的新鲜AIM-V培养基，重悬浮活化的T细胞，并在6孔板中培养。将板在32℃下以1000×g离心2小时，然后在37℃下孵育过夜。在第二天进行第二次转导。在第三天，去除CD3/CD28珠，并将细胞以300,000个细胞/mL培养在含有100IU/mL IL-2的AIM-V中，每2-3天添加新鲜的含有IL2的培养基，直到在第8天或第9天收获。
通过瞬时转染293T慢病毒包装细胞系而产生用于单一抗CD19 CAR、单一抗CD22CAR和双特异性的环CAR6载体。
抗CD19 CAR的序列如下：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:59)。
抗CD22 CAR的序列如下：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKTSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:60)。
环CAR6在第WO 2016/149578号国际专利公开中有描述，并且具有以下序列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:61)。
实施例2
本实施例证明了与其他的CAR相比，根据本发明的实施方案的从CAR构建体切割的CAR在人T细胞上的表面表达。
抗CD19 CAR和抗CD22 CAR在V1转导的T细胞上的表面表达为约15％，而来自仅编码单一抗CD19 CAR的载体的抗CD19 CAR的表达为61％，并且来自仅编码单一抗CD22 CAR的载体的抗CD22 CAR的表达为56％(图2A-2C)。
用CD3/CD28微珠将来自健康供体的人PBMC活化24小时。然后单独用载体转导或用单一抗CD19 CAR和单一抗CD22 CAR载体两者一起共转导活化的T细胞。在第8天分析抗CD19CAR和抗CD22 CAR的表面表达。与双特异性的环CAR6相比，共转导的T细胞具有低得多的抗CD19和抗CD22 CAR两者的表达。共转导的T细胞上抗CD19和抗CD22 CAR的表达并非是以相等的摩尔比的。相反，在抗CD19和抗CD22 CAR的表达中，环CAR6显示几乎1:1的比例，其展现为对角线图。参见图3。
通过瞬时转染293T慢病毒包装细胞系而产生用于双特异性的环CAR6和V1和V5CAR的载体。将来自健康供体的人PBMC用CD3/CD28微珠活化24小时。然后用载体转导活化的T细胞。在第7天使用流式细胞术分析抗CD19 CAR和抗CD22 CAR的表面表达。用编码V5 CAR的载体转导的T细胞具有比用编码V1 CAR的载体转导的T细胞高的如通过切割CAR提供的分离的抗CD19 CAR和分离的抗CD22 CAR两者的细胞表面表达(图4)。
实施例3
本实施例基于细胞因子的产生证明了与其他的CAR相比，根据本发明的实施方案的CAR构建体的体外活性。
将CAR转导的T细胞(1E5个)用1×PBS洗涤3次，然后与在200ml RPMI培养基中的等量的靶细胞在96孔板中于37℃恒温箱中共孵育15至20小时。靶细胞是表达CD19或CD22或CD19和CD22两者的K562。K562细胞被用作阴性对照。用ELISA试剂盒(R&D Systems,明尼阿波里斯市,MN,USA)测量培养物上清液中IL2和IFNγ的细胞因子水平。所有测试均设定为一式三份。V1CAR T细胞当与CD22表达靶细胞共培养时制造了大量的IL2和IFNγ，但当与CD19表达靶细胞共培养时仅制造了低水平的IL2和IFNγ(图5A和5B)。
用CD19或CD22或二者人工转导CML细胞系K562，以表达靶标抗原。K562细胞被用作阴性对照。将1E5个CAR T细胞洗涤3次，然后在RPMI培养基中与1E5个靶细胞于37℃下共孵育。在14小时后，收获培养物上清液，并用ELISA试剂盒测量产生的细胞因子。当与双特异性的环CAR6和抗CD19和抗CD22单一CAR相比时，当与K562上表达的靶标抗原共孵育时，V5制造最高水平的IL2和IFNγ。当与双特异性的环CAR6和抗CD19和抗CD22单一CAR相比时，当与K562上表达的靶标抗原共孵育时V1制造大量的IL2和IFNγ。参见图6A和6B。
B细胞白血病细胞系NALM6表达CD19和CD22表面抗原。利用CRISPR/Cas9技术敲除CD19或CD22，以清除这些靶标抗原的表达。NALM6细胞被用作阳性对照。将1E5个CAR T细胞洗涤3次，然后在RPMI培养基中与1E5个靶细胞于37℃下共孵育。在14小时后，收获培养物上清液，并用ELISA试剂盒测量产生的细胞因子。当与双特异性的环CAR6和抗CD19和抗CD22单一CAR相比时，当与NALM6上表达的CD19共孵育时，V5制造最高水平的IL2和IFNγ。当与抗CD22单一CAR相比时，当与NALM6上表达的CD22共孵育时，V5制造较低量的IL2和IFNγ。当与V5 CAR相比时，当与NALM6上表达的靶标抗原共孵育时，V1制造小量的IL2和IFNγ。V1制造与双特异性的环CAR6和抗CD19和抗CD22单一CAR相当量的IL2和IFNγ。参见图7A和7B。
将CAR T细胞与NALM6肿瘤细胞共孵育18小时，并通过ELISA测量培养物上清液中的IL2产生水平。如图8中所见，Bicis-V5和Bicis-V6可以具有协同效应。
实施例4
本实施例证明了与其他的CAR相比，使用根据本发明的实施方案的CAR构建体治疗了复发性白血病模型。
将生物发光成像用于追踪体内白血病进展。在第0天，将五十万个CD19KO NALM6细胞与等量的CD22KO NALM6细胞混合，并注射至NSG小鼠内。3天后，用3百万个CAR T细胞或模拟的T细胞治疗这些小鼠。
使用用编码V1 CAR的载体转导的T细胞似乎完全根除了白血病，而使用用编码单一抗CD19 CAR或单一抗CD22 CAR的载体转导的T细胞未能如此(图9)。
在第14天将小鼠安乐死。用抗CD19或抗CD22抗体染色骨髓(BM)细胞以用于检测白血病，并也用CD22Fc或CD19的抗独特型染色以用于分别检测抗CD22 CAR或抗CD19 CAR。
在用用编码V1 CAR的载体转导的T细胞治疗的小鼠中无可检测水平的白血病，而在用用编码单一抗CD19 CAR或单一抗CD22 CAR的载体转导的T细胞治疗的小鼠中有高肿瘤负荷。在用模拟的T细胞治疗的小鼠中有高肿瘤负荷。在BM隔室中，V1 CAR T细胞持续至多达第14天。
在第0天，用混合的白血病细胞(0.1E6个NALM6和0.1E6个NALM6-CD19-和0.1E6个NALM6-CD22-)注射NSG小鼠。在第3天，所有组中的小鼠接受3E6个CAR+ T细胞，除了第2组(G2)外，第2组接受6E6个CAR+ T细胞。第5组(G5)中的小鼠接受CD19 CAR和CD22 CAR共转导的T细胞。第6组(G6)中的小鼠接受共施用的3E6个CD19 CAR和3E6个CD22 CAR。第9组(G9)中的小鼠接受Lenti-GFP+ T细胞并被用作阴性对照。生物发光强度代表肿瘤负荷。数据表明在相同剂量水平的CAR T细胞(3E6个)下，双顺反子-V1 CAR对于减少该复发模型中的白血病可能是最有效的(图10)。
实施例5
本实施例证明了与其他的CAR相比，使用根据本发明的实施方案的CAR构建体治疗了CD19-和CD22-白血病。
生物发光成像被用于追踪体内白血病进展。在第0天，将五十万个CD19KO NALM6细胞与等量的CD22KO NALM6细胞混合，并注射至NSG小鼠内。在3天后，用3百万个CAR T细胞治疗这些小鼠。
使用用编码V1 CAR载体转导的T细胞几乎清除了所有的白血病，而使用用编码单一抗CD19 CAR或单一抗CD22 CAR的载体转导的T细胞未能如此(图11)。
在第0天用1E5个NALM6细胞、1E5个NALM6-CD19KO细胞和1E5个CD22KO白血病细胞攻击NSG小鼠，然后其在第3天接受3E6个CAR+ T细胞。生物发光强度代表肿瘤负荷。图像表明V1、V5、V6和V7 CAR可有效减少CD19+CD22+白血病，以及CD19阴性和CD22阴性白血病细胞，但抗CD19或抗CD22单一CAR未能如此。图12。
实施例6
本实施例证明了与其他的CAR相比，用根据本发明的实施方案的CAR构建体治疗了白血病。
在第0天用1E6个NALM6白血病细胞攻击NSG小鼠。第1组和第2组中的小鼠(小鼠分组参见图13)接受在第3天用编码单一抗CD19 CAR或单一抗CD22的载体转导的1E6个T细胞的和在第7天用编码另一单一CAR的载体转导的3E6个T细胞的连续的治疗。第3组中的小鼠在第3天接受总共6E6个CAR+ T细胞的施用，其中接受用编码单一抗CD19CAR的载体转导的3E6个T细胞和用编码单一抗CD22 CAR的载体转导的3E6个T细胞。第4至7组中的小鼠在第3天接受用编码图13中指示的CAR的载体转导的3E6个T细胞。由于共转导的T细胞上的低表达，第4组中的小鼠接受几乎10E6个总CAR+ T细胞。图13证明了同时靶向CD19和CD22好于用单一靶向CAR的连续治疗。
在第0天用0.25E6个NALM6-CD19KO和0.25E6个CD22KO白血病细胞攻击NSG小鼠。在第3天，用3E6个CAR+ T细胞注射NSG小鼠。使用用编码V1 CAR的载体转导的T细胞的和使用用编码V5 CAR的载体转导的T细胞似乎完全根除CD19-和CD22-白血病细胞(图14)。
实施例7
本实施例证明了根据本发明的实施方案的双特异性的CAR。
人白血病样品
经由NCI IRB批准的筛选方案筛选了患者样品中的抗原表达。在获得美国国家癌症研究所(NCI)-IRB批准的组织获取方案的知情同意书后，收集并存储了异种移植体产生的人ALL样品。所有来自人类对象的研究样本均在获得根据赫尔辛基宣言的知情同意书的情况下获得。
细胞系和培养条件
使用了以下白血病细胞系：红白血病K562-CD22(用人CD22转导的，GeneCopoeia,Cat:EX-Z9364-Lv151)、K562-CD19(用人CD19转导的)、K562-CD19CD22(用人CD19和CD22转导的)、作为阴性对照的非转导的K562；B细胞急性成淋巴细胞性白血病系NALM6、NALM6-GL(用GFP和荧光素酶转导的)和REH-TSLPR-GL(Qin等人,Blood,126:629-39(2015)，通过引用并入)。在补充有10％的热灭活的FBS、10mM HEPES、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺(Invitrogen)的培养基中培养细胞系。在DMEM(Invitrogen)培养基中培养Lenti-X 293T慢病毒包装细胞系(Clontech.Cat#632180)。
CD19neg和CD22neg白血病复发模型的产生
将CRISPR Cas9技术用于编辑Nalm6，以产生NALM6-CD19neg-GL(外显子3上的CRISPR CD19)、NALM6-CD22neg-GL(外显子6上的CRISPR CD22)。用于NALM6上的CD19或CD22的CRISPR/Cas9基因编辑的慢病毒载体先前已有描述(Fry等人,Nat.Med.,24:20-28(2018)，通过引用并入)。简言之，通过http://crispr.mit.edu/最优化引导RNA，克隆至LentiCRISPR v2质粒(Addgene Plasmid 52,961)中。然后将质粒与包装质粒共转染，并转化至HEK293T细胞内。2天后，收获上清液，过滤并浓缩。对于病毒转导，将105个NALM6细胞与10ml浓缩的病毒上清液一起孵育2天，然后在RPMI培养基中扩增。通过流式细胞术，随后通过用表型改变和单细胞克隆分选细胞来评估细胞表型。对单细胞克隆进行测序以证实基因型改变。
CAR慢病毒载体产生和T细胞转导
设计并合成二价CAR构建体，然后将其克隆到慢病毒转移质粒内。通过瞬时转染Lenti-X 293T慢病毒包装细胞系产生二价编码CAR慢病毒载体。简言之，将lenti-X 293T细胞接种至聚D赖氨酸包被的15-cm板(BD Biosciences)中。第二天，使用lipofectamine3000(Thermo Fisher Scientific)将编码CAR构建体的质粒连同包装和包膜载体(pMDLg/pRRE、pMD-2G和pRSV-Rev)一起转染Lenti-X 293T细胞。在转染后24和48小时收获慢病毒上清液，以3000RPM离心10分钟以去除细胞碎片，在干冰上冷冻并储存在-80℃。用NIH批准的方案从正常供体中获得人PBMC，并用在含有40IU/mL重组IL-2和5％ FBS的AIM-V培养基中的1:3比例的CD3/CD28微珠(Dynabeads人T扩增器CD3/CD28,Thermo Fisher Scientific,Cat#11141D)活化24小时。在6孔板中，将活化的T细胞以每2mL慢病毒上清液2百万个细胞，加上1mL的具有10ug/mL终浓度的硫酸鱼精蛋白和100IU/mL IL-2的新鲜AIM-V培养基重悬。将板在32℃下以1000×g离心2小时，并在37℃下孵育过夜。在第二天，通过重复上述相同的转导方案进行第二次转导。在转导后第三天去除CD3/CD28珠，并在含有100IU/mL IL2的AIM-V中以300,000个细胞/mL培养细胞，每2-3天添加新鲜的含有的IL2的培养基，直到在第8天或第9天收获。
流式细胞术分析
通过流式细胞术，使用CD22-Fc(R&D Systems)，然后与特异性针对人IgG-Fc的PE-F(ab)2或APC-F(ab)2(Jackson免疫研究实验室)孵育，来确定CD22 CAR转导的T细胞的表面表达。用与APC缀合的抗CD19独特型或重组人CD19Fc嵌合体蛋白(R&D Systems)，通过使用闪电连接APC抗体标记试剂盒(Lightning-Link APC Antibody Labeling Kit，NovusBiologicals)，来检测CD19 CAR转导的T细胞的表面表达。使用如单幅图所指示的两种检测试剂的组合来评估二价CAR的表达。使用以下抗人抗体检测B-ALL系上CD19和CD22的表达：CD45-PerCP-Cy5.5(eBioscience)、CD19-Pacific Blue、CD19-APC-Cy7、CD10-PE-Cy7和CD22-PE(Biolegend)。用以下抗体表征T细胞：CD3-APC-Cy7、CD4-Pacific Blue和CD8a-PE-Cy7(BioLegend)。
孵育细胞细胞毒性测定
将于100ul的RPMI培养基中的5E4个靶标肿瘤细胞加载至96孔板(BioCoatTM聚-L-赖氨酸96孔透明TC处理的平底测定板)内。在第2天将等量的CAR T细胞添加至指定的孔内。将凋亡标志物(Essen BioScience)在100ul PBS中稀释，并将1ul的稀释液添加至每个孔内。使用IncuCyte系统每30分钟扫描板的GFP荧光表达，以监测细胞凋亡GFP阳性细胞消失，持续40小时。确定了每个时间点处相对于基线的细胞杀死百分比。
细胞因子产生的分析
将靶标肿瘤细胞和转导的CAR阳性T细胞用PBS洗涤3次，并以1E6个/ml重悬于RPMI中。将100ul的肿瘤细胞悬液和100ul的CAR T细胞悬液以一式双份或一式三份加载至具有仅T细胞和仅肿瘤细胞对照的96孔板中的每个孔中。在37℃恒温箱中18小时后，收获培养物上清液以用于使用ELISA(R&D Biosciences)或多重测定(Meso Scale Discovery)来检测细胞因子。
体内研究
在NCI贝塞斯达动物护理和使用委员会(NCI Bethesda Animal Care and UseCommittee)批准的方案下进行动物实验。将B-ALL细胞系和异种移植的人B-ALL样本经IV注射至NSG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ,Jakcson实验室)内。对于荧光素酶表达系，使用Xenogen IVIS Lumina(Caliper Life Sciences)检测白血病。向小鼠经腹腔内注射3mg D-荧光素(Caliper Life Sciences)，并稍后成像4分钟，对于NALM6为30秒的暴露时间，且对于PDX为2分钟。将活体成像4.1版的软件(Caliper Life Sciences)用于分析每只小鼠的生物发光信号通量(flux)，表示为光子/s/cm2/sr。通过外周血、骨髓和脾脏的流式细胞术测量表达非荧光素酶的异种移植物中的白血病负荷。
患者来源的异种移植体
将以下原代样品用于产生PDX模型：CD19-ALL和CD19+CD22dim(从头合成复发样本ALL_H0113_post22_r(CAR3)、ALL_H0090_post19_pd(HMB15)。通过经静脉内注射1E6-10E6个患者ALL细胞至NSG小鼠(NOD免疫缺陷γ,NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ；Jackson免疫研究实验室)内来产生PDX。在2次成功的传代后，用lenti-GFP-Luc病毒转导PDX系，并在第一和第二次传代后分选高表达的GFP和荧光素酶。通过每周的荧光成像评估GFP转导的PDX白血病体内负荷，并在一旦通过荧光成像可检测人ALL时即经尾静脉注射用CAR T细胞治疗动物。根据IRB批准的方案，从美国国立卫生研究院(NIH)临床中心的输血科(Department of Transfusion Medicine)获得来自健康供体的淘选的人淋巴细胞。在AIM-V培养基中培养人淋巴细胞。
PDX模型的基因组分析
根据制造商的方案(Qiagen)，使用Qiagen AllPrep微型试剂盒对有活力的冷冻保存的样品进行核酸提取。使用Agilent 2100生物分析仪对DNA和RNA进行定量和质量评估。生成了聚腺苷酸化的RNA文库，并在Hiseq2500(Illumina)平台上使用TruSeq 4.0化学进行测序。使用Agilent SureSelect XT人所有外显子V5(gilent SureSelect XT Human AllExon V5)和TruSeq V4化学方法生成了全外显子组数据，并使用HiSeq 2500(Illumina)将其测序至100×覆盖率的中值。
绘制了全外显子组和RNA测序数据，并使用CCR合作的生物信息学(CCRCollaborative Bioinformatics,CCBR)传递途径(https://bioinformatics.cancer.gov)进行分析。将读取(reads)与参考基因组Hg19比对。使用MuTect20进行体细胞变异搜寻(Somatic variant calling)，并使用Nexus拷贝数发现版本#9Copy Number DiscoveryEdition#9(Nexus Copy Number Discovery Edition#9，BioDiscovery)分析拷贝数改变。使用整合基因组浏览器(Integrative Genome Viewer，IGV)，通过手动检查进一步探询了CD19和CD22基因的完整性。使用Trimmomatic软件修剪每个样品的适配子的RNA测序读取和低质量碱基，并使用STAR软件与参考人Hg 38和Genecode V24转录本进行比对。
统计分析
使用Prism 7.0软件进行统计分析。使用曼惠特尼检验计算患者CD19和CD22分析的统计显著性。
前B ALL上CD19和CD22的不均一和动态表达。
评估了主要是来源于患有多次复发的疾病的患者的患者样品的CD19和CD22表达。在施用免疫疗法之前，存在较广范围的CD19和CD22的表达(图42)。在CD19靶向的免疫疗法之后的CD19表位丢失已被很好地描述。在匹配的配对分析中，评估了在CD19丢失之前和之后患者中的CD22表达，并证明了与CD19丢失相关的CD22表达的一致减少，表明单一抗原丢失也可以广泛地调节抗原表达(图15)。这些结果说明了与单一抗原靶向的免疫疗法相关的挑战。
同时靶向CD19和CD22在预防抗原丢失-复发模型的复发或疾病进展方面优于连续治疗。
为了模拟临床试验能中见到的CD19和CD22复发现象，将CRISPR/Cas9基因编辑用于从前B ALL细胞系NALM6细胞删除CD19和/或CD22(图16)，某些数据提供在表17中。
表17
在单细胞克隆以确保稳定性后，CRISPR编辑的NALM6系和亲本NALM6当植入NSG小鼠中时均证明疾病进展，尽管B细胞受体相关基因缺失或相应表面蛋白表达丧失(图17)。
一种对两种抗原施加免疫治疗压力的方法是经由连续输注抗CD19-CAR T细胞和随后的抗CD22 CAR T-细胞，或者反之亦然。为了测试该策略，向小鼠注射CD19neg、CD22neg和亲本NALM6(CD19pos/CD22pos)ALL的混合物，以模拟抗原阴性的复发。施用单一抗原特异性的CAR T细胞导致不表达靶标抗原的白血病的复发，从而验证了复发模型(图18)。出人意料地，连续6天单独输注有疗效剂量的抗CD19和抗CD22 CART并不能阻止ALL进展。重要地是，复发表型证明了第二次CAR输注的减少的功效。同时施用(共输注)抗CD19和抗CD22靶向的CART优于连续输注，但引起仍表达CD22的CD19neg ALL的进展，表明抗CD19 CAR可能占主导。
基于在与CD22 CAR共输注时抗CD19 CAR的明显优势，下一步是通过共转导将抗CD19和抗CD22 CAR两者引入同一T细胞中，以产生包含双特异性的CAR T细胞的T细胞库。然而，共转导效率一致性地低，仅产生了表达抗CD19和抗CD22 CAR的总T细胞产物的四分之一(图19)。此外，复发表型(CD22+CD19neg和CD22negCD19neg，图20)再次表明，抗CD19 CAR T细胞当与表达两种抗CAR或仅抗CD22 CAR的T细胞一起施用时可能占主导地位。因此，基于两种载体的基因转移效率低、与管理两种载体相关的技术挑战和成本，以及纳入两种单一表达CAR的T细胞可能会削弱双特异性T细胞群的扩增的可能性，寻求了从同一载体中引入双特异性的方法。
用scFv的串联测序开发二价CAR。
通过将两种不同的scFv结构域偶联至单一CAR构建体中而产生了二价CAR。在构建抗CD19x抗CD22 CAR中采取的方法是以相继顺序为每个scFv放置重链(VH)和轻链(VL)(对于CD19为FMC63，且对于CD22为m971)，以制备如图21中所示的串联CAR(TanCAR)。对于TanCAR1，维持来自每个单一CAR的VH和VL之间原来的连接子，并使用G(S)4x 5连接子(在转导后可以以与细胞表面上的单一抗原靶向的CAR相当的水平检测的形式)来连接两个scFv。TanCAR1在第WO 2016/149578号国际专利公开中有描述。重要地是，可以使用抗CD22Fc融合和抗FMC63独特型检测所有表达CAR的T细胞。对于TanCAR2(SEQ ID NO:63)，抗CD19和抗CD22scFv的顺序被翻转，导致表面上低得多的检测。尽管与单价CD19 CART相比，针对CD19pos/CD22neg ALL的TanCAR1的良好的表面检测和相当水平的IL2产生，但是当与CD9neg/CD22pos ALL共孵育时IL-2的产生非常低(图22A和22B)。鉴于抗CD22VH和VL之间的极其短的连接子(G4S)，用CD22scFv内的增加的连接子长度(取消了CD22Fc和抗独特型结合的形式)构建了TanCAR3(SEQ ID NO:64)(图21)。对于TanCAR4(SEQ ID NO:65)，维持了用于抗CD22scFv的短的亲本连接子，但减少了抗CD19和抗CD22scFv之间的连接子长度。这引起了CAR表面表达(抗CD22Fc和抗FMC63独特型结合)并与TanCAR1相比增强了CD22指向的功能，如通过针对CD19-/CD22+ALL的IL2产生所测量的(图22A和22B)。
进一步评估了TanCAR1和TanCAR4的细胞毒性，证明其活性与CD19和CD22单价CAR相当。尽管具有体外活性，但TanCAR1和TanCAR4都没有完全消除体内的CD19posCD22posALL(图23A-23D)。用产生环结构的scFv的可替代序列开发二价CAR。
构建了一系列的二价CAR构建体(图24)。用抗CD19scFv的VH和VL之间的抗CD22scFv(维持短连接子)(只能在细胞表面上以低百分比检测的形式)，构建了环CAR1(SEQID NO:66)。对于环CAR2(SEQ ID NO:67)，增加了抗CD22scFv之间的连接子长度以试图促进环结构的折叠，并且对抗CD19可变链和抗CD22scFv之间的连接子的氨基酸结构进行了轻微修饰以促进二硫键的形成。这改善了CAR表面检测。环CAR1无法产生针对CD19或CD22的IL-2的产生。尽管表面检测有所改善并且产生了一些针对CD19的IL-2，但环CAR2并未产生可检测的针对CD22抗原的IL-2。参见图25A和25B。
对环CAR3(SEQ ID NO:68)进行了进一步的修饰以减少抗CD19重链和抗CD22scFv之间的连接子长度，并维持了在环2中引入的VH和VL之间的稍长的连接子，这改善了针对CD19neg/CD22pos ALL的IL-2产生。对于下一构建体系列，将抗CD19scFv放置在膜的远端位置以及抗CD22scFv的可变链之间。在环CAR4(SEQ ID NO:69)中，维持了在环CAR3中引入的抗CD19scFv和抗CD22scFv可变链之间的连接子，这造成了与任何先前的形式相比的高水平的CAR检测和更优的IL2产生，表明抗CD22scFv膜的近端位置可能是最佳的。鉴于针对CD19neg/CD22pos ALL的IL-2产生仍不如CD22单价CAR，因此对环CAR5(SEQ ID NO:70)进行了修饰以利于二硫键形成(不能提高细胞因子产生的结构)。参见图25C。
最后，在环CAR6(SEQ ID NO:61)中，在抗CD19scFv和抗CD22可变链之间并入了一个较短的连接子，其显著地改善了针对CD19pos/CD22neg和CD19neg/CD22pos ALL的CAR检测和IL-2产生(图26)，以及表达单抗原的ALL的体外杀死(图27和28)。值得注意的是，与表达抗CD22 CAR的T细胞相比，通过表达环CAR6的T细胞杀死CD19neg ALL的动力学表明针对CD22的稍微更弱的效力。环CAR6应答CD19和CD22而产生了多种细胞因子(图29A-29F)，这进一步证实了表达环CAR6的T细胞的效力和多功能性。因此，环设计对于并入CD19xCD22特异性的二价CAR可能是最佳的，这可能是由于保持CD22结合的攻击。在设计和测试的多种构建体中，环6被认为是最有效的形式，并在体内模型中进行了进一步测试。
环CAR6有效地消除了CD19posCD22neg和CD19neg PDX。
接下来测试了Nalm6异种移植体上的环CAR6。8×106剂量的环CAR6似乎能够消除CD19pos/CD22pos Nalm6(图30)并在低至3×106的剂量下保持活性(图31)。环CAR6也优于针对CD19pos/CD22pos ALL的连续输注(图32)。然而，在低剂量下，环CAR6针对CD19neg/CD22pos白血病(亲本NALM6相比具有较低的CD22表达的细胞系)与(图33A)的效果并不同样好。
在“加标”复发模型中进一步测试了环CAR6，其中移植的ALL接种物中含有1％的CD19neg或CD22neg ALL与99％的CD19pos/CD22pos ALL，所述测定模拟了来自小的、先前存在的克隆的复发。在该模型中，环CAR6在清除CD22neg ALL方面与抗CD19 CAR相当，这证实了环CAR6针对CD19的与抗CD19单价CAR相当的效力。然而，与抗CD22单价CAR相反，环CAR6不能完全清除具有低CD22位点密度的CD19neg/CD22pos ALL(图33B)。总之，并且如通过体外杀死表达单一CD22的ALL的动力学所证明的(图27)，体内实验表明环CAR6具有针对CD19的与抗CD19单价CAR相当的效力，但针对CD22比抗CD22单价CAR稍低的效力。
为了进一步探索抗CD19 CAR抗性的临床相关模型中环CAR6的体内活性，利用了从从头合成复发样本(HMB15；CD19pos/CD22pos和HMB28；CD19neg/CD22pos)产生的两个不同的患者来源的异种移植体。进行了全外显子组和转录组测序以表征两个PDX模型系统。HMB15具有导致在MLL(外显子1-6)的N末端和MLLT10的C末端之间的框内融合癌基因的易位。CD19和CD22基因组基因座在该模型中是完整的。HMB28PDX原癌基因驱动因素是KRASG12D的点突变。另外，该模型在CD19中具有早熟的终止密码子(表18)。
表18
PDX模型 原癌基因 CD19 CD22
HMB15 MLL-MLLT10融合 完整的DNA和RNA 完整的DNA和RNA
HMB28 KRAS G12D W214终止密码子 完整的DNA和RNA
HMB15似乎已被单价CAR和环CAR6清除(图34A和34B)。HMB 28对抗CD19单价CAR有抗性，因此是抗CD19 CAR抗性的良好模型。令人鼓舞地是，环CAR6阻止了HMB28的进展，表明环CAR6可以有效预防抗CD19 CAR抗性。
无证据表明环CAR6的脱靶活性。
鉴于两种不同的VH和VL的错配引起潜在的脱肿瘤(off tumor)毒性的可能性，进行了表达环CAR6的T细胞的功能筛选。将环CAR6T细胞与代表多种正常组织的人iPSC细胞系共孵育，并测量了培养物上清液中的IFNγ产生。将IFNγ产生用于测量如开发的所有活性CAR构建体诱导IFNγ的反应。将表达CD19和CD22两者的NALM6和REH-TSLPR(两种单独的ALL细胞系)用作阳性对照。
在该测定中，环CAR6在T细胞中诱导了针对NALM6和REH-TSLPR的IFNγ。在任何iPS细胞系存在下，在表达环CAR6的T细胞的上清液中均未检测到IFNγ产生(图35A和35B)。
表19呈现了结果的概要。
表19
实施例8
本实施例证明了根据本发明的实施方案的可切割的CAR。
细胞系和培养条件
使用了以下白血病细胞系：红白血病K562-CD22(用人CD22转导的，GeneCopoeia，Cat:EX-Z9364-Lv151)、K562-CD19(用人CD19转导的)、K562-CD19CD22(用人CD19和CD22转导的)、作为阴性对照的非转导的K562；B细胞急性成淋巴细胞性白血病系NALM6、NALM6-GL(用以GFP和荧光素酶转导的)、NALM6-CD19--GL(外显子3上的Crisper KO CD19)、NALM6-CD22--GL(外显子6上的Crisper KO CD22)。在补充有10％热失活的FBS、10mM HEPES、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)的培养基中培养细胞系。在DMEM(Invitrogen)培养基中培养Lenti-X 293T慢病毒包装细胞系(Clontech.Cat#632180)。
原代人白血病样品和患者来源的异种移植体
在取得IRB批准的组织获取方案(方案编号：15-C-0029)的知情同意书后收集人ALL(急性成淋巴细胞性白血病)样品并储存。来自人类对象的所有研究样本均在取得根据赫尔辛基宣言的知情同意的情况下获取。使用了以下原代样品：CD19-ALL和CD19+CD22dim(从头合成的复发样品ALL_H0113_post22_r(CAR3)、ALL_H0090_post19_pd(HMB15)，其被用于体内测试双特异性CAR构建体。通过将1E6个至10E6个患者ALL细胞经静脉注射到NSG小鼠(NOD免疫缺陷γ,NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ；Jackson免疫研究实验室)内，而创建了PDX模型。利用lenti-GFP-Luc病毒转导PDX系，并在第一次和第二次传代后分选表达GFP和荧光素酶的白血病细胞。对于这些研究，PDX的第二次传代和以后的传代分别被用于复发的和从头合成的ALL样本。通过每周的荧光成像评估了GFP转导的PDX白血病体内负荷，并在一旦通过荧光成像检测到人ALL时，经尾静脉注射对动物进行CAR T细胞治疗。根据IRB批准的方案从美国国立卫生研究院(NIH)临床中心的输血科获得来自健康供体的淘选的人淋巴细胞。在AIM-V培养基中培养人淋巴细胞。
用CRISPR产生CD19阴性或CD22阴性白血病
制备了用于NALM6上的CD19或CD22的CRISPR敲除的慢病毒载体。简言之，通过http://crispr.mit.edu/对引导RNA进行了优化，将其克隆到LentiCRISPR v2质粒(Addgene质粒52,961)内。然后将质粒与包装质粒共转染并转化至HEK293T细胞内。两天后，收获CRISPR上清液，过滤并浓缩。对于病毒转导，将105个NALM6细胞与10ml浓缩的病毒上清液一起孵育2天，然后在RPMI培养基中扩增。通过流式细胞术评估细胞表型，然后分选具有表型改变和单细胞克隆的细胞。对单细胞克隆进行测序以证实基因型改变。
制备慢病毒CAR构建体
用不同配对的CD28或每个CD19和CD22 CAR中的4-1BB共刺激结构域以及与其间的可切割的连接子的连接，制备了CD19/CD22双顺反子CAR。每个CD19和CD22 CAR在起始处具有前导序列，接着是CD19或CD22单链可变区片段，然后是与4-1BB和CD3ζ结构域连接的CD8跨膜结构域或与CD28和CD3ζ结构域连接的CD28跨膜结构域。将这些CAR亚克隆至pELNS慢病毒载体骨架内。所有限制酶均购自New England Biolabs。所有CAR构建体的序列均通过在Macrogen的测序进行了证实。
本实施例中描述的CAR如下：22-BB/19-28(其在本文中也被列为V5)、22-28/19-BB(其在本文中也被列为V6)、22-BB/19-BB(其在本文中也被列为V7)和22-28/19-28(其在本文中也被列为V8)。
CAR T细胞产生
通过瞬时转染Lenti-X 293T慢病毒包装细胞系而产生了编码双顺反子CAR的慢病毒载体。简言之，将lenti-X 293T细胞接种至聚D赖氨酸包被的15-cm板(BD Biosciences)内。第二天，使用lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)将编码CAR构建体的质粒连同包装和包膜载体(pMDLg/pRRE、pMD-2G和pRSV-Rev)一起转染Lenti-X 293T细胞。在转染后24和48小时收获慢病毒上清液，在3000RPM下离心10分钟以去除细胞碎片，在干冰上冷冻，并储存在-80℃。根据NIH批准的方案获得了来自正常供体的人PBMC，并在含有40IU/mL重组IL-2和5％ FBS的AIM-V培养基中用1:3比例的CD3/CD28微珠(Dynabeads人T扩增器CD3/CD28,Thermo Fisher Scientific,Cat#11141D)活化24小时。在6孔板中，将活化的T细胞以每2mL慢病毒上清液200万个细胞加1mL具有10mg/mL硫酸鱼精蛋白和100IU/mL IL-2的新鲜AIM-V培养基重悬。将板在32℃下以1000×g离心2小时，并在37℃下孵育过夜。在第二天通过重复上述相同的转导程序进行第二次转导。在转导后第三天去除CD3/CD28珠，并将细胞以300,000个细胞/mL在含有100IU/mL IL2的AIM-V中培养，每2-3天添加新鲜的含有IL2的培养基，直到在第8天或第9天收获。
流式细胞术
通过流式细胞术，使用CD22-Fc(R&D Systems)，然后与特异性针对人IgG-Fc(Jackson免疫研究实验室)的PE-F(ab)2或APC-F(ab)2孵育，来确定CD22 CAR转导的T细胞的表面表达。用与APC缀合的抗CD19独特型或重组人CD19Fc嵌合体蛋白(R&D Systems)，通过使用闪电连接APC抗体标记试剂盒(Novus Biologicals)检测CD19 CAR转导的T细胞的表面表达。使用以下抗人抗体检测B-ALL系上CD19、CD22的表达：CD45-PerCP-Cy5.5(eBioscience)、CD19-Pacific Blue、CD19-APC-Cy7、CD10-PE-Cy7和CD22-PE(Biolegend)。用以下抗体表征T细胞：CD3-APC-Cy7、CD4-Pacific Blue和CD8a-PE-Cy7(BioLegend)。
细胞毒性测定
将于100ul RPMI培养基中的5E4个靶标肿瘤细胞加载到96孔板(BioCoatTM聚L-赖氨酸96孔透明TC处理的平底测定板)内。在第二天将等量的CAR T细胞添加到指定的孔内。将初始的孵育细胞细胞凋亡标志物(Essen BioScience)在100ul PBS中稀释，并将1ul的稀释液添加到每个孔内。使用IncuCyte系统每30分钟扫描板的GFP和或RFP荧光表达，以监测细胞凋亡，持续40小时。对每个时间点处的细胞杀死百分比进行基线校正。
分析细胞因子产生
利用1×PBS将靶标肿瘤细胞和转导的CAR阳性T细胞洗涤3次，并以1E6个/ml重悬于RPMI中。将具有100ul的CAR阳性T细胞的100ul的肿瘤细胞加载到96孔板的每个孔内。设置了仅T细胞和仅肿瘤细胞对照。所有测试均以一式双份或一式三份进行。将细胞在37℃下孵育18小时，并收获120ul的培养物上清液用于检测细胞因子产生。使用ELISA试剂盒(R&DSystems)或多重测定(Meso Scale Discovery)测量上清液中的细胞因子水平。
RNAseq分析
将NALM6和CAR T细胞以1E6个/ml重悬。在25ml培养瓶中，在具有40U的IL2培养基的10ml的AIMV中，以一式双份或一式三份将5E5个NALM6与5E5个CAR+ T细胞共孵育24小时。用LD柱去除具有CD19微珠的NALM6。收集总洗脱物，并通过在1200rpm下离心6分钟来使细胞成团沉淀。立即利用RNAeasy Plus微型试剂盒提取tRNA。将RNA样品送至NIH核心设备进行分析。利用TapeStation分析软件(Agilent Technologies)评估RNA质量。用NextSeqFASTQ，通过TruSeq LT测定产生RNAseq。
生物能量学分析
对于糖酵解应激测试，将CAR T细胞悬浮在补充有L-谷氨酰胺(200mM)和NaCl(143mM)的无血清的无缓冲DMEM培养基(Sigma-Aldrich)中。加入0.6mL 0.5％酚红溶液(SigmaP0290)，终浓度为3mg/L，并将pH值调节至7.35+/-0.05。将CAR T细胞接种到Seahorse细胞板上(每孔3E5个细胞)，其上包被有Cell-Tak(Corning)以促进T细胞的附着。简言之，在测定前一天将盒子(cartridges)水化。在测定的当天，将板包被上Cell-Tak，并将细胞接种在包被有Cell-Tak的板上，然后放置在XF24分析仪上进行测定。详细程序如下。首先以200ul/孔用XF校准溶液对测定盒进行水化，加入水力增强剂(hydro booster)，并在石蜡膜中使其变形，然后将感应器盒置于效用板顶部，并在37℃、无C02下孵育过夜。然后按如下方式将细胞培养板包被上Cell-Tak：对于1个板，将46μl的Cell-Tak稀释在204μl TC水和1ml NaHCO3中。在每个孔中分配50μl的混合物，并将板在室温下孵育至少20分钟。除去Cell-Tak溶液后，使用250ml的TC水洗涤每个孔。将CAR T细胞(3E5个/孔)接种在158μl测定培养基中。然后将细胞培养板在低加速和无减速下以450rpm旋转1秒钟，然后反转板的方向，并在低加速和无减速下以650rpm旋转1秒钟。然后将板在37℃、0％C02下孵育25-30分钟。孵育25-30分钟后，使用手动P200移液器沿壁的侧面将158ul温暖的测定培养基缓慢并轻轻地加入到每个孔的顶部。将细胞板孵育15-25分钟。15-25分钟后，将板放置在XF24分析仪上(在校准完成后)。执行XF测定。通过三个口连续注射溶液：A口：葡萄糖80mM(在3ml测定培养基中的96μl的储备溶液)。B口：寡霉素18μM(在3ml测定培养基中的10.8μl的储备溶液)。C口：2DG使用储备液。通过测量在盒口装载75μl的药物溶液后的稳态下的ECAR(mpH/min)，来进行糖酵解应激测试。对于线粒体应激测试，将CAR T细胞悬浮在具有D-葡萄糖(25mM)和丙酮酸钠(1mM)的无血清无缓冲DMEM培养基中。通过测量稳态下以及在连续注射寡霉素(0.5μM)、FCCP(0.5μM)、鱼藤酮(1μM)和抗霉素A(1μM)(Sigma-Aldrich)后的OCR(pmol/min)，来以与上述类似的方式进行线粒体应激测试。利用Seahorse系统的实验采用了以下测定条件：2分钟混合；2分钟等待；和3分钟测量。
荧光显微镜成像和分析
T细胞被共转导以表达CAR-Cerulean或CAR-mCherry融合蛋白。分选CAR阳性T细胞，并用在PBS中的亲脂性示踪物-DiD膜染料(Life Technologies)和活的/死的可固定的蓝色死细胞(LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell,Life Technologies)染色。然后将细胞洗涤并安装(mounted)。利用配有AxioCam MRm相机的Zeiss Apotome，使用Zeiss平场高度消色透镜20×物镜获取图像。整个实验的曝光设置相同。将ImageJ软件用于数据分析。排除死细胞。将DiD膜染色用于鉴定每个细胞。对Cerulean(CFP)阳性或mCherry阳性区的尺寸和最大强度进行了计数。仅计数了大于1的最大强度。DiD染色的阈值设置为最大像素强度的10％。Cerulean通道和mCherry通道的阈值设置为最大像素强度的20％。
体内实验
在NCI贝塞斯达动物护理和使用委员会批准的方案下进行动物实验。将B-ALL细胞系和异种移植的人B-ALL样本IV注射至NSG小鼠内。对于表达荧光素酶的细胞系，使用Xenogen IVIS Lumina(Caliper Life Sciences)检测白血病。将NSG与3mg D-萤光素(Caliper Life Sciences)一起腹腔内注射，并在4分钟后成像，对于NALM6细胞，曝光时间为30秒，且对于PDX，曝光时间为2分钟。使用活体成像4.1版软件(Caliper Life Sciences)分析了每只小鼠的生物发光信号通量，表示为光子/s/cm2/sr。通过外周血、骨髓和脾脏的流式细胞术测量表达非荧光素酶的异种移植体中的白血病负荷。
统计分析
使用Prism 7.0软件进行统计分析。图呈现为平均值+/-SD。使用患者CD19和CD22分析的曼惠特尼检验计算所有数据的统计显著性。
双顺反子CAR的开发
当在具有低剂量CAR的极具侵入性复发模型中进行测试时，二价环CAR6不能完全消除CD19neg和CD22neg白血病。在测试了11种不同形式的二价CAR后，发现很难以二价形式保留CD22活性。
通过流式细胞术确定双顺反子CAR表达，以证实双顺反子构建体的表达。如图36中所示的，在蛋白质翻译后，双顺反子CD19 CAR和CD22CAR变成了两个单独的片段，并最终在细胞表面上表达两种CAR。第四象限中的细胞聚集指示细胞表面上等摩尔的CD19和CD22CAR表达。发现具有22-BB/19-28表达系统的CAR具有最高比例的双阳性细胞，其中具有70.3％的阳性细胞。最低水平的双重表达与具有双BB或双28的那些相关，其分别为40.8％和58.1％。当切换共刺激结构域时，在双阳性群体中损失了约10％的表达。
与二价的和其他的双顺反子CAR相比，具有4-1BB和CD28的组合的双顺反子CAR在体外具有更优的功能
先前已有报道，共同刺激内结构域CD28和4-1BB对CAR功能的免疫调节具有不同的影响。为了阐明单一靶向性CAR构建体的灵敏度，将每种CAR-T细胞与以不同密度的表达同源抗原的白血病共培养，并测量18小时共培养物上清液中的IL-2水平。靶标抗原密度使细胞因子产生的差异高达10倍，并且CD22 CAR对靶标密度尤其敏感(图37A)。共刺激结构域还有助于细胞因子产生的差异，但与靶标抗原密度的影响相比，可归因于共刺激结构域的差异较适中。
接下来，将具有不同配对的共刺激结构域的双顺反子CAR与K562和NALM6来源的细胞一起孵育，以确定抗原密度是否会影响细胞因子产生。具有CD28和4-1BB共刺激结构域的组合的双顺反子CAR比只有CD28或4-1BB共刺激结构域或单一靶向性CAR的那些产生更多的细胞因子(图37B)。抗原密度再次地对CAR T细胞的细胞因子产生具有最高的影响。22-BB/19-28比22-28/19-BB CAR制造稍微更多的细胞因子。22-BB/19-28 CAR也比CD19/CD22二价CAR制造更多的细胞因子(图37C)。所有的双顺反子CAR都表现出对靶细胞系的有效杀死(图37D-37G)。RNAseq分析证明了与不同配对的共刺激结构域相关的独特的基因表达
进行了RNAseq分析以探询与不同的共刺激结构域组合相关的生物通路。将双顺反子CAR与CD19+CD22+NALM6细胞一起共孵育，并提取总RNA进行RNAseq分析。PCA表明不同的组合与独特的基因表达谱相关(图38)。
双顺反子CAR有效减少原始(blast)CD19+CD22+白血病和CD19neg或CD22neg白血病
将CD19+CD22+NALM6系用于测试双顺反子CAR的体内活性。将CD19和CD22 CAR与CD28或4-1BB单一CAR用作对照。如图39中所示的，通常，双顺反子CAR好于单一靶向性CAR。不同配对的CD28和4-1BB共刺激诱导不同比例的肿瘤消除；22-BB/19-28在消除原始白血病方面是最好的配对。
在复发的患者中观察到原始CD19neg和CD22低。为了模拟该临床情形，将CRISPRCas9技术用于用NALM6细胞产生CD19neg和CD22neg白血病系。将CD19neg、CD22neg和亲本NALM6细胞的混合物注射至免疫缺陷型NSG内，以产生模拟临床复发情形的侵入性的异种移植体模型。将3种双顺反子CAR与CD19和CD22单一靶向性CAR进行了比较(图39B)。单一靶向性CAR不能够阻止白血病进展。具有CD28和4-1BB的双顺反子CAR在清除白血病方面具有非常强的活性。
利用混合的CD19neg和CD22neg白血病，在体内进行了双顺反子CAR和二价CAR的进一步的比较(图40)。双顺反子CAR在减少CD19neg和CD22neg白血病方面优于二价CAR。
双顺反子CAR的强活性
使用临床相关的CD19neg PDX模型(HMB28)测试了双顺反子CAR。PDX模型的白血病来源于先前利用CD19 CAR治疗，且复发为CD19阴性白血病复发，随后以抗CD22 CAR-T细胞治疗的患者，其由于低表达CD22的原始细胞的出现而不能清除白血病。双顺反子CAR可以完全消除原始CD19阴性白血病(图41)。
本文中引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)均通过引用并入本文中，其程度如同每篇参考文献被单独和明确地指示通过引用并入本文中以及在本文中被完整陈述。
除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种(a/an)”及“所述(the)”和“至少一个(at least one)”以及类似的指示词应解释为包括单数和复数。除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则使用术语“至少一个”接着是一系列的一个或多个项目(例如，“A和B中的至少一个”)应解释为意指从所列的项目(A或B)中选定的一个项目或者所列项目(A和B)中的两个或更多个的任意组合。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另有说明，否则在本文中叙述的数值范围仅旨在用作单独提及落入范围内的每个单独的值的简写方法，并且每个单独的值均被并入本说明书中，就像其在本文中被单独引用一样。除非在本文中另外说明或与上下文明显矛盾，否则可以以任何适当的顺序进行本文中所述的所有方法。除非另有声明，否则在本文中提供的任何和所有实例或示例性的语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言均不得解释为表明任何非要求保护的要素对实施本发明至关重要。
在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读前述描述之后，那些优选实施方案的变型对本领域技术人员来说可能变得显而易见。发明人期望技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人希望以除本文中明确描述的之外的其他的方式实施本发明。因此，本发明包括适用法律允许的本文所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非在本文中另外说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素在所有其可能变型中的任何组合。
序列表
<110> 美国卫生和人力服务部(THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BYTHE
SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES)
<120> 双顺反子嵌合抗原受体及其用途
<130> 746136
<140> CN 201880032676.5
<141> 2019-11-15
<150> PCT/US2018/032809
<151> 2018-05-15
<150> US 62/506,268
<151> 2017-05-15
<160> 88
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 45
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
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<220>
<223> 合成的
<400> 47
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1
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 48
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1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
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Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
165 170 175
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Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
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Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
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305 310 315 320
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 49
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Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
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Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly
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Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp
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Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser
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Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 50
<211> 1008
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 50
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
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<220>
<223> 合成的
<400> 51
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Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly
645 650 655
Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly
660 665 670
Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val
675 680 685
Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro
690 695 700
Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp
725 730 735
Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp
740 745 750
Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser
755 760 765
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
770 775 780
Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
785 790 795 800
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
805 810 815
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
820 825 830
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
835 840 845
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
850 855 860
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
865 870 875 880
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
885 890 895
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
900 905 910
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
915 920 925
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
930 935 940
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
945 950 955 960
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
965 970 975
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
980 985 990
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
995 1000 1005
Arg
<210> 52
<211> 1007
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp
35 40 45
Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro
50 55 60
Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp
65 70 75 80
Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro
85 90 95
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu
115 120 125
Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
165 170 175
Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys
180 185 190
Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
195 200 205
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
225 230 235 240
Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
245 250 255
Lys Ser Gly Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu
260 265 270
Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
275 280 285
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290 295 300
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
305 310 315 320
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
325 330 335
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
340 345 350
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355 360 365
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
370 375 380
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
385 390 395 400
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
405 410 415
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
420 425 430
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
435 440 445
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
450 455 460
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
465 470 475 480
Arg Arg Lys Arg Arg Gly Ser Gly Thr Pro Asp Pro Trp Gly Ser Gly
485 490 495
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Leu Glu Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val
515 520 525
Ala Ile Leu Lys Gly Val Gln Cys Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln
530 535 540
Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser
545 550 555 560
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
565 570 575
Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu
580 585 590
His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
595 600 605
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
610 615 620
Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
625 630 635 640
Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
645 650 655
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro
660 665 670
Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser
675 680 685
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro
690 695 700
Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr
705 710 715 720
Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn
725 730 735
Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp
740 745 750
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr
755 760 765
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr
770 775 780
Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn
785 790 795 800
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
805 810 815
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
820 825 830
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
835 840 845
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
850 855 860
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
865 870 875 880
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
885 890 895
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
900 905 910
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
915 920 925
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
930 935 940
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
945 950 955 960
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
965 970 975
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
980 985 990
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
995 1000 1005
<210> 53
<211> 2994
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 53
atgctgctgc tcgtgacatc tctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
attcctcagg tgcagctgca gcagtctggc cctggcctcg tgaagcctag ccagaccctg 120
agcctgacct gtgccatcag cggcgatagc gtgtccagca atagcgccgc ctggaactgg 180
atcagacaga gccctagcag aggcctggaa tggctgggcc ggacctacta ccggtccaag 240
tggtacaacg actacgccgt gtccgtgaag tcccggatca ccatcaaccc cgacaccagc 300
aagaaccagt tctccctgca gctgaacagc gtgacccccg aggataccgc cgtgtactac 360
tgcgccagag aagtgaccgg cgacctggaa gatgccttcg acatctgggg ccagggcaca 420
atggtcaccg tgtctagcgg aggcggcgga agcgacatcc agatgacaca gagccccagc 480
tccctgagcg ccagcgtggg agacagagtg accatcacct gtcgggccag ccagaccatc 540
tggtcctacc tgaactggta tcagcagcgg cctggcaagg cccccaacct gctgatctat 600
gccgccagct cactgcagag cggcgtgccc agcagatttt ccggcagagg cagcggcacc 660
gacttcaccc tgacaatcag ttccctgcag gccgaggact tcgccaccta ctactgccag 720
cagagctaca gcatccccca gaccttcggc caggggacca agctggaaat caagactagt 780
accaccaccc ctgcccctag acctcccacc ccagccccaa caattgccag ccagcctctg 840
tctctgcggc ccgaagcttg tagacctgct gccggcggag ccgtgcacac cagaggactg 900
gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc cctctggccg gcacatgtgg cgtgctgctg 960
ctgagcctgg tcatcaccct gtactgcaag cggggcagaa agaagctgct gtacatcttc 1020
aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagacc acacaggaag aggacggctg cagctgccgg 1080
ttccctgagg aagaagaagg cggctgcgaa ctgagagtga agttcagcag aagcgccgac 1140
gcccctgcct accagcaggg ccagaaccag ctgtacaacg agctgaacct gggcagacgg 1200
gaagagtacg acgtgctgga caagcggaga ggcagagatc ccgagatggg cggcaagccc 1260
agacggaaga atccccagga aggcctgtat aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag 1320
gcctacagcg agatcggaat gaagggcgag cggagaagag gcaagggcca cgatggcctg 1380
taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac acctacgatg ccctgcacat gcaggccctg 1440
cctccaagag gcagcggaga gggcagaggc agcctgctga cctgcgggga cgtggaagag 1500
aacccaggcc ccagaatgct gctcctggtc acctctctgc tgctgtgcga gctgccccac 1560
cccgcctttc tgctgatccc cgacatccag atgacccaga ccaccagcag cctgagcgcc 1620
agcctgggcg atagagtgac catcagctgc agagccagcc aggacatcag caagtacctg 1680
aactggtatc agcagaaacc cgatggcacc gtgaaactgc tgatctacca caccagcaga 1740
ctgcacagcg gcgtgcccag cagattttct ggcagcggct ccggcaccga ctacagcctg 1800
accatctcca acctggaaca ggaagatatc gctacctact tctgtcagca aggcaacacc 1860
ctgccctaca ccttcggcgg aggcaccaag ctggaaatca ccggcagcac aagcggctct 1920
ggcaagcctg gatctggcga gggctctacc aagggcgaag tgaagctgca ggaaagcggc 1980
cctggactgg tggccccatc tcagagcctg tccgtgacct gtaccgtgtc cggcgtgtcc 2040
ctgcccgatt atggcgtgtc ctggatccgg cagcctccca gaaagggcct ggaatggctg 2100
ggcgtgatct ggggcagcga gacaacctac tacaacagcg ccctgaagtc ccggctgacc 2160
atcatcaagg acaactccaa gagccaggtg ttcctgaaga tgaactccct gcagaccgac 2220
gacaccgcca tctactactg cgccaagcac tactactacg gcggcagcta cgccatggac 2280
tactggggcc agggcaccag cgtgaccgtg tcatcttccg gaaccacgac gccagcgccg 2340
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 2400
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 2460
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 2520
ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 2580
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 2640
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccaacag 2700
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 2760
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 2820
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 2880
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 2940
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 2994
<210> 54
<211> 3027
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 54
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctcca tgctgctaga 60
cctcaggtgc agctccagca gtctggccca ggactggtca agcctagcca gaccctgagc 120
ctgacctgcg ccatcagcgg cgacagcgtg tcctctaaca gcgccgcctg gaactggatc 180
agacagagcc ccagcagagg cctggaatgg ctgggccgga cctactaccg gtccaagtgg 240
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aaccagttct ccctgcagct gaacagcgtg acccctgagg acaccgccgt gtactactgc 360
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tcctacctga attggtatca gcagcggcca ggcaaggccc ctaacctgct gatctatgcc 600
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tcctacagca tccctcagac cttcggccag gggaccaagc tggaaatcaa gtccggaacc 780
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ctgaggcctg aagcttgcag gcccgctgcc ggaggagctg tccataccag gggactcgac 900
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tccctggtga tcacactgta ctgtaagagg ggcagaaaga agctgctcta catcttcaag 1020
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cctgaggagg aggagggcgg ctgcgaactg agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc 1140
cccgcttatc aacagggcca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctcgg cagaagagag 1200
gagtatgacg tgctggacaa gaggaggggc agggaccctg agatgggcgg caagcctaga 1260
agaaagaacc cccaggaagg cctctacaac gaactgcaga aggacaagat ggccgaggcc 1320
tacagcgaga tcggcatgaa aggcgagaga aggaggggaa agggacatga cggcctgtac 1380
cagggactct ccacagccac caaggacacc tacgatgccc tgcacatgca ggctctgccc 1440
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ttctccctgc tcaagcaggc tggcgatgtg gaggagaacc ccggccccct cgagatggag 1560
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atccagatga cccagaccac aagcagcctg agcgcttccc tcggcgacag ggtgaccatc 1680
tcctgtagag cctcccaaga catctccaag tacctgaact ggtaccagca gaaacccgac 1740
ggcaccgtga agctgctgat ctaccacacc agcaggctgc attccggcgt gccctccaga 1800
ttttccggca gcggctctgg taccgactac agcctcacca tcagcaactt agaacaggag 1860
gacatcgcca catatttctg ccaacaggga aacacactcc cctatacctt cggcggcggc 1920
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agcaccaagg gcgaagtgaa gctgcaggaa agcggacctg gactggtcgc tcccagccag 2040
agcctcagcg tgacctgtac agtgagcggc gtgagcctgc ctgattacgg cgtgagctgg 2100
attagacagc ctcccaggaa gggcttagaa tggctcggcg tgatttgggg cagcgagaca 2160
acctactata acagcgccct gaagagcagg ctcaccatta tcaaggacaa cagcaaatcc 2220
caggtcttcc tgaagatgaa cagcctccag accgacgaca ccgccatcta ctactgcgcc 2280
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acagtgagct ccactagtgc cgccgctatc gaagtgatgt accctcctcc ctacctggac 2400
aacgagaagt ccaacggcac catcatccac gtgaagggca agcacctgtg ccccagccct 2460
ctgttccctg gccctagcaa gcctttctgg gtgctggtgg tcgtgggcgg cgtgctggcc 2520
tgttactctc tgctggtcac agtggccttc atcatctttt gggtccgaag caagcggagc 2580
cggctgctgc acagcgacta catgaacatg acccctcgga ggccaggccc caccagaaag 2640
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<210> 55
<211> 3024
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 55
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctcca tgctgctaga 60
cctcaggtgc agctccagca gtctggccca ggactggtca agcctagcca gaccctgagc 120
ctgacctgcg ccatcagcgg cgacagcgtg tcctctaaca gcgccgcctg gaactggatc 180
agacagagcc ccagcagagg cctggaatgg ctgggccgga cctactaccg gtccaagtgg 240
tacaacgact acgccgtgtc cgtgaagtcc cggatcacca tcaaccccga caccagcaag 300
aaccagttct ccctgcagct gaacagcgtg acccctgagg acaccgccgt gtactactgc 360
gccagagaag tgaccggcga cctggaagat gccttcgaca tctggggcca gggcaccatg 420
gtcaccgtgt ctagcggagg cggcggaagc gacatccaga tgacccagag ccctagctcc 480
ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca gaccatctgg 540
tcctacctga attggtatca gcagcggcca ggcaaggccc ctaacctgct gatctatgcc 600
gccagcagcc tgcagagcgg cgtgccaagc agattctctg gcagaggctc cggcaccgac 660
ttcaccctga caatcagttc cctgcaggcc gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag 720
tcctacagca tccctcagac cttcggccag gggaccaagc tggaaatcaa gtccggagcc 780
gctgctattg aagtgatgta cccccccccc tacctggata acgagaagtc caacggcacc 840
atcatccacg tgaagggaaa gcatctgtgt cccagccctc tgttccccgg acccagcaag 900
cccttctggg tcctcgtcgt cgtgggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 960
gtcgccttca tcatcttctg ggtgaggtcc aagaggagca gactgctgca cagcgattac 1020
atgaacatga cccccagaag gcctggacct accagaaagc actaccagcc ttatgctcct 1080
cccagagact ttgccgccta cagatccaga gtgaagttta gcaggagcgc tgatgccccc 1140
gcctatcagc agggccagaa ccagctctac aacgagctga acctgggcag aagggaggaa 1200
tatgatgtgc tggacaagag aagaggcagg gaccccgaga tgggcggcaa gcctaggagg 1260
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tccgagatcg gcatgaaagg cgagaggaga aggggaaagg gacacgacgg cctgtatcaa 1380
ggcctgtcca cagccaccaa agacacctat gatgccctgc acatgcaggc tctgcctcct 1440
aggaggaaga ggaggggttc tggcacaccc gacccttggg gttctggtgc caccaacttc 1500
tccctgctga aacaggccgg agacgtcgaa gagaatcctg gacccctcga gatggagttt 1560
ggactgtcct ggctgtttct cgtcgccatc ctgaaaggcg tgcaatgctc cagagacatc 1620
caaatgaccc agacaacatc ctccctcagc gccagcctgg gcgacagagt gaccatttcc 1680
tgcagagctt cccaggacat cagcaagtac ctgaactggt atcagcagaa gcccgacggc 1740
accgtgaagc tcctcatcta tcacaccagc aggctccatt ccggcgtgcc tagcaggttc 1800
agcggaagcg gcagcggaac cgactactcc ctgaccatca gcaatttaga acaagaggat 1860
atcgccacct acttttgcca gcagggaaac acactgcctt acacctttgg cggcggcacc 1920
aaactggaga ttacaggttc tacctccggc agcggcaaac ccggaagcgg cgagggcagc 1980
acaaagggag aagtcaaact gcaggagagc ggccctggac tggtggctcc tagccagtcc 2040
ctgtccgtga cctgcacagt gagcggagtc agcctgcctg attacggcgt cagctggatt 2100
aggcagcccc ccagaaaggg actggagtgg ctcggcgtga tttggggctc cgaaaccacc 2160
tactacaact ccgctctgaa gagcaggctg accatcatta aagataactc caagtcccag 2220
gtgttcctga agatgaactc cctgcagaca gatgacaccg ccatctatta ctgcgccaag 2280
cactactact acggaggcag ctacgccatg gattactggg gccagggcac ctccgtgacc 2340
gtgtccagca ctagtaccac aacccctgct cctagacccc ctacacctgc ccccaccatt 2400
gccagccagc ccctgtccct gaggcctgaa gcctgcagac ccgctgctgg aggagctgtg 2460
cacaccaggg gactggactt cgcctgcgac atctacatct gggcccccct ggccggaacc 2520
tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc acactgtact gcaagagggg caggaaaaag 2580
ctgctctaca tcttcaagca gcctttcatg aggcctgtcc agacaaccca agaggaggat 2640
ggctgcagct gtaggttccc tgaggaggag gaaggcggct gcgagctcag agtgaaattc 2700
agcagatccg ctgatgctcc cgcttaccag cagggacaga accagctgta taacgaactg 2760
aatctgggaa ggagggagga atacgacgtg ctggataaaa ggaggggacg tgatcctgaa 2820
atgggaggca agcccagaag aaaaaatccc caggagggcc tgtataatga gctccagaaa 2880
gacaagatgg ccgaagccta ctccgagatt ggcatgaaag gagagagaag gagaggcaaa 2940
ggccatgatg gcctctacca gggcctgtcc accgctacaa aggacaccta cgacgccctc 3000
catatgcagg ccctgccccc cagg 3024
<210> 56
<211> 3027
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 56
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctcca tgctgctaga 60
cctcaggtgc agctccagca gtctggccca ggactggtca agcctagcca gaccctgagc 120
ctgacctgcg ccatcagcgg cgacagcgtg tcctctaaca gcgccgcctg gaactggatc 180
agacagagcc ccagcagagg cctggaatgg ctgggccgga cctactaccg gtccaagtgg 240
tacaacgact acgccgtgtc cgtgaagtcc cggatcacca tcaaccccga caccagcaag 300
aaccagttct ccctgcagct gaacagcgtg acccctgagg acaccgccgt gtactactgc 360
gccagagaag tgaccggcga cctggaagat gccttcgaca tctggggcca gggcaccatg 420
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tcctacctga attggtatca gcagcggcca ggcaaggccc ctaacctgct gatctatgcc 600
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ttcaccctga caatcagttc cctgcaggcc gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag 720
tcctacagca tccctcagac cttcggccag gggaccaagc tggaaatcaa gtccggaacc 780
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<210> 57
<211> 3021
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 57
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctcca tgctgctaga 60
cctcaggtgc agctccagca gtctggccca ggactggtca agcctagcca gaccctgagc 120
ctgacctgcg ccatcagcgg cgacagcgtg tcctctaaca gcgccgcctg gaactggatc 180
agacagagcc ccagcagagg cctggaatgg ctgggccgga cctactaccg gtccaagtgg 240
tacaacgact acgccgtgtc cgtgaagtcc cggatcacca tcaaccccga caccagcaag 300
aaccagttct ccctgcagct gaacagcgtg acccctgagg acaccgccgt gtactactgc 360
gccagagaag tgaccggcga cctggaagat gccttcgaca tctggggcca gggcaccatg 420
gtcaccgtgt ctagcggagg cggcggaagc gacatccaga tgacccagag ccctagctcc 480
ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca gaccatctgg 540
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tcctacagca tccctcagac cttcggccag gggaccaagc tggaaatcaa gtccggagcc 780
gctgctattg aagtgatgta cccccccccc tacctggata acgagaagtc caacggcacc 840
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gtgagctcca ctagtgccgc cgctatcgaa gtgatgtacc ctcctcccta cctggacaac 2400
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tactctctgc tggtcacagt ggccttcatc atcttttggg tccgaagcaa gcggagccgg 2580
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cacgacggac tgtatcaggg actgtccaca gccacaaaag atacctatga cgcactccat 3000
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<210> 58
<211> 7691
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 58
gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt 60
gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc 120
cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag 180
ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc 240
actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc 300
cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg 360
ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg 420
ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc 480
ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 540
cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt 600
cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt 660
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ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 780
tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 840
cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 900
aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga 960
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acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 1860
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agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 2280
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 2340
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 2400
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 2460
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 2520
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 2580
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ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 2820
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<210> 59
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 59
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
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His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
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340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
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Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
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420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
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Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
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465 470 475 480
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485 490
<210> 60
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 60
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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145 150 155 160
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
165 170 175
Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
180 185 190
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245 250 255
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260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
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305 310 315 320
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 61
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 61
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1 5 10 15
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35 40 45
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<210> 62
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 62
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1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 63
<211> 751
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 63
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
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Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val
290 295 300
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305 310 315 320
Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser
325 330 335
Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr
340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
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420 425 430
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
435 440 445
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515 520 525
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530 535 540
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
545 550 555 560
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
565 570 575
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
580 585 590
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
595 600 605
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675 680 685
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<210> 64
<211> 766
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly
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Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
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Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro
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Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr
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260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr
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Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg
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Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
325 330 335
Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser
340 345 350
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
355 360 365
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580 585 590
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595 600 605
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660 665 670
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675 680 685
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
690 695 700
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
755 760 765
<210> 65
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 65
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu
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35 40 45
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100 105 110
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130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
165 170 175
Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys
180 185 190
Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
195 200 205
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
225 230 235 240
Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
245 250 255
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
275 280 285
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
290 295 300
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
305 310 315 320
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
325 330 335
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
340 345 350
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
355 360 365
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
370 375 380
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
385 390 395 400
Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
405 410 415
Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro
420 425 430
Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu
435 440 445
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala
450 455 460
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
465 470 475 480
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
485 490 495
Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
500 505 510
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Ser Gly Thr Thr
515 520 525
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
530 535 540
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
545 550 555 560
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565 570 575
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675 680 685
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
690 695 700
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
705 710 715 720
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
725 730 735
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
740 745
<210> 71
<211> 2256
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 71
atgctgctgc tcgtgacatc tctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
attcctgata ttcagatgac ccagaccacc tccagcctgt ccgccagcct gggcgatcgc 120
gtgaccatct cttgcagagc cagccaggac atcagcaagt atctgaattg gtatcagcag 180
aaacccgacg gcaccgtgaa gctgctgatc taccacacca gcagactgca ctccggcgtg 240
ccatccagat tcagcggctc tggctccggc accgattata gcctgaccat cagcaacctg 300
gaacaggaag atatcgctac ctacttttgt cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttc 360
ggcggaggca caaaactgga aattaccggc agcaccagcg gcagcggaaa gcctggaagc 420
ggcgagggaa gcaccaaggg cgaagtgaaa ctgcaggaaa gcggacccgg actggtggcc 480
ccaagccagt ctctgagcgt gacatgtacc gtgtccggcg tgtccctgcc cgactatggc 540
gtgtcctgga tcaggcagcc ccccagaaag ggactggaat ggctgggagt gatctggggc 600
agcgagacaa cctactacaa cagcgccctg aagtccaggc tgaccattat caaggacaac 660
tccaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac agccatctac 720
tattgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggacaggga 780
acctccgtga ccgtgtcctc tggcggaggg ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 840
ggcagtgggg gcggaggaag tggcggggga ggctctcagg tgcagctgca gcagtctggc 900
cctggcctcg tgaagcctag ccagaccctg agcctgacct gtgccatcag cggcgatagc 960
gtgtccagca atagcgccgc ctggaactgg atcagacaga gccctagcag aggcctggaa 1020
tggctgggcc ggacctacta ccggtccaag tggtacaacg actacgccgt gtccgtgaag 1080
tcccggatca ccatcaaccc cgacaccagc aagaaccagt tctccctgca gctgaacagc 1140
gtgacccccg aggataccgc cgtgtactac tgcgccagag aagtgaccgg cgacctggaa 1200
gatgccttcg acatctgggg ccagggcaca atggtcaccg tgtctagcgg aggcggcgga 1260
agcgacatcc agatgacaca gagccccagc tccctgagcg ccagcgtggg agacagagtg 1320
accatcacct gtcgggccag ccagaccatc tggtcctacc tgaactggta tcagcagcgg 1380
cctggcaagg cccccaacct gctgatctat gccgccagct cactgcagag cggcgtgccc 1440
agcagatttt ccggcagagg cagcggcacc gacttcaccc tgacaatcag ttccctgcag 1500
gccgaggact tcgccaccta ctactgccag cagagctaca gcatccccca gaccttcggc 1560
caggggacca agctggaaat caagaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 1620
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 1680
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 1740
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1800
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1860
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1920
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1980
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 2040
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 2100
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 2160
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 2220
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 2256
<210> 72
<211> 2301
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 72
atgctgctgc tcgtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccctgc ctttctgctg 60
atccctcagg tgcagctgca gcagtctggc cctggcctcg tgaagcctag ccagaccctg 120
agcctgacct gtgccatcag cggcgatagc gtgtccagca atagcgccgc ctggaactgg 180
atccggcaga gcccttctag aggcctggaa tggctgggcc ggacctacta ccggtccaag 240
tggtacaacg actacgccgt gtccgtgaag tcccggatca ccatcaaccc cgacaccagc 300
aagaaccagt tctccctgca gctgaacagc gtgacccccg aggataccgc cgtgtactac 360
tgcgccagag aagtgaccgg cgacctggaa gatgccttcg acatctgggg ccagggcaca 420
atggtcaccg tgtctagcgg cagcacaagc ggctctggca agcctggatc tggcgagggc 480
tctaccaagg gcgacatcca gatgacccag agccccagca gcctgtctgc cagcgtgggc 540
gacagagtga ccatcacctg tagggccagc cagaccatct ggtcctacct gaactggtat 600
cagcagaggc ccggcaaggc ccccaacctg ctgatctatg ccgcctccag tctgcagagc 660
ggcgtgccca gcagattcag cggcagaggc agcggcaccg acttcaccct gaccattagt 720
agtctgcagg ccgaggactt cgccacctac tactgccagc agagctacag catcccccag 780
accttcggcc aggggaccaa gctggaaatc aagggcggag gcggaagtgg cggcggagga 840
tctgggggag gcggatcagg cggagggggc tcaggggggg gaggctctga tattcagatg 900
acacagacca cctccagcct gagcgcctct ctgggagatc gcgtgacaat ctcctgccgc 960
gccagccagg acatcagcaa gtatctgaat tggtatcagc agaaacccga cggcaccgtg 1020
aagctgctga tctaccacac cagcagactg cactccggcg tgccatccag attttccggc 1080
agcggctccg gcaccgatta tagcctgacc atcagcaacc tggaacagga agatatcgct 1140
acctactttt gtcagcaagg caacaccctg ccctacacct tcggcggagg cacaaaactg 1200
gaaattaccg gctccaccag cggcagcgga aagcctggaa gcggagaggg aagcacaaag 1260
ggcgaagtga aactgcagga aagcggaccc ggactggtgg ccccaagcca gtctctgagc 1320
gtgacatgta ccgtgtccgg cgtgtccctg cccgactatg gcgtgtcctg gatcagacag 1380
ccccccagaa agggactgga atggctggga gtgatctggg gcagcgagac aacctactac 1440
aacagcgccc tgaagtccag gctgacaatc atcaaggaca actccaagag ccaggtgttc 1500
ctgaagatga attccctgca gaccgacgac acagccatct actattgcgc caagcactac 1560
tactacggcg gcagctacgc catggactac tggggacagg gaacctccgt gaccgtgtcc 1620
tcttccggaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 1680
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 1740
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1800
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1860
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1920
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1980
agcgcagacg cccccgcgta ccaacagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 2040
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 2100
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 2160
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 2220
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 2280
caggccctgc cccctcgcta a 2301
<210> 73
<211> 2250
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 73
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctcca tgctgctaga 60
cctcaggtgc agctccagca gtctggccca ggactggtca agcctagcca gaccctgagc 120
ctgacctgcg ccatcagcgg cgacagcgtg tcctctaaca gcgccgcctg gaactggatc 180
agacagagcc ccagcagagg cctggaatgg ctgggccgga cctactaccg gtccaagtgg 240
tacaacgact acgccgtgtc cgtgaagtcc cggatcacca tcaaccccga caccagcaag 300
aaccagttct ccctgcagct gaacagcgtg acccctgagg acaccgccgt gtactactgc 360
gccagagaag tgaccggcga cctggaagat gccttcgaca tctggggcca gggcaccatg 420
gtcaccgtgt ctagcggagg cggcggaagc gacatccaga tgacccagag ccctagctcc 480
ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca gaccatctgg 540
tcctacctga attggtatca gcagcggcca ggcaaggccc ctaacctgct gatctatgcc 600
gccagcagcc tgcagagcgg cgtgccaagc agattctctg gcagaggctc cggcaccgac 660
ttcaccctga caatcagttc cctgcaggcc gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag 720
tcctacagca tccctcagac cttcggccag gggaccaagc tggaaatcaa gggtggcgga 780
ggatctggcg gcggtggtag tggcggcgga ggttcaggtg gtggcggctc cgatattcag 840
atgacacaga ccacctccag cctgtccgcc tccctgggag atagagtgac aatctcctgc 900
agggcctccc aggacatcag caagtatctc aactggtacc agcagaaacc cgacggcacc 960
gtgaagctgc tcatctacca caccagcaga ctgcactccg gcgtgccctc tagattttcc 1020
ggctctggca gcggcacaga ctactccctg accatctcca acctggaaca ggaagatatc 1080
gctacttact tctgtcagca aggcaacacc ctgccctaca ccttcggcgg aggcacaaaa 1140
ctggaaatta ccggcagcac cagcggcagc ggaaagcctg gaagcggcga gggctctacc 1200
aagggcgaag tgaaactgca ggaaagcggc cctggcctgg tggccccttc tcagtctctg 1260
tccgtgacct gtaccgtgtc tggcgtgtcc ctgcccgatt acggcgtgtc ctggatcagg 1320
cagcctcccc ggaaaggact cgaatggctc ggcgtgatct ggggcagcga gacaacctac 1380
tacaacagcg ccctgaagtc caggctgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaggtg 1440
ttcctgaaga tgaactctct gcagaccgac gataccgcca tctattattg cgccaagcac 1500
tactactacg gcggcagcta cgccatggac tactggggac agggaacctc cgtgaccgtg 1560
tccagtacta gttccggaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 1620
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 1680
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 1740
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1800
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1860
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1920
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac caacagggcc agaaccagct ctataacgag 1980
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 2040
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 2100
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 2160
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 2220
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 2250
<210> 74
<211> 2247
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 74
atgctgctgc tcgtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccctgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc agcagcctga gcgccagcct gggcgataga 120
gtgaccatca gctgcagagc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aaacccgacg gcaccgtgaa gctgctgatc taccacacca gcagactgca cagcggcgtg 240
cccagcagat tttctggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgctac ctacttctgt cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttc 360
ggcggaggca ccaagctgga aatcacaggc ggcggaggat ccggcggcgg aggatccggc 420
ggcggaggat cccaggtgca gctgcagcag tctggacccg gcctcgtgaa gcctagccag 480
accctgtctc tgacctgcgc catcagcggc gatagcgtgt ccagcaatag cgccgcctgg 540
aactggatcc ggcagagccc ttctagaggc ctggaatggc tgggccggac ctactaccgg 600
tccaagtggt acaacgacta cgccgtgtcc gtgaagtccc ggatcaccat caaccccgac 660
accagcaaga accagttctc cctgcagctg aacagcgtga cccccgagga taccgccgtg 720
tactactgcg ccagagaagt gaccggcgac ctggaagatg ccttcgacat ctggggccag 780
ggcacaatgg tcaccgtgtc tagcggggga ggcggcagcg atattcagat gacacagagc 840
ccctccagcc tgtccgcctc tgtgggagac agagtgacaa tcacctgtcg ggcctcccag 900
accatctggt cctatctgaa ttggtatcag cagcggcctg gcaaggcccc caacctgctg 960
atctatgccg ccagctctct gcagtccggc gtgccatcta gattcagcgg cagaggcagc 1020
ggcaccgatt tcaccctgac aattagcagt ctgcaggccg aggacttcgc cacctactat 1080
tgccagcaga gctacagcat cccccagacc ttcggccagg gaacaaaact ggaaatcaaa 1140
gggggaggcg gcagcggggg aggcggcagc gggggaggcg gcagcgaagt gaaactgcag 1200
gaatctggcc ctggcctggt ggccccaagc cagtctctga gcgtgacctg taccgtgtct 1260
ggcgtgtccc tgcccgatta cggcgtgtcc tggatcagac agccccccag aaagggactg 1320
gaatggctgg gagtgatctg gggcagcgag acaacctact acaacagcgc cctgaagtcc 1380
aggctgacca tcatcaagga caactccaag agccaggtgt tcctgaagat gaattccctg 1440
cagaccgacg acaccgccat ctattactgt gccaagcact actactacgg cggcagctac 1500
gccatggact actggggaca gggaacctcc gtgaccgtgt cctctactag ttccggaacc 1560
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 1620
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tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1800
caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1860
ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1920
cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1980
gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 2040
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 2100
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 2160
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 2220
cctcgcggat cctaatgatc agtcgac 2247
<210> 75
<211> 2274
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 75
atgctgctgc tcgtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccctgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc agcagcctga gcgccagcct gggcgataga 120
gtgaccatca gctgcagagc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aaacccgacg gcaccgtgaa gctgctgatc taccacacca gcagactgca cagcggcgtg 240
cccagcagat tttctggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgctac ctacttctgt cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttc 360
ggcggaggca ccaagctgga aatcacaggc ggctgcggat ccggcggcgg aggatccggc 420
ggcggaggat cccaggtgca gctgcagcag tctggacccg gcctcgtgaa gcctagccag 480
accctgtctc tgacctgcgc catcagcggc gatagcgtgt ccagcaatag cgccgcctgg 540
aactggatcc ggcagagccc ttctagaggc ctggaatggc tgggccggac ctactaccgg 600
tccaagtggt acaacgacta cgccgtgtcc gtgaagtccc ggatcaccat caaccccgac 660
accagcaaga accagttctc cctgcagctg aacagcgtga cccccgagga taccgccgtg 720
tactactgcg ccagagaagt gaccggcgac ctggaagatg ccttcgacat ctggggccag 780
ggcacaatgg tcaccgtgtc tagcggcagc acaagcggct ctggcaagcc tggatctggc 840
gagggctcta ccaagggcga tattcagatg acacagagcc cctccagcct gtccgcctct 900
gtgggagaca gagtgacaat cacctgtcgg gcctcccaga ccatctggtc ctatctgaat 960
tggtatcagc agcggcctgg caaggccccc aacctgctga tctatgccgc cagctctctg 1020
cagtccggcg tgccatctag attcagcggc agaggcagcg gcaccgattt caccctgaca 1080
attagcagtc tgcaggccga ggacttcgcc acctactatt gccagcagag ctacagcatc 1140
ccccagacct tcggccaggg aacaaaactg gaaatcaaag ggggaggcgg cagcggggga 1200
ggcggcagcg ggggatgcgg cagcgaagtg aaactgcagg aatctggccc tggcctggtg 1260
gccccaagcc agtctctgag cgtgacctgt accgtgtctg gcgtgtccct gcccgattac 1320
ggcgtgtcct ggatcagaca gccccccaga aagggactgg aatggctggg agtgatctgg 1380
ggcagcgaga caacctacta caacagcgcc ctgaagtcca ggctgaccat catcaaggac 1440
aactccaaga gccaggtgtt cctgaagatg aattccctgc agaccgacga caccgccatc 1500
tattactgtg ccaagcacta ctactacggc ggcagctacg ccatggacta ctggggacag 1560
ggaacctccg tgaccgtgtc ctctactagt tccggaacca cgacgccagc gccgcgacca 1620
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 1680
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 1740
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 1800
tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1860
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1920
tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1980
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 2040
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 2100
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 2160
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2220
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgcggatc ctaa 2274
<210> 76
<211> 2235
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 76
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60
cccgatatcc agatgaccca gaccaccagc agcctgagcg ccagcctggg cgatagagtg 120
accatcagct gccgggccag ccaggacatc agcaagtacc tgaactggta tcagcagaaa 180
cccgacggca ccgtgaagct gctgatctac cacaccagca gactgcacag cggcgtgccc 240
agcagatttt ctggcagcgg ctccggcacc gactacagcc tgaccatctc caacctggaa 300
caggaagata tcgctaccta cttctgtcag caaggcaaca ccctgcccta caccttcggc 360
ggaggcacca agctggaaat cacaggcggc ggaggatctg gcggaggcgg atctcaggtc 420
cagctccagc agtctggacc cggcctggtc aagcctagcc agaccctgag cctgacctgc 480
gccatcagcg gcgacagcgt gtcctctaac agcgccgcct ggaattggat cagacagagc 540
cccagcagag gcctggaatg gctgggccgg acctactacc ggtccaagtg gtacaacgac 600
tacgccgtgt ccgtgaagtc ccggatcacc atcaaccccg acaccagcaa gaaccagttc 660
tccctgcagc tgaacagcgt gacccctgag gacaccgccg tgtactactg cgccagagaa 720
gtgaccggcg acctggaaga tgccttcgac atctggggcc agggcaccat ggtcaccgtg 780
tctagcggca gcacaagcgg ctctggcaag cctggaagcg gcgagggctc taccaagggc 840
gacattcaga tgactcagag cccctccagc ctgtccgcct ctgtgggaga cagagtgaca 900
atcacctgta gagcctccca gaccatctgg tcctatctca attggtacca gcagcggcca 960
ggcaaggccc ctaacctgct catctatgcc gcctctagcc tgcagtccgg cgtgccatct 1020
agattcagcg gcaggggcag cggcaccgat ttcaccctga caatcagttc cctgcaggcc 1080
gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag tcctacagca tccctcagac cttcggccag 1140
ggaacaaagc tcgaaatcaa aggtggtggt ggcagtggtg gcggcggaag cgaagtgaaa 1200
ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc ccttctcagt ctctgtccgt gacctgtacc 1260
gtgtctggcg tgtccctgcc cgattacggc gtgtcctgga tcaggcagcc accccggaaa 1320
ggactcgaat ggctcggcgt gatctggggc agcgagacaa cctactacaa cagcgccctg 1380
aagtccaggc tgaccatcat caaggacaac tccaagagcc aggtgttcct gaagatgaac 1440
agcctgcaga ccgacgatac cgccatctat tactgtgcca agcactacta ctacggcggc 1500
agctacgcca tggactactg gggacaggga acctccgtga ccgtgtccag tactagttcc 1560
ggaaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 1620
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 1680
ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 1740
ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 1800
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1860
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 1920
gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1980
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 2040
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 2100
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 2160
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 2220
ctgccccctc gctaa 2235
<210> 77
<211> 2238
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 77
atgctgctgc tggtcacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
attcctcagg tccagctgca gcagtctggc cctggcctgg tcaagcctag ccagaccctg 120
agcctgacct gcgccatcag cggcgacagc gtgtcctcta acagcgccgc ctggaactgg 180
atcagacaga gccccagcag aggcctggaa tggctgggcc ggacctacta ccggtccaag 240
tggtacaacg actacgccgt gtccgtgaag tcccggatca ccatcaaccc cgacaccagc 300
aagaaccagt tctccctgca gctgaacagc gtgacccctg aggacaccgc cgtgtactac 360
tgcgccagag aagtgaccgg cgacctggaa gatgccttcg acatctgggg ccagggcacc 420
atggtcaccg tgtctagcgg aggcggagga agtggcggcg gaggcagcga tatccagatg 480
acccagacca ccagcagcct gagcgccagc ctgggcgata gagtgaccat ctcctgccgg 540
gccagccagg acatcagcaa gtacctgaat tggtatcagc agaagcccga cggcaccgtc 600
aagctgctga tctaccacac cagcagactg cacagcggcg tgcccagcag attttctggc 660
agcggctccg gcaccgacta cagcctgacc atcagcaacc tggaacagga agatatcgct 720
acctacttct gtcagcaagg caacaccctg ccctacacct tcggaggcgg caccaagctg 780
gaaatcaccg gcagcacaag cggcagcggc aagcctggat ctggcgaggg ctctaccaag 840
ggcgaagtga agctgcagga aagcggaccc ggactggtgg cccctagcca gtctctgtct 900
gtgacctgta ccgtgtccgg cgtgtccctg cccgattatg gcgtgtcctg gatcaggcag 960
cctccccgga aaggactcga atggctcggc gtgatctggg gcagcgagac aacctactac 1020
aacagcgccc tgaagtccag gctgacaatc atcaaggaca actccaagag ccaggtgttc 1080
ctgaagatga acagcctgca gaccgacgat accgccatct actattgtgc caagcactac 1140
tactacggcg gcagctacgc catggactac tggggacagg gaacctccgt gaccgtcagt 1200
agtggtggtg gcggatctgg tggaggcggc tccgacattc agatgactca gagcccttcc 1260
agcctgtccg cctctgtggg agacagagtg acaatcacct gtagagcctc ccagaccatc 1320
tggtcctatc tcaactggta ccagcagcgg ccaggcaagg cccctaacct gctcatctat 1380
gccgcctcta gcctgcagtc cggggtgccc tctagattca gcggcagagg aagcggcacc 1440
gatttcaccc tgacaattag ctcactgcag gccgaggact tcgccaccta ttactgccag 1500
cagagctaca gcatccctca gaccttcggc cagggaacaa agctcgaaat caagactagt 1560
tccggaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 1620
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 1680
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 1740
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1800
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1860
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1920
gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1980
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 2040
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 2100
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 2160
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 2220
gccctgcccc ctcgctaa 2238
<210> 78
<211> 2244
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 78
atgctgctgc tggtcacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc agcagcctga gcgccagcct gggcgataga 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gcagactgca cagcggcgtg 240
cccagcagat tttctggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgctac ctacttctgt cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttc 360
ggcggaggca ccaagctgga aatcacaggc ggcggaggat ctggcggagg cggaagttgt 420
ggtggcggat ctcaggtcca gctgcagcag agtggccctg gcctggtcaa gcctagccag 480
accctgagcc tgacctgcgc catcagcggc gacagcgtgt cctctaacag cgccgcctgg 540
aattggatca gacagagccc cagcagaggc ctggaatggc tgggccggac ctactaccgg 600
tccaagtggt acaacgacta cgccgtgtcc gtgaagtccc ggatcaccat caaccccgac 660
accagcaaga accagttctc cctgcagctg aacagcgtga cccctgagga caccgccgtg 720
tactactgcg ccagagaagt gaccggcgac ctggaagatg ccttcgacat ctggggccag 780
ggcaccatgg tcaccgtcag tagtggaggc ggtggcagcg gtggcggcgg aagcgatatt 840
cagatgactc agagcccctc cagcctgtcc gcctctgtgg gagacagagt gacaatcacc 900
tgtagagcct cccagaccat ctggtcctat ctcaattggt accagcagcg gccaggcaag 960
gcccctaacc tgctcatcta tgccgcctct agcctgcagt ccggcgtgcc atctagattc 1020
agcggcagag gcagcggcac cgatttcacc ctgacaatca gttccctgca ggccgaggac 1080
ttcgccacct actattgcca gcagagctac agcatccctc agaccttcgg ccagggaaca 1140
aagctcgaaa tcaaaggtgg aggcggctgc ggaggtggtg gatctggagg cggaggctcc 1200
gaagtgaagc tgcaggaaag cggcccagga ctggtggccc ctagccagtc tctgtccgtg 1260
acctgtaccg tgtctggcgt gtccctgccc gattacggcg tgtcctggat caggcagcca 1320
ccccggaaag gactcgaatg gctcggcgtg atctggggca gcgagacaac ctactacaac 1380
agcgccctga agtccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca ggtgttcctg 1440
aagatgaaca gcctgcagac cgacgatacc gccatctatt actgtgccaa gcactactac 1500
tacggcggca gctacgccat ggactactgg ggacagggaa cctccgtgac cgtgtccagt 1560
actagttccg gaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 1620
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 1680
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 1740
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1800
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1860
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1920
aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1980
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 2040
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 2100
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 2160
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 2220
atgcaggccc tgccccctcg ctaa 2244
<210> 79
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 79
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 81
Gly Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Gly Ser
1 5 10 15
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 83
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 84
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 85
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 86
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Ser Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 87
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 87
Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly Val
1 5 10 15
Gln Cys Ser Arg
20
<210> 88
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20

Claims (12)

1.嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体，其中所述CAR氨基酸构建体的氨基酸序列如SEQID NO:48、49、50、51或52所示。
2.如权利要求1所述的CAR氨基酸构建体，其中所述CAR氨基酸构建体的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示。
3.如权利要求1所述的CAR氨基酸构建体，其中所述CAR氨基酸构建体的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示。
4.如权利要求1所述的CAR氨基酸构建体，其中所述CAR氨基酸构建体的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。
5.如权利要求1所述的CAR氨基酸构建体，其中所述CAR氨基酸构建体的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示。
6.如权利要求1所述的CAR氨基酸构建体，其中所述CAR氨基酸构建体的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示。
7.核酸，其包含编码权利要求1-6中任一项所述的CAR氨基酸构建体的核苷酸序列。
8.分离的宿主细胞，其包含含有权利要求7所述的核酸的重组表达载体。
9.细胞群，其包含权利要求8所述的宿主细胞。
10.药物组合物，其包含权利要求8所述的宿主细胞或权利要求9所述的细胞群，以及药学上可接受的载体。
11.权利要求8所述的宿主细胞或权利要求9所述的细胞群在制备用于治疗哺乳动物的癌症的药物中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述癌症为血液恶性肿瘤。
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