JP2022553818A - 二重標的キメラ抗原レセプターｔ細胞療法のためのプロテアーゼスイッチ - Google Patents

Abstract

本発明は、キメラ抗原レセプター、ＣＡＲを含むＴ細胞、ＣＡＲの製造方法、癌及び／又は免疫疾患の治療のためのＣＡＲの及びＴ細胞の使用方法に関する。特定の実施形態において、方法は、標的細胞の異なる抗原を標的とする、ＣＡＲを含むＴ細胞を用いることを含む。さらに特定の実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＮＳ３プロテアーゼドメインと切断部位とを含み、カスタマイズされたＣＡＲ－Ｔ細胞療法について、ＮＳ３ドメインは、小分子インヒビターにより阻害される。

Description

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本出願は、２０１９年１０月３０日出願の米国仮出願第６２／９２７，８９８号の優先権を主張するものであり、全ての図表、アミノ酸又は核酸配列を含む全内容を参照することにより組み込まれる。
本出願の配列表は、２０２０年１０月２９日に作成され、１０５３ＫＢである「Seq－List.txt」とラベル付けされたものである。配列表の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本段落は、本発明の様々な態様の理解を容易にするための背景情報について述べる。本書の本段落の記載はこの点に鑑みて読むものとし、先行技術を容認するものではないものとする。

腫瘍抗原を標的とするように遺伝子操作された自己細胞を利用した養子Ｔ細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療に革命をもたらした。腫瘍抗原を標的とする合成キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を形質導入して、腫瘍抗原を発現する腫瘍に向けてそれらを標的化するために使用されてきた。

ＣＡＲを発現するＴ細胞は、遺伝子工学によって生成され、（１）腫瘍標的に対する、免疫グロブリンの細胞質外可変フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、（２）細胞内Ｔ細胞レセプター活性化分子（例えば、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ））、及び（３）正の共刺激分子、例えば、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢからなる活性化レセプターを有する患者の免疫能力のあるＴ細胞を武装化（arm）するように設計される。患者から得られたＴ細胞を、ベクター、例えば、上記エレメントをコードする所望のＤＮＡ配列を、形質導入されたＴ細胞のゲノムに転写するレトロ又はレンチウイルスベクターで形質転換し、外因性のＣＡＲのエレメントが、形質導入されたＴ細胞において発現される。これらのエレメントの発現は、一般に、ＣＡＲエレメントの連続的発現を提供する構成的プロモーター、又は誘導剤が存在する場合にのみＣＡＲエレメントの発現を提供する誘導性プロモーターのいずれかによって制御される。あるいは、プロモーターが内因性に調節され、内因性プロモーターによって通常制御されるタンパク質が発現される場合はいつでも、ＣＡＲエレメントの発現を提供する。一般に、高レベルのタンパク質を誘導する強力なプロモーターは、遺伝子操作された細胞において望ましい。

大半の免疫能力のあるＴ細胞はＣＡＲの発現のために使用されるが、ＣＤ３－ゼータ及び共刺激ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢ分子によって活性化できる任意の免疫細胞を用いてＣＡＲを発現させることができる。

ＣＡＲを発現する患者の遺伝子操作されたＴ細胞は、例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）制限なしに腫瘍標的を認識し、細胞傷害性エフェクター機構を介して標的を破壊することが可能である。

さらに、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞は、造血幹細胞ドナーのリンパ球で生成でき、例えば、同種移植後再発において使用することができる。

ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いる治療方法は、患者の新たに生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞が静脈内注入後に戻る余地を作るために、患者のＴ細胞をリンパ枯渇させることを含む。免疫枯渇はさらに、残存腫瘍量の減少、炎症の誘導、腫瘍抗原の放出、及び、新たに注入され操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を抑制する制御性Ｔ細胞の数の減少を引き起こす可能性がある。さらに、ＣＡＲのいずれかのエレメントが非ヒト起源である場合、リンパ枯渇もまた、このＣＡＲエレメントに対する免疫化のリスクを低下させる可能性がある。ＣＡＲの構築におけるヒト化免疫グロブリンの可変フラグメントの使用もまた、ＣＡＲに対する免疫化のリスクを低下させることを助長し得る。

患者への注入後にＣＡＲ－Ｔ細胞を制御できないことから、安全性の懸念がある。例えば、臨床試験中にオンターゲット／オフ腫瘍及びオフターゲット抗原認識が一部の患者で観察された。さらに、in vivoでの制御不能なＣＡＲ－Ｔ細胞作用は、サイトカイン放出症候群及びＣＡＲ－Ｔ関連脳症症候群を含む重篤な有害事象を生じる可能性がある。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の２つの主な安全性の懸念は、サイトカイン放出症候群と、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞関連脳症症候群のような神経毒性である。残念ながら、サイトカイン放出症候群は、比較的頻度が高く、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けている患者の約５０％～１００％に起こりうる。さらに、Ｔ細胞、一般に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の広範な活性化は、Ｔ細胞死、すなわち、ＣＡＲ－Ｔ集団の枯渇を特異的に導く。患者への注入後のＣＡＲ－Ｔ細胞の寿命を延ばすためには、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化を制御することが望ましい。これらの安全性及び有効性の懸念は、ＣＡＲ－Ｔ活性化、増殖を制御することができず、より重要なのは、治療用ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を終了できないことである。従って、治療用ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲの時間的及び空間的制御によって、この重要な技術の安全性及び有効性プロファイルを改善することができ、ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＡＲの発現レベルを微調整することによって、例えば、過剰なサイトカイン放出及びＣＡＲ－Ｔ細胞枯渇を抑制することができる。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＡＲ微調整を可能にすることにより、ＣＡＲ発現を寛解中にオフにし、疾患再発の場合はオンに戻すことができる。

ＣＡＲ－Ｔ療法のさらなる問題は、標的細胞上の抗原発現の喪失に関連するＣＡＲ－Ｔ細胞療法後の応答の欠如又は低応答及び再発である。従って、２つ以上の抗原を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の使用は、この問題に対処するのに有用である。このように、安全性と有効性の懸念及び潜在的な標的細胞抵抗に対処できる新たなＣＡＲ－Ｔ細胞療法を開発する必要がある。

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本発明は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）Ｔ細胞系、この製造方法、及び標的免疫細胞で治療できる疾患の療法のための使用を提供する。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞系は、遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現を微調整するために使用できる、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造タンパク質３（ＮＳ３）プロテアーゼドメインに基づく誘導性スイッチ設計を含む。この設計により、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の安全性及び効力は、実質的に改善される。

利点を挙げると、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞系のＮＳ３プロテアーゼドメインがＣＡＲ発現を最大限に制御し、そのような存在が望ましくない場合に患者におけるＣＡＲ存在を回避するための手段として、形質導入されたＴ細胞におけるＣＡＲのデフォルトの自己タンパク質分解を提供する。

対照的に、ＣＡＲ発現が望ましい場合、小分子インヒビターを投与して、ＮＳ３ドメインのタンパク質分解活性を阻害し、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上でのＣＡＲの発現を導くＣＡＲ自己タンパク質分解をブロックすることができる。さらに、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞で治療した対象への小分子インヒビターの用量依存的投与は、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞によるＣＡＲ発現のレベルの微調整を可能にし、例えば、標的細胞の残存負荷及び／又はサイトカイン放出症候群などの有害事象の発生に従って調整することができる。

利点を挙げると、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞系は、癌及び／又は免疫障害を治療するための癌及び／又は免疫障害関連抗原を含むがこれらに限定されない、種々の疾患関連抗原に対する種々の単鎖可変フラグメントを含むことができる。

さらに、療法効率を改善し、有害事象のリスクを低下させるために、同じ又は異なる標的細胞上の少なくとも２つの標的抗原を同時に標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞系が提供される。

例えば、一実施形態において、本発明は、ＣＤ１９－ＣＡＲ及びＣＤ２２－ＣＡＲ「カクテル」及び／又はＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞「カクテル」を提供して、Ｂ細胞白血病の高効率治療を提供する。

利点を挙げると、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞系は、安全スイッチと二重標的設計とを組み合わせることである。例えば、この戦略は、ＣＤ１９とＣＤ２２の両方を同時に標的とし、Ｂ細胞悪性腫瘍に対するより広範なカバーを可能にし、抗原喪失によって引き起こされる再発を減少させ、療法効率を改善する。さらに、新規なプロテアーゼスイッチ系は、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性の正確な調節を提供し、ＣＡＲ発現を停止させることができるので、in vivoでＣＡＲ－Ｔ細胞消耗の回避を可能にして、患者におけるＣＡＲ－Ｔ細胞過剰活性化を防止し、ＣＡＲ－Ｔ細胞寿命を延ばす。このように、この新規なＣＡＲ－Ｔ細胞系は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の安全性と効力を増加させるものである。

本特許又は出願書類は，色を付して作成された少なくとも１の図面を含んでいる。本特許又は特許出願公開の写しであって、色図面のものは、特許庁が要求し、かつ、必要な手数料を納付したときに提供される。

図１Ａ～１Ｃは、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞系を示す。図１Ａは、ＣＡＲ－腫瘍抗原（ＴＡＡ）結合事象を介して相互作用する標的細胞及びＴ細胞を示す。図１Ｂは、ＮＳ３インヒビターアスナプレビル（ＡＳＶ）の非存在下及び存在下での「オフ」及び「オン」状態における本発明のＣＡＲの詳細を示す。図１Ｃは、第１の切断部位（１ＣＳ）、第２の切断部位（２ＣＳ）、及び両方の切断部位を有する本発明のＮＳ３－ＣＡＲ構築物を示す。黄色の線は、ＮＳ３切断部位を示し、赤色の矢印は、アスナプレビル非存在下でのＮＳ３プロテアーゼの切断作用を示す。 図２は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するためのＴ細胞の形質導入に使用される対照ＣＡＲ（上）及びＮＳ３スイッチ－ＣＡＲ（下）のＣＡＲカセットを示す。 図３は、形質導入されていない細胞、ＣＤ１９－ＣＡＲ形質導入細胞、アスナプレビル処理なしでＮＳ３－ＣＤ１９－ＣＡＲで形質導入された細胞、及びアスナプレビル処理ありのＮＳ３－ＣＤ１９－ＣＡＲで形質導入された細胞におけるＣＤ１９－ＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析を示す。 図４Ａ～４Ｂは、増加するアスナプレビル濃度の存在下でのＣＡＲ形質導入細胞におけるＣＡＲ発現レベルを示す。図４Ａは、フローサイトメトリーによって求められたＣＡＲ発現を示す。図４Ｂは、異なる時点及び異なる濃度のアスナプレビルの存在下でのＣＡＲ発現細胞のパーセンテージを示す。 図５Ａ～５Ｂは、アスナプレビルの離脱時のＣＡＲ形質導入細胞におけるＣＡＲ発現レベルを示す。図５Ａは、アスナプレビル離脱の２４時間後及び４８時間後のＣＡＲ発現に関するフローサイトメトリーデータを示す。図５Ｂは、アスナプレビルの存在下での２４時間及び４８時間でのＣＡＲ発現に関するフローサイトメトリーデータを示す。 図６Ａ～６Ｂは、アスナプレビルの存在下及び非存在下におけるＣＡＲ形質導入細胞の細胞死及びＣＤ４／ＣＤ８プロファイルを示す。図６Ａは、アスナプレビルの存在下及び非存在下での非導入細胞、ＣＤ１９－ＣＡＲ導入細胞及びＮＳ３－ＣＤ１９ＣＡＲを導入した細胞のアネキシンＶ発現及びプロピジウムヨード染色に関するフローサイトメトリーデータを示す。 図６Ｂは、アスナプレビルの存在下及び非存在下での非形質導入細胞、ＣＤ１９－ＣＡＲ形質導入細胞及びＮＳ３－ＣＤ１９ＣＡＲを形質導入した細胞上のＣＤ４及びＣＤ８発現に関するフローサイトメトリーデータを示す。 図７は、プラスミドＰＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＮＳ３ＷＴのマップを示す。 図８は、プラスミドＰＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＮＳ３Ｔ５４Ａのマップを示す。 図９は、プラスミドＰＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＮＳ３１ＣＳのマップを示す。 図１０は、プラスミドＰＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＮＳ３２ＣＳのマップを示す。 図１１は、プラスミドＰＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＮＳ３ＡＩのマップを示す。 図１２は、プラスミドＰＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＮＳ３ＴＩのマップを示す。 図１３は、プラスミドＰＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＮＳ３ダブルスイッチ１のマップを示す。 図１４は、プラスミドＰＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＮＳ３ダブルスイッチ２のマップを示す。

提供されるのは、キメラ－抗原－レセプター（ＣＡＲ）Ｔ細胞系、その製造方法、腫瘍及び他の疾患の療法のためにこれらの系の使用である。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞系は、タンパク質機能の化学遺伝学的制御を使用して、カスタマイズされた信頼性のあるオン効果及びオフ効果の両方を達成する。本発明の誘導性スイッチ設計は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質３（ＮＳ３）プロテアーゼドメインに基づくものであり、ＮＳ３ドメインは特異的切断部位で自己切断する。

本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞系のＮＳ３プロテアーゼドメインは、ＣＡＲ構築物内に局在化されて、ＮＳ３プロテアーゼの自己タンパク質分解活性がデフォルトでＣＡＲ構築物を切断する。対照的に、ＮＳ３タンパク質分解活性をブロックする小分子インヒビターの存在下で、本発明の操作されたＣＡＲは、ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞の表面上で発現される。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞系は、形質導入されたＴ細胞上でのＣＡＲ発現の用量依存性誘導、及び小分子インヒビターの離脱に際して、Ｔ細胞からのＣＡＲの除去を可能にする。従って、この新規な調節ＣＡＲ－Ｔ細胞系は、形質導入されたＴ細胞上のＣＡＲの発現によるカスタマイズされたＣＡＲ－Ｔ細胞療法を可能にし、さらにＣＡＲ形質導入されたＴ細胞の維持を可能にする。

本発明の特定の実施形態において、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、（１）腫瘍標的又は免疫細胞標的に対して指向される免疫グロブリンの細胞質外可変フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、（２）ＮＳ３プロテアーゼドメイン、（３）ヒンジ領域、（４）膜貫通ドメイン、（５）例えば、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢ由来の少なくとも１つの正の共刺激分子ドメイン、及び（６）例えば、ＣＤ３－ゼータ由来の細胞内Ｔ細胞レセプター活性化分子ドメインを含む活性化レセプターを、患者の免疫能力のあるＴ細胞を武装化する遺伝子工学によって生成される。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞レセプターの細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用して操作される。他の実施形態において、Ｔ細胞レセプターの細胞内シグナル伝達ドメイン全体の一部を使用することができる。ＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される際、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用される。特定の実施形態において、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲのエフェクター機能シグナルを形質導入することができる細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分である。

本発明のＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル形質導入ドメインの例としては、抗原レセプター連結後にシグナル形質導入を開始するＴ細胞レセプター及びコレセプターの細胞質配列、これらの配列の任意の誘導体又は変異体、同等の機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、二次又は共刺激シグナルをさらに含む。共刺激シグナル伝達部分は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの領域のことである。共刺激分子とは、抗原レセプター又はその配位子以外の細胞表面分子であり、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要である。

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化は、２つの異なる部類の細胞内シグナル伝達配列によって媒介される。すなわち、ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞内シグナル伝達配列）及び二次シグナル又は補助刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの（二次細胞内シグナル伝達配列）である。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメイン、及び、任意で、ＣＡＲに関して有用な任意の他の所望の細胞質ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータ鎖部分及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む。共刺激シグナル伝達ドメインを誘導し、本発明のＣＡＲの生成に用いることができる共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＴＮＦＳＦ１４、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ１３２、及びＩＬＲβ（ＣＤ１２２）が挙げられるが、これらに限定されない。補助刺激シグナル伝達エレメント（共刺激シグナル伝達ドメイン）としてのＣＤ２８及び４－１ＢＢの使用は実施例で例示されるが、他の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＴＮＦＳＦ１４、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ１３２、及びＩＬＲβ（ＣＤ１２２））を使用することができ、本発明の範囲内である。

好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない、１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ８－アルファヒンジ領域、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＩｇＧ４ｍヒンジ領域、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域を含むが、これらに限定されないヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＩｇＧ４ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ及びスペーサー、ＩｇＧ２ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ及びスペーサー、又はＩｇＧ１ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ及びスペーサーを含むが、これらに限定されないヒンジ領域及びスペーサーを含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ８－アルファ膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ３－ゼータ膜貫通ドメイン、又はＩＣＯＳ膜貫通ドメインを含むがこれらに限定されない膜貫通ドメインを含む。

本発明に従って有用なＣＡＲは、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、及び第３世代ＣＡＲを含む。第１世代ＣＡＲは、目的の抗原を特異的に認識する結合部分及びＴ細胞活性化シグナル伝達ドメイン（細胞内共刺激ドメインなし）を含む。第２及び第３世代ＣＡＲは、種々の共刺激分子からのシグナル配列を含む。第２世代ＣＡＲは、目的の抗原を特異的に認識する結合部分、Ｔ細胞活性化細胞内シグナル伝達ドメイン、及び１つの細胞内共刺激ドメインを含む。第３世代ＣＡＲは、目的の抗原を特異的に認識する結合部分、Ｔ細胞活性化細胞内シグナル伝達ドメイン、及び２つ以上の細胞内共刺激ドメインを含む。

第１世代ＣＡＲのいくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含む。第２世代ＣＡＲのいくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータ及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含む。第３世代ＣＡＲのいくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、及び４－１ＢＢシグナル伝達ドメインの任意の組み合わせ、又はＴ細胞活性化を誘導するのに有用な任意の他のシグナル伝達ドメインの任意の組み合わせを含む。

好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲは、抗体（ｓｃＦｖ）の単鎖可変フラグメント、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質３（ＮＳ３）プロテアーゼドメイン、ヒトＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒトＣＤ３ゼータ、ヒトＣＤ２８及びヒト４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、ＮＳ３プロテアーゼドメインは、特定の位置でＣＡＲに組み込まれ、ＮＳ３プロテアーゼ活性が、特定の所定のプロテアーゼ切断部位でＣＡＲタンパク質構築物を切断し、細胞表面上に無傷なＣＡＲタンパク質構築物の発現を妨げるようにする。

いくつかの実施形態において、ＮＳ３プロテアーゼドメインは、適切なＮＳ３プロテアーゼ発現及び機能を確実にするために、ＨＣＶのＮＳ４タンパク質配列をさらに含む。他の実施形態において、ＣＡＲ構築物は、ＨＣＶ ＮＳ２及びＮＳ３プロテアーゼの配列に由来するプロテアーゼドメインを含む。本発明の好ましい実施形態において、ＮＳ３プロテアーゼドメインは、ＮＳ４Ａ配列（ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメイン）を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、癌抗原及び／又は免疫細胞抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３－ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、癌抗原及び／又は免疫細胞抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、ＣＤ３－ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、癌抗原及び／又は免疫細胞抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、ＣＤ３－ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメイン、及び４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、フレキシブルリンカーによって融合された抗体重鎖及び軽鎖の可変部分を含む。本発明のＣＡＲのリンカーには配列番号９９５～９９７の単鎖可変フラグメントリンカーが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、フレキシブルリンカーによって、ｓｃＦｖが異なる方向に配向して抗原結合を可能にする。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞において発現される場合、Ｔ細胞媒介免疫応答を活性化するために、抗原結合特異性に基づいて、抗原認識を指向することができる。

本発明のＣＡＲの単鎖可変ドメインは、標的細胞の表面上に存在する任意の１つ以上のタンパク質を標的とするように操作される。例えば、標的細胞上の抗原に結合する抗体の可変ドメイン領域は、ＣＡＲの単鎖可変フラグメントとして操作され、特定の抗原を標的とする本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために使用される。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞によって標的化される抗原としては、寄生虫抗原、細菌抗原、ウイルス抗原及び自己抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、抗癌剤抗体（抗癌剤ｓｃＦｖ）、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒトＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒトＣＤ３－ゼータ、ヒトＣＤ２８、及びヒト４－１ＢＢシグナル伝達ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、抗免疫細胞抗体（抗免疫細胞ｓｃＦｖ）、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒトＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒトＣＤ３ゼータ、ヒトＣＤ２８、及びヒト４－１ＢＢシグナル伝達ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、寄生虫抗原、細菌抗原及び／又はウイルス抗原（抗感染性ｓｃＦｖ）に結合する抗体、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒトＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒトＣＤ３－ゼータ、ヒトＣＤ２８、及びヒト４－１ＢＢシグナル伝達ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、自己免疫反応性細胞（抗自己免疫細胞ｓｃＦｖ）に結合する抗体、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒトＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、ならびにヒトＣＤ３－ゼータ、ヒトＣＤ２８、及びヒト４－１ＢＢシグナル伝達ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。利点を挙げると、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ発現を微調整するために使用して、同様の抗原を発現する非自己反応性細胞を標的化することを回避するために、自己反応性細胞が標的化されると、ＣＡＲ発現をオフにすることができる自己反応性細胞上の抗原の安全な標的化を可能にすることである。

抗癌剤抗体は、本明細書中で使用される場合、癌細胞上に存在する任意の抗原に結合する任意の抗体のことである。

抗免疫細胞抗体は、本明細書中で使用される場合、免疫細胞上に存在する任意の抗原に結合する任意の抗体のことである。

本発明のＣＡＲの操作において使用される可変ドメインを含む抗体の例としては、以下のもの挙げられるが、これらに限定されない。アルファフェトプロテイン１、未分化リンパ腫キナーゼ（ＣＤ２４６）、Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化インヒビター１、Ｂ細胞レセプターＡｂｌ融合タンパク質（Ｂｃｒ／Ａｂｌ）、絨毛性ゴナドトロピンベータサブユニット３（ベータ－ＨＣＧ）、ベータ－２ミクログロブリン、Ｂ－ｒａｆプロトオンコジーン（ＢＲＡＦ）、乳癌１型感受性タンパク質（ＢＲＣＡ１）、乳癌２型感受性タンパク質（ＢＲＣＡ２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７様分子Ｈ４（Ｂ７－Ｈ４）、癌抗原１５－３（Ｃａ１５－３）、癌抗原１９－９（Ｃａ１９－９）、カルシトニン、カルレチニン、ネプリリシン（ＣＤ１０）、食作用性糖タンパク質－１（ＣＤ４４）、プロテインチロシンホスファターゼレセプターＣ（ＣＤ４５）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、クロモグラニンＡ、チロシンプロテインキナーゼキット（ｅ－キット）、サイトケラチン１９、上皮細胞接着因子レセプター（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、エストロゲンレセプター－アルファ、エストロゲンレセプター－ベータ、葉酸レセプター１、精巣分泌物タンパク質Ｅ４（ＨＥ４）、グリピカン－３タンパク質（ＧＰＣ－３）、免疫グロブリン関連ベータ（ＣＤ７９ｂ）、ｖ－ｅｒｂ－ｂ２赤芽球性白血病ウイルス性腫瘍遺伝子ホモログ２（ＨＥＲ２）、インヒビン、インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ／ＣＤ４７）、インターロイキン－３レセプター（ＣＤ１２３）、モノクローナル抗体Ｋｉ－６７（Ｋｉ－６７）識別抗原、キルステンラット肉腫ウイルス性腫瘍遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、白血球抗原ＣＤ３７、メラン－Ａ（ＭＡＲＴ１）、メラノーマ細胞接着分子（ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６／卵巣癌抗原１２５（ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５）、核マトリックタンパク質２２（ＮＭＰ２２）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、神経栄養性チロシンキナーゼレセプター関連１（ＲＯＲ１）、神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）、腫瘍タンパク質５３（ｐ５３）、細胞骨格関連タンパク質４（ｐ６３）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、プログラム細胞死－リガンド（ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４）、ピルビン酸キナーゼ筋肉（ＰＫＭ）、ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、ポドプラニン、プロゲステロンレセプター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３（ＣＤ３３）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ４（Ｓ１００Ａ４）、細胞ピンペプチダーゼインヒビターグレードＥ（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、分泌フリズルド関連タンパク質１（ＳＦＲＰ１）、これらに限定されないが、シグナル伝達リンパ活性化分子（ＣＤ１５０）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ８４、ＮＴＢ－Ａ（Ｌｙ－１０８）、Ｌｙ－９（ＣＤ２２９）を含むシグナル伝達リンパ球活性化分子関連レセプター系列、シンデカン－１（ＣＤ１３８）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ、チログロブリン、トランスチレチン、転写終結因子１（ＴＴＦ１）、プラスミノーゲンアクチベーターウロキナーゼ（ｕＰＡ）、血管内皮増殖因子レセプター２（ＶＥＧＲ２）又はビメンチン。

本発明のいくつかの実施形態において、ＣＡＲは、所望の標的抗原に結合する任意の可変ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。利点を挙げると、所望の標的抗原に結合する任意の抗体の任意の可変ドメインを使用して、本発明のＣＡＲを生成することができる。というのは、抗体可変ドメインのアミノ酸配列は、本発明のＣＡＲの単鎖可変フラグメント配列に容易に変換することができるからである。例えば、いくつかの実施形態において、３つ以上の抗原に結合する可変ドメインを有する二重特異性抗体又は多重特異性抗体由来の可変ドメインを使用して、本発明のＣＡＲを生成することができる。いくつかの実施形態において、二重又は多重特異性抗体の第１の可変ドメインの重鎖及び軽鎖を使用して、１つのＣＡＲを生成することができ、二重又は多重特異性抗体の第２の可変ドメインの重鎖及び軽鎖を使用して、第２のＣＡＲを生成することができる。

いくつかの実施形態において、１つの抗体の１つの可変ドメインの重鎖及び／又は軽鎖ドメインと、二重特異性又は多重特異性抗体の第２の抗体の第２の可変ドメイン又は第２の可変ドメインの重鎖及び／又は軽鎖を使用して、本発明のＣＡＲを生成することができる。さらなる実施形態において、２つ以上の重鎖ドメインと２つ以上の軽鎖ドメインをリンカーによって組み合わせて、本発明の多重特異性ＣＡＲを生成することができる。２つ以上の重鎖と２つ以上の軽鎖ドメインは、異なる抗体の単一可変ドメインからであっても、二重特異性又は多重特異性抗体の異なる可変ドメインからであってもよい。

さらなる実施形態において、軽鎖ドメインを含まない重鎖ドメインと重鎖ドメインを含まない軽鎖ドメインを使用して、本発明のＣＡＲを生成することができる。いくつかの実施形態において、第１の可変ドメインからの重鎖と第２の可変ドメインからの軽鎖を使用して、本発明のＣＡＲを生成することができる。いくつかの実施形態において、２つ以上の可変ドメインからの２つ以上の重鎖を組み合わせて、本発明のＣＡＲを生成することができる。いくつかの実施形態において、２つ以上の可変ドメインから２つ以上の軽鎖を組み合わせて、本発明のＣＡＲを生成することができる。なお、さらなる実施形態において、可変ドメインの２つ以上の第１のグループからの２つ以上の重鎖と可変ドメインの２つ以上の第２のグループからの２つ以上の軽鎖を組み合わせて、本発明のＣＡＲを生成することができる。

例えば、本発明のＣＡＲのｓｃＦｖは、これらに限定されるものではないが、以下に挙げる抗体由来の可変配列を含む。Abagovomab、Abelacimab、Abituzumab、Abrezekimab、Abrilumab、Actoxumab、Adalimumab、Aducanaumab、Afasevikumab、Alacizumab、Alemtuzumab、Alirocumab、Amatuximab、Andecaliximab、Anetumab、Anifrolumab、Anrukizumab、Apamistamab、Aprutumab、Ascrinvacumab、Atezolizumab、Atidortozumab、Atinumab、Atoltivimab、Avelumab、Axicabtagene Ciloleucel、Azintuxizumab、Balstilimab、Bapineuzumab、Basiliximab、Bavituximab、Bedinvetmab、Begelomab、Belantamab、Belimumab、Bemarituzumab、Benralizumab、Berlimatoxumab、Bermekimab、Bersanlimab、Bevacizumab、Bezlotoxumab、Bimagrumab、Bimekizumab、Birtamimab、Bleselumab、Blinatumomab、Blontuvetmab、Blosozumab、Bococizumab、Brazikumab、Brentuximab、Briakinumab、Brodalumab、Broluczumab、Brontictuzumab、Budigalimab、Burosumab、Cabiralizumab、Camidanlumab、Camrelizumab、Canakinumab、Cantuzumab、Caplacizumab、Carlumab、Carotuximab、Cemiplimab、Candakimab、Cergutuzumab、Certolizumab、Cetrelimab、Cetuximab、Cibisatamab、Cinpanemab、Citatuzumab、Cixutumumab、Clazakizumab、Clervonafusp、Clivatuzumab、Cobolimab、Codrituzumab、Cofetuzumab、Coltuximab、Conatumumab、Concizumab、Cosfroviximab、Crenezumab、Crizanlizumab、Crotedumab、Crovalimab、Cusatuzumab、Dacetuzumab、Daclizumab、Dalotuzumab、Dapirolizumab、Daratumumab、Dectrekumab、Demcizumab、Denintuzumab、Denosumab、Depatuxizumab、Derlotuximab、Dezamizumab、Dilpacimab、Dinutuximab、Diridavumab、Disitamab、Domagrozumab、Donanemab、Dostarlimab、Drozitumab、Duligotuzumab、Dupilumab、Durvalumab、Dusigitumab、Duvortuxizumab、Eculizumab、Edrecolomab、Efalizumab、Efungumab、Eldelumab、Elezanumab、Elgemtumab、Elipovimab、Elotuzumab、Emactuzumab、Emapalumab、Emicizumab、Emibetuzumab、Enapotamab、Enavatuzumab、Enfortumab、Enoblituzumab、Enokizumab、Enoticumab、Ensituximab、Envafolimab、Epratuzumab、Eptinezumab、Erenumab、Etaracizumab、Etigilimab、Etokimab、Etrolizumab、Evinacumab、Evolocumab、Faricimab、Farletuzumab、Fasinumab、Fezakinumab、Ficlatuzumab、Figitumumab、Firivumab、Flanvotumab、Fletikumab、Flotetuzumab、Fontolizumab、Foralumab、Foravirumab、Fremanezumab、Fresolimumab、Frovocimab、Frunevetmab、Fulranumab、Futuximab (Zatuximab)、Galcanezumab、Galiximab、Gancotamab、Ganitumab、Gantenerumab、Garadacimab、Garetosmab、Gatipotuzumab、Gedivumab、Gemtuzumab、Gevokizumab、Gilvetmab、Gimsilumab、Girentuximab、Glembatumumab、Glenzocimab、Golimumab、Gosuranemab、Guselkumab、Ianalumab、Ibalizumab、Icrucumab、Idarucizumab、Ieramilimab、Ifabotuzumab、Iladatuzumab、Imalumab、Imaprelimab、Imgatuzumab、Inclacumab、Indatuximab、Indusatumab、Inebilizumab、Infliximab、Inotuzumab、Intetumumab、Ipilimumab、Iratumumab、Isatuximab、Iscalimab、Istiratumab、Itolizumab、Ixekizumab、Labetuzumab、Lacnotuzumab、Lacutamab、Ladiratuzumab、Lampalizumab、Lanadelumab、Landogrozumab、Laprituximab、Larcaviximab、Lebrikizumab、Lenvervimab、Lenzilumab、Leronlimab、Lesofavumab、Letolizumab、Levilimab、Lexatumumab、Lifastuzumab、Ligelizumab、Lilotomab、Lintuzumab、Lirilumab、Lodelcizumab、Lokivetmab、Loncastuximab、Lorukafusp、Lorvotuzumab、Losatuxizumab (Serclutamab)、Lucatumumab、Lulizumab、Lumiliximab、Lumretuzumab、Lupartumab、Lutikizumab、Maftivimab、Magrolimab、Margetuximab、Marstacimab、Matuzumab、Mavrilimumab、Mepolizumab、Milatuzumab、Mirikizumab、Mirvetuximab、Mitazalimab (Vanalimab)、Modotuximab、Mogamulizumab、Monalizumab、Mosunetuzumab、Motavizumab、Moxetumomab、Murlentamab、Muromonab (Zolimomab)、Namilumab、Naptumomab、Naratuximab、Narnatumab、Natalizumab、Navivumab、Navicixizumab、Naxitamab、Necitumumab、Nemolizumab、Nesvacumab、Netakimab、Nidanilimab、Nimacimab、Nimotuzumab、Nirsevimab、Nivolumab、Obexelimab、Obiltoxaximab、Obinutuzumab (Afutuzumab)、Ocaratuzumab、Ocrelizumab、Ofatumumab、Olaratumab、Oleclumab、Olendalizumab、Olinvacimab (Tanibirumab)、Olokizumab、Omalizumab、Omburtamab、Onartuzumab、Ontamalimab、Ontuxizumab、Onvatilimab、Opicinumab、Oportuzumab、Orilanolimab、Orticumab、Osocimab、Otelixizumab、Otilimab、Otlertuzumab、Oxelumab、Ozanezumab、Ozoralizumab、Pabinafusp、Palivizumab、Pamrevlumab、Panitumumab、Panobacumab、Parsatuzumab、Pasotuxizumab、Pateclizumab、Patritumab、Pembrolizumab (Lambrolizumab)、Pepinemab、Perakizumab、Pertuzumab、Pidilizumab、Pinatuzumab、Placulumab、Plamotamab、Plozalizumab、Polatuzumab、Ponezumab、Porgaviximab、Prasinezumab、Prezalumab、Pritoxaximab、Prolgolimab、Quetmolimab、Quilizumab、Racotumomab、Radretumab (Bifikafusp/Onfekafusp)、Rafivirumab、Ralpancizumab、Ramucirumab、Ranevetmab、Ranibizumab、Ravagalimab、Ravulizumab、Refanezumab、Relatlimab、Relfovetmab、Remtolumab、Reslizumab、Rilotumumab、Rinucumab、Risankizumab、Rituximab、Rivabazumab、Robatumumab、Roledumab、Rolinsatamab、Romilkimab、Romosozumab、Rontalizumab、Rosmantuzumab、Rovalpituzumab、Rozanolixizumab、Rozipafusp、Ruplizumab、Sacituzumab、Samalizumab、Samrotamab、Sarilumab、Satralizumab (Sapelizumab)、Secukinumab、Selicrelumab Semorinemab、Seribantumab、Setoxaximab、Setrusumab、Sifalimumab、Siltuximab、Simtuzumab、Sintilimab、Sirtratumab、Sirukumab、Sofituzumab、Solanezumab、Solitomab、Spartalizumab、Spesolimab、Suptavumab、Sutimlimab、Suvizumab、Suvratoxumab、Tabalumab、Tabituximab、Tadocizumab、Tafasitamab、Talacotuzumab、Tamrintamab、Tamtuvetmab、Tanezumab、Tarextumab、Tavolimab (Tavolixizumab)、Tebentafusp、Teclistamab、Telisotuzumab、Temelimab、Tenatumomab、Teplizumab、Tepoditamab、Teprotumumab、Tesidolumab、Tezepelumab、Tibulizumab、Tidutamab、Tigatuzumab、Tilavonemab、Tildrakizumab、Timolumab、Tiragolumab、Tislelizumab、Tisotumab、Tocilizumab、Tomaralimab、Tomuzotuximab、Toripalimab、Tosatoxumab、Tovetumab、Tralokinumab、Trastuzumab (Timigutuzumab)、Tregalizumab、Tremelimumab (Ticilimumab)、Trevogrumab、Ublituximab、Ulocuplumab、Urelumab、Ustekinumab、Utomilumab、Vadastuximab、Valanafusp、Vantictumab、Vanucizumab、Varisacumab、Varlilumab、Vatelizumab、Vedolizumab、Veltuzumab、Vesencumab、Vibecotamab、Visilizumab、Vobarilizumab、Vofatamab、Volagidemab、Vonlerolizumab (Pogalizumab)、Vopratelimab、Vorsetuzumab、Vunakizumab、Xentuzumab、Zalifrelimab、Zalutumumab、Zampilimab、Zanolimumab、Zenocutuzumab、Zolbetuximab (Claudiximab)、ならびに軽鎖及び／又は可変重鎖配列のいずれかの組み合わせ。上記抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＩＭＧＴウェブサイトで入手可能である（Worldwide Website: imgt.orgを参照のこと。添付の配列リスト及び表２にも提供される）。

さらなる実施形態において、本開示後の任意の時点において、当技術分野で発見された任意の抗体の任意の可変領域を、本発明のＣＡＲ構築物に含めることができる。というのは、本開示に基づいて、当業者であれば、日常的な方法を用いて、可変領域配列をＣＡＲ構築物に組み込み、本発明に従ってＣＡＲ－Ｔ細胞を生成することができるからである。

好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲの構築において使用される細胞結合抗体の単鎖可変フラグメントは、そのような結合フラグメントから生成されるＣＡＲの結合が、任意の二量化パートナーとの標的抗原の二量化を物理的にブロックするのに効率的であるように、標的抗原の膜近位領域に結合するフラグメントである。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲの抗原結合フラグメントは、標的細胞上の抗原に結合する設計されたアンキリン反復タンパク質に由来する。本発明のＣＡＲにおいて有用な設計されたアンキリン反復タンパク質の結合フラグメントは、フレームワーク配列及び可変配列の両方を含む１～２０個、好ましくは２～６個のアンキリン反復を含み、アンキリン反復タンパク質ライブラリーから回収することができる。利点を挙げると、アンキリン反復タンパク質は、標的細胞の細胞表面上の所望の標的分子に結合し、高い安定性と低い抗原性を有しているため、有害な副作用の危険性を低下させることである。

本発明のＣＡＲは、ＣＡＲが発現されるＴ細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する少なくとも１つの細胞質ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。本明細書中で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、特化した機能を細胞に実行するように指示するタンパク質の部分のことである。「エフェクター機能」という用語は、Ｔ細胞の特化した機能のことである。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、炎症性サイトカインの分泌を含む細胞傷害及び免疫刺激活性である。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含む。好ましい実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに融合される。特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、その膜貫通ドメインが本発明のＣＡＲのドメインの１つと天然に関連する分子に由来する。特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、他の膜関連分子との望ましくない相互作用を最小限にするために、他の細胞膜分子の膜貫通ドメインへの結合を回避するように修飾される（例えば、アミノ酸置換によって）。

膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来する。いくつかの実施形態において、供給源は、天然であり、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来する。本発明による有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞レセプターのアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ４、ＣＤ８－アルファ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、及び／又はＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞刺激剤）の膜貫通領域の少なくとも１つから誘導する、又はそれらを含むことができる。

いくつかの実施形態において、本発明に従って有用な膜貫通ドメインは合成され、主に疎水性残基、例えば、ロイシン及びバリンを含む。好ましくは、合成膜貫通ドメインのＮ及び／又はＣ末端は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンの三重項を含む。

任意で、本発明のＣＡＲの膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインは、好ましくは、２～１０個のアミノ酸長の短いオリゴ又はポリペプチドスペーサーによって連結される。

本明細書中で使用される「スペーサー」又は「リンカー」という用語は、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン又は細胞内ドメインに連結するように機能する任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。スペーサーは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは、１０～１００個のアミノ酸、より好ましくは、２５～５０個のアミノ酸、最も好ましくは、５～２０個のアミノ酸を含む。

本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、特異的切断部位を切断する。いくつかの実施形態において、切断部位は、例えば、切断側のＮ端末側に６個のアミノ酸、Ｃ末端部位に４個の残基を含むデカペプチドである。他の実施形態において、切断部位は、１～１００個のアミノ酸及び間の任意の数のアミノ酸を含み、切断部位ペプチド内の任意の位置で切断される。

好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲの切断部位は、アミノ酸ＤＬＥＶＶＴ／ＳＴＷＶ、ＤＥＭＥＥＣ／ＳＱＨＬ、ＥＣＴＴＰＣ／ＳＧＳＷ及び／又はＥＤＶＶＣＣ／ＳＭＳＹを含み、「／」は切断されたペプチド結合を示す。

好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、単鎖可変フラグメントとヒンジ領域との間に位置する。

他の実施形態において、ＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、ヒンジ領域と膜貫通ドメインとの間に位置する。さらに他の実施形態において、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、その存在がＣＡＲの発現、膜位置及び／又は機能を妨げない限り、細胞内ドメイン間、例えば、ＣＤ２８ドメインと４－１ＢＢドメインとの間、ＣＤ２８ドメインとＣＤ３－ゼータドメインとの間、４－１ＢＢドメインとＣＤ３－ゼータドメインとの間、又は本発明のＣＡＲの任意の部分内に位置する。

好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲは、単一のＮＳ３／４Ａ切断部位を含む。他の好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲは、２つ以上のＮＳ３／４Ａ切断部位を含む。

好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲの単一ＮＳ３／４Ａ切断部位は、ＮＳ３／４ＡプロテアーゼドメインのＮ末端に、又はそれに隣接して位置する。

他の好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲの単一のＮＳ３／４Ａ切断部位は、ＮＳ３／４ＡプロテアーゼドメインのＣ末端に、又はそれに隣接して位置する。

より好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲは、２つ以上のＮＳ３／４Ａ切断部位を含み、少なくとも１つのＮＳ３／４Ａ切断部位は、ＮＳ３／４ＡプロテアーゼドメインのＮ末端に、又はそれに隣接して位置する。

さらに好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲは、２つ以上のＮＳ３／４Ａ切断部位を含み、少なくとも１つのＮＳ３／４Ａ切断部位は、ＮＳ３／４ＡプロテアーゼドメインのＣ末端に、又はそれに隣接して位置する。

最も好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲは、２つ以上のＮＳ３／４Ａ切断部位を含み、少なくとも１つのＮＳ３／４Ａ切断部位は、ＮＳ３／４ＡプロテアーゼドメインのＮ末端又はそれに隣接して位置し、少なくとも１つの切断部位は、ＮＳ３／４ＡプロテアーゼドメインのＣ末端又はそれに隣接して位置する。

さらなる実施形態において、ＮＳ３／４Ａ切断部位は、それらの存在がＣＡＲの発現、膜位置及び／又は機能を妨げない限り、本発明のＣＡＲ内の任意の位置に位置する。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼは、ＮＳ３及び／又は４Ａドメイン配列及び／又は切断部位内の少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含む突然変異を含む。

少なくとも１つの突然変異は、ＮＳ３及び／又はＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメイン内の任意のアミノ酸位置で生じるが、好ましい位置は、アミノ酸３６、４３、５４、８０、１２２、及び１６８である（ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメインの位置１のＡから開始される番号付け）。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、野生型ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインのアミノ酸配列を含む（配列番号９８０参照）。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、ＨＣＶ ＮＳ３／４ＡプロテアーゼドメインにおけるＴ５４Ａ置換を含む（配列番号９８１参照）。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、ＮＳ３／４ＡプロテアーゼドメインのＮＳ４Ａ配列又はそれに隣接する単一の切断部位を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、本発明のＣＡＲ構築物のＣＤ８ヒンジのＣ末端又はＣ末端に隣接する単一の切断部位を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のある本発明のＮＳ３／４Ａプロテアーゼを与える少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、アスナプレビルによる阻害に対して感受性のあるＮＳ３／４Ａプロテアーゼを与える少なくとも１つの突然変異を含む（配列番号９８２参照）。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインは、小分子インヒビターテラプレビルによる阻害に対して感受性のあるＮＳ３／４Ａプロテアーゼを与える少なくとも１つのアミノ酸置換を含む（配列番号９８３参照）。

好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲは、これらに限定されるものではないが、アスナプレビル、テラプレビル、シメプレビル、ファルダプレビル、ダノプレビル、バニプレビル、ナルラプレビル／ｒ、ＭＫ－５１７２、ＡＢＴ－４５０／ｒ、ＡＣＨ－１６２５、ＡＣＨ－２６８４、ＧＳ－９２５６、ＧＳ－９４５１、及びＩＤＸ３２０を含む小分子インヒビターによってそのプロテアーゼ活性が阻害される少なくとも１つのＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインを含む。

利点を挙げると、本発明のＣＡＲは、小分子インヒビターの非存在下で、特異的切断部位においてＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインによって切断される。対照的に、ＮＳ３／４Ａドメインを小分子インヒビターの結合及び阻害に対して感受性のあるＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインにおける少なくとも１つの突然変異を含む本発明のＣＡＲは、本発明のこのようなＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞を有効量の小分子インヒビターと接触させることによって阻害される。

本明細書中で使用される小分子インヒビターの「有効量」とは、本発明のＣＡＲ構築物で形質導入された細胞の細胞膜上にＣＡＲの存在を生じる任意の量である。

疾患の治療又は予防について使用される場合、本明細書中で使用される「有効量」という用語は、疾患又は状態を治療又は改善する、その他意図される療法効果（例えば、自己反応性細胞のレベルを予防又は減少させること）を生じ得る量のことである。

例えば、それを必要とする対象に投与されるＣＡＲ－Ｔ細胞の療法有効量は、投与当たり、これらに限定されるものではないが、約１０^２～約１０^１３、約１０^３～約１０^１２、約１０^４～約１０^１１、約１０^５～約１０^１０、約１０^６～約１０^９、及びこれらの間の任意の数、例えば、１×１０^２、１．１×１０^２、１．２×１０^２、１．３×１０^２、１．４×１０^２、１．５×１０^２、１．６×１０^２、１．７×１０^２、１．８×１０^２、１．９×１０^２及び２×２１０^２をはじめとする約１０～約１０^１４個の細胞である。

本明細書中で使用される「治療」（治療する等）という用語は、疾患又は状態の症状を改善又は軽減すること、状態の進行、重症度、及び／又は範囲を減少、抑制、阻害、軽減、又は影響を及ぼすことを含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「予防」（予防する等）という用語は、これらに限定されるものではないが、症状の発症を遅延させる、疾患の再発を予防する、再発エピソードの数又は頻度を減少させる、症候性エピソード間の潜伏期間を増加させる、又はこれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態において、細胞の混合集団は、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞又はドナー対象で治療する疾患を有する患者から抽出される。続いて、単離されたＴ細胞における本発明のＣＡＲのレトロウイルス又はレンチウイルス媒介発現が行われ、１～１０¹⁴の範囲の療法有効量のＣＡＲ－Ｔ細胞が、患者に輸注される。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、in vivoで複製することができ、その結果、持続的な疾患制御につながる長期残存性が得られる。例えば、輸注されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、投与後少なくとも１ヶ月間、患者に残存する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の残存集団は、投与後、少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、２年、又は３年間、ヒトに残存する。

さらに、第１の抗原に結合する単鎖可変フラグメントを有するＣＡＲをコードする少なくとも１つのＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞と、第２の抗原に結合する単鎖可変フラグメントを有するＣＡＲをコードする少なくとも１つのＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞とを含む二重スイッチＣＡＲ－Ｔ細胞系が提供される。

いくつかの実施形態において、第１の抗原に結合するｓｃＦｖ及び第２の抗原に結合するｓｃＦｖをコードするＣＡＲ構築物は、単一のベクター内で組み合わされて同じＴ細胞に転写される。

他の実施形態において、第１の抗原に結合するｓｃＦｖ及び第２の抗原に結合するｓｃＦｖをコードするＣＡＲ構築物は、別々のベクターに含まれ、異なるＴ細胞に転写される。

好ましい実施形態において、第１の抗原に結合するｓｃＦｖをコードするＣＡＲは、小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるＮＳ３／４Ａドメインにする少なくとも１つの突然変異を含むＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインを含む。

さらに好ましい実施形態において、第２の抗原に結合するｓｃＦｖをコードするＣＡＲは、異なる小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のある少なくとも１つの突然変異を含むＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインを含む。

より好ましい実施形態において、第１の抗原に結合するｓｃＦｖ及び第２の抗原に結合するｓｃＦｖをコードするＣＡＲ構築物は、異なる小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインを含む。

最も好ましい実施形態において、本発明の第１のＣＡＲ構築物は、ＣＤ１９抗原に結合するｓｃＦｖをコードし、小分子インヒビターアスナプレビルによる阻害に対して感受性のあるＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインを含み、第２のＣＡＲ構築物は、ＣＤ２２抗原に結合するｓｃＦｖをコードし、小分子インヒビターテラプレビルによる阻害に対して感受性のあるＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインを含む。

例えば、いくつかの実施形態において、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼスイッチの異なる変異体を使用して、スイッチ可能な抗ＣＤ１９ＣＡＲ及びスイッチ可能な抗ＣＤ２２ＣＡＲ（例えば、発現ベクタープラスミドｐＬＶＸを参照のこと）の両方をコードするレンチウイルスベクターが構築される。なお、異なるＮＳ３／４Ａ変異体は、異なる小分子インヒビターによって阻害される。単一のレンチウイルス発現プラスミドからの２つのＣＡＲの同時発現は、例えば、自己切断ウイルス２Ａペプチド配列によって達成される。各ＣＡＲは、例えば、ＣＤ３ゼータ活性化ドメイン（第３世代）に加えて、ＣＤ２８及び４－１－ＢＢ共刺激ドメインを含む。レンチウイルスを、発現ベクターをレンチウイルスエンベローププラスミド、例えば、プラスミドｐＰＡＸ２、及びレンチウイルスパッケージングプラスミド、例えば、ｐＭＤ２．Ｇ、で２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって２９３Ｔ細胞中にパッケージングし、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞によって作製されたレンチウイルスを採取する。このようにして生成されたレンチウイルスは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ構築物及び抗ＣＤ２２ＣＡＲ構築物を含み、ＣＡＲ－Ｔ療法を必要とする患者から得られたＴ細胞又はドナーから得られたＴ細胞を形質導入するために使用される。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、続いて、注入によってＣＡＲ－Ｔ細胞療法を必要とする患者に投与される。

利点を挙げると、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、小分子インヒビター、例えば、アスナプレビルの非存在下で培養される場合、ＣＤ１９－ＣＡＲに対する抗体及びフローサイトメトリーによって測定されるように、細胞表面上でＣＡＲを発現しない。

しかしながら、アスナプレビルの存在下では、Ｔ細胞の大部分が、フローサイトメトリーによって測定されるように、それらの細胞表面上で本発明のＣＡＲを発現する。

さらに、形質導入されたＴ細胞の細胞表面上に存在する本発明のＣＡＲの発現レベルは、増加する濃度のアスナプレビルへのＴ細胞の曝露と共に増加する。

アスナプレビルの存在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＡＲの発現レベルは、経時で安定している。例えば、発現レベルは、少なくとも１時間～約４週間、例えば、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１週間、２週間、３週間、及び／又は４週間安定である。

重要なのは、本発明のＣＡＲにおけるＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインの存在は、本発明のＣＡＲを発現するＴ細胞の殺傷能力に対して負の影響がないことである。例えば、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼドメインを有さないＣＡＲを発現するＴ細胞の殺腫瘍又は癌細胞殺傷活性は、ＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＳ３／４ａプロテアーゼドメインを発現する本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の殺腫瘍活性と同様である。

利点を挙げると、小分子インヒビターが離脱すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞表面上の本発明のＣＡＲの発現レベルは、大幅に減少するか、又はＣＡＲはインヒビター処理されたＣＡＲ－Ｔ細胞の表面に存在しないことである。

例えば、２４時間のアスナプレビルの離脱により、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上のＣＡＲが大幅に減少し、４８時間のアスナプレビルの離脱だと、ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＡＲがなくなる。

しかしながら、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、小分子インヒビターの有無により、アポトーシス細胞死、壊死細胞死、及び／又はオートファジーとならない。

さらに、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、小分子インヒビターの有無により、ＣＤ４及び／又はＣＤ８発現レベルを変化させない。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面からのＣＡＲの効率的な除去は、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の非活性化状態への戻りを可能にする。Ｔ細胞、一般に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の広範な活性化は、細胞死、すなわち、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団の枯渇を特異的に導くので、本発明のＣＡＲのオン／オフスイッチは、患者におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の生存率を延長し、活性化誘導細胞死及びＣＡＲ－Ｔ細胞枯渇を回避する。

核酸分子、ベクター及び発現構築物
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗原特異的ＣＡＲをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、本発明の抗原特異的ＣＡＲをコードする核酸分子を含む発現構築物及びベクターも提供する。

好ましい実施形態において、ＣＡＲ配列は、ＣＡＲのより一貫した表面準位発現を可能にするために、Ｔ細胞ゲノムへのＣＡＲ構築物の部位指向性挿入を可能にする遺伝子構築物に含まれる。

本発明に従って有用な核酸配列は、例えば、目的の遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、同じものを含むことが知られているベクターから目的の遺伝子を誘導することによって、又は同じものを含む細胞及び組織から直接単離することによって、当該分野で公知の組換え方法を使用して得られる。あるいは、目的の核酸配列は、合成により生成される。

ＣＡＲをコードする天然又は合成核酸の発現は、ＣＡＲポリペプチド又はその部分をコードする核酸をプロモーターに動作可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物における複製及び統合（integration）に適切である。典型的なクローニングベクターは、開始配列、所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーター、転写及び翻訳ターミネーターを含む。

本明細書中で使用される「発現構築物」という用語は、動作可能に連結された核酸配列を転写する核酸配列の組み合わせのことである。本発明の発現構築物はまた、一般に、発現構築物が発現されるべき意図される宿主細胞において機能的である調節エレメントを含む。調節エレメントには、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー、及びポリアデニル化エレメントが含まれる。

本発明の発現構築物は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーター配列を含む。プロモーターは、当該分野で公知の標準的な技術を使用して、ポリヌクレオチドに組み込まれる。プロモーター又は複数のプロモーターの複数のコピーを、本発明の発現構築物において使用することができる。好ましい実施形態において、プロモーターは、天然の遺伝的環境における転写開始部位からとほぼ同じ転写開始部位からの距離に位置する。この距離のいくらかの変更は、プロモーター活性を大幅に減少することなく可能である。転写開始部位は、典型的には、発現構築物中に含まれる。

本明細書中で使用される「動作可能に連結された」という用語は、記載される成分の並置をいい、成分は、意図される様式でそれらが機能することを可能にする関係にある。一般に、動作可能に連結された成分は、連続した関係にある。コード配列に動作可能に連結された配列は、コード配列の複製、転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。例えば、プロモーターがそのコード配列の転写を指示できる場合、コード配列はプロモーターに動作可能に連結される。

「コード配列」又は「コード領域」は、ｍＲＮＡに転写され、及び／又はポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。例えば、コード配列は、目的のポリペプチドをコードする。コード配列の境界は、５'末端にある翻訳開始コドンと３'末端にある翻訳終結コドンとによって決まる。

本明細書中で使用される「プロモーター」という用語は、所望の分子をコードする核酸配列のような転写されるべき核酸配列に動作可能に連結されたＤＮＡ配列のことである。プロモーターは、一般に、転写されるべき核酸配列の上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。特定の実施形態において、プロモーターは、一般に、転写されて所望の分子を生成する核酸配列の上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。

特定の実施形態において、本発明に有用なプロモーターは、これらに限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長成長因子－１ａ（ＥＦ－１ａ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。

本発明に有用なベクターは、これらに限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、及びレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターが含まれる。

好ましい実施形態において、癌抗原又は免疫疾患抗原に特異的なＣＡＲをコードする核酸分子を含むレンチウイルスベクターが提供される。本発明のＣＡＲ構築物がウイルスベクターのパッケージング容量を超えるサイズを有する場合、ＣＡＲ構築物を標的細胞に転写するために、ピギーバックトランスポゾン系を含むがこれに限定されない代替的な方法が使用される。

Ｔ細胞の形質導入、単離、濃縮
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、これらに限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターを含む種々のウイルスベクターを使用して形質導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を含む。

本明細書で使用される「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に転写又は導入されるプロセスのことである。

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｔ細胞の形質導入のためのレンチウイルスベクターの使用を提供する。レンチウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期にわたる安定した統合と娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を達成する適切なツールである。レンチウイルスベクターは、非増殖性細胞を形質導入できる点で、例えば、マウス白血病ウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクターよりも付加的な利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低い免疫原性という付加的な利点も有する。

選択された遺伝子は、ベクターに挿入され、当該分野で公知の技術を使用して、ウイルス（レンチウイルス等）粒子にパッケージングされる。次いで、組換えウイルスは、単離され、細胞、例えば、対象のＴ細胞に、in vivo又はex vivoのいずれかで送達される。いくつかの実施形態において、本発明のレンチウイルスベクターは、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれかを含む。レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされ、及び／又は感染された細胞を同定するため、そして調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織中に存在しないか、又は発現されず、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性や蛍光活性によって示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、及び任意の蛍光タンパク質遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質が挙げられる。適切な発現系は当該分野で周知であり、当該分野で公知の技術を使用して調製又は商業的に入手される。

本明細書で用いられる「活性化」（活性化する等）という用語は、検出可能な細胞増殖を誘発するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を意味する。活性化はまた、誘導されたサイトカイン生成、及び検出可能なエフェクター機能とも関連する。

本明細書で使用される「活性化Ｔ細胞」という用語は、特に、細胞分裂を受けているＴ細胞のことである。

一実施形態において、本発明のＴ細胞の増殖及び遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源は、対象から得られる。

本明細書で用いられる「単離」（単離する等）という用語は、どの細胞が単離されたかに基づいて、その自然環境（末梢血等）から除去され、天然に存在するが、細胞表面マーカーのない他の細胞を少なくとも約７５％、最も好ましくは約９０％含まない血液の混合物から分離された細胞を指す。

Ｔ細胞は、これらに限定されるものではないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の源から得ることができる。本発明の特定の実施形態において、当該分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株が使用される。

好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞富化組成物が続いて導入される対象の血液又は骨髄から単離及び精製される。対象は、免疫細胞関連抗原に対する免疫応答の抑制が望まれる、癌患者又は免疫関連疾患に罹患している患者である。いくつかの実施形態において、対象は、癌又は自己免疫疾患に罹患したヒトである。

あるいは、Ｔ細胞は、患者とは異なるドナーから得られる。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に公知の数多くある技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得られる。好ましい実施形態において、個別の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含む。

いくつかの実施形態において、アフェレーシス又はＦｉｃｏｌｌ（商標）分離によって収集された細胞は、洗浄されて、血漿画分を除去し、細胞を、その後の処理工程のために適切な緩衝液又は培地中に配置する。さらなる実施形態において、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。変形実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを含まず、マグネシウムを含まず、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを含んでいなくてよい。当業者であれば容易に理解されるように、洗浄工程は、製造者の指示に従って、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用する等して、当業者に公知の方法によって行われる。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａ^２＋を含まない、Ｍｇ^２＋を含まないＰＢＳ、血漿液Ａ、ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、緩衝液有りの他の生理食塩水、又は緩衝液無しの他の生理食塩水といった種々の生体適合性緩衝液中に再懸濁される。例えば、ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０９％アジドを含む。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁してもよい。

採取されたリンパ球は、本明細書に記載されるようなＴ細胞特異的細胞マーカーに基づく細胞分離技術を用いて分離される。血液サンプルから得られた細胞の中から表現型の特徴を選択することによって、種特異的種類のマーカーを認識する抗体が、Ｔ細胞を濃縮及び選択するために使用される。例えば、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＣＤ４５ＲＡの種特異的種類を認識する抗体、及び当技術分野で公知の他のマーカーを使用して、ヒトからＴ細胞を濃縮又は単離する（例えば、ヒトＴ細胞についてヒトＣＤ４に対する抗体）。

特定の実施形態において、Ｔ細胞が、Ｔ細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する試薬を使用して細胞集団から濃縮され、当技術分野で知られているように、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、固相磁気ビーズ等の細胞選別アッセイを使用してこれらの細胞を分離する。いくつかの実施形態において、細胞を選別するための方法の組み合わせ、例えば、磁気選択、続いてＦＡＣＳを使用することができる。濃縮を促進するために、例えば、Ｔ細胞上で発現される表面マーカーを使用する正の選択を、例えば、Ｔ細胞上で発現されない表面マーカーを使用する負の選択と組み合わせる。細胞表面マーカーを用いたＴ細胞の単離／濃縮は、任意の順序で行うことができることが意図される。従って、正の選択ステップは、負の選択ステップの直前にあってよく、その逆であってもよい。単離／濃縮は、正の選択ステップ及び負の選択ステップをグループ化することによって行われることも意図される。従って、単離／濃縮は、最初に方法のポジティブ選択ステップを実行し、続いて方法のネガティブ選択ステップを実行することによって行われる。又はその逆でもよい。

非ＣＤ４^＋及び非ＣＤ８^＋免疫細胞を枯渇させることによって、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋細胞を濃縮することもできる。このような細胞型には、これらに限定されるものではないが、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、単球、顆粒球及び赤血球細胞が含まれる。非ＣＤ４^＋及び非ＣＤ８^＋細胞を枯渇させるために使用される表面マーカーに対する抗体は当該分野で公知であり、これらに限定されるものではないが、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、及びグリコホリンＡを含む。

例えば、本発明の一実施形態において、細胞の集団は、まず、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、及びグリコホリンＡのうちの１つ以上に結合する第１の試薬又は試薬の基と接触し、続いて、ＣＤ４及び／又はＣＤ８及び／又はＣＤ４５ＲＡにそれぞれ結合する試薬と接触する。

所望のＣＡＲを発現するためのＴ細胞の遺伝子改変の前又は後にかかわらず、Ｔ細胞は、当該分野で公知の方法を一般的に使用して、活性化されて増殖される。

一般に、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを付着させた表面と接触させることによって拡張する。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書中に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体、又はその抗原結合フラグメント、又は表面に固定化された抗ＣＤ３抗体との接触によって、又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激される。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触する。

特定の実施形態において、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供される。例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中にあってもよいし、表面に結合されていてもよい。表面に結合される場合、薬剤は同じ表面に（すなわち、「シス」形成で）、又は別の表面に（すなわち、「トランス」形成で）結合される。あるいは、一方の薬剤を表面に結合させ、他方の薬剤を溶液中に存在させてもよい。一実施形態において、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合され、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合される。特定の実施形態において、両方の薬剤が溶液中に存在する。他の実施形態において、薬剤は、可溶形態であってもよく、次いで、Ｆｃレセプターを発現する細胞、又は薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。

いくつかの実施形態において、２つの薬剤は同じビーズ上、すなわち「シス」、又は別のビーズ、すなわち、「トランス」のいずれかに固定される。一例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合フラグメントであり、両方の薬剤が等価分子量で同じビーズに共固定化される。一実施形態において、Ｔ細胞拡張及びＴ細胞増殖のためにビーズに結合した各抗体の１：１の比が使用される。本発明の特定の態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１：１の比を使用して観察される拡大と比較して、Ｔ細胞拡張の増加が観察されるようなものを使用する。

いくつかの実施形態において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００の範囲であり、それらの間のすべての整数値である。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＤ３：ＣＤ２８の比が１未満であるように、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合される。

特定の実施形態において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は、２：１より大きい。特定の一実施形態において、ビーズに結合した抗体の１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。他の実施形態において、ビーズに結合した１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。さらなる実施形態において、ビーズに結合した抗体の１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。他の実施形態において、ビーズに結合した抗体の１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。１つの好ましい実施形態において、ビーズに結合した抗体の１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。他の実施形態において、ビーズに結合した抗体の１：３のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。さらに他の実施形態において、ビーズに結合した抗体の３：１のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。

粒子対細胞の比率は、１：５００～５００：１の範囲であり、間の任意の整数値を用いて、Ｔ細胞又は他の標的細胞を刺激する。当業者であれば容易に理解されるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒子サイズに依る。例えば、小さなサイズのビーズは、数個の細胞のみにしか結合できないが、大きなビーズは多くに結合できる。特定の実施形態において、細胞対粒子の比は、１：１００～１００：１の範囲であり、間の整数値、そして、さらなる実施形態においては、比は１：９～９：１であり、間の任意の整数値を用いて、Ｔ細胞を刺激する。他の実施形態において、粒子は、毎日又は１日おきに添加される。当業者であれば、様々な他の比率が、本発明での使用に適していることが分かるはずである。特に、比率は、粒子サイズに応じて変えられる。

さらなる実施形態において、Ｔ細胞を、薬剤でコーティングされたビーズと組み合わせ、ビーズ及び細胞を続いて分離し、分離された細胞を培養する。変形実施形態において、培養の前に、薬剤でコーティングされたビーズ及び細胞は分離せず、一緒に培養される。さらなる実施形態において、ビーズ及び細胞を、まず、磁力等の力の適用によって濃縮して、細胞表面マーカーの結合を増やすことによって、細胞刺激を誘導する。

いくつかの実施形態において、薬剤でコーティングされたビーズと細胞の混合物を、数時間（約３時間）～約２１日間、又は間の任意の時間での整数値の間、培養する。好ましい実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、約８日間一緒に培養する。他の好ましい実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、２～３日間一緒に培養する。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上となるようなサイクルでの刺激も望ましい。

Ｔ細胞培養に適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎児又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－α、又は当業者に公知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存に必要な因子を含む適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭ１培地１６４０、又はＸ－ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞の成長のための他の添加剤としては、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、プラスマネート、及び、Ｎ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノール等の還元剤が挙げられる。培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、Ｘ－Ｖｉｖｏ２０、及びＯｐｔｉｍｉｚｅｒを含み、血清を含まないか、適切な量の血清（又はプラズマ）又は規定したセットのホルモン、及び／又はＴ細胞の成長及び増殖に十分な量のサイトカインが補充された、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加される。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養物中にのみ含まれ、対象に注入されるべき細胞の培養物中には含まれない。標的細胞を、成長を支持するために必須の条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び空気（例えば、空気プラス５％ＣＯ_２）で維持する。

抗体と抗体ドメイン
本発明において使用することが意図される抗体は、全免疫グロブリン、Ｆｖ、Ｆａｂ及び同様のフラグメント等の抗体フラグメント、可変ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む単鎖抗体、及び同様の形態を含む、様々な形態のいずれかであり、これらは全て、本明細書中で使用される広義の用語「抗体」に含まれる。

本明細書中で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列と同一、実質的に同一、又はそれに由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むものとする。このようなヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含む（例えば、in vitroでのランダム又は部位特異的突然変異誘発によって、又はin vivoでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むものではない。

「抗体フラグメント」という用語は、全長抗体の一部、一般に、抗原結合又は可変領域のことである。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２及びＦｖフラグメントが含まれる。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる、２つの同一の抗原結合フラグメントを生成し、それぞれ、単一の抗原結合部位を有し、容易に結晶化する能力のための、いわゆる、残りの「Ｆｃ」フラグメントを有する。抗体のペプシン処理は、抗原を架橋することができる２つの抗原結合フラグメント、及び残りの他のフラグメント（ｐＦｃ'と呼ばれる）を有するＦ（ａｂ'）_２フラグメントを生じる。さらなるフラグメントとしては、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。本明細書中で使用される、抗体に関する「抗原結合フラグメント」とは、例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ'）_２フラグメントのことである。結合にとって特に重要なのは、本明細書中に例示されるアミノ酸配列のＮ末端の最初の１１０～１３０のアミノ酸である。このように、可変領域を構成するＮ末端１１０、１１５、１２０、１２５、又は１３０のアミノ酸における高い同一性が好ましい。変異体配列は、好ましくは、この領域において７５％、９０％、又は９５％を超える同一性を有する。

Ｆａｂは、抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含有する抗体のフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、酵素パパインで全抗体を消化して、無傷の軽鎖及び１つの重鎖の一部を生じることにより、生成される。

Ｆａｂ'は、全抗体をペプシンで処理し、続いて還元すると、無傷の軽鎖及び重鎖の一部を生じる、抗体分子のフラグメントである。抗体１分子当たり２つのＦａｂ'フラグメントが得られる。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基を付加されているところが、Ｆａｂフラグメントとは異なる。

（Ｆａｂ'）_２は、後の還元なしに全抗体を酵素ペプシンで処理することによって得られる抗体のフラグメントである。Ｆ（ａｂ'）_２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ'フラグメントの二量体である。

Ｆｖは、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、密接な非共有結合（ＶＨ－ＶＬダイマー）における１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。この立体構造においては、個々の可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画定する。まとめると、６つのＣＤＲによって、抗体に対する抗原結合特異性が付与される。

しかしながら、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む単一の可変ドメイン、又はＦｖの半分であっても、結合部位全体よりも低い親和性の可能性はあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。

単鎖抗体は、軽鎖（ＶＬ）の可変領域、重鎖（ＶＨ）の可変領域を含み、遺伝的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、遺伝子操作された分子と定義される。このような単鎖抗体はまた、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体フラグメントとも呼ばれる。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。

「特異的結合」又は「特異性」とは、抗体又は他の薬剤が抗原上に提示されたエピトープに検出可能に結合する一方で、他のタンパク質又は構造との検出可能な反応性が比較的少ない能力のことである。特異性は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用して、結合アッセイ又は競合結合アッセイによって相対的に判断される。特異性は、例えば、特異的抗原への結合におけるアフィニティー／アビディティーの約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１以上の比、又は他の無関係な分子への非特異的結合によって示すことができる。

抗体最適化のための方策は、ランダム突然変異誘発を用いてなされることがある。これらの場合、位置はランダムに選択されるか、又はアミノ酸変化はアラニンへの全ての残基の連続的な変化のような単純化されたルールを使用してなされる。アラニンスキャニング突然変異誘発もまた、例えば、抗体の抗原結合残基をマッピングするために使用される。親和性成熟の配列ベースの方法もまた、抗体の結合親和性を増加させるために使用される。

本発明の範囲内の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＭを含む任意のアイソタイプのものである。ＩｇＧアイソタイプ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４サブタイプにさらに細分することができる。ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプにさらに細分することができる。

製剤及び投与
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲを発現するＴ細胞は、対象に投与される。本明細書で使用される「対象」という用語は、霊長類などの哺乳動物を含む生物を表す。開示された治療方法から利益を得ることができる哺乳動物種には、これらに限定されるものではないが、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒトサル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、及びハムスター等の家畜化及び実験動物が含まれる。特定の一実施形態において、対象はヒトである。

いくつかの実施形態において、本発明に従って操作された有効量のＣＡＲ発現Ｔ細胞は、疾患の治療を必要とする患者に投与され、養子細胞移植のような当該分野で周知の方法を使用して実施される。

一実施形態において、細胞の混合集団が、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞又はドナー対象で治療されるべき疾患を有する患者から抽出される。続いて、単離されたＴ細胞における本発明のＣＡＲのレトロウイルス又はレンチウイルス媒介発現が行われ、１～１０^１４の範囲の治療有効量のＣＡＲ－Ｔ細胞が、患者に輸注される。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、in vivoで複製することができ、その結果、持続的な疾患制御をもたらす長期持続性が得られる。例えば、輸注されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、投与後少なくとも１ヶ月間、患者において持続する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の持続集団は、投与後、少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、２年、又は３年間、ヒトにおいて持続する。

本発明はまた、本発明の１つ以上のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬組成物も提供する。特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１、１０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、又は１０^１４のＣＡＲ－Ｔ細胞、又は１０^１４を超える量のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。

いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の持続集団は、ヒトに投与されたＴ細胞、ヒトに投与されたＴ細胞の子孫、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの細胞を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞には、強固なin vivoＴ細胞増殖がなされる。好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、再活性化されて、ＣＡＲ－Ｔ細胞で元々処置された疾患の任意のさらなる腫瘍細胞又は免疫細胞を阻害する、特定の記憶Ｔ細胞に進化する。

いくつかの実施形態において、患者に注入される本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、癌又は免疫関連疾患のある患者において、in vivoで癌細胞又は免疫細胞を排除する。

いくつかの実施形態において、患者に注入される本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、癌又は免疫関連疾患に罹患している患者において、in vivoでの腫瘍負荷又は免疫学的応答を減少させることができる。

他の実施形態において、患者に注入される本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、免疫疾患を引き起こす癌細胞又は免疫細胞の再発を予防することができる。

さらに他の実施形態において、患者に注入される本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、癌又は免疫関連疾患を発症する高いリスクを有する対象にいて、in vivoで癌又は免疫関連疾患の発生を予防することができ、このリスクは、患者の以前の病歴、家族歴、種々のリスク因子の蓄積、又は免疫関連疾患の前兆と考えられる前癌病変又は免疫系変化の存在に基づく。

本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、単独で投与されるが、好ましくは、医薬組成物として投与され、これは、通常、意図される投与経路に従って選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤又は担体を含む。

ＣＡＲ－Ｔ細胞は、任意の適切な経路によって、それを必要とする患者に投与される。適用の様式は、様々であり、例えば、特定の実施形態において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞含有組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内及び膣内、又は腫瘍もしくは炎症の部位に直接投与される。それでも、ワクチンの投与のための任意の従来の方法は、適用可能である。ワクチンの投与量は、投与経路に依存し、宿主の大きさに応じて変化する。

一実施形態において、本発明の組成物は、注射により投与される。

いくつかのさらなる適切な投与経路には、これらに限定されるものではないが、経口、直腸、経鼻、局所（頬及び舌下を含む）、皮下、膣又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内及び硬膜外を含む）投与が含まれる。

局所部位での静脈内注射及び注射のために、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ値、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態で存在する。

適切な溶液は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、リンゲル乳酸塩注射のような等張性賦形剤を使用して、当業者が処方できる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を添加してもよい。経口投与される医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は経口液体などの形態であってよい。ゼラチン又はアジュバント等の固体担体が、錠剤に含まれてもよい。液体医薬組成物は、通常、液体担体、例えば、水、石油、動物又は植物油、鉱油又は合成油を含む。また、生理食塩水、グルコース、その他糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等のグリコールが含まれていてもよい。

材料及び方法
ＰＢＭＣは、ドナーから採取された血液から、又は血液銀行から得られたバフィーコートから単離される。約１５０ｍｌのドナー血液を、ヘパリン処理した血液収集チューブ（ペンシルバニア州ウエストチェスターのＶＷＲ）に採取し、次いで、ＰＢＳ中で１：１に希釈する。バフィーコートを、ＰＢＳ中で２００ｍｌの最終容量に希釈する。約４容量の希釈サンプルを、３容量のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ペンシルベニア州ピッツバーグのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に層状にし、次いで、８００ｒｃｆ、室温で３０分間、ブレーキなしで遠心分離する。界面の細胞を採取し、洗浄し、さらなる分離のためにＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。

in vivo動物研究及びin vitro実験のために、これらに限定されるものではないが、Ｒａｊｉ、Ｋ５６２、Ｎａｌｍ－６、２９３Ｔをはじめとする細胞株を、ＡＴＣＣから購入し、ＡＴＣＣの指示に従って維持する。細胞株を２～３日毎に継代し、対数増殖期の細胞を実験に使用する。

ＰＢＭＣを密度勾配遠心分離により単離する。ＰＢＭＣからＣＤ３磁気マイクロビーズによりＴ細胞を選別した後、これらの細胞をＣＤ３／ＣＤ２８刺激剤を含む完全Ｔ細胞培地で培養する。Ｔ細胞を単離後２４時間以内に濃縮レンチウイルスで形質導入する。その後、細胞密度を毎日培養培地で調整する。

細胞を、ＬＳカラム（カリフォルニア州、オーバーンのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造者のプロトコルに従って、ＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって分離する。結合した細胞を溶出するために、カラムを磁界から除去する。３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液をカラムに添加し、溶出された細胞を収集する。

フローサイトメトリーのために、細胞を標準的な手順を用いて染色する。簡潔に述べると、細胞を、分析のためにＰＢＳ＋３％ＦＢＳ中に、又は選別のために選別バッファ（ＰＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ）中に、１×１０^７細胞／ｍｌの濃度で懸濁する。添加される抗体の量は、メーカーの指示する容積に従うか、又は滴定によって決定される。細胞を、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（インジアナ州インジアナポリスのＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するフローサイトメトリーによって分析し、標準的な手順の下で操作する。ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞の下位集団を濃縮するために、磁気的に分離された細胞を抗ＣＤ４及び／又は抗ＣＤ８抗体で染色し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒで選別する。

本明細書に言及又は引用した全ての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は、それらが本明細書の明白な開示と矛盾しない限り、その図面及び表を含む全体が参照により本明細書に援用される。

以下は、本発明を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定とはみなされない。パーセンテージは全て重量基準で表示されており、全ての混合比率は特に注意がない限り、容積基準である。

実施例１－ベクター構築及びレンチウイルスパッケージング
ＮＳ３プロテアーゼスイッチの異なる変異体を適用することにより、スイッチ可能な抗ＣＤ１９ＣＡＲとスイッチ可能な抗ＣＤ２２ＣＡＲの両方をコードするレンチウイルスベクターを構築した。２つの対象の同時発現は、自己切断ウイルス２Ａペプチド配列によって達成された。各ＣＡＲには、ＣＤ３ゼータ活性化ドメイン（第３世代）に加えて、ＣＤ２８及び４－１－ＢＢ共刺激ドメインが含まれる。レンチウイルスパッケージングのために、２９３Ｔ細胞を発現ベクター、ｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．Ｇで同時トランスフェクトした。以下の表は、本発明のＣＡＲのＣＡＲ名称及びそれぞれのＣＡＲ構造を示す。

実施例２-in vitro機能アッセイ
Ｔ細胞形質導入後、異なる薬剤を提供し、ＣＤ１９－、ＣＤ２２－ＣＡＲをフローサイトメトリーによりＣＤ１９、ＣＤ２２タンパク質で検出した。さらに、二重標的スイッチ可能なＣＡＲ－Ｔ細胞の生物学的特性を求めた。例えば、ＣＤ２５及びＣＤ６９抗体を用いて活性化アッセイを行い、ＣＦＳＥを用いて増殖アッセイを行い、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡ抗体を用いてＴ細胞サブセットを決定し、アネキシン－Ｖを用いてアポトーシスアッセイを行った。さらに、細胞毒性アッセイ（カルセイン－ＡＭ放出）、ＣＤ１０７ａアッセイ、及びサイトカイン生成検出を行った。これらのアッセイは、効力を試験し、スイッチ系がどのように機能するかを規定するのに非常に重要である。

実施例３－動物実験
Ｎａｌｍ－６／Ｒａｊｉ細胞株を遺伝的に編集し、ｓｈＲＮＡによりＣＤ１９陰性及び／又はＣＤ２２陰性細胞を生成した。異なる抗原を発現する細胞が唯一のルシフェリンとのみ反応するように、ルシフェラーゼの変異体バージョンをこれらの細胞中に構築した［１４］。このようにして、二重標的スイッチの活性は、異なる標的細胞のルミネセンス強度を測定することによって判断される。

修飾Ｎａｌｍ－６／Ｒａｊｉ細胞株を、ＮＳＧマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）。生物発光イメージングを、修飾ルシフェリンの腹腔内注射の後、毎週行った。腫瘍負荷は、末梢血、骨髄、ひ臓のフローサイトメトリーで測定した。

実施例４-殺腫瘍性アッセイ
陽性標的細胞（Ｒａｊｉ）及び陰性標的細胞（Ｋ５６２）を、カルセイン－ＡＭ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識した後、異なる比率で９６のウェルプレート中でエフェクター細胞（ＡＳＶを有するＣＡＲＴ細胞）と共培養した。共培養に用いた培地は、ＰＢＳ＋５％ＦＢＳであった。共培養標的細胞及びＰＢＳ＋５％ＦＢＳの入ったウェルを、自然放出ウェルとして使用し、共培養標的細胞及び溶解溶液に入ったウェルを最大放出ウェルとして使用した。培養物を３時間のインキュベーション後に遠心分離し、上清を別の９６のウェルプレートに移した。それぞれのウェル（Ｆ）の蛍光値を、マイクロプレートリーダーで測定し、式ｌｙｓｉｓ％＝（Ｆ_{実験ウェル}－Ｆ_自然放出）／（Ｆ_最大放出－Ｆ_自然放出）×１００％に従って計算した。

表１に、殺腫瘍性in vitroアッセイの結果を示す。結果はまた、アスナプレビルの存在下及び非存在下におけるＣＡＲ形質導入細胞の細胞死及びＣＤ４／ＣＤ８プロファイルを示す同図６Ａ～６Ｂにも示される。

本明細書に記載した実施例及び実施形態は、例示のためのみであり、それを考慮した様々な変形や変更は、当業者に示唆され、本明細書及び請求項の理念及び範囲に含まれるものとする。また、本明細書に開示された本発明又は実施形態のあらゆる要素及び限定は、本明細書に開示されたあらゆる他の要素及び限定（個別に、又は任意の組み合わせいおいて）又は他の発明又は実施形態と組み合わせることができ、このような組み合わせの全てが、限定されることなく、本発明の範囲内であることが意図される。

配列の簡単な説明
配列番号１は、本発明のＣＡＲのＣＤ８－アルファシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号２は、本発明のＣＡＲのＣＤ１９単鎖可変フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号３は、本発明のＣＡＲのＣＤ２２単鎖可変フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号４は、本発明のＣＡＲのＣＤ８アルファヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号５は、本発明のＣＡＲのＣＤ２８ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号６は、本発明のＣＡＲのＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号７は、本発明のＣＡＲのＩｇＧ４ｍヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号８は、本発明のＣＡＲのＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号９は、本発明のＣＡＲのＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、本発明のＣＡＲのＩｇＧ４ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ及びスペーサー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、本発明のＣＡＲのＩｇＧ２ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ及びスペーサー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、本発明のＣＡＲのＩｇＧ１ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ及びスペーサー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、本発明のＣＡＲのＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１４は、本発明のＣＡＲのＣＤ８－アルファ膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、本発明のＣＡＲのＣＤ４膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１６は、本発明のＣＡＲのＣＤ３－ゼータ膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、本発明のＣＡＲのＩＣＯＳ膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１８は、本発明のＣＡＲの４－１ＢＢ細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、本発明のＣＡＲのＣＤ２８細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２０は、本発明のＣＡＲのＣＤ３－ゼータ細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２１～９７９は、表２に挙げた抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号９８０は、本発明のＣＡＲの野生型ＮＳ３プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号９８１は、本発明のＣＡＲのＴ５４Ａ変異体ＮＳ３プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号９８２は、本発明のＣＡＲのアスナプレビル－阻害性（ＡＩ）ＮＳ３プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号９８３は、本発明のＣＡＲのテラプレビル阻害性（ＴＩ）ＮＳ３プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号９８４は、本発明のＣＡＲのＮＳ４Ａドメインのアミノ酸配列である。
配列番号９８５は、本発明のＣＡＲの第１のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号９８６は、本発明のＣＡＲの第２のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号９８７は、本発明のＣＡＲの第３のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号９８８は、本発明のＣＡＲの第４のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号９８９は、本発明のＣＡＲの第１の自己切断ウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）のアミノ酸配列である。
配列番号９９０は、本発明のＣＡＲの第２の自己切断ウイルス２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）のアミノ酸配列である。
配列番号９９１は、本発明のＣＡＲのＣＤ１９軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号９９２は、本発明のＣＡＲのＣＤ１９重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号９９３は、本発明のＣＡＲのＣＤ２２重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号９９４は、本発明のＣＡＲのＣＤ２２軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号９９５は、第１の単鎖変形フラグメントリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号９９６は、第２の単鎖変形フラグメントリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号９９７は、第３の単鎖変形フラグメントリンカーのアミノ酸配列である。

Claims (43)

1. 単一の軽鎖可変フラグメントと、
   単一の重鎖可変フラグメントと、
   単鎖可変フラグメントリンカーと、
   少なくとも１つの非構造タンパク質３（ＮＳ３）プロテアーゼドメインと、
   少なくとも１つの切断部位と、
   ヒンジ領域と、
   膜貫通領域と、
   ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインと、任意で、
   ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＴＮＦＳＦ１４、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ１３２、又はＩＬＲβ（ＣＤ１２２）の細胞内シグナル伝達ドメインのような細胞内シグナル伝達ドメインと
   を含む、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）。
2. 前記少なくとも１つのＮＳ３プロテアーゼドメインは、野生型ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメイン、Ｔ５４Ａ ＮＳ３プロテアーゼドメイン、及び小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるＮＳ３プロテアーゼドメインから選択される、請求項１に記載のＣＡＲ。
3. 前記ＮＳ３プロテアーゼドメインは、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメントと前記ヒンジ領域との間、又は前記ヒンジ領域と前記膜貫通領域との間に位置する、請求項１に記載のＣＡＲ。
4. 前記ＮＳ３プロテアーゼドメインは、２つの切断部位に隣接している、請求項１に記載のＣＡＲ。
5. 前記ＮＳ３プロテアーゼドメインは、１つの切断部位に隣接している、請求項１に記載のＣＡＲ。
6. 前記１つの切断部位は、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメントと前記ＮＳ３プロテアーゼドメインとの間、前記ＮＳ３プロテアーゼドメインと前記ヒンジ領域との間、前記ヒンジ領域と前記膜貫通領域との間、又は前記切断部位の存在が前記ＣＡＲの機能を妨げない限り、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメント、ＮＳ３プロテアーゼ、ヒンジ領域、及び／又は膜貫通内の任意の位置に位置する、請求項５に記載のＣＡＲ。
7. 少なくとも１つの前記切断部位は、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメントと前記ＮＳ３プロテアーゼドメインとの間、前記ＮＳ３プロテアーゼドメインと前記ヒンジ領域との間、前記ヒンジ領域と前記膜貫通領域との間、又は前記切断部位の存在が前記ＣＡＲの機能を妨げない限り、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメント、ＮＳ３プロテアーゼ、ヒンジ領域、及び／又は膜貫通内の任意の位置に位置する、請求項４に記載のＣＡＲ。
8. 第１の切断部位は、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメントと前記ＮＳ３プロテアーゼドメインとの間に位置し、第２の切断部位は、前記ヒンジ領域と前記膜貫通ドメインとの間に位置する、請求項４に記載のＣＡＲ。
9. 前記単鎖及び重鎖可変フラグメントは、表２に挙げた前記抗体の可変領域のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
10. 請求項１～９のいずれか１項に記載の前記ＣＡＲをコードする核酸。
11. 単一の軽鎖可変フラグメントと、
    単一の重鎖可変フラグメントと、
    単鎖可変フラグメントリンカーと、
    第１の非構造タンパク質３（ＮＳ３）プロテアーゼドメインと、
    少なくとも１つの第１の切断部位と、
    第１のヒンジ領域と、
    第１の膜貫通領域と、
    第１のＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインと、任意で、
    第１の細胞内シグナル伝達ドメインと
    を含む第１のＣＡＲ、及び
    単一の軽鎖可変フラグメントと、
    単一の重鎖可変フラグメントと、
    単鎖可変フラグメントリンカーと、
    第２の非構造タンパク質３（ＮＳ３）プロテアーゼドメインと、
    少なくとも１つの第２の切断部位と、
    第２のヒンジ領域と、
    第２の膜貫通領域と、
    第２のＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインと、任意で、
    第２の細胞内シグナル伝達ドメインと
    を含む第２のＣＡＲ、をコードする核酸。
12. 前記第１のＣＡＲは、ＣＤ１９単一軽鎖及び重鎖可変フラグメントを含み、前記第２のＣＡＲは、ＣＤ２２単一軽鎖及び重鎖可変フラグメントを含む、請求項１１に記載の核酸。
13. 前記第１及び第２のＮＳ３プロテアーゼドメインは、野生型ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメイン、Ｔ５４Ａ ＮＳ３プロテアーゼドメイン、及び小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるＮＳ３プロテアーゼドメインから選択される、請求項１１に記載の核酸。
14. 第１及び第２のＮＳ３プロテアーゼドメインは、小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるＮＳ３プロテアーゼドメインである、請求項１３に記載の核酸。
15. 前記第１のＮＳ３プロテアーゼドメインは、第１の小分子インヒビターによる阻害に対して感受性があり、前記第２のＮＳ３プロテアーゼドメインは、第２の小分子インヒビターによる阻害に対して感受性がある請求項１４に記載の核酸。
16. Ｔ細胞は、小分子プロテアーゼインヒビターの非存在下、細胞表面上でＣＡＲを発現しない、請求項１０に記載の核酸を含むＴ細胞。
17. 前記Ｔ細胞は、小分子プロテアーゼインヒビターと接触した場合に、前記細胞表面上でＣＡＲを発現する、請求項１６に記載のＴ細胞。
18. 前記Ｔ細胞は、小分子プロテアーゼインヒビターの非存在下、前記細胞表面上で第１のＣＡＲ及び／又は第２のＣＡＲを発現しない、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の核酸を含むＴ細胞。
19. 前記Ｔ細胞は、少なくとも１つの小分子プロテアーゼインヒビターと接触した場合に、前記細胞表面上で前記第１のＣＡＲ及び／又は前記第２のＣＡＲを発現する、請求項１８に記載のＴ細胞。
20. 請求項１６～１７のいずれか１項に記載のＴ細胞を含む医薬組成物。
21. プロテアーゼドメインを阻害する小分子インヒビターをさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 請求項１８～１９のいずれか１項に記載のＴ細胞を含む医薬組成物。
23. プロテアーゼドメインを阻害する少なくとも１つの小分子インヒビターをさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. 第１の小分子は、第１のプロテアーゼドメインを阻害し、第２の小分子インヒビターは、第２のプロテアーゼドメインを阻害する、請求項２３に記載の医薬組成物。
25. 請求項１６～１７のいずれか１項に記載のＴ細胞の製造方法。
26. 請求項１８～１９のいずれか１項に記載のＴ細胞の製造方法。
27. 請求項１６～１７のいずれか１項に記載のＴ細胞を、癌に罹患している対象に投与することを含む、癌の治療方法。
28. 請求項２０～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を、癌に罹患している対象に投与することを含む、癌の治療方法。
29. 請求項１８～１９のいずれか１項に記載のＴ細胞を、癌に罹患している対象に投与することを含む、癌の治療方法。
30. 請求項２２～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物を、癌に罹患している対象に投与することを含む、癌の治療方法。
31. 請求項１６～１７のいずれか１項に記載のＴ細胞を、免疫疾患に罹患している対象に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
32. 請求項２０～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を、免疫疾患に罹患している対象に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
33. 請求項１８～１９のいずれか１項に記載のＴ細胞を、免疫疾患に罹患している対象に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
34. 請求項２２～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物を、免疫疾患に罹患している対象に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
35. 前記方法は、前記Ｔ細胞又は前記医薬組成物の投与に加えて、少なくとも１つの小分子プロテアーゼインヒビターの同時、前又は後の投与をさらに含む、請求項２７～３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 癌を治療する方法において使用するための、請求項１６～１７のいずれか１項に記載のＴ細胞であって、前記Ｔ細胞は、前記癌に罹患している対象に投与される、Ｔ細胞。
37. 癌を治療する方法において使用するための、請求項２０～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記組成物は、前記癌に罹患している対象に投与される、医薬組成物。
38. 癌を治療する方法において使用するための、請求項１８～１９のいずれか１項に記載のＴ細胞であって、前記Ｔ細胞は、前記癌に罹患している対象に投与される、Ｔ細胞。
39. 癌を治療する際に使用するための、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記組成物は、前記癌に罹患している対象に投与される、医薬組成物。
40. 免疫疾患を治療する方法において使用するための、請求項１６～１７のいずれか１項に記載のＴ細胞であって、前記Ｔ細胞は、前記免疫疾患に罹患している対象に投与される、Ｔ細胞。
41. 免疫疾患を治療する方法において使用するための、請求項２０～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記組成物は、前記免疫疾患に罹患している対象に投与される、医薬組成物。
42. 免疫疾患を治療する方法において使用するための、請求項１８～１９のいずれか１項に記載のＴ細胞であって、前記Ｔ細胞は、前記免疫疾患に罹患している対象に投与される、Ｔ細胞。
43. 免疫疾患を治療するための方法において使用するための、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記組成物は、前記免疫疾患に罹患している対象に投与される、医薬組成物。

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