JP2022553818A - 二重標的キメラ抗原レセプターt細胞療法のためのプロテアーゼスイッチ - Google Patents
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Abstract
本発明は、キメラ抗原レセプター、CARを含むT細胞、CARの製造方法、癌及び/又は免疫疾患の治療のためのCARの及びT細胞の使用方法に関する。特定の実施形態において、方法は、標的細胞の異なる抗原を標的とする、CARを含むT細胞を用いることを含む。さらに特定の実施形態において、本発明のCARは、NS3プロテアーゼドメインと切断部位とを含み、カスタマイズされたCAR-T細胞療法について、NS3ドメインは、小分子インヒビターにより阻害される。
Description
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本出願は、2019年10月30日出願の米国仮出願第62/927,898号の優先権を主張するものであり、全ての図表、アミノ酸又は核酸配列を含む全内容を参照することにより組み込まれる。
本出願の配列表は、2020年10月29日に作成され、1053KBである「Seq-List.txt」とラベル付けされたものである。配列表の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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本段落は、本発明の様々な態様の理解を容易にするための背景情報について述べる。本書の本段落の記載はこの点に鑑みて読むものとし、先行技術を容認するものではないものとする。
腫瘍抗原を標的とするように遺伝子操作された自己細胞を利用した養子T細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療に革命をもたらした。腫瘍抗原を標的とする合成キメラ抗原レセプター(CAR)は、T細胞(CAR-T細胞)を形質導入して、腫瘍抗原を発現する腫瘍に向けてそれらを標的化するために使用されてきた。
CARを発現するT細胞は、遺伝子工学によって生成され、(1)腫瘍標的に対する、免疫グロブリンの細胞質外可変フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント(scFv)、(2)細胞内T細胞レセプター活性化分子(例えば、CD3ゼータ(CD3ζ))、及び(3)正の共刺激分子、例えば、CD28及び/又は4-1BBからなる活性化レセプターを有する患者の免疫能力のあるT細胞を武装化(arm)するように設計される。患者から得られたT細胞を、ベクター、例えば、上記エレメントをコードする所望のDNA配列を、形質導入されたT細胞のゲノムに転写するレトロ又はレンチウイルスベクターで形質転換し、外因性のCARのエレメントが、形質導入されたT細胞において発現される。これらのエレメントの発現は、一般に、CARエレメントの連続的発現を提供する構成的プロモーター、又は誘導剤が存在する場合にのみCARエレメントの発現を提供する誘導性プロモーターのいずれかによって制御される。あるいは、プロモーターが内因性に調節され、内因性プロモーターによって通常制御されるタンパク質が発現される場合はいつでも、CARエレメントの発現を提供する。一般に、高レベルのタンパク質を誘導する強力なプロモーターは、遺伝子操作された細胞において望ましい。
大半の免疫能力のあるT細胞はCARの発現のために使用されるが、CD3-ゼータ及び共刺激CD28及び/又は4-1BB分子によって活性化できる任意の免疫細胞を用いてCARを発現させることができる。
CARを発現する患者の遺伝子操作されたT細胞は、例えば、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)制限なしに腫瘍標的を認識し、細胞傷害性エフェクター機構を介して標的を破壊することが可能である。
さらに、同種CAR-T細胞は、造血幹細胞ドナーのリンパ球で生成でき、例えば、同種移植後再発において使用することができる。
CAR-T細胞を用いる治療方法は、患者の新たに生成されたCAR-T細胞が静脈内注入後に戻る余地を作るために、患者のT細胞をリンパ枯渇させることを含む。免疫枯渇はさらに、残存腫瘍量の減少、炎症の誘導、腫瘍抗原の放出、及び、新たに注入され操作されたCAR-T細胞の機能を抑制する制御性T細胞の数の減少を引き起こす可能性がある。さらに、CARのいずれかのエレメントが非ヒト起源である場合、リンパ枯渇もまた、このCARエレメントに対する免疫化のリスクを低下させる可能性がある。CARの構築におけるヒト化免疫グロブリンの可変フラグメントの使用もまた、CARに対する免疫化のリスクを低下させることを助長し得る。
患者への注入後にCAR-T細胞を制御できないことから、安全性の懸念がある。例えば、臨床試験中にオンターゲット/オフ腫瘍及びオフターゲット抗原認識が一部の患者で観察された。さらに、in vivoでの制御不能なCAR-T細胞作用は、サイトカイン放出症候群及びCAR-T関連脳症症候群を含む重篤な有害事象を生じる可能性がある。例えば、CAR-T細胞療法の2つの主な安全性の懸念は、サイトカイン放出症候群と、例えば、CAR-T細胞関連脳症症候群のような神経毒性である。残念ながら、サイトカイン放出症候群は、比較的頻度が高く、CAR-T細胞療法を受けている患者の約50%~100%に起こりうる。さらに、T細胞、一般に、CAR-T細胞の広範な活性化は、T細胞死、すなわち、CAR-T集団の枯渇を特異的に導く。患者への注入後のCAR-T細胞の寿命を延ばすためには、CAR-T細胞活性化を制御することが望ましい。これらの安全性及び有効性の懸念は、CAR-T活性化、増殖を制御することができず、より重要なのは、治療用CAR-T細胞におけるCARの発現を終了できないことである。従って、治療用CAR-T細胞におけるCARの時間的及び空間的制御によって、この重要な技術の安全性及び有効性プロファイルを改善することができ、CAR-T細胞上のCARの発現レベルを微調整することによって、例えば、過剰なサイトカイン放出及びCAR-T細胞枯渇を抑制することができる。さらに、CAR-T細胞上のCAR微調整を可能にすることにより、CAR発現を寛解中にオフにし、疾患再発の場合はオンに戻すことができる。
CAR-T療法のさらなる問題は、標的細胞上の抗原発現の喪失に関連するCAR-T細胞療法後の応答の欠如又は低応答及び再発である。従って、2つ以上の抗原を標的とするCAR-T細胞の使用は、この問題に対処するのに有用である。このように、安全性と有効性の懸念及び潜在的な標的細胞抵抗に対処できる新たなCAR-T細胞療法を開発する必要がある。
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本発明は、キメラ抗原レセプター(CAR)T細胞系、この製造方法、及び標的免疫細胞で治療できる疾患の療法のための使用を提供する。本発明のCAR-T細胞系は、遺伝子操作されたCAR-T細胞におけるCAR発現を微調整するために使用できる、C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質3(NS3)プロテアーゼドメインに基づく誘導性スイッチ設計を含む。この設計により、CAR T細胞療法の安全性及び効力は、実質的に改善される。
利点を挙げると、本発明のCAR T細胞系のNS3プロテアーゼドメインがCAR発現を最大限に制御し、そのような存在が望ましくない場合に患者におけるCAR存在を回避するための手段として、形質導入されたT細胞におけるCARのデフォルトの自己タンパク質分解を提供する。
対照的に、CAR発現が望ましい場合、小分子インヒビターを投与して、NS3ドメインのタンパク質分解活性を阻害し、操作されたCAR-T細胞の表面上でのCARの発現を導くCAR自己タンパク質分解をブロックすることができる。さらに、操作されたCAR-T細胞で治療した対象への小分子インヒビターの用量依存的投与は、操作されたCAR-T細胞によるCAR発現のレベルの微調整を可能にし、例えば、標的細胞の残存負荷及び/又はサイトカイン放出症候群などの有害事象の発生に従って調整することができる。
利点を挙げると、本発明のCAR-T細胞系は、癌及び/又は免疫障害を治療するための癌及び/又は免疫障害関連抗原を含むがこれらに限定されない、種々の疾患関連抗原に対する種々の単鎖可変フラグメントを含むことができる。
さらに、療法効率を改善し、有害事象のリスクを低下させるために、同じ又は異なる標的細胞上の少なくとも2つの標的抗原を同時に標的とするCAR-T細胞系が提供される。
例えば、一実施形態において、本発明は、CD19-CAR及びCD22-CAR「カクテル」及び/又はCD19-CAR-T細胞及びCD22-CAR-T細胞「カクテル」を提供して、B細胞白血病の高効率治療を提供する。
利点を挙げると、本発明のCAR-T細胞系は、安全スイッチと二重標的設計とを組み合わせることである。例えば、この戦略は、CD19とCD22の両方を同時に標的とし、B細胞悪性腫瘍に対するより広範なカバーを可能にし、抗原喪失によって引き起こされる再発を減少させ、療法効率を改善する。さらに、新規なプロテアーゼスイッチ系は、CAR-T細胞活性の正確な調節を提供し、CAR発現を停止させることができるので、in vivoでCAR-T細胞消耗の回避を可能にして、患者におけるCAR-T細胞過剰活性化を防止し、CAR-T細胞寿命を延ばす。このように、この新規なCAR-T細胞系は、CAR-T細胞療法の安全性と効力を増加させるものである。
本特許又は出願書類は,色を付して作成された少なくとも1の図面を含んでいる。本特許又は特許出願公開の写しであって、色図面のものは、特許庁が要求し、かつ、必要な手数料を納付したときに提供される。
提供されるのは、キメラ-抗原-レセプター(CAR)T細胞系、その製造方法、腫瘍及び他の疾患の療法のためにこれらの系の使用である。本発明のCAR-T細胞系は、タンパク質機能の化学遺伝学的制御を使用して、カスタマイズされた信頼性のあるオン効果及びオフ効果の両方を達成する。本発明の誘導性スイッチ設計は、C型肝炎ウイルス(HCV)の非構造タンパク質3(NS3)プロテアーゼドメインに基づくものであり、NS3ドメインは特異的切断部位で自己切断する。
本発明のCAR-T細胞系のNS3プロテアーゼドメインは、CAR構築物内に局在化されて、NS3プロテアーゼの自己タンパク質分解活性がデフォルトでCAR構築物を切断する。対照的に、NS3タンパク質分解活性をブロックする小分子インヒビターの存在下で、本発明の操作されたCARは、CAR形質導入されたT細胞の表面上で発現される。本発明のCAR-T細胞系は、形質導入されたT細胞上でのCAR発現の用量依存性誘導、及び小分子インヒビターの離脱に際して、T細胞からのCARの除去を可能にする。従って、この新規な調節CAR-T細胞系は、形質導入されたT細胞上のCARの発現によるカスタマイズされたCAR-T細胞療法を可能にし、さらにCAR形質導入されたT細胞の維持を可能にする。
本発明の特定の実施形態において、CARを発現するT細胞は、(1)腫瘍標的又は免疫細胞標的に対して指向される免疫グロブリンの細胞質外可変フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント(scFv)、(2)NS3プロテアーゼドメイン、(3)ヒンジ領域、(4)膜貫通ドメイン、(5)例えば、CD28及び/又は4-1BB由来の少なくとも1つの正の共刺激分子ドメイン、及び(6)例えば、CD3-ゼータ由来の細胞内T細胞レセプター活性化分子ドメインを含む活性化レセプターを、患者の免疫能力のあるT細胞を武装化する遺伝子工学によって生成される。
いくつかの実施形態において、本発明のCARは、T細胞レセプターの細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用して操作される。他の実施形態において、T細胞レセプターの細胞内シグナル伝達ドメイン全体の一部を使用することができる。TCRの細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される際、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用される。特定の実施形態において、本発明のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRのエフェクター機能シグナルを形質導入することができる細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分である。
本発明のCARにおいて使用するための細胞内シグナル形質導入ドメインの例としては、抗原レセプター連結後にシグナル形質導入を開始するT細胞レセプター及びコレセプターの細胞質配列、これらの配列の任意の誘導体又は変異体、同等の機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、CARの細胞内ドメインは、二次又は共刺激シグナルをさらに含む。共刺激シグナル伝達部分は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの領域のことである。共刺激分子とは、抗原レセプター又はその配位子以外の細胞表面分子であり、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要である。
いくつかの実施形態において、T細胞活性化は、2つの異なる部類の細胞内シグナル伝達配列によって媒介される。すなわち、TCRを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの(一次細胞内シグナル伝達配列)及び二次シグナル又は補助刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの(二次細胞内シグナル伝達配列)である。
いくつかの実施形態において、本発明のCARの細胞内ドメインは、CD3-ゼータシグナル伝達ドメイン、及び、任意で、CARに関して有用な任意の他の所望の細胞質ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態において、CARの細胞内ドメインは、CD3-ゼータ鎖部分及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む。共刺激シグナル伝達ドメインを誘導し、本発明のCARの生成に用いることができる共刺激分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、TNFSF14、NKG2C、B7-H3、CD132、及びILRβ(CD122)が挙げられるが、これらに限定されない。補助刺激シグナル伝達エレメント(共刺激シグナル伝達ドメイン)としてのCD28及び4-1BBの使用は実施例で例示されるが、他の共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、TNFSF14、NKG2C、B7-H3、CD132、及びILRβ(CD122))を使用することができ、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態において、本発明のCARの細胞内ドメインは、CD3-ゼータ、CD28、及び4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない、1つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のCARは、CD8-アルファヒンジ領域、CD28ヒンジ領域、IgG4ヒンジ領域、IgG4mヒンジ領域、IgG1ヒンジ領域、IgG2ヒンジ領域を含むが、これらに限定されないヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明のCARは、IgG4CH2CH3ヒンジ及びスペーサー、IgG2CH2CH3ヒンジ及びスペーサー、又はIgG1CH2CH3ヒンジ及びスペーサーを含むが、これらに限定されないヒンジ領域及びスペーサーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のCARは、CD28膜貫通ドメイン、CD8-アルファ膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD3-ゼータ膜貫通ドメイン、又はICOS膜貫通ドメインを含むがこれらに限定されない膜貫通ドメインを含む。
本発明に従って有用なCARは、第1世代CAR、第2世代CAR、及び第3世代CARを含む。第1世代CARは、目的の抗原を特異的に認識する結合部分及びT細胞活性化シグナル伝達ドメイン(細胞内共刺激ドメインなし)を含む。第2及び第3世代CARは、種々の共刺激分子からのシグナル配列を含む。第2世代CARは、目的の抗原を特異的に認識する結合部分、T細胞活性化細胞内シグナル伝達ドメイン、及び1つの細胞内共刺激ドメインを含む。第3世代CARは、目的の抗原を特異的に認識する結合部分、T細胞活性化細胞内シグナル伝達ドメイン、及び2つ以上の細胞内共刺激ドメインを含む。
第1世代CARのいくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメインを含む。第2世代CARのいくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、CD3-ゼータ及びCD28のシグナル伝達ドメインを含む。第3世代CARのいくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、CD3-ゼータ、CD28及び4-1BBのシグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態において、CARの細胞質ドメインは、CD3-ゼータ、CD28、及び4-1BBシグナル伝達ドメインの任意の組み合わせ、又はT細胞活性化を誘導するのに有用な任意の他のシグナル伝達ドメインの任意の組み合わせを含む。
好ましい実施形態において、本発明のCARは、抗体(scFv)の単鎖可変フラグメント、C型肝炎ウイルス(HCV)の非構造タンパク質3(NS3)プロテアーゼドメイン、ヒトCD8ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒトCD3ゼータ、ヒトCD28及びヒト4-1BBシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、NS3プロテアーゼドメインは、特定の位置でCARに組み込まれ、NS3プロテアーゼ活性が、特定の所定のプロテアーゼ切断部位でCARタンパク質構築物を切断し、細胞表面上に無傷なCARタンパク質構築物の発現を妨げるようにする。
いくつかの実施形態において、NS3プロテアーゼドメインは、適切なNS3プロテアーゼ発現及び機能を確実にするために、HCVのNS4タンパク質配列をさらに含む。他の実施形態において、CAR構築物は、HCV NS2及びNS3プロテアーゼの配列に由来するプロテアーゼドメインを含む。本発明の好ましい実施形態において、NS3プロテアーゼドメインは、NS4A配列(NS3/4Aプロテアーゼドメイン)を含む。
いくつかの実施形態において、CAR-T細胞は、癌抗原及び/又は免疫細胞抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン、NS3/4Aプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及びCD3-ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、CAR-T細胞は、癌抗原及び/又は免疫細胞抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン、NS3/4Aプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、CD3-ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン、及びCD28の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、CAR-T細胞は、癌抗原及び/又は免疫細胞抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン、NS3/4Aプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、CD3-ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン、CD28の細胞内シグナル伝達ドメイン、及び4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、scFvは、フレキシブルリンカーによって融合された抗体重鎖及び軽鎖の可変部分を含む。本発明のCARのリンカーには配列番号995~997の単鎖可変フラグメントリンカーが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、フレキシブルリンカーによって、scFvが異なる方向に配向して抗原結合を可能にする。いくつかの実施形態において、本発明のCARは、T細胞において発現される場合、T細胞媒介免疫応答を活性化するために、抗原結合特異性に基づいて、抗原認識を指向することができる。
本発明のCARの単鎖可変ドメインは、標的細胞の表面上に存在する任意の1つ以上のタンパク質を標的とするように操作される。例えば、標的細胞上の抗原に結合する抗体の可変ドメイン領域は、CARの単鎖可変フラグメントとして操作され、特定の抗原を標的とする本発明のCAR-T細胞を生成するために使用される。本発明のCAR-T細胞によって標的化される抗原としては、寄生虫抗原、細菌抗原、ウイルス抗原及び自己抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明のCARは、抗癌剤抗体(抗癌剤scFv)、NS3/4Aプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒトCD8ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒトCD3-ゼータ、ヒトCD28、及びヒト4-1BBシグナル伝達ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のCARは、抗免疫細胞抗体(抗免疫細胞scFv)、NS3/4Aプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒトCD8ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒトCD3ゼータ、ヒトCD28、及びヒト4-1BBシグナル伝達ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のCARは、寄生虫抗原、細菌抗原及び/又はウイルス抗原(抗感染性scFv)に結合する抗体、NS3/4Aプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒトCD8ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒトCD3-ゼータ、ヒトCD28、及びヒト4-1BBシグナル伝達ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のCARは、自己免疫反応性細胞(抗自己免疫細胞scFv)に結合する抗体、NS3/4Aプロテアーゼドメイン、切断部位、ヒトCD8ヒンジ及び膜貫通ドメイン、ならびにヒトCD3-ゼータ、ヒトCD28、及びヒト4-1BBシグナル伝達ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。利点を挙げると、本発明のCARは、CAR-T細胞のCAR発現を微調整するために使用して、同様の抗原を発現する非自己反応性細胞を標的化することを回避するために、自己反応性細胞が標的化されると、CAR発現をオフにすることができる自己反応性細胞上の抗原の安全な標的化を可能にすることである。
抗癌剤抗体は、本明細書中で使用される場合、癌細胞上に存在する任意の抗原に結合する任意の抗体のことである。
抗免疫細胞抗体は、本明細書中で使用される場合、免疫細胞上に存在する任意の抗原に結合する任意の抗体のことである。
本発明のCARの操作において使用される可変ドメインを含む抗体の例としては、以下のもの挙げられるが、これらに限定されない。アルファフェトプロテイン1、未分化リンパ腫キナーゼ(CD246)、Vセットドメイン含有T細胞活性化インヒビター1、B細胞レセプターAbl融合タンパク質(Bcr/Abl)、絨毛性ゴナドトロピンベータサブユニット3(ベータ-HCG)、ベータ-2ミクログロブリン、B-rafプロトオンコジーン(BRAF)、乳癌1型感受性タンパク質(BRCA1)、乳癌2型感受性タンパク質(BRCA2)、B細胞成熟抗原(BCMA)、B7様分子H4(B7-H4)、癌抗原15-3(Ca15-3)、癌抗原19-9(Ca19-9)、カルシトニン、カルレチニン、ネプリリシン(CD10)、食作用性糖タンパク質-1(CD44)、プロテインチロシンホスファターゼレセプターC(CD45)、癌胎児性抗原(CEA)、クロモグラニンA、チロシンプロテインキナーゼキット(e-キット)、サイトケラチン19、上皮細胞接着因子レセプター(EGFR)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、エストロゲンレセプター-アルファ、エストロゲンレセプター-ベータ、葉酸レセプター1、精巣分泌物タンパク質E4(HE4)、グリピカン-3タンパク質(GPC-3)、免疫グロブリン関連ベータ(CD79b)、v-erb-b2赤芽球性白血病ウイルス性腫瘍遺伝子ホモログ2(HER2)、インヒビン、インテグリン関連タンパク質(IAP/CD47)、インターロイキン-3レセプター(CD123)、モノクローナル抗体Ki-67(Ki-67)識別抗原、キルステンラット肉腫ウイルス性腫瘍遺伝子ホモログ(KRAS)、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)、白血球抗原CD37、メラン-A(MART1)、メラノーマ細胞接着分子(MCAM/CD146)、メソテリン、ムチン1(MUC1)、ムチン16/卵巣癌抗原125(MUC16/CA125)、核マトリックタンパク質22(NMP22)、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、神経栄養性チロシンキナーゼレセプター関連1(ROR1)、神経成長因子レセプター(NGFR)、腫瘍タンパク質53(p53)、細胞骨格関連タンパク質4(p63)、プログラム細胞死タンパク質1(PD1)、プログラム細胞死-リガンド(PD-L1/CD274)、ピルビン酸キナーゼ筋肉(PKM)、ホスホリパーゼA2活性化タンパク質(PLAP)、ポドプラニン、プロゲステロンレセプター、前立腺特異的抗原(PSA)、シアル酸結合Ig様レクチン3(CD33)、S100カルシウム結合タンパク質A4(S100A4)、細胞ピンペプチダーゼインヒビターグレードE(SERPINE1)、分泌フリズルド関連タンパク質1(SFRP1)、これらに限定されないが、シグナル伝達リンパ活性化分子(CD150)、2B4(CD244)、CD84、NTB-A(Ly-108)、Ly-9(CD229)を含むシグナル伝達リンパ球活性化分子関連レセプター系列、シンデカン-1(CD138)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、チミジンキナーゼ、チログロブリン、トランスチレチン、転写終結因子1(TTF1)、プラスミノーゲンアクチベーターウロキナーゼ(uPA)、血管内皮増殖因子レセプター2(VEGR2)又はビメンチン。
本発明のいくつかの実施形態において、CARは、所望の標的抗原に結合する任意の可変ドメインの単鎖可変フラグメントを含む。利点を挙げると、所望の標的抗原に結合する任意の抗体の任意の可変ドメインを使用して、本発明のCARを生成することができる。というのは、抗体可変ドメインのアミノ酸配列は、本発明のCARの単鎖可変フラグメント配列に容易に変換することができるからである。例えば、いくつかの実施形態において、3つ以上の抗原に結合する可変ドメインを有する二重特異性抗体又は多重特異性抗体由来の可変ドメインを使用して、本発明のCARを生成することができる。いくつかの実施形態において、二重又は多重特異性抗体の第1の可変ドメインの重鎖及び軽鎖を使用して、1つのCARを生成することができ、二重又は多重特異性抗体の第2の可変ドメインの重鎖及び軽鎖を使用して、第2のCARを生成することができる。
いくつかの実施形態において、1つの抗体の1つの可変ドメインの重鎖及び/又は軽鎖ドメインと、二重特異性又は多重特異性抗体の第2の抗体の第2の可変ドメイン又は第2の可変ドメインの重鎖及び/又は軽鎖を使用して、本発明のCARを生成することができる。さらなる実施形態において、2つ以上の重鎖ドメインと2つ以上の軽鎖ドメインをリンカーによって組み合わせて、本発明の多重特異性CARを生成することができる。2つ以上の重鎖と2つ以上の軽鎖ドメインは、異なる抗体の単一可変ドメインからであっても、二重特異性又は多重特異性抗体の異なる可変ドメインからであってもよい。
さらなる実施形態において、軽鎖ドメインを含まない重鎖ドメインと重鎖ドメインを含まない軽鎖ドメインを使用して、本発明のCARを生成することができる。いくつかの実施形態において、第1の可変ドメインからの重鎖と第2の可変ドメインからの軽鎖を使用して、本発明のCARを生成することができる。いくつかの実施形態において、2つ以上の可変ドメインからの2つ以上の重鎖を組み合わせて、本発明のCARを生成することができる。いくつかの実施形態において、2つ以上の可変ドメインから2つ以上の軽鎖を組み合わせて、本発明のCARを生成することができる。なお、さらなる実施形態において、可変ドメインの2つ以上の第1のグループからの2つ以上の重鎖と可変ドメインの2つ以上の第2のグループからの2つ以上の軽鎖を組み合わせて、本発明のCARを生成することができる。
例えば、本発明のCARのscFvは、これらに限定されるものではないが、以下に挙げる抗体由来の可変配列を含む。Abagovomab、Abelacimab、Abituzumab、Abrezekimab、Abrilumab、Actoxumab、Adalimumab、Aducanaumab、Afasevikumab、Alacizumab、Alemtuzumab、Alirocumab、Amatuximab、Andecaliximab、Anetumab、Anifrolumab、Anrukizumab、Apamistamab、Aprutumab、Ascrinvacumab、Atezolizumab、Atidortozumab、Atinumab、Atoltivimab、Avelumab、Axicabtagene Ciloleucel、Azintuxizumab、Balstilimab、Bapineuzumab、Basiliximab、Bavituximab、Bedinvetmab、Begelomab、Belantamab、Belimumab、Bemarituzumab、Benralizumab、Berlimatoxumab、Bermekimab、Bersanlimab、Bevacizumab、Bezlotoxumab、Bimagrumab、Bimekizumab、Birtamimab、Bleselumab、Blinatumomab、Blontuvetmab、Blosozumab、Bococizumab、Brazikumab、Brentuximab、Briakinumab、Brodalumab、Broluczumab、Brontictuzumab、Budigalimab、Burosumab、Cabiralizumab、Camidanlumab、Camrelizumab、Canakinumab、Cantuzumab、Caplacizumab、Carlumab、Carotuximab、Cemiplimab、Candakimab、Cergutuzumab、Certolizumab、Cetrelimab、Cetuximab、Cibisatamab、Cinpanemab、Citatuzumab、Cixutumumab、Clazakizumab、Clervonafusp、Clivatuzumab、Cobolimab、Codrituzumab、Cofetuzumab、Coltuximab、Conatumumab、Concizumab、Cosfroviximab、Crenezumab、Crizanlizumab、Crotedumab、Crovalimab、Cusatuzumab、Dacetuzumab、Daclizumab、Dalotuzumab、Dapirolizumab、Daratumumab、Dectrekumab、Demcizumab、Denintuzumab、Denosumab、Depatuxizumab、Derlotuximab、Dezamizumab、Dilpacimab、Dinutuximab、Diridavumab、Disitamab、Domagrozumab、Donanemab、Dostarlimab、Drozitumab、Duligotuzumab、Dupilumab、Durvalumab、Dusigitumab、Duvortuxizumab、Eculizumab、Edrecolomab、Efalizumab、Efungumab、Eldelumab、Elezanumab、Elgemtumab、Elipovimab、Elotuzumab、Emactuzumab、Emapalumab、Emicizumab、Emibetuzumab、Enapotamab、Enavatuzumab、Enfortumab、Enoblituzumab、Enokizumab、Enoticumab、Ensituximab、Envafolimab、Epratuzumab、Eptinezumab、Erenumab、Etaracizumab、Etigilimab、Etokimab、Etrolizumab、Evinacumab、Evolocumab、Faricimab、Farletuzumab、Fasinumab、Fezakinumab、Ficlatuzumab、Figitumumab、Firivumab、Flanvotumab、Fletikumab、Flotetuzumab、Fontolizumab、Foralumab、Foravirumab、Fremanezumab、Fresolimumab、Frovocimab、Frunevetmab、Fulranumab、Futuximab (Zatuximab)、Galcanezumab、Galiximab、Gancotamab、Ganitumab、Gantenerumab、Garadacimab、Garetosmab、Gatipotuzumab、Gedivumab、Gemtuzumab、Gevokizumab、Gilvetmab、Gimsilumab、Girentuximab、Glembatumumab、Glenzocimab、Golimumab、Gosuranemab、Guselkumab、Ianalumab、Ibalizumab、Icrucumab、Idarucizumab、Ieramilimab、Ifabotuzumab、Iladatuzumab、Imalumab、Imaprelimab、Imgatuzumab、Inclacumab、Indatuximab、Indusatumab、Inebilizumab、Infliximab、Inotuzumab、Intetumumab、Ipilimumab、Iratumumab、Isatuximab、Iscalimab、Istiratumab、Itolizumab、Ixekizumab、Labetuzumab、Lacnotuzumab、Lacutamab、Ladiratuzumab、Lampalizumab、Lanadelumab、Landogrozumab、Laprituximab、Larcaviximab、Lebrikizumab、Lenvervimab、Lenzilumab、Leronlimab、Lesofavumab、Letolizumab、Levilimab、Lexatumumab、Lifastuzumab、Ligelizumab、Lilotomab、Lintuzumab、Lirilumab、Lodelcizumab、Lokivetmab、Loncastuximab、Lorukafusp、Lorvotuzumab、Losatuxizumab (Serclutamab)、Lucatumumab、Lulizumab、Lumiliximab、Lumretuzumab、Lupartumab、Lutikizumab、Maftivimab、Magrolimab、Margetuximab、Marstacimab、Matuzumab、Mavrilimumab、Mepolizumab、Milatuzumab、Mirikizumab、Mirvetuximab、Mitazalimab (Vanalimab)、Modotuximab、Mogamulizumab、Monalizumab、Mosunetuzumab、Motavizumab、Moxetumomab、Murlentamab、Muromonab (Zolimomab)、Namilumab、Naptumomab、Naratuximab、Narnatumab、Natalizumab、Navivumab、Navicixizumab、Naxitamab、Necitumumab、Nemolizumab、Nesvacumab、Netakimab、Nidanilimab、Nimacimab、Nimotuzumab、Nirsevimab、Nivolumab、Obexelimab、Obiltoxaximab、Obinutuzumab (Afutuzumab)、Ocaratuzumab、Ocrelizumab、Ofatumumab、Olaratumab、Oleclumab、Olendalizumab、Olinvacimab (Tanibirumab)、Olokizumab、Omalizumab、Omburtamab、Onartuzumab、Ontamalimab、Ontuxizumab、Onvatilimab、Opicinumab、Oportuzumab、Orilanolimab、Orticumab、Osocimab、Otelixizumab、Otilimab、Otlertuzumab、Oxelumab、Ozanezumab、Ozoralizumab、Pabinafusp、Palivizumab、Pamrevlumab、Panitumumab、Panobacumab、Parsatuzumab、Pasotuxizumab、Pateclizumab、Patritumab、Pembrolizumab (Lambrolizumab)、Pepinemab、Perakizumab、Pertuzumab、Pidilizumab、Pinatuzumab、Placulumab、Plamotamab、Plozalizumab、Polatuzumab、Ponezumab、Porgaviximab、Prasinezumab、Prezalumab、Pritoxaximab、Prolgolimab、Quetmolimab、Quilizumab、Racotumomab、Radretumab (Bifikafusp/Onfekafusp)、Rafivirumab、Ralpancizumab、Ramucirumab、Ranevetmab、Ranibizumab、Ravagalimab、Ravulizumab、Refanezumab、Relatlimab、Relfovetmab、Remtolumab、Reslizumab、Rilotumumab、Rinucumab、Risankizumab、Rituximab、Rivabazumab、Robatumumab、Roledumab、Rolinsatamab、Romilkimab、Romosozumab、Rontalizumab、Rosmantuzumab、Rovalpituzumab、Rozanolixizumab、Rozipafusp、Ruplizumab、Sacituzumab、Samalizumab、Samrotamab、Sarilumab、Satralizumab (Sapelizumab)、Secukinumab、Selicrelumab Semorinemab、Seribantumab、Setoxaximab、Setrusumab、Sifalimumab、Siltuximab、Simtuzumab、Sintilimab、Sirtratumab、Sirukumab、Sofituzumab、Solanezumab、Solitomab、Spartalizumab、Spesolimab、Suptavumab、Sutimlimab、Suvizumab、Suvratoxumab、Tabalumab、Tabituximab、Tadocizumab、Tafasitamab、Talacotuzumab、Tamrintamab、Tamtuvetmab、Tanezumab、Tarextumab、Tavolimab (Tavolixizumab)、Tebentafusp、Teclistamab、Telisotuzumab、Temelimab、Tenatumomab、Teplizumab、Tepoditamab、Teprotumumab、Tesidolumab、Tezepelumab、Tibulizumab、Tidutamab、Tigatuzumab、Tilavonemab、Tildrakizumab、Timolumab、Tiragolumab、Tislelizumab、Tisotumab、Tocilizumab、Tomaralimab、Tomuzotuximab、Toripalimab、Tosatoxumab、Tovetumab、Tralokinumab、Trastuzumab (Timigutuzumab)、Tregalizumab、Tremelimumab (Ticilimumab)、Trevogrumab、Ublituximab、Ulocuplumab、Urelumab、Ustekinumab、Utomilumab、Vadastuximab、Valanafusp、Vantictumab、Vanucizumab、Varisacumab、Varlilumab、Vatelizumab、Vedolizumab、Veltuzumab、Vesencumab、Vibecotamab、Visilizumab、Vobarilizumab、Vofatamab、Volagidemab、Vonlerolizumab (Pogalizumab)、Vopratelimab、Vorsetuzumab、Vunakizumab、Xentuzumab、Zalifrelimab、Zalutumumab、Zampilimab、Zanolimumab、Zenocutuzumab、Zolbetuximab (Claudiximab)、ならびに軽鎖及び/又は可変重鎖配列のいずれかの組み合わせ。上記抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、IMGTウェブサイトで入手可能である(Worldwide Website: imgt.orgを参照のこと。添付の配列リスト及び表2にも提供される)。
さらなる実施形態において、本開示後の任意の時点において、当技術分野で発見された任意の抗体の任意の可変領域を、本発明のCAR構築物に含めることができる。というのは、本開示に基づいて、当業者であれば、日常的な方法を用いて、可変領域配列をCAR構築物に組み込み、本発明に従ってCAR-T細胞を生成することができるからである。
好ましい実施形態において、本発明のCARの構築において使用される細胞結合抗体の単鎖可変フラグメントは、そのような結合フラグメントから生成されるCARの結合が、任意の二量化パートナーとの標的抗原の二量化を物理的にブロックするのに効率的であるように、標的抗原の膜近位領域に結合するフラグメントである。
いくつかの実施形態において、本発明のCARの抗原結合フラグメントは、標的細胞上の抗原に結合する設計されたアンキリン反復タンパク質に由来する。本発明のCARにおいて有用な設計されたアンキリン反復タンパク質の結合フラグメントは、フレームワーク配列及び可変配列の両方を含む1~20個、好ましくは2~6個のアンキリン反復を含み、アンキリン反復タンパク質ライブラリーから回収することができる。利点を挙げると、アンキリン反復タンパク質は、標的細胞の細胞表面上の所望の標的分子に結合し、高い安定性と低い抗原性を有しているため、有害な副作用の危険性を低下させることである。
本発明のCARは、CARが発現されるT細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つを活性化する少なくとも1つの細胞質ドメイン及び/又は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。本明細書中で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、特化した機能を細胞に実行するように指示するタンパク質の部分のことである。「エフェクター機能」という用語は、T細胞の特化した機能のことである。T細胞のエフェクター機能は、例えば、炎症性サイトカインの分泌を含む細胞傷害及び免疫刺激活性である。
いくつかの実施形態において、本発明のCARは、膜貫通ドメインをさらに含む。好ましい実施形態において、膜貫通ドメインは、CARの細胞外抗原結合ドメインに融合される。特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、その膜貫通ドメインが本発明のCARのドメインの1つと天然に関連する分子に由来する。特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、他の膜関連分子との望ましくない相互作用を最小限にするために、他の細胞膜分子の膜貫通ドメインへの結合を回避するように修飾される(例えば、アミノ酸置換によって)。
膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来する。いくつかの実施形態において、供給源は、天然であり、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来する。本発明による有用な膜貫通領域は、T細胞レセプターのアルファ、ベータ又はゼータ鎖、CD4、CD8-アルファ、CD28、CD3イプシロン、CD3ゼータ、CD45、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、及び/又はICOS(誘導性T細胞刺激剤)の膜貫通領域の少なくとも1つから誘導する、又はそれらを含むことができる。
いくつかの実施形態において、本発明に従って有用な膜貫通ドメインは合成され、主に疎水性残基、例えば、ロイシン及びバリンを含む。好ましくは、合成膜貫通ドメインのN及び/又はC末端は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンの三重項を含む。
任意で、本発明のCARの膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインは、好ましくは、2~10個のアミノ酸長の短いオリゴ又はポリペプチドスペーサーによって連結される。
本明細書中で使用される「スペーサー」又は「リンカー」という用語は、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン又は細胞内ドメインに連結するように機能する任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。スペーサーは、最大300個のアミノ酸、好ましくは、10~100個のアミノ酸、より好ましくは、25~50個のアミノ酸、最も好ましくは、5~20個のアミノ酸を含む。
本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、特異的切断部位を切断する。いくつかの実施形態において、切断部位は、例えば、切断側のN端末側に6個のアミノ酸、C末端部位に4個の残基を含むデカペプチドである。他の実施形態において、切断部位は、1~100個のアミノ酸及び間の任意の数のアミノ酸を含み、切断部位ペプチド内の任意の位置で切断される。
好ましい実施形態において、本発明のCARの切断部位は、アミノ酸DLEVVT/STWV、DEMEEC/SQHL、ECTTPC/SGSW及び/又はEDVVCC/SMSYを含み、「/」は切断されたペプチド結合を示す。
好ましい実施形態において、本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、単鎖可変フラグメントとヒンジ領域との間に位置する。
他の実施形態において、CARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、ヒンジ領域と膜貫通ドメインとの間に位置する。さらに他の実施形態において、NS3/4Aプロテアーゼドメインは、その存在がCARの発現、膜位置及び/又は機能を妨げない限り、細胞内ドメイン間、例えば、CD28ドメインと4-1BBドメインとの間、CD28ドメインとCD3-ゼータドメインとの間、4-1BBドメインとCD3-ゼータドメインとの間、又は本発明のCARの任意の部分内に位置する。
好ましい実施形態において、本発明のCARは、単一のNS3/4A切断部位を含む。他の好ましい実施形態において、本発明のCARは、2つ以上のNS3/4A切断部位を含む。
好ましい実施形態において、本発明のCARの単一NS3/4A切断部位は、NS3/4AプロテアーゼドメインのN末端に、又はそれに隣接して位置する。
他の好ましい実施形態において、本発明のCARの単一のNS3/4A切断部位は、NS3/4AプロテアーゼドメインのC末端に、又はそれに隣接して位置する。
より好ましい実施形態において、本発明のCARは、2つ以上のNS3/4A切断部位を含み、少なくとも1つのNS3/4A切断部位は、NS3/4AプロテアーゼドメインのN末端に、又はそれに隣接して位置する。
さらに好ましい実施形態において、本発明のCARは、2つ以上のNS3/4A切断部位を含み、少なくとも1つのNS3/4A切断部位は、NS3/4AプロテアーゼドメインのC末端に、又はそれに隣接して位置する。
最も好ましい実施形態において、本発明のCARは、2つ以上のNS3/4A切断部位を含み、少なくとも1つのNS3/4A切断部位は、NS3/4AプロテアーゼドメインのN末端又はそれに隣接して位置し、少なくとも1つの切断部位は、NS3/4AプロテアーゼドメインのC末端又はそれに隣接して位置する。
さらなる実施形態において、NS3/4A切断部位は、それらの存在がCARの発現、膜位置及び/又は機能を妨げない限り、本発明のCAR内の任意の位置に位置する。
いくつかの実施形態において、本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼは、NS3及び/又は4Aドメイン配列及び/又は切断部位内の少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含む突然変異を含む。
少なくとも1つの突然変異は、NS3及び/又はNS3/4Aプロテアーゼドメイン内の任意のアミノ酸位置で生じるが、好ましい位置は、アミノ酸36、43、54、80、122、及び168である(HCV NS3プロテアーゼドメインの位置1のAから開始される番号付け)。
いくつかの実施形態において、本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、野生型HCV NS3/4Aプロテアーゼドメインのアミノ酸配列を含む(配列番号980参照)。
いくつかの実施形態において、本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、HCV NS3/4AプロテアーゼドメインにおけるT54A置換を含む(配列番号981参照)。
いくつかの実施形態において、本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、NS3/4AプロテアーゼドメインのNS4A配列又はそれに隣接する単一の切断部位を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、本発明のCAR構築物のCD8ヒンジのC末端又はC末端に隣接する単一の切断部位を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のある本発明のNS3/4Aプロテアーゼを与える少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態において、本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、アスナプレビルによる阻害に対して感受性のあるNS3/4Aプロテアーゼを与える少なくとも1つの突然変異を含む(配列番号982参照)。
いくつかの実施形態において、本発明のCARのNS3/4Aプロテアーゼドメインは、小分子インヒビターテラプレビルによる阻害に対して感受性のあるNS3/4Aプロテアーゼを与える少なくとも1つのアミノ酸置換を含む(配列番号983参照)。
好ましい実施形態において、本発明のCARは、これらに限定されるものではないが、アスナプレビル、テラプレビル、シメプレビル、ファルダプレビル、ダノプレビル、バニプレビル、ナルラプレビル/r、MK-5172、ABT-450/r、ACH-1625、ACH-2684、GS-9256、GS-9451、及びIDX320を含む小分子インヒビターによってそのプロテアーゼ活性が阻害される少なくとも1つのNS3/4Aプロテアーゼドメインを含む。
利点を挙げると、本発明のCARは、小分子インヒビターの非存在下で、特異的切断部位においてNS3/4Aプロテアーゼドメインによって切断される。対照的に、NS3/4Aドメインを小分子インヒビターの結合及び阻害に対して感受性のあるNS3/4Aプロテアーゼドメインにおける少なくとも1つの突然変異を含む本発明のCARは、本発明のこのようなCAR構築物で形質導入されたT細胞を有効量の小分子インヒビターと接触させることによって阻害される。
本明細書中で使用される小分子インヒビターの「有効量」とは、本発明のCAR構築物で形質導入された細胞の細胞膜上にCARの存在を生じる任意の量である。
疾患の治療又は予防について使用される場合、本明細書中で使用される「有効量」という用語は、疾患又は状態を治療又は改善する、その他意図される療法効果(例えば、自己反応性細胞のレベルを予防又は減少させること)を生じ得る量のことである。
例えば、それを必要とする対象に投与されるCAR-T細胞の療法有効量は、投与当たり、これらに限定されるものではないが、約102~約1013、約103~約1012、約104~約1011、約105~約1010、約106~約109、及びこれらの間の任意の数、例えば、1×102、1.1×102、1.2×102、1.3×102、1.4×102、1.5×102、1.6×102、1.7×102、1.8×102、1.9×102及び2×2102をはじめとする約10~約1014個の細胞である。
本明細書中で使用される「治療」(治療する等)という用語は、疾患又は状態の症状を改善又は軽減すること、状態の進行、重症度、及び/又は範囲を減少、抑制、阻害、軽減、又は影響を及ぼすことを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「予防」(予防する等)という用語は、これらに限定されるものではないが、症状の発症を遅延させる、疾患の再発を予防する、再発エピソードの数又は頻度を減少させる、症候性エピソード間の潜伏期間を増加させる、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、細胞の混合集団は、本発明のCAR-T細胞又はドナー対象で治療する疾患を有する患者から抽出される。続いて、単離されたT細胞における本発明のCARのレトロウイルス又はレンチウイルス媒介発現が行われ、1~1014の範囲の療法有効量のCAR-T細胞が、患者に輸注される。本発明のCAR-T細胞は、in vivoで複製することができ、その結果、持続的な疾患制御につながる長期残存性が得られる。例えば、輸注されたCAR-T細胞は、投与後少なくとも1ヶ月間、患者に残存する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたCAR-T細胞の残存集団は、投与後、少なくとも4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、2年、又は3年間、ヒトに残存する。
さらに、第1の抗原に結合する単鎖可変フラグメントを有するCARをコードする少なくとも1つのCAR構築物で形質導入されたT細胞と、第2の抗原に結合する単鎖可変フラグメントを有するCARをコードする少なくとも1つのCAR構築物で形質導入されたT細胞とを含む二重スイッチCAR-T細胞系が提供される。
いくつかの実施形態において、第1の抗原に結合するscFv及び第2の抗原に結合するscFvをコードするCAR構築物は、単一のベクター内で組み合わされて同じT細胞に転写される。
他の実施形態において、第1の抗原に結合するscFv及び第2の抗原に結合するscFvをコードするCAR構築物は、別々のベクターに含まれ、異なるT細胞に転写される。
好ましい実施形態において、第1の抗原に結合するscFvをコードするCARは、小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるNS3/4Aドメインにする少なくとも1つの突然変異を含むNS3/4Aプロテアーゼドメインを含む。
さらに好ましい実施形態において、第2の抗原に結合するscFvをコードするCARは、異なる小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のある少なくとも1つの突然変異を含むNS3/4Aプロテアーゼドメインを含む。
より好ましい実施形態において、第1の抗原に結合するscFv及び第2の抗原に結合するscFvをコードするCAR構築物は、異なる小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるNS3/4Aプロテアーゼドメインを含む。
最も好ましい実施形態において、本発明の第1のCAR構築物は、CD19抗原に結合するscFvをコードし、小分子インヒビターアスナプレビルによる阻害に対して感受性のあるNS3/4Aプロテアーゼドメインを含み、第2のCAR構築物は、CD22抗原に結合するscFvをコードし、小分子インヒビターテラプレビルによる阻害に対して感受性のあるNS3/4Aプロテアーゼドメインを含む。
例えば、いくつかの実施形態において、NS3/4Aプロテアーゼスイッチの異なる変異体を使用して、スイッチ可能な抗CD19CAR及びスイッチ可能な抗CD22CAR(例えば、発現ベクタープラスミドpLVXを参照のこと)の両方をコードするレンチウイルスベクターが構築される。なお、異なるNS3/4A変異体は、異なる小分子インヒビターによって阻害される。単一のレンチウイルス発現プラスミドからの2つのCARの同時発現は、例えば、自己切断ウイルス2Aペプチド配列によって達成される。各CARは、例えば、CD3ゼータ活性化ドメイン(第3世代)に加えて、CD28及び4-1-BB共刺激ドメインを含む。レンチウイルスを、発現ベクターをレンチウイルスエンベローププラスミド、例えば、プラスミドpPAX2、及びレンチウイルスパッケージングプラスミド、例えば、pMD2.G、で293T細胞に同時トランスフェクトすることによって293T細胞中にパッケージングし、トランスフェクトされた293T細胞によって作製されたレンチウイルスを採取する。このようにして生成されたレンチウイルスは、抗CD19CAR構築物及び抗CD22CAR構築物を含み、CAR-T療法を必要とする患者から得られたT細胞又はドナーから得られたT細胞を形質導入するために使用される。CAR-T細胞は、続いて、注入によってCAR-T細胞療法を必要とする患者に投与される。
利点を挙げると、本発明のCAR-T細胞は、小分子インヒビター、例えば、アスナプレビルの非存在下で培養される場合、CD19-CARに対する抗体及びフローサイトメトリーによって測定されるように、細胞表面上でCARを発現しない。
しかしながら、アスナプレビルの存在下では、T細胞の大部分が、フローサイトメトリーによって測定されるように、それらの細胞表面上で本発明のCARを発現する。
さらに、形質導入されたT細胞の細胞表面上に存在する本発明のCARの発現レベルは、増加する濃度のアスナプレビルへのT細胞の曝露と共に増加する。
アスナプレビルの存在下でのCAR-T細胞上のCARの発現レベルは、経時で安定している。例えば、発現レベルは、少なくとも1時間~約4週間、例えば、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、12時間、14時間、16時間、18時間、20時間、24時間、30時間、36時間、40時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、1週間、2週間、3週間、及び/又は4週間安定である。
重要なのは、本発明のCARにおけるNS3/4Aプロテアーゼドメインの存在は、本発明のCARを発現するT細胞の殺傷能力に対して負の影響がないことである。例えば、NS3/4Aプロテアーゼドメインを有さないCARを発現するT細胞の殺腫瘍又は癌細胞殺傷活性は、CAR-T細胞がNS3/4aプロテアーゼドメインを発現する本発明のCAR-T細胞の殺腫瘍活性と同様である。
利点を挙げると、小分子インヒビターが離脱すると、CAR-T細胞の細胞表面上の本発明のCARの発現レベルは、大幅に減少するか、又はCARはインヒビター処理されたCAR-T細胞の表面に存在しないことである。
例えば、24時間のアスナプレビルの離脱により、CAR-T細胞の表面上のCARが大幅に減少し、48時間のアスナプレビルの離脱だと、CAR-T細胞上のCARがなくなる。
しかしながら、本発明のCAR-T細胞は、小分子インヒビターの有無により、アポトーシス細胞死、壊死細胞死、及び/又はオートファジーとならない。
さらに、本発明のCAR-T細胞は、小分子インヒビターの有無により、CD4及び/又はCD8発現レベルを変化させない。
CAR-T細胞の表面からのCARの効率的な除去は、本発明のCAR-T細胞の非活性化状態への戻りを可能にする。T細胞、一般に、CAR-T細胞の広範な活性化は、細胞死、すなわち、CAR-T細胞集団の枯渇を特異的に導くので、本発明のCARのオン/オフスイッチは、患者におけるCAR-T細胞の生存率を延長し、活性化誘導細胞死及びCAR-T細胞枯渇を回避する。
核酸分子、ベクター及び発現構築物
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗原特異的CARをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、本発明の抗原特異的CARをコードする核酸分子を含む発現構築物及びベクターも提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗原特異的CARをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、本発明の抗原特異的CARをコードする核酸分子を含む発現構築物及びベクターも提供する。
好ましい実施形態において、CAR配列は、CARのより一貫した表面準位発現を可能にするために、T細胞ゲノムへのCAR構築物の部位指向性挿入を可能にする遺伝子構築物に含まれる。
本発明に従って有用な核酸配列は、例えば、目的の遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、同じものを含むことが知られているベクターから目的の遺伝子を誘導することによって、又は同じものを含む細胞及び組織から直接単離することによって、当該分野で公知の組換え方法を使用して得られる。あるいは、目的の核酸配列は、合成により生成される。
CARをコードする天然又は合成核酸の発現は、CARポリペプチド又はその部分をコードする核酸をプロモーターに動作可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物における複製及び統合(integration)に適切である。典型的なクローニングベクターは、開始配列、所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーター、転写及び翻訳ターミネーターを含む。
本明細書中で使用される「発現構築物」という用語は、動作可能に連結された核酸配列を転写する核酸配列の組み合わせのことである。本発明の発現構築物はまた、一般に、発現構築物が発現されるべき意図される宿主細胞において機能的である調節エレメントを含む。調節エレメントには、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー、及びポリアデニル化エレメントが含まれる。
本発明の発現構築物は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーター配列を含む。プロモーターは、当該分野で公知の標準的な技術を使用して、ポリヌクレオチドに組み込まれる。プロモーター又は複数のプロモーターの複数のコピーを、本発明の発現構築物において使用することができる。好ましい実施形態において、プロモーターは、天然の遺伝的環境における転写開始部位からとほぼ同じ転写開始部位からの距離に位置する。この距離のいくらかの変更は、プロモーター活性を大幅に減少することなく可能である。転写開始部位は、典型的には、発現構築物中に含まれる。
本明細書中で使用される「動作可能に連結された」という用語は、記載される成分の並置をいい、成分は、意図される様式でそれらが機能することを可能にする関係にある。一般に、動作可能に連結された成分は、連続した関係にある。コード配列に動作可能に連結された配列は、コード配列の複製、転写及び/又は翻訳に影響を及ぼす。例えば、プロモーターがそのコード配列の転写を指示できる場合、コード配列はプロモーターに動作可能に連結される。
「コード配列」又は「コード領域」は、mRNAに転写され、及び/又はポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。例えば、コード配列は、目的のポリペプチドをコードする。コード配列の境界は、5'末端にある翻訳開始コドンと3'末端にある翻訳終結コドンとによって決まる。
本明細書中で使用される「プロモーター」という用語は、所望の分子をコードする核酸配列のような転写されるべき核酸配列に動作可能に連結されたDNA配列のことである。プロモーターは、一般に、転写されるべき核酸配列の上流に位置し、RNAポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。特定の実施形態において、プロモーターは、一般に、転写されて所望の分子を生成する核酸配列の上流に位置し、RNAポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。
特定の実施形態において、本発明に有用なプロモーターは、これらに限定されるものではないが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、伸長成長因子-1a(EF-1a)プロモーター、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)長末端反復(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン-バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。
本発明に有用なベクターは、これらに限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、及びレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターが含まれる。
好ましい実施形態において、癌抗原又は免疫疾患抗原に特異的なCARをコードする核酸分子を含むレンチウイルスベクターが提供される。本発明のCAR構築物がウイルスベクターのパッケージング容量を超えるサイズを有する場合、CAR構築物を標的細胞に転写するために、ピギーバックトランスポゾン系を含むがこれに限定されない代替的な方法が使用される。
T細胞の形質導入、単離、濃縮
いくつかの実施形態において、T細胞は、これらに限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターを含む種々のウイルスベクターを使用して形質導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、本発明のCARをコードする核酸分子を含む。
いくつかの実施形態において、T細胞は、これらに限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターを含む種々のウイルスベクターを使用して形質導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、本発明のCARをコードする核酸分子を含む。
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に転写又は導入されるプロセスのことである。
いくつかの実施形態において、本発明は、T細胞の形質導入のためのレンチウイルスベクターの使用を提供する。レンチウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期にわたる安定した統合と娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を達成する適切なツールである。レンチウイルスベクターは、非増殖性細胞を形質導入できる点で、例えば、マウス白血病ウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクターよりも付加的な利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低い免疫原性という付加的な利点も有する。
選択された遺伝子は、ベクターに挿入され、当該分野で公知の技術を使用して、ウイルス(レンチウイルス等)粒子にパッケージングされる。次いで、組換えウイルスは、単離され、細胞、例えば、対象のT細胞に、in vivo又はex vivoのいずれかで送達される。いくつかの実施形態において、本発明のレンチウイルスベクターは、本発明のCARをコードする核酸分子を含む。
いくつかの実施形態において、CARポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれかを含む。レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされ、及び/又は感染された細胞を同定するため、そして調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織中に存在しないか、又は発現されず、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性や蛍光活性によって示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、及び任意の蛍光タンパク質遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質が挙げられる。適切な発現系は当該分野で周知であり、当該分野で公知の技術を使用して調製又は商業的に入手される。
本明細書で用いられる「活性化」(活性化する等)という用語は、検出可能な細胞増殖を誘発するために十分に刺激されたT細胞の状態を意味する。活性化はまた、誘導されたサイトカイン生成、及び検出可能なエフェクター機能とも関連する。
本明細書で使用される「活性化T細胞」という用語は、特に、細胞分裂を受けているT細胞のことである。
一実施形態において、本発明のT細胞の増殖及び遺伝子改変の前に、T細胞の供給源は、対象から得られる。
本明細書で用いられる「単離」(単離する等)という用語は、どの細胞が単離されたかに基づいて、その自然環境(末梢血等)から除去され、天然に存在するが、細胞表面マーカーのない他の細胞を少なくとも約75%、最も好ましくは約90%含まない血液の混合物から分離された細胞を指す。
T細胞は、これらに限定されるものではないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の源から得ることができる。本発明の特定の実施形態において、当該分野で利用可能な任意の数のT細胞株が使用される。
好ましい実施形態において、T細胞は、CAR-T細胞富化組成物が続いて導入される対象の血液又は骨髄から単離及び精製される。対象は、免疫細胞関連抗原に対する免疫応答の抑制が望まれる、癌患者又は免疫関連疾患に罹患している患者である。いくつかの実施形態において、対象は、癌又は自己免疫疾患に罹患したヒトである。
あるいは、T細胞は、患者とは異なるドナーから得られる。特定の実施形態において、T細胞は、Ficoll(商標)分離などの当業者に公知の数多くある技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得られる。好ましい実施形態において、個別の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含む。
いくつかの実施形態において、アフェレーシス又はFicoll(商標)分離によって収集された細胞は、洗浄されて、血漿画分を除去し、細胞を、その後の処理工程のために適切な緩衝液又は培地中に配置する。さらなる実施形態において、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄する。変形実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを含まず、マグネシウムを含まず、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを含んでいなくてよい。当業者であれば容易に理解されるように、洗浄工程は、製造者の指示に従って、半自動「フロースルー」遠心分離機(例えば、Cobe2991細胞プロセッサー、Baxter CytoMate、又はHaemonetics Cell Saver 5)を使用する等して、当業者に公知の方法によって行われる。洗浄後、細胞は、例えば、Ca2+を含まない、Mg2+を含まないPBS、血漿液A、autoMACS Running Buffer、緩衝液有りの他の生理食塩水、又は緩衝液無しの他の生理食塩水といった種々の生体適合性緩衝液中に再懸濁される。例えば、autoMACS Running Bufferは、ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.09%アジドを含む。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁してもよい。
採取されたリンパ球は、本明細書に記載されるようなT細胞特異的細胞マーカーに基づく細胞分離技術を用いて分離される。血液サンプルから得られた細胞の中から表現型の特徴を選択することによって、種特異的種類のマーカーを認識する抗体が、T細胞を濃縮及び選択するために使用される。例えば、CD4、CD25、及びCD45RAの種特異的種類を認識する抗体、及び当技術分野で公知の他のマーカーを使用して、ヒトからT細胞を濃縮又は単離する(例えば、ヒトT細胞についてヒトCD4に対する抗体)。
特定の実施形態において、T細胞が、T細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する試薬を使用して細胞集団から濃縮され、当技術分野で知られているように、蛍光活性化細胞選別(FACS)、固相磁気ビーズ等の細胞選別アッセイを使用してこれらの細胞を分離する。いくつかの実施形態において、細胞を選別するための方法の組み合わせ、例えば、磁気選択、続いてFACSを使用することができる。濃縮を促進するために、例えば、T細胞上で発現される表面マーカーを使用する正の選択を、例えば、T細胞上で発現されない表面マーカーを使用する負の選択と組み合わせる。細胞表面マーカーを用いたT細胞の単離/濃縮は、任意の順序で行うことができることが意図される。従って、正の選択ステップは、負の選択ステップの直前にあってよく、その逆であってもよい。単離/濃縮は、正の選択ステップ及び負の選択ステップをグループ化することによって行われることも意図される。従って、単離/濃縮は、最初に方法のポジティブ選択ステップを実行し、続いて方法のネガティブ選択ステップを実行することによって行われる。又はその逆でもよい。
非CD4+及び非CD8+免疫細胞を枯渇させることによって、CD4+及びCD8+細胞を濃縮することもできる。このような細胞型には、これらに限定されるものではないが、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、単球、顆粒球及び赤血球細胞が含まれる。非CD4+及び非CD8+細胞を枯渇させるために使用される表面マーカーに対する抗体は当該分野で公知であり、これらに限定されるものではないが、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、及びグリコホリンAを含む。
例えば、本発明の一実施形態において、細胞の集団は、まず、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、及びグリコホリンAのうちの1つ以上に結合する第1の試薬又は試薬の基と接触し、続いて、CD4及び/又はCD8及び/又はCD45RAにそれぞれ結合する試薬と接触する。
所望のCARを発現するためのT細胞の遺伝子改変の前又は後にかかわらず、T細胞は、当該分野で公知の方法を一般的に使用して、活性化されて増殖される。
一般に、本発明のCAR-T細胞は、CD3TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤、及びT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを付着させた表面と接触させることによって拡張する。特に、T細胞集団は、本明細書中に記載されるように、例えば、抗CD3抗体、又はその抗原結合フラグメント、又は表面に固定化された抗CD3抗体との接触によって、又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼCアクチベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触によって刺激される。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触する。
特定の実施形態において、T細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供される。例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中にあってもよいし、表面に結合されていてもよい。表面に結合される場合、薬剤は同じ表面に(すなわち、「シス」形成で)、又は別の表面に(すなわち、「トランス」形成で)結合される。あるいは、一方の薬剤を表面に結合させ、他方の薬剤を溶液中に存在させてもよい。一実施形態において、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合され、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合される。特定の実施形態において、両方の薬剤が溶液中に存在する。他の実施形態において、薬剤は、可溶形態であってもよく、次いで、Fcレセプターを発現する細胞、又は薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。
いくつかの実施形態において、2つの薬剤は同じビーズ上、すなわち「シス」、又は別のビーズ、すなわち、「トランス」のいずれかに固定される。一例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗CD3抗体又はその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗CD28抗体又はその抗原結合フラグメントであり、両方の薬剤が等価分子量で同じビーズに共固定化される。一実施形態において、T細胞拡張及びT細胞増殖のためにビーズに結合した各抗体の1:1の比が使用される。本発明の特定の態様において、ビーズに結合した抗CD3:CD28抗体の比は、1:1の比を使用して観察される拡大と比較して、T細胞拡張の増加が観察されるようなものを使用する。
いくつかの実施形態において、ビーズに結合したCD3:CD28抗体の比は、100:1~1:100の範囲であり、それらの間のすべての整数値である。本発明のいくつかの実施形態において、CD3:CD28の比が1未満であるように、抗CD3抗体よりも多くの抗CD28抗体が粒子に結合される。
特定の実施形態において、ビーズに結合した抗CD28抗体対抗CD3抗体の比は、2:1より大きい。特定の一実施形態において、ビーズに結合した抗体の1:100のCD3:CD28比が使用される。他の実施形態において、ビーズに結合した1:75のCD3:CD28比の抗体が使用される。さらなる実施形態において、ビーズに結合した抗体の1:50のCD3:CD28比が使用される。他の実施形態において、ビーズに結合した抗体の1:30のCD3:CD28比が使用される。1つの好ましい実施形態において、ビーズに結合した抗体の1:10のCD3:CD28比が使用される。他の実施形態において、ビーズに結合した抗体の1:3のCD3:CD28比が使用される。さらに他の実施形態において、ビーズに結合した抗体の3:1のCD3:CD28比が使用される。
粒子対細胞の比率は、1:500~500:1の範囲であり、間の任意の整数値を用いて、T細胞又は他の標的細胞を刺激する。当業者であれば容易に理解されるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒子サイズに依る。例えば、小さなサイズのビーズは、数個の細胞のみにしか結合できないが、大きなビーズは多くに結合できる。特定の実施形態において、細胞対粒子の比は、1:100~100:1の範囲であり、間の整数値、そして、さらなる実施形態においては、比は1:9~9:1であり、間の任意の整数値を用いて、T細胞を刺激する。他の実施形態において、粒子は、毎日又は1日おきに添加される。当業者であれば、様々な他の比率が、本発明での使用に適していることが分かるはずである。特に、比率は、粒子サイズに応じて変えられる。
さらなる実施形態において、T細胞を、薬剤でコーティングされたビーズと組み合わせ、ビーズ及び細胞を続いて分離し、分離された細胞を培養する。変形実施形態において、培養の前に、薬剤でコーティングされたビーズ及び細胞は分離せず、一緒に培養される。さらなる実施形態において、ビーズ及び細胞を、まず、磁力等の力の適用によって濃縮して、細胞表面マーカーの結合を増やすことによって、細胞刺激を誘導する。
いくつかの実施形態において、薬剤でコーティングされたビーズと細胞の混合物を、数時間(約3時間)~約21日間、又は間の任意の時間での整数値の間、培養する。好ましい実施形態において、ビーズ及びT細胞は、約8日間一緒に培養する。他の好ましい実施形態において、ビーズ及びT細胞は、2~3日間一緒に培養する。T細胞の培養時間が60日以上となるようなサイクルでの刺激も望ましい。
T細胞培養に適切な条件としては、血清(例えば、ウシ胎児又はヒト血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、及びTNF-α、又は当業者に公知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存に必要な因子を含む適切な培地(例えば、最小必須培地又はRPM1培地1640、又はX-vivo15(Lonza))が挙げられる。細胞の成長のための他の添加剤としては、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、プラスマネート、及び、N-アセチル-システイン及び2-メルカプトエタノール等の還元剤が挙げられる。培地は、RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo15、X-Vivo20、及びOptimizerを含み、血清を含まないか、適切な量の血清(又はプラズマ)又は規定したセットのホルモン、及び/又はT細胞の成長及び増殖に十分な量のサイトカインが補充された、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加される。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養物中にのみ含まれ、対象に注入されるべき細胞の培養物中には含まれない。標的細胞を、成長を支持するために必須の条件下、例えば、適切な温度(例えば、37℃)及び空気(例えば、空気プラス5%CO2)で維持する。
抗体と抗体ドメイン
本発明において使用することが意図される抗体は、全免疫グロブリン、Fv、Fab及び同様のフラグメント等の抗体フラグメント、可変ドメイン相補性決定領域(CDR)を含む単鎖抗体、及び同様の形態を含む、様々な形態のいずれかであり、これらは全て、本明細書中で使用される広義の用語「抗体」に含まれる。
本発明において使用することが意図される抗体は、全免疫グロブリン、Fv、Fab及び同様のフラグメント等の抗体フラグメント、可変ドメイン相補性決定領域(CDR)を含む単鎖抗体、及び同様の形態を含む、様々な形態のいずれかであり、これらは全て、本明細書中で使用される広義の用語「抗体」に含まれる。
本明細書中で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列と同一、実質的に同一、又はそれに由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むものとする。このようなヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含む(例えば、in vitroでのランダム又は部位特異的突然変異誘発によって、又はin vivoでの体細胞突然変異によって導入される突然変異)。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むものではない。
「抗体フラグメント」という用語は、全長抗体の一部、一般に、抗原結合又は可変領域のことである。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFvフラグメントが含まれる。抗体のパパイン消化は、Fabフラグメントと呼ばれる、2つの同一の抗原結合フラグメントを生成し、それぞれ、単一の抗原結合部位を有し、容易に結晶化する能力のための、いわゆる、残りの「Fc」フラグメントを有する。抗体のペプシン処理は、抗原を架橋することができる2つの抗原結合フラグメント、及び残りの他のフラグメント(pFc'と呼ばれる)を有するF(ab')2フラグメントを生じる。さらなるフラグメントとしては、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。本明細書中で使用される、抗体に関する「抗原結合フラグメント」とは、例えば、Fv、F(ab)及びF(ab')2フラグメントのことである。結合にとって特に重要なのは、本明細書中に例示されるアミノ酸配列のN末端の最初の110~130のアミノ酸である。このように、可変領域を構成するN末端110、115、120、125、又は130のアミノ酸における高い同一性が好ましい。変異体配列は、好ましくは、この領域において75%、90%、又は95%を超える同一性を有する。
Fabは、抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含有する抗体のフラグメントである。Fabフラグメントは、酵素パパインで全抗体を消化して、無傷の軽鎖及び1つの重鎖の一部を生じることにより、生成される。
Fab'は、全抗体をペプシンで処理し、続いて還元すると、無傷の軽鎖及び重鎖の一部を生じる、抗体分子のフラグメントである。抗体1分子当たり2つのFab'フラグメントが得られる。Fab'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端に数個の残基を付加されているところが、Fabフラグメントとは異なる。
(Fab')2は、後の還元なしに全抗体を酵素ペプシンで処理することによって得られる抗体のフラグメントである。F(ab')2は、2つのジスルフィド結合によって一緒に保持された2つのFab'フラグメントの二量体である。
Fvは、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、密接な非共有結合(VH-VLダイマー)における1つの重鎖及び1つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。この立体構造においては、個々の可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面に抗原結合部位を画定する。まとめると、6つのCDRによって、抗体に対する抗原結合特異性が付与される。
しかしながら、抗原に特異的な3つのCDRのみを含む単一の可変ドメイン、又はFvの半分であっても、結合部位全体よりも低い親和性の可能性はあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
単鎖抗体は、軽鎖(VL)の可変領域、重鎖(VH)の可変領域を含み、遺伝的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、遺伝子操作された分子と定義される。このような単鎖抗体はまた、「単鎖Fv」又は「sFv」抗体フラグメントとも呼ばれる。一般に、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、VHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。
「特異的結合」又は「特異性」とは、抗体又は他の薬剤が抗原上に提示されたエピトープに検出可能に結合する一方で、他のタンパク質又は構造との検出可能な反応性が比較的少ない能力のことである。特異性は、例えば、Biacore機器を使用して、結合アッセイ又は競合結合アッセイによって相対的に判断される。特異性は、例えば、特異的抗原への結合におけるアフィニティー/アビディティーの約10:1、約20:1、約50:1、約100:1、10.000:1以上の比、又は他の無関係な分子への非特異的結合によって示すことができる。
抗体最適化のための方策は、ランダム突然変異誘発を用いてなされることがある。これらの場合、位置はランダムに選択されるか、又はアミノ酸変化はアラニンへの全ての残基の連続的な変化のような単純化されたルールを使用してなされる。アラニンスキャニング突然変異誘発もまた、例えば、抗体の抗原結合残基をマッピングするために使用される。親和性成熟の配列ベースの方法もまた、抗体の結合親和性を増加させるために使用される。
本発明の範囲内の抗体は、IgG、IgA、IgE、IgD、及びIgMを含む任意のアイソタイプのものである。IgGアイソタイプ抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4サブタイプにさらに細分することができる。IgA抗体は、IgA1及びIgA2サブタイプにさらに細分することができる。
製剤及び投与
いくつかの実施形態において、本発明のCARを発現するT細胞は、対象に投与される。本明細書で使用される「対象」という用語は、霊長類などの哺乳動物を含む生物を表す。開示された治療方法から利益を得ることができる哺乳動物種には、これらに限定されるものではないが、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒトサル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、及びハムスター等の家畜化及び実験動物が含まれる。特定の一実施形態において、対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、本発明のCARを発現するT細胞は、対象に投与される。本明細書で使用される「対象」という用語は、霊長類などの哺乳動物を含む生物を表す。開示された治療方法から利益を得ることができる哺乳動物種には、これらに限定されるものではないが、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒトサル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、及びハムスター等の家畜化及び実験動物が含まれる。特定の一実施形態において、対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、本発明に従って操作された有効量のCAR発現T細胞は、疾患の治療を必要とする患者に投与され、養子細胞移植のような当該分野で周知の方法を使用して実施される。
一実施形態において、細胞の混合集団が、本発明のCAR-T細胞又はドナー対象で治療されるべき疾患を有する患者から抽出される。続いて、単離されたT細胞における本発明のCARのレトロウイルス又はレンチウイルス媒介発現が行われ、1~1014の範囲の治療有効量のCAR-T細胞が、患者に輸注される。本発明のCAR-T細胞は、in vivoで複製することができ、その結果、持続的な疾患制御をもたらす長期持続性が得られる。例えば、輸注されたCAR-T細胞は、投与後少なくとも1ヶ月間、患者において持続する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたCAR-T細胞の持続集団は、投与後、少なくとも4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、2年、又は3年間、ヒトにおいて持続する。
本発明はまた、本発明の1つ以上のCAR-T細胞を含む医薬組成物も提供する。特定の実施形態において、組成物は、少なくとも1、10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、又は1014のCAR-T細胞、又は1014を超える量のCAR-T細胞を含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたCAR-T細胞の持続集団は、ヒトに投与されたT細胞、ヒトに投与されたT細胞の子孫、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの細胞を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のCAR-T細胞には、強固なin vivoT細胞増殖がなされる。好ましい実施形態において、本発明のCAR-T細胞は、再活性化されて、CAR-T細胞で元々処置された疾患の任意のさらなる腫瘍細胞又は免疫細胞を阻害する、特定の記憶T細胞に進化する。
いくつかの実施形態において、患者に注入される本発明のCAR-T細胞は、癌又は免疫関連疾患のある患者において、in vivoで癌細胞又は免疫細胞を排除する。
いくつかの実施形態において、患者に注入される本発明のCAR-T細胞は、癌又は免疫関連疾患に罹患している患者において、in vivoでの腫瘍負荷又は免疫学的応答を減少させることができる。
他の実施形態において、患者に注入される本発明のCAR-T細胞は、免疫疾患を引き起こす癌細胞又は免疫細胞の再発を予防することができる。
さらに他の実施形態において、患者に注入される本発明のCAR-T細胞は、癌又は免疫関連疾患を発症する高いリスクを有する対象にいて、in vivoで癌又は免疫関連疾患の発生を予防することができ、このリスクは、患者の以前の病歴、家族歴、種々のリスク因子の蓄積、又は免疫関連疾患の前兆と考えられる前癌病変又は免疫系変化の存在に基づく。
本発明のCAR-T細胞は、単独で投与されるが、好ましくは、医薬組成物として投与され、これは、通常、意図される投与経路に従って選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤又は担体を含む。
CAR-T細胞は、任意の適切な経路によって、それを必要とする患者に投与される。適用の様式は、様々であり、例えば、特定の実施形態において、本発明のCAR-T細胞含有組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内及び膣内、又は腫瘍もしくは炎症の部位に直接投与される。それでも、ワクチンの投与のための任意の従来の方法は、適用可能である。ワクチンの投与量は、投与経路に依存し、宿主の大きさに応じて変化する。
一実施形態において、本発明の組成物は、注射により投与される。
いくつかのさらなる適切な投与経路には、これらに限定されるものではないが、経口、直腸、経鼻、局所(頬及び舌下を含む)、皮下、膣又は非経口(皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内及び硬膜外を含む)投与が含まれる。
局所部位での静脈内注射及び注射のために、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なpH値、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態で存在する。
適切な溶液は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、リンゲル乳酸塩注射のような等張性賦形剤を使用して、当業者が処方できる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び/又は他の添加剤を添加してもよい。経口投与される医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は経口液体などの形態であってよい。ゼラチン又はアジュバント等の固体担体が、錠剤に含まれてもよい。液体医薬組成物は、通常、液体担体、例えば、水、石油、動物又は植物油、鉱油又は合成油を含む。また、生理食塩水、グルコース、その他糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等のグリコールが含まれていてもよい。
材料及び方法
PBMCは、ドナーから採取された血液から、又は血液銀行から得られたバフィーコートから単離される。約150mlのドナー血液を、ヘパリン処理した血液収集チューブ(ペンシルバニア州ウエストチェスターのVWR)に採取し、次いで、PBS中で1:1に希釈する。バフィーコートを、PBS中で200mlの最終容量に希釈する。約4容量の希釈サンプルを、3容量のFicoll-Paque PLUS(ペンシルベニア州ピッツバーグのGE Healthcare Bio-Sciences)上に層状にし、次いで、800rcf、室温で30分間、ブレーキなしで遠心分離する。界面の細胞を採取し、洗浄し、さらなる分離のためにMACS緩衝液に再懸濁する。
PBMCは、ドナーから採取された血液から、又は血液銀行から得られたバフィーコートから単離される。約150mlのドナー血液を、ヘパリン処理した血液収集チューブ(ペンシルバニア州ウエストチェスターのVWR)に採取し、次いで、PBS中で1:1に希釈する。バフィーコートを、PBS中で200mlの最終容量に希釈する。約4容量の希釈サンプルを、3容量のFicoll-Paque PLUS(ペンシルベニア州ピッツバーグのGE Healthcare Bio-Sciences)上に層状にし、次いで、800rcf、室温で30分間、ブレーキなしで遠心分離する。界面の細胞を採取し、洗浄し、さらなる分離のためにMACS緩衝液に再懸濁する。
in vivo動物研究及びin vitro実験のために、これらに限定されるものではないが、Raji、K562、Nalm-6、293Tをはじめとする細胞株を、ATCCから購入し、ATCCの指示に従って維持する。細胞株を2~3日毎に継代し、対数増殖期の細胞を実験に使用する。
PBMCを密度勾配遠心分離により単離する。PBMCからCD3磁気マイクロビーズによりT細胞を選別した後、これらの細胞をCD3/CD28刺激剤を含む完全T細胞培地で培養する。T細胞を単離後24時間以内に濃縮レンチウイルスで形質導入する。その後、細胞密度を毎日培養培地で調整する。
細胞を、LSカラム(カリフォルニア州、オーバーンのMiltenyi Biotec)を使用して、製造者のプロトコルに従って、MACSマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)によって分離する。結合した細胞を溶出するために、カラムを磁界から除去する。3mlのMACS緩衝液をカラムに添加し、溶出された細胞を収集する。
フローサイトメトリーのために、細胞を標準的な手順を用いて染色する。簡潔に述べると、細胞を、分析のためにPBS+3%FBS中に、又は選別のために選別バッファ(PBS、25mM HEPES、1mM EDTA、0.1%BSA)中に、1×107細胞/mlの濃度で懸濁する。添加される抗体の量は、メーカーの指示する容積に従うか、又は滴定によって決定される。細胞を、CytoFLEX(インジアナ州インジアナポリスのBeckman Coulter Life Sciences)を使用するフローサイトメトリーによって分析し、標準的な手順の下で操作する。CD4+及び/又はCD8+細胞の下位集団を濃縮するために、磁気的に分離された細胞を抗CD4及び/又は抗CD8抗体で染色し、FACScalibur Cell Sorterで選別する。
本明細書に言及又は引用した全ての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は、それらが本明細書の明白な開示と矛盾しない限り、その図面及び表を含む全体が参照により本明細書に援用される。
以下は、本発明を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定とはみなされない。パーセンテージは全て重量基準で表示されており、全ての混合比率は特に注意がない限り、容積基準である。
実施例1-ベクター構築及びレンチウイルスパッケージング
NS3プロテアーゼスイッチの異なる変異体を適用することにより、スイッチ可能な抗CD19CARとスイッチ可能な抗CD22CARの両方をコードするレンチウイルスベクターを構築した。2つの対象の同時発現は、自己切断ウイルス2Aペプチド配列によって達成された。各CARには、CD3ゼータ活性化ドメイン(第3世代)に加えて、CD28及び4-1-BB共刺激ドメインが含まれる。レンチウイルスパッケージングのために、293T細胞を発現ベクター、psPAX2及びpMD2.Gで同時トランスフェクトした。以下の表は、本発明のCARのCAR名称及びそれぞれのCAR構造を示す。
NS3プロテアーゼスイッチの異なる変異体を適用することにより、スイッチ可能な抗CD19CARとスイッチ可能な抗CD22CARの両方をコードするレンチウイルスベクターを構築した。2つの対象の同時発現は、自己切断ウイルス2Aペプチド配列によって達成された。各CARには、CD3ゼータ活性化ドメイン(第3世代)に加えて、CD28及び4-1-BB共刺激ドメインが含まれる。レンチウイルスパッケージングのために、293T細胞を発現ベクター、psPAX2及びpMD2.Gで同時トランスフェクトした。以下の表は、本発明のCARのCAR名称及びそれぞれのCAR構造を示す。
実施例2-in vitro機能アッセイ
T細胞形質導入後、異なる薬剤を提供し、CD19-、CD22-CARをフローサイトメトリーによりCD19、CD22タンパク質で検出した。さらに、二重標的スイッチ可能なCAR-T細胞の生物学的特性を求めた。例えば、CD25及びCD69抗体を用いて活性化アッセイを行い、CFSEを用いて増殖アッセイを行い、CD4、CD8、CCR7及びCD45RA抗体を用いてT細胞サブセットを決定し、アネキシン-Vを用いてアポトーシスアッセイを行った。さらに、細胞毒性アッセイ(カルセイン-AM放出)、CD107aアッセイ、及びサイトカイン生成検出を行った。これらのアッセイは、効力を試験し、スイッチ系がどのように機能するかを規定するのに非常に重要である。
T細胞形質導入後、異なる薬剤を提供し、CD19-、CD22-CARをフローサイトメトリーによりCD19、CD22タンパク質で検出した。さらに、二重標的スイッチ可能なCAR-T細胞の生物学的特性を求めた。例えば、CD25及びCD69抗体を用いて活性化アッセイを行い、CFSEを用いて増殖アッセイを行い、CD4、CD8、CCR7及びCD45RA抗体を用いてT細胞サブセットを決定し、アネキシン-Vを用いてアポトーシスアッセイを行った。さらに、細胞毒性アッセイ(カルセイン-AM放出)、CD107aアッセイ、及びサイトカイン生成検出を行った。これらのアッセイは、効力を試験し、スイッチ系がどのように機能するかを規定するのに非常に重要である。
実施例3-動物実験
Nalm-6/Raji細胞株を遺伝的に編集し、shRNAによりCD19陰性及び/又はCD22陰性細胞を生成した。異なる抗原を発現する細胞が唯一のルシフェリンとのみ反応するように、ルシフェラーゼの変異体バージョンをこれらの細胞中に構築した[14]。このようにして、二重標的スイッチの活性は、異なる標的細胞のルミネセンス強度を測定することによって判断される。
Nalm-6/Raji細胞株を遺伝的に編集し、shRNAによりCD19陰性及び/又はCD22陰性細胞を生成した。異なる抗原を発現する細胞が唯一のルシフェリンとのみ反応するように、ルシフェラーゼの変異体バージョンをこれらの細胞中に構築した[14]。このようにして、二重標的スイッチの活性は、異なる標的細胞のルミネセンス強度を測定することによって判断される。
修飾Nalm-6/Raji細胞株を、NSGマウスに静脈内(i.v.)注射した(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)。生物発光イメージングを、修飾ルシフェリンの腹腔内注射の後、毎週行った。腫瘍負荷は、末梢血、骨髄、ひ臓のフローサイトメトリーで測定した。
実施例4-殺腫瘍性アッセイ
陽性標的細胞(Raji)及び陰性標的細胞(K562)を、カルセイン-AM(Biolegend)で標識した後、異なる比率で96のウェルプレート中でエフェクター細胞(ASVを有するCART細胞)と共培養した。共培養に用いた培地は、PBS+5%FBSであった。共培養標的細胞及びPBS+5%FBSの入ったウェルを、自然放出ウェルとして使用し、共培養標的細胞及び溶解溶液に入ったウェルを最大放出ウェルとして使用した。培養物を3時間のインキュベーション後に遠心分離し、上清を別の96のウェルプレートに移した。それぞれのウェル(F)の蛍光値を、マイクロプレートリーダーで測定し、式lysis%=(F実験ウェル-F自然放出)/(F最大放出-F自然放出)×100%に従って計算した。
陽性標的細胞(Raji)及び陰性標的細胞(K562)を、カルセイン-AM(Biolegend)で標識した後、異なる比率で96のウェルプレート中でエフェクター細胞(ASVを有するCART細胞)と共培養した。共培養に用いた培地は、PBS+5%FBSであった。共培養標的細胞及びPBS+5%FBSの入ったウェルを、自然放出ウェルとして使用し、共培養標的細胞及び溶解溶液に入ったウェルを最大放出ウェルとして使用した。培養物を3時間のインキュベーション後に遠心分離し、上清を別の96のウェルプレートに移した。それぞれのウェル(F)の蛍光値を、マイクロプレートリーダーで測定し、式lysis%=(F実験ウェル-F自然放出)/(F最大放出-F自然放出)×100%に従って計算した。
表1に、殺腫瘍性in vitroアッセイの結果を示す。結果はまた、アスナプレビルの存在下及び非存在下におけるCAR形質導入細胞の細胞死及びCD4/CD8プロファイルを示す同図6A~6Bにも示される。
本明細書に記載した実施例及び実施形態は、例示のためのみであり、それを考慮した様々な変形や変更は、当業者に示唆され、本明細書及び請求項の理念及び範囲に含まれるものとする。また、本明細書に開示された本発明又は実施形態のあらゆる要素及び限定は、本明細書に開示されたあらゆる他の要素及び限定(個別に、又は任意の組み合わせいおいて)又は他の発明又は実施形態と組み合わせることができ、このような組み合わせの全てが、限定されることなく、本発明の範囲内であることが意図される。
配列の簡単な説明
配列番号1は、本発明のCARのCD8-アルファシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号2は、本発明のCARのCD19単鎖可変フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号3は、本発明のCARのCD22単鎖可変フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号4は、本発明のCARのCD8アルファヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号5は、本発明のCARのCD28ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号6は、本発明のCARのIgG4ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号7は、本発明のCARのIgG4mヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号8は、本発明のCARのIgG1ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号9は、本発明のCARのIgG2ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号10は、本発明のCARのIgG4CH2CH3ヒンジ及びスペーサー領域のアミノ酸配列である。
配列番号11は、本発明のCARのIgG2CH2CH3ヒンジ及びスペーサー領域のアミノ酸配列である。
配列番号12は、本発明のCARのIgG1CH2CH3ヒンジ及びスペーサー領域のアミノ酸配列である。
配列番号13は、本発明のCARのCD28膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号14は、本発明のCARのCD8-アルファ膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号15は、本発明のCARのCD4膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号16は、本発明のCARのCD3-ゼータ膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号17は、本発明のCARのICOS膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号18は、本発明のCARの4-1BB細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号19は、本発明のCARのCD28細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号20は、本発明のCARのCD3-ゼータ細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号21~979は、表2に挙げた抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号980は、本発明のCARの野生型NS3プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号981は、本発明のCARのT54A変異体NS3プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号982は、本発明のCARのアスナプレビル-阻害性(AI)NS3プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号983は、本発明のCARのテラプレビル阻害性(TI)NS3プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号984は、本発明のCARのNS4Aドメインのアミノ酸配列である。
配列番号985は、本発明のCARの第1のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号986は、本発明のCARの第2のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号987は、本発明のCARの第3のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号988は、本発明のCARの第4のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号989は、本発明のCARの第1の自己切断ウイルス2Aペプチド(T2A)のアミノ酸配列である。
配列番号990は、本発明のCARの第2の自己切断ウイルス2Aペプチド(P2A)のアミノ酸配列である。
配列番号991は、本発明のCARのCD19軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号992は、本発明のCARのCD19重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号993は、本発明のCARのCD22重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号994は、本発明のCARのCD22軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号995は、第1の単鎖変形フラグメントリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号996は、第2の単鎖変形フラグメントリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号997は、第3の単鎖変形フラグメントリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号1は、本発明のCARのCD8-アルファシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号2は、本発明のCARのCD19単鎖可変フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号3は、本発明のCARのCD22単鎖可変フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号4は、本発明のCARのCD8アルファヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号5は、本発明のCARのCD28ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号6は、本発明のCARのIgG4ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号7は、本発明のCARのIgG4mヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号8は、本発明のCARのIgG1ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号9は、本発明のCARのIgG2ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号10は、本発明のCARのIgG4CH2CH3ヒンジ及びスペーサー領域のアミノ酸配列である。
配列番号11は、本発明のCARのIgG2CH2CH3ヒンジ及びスペーサー領域のアミノ酸配列である。
配列番号12は、本発明のCARのIgG1CH2CH3ヒンジ及びスペーサー領域のアミノ酸配列である。
配列番号13は、本発明のCARのCD28膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号14は、本発明のCARのCD8-アルファ膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号15は、本発明のCARのCD4膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号16は、本発明のCARのCD3-ゼータ膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号17は、本発明のCARのICOS膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号18は、本発明のCARの4-1BB細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号19は、本発明のCARのCD28細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号20は、本発明のCARのCD3-ゼータ細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号21~979は、表2に挙げた抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号980は、本発明のCARの野生型NS3プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号981は、本発明のCARのT54A変異体NS3プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号982は、本発明のCARのアスナプレビル-阻害性(AI)NS3プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号983は、本発明のCARのテラプレビル阻害性(TI)NS3プロテアーゼドメインのアミノ酸配列である。
配列番号984は、本発明のCARのNS4Aドメインのアミノ酸配列である。
配列番号985は、本発明のCARの第1のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号986は、本発明のCARの第2のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号987は、本発明のCARの第3のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号988は、本発明のCARの第4のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列である。
配列番号989は、本発明のCARの第1の自己切断ウイルス2Aペプチド(T2A)のアミノ酸配列である。
配列番号990は、本発明のCARの第2の自己切断ウイルス2Aペプチド(P2A)のアミノ酸配列である。
配列番号991は、本発明のCARのCD19軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号992は、本発明のCARのCD19重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号993は、本発明のCARのCD22重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号994は、本発明のCARのCD22軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号995は、第1の単鎖変形フラグメントリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号996は、第2の単鎖変形フラグメントリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号997は、第3の単鎖変形フラグメントリンカーのアミノ酸配列である。
Claims (43)
- 単一の軽鎖可変フラグメントと、
単一の重鎖可変フラグメントと、
単鎖可変フラグメントリンカーと、
少なくとも1つの非構造タンパク質3(NS3)プロテアーゼドメインと、
少なくとも1つの切断部位と、
ヒンジ領域と、
膜貫通領域と、
CD3-ゼータシグナル伝達ドメインと、任意で、
CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、TNFSF14、NKG2C、B7-H3、CD132、又はILRβ(CD122)の細胞内シグナル伝達ドメインのような細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、キメラ抗原レセプター(CAR)。 - 前記少なくとも1つのNS3プロテアーゼドメインは、野生型HCV NS3プロテアーゼドメイン、T54A NS3プロテアーゼドメイン、及び小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるNS3プロテアーゼドメインから選択される、請求項1に記載のCAR。
- 前記NS3プロテアーゼドメインは、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメントと前記ヒンジ領域との間、又は前記ヒンジ領域と前記膜貫通領域との間に位置する、請求項1に記載のCAR。
- 前記NS3プロテアーゼドメインは、2つの切断部位に隣接している、請求項1に記載のCAR。
- 前記NS3プロテアーゼドメインは、1つの切断部位に隣接している、請求項1に記載のCAR。
- 前記1つの切断部位は、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメントと前記NS3プロテアーゼドメインとの間、前記NS3プロテアーゼドメインと前記ヒンジ領域との間、前記ヒンジ領域と前記膜貫通領域との間、又は前記切断部位の存在が前記CARの機能を妨げない限り、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメント、NS3プロテアーゼ、ヒンジ領域、及び/又は膜貫通内の任意の位置に位置する、請求項5に記載のCAR。
- 少なくとも1つの前記切断部位は、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメントと前記NS3プロテアーゼドメインとの間、前記NS3プロテアーゼドメインと前記ヒンジ領域との間、前記ヒンジ領域と前記膜貫通領域との間、又は前記切断部位の存在が前記CARの機能を妨げない限り、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメント、NS3プロテアーゼ、ヒンジ領域、及び/又は膜貫通内の任意の位置に位置する、請求項4に記載のCAR。
- 第1の切断部位は、前記単一の軽鎖及び重鎖可変フラグメントと前記NS3プロテアーゼドメインとの間に位置し、第2の切断部位は、前記ヒンジ領域と前記膜貫通ドメインとの間に位置する、請求項4に記載のCAR。
- 前記単鎖及び重鎖可変フラグメントは、表2に挙げた前記抗体の可変領域のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のCAR。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の前記CARをコードする核酸。
- 単一の軽鎖可変フラグメントと、
単一の重鎖可変フラグメントと、
単鎖可変フラグメントリンカーと、
第1の非構造タンパク質3(NS3)プロテアーゼドメインと、
少なくとも1つの第1の切断部位と、
第1のヒンジ領域と、
第1の膜貫通領域と、
第1のCD3-ゼータシグナル伝達ドメインと、任意で、
第1の細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む第1のCAR、及び
単一の軽鎖可変フラグメントと、
単一の重鎖可変フラグメントと、
単鎖可変フラグメントリンカーと、
第2の非構造タンパク質3(NS3)プロテアーゼドメインと、
少なくとも1つの第2の切断部位と、
第2のヒンジ領域と、
第2の膜貫通領域と、
第2のCD3-ゼータシグナル伝達ドメインと、任意で、
第2の細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む第2のCAR、をコードする核酸。 - 前記第1のCARは、CD19単一軽鎖及び重鎖可変フラグメントを含み、前記第2のCARは、CD22単一軽鎖及び重鎖可変フラグメントを含む、請求項11に記載の核酸。
- 前記第1及び第2のNS3プロテアーゼドメインは、野生型HCV NS3プロテアーゼドメイン、T54A NS3プロテアーゼドメイン、及び小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるNS3プロテアーゼドメインから選択される、請求項11に記載の核酸。
- 第1及び第2のNS3プロテアーゼドメインは、小分子インヒビターによる阻害に対して感受性のあるNS3プロテアーゼドメインである、請求項13に記載の核酸。
- 前記第1のNS3プロテアーゼドメインは、第1の小分子インヒビターによる阻害に対して感受性があり、前記第2のNS3プロテアーゼドメインは、第2の小分子インヒビターによる阻害に対して感受性がある請求項14に記載の核酸。
- T細胞は、小分子プロテアーゼインヒビターの非存在下、細胞表面上でCARを発現しない、請求項10に記載の核酸を含むT細胞。
- 前記T細胞は、小分子プロテアーゼインヒビターと接触した場合に、前記細胞表面上でCARを発現する、請求項16に記載のT細胞。
- 前記T細胞は、小分子プロテアーゼインヒビターの非存在下、前記細胞表面上で第1のCAR及び/又は第2のCARを発現しない、請求項11~15のいずれか1項に記載の核酸を含むT細胞。
- 前記T細胞は、少なくとも1つの小分子プロテアーゼインヒビターと接触した場合に、前記細胞表面上で前記第1のCAR及び/又は前記第2のCARを発現する、請求項18に記載のT細胞。
- 請求項16~17のいずれか1項に記載のT細胞を含む医薬組成物。
- プロテアーゼドメインを阻害する小分子インヒビターをさらに含む、請求項20に記載の医薬組成物。
- 請求項18~19のいずれか1項に記載のT細胞を含む医薬組成物。
- プロテアーゼドメインを阻害する少なくとも1つの小分子インヒビターをさらに含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- 第1の小分子は、第1のプロテアーゼドメインを阻害し、第2の小分子インヒビターは、第2のプロテアーゼドメインを阻害する、請求項23に記載の医薬組成物。
- 請求項16~17のいずれか1項に記載のT細胞の製造方法。
- 請求項18~19のいずれか1項に記載のT細胞の製造方法。
- 請求項16~17のいずれか1項に記載のT細胞を、癌に罹患している対象に投与することを含む、癌の治療方法。
- 請求項20~21のいずれか1項に記載の医薬組成物を、癌に罹患している対象に投与することを含む、癌の治療方法。
- 請求項18~19のいずれか1項に記載のT細胞を、癌に罹患している対象に投与することを含む、癌の治療方法。
- 請求項22~24のいずれか1項に記載の医薬組成物を、癌に罹患している対象に投与することを含む、癌の治療方法。
- 請求項16~17のいずれか1項に記載のT細胞を、免疫疾患に罹患している対象に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
- 請求項20~21のいずれか1項に記載の医薬組成物を、免疫疾患に罹患している対象に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
- 請求項18~19のいずれか1項に記載のT細胞を、免疫疾患に罹患している対象に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
- 請求項22~24のいずれか1項に記載の医薬組成物を、免疫疾患に罹患している対象に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
- 前記方法は、前記T細胞又は前記医薬組成物の投与に加えて、少なくとも1つの小分子プロテアーゼインヒビターの同時、前又は後の投与をさらに含む、請求項27~34のいずれか1項に記載の方法。
- 癌を治療する方法において使用するための、請求項16~17のいずれか1項に記載のT細胞であって、前記T細胞は、前記癌に罹患している対象に投与される、T細胞。
- 癌を治療する方法において使用するための、請求項20~21のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記組成物は、前記癌に罹患している対象に投与される、医薬組成物。
- 癌を治療する方法において使用するための、請求項18~19のいずれか1項に記載のT細胞であって、前記T細胞は、前記癌に罹患している対象に投与される、T細胞。
- 癌を治療する際に使用するための、請求項22~24のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記組成物は、前記癌に罹患している対象に投与される、医薬組成物。
- 免疫疾患を治療する方法において使用するための、請求項16~17のいずれか1項に記載のT細胞であって、前記T細胞は、前記免疫疾患に罹患している対象に投与される、T細胞。
- 免疫疾患を治療する方法において使用するための、請求項20~21のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記組成物は、前記免疫疾患に罹患している対象に投与される、医薬組成物。
- 免疫疾患を治療する方法において使用するための、請求項18~19のいずれか1項に記載のT細胞であって、前記T細胞は、前記免疫疾患に罹患している対象に投与される、T細胞。
- 免疫疾患を治療するための方法において使用するための、請求項22~24のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記組成物は、前記免疫疾患に罹患している対象に投与される、医薬組成物。
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